特表 2024-504878 弱毒化アフリカ豚熱ウイルス及びワクチンとしてのその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-01

(54)【発明の名称】弱毒化アフリカ豚熱ウイルス及びワクチンとしてのその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20240125BHJP

   C12N 7/04 20060101ALI20240125BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20240125BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240125BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240125BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z

C12N7/04 ZNA

C12Q1/686 Z

A61K39/12

A61P31/20

A61P37/04

A61K35/76

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023570333

(86)(22)【出願日】2022-01-31

(85)【翻訳文提出日】2023-09-22

(86)【国際出願番号】 EP2022052183

(87)【国際公開番号】W WO2022167360

(87)【国際公開日】2022-08-11

(31)【優先権主張番号】21305138.6

(32)【優先日】2021-02-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】512034999

【氏名又は名称】アジャンス ナシオナル ド セキュリテ サニテア ド ラリマンタシオン，ド レンヴィロンヌマン エ デュ トラヴァイユ

【氏名又は名称原語表記】ＡＧＥＮＣＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬＥ ＤＥ ＳＥＣＵＲＩＴＥ ＳＡＮＩＴＡＩＲＥ ＤＥ Ｌ’ＡＬＩＭＥＮＴＡＴＩＯＮ， ＤＥ Ｌ’ＥＮＶＩＲＯＮＮＥＭＥＮＴ ＥＴ ＤＵ ＴＲＡＶＡＩＬ

【住所又は居所原語表記】１４ ｒｕｅ Ｐｉｅｒｒｅ ｅｔ Ｍａｒｉｅ Ｃｕｒｉｅ，９４７０１ Ｍａｉｓｏｎｓ－Ａｌｆｏｒｔ Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ

(74)【代理人】

【識別番号】110002860

【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ブロ ル ポティエ，マリーーフレデリック

(72)【発明者】

【氏名】ブーリー，オリヴィエ

(72)【発明者】

【氏名】ヒュテット，エヴリーヌ

(72)【発明者】

【氏名】ル ディムナ，ミレイユ

(72)【発明者】

【氏名】シャスタニエ，アメリ

(72)【発明者】

【氏名】パブーフ，フレデリック

(72)【発明者】

【氏名】ブランシャール，ヤニック

(72)【発明者】

【氏名】ルーカス，ピエリック

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B063QQ10

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QS25

4B065AA99Y

4B065BA14

4B065CA45

4B065CA46

4C085AA03

4C085BA51

4C085CC08

4C085EE01

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC83

4C087CA09

4C087CA12

4C087ZB09

4C087ZB33

(57)【要約】

本発明は、弱毒化アフリカ豚熱（ＡＳＦ）ウイルスであって、対応する非弱毒化ウイルスのゲノムと比較して、遺伝子ＭＧＦ３６０－１２Ｌ、３６０－１３Ｌ、３６０－１４Ｌ、５０５－２Ｒ、５０５－３Ｒが、遺伝子が転写及び／又は翻訳されないように、欠失、中断、又は変異しており、ＡＳＦＶ＿Ｇ＿ＡＣＤ＿００５２０のＯＲＦが、転写及び／又は翻訳されないように、欠失、中断、又は変異しており、遺伝子ＭＧＦ５０５－１Ｒ及び５０５－４Ｒが短縮している、ＡＳＦウイルスに関する。本発明は、弱毒化ＡＳＦウイルスを含むワクチン、及び対象におけるアフリカ豚熱ウイルスの予防におけるその使用にも関する。本発明はまた、弱毒化ＡＳＦウイルスを得るためのインビトロ方法であって、Ｇｅｏｒｇｉａ２００７／１、Ｐｉｇ／ＨＬＪ／２０１８、遺伝子型ＩＩのＡＳＦウイルス株又は遺伝的に近いＡＳＦウイルス株の中から選択される毒性ＡＳＦＶウイルス株の熱弱毒化、及び特定病原体除去ブタの接種による増幅、及び前記弱毒化ＡＳＦウイルスの選択の少なくとも１つの工程を含む方法に関する。本発明は、弱毒化ＡＳＦウイルス及び対応する非弱毒化ＡＳＦウイルスの示差検出のためのインビトロ方法にも関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

弱毒化アフリカ豚熱（ＡＳＦ）ウイルスであって、
対応する非弱毒化ウイルスのゲノムと比較して、
遺伝子ＭＧＦ３６０－１２Ｌ、３６０－１３Ｌ、３６０－１４Ｌ、５０５－２Ｒ、５０５－３Ｒが、前記遺伝子が転写及び／又は翻訳されないように、欠失、中断、又は変異しており、
ＡＳＦＶ＿Ｇ＿ＡＣＤ＿００５２０のＯＲＦが、転写及び／又は翻訳されないように、欠失、中断、又は変異しており、
遺伝子ＭＧＦ５０５－１Ｒ及び５０５－４Ｒが短縮している、
弱毒化ＡＳＦウイルス。

【請求項2】

ＭＧＦ５０５－１Ｒ遺伝子の始まりの開始コドンＡＴＧ及びＭＧＦ５０５－４Ｒ遺伝子の終わりの終止コドンが、短縮型遺伝子ＭＧＦ５０５－１Ｒ及び５０５－４Ｒにおいて維持されている、請求項１に記載の弱毒化ＡＳＦウイルス。

【請求項3】

遺伝子ＭＧＦ３６０－１２Ｌ、３６０－１３Ｌ、３６０－１４Ｌ、５０５－２Ｒ、５０５－３Ｒが欠失しており、
ＡＳＦＶ＿Ｇ＿ＡＣＤ＿００５２０のＯＲＦが欠失している、請求項１又は２に記載の弱毒化ＡＳＦウイルス。

【請求項4】

遺伝子ＭＧＦ３６０－１２Ｌ、３６０－１３Ｌ、３６０－１４Ｌ、５０５－２Ｒ、５０５－３Ｒが、前記遺伝子が転写及び／又は翻訳されないように中断しており、
ＡＳＦＶ＿Ｇ＿ＡＣＤ＿００５２０のＯＲＦが、転写及び／又は翻訳されないように中断している、先行請求項のいずれか一項に記載の弱毒化ＡＳＦウイルス。

【請求項5】

前記中断が、前記遺伝子のＡＴＧ開始コドンの欠失若しくは改変、
又は翻訳開始部位の改変、
又はフレームシフト、
又は前記遺伝子のオープンリーディングフレームにおける１つ以上の終止コドンの導入を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の弱毒化ＡＳＦウイルス。

【請求項6】

前記ゲノムの残りが、Ｇｅｏｒｇｉａ２００７／１の系統、例えば、Ｐｉｇ／ＨＬＪ／２０１８、ＡＳＦＶ－ＳＹ１８、Ｃｈｉｎａ／２０１８／ＡｎｈｕｉＸＣＧＱ、ＡＳＦＶ／ＰＯＬ／２０１５／Ｐｏｄｌａｓｋｉｅ、Ｏｄｉｎｔｓｏｖｏ２／２０１４、Ｋａｓｈｉｎｏ０４／１３、ＡＳＦＶ－Ｂｅｌｇｉｕｍ２０１８／１、ＡＳＦＶ／Ｃｈｉｎａ／２０１６／１３１、遺伝子型ＩＩのＡＳＦウイルス株、又は遺伝的に近いＡＳＦウイルス株の中から選択される毒性ＡＳＦＶウイルス株由来のゲノムに対応する、先行請求項のいずれか一項に記載の弱毒化ＡＳＦウイルス。

【請求項7】

前記ゲノムの残りが、前記毒性ＡＳＦＶウイルス株Ｇｅｏｒｇｉａ２００７／１由来のゲノムに対応する、先行請求項のいずれか一項に記載の弱毒化ＡＳＦウイルス。

【請求項8】

いかなるレポーター遺伝子も含まない、先行請求項のいずれか一項に記載の弱毒化ＡＳＦウイルス。

【請求項9】

先行請求項のいずれか一項に記載の弱毒化ＡＳＦウイルスを含む、ワクチン。

【請求項10】

前記弱毒化ＡＳＦウイルスの異なる株を含む、請求項９に記載のワクチン。

【請求項11】

前記対象におけるアフリカ豚熱ウイルスの予防に使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の弱毒化ＡＳＦウイルス、又は請求項９～１０のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項12】

前記対象において、前記毒性ＡＳＦＶウイルス株Ｇｅｏｒｇｉａ２００７／１又は前記Ｇｅｏｒｇｉａ２００７／１系統の中の他の遺伝的に近いＡＳＦウイルス株に対する防御免疫応答を誘導することによる、請求項１１に記載の使用のための弱毒化ＡＳＦウイルス又はワクチン。

【請求項13】

前記弱毒化ＡＳＦウイルス又は前記ワクチンが、口鼻経路及び非経口経路の中から選択される経路、特に筋肉内経路によって投与される、請求項１１又は１２に記載の使用のための弱毒化ＡＳＦウイルス又はワクチン。

【請求項14】

前記対象がブタ若しくはイノシシであり、及び／又は前記ワクチンがプライムレジメンに従って投与される、請求項１１～１３に記載の使用のための弱毒化ＡＳＦウイルス又はワクチン。

【請求項15】

請求項１～８のいずれか一項に記載の弱毒化ＡＳＦウイルスを得るためのインビトロ方法であって、
対応する非弱毒化ウイルスのゲノムと比較して、
遺伝子ＭＧＦ３６０－１２Ｌ、３６０－１３Ｌ、３６０－１４Ｌ、５０５－２Ｒ、５０５－３Ｒを、前記遺伝子が転写及び／又は翻訳されないように、欠失又は中断させる工程と、
ＡＳＦＶ＿Ｇ＿ＡＣＤ＿００５２０のＯＲＦを、転写及び／又は翻訳されないように、欠失又は中断させる工程と、
遺伝子ＭＧＦ５０５－１Ｒ及び５０５－４Ｒを短縮させる工程とを含む、
方法。

【請求項16】

遺伝子ＭＧＦ３６０－１２Ｌ、３６０－１３Ｌ、３６０－１４Ｌ、５０５－２Ｒ、５０５－３Ｒが欠失しており、
ＡＳＦＶ＿Ｇ＿ＡＣＤ＿００５２０のＯＲＦが欠失している、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

遺伝子ＭＧＦ３６０－１２Ｌ、３６０－１３Ｌ、３６０－１４Ｌ、５０５－２Ｒ、５０５－３Ｒが、前記遺伝子が転写及び／又は翻訳されないように中断しており、
ＡＳＦＶ＿Ｇ＿ＡＣＤ＿００５２０のＯＲＦが、転写及び／又は翻訳されないように中断している、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記中断が、前記遺伝子のＡＴＧ開始コドンの欠失若しくは改変、又は翻訳開始部位の改変、又はフレームシフト、又は前記遺伝子のオープンリーディングフレームにおける１つ以上の終止コドンの導入を含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

Ｇｅｏｒｇｉａ２００７／１、Ｐｉｇ／Ｈ ＬＪ／２０１８、遺伝子型ＩＩのＡＳＦウイルス株、又は遺伝的に近いＡＳＦウイルス株の中から選択される毒性ＡＳＦＶウイルス株の熱弱毒化、及び特定病原体除去ブタの接種による増幅、及び前記弱毒化ＡＳＦウイルスの選択の少なくとも１つの工程を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の弱毒化ＡＳＦウイルスを得るためのインビトロ方法。

【請求項20】

請求項１～８のいずれか一項に記載の弱毒化ＡＳＦウイルスと、対応する非弱毒化ＡＳＦウイルスとの試料中での差次検出のためのインビトロでの方法であって、各株に特異的
なプライマー／プローブのセットを用いたＰＣＲによる核酸鎖の差次的増幅を実行することを含み、配列：
Ｄｅｌ＿Ｆｏｗ ＴＧＣＴＴＴＣＡＡＧＣＣＴＡＣＡＡＣＴＣＣ（配列番号４）
Ｄｅｌ＿Ｒｅｖ ＡＴＴＣＴＣＡＧＧＧＣＣＴＣＡＴＴＧＧＴ（配列番号５）、及び
Ｄｅｌ＿Ｐｒｏｂｅ ＡＧＣＧＡＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＧＣＣＡＣＣ（配列番号６）のプライマー／プローブは、前記弱毒化ＡＳＦウイルスの特異的増幅を可能にする一方、配列：
５０５＿３Ｒ＿Ｌ１ ＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＴＴＣＣＣＴ（配列番号７）
５０５＿３Ｒ＿Ｒ１ ＡＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣＡＴＧＡＣＡＡＣＡ（配列番号８）、及び
５０５＿３Ｒ＿Ｐ１ ＣＣＣＴＴＣＣＧＡＴＧＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号９）のプライマー／プローブは、対応する非弱毒化ＡＳＦウイルスの特異的増幅を可能にする、
方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、弱毒化アフリカ豚熱ウイルス（ＡＳＦ）ウイルス、及びＡＳＦを予防するための、それを含有するワクチンとしてのその使用、並びに弱毒化ＡＳＦウイルス及び対応する非弱毒化ＡＳＦウイルスの示差検出のためのインビトロ方法に関する。

【0002】

したがって、本発明は、医薬、特に獣医学の分野において有用性を有する。

【0003】

以下の説明では、角括弧（［］）内の参照は、本文書の最後の参照文献のリストを指す。

【背景技術】

【0004】

アフリカ豚熱（ＡＳＦ）は、家畜及び野生のイノシシ科動物においてその急性形態でしばしば致死的な出血性症候群を引き起こすウイルス疾患である。欧州のブタでは伝染性であり、野生のアフリカのイノシシ科（カワイノシシ及びイボイノシシ）では不顕性であり、ヒトに伝染しない。

【0005】

この疾患は、サハラ以南のアフリカからの野生のイノシシ科（カワイノシシ、イボイノシシ、及び他のブタ）において少なくとも１世紀にわたって存在しているが、それらはいかなる症状も発症しない。ＡＳＦは、１９２１年にケニヤで初めて記載されたが、アフリカにおいて個体から個体へ、及びマダニの軟咬傷を介して拡散しており、サハラ以南のアフリカにおいて風土病となっている。

【0006】

この疾患のアフリカ以外での最初の進出は、国際貿易の発展に関連して１９６０年代にさかのぼる。米国での大流行は、１９９５年までに根絶されなかったイベリア半島及び１９７８年にＡＳＦが導入されて以来ＡＳＦが風土病になったサルジニアを除いて、ヨーロッパの大流行と同様にかなり迅速に根絶された。２００７年には、欧州大陸が再び影響を受け、ジョージアでの養豚における大発生が最初に検出された。２００８年に、この疾患は、ユーラシア大陸（アルメニア、アゼルバイジャン、南ロシア）に徐々に定着し、野生のブタ及び家畜ブタの両方に影響を及ぼした。そして、小規模で制御が不十分な農場で局所的に拡散することによって、西側に拡散し続けている。２０１４年に、ＡＳＦは欧州連合、最初はポーランド及びバルト諸国へと戻り、その後、モルドバ（２０１６年）、ルーマニア及びチェコ共和国（２０１７年）、ハンガリー及びベルギー（２０１８年）、並びにドイツ（２０２０年）で野生のイノシシの風土病となった。最後に、２０１８年８月以来、アジア大陸が大きく影響を受けている：中国、次いでモンゴル、台湾及びべトナム、フィリピン（２０１９年）、並びにインド（２０２０年）。拡散の危険性は世界的になってきている。

【0007】

ウイルス株の毒性及びブタ宿主の感受性に依存して、ＡＳＦは、疾患の様々な毒性レベル：急性型、亜急性型、及び慢性型で提示され得る。

【0008】

症状及び病変は、古典的なブタ熱について記載されたものと同様であり、すなわち、高体温、血液学的障害、皮膚発赤、食欲不振、嗜眠、協調運動障害、嘔吐、及び下痢である。

【0009】

急性型では１００％の割合で４～１３日で死亡し、亜急性型では３０～４０日でより少ない死亡率で死亡する。この疾患は、慢性型では数ヶ月間進行し得る。

【0010】

アスファウイルス科の唯一のメンバーである、ＡＳＦに関与するウイルスは、非常に複雑で大きなエンベロープを有する二本鎖ＤＮＡウイルスである。これは、単球－マクロファージ系統の細胞に感染し、免疫応答をその利点に転用する。そのゲノムは近年完全に配列決定されただけであり、毒性又は防御に関与する全ての遺伝子がまだ同定されているわけではなく、信頼できる有効なワクチンの開発が遅れている。

【0011】

ＡＳＦは、現在有効な動物の健康に関連する健康上の危険の階層に関して、フランスにおいて第１カテゴリーの健康上の危険として分類されている。動物の健康において、危険の第１のカテゴリーは、深刻な公衆衛生問題又は環境若しくはフランスの生産能力に対する深刻なリスクに関する。そうしたリスクは、一般的な関心において、強制的防止、監視、又は制御手段を必要とする。この疾患は、高い死亡率及び罹患国に課せられた取引制限のために、大きな経済的損失を引き起こす。

【0012】

この疾患の診断は複雑であり、今日まで、実験室試験（ウイルス学的及び／又は血清学的）のみが診断を提供し、ＡＳＦを古典的ブタ熱と区別することができる。一次診断は、迅速な検出（２４時間以内）のために、完全に検証された方法を使用して、血清学的にはＥＬＩＳＡ及びウイルス学的にはＰＣＲによって行うことができ、それらの方法のいくつかは市販のキットとして入手可能である。

【0013】

最後に、今日まで、この疾患を制御するための処置又はワクチンはなく、この疾患を制御する唯一の手段は未だに、検疫及び屠殺である。欧州連合内の課題は、古典的豚熱に対して既に行われているように、例えば餌によってイノシシに経口的に送達され得るワクチンを有すること、又は小さな家族農場の豚に送達され得るワクチンを有することである。世界的なレベルでの挑戦は、ブタを繁殖させるための、特に世界の主要な生産者であるアジアのためのワクチンを有することである。

【0014】

感染細胞抽出物、感染ブタ末梢血白血球の上清、精製及び不活化ビリオン、感染グルタルアルデヒド固定マクロファージ、又は界面活性剤処理感染肺胞マクロファージを用いて動物にワクチン接種する試みは、防御免疫を誘導することができなかった。ウイルス感染を生き延びたブタでは、同種防御免疫が発生する。ＡＳＦＶの中程度に毒性の又は弱毒化変異体による急性感染を生き延びたブタは、同種ウイルスチャレンジに対する長期耐性を示すが、異種ウイルスチャレンジに対する長期耐性を示すことは稀である。特定のＡＳＦＶ毒性関連遺伝子の操作された欠失を含む生弱毒化ＡＳＦウイルスで免疫されたブタは、同種親ウイルスでチャレンジされた場合に防御された。詳細には、病原性ＡＳＦウイルス（Ｍａｌａｗｉ Ｌｉｌ－２０／１、Ｐｒｅｔｏｒｉｕｓｋｏｐ／９６／４、及びＥ７０）のゲノムからのＵＫ（ＤＰ６９Ｒ）、２３－ＮＬ（ＤＰ７１ Ｌ）、ＴＫ（Ａ２４０Ｌ）、又は９ＧＬ（Ｂ１１９Ｌ）遺伝子の個々の欠失は、ブタにおいてウイルスを顕著に弱毒化し、そしてこれらの弱毒化ウイルスで免疫された動物は、同種ウイルスでのチャレンジに対して防御された。

【0015】

ゲノムサイズ及び制限フラグメントパターンにおける変動が、異なるＡＳＦＶ単離物の間で観察され、そしてこの多様性は、末端ゲノム領域に存在する。これらの可変領域は、ＡＳＦＶゲノムの左３５ｋｂ末端及び右１５ｋｂ末端を含み、少なくとも５つの多重遺伝子ファミリー（ＭＧＦ）：ＭＧＦ１００、ＭＧＦ１１０、ＭＧＦ３００、ＭＧＦ３６０、及びＭＧＦ５０５を含有する。これらの遺伝子は、配列及び構造的同一性の両方を共有するため、これらのＭＧＦに分類される。これらの遺伝子の機能は完全には理解されていないが、それらは、マクロファージ宿主範囲、先天性宿主免疫応答の調節及び毒性と相関している。

【0016】

最近、組換えＡＳＦＶ－Ｇ（アフリカ豚熱ウイルス－Ｇｅｏｒｇｉａ２００７分離株）
変異体である「ＡＳＦＶ－Ｇ－ΔＭＧＦ」が作製されており、これは７，５５９ヌクレオチド（ヌクレオチド位置２７，９２８～３５，４８７の間）の欠失を含み、ＭＧＦ３６０遺伝子１２Ｌ、１３Ｌ、及び１４Ｌ、並びにＭＧＦ５０５ １Ｒ、２Ｒ及び３Ｒの欠失をもたらす（非特許文献１（［１］）；特許文献１（［２］））。しかしながら、この変異体ウイルスがＡＳＦ Ｇｅｏｒｇｉａ株での致死性チャレンジに対してブタを臨床的に防御した場合、免疫されたブタのかなりの頭数（１０匹中４匹）がチャレンジ後にウイルス血症を示したため、ウイルス学的に防御されなかった。

【0017】

したがって、代替の弱毒化ワクチンが必要とされている。本発明は、この必要性及び他の必要性を満たす。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0018】

【特許文献1】米国特許出願公開第２０１６／０１３０５６２号明細書

【非特許文献】

【0019】

【非特許文献1】Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌら、「ＭＧＦ３６０及びＭＧＦ５０５遺伝子の欠失を保有するアフリカ豚熱ウイルスＧｅｏｒｇｉａ分離株はブタにおいて弱毒化され、病原性親ウイルスによるチャレンジに対する防御を付与する」、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１５年６月；８９（１１）：６０４８－５６

【非特許文献2】Ｘｕｅｘｉａ Ｗｅｎら（２０１９年）、「ブタ及び乾燥ブタ飼料試料に由来するゲノム配列は、２０１８年の中国におけるアフリカ豚熱ウイルスの伝染に対する重要な洞察を提供する」、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ＆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、８：１、３０３－３０６

【非特許文献3】Ｂａｏ，Ｊら、「アフリカ豚熱ウイルスＣｈｉｎａ／２０１８／ＡｎｈｕｉＸＣＧＱ株及び関連する欧州ｐ７２遺伝子型ＩＩ株のゲノム比較」、Ｔｒａｎｓｂｏｕｎｄ Ｅｍｅｒｇ Ｄｉｓ．２０１９年；６６：１１６７－１１７６．

【非特許文献4】Ｍａｚｕｒ－Ｐａｎａｓｉｕｋ Ｎ．ら、「ポーランドで単離されたアフリカ豚熱ウイルスの最初の完全ゲノム配列」、Ｓｃｉ Ｒｅｐ ９、４５５６（２０１９年）

【非特許文献5】Ｆｏｒｔｈ ＪＨら、「アフリカ豚熱ウイルスの完全ゲノム配列の比較分析」、ベルギー、２０１８／１、Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１９年６月；２５（６）：１２４９－１２５２．

【非特許文献6】Ｋｏｖａｌｅｎｋｏ，Ｇ．ら、「ウクライナの家畜ブタからの毒性アフリカ豚熱ウイルスの完全ゲノム配列」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ａｎｎｏｕｎｃｅｍｅｎｔｓ ２０１９，８，ｅ００８８３－００８１９

【非特許文献7】Ｒａｔｈａｋｒｉｓｈｎａｎ Ａら、「組換えアフリカ豚熱ウイルスの産生：プロセスのスピードアップ」、Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０２０年６月５日；１２（６）：６１５

【非特許文献8】Ｃａｒｒａｓｃｏｓａ，Ａ．Ｌ．ら、「アフリカ豚熱ウイルスを成長及び滴定するための方法：野外及び実験室試料」、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２０１１年、第２６章：ｐ．Ｕｎｉｔ ２６ １４

【非特許文献9】Ｂｏｌｇｅｒ、Ａ．Ｍ．、Ｍ．Ｌｏｈｓｅ、及びＢ．Ｕｓａｄｅｌ、「Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ：イルミナ配列データ用の柔軟なトリマー」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０１４年、３０（１５）：ｐ．２１１４－２０

【非特許文献10】Ｌｉ，Ｈ．及びＲ．Ｄｕｒｂｉｎ、「バローズ－ホイーラー変換による高速かつ正確なショートリードアライメント」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００９年、２５（１４）：ｐ．１７５４－６０

【非特許文献11】Ｌｉ，Ｈ．ら、「配列アライメント／マップフォーマット及びＳＡＭｔｏｏｌｓ」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００９年、２５（１６）：ｐ．２０７８－９

【非特許文献12】Ｌａｃａｓｔａら：「発現ライブラリ免疫化は、アフリカ豚熱ウイルスでの致死性チャレンジに対する防御を付与することができる」、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、２０１４年１１月、８８（２２）：１３３２２－３２

【非特許文献13】Ｔｉｇｎｏｎ，Ｍ．ら、「アフリカ豚熱ウイルスの検出及び実験室診断のための内部対照を用いた改良された新しいリアルタイムＰＣＲアッセイの開発及び実験室間検証研究」、Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１１年、１７８（１－２）：ｐ．１６１－７０

【非特許文献14】Ｋｉｎｇ，Ｋ．ら、「実験的免疫化によるアフリカ豚熱ウイルスの毒性アフリカ単離物からの欧州国内ブタの保護」、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０１１年、２９（２８）：ｐ．４５９３－６００

【発明の概要】

【0020】

重要な研究の結果として、本出願人は、新たな弱毒化アフリカ豚熱ウイルス、内部参照ＰＰＡ／ｄｐ／ＦＲ－２２／２０１８／１８０１７２－２、更にＡＳＦＶ－９８９と名付けられたものを開発し、これは驚くべきことに、攻撃された個体においてウイルス血症を完全に予防することによって、既存の弱毒化ウイルス、特にＡＳＦＶ－Ｇ－ＡＭＧＦと比較して優れたワクチン効力を示す。

【0021】

驚くべきことに、本発明者らは、ブタ肺胞マクロファージ上で培養した場合、本発明の弱毒化ＡＳＦＶ－９８９が、非弱毒化Ｇｅｏｒｇｉａ２００７／１と同様の複製速度を示すことを見出した。

【0022】

本発明者らは、本発明の弱毒化ウイルス（筋肉内経路又は口鼻経路のいずれかによって）を接種した動物におけるＡＳＦウイルスに特異的な細胞応答、本発明の弱毒化ウイルスＡＳＦＶ－９８９を接種した動物における血清変換及びウイルス血症が、Ｇｅｏｒｇｉａ２００７／１株を接種した動物におけるよりも１００～１０００倍低いことを示した。興味深いことに、ＡＳＦＶ－９８９の接種の２週間後すぐにＧｅｏｒｇｉａ株でチャレンジした後、動物はＡＳＦ関連症状を示さず、本発明の弱毒化ウイルスで予め免疫化した動物においてこの株についてウイルス血症は検出されなかった。更に、Ｇｅｏｒｇｉａ株のゲノムは、筋肉内経路を介して本発明の弱毒化ウイルスで予め免疫化された動物の組織において検出されなかった。

【0023】

更に、本出願人は、本発明の弱毒化ＡＳＦＶ ａＳＦＶと対応する非弱毒化ＡＳＦＶとの示差検出のための分子的方法を開発した。

【0024】

したがって、第１の態様において、本発明は、弱毒化アフリカ豚熱（ＡＳＦ－９８９）ウイルスであって、対応する非弱毒化ウイルスのゲノムと比較して、
遺伝子ＭＧＦ３６０－１２Ｌ、３６０－１３Ｌ、３６０－１４Ｌ、５０５－２Ｒ、５０５－３Ｒが、遺伝子が転写及び／又は翻訳されないように、欠失、中断、又は変異しており、
ＡＳＦＶ＿Ｇ＿ＡＣＤ＿００５２０のＯＲＦが、転写及び／又は翻訳されないように、欠失、中断、又は変異しており、
遺伝子ＭＧＦ５０５－１Ｒ及び５０５－４Ｒが、短縮している。

【0025】

「対応する非弱毒化ウイルスのゲノム」は、本明細書において、上記に列挙された改変を含まない対応するウイルス由来のゲノムを指す。それは、Ｇｅｏｒｇｉａ２００７／１の系統、例えば、Ｐｉｇ／ＨＬＪ／２０１８（非特許文献２（［３］））、ＡＳＦＶ－ＳＹ１８（非特許文献２（［３］））、Ｃｈｉｎａ／２０１８／ＡｎｈｕｉＸＣＧＱ（非特許文献３（［４］））、ＡＳＦＶ／ＰＯＬ／２０１５／Ｐｏｄｌａｓｋｉｅ（非特許文献
４（［５］））、Ｏｄｉｎｔｓｏｖｏ ２／２０１４、Ｋａｓｈｉｎｏ ０４／１３、ＡＳＦＶ－Ｂｅｌｇｉｕｍ２０１８／１（非特許文献５（［６］））又はＡＳＦＶ／Ｋｙｉｖ／２０１６／１３１（非特許文献６（［７］））、遺伝子型ＩＩのＡＳＦウイルス株、又は遺伝的に近いＡＳＦウイルス株、から選択される毒性ＡＳＦウイルス株であり得る。

【0026】

本発明によれば、欠失は、当業者に公知の任意の手段によって行われ得る。欠失は、各遺伝子又はＯＲＦの少なくとも一部が除去された変異であってもよい。遺伝子又はＯＲＦが転写及び／又は翻訳されない限り、単一塩基から遺伝子又はＯＲＦ全体まで、任意の数のヌクレオチドを欠失させることができる。好ましくは、全遺伝子及びＯＲＦが欠失している、すなわち、
遺伝子ＭＧＦ３６０－１２Ｌ、３６０－１３Ｌ、３６０－１４Ｌ、５０５－２Ｒ、５０５－３Ｒが完全に欠失しており、
ＡＳＦＶ＿Ｇ＿ＡＣＤ＿００５２０のＯＲＦが完全に欠失している。

【0027】

本発明によれば、中断は、当業者に知られている任意の手段によって行われ得る。それは、例えば、遺伝子のＡＴＧ開始コドンを欠失させるか、若しくは他の方法での改変、又は翻訳開始部位の改変、又はフレームシフト、又は遺伝子のオープンリーディングフレームにおける１つ以上の終止コドンの導入によるものであり得る。

【0028】

本発明によれば、変異は、当業者に公知の任意の手段によって、例えば、１～数個のヌクレオチドに影響を及ぼす遺伝子の構造の変化によって行われ得る。それは、置換変異、すなわち少なくとも１つのヌクレオチドの別のヌクレオチドによる置換、又は挿入変異、すなわち１つ以上のヌクレオチドの付加、又は欠失変異、すなわち１つ以上のヌクレオチドの喪失、又は逆位変異、すなわち２つの隣接するデオキシリボヌクレオチドの置換であってもよい。いずれの場合も、変異は、発現されるために、最初のヌクレオチドによって与えられるものとは異なるアミノ酸をコードするコドンを与える１つ以上のヌクレオチドによる置換であり、さもなければ変異はサイレントであると言われる。いずれの場合においても、変異は、遺伝子が転写及び／又は翻訳されないようにし得る。

【0029】

本発明によれば、「転写及び／又は翻訳されない」という句は、対応する遺伝子又はＯＲＦの全てにおいて転写及び／又は翻訳がないことを意味する。

【0030】

本発明によれば、切断は、遺伝子の任意の部分の欠失であってもよく、当業者に公知の任意の手段によって、例えば、少なくとも１つの遺伝子に点ナンセンス変異、すなわち、未成熟終止コドンをもたらし、短縮された不完全な、任意選択で非機能的なタンパク質産物をもたらすＤＮＡ配列における点変異を挿入することによって行われてもよい。好ましくは、ＭＧＦ５０５－１Ｒ遺伝子の始まりの開始コドンＡＴＧ及びＭＧＦ５０５－４Ｒ遺伝子の終わりの停止コドンは維持され、したがって短縮部分の一部ではない。この場合、ＭＧＦ５０５－１Ｒ及び５０５－４Ｒ遺伝子の２つの部分は、２つのより短いタンパク質１Ｒ及び４Ｒを形成する。

【0031】

実施形態では、
遺伝子ＭＧＦ３６０－１２Ｌ、３６０－１３Ｌ、３６０－１４Ｌ、５０５－２Ｒ、５０５－３Ｒが欠失しており、
ＡＳＦＶ＿Ｇ＿ＡＣＤ＿００５２０のＯＲＦが欠失しており、
遺伝子ＭＧＦ５０５－１Ｒ及び５０５－４Ｒが短縮しており、ＭＧＦ５０５－１Ｒ遺伝子の始めの開始コドンＡＴＧ及び
ＭＧＦ５０５－４Ｒ遺伝子の終わりの終止コドンが維持され、
Ｇｅｏｒｇｉａ２００７／１株（ＦＲ６８２４６８．２）のゲノムと比較して、７４５８ヌクレオチドが欠失している。本の実施形態では、ＭＧＦ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号１である。欠失領域の７４５８ヌクレオチド配列は配列番号２として示され、Ｇｅｏｒｇｉａ株２００７／１のＭＧＦ遺伝子ヌクレオチド配列は配列番号３である。

【0032】

本発明の弱毒化ＡＳＦウイルスは、定方向変異誘発によって、例えば相同組換え又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によって得ることができる。あるいは、本発明の弱毒化ＡＳＦウイルスは、以下に記載されるような毒性ＡＳＦＶウイルス株の熱弱毒化によって得ることができる。したがって、本発明の別の目的は、本発明の弱毒化ＡＳＦウイルスを得るためのインビトロ方法であって、対応する非弱毒化ウイルスのゲノムと比較して、
遺伝子ＭＧＦ３６０－１２Ｌ、３６０－１３Ｌ、３６０－１４Ｌ、５０５－２Ｒ、５０５－３Ｒを、遺伝子が転写及び／又は翻訳されないように、欠失、又は中断、又は変異させる工程と、
ＡＳＦＶ＿Ｇ＿ＡＣＤ＿００５２０のＯＲＦを、転写及び／又は翻訳されないように、欠失、中断、又は変異させる工程と、
ＭＧＦ５０５－１Ｒ及び５０５－４Ｒを短縮させる工程とを含む方法である。

【0033】

明らかに、定方向変異誘発プロセスにおいて実施される任意の古典的な工程、例えば、ＰＣＲ、クローニング、配列分析、及び増幅を、本発明のプロセスの一部として実施することができる。この目的のために、それは、非特許文献１又はＲａｔｈａｋｒｉｓｈｎａｎ Ａらによって記載されるようなプロセスであり得る（非特許文献７（［８］））。

【0034】

好ましくは、既に上述したように、
遺伝子ＭＧＦ３６０－１２Ｌ、３６０－１３Ｌ、３６０－１４Ｌ、５０５－２Ｒ、５０５－３Ｒが欠失しており、
ＡＳＦＶ＿Ｇ＿ＡＣＤ＿００５２０のＯＲＦが欠失している。

【0035】

あるいは、
遺伝子ＭＧＦ３６０－１２Ｌ、３６０－１３Ｌ、３６０－１４Ｌ、５０５－２Ｒ、５０５－３Ｒが、遺伝子が転写及び／又は翻訳されないように中断しており、
ＡＳＦＶ＿Ｇ＿ＡＣＤ＿００５２０のＯＲＦが、転写及び／又は翻訳されないように中断している。

【0036】

本発明の更に別の目的は、本発明の弱毒化ＡＳＦウイルスを得るためのインビトロ方法であって、Ｇｅｏｒｇｉａ２００７／１、Ｐｉｇ／ＨＬＪ／２０１８、遺伝子型ＩＩのＡＳＦウイルス株、又は遺伝的に近いＡＳＦウイルス株の中から選択される毒性ＡＳＦＶウイルス株の熱弱毒化、当該弱毒化ＡＳＦウイルスの増幅及び選択のうち少なくとも１つの工程を含む方法を提供することである。

【0037】

有利には、熱弱毒化は、１つ以上の工程で実現することができ、したがって、連続プロセス又は不連続プロセスである。毒性ＡＳＦＶウイルス株は、熱弱毒化の各工程の持続時間に応じて、５５～６５℃の範囲の温度に供され得る。当業者は、その一般的な知識を考慮して、及び配列分析によって本発明のウイルスの取得を検証することによって、熱不活性化の持続時間に従って温度を変化させることができる。

【0038】

増幅及び選択の工程は、当業者によって一般的に使用される方法によって、例えば、弱毒化ウイルスを増幅するための特定病原体除去ブタ（感染に対して非常に弱いことが知られる）の接種、及びそれを選択するための配列分析によって実現され得る。

【0039】

本発明のウイルスは、上記のように、特異的変異誘発又は熱不活性化によって得られるかどうかにかかわらず、いかなるレポーター遺伝子も含まない。これは、ワクチン又は医薬組成物にＧＭＯ状態を付与するそのようなレポーター遺伝子、特にＧＵＳ又はｐ７２－
ｃｈｅｒｒｙを含有する先行技術の弱毒化ウイルスを超える利点である。

【0040】

別の態様では、本発明は、本発明の弱毒化ＡＳＦウイルスを含むワクチンを提供する。

【0041】

本明細書で使用される「ワクチン」という用語は、対象に投与された場合、ワクチンが送達された動物において防御免疫応答を誘導又は刺激する調製物を指す。ワクチンは、生物を特定の疾患（この場合はＡＳＦ）に対して免疫化することができる。従って、本発明のワクチンは、対象において免疫応答を誘導し、これは、その後のＡＳＦウイルスチャレンジに対して防御的である。したがって、ワクチンは、ワクチン接種された動物においてアフリカ豚熱ウイルスを予防するのに有用であり得る。用語「予防」という用語は、ＡＳＦの感染を回避、遅延、妨害、又は遅延することを指すことを意図する。ワクチンは、例えば、感染性ＡＳＦＶが細胞に侵入する可能性、疾患の臨床症状の発生及び死亡を予防又は低減し得る。一実施形態において、ワクチンは、上記弱毒化ＡＳＦウイルスの異なる株を含んでもよい。このようなワクチンは、複数のＡＳＦウイルス株に対して交差防御免疫応答を誘導することができる。

【0042】

本発明のワクチンは、医薬組成物の形態であってもよい。

【0043】

本発明のワクチン又は医薬組成物は、本発明の弱毒化ＡＳＦウイルスと、任意選択で、本発明の分野で一般的に使用される１つ以上のアジュバント、賦形剤、担体、及び希釈剤とを含んでもよい。

【0044】

担体は、安定剤、保存剤、及び緩衝剤を含んでもよい。適切な安定剤は、例えば、ＳＰＧＡ（スクロース、ホスフェート、グルタメート、及びヒトアルブミン）、炭水化物（ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストラン、グルタメート、又はグルコースなど）、タンパク質（乾燥乳清、アルブミン、又はカゼインなど）又はそれらの分解産物である。好適な緩衝剤は、例えばアルカリ金属リン酸塩である。適切な保存剤は、チメロサール、メルチオレート、及びゲンタマイシンである。希釈剤としては、水、水性緩衝液（例えば、緩衝化生理食塩水）、アルコール、及びポリオール（例えば、グリセロール）が挙げられる。

【0045】

好ましくは、医薬品としての本発明の組成物は、免疫アジュバントを更に含むことができる。これらのアジュバントは、有効量の本発明による生弱毒化ＡＳＦＶと混合した場合に、組成物の抗原力を増大させ、より大きな免疫反応を促進することができる限り、当業者にとって公知の任意のタイプのものであってよい。

【0046】

本発明によるワクチン又は医薬組成物は、市販の弱毒化ウイルスワクチンに一般的に使用される方法などの従来の方法によって調製することができる。簡単に説明すると、感受性基質に本発明のＡＳＦウイルスを接種し、ウイルスが所望の力価に複製するまで増殖させ、その後、ウイルス含有材料を採取する。続いて、採取された物質は、免疫特性を有する薬学的調製物に製剤化される。

【0047】

別の態様では、本発明は、対象におけるアフリカ豚熱ウイルスの予防に使用するための、本発明による弱毒化ＡＳＦウイルス又は本発明によるワクチンを提供する。

【0048】

有利には、本発明の弱毒化ＡＳＦウイルス又はワクチンは、対象において、毒性ＡＳＦＶウイルス株Ｇｅｏｒｇｉａ２００７／１又は他の遺伝的に近いＡＳＦウイルス株に対する防御免疫応答を誘導することができる。

【0049】

好ましくは、ワクチン又は弱毒化ＡＳＦウイルスは、プライムレジメンに対応する単回
用量として投与されてもよい。あるいは、本発明のワクチンは、数回の用量で投与され得る。

【0050】

本発明のワクチンは、任意の好都合な経路によって、特に口鼻経路及び非経口経路の中から選択される経路、特に筋肉内経路によって投与され得る。一実施形態において、経口投与は、ワクチンを動物飼料又は飲料水に添加することを含む。別の実施形態では、ワクチンは、野生動物用の餌、例えば、野生のイノシシ、野生のブタ、カワイノシシ、又はイボイノシシに適した餌に添加されてもよい。好ましくは、投与は口鼻経路によるプライム投与である。

【0051】

本発明は更に、有効量の弱毒化ＡＳＦウイルスを、それを必要とする対象に投与する工程を含む、対象のアフリカ豚熱ウイルスを予防する方法を提供する。

【0052】

別の態様において、本発明は、本発明の弱毒化ＡＳＦウイルス及び対応する非弱毒化ＡＳＦウイルスの、試料中での示差検出のインビトロ方法であって、各株に特異的なプライマー／プローブのセットを用いたＰＣＲなどの分子的方法によって核酸鎖の示差増幅を行うことを含み、配列：
Ｄｅｌ＿Ｆｏｗ ＴＧＣＴＴＴＣＡＡＧＣＣＴＡＣＡＡＣＴＣＣ（配列番号４）、
Ｄｅｌ＿Ｒｅｖ ＡＴＴＣＴＣＡＧＧＧＣＣＴＣＡＴＴＧＧＴ（配列番号５）、及び
Ｄｅｌ＿Ｐｒｏｂｅ ＡＧＣＧＡＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＧＣＣＡＣＣ（配列番号６）のプライマー／プローブは、弱毒化ＡＳＦウイルスの特異的増幅を可能にする一方、配列：
５０５＿３Ｒ＿Ｌ１ ＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＴＴＣＣＣＴ（配列番号７）
５０５＿３Ｒ＿Ｒ１ ＡＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣＡＴＧＡＣＡＡＣＡ（配列番号８）、及び
５０５＿３Ｒ＿Ｐ１ ＣＣＣＴＴＣＣＧＡＴＧＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号９）のプライマー／プローブが、前記対応する非弱毒化ＡＳＦウイルスの特異的増幅を可能にする、方法を提供する。

【0053】

示差増幅は、この技術分野で通常使用される実験条件下で実現することができる。

【0054】

有利には、本発明の方法は、非弱毒化ＡＳＦウイルスに感染した動物を、本発明の弱毒化ＡＳＦウイルスでワクチン接種された動物と区別することを可能にする。

【0055】

本方法において使用される動物の試料は、ウイルスが検出され得る任意の試料（例えば、血液試料、又は脾臓、扁桃腺、若しくはリンパ節のような組織試料）であり得る。

【0056】

本発明の更なる目的は、ワクチン接種された動物と非弱毒化ＡＳＦウイルスに感染した動物とを区別することができ、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６のうちの少なくとも１つの配列からなる遺伝子マーカーを提供することである。

【0057】

本発明は、限定として解釈されるべきではない添付図面を参照して、以下の実施例によって更に説明される。

【図面の簡単な説明】

【0058】

【図1】欠失部位におけるＧｅｏｒｇｉａ２００７／１ゲノムとＡＳＦＶ－９８９ゲノムとの比較を表す。

【図2】ブタ肺胞マクロファージにおけるＧｅｏｒｇｉａ２００７／１株及びＡＳＦＶ－９８９株のウイルス複製を表す（力価（Ｌｏｇ１０ ＨＡＤ５０／ｍｌ）、時間（接種後日数））。

【図3】Ｇｅｏｒｇｉａ２００７／１株を検出するＰＣＲ５０５（Ｌ１、Ｐ１、及びＲ１）及びＡＳＦＶ－９８９を検出するＰＣＲ９８９（Ｄｅｌ＿Ｆｏｗ、Ｄｅｌ＿Ｐｒｏｂｅ、及びＤｅｌ＿Ｒｅｖ）のプライマー及びプローブの位置を示す。

【図4】Ｇｅｏｒｇｉａ株又はＡＳＦＶ－９８９株でのＩＭ免疫化後の直腸温度（℃）の進展を表す（免疫化後の日数での時間）。対照：Ａ１群からのデータ；９８９ ＩＭ：Ｃ及びＤ群からのデータ；Ｇｅｏ ＩＭ：Ｅ群からのデータ

【図5】Ｇｅｏｒｇｉａ株又はＡＳＦＶ－９８９株でのＩＭ接種後（接種後日数での時間）のブタ生存率（％）を表す。対照：Ａ１群からのデータ；９８９ ＩＭ：Ｃ及びＤ群からのデータ；Ｇｅｏ ＩＭ：Ｅ群からのデータ

【図6】Ｇｅｏｒｇｉａ株又はＡＳＦＶ－９８９株でのＩＭ接種後の成長成績の進展を表す。接種後の平均１日体重増加（Ｋｇ／Ｄ）対照：群Ａ１及びＡ２からのデータ；９８９ ＩＭ：Ｃ及びＤ群からのデータ；Ｇｅｏ ＩＭ：Ｅ群からのデータ。

【図7】Ｇｅｏｒｇｉａ株又はＡＳＦＶ－９８９株でのＯＮ免疫化後の直腸温度（℃）の進展を日数で表す。対照：Ａ１群からのデータ；９８９ ＯＮ：Ｂ、Ｈ、及びＩ群からのデータ；Ｇｅｏ ＯＮ：Ｆ群からのデータ。

【図8】Ｇｅｏｒｇｉａ株又はＡＳＦＶ－９８９株をＯＮ接種した後のブタ生存率（％）を日数で表す。対照：Ａ１群からのデータ；９８９ ＯＮ：Ｂ、Ｈ、及びＩ群からのデータ；Ｇｅｏ ＯＮ：Ｆ群からのデータ。

【図9】Ｇｅｏｒｇｉａ株又はＡＳＦＶ－９８９株でのＯＮ接種後の成長成績（平均１日体重増加（Ｋｇ／Ｄ））の進展を表す。対照：Ａ１及びＡ２群からのデータ；９８９ ＯＮ：Ｂ、Ｈ、及びＩ群からのデータ；Ｇｅｏ ＯＮ：Ｆ群からのデータ。

【図10】Ｇｅｏｒｇｉａ株又はＡＳＦＶ－９８９株での接種後のＡＳＦＶウイルス血症（Ｌｏｇ１０ ｅｑ ＨＡＤ５０／ｍｌ）の進展（接種後日数）を表す。Ｇｅｏ ＩＭ：Ｅ及びＦ群からのデータ；Ｇｅｏ ＯＮ：Ｆ及びＪ群からのデータ；９８９ ＩＭ：Ｃ及びＤ群からのデータ；９８９ ＯＮ：Ｂ、Ｈ、及びＩ群からのデータ。

【図11】ＡＳＦＶ－９８９株での接種後のＡＳＦＶウイルス血症（ＰＣＲ９８９、Ｌｏｇ１０ ｅｑ ＨＡＤ５０／ｍｌ）の進展（日数）を表す。９８９ ＩＭ：Ｃ及びＤ群からのデータ；９８９ ＯＮ：Ｂ、Ｈ、及びＩ群からのデータ。

【図12】Ｇｅｏｒｇｉａ株又はＡＳＦＶ－９８９株での接種後の抗体応答（ＥＬＩＳＡによって検出、競合％）（接種後日数）を表す。９８９ ＩＭ：Ｃ群からのデータ；９８９オン：Ｂ群からのデータ；Ｇｅｏ ＩＭ：Ｅ群からのデータ；Ｇｅｏ ＯＮ：Ｆ群からのデータ。

【図13】ＡＳＦＶ－９８９株での接種後の特異的細胞媒介性応答（ＩＦＮｇ分泌細胞の数／１０^６ＰＢＭＣ）を表す。９８９ ＩＭ：Ｃ及びＤ群からのデータ；９８９ ＯＮ：Ｂ、Ｈ、及びＩ群からのデータ。

【図14】Ｇｅｏｒｇｉａ ＡＳＦＶ株でのＩＭチャレンジ後の直腸温度（℃）の進展を表す（チャレンジ後の日数）。対照：Ａ２群からのデータ；９８９ ＩＭ／Ｇｅｏ ＩＭ：Ｄ群からのデータ；９８９ ＯＮ／Ｇｅｏ ＩＭ：Ｉ群からのデータ；Ｇｅｏ ＩＭ：Ｇ群からのデータ。

【図15】Ｇｅｏｒｇｉａ ＡＳＦＶ株でのＯＮチャレンジ後の直腸温度（℃）の進展を表す（チャレンジ後の日数）。対照：Ａ２群からのデータ；９８９ ＯＮ／Ｇｅｏ ＯＮ：Ｈ群からのデータ；Ｇｅｏ ＯＮ：Ｊ群からのデータ。

【図16】Ｇｅｏｒｇｉａ ＡＳＦＶ株でのチャレンジ後（チャレンジ後の日数）の成長成績（平均１日体重増加（Ｋｇ／Ｄ））の進展を表す。対照：Ａ１及びＡ２群からのデータ；９８９ ＩＭ／Ｇｅｏ ＩＭ：Ｄ群からのデータ；９８９ ＯＮ／Ｇｅｏ ＯＮ：Ｈ群からのデータ；９８９ ＯＮ／Ｇｅｏ ＩＭ：Ｉ群からのデータ；Ｇｅｏ ＩＭ：Ｇ群からのデータ；Ｇｅｏ ＯＮ：グループＪ群からのデータ。

【図17】ＡＳＦＶ－９８９株でのＩＭ又はＯＮ接種後、及び２週間後に同じ経路でＧｅｏｒｇｉａ ＡＳＦＶ株でのチャレンジ後の直腸温度（℃）の進展を日数で表す。対照：Ａ３群からのデータ；９８９ ＯＮ／Ｇｅｏ ＯＮ－１４：Ｌ群からのデータ；９８９ ＩＭ／Ｇｅｏ ＩＭ－１４：Ｋ群からのデータ。

【図18】ＡＳＦＶ－９８９株でのＩＭ又はＯＮ接種後、及び２週間後に同じ経路でＧｅｏｒｇｉａ ＡＳＦＶ株でのチャレンジ後の成長成績（平均１日体重増加（Ｋｇ／Ｄ））の進展を表す。対照：Ａ３群からのデータ；９８９ ＯＮ／Ｇｅｏ ＯＮ－１４：Ｌ群からのデータ；９８９ ＩＭ／Ｇｅｏ ＩＭ－１４：Ｋ群からのデータ。

【図19】ＡＳＦＶ－９８９株でのＩＭ又はＯＮ接種後、及び２週間後に同じ経路でＧｅｏｒｇｉａ ＡＳＦＶ株でのチャレンジ後のＡＳＦＶウイルス血症（ＰＣＲ９８９、Ｌｏｇ１０ ｅｑ ＨＡＤ５０／ｍｌ）の進展を日数で表す。９８９ ＯＮ／Ｇｅｏ ＯＮ－１４：Ｌ群からのデータ；９８９ ＩＭ／Ｇｅｏ ＩＭ－１４：Ｋ群からのデータ。

【実施例】

【0059】

実施例１：ＡＳＦＶ－９８９株の調製及びインビボでの特徴付け
１．材料及び方法
１．１ウイルス及び細胞
Ｇｅｏｒｇｉａ起源の家畜ブタから２００７年に最初に単離されたＧｅｏｒｇｉａ２００７／１ ＡＳＦＶ株は、Ｄｒ．Ｌｉｎｄａ Ｄｉｘｏｎ（ＯＩＥ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｉｒｂｒｉｇｈｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、英国）によって快く提供された。ＰＰＡ／ｄｐ／ＦＲ－２２／２０１８／１８０１７２－２ ＡＳＦＶ株（以後、ＡＳＦＶ－９８９（又は「９８９」）と称する）は、熱弱毒化ＡＳＦＶ Ｇｅｏｒｇｉａ２００７／１株を接種した特定病原体除去（ＳＰＦ）ブタから採取した血液試料から単離した。Ｇｅｏｒｇｉａ２００７／１株及びＡＳＦＶ－９８９株をブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）上でそれぞれ３継代及び１継代培養した後、ブタに接種した。ウイルスをＲＰＭＩ培地中で希釈して、接種用量を筋肉内（ＩＭ）接種についてはブタ当たり１０^３の血液吸着用量５０％（ＨＡＤ５０）に、口鼻（ＯＮ）接種についてはブタ当たり１０^４のＨＡＤ５０に調整した。ウイルス力価測定は、赤血球吸着アッセイによって実施した（非特許文献８（［９］））。

【0060】

１．２全ゲノム配列決定
高純度ＰＣＲテンプレート調整キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、フランス、メラン）を用いてＡＳＦＶ－９８９株からＤＮＡを抽出した。実験室調製のために、Ｉｏｎ Ｘｐｒｅｓｓ Ｐｌｕｓ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国メリーランド州フレデリック）を使用し、２５０ｂｐ～２９０ｂｐのＤＮＡ断片をＩｏｎ Ｘｐｒｅｓｓ Ｂａｒｃｏｄｅ
Ａｄａｐｔｅｒｓ １－９６キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国メリーランド州フレデリック）でサイズ選択した。ＤＮＡ精製工程のために、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、フランス、ヴィルパント）からの磁気ビーズを使用した。全ての試料を、Ｐｒｏｔｏｎ Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国メリーランド州フレデリック）を用いて配列決定した。リードを、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃを使用してクリーニングした（非特許文献９（［１０］））０．３６ソフトウェア（ＩＬＬＵＭＩＮＡＣＬＩＰ：ｏｌｉｇｏｓ．ｆａｓｔａ：２：３０：５：１：ｔｒｕｅ；ＬＥＡＤＩＮＧ：３；ＴＲＡＩＬＩＮＧ：３；ＭＡＸＩＮＦＯ：４０：０．２；ＭＩＮＬＥＮ：３６）。次いで、ｂｗａ（非特許文献１０（［１１］））（バージョン２．２．５）アライメントを、クリーンリード対ＮＣＢＩ参照ＦＲ６８２４６８．２を用いて行った。コンセンサス配列を、ｓａｍｔｏｏｌｓを用いて作製した（非特許文献１１（［１２］））（バージョン１．８）及びｓｅｑｔｋ（バージョン１．２）（https://qithub.com/lh3/seqtk）

【0061】

１．２インビボ試験
６５匹の特定病原体除去（ＳＰＦ）大ヨークシャー種ブタ（６週齢）を、表１に記載される３つの試験において使用した。Ｌａｃａｓｔａらによって報告されたように（非特許
文献１２）、本発明者らのＳＰＦブタは、ＡＳＦＶ感染に特に感受性が高く、家畜ブタにおいて弱毒化されることが示されているＡＳＦＶ株についての臨床徴候を発現し得る。この感受性は、それらのＰＲＲの低い多型及びそれらの先天性免疫系の低い刺激／成熟に関連し得る。試験＃１及び試験＃２において、ブタの群にＡＳＦＶ－９８９又はＧｅｏｒｇｉａ株を０日目に筋肉内（ＩＭ）又は口鼻（ＯＮ）経路のいずれかによって接種した。ＡＳＦＶ－９８９株を接種した群のうち、２群は未チャレンジのままであった（９８９ ＯＮ及び９８９ ＩＭ長期：ＬＴ）が、他の群はＡＳＦＶ－９８９接種の２８日後にＧｅｏｒｇｉａ株でチャレンジした。対照ブタ（非免疫、未チャレンジ）も各試験に含めた。試験＃３では、ＡＳＦＶ－９８９接種によって誘導される防御の開始を評価するために、免疫化の１４日後に、最初の接種（ＩＭ又はＯＮ）と同じ経路で行われたチャレンジを用いて、Ｇｅｏｒｇｉａ株でブタをチャレンジした。

【0062】

【表1】

【0063】

ブタを個々に同定し、ブタの各群を、Ａｎｓｅｓ－Ｐｌｏｕｆｇａｎａｎの空気濾過バイオセーフティレベル３の動物施設の別々の部屋に収容した。全てのブタを直腸温度及びＡＳＦＶ感染の臨床徴候について毎日監視し、週に１回体重を測定した。血液試料を、接種又はチャレンジの前に、次いで、接種／チャレンジ後の最初の２週間の間に週２回、そして最後にフォローアップの残りの間に週１回、収集した。血液を、ＥＬＩＳＰＯＴ ＩＦＮｇ及びウイルス単離のためのリチウムヘパリン、ＡＳＦＶゲノム検出のためのＥＤＴＡを含むチューブ、並びに抗体検出のための血清を得るための乾燥チューブに収集した。実験の終わりに、又は動物愛護の理由でより早い段階で、ブタを麻酔薬過剰投与によって屠殺し、次いで放血させた。

【0064】

倫理声明
動物実験は、フランス研究省（プロジェクト番号２０１９０３０４１８４４５７３１）によって認可され、国家倫理委員会（認可番号１９－０１８＃１９５８５）によって承認された。

【0065】

ウイルス学的及び免疫学的アッセイ
リアルタイムＰＣＲ：接種後第１週の間のＡＳＦＶウイルス血症の評価（図１０）を、
以前に記載されたようにリアルタイムＰＣＲによって（非特許文献１３（［１３］））、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）８ウイルス（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して、１００ｐＬのＥＤＴＡ血液試料から抽出したＤＮＡを使用して行った。ブタβ－アクチンをブタ試料からのＤＮＡ抽出の内部対照として使用した。ＡＳＦＶ－９８９ウイルス血症の長期フォローアップ（図１１）、及び免疫化し、次いでチャレンジしたブタにおけるＡＳＦＶ－９８９又はＧｅｏｒｇｉａゲノムの特異的検出（表２、３及び４）を、結果部分に記載した方法に従ってＰＣＲ９８９及びＰＣＲ５０５を用いてそれぞれ行った。

【0066】

ＥＬＩＳＡ：ＡＳＦＶのタンパク質Ｐ３２に対する抗体を、製造業者の説明書に従って競合ＥＬＩＳＡキット（ＩＤ Ｓｃｒｅｅｎ ＡＳＦＶ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ、ＩＤＶＥＴ、フランス）を使用して血清中で測定した。

【0067】

ＥＬＩＳＰＯＴ：ＡＳＦＶ特異的ＩＦＮｇ分泌細胞（ＩＦＮｇ－ＳＣ）を、以前に記載されたように（非特許文献１４（［１４］））、Ｇｅｏｒｇｉａ株について０．２の感染多重度を有するＰＢＭＣ４×１０^５の１６時間ＡＳＦＶ刺激を使用して定量した。ウェル当たりのスポット数を、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ６ ＵＶアナライザ（ＣＴＬ、米国オハイオ州シェーカーハイツ）を使用して計数した。

【0068】

２．結果
２．１ゲノム配列及びインビトロ特徴付け
＋ＡＳＦＶ－９８９株の全ゲノム配列
ＡＳＦＶ－９８９株は、熱弱毒化ＡＳＦＶ Ｇｅｏｒｇｉａ株を接種したＳＰＦブタ（ブタ番号９８９）から採取した血液試料から単離した。ＡＳＦＶ－９８９株をＰＡＭ上で更に１回増幅し、全ゲノム配列決定に供した。ＡＳＦＶ－９８９及びＧｅｏｒｇｉａ完全ゲノム配列（ＦＲ６８２４６８．２）の比較により、ＡＳＦＶ－９８９株について、ＭＧＦ５０５－１Ｒ及び５０５－４Ｒの部分欠失並びに３６０－１２Ｌ、３６０－１３Ｌ、３６０－１４Ｌ、５０５－２Ｒ、５０５－３Ｒ、及びＡＳＦＶ＿Ｇ＿ＡＣＤ＿００５２０の完全欠失に対応する７４５８ヌクレオチド（ヌクレオチド位置２９４３９と３６８９８との間の）の欠失が明らかになった。図１

【0069】

＋ＡＳＦＶ－９８９及びＧｅｏｒｇｉａ株のインビトロ複製
ＡＳＦＶ－９８９株のインビトロ複製をその親株Ｇｅｏｒｇｉａと比較して特徴付けるために、ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）を両方の株に感染させ、複製動態を４日間追跡した。図２に示されるように、複製動態は、ＡＳＦＶ－９８９株及びＧｅｏｒｇｉａ株について同様であり、接種後０日目から２日目にウイルス力価が増加し、続いて２日目から４日目はプラトーであった。

【0070】

＋ＡＳＦＶ－９８９及びＧｅｏｒｇｉａ株を検出するための特異的ＰＣＲ系の設計
生物学的試料中のＡＳＦＶ－９８９又はＧｅｏｒｇｉａ株を特異的に検出することができるＰＣＲツールを有するために、本発明者らは、これらの株の各々についてのＰＣＲシステムを設計した。ＰＣＲ５０５は、以下の５０５＿３Ｒ＿Ｌ１ ＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＴＴＣＣＣＴ（配列番号７）、５０５＿３Ｒ＿Ｒ１ ＡＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣＡＴＧＡＣＡＡＣＡ（配列番号８）及び５０５＿３Ｒ＿Ｐ１ ＣＣＣＴＴＣＣＧＡＴＧＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号９）のようなプライマー及びプローブ配列を用いて、Ｇｅｏｒｇｉａ株のＭＧＦ５０５－３Ｒ遺伝子を標的としている。ＰＣＲ９８９は、ＭＧＦ５０５－１Ｒの近位部分とＭＧＦ５０５－４Ｒの遠位部分との融合から生じる９８９株のキメラ遺伝子を標的としている（図３）。ＰＣＲ９８９のプライマー及びプローブ配列は以下の通りである。Ｄｅｌ＿Ｆｏｗ ＴＧＣＴＴＴＣＡＡＧＣＣＴＡＣＡＡＣＴＣＣ（配列番号４）、Ｄｅｌ＿Ｒｅｖ ＡＴＴＣＴＣＡＧＧＧＣＣＴＣＡＴＴＧＧＴ（配列番号５）及びＤｅｌ＿Ｐｒｏｂｅ ＡＧＣＧＡＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＧＣＣＡＣＣ（配列番号６）。

【0071】

最初に、本発明者らは、ＰＣＲ５０５がＧｅｏｒｇｉａ株を検出するがＡＳＦＶ－９８９株を検出しないこと、及びＰＣＲ９８９がＡＳＦＶ－９８９株を検出するがＧｅｏｒｇｉａを検出しないことを確認した。標準範囲のＡＳＦＶ－９８９又はＧｅｏｒｇｉａ株を使用して、本発明者らは、各ＰＣＲについてＰＣＲ効率、直線性、及び定量限界を判定した。両方のＰＣＲは、１０Ｅ３．８当量ＨＡＤ_５０／ｍｌの定量限界を有する、９０％より高い有効性、非常に良好な線形性（５つの希釈物について０．９９より高いＲ^２）を示した。

【0072】

２．２ Ｇｅｏｒｇｉａ株と比較した、ＡＳＦＶ－９８９株接種に対する毒性及び免疫応答のインビボ特徴付け
ＡＳＦＶ－９８９株を接種したブタにおいて誘導された毒性レベル及び免疫反応を特徴付けるために、本発明者らは、ＡＳＦＶ－９８９株又はＧｅｏｒｇｉａ株のいずれかを筋肉内（ＩＭ）経路又は口鼻（ＯＮ）経路によってブタに接種した３つのインビボ試験を行った。（表１）

【0073】

第１の工程において、本発明者らは、ＯＮ又はＩＭ経路によってＡＳＦＶ－９８９株を接種されたブタについての臨床的、ウイルス学的、及び免疫学的パラメータを、同じ経路によって毒性Ｇｅｏｒｇｉａ株を投与したブタと比較した。条件当たりのブタの数を増加させるために、異なる実験群からのデータをまとめた。各条件に対応する実験群を各図に記載する。

【0074】

＋臨床及び動物実験データ
－筋肉内接種：
Ｇｅｏｒｇｉａ株のＩＭ接種後、感染したブタ（Ｇｅｏ ＩＭ：Ｅ群）は、接種後（ＰＩ）３日目に最初の高熱を示し、次いで、２日後に高熱のピークを示し（接種後５日目に４１．０±０．３℃、図４）、典型的なＡＳＦ関連症状を発症した。それらのブタは、接種後６日目に安楽死させなければならない（図５）。

【0075】

ＡＳＦＶ－９８９株を筋肉内接種したブタ（９８９ ＩＭ：Ｃ群及びＤ群）もまた、接種後３日目に最初の高体温を示したが、より低い高体温（接種後５日目に４０．２±０．６℃、図４）及び限定された症状を発症した。

【0076】

ＡＳＦＶ－９８９株をＩＭ接種した１１匹のブタのうち、２匹の動物のみが、ＡＳＦＶ－９８９接種後最初の２週間の間にＡＳＦ関連症状を発症し、安楽死させなければならなかった（図５）。ＩＭ ９８９接種ブタにおける直腸体温の上昇は、接種後２週間の間の成長成績の低下を伴った（図６）：接種後０日目／７日目間の平均１日体重増加（ＡＤＷＧ）：９８９ ＩＭについて０．３６±０．１２ｋｇ／Ｄ対対照について０．６４±０．１０ｋｇ／Ｄ、及び接種後７日目／１４日目間のＡＤＷＧ：９８９ ＩＭについて０．４１±０．２４ｋｇ／Ｄ対対照について０．６９±０．１６ｋｇ／Ｄ。

【0077】

－口鼻接種：
Ｇｅｏｒｇｉａ株のＯＮ接種の後、ブタ（Ｇｅｏ ＯＮ：Ｆ群）は、ＩＭ接種と同じ重度の症状を示し、接種後４日目に高体温のピーク（４１．０±０．４℃）を示した（図７）。全てのブタはまた、接種後６日目に安楽死させなければならなかった（図８）。一方、ＡＳＦＶ－９８９株（９８９ ＯＮ：Ｂ群、Ｈ群及びＩ群）をＯＮ接種したブタは、より低い発熱（接種後６日目に４０．６±０．５℃）を発症し（図７）、症状が限定され、全てのブタが感染を生き延びた（図８）。ＡＳＦＶ－９８９株をＯＮ接種したブタもまた、成長成績の低下を示した（接種後０日目／７日目間のＡＤＷＧ：９８９ ＯＮについて０．２７±０．１１ｋｇ／Ｄ対対照について０．６４±０．１０ｋｇ／Ｄ）が、接種後第１週の間のみであった（図９）。

【0078】

＋ウイルス学的データ
ＡＳＦＶ－９８９株の弱毒化性質を更に特徴付けるために、本発明者らは次に、感染の第１週の間にＩＭ又はＯＮ経路によって接種されたブタについて、Ｇｅｏｒｇｉａと比較してＡＳＦＶ－９８９株のウイルス血症レベルを評価した。図１０に示すように、ＡＳＦＶ－９８９株のウイルス血症レベルは、Ｇｅｏｒｇｉａ株よりも顕著に低く、ＡＳＦＶ－９８９株のウイルス量は１００分の１である。Ｇｅｏｒｇｉａ株をＩＭ接種したブタでは、接種後５日目のＡＳＦＶウイルス血症は８．５±０．２ｌｏｇ１０当量ＨＡＤ_５０／ｍｌであったが、ＡＳＦＶ－９８９株を同じ経路で接種した動物ではわずか５．９±０．３ｌｏｇ１０当量ＨＡＤ_５０／ｍｌであった。興味深いことに、ＡＳＦＶ－９８９株をＯＮ経路で接種されたブタは、ＩＭで接種されたブタよりも低いウイルス血症を示した（接種後５日目に、ＯＮ摂取経路について４．７±１．６ｌｏｇ１０当量ＨＡＤ_５０／ｍｌ対ＩＭ接種経路について５．９±０．３ｌｏｇ１０当量ＨＡＤ_５０／ｍｌ）。

【0079】

ＡＳＦＶ－９８９株（ＩＭ又はＯＮのいずれか）を接種したブタにおけるＡＳＦＶウイルス血症プロファイルをより正確に説明するために、本発明者らは、Ｂ群及びＣ群の動物について、９８９ ＰＣＲを用いて最大１００日間、ＡＳＦＶ－９８９株のウイルス血症を追跡した。図１１に示されるデータは、ＯＮ接種経路についてのウイルス血症のより低いレベル（接種後７日目に、ＩＭについて６．２±０．３ｌｏｇ１０当量ＨＡＤ_５０／ｍｌ対ＯＮについて５．５±０．４ｌｏｇ１０当量ＨＡＤ_５０／ＭＬ）、ＯＮ接種経路についてのウイルス血症のより早い消滅（接種後７６日目：ＯＮについて０／４ブタウイルス血症対ＩＭについて３／４依然ウイルス血症）を確認した。

【0080】

＋ＡＳＦＶ特異的免疫応答
－抗体応答
Ｇｅｏｒｇｉａ株の接種後、感染したブタは、安楽死させなければならなくなる前にＡＳＦ特異的抗体を発現しなかった。ＡＳＦＶ－９８９株を接種したブタについては、ＯＮ又はＩＭ接種したブタの両方が、接種後７日目と接種後１１日目の間血清変換が起こった（図１２）。

【0081】

－細胞媒介応答
ＡＳＦＶに特異的な細胞性免疫（ＣＭＩ）応答を、ＡＳＦＶ－９８９株をＩＭ又はＯＮ接種したブタの間でＥＬＩＳＰＯＴ ＩＦＮｇによって評価した。ＡＳＦＶウイルスに特異的なＣＭＩ応答は、接種後１３日目に早くも検出され、接種後２７日目に確認された（図１３）。ＣＭＩ応答のレベルは、ＩＭ群（接種後２７日目の３５±２３ＩＦＮｇ ＳＣ／１０Ｅ６ ＰＢＭＣ）と比較して、ＯＮ群（接種後２７日目の１２２±６７ ＩＦＮｇ ＳＣ／１０Ｅ６ ＰＢＭＣ）でより強いようであった。

【0082】

２．３ ４週間後に生じるＧｅｏｒｇｉａ株でのチャレンジに対するＡＳＦＶ－９８９株免疫の防御効果
ＡＳＦＶ－９８９株接種によって誘導された免疫応答を特徴付けたので、本発明者らは次に、免疫化されたブタが、免疫化の１ヶ月後に生じる毒性Ｇｅｏｒｇｉａ株でのＡＳＦＶチャレンジに対して防御され得るかどうかを評価した（表１）。

【0083】

＋臨床及び動物実験データ
先に示したように、ＯＮ又はＩＭ経路によるＧｅｏｒｇｉａ株でのチャレンジは、非免疫ブタにおいて急速な高熱を誘導し（図１４及び１５）、重篤な症状を伴い、これはブタ（Ｇ群及びＪ群）の例外的な安楽死を強いる。対照的に、ＡＳＦＶ－９８９株で免疫し、
Ｇｅｏｒｇｉａでチャレンジしたブタはいずれも、高熱又はＡＳＦ関連症状を発症せず、全てがＧｅｏｒｇｉａチャレンジを生き延びた（Ｄ群、Ｈ群、及びＩ群）。

【0084】

成長成績に関して、Ｇｅｏｒｇｉａチャレンジは、平均１日体重増加の急速な低下を示した非免疫動物とは対照的に、ＡＳＦＶ－９８９免疫化ブタにおいて影響を有さなかった（図１６）。

【0085】

＋ウイルス学的データ
ＡＳＦＶ－９８９株で免疫したブタが臨床的観点でＧｅｏｒｇｉａチャレンジに対して完全に防御されることを決定したので、本発明者らは次に、ウイルス学的レベルでのＡＳＦＶ－９８９免疫の効果を評価した。ＰＣＲ５０５（Ｇｅｏｒｇｉａ株を検出する）及びＰＣＲ９８９（ＡＳＦＶ－９８９株を検出する）の両方を使用して、本発明者らは、Ｇｅｏｒｇｉａ株でチャレンジしたブタ（ＡＳＦＶ－９８９で予め免疫化したか又は免疫化していない）におけるＧｅｏｒｇｉａウイルス血症及びＡＳＦＶ－９８９ウイルス血症を評価した。

【0086】

表２及び３に示されるように、非免疫ブタの両方の群は、チャレンジ後にＧｅｏｒｇｉａウイルス血症の迅速な上昇を示した（Ｄ５ ＰＣで：Ｇｅｏｒｇｉａ ＩＭについて８．９±０．２ｌｏｇ１０当量ＨＡＤ５０／ｍｌ及びＧｅｏｒｇｉａ ＯＮについて９．０±０．４ｌｏｇ１０当量ＨＡＤ５０／ｍｌ）。対照的に、Ｇｅｏｒｇｉａゲノムは、免疫化の経路又はチャレンジの経路にかかわらず、ＡＳＦＶ－９８９免疫化ブタのいずれの血液においても検出されなかった。先に示したように、ＰＣＲ９８９の結果は、ＡＳＦＶ－９８９ウイルス血症が免疫化後少なくとも３週間検出され得ることを確認した。

【0087】

【表2】

【0088】

【表3】

【0089】

剖検時に採取した組織試料では、ＩＭ経路でチャレンジしたＡＳＦＶ－９８９ ＩＭ免
疫化ブタのいずれにおいても、Ｇｅｏｒｇｉａゲノムは検出されなかった（表４）。ＡＳＦＶ－９８９株をＯＮ経路で免疫化したブタのうち、Ｇｅｏｒｇｉａゲノムは１２頭中４頭（Ｈ群２頭、Ｉ群２頭）の組織（扁桃腺、脾臓、又は肝臓－胃リンパ節）で検出された。

【0090】

【表4】

【0091】

２．４ ２週間後に生じるＧｅｏｒｇｉａ株でのチャレンジに対するＡＳＦＶ－９８９株接種の防御効果
ＡＳＦＶ－９８９接種が、４週間後に生じるＧｅｏｒｇｉａチャレンジに対して強い防御を誘導することができることを実証したので、本発明者らは、次いで、同じ防御が免疫化の２週間後にすぐに獲得され得るか否かに疑問を抱いた。２群のブタにＡＳＦＶ－９８９株をＩＭ又はＯＮ経路で接種し、２週間後に同じ経路でＧｅｏｒｇｉａ株をチャレンジした（表１、Ｋ群及びＬ群）。

【0092】

試験＃１及び＃２に見られるように、ＡＳＦＶ－９８９株でのブタの接種は、接種後３日目に始まり、約１週間続く高体温の期間を誘導した（図１７）。この高体温は、１～２週間の間に成長成績の低下を伴った（図１８）。ＡＳＦＶ－９８９株を筋肉内接種したブタのうち、１匹の動物が亜急性型のＡＳＦ（体重減少、振せん、及び運動失調）を発症し、接種後１２日目に死亡した。

【0093】

免疫化後１４日目のＧｅｏｒｇｉａチャレンジの後、ＡＳＦＶ－９８９免疫化ブタのいずれについても、症状、高体温、及び成長成績に対する影響は記録されなかった（図１７及び１８）。

【0094】

ウイルス学的観点では、ＡＳＦＶ－９８９接種後、全てのブタが、弱毒化株について検出可能なウイルス血症を示し、これは、ＯＮ接種ブタと比較して、ＩＭ接種ブタについてより速く検出され、わずかに高いレベルであった（図１９）。Ｇｅｏｒｇｉａチャレンジ後、Ｇｅｏｒｇｉａ株（ＰＣＲ５０５）のゲノムが免疫化ブタの血液中（表５）又は組織中（表６）に検出されなかったため、全ての免疫化ブタはチャレンジ株に対して完全に防御された。

【0095】

【表5】

【0096】

【表6】

【0097】

参照リスト
１．Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌら、「ＭＧＦ３６０及びＭＧＦ５０５遺伝子の欠失を保有するアフリカ豚熱ウイルスＧｅｏｒｇｉａ分離株はブタにおいて弱毒化され、病原性親ウイルスによるチャレンジに対する防御を付与する」、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１５年６月；８９（１１）：６０４８－５６．
２．米国特許出願公開第２０１６／０１３０５６２号明細書
３．Ｘｕｅｘｉａ Ｗｅｎら（２０１９年）、「ブタ及び乾燥ブタ飼料試料に由来するゲノム配列は、２０１８年の中国におけるアフリカ豚熱ウイルスの伝染に対する重要な洞察を提供する」、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ＆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、８：１、３０３－３０６．
４．Ｂａｏ，Ｊら、「アフリカ豚熱ウイルスＣｈｉｎａ／２０１８／ＡｎｈｕｉＸＣＧＱ株及び関連する欧州ｐ７２遺伝子型ＩＩ株のゲノム比較」、Ｔｒａｎｓｂｏｕｎｄ Ｅｍｅｒｇ Ｄｉｓ．２０１９年；６６：１１６７－１１７６．
５．Ｍａｚｕｒ－Ｐａｎａｓｉｕｋ Ｎ．ら、「ポーランドで単離されたアフリカ豚熱ウイルスの最初の完全ゲノム配列」、Ｓｃｉ Ｒｅｐ ９、４５５６（２０１９年）．
６．Ｆｏｒｔｈ ＪＨら、「アフリカ豚熱ウイルスの完全ゲノム配列の比較分析」、ベルギー、２０１８／１、Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１９年６月；２５（６）：１２４９－１２５２．
７．Ｋｏｖａｌｅｎｋｏ，Ｇ．ら、「ウクライナの家畜ブタからの毒性アフリカ豚熱ウイルスの完全ゲノム配列」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ａｎｎｏｕｎｃｅｍｅｎｔｓ ２０１９，８．
８．Ｒａｔｈａｋｒｉｓｈｎａｎ Ａら、「組換えアフリカ豚熱ウイルスの産生：プロセスのスピードアップ」、Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０２０年６月５日；１２（６）：６１５．
９．Ｃａｒｒａｓｃｏｓａ，Ａ．Ｌ．ら、「アフリカ豚熱ウイルスを成長及び滴定するための方法：野外及び実験室試料」、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２０１１年、第２６章：ｐ．Ｕｎｉｔ ２６ １４．
１０．Ｂｏｌｇｅｒ、Ａ．Ｍ．、Ｍ．Ｌｏｈｓｅ、及びＢ．Ｕｓａｄｅｌ、「Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ：イルミナ配列データ用の柔軟なトリマー」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０１４年、３０（１５）：ｐ．２１１４－２０．
１１．Ｌｉ，Ｈ．及びＲ．Ｄｕｒｂｉｎ、「バローズ－ホイーラー変換による高速かつ正確なショートリードアライメント」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００９年、２５（１４）：ｐ．１７５４－６０．
１２．Ｌｉ，Ｈ．ら、「配列アライメント／マップフォーマット及びＳＡＭｔｏｏｌｓ」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００９年、２５（１６）：ｐ．２０７８－９．
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

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【国際調査報告】