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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-02
(54)【発明の名称】腫瘍及びがんを予防するための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/22 20060101AFI20240126BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240126BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240126BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240126BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240126BHJP
A61K 39/08 20060101ALI20240126BHJP
C07K 14/595 20060101ALN20240126BHJP
【ＦＩ】
A61K38/22
A61P35/00 ZNA
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K47/68
A61K39/00 H
A61K39/08
C07K14/595
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023541717
(86)(22)【出願日】2022-01-13
(85)【翻訳文提出日】2023-09-06
(86)【国際出願番号】 US2022012294
(87)【国際公開番号】W WO2022155320
(87)【国際公開日】2022-07-21
(31)【優先権主張番号】17/148,159
(32)【優先日】2021-01-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
(71)【出願人】
【識別番号】519447916
【氏名又は名称】キャンサー アドヴァンシーズ インク．
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＮＣＥＲ ＡＤＶＡＮＣＥＳ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】サットン， リンダ
(72)【発明者】
【氏名】スミス， ジル ピー
(72)【発明者】
【氏名】カトー， アレン
(72)【発明者】
【氏名】フィリップス， テレサ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41A
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA03
4C084DB41
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB26
4C085AA05
4C085AA13
4C085BA12
4C085BB31
4C085CC22
4C085DD61
4C085EE01
4H045BA15
4H045BA16
4H045BA17
4H045DA30
4H045EA20
(57)【要約】
提供されるのは対象におけるガストリン関連腫瘍及び／又はがんのイニシエーション及び／又は進行を予防するための方法である。幾つかの実施態様では、本方法は、ガストリン免疫原を含む組成物を対象に投与することに関する。また提供されるのは、ガストリン関連前がん病変の発生を阻害するための方法、腫瘍及び／又はがんに関連する線維形成を予防するための方法、ガストリン関連腫瘍又はがんのイニシエーション及び／又は発生を予防するための、並びに／或いはそのための医薬を調製するための、ガストリン免疫原を含む組成物の使用、並びにガストリン関連腫瘍及び／又はがん及び／又はそれらの前がん病変のイニシエーション及び／又は発生の予防における使用のための組成物である。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象におけるガストリン関連腫瘍又はがんのイニシエーション又は進行を予防するための方法であって、（ａ）ガストリン関連腫瘍又はがんを発症するリスクのある対象を提供することと；
（ｂ）ガストリン免疫原を含む組成物を対象に投与すること
を含み、ガストリン免疫原が、対象におけるガストリン関連腫瘍又はがんのイニシエーション又は進行を予防するのに十分な抗ガストリン体液性及び／又は細胞性免疫応答を対象において誘導する、方法。
【請求項2】
ガストリン免疫原が、ガストリンペプチド、任意選択的に、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥ（配列番号：１）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥ（配列番号：２）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹ（配列番号：３）、及びＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ（配列番号：４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなるガストリンペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ガストリンペプチドが、任意選択的にリンカーを介して、免疫原性担体にコンジュゲートされる、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
免疫原性担体が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
リンカーがε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
リンカーとガストリンペプチドとがアミノ酸スペーサーによって分離され、任意選択的にアミノ酸スペーサーが１と１０の間のアミノ酸長であり、更に任意選択的にアミノ酸スペーサーが７アミノ酸長である、請求項３又は請求項５に記載の方法。
【請求項7】
組成物がアジュバント、任意選択的に油性アジュバントを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
ガストリン関連腫瘍及び／又はがんが、膵臓がんである、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
組成物が、膵臓がんに関連する線維化の減少を誘導し、及び／又はその発生を予防する、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
組成物が、約５０μｇから約１０００μｇ、約５０μｇから約５００μｇ、約１００μｇから約１０００μｇ、約２００μｇから約１０００μｇ、及び約２５０μｇから約５００μｇからなる群から選択される用量で投与され、任意選択的に、投与が、一回、二回、又は三回繰り返され、任意選択的に、二回目の投与が、初回投与の１週間後になされ、三回目の投与が、投与される場合は、二回目の投与の１週間又は２週間後になされる、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
対象におけるガストリン関連前がん病変の発生を阻害するための方法であって、（ａ）ガストリン関連前がん病変の発生のリスクのある対象を提供することと；
（ｂ）ガストリン免疫原を含む組成物を対象に投与すること
を含み、ガストリン免疫原が、対象におけるガストリン関連前がん病変の発生を阻害する、方法。
【請求項12】
ガストリン免疫原がガストリンペプチドを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
ガストリンペプチドが、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥ（配列番号：１）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥ（配列番号：２）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹ（配列番号：３）、及びＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ（配列番号：４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
ガストリンペプチドが、任意選択的にリンカーを介して、免疫原性担体にコンジュゲートされる、請求項１２又は請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
免疫原性担体が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
リンカーがε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
リンカーとガストリンペプチドとがアミノ酸スペーサーによって分離され、任意選択的にアミノ酸スペーサーが１と１０の間のアミノ酸長であり、更に任意選択的にアミノ酸スペーサーが７アミノ酸長である、請求項１４又は請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
組成物がアジュバント、任意選択的に油性アジュバントを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項19】
ガストリン関連腫瘍及び／又はがんが、膵臓がんである、請求項１１に記載の方法。
【請求項20】
組成物が、膵臓がんに関連する線維化の減少を誘導及び／又はその発生を予防し、ガストリン関連前がん病変が膵上皮内腫瘍（ＰａｎＩＮ）を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項21】
組成物が、約５０μｇから約１０００μｇ、約５０μｇから約５００μｇ、約１００μｇから約１０００μｇ、約２００μｇから約１０００μｇ、及び約２５０μｇから約５００μｇからなる群から選択される用量で投与され、任意選択的に、投与が、一回、二回、又は三回繰り返され、任意選択的に、二回目の投与が、初回投与の１週間後になされ、三回目の投与が、投与される場合は、二回目の投与の１週間又は２週間後になされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項22】
腫瘍及び／又はがんに関連する線維形成を予防するための方法であって、腫瘍及び／又はがんの細胞を、腫瘍及び／又はがんにおけるガストリンの一又は複数の生物学的活性を直接的又は間接的に阻害する薬剤を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項23】
薬剤がガストリンペプチドに対する体液性免疫応答を誘導し、任意選択的に薬剤が対象において中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチドを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
中和抗ガストリン抗体が、アミノ酸配列ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥ（配列番号：１）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥ（配列番号：２）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹ（配列番号：３）又はＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ（配列番号：４）内に存在するエピトープに結合する、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
薬剤が、免疫原性担体にコンジュゲートされた中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチドを含む、請求項２２から２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項26】
ガストリンペプチドが、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥ（配列番号：１）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥ（配列番号：２）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹ（配列番号：３）、及びＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ（配列番号：４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
免疫原性担体が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
ガストリンペプチドが、リンカーを介して免疫原性担体にコンジュゲートされる、請求項２５に記載の方法。
【請求項29】
リンカーがε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
リンカーとガストリンペプチドとがアミノ酸スペーサーによって分離され、任意選択的にアミノ酸スペーサーが１と１０の間のアミノ酸長であり、更に任意選択的にアミノ酸スペーサーが７アミノ酸長である、請求項２８又は請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
組成物がアジュバント、任意選択的に油性アジュバントを更に含む、請求項２２から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項32】
腫瘍及び／又はがんが、膵臓がんである、請求項２２から３１の何れか一項に記載の方法。
【請求項33】
ガストリン関連腫瘍又はがんのイニシエーション及び／又は発生を予防するための、ガストリン免疫原を含む組成物の使用。
【請求項34】
ガストリン関連腫瘍又はがんのイニシエーション及び／又は発生を予防する医薬の調製のための、ガストリン免疫原を含む組成物の使用。
【請求項35】
ガストリン関連腫瘍及び／又はがん及び／又はその前がん病変のイニシエーション及び／又は発生の予防における使用のための組成物であって、ガストリン免疫原を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、任意選択的に、 ガストリン免疫原が、免疫原性担体にコンジュゲートされる中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチドを含む、組成物。
【請求項36】
ガストリンペプチドが、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥ（配列番号：１）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥ（配列番号：２）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹ（配列番号：３）、及びＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ（配列番号：４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる、請求項３５に記載の使用のための組成物。
【請求項37】
免疫原性担体が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンからなる群から選択される、請求項３５に記載の使用のための組成物。
【請求項38】
ガストリンペプチドが、リンカーを介して免疫原性担体にコンジュゲートされる、請求項３５に記載の使用のための組成物。
【請求項39】
リンカーがε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む、請求項３８に記載の使用のための組成物。
【請求項40】
リンカーとガストリンペプチドとがアミノ酸スペーサーによって分離され、任意選択的にアミノ酸スペーサーが１と１０の間のアミノ酸長であり、更に任意選択的にアミノ酸スペーサーが７アミノ酸長である、請求項３８又は請求項３９に記載の使用のための組成物。
【請求項41】
組成物がアジュバント、任意選択的に油性アジュバントを更に含む、請求項３５から４０の何れか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項42】
腫瘍及び／又はがんが、膵臓がんである、請求項３５から１１の何れか一項に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願との相互参照］
この出願は、２０２１年１月１３日に出願された米国特許出願第１７／１４８１５９号の利益を主張し、その開示はその全体が出典明示によりここに援用される。
この出願は、２０２１年１月１３日に出願された米国特許出願第１７／１４８１５９号の利益を主張し、その開示はその全体が出典明示によりここに援用される。
【0002】
［配列表の参照］
本開示に関連する配列表は、２０２２年１月１３日に作成され、「１７３４＿１０＿２２＿３＿ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称で２キロバイトのＡＳＣＩＩテキストファイルとして米国特許商標庁に電子的に提出している。ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で提出した配列表は、その全体が出典明示によりここに援用される。
本開示に関連する配列表は、２０２２年１月１３日に作成され、「１７３４＿１０＿２２＿３＿ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称で２キロバイトのＡＳＣＩＩテキストファイルとして米国特許商標庁に電子的に提出している。ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で提出した配列表は、その全体が出典明示によりここに援用される。
【0003】
［技術分野］
本開示の主題は、腫瘍及びがんに対する体液性及び細胞性免疫の両方を誘導するための組成物及び方法に関する。幾つかの実施態様では、本開示の主題は、限定されないが膵臓がんを含むがんのイニシエーション及び／又は進行を予防するために、ガストリンペプチドに対する体液性若しくは細胞性免疫応答の治療誘導剤を、並びに／或いは腫瘍又はがんに対する細胞性免疫応答の誘導剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することに関する。
本開示の主題は、腫瘍及びがんに対する体液性及び細胞性免疫の両方を誘導するための組成物及び方法に関する。幾つかの実施態様では、本開示の主題は、限定されないが膵臓がんを含むがんのイニシエーション及び／又は進行を予防するために、ガストリンペプチドに対する体液性若しくは細胞性免疫応答の治療誘導剤を、並びに／或いは腫瘍又はがんに対する細胞性免疫応答の誘導剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することに関する。
【背景技術】
【0004】
一般に膵管腺癌（ＰＤＡＣ）と呼ばれる膵臓がんは、幾つかの細胞増殖調節経路における遺伝子変異の連続的蓄積を伴う複雑な疾患である。膵上皮内腫瘍の比較的良性の病変として始まるもの（ＰａｎＩＮ；Ｈｒｕｂａｎ等，２００８）が、異常な遺伝子発現パターンの多様性、ゲノムの不安定性、そして最終的には治療に抵抗性の浸潤がんへと進行する。
【0005】
組織学的に、ＰＤＡＣは一般に高分化型であり、主に腺房導管化生、免疫抑制性炎症細胞の存在、細胞傷害性Ｔ細胞の欠如、及び高密度の線維化間質の存在によって規定される。これらの徴候は、程度が大きく異なり得、明白な臨床症状を伴わずに発生する場合があり、これがＰＤＡＣの早期診断を稀なことにしている。ＰＤＡＣ腫瘍間質は、線維芽細胞及び膵星細胞（ＰＳＣ）などの間葉細胞、細胞外マトリックスタンパク質、腫瘍周囲神経線維、内皮細胞、及び免疫細胞で構成されている。間質細胞に影響を与えて豊富な線維形成効果を生み出す特定の機構は、（ガストリンを含む）増殖因子活性化、コラーゲン及び細胞外マトリックス合成及び分泌（Ｚｈａｎｇ等，２００７）、並びに血管及びサイトカイン媒介プロセスの多数の調節因子の発現（Ｈｉｄａｌｇｏ等，２０１２）を含む。
【0006】
浸潤性ＰＤＡＣは、管系癌腫の大部分（＞８５％）を構成する。ＰＤＡＣは、制御されない浸潤と早期転移を特徴とする。管腺癌の推定前駆型は、管内増殖変化を経て、最終的にＰａｎＩＮ－１ＡからＰａｎＩＮ－３への一連の腫瘍性転化（上皮内癌）及び末期の悪性癌腫となるＰａｎＩＮの顕微鏡的病変である。
【0007】
ＰＤＡＣの重要な特徴は、腫瘍細胞の表面でのガストリン／コレシストキニン受容体（ＣＣＫ－Ｂ）の異常発現（Ｓｍｉｔｈ等，１９９４）並びに腫瘍による高レベルのガストリンの発現（Ｐｒａｓａｄ等，２００５）である。ガストリン（Ｓｍｉｔｈ，１９９５）及びコレシストキニン（Ｓｍｉｔｈ等，１９９０；Ｓｍｉｔｈ等，１９９１）タンパク質は両方とも膵臓腫瘍の増殖を刺激する。しかし、ガストリンのみが、自己分泌機構を通じて増殖をまた刺激することができ（Ｓｍｉｔｈ等，１９９６ａ；Ｓｍｉｔｈ等，１９９８ｂ）、ガストリン発現の阻害（Ｍａｔｔｅｒｓ等，２００９）、又はＣＣＫ－Ｂ受容体機能の遮断（Ｆｉｎｏ等，２０１２；Ｓｍｉｔｈ及びＳｏｌｏｍｏｎ，２０１４）ががん増殖を阻害する。
【0008】
長年にわたる多くのがんの治療での印象的な成功にもかかわらず、悲劇的には、全ての胃腸悪性腫瘍のなかで最も不良な予後を示す（Ｓｉｅｇｅｌ等，２０１６）、ＰＤＡＣに対しては画期的な治療薬の販売承認は殆ど乃至は全く成功していない（Ｈｉｄａｌｇｏ，２０１０；Ｒｙａｎ等，２０１４を参照）。ＰＤＡＣに対する現在の５年生存率は約９～１０％であり、がんの中で最も低い（Ｓｉｅｇｅｌ等，２０１６）。
【0009】
ＰＤＡＣの転帰不良は過去３０年間大きく変わっていない。集学的診断とその後の手術並びに化学及び放射線療法が第一選択治療アプローチである。しかし、小分子化学療法剤ゲムシタビン及び５－フルオロウラシルに基づく治療は満足のいく転帰をもたらさず、これらのレジメンによる平均生存期間は依然として１年未満にとどまっている（Ｈｏｆｆ等，２０１１、Ｃｏｎｒｏｙ等，２０１１）。
【0010】
低い生存率の要因には、この疾患を初期段階で診断できないこと、細胞性及び解剖学的腫瘍細胞の不均一性、高い転移率、薬物の浸透と曝露を阻害する高密度の線維化微小環境の存在が含まれる（Ｎｅｅｓｓｅ等，２０１３）。腫瘍に到達しにくいことにより、標準的な化学療法剤及び免疫療法剤に対するＰＤＡＣの相対的な耐性が生じ（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ及びＢｒｅｎｔｎａｌｌ，２０１３）、この不治の病の予後不良の一因となっている。
【0011】
宿主免疫応答は、ＰＤＡＣの不応性で攻撃的な性質に寄与するもう一つの重要な要因である。ＰＤＡＣの微小環境では非常に卓越している免疫細胞は、抗腫瘍免疫をサポートしない（Ｚｈｅｎｇ等，２０１３）。むしろ、これらの細胞（Ｍ２分極化マクロファージ、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、及び好中球を含む）は、実際に腫瘍増殖及び浸潤を促進する。実際、ＰＤＡＣの特徴の一つは、免疫破壊を逃れる能力である（Ｈａｎａｈａｎ及びＷｅｉｎｂｅｒｇ，２０１１）。
【0012】
ＰＤＡＣを含むがんは、多くのツールを用いて、患者の免疫系からの攻撃を逃れ及び／又は打ち破る（Ｐａｒｄｏｌｌ，２０１２；Ｗｅｉｎｅｒ及びＬｏｔｚｅ，２０１２）。腫瘍の代謝環境の構成要素がこれらの応答を調節することが示されている（Ｆｅｉｇ等，２０１２；Ｑｕａｎｔｅ等，２０１３）。がん治療薬における大きな進歩は、免疫耐性の機構として腫瘍細胞によってしばしば調節される免疫チェックポイント経路の発見によってもたらされた（Ｌｅａｃｈ等，１９９６）。細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、及びプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）などのチェックポイント経路のタンパク質を標的とする抗体が開発され、メラノーマ、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、及び腎臓がんなどの一部のがんの免疫耐性を逆転させるのに臨床的に有効であることが示されている（Ｐａｒｄｏｌｌ，２０１２）。しかし、ＰＤＡＣは、免疫抑制性制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞が優勢であり、ＣＤ８＋腫瘍浸潤エフェクターＴ細胞を欠く微小環境を有する免疫学的に「コールド」な腫瘍として特徴付けられ（Ｆｅｉｇ等，２０１２；Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ及びＢａｙｎｅ，２０１３；Ｚｈｅｎｇ等，２０１３）、血管新生化に乏しい。密な間質環境の線維化の性質、並びに血流を介した到達性の欠如は、ＰＤＡＣが抗ＰＤ－１及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体に対してせいぜい中程度にしか応答しないという知見を部分的に説明する（Ｂｒａｈｍｅｒ等，２０１２、Ｚｈａｎｇ，２０１８）。
【0013】
ＰＤＡＣ細胞表面上のチェックポイントリガンドＰＤ－Ｌ１の発現レベルは、免疫チェックポイント阻害剤免疫療法に対する応答のもう一つの決定要因であると考えられる（Ｚｈｅｎｇ，２０１７）。ある研究では、ＰＤ－Ｌ１発現レベルの低下が免疫チェックポイント阻害剤に対する応答の欠如と相関していること（Ｓｏａｒｅｓ等，２０１５）、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１発現の刺激が抗チェックポイントタンパク質抗体の効果の促進に役立つ可能性があること（Ｌｕｔｚ等，２０１４）が示唆されている。ＰＤＡＣの他の研究では、ＰＤ－Ｌ１が大部分の腫瘍細胞並びに多くの腫瘍サンプルで高度に発現していることが見出された（Ｌｕ等，２０１７）。従って、免疫チェックポイント阻害剤療法の有効性は、腫瘍内のＰＤ－Ｌ１の状態を考慮し、ＰＤＡＣ標的療法に伴うＰＤ－Ｌ１発現の調節方法を探索することによって増強される可能性がある。
【0014】
現在、ＰＤＡＣの治療のための臨床試験には、抗体免疫チェックポイント阻害剤を化学療法、放射線、ケモカイン不活化（オラプテセド（ｏｌａｐｔｅｓｅｄ））、サイクリン依存性キナーゼ阻害（アベマシクリブ）、ＴＧＦ－β受容体Ｉキナーゼ阻害剤（ガルニセルチブ）、接着斑キナーゼ阻害剤（デファクチニブ）、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤（ペキシダルチニブ）、ビタミンＤ、及びポリＡＤＰリボースポリメラーゼ阻害剤（ニラパリブ）と併用することが含まれる。これらの試験は、ＰＤＡＣ腫瘍微小環境中への免疫細胞の物理的透過及び／又は免疫細胞の存在を改善し、並びに免疫チェックポイント阻害剤治療の有効性を改善する可能性のある併用剤を目的としている。最近の報告（Ｓｍｉｔｈ等，２０１８）では、ＣＣＫ－Ｂ受容体機能の阻害によりＰＤＡＣ線維化が低減され、抗ＰＤ－１抗体（Ａｂ）又は抗ＣＴＬＡ－４ Ａｂを使用する抗体療法の有効性が改善された。
【0015】
ＰＤＡＣ腫瘍の複雑さを考慮すると、患者の多様性にわたってＰＤＡＣ微小環境の免疫表現型を改変し、化学療法と免疫療法の両方に対して腫瘍をより応答性にするために、新しい戦略をどのように使用できるかについて、より深い理解が必要である。
【0016】
胃がんは別の深刻ながんであり、特に胃腺癌は全てのがんの中で最も予後が不良ながんの一つであり、５年生存率は最大３０％である（Ｆｅｒｌａｙ等，２０１３）。この悪性腫瘍の早期発見は困難であり、意図的なスクリーニングの実施を必要とするが、これは一般的には利用されていない。殆どの診断は既に進行期にあり、生存期間中央値は９～１０か月である（Ｗａｇｎｅｒ等，２０１０；Ａｊａｎｉ等，２０１７）。胃がんの現在の標準治療では、適切な場合は手術が行われ、その後、放射線療法及び／又は５－フルオロウラシルなどのＤＮＡ合成阻害剤及び／又はシスプラチンなどのＤＮＡ傷害剤を用いた化学療法が続く。
【0017】
一部の胃がんの治療には標的療法もまた登場し始めている。ヒト上皮増殖因子受容体２（ＥＧＦＲ２）を発現する腫瘍は、化学療法との併用で、トラスツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）により商品名ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）で販売）で治療されうる。一部の胃がんは、ラムシルマブ（イーライリリーアンドカンパニー（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）により商品名ＣＹＲＡＭＺＡ（登録商標）で販売）などの抗血管新生薬にまた応答性である。この蔓延している悪性腫瘍の憂鬱な予後を改善するには、更なる標的療法が緊急に必要とされている。
【0018】
胃腺癌は、典型的には、ガストリンと、ＣＣＫ－Ｂ受容体と呼ばれるガストリンの受容体とを過剰発現し（Ｓｍｉｔｈ等，１９９８ａ；ＭｃＷｉｌｌｉａｍｓ等，１９９８）、ＣＣＫ－Ｂへの結合時のガストリン媒介増殖効果により、これらの腫瘍における増殖と発現の制御されない自己分泌サイクルに至る。このがんの治療手段としてガストリンの機能を遮断することは、長年の研究の焦点となってきている（Ｒａｉ等，２０１２で概説）。標的療法の候補の中で、ガストリンワクチンポリクローナル抗体刺激剤（ＰＡＳ）が、第２相臨床試験で胃がんの、第２相及び第３相臨床試験で膵臓がんの生存期間の改善において顕著な見込みを示した。ＰＡＳワクチン接種は、ガストリンに対する中和抗体の産生によって実証されるように、体液性免疫応答を誘発することが示されている。ガストリンを除去することにより、ワクチンは腫瘍増殖を遅らせ、長期にわたる腫瘍殺傷活性をもたらす可能性がある。
【0019】
特定の腫瘍抗原に対する免疫応答を高めるがんワクチンは、標的抗原の免疫介在性固定化又は不活化が体内の他の部位に有害作用を及ぼさない場合、魅力的な治療戦略となる。ペプチドワクチンには、免疫応答の特異性を狭めるという潜在的な利点があるが、弱い免疫原性を誘発するという欠点が時々ありうる。強い応答を確保し、所望の免疫経路の誘導を開始させるには、ペプチド組成物の慎重な選択、並びにアジュバント分子及び送達系の取り込みが必要な場合がある。エピトープ内のアミノ酸が一つでも変化すると反応が妨げられる可能性があるが、９～１１アミノ酸という短いペプチドでも特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介反応を引き起こす可能性がある（Ｇｅｒｓｈｏｎｉ等，２００７）。
【0020】
ペプチドに含められるエピトープの選択には、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を誘導するＭＨＣクラスＩＩエピトープ及びヘルパーＴ細胞とＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導するＭＨＣクラスＩ ＣＤ８エピトープを含む、所望される免疫応答のタイプを考慮する必要がある（Ｌｉ等，２０１４）。
【0021】
免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせたＰＡＳなどのガストリンペプチドワクチンの組み合わせは、ガストリンペプチドホルモンによる増殖刺激を受けるがんの転帰を改善するための新しいアプローチとなる。
【発明の概要】
【0022】
この概要は、本開示の主題の幾つかの実施態様を列挙し、多くの場合、これらの実施態様の変形及び置換を列挙する。この概要は、多くの多様な実施態様の単なる例示に過ぎない。所与の実施態様の一又は複数の代表的な特徴の言及も同様に例示的なものである。そのような実施態様は、典型的には、言及された特徴の有無にかかわらず存在しうる；同様に、その特徴は、この概要に列挙されているかどうかにかかわらず、本開示の主題の他の実施態様に適用することができる。過度の繰り返しを避けるため、この概要では、そのような特徴の全ての可能な組み合わせを列挙したり、示唆したりするものではない。
【0023】
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、対象におけるガストリン関連腫瘍又はがんのイニシエーション及び／又は進行を予防するための方法に関する。幾つかの実施態様では、該方法は、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを発症するリスクのある対象を提供することと；ガストリン免疫原を含む組成物を対象に投与することを含み、ガストリン免疫原が、対象におけるガストリン関連腫瘍又はがんのイニシエーション又は進行を予防するのに十分な抗ガストリン体液性及び／又は細胞性免疫応答を対象において誘導する。幾つかの実施態様では、ガストリン免疫原は、ガストリンペプチド、任意選択的に、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥ（配列番号：１）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥ（配列番号：２）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹ（配列番号：３）、及びＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ（配列番号：４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなるガストリンペプチドを含む。幾つかの実施態様では、ガストリンペプチドは、任意選択的にリンカーを介して、免疫原性担体にコンジュゲートされる。幾つかの実施態様では、免疫原性担体は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、リンカーはε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む。幾つかの実施態様では、リンカーとガストリンペプチドとがアミノ酸スペーサーによって分離され、任意選択的にアミノ酸スペーサーが１と１０の間のアミノ酸長であり、更に任意選択的にアミノ酸スペーサーが７アミノ酸長である。幾つかの実施態様では、組成物はアジュバント、任意選択的に油性アジュバントを更に含む。幾つかの実施態様では、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんは、膵臓がんである。幾つかの実施態様では、組成物は、膵臓がんに関連する線維化の減少を誘導し、及び／又はその発生を予防する。幾つかの実施態様では、組成物は、約５０μｇから約１０００μｇ、約５０μｇから約５００μｇ、約１００μｇから約１０００μｇ、約２００μｇから約１０００μｇ、及び約２５０μｇから約５００μｇからなる群から選択される用量で投与され、任意選択的に、投与が、一回、二回、又は三回繰り返され、任意選択的に、二回目の投与が、初回投与の１週間後になされ、三回目の投与が、投与される場合は、二回目の投与の１週間又は２週間後になされる。
【0024】
本開示の主題はまた幾つかの実施態様において対象におけるガストリン関連前がん病変の発生を阻害するための方法に関する。幾つかの実施態様では、該方法はガストリン関連前がん病変の発生のリスクのある対象を提供することと；ガストリン免疫原を含む組成物を対象に投与することを含み、ガストリン免疫原が、対象におけるガストリン関連前がん病変の発生を阻害する。幾つかの実施態様では、ガストリン免疫原は、ガストリンペプチドを含む。幾つかの実施態様では、ガストリンペプチドは、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥ（配列番号：１）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥ（配列番号：２）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹ（配列番号：３）、及びＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ（配列番号：４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。幾つかの実施態様では、ガストリンペプチドは、任意選択的にリンカーを介して、免疫原性担体にコンジュゲートされる。幾つかの実施態様では、免疫原性担体は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、リンカーはε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む。幾つかの実施態様では、リンカーとガストリンペプチドとはアミノ酸スペーサーによって分離され、任意選択的にアミノ酸スペーサーが１と１０の間のアミノ酸長であり、更に任意選択的にアミノ酸スペーサーが７アミノ酸長である。幾つかの実施態様では、組成物はアジュバント、任意選択的に油性アジュバントを更に含む。幾つかの実施態様では、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんは、膵臓がんである。幾つかの実施態様では、組成物は、膵臓がんに関連する線維化の減少を誘導し、及び／又はその発生を予防する。幾つかの実施態様では、ガストリン関連前がん病変は膵上皮内腫瘍（ＰａｎＩＮ）を含む。幾つかの実施態様では、組成物は、約５０μｇから約１０００μｇ、約５０μｇから約５００μｇ、約１００μｇから約１０００μｇ、約２００μｇから約１０００μｇ、及び約２５０μｇから約５００μｇからなる群から選択される用量で投与され、任意選択的に、投与が、一回、二回、又は三回繰り返され、任意選択的に、二回目の投与が、初回投与の１週間後になされ、三回目の投与が、投与される場合は、二回目の投与の１週間又は２週間後になされる。
【0025】
本開示の主題はまた幾つかの実施態様において腫瘍及び／又はがんに関連する線維形成を予防するための方法に関する。幾つかの実施態様では、該方法は、腫瘍及び／又はがんの細胞を、腫瘍及び／又はがんにおけるガストリンの一又は複数の生物学的活性を直接的又は間接的に阻害する薬剤を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる組成物と接触させることを含む。幾つかの実施態様では、薬剤はガストリンペプチドに対する体液性免疫応答を誘導し、任意選択的に薬剤は対象において中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチドを含む。幾つかの実施態様では、中和抗ガストリン抗体は、アミノ酸配列ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥ（配列番号：１）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥ（配列番号：２）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹ（配列番号：３）又はＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ（配列番号：４）内に存在するエピトープに結合する。幾つかの実施態様では、薬剤は、免疫原性担体にコンジュゲートされた中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチドを含む。幾つかの実施態様では、ガストリンペプチドは、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥ（配列番号：１）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥ（配列番号：２）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹ（配列番号：３）、及びＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ（配列番号：４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。幾つかの実施態様では、免疫原性担体は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、ガストリンペプチドは、リンカーを介して免疫原性担体にコンジュゲートされる。幾つかの実施態様では、リンカーはε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む。幾つかの実施態様では、リンカーとガストリンペプチドとはアミノ酸スペーサーによって分離され、任意選択的にアミノ酸スペーサーが１と１０の間のアミノ酸長であり、更に任意選択的にアミノ酸スペーサーが７アミノ酸長である。幾つかの実施態様では、組成物はアジュバント、任意選択的に油性アジュバントを更に含む。幾つかの実施態様では、腫瘍及び／又はがんが、膵臓がんである。
【0026】
本開示の主題はまた幾つかの実施態様においてガストリン関連腫瘍又はがんのイニシエーション及び／又は発生を予防するための、一又は複数のガストリン免疫原を含む組成物の使用に関する。
【0027】
本開示の主題はまた幾つかの実施態様においてガストリン関連腫瘍又はがんのイニシエーション及び／又は発生を予防する医薬の調製のための、一又は複数のガストリン免疫原を含む組成物の使用に関する。
【0028】
本開示の主題はまた幾つかの実施態様においてガストリン関連腫瘍及び／又はがん及び／又はその前がん病変のイニシエーション及び／又は発生の予防における使用のための組成物に関する。幾つかの実施態様では、該組成物は、一又は複数のガストリン免疫原を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、任意選択的に、一又は複数のガストリン免疫原の少なくとも一つが、免疫原性担体にコンジュゲートされる中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチドを含む。幾つかの実施態様では、一又は複数のガストリンペプチドの少なくとも一つは、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥ（配列番号：１）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥ（配列番号：２）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹ（配列番号：３）、及びＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ（配列番号：４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。幾つかの実施態様では、免疫原性担体は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、一又は複数のガストリンペプチドの少なくとも一つは、リンカーを介して免疫原性担体にコンジュゲートされる。幾つかの実施態様では、リンカーはε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む。幾つかの実施態様では、リンカーとガストリンペプチドとはアミノ酸スペーサーによって分離され、任意選択的にアミノ酸スペーサーは１と１０の間のアミノ酸長であり、更に任意選択的にアミノ酸スペーサーは７アミノ酸長である。幾つかの実施態様では、組成物はアジュバント、任意選択的に油性アジュバントを更に含む。幾つかの実施態様では、腫瘍及び／又はがんが、膵臓がんである。
【0029】
従って、ガストリン関連腫瘍及び／又はがん及び／又はその前がん病変のイニシエーション及び／又は進行を予防するための方法を提供することが本開示の主題の目的である。
【0030】
本開示の主題の目的は上に述べた通りで、ここに開示される組成物及び方法によって全部が又は部分的に達成されるが、他の目的は、以下に最もよく記載されている添付図面と関連して説明が進むにつれて明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】図１は、免疫チェックポイント阻害剤を伴うか伴わないでＰＡＳがマウスにおける膵臓細胞腫瘍の増殖に影響を与える能力を試験するための例示的な実験戦略の概略図である。特定の実施態様では、治療の１週間前にＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃ５７ＢＬ／６はｍＴ３細胞と同系である）に５×１０５個のマウスｍＴ３膵臓がん細胞を注射することによって、皮下腫瘍を生成した。１０匹のマウスの群（合計４０匹）を、ｔ＝０、１、及び３週目にＰＡＳで、及び／又はｔ＝０、４、８、１５、及び２１日目に抗ＰＤ－１抗体（ＰＤ１－１Ａｂ；Ｂｉｏ Ｘ ｃｅｌｌ，Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ，Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）で治療した。治療間で腫瘍体積を測定した。試験が終了し、脾臓からＰＢＭＣを採取し、マウスから腫瘍を切除し、分析した。
【図2】図２は、対照（リン酸緩衝生理食塩水のみ；ＰＢＳ）、ＰＡＳ単独（投与当たり１００μｇ；ＰＡＳ１００）、ＰＤ－１ Ａｂ単独（投与当たり１５０μｇ；ＰＤ－１）、又はＰＡＳ（投与当たり１００μｇ）とＰＤ－１ Ａｂ（投与当たり１５０μｇ）の組み合わせ（ＰＡＳ１００＋ＰＤ－１）による治療後のｍＴ３担持マウスにおける平均腫瘍重量をグラムで示す棒グラフである。ＮＳ：ｐ≧０．０５（つまり、有意ではない）；＊ＰＢＳ及びＰＡＳ１００と比較してｐ＜０．０５；＃ＰＤ－１と比較してｐ＝０．００１７。エラーバーは±ＳＥＭである。
【図3】図３Ａ及び３Ｂは、ＰＢＳ、ＰＤ－１ Ａｂ単独（投与当たり１５０μｇ；ＰＤ１）、ＰＡＳ単独（投与当たり１００μｇ；ＰＡＳ１００）、又はＰＡＳ（投与当たり１００μｇ）とＰＤ－１ Ａｂ（投与当たり１５０μｇ）の組み合わせ（ＰＡＳ１００／ＰＤ－１）による治療後の、ＣＤ３最終分化Ｔ細胞に存在するＣＤ４－／ＣＤ８－及びＣＤ４－／ＣＤ８－ＴＥＭＲＡ細胞の一連のプロットである。図３Ａは、様々な治療を受けたマウスにおけるＣＤ３＋／ＣＤ４－／ＣＤ８－及びＣＤ３＋／ＣＤ４－／ＣＤ８－／ＣＤ４４－／ＣＤ６２Ｌ－（すなわち、ＴＥＭＲＡ）細胞のパーセンテージを示す。図３Ｂは、ＣＤ３＋／ＣＤ４－／ＣＤ８－／ＣＤ４４－／ＣＤ６２Ｌ－ＴＥＭＲＡ細胞であったＣＤ３＋／ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞の部分を示す。細胞の部分は、ＣＤ３＋／ＣＤ４－／ＣＤ８－リンパ球のパーセンテージに、ＣＤ４－／ＣＤ８－リンパ球／１００００中のＣＤ３＋／ＣＤ４－／ＣＤ８－／ＣＤ４４－／ＣＤ６２Ｌ－ＴＥＭＲＡ細胞のパーセンテージを乗じて計算し、ＣＤ３＋Ｔ細胞画分中のＣＤ４－／ＣＤ８－／ＣＤ４４－／ＣＤ６２Ｌ－ＴＥＭＲＡ細胞の部分を計算した（図３Ｂを参照）。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。エラーバーは±１標準偏差である。
【図4】図４Ａ及び４Ｂは、ＰＡＳ１００での治療後で、ガストリンにより再刺激しない場合（図４Ａ）及び再刺激した場合（図４Ｂ）の様々なＴ細胞亜集団におけるＴＮＦα、グランザイムＢ、パーフォリン、及びＩＮＦγに関するサイトカイン活性化アッセイを要約する一連の棒グラフである。図４Ａは、ＰＡＳ１００で治療したマウスの脾臓から単離されたＴ細胞が実際に活性化されたことを示している。これらの同じ細胞を６時間培養した状態でガストリンで再刺激すると（図４Ｂ）、それらは再刺激され、各サイトカインの更に多くが放出された。黒色バー：ＩＮＦγ。薄い灰色バー：グランザイムＢ。濃い灰色バー：パーフォリン。斜線の灰色バー：ＴＮＦα。
【図5】図５Ａ及び５Ｂは、ＰＡＳ１００単独療法（図５Ａ）又はＰＡＳ１００＋ＰＤ－１併用療法（図５Ｂ）で治療されたＣＤ４－／ＣＤ８－（各図の左の群）、ＣＤ８＋（各図の中央の群）、及びＣＤ４＋（各図の右の群）Ｔ細胞亜集団におけるＴＮＦα、グランザイムＢ、パーフォリン、及びＩＮＦγに関するサイトカイン放出を比較する一連の棒グラフである。活性化されたＴリンパ球は、ＰＢＳ処置マウスのリンパ球と比較して、増加したサイトカインを放出した。併用治療マウスからのリンパ球は、顕著に高いレベルのサイトカインを放出し、併用療法が活性化Ｔ細胞の刺激において優れていることを示唆している。特にＴＮＦαは、ＰＡＳ＋ＰＤ－１ Ａｂ併用療法により２倍を超えて増加した。黒色バー：ＩＮＦγ。薄い灰色バー：グランザイムＢ。濃い灰色バー：パーフォリン。斜線の灰色バー：ＴＮＦα。
【図6A】図６Ａ及び６Ｂは、マウスにおけるｍＴ３膵臓がん細胞腫瘍における線維化の発生に対するＰＢＳ対照、ＰＤ－１単独療法、ＰＡＳ１００単独療法、及びＰＡＳ１００＋ＰＤ－１併用療法の結果を示す。図６Ａは、コラーゲンを青に染色し、線維化の指標となるマッソントリクローム染色で染色したｍＴ３腫瘍を示す。
【図6B】図６Ｂは、図６Ａに示した染色の結果を要約する棒グラフである。注目すべき点は、ＰＤ－１単独療法とＰＡＳ１００単独療法で治療した腫瘍の統合密度は、陰性対照ＰＢＳ処置とほとんど差がなかったのに対し、ＰＡＳ＋ＰＤ－１ Ａｂ併用治療では、ＰＢＳ単独（ｐ＜０．００５）及びＰＡＳ１００単独（ｐ＜０．００１）と比較して統計的に有意であった密度（従って線維化）の低下が生じたことである。＊＊＊ＰＢＳと比較してｐ＜０．００５、ＰＡＳ１００と比較してｐ＜０．００１。黒色バー：ＰＢＳ。薄い灰色バー：ＰＤ－１単独。白色バー：ＰＡＳ１００単独。斜線の灰色バー：ＰＡＳ１００＋ＰＤ－１。
【図7A】図７Ａ及び７Ｂは、マウスにおけるｍＴ３膵臓がん細胞腫瘍へのＣＤ８＋細胞の浸潤に対するＰＢＳ対照、ＰＤ－１単独療法、ＰＡＳ１００単独療法、及びＰＡＳ１００＋ＰＤ－１併用療法の結果を示す。図７Ａは、マウスにおけるｍＴ３膵臓がん細胞腫瘍へのＣＤ８＋細胞の浸潤に対するＰＢＳ、ＰＤ－１ Ａｂ（ＰＤ－１）単独療法、ＰＡＳ１００単独療法（ＰＡＳ）、及びＰＡＳ１００＋ＰＤ－１併用療法での治療後の、ＣＤ８に結合する抗体で染色された例示的なｍＴ３腫瘍を示す。
【図7B】図７Ｂは、図７Ａによって例証されたデータを要約した棒グラフである。ＰＤ－１（ＰＤ－１ Ａｂ）単独療法又はＰＡＳ１００単独による治療では、陰性対照ＰＢＳ処置と比較して、腫瘍内のＣＤ８＋細胞のレベルが有意に高くなった（それぞれｐ＝０．００１９及びｐ＝０．００２６）。ＰＡＳ＋ＰＤ－１ Ａｂ併用療法は、ＰＢＳ単独と比較した場合（ｐ＝４．７×１０－５）並びにＰＤ－１単独と比較した場合（ｐ＝０．０４２）、及びＰＡＳ１００単独と比較した場合（ｐ＝０．０３９）、腫瘍内のＣＤ８＋細胞のレベルが更に高くなった。ＰＤ－１単独は、ＰＡＳ１００単独と比較して有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。＊＊ＰＢＳと比較してｐ＝０．００２６；＊＊＊ＰＢＳと比較してｐ＝０．００１９；＊＊＊＊ＰＢＳと比較してｐ＝４．７×１０－５。エラーバーは±ＳＥＭである。
【図8A】図８Ａ及び８Ｂは、ｍＴ３腫瘍におけるＦｏｘｐ３＋細胞の分析を示す。図８Ａは、ＴｒｅｇのマーカーであるＦｏｘｐ３タンパク質に結合する抗体で染色された例示的なｍＴ３腫瘍を示す。視野の比較では、ＰＢＳ（左上のパネル）、ＰＤ－１単独療法（右上のパネル）、又はＰＡＳ１００単独療法（左下のパネル）と比較して、ＰＡＳ１００＋ＰＤ－１併用療法では、腫瘍内Ｔｒｅｇの存在が減少したことが示され、これは、ＰＡＳ１００＋ＰＤ－１併用療法が、何れかの単独療法のみと比較して、腫瘍内環境を、腫瘍内微小環境がＴｒｅｇベースの免疫抑制の程度が低いことを特徴とする程度まで改変する可能性を示唆している。
【図8B】図８Ｂは、図８Ａによって例証されたデータを要約した棒グラフである。ＰＢＳと比較して、ＰＤ－１単独療法又はＰＡＳ１００単独療法で治療した腫瘍内のＦｏｘｐ３＋細胞の数には有意な差はなかった。ＰＡＳ１００＋ＰＤ－１ Ａｂ併用療法で治療した腫瘍では、陰性対照よりもＦｏｘｐ３＋細胞の数が有意に少なかった。＊ｐ＝０．０３８。黒色バー：ＰＢＳ。薄い灰色バー：ＰＤ－１ Ａｂ単独。白色バー：ＰＡＳ１００単独。斜線の灰色バー：ＰＡＳ１００＋ＰＤ－１ Ａｂ。エラーバーは±ＳＥＭである。
【図9】図９Ａ－９Ｈは、ＰａｎＩＮステージを示すヘマトキシリン・エオシン染色したマウス膵臓の一連の顕微鏡写真である。図９Ａ：進行性ＰａｎＩＮ及びがんを有する代表的な未治療トランスジェニックＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｐ４８－Ｃｒｅ（ＫＲＡＳ）マウスからの膵臓（倍率１０倍）。図９Ｂ：ＰａｎＩＮ－３病変及び正常な膵臓腺房細胞の喪失を示す未治療ＫＲＡＳマウスからの膵臓（倍率１０倍）。図９Ｃ：未治療対照ＫＲＡＳマウスからの浸潤性膵臓がんを有する膵臓（倍率１０倍）。図９Ｄ：年齢を一致させたＫＲＡＳ ＰＡＳ治療マウスの膵臓は、正常な膵腺房細胞（矢印）を有する低ステージのＰａｎＩＮを示す（倍率１０倍）。図９Ｅ：ＰＡＳ治療ＫＲＡＳマウスの膵臓（倍率２０倍）は、ＰａｎＩＮ病変が主にステージ１であり、正常な腺房細胞（矢印）が豊富に存在することを示している。図９Ｆ：ＰＡＳ治療ＫＲＡＳマウスの代表的な膵臓（倍率１０倍）。図９Ｇ：低倍率（４Ｘ）での未治療ＫＲＡＳマウスの膵臓は、膵臓組織が広範なＰａｎＩＮ病変及び線維化で置き換えられていることを示している。図９Ｈ：低倍率（４Ｘ）でのＰＡＳ治療ＫＲＡＳマウスの膵臓は、ＰａｎＩＮが少なく、正常な膵臓腺房細胞が保存されていることを示している。
【図10】図１０Ａ－１０Ｃは、マッソントリクローム染色による膵線維化の分析結果を示す。図１０Ａ：倍率１０Ｘ（左）及び２０Ｘ（右）での広範な線維化（青色染色）を示す、８か月齢の対照ＫＲＡＳマウスの膵臓の代表的な画像。図１０Ｂ：ＰＡＳをワクチン接種した年齢を一致させた８か月齢のＫＲＡＳマウスの膵臓の代表的な画像は、膵臓内線維化が有意に少ないことを示している（倍率１０Ｘ（左）及び２０Ｘ（右））。図１０Ｃ：線維化密度の形態計測コンピュータ解析は、ＰＡＳ治療膵臓における線維化が有意に少ないことを示している（ｐ＝０．０００１）。
【図11】図１１Ａ－１１Ｅ。Ｍ２マクロファージのアルギナーゼ免疫反応性の解析結果を示す。図１１Ａ：代表的な未治療ＫＲＡＳマウス膵臓の切片は、多数のＭ２陽性マクロファージを示す（１０倍）。図１１Ｂ：未治療ＫＲＡＳマウス膵臓の倍率２０Ｘの写真は、ＰａｎＩＮ病変の周囲のアルギナーゼ陽性マクロファージを示している。図１１Ｃ：ＰＡＳ治療ＫＲＡＳマウスの膵臓の写真は、アルギナーゼ陽性マクロファージをほとんど示していない（１０Ｘ）。図１１Ｄ：ＰＡＳ治療ＫＲＡＳマウスからの膵臓の高倍率（２０Ｘ）は、Ｍ２アルギナーゼ陽性マクロファージの減少を示している。図１１Ｅ：アルギナーゼ陽性Ｍ２マクロファージのコンピュータ計数及び解析は、ＰＡＳ治療ＫＲＡＳマウスの膵臓における４倍の減少を示している。＊＊＊ｐ＝０．０００６で有意。
【発明を実施するための形態】
【0032】
見出しは、参照のために、また所定のセクションを見つけやすくするためにここに含められる。これらの見出しは、その中で説明される概念の範囲を限定することを意図したものではなく、これらの概念は、明細書全体を通じて他のセクションにも適用可能でありうる。
【0033】
Ｉ．一般的な考慮事項
他のがんの診断と治療では長年にわたって成功を収めてきたにもかかわらず、全ての胃腸悪性腫瘍の中で最も予後が不良である（Ｆａｌｃｏｎｉ等，２００３）膵臓がんの生存期間には僅かな改善しか見られない（Ｈｉｄａｌｇｏ，２０１０；Ｒｙａｎ等，２０１４）。膵臓がんは現在、結腸がんと乳がんを上回り、米国におけるがん関連死の上位二つの原因の一つとなっている（Ｒａｈｉｂ等，２０１４）。現在、膵臓がんの５年生存率は約９％であり、がんの中で最も低い（Ｓｉｅｇｅｌ等，２０１４）。膵臓がんについて報告されている低い生存率の理由には、早期段階でこの疾患を診断し、介入することができないこと、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）で腫瘍を取り囲む高密度の線維化組織、及びこの悪性腫瘍の攻撃的な性質が含まれる（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ及びＢｒｅｎｔｎａｌｌ，２０１３）。長年にわたり、膵臓がんは化学療法及び非選択的である他の薬剤で治療されてきた。がん治療の進歩は、腫瘍特異的受容体及び／又は特定のがん及びその前駆型病変の遺伝子構造の同定を含む、腫瘍生物学のより深い理解によってもたらされてきた（Ｓｃｈａｌｌｙ及びＮａｇｙ，２００４）。
他のがんの診断と治療では長年にわたって成功を収めてきたにもかかわらず、全ての胃腸悪性腫瘍の中で最も予後が不良である（Ｆａｌｃｏｎｉ等，２００３）膵臓がんの生存期間には僅かな改善しか見られない（Ｈｉｄａｌｇｏ，２０１０；Ｒｙａｎ等，２０１４）。膵臓がんは現在、結腸がんと乳がんを上回り、米国におけるがん関連死の上位二つの原因の一つとなっている（Ｒａｈｉｂ等，２０１４）。現在、膵臓がんの５年生存率は約９％であり、がんの中で最も低い（Ｓｉｅｇｅｌ等，２０１４）。膵臓がんについて報告されている低い生存率の理由には、早期段階でこの疾患を診断し、介入することができないこと、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）で腫瘍を取り囲む高密度の線維化組織、及びこの悪性腫瘍の攻撃的な性質が含まれる（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ及びＢｒｅｎｔｎａｌｌ，２０１３）。長年にわたり、膵臓がんは化学療法及び非選択的である他の薬剤で治療されてきた。がん治療の進歩は、腫瘍特異的受容体及び／又は特定のがん及びその前駆型病変の遺伝子構造の同定を含む、腫瘍生物学のより深い理解によってもたらされてきた（Ｓｃｈａｌｌｙ及びＮａｇｙ，２００４）。
【0034】
胃腸（ＧＩ）ペプチドであるガストリン、特に生物学的に活性な形態であるガストリン－１７（Ｇ１７）は、膵臓がんの増殖の調節に関与する重要な因子である。ガストリンは発生学的には発達中の膵臓で発現されるが（Ｂｒａｎｄ及びＦｕｌｌｅｒ，１９８８）、成人の膵臓では発現が停止されており、出生後の成人の胃洞でのみ見出される。しかし、ガストリンペプチドはヒト膵臓がんで発現され（Ｓｍｉｔｈ等，１９９５）、自己分泌様式で増殖を刺激する（Ｓｍｉｔｈ等，１９９６ａ）。膵臓の発癌中、膵臓には膵上皮内腫瘍（ＰａｎＩＮ）と呼ばれる組織学的前がん病変が発生する。ガストリンとその受容体であるコレシストキニンＢ受容体（ＣＣＫ－ＢＲ）は、これらのＰａｎＩＮで再発現されるようになる（Ｐｒａｓａｄ等，２００５）。
【0035】
本開示の主題は、幾つかの実施態様では、体液性免疫抗腫瘍効果と細胞性免疫抗腫瘍効果の両方を一緒に生み出す治療の組み合わせを使用して、ヒト及び動物のがんを治療するための方法及び系に関する。より具体的には、本開示の主題は、幾つかの実施態様では、（１）腫瘍及び／又は循環腫瘍増殖因子に対する抗体を産生する免疫学的体液性Ｂ細胞応答を誘導し；且つ（２）腫瘍に対する免疫学的細胞性Ｔ細胞応答を誘導若しくは増強等して、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘発する薬物の特定の組み合わせを使用することに関する。より具体的には、本開示の主題は、幾つかの実施態様では、免疫チェックポイント遮断を引き起こす第二の薬物と組み合わせて抗ガストリンがんワクチンを使用してヒトがんを治療するための方法及び系に関する。更により特定的には、本開示の主題は、幾つかの実施態様では、増殖因子ガストリンの活性型に対してＢ細胞抗体応答を誘発するように設計された一又は複数種のがんワクチンを用いて特定のヒトがんを治療することに関する。ここで初めて開示されるように、幾つかの実施態様では、抗ガストリンワクチンにより、ヒト腫瘍が免疫チェックポイント阻害剤での治療に応答性になる可能性があり、従って、全体的な抗腫瘍効果を増強する予期せぬ相加的又は相乗的でさえある併用療法効果を生み出す。
【0036】
本開示の主題は、幾つかの実施態様では、体液性抗体免疫応答（ガストリンがんワクチン）と細胞性Ｔ細胞免疫応答（免疫チェックポイント遮断）の両方を生じる方法の組み合わせを使用する、腫瘍及び／又はがんの治療方法にも関する。幾つかの実施態様では、本開示の主題は、体液性免疫抗腫瘍効果と細胞性免疫抗腫瘍効果の両方を生じる薬物クラスの新規で独特の組み合わせを使用して、ヒト及び動物胃腸腫瘍を治療する際に、新規で予想外の、相加的及び／又は相乗的効果を生み出す組成物及び方法に関する。幾つかの実施態様では、本開示の主題は、（１）腫瘍増殖因子及び／又は循環腫瘍増殖因子に対する免疫学的体液性Ｂ細胞応答を誘導し；且つ（２）腫瘍に対する免疫学的細胞性Ｔ細胞応答を引き起こし及び／又は増強して、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘発する、薬物の特定の組み合わせを使用することに関する。幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ガストリンがんワクチンと、免疫チェックポイント遮断を引き起こす一又は複数種の第二の薬物との本開示の組み合わせを使用して、ヒト及び動物がんを治療するための方法及び系に関する。幾つかの実施態様では、本開示の主題は、増殖因子ガストリンの活性型に対してＢ細胞抗体応答を誘発するように設計された一又は複数種のがんワクチンを用いて特定のヒトがんを治療することに関し、これは、ここに開示されるように、予想外にもヒト腫瘍が免疫チェックポイント阻害剤による治療に対してより応答性になる結果となり、抗腫瘍効果を増強する予期せぬ相加的、若しくは相乗的でありさえする併用療法効果を生み出す。従って、幾つかの実施態様では、本開示の主題は、免疫チェックポイント阻害剤と共にＰＡＳを使用することに関する。幾つかの実施態様では、本開示の主題は、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を誘導するがんワクチンとしてＰＡＳを使用することに関する。
【0037】
本開示の主題はまた幾つかの実施態様において体液性抗体免疫応答を誘導する組成物（例えば、ガストリンがんワクチン）を使用してガストリン関連腫瘍及び／又はがん及び／又はその前がん性病変のイニシエーション及び／又は進行の予防のための方法に関する。幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ヒト及び動物胃腸腫瘍及び／又はがん及び／又はその前がん性病変に対して体液性免疫を誘導する免疫原を使用して、ヒト及び動物の胃腸腫瘍及びその前がん性病変のイニシエーション及び／又は進行の予防に新規で予想外の、相加的及び／又は相乗的効果を生み出す組成物及び方法に関する。幾つかの実施態様では、本開示の主題は、（１）腫瘍及び／又はがん増殖因子及び／又は循環腫瘍及び／又は増殖因子に対する体液性Ｂ細胞応答を誘導し；並びに／或いは（２）腫瘍に対する免疫学的細胞性Ｔ細胞応答を引き起こし及び／又は増強して、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘発する、ガストリン免疫原に関する。幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ここに開示されるように、予期せぬことに、ヒト腫瘍のイニシエーション及び／又は進行を予防する、増殖因子ガストリンの活性型に対してＢ細胞抗体応答を誘発するように設計された一又は複数種のがんワクチンを用いて、特定のヒト腫瘍及び／又はがん及び／又はその前がん性病変を予防することに関する。幾つかの実施態様では、本開示の主題は、腫瘍及び／又はがんの予防のためのガストリンワクチンポリクローナル抗体刺激剤（ＰＡＳ）の使用に関する。幾つかの実施態様では、本開示の主題は、腫瘍、がん、及び／又は前がん病変のイニシエーション及び／又は進行を予防し又は遅らせるのに十分な両方の体液性免疫応答を誘導するがんワクチンとしてＰＡＳを使用することに関する。
【0038】
ＩＩ．定義
ここで使用される用語法は、特定の実施態様を説明することのみを目的としており、本開示の主題を限定することを意図したものではない。
ここで使用される用語法は、特定の実施態様を説明することのみを目的としており、本開示の主題を限定することを意図したものではない。
【0039】
次の用語は当業者にはよく理解されていると考えられるが、次の定義を、本開示の主題の説明を容易にするために記載する。
【0040】
以下に別段の定義がない限り、ここで使用される全ての技術及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有することが意図される。ここで用いられる技術への言及は、当業者には明らかであろうそれらの技術の変形又は同等の技術の代替を含み、当該技術分野で一般に理解されている技術を指すことが意図される。次の用語は当業者にはよく理解されていると考えられるが、次の定義を、本開示の主題の説明を容易にするために記載する。
【0041】
本開示の主題を説明する際に、多くの技術及びステップが開示されることが理解される。これらのそれぞれには個別の利点があり、それぞれを他の開示された技術の一又は複数、又は場合によっては全てと組み合わせて使用することもできる。
【0042】
従って、明確にするために、この説明では、個々のステップのあらゆる可能な組み合わせを不必要な形で繰り返すことは控える。それにも関わらず、明細書及び特許請求の範囲は、そのような組み合わせが完全に本開示の請求項記載の主題の範囲内にあることを理解して読まれるべきである。
【0043】
長年の特許法の慣例に従って、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は、特許請求の範囲を含み、この出願で使用される場合、「一又は複数」を指す。例えば、「一つの阻害剤（ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」という語句は、複数の同じ阻害剤を含む、一又は複数の阻害剤を指す。同様に、「少なくとも一つ」という語句は、エンティティを指すためにここで用いられる場合、限定されないが、１と１００の間及び１００を超える整数値を含み、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、又はそれ以上の該エンティティを指す。
【0044】
特に明記しない限り、明細書及び特許請求の範囲で使用される成分、反応条件などの量を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。質量、重量、時間、体積、濃度、又はパーセンテージの量などの測定可能な値を指す場合にここで使用される「約」という用語は、特定された量からの、幾つかの実施態様では±２０％、幾つかの実施態様では±１０％、幾つかの実施態様では±０．５％、幾つかの実施態様では±１％、幾つかの実施態様では±０．５％、及び幾つかの実施態様では±０．１％の変動を、そのような変動が開示された方法を実施し及び／又は開示された組成物を用いるのに適切であるため、包含することを意味する。従って、特に明記しない限り、この明細書及び添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、本開示の主題によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化しうる近似値である。
【0045】
ここで使用される場合、「及び／又は」という用語は、エンティティのリストの文脈で使用される場合、単独で又は組み合わせて存在しているエンティティを指す。従って、例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、及び／又はＤ」という語句には、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤが個別に含まれるが、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの任意かつ全ての組み合わせ及びサブコンビネーションも含まれる。
【0046】
ここで使用される場合、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされる一又は複数のポリペプチドを含むタンパク質を指す。免疫グロブリン遺伝子には、典型的には、カッパ（κ）、ラムダ（λ）、アルファ（α）、ガンマ（γ）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、及びミュー（μ）定常領域遺伝子、並びに種々の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκ又はλの何れかに分類される。哺乳動物では、重鎖はγ、μ、α、δ、又はεとして分類され、これが免疫グロブリンのクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥをそれぞれ定める。他の種は、他の軽鎖及び重鎖遺伝子を有し（例えば、所定の鳥類は、鶏が卵の黄身に沈着させる免疫グロブリンタイプである、ＩｇＹと呼ばれるものを産生する）、それらは同様に、本開示の主題に包含される。幾つかの実施態様では、「抗体」という用語は、限定されないが、配列番号：１又は配列番号：２又は配列番号：３又は配列番号：４に示されるアミノ酸配列内に存在するエピトープを含む、ガストリン遺伝子産物上に存在するエピトープに特異的に結合する抗体を指す。
【0047】
典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体を含むことが知られている。各四量体は、各対が一つの「軽」鎖（約２５キロダルトン（ｋＤａ）の平均分子量）と一つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａの平均分子量）を有する、二つの同一対のポリペプチド鎖から構成される。ポリペプチド鎖の二つの同一対は、重鎖領域内に存在するジスルフィド結合によって二量体形態で一緒に保持される。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関与する約１００から１１０以上のアミノ酸の可変領域を定める。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖及び重鎖を指す。
【0048】
抗体は、典型的には、インタクトな免疫グロブリンとして、又は様々なペプチダーゼによる消化によって産生されうる、多くの特徴が明確な断片として存在する。例えば、抗体分子をパパインで消化させると、ジスルフィド結合のＮ末端側の位置で抗体が切断される。これにより、三つの断片が生成される：軽鎖と重鎖のＮ末端を持つ二つの同一「Ｆａｂ」断片と、ジスルフィド結合によって一緒に保持された重鎖のＣ末端を含む「Ｆｃ」断片である。一方、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合のＣ末端で抗体を消化して、「Ｆ（ａｂ）’２」断片として知られる断片を産生し、これは、ジスルフィドによって結合されたＦａｂ断片の二量体である。Ｆ（ａｂ）’２断片は穏やかな条件下で還元され得、ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断し、それによってＦ（ａｂ’）２二量体を二つのＦａｂ’単量体に変換する。Ｆａｂ’単量体は本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂ断片である（例えば、他の抗体断片のより詳細な説明については、Ｐａｕｌ，１９９３を参照）。これらの様々な断片に関して、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦａｂ’断片には、少なくとも一つのインタクトな抗原結合ドメインが含まれ、よって抗原に結合することができる。
【0049】
様々な抗体断片がインタクトな抗体の消化という観点から定義されるが、当業者であれば、（限定されないが、Ｆａｂ’断片を含む）これらの断片の様々なものが化学的に又は組換えＤＮＡ法を利用することによって新たに合成できることを理解するであろう。従って、ここで使用される「抗体」という用語には、全抗体の修飾によって産生されるか、又は組換えＤＮＡ法を使用して新たに合成される抗体断片がまた含まれる。幾つかの実施態様では、「抗体」という用語は、少なくとも一つの抗原結合ドメインを有する断片を含む。
【0050】
抗体はポリクローナル又はモノクローナルでありうる。ここで使用される場合、「ポリクローナル」という用語は、抗体の所与の集合内に一緒に存在する、異なる抗体産生細胞（例えば、Ｂ細胞）に由来する抗体を指す。例示的なポリクローナル抗体には、限定されないが、特定の抗原に結合し、動物が抗原に対して免疫応答を生じた後にその動物の血液中に見出される抗体が含まれる。しかしながら、抗体のポリクローナル調製物は、少なくとも非同一の二つの抗体を混合することによって人工的に調製することもできることが理解される。従って、ポリクローナル抗体には、典型的には、任意の所与の抗原の異なるエピトープ（時折「抗原決定基」又は単に「決定基」と呼ばれる）に対する（すなわち、結合する）異なる抗体が含まれる。
【0051】
ここで使用される場合、「モノクローナル」という用語は、単一の抗体種及び／又は単一の抗体種の実質的に均一な集団を指す。別の言い方をすると、「モノクローナル」とは、天然に存在する可能な変異、又は少量で存在しうる翻訳後修飾を除いて、抗体が特異性及び親和性において同一である、個々の抗体又は個々の抗体の集団を指す。典型的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、単一Ｂ細胞又はその子孫細胞によって産生される（但し、本開示の主題は、ここに記載の分子生物学的技術によって産生される「モノクローナル」抗体をまた包含する）。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は高度に特異的であり、典型的には単一抗原部位に対して作られる。更に、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、所与のｍＡｂは典型的には、抗原上の単一エピトープに対して作られる。
【0052】
ｍＡｂは、その特異性に加えて、他の抗体に汚染されないで合成できるという点で、幾つかの目的に対して有利な場合がある。しかしながら、「モノクローナル」という修飾語は、何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、幾つかの実施態様では、本開示の主題のｍＡｂは、Ｋｏｈｌｅｒ等，１９７５によって最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して調製され、幾つかの実施態様では、細菌又は真核動物細胞又は植物細胞において組換えＤＮＡ法を使用して作製される（例えば、その全内容が出典明示によりここに援用される米国特許第４８１６５６７号を参照）。ｍＡｂはまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ等，１９９１及びＭａｒｋｓ等，１９９１に記載されている技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【0053】
本開示の主題の抗体、断片、及び誘導体には、キメラ抗体もまた含まれうる。抗体との関連でここで使用される場合、「キメラ」という用語とその文法的変形語は、ある種由来の抗体定常領域に実質的又は排他的に由来する定常領域と、別の種の可変領域の配列に実質的又は排他的に由来する可変領域とを有する抗体誘導体を指す。特定の種類のキメラ抗体は「ヒト化」抗体であり、この抗体は、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体のＣＤＲと置換することによって産生される（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第１９９２／２２６５３号を参照）。従って、幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、対応するヒト抗体領域に実質的又は排他的に由来するＣＤＲ以外の定常領域及び可変領域と、ヒト以外の哺乳動物に実質的又は排他的に由来するＣＤＲを有する。
【0054】
本開示の主題の抗体、断片、及び誘導体はまた単鎖抗体及び単鎖抗体断片でありうる。単鎖抗体断片は、ここに記載される全抗体の可変領域及び／又はＣＤＲの少なくとも一つを有するが、それら抗体の定常ドメインの一部又は全てを欠いているアミノ酸配列を含む。これらの定常ドメインは抗原結合には必要ではないが、全抗体の構造の主要部分を構成する。
【0055】
単鎖抗体断片は、定常ドメインの一部又は全てを含む抗体の使用に関連する問題の幾つかを克服できる。例えば、単鎖抗体断片は、生体分子と重鎖定常領域との間の望ましくない相互作用、又は他の望まれない生物学的活性を含まない傾向がある。加えて、単鎖抗体断片は全抗体よりもかなり小さいため、全抗体よりも高い毛細血管透過性を有しており、単鎖抗体断片が局在化して標的の抗原結合部位により効率的に結合できるようになる。また、抗体断片は原核細胞内で比較的大規模に産生できるため、その生産が容易になる。更に、単鎖抗体断片のサイズは比較的小さいため、全抗体よりもレシピエントに免疫応答を誘発する可能性が低くなる。本開示の主題の単鎖抗体断片には、限定されないが、単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）抗体及びそれらの誘導体、例えば、限定されないが、タンデムジ－ｓｃＦｖ、タンデムトリ－ｓｃＦｖ、ダイアボディ、及びトリアボディ、テトラボディ、ミニ抗体、及びミニボディが含まれる。
【0056】
Ｆｖ断片は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のＮ末端の可変断片に対応する。Ｆｖ断片は、Ｆａｂ断片よりもその二つの鎖の相互作用エネルギーが低いようである。ＶＨドメインとＶＬドメインの結合を安定させるために、それらはペプチド（Ｂｉｒｄ等，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ等，１９８８を参照）、ジスルフィド架橋（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ等，１９９０）、及び「ノブ・イン・ホール」変異（Ｚｈｕ等，１９９７）で連結されている。ＳｃＦｖ断片は、当業者によく知られた方法により産生することができる（例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗ等，１９９１及びＨｕｓｔｏｎ等，１９９３を参照）。
【0057】
ｓｃＦｖは、大腸菌などの細菌細胞又は真核細胞内で産生されうる。ｓｃＦｖの一つの潜在的な欠点は、多価結合による結合力の増加を妨げうる生成物の一価性とその短い半減期である。これらの問題を克服する試みには、追加のＣ末端システインを含むｓｃＦｖから化学的結合によって（Ａｄａｍｓ等，１９９３；ＭｃＣａｒｔｎｅｙ等，１９９５）、又は不対Ｃ末端システイン残基を含むｓｃＦｖの自発的な部位特異的二量体化によって（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ等，１９９５を参照）、二価（ｓｃＦｖ’）２を産生するものがある。
【0058】
或いは、ペプチドリンカーを３から１２残基に短縮して「ダイアボディ」を形成することにより、ｓｃＦｖに多量体を強制的に形成させることができる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ等，１９９３を参照）。リンカーの低減はまた更にｓｃＦｖ三量体（「トリアボディ」；Ｋｏｒｔｔ等，１９９７を参照）及び四量体（「テトラボディ」；Ｌｅ Ｇａｌｌ等，１９９９を参照）を生じうる。二価ｓｃＦｖ分子の構築は、「ミニ抗体」（Ｐａｃｋ等，１９９２を参照）及び「ミニボディ」（Ｈｕ等，１９９６を参照）を形成するタンパク質二量体化モチーフとの遺伝子融合によっても達成できる。ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖタンデム（（ｓｃＦｖ）２）は、二つのｓｃＦｖ単位を第三のペプチドリンカーによって連結することによって産生されうる（Ｋｕｒｕｃｚ等，１９９５を参照）。
【0059】
二重特異性ダイアボディは、ある抗体由来のＶＨドメインを短いリンカーによって別の抗体のＶＬドメインに連結してなる二つの単鎖融合産物の非共有的結合を通じて産生されうる（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ等，１９９８を参照）。そのような二重特異性ダイアボディの安定性は、上に記載したジスルフィド架橋又は「ノブ・イン・ホール」変異の導入によって、又は二つのハイブリッドｓｃＦｖ断片がペプチドリンカーを介して連結される単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）の形成によって（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ等，１９９９を参照）、増強されうる。
【0060】
四価の二重特異性分子は、例えば、ｓｃＦｖ断片をＩｇＧ分子のＣＨ３ドメインに、又はヒンジ領域を介してＦａｂ断片に融合させることによって、産生することができる（Ｃｏｌｏｍａ等，１９９７を参照）。或いは、四価の二重特異性分子は、二重特異性単鎖ダイアボディの融合によって作製されている（Ａｌｔ等，１９９９を参照）。より小さい四価の二重特異性分子は、ヘリックス－ループ－ヘリックスモチーフを含むリンカーを用いたｓｃＦｖ－ｓｃＦｖタンデム（ＤｉＢｉミニ抗体；Ｍｕｌｌｅｒ等，１９９８を参照）、又は分子内ペアリングを防止する配向で４つの抗体可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）を含む単鎖分子（タンデムダイアボディ；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ等，１９９９を参照）の何れかの二量体化によって形成することもできる。
【0061】
二重特異性Ｆ（ａｂ’）２断片は、Ｆａｂ’断片の化学結合又はロイシンジッパーを介したヘテロ二量体化によって作製されうる（Ｓｈａｌａｂｙ等，１９９２；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ等，１９９２を参照）。また利用可能であるものは単離されたＶＨ及びＶＬドメインである（米国特許第６１７２１９７号；第６２４８５１６号；及び第６２９１１５８号を参照）。
【0062】
本開示の主題には、抗ガストリン抗体の機能的等価物もまた含まれる。ここで使用される場合、抗体を指す「機能的等価物」という語句は、所与の抗体の結合特性に匹敵する結合特性を有する分子を指す。幾つかの実施態様では、キメラ化抗体、ヒト化抗体、及び単鎖抗体、並びにそれらの断片は、それらが基づく対応する抗体の機能的等価物と考えられる。
【0063】
機能的等価物にはまた本開示の主題の抗体の可変又は超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。アミノ酸配列に関してここで使用される場合、「実質的に同じ」という語句は、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，１９８８に従うＦＡＳＴＡ検索法によって決定して、別のアミノ酸配列に対して、幾つかの実施態様では少なくとも８０％、幾つかの実施態様では少なくとも８５％、幾つかの実施態様では少なくとも約９０％、幾つかの実施態様では少なくとも約９１％、幾つかの実施態様では少なくとも９２％、幾つかの実施態様では少なくとも９３％、幾つかの実施態様では少なくとも９４％、幾つかの実施態様では少なくとも９５％、幾つかの実施態様では少なくとも９６％、幾つかの実施態様では少なくとも９７％、幾つかの実施態様では少なくとも９８％、及び幾つかの実施態様では少なくとも約９９％の配列同一性を持つ配列を指す。幾つかの実施態様では、同一性パーセントの計算は、本開示の主題の抗体のアミノ酸配列の全長にわたって実施される。
【0064】
機能的等価物には、本開示の主題の全抗体の結合特性と同じ又は同等の結合特性を有する抗体の断片が更に含まれる。そのような断片は、一方又は両方のＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆｖ断片、又は少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む任意の他の断片を含みうる。幾つかの実施態様では、抗体断片は、本開示の主題の全抗体の６つのＣＤＲ全てを含むが、そのような領域の全てよりも少ない、例えば３つ、４つ、又は５つのＣＤＲを含む断片もまたここで定義される機能的同等物でありうる。更に、機能的等価物は、次の免疫グロブリンクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ、及びそれらのサブクラス、並びに非哺乳動物対象に適切であるかも知れない他のサブクラス（例えば、ニワトリ及び他の鳥類種のＩｇＹ）の何れか一つのメンバーでありうるか、又はそれらを組み合わせうる。
【0065】
機能的等価物には、本開示の主題の全タンパク質の特徴と同じ又は同等の特徴を有するペプチドが更に含まれる。そのようなペプチドは、治療された対象において免疫応答を誘発しうる、全タンパク質の一つ又は複数の抗原を含みうる。
【0066】
機能的等価物には、アプタマー及び他の非抗体分子もまた含まれるが、但し、そのような分子が、本開示の主題の全抗体の結合特性と同じ又は同等の結合特性を有することを条件とする。
【0067】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又は「を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）」と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、追加の未記載の要素及び／又は方法ステップを排除するものではない。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、指定された要素及び／又はステップが存在するが、他の要素及び／又はステップを追加することができ、依然として関連する主題の範囲内に含まれることを意味する専門用語である。
【0068】
ここで使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という語句は、特に記載されていない任意の要素、ステップ、又は成分を除外する。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」という語句が、前段部の直後ではなく、特許請求の範囲の特徴部の文節に出現する場合、その文節に記載されている要素のみを限定するものであり；他の要素は全体として請求項から除外されるものではないことに留意のこと。
【0069】
ここで使用される場合、「から本質的になる」という語句は、関連する開示又は請求項の範囲を、特定された材料及び／又はステップに加えて、開示され及び／又は請求項に記載された主題の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を与えないものに限定する。例えば、薬学的組成物は、一つの薬学的活性薬剤又は複数の薬学的活性薬剤「から本質的になり」得、これは、記載された薬学的活性薬剤が、薬学的組成物中に存在する唯一の薬学的活性薬剤であることを意味する。しかしながら、担体、添加物、及び／又は他の不活性薬剤がそのような薬学的組成物中に存在し得、また存在する可能性が高く、「から本質的になる」という語句の性質内に包含されることに留意のこと。
【0070】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語に関して、これら三つの用語のうちの一つがここで使用される場合、本開示の請求項記載の主題は、他の二つの用語の何れかの使用を含みうる。例えば、幾つかの実施態様では、本開示の主題は、抗体を含む組成物に関する。従って、本開示を検討した後に当業者であれば、本開示の主題が、本開示の主題の抗体から本質的になる組成物、並びに本開示の主題の抗体からなる組成物を包含することを理解するであろう。
【0071】
ここで使用される場合、「免疫細胞」という語句は、限定されないが、抗原提示細胞、Ｂ細胞、好塩基球、細胞傷害性Ｔ細胞、樹状細胞、好酸球、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、白血球、リンパ球、マクロファージ、マスト細胞、メモリー細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好中球、食細胞、形質細胞及びＴ細胞を含む、哺乳動物免疫系の細胞を指す。
【0072】
ここで使用される場合、「免疫応答」という語句は、限定されないが、自然免疫、体液性免疫、細胞性免疫、免疫、炎症反応、獲得（適応）免疫、自己免疫、及び／又は過剰免疫を含む免疫を指す。
【0073】
ここで使用される場合、「ガストリン関連がん」という語句は、ガストリン遺伝子産物が、腫瘍及び／又はがん細胞に外因的に適用されたときと、自己分泌及びパラ分泌機構を介するインビボの両方で、腫瘍及び／又はがん細胞増殖を刺激する栄養ホルモンとして作用する、腫瘍又はがん又はそれら由来の細胞である。例示的なガストリン関連がんには、膵臓がん、胃がん、胃食道がん、及び結腸直腸がんが含まれる。
【0074】
ここで使用される「ポリヌクレオチド」という用語には、限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、及び／又はｔＲＮＡが含まれる。
【0075】
ここで使用される場合、「単鎖可変断片」、「単鎖抗体可変断片」、及び「ｓｃＦｖ」抗体という語句は、リンカーペプチドによって連結された、重鎖及び軽鎖のみの可変領域を含む抗体の形態を指す。
【0076】
ここで使用される「対象」という用語は、任意の無脊椎動物又は脊椎動物種のメンバーを指す。従って、「対象」という用語は、幾つかの実施態様では、限定されないが、脊索動物門（例えば、硬骨魚綱（硬骨魚）、両生綱（両生類）、爬虫綱（爬虫類）、鳥綱（鳥類）、及び哺乳綱（哺乳類）のメンバー）及びそこに包含される全ての目及び科を含む、動物界の任意のメンバーを包含することが意図される。
【0077】
従って、本開示の主題の組成物及び方法は、温血脊椎動物に特に有用である。従って、幾つかの実施態様では、本開示の主題は、哺乳動物及び鳥類に関する。より特定的に提供されるのは、ヒト及び他の霊長類などの哺乳動物、並びに絶滅の危機に瀕しているため重要な哺乳動物（シベリアトラなど）、経済的に重要な哺乳動物（ヒトによる消費のために農場で飼育されている動物）及び／又はヒトにとって社会的に重要な哺乳動物（ペットとして又は動物園で飼われている動物）、例えば、ヒト以外の肉食動物（ネコ及びイヌなど）、ブタ（ｓｗｉｎｅ）（ブタ（ｐｉｇｓ）、雄ブタ、及びイノシシ）、反芻動物（ウシ、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、及びラクダなど）、齧歯類（マウス、ラット、及びウサギなど）、有袋類、及びウマに由来し、並びに／或いはそれらにおいて使用するための組成物及び方法である。また提供されるのは、動物園で飼育されている絶滅危惧種の鳥類、並びに家禽（ｆｏｗｌ）、より具体的には、ヒトにとって経済的にも重要であるため、家畜化された家禽、例えば、家禽（ｐｏｕｌｔｒｙ）、例えば七面鳥、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウなどを含む鳥類への開示された方法及び組成物の使用である。従って、また提供されるのは、限定されないが、家畜化されたブタ（ｓｗｉｎｅ）（ブタ（ｐｉｇｓ）及び雄ブタ）、反芻動物、ウマ、家禽などを含む家畜に対する開示された方法及び組成物の使用である。
【0078】
ここで使用される場合、「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」という用語は互換性があり、同義的に使用される。例には、限定されないが、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞及びそれらの組み合わせが含まれる。
【0079】
ここで使用される場合、「治療薬」という語句は、疾患又は障害、例えば限定されないが、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを、例えば、治療し、阻害し、予防し、その影響を軽減し、その重症度を低減させ、発症の可能性の低減させ、その進行を遅らせ、及び／又は治癒するために使用される薬剤を指す。
【0080】
ここで使用される「治療」及び「治療する」という用語は、治療的処置と予防的又は防止的方策の両方を指し、その目的は、標的とされる病的状態を予防し又は遅らせ（軽減させ）、病的状態を予防し、有益な結果を追求し又は獲得し、並びに／或いはたとえ治療が最終的に成功しなかったとしても、個体が状態、疾患、又は障害を発症する見込みを低下させることである。幾つかの実施態様では、「治療」は、限定されないが、外科的除去後の腫瘍及び／又はがんの再発の予防又は遅延化など、以前の治療後の状態の再発の予防又は遅延化に関する。治療を必要とする者には、既にその状態にある者並びに状態、疾患、又は障害に罹りやすいか、又はその素因がある者、或いはその状態を予防すべき者が含まれる。
【0081】
ここで使用される場合、「腫瘍」という用語は、悪性か良性かを問わず、あらゆる新生物細胞の成長及び／又は増殖、並びにその転移のイニシエーション、進行、増殖、維持がガストリンの自己分泌及び／又はパラ分泌作用によって直接的又は間接的に影響を受ける全ての前がん性及びがん性の細胞及び組織を指す。「がん」及び「腫瘍」という用語は、ここでは互換的に使用され、限定されないが、膵臓がん、胃がん、胃食道がん、及び結腸直腸がん（ここでは集合的に「ガストリン関連」腫瘍及び／又はがんと呼ばれる）を含む、対象における任意の組織の原発性と転移性の両方の固形腫瘍及び癌腫を指しうる。ここで使用される場合、「がん」及び「腫瘍」という用語は、多細胞腫瘍、並びに個々の新生物又は前新生物細胞を指すことも意図される。幾つかの実施態様では、がん又は腫瘍は、限定されないが癌腫などの上皮組織のがん又は腫瘍を含む。幾つかの実施態様では、腫瘍は腺癌であり、これは、幾つかの実施態様では、膵臓、肝臓、胃、食道、結腸、又は直腸の腺癌、並びに／或いはそれらに由来する転移性細胞である。幾つかの実施態様では、腫瘍及び／又はがんは線維化（線維症）と関連しており、これは、腫瘍及び／又はがんの発生の直接的又は間接的な結果として、線維化の一又は複数の領域が典型的には腫瘍及び／又はがんの領域に発生することを意味する。
【0082】
ここに開示される全ての遺伝子、遺伝子名、及び遺伝子産物は、ここに開示される組成物及び方法が適用可能である任意の種に由来するホモログ及び／又はオルソログに対応することが意図される。従って、該用語には、限定されないが、ヒト及びマウス由来の遺伝子及び遺伝子産物が含まれる。特定の種に由来する遺伝子又は遺伝子産物が開示される場合、この開示は例示のみを意図しており、それが現れる文脈が明確に示していない限り、限定として解釈されるべきではないことが理解される。従って、例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）生物配列データベース受入番号：ＮＰ＿０００７９６．１に提示されるガストリン遺伝子産物については、開示されるヒトアミノ酸配列は、限定されないが、他の哺乳類、魚類、両生類、爬虫類、及び鳥類を含む他の動物由来のホモロガス及びオルソロガスガストリン遺伝子及び遺伝子産物を包含することが意図される。また包含されるのは、限定されないが、対応するＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）エントリーに開示されたもの（すなわち、それぞれ、ＮＰ＿０００７９６．１及びＮＭ＿０００８０５．５）を含む、開示されたアミノ酸配列をコードする任意且つ全てのヌクレオチド配列である。
【0083】
ＩＩＩ．抗ガストリンワクチンの開発
腫瘍関連抗原ベースのワクチンに対する独特のアプローチが、ＰＣ及び他の胃腸がんに対する重要な自己分泌及びパラ分泌増殖因子としてのガストリンの関与を利用することによって、取られている。このアプローチには、「ポリクローナル抗体刺激剤」又はＰＡＳと呼ばれる化合物を用いて、ガストリン－１７（Ｇ１７）に対する能動体液性免疫を通じてガストリンの栄養効果を中和することが含まれる。ＰＡＳは、マウスとヒトにおいて同一であり、リンカー分子を介してジフテリアトキソイド（ＤＴ）にコンジュゲートされる、Ｇ１７のＮ末端配列に由来する９アミノ酸のガストリンエピトープを含む。この化合物は、ＰＡＳを作るために油性アジュバントに配合されている。ＰＡＳは特異的で高親和性のポリクローナル抗Ｇ１７抗体の産生を刺激するが、ＤＴ単独では効果がなかった（Ｗａｔｓｏｎ等，１９９６）。前臨床試験が、結腸がん（Ｓｉｎｇｈ等，１９８６；Ｓｍｉｔｈ及びＳｏｌｏｍｏｎ，１９８８；Ｕｐｐ等，１９８９；Ｓｍｉｔｈ等，１９９６ｂ）、胃がん（Ｓｍｉｔｈ等，１９９８ａ；Ｗａｔｓｏｎ等，１９８９）、肺がん（Ｒｅｈｆｅｌｄ等，１９８９）、及び膵臓がん（Ｓｍｉｔｈ等，１９９０；Ｓｍｉｔｈ等，１９９１；Ｓｍｉｔｈ等，１９９５；Ｓｅｇａｌ等，２０１４）を含むガストリン応答性の胃腸（ＧＩ）がんを有する幾つかの動物モデルで実施された。
腫瘍関連抗原ベースのワクチンに対する独特のアプローチが、ＰＣ及び他の胃腸がんに対する重要な自己分泌及びパラ分泌増殖因子としてのガストリンの関与を利用することによって、取られている。このアプローチには、「ポリクローナル抗体刺激剤」又はＰＡＳと呼ばれる化合物を用いて、ガストリン－１７（Ｇ１７）に対する能動体液性免疫を通じてガストリンの栄養効果を中和することが含まれる。ＰＡＳは、マウスとヒトにおいて同一であり、リンカー分子を介してジフテリアトキソイド（ＤＴ）にコンジュゲートされる、Ｇ１７のＮ末端配列に由来する９アミノ酸のガストリンエピトープを含む。この化合物は、ＰＡＳを作るために油性アジュバントに配合されている。ＰＡＳは特異的で高親和性のポリクローナル抗Ｇ１７抗体の産生を刺激するが、ＤＴ単独では効果がなかった（Ｗａｔｓｏｎ等，１９９６）。前臨床試験が、結腸がん（Ｓｉｎｇｈ等，１９８６；Ｓｍｉｔｈ及びＳｏｌｏｍｏｎ，１９８８；Ｕｐｐ等，１９８９；Ｓｍｉｔｈ等，１９９６ｂ）、胃がん（Ｓｍｉｔｈ等，１９９８ａ；Ｗａｔｓｏｎ等，１９８９）、肺がん（Ｒｅｈｆｅｌｄ等，１９８９）、及び膵臓がん（Ｓｍｉｔｈ等，１９９０；Ｓｍｉｔｈ等，１９９１；Ｓｍｉｔｈ等，１９９５；Ｓｅｇａｌ等，２０１４）を含むガストリン応答性の胃腸（ＧＩ）がんを有する幾つかの動物モデルで実施された。
【0084】
動物では、ＰＡＳで産生された抗Ｇ１７抗体が胃腸腫瘍の増殖と転移を軽減することが示されている（Ｗａｔｓｏｎ等，１９９５；Ｗａｔｓｏｎ等，１９９６；Ｗａｔｓｏｎ等，１９９９）。ＰＡＳによる能動免疫とＰＡＳで産生された抗Ｇ１７抗体による受動免疫の両方（Ｗａｔｓｏｎ等，１９９９）が、ＧＩがんの動物モデルにおいて腫瘍増殖を阻害することが示されている（Ｗａｔｓｏｎ等，１９９８；Ｗａｔｓｏｎ等，１９９９）。
【0085】
進行性膵臓がんの治療のためのＰＡＳの前向き無作為化二重盲検プラセボ対照群逐次試験が、進行性膵臓がんを有するヒト患者において行われた。この試験の主目的は、患者の生存期間について単独療法ＰＡＳの効果をプラセボと比較することであった。全体として、患者の６５％がＰＡＳに対して抗体応答を示した。ＰＡＳ治療群の対象はプラセボ群よりも長く生存した（それぞれ平均１５０日対８４日；ｐ＝０．０１６）。しかし、患者を、ＰＡＳに対して免疫応答を生じたか（すなわち、ＰＡＳレスポンダー）、又は免疫応答を生じなかったか（すなわち、ＰＡＳノンレスポンダー）に基づいて層別化した場合、レスポンダーで生存期間が有意に増加した（ｐ＝０．００３）。
【0086】
現在までに、４６９人のＰＤＡＣ患者が臨床試験においてＰＡＳで治療されている。これらの対象の約９０％が防御的抗体力価を誘発した。４つの試験からのプールされたデータ（ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３、及びＰＣ６；Ｂｒｅｔｔ等，２００２；Ｇｉｌｌｉａｍ等，２０１２）では、レスポンダー患者は、ノンレスポンダー患者（１０６日；ｐ＝０．０００３）と比較して、生存日数中央値（１９１日）が有意に増加したことが示された。重要なことには、これらの患者は何れも、ガストリンの正常なレベル及び機能に悪影響を与える自己免疫型反応の証拠を示さなかった。
【0087】
ＰＡＳは、ガストリンに対する中和抗体の産生と共にＢ細胞応答を誘発することが知られている。しかし、臨床試験では長期生存者もまた存在することが実証されており、これは、抗腫瘍免疫の更なる機構がまた関与している可能性があることが示唆している。しかし、ＰＡＳが、幾つかの実施態様では、膵臓がん又は未治療のまま放置すると膵臓がんに進行しうる前がん病変でありうる、ガストリン関連腫瘍、がん、及びそれらの前がん病変のイニシエーション及び／又は進行をまた予防することは初めて示された。
【0088】
ＩＶ．ＰＡＳ＋チェックポイント阻害剤併用療法
ＩＶ．Ａ．全般
ＰＡＳ投与は、ＰＤＡＣにおいて不適切に発現（すなわち、過剰発現）されるがん胎児性タンパク質ガストリンに対する体液性抗体応答及び細胞性免疫応答を生み出す。ＰＤＡＣにおけるこの不適切なガストリン発現は、自己分泌及びパラ分泌増殖促進効果を引き起こす。ガストリンに対する体液性抗体の引き続いての産生を伴うＰＡＳ投与は、この病理学的増殖促進効果を排除するのに役立つ。加えて、ガストリンに対するＰＡＳ媒介の体液性免疫応答は、不適切なガストリン発現に関連する血管新生の促進、アポトーシスの回避、細胞遊走の増加、及び侵襲性酵素発現の増加を逆転させるのにも役立つ（Ｗａｔｓｏｎ等，２００６）。
ＩＶ．Ａ．全般
ＰＡＳ投与は、ＰＤＡＣにおいて不適切に発現（すなわち、過剰発現）されるがん胎児性タンパク質ガストリンに対する体液性抗体応答及び細胞性免疫応答を生み出す。ＰＤＡＣにおけるこの不適切なガストリン発現は、自己分泌及びパラ分泌増殖促進効果を引き起こす。ガストリンに対する体液性抗体の引き続いての産生を伴うＰＡＳ投与は、この病理学的増殖促進効果を排除するのに役立つ。加えて、ガストリンに対するＰＡＳ媒介の体液性免疫応答は、不適切なガストリン発現に関連する血管新生の促進、アポトーシスの回避、細胞遊走の増加、及び侵襲性酵素発現の増加を逆転させるのにも役立つ（Ｗａｔｓｏｎ等，２００６）。
【0089】
ＰＡＳは３つのサブユニットを含む。第一サブユニットはガストリンエピトープであり、これは、システイン残基で終わるカルボキシ末端の７アミノ酸スペーサー配列を有するヒトＧ１７のアミノ末端アミノ酸残基１～９を含むペプチドである。この第一サブユニットの例示的な配列は、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥ（配列番号：２）である。
【0090】
ＰＡＳの第二サブユニットは、第一サブユニットを第三サブユニットに共有結合させるリンカーである。幾つかの実施態様では、リンカーはε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンアミドエステル（ｅＭＣＳ）であるが、限定されないが、ポリエチレングリコールリンカーなどの非ペプチドリンカーを含む任意のリンカーをこの目的に使用することもできる。
【0091】
ＰＡＳの第三サブユニットはジフテリアトキソイドであり、これは、第一サブユニットに対する体液性応答（特に、胃エピトープに対する体液性応答）を増強する担体タンパク質として使用される。しかしながら、幾つかの実施態様では、限定されないが、破傷風トキソイド又はウシ血清アルブミンなど、ジフテリアトキソイド以外の担体タンパク質を用いることができることに留意のこと。
【0092】
幾つかの実施態様では、その三サブユニットが筋肉内（ｉ．ｍ．）注射用に製剤化され、その製剤は優れた物理的、化学的、及び薬学的特性を有する。ＰＡＳはまた、ガストリンに対する中和抗体の生成と共にＢ細胞応答を誘発する。ガストリンは細胞増殖を増加させ、血管新生を促進し、アポトーシスの回避を促進し、細胞遊走を増加させ、侵襲性酵素の発現を増加させ、ＰＤＡＣ微小環境での線維化に関連しているため、これはＰＤＡＣに関連している。本開示の主題の幾つかの態様によれば、ガストリンの作用が遮断されると、ＣＤ８＋リンパ球がＰＤＡＣに流入し、それらが免疫チェックポイント療法に応答しやすくなる（例えば、Ｔ細胞媒介応答）。ここに開示されている通り、ＰＡＳはまた、Ｔ細胞応答と、ガストリン刺激に応答してサイトカインを産生するＣＤ８＋細胞を誘発する。
【0093】
ＰＡＳは、治療用ワクチン又は免疫療法として設計できる。ＰＡＳ誘導性体液性抗体は高度に特異的で、典型的にはＧ１７及びＧｌｙ－Ｇ１７に対する高い親和性を特徴とする。
【0094】
ＰＡＳは、ホルモンＧ１７とその前駆体Ｇｌｙ－Ｇ１７に対する抗体の治療上有効なレベルを一貫して誘導した。合計１５４２人の患者を対象とした２２件の臨床試験が完了している。重要なのは、ＰＡＳによる治療は、優れた安全性と忍容性プロファイルを示し、更に結腸直腸がん、胃がん、及び膵臓がんの患者において延命効果をもたらしたことである。単独療法として使用される場合、例示的な用量及びスケジュールは、０、１、及び３週目に２５０μｇ／０．２ｍｌの用量であることが特定された。
【0095】
まとめると、２２件の試験とＰＡＳで治療を受けた１５００人を超える患者から得られうる結論は次の通りである：
（ａ）非臨床データは、抗Ｇ１７抗体のインビトロ及びインビボ両方の抗腫瘍効果を示しており、ヒト膵臓がんモデルを含む様々ながんモデルにおいて幅広い治療指数を示した。
（ｂ）ＰＡＳは非常に安全で忍容性の高い用量で投与でき、有害反応や負の自己免疫効果の誘発もなく、ガストリンに対するＢ細胞抗体応答を効果的に生じる；及び
（ｃ）多数の臨床試験により、膵臓がんを含む胃腸腫瘍に対して延命効果と、抗Ｇ１７抗体応答の生成と生存期間の改善との相関関係が実証された。
（ａ）非臨床データは、抗Ｇ１７抗体のインビトロ及びインビボ両方の抗腫瘍効果を示しており、ヒト膵臓がんモデルを含む様々ながんモデルにおいて幅広い治療指数を示した。
（ｂ）ＰＡＳは非常に安全で忍容性の高い用量で投与でき、有害反応や負の自己免疫効果の誘発もなく、ガストリンに対するＢ細胞抗体応答を効果的に生じる；及び
（ｃ）多数の臨床試験により、膵臓がんを含む胃腸腫瘍に対して延命効果と、抗Ｇ１７抗体応答の生成と生存期間の改善との相関関係が実証された。
【0096】
しかし、臨床試験では長期生存者がいることもまた実証されており、ＰＡＳ投与によって更なる治療効果が得られたことが示唆されている。如何なる特定の作用理論にも束縛されることは望まないが、ＰＡＳ治療がこれらの対象において細胞傷害性Ｔ細胞及びメモリー細胞の活性化を特徴とするＴ細胞性免疫応答をまた誘導したかもしれないこともありうる。
【0097】
ＰＤＡＣにおけるチェックポイント阻害剤の使用は限られており、控えめの結果しか実証されていない。ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、及びＰＤ－Ｌ１阻害剤は、局所進行性又は転移性ＰＤＡＣ患者を対象とした多くの臨床試験において研究されている（Ｒｏｙａｌ等，２０１０；Ｂｒａｈｍｅｒ等，２０１２；Ｓｅｇａｌ等，２０１４）。デュルバルマブ（ＭＥＤＩ ４７３６）は、２０１４年にアメリカ臨床腫瘍学会で発表された予備分析で８％の部分奏効率をもたらした（Ｓｅｇａｌ等，２０１４）。
【0098】
膵臓腫瘍が、チェックポイント阻害剤を標的とするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ベースの免疫療法に対して比較的耐性があることがなぜ証明されたかは不明である。抗免疫チェックポイント阻害剤による免疫療法の失敗は、免疫抑制性白血球の大量浸潤に関連しているかもしれず、これにより実際に抗腫瘍免疫反応が抑制される可能性がある。これは、膵臓腫瘍微小環境における免疫特権の確立に役立つ炎症プログラムを駆動するＲＡＳ癌遺伝子の発現に関連しているかもしれない（Ｚｈｅｎｇ等，２０１３）。
【0099】
ＩＶ．Ｂ．チェックポイント阻害剤は細胞傷害性Ｔ細胞応答を生じさせる
免疫系は、自己（つまり「正常な」細胞）と、感染で見出される細菌であろうと、典型的には腫瘍及びがんで見出される改変及び／又は形質転換された細胞であろうと、「非自己」又は「外来」細胞とを区別する上で重要な中心的役割を果たす。このプロセスに関して、免疫系は正常な体細胞に対して自己免疫反応を起こさないように「自己」と認識すれば「オフ」にする一方、外来性及び／又は形質転換細胞を認識すれば「オン」にする必要がある絶妙な制御を必要とする。実際、細胞の形質転換は比較的一般的な現象であるが、免疫系はこれを効率的かつ効果的に監視し続け、外来性及び／又は形質転換細胞を効果的かつ効率的に排除する。形質転換細胞が、それらが正常な免疫系チェックポイントを破壊でき、免疫系がそれらを形質転換したと認識せず、例えば形質転換腫瘍細胞への細胞傷害性Ｔリンパ球の接着による免疫攻撃を無効にする機構を生じさせることは稀にしかないため、腫瘍形成及びがんは比較的稀な事象である。
免疫系は、自己（つまり「正常な」細胞）と、感染で見出される細菌であろうと、典型的には腫瘍及びがんで見出される改変及び／又は形質転換された細胞であろうと、「非自己」又は「外来」細胞とを区別する上で重要な中心的役割を果たす。このプロセスに関して、免疫系は正常な体細胞に対して自己免疫反応を起こさないように「自己」と認識すれば「オフ」にする一方、外来性及び／又は形質転換細胞を認識すれば「オン」にする必要がある絶妙な制御を必要とする。実際、細胞の形質転換は比較的一般的な現象であるが、免疫系はこれを効率的かつ効果的に監視し続け、外来性及び／又は形質転換細胞を効果的かつ効率的に排除する。形質転換細胞が、それらが正常な免疫系チェックポイントを破壊でき、免疫系がそれらを形質転換したと認識せず、例えば形質転換腫瘍細胞への細胞傷害性Ｔリンパ球の接着による免疫攻撃を無効にする機構を生じさせることは稀にしかないため、腫瘍形成及びがんは比較的稀な事象である。
【0100】
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１；ＣＤ２７９としても知られる）は、Ｔ細胞の表面に見出されるチェックポイントとして機能する細胞表面受容体である。ＰＤ－１は、「オフスイッチ」として機能し、Ｔ細胞が体内の正常細胞に対して細胞傷害性Ｔリンパ球攻撃を開始しないようにすると思われる。ヒトＰＤ－１は、２８８アミノ酸の前駆体タンパク質として産生され、その例示的なアミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）生物配列データベース受入番号ＮＰ＿００５００９．２（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＭ＿００５０１８．２によってコードされる）として提供される。２８８アミノ酸前駆体には、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＰ＿００５００９．２のアミノ酸１～２０としてシグナルペプチドが含まれており、これが除去されて成熟ペプチド（すなわち、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＰ＿００５００９．２のアミノ酸２１～２８８）が産生される。ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）生物配列データベース中に存在する他種由来のヒトＰＤ－１のオルソログのアミノ酸配列には、限定されないが、受入番号ＮＰ＿０３２８２４．１（ハツカネズミ）、ＮＰ＿００１１００３９７．１（ドブネズミ）、ＮＰ＿００１３０１０２６．１（イヌ）、ＮＰ＿００１１３８９８２．１（ネコ）、ＮＰ＿００１０７６９７５．１（ウシ）、ＸＰ＿００４０３３５５０．１（ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ））、ＮＰ＿００１１０７８３０．１（アカゲザル）、ＮＰ＿００１２７１０６５．１（カニクイザル）、及びＸＰ＿００３７７６１７８．１（スマトラオランウータン）が含まれる。
【0101】
ＰＤ－１受容体のリガンドは、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）と呼ばれる。それはＣＤ２７４又はＢ７ホモログ１（Ｂ７－Ｈ１）としてもまた知られている。ヒトには、ＰＤ－Ｌ１タンパク質の幾つかのアイソフォームがあり、その中で最も大きなもの（アイソフォームａ）は２９０アミノ酸の前駆体として産生される。ヒトＰＤ－Ｌ１前駆体タンパク質の例示的なアミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）生物配列データベース受入番号ＮＰ＿０５４８６２．１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＭ＿０１４１４３．３によってコードされる）として提供される。２９０アミノ酸の前駆体には、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＰ＿０５４８６２．１のアミノ酸１～１８としてシグナルペプチドが含まれており、これが除去されて成熟ペプチド（すなわち、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＰ＿０５４８６２．１のアミノ酸１９～２９０）が産生される。ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）生物配列データベース中に存在する他種由来のヒトＰＤ－Ｌ１のオルソログのアミノ酸配列には、限定されないが、受入番号ＮＰ＿０６８６９３．１（ハツカネズミ）、ＮＰ＿００１１７８８８３．１（ドブネズミ）、ＮＰ＿００１２７８９０１．１（イヌ）、ＸＰ＿００６９３９１０１．１（ネコ）、ＮＰ＿００１１５６８８４．１（ウシ）、ＸＰ＿０１８８８９１３９．１（ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ））、ＮＰ＿００１０７７３５８．１（アカゲザル）、ＸＰ＿０１５２９２６９４．１（カニクイザル）、及びＸＰ＿００９４５４５５７．１（ポンゴ・トログロダイト）が含まれる。
【0102】
ＰＤ－Ｌ１は主に正常細胞に見出され、ＰＤ－１を発現するＴ細胞がＰＤ－Ｌ１を伴う正常細胞に結合すると、Ｔ細胞にこれが正常細胞（つまり「自己」）であるシグナル伝達し、（正常）細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答が抑制される。殆どの形質転換細胞は典型的にはＰＤ－Ｌ１を発現しないため、常套的に排除され、これは、ＰＤ－１発現Ｔ細胞がそのような細胞に遭遇すると「停止」されるのではなく、むしろ「活性化」され、それによってその形質転換細胞が排除されることを意味する。しかし、稀に、形質転換細胞がＰＤ－Ｌ１リガンドを発現し、その結果、形質転換細胞に対するＴ細胞応答が停止することがある。よって、ＰＤ－Ｌ１を発現する形質転換細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞応答を回避できる。これが起こると、認識されない形質転換細胞が増殖し、更なる変異を獲得し、悪性の転移性腫瘍へと成長する場合がある。
【0103】
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１チェックポイントの阻害（「免疫チェックポイント阻害剤」と呼ばれる）は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合を妨害し、それによってＴリンパ球が腫瘍及び／又はがん細胞を非自己として認識できるようにし、その結果、腫瘍及び／又はがん細胞に対する細胞傷害性Ｔリンパ球反応を引き起こす。これは、Ｔ細胞上のＰＤ－１又は腫瘍及び／又はがん細胞上のＰＤ－Ｌ１を標的とし、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を効果的にブロックする薬物によって達成できる。このプロセスには少なくとも二つの要件が重要である。第一に、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間の如何なる相互作用も遮断するためには腫瘍及び／又はがんの部位に到達しなければならない。第二に、腫瘍及び／又はがん自体が細胞傷害性Ｔ細胞に到達可能でなければならない。
【0104】
別のチェックポイントタンパク質は細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４；ＣＤ１５２としても知られる）タンパク質である。ＰＤ－１と同様に、ＣＴＬＡ－４は免疫応答をダウンレギュレートできる細胞表面受容体である。活性化Ｔ細胞と同様にＴｒｅｇはＣＴＬＡ－４を発現する。ＣＴＬＡ－４受容体が抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に存在するＣＤ８０又はＣＤ８６に結合すると、ＰＤ－１と同様に、免疫応答に関して「オフスイッチ」として機能する。
【0105】
ヒトＣＴＬＡ４－ＴＭアイソフォームは、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＰ＿００５２０５．２（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＭ＿００５２１４．４によってコードされる）に示されたアミノ酸を有する２２３アミノ酸の前駆体タンパク質である。このタンパク質には３５アミノ酸のシグナルペプチドが含まれ、これが除去されると１８８アミノ酸の成熟タンパク質を生じる。ＧＥＮＢＡＮＫ生物配列データベース中に存在する他種由来のヒトＣＴＬＡ－４のオルソログのアミノ酸配列には、限定されないが、受入番号ＮＰ＿０３３９７３．２（ハツカネズミ）、ＮＰ＿１１３８６２．１（ドブネズミ）、ＮＰ＿００１００３１０６．１（イヌ）、ＮＰ＿００１００９２３６．１（ネコ）、ＮＰ＿７７６７２２．１（ウシ）、ＸＰ＿００４０３３１３３．１（ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ））、ＸＰ＿００９１８１０９５．２（アカゲザル）、ＸＰ＿００５５７４０７３．１（カニクイザル）、及びＸＰ＿５２６０００．１（チンパンジー）が含まれる。
【0106】
而して、幾つかの実施態様では、本開示の主題は、一又は複数種の免疫チェックポイント阻害剤と共にＰＡＳを投与することに関する。より具体的には、幾つかの実施態様において、本開示の主題は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、及び／又はＰＤ－Ｌ１を標的とする免疫チェックポイント阻害剤の使用に関する。これらの免疫チェックポイント阻害剤を阻害する例示的な化合物には、次のものが含まれる。ＣＴＬＡ－４の場合：イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）ブランド；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びトレメリムマブ（以前のチシリムマブ；Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ，ＬＬＣ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）。ＰＤ－１の場合：ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）ブランド；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ピジリズマブ（（Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）ブランド；Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ５１４；Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ，ＬＬＣ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、及びＡＵＮＰ－１２（Ａｕｒｉｇｅｎｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ／Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ Ｐｉｅｒｒｅ Ｆａｂｒｅ ＳＡ）。ＰＤ－Ｌ１の場合：ＢＭＳ－９３６５５９／ＭＤＸ－１１０５（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）ブランド、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６；Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ，ＬＬＣ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、及びアベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標）ブランド；ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，及びＰｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【0107】
ＰＤ－１阻害剤とＰＤ－Ｌ１阻害剤を比較すると、有効性と毒性に関しては相違よりも共通性があることが証拠により強く示唆される。実際、クロストライアルメタタイプ分析では、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ及びＭＤＸ１１０５が、毒性と有効性に関して非常に類似した（しかし同一ではない）プロファイルを有することが示されている。親和性と現在の投与レジメンは、様々なＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１阻害剤に対して異なるかもしれないが、一般的には全てに対して非常に幅広い治療域がある。この幅広い治療域に関連して、これらのチェックポイント阻害剤の殆どが第一相で失敗せず、多くの臨床開発計画が計量投与ではなく均一投与レジメンに移行している。
【0108】
ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１を標的とする薬物には、類似した作用機序、有効性プロファイル及び毒性プロファイルがあるが、一般にそれらの間には幾らかの微妙な違いがある。アベルマブは、ＰＡＳ由来Ｂ細胞応答を抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＤＣ）応答で補完する能力のため、他のＰＤ－Ｌ１標的薬よりも幾らか利点があるかもしれない。また、アベルマブは天然Ｆｃ受容体を持っているため、「正常な」ＡＤＣＣ応答を誘発することができる一方、アテゾリズマブは（少なくともヒトにおいて）ＡＤＣＣ応答を減少させることが予想されるかもしれない改変をＦｃ領域に有している。
【0109】
様々なＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１を標的とする薬物を比較する際に注意すべき別の差異は、あるものはヒト化ｍＡｂであり他のものは完全なヒトｍＡｂであるという事実である。ヒト化ｍＡｂは、ヒトに投与した場合、完全なヒトｍＡｂと比較して「アレルギー」タイプの反応を誘導する可能性が高まる特性があると想定されるかもしれない。
【0110】
Ｖ．組成物
Ｖ．Ａ．薬学的組成物
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、幾つかの実施態様では本開示の主題の方法において用いることができる薬学的組成物を提供する。
Ｖ．Ａ．薬学的組成物
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、幾つかの実施態様では本開示の主題の方法において用いることができる薬学的組成物を提供する。
【0111】
ここで使用される場合、「薬学的組成物」とは、薬学的組成物がそれを必要とする対象に投与される治療又は他の方法の一部として用いられることになる組成物を指す。幾つかの実施態様では、それを必要とする対象は、その少なくとも一つの症状、特徴、又は結果が、腫瘍及び／又はがん及び／又はそれに関連する細胞に直接的及び／又は間接的に作用する薬学的組成物の生物学的活性のため少なくとも部分的に寛解されることが期待される腫瘍及び／又はがんを有する対象である。
【0112】
薬学的組成物を調製するための技術は当該技術分野で知られており、幾つかの実施態様では、薬学的組成物は、薬学的組成物が投与されることになる対象に基づいて製剤化される。例えば、幾つかの実施態様では、薬学的組成物はヒト対象に使用するために製剤化される。従って、幾つかの実施態様では、薬学的組成物はヒトでの使用のために薬学的に許容される。
【0113】
幾つかの実施態様における本開示の主題の薬学的組成物は、ガストリンペプチド及び／又はＣＣＫ－Ｂ受容体に対する能動及び／又は受動体液性免疫応答を誘導及び／又は提供する第一の薬剤；並びに任意選択的に免疫チェックポイント阻害剤である第二の薬剤を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。幾つかの実施態様では、第一の薬剤は、ガストリンペプチド、抗ガストリン抗体、及び抗ＣＣＫ－Ｒ抗体からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、第一の薬剤は、ガストリンペプチド、任意選択的に、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥ（配列番号：１）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥ（配列番号：２）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹ（配列番号：３）、及びＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ（配列番号：４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなるガストリンペプチドを含む。幾つかの実施態様では、配列番号：１～４の何れかのアミノ酸位置１のグルタミン酸残基は、ピログルタミン酸残基である。幾つかの実施態様では、ガストリンペプチドは免疫原性担体にコンジュゲートされ、任意選択的に、免疫原性担体は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、ガストリンペプチドはリンカーを介して免疫原性担体にコンジュゲートされ、任意選択的にリンカーはε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む。
【0114】
幾つかの実施態様では、リンカーとガストリンペプチドとは、アミノ酸スペーサーによって分離されており、任意選択的に、アミノ酸スペーサーは、１と１０の間のアミノ酸長であり、更に任意選択的に、アミノ酸スペーサーは、７アミノ酸長である。
【0115】
体液性免疫応答を誘発するように設計された本開示の主題の薬学的組成物は、幾つかの実施態様では、アジュバント、任意選択的に油性アジュバントを更に含みうる。例示的なアジュバントには、限定されないが、モンタニドＩＳＡ－５１（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｉｎｃ．）；ＱＳ－２１（Ａｑｕｉｌａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；アルラセルＡ；オレイン酸；破傷風ヘルパーペプチド；ＧＭ－ＣＳＦ；シクロホスアミド；カルメットゲラン桿菌（ＢＣＧ）；コリンバクテリウム・パルバム（ｃｏｒｙｎｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）；レバミゾール、アジメゾン（ａｚｉｍｅｚｏｎｅ）；イソプリニゾン（ｉｓｏｐｒｉｎｉｓｏｎｅ）；ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）；フロイントアジュバント（完全及び不完全）を含むキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）；ミネラルゲル；水酸化アルミニウム（ミョウバン）；リゾレシチン；プルロニックポリオール；ポリアニオン；ペプチド；油エマルジョン；核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ）ジニトロフェノール；ジフテリア毒素（ＤＴ）；トール様受容体（ＴＬＲ、例えば、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８又はＴＬＲ９）アゴニスト（例えば、エンドトキシン、例えばリポ多糖類（ＬＰＳ）；モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）；ポリイノシン・ポリシチジン酸（ポリ－ＩＣＬＣ／ＨＩＬＴＯＮＯＬ（登録商標）；Ｏｎｃｏｖｉｒ，Ｉｎｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）；ＩＭＯ－２０５５、グルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）、ＱＳ－２１－キラヤサ科シャボンノキ樹皮から抽出されたサポニン（ソープバーク木又はソープバークとしても知られる）；レシキモド（ＴＬＲ７／８アゴニスト）、ＣＤＸ－１４０１－ＮＹ－ＥＳＯ－１腫瘍抗原に結合した樹状細胞受容体ＤＥＣ－２０５に対して特異性を有する完全ヒトモノクローナル抗体からなる融合タンパク質；Ｊｕｖａｒｉｓのカチオン性脂質ＤＮＡ複合体；Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ；並びにそれらの組み合わせが含まれる。
【0116】
本開示の主題の薬学的組成物は、幾つかの実施態様において、免疫チェックポイント阻害剤を含みうる。免疫チェックポイント阻害剤は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死１受容体（ＰＤ－１）、及びプログラム細胞死１受容体リガンド（ＰＤ－Ｌ１）からなる群から選択される標的ポリペプチドの生物学的活性を阻害する化合物クラスである。幾つかの実施態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ペムブロリズマブ、ＡＭＰ５１４、ＡＵＮＰ１２、ＢＭＳ－９３６５５９／ＭＤＸ－１１０５、アテゾリズマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６、ＲＯ５５４１２６７、ＭＥＤＩ４７３６、アベルマブ及びデュルバルマブからなる群から選択される。
【0117】
本開示の薬学的組成物の幾つかの実施態様では、第一の薬剤は、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥ（配列番号：１）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥ（配列番号：２）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹ（配列番号：３）、及びＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ（配列番号：４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、抗ガストリン体液性応答を誘導するのに有効な量のガストリンペプチドを含み、第二の薬剤は、ガストリン関連腫瘍又はがんを有する対象に投与されると、ガストリン関連腫瘍又はがんに対する細胞性免疫応答を誘導又は促進するのに有効な量のチェックポイント阻害剤を含む。
【0118】
本開示の薬学的組成物の幾つかの実施態様では、第一の薬剤は、一又は複数種の抗ＣＣＫ－Ｂ受容体抗体を含み、ガストリン関連腫瘍又はがんを有する対象に投与されると、ガストリン関連腫瘍又はがん上に存在するＣＣＫ－Ｂ受容体を介してガストリンシグナル伝達を低減し又は阻害するのに十分な量で薬学的組成物中に存在する。
【0119】
本開示の主題の薬学的組成物は、幾つかの実施態様では、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを治療するために用いられる。幾つかの実施態様では、本開示の主題の薬学的組成物は、膵臓がんを治療することが意図される。
【0120】
Ｖ．Ｂ．核酸
「ＲＮＡ」という用語は、少なくとも一つのリボヌクレオチド残基を含む分子を指す。「リボヌクレオチド」とは、β－Ｄ－リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖及び一本鎖領域の両方を含むＲＮＡ、部分精製ＲＮＡなどの単離ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えにより産生されたＲＮＡ、並びに、一又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び／又は改変により天然に存在するＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡ又はアナログＲＮＡを包含する。そのような改変は、例えばＲＮＡの一又は複数のヌクレオチドににおける、例えばｓｉＲＮＡの末端又は内部への、非ヌクレオチド物質の付加を含みうる。本開示の主題のＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチド、又は化学合成ヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドをまた含みうる。これらの改変ＲＮＡはアナログ又は天然に存在するＲＮＡのアナログと称されうる。
「ＲＮＡ」という用語は、少なくとも一つのリボヌクレオチド残基を含む分子を指す。「リボヌクレオチド」とは、β－Ｄ－リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖及び一本鎖領域の両方を含むＲＮＡ、部分精製ＲＮＡなどの単離ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えにより産生されたＲＮＡ、並びに、一又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び／又は改変により天然に存在するＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡ又はアナログＲＮＡを包含する。そのような改変は、例えばＲＮＡの一又は複数のヌクレオチドににおける、例えばｓｉＲＮＡの末端又は内部への、非ヌクレオチド物質の付加を含みうる。本開示の主題のＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチド、又は化学合成ヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドをまた含みうる。これらの改変ＲＮＡはアナログ又は天然に存在するＲＮＡのアナログと称されうる。
【0121】
「低分子（ｓｍａｌｌ）干渉ＲＮＡ」、「低分子（ｓｈｏｒｔ）干渉ＲＮＡ」、「低分子ヘアピンＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、及びｓｈＲＮＡという用語は互換的に使用され、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）又は遺伝子サイレンシングを媒介できる任意の核酸分子を指す。例えば、Ｂａｓｓ，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４２８－４２９，２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ等，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４－４９８，２００１ａ；及びＰＣＴ国際公開第００／４４８９５号、国際公開第０１／３６６４６号、国際公開第９９／３２６１９号、国際公開第００／０１８４６号、国際公開第０１／２９０５８号、国際公開第９９／０７４０９号、及び国際公開第００／４４９１４号を参照のこと。一実施態様では、ｓｉＲＮＡは、相補的センス及びアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、アンチセンス領域は、標的核酸分子（例えば、ガストリン遺伝子産物をコードする核酸分子）の領域に相補的な配列を含む。別の実施態様では、ｓｉＲＮＡは自己相補的センス及びアンチセンス領域を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含み、アンチセンス領域は、標的核酸分子の領域に相補的な配列を含む。別の実施態様では、ｓｉＲＮＡは一又は複数のループ構造を有する一本鎖ポリヌクレオチドと、自己相補的センス及びアンチセンス領域を含むステムを含み、アンチセンス領域は、標的核酸分子の領域に相補的な配列を含み、ポリヌクレオチドはインビボ又はインビトロでプロセシングされて、ＲＮＡｉを媒介可能な活性ｓｉＲＮＡを産生できる。ここで使用される場合、ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含む分子に限定される必要はなく、化学的に改変されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドを更に包含する。
【0122】
本開示の主題は、ＲＮＡ干渉と呼ばれるプロセスである細胞遺伝子のダウンレギュレーションを引き起こす短い二本鎖ＲＮＡ分子の能力を利用することにある。ここで使用される場合、「ＲＮＡ干渉」は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す。全般についてはＦｉｒｅ等，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６－８１１，１９９８を参照のこと。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を防ぐために進化してきた進化的に保存された細胞防御機構であると考えられる（Ｆｉｒｅ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １５：３５８－３６３，１９９９）。
【0123】
ＲＮＡｉは、所定のウイルス（特に二本鎖ＲＮＡウイルス又はライフサイクルに二本鎖ＲＮＡ中間体が含まれるウイルス）の感染に起因する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子の産生、又は一本鎖ＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡ種に相同なウイルスゲノムＲＮＡを特異的に分解する機構を介したトランスポゾンエレメントの宿主ゲノムへのランダムインテグレーションから細胞及び生物を保護するように進化してきた可能性がある。
【0124】
細胞内に長鎖ｄｓＲＮＡが存在するとリボヌクレアーゼＩＩＩである酵素ダイサーの活性が刺激される。ダイサーは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ等，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３－３６６，２００１）と呼ばれるｄｓＲＮＡの短鎖へのｄｓＲＮＡの分解を触媒する。ダイサー媒介分解から生じる低分子干渉ＲＮＡは、典型的には約２１～２３ヌクレオチド長であり、約１９塩基対の二重鎖を含む。分解後、ｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるエンドヌクレアーゼ複合体に取り込まれる。ＲＩＳＣはｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な細胞内に存在する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介できる。Ｅｌｂａｓｈｉｒ等によると、標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な一本鎖ＲＮＡ領域の中央付近で起こる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ等，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １５：１８８－２００，２００１ｂ）。
【0125】
ＲＮＡｉは幾つかの細胞型及び生物において記述されている。Ｆｉｒｅ等，１９９８では、線虫のＲＮＡｉが記載された。Ｗｉａｎｎｙ及びＺｅｒｎｉｃｋａ－Ｇｏｅｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２：７０－７５，１９９９では、マウス胚においてｄｓＲＮＡによって媒介されたＲＮＡｉが開示される。Ｈａｍｍｏｎｄ等，Ｎａｔｕｒｅ ４０４：２９３－２９６，２０００では、ｄｓＲＮＡをショウジョウバエ細胞にトランスフェクトすることによりショウジョウバエ細胞にＲＮＡｉを誘導できた。Ｅｌｂａｓｈｉｒ等，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４－４９８，２００１ａでは、合成２１ヌクレオチドＲＮＡの二重鎖の導入によりヒト胎児腎臓及びＨｅＬａ細胞を含む培養哺乳動物細胞でＲＮＡｉの存在が実証された。
【0126】
他の研究で、ｓｉＲＮＡ二重鎖の標的相補鎖上の５’－リン酸がｓｉＲＮＡ活性を促進し、ＡＴＰがｓｉＲＮＡ上の５’－リン酸部分を維持するために利用されることが示されている（Ｎｙｋａｎｅｎ等、Ｃｅｌｌ １０７：３０９－３２１，２００１）。ｓｉＲＮＡ分子に導入された場合に許容されるかもしれない他の修飾には、糖－リン酸骨格の修飾又は窒素若しくは硫黄ヘテロ原子の少なくとも一つでのヌクレオシドの置換（ＰＣＴ国際公開第００／４４９１４号及び国際公開第０１／６８８３６号）と、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、特に２’－アミノ若しくは２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、及び２’－Ｏ若しくは４’－Ｃメチレン架橋を含むヌクレオチドの活性化を阻害するかもしれない所定のヌクレオチド修飾（カナダ特許出願第２３５９１８０号）が含まれる。
【0127】
ｄｓＲＮＡ及びＲＮＡｉの使用を開示している他の参考文献には、ＰＣＴ国際公開第０１／７５１６４号（ショウジョウバエ由来の細胞を使用するインビトロＲＮＡｉ系、及び所定の機能ゲノム及び所定の治療用途のための特異的ｓｉＲＮＡ分子の使用）；国際公開第０１／３６６４６号（ｄｓＲＮＡ分子を使用して哺乳動物細胞の特定遺伝子の発現を阻害する方法；国際公開第９９／３２６１９号（遺伝子発現の阻害において使用するためにｄｓＲＮＡ分子を細胞内に導入する方法）；国際公開第０１／９２５１３号（ＲＮＡｉを増強する因子を使用して遺伝子抑制を媒介する方法）；国際公開第０２／４４３２１号（合成ｓｉＲＮＡコンストラクト）；国際公開第００／６３３６４号及び国際公開第０１／０４３１３号（ポリヌクレオチド配列の機能を阻害するための方法及び組成物）；並びに国際公開第０２／０５５６９２号及び国際公開第０２／０５５６９３号（ＲＮＡｉを使用する遺伝子発現の阻害方法）が含まれる。
【0128】
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、少なくとも一つのガストリン遺伝子産物の発現を少なくとも部分的に阻害するためにＲＮＡｉを利用する。阻害は、好ましくは、正常の発現量の少なくとも約１０％である。幾つかの実施態様では、本方法は、ガストリン遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な量のＲＮＡを標的細胞に導入することを含み、ここで、ＲＮＡは目的の遺伝子のコード鎖に対応するリボヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施態様では、標的細胞は対象中に存在し、ＲＮＡは対象中に導入される。
【0129】
ＲＮＡは、標的タンパク質（例えば、ガストリン遺伝子産物）をコードする遺伝子のコード鎖に対応するリボヌクレオチド配列を含む第一鎖と、第一鎖に相補的なリボヌクレオチド配列を含む第二鎖を含む二本鎖領域を有しうる。第一鎖と第二鎖は互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。二本鎖領域は、少なくとも１５塩基対長であり得、幾つかの実施態様では、１５から５０塩基対長であり得、幾つかの実施態様では、二本鎖領域は１５から３０塩基対長でありうる。
【0130】
幾つかの実施態様では、ＲＮＡは、少なくとも１９塩基にわたって好ましくは相補的である、分子内自己ハイブリダイゼーションにより二本鎖領域を形成する一本の鎖を含む。幾つかの実施態様では、ＲＮＡは、少なくとも１９塩基にわたって相補的である、分子間ハイブリダイゼーションにより二本鎖領域を形成する二本の別々の鎖を含む。
【0131】
当業者は、幾つもの適切な一般的技術を使用してＲＮＡの標的細胞内へ導入することができることを認識する。幾つかの実施態様では、ＲＮＡをコードしているベクターが標的細胞に導入される。例えば、ＲＮＡをコードするベクターを標的細胞にトランスフェクトすることができ、ＲＮＡはついで細胞ポリメラーゼによって転写される。
【0132】
幾つかの実施態様では、ＲＮＡをコードする核酸を含む組換えウイルスを産生することができる。その場合、標的細胞へのＲＮＡの導入は、標的細胞を組換えウイルスで感染させることを含む。細胞ポリメラーゼがＲＮＡを転写し、標的細胞内でのＲＮＡの発現が生じる。組換えウイルスの改変は、当業者にはよく知られている。当業者であれば、ここで更に詳細に検討する必要なく、本開示の主題で使用するための組換えウイルス産生を最適化するのに必要な適切なウイルス及びベクター成分の選択に関与する複数の要因を直ぐに理解するであろう。非限定的な一例として、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含む組換えアデノウイルスを改変することができる。ウイルスは、細胞が組換えアデノウイルスに感染し、ｓｉＲＮＡが転写され、感染した標的細胞で一過性に発現できるように、複製できないように改変できる。組換えウイルスの産生及び使用の詳細は、その全体が出典明示によりここに援用される、ＰＣＴ国際特許出願公開第２００３／００６４７７号に見出すことができる。或いは、例えばｐＳＩＬＥＮＣＥＲ ＡＤＥＮＯ １．０－ＣＭＶ ＳＹＳＴＥＭＴＭブランドのウイルス産生キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）などの組換えウイルスを産生するための市販キットを使用することができる。
【0133】
Ｖ．Ｃ．遺伝子編集
遺伝子産物のダウンレギュレーションは、また、全てがそれらの全体において出典明示によってここに援用される、Ｚｈａｎｇの米国特許第８９４５８３９号と、そこで引用されている文献、Ａｌ－Ａｔｔａｒ等，２０１１：Ｍａｋａｒｏｖａ等，２０１１；Ｌｅ Ｃｏｎｇ等，２０１３；Ｓｅｕｎｇ Ｗｏｏ Ｃｈｏ等，２０１３ａ、ｂ；Ｃａｒｒｏｌｌ，２０１２；Ｇａｓｉｕｎａｓ等，２０１２；Ｈａｌｅ等，２０１２；及びＪｉｎｅｋ等，２０１２に記載されているＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集システムを使用して達成することができる。幾つかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集システムで使用される方法及び組成物は、幾つかの実施態様では腫瘍及び／又はがん内のガストリン遺伝子配列であるガストリン遺伝子配列を標的とする核酸を含む。
遺伝子産物のダウンレギュレーションは、また、全てがそれらの全体において出典明示によってここに援用される、Ｚｈａｎｇの米国特許第８９４５８３９号と、そこで引用されている文献、Ａｌ－Ａｔｔａｒ等，２０１１：Ｍａｋａｒｏｖａ等，２０１１；Ｌｅ Ｃｏｎｇ等，２０１３；Ｓｅｕｎｇ Ｗｏｏ Ｃｈｏ等，２０１３ａ、ｂ；Ｃａｒｒｏｌｌ，２０１２；Ｇａｓｉｕｎａｓ等，２０１２；Ｈａｌｅ等，２０１２；及びＪｉｎｅｋ等，２０１２に記載されているＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集システムを使用して達成することができる。幾つかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集システムで使用される方法及び組成物は、幾つかの実施態様では腫瘍及び／又はがん内のガストリン遺伝子配列であるガストリン遺伝子配列を標的とする核酸を含む。
【0134】
Ｖ．Ｄ．製剤
ここに記載の組成物は、幾つかの実施態様では、薬学的に許容される担体を含む組成物を含む。適切な製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質、及び製剤を意図されるレシピエントの体液と等張にする溶質を含みうる水性及び非水性の滅菌注射液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含みうる水性及び非水性の滅菌懸濁液が含まれる。幾つかの実施態様では、本開示の主題の製剤は、アジュバント、任意選択的に油性アジュバントを含む。
ここに記載の組成物は、幾つかの実施態様では、薬学的に許容される担体を含む組成物を含む。適切な製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質、及び製剤を意図されるレシピエントの体液と等張にする溶質を含みうる水性及び非水性の滅菌注射液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含みうる水性及び非水性の滅菌懸濁液が含まれる。幾つかの実施態様では、本開示の主題の製剤は、アジュバント、任意選択的に油性アジュバントを含む。
【0135】
本方法で使用される組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、又はエマルジョンなどの形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの配合剤を含みうる。本方法で使用される組成物は、限定されないが、口周囲、静脈内、腹腔内、筋肉内、及び腫瘍内製剤を含む形態をとることができる。或いは、又は加えて、活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）で構成するための粉末形態でありうる。
【0136】
製剤は、単位用量又は複数回用量の容器、例えば密封されたアンプル及びバイアルで提供することができ、使用直前に滅菌液体担体を添加することだけを必要とする凍結又はフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。
【0137】
経口投与の場合、組成物は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；フィラー（例えば、乳糖、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される添加物を用いて一般的な技術によって調製される、例えば錠剤又はカプセルの形態をとることができる。錠剤は、当該技術分野で知られている方法によってコーティングされうる。例えば、向神経活性ステロイドは、ヒドロクロロチアジドと組み合わせて、結腸に到達するまで向神経活性ステロイドを保護する腸溶性又は遅延放出コーティングを有するｐＨ安定化コアとして製剤化することができる。
【0138】
経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップ又は懸濁液の形態をとることができ、或いは使用前に水又は他の適切なビヒクルで構成するための乾燥品として提供されうる。そのような液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素添加食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチン又はアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分別植物油）；及び保存料（例えば、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル若しくはプロピル、又はソルビン酸）などの薬学的に許容される添加物を用いて一般的な技術によって調製することができる。製剤は、必要に応じて、緩衝塩、香味料、着色料、及び甘味料をまた含みうる。経口投与用の製剤は、活性化合物の制御放出をもたらすように適切に製剤化することができる。頬側投与の場合、組成物は一般的な方法で製剤化された錠剤又はトローチ剤の形態をとることができる。
【0139】
化合物はまた、移植又は注射用の製剤として製剤化することもできる。従って、例えば、化合物は、適切な高分子材料又は疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）製剤化することができる。
【0140】
化合物はまた、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、又は水中油中水型エマルジョンとして投与される油中に製剤化することもできる。
【0141】
化合物はまた、直腸用組成物（例えば、ココアバター又は他のグリセリドなどの一般的な坐剤基剤を含む坐剤又は停留浣腸）、クリーム又はローション、又は経皮パッチに製剤化することもできる。
【0142】
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ヒトでの使用に薬学的に許容される組成物を用いる。当業者ならば、ヒトでの使用に薬学的に許容される組成物中に存在することができる成分の性質と、またヒトでの使用に薬学的に許容される組成物からどの成分を除外すべきかを理解している。
【0143】
Ｖ．Ｅ．用量
ここで使用される場合、「治療有効量」、「治療的に有効な量」、「治療量」、及び「有効量」という語句は互換的に使用され、測定可能な応答（例えば、治療対象における生物学的又は臨床的に関連する応答）を得るのに十分な治療組成物の量を指す。本開示の主題の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の対象に対して所望の治療応答を達成するのに有効な量の活性化合物を投与するように変えることができる。選択される投薬量レベルは、治療用組成物の活性、投与経路、他の薬物又は治療との組み合わせ、治療される状態の重症度、治療対象の状態及び以前の病歴などに依存しうる。しかしながら、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることは、当業者の技量の範囲内である。
ここで使用される場合、「治療有効量」、「治療的に有効な量」、「治療量」、及び「有効量」という語句は互換的に使用され、測定可能な応答（例えば、治療対象における生物学的又は臨床的に関連する応答）を得るのに十分な治療組成物の量を指す。本開示の主題の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の対象に対して所望の治療応答を達成するのに有効な量の活性化合物を投与するように変えることができる。選択される投薬量レベルは、治療用組成物の活性、投与経路、他の薬物又は治療との組み合わせ、治療される状態の重症度、治療対象の状態及び以前の病歴などに依存しうる。しかしながら、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることは、当業者の技量の範囲内である。
【0144】
治療組成物の効力は変動する場合があり、故に「治療的に有効な量」は変わりうる。しかしながら、当業者であれば、本開示の主題の候補修飾薬の効力及び有効性を容易に評価し、それに応じて治療レジメンを調整することができる。
【0145】
本開示の主題のここでの開示を検討した後、当業者であれば、特定の製剤、組成物と共に使用される投与方法、及び他の要因を考慮して、個々の対象に合わせて投薬量を調整することができる。用量の更なる計算では、対象の身長と体重、症状の重症度とステージ、及び追加の有害な健康状態の存在を考慮することができる。そのような調整又は変更、並びにそのような調整又は変更をいつどのように行うかの評価は、医療分野の当業者にはよく知られている。
【0146】
従って、幾つかの実施態様では、「有効量」という用語は、測定可能な抗腫瘍及び／又は抗がん生物活性をもたらすのに十分な、ガストリンペプチドに対して体液性又は細胞性免疫応答を提供し及び／又は誘導する薬剤を含み、並びに或いはガストリン遺伝子産物の発現を阻害する核酸、その薬学的に許容される塩、その誘導体、又はそれらの組み合わせを含む組成物の量を指すためにここで使用される。本開示の主題の組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の対象及び／又は用途に対して所望の応答を達成するのに有効な量の活性化合物を投与するように変更することができる。選択される投薬量レベルは、組成物の活性、製剤、投与経路、他の薬物又は治療との組み合わせ、治療される状態の重症度、治療される対象の健康状態及び以前の病歴を含む様々な要因に依存しうる。幾つかの実施態様では、最小用量が投与され、用量制限毒性の非存在下で用量が最小有効量まで増量される。有効用量の決定及び調整、並びにそのような調整をいつどのように行うかの評価は、当業者に知られている。
【0147】
ここに開示される組成物の投与では、マウス動物モデルに投与される用量に基づいてヒト投薬量を推定する一般的な方法を、当業者に知られている技術を使用して実施することができる。この方法では、体重ではなく、所定の代謝及び排泄機能と良好な相関関係が得られるため、薬物用量を体表面積１平方メートル当たりのミリグラムで与えることもできる。更に、体表面積は、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ等，１９６６に記載されているように、成人と小児、並びに様々な動物種の薬物投与量の共通の分母として使用できる。簡単に言えば、任意の所与の種におけるｍｇ／ｋｇ用量を等価ｍｇ／ｍ２用量として表すためには、その用量に適切なｋｍ係数を掛ける。ヒト成人の場合、１００ｍｇ／ｋｇは１００ｍｇ／ｋｇ×３７ｋｇ／ｍ２＝３７００ｍｇ／ｍ２に等価である。
【0148】
製剤と用量に関する追加のガイダンスについては、米国特許第５３２６９０２号；第５２３４９３３号；ＰＣＴ国際公開第９３／２５５２１号；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ等，１９７５；Ｇｏｏｄｍａｎ等，１９９６；Ｂｅｒｋｏｗ等，１９９７；Ｓｐｅｉｇｈｔ等，１９９７；Ｅｂａｄｉ，１９９８；Ｄｕｃｈ等，１９９８；Ｋａｔｚｕｎｇ，２００１；Ｇｅｒｂｉｎｏ，２００５を参照のこと。
【0149】
Ｖ．Ｆ．投与の経路
本開示の組成物は、任意の形態及び／又は任意の投与経路によって対象に投与することができる。幾つかの実施態様では、製剤は、徐放性製剤、制御放出製剤、又は徐放及び制御放出の両方のために設計された製剤である。ここで使用される場合、「徐放」という用語は、ほぼ一定量の活性薬剤が時間の経過と共に対象に利用可能になるような活性薬剤の放出を指す。「制御放出」という語句はより広く、一定レベルである場合もそうでない場合もある、経時的な活性薬剤の放出を指す。特に、「制御放出」は、活性成分が必ずしも一定速度で放出されるわけではない状況及び製剤を包含するが、経時的に放出を増加させること、経時的に放出を減少させること、及び／又は増加放出、減少放出、又はそれらの組み合わせの一又は複数の期間を伴う一定の放出を含みうる。従って、「徐放」は「制御放出」の一形態であるが、後者には、異なる時間に送達される活性薬剤の量の変化を利用する送達様式も含まれる。
本開示の組成物は、任意の形態及び／又は任意の投与経路によって対象に投与することができる。幾つかの実施態様では、製剤は、徐放性製剤、制御放出製剤、又は徐放及び制御放出の両方のために設計された製剤である。ここで使用される場合、「徐放」という用語は、ほぼ一定量の活性薬剤が時間の経過と共に対象に利用可能になるような活性薬剤の放出を指す。「制御放出」という語句はより広く、一定レベルである場合もそうでない場合もある、経時的な活性薬剤の放出を指す。特に、「制御放出」は、活性成分が必ずしも一定速度で放出されるわけではない状況及び製剤を包含するが、経時的に放出を増加させること、経時的に放出を減少させること、及び／又は増加放出、減少放出、又はそれらの組み合わせの一又は複数の期間を伴う一定の放出を含みうる。従って、「徐放」は「制御放出」の一形態であるが、後者には、異なる時間に送達される活性薬剤の量の変化を利用する送達様式も含まれる。
【0150】
幾つかの実施態様では、徐放性製剤、制御放出製剤、又はそれらの組み合わせは、経口（ｏｒａｌ）製剤、経口（ｐｅｒｏｒａｌ）製剤、頬側製剤、経腸製剤、経肺製剤、直腸製剤、膣製剤、経鼻製剤、舌製剤、舌下製剤、静脈内製剤、動脈内製剤、心臓内製剤、筋肉内製剤、腹腔内製剤、経皮製剤、頭蓋内製剤、皮内製剤、皮下製剤、エアロゾル化製剤、眼用製剤、移植可能な製剤、デポ注射製剤、経皮製剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、投与経路は、経口（ｏｒａｌ）、経口（ｐｅｒｏｒａｌ）、頬側、経腸、肺、直腸、膣、鼻、舌、舌下、静脈内、動脈内、心臓内、筋肉内、腹腔内、経皮、頭蓋内、皮内、皮下、眼、インプラント経由、及びデポ注射経由からなる群から選択される。適用可能な場合、連続注入は標的部位での薬物の蓄積を高めることができる（例えば、米国特許第６１８００８２号を参照）。経皮製剤及び組成物の送達方法に関して、米国特許第３５９８１２２号；第５０１６６５２号；第５９３５９７５号；第６１０６８５６号；第６１６２４５９号；第６４９５６０５号；及び第６５８２７２４号；並びに米国特許出願公開第２００６／０１８８５５８号をまた参照のこと。幾つかの実施態様では、投与は、経口、静脈内、腹腔内、吸入、及び腫瘍内からなる群から選択される経路を介してなされる。
【0151】
ここに開示された方法に従って使用される、本開示の主題の組成物の特定の投与様式は、限定されないが、用いられる製剤、治療される状態の重症度、組成物中の活性薬剤（例えば、ＰＡＳ）が局所的又は全身的に作用することが意図されているかどうか、投与後の活性薬剤の代謝又は除去の機構を含む様々な要因に依存しうる。
【0152】
ＶＩ．方法と使用
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんの治療、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを治療するための医薬の製造、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんの増殖の阻害、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんに対する体液性及び／又は細胞性免疫応答の誘導及び／又は増強、腫瘍及び／又はがんに対する細胞性免疫応答の誘導剤に対する対象におけるガストリン及び／又はＣＣＫ－Ｂ受容体シグナル伝達に関連する腫瘍及び／又はがんの感作、特に膵臓がんの観点での腫瘍及び／又はがんに関連する線維形成の予防、軽減、及び／又は排除；ガストリン関連腫瘍及び／又はがんの転移の予防、軽減、及び／又は排除；腫瘍及び／又はがんにおける腫瘍浸潤ＣＤ８＋リンパ球の数の増加；腫瘍及び／又はがんに存在するＦｏｘＰ３＋抑制性制御性Ｔ細胞の数の低減；及びガストリン関連腫瘍及び／又はがんに応答する対象におけるＴＥＭＲＡ細胞の数の増加に関連した様々な方法及び／又は使用の観点で薬学的組成物を用いることに関する。これらの方法及び／又は使用のそれぞれを、ここで以下により詳細に記載する。
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんの治療、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを治療するための医薬の製造、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんの増殖の阻害、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんに対する体液性及び／又は細胞性免疫応答の誘導及び／又は増強、腫瘍及び／又はがんに対する細胞性免疫応答の誘導剤に対する対象におけるガストリン及び／又はＣＣＫ－Ｂ受容体シグナル伝達に関連する腫瘍及び／又はがんの感作、特に膵臓がんの観点での腫瘍及び／又はがんに関連する線維形成の予防、軽減、及び／又は排除；ガストリン関連腫瘍及び／又はがんの転移の予防、軽減、及び／又は排除；腫瘍及び／又はがんにおける腫瘍浸潤ＣＤ８＋リンパ球の数の増加；腫瘍及び／又はがんに存在するＦｏｘＰ３＋抑制性制御性Ｔ細胞の数の低減；及びガストリン関連腫瘍及び／又はがんに応答する対象におけるＴＥＭＲＡ細胞の数の増加に関連した様々な方法及び／又は使用の観点で薬学的組成物を用いることに関する。これらの方法及び／又は使用のそれぞれを、ここで以下により詳細に記載する。
【0153】
加えて、幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ガストリン関連腫瘍及び／又はがん及び／又はそれらの前がん病変のイニシエーション及び／又は進行の予防、ガストリン関連腫瘍及び／又はがん及び／又はそれらの前がん病変のイニシエーション及び／又は進行を予防するための医薬の製造、特に膵臓がん及びその前がん病変の観点での腫瘍及び／又はがんに関連する線維形成の予防、軽減、及び／又は排除に関連した様々な方法及び／又は使用の観点で薬学的組成物を用いることに関する。これらの方法及び／又は使用のそれぞれを、ここで以下により詳細に記載する。
【0154】
ＶＩ．Ａ．ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを治療するための方法
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを治療するための方法に関する。幾つかの実施態様では、本方法は、それを必要とする対象（例えば、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを有する対象）に、ガストリンペプチド及び／又はＣＣＫ－Ｂ受容体に対して能動及び／又は受動体液性免疫応答を誘導及び／又は提供する第一の薬剤と；ガストリン関連腫瘍又はがんに対する細胞性免疫応答を誘導及び／又は提供する第二の薬剤とを含む有効量の組成物を投与することを含む。従って、幾つかの実施態様における本開示の方法は、ガストリンペプチド及び／又はＣＣＫ－Ｂ受容体に対する能動及び／又は受動体液性免疫応答の提供及び／又は誘導と、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんに対する細胞性免疫応答の誘導及び／又は提供という二つの異なる免疫治療活性を一緒に提供する一又は複数種の活性薬剤を有する薬学的組成物の使用に依存する。
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを治療するための方法に関する。幾つかの実施態様では、本方法は、それを必要とする対象（例えば、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを有する対象）に、ガストリンペプチド及び／又はＣＣＫ－Ｂ受容体に対して能動及び／又は受動体液性免疫応答を誘導及び／又は提供する第一の薬剤と；ガストリン関連腫瘍又はがんに対する細胞性免疫応答を誘導及び／又は提供する第二の薬剤とを含む有効量の組成物を投与することを含む。従って、幾つかの実施態様における本開示の方法は、ガストリンペプチド及び／又はＣＣＫ－Ｂ受容体に対する能動及び／又は受動体液性免疫応答の提供及び／又は誘導と、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんに対する細胞性免疫応答の誘導及び／又は提供という二つの異なる免疫治療活性を一緒に提供する一又は複数種の活性薬剤を有する薬学的組成物の使用に依存する。
【0155】
ガストリンペプチド及び／又はＣＣＫ－Ｂ受容体に対する能動及び／又は受動体液性免疫応答の提供及び／又は誘導に関して、本開示の主題の薬学的組成物中に存在する第一の薬剤は、ガストリンに対して能動体液性応答を誘導するように設計されたガストリンペプチド、並びに／或いはガストリン及び／又はＣＣＫ－Ｂ受容体、幾つかの実施態様では、ガストリン関連腫瘍及び／又はがん上に存在するＣＣＫ－Ｂ受容体に対して受動体液性応答を提供するように設計された抗ガストリン抗体及び／又は抗ＣＣＫ－Ｒ抗体からなる群から選択される。如何なる特定の作用理論にも束縛されることは望まないが、ガストリンペプチド及び／又はＣＣＫ－Ｂ受容体に対する能動及び／又は受動体液性免疫応答は、対象に存在する循環ガストリンの量を減少させることによりＣＣＫ－Ｂ受容体へのガストリン結合を減少させることにより、並びに／或いは中和及び／又は遮断抗体を用いてＣＣＫ－Ｂ受容体へのガストリンの結合を妨害することにより、ＣＣＫ－Ｂ受容体を介するガストリン関連腫瘍及び／又はがんにおけるガストリンシグナル伝達を部分的又は完全に阻害するように設計されている。
【0156】
従って、幾つかの実施態様では、第一の薬剤は、ガストリンペプチド、任意選択的に、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥ（配列番号：１）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥ（配列番号：２）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹ（配列番号：３）、及びＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ（配列番号：４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなるガストリンペプチドを含み、配列番号：１～４の何れかのアミノ酸位置１のグルタミン酸残基はピログルタミン酸残基である。幾つかの実施態様では、ガストリンペプチドは、薬学的組成物中で、免疫原性担体に、任意選択的にリンカー、更に任意選択的にε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンアミドエステルを含むリンカーを介して、コンジュゲートされる。免疫原性担体の非限定的な例には、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンが含まれる。第一の薬剤の構造はここで前により詳細に記載しているが、幾つかの実施態様では、リンカーとガストリンペプチドはアミノ酸スペーサーによって分離され、任意選択的にアミノ酸スペーサーは１と１０の間のアミノ酸長であり、更に任意選択的にアミノ酸スペーサーは７アミノ酸長である。
【0157】
この開示を考慮すれば当業者には理解されるように、幾つかの実施態様では、薬学的組成物は、能動抗ガストリン体液性免疫応答が望まれる場合にガストリンペプチド及び／又はガストリンペプチドコンジュゲートの免疫原性を増強するために、アジュバント、任意選択的に油性アジュバントを更に含む。
【0158】
ガストリン関連腫瘍又はがんに対する細胞性免疫応答を誘導するために、本開示の主題の方法は、一又は複数種のチェックポイント阻害剤を含む薬学的組成物を用いる。知られているように、チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント活性を有する標的ポリペプチドの一つ又は複数の生物学的活性を阻害する。例示的なそのようなポリペプチドには、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）ポリペプチド、プログラム細胞死１受容体（ＰＤ－１）ポリペプチド、及びプログラム細胞死１受容体リガンド（ＰＤ－Ｌ１）ポリペプチドが含まれる。幾つかの実施態様では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１ポリペプチドとＰＤ－Ｌ１ポリペプチドとの間の相互作用を阻害し又は防止することによって、結合し、及び／又はＴ細胞と腫瘍細胞との間の相互作用を妨害する抗体又は小分子を含む。例示的なそのような抗体及び小分子の例には、限定されないが、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、ペムブロリズマブ、ＡＭＰ５１４、ＡＵＮＰ１２、ＢＭＳ－９３６５５９／ＭＤＸ－１１０５、アテゾリズマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６、ＲＯ５５４１２６７、ＭＥＤＩ４７３６、アベルマブ及びデュルバルマブが含まれる。
【0159】
本開示の主題の薬学的組成物は、体液性応答と細胞性応答の両方が対象において誘導及び／又は提供されることを条件として、様々な量の第一及び第二薬剤を含み得、薬学的組成物中に存在する第一及び第二薬剤の量を、治療の有効性を最大化し、及び／又はその望ましくない副作用を最小限に抑えるため調整することができる。しかしながら、幾つかの実施態様では、本開示の主題の薬学的組成物は、約５０μｇから約１０００μｇ、約５０μｇから約５００μｇ、約１００μｇから約１０００μｇ、約２００μｇから約１０００μｇ、及び約２５０μｇから約５００μｇからなる群から選択される用量で投与され、任意選択的に、その投与は、一回、二回、又は三回繰り返され、任意選択的に、二回目の投与は、初回投与の１週間後になされ、三回目の投与は、投与されるならば、二回目の投与から１週間又は２週間後になされる。
【0160】
幾つかの実施態様では、本開示の主題のガストリン関連腫瘍及び／又はがんを治療するための方法は、それを必要とする対象に、腫瘍／又はがんにおけるガストリンの一つ又は複数の生物学的活性を直接的又は間接的に阻害する第一の薬剤と、腫瘍及び／又はがんに対する細胞性免疫応答の刺激剤を含む第二の薬剤とを投与することを含む。而して、幾つかの実施態様では、第一の薬剤は、ガストリンペプチドに対する体液性免疫応答を提供及び／又は誘導することによって、腫瘍及び／又はがんにおけるガストリンの一つ又は複数の生物学的活性を直接的又は間接的に阻害し、任意選択的に、薬剤は、抗ガストリン抗体及び対象において中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチドからなる群から選択され；並びに／或いはガストリン遺伝子産物の発現を阻害する核酸を含む。ガストリン遺伝子産物の発現を阻害する核酸は、この開示を考慮すれば当業者には理解されるであろうし、例はここで上で検討している。
【0161】
抗ガストリン抗体は当該技術分野で知られており、米国特許第５６０７６７６号；第５６０９８７０号；第５６２２７０２号；第５７８５９７０号；第５８６６１２８号；及び第６８６１５１０号に記載されている。ＰＣＴ国際特許出願国際公開第２００３／００５９５５号及び国際公開第２００５／０９５４５９号をまた参照のこと。これらの米国特許及びＰＣＴ国際特許出願公開公報のそれぞれの内容は、その全体がここに援用される。幾つかの実施態様では、抗ガストリン抗体は、ガストリン－１７（Ｇ１７）内に存在するエピトープに対する抗体である。幾つかの実施態様では、エピトープは、アミノ酸配列ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥ（配列番号：１）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥ（配列番号：２）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹ（配列番号：３）、及びＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ（配列番号：４）のうちの一つ又は複数の中に存在する。
【0162】
幾つかの実施態様では、本開示の主題の薬学的組成物の対象への投与は、膵臓がんに関連する線維化（線維症）の減少を誘導し、及び／又はその発生を予防する。
【0163】
幾つかの実施態様では、本開示の治療方法は、対象におけるガストリン関連腫瘍及び／又はがんの増殖及び／又は生存を阻害するように設計される。従って、幾つかの実施態様では、本開示の方法は、ガストリン免疫原、一又は複数種の抗ガストリン抗体、一又は複数種の抗ＣＣＫ－Ｂ受容体抗体、又はそれらの任意の組み合わせを含む第一の薬剤と；チェックポイント阻害剤を含む第二の薬剤を含む組成物を対象に投与することを含む。
【0164】
従って、幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを治療する医薬の調製のためのここに開示される薬学的組成物の使用、並びにガストリン関連腫瘍及び／又はがんを治療するためのここに開示される薬学的組成物の使用を提供する。
【0165】
幾つかの実施態様では、ここに開示される多剤薬学的組成物は、同様の対象を何れかの薬剤で個別に治療する場合よりも、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんの促進された、より効果的な、及び／又はより成功した治療をもたらす。
【0166】
ＶＩ．Ｂ．ガストリン関連腫瘍及び／又はがん及び／又はその前がん病変のイニシエーション及び／又は進行を予防するための方法
ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを治療するための方法に加えて、幾つかの実施態様では、本開示の主題は、前記ガストリン関連腫瘍及び／又はがん及び／又は未治療のまま放置すると、前記ガストリン関連腫瘍及び／又はがんの発生につながる可能性がある前がん病変のイニシエーション及び／又は進行を予防するための方法に関する。従って、幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ガストリン関連腫瘍、がん、及び／又はその前がん病変の発生のリスクのある対象を提供することと、ガストリン免疫原を含む組成物を対象に投与することに関し、ここで、ガストリン免疫原が対象におけるガストリン関連前がん病変の発生を阻害する。
ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを治療するための方法に加えて、幾つかの実施態様では、本開示の主題は、前記ガストリン関連腫瘍及び／又はがん及び／又は未治療のまま放置すると、前記ガストリン関連腫瘍及び／又はがんの発生につながる可能性がある前がん病変のイニシエーション及び／又は進行を予防するための方法に関する。従って、幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ガストリン関連腫瘍、がん、及び／又はその前がん病変の発生のリスクのある対象を提供することと、ガストリン免疫原を含む組成物を対象に投与することに関し、ここで、ガストリン免疫原が対象におけるガストリン関連前がん病変の発生を阻害する。
【0167】
ここで使用される場合、「前がん病変」という語句は、未治療のまま放置すると腫瘍及び／又はがんに進行する可能性がある、別の正常細胞と比較して何らかの生化学的変化を受けている細胞又は複数の細胞を指す。例示的な前がん性病変には、限定されないが、未治療のまま放置すると膵臓腫瘍及び／又はがんを引き起こす可能性がある膵上皮内腫瘍（ＰａｎＩＮ）病変、及び結腸がんを引き起こす可能性がある腺腫性結腸ポリープが含まれる。
【0168】
従って、幾つかの実施態様では、本開示の主題は、さもなければ起こるであろう生化学的変化が起こらず、並びに／又は生化学的変化の結果が、細胞若しくは複数の細胞が前がん病変を形成しないように、又は前がん病変が腫瘍及び／若しくはがんに進行しないように、部分的、本質的に完全に、若しくは完全に軽減されるように、細胞若しくは複数の細胞に関して介入するための組成物及び方法に関する。幾つかの実施態様では、生化学的変化は、その受容体であるＣＣＫ－Ｂを介したガストリンシグナル伝達から部分的に、本質的に完全に、若しくは完全に生じる。幾つかの実施態様では、介入は、対象において抗ガストリン体液性免疫応答が誘導されるように、細胞又は複数の細胞が存在する対象にガストリン免疫原を投与することに関する。如何なる特定の作用理論にも束縛されることを望まないが、抗ガストリン体液性免疫応答の誘導は、対象において、幾つかの実施態様では対象内に存在する細胞又は複数の細胞自体において、細胞若しくは複数の細胞が前がん病変を形成しないか、又は前がん病変が腫瘍及び／又はがんに進行しないように、ガストリンシグナル伝達を調節する（幾つかの実施態様では阻害する）ように設計される。幾つかの実施態様では、ガストリン免疫原は、ここに記載のＰＡＳ及び／又はその誘導体である。
【0169】
ＶＩ．Ｃ．ガストリン関連腫瘍及び／又はがんに対する細胞免疫応答を誘導及び／又は増強するための方法
本開示の主題はまた対象におけるガストリン関連腫瘍及び／又はがんに対する細胞性免疫応答を誘導及び／又は増強するための方法を提供する。幾つかの実施態様では、本方法は、ガストリン関連腫瘍又はがんを有する対象に、ガストリン関連腫瘍又はがん上に存在するＣＣＫ－Ｂ受容体を介したガストリンシグナル伝達を低減又は阻害する薬剤を含む有効量の組成物を投与することを含み、それにより、対象のガストリン関連腫瘍及び／又はがんに対する細胞性免疫応答を誘導及び／又は増強する。ここで使用される場合、「ガストリン関連腫瘍及び／又はがんに対する細胞性免疫応答を誘導及び／又は増強する」という語句とその文法的変形語は、ガストリン関連腫瘍又はがん上に存在するＣＣＫ－Ｂ受容体を介したガストリンシグナル伝達を低減又は阻害する薬剤を含む有効量の組成物を、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを有する対象に投与した結果、Ｔ細胞ベースの免疫応答のレベルが、治療がなかった場合に対象に存在していたであろうよりも投与後の関連時間において対象においてより高い状況を指す。ガストリン関連腫瘍又はがん上に存在するＣＣＫ－Ｂ受容体を介したガストリンシグナル伝達を減少又は阻害する薬剤には、ガストリンペプチドとＣＣＫ－Ｂ受容体の相互作用を妨害することができるここに開示される薬剤が含まれ、限定されないが、ガストリンペプチド及び／又は免疫原、抗ガストリン抗体、抗ＣＣＫ－Ｂ受容体抗体、ガストリン／ＣＣＫ－Ｂシグナル伝達の小分子阻害剤、及びそれらの組み合わせが含まれる。
本開示の主題はまた対象におけるガストリン関連腫瘍及び／又はがんに対する細胞性免疫応答を誘導及び／又は増強するための方法を提供する。幾つかの実施態様では、本方法は、ガストリン関連腫瘍又はがんを有する対象に、ガストリン関連腫瘍又はがん上に存在するＣＣＫ－Ｂ受容体を介したガストリンシグナル伝達を低減又は阻害する薬剤を含む有効量の組成物を投与することを含み、それにより、対象のガストリン関連腫瘍及び／又はがんに対する細胞性免疫応答を誘導及び／又は増強する。ここで使用される場合、「ガストリン関連腫瘍及び／又はがんに対する細胞性免疫応答を誘導及び／又は増強する」という語句とその文法的変形語は、ガストリン関連腫瘍又はがん上に存在するＣＣＫ－Ｂ受容体を介したガストリンシグナル伝達を低減又は阻害する薬剤を含む有効量の組成物を、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを有する対象に投与した結果、Ｔ細胞ベースの免疫応答のレベルが、治療がなかった場合に対象に存在していたであろうよりも投与後の関連時間において対象においてより高い状況を指す。ガストリン関連腫瘍又はがん上に存在するＣＣＫ－Ｂ受容体を介したガストリンシグナル伝達を減少又は阻害する薬剤には、ガストリンペプチドとＣＣＫ－Ｂ受容体の相互作用を妨害することができるここに開示される薬剤が含まれ、限定されないが、ガストリンペプチド及び／又は免疫原、抗ガストリン抗体、抗ＣＣＫ－Ｂ受容体抗体、ガストリン／ＣＣＫ－Ｂシグナル伝達の小分子阻害剤、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【0170】
ＶＩ．Ｄ．細胞免疫応答の誘導剤に対して腫瘍及び／又はがんを感作させるための方法
幾つかの実施態様では、本開示の主題はまた対象におけるガストリン及び／又はＣＣＫ－Ｂ受容体シグナル伝達に関連する腫瘍及び／又はがんを、腫瘍及び／又はがんに対する細胞性免疫応答の誘導剤に対して感作させるための方法を提供する。ここで使用される場合、「対象におけるガストリン及び／又はＣＣＫ－Ｂ受容体シグナル伝達に関連する腫瘍及び／又はがんを、細胞性免疫応答の誘導剤に対して感作させる」という語句は、治療がない状態で細胞性免疫応答の一又は複数種の誘導剤が対象に投与される場合の対象における細胞性免疫応答のレベルと比較して、細胞性免疫応答の一又は複数種の誘導剤が対象に投与される場合の対象における細胞性免疫応答のレベルを生じる治療を指す。
幾つかの実施態様では、本開示の主題はまた対象におけるガストリン及び／又はＣＣＫ－Ｂ受容体シグナル伝達に関連する腫瘍及び／又はがんを、腫瘍及び／又はがんに対する細胞性免疫応答の誘導剤に対して感作させるための方法を提供する。ここで使用される場合、「対象におけるガストリン及び／又はＣＣＫ－Ｂ受容体シグナル伝達に関連する腫瘍及び／又はがんを、細胞性免疫応答の誘導剤に対して感作させる」という語句は、治療がない状態で細胞性免疫応答の一又は複数種の誘導剤が対象に投与される場合の対象における細胞性免疫応答のレベルと比較して、細胞性免疫応答の一又は複数種の誘導剤が対象に投与される場合の対象における細胞性免疫応答のレベルを生じる治療を指す。
【0171】
幾つかの実施態様では、本方法は、ガストリンペプチドに対する能動及び／又は受動体液性免疫応答を誘導及び／又は提供する第一の薬剤と、腫瘍及び／又はがんに対して細胞性免疫応答を誘導及び／又は提供する第二の薬剤、又はそれらの組み合わせを含む組成物を対象に投与することを含み、任意選択的に、第一の薬剤と第二の薬剤は、対象における細胞性免疫応答又は中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチド及び／又はその断片及び／又は誘導体及び中和抗ガストリン抗体及び／又はその断片及び／又は誘導体；並びに／又はガストリン遺伝子産物の発現を阻害する核酸を含む組成物；並びに／又はＣＣＫ－Ｂ受容体におけるガストリンの生物学的機能を遮断する薬剤を含む組成物からなる群から個別に選択される。幾つかの実施態様では、抗ガストリン抗体は、ガストリン－１７（Ｇ１７）内に存在するエピトープに対する抗体である。
【0172】
従って、幾つかの実施態様では、対象におけるガストリン及び／又はＣＣＫ－Ｂ受容体シグナル伝達に関連する腫瘍及び／又はがんを細胞性免疫応答の誘導剤に対して感作させるための本方法は、対象におけるガストリンペプチドに対する能動及び／又は受動体液性免疫応答の両方を対象に誘導及び／又は提供するために、並びに腫瘍及び／又はがんに対する細胞性免疫応答を誘導及び／又は提供するためにここに開示された薬学的組成物を対象に投与することを含む。
【0173】
ＶＩ．Ｅ．腫瘍及び／又はがん及び／又はそれらの前がん性病変に関連する線維化を予防、減少、及び／又は排除するための方法
ＰＤＡＣは高密度の線維化環境によっても特徴付けられ（Ｎｅｅｓｓｅ等，２０１１）、これは血管新生の促進に役立ち、化学療法薬及び免疫療法薬の膵臓腫瘍部位への浸透を阻害する可能性のある物理的障壁を作り出す（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ及びＢｒｅｎｔｎａｌｌ，２０１３）。ここに開示されるのは、任意選択的に一又は複数種の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた、ＰＡＳ投与により、ＰＤＡＣ線維症の特徴である線維化の性質が軽減されうるという予期せぬ驚くべき所見である。如何なる特定の作用理論にも束縛されることは望まないが、線維化の減少は、限定されないがチェックポイントｍＡｂのような高分子を含む他の薬物のより大きな浸透を容易にしうる。これは、おそらくチェックポイントｍＡｂがＰＤＡＣ細胞に浸透しないため、これまでチェックポイント阻害剤の効果が非常に控えめであると特徴付けられた理由を説明しうる。従って、本開示の主題の一態様は、ＰＡＳ＋免疫チェックポイント阻害剤が、単独療法として与えられた場合には別々に抗ＰＤＡＣ腫瘍活性を有するが、ここに開示されるように併用療法として与えられた場合には、より大きな活性を有するということである。
ＰＤＡＣは高密度の線維化環境によっても特徴付けられ（Ｎｅｅｓｓｅ等，２０１１）、これは血管新生の促進に役立ち、化学療法薬及び免疫療法薬の膵臓腫瘍部位への浸透を阻害する可能性のある物理的障壁を作り出す（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ及びＢｒｅｎｔｎａｌｌ，２０１３）。ここに開示されるのは、任意選択的に一又は複数種の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた、ＰＡＳ投与により、ＰＤＡＣ線維症の特徴である線維化の性質が軽減されうるという予期せぬ驚くべき所見である。如何なる特定の作用理論にも束縛されることは望まないが、線維化の減少は、限定されないがチェックポイントｍＡｂのような高分子を含む他の薬物のより大きな浸透を容易にしうる。これは、おそらくチェックポイントｍＡｂがＰＤＡＣ細胞に浸透しないため、これまでチェックポイント阻害剤の効果が非常に控えめであると特徴付けられた理由を説明しうる。従って、本開示の主題の一態様は、ＰＡＳ＋免疫チェックポイント阻害剤が、単独療法として与えられた場合には別々に抗ＰＤＡＣ腫瘍活性を有するが、ここに開示されるように併用療法として与えられた場合には、より大きな活性を有するということである。
【0174】
ＰＤＡＣの本質的に線維化の性質に対処し、且つ限定されないが抗免疫チェックポイント阻害剤ｍＡｂなどの大きなモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の腫瘍環境への大なる到達性を得るのに有益となる本開示の主題に従って、新規且つ革新的な薬物（例えば、ＰＡＳ）及び／又は多様ではあるが相補的又は相乗的作用機序さえ有するそれらの組み合わせが提供される。如何なる特定の作用理論にも束縛されることは望まないが、併用療法の一部としてＰＡＳと免疫チェックポイント阻害剤を一緒に投与すると、ＰＤＡＣに関連する線維化を減少させることにより、腫瘍が化学療法剤及び免疫チェックポイント阻害剤薬物に到達しやすくなる相乗効果を得ることができ、ガストリン関連腫瘍に対する細胞性免疫応答を誘導するために、抗腫瘍治療薬がＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用を標的にすることを可能にする。
【0175】
ＰＡＳによる治療は、自己分泌及びパラ分泌腫瘍／がん増殖因子ガストリンに対する体液性免疫応答（つまり、抗体応答）を引き起こす。その際、ＰＡＳは、細胞増殖、アポトーシス、血管新生、浸潤、及び転移に影響を与えることにより、腫瘍／がん（例えばＰＤＡＣ）表現型に影響を与える。ここに開示されるように、ＰＡＳはまた、ＰＤＡＣに関連する線維化を減少させるのにも有効である。如何なる特定の作用理論にも束縛されることを望まないが、これは、限定されないが免疫チェックポイント阻害ｍＡｂなどの大きな分子が膵臓腫瘍部位への大なる到達性を獲得する能力を増強すると考えられ、これがついで更により大きな細胞性免疫効果を促進することが予想される。ＰＡＳはまたガストリンに対する細胞性免疫応答を生じさせる。従って、ここに開示されるのは、効果を得るために腫瘍に到達する必要がある治療薬に対する耐性において、固有の線維化並びにＰＤＡＣの不応性の性質に対処するために、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、及び／又は抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂなどの免疫チェックポイント阻害剤の投与と併用したＰＡＳ投与によって腫瘍及び／又はがんを治療するための方法である。
【0176】
従って、幾つかの実施態様では、本開示の主題は、腫瘍及び／又はがんの細胞を、腫瘍及び／又はがんにおけるガストリンの一又は複数の生物学的活性を直接的又は間接的に阻害する薬剤と接触させることによって、腫瘍及び／又はがん、任意選択的に膵臓がんに関連する線維形成を予防、減少、及び／又は排除するための方法を提供する。ガストリンの一又は複数の生物学的活性を直接的又は間接的に阻害する薬剤は、ここにおいて上に開示されており、ガストリンペプチドに対して体液性免疫応答を提供及び／又は誘導する薬剤（例えば、限定されないが、抗ガストリン抗体、及び／又はそれらの断片及び／又は誘導体）、及び対象において中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチド；ガストリン遺伝子産物の発現を阻害する阻害性核酸；ガストリンホルモンの機能を遮断する小分子化合物、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。幾つかの実施態様では、抗ガストリン抗体は、ガストリン－１７（Ｇ１７）内に存在するエピトープに対する抗体を含み、このエピトープは、幾つかの実施態様では、アミノ酸配列ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥ（配列番号：１）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥ（配列番号：２）、ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹ（配列番号：３）、及びＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ（配列番号：４）の一又は複数内に存在する。
【0177】
ここに開示されたガストリン及びガストリンペプチドの他の免疫原性形態と同様に、幾つかの実施態様では、ガストリンペプチドは免疫原性担体、任意選択的に、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンからなる群から選択される免疫原性担体にコンジュゲートされる。
【0178】
幾つかの実施態様では、腫瘍及び／又はがん、任意選択的には膵臓がんに関連する線維形成を予防、減少、及び／又は排除するための方法は、腫瘍及び／又はがんを、腫瘍及び／又はがんに対する細胞免疫応答の刺激剤を含む第二の薬剤と接触させることを更に含む。細胞性免疫応答の例示的な刺激剤には、限定されないが、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、ペムブロリズマブ、ＡＭＰ５１４、ＡＵＮＰ１２、ＢＭＳ－９３６５５９／ＭＤＸ－１１０５、アテゾリズマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６、ＲＯ５５４１２６７、ＭＥＤＩ４７３、及びアベルマブを含む、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死１受容体（ＰＤ－１）、及びプログラム細胞死１受容体リガンド（ＰＤ－Ｌ１）からなる群から選択される標的ポリペプチドの生物学的活性を阻害するものなどの免疫チェックポイント阻害剤が含まれる。
【0179】
幾つかの実施態様では、そこでの線維化の形成を予防、減少、及び／又は排除する腫瘍及び／又はがんは、膵臓がんである。
【0180】
ＶＩ．Ｆ．対象及び対象に存在する腫瘍中のＴ細胞亜集団を調節するための方法
ここに開示されるように、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを有する対象への本開示の主題の薬学的組成物の投与は、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんで治療された対象に存在する循環Ｔ細胞亜集団並びに腫瘍及び／又はがん自体の中に存在するＴ細胞亜集団の両方を改変することが観察された。
ここに開示されるように、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを有する対象への本開示の主題の薬学的組成物の投与は、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんで治療された対象に存在する循環Ｔ細胞亜集団並びに腫瘍及び／又はがん自体の中に存在するＴ細胞亜集団の両方を改変することが観察された。
【0181】
幾つかの実施態様では、本開示の主題の薬学的組成物を、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを有する対象に投与すると、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんに存在するＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の数の増加を生じる。ＴＩＬは抗腫瘍及び抗がん活性を有し、よって腫瘍及び／又はがんにおけるＴＩＬの数を増加させると、本開示の主題の薬学的組成物を単独で、又は他の現場で使用されている治療及び／又は二次治療と併用される様々な治療戦略のより高い抗腫瘍及び／又は抗がん効果を生じうることが当該技術分野において認識されている。
【0182】
幾つかの実施態様では、本開示の主題の薬学的組成物をガストリン関連腫瘍及び／又はがんを有する対象に投与すると、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんに存在するＦｏｘＰ３＋阻害性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数が減少する。Ｔｒｅｇは免疫抑制活性、特に腫瘍及びがんに特異的な免疫抑制活性を有し、よって腫瘍及び／又はがんにおけるＦｏｘＰ３＋阻害性Ｔｒｅｇの数を減少させると、本開示の主題の薬学的組成物を単独で、又は他の現場で使用されている治療及び／又は二次治療と併用される様々な治療戦略のより高い抗腫瘍及び／又は抗がん効果を生じうることが当該技術分野において認識されている。幾つかの実施態様では、腫瘍及び／又はがんにおけるＦｏｘＰ３＋阻害性Ｔｒｅｇの数を減少させることにより、現場で使用されている化学療法剤の有効性がより高まる可能性がある。
【0183】
幾つかの実施態様では、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを有する対象への本開示の主題の薬学的組成物の投与は、対象における抗ガストリンＴＥＭＲＡ細胞の増加をもたらす。ＴＥＭＲＡ細胞は、末梢循環及び組織に見出されるエフェクターメモリーＴ細胞である。ＴＥＭＲＡ細胞は、転移の認識に関与しているかもしれないという点でセンチネル活性を有しているようである。而して、対象における抗ガストリンＴＥＭＲＡ細胞の増加により、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんに関連する転移を予防、減少、及び／又は排除できる可能性がある。従って、幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ここに開示される薬学的組成物で対象を治療することによって、ガストリン関連腫瘍抗原及び／又はがん抗原を認識するＴＥＭＲＡ細胞並びにこれを発現する細胞を増加させる方法に関する。
【0184】
要約すると、幾つかの実施態様では、本開示の主題は、現場で使用される治療法として単独で、他の現場で使用されている治療法と組み合わせて、又はガストリン関連腫瘍及び／又はがんを有する対象に適切であろう任意の他の療法と組み合わせて、ガストリン関連腫瘍及び／又はがんを治療するための、免疫チェックポイント阻害剤及びガストリン免疫原を含む本開示の組成物の使用に関する。
【0185】
ＶＩＩ．結論
従って、本開示の主題は、幾つかの実施態様では、体液性抗体免疫応答（例えば、ガストリンがんワクチンＰＡＳを使用）及び細胞性免疫応答（例えば、ガストリンがんワクチンＰＡＳ又は免疫チェックポイント阻害剤を使用）の両方を個別に又は一緒に生成する方法の組み合わせを使用する、がんの治療のための併用療法に関する。より具体的には、細胞性免疫抗腫瘍効果と組み合わせて体液性及び細胞性免疫抗腫瘍応答を生成する、薬物クラスの本記載の組み合わせを使用した、ヒト及び動物胃腸腫瘍の治療における予期せぬ相加的及び／又は相乗的有効性が記載される。
従って、本開示の主題は、幾つかの実施態様では、体液性抗体免疫応答（例えば、ガストリンがんワクチンＰＡＳを使用）及び細胞性免疫応答（例えば、ガストリンがんワクチンＰＡＳ又は免疫チェックポイント阻害剤を使用）の両方を個別に又は一緒に生成する方法の組み合わせを使用する、がんの治療のための併用療法に関する。より具体的には、細胞性免疫抗腫瘍効果と組み合わせて体液性及び細胞性免疫抗腫瘍応答を生成する、薬物クラスの本記載の組み合わせを使用した、ヒト及び動物胃腸腫瘍の治療における予期せぬ相加的及び／又は相乗的有効性が記載される。
【0186】
より具体的には、本開示の主題は、幾つかの実施態様では、（ｉ）腫瘍増殖因子又は循環腫瘍増殖因子に対する体液性Ｂ細胞性免疫応答を誘導し；且つ（ｉｉ）腫瘍及び／又はがんに対する細胞性免疫応答（すなわち、抗腫瘍及び／又はがんＴ細胞応答）を誘導及び／又は増強して、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘発する薬物の特定の組み合わせの使用に関する。
【0187】
而して、幾つかの実施態様において、ここに開示されるのは、免疫チェックポイントの失敗を克服する第二の薬物と組み合わせた、ガストリンがんワクチンの組み合わせを使用して、ヒト及び動物の腫瘍及びがんを治療する方法である。従って、幾つかの実施態様では、本開示の主題は、Ｂ細胞及び／又は抗体免疫応答、並びに増殖因子ガストリンの活性型に対する細胞性免疫応答を誘発することに向けられたがんワクチンを用いて特定のヒトがんを治療することに関し、このワクチン治療はまた免疫チェックポイント阻害剤での治療に対して腫瘍をより応答性にし、よって抗腫瘍効果を高めた予想外の相加的な、又は相乗的な併用治療効果さえ生じるという予期せぬ所見を伴う。
【0188】
加えて、本開示の主題の薬学的組成物は、ＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球の数を増強するのに十分な量のここに開示された薬学的組成物を、ガストリン関連腫瘍又はがんを有する対象に投与することによって、ガストリン関連腫瘍又はがんの転移を予防、減少、及び／又は排除するために用いることができる。幾つかの実施態様では、投与により、薬学的組成物が投与されなかった場合に起こるであろうものと比較して、対象の生存期間が改善され、腫瘍増殖が減少し、及び／又は対象における化学療法剤及び／又は免疫チェックポイント療法の有効性が増強される。
【実施例】
【0189】
次の実施例は、例証的な実施態様を提供する。本開示及び当業者の一般的なレベルを考慮すると、当業者であれば、次の実施例が例示のみを意図しており、本開示の主題の範囲から逸脱することなく数多くの変化、修正、及び変更を採用できることが理解されるであろう。
【0190】
［実施例のための材料と方法］
細胞株：マウスｍＴ３膵臓がん細胞を、Ｄａｖｉｄ Ｔｕｖｅｓｏｎ博士の研究室から入手した（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ；Ｂｏｊ等，２０１５も参照）。これらの細胞は、ＣＣＫ－Ｂ受容体を発現し、ガストリンを産生することが示されており、腫瘍モデルとして使用した。これらの細胞は、同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスに腫瘍を生成する（Ｓｍｉｔｈ等，２０１８）。
細胞株：マウスｍＴ３膵臓がん細胞を、Ｄａｖｉｄ Ｔｕｖｅｓｏｎ博士の研究室から入手した（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ；Ｂｏｊ等，２０１５も参照）。これらの細胞は、ＣＣＫ－Ｂ受容体を発現し、ガストリンを産生することが示されており、腫瘍モデルとして使用した。これらの細胞は、同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスに腫瘍を生成する（Ｓｍｉｔｈ等，２０１８）。
【0191】
試験デザイン：全ての動物試験は、ジョージタウン大学（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコル下で倫理的な方法で実施した。４０匹の雄（６週齢）野生型Ｃ５７ＢＬ－６マウスの側腹部に５０００００個の細胞を皮下注射した。接種後６日目に、マウスの１００％に触知可能な腫瘍があり、ベースラインの腫瘍体積が全ての群で等しくなるように、それぞれｎ＝１０匹のマウスからなる四（４）群のうちの一つに割り当てた。群は次の通りであった：
１． ＰＢＳ対照（ＰＢＳ）
２． ＰＡＳ １００μｇ（ＰＡＳ１００）
３． ＰＤ－１ Ａｂ １５０μｇ（ＰＤ－１）
４． ＰＤ－１ Ａｂ（１５０μｇ）＋ＰＡＳ １００μｇ（ＰＤ－１＋ＰＡＳ１００）
１． ＰＢＳ対照（ＰＢＳ）
２． ＰＡＳ １００μｇ（ＰＡＳ１００）
３． ＰＤ－１ Ａｂ １５０μｇ（ＰＤ－１）
４． ＰＤ－１ Ａｂ（１５０μｇ）＋ＰＡＳ １００μｇ（ＰＤ－１＋ＰＡＳ１００）
【0192】
ｍＴ３細胞を注射してから１週間（７日）後、非対照群のマウスは、次のようにＰＡＳ及び／又はＰＤ－１ Ａｂの投与を受けた：マウスがＰＡＳを投与される群の場合は、ＰＡＳを、無作為化時（ベースライン時＝０）に腹腔内注射として開始して１００μｌを、また１週目と３週目に再び、注射した。ＰＤ－１抗体（Ｂｉｏ Ｘ ｃｅｌｌ，Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ，Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）は、適切なマウスに試験期間中、５回（ｔ＝０、４、８、１５、及び２１日目）、１５０μｇの用量を腹腔内投与した。対照マウスには、ＰＡＳを投与したのと同じ日にＰＢＳを投与した。腫瘍体積をキャリパーで毎週測定し、Ｌ×（ｗ）２×０．５として計算した。
【0193】
組織学的検査：３１日間の成育後、マウスをＣＯ２窒息と頸椎脱臼によって倫理的に安楽死させた。マウスの体重を量り、膵臓腫瘍を切除し、秤量した。腫瘍を分割し、腫瘍の半分を、組織学的検査のために４％のパラフィンを含むホルムアルデヒドで固定し、残り半分を液体窒素で急速冷凍した。腫瘍関連線維化をマッソントリクローム染色で評価した。マッソントリクロームの解析は、ＩｍａｇｅＪ画像処理及び解析ソフトウェア（米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）のＷａｙｎｅ Ｒａｓｂａｎｄによって開発、ＮＩＨのウェブサイトから入手可能）を使用して、治療について知らされていない技師によって行われた。
【0194】
免疫組織化学的検査では、腫瘍をパラフィン包埋ブロックから切片化し（１０μｍ）、スライド上に固定した。腫瘍切片を、抗ＣＤ８抗体（１：７５；ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＴＭ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）；又は抗Ｆｏｘｐ３抗体（１：３０；ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＴＭ）の何れかで染色した。免疫反応性細胞を手動でカウントした。
【0195】
脾臓Ｔ細胞の分離：各動物から脾臓を取り出し、秤量し、５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を含む６０ｍｍのディッシュに入れた。脾臓はかみそりの刃を使用して機械的に刻んだ。脾臓組織を含む培地を、１００μＭのセルストレーナーを通して５０ｍｌのチューブに濾過し、最終容量が４０ｍｌになるまで培地で数回すすいだ。ついで、脾臓組織を、４０μＭのセルストレーナーを使用して５０ｍｌのチューブに再度濾過し、１５００ｒｐｍ、４℃において５分間遠心分離して細胞をペレット化した。上清を除去し、細胞ペレットを４０ｍｌのＰＢＳに再懸濁した後、４℃において１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって細胞を再ペレット化した。上清を捨て、細胞ペレットを３ｍｌの洗浄緩衝液（２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．５％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）に再懸濁し、ついで１５ｍｌのチューブ中の５ｍｌのフィコール培地の上にゆっくりと加えた。減速をゼロに設定し、２１００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、リンパ球を緩衝液とＦｉｃｏｌｌの間の白層から収集した。リンパ球を更に二回洗浄し、培地に再懸濁し、カウントした。
【0196】
フローサイトメトリー。１００万個のリンパ球を５ｍｌの透明チューブ（カタログ番号３５２０５４；ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）に加え、ＰＢＳで体積を等量にし、細胞を１５００ｒｐｍで５分間ペレット化した。ＰＢＳで洗浄した後、５０μｌの予め希釈したＺＯＭＢＩＥ ＮＩＲＴＭブランドの固定可能な生存率溶液（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標），Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を細胞に添加し、ついで暗所で室温において２０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ついで５μｌの精製ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（マウスＢＤ Ｆｃ ＢＬＯＣＫＴＭブランド試薬；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を添加し、２０分間インキュベートすることによってブロックした。
【0197】
表１に列挙した抗体をリンパ球と反応させ、３７５ｎｍ、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ及び６３３ｎｍレーザーラインを備えたＦＡＣＳＡＲＩＡＴＭＩＩｕブランドのセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリーを実施した。
【0198】
【0199】
再刺激用。１００万個又は２００万個の単離し洗浄したリンパ球を、２枚の複製プレートの６ウェルプレートの各ウェルに加え、それぞれ容量を同じ（２又は３ｍｌ）にした。ブレフェルジンＡ溶液（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標）、１０００Ｘ、カタログ番号４２０６０１）を各ウェルに１μｌ／ｍｌで添加した。１μＭのガストリン－１４（アミノ酸配列ｐＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷ（配列番号：５）を有するＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＳＣＰ０１５２）を、一つのプレートに対して１μｌ／ｍｌで各ウェルに添加し、最終ガストリン濃度を１ｎＭとした。もう一つの複製プレートはガストリン－１４で処理せず、対照とした。６ウェルプレートを３７℃において細胞培養インキュベーターに６時間配した。ついで、細胞を取り出し、洗浄し、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｉｘａｔｉｏｎ ＆ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（細胞内固定・透過処理緩衝液セット（ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＴＭカタログ番号８８－８８２４－００）を使用して透過処理した。表２に列挙した４つの抗体を含むサイトカイン抗体マスターミックス（８サンプルに対して４抗体、従ってマスターミックスを作製するには各抗体１０μｌ）を加え、４℃において一晩インキュベートした。
【0200】
【0201】
ガストリン又はＰＢＳで再刺激した細胞中のサイトカインを解析するためにフローサイトメトリーを実施した。フローサイトメトリーデータの解析は、ＦＣＳＥｘｐｒｅｓｓ－６ソフトウェア（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｇｌｅｎｄａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を使用して行った。
【0202】
動物。マウスにおける全ての試験は、ジョージタウン大学（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）の承認下で倫理的な方法で実施した。予防試験では、トランスジェニックＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｐ４８－Ｃｒｅマウスコロニーからの雄雌両方の同腹仔をこの試験において使用した。このモデルは以前に特徴付けされており、３か月までに前がん性ＰａｎＩＮ病変を、また時間の経過と共に膵臓がんを発症することが示されている。マウスは２１日齢までに離乳させ、遺伝子型を同定し、ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｐ４８－Ｃｒｅ（ＫＲＡＳ）遺伝子型を有するマウスを、ＰａｎＩＮ進行及び膵臓がんの予防におけるＰＡＳワクチン接種の能力を試験するために使用した。
【0203】
治療。１９匹の年齢を一致させたＫＲＡＳ同腹仔（雄と雌）を、対照／未治療（ｎ＝９）とＰＡＳ治療（ｎ＝１０）の二群に分けた。マウスが３か月齢、つまりＰａｎＩＮ病変が発生する年齢のとき、ＰＡＳマウスに、ベースライン、１週目及び３週目に開始用量のＰＡＳ２５０μｇを皮下（ｓｃ）投与した。この開始後、ＰＡＳ治療マウスには、マウスが８か月齢に達するまで、合計４回の追加免疫に対して４週間ごとにＰＡＳ２５０μｇの追加免疫用量を皮下投与した。ＰＡＳ治療と対照の全てのマウスは、８か月齢で倫理的に安楽死させた。
【0204】
組織学的検査及びＰａｎＩＮスコアリング。膵臓を解剖し、パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した。組織切片（５μｍ）をマウントし、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。組織切片は、治療を知らされていない病理医によって、最も高い悪性度のＰａｎＩＮ病変及び膵臓を置き換えるＰａｎＩＮのパーセンテージについてスコア付けされた。膵臓切片は、Ｓｍｉｔｈ等，２０１４に記載されているようにＰａｎＩＮのステージに従って、また前がん性ＰａｎＩＮ病変で置き換えられた正常膵臓組織のパーセンテージに従ってスコア付けされた。
【0205】
膵臓の特殊な染色。膵臓組織内の線維化は、マッソントリクローム染色によって評価した。ＤＰ７３カメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６１顕微鏡を使用して、全てのスライドの画像を撮影した。線維化の定量的濃度測定は、Ｉｍａｇｅ Ｊコンピュータソフトウェアで解析した。
【0206】
免疫組織化学的染色手順。Ｍ２分極腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）に対するＰＡＳワクチン接種の効果を試験するために、試験した全ての症例のホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックの５μｍ厚の切片を、標識ストレプトアビジン－ビオチン－ペルオキシダーゼ複合体技術を用いて１：１８００希釈でアルギナーゼ－１に対するウサギポリクローナル抗体（カタログ番号ＰＡ５－２９６４５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）の存在を調べた。簡単に言うと、組織切片を脱パラフィンし、キシレンと下降等級のアルコールで水和させた。ＰＢＳですすいだ後、熱誘起エピトープ回復（ＨＩＥＲ）を、ＰＴ Ｌｉｎｋ（Ｄａｋｏ）内の低ｐＨのＴａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄａｋｏ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）に組織切片を浸漬することにより、実施した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、３％の過酸化水素中でスライドを１０分間インキュベートすることによってブロックし、１０％の正常ヤギ血清で更に１０分間のブロックを実施してバックグラウンドを低減し、ついで緩衝液で洗浄した。これに続いて、一次抗体（アルギナーゼ－１）と共に室温において１時間インキュベートした。スライドを適切なＨＲＰ標識ポリマーに３０分間曝露した。抗体反応は、色素原としてジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を使用して検出した。切片をヘマトキシリンで対比染色した。正常膵臓組織を陽性対照として使用する一方、陰性対照は、同じ組織（正常膵臓）を使用し一次抗体を省いたものとした。
【0207】
統計解析。対照未治療マウスとＰＡＳ治療マウスとの間の差異は、ＭＩＮＩＴＡＢ（バージョン１９）統計解析プログラムを使用して決定した。平均値はＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定によって比較し、有意性は９５％又はｐ＜０．０５の信頼レベルに設定した。
【0208】
実施例１
マウスでの腫瘍形成
ＰＡＳ治療が体液性及び細胞性免疫応答の両方を誘導し、免疫チェックポイント抗体療法に相乗的効果をもたらしたかどうかを決定するために、免疫適格マウス（例えば、マウスｍＴ３膵臓がん細胞と同系のＣ５７ＢＬ／６マウス）に、０．１ｍｌのＰＢＳ中の５×１０５のマウスｍＴ３膵臓がん細胞を側腹部に皮下投与することによって、腫瘍を形成させた。腫瘍が定着するまで１週間待った後、図１に示されるように、マウスをＰＡＳと一又は複数種の免疫チェックポイント阻害剤で治療した。
マウスでの腫瘍形成
ＰＡＳ治療が体液性及び細胞性免疫応答の両方を誘導し、免疫チェックポイント抗体療法に相乗的効果をもたらしたかどうかを決定するために、免疫適格マウス（例えば、マウスｍＴ３膵臓がん細胞と同系のＣ５７ＢＬ／６マウス）に、０．１ｍｌのＰＢＳ中の５×１０５のマウスｍＴ３膵臓がん細胞を側腹部に皮下投与することによって、腫瘍を形成させた。腫瘍が定着するまで１週間待った後、図１に示されるように、マウスをＰＡＳと一又は複数種の免疫チェックポイント阻害剤で治療した。
【0209】
ｍＴ３膵臓がん細胞接種の１週間後に、この時間枠で、試験中の全ての動物が触知可能な皮下腫瘍を有し、治療が腫瘍イニシエーションを妨げないことが担保されたので、動物の治療を開始した。主要エンドポイントは、腫瘍の増殖と生存期間であった。腫瘍の増殖をノギスで毎週測定し、腫瘍の体積をＬ×Ｗ２×０．５として計算した。腫瘍を切除し、限定されないが、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を含む免疫細胞について免疫組織化学的検査により組織学的に調べた。腫瘍をＰＤＡＣに典型的に関連する線維化の発生の有無と程度についても調べた。脾臓を摘出し、Ｔ細胞を単離してガストリンで再刺激した。細胞は、サイトカインの関連抗体パネルで標識し、フローサイトメトリーで特徴付けした。
【0210】
各実験では４０匹のマウスを用い（ｎ＝１群当たり１０匹；図１参照）、これに５×１０５の膵臓マウスがん細胞を移植した。ｍＴ３マウス膵臓腫瘍を担持する免疫適格な同系マウス群を、ＰＢＳ（陰性対照）、ＰＡＳ単独療法（腫瘍細胞接種から０、１、２、及び３週目に１投与当たり１００μｇ）、免疫チェックポイント阻害剤（初回ＰＡＳワクチン接種から０、４、８、１５、及び２１日目に１投与当たり１５０μｇ）として抗ＰＤ－１抗体（ＰＤ１－１抗体；Ｂｉｏ Ｘ ｃｅｌｌ，Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ，Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、又はＰＡＳワクチン接種（腫瘍細胞接種から０、１、２、及び３週目に１投与当たり１００μｇ）と免疫チェックポイント阻害剤（初回ＰＡＳワクチン接種から０、４、８、１５、及び２１日目に１投与当たり１５０μｇ）の組み合わせで治療した。プログラム細胞死タンパク質１に特異的な免疫チェックポイント遮断抗体（ＰＤ１－１ Ａｂ；Ｂｉｏ Ｘ ｃｅｌｌ，Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ，Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を腹腔内投与した。データを以下の表３と図２にまとめる。
【0211】
【0212】
ＰＢＳ対照マウスとＰＤ－１及びＰＡＳ１００治療群の両方のマウスの腫瘍重量の間のグラムでの最終腫瘍重量に統計的差異はなかった。対照的に、ＰＤ－１とＰＡＳ１００の組み合わせで治療したマウスは、ＰＢＳ対照（ｐ＝０．０１４）及びＰＤ－１対照（ｐ＝０．００１７）と比較して、腫瘍が有意に小さかった。更に、ＰＤ－１とＰＡＳ１００の併用治療では、ＰＡＳ１００単独療法よりも腫瘍はまた有意に小さかった（ｐ＜０．０５）。
【0213】
実施例２
ＣＤ３高分化型Ｔ細胞亜集団におけるＴＥＭＲＡＣＤ４－／ＣＤ８－細胞の分析
実施例１に記載したように、マウスに腫瘍を誘発した。Ｔリンパ球を、ＰＢＳ、ＰＤ－１ Ａｂ、ＰＡＳ１００、又はＰＡＳ１００＋ＰＤ－１ Ａｂで治療したマウスから単離した脾臓末梢血単核細胞（ＰＢＣＭ）から単離した。様々なＴ細胞亜集団を、表１に列挙された抗体を使用するフローサイトメトリーによって同定した。特に、ＣＤ３＋／ＣＤ４－／ＣＤ８－であった第一のＴ細胞亜集団を単離し、この亜集団からＣＤ３＋／ＣＤ４－／ＣＤ８－／ＣＤ４４－／ＣＤ６２Ｌ－であったＴＥＭＲＡ細胞を表す更なる亜集団を単離した。ＰＢＳ、ＰＤ－１ Ａｂ、ＰＡＳ１００、又はＰＡＳ１００＋ＰＤ－１ Ａｂで治療したマウスに存在するこれら様々な亜集団のパーセンテージと比率を決定し、その結果を図３Ａ及び３Ｂに示す。
ＣＤ３高分化型Ｔ細胞亜集団におけるＴＥＭＲＡＣＤ４－／ＣＤ８－細胞の分析
実施例１に記載したように、マウスに腫瘍を誘発した。Ｔリンパ球を、ＰＢＳ、ＰＤ－１ Ａｂ、ＰＡＳ１００、又はＰＡＳ１００＋ＰＤ－１ Ａｂで治療したマウスから単離した脾臓末梢血単核細胞（ＰＢＣＭ）から単離した。様々なＴ細胞亜集団を、表１に列挙された抗体を使用するフローサイトメトリーによって同定した。特に、ＣＤ３＋／ＣＤ４－／ＣＤ８－であった第一のＴ細胞亜集団を単離し、この亜集団からＣＤ３＋／ＣＤ４－／ＣＤ８－／ＣＤ４４－／ＣＤ６２Ｌ－であったＴＥＭＲＡ細胞を表す更なる亜集団を単離した。ＰＢＳ、ＰＤ－１ Ａｂ、ＰＡＳ１００、又はＰＡＳ１００＋ＰＤ－１ Ａｂで治療したマウスに存在するこれら様々な亜集団のパーセンテージと比率を決定し、その結果を図３Ａ及び３Ｂに示す。
【0214】
図３Ａは、ＰＢＳ、ＰＤ－１ Ａｂ、ＰＡＳ１００、又はＰＡＳ１００／ＰＤ－１で治療したマウスにおけるＣＤ３＋Ｔ細胞中のＴＥＭＲＡ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ４－／ＣＤ８－／ＣＤ４４－／ＣＤ６２Ｌ－）のパーセンテージを示す。図３Ｂは、ＴＥＭＲＡ細胞であった各治療群中のＣＤ３＋／ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞の比率を示す。
【0215】
治療群間での最も顕著な差異は、ＰＡＳ１００ではＰＢＳよりＣＤ４－／ＣＤ８－ＴＥＭＲＡ細胞が少なかったが、ＰＡＳ１００＋ＰＤ－１治療ではＰＢＳと比較して同様のＣＤ４－／ＣＤ８－ＴＥＭＲＡ細胞が生じたことである。ＰＡＳ１００／ＰＤ１で治療されたマウスのＴ細胞中のＴＥＭＲＡ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ４－／ＣＤ８－／ＣＤ４４－／ＣＤ６２Ｌ－）の部分は、ＰＢＳ又はＰＡＳ１００単独で治療されたマウスの部分の２倍以上であったが、これはＴＥＭＲＡ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ４－／ＣＤ８－／ＣＤ４４－／ＣＤ６２Ｌ－）がガストリン関連腫瘍及びがんを防ぎそれと戦うのに優れていることを示唆している。
【0216】
実施例３
ＰＡＳ１００でのサイトカイン活性化アッセイ
ＰＡＳ１００で治療されたマウスから単離された脾臓末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＴリンパ球を単離した。これらの細胞は、これらがインターフェロン－γ（ＩＮＦＧ）、グランザイム－Ｂ（グランザイム）、パーフォリン、及び腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）へのサイトカイン活性化によって確かに活性化されたＴ細胞であったかどうかを判定するためにフローサイトメトリーによって解析した。結果は図４Ａ及び４Ｂに提供される。
ＰＡＳ１００でのサイトカイン活性化アッセイ
ＰＡＳ１００で治療されたマウスから単離された脾臓末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＴリンパ球を単離した。これらの細胞は、これらがインターフェロン－γ（ＩＮＦＧ）、グランザイム－Ｂ（グランザイム）、パーフォリン、及び腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）へのサイトカイン活性化によって確かに活性化されたＴ細胞であったかどうかを判定するためにフローサイトメトリーによって解析した。結果は図４Ａ及び４Ｂに提供される。
【0217】
図４Ａは、ＰＡＳ１００で治療されたマウスから単離されたＴ細胞が確かに活性化されたことを示している。これら同じ細胞を培養中にガストリンで６時間再刺激すると（図４Ｂを参照）、細胞が再刺激され、より多くのサイトカインを放出したが、これは、ＰＡＳ１００ワクチン接種がＴ細胞を刺激したこと、更にこれらＴ細胞がガストリンに特異的に反応したことを裏付けている。
【0218】
実施例４
ＰＡＳ１００とＰＡＳ＋ＰＤ－１併用療法との比較
ＰＡＳ１００又はＰＡＳ１００とＰＤ－１の組み合わせで治療されたマウスから単離された脾臓ＰＢＭＣからＴリンパ球を単離した。細胞を、これらがインターフェロン－γ（ＩＮＦＧ）、グランザイム－Ｂ（グランザイム）、パーフォリン、及び腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）へのサイトカイン活性化によって確かに活性化されたＴ細胞であったかどうかを判定するためにフローサイトメトリーによって解析した。結果は図５Ａ及び５Ｂに提供される。
ＰＡＳ１００とＰＡＳ＋ＰＤ－１併用療法との比較
ＰＡＳ１００又はＰＡＳ１００とＰＤ－１の組み合わせで治療されたマウスから単離された脾臓ＰＢＭＣからＴリンパ球を単離した。細胞を、これらがインターフェロン－γ（ＩＮＦＧ）、グランザイム－Ｂ（グランザイム）、パーフォリン、及び腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）へのサイトカイン活性化によって確かに活性化されたＴ細胞であったかどうかを判定するためにフローサイトメトリーによって解析した。結果は図５Ａ及び５Ｂに提供される。
【0219】
ＰＡＳ１００単独で治療されたマウスの活性化Ｔリンパ球は、ＰＢＳ処置マウスのリンパ球と比較して増加したサイトカインを放出した（図５Ａ参照）。しかし、併用治療マウスのリンパ球は顕著に更に多くのサイトカインを放出したが（図５Ｂ参照）、これは、併用療法が活性化Ｔ細胞の刺激においてより良好であったことを示唆している。特にＴＮＦαは、ＰＡＳ１００単独での治療と比較して、ＰＡＳ１００＋ＰＤ－１ Ａｂ併用療法で２倍を超えて増加した（図５Ａ及び５Ｂを比較のこと）。
【0220】
実施例５
線維化に対するＰＤ－１単独療法、ＰＡＳ１００単独療法、及びＰＤ－１＋ＰＡＳ１００併用療法の効果の解析
ＰＢＳ、ＰＤ－１単独、ＰＡＳ１００、又はＰＡＳ１００＋ＰＤ－１で治療されたマウスの腫瘍を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、８μｍの切片を切り出しマウントした。組織切片を、線維化についてマッソントリクロームで染色した。
線維化に対するＰＤ－１単独療法、ＰＡＳ１００単独療法、及びＰＤ－１＋ＰＡＳ１００併用療法の効果の解析
ＰＢＳ、ＰＤ－１単独、ＰＡＳ１００、又はＰＡＳ１００＋ＰＤ－１で治療されたマウスの腫瘍を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、８μｍの切片を切り出しマウントした。組織切片を、線維化についてマッソントリクロームで染色した。
【0221】
マッソントリクロームで染色された代表的な切片を図６Ａに示す。線維化の定量的スコアを、ＩｍａｇｅＪ画像処理及び解析ソフトウェアを使用したコンピュータプログラムによって解析し、その結果を図６Ｂに示す。注目すべきは、ＰＤ－１単独療法及びＰＡＳ１００単独療法で治療された腫瘍の統合密度は陰性対照ＰＢＳ処置とは僅かな差であったが、ＰＡＳ＋ＰＤ－１ Ａｂ併用療法は、ＰＢＳ単独（ｐ＜０．００５）及びＰＡＳ１００単独（ｐ＜０．００１）と比較して統計的に有意であった密度（従って線維化）の低下をもたらした。
【0222】
実施例６
ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤に対するＰＤ－１単独療法、ＰＡＳ１００単独療法、及びＰＤ－１＋ＰＡＳ１００併用療法の効果の解析
腫瘍を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、８μｍの切片を切り出しマウントした。ＣＤ８＋リンパ球は、腫瘍微小環境においてＣＤ８抗体（１：７５力価；ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＴＭ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ１ＳＡ）で染色し、ＣＤ８＋細胞を盲検式に手動でカウントした。結果は図７Ａ及び７Ｂに提供される。
ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤に対するＰＤ－１単独療法、ＰＡＳ１００単独療法、及びＰＤ－１＋ＰＡＳ１００併用療法の効果の解析
腫瘍を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、８μｍの切片を切り出しマウントした。ＣＤ８＋リンパ球は、腫瘍微小環境においてＣＤ８抗体（１：７５力価；ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＴＭ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ１ＳＡ）で染色し、ＣＤ８＋細胞を盲検式に手動でカウントした。結果は図７Ａ及び７Ｂに提供される。
【0223】
図７Ａ及び７Ｂに示されるように、ＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）はＰＡＳ１００単独及びＰＤ－１単独で増加したが、併用療法では顕著に増加した。ＰＡＳ１００＋ＰＤ－１の組み合せでのＣＤ８＋細胞は、ＰＤ－１単独（ｐ＝０．０４２）よりも有意に多く、ＰＡＳ１００単独（ｐ＝０．０３９）よりも多かった。
【0224】
実施例７
Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ浸潤に対するＰＤ－１単独療法、ＰＡＳ１００単独療法、及びＰＤ－１＋ＰＡＳ１００併用療法の効果の解析
腫瘍を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、８μｍの切片を切り出しマウントした。腫瘍を抗Ｆｏｘｐ３抗体（１：３０力価；ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＴＭ）と反応させ、免疫反応性細胞を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して手動でカウントした。結果は図８Ａ及び８Ｂに提供される。
Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ浸潤に対するＰＤ－１単独療法、ＰＡＳ１００単独療法、及びＰＤ－１＋ＰＡＳ１００併用療法の効果の解析
腫瘍を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、８μｍの切片を切り出しマウントした。腫瘍を抗Ｆｏｘｐ３抗体（１：３０力価；ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＴＭ）と反応させ、免疫反応性細胞を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して手動でカウントした。結果は図８Ａ及び８Ｂに提供される。
【0225】
図８Ａは、ＴｒｅｇのマーカーであるＦｏｘｐ３タンパク質に結合する抗体で染色された例示的なｍＴ３腫瘍を示す。視野の比較では、ＰＢＳ（左上のパネル）、ＰＤ－１単独療法（右上のパネル）、又はＰＡＳ１００単独療法（左下のパネル）と比較して、ＰＡＳ１００＋ＰＤ－１併用療法では、腫瘍内Ｔｒｅｇの存在が減少したことが示され、これは、ＰＡＳ１００＋ＰＤ－１併用療法が、何れかの単独療法のみと比較して、腫瘍内環境を、腫瘍内微小環境がＴｒｅｇベースの免疫抑制の程度が低いことを特徴とする程度まで改変する可能性を示唆している。
【0226】
図８Ｂは、図８Ａによって例証されたデータを要約した棒グラフである。ＰＢＳと比較して、ＰＤ－１単独療法又はＰＡＳ１００単独療法で治療した腫瘍内のＦｏｘｐ３＋細胞の数には有意な差はなかった。ＰＡＳ１００＋ＰＤ－１ Ａｂ併用療法で治療した腫瘍では、陰性対照よりもＦｏｘｐ３＋細胞が有意に少なかった。
【0227】
実施例８
ＰａｎＩＮに対するＰＡＳワクチン接種の効果
ＰＡＳによる治療を、マウスが３か月齢になったときに開始したが、そのとき、膵臓は既にＰａｎＩＮを樹立していた。８か月齢で安楽死させたとき、対照マウスの６７％に高悪性度のＰａｎＩＮ－３病変があり、３３．３％に浸潤癌があった。対照的に、年齢を合わせたＰＡＳ治療マウスの組織学的病期は著しく低く、２０％がＰａｎＩＮ－２期であり、浸潤癌はわずか１０％であった。Ｈ＆Ｅ染色を施した対照膵臓の代表的な写真を、倍率１０Ｘで図９Ａ～９Ｃに示す。これらの図は、正常な膵臓構造の完全な破壊と広範な線維化を伴う高悪性度のＰａｎＩＮを示している。浸潤がんは対照マウスの膵臓に見られた（図９Ｃ）。対照的に、ＰＡＳ治療マウスからの膵臓の代表的な写真（図９Ｄ～９Ｆ）は、初期ステージの低悪性度のＰａｎＩＮと多くの保存された正常な膵臓腺房細胞を示した。対照膵臓の低倍率画像（４Ｘ）では、ＰａｎＩＮ病変及び線維化を伴う膵臓組織のほぼ完全な置換が示され（図９Ｇ）、同じ倍率では、ＰＡＳ治療膵臓では膵臓構造が保存されたＰａｎＩＮが減少していることが示された（図９Ｈ）。ＰＡＳ治療マウスにおけるＰａｎＩＮ形成を免れた正常膵臓の程度は、対照マウスにおけるよりも６０％高かった。
ＰａｎＩＮに対するＰＡＳワクチン接種の効果
ＰＡＳによる治療を、マウスが３か月齢になったときに開始したが、そのとき、膵臓は既にＰａｎＩＮを樹立していた。８か月齢で安楽死させたとき、対照マウスの６７％に高悪性度のＰａｎＩＮ－３病変があり、３３．３％に浸潤癌があった。対照的に、年齢を合わせたＰＡＳ治療マウスの組織学的病期は著しく低く、２０％がＰａｎＩＮ－２期であり、浸潤癌はわずか１０％であった。Ｈ＆Ｅ染色を施した対照膵臓の代表的な写真を、倍率１０Ｘで図９Ａ～９Ｃに示す。これらの図は、正常な膵臓構造の完全な破壊と広範な線維化を伴う高悪性度のＰａｎＩＮを示している。浸潤がんは対照マウスの膵臓に見られた（図９Ｃ）。対照的に、ＰＡＳ治療マウスからの膵臓の代表的な写真（図９Ｄ～９Ｆ）は、初期ステージの低悪性度のＰａｎＩＮと多くの保存された正常な膵臓腺房細胞を示した。対照膵臓の低倍率画像（４Ｘ）では、ＰａｎＩＮ病変及び線維化を伴う膵臓組織のほぼ完全な置換が示され（図９Ｇ）、同じ倍率では、ＰＡＳ治療膵臓では膵臓構造が保存されたＰａｎＩＮが減少していることが示された（図９Ｈ）。ＰＡＳ治療マウスにおけるＰａｎＩＮ形成を免れた正常膵臓の程度は、対照マウスにおけるよりも６０％高かった。
【0228】
実施例９
膵線維化の解析
膵臓がんの特徴の一つは、腫瘍への化学療法剤（Ｗａｇｈｒａｙ等，２０１３）及び免疫細胞（Ｓａｌｍｏｎ等，２０１２；Ｚｈｅｎｇ等，２０１３）の透過性を低下させる、腫瘍を取り囲む高密度の線維組織の形成（Ａｐｔｅ等，２００４）である。対照マウスの膵臓ではマッソントリクローム染色により広範な線維化が見出されたが（図１０Ａ）、ＰＡＳ治療マウスでは観察された線維化は顕著に少なかった（図１０Ｂ）。形態計測コンピュータ解析による線維化密度の定量では、対照マウスの膵臓と比較して、ＰＡＳをワクチン接種したマウスでは膵臓組織の線維化の量が５０％少なく、この差は有意である（ｐ＝０．０００１）ことが示された。
膵線維化の解析
膵臓がんの特徴の一つは、腫瘍への化学療法剤（Ｗａｇｈｒａｙ等，２０１３）及び免疫細胞（Ｓａｌｍｏｎ等，２０１２；Ｚｈｅｎｇ等，２０１３）の透過性を低下させる、腫瘍を取り囲む高密度の線維組織の形成（Ａｐｔｅ等，２００４）である。対照マウスの膵臓ではマッソントリクローム染色により広範な線維化が見出されたが（図１０Ａ）、ＰＡＳ治療マウスでは観察された線維化は顕著に少なかった（図１０Ｂ）。形態計測コンピュータ解析による線維化密度の定量では、対照マウスの膵臓と比較して、ＰＡＳをワクチン接種したマウスでは膵臓組織の線維化の量が５０％少なく、この差は有意である（ｐ＝０．０００１）ことが示された。
【0229】
実施例１０
ＰＡＳワクチン接種は腫瘍形成促進性Ｍ２マクロファージを減少させた
膵臓癌発生中、ＰａｎＩＮ病変を取り囲む微小環境では腫瘍形成促進性マクロファージの数が増加する（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ及びＢａｙｎｅ，２０１３；Ｚｈｅｎｇ等，２０１３）。発癌促進性マクロファージはアルギナーゼ陽性に染色され、Ｍ２マクロファージとして分極する（Ｐｏｌｌａｒｄ，２００９）。アルギナーゼ陽性マクロファージは、対照マウスの膵臓に豊富に存在した（図１１Ａ及び１１Ｂ）。対照的に、ＰＡＳ治療マウスでは、膵臓微小環境中のＭ２マクロファージが有意に少なかった（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。Ｍ２マクロファージ数のコンピュータ解析により、ＰＡＳ治療マウスでは対照マウスよりもアルギナーゼ陽性マクロファージが４倍少ないことが明らかになり（図１１Ｅ）、これは、ＰＡＳワクチン接種が膵臓の腫瘍形成性を低下させたことを示唆している（ｐ＜０．００１）。
ＰＡＳワクチン接種は腫瘍形成促進性Ｍ２マクロファージを減少させた
膵臓癌発生中、ＰａｎＩＮ病変を取り囲む微小環境では腫瘍形成促進性マクロファージの数が増加する（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ及びＢａｙｎｅ，２０１３；Ｚｈｅｎｇ等，２０１３）。発癌促進性マクロファージはアルギナーゼ陽性に染色され、Ｍ２マクロファージとして分極する（Ｐｏｌｌａｒｄ，２００９）。アルギナーゼ陽性マクロファージは、対照マウスの膵臓に豊富に存在した（図１１Ａ及び１１Ｂ）。対照的に、ＰＡＳ治療マウスでは、膵臓微小環境中のＭ２マクロファージが有意に少なかった（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。Ｍ２マクロファージ数のコンピュータ解析により、ＰＡＳ治療マウスでは対照マウスよりもアルギナーゼ陽性マクロファージが４倍少ないことが明らかになり（図１１Ｅ）、これは、ＰＡＳワクチン接種が膵臓の腫瘍形成性を低下させたことを示唆している（ｐ＜０．００１）。
【0230】
［実施例の考察］
ここに記載されるのは、膵臓がん及び膵臓の前がん病変の進行が、ガストリンを標的とするワクチンによって予防できることを実証した実験である。ＰＡＳは、変異ＫＲＡＳマウスのＰａｎＩＮステージを低下させるだけでなく、がんの発生率も低下させた。部分的には、この効果は、ワクチン接種に応答して産生される抗ガストリン抗体の中和効果によって媒介される。ＣＣＫ－Ｂ受容体は初期のＰａｎＩＮ病変で発現されるようになり（Ｓｍｉｔｈ等，２０１４）、この受容体のガストリン活性化は上皮細胞増殖を伴う下流のシグナル伝達を誘導するため、受容体界面でのガストリンの作用の妨害がＰａｎＩＮ抑止をもたらした可能性が最も高い。ＰＡＳをワクチン接種されたマウスは、ガストリンに対する中和抗体の力価が高い（Ｏｓｂｏｒｎｅ等，２０１９ｂ）。
ここに記載されるのは、膵臓がん及び膵臓の前がん病変の進行が、ガストリンを標的とするワクチンによって予防できることを実証した実験である。ＰＡＳは、変異ＫＲＡＳマウスのＰａｎＩＮステージを低下させるだけでなく、がんの発生率も低下させた。部分的には、この効果は、ワクチン接種に応答して産生される抗ガストリン抗体の中和効果によって媒介される。ＣＣＫ－Ｂ受容体は初期のＰａｎＩＮ病変で発現されるようになり（Ｓｍｉｔｈ等，２０１４）、この受容体のガストリン活性化は上皮細胞増殖を伴う下流のシグナル伝達を誘導するため、受容体界面でのガストリンの作用の妨害がＰａｎＩＮ抑止をもたらした可能性が最も高い。ＰＡＳをワクチン接種されたマウスは、ガストリンに対する中和抗体の力価が高い（Ｏｓｂｏｒｎｅ等，２０１９ｂ）。
【0231】
本開示の主題の別の重要な発見は、ＰＡＳ治療マウスにおける膵臓微小環境の変化に関与する。膵臓癌発生中、膵星細胞は活性化された筋線維芽細胞になり、膵臓にコラーゲン性線維形成を起こさせる（Ａｐｔｅ等，２００４）。星細胞はまたＣＣＫ－Ｂ受容体を有しており（Ｂｅｒｎａ等，２０１０）、これら受容体のガストリン活性化を阻害すると、微小環境の線維化が減少した。膵臓微小環境の線維芽細胞は、がん上皮細胞及び免疫細胞とコミュニケートし、サイトカインの活性化を生じる。この免疫活性化により、正常な膵臓組織の破壊と、前がん性ＰａｎＩＮ病変での置換に至る。実際、ＰＡＳ治療マウスでは、正常な膵臓と腺房細胞の大部分が保護された。以前には、ＰＡＳとＰＤ－１抗体の組み合わせで治療した膵臓腫瘍担持マウスで腫瘍内線維化が減少するが、ＰＡＳ又はＰＤ－１抗体での単独療法では線維化を減少させることができなかったことが示されていた（Ｏｓｂｏｒｎｅ等，２０１９１；Ｏｓｂｏｒｎｅ等，２０１９ｂ）。ここに開示されるＰＡＳ単独療法による線維化の顕著な減少についての一つの可能な説明は、ここに記載される実験では、ＰＡＳが、以前の試験の腫瘍担持マウスと比較して、ＫＲＡＳマウスにおいてより長い期間（すなわち、数か月対数週間）投与され、また数回の追加免疫が施されたことでありうる。また、ここで用いられたより多い用量がより効果的であった可能性もある。
【0232】
膵臓癌発生を促進するもう一つの重要な免疫細胞は、Ｍ２マクロファージである。未治療の変異ＫＲＡＳマウスの膵臓微小環境には、癌発生中に豊富なＭ２アルギナーゼ陽性マクロファージが浸潤するようになる。ＰＡＳワクチン接種は、これらの腫瘍関連マクロファージの流入と分極を抑制し、膵臓微小環境の発癌性を低下させた。
【0233】
現在、膵臓がんを予防するための予防検査又は治療法はない。我々の研究から直ちに恩恵を受ける集団には、膵臓がんのリスクが高いと考えられる集団、例えば膵臓がん、慢性膵炎、又は新たに発症した糖尿病の家族歴がある集団が含まれる。ＢＲＣＡ２生殖細胞系列の変化又は遺伝性膵炎のある集団もまたワクチン接種の恩恵を受ける場合がある。現在、高リスク又は家族歴のある集団は、ＭＲＩ画像監視、時には超音波内視鏡検査を受けるが、これらの技術は監視のみを目的としており、予防的ではない。免疫予防薬としてのＰＡＳを発生させるための一つの戦略は、膵臓がん発症のリスクが高い集団にワクチン接種をすることであろう。ワクチン接種は、腫瘍の再発を防ぐために、膵臓がんの切除／ウィップル手術が成功した患者にも使用できる可能性がある。膵臓がん集団の最大２０％で根治的切除が試みられているが、この集団の５年生存率は顕微鏡的疾患の再発により依然としてせいぜい２０～３０％に過ぎない。ＰＡＳワクチン接種は、手術後の再発の減少と高リスク集団におけるがん予防のための新しいアプローチを提供する可能性がある。
【0234】
要約すると、ここに開示されているのは、ポリクローナル抗体刺激剤（ＰＡＳ）であるガストリン標的ワクチンが膵臓がん又はその前駆体のイニシエーション及び／又は進行を予防する能力を調査するために前がん性膵上皮内腫瘍（ＰａｎＩＮ）病変及び膵臓がんを経時的に発症するトランスジェニックＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｐ４８－Ｃｒｅマウスを用いた実験である。マウスを、３か月齢で開始してＰＡＳ（２５０μｇ）で治療し、マウスが８か月齢に達するまで毎月追加免疫を施した。膵臓は、治療を知らされていない病理医による組織学的分析のために切除され、固定され、パラフィン包埋された。ＰａｎＩＮステージと正常な膵臓組織を置き換えるＰａｎＩＮの程度は、ＰＡＳ治療マウスにおいて低下した。８か月齢の時点で、未治療のＫＲＡＳ対照マウスの３３％においてがんが発生したが、ＰＡＳ治療マウスでは１０％のみで発生した。対照マウスと比較して、ＰＡＳで治療されたマウスの膵臓では、線維化が５０％を超えて減少し、アルギナーゼ陽性腫瘍関連マクロファージが７４％減少した。
【0235】
従って、本開示の主題は、ＰＡＳ投与を、膵臓がんと他の関連するガストリン関連障害の治療法として使用できるだけでなく、そのイニシエーション又は進行を予防するためにもまた使用できることを提示する。
【0236】
［参考文献］
限定されないが、全ての特許、特許出願及びそれらの公報、科学雑誌記事、及びデータベースエントリー（限定されないが、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）生物配列データベースエントリー及びその中で利用可能な全ての注釈を含む）を含む本開示に列挙された全ての参考文献は、それらがここで用いられる方法論、技術、及び／又は組成物を補足し、説明し、その背景を提供し、及び／又は教示する範囲で、その全体が出典明示によってここに援用される。参考文献の検討は、単にその著者がなした主張を要約することを意図している。如何なる参考文献（又は如何なる参考文献の一部）も関連する先行技術であるという自認はしない。本出願人は、あらゆる引用参考文献の正確性と妥当性については異議を唱える権利を留保する。
限定されないが、全ての特許、特許出願及びそれらの公報、科学雑誌記事、及びデータベースエントリー（限定されないが、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）生物配列データベースエントリー及びその中で利用可能な全ての注釈を含む）を含む本開示に列挙された全ての参考文献は、それらがここで用いられる方法論、技術、及び／又は組成物を補足し、説明し、その背景を提供し、及び／又は教示する範囲で、その全体が出典明示によってここに援用される。参考文献の検討は、単にその著者がなした主張を要約することを意図している。如何なる参考文献（又は如何なる参考文献の一部）も関連する先行技術であるという自認はしない。本出願人は、あらゆる引用参考文献の正確性と妥当性については異議を唱える権利を留保する。
【0237】
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【0238】
本開示の主題の様々な詳細は、本開示の主題の範囲から逸脱することなく変更されうることが理解されるであろう。更に、前述の説明は例証のみを目的としており、限定を目的とするものではない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】