知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ヴィトラフィー ライフ サイエンシズ プロプライエタリー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-02
(54)【発明の名称】生物学的材料の保存方法および装置
(51)【国際特許分類】
C12M 1/38 20060101AFI20240126BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20240126BHJP
C12N 1/04 20060101ALI20240126BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20240126BHJP
【ＦＩ】
C12M1/38 Z
C12M3/00 Z
C12N1/04
C12N5/078
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023542813
(86)(22)【出願日】2021-01-14
(85)【翻訳文提出日】2023-09-12
(86)【国際出願番号】 AU2021050024
(87)【国際公開番号】W WO2022150870
(87)【国際公開日】2022-07-21
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521225247
【氏名又は名称】ヴィトラフィー ライフ サイエンシズ リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＶＩＴＲＡＦＹ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｌｅｖｅｌ １，４７ Ｓａｎｄｙ Ｂａｙ Ｒｏａｄ，Ｈｏｂａｒｔ，Ｔａｓｍａｎｉａ ７０００，ＡＵＳＴＲＡＬＩＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110002147
【氏名又は名称】弁理士法人酒井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キャメロン，ショーン
(72)【発明者】
【氏名】オーウェンズ，ブレント
(72)【発明者】
【氏名】テイラー，ブライアン
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029BB11
4B029CC01
4B029DD04
4B029DF01
4B065AA94X
4B065BD12
4B065CA44
(57)【要約】
生物学的材料を保存するための装置（１０）。当該装置（１０）は、外側断熱タンク（２）内に配置されるように構成されたインサート（４）を有し、該インサート（４）は、生物学的材料を受容するためのコンパートメント（６）を画定する。外側断熱タンク（２）からコンパートメント（６）への熱交換流体の流入は、インサート（４）の一方の面またはそれに隣接して行われ、コンパートメント６から外側断熱タンク（２）への熱交換流体の流出は、インサート（４）の前記面またはそれに隣接して行われる。コンパートメント（６）は、装置を通じる連続的な熱交換流体の流れを収容するための一連の開口部を有する壁を含み、作動時に、コンパートメント（６）内の生物学的材料が熱交換流体中に浸漬され、生物学的材料の凍結のために熱交換流体と熱交換する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生物学的材料を保存するための装置であって、外側断熱タンク内に配置されるように構成されたインサートを備え、前記インサートは、生物学的材料を受容するためのコンパートメントを画定し、前記外側断熱タンクから前記コンパートメントへの熱交換流体の流入は、前記インサートの一方の面において、またはそれに隣接して行われ、前記熱交換流体の前記コンパートメントから前記外側断熱タンクへの流出は、前記インサートの前記面において、またはそれに隣接して行われ、前記コンパートメントは、前記装置を通じる連続的な熱交換流体の流れを収容するための一連の開口部を有する壁を含み、作動中、前記コンパートメント内の生物学的材料は、熱交換流体中に浸漬され、前記生物学的材料の凍結のために前記熱交換流体と熱交換する、装置。
【請求項2】
前記インサートが、１つ以上の特定の経路に沿って前記コンパートメントを通る前記熱交換流体の流れを誘導するように構成されたバッフルを有する、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項3】
生物学的材料を保持するために前記コンパートメント内に受容可能な構造体を含み、前記構造体がトレイ、ラックおよびバスケットのうちの１つ以上である、ことを特徴とする請求項１または２に記載の装置。
【請求項4】
前記コンパートメントが、複数のサブコンパートメントを画定する複数の内部仕切りを有し、各サブコンパートメントが、前記構造体の１つを受容するように構成されている、ことを特徴とする請求項３に記載の装置。
【請求項5】
前記外側断熱タンクは、前記インサートが前記外側断熱タンク内に配置されたときに、前記インサートの前記面に隣接する１つの側面を有し、前記側面は、少なくとも１つの入口および少なくとも１つの出口を含み、前記入口は、使用時に、前記外側断熱タンクの外側から前記コンパートメント内に連通し、前記出口は、使用時に、前記コンパートメントから前記外側断熱タンクの外側に連通し、作動中、前記熱交換流体は、前記少なくとも１つの入口を介して前記タンクに導入され、前記少なくとも１つの出口を介して前記タンクから除去される、ことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項6】
前記コンパートメント内の前記生物学的材料の凍結後に、前記生物学的材料を保持する１つ以上の容器を受容するように構成された乾燥タンクをさらに備え、前記乾燥タンクは、前記容器上に存在する残留流体を乾燥するように構成される、請求項１から５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項7】
熱交換流体が、前記乾燥タンクを冷却するために前記乾燥タンク内に導かれる、ことを特徴とする請求項６に記載の装置。
【請求項8】
装置が、熱交換流体を前記外側断熱タンクおよび前記乾燥タンクの一方または両方に選択的に導くための電磁制御弁を備える、請求項７に記載の装置。
【請求項9】
前記乾燥タンクは、前記生物学的材料を保持する前記１つ以上の容器を所定の温度で貯蔵するように構成されている、ことを特徴とする請求項６から８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項10】
生物学的材料を保存する方法であって、ａ．前記生物学的材料の試料の近似形状の総表面積を決定する工程であって、前記生物学的材料および任意の包装は、試料を画定する、工程と、
ｂ．前記試料の熱特性を推定する工程と、
ｃ．試料の近似形状、前記試料の熱的性質、前記装置の形状、前記装置内の試料の所定の配置、熱交換流体の所定の入口温度、および入口から出口への前記熱交換流体の所定の温度上昇のいずれか１つ以上を含む流れ制約に基づいて、請求項１から９のいずれか一項に記載の装置の前記コンパートメント内の前記試料に対して計算流体力学解析を実行する工程と、
ｄ．前記試料の液－固相転移の開始を概算する工程と、
ｅ．相転移の前記開始付近までの所定の試料表面温度における前記試料の前記コアの平均温度低下率、および所定の徐冷速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
ｆ．相転移の前記開始付近から所定の試料表面温度における前記試料の前記コアの平均温度低下率、および所定の急速冷却速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
ｇ．請求項１から９のいずれか一項に記載の装置の前記コンパートメント内の試料を、相転移の前記開始付近まで前記徐冷速度で冷却する工程と、
ｈ．前記コンパートメント内の前記試料を、相転移の前記開始付近から前記急速冷却速度で冷却する工程と
を備える方法。
【請求項11】
前記試料が凍結保護剤を含まない、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
生物学的材料が貯蔵されるコンパートメント、および熱交換流体を前記コンパートメントに流入および／またはそこから流出させるポンプ機械を有する装置内で前記生物学的材料を保存する方法であって、前記生物学的材料の熱特性、ならびに前記ポンプ機械のポンプ能力、熱交換流体、および前記生物学的材料の温度の少なくとも１つに基づいて、前記コンパートメントへの熱交換流体の流入および／または前記コンパートメントからの熱交換流体の流出を調整する工程を備える、方法。
【請求項13】
保存前に生物学的材料に添加されるべき凍結保護剤の量を決定する方法であって、ａ．初期量の凍結保護剤を含む、保存されるべき前記生物学的材料の近似形状の総表面積を決定する工程であって、前記生物学的産物、凍結保護剤および任意の包装が試料を画定する、工程と、
ｂ．前記試料の熱特性を推定する工程と、
ｃ．前記試料の近似形状、前記試料の熱特性、前記装置の形状、前記装置内の試料の所定の配置、熱交換流体の所定の入口温度、および入口から出口への前記熱交換流体の所定の温度上昇のいずれか１つ以上を含む流れ制約に基づいて、請求項１から９のいずれか一項に記載の装置の前記コンパートメント内の前記試料について計算流体力学解析を実行する工程と、
ｄ．前記試料の液－固相転移の開始を近似する工程と、
ｅ．相転移の開始付近までの所定の試料表面温度における前記試料の前記コアの平均温度低下率、および所定の徐冷速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
ｆ．相転移の開始付近から所定の試料表面温度における前記試料の前記コアの平均温度低下率、および所定の急冷速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
ｇ．工程（ｆ）で計算された前記熱交換流体流量が、所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティを超える前記装置のポンプデューティまたはエバポレータデューティにそれぞれ対応する場合、前記初期量よりも所定量多い凍結保護剤の量を選択して、新たな初期量を定義するか、または工程（ｆ）で計算された前記熱交換流体流量が、所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティ以下であるポンプデューティまたはエバポレータデューティにそれぞれ対応する場合、凍結保護剤の前記初期量を、保存前に生物学的材料に添加されるべき凍結保護剤の前記量として選択する工程と、
ｈ．工程（ｆ）で計算された前記熱交換流体流量が、前記所定のポンプデューティまたは前記所定のエバポレータデューティを超えるポンプデューティまたはエバポレータデューティにそれぞれ対応する場合、工程（ｆ）で計算された前記熱交換流体流量が、前記所定のポンプデューティまたは前記所定のエバポレータデューティ以下であるポンプデューティまたはエバポレータデューティにそれぞれ対応するまで、工程（ａ）から（ｇ）を繰り返す工程と
を備える方法。
【請求項14】
工程（ａ）から（ｇ）のいずれかを繰り返す前の凍結保護剤の前記初期量がゼロである、ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記徐冷速度が約毎分約１０℃までである、ことを特徴とする請求項１０から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記徐冷速度が毎分約０．１℃と約１０℃との間である、ことを特徴とする請求項１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記急冷速度が毎分約１００℃より大きい、ことを特徴とする請求項１０から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記急冷速度が毎分約２００℃より大きい、ことを特徴とする請求項１０から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
液－固相転移の前記開始が、一定の冷却速度で凍結中の前記試料の冷却曲線から近似される、ことを特徴とする請求項１０から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
凍結中の前記試料の前記冷却曲線が、前記試料に対する前記計算流体力学解析から得られる、ことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
凍結保存された生物学的材料を解凍するための装置であって、生物学的材料を受容するための解凍タンクであって、前記生物学的材料は、トレイ、ラックおよびバスケットのうちの１つ以上を含む構造において前記タンク内に保持される、解凍タンクと、解凍液がタンク内に導入されるタンク入口と、解凍液が前記タンクから除去されるタンク出口とを備え、前記タンクは、前記装置を通じる連続的な解凍流体流を収容するように構成され、作動中、前記タンク内の生物学的材料は、前記解凍流体中に浸漬され、前記生物学的材料を解凍するために前記解凍流体と熱交換する、ことを特徴とする装置。
【請求項22】
前記解凍流体が前記タンク入口を介して前記タンク内に導入される速度が、前記生物学的材料の損傷を防止するように前記生物学的材料が加熱される速度を制御するよう制御可能である、ことを特徴とする請求項２１に記載の装置。
【請求項23】
前記タンクは、１つ以上の特定の経路に沿って前記タンクを通じる前記解凍流体の流れを誘導するように構成されたバッフルを有する、ことを特徴とする請求項２２に記載の装置。
【請求項24】
凍結保存された生物学的材料を解凍する方法であって、ａ．前記生物学的材料の近似形状の総表面積を決定する工程であって、前記生物学的材料および任意の包装が試料を画定する、工程と、
ｂ．前記試料の熱特性を推定する工程と、
ｃ．前記試料の近似形状、前記試料の熱特性、前記装置の形状、前記装置内の試料の所定の配置、解凍流体の所定の入口温度、および入口から出口への前記解凍流体の所定の温度低下のいずれか１つ以上を含む流れ制約に基づいて、請求項１９または２０に記載の解凍装置の前記タンク内の前記試料に対して計算流体力学解析を実行する工程と、
ｄ．前記試料の固－液相転移の開始を概算する工程と、
ｅ．工程（ｄ）で決定された固－液相転移の前記開始までの期間、前記凍結保存された生物学的産物を解凍する工程と
を備える方法。
【請求項25】
前記解凍流体の前記入口温度が約３７℃である、ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
固－液相転移の前記開始が、一定の冷却速度で凍結中の前記試料の冷却曲線から近似される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項27】
凍結中の前記試料の前記解凍曲線が、前記試料に対する前記計算流体力学解析から得られる、ことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物学的材料を保存する方法および生物学的材料を保存するための装置に関する。
【背景技術】
【0002】
赤血球（ＲＢＣ）を体外で保存する能力は、長年、救命のための実践とみなされてきた。より最近では、輸血医療における冷蔵保存赤血球の使用が広く評価されている。冷蔵保存中の赤血球は徐々に劣化し、長期保存赤血球の点滴は、術後感染症、入院期間、死亡率などの点で不利な臨床結果と関連している。
【0003】
保存された赤血球の輸血に関する懸念は依然として残っており、現在では輸血制限戦略が支持されている。このため、凍結保存への関心が再び高まっている。赤血球を超低温で保存すると、細胞代謝が停止し、その結果、不利な臨床結果に関係してきた細胞の劣化が進行するのを防ぐことができる。
【0004】
当初、凍結保存は、赤血球を長期間生存可能に維持するための有望な方法と考えられていた。しかしながら、凍結保存された赤血球（一般に「凍結赤血球」として知られている）の臨床応用は、この保存方法が高価で、時間がかかり、非効率的な性質によって妨げられていた。
【0005】
冷蔵保存赤血球の要件
現在、赤血球は、生存赤血球の保存状態にもよるが、２～６℃で最大５～６週間保存されるのが普通である。一方、凍結保存は赤血球を数年間保存することを可能にする。凍結保存は現在、希少血液型のドナーからの赤血球の長期保存や軍事配備のための貴重なアプローチである。しかし、凍結保存赤血球の備蓄は、需要が赤血球の供給を上回るような緊急時や臨床状況においても有益である。現在の方法による凍結保存赤血球の保存期間は最長１０年である。
現在、赤血球は、生存赤血球の保存状態にもよるが、２～６℃で最大５～６週間保存されるのが普通である。一方、凍結保存は赤血球を数年間保存することを可能にする。凍結保存は現在、希少血液型のドナーからの赤血球の長期保存や軍事配備のための貴重なアプローチである。しかし、凍結保存赤血球の備蓄は、需要が赤血球の供給を上回るような緊急時や臨床状況においても有益である。現在の方法による凍結保存赤血球の保存期間は最長１０年である。
【0006】
国際的なガイドラインでは、冷蔵赤血球保存装置での溶血が許容レベル（すなわち、ヨーロッパでは０．８％、米国では１％）以下でなければならず、点滴後２４時間経過しても点滴赤血球の少なくとも７５％が循環していなければならない。
【0007】
しかし、このガイドラインは、点滴後の赤血球の機能を具体的に反映していない。
【0008】
保存赤血球の品質
４℃での保存は、赤血球の生化学的プロセスを遅らせるが、細胞代謝はこの温度で完全に抑制されるわけではない。冷蔵保存中に、点滴後の赤血球の機能を損なう可能性のある様々な変化が観察されている。これらの変化には、２，３－ジホスホグリセリン酸（ＤＰＧ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）および膜シアル酸含量の濃度減少が含まれる。その他の変化としては、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の細胞表面への移行、膜脂質やタンパク質の酸化傷害、球状赤血球への形状変化、膜の滲出、赤血球貯蔵ユニットにおけるカリウム、遊離ヘモグロビン（Ｈｂ）、サイトカイン、生理活性脂質、（凝固促進）マイクロベシクルの蓄積などがある。
４℃での保存は、赤血球の生化学的プロセスを遅らせるが、細胞代謝はこの温度で完全に抑制されるわけではない。冷蔵保存中に、点滴後の赤血球の機能を損なう可能性のある様々な変化が観察されている。これらの変化には、２，３－ジホスホグリセリン酸（ＤＰＧ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）および膜シアル酸含量の濃度減少が含まれる。その他の変化としては、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の細胞表面への移行、膜脂質やタンパク質の酸化傷害、球状赤血球への形状変化、膜の滲出、赤血球貯蔵ユニットにおけるカリウム、遊離ヘモグロビン（Ｈｂ）、サイトカイン、生理活性脂質、（凝固促進）マイクロベシクルの蓄積などがある。
【0009】
赤血球のレオロジー特性も冷蔵保存中に損なわれる。冷蔵保存された赤血球は、凝集傾向の増大と内皮細胞（ＥＣ）への接着を示し、また保存の２週間目からは変形性が低下する。このような変化は、赤血球が微小循環において適切に機能することを妨げる可能性がある。
【0010】
超低温での赤血球の保存は、赤血球の生物学的活性を停止させ、長期間の保存を可能にする。一般に、細胞の損傷を防ぐには、高濃度の凍結保護添加剤か急速な凍結速度が必要である。冷却速度が遅いと、細胞外に氷が形成される。氷が形成されると、未凍結画分の溶質含量が濃縮される。その結果、浸透圧の不均衡が生じ、赤血球から体液が流出し、細胞内脱水が起こる。一方、急速な冷却速度では、赤血球の細胞質が過冷却状態になり、細胞内に氷が形成される。
【0011】
凍結損傷を最小限に抑えるためには、凍結保護添加剤が重要であると考えられてきた。長年にわたり、赤血球の凍結保存のためのさまざまな非透過性添加剤および透過性添加剤が研究されてきた。ヒドロキシエチルデンプンやポリビニルピロリドンなどの非透過性添加剤や、さまざまなグリコールや糖類は、輸血前に解凍赤血球から除去する必要がないと提唱されたため、有望視された。
【0012】
逆に、浸透性添加剤のグリセロールは、超低温で赤血球を保護する能力で知られている。赤血球を保護するのに必要なグリセロールの濃度は、冷却速度と保存温度に依存する。グリセロールは、凍結中の細胞脱水と溶質の影響を最小限に抑えながら、氷の形成速度と程度を遅くすることで赤血球を保護する。
【0013】
解凍保存赤血球の要件
超低温の氷点下で赤血球を保存することにより、赤血球を何年も保存することが可能になるが、いったん解凍された赤血球の保存可能期間は限られている。脱グリセロールした赤血球は、主に生理食塩水－アデニン－グルコース－マンニトール（ＳＡＧＭ）保存液で４８時間まで、またはＡＳ－３保存液で１４日間まで保存される。凍結保存された赤血球は、残存グリセロール含量を１％以下にするために脱グリセロールする必要がある。さらに、赤血球は、赤血球単位の溶血が許容レベル（欧州では０．８％、米国では１％）以下であること、および脱グリセロール後の赤血球の解凍後回復率（凍結解凍洗浄回復率）が８０％以上であることを要求する上記の国際的ガイドラインの対象となる。また、凍結保存された赤血球の少なくとも７５％は、点滴後２４時間経っても循環していなければならない。
超低温の氷点下で赤血球を保存することにより、赤血球を何年も保存することが可能になるが、いったん解凍された赤血球の保存可能期間は限られている。脱グリセロールした赤血球は、主に生理食塩水－アデニン－グルコース－マンニトール（ＳＡＧＭ）保存液で４８時間まで、またはＡＳ－３保存液で１４日間まで保存される。凍結保存された赤血球は、残存グリセロール含量を１％以下にするために脱グリセロールする必要がある。さらに、赤血球は、赤血球単位の溶血が許容レベル（欧州では０．８％、米国では１％）以下であること、および脱グリセロール後の赤血球の解凍後回復率（凍結解凍洗浄回復率）が８０％以上であることを要求する上記の国際的ガイドラインの対象となる。また、凍結保存された赤血球の少なくとも７５％は、点滴後２４時間経っても循環していなければならない。
【0014】
グリセロールを用いた凍結法
現在、グリセロールによる赤血球の保存には２つの凍結法が認められている。
１．赤血球は、－１４０℃以下の温度で、最終濃度約２０％グリセロール（ｗｔ／ｖｏｌ）の低グリセロール法（ＬＧＭ）を用いて液体窒素中で急速凍結することができる。
２．赤血球は、高グリセロール法（ＨＧＭ）を用いてゆっくりと凍結することができ、－６５℃～－８０℃で最終濃度約４０％（ｗｔ／ｖｏｌ）のグリセロールで保存することができる。
３．赤血球は、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の標準製剤を用いて急速凍結することができる。
現在、グリセロールによる赤血球の保存には２つの凍結法が認められている。
１．赤血球は、－１４０℃以下の温度で、最終濃度約２０％グリセロール（ｗｔ／ｖｏｌ）の低グリセロール法（ＬＧＭ）を用いて液体窒素中で急速凍結することができる。
２．赤血球は、高グリセロール法（ＨＧＭ）を用いてゆっくりと凍結することができ、－６５℃～－８０℃で最終濃度約４０％（ｗｔ／ｖｏｌ）のグリセロールで保存することができる。
３．赤血球は、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の標準製剤を用いて急速凍結することができる。
【0015】
凍結保存赤血球は、処理手順中に生じる細胞損失のために効率が悪い。この細胞損失は、ＨＧＭ凍結保存赤血球ではより顕著である（約１０－２０％）。しかし、ＬＧＭの方が赤血球の収量が多いにもかかわらず、一般にＨＧＭ凍結保存赤血球は凍結中の温度変動に耐え、解凍後の保存中により安定であると考えられている。さらに、ＨＧＭ凍結保存赤血球は液体窒素を必要としないため、保存や輸送の条件が緩和される。その結果、ＨＧＭは現在欧米で最も適用されている赤血球凍結法である。
【0016】
凍結保存のＨＧＭに関連する保存方法は、高いグリセロール含量と保存温度範囲に起因する細胞内脱水をもたらす。さらに、ＨＧＭ法は、多くの用途において、保存細胞およびその周囲の物質が液体状態から固体状態へ、またはその逆へゆっくりと移行するため、浸透圧ショック損傷につながり、細胞死の増加に関連する。
【0017】
対照的に、ＬＧＭは溶質濃度効果を最小化し、それによって浸透圧ショック効果を最小化するが、急速冷却速度が細胞外に水が移動するのに十分な時間を与えなければ、細胞内氷形成が問題になる可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0018】
本発明の好ましい実施形態は、より低いグリセロール含量を利用することで、凍結保存赤血球の保存期間を延長しながら、細胞の脱水および溶質の影響を最小限に抑えることを追求する。
【0019】
他の好ましい実施形態は、細胞の生存率を維持しながら、凍結保護剤の使用を減らすか、または排除しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【0020】
上記の背景は赤血球に関するものであるが、本発明の実施形態は、幹細胞（例えば、骨髄、臍帯血、羊水などからのもの）、他の血液製剤（例えば、白血球、血漿、血小板、血清など）、細菌および真菌などの微生物、生殖細胞および精液などの関連物質、腫瘍細胞、初乳、ワクチン、植物細胞などの他の生物学的材料に適用できることが理解されよう。
【0021】
本明細書で使用される場合、「生物学的材料」には、以下の材料の非網羅的リストが含まれる：血液、血漿、血小板、細菌、臓器、精液、卵、初乳、皮膚、血清、ワクチン、幹細胞、臍帯、骨髄、および上記の他の材料。
【0022】
本発明の第１の態様によれば、生物学的材料を保存するための装置が提供され、当該装置は、外側断熱タンク内に配置されるように構成されたインサートを備え、該インサートは、生物学的材料を受容するためのコンパートメントを画定し、外側断熱タンクからコンパートメントへの熱交換流体の流入は、インサートの一方の面において、または該面に隣接して行われ、コンパートメントから外側断熱タンクへの熱交換流体の流出は、インサートの前記面であるか、または前記面に隣接して行われ、コンパートメントは、装置を通じて連続的な熱交換流体の流れを収容するための一連の開口部を有する壁を含み、作動中、コンパートメント内の生物学的材料は、熱交換流体中に浸漬され、生物学的材料の凍結のために熱交換流体と熱交換する。
【0023】
本発明の第２の態様によれば、生物学的材料を保存する方法が提供され、当該方法は、
ａ．生物学的材料の試料の近似された形状の総表面積を決定する工程であって、生物学的材料および任意の包装は、試料を画定する、工程と、
ｂ．試料の熱特性を推定する工程と、
ｃ．近似された試料の形状、試料の熱的性質、装置の形状、装置内の試料の所定の配置、熱交換流体の所定の入口温度、および入口から出口への熱交換流体の所定の温度上昇のいずれか１つ以上を含む流れ制約に基づいて、上記の態様の装置の前記コンパートメント内の試料に対して計算流体力学解析を実施する工程と、
ｄ．試料の液－固相転移の開始を概算する工程と、
ｅ．相転移が始まるまでの所定の試料表面温度における試料のコアの平均温度低下率、および所定の徐冷速度を得るために必要な対応する熱交換流体の流量を決定する工程と、
ｆ．相転移の開始から所定の試料表面温度における試料のコアの平均温度低下率、および所定の急速冷却速度を得るために必要な対応する熱交換流体の流量を決定すると、
ｇ．相転移の開始付近まで、前記徐冷速度で、上記態様の装置のコンパートメント内の試料を冷却する工程と、
コンパートメント内の試料を、相転移の開始付近から急速冷却速度で冷却する工程とを含む。
ａ．生物学的材料の試料の近似された形状の総表面積を決定する工程であって、生物学的材料および任意の包装は、試料を画定する、工程と、
ｂ．試料の熱特性を推定する工程と、
ｃ．近似された試料の形状、試料の熱的性質、装置の形状、装置内の試料の所定の配置、熱交換流体の所定の入口温度、および入口から出口への熱交換流体の所定の温度上昇のいずれか１つ以上を含む流れ制約に基づいて、上記の態様の装置の前記コンパートメント内の試料に対して計算流体力学解析を実施する工程と、
ｄ．試料の液－固相転移の開始を概算する工程と、
ｅ．相転移が始まるまでの所定の試料表面温度における試料のコアの平均温度低下率、および所定の徐冷速度を得るために必要な対応する熱交換流体の流量を決定する工程と、
ｆ．相転移の開始から所定の試料表面温度における試料のコアの平均温度低下率、および所定の急速冷却速度を得るために必要な対応する熱交換流体の流量を決定すると、
ｇ．相転移の開始付近まで、前記徐冷速度で、上記態様の装置のコンパートメント内の試料を冷却する工程と、
コンパートメント内の試料を、相転移の開始付近から急速冷却速度で冷却する工程とを含む。
【0024】
本発明の第３の態様によれば、生物学的材料が貯蔵されるコンパートメント、および熱交換流体をコンパートメントに流入および／またはコンパートメントから流出させるポンプ機械を有する装置内で生物学的材料を保存する方法が提供され、当該方法は、生物学的材料の熱特性、ならびにポンプ機械のポンプ能力、熱交換流体、および生物学的材料の温度のうちの少なくとも１つに基づいて、コンパートメントへの熱交換流体の流入および／またはコンパートメントからの熱交換流体の流出を調節する工程を含む。
【0025】
本発明の第４の態様によれば、保存前に生物学的材料に添加されるべき凍結保護剤の量を決定する方法が提供され、当該方法は、
ａ．初期量の凍結保護剤を含む、保存されるべき生物学的材料の近似形状の総表面積を決定する工程であって、生物学的産物、凍結保護剤および任意の包装が試料を画定する、工程と、
ｂ．試料の熱特性を推定する工程と、
ｃ．試料の近似された形状、試料の熱特性、装置の形状、装置内の試料の所定の配置、熱交換流体の所定の入口温度、および入口から出口への熱交換流体の所定の温度上昇のいずれか１つ以上を含む流れ制約に基づいて、上記の態様の装置のコンパートメント内の試料に対して計算流体力学解析を実行する工程と、
ｄ．試料の液－固相転移の開始を概算する工程と、
ｅ．相転移の開始付近までの所定の試料表面温度における試料のコアの平均温度低下率と、所定の徐冷速度を得るために必要な対応する熱交換流体の流量を決定する工程と、
ｆ．相転移の開始付近から所定の試料表面温度における試料のコアの平均温度低下率、および所定の急冷速度を得るために必要な対応する熱交換流体の流量を決定する工程と、
ｇ．工程（ｆ）で計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティを超える装置のポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応する場合、初期量よりも所定量多い凍結保護剤の量を選択して、新たな初期量を定義するか、または、工程（ｆ）で計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティ以下であるポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応する場合、凍結保護剤の初期量を、保存前に生物学的材料に添加すべき凍結保護剤の量として選択する工程と、
ｈ．工程（ｆ）で計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティを超えるポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応する場合、工程（ｆ）で計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティ以下であるポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応するまで、工程（ａ）～（ｇ）を繰り返す工程とを含む。
ａ．初期量の凍結保護剤を含む、保存されるべき生物学的材料の近似形状の総表面積を決定する工程であって、生物学的産物、凍結保護剤および任意の包装が試料を画定する、工程と、
ｂ．試料の熱特性を推定する工程と、
ｃ．試料の近似された形状、試料の熱特性、装置の形状、装置内の試料の所定の配置、熱交換流体の所定の入口温度、および入口から出口への熱交換流体の所定の温度上昇のいずれか１つ以上を含む流れ制約に基づいて、上記の態様の装置のコンパートメント内の試料に対して計算流体力学解析を実行する工程と、
ｄ．試料の液－固相転移の開始を概算する工程と、
ｅ．相転移の開始付近までの所定の試料表面温度における試料のコアの平均温度低下率と、所定の徐冷速度を得るために必要な対応する熱交換流体の流量を決定する工程と、
ｆ．相転移の開始付近から所定の試料表面温度における試料のコアの平均温度低下率、および所定の急冷速度を得るために必要な対応する熱交換流体の流量を決定する工程と、
ｇ．工程（ｆ）で計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティを超える装置のポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応する場合、初期量よりも所定量多い凍結保護剤の量を選択して、新たな初期量を定義するか、または、工程（ｆ）で計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティ以下であるポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応する場合、凍結保護剤の初期量を、保存前に生物学的材料に添加すべき凍結保護剤の量として選択する工程と、
ｈ．工程（ｆ）で計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティを超えるポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応する場合、工程（ｆ）で計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティ以下であるポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応するまで、工程（ａ）～（ｇ）を繰り返す工程とを含む。
【0026】
本発明の第５の態様によれば、凍結保存された生物学的材料を解凍するための装置が提供され、当該装置は、生物学的材料を受容するための解凍タンクを有し、生物学的材料は、トレイ、ラックおよびバスケットのうちの１つ以上を含む構造においてタンク内に保持され、解凍流体がタンク内に導入されるタンク入口を有し、該タンクは、該装置を通じる連続的な解凍流体流を収容するように構成され、動作中、該タンク内の生物学的材料は、該解凍流体中に浸漬され、生物学的材料の解凍のために該解凍流体と熱交換する。
【0027】
本発明の第６の態様によれば、凍結保存された生物学的材料を解凍する方法が提供され、当該方法は、
ａ．生物学的材料の近似形状の総表面積を決定する工程であって、生物学的材料および任意の包装が試料を規定する、工程と、
ｂ．試料の熱特性を推定する工程と、
ｃ．試料の近似形状、試料の熱特性、装置の形状；装置内の試料の所定の配置、解凍流体の所定の入口温度、および入口から出口への解凍流体の所定の温度低下のいずれか１つ以上を含む流れ制約に基づいて、上記の態様の解凍装置の前記タンク内の試料に対して計算流体力学解析を実行する工程と、
ｄ．試料の固－液相転移の開始を概算する工程；
工程（ｄ）で決定された固－液相転移の開始までの期間、凍結保存生物学的産物を解凍する工程とを含む。
ａ．生物学的材料の近似形状の総表面積を決定する工程であって、生物学的材料および任意の包装が試料を規定する、工程と、
ｂ．試料の熱特性を推定する工程と、
ｃ．試料の近似形状、試料の熱特性、装置の形状；装置内の試料の所定の配置、解凍流体の所定の入口温度、および入口から出口への解凍流体の所定の温度低下のいずれか１つ以上を含む流れ制約に基づいて、上記の態様の解凍装置の前記タンク内の試料に対して計算流体力学解析を実行する工程と、
ｄ．試料の固－液相転移の開始を概算する工程；
工程（ｄ）で決定された固－液相転移の開始までの期間、凍結保存生物学的産物を解凍する工程とを含む。
【0028】
以下、本発明の実施形態を、非限定的な例として、添付図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【発明を実施するための形態】
【0030】
図１～図３は、一実施形態による生物学的材料を保存するための装置１０を示し、外側断熱タンク／浸漬タンク２内に配置されるように構成されたインサート４を備え、インサート４は、生物学的材料を受容するためのコンパートメント６を画定し、外側断熱タンク２からコンパートメントへの熱交換流体の（流入口８を通る）流入は、インサートの１つの面１４であるか、またはそれに隣接して行われ、コンパートメントから外側断熱タンクへの熱交換流体の（流出口１２を通る）流出は、インサートの該面１４であるか、またはそれに隣接して行われる。
【0031】
コンパートメント６は、一連の開口部１８を有する壁１６からなり、作動中、コンパートメント内の生物学的材料が、生物学的材料の凍結のために熱交換流体と熱交換するために熱交換流体中に浸漬されるように、装置を通る連続的な熱交換流体の流れを収容する。各開口部の直径または幅は約５ｍｍ～２０ｍｍ、好ましくは約１０ｍｍである。
【0032】
インサート４は、１つ以上の特定の経路に沿ってコンパートメントを通る熱交換流体の流れを導くように構成されたバッフル２０を含んでいる。図示された実施形態（特に図３Ａを参照）では、熱交換流体の流れは、インサートの前側に隣接する流入口８から、コンパートメント６を通って中間流出口２２から流出し、その後、インサートの前側に戻って流出口１２から流出する。バッフル２０によって導かれる特定の流路は、コンパートメントを通る熱交換流体の循環を改善し、ホットスポットを減少させる。さらに、熱交換流体の流入と流出がインサート４の共通の面またはそれに隣接する特定の構成により、流体がコンパートメント６全体を循環し、流体がインサート４の反対側の面から跳ね返ることで循環が改善される（インサートの反対側の面から跳ね返る流体のシミュレーションについては、例えば図４と図５の流れモデルを参照）。
【0033】
コンパートメント６は、生物学的材料を保持するための構造を受容するように構成され、その構造は、トレイ、ラック、およびバスケットのうちの１つ以上である。複数のバイアルを保持するように構成されたラック４２の例が図２９に示されている。コンパートメントは、複数のサブコンパートメント４６Ａ～４６Ｄを画定する複数の内部仕切り４４からなり、各サブコンパートメントは、構造物の１つを受容するように構成される。
【0034】
インサート４がタンク２内に配置される場合、インサートの面１４に隣接するタンクの一方の面３０は、少なくとも１つの入口と少なくとも１つの出口を構成する。図３Ａ、図８および図１２を参照すると、本発明の好ましい実施形態によるタンクは、２つの入口と１つの出口を有する。入口は、使用時に外側断熱タンク２の外側からコンパートメント６に連通し、出口は、使用時にコンパートメントから外側断熱タンクの外側に連通し（ドレン管４０を介して）、作動時に、熱交換流体が少なくとも１つの入口を介してタンク２内（ひいてはコンパートメント６内）に導入され、少なくとも１つの出口を介してコンパートメント６およびタンク２から除去されるようになっている。
【0035】
タンク２の側壁３０は、インサート４の面１４から間隔をあけて配置され、その結果、空隙（図示せず）が画定される。タンク２は、ＡＳＴＭ Ａ２４０に準拠した鋼鉄製であることが好ましい。
【0036】
使用時、タンク２は－８０℃以上では凍結しない熱交換流体で満たされる。熱交換流体はタンク２の熱交換流体入口から空隙に予め決められた体積流量で送り込まれる。熱交換流体が開口部１８の制限された領域を強制的に通過するため、空隙内に圧力が発生し、体積流量は減少するが、コンパートメント６に流入する流体の速度は増加する。開口部１８とバッフル２０は、コンパートメント６のすべての部分への冷たい流体の分配を改善し、そうでなければ入口領域から離れて発生しそうなホットスポットの発生を最小限に抑える。熱交換流体がタンク２およびコンパートメント６内を連続的に流れるにつれて、コンパートメント６内に位置する生物学的材料から熱が除去され、コンパートメント６およびタンク２を出る加熱された熱交換流体は、熱交換流体を連続的に冷却する装置の冷凍システムと熱交換される。熱交換流体自体は、冷凍システム内で冷媒と熱交換する。図３２は、熱交換流体を連続的に冷却する一実施形態による装置１０の冷凍システムの配管および計装図である。冷凍システムは、熱交換流体と冷媒との間で熱交換するための熱交換器を含む。
【0037】
装置１０は、浸漬タンク２内での生物試料の凍結後、生物試料を保持する１つ以上の容器を受け入れるように構成された乾燥タンク５０、具体的にはブローダウン乾燥タンクをさらに含むことができる。乾燥タンク５０は、容器に残留する熱交換液を乾燥させ、試料の汚染を防止するように構成される。
【0038】
好ましい実施形態では、装置１０は、浸漬タンク２と乾燥タンク５０の両方に熱交換流体を投入する。すなわち、乾燥タンクを冷却するために、熱交換流体を乾燥タンク５０に選択的に導くことができる。装置１０は、熱交換流体を外側断熱タンク２と乾燥タンク５０の一方または両方に選択的に導くための電磁制御弁のような制御装置を含んでいてもよい。例えば、装置は、装置内の同じ熱交換流体源に接続された３つの電磁制御弁から構成されることができる。バルブのうち２つは熱交換流体をタンク２に導き、３つ目は熱交換流体を乾燥タンク５０に導く。バルブは、各構成要素に要求される流量に応じて制御することができ、例えば、浸漬タンク２に投入される流量がより多く要求される場合（以下により詳細に説明される一実施形態による冷却方法の急速冷却工程中など）、バルブは、全ての流体がタンク２に導かれるように、乾燥タンク５０への流量を最小化または遮断するように制御することができる。他の時には、流体を浸漬タンク２と乾燥タンク５０の両方に投入して、乾燥タンクが浸漬タンクとほぼ同じ温度に維持され、乾燥および／または貯蔵のために生物学的材料を乾燥タンクに移す準備ができるようにすることもできる。したがって、いくつかの実施形態では、乾燥タンク５０は、生物学的材料の容器を貯蔵するための貯蔵容器としても使用されるように構成される。本発明の好ましい実施形態によれば、乾燥タンクは、内容物を冷却するために電磁制御弁が開いているときに伝熱流体で満たされる、乾燥タンクを画定する壁配置の空隙またはキャビティを有する。壁配置の空隙またはキャビティは、約１ｍｍから５ｍｍ、好ましくは約２ｍｍの厚さまたは幅を有することができる。
【0039】
二相冷却保存法
本発明の発明者らは、凍結の特定の段階において冷却速度を上げることにより、凍結保護剤の使用量を減らし、場合によっては凍結保護剤を使用しなくても生物学的産物を保存できることを見出した。具体的には、液－固相転移が始まるまでは徐冷し、液－固相転移が始まる頃から急冷するという二相冷却を行う。図３０は、一般的な凍結曲線であり、液－固相転移が、材料の過冷却に続く氷点下からの温度上昇をどのように伴うかを示している。核生成は相転移の開始時に始まり、固体凍結相へと続く。本発明者らは、核生成の持続時間を短縮することにより、試料中の氷結晶形成を低減し、液体窒素凍結に類似した急速凍結効果が得られるが、従来の液体窒素法と比較して浸透圧ダメージが低減されることを見出した。具体的には、本方法では、液－固相転移の開始時点から冷却速度を上げて（すなわち、試料の急速凍結を開始して）、生物学的材料の核形成期間を短縮する。場合によっては、凍結ダメージの減少が非常に大きく、凍結保護剤が不要になることもある。図３１は、０％凍結保護剤中の赤血球試料を本発明の二相冷却法で凍結したときの凍結曲線を示している。相転移の開始時に急速冷却が開始されるため、相転移中の温度上昇は見られない。
本発明の発明者らは、凍結の特定の段階において冷却速度を上げることにより、凍結保護剤の使用量を減らし、場合によっては凍結保護剤を使用しなくても生物学的産物を保存できることを見出した。具体的には、液－固相転移が始まるまでは徐冷し、液－固相転移が始まる頃から急冷するという二相冷却を行う。図３０は、一般的な凍結曲線であり、液－固相転移が、材料の過冷却に続く氷点下からの温度上昇をどのように伴うかを示している。核生成は相転移の開始時に始まり、固体凍結相へと続く。本発明者らは、核生成の持続時間を短縮することにより、試料中の氷結晶形成を低減し、液体窒素凍結に類似した急速凍結効果が得られるが、従来の液体窒素法と比較して浸透圧ダメージが低減されることを見出した。具体的には、本方法では、液－固相転移の開始時点から冷却速度を上げて（すなわち、試料の急速凍結を開始して）、生物学的材料の核形成期間を短縮する。場合によっては、凍結ダメージの減少が非常に大きく、凍結保護剤が不要になることもある。図３１は、０％凍結保護剤中の赤血球試料を本発明の二相冷却法で凍結したときの凍結曲線を示している。相転移の開始時に急速冷却が開始されるため、相転移中の温度上昇は見られない。
【0040】
一実施形態において、生物学的材料を保存する方法は、まず、生物学的材料の近似形状の総表面積を決定する工程であって、生物学的材料および任意の包装が試料を画定する、工程と、試料の熱特性を推定する工程と、保存システムの入力パラメータを変化させた場合の影響を調査するために、装置２内（より具体的には、コンパートメント６内）で凍結されている試料のシミュレーションを介して試料に対して計算流体力学解析を実行する工程とを有する。調査され得るシミュレーションの入力／制約には、包装の特性および利用されるラッキングシステムの特性、試料の近似形状、試料の熱特性、装置の形状、装置内の試料の所定の配置、熱交換流体の所定の入口温度、および入口から出口への熱交換流体の所定の温度上昇が含まれる。
【0041】
図４は、コンパートメント６に配置された１３個のクライオバイアルのアレイの凍結をシミュレートするための例示的なパラメータを示し、各クライオバイアルは０．５ｍｌの血液を含む。各クライオバイアルはポリプロピレン製で、直径６ｍｍ、高さ２７．５ｍｍ、壁厚０．５ｍｍとしてモデル化されている。熱交換流体の流入量は３９リットル／分として選択される。コンパートメント６の高さは３５．５ｍｍとしてモデル化した。凍結中の血液の動きは無視され、すなわち血液は「固体」であると仮定される。血液の熱特性は、８５％の水と１５％のタンパク質から構成されているという仮定に基づいている。生物学的材料の熱的性質は、当業者に周知の方法で求めることができ、また当業者に周知の熱的性質表で調べることもできる。
【0042】
図５は、コンパートメント６に配置された１３個のクライオバイアルの配列の凍結をシミュレートするためのパラメータの例を示しており、各クライオバイアルは２ｍｌの血液を含む。各クライオバイアルはポリプロピレン製で、直径１３．５ｍｍ、高さ４８．８ｍｍ、壁厚０．５ｍｍとしてモデル化されている。熱交換流体の流入量は３９リットル／分として選択されている。コンパートメント６は高さ５７ｍｍとしてモデル化されている。
【0043】
一実施形態による計算流体力学解析では、生物学的材料を幾何学的な増分（例えば、ボトルや試験管の円筒形のシェル）に分割する。すなわち、所与の時間工程において、ある量のエネルギーがシェルから除去され、その結果、そのシェルの温度が低下する。除去されるエネルギー量は、隣接するシェルの温度とシェル間の熱流に対する抵抗の関数である。これには、温度の関数として生物学的材料の熱特性を考慮する必要がある。
【0044】
解析は、試料が２℃の開始温度を有する固体塊として扱われ、当業者に周知の方法を用いて同定、推定または計算できる熱特性を有すると仮定して実行される。
【0045】
産物の総表面積、タンク内の産物の負荷量、熱交換流体の予め選択された入口温度、熱交換流体の予め選択された許容可能な出口温度（例えば、入口温度より３℃大きい）、産物（凍結保護剤を含む）及び包装の熱特性、並びにタンクを通る流体の予め選択された速度等に基づいて、産物の温度低下速度を、上記で詳述したようにシミュレートすることができる。
【0046】
図６は、図５のモデルの流体力学的解析から得られた、クライオバイアルを通してコンパートメント中間面を通る熱交換流体の流れの平面図である。このモデリングは、コンパートメント内のクライオバイアルに関して均一な熱除去率を示している。図７Ａおよび図７Ｂは、それぞれタンクの正面図および背面図から見た熱交換流体の流れを示している。
【0047】
図８および図９の温度－時間プロットはそれぞれ、約６５秒以内に約－８０℃、約８０秒以内に約－５１℃に凍結された、図４のモデルの中央の０．５ｍｌクライオバイアルの解析に対応する。これらの２つの図から、本発明の好ましい実施形態によれば、約－５１℃に凍結したクライオバイアルは、約－８０℃に凍結したクライオバイアルと比較して、より良好な保存結果を達成している。グラフは、クライオバイアルの外側（「ＰＧ温度２．９９ｍｍ ＰＰｏｕｔｓｉｄｅ」）から中心部（「ＰＧ温度０ｍｍ」）に至るまで、クライオバイアルを貫通する様々なシェルにおける温度をプロットしたものである。図１０は、図８のシミュレーションと同じ速度で凍結させた中央クライオバイアルの温度－時間プロットであるが、バッフル２０をインサート４から取り外したものであり、コンパートメント６を通る伝熱流体の循環を改善するバッフルの有効性を示している。
【0048】
【0049】
図１３Ａは、コンパートメント６内に吊り下げられた血液バッグの凍結をシミュレートするためのパラメータの例を示している。バッグの寸法は、幅１４．５ｃｍ、高さ７．６ｃｍ、厚さ４ｍｍであり、バッグには１０～３０ｍｌの血液が入っている。バッグの壁は、厚さ０．１３ｍｍのエチレンビニルアセテート製としてモデル化されている。熱交換流体の流入量は約３９リットル／分とし、バッグの狭い側面に実質的に垂直な方向とする。コンパートメント６の高さは８０ｍｍとしてモデル化されている。図１３Ｂは、図１３Ａのモデルと同様のパラメータを有するが、熱交換流体がバッグの広い前面に対して実質的に垂直な方向にコンパートメントに流入するモデルを示している。
【0050】
図１４は、約１８０秒以内に約－８０℃に凍結された図１３Ａのモデルの血液バッグの温度－時間プロットである。図１５は、約２７０秒以内に約－８０℃に凍結された図１３Ｂのモデルの血液バッグの温度－時間プロットである。図１６は、約１８０秒以内に約－５１℃に凍結された図１３Ａのモデルの血液バッグの温度－時間プロットである。
【0051】
試料の液－固相転移の開始が近似される。一実施形態では、液－固相転移の開始は、一貫した冷却速度で凍結中の材料の試料の１つ以上の試験結果から得られた冷却曲線から概算される。液－固相転移の開始は、追加的または代替的に、上述の計算流体力学解析によって得られた試料の冷却曲線から決定／確認することができる。
【0052】
所定の徐冷速度の場合、相転移の開始付近までの所定の試料表面温度における試料の中心部の平均温度低下速度が（計算流体力学モデルから）決定される。次に、徐冷速度を達成するために必要な浸漬タンク２への熱交換流体流量を決定することができる。
【0053】
所定の急速冷却速度を達成するために必要な熱交換流体の流量は、同様に、相転移の開始付近から所定の試料表面温度における試料のコアの平均温度低下速度の解析によって決定される。
【0054】
解析が完了すると、試料は、次に、上述のように、装置のコンパートメント６内で、まず、相転移の開始まで徐冷速度で冷却され、次に、相転移の開始頃から急速冷却速度で冷却されうる。試料は、所定の終了温度に達するまで、少なくとも毎分約１００℃で冷却される。
【0055】
急速冷却に必要な熱交換流体流量を達成するために、熱交換流体をタンク２に投入する装置１０のポンプ機械のポンプデューティを増加させる。追加的または代替的に、ポンプ機械が上述のように選択的に制御可能な弁を使用してタンク２だけでなく乾燥タンク５０にも供給する場合には、乾燥タンク５０への供給を一時的に停止して、浸漬タンク２への流量を増加させることができる。
【0056】
いくつかの実施形態において、上述の方法は、凍結保護剤を使用せずに生物学的材料を効果的に保存するために使用され得ることが想定される。
【0057】
表１は、上述の方法を用いて得られた、０％凍結保護剤中の赤血球についての試験結果を含む。回収率は約９８％であった。試験方法の具体的なパラメータは以下の通りである。徐冷速度は、５～１０℃で５リットル／分の熱交換液流量で達成した。急速冷却速度は２００℃以上で５０リットル／分の熱交換流体流量で達成した。表２に冷却速度の経時変化を示す。液－固相転移の開始は－０．５℃で決定した。試料は－５１℃まで凍結され、処理の総時間は平均３分であった。試料を入れたバイアルはポリプロピレン製で、２ｍｌの自立バイアルである。他の熱可塑性材料、他のプラスチック材料、または他の材料から作られたバイアルも、本発明の実施形態で使用することができる。細胞計数の前に、以下に述べる解凍方法を用いて、３７．５℃で５５秒間、解凍培地を用いて試料を解凍した。
【0058】
０％、４％、８％の凍結保護剤中の赤血球
【表1】
【0059】
２段階の冷却速度 ０．５ｍｌクライオバイアル
【表2】
【0060】
保存処理に必要な凍結保護剤の量を決定する方法
場合によっては、保存工程中の細胞損傷を最小化するために凍結保護剤が必要とされることがある。従って、別の態様において、保存前に生物学的材料に添加すべき凍結保護剤の量を決定する方法が提供される。当該方法は、まず、凍結保護剤の初期量を含む、保存すべき生物学的材料の近似形状の総表面積を決定する工程であって、生物学的材料、凍結保護剤および任意の包装が試料を画定する、工程と、試料の熱特性を推定する工程と、保存システムの入力パラメータを変化させた場合の影響を調べるために、装置２内（より具体的には、コンパートメント６内）で試料に対して計算流体力学解析を実行する工程とを含む。調査されるシミュレーションの入力／制約には、包装の特性および利用されるラッキングシステムの特性、試料の近似形状、試料の熱特性、装置の形状、装置内の試料の所定の配置、熱交換流体の所定の入口温度、および入口から出口への熱交換流体の所定の温度上昇が含まれる。
場合によっては、保存工程中の細胞損傷を最小化するために凍結保護剤が必要とされることがある。従って、別の態様において、保存前に生物学的材料に添加すべき凍結保護剤の量を決定する方法が提供される。当該方法は、まず、凍結保護剤の初期量を含む、保存すべき生物学的材料の近似形状の総表面積を決定する工程であって、生物学的材料、凍結保護剤および任意の包装が試料を画定する、工程と、試料の熱特性を推定する工程と、保存システムの入力パラメータを変化させた場合の影響を調べるために、装置２内（より具体的には、コンパートメント６内）で試料に対して計算流体力学解析を実行する工程とを含む。調査されるシミュレーションの入力／制約には、包装の特性および利用されるラッキングシステムの特性、試料の近似形状、試料の熱特性、装置の形状、装置内の試料の所定の配置、熱交換流体の所定の入口温度、および入口から出口への熱交換流体の所定の温度上昇が含まれる。
【0061】
試料の液－固相転移の開始が近似される。一実施形態では、液－固相転移の開始は、一定の冷却速度で凍結している材料の試料の１つ以上の試験結果から得られる冷却曲線から概算される。液－固相転移の開始は、追加的または代替的に、上述の計算流体力学解析によって得られた試料の冷却曲線から決定／確認することができる。
【0062】
所定の徐冷速度の場合、相転移の開始付近までの所定の試料表面温度における試料の中心部の平均温度低下速度が（上述の計算流体力学モデルから）決定される。その後、徐冷速度を達成するために必要な浸漬タンク２への熱交換流体流量を決定することができる。
【0063】
所定の急速冷却速度を達成するために必要な熱交換流体流量も同様に、相転移の開始付近から所定の試料表面温度における試料のコアの平均温度低下速度の解析によって決定される。この工程で算出された熱交換流体流量が、装置のポンプデューティまたはエバポレータデューティがそれぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティ以上である場合に、初期量よりも所定量多い量の凍結保護剤が選択され、新たな初期量が定義される。一方、この工程で計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティ以下のポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応する場合（すなわち、熱交換流体流量が実用的な観点から許容される場合、例えば、ポンプデューティが選択された温度における熱交換流体の粘度に基づいて許容可能である場合、またはエバポレータデューティが必要な熱除去に基づいて許容可能である場合）、その初期量の凍結保護剤が、保存前に生物学的材料に添加されるべき凍結保護剤の量として選択される。
【0064】
計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティを上回るポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応する場合、計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティ以下のポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応するまで、方法工程が繰り返される。
【0065】
一実施形態では、凍結保護剤の初期量はゼロである。計算工程が繰り返される場合、初期量より多い凍結保護剤の所定量は、各繰り返しにおいて１％多いなど、規則的な増分で増加させることができる。
【0066】
一旦、適切な量の凍結保護剤が上述の方法を用いて決定されると、次に、生物学的材料の試料は、上述の装置１０を用いて保存するために、計算された量の凍結保護剤を用いて調製され得る。
【0067】
所定の徐冷速度および／または急速冷却速度は、従来のプロトコルに基づいて、または生物学的材料の特定の試料に対して実施された試験もしくは解析に基づいて同定することができる。一実施形態では、徐冷速度は毎分約１０℃までである。徐冷速度は、毎分約０．１℃～約１０℃の間であってもよい。
【0068】
一実施形態において、急速冷却速度は、毎分約１００℃より大きい。急冷速度は毎分約２００℃より大きくてもよい。
【0069】
解凍装置および方法
図１７を参照すると、凍結保存された生物学的材料を解凍するための解凍装置１００も提供され、当該装置は、生物学的材料を受容するための解凍タンク１０２を含む。生物学的材料は、トレイ、ラックおよびバスケットのうちの１つ以上を含む構造でタンク内に保持され得る。この構造は、生物学的材料を凍結装置から解凍装置に簡便に移すことができるように、生物学的材料を浸漬タンク２内に保持するために使用される構造と同一であってもよい。解凍装置１００は、解凍流体がタンク１０２に導入されるタンク入口と、解凍流体がタンクから除去されるタンク出口とを有し、タンクは、作動中、タンク内の生物学的材料が解凍流体中に浸漬され、生物学的材料の解凍のために解凍流体と熱交換するように、装置を通る連続的な解凍流体の流れを収容するように構成される。解凍タンクは、１つ以上の特定の経路に沿ってタンクを通る解凍流体の流れを誘導するように構成されたバッフル（図示せず）を含んでいてもよい。
図１７を参照すると、凍結保存された生物学的材料を解凍するための解凍装置１００も提供され、当該装置は、生物学的材料を受容するための解凍タンク１０２を含む。生物学的材料は、トレイ、ラックおよびバスケットのうちの１つ以上を含む構造でタンク内に保持され得る。この構造は、生物学的材料を凍結装置から解凍装置に簡便に移すことができるように、生物学的材料を浸漬タンク２内に保持するために使用される構造と同一であってもよい。解凍装置１００は、解凍流体がタンク１０２に導入されるタンク入口と、解凍流体がタンクから除去されるタンク出口とを有し、タンクは、作動中、タンク内の生物学的材料が解凍流体中に浸漬され、生物学的材料の解凍のために解凍流体と熱交換するように、装置を通る連続的な解凍流体の流れを収容するように構成される。解凍タンクは、１つ以上の特定の経路に沿ってタンクを通る解凍流体の流れを誘導するように構成されたバッフル（図示せず）を含んでいてもよい。
【0070】
一実施形態では、凍結保存された生物学的材料を解凍する方法は、まず、生物学的材料の近似形状の総表面積を決定する工程であって、生物学的材料および任意の包装が試料を画定する、工程と、試料の熱特性を推定する工程と、解凍タンク１０２内で解凍されている試料のシミュレーションを介して試料に対して計算流体力学解析を実行し、解凍システムの様々な入力パラメータの影響を調査する工程とを含む。調査されるシミュレーションの入力／制約には、包装の特性および利用されるラッキングシステムの特性、試料の近似形状、試料の熱特性、装置の形状、装置内の試料の所定の配置、解凍流体の所定の入口温度、および入口から出口までの解凍流体の所定の温度低下が含まれる。
【0071】
図１８は、解凍タンク内に配置された１３個のクライオバイアルのアレイの解凍をシミュレートするためのパラメータの例を示しており、各クライオバイアルは０．５ｍｌの血液を含んでいる。各クライオバイアルはポリプロピレン製で、直径６ｍｍ、高さ２７．５ｍｍ、壁厚０．５ｍｍとしてモデル化されている。解凍液の流入量は３９リットル・秒／分とした。解凍タンクの筐体は高さ３５．５ｍｍとしてモデル化した。
【0072】
図１９は、コンパートメント６に配置された１３個のクライオバイアルの配列の解凍をシミュレートするためのパラメータの例を示しており、各クライオバイアルは２ｍｌの血液を含んでいる。各クライオバイアルはポリプロピレン製で、直径１３．５ｍｍ、高さ４８．８ｍｍ、壁厚０．５ｍｍとしてモデル化されている。解凍液の流入量は３９リットル・秒／分とした。解凍タンクの筐体は高さ５７ｍｍでモデル化されている。
【0073】
【0074】
図２２、２３および２４の温度－時間プロットは、約－５１℃から解凍した図１９のモデルの中央０．５ｍｌについての解析に対応し、クライオバイアルはそれぞれ、凍結保護剤を含まない赤血球、凍結保護剤として４％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む赤血球、および凍結保護剤として１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む赤血球を含む。図２７および図２８は、ＤＭＳＯ濃度を変化させた混合血液の見かけ比熱および熱伝導率の参照プロットである。この参照プロットは、凍結保護剤濃度の影響を調べるための入力パラメータとして使用することができる。
【0075】
図２５は、解凍タンク１０２の筐体内に吊り下げられた血液バッグの凍結をシミュレートするためのパラメータ例を示している。バッグの寸法は幅１４．５ｃｍ、高さ７．６ｃｍ、厚さ４ｍｍであり、バッグには１０～３０ｍｌの血液が入っている。バッグの壁はエチレンビニルアセテート製で、厚さは０．１３ｍｍとモデル化されている。解凍液の流入量は約３９リットル／分とし、バッグの狭い側面に実質的に垂直な方向とする。解凍タンクの筐体の高さは約３２０ｍｍとしてモデル化されている。
【0076】
試料の固－液相転移の開始が近似される。一実施形態では、固－液相転移の開始は、一定の冷却速度で凍結中の材料の試料の１つ以上の試験結果から得られた冷却曲線から概算される。固－液相転移の開始は、追加的または代替的に、上述の計算流体力学解析によって得られた試料の解凍曲線から決定／確認することができる。
【0077】
その後、固－液相転移が始まるまでの期間、試料を解凍する。凍結した試料を転移の開始まで解凍すると、細胞生存率が上昇することが分かっている。解凍後、試料は約２℃に保たれる。
【0078】
いくつかの実施形態では、解凍液は３７℃の温度で投入される水である。
【0079】
以上、本発明の様々な実施形態について説明したが、これらは例示として提示したものであって、限定するものではないことを理解されたい。本発明の思想および態様から逸脱することなく、形態および詳細における様々な変更を行うことができることは、関連技術の当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、上述した例示的な実施形態のいずれかによって限定されるべきではない。
【0080】
本明細書における先行刊行物（またはそれに由来する情報）または周知の事項への言及は、その先行刊行物（またはそれに由来する情報）または周知の事項が、本明細書が関係する研究分野における一般的な知識の一部を形成していることを認めるものでも、示唆するものでもない。
【0081】
本明細書および特許請求の範囲全体を通して、文脈上別段必要とされない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」という語、および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形は、記載された整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を含むことを意味するが、他の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を排除することを意味しないと理解されべきである。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【手続補正書】
【提出日】2024-01-11
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生物学的材料を保存するための装置であって、外側断熱タンク内に配置されるように構成されたインサートを備え、前記インサートは、生物学的材料を受容するためのコンパートメントを画定し、前記外側断熱タンクから前記コンパートメントへの熱交換流体の流入は、前記インサートの一方の面において、またはそれに隣接して行われ、前記熱交換流体の前記コンパートメントから前記外側断熱タンクへの流出は、前記インサートの前記面において、またはそれに隣接して行われ、前記コンパートメントは、前記装置を通じる連続的な熱交換流体の流れを収容するための一連の開口部を有する壁を含み、作動中、前記コンパートメント内の生物学的材料は、熱交換流体中に浸漬され、前記生物学的材料の凍結のために前記熱交換流体と熱交換する、装置。
【請求項2】
前記インサートが、１つ以上の特定の経路に沿って前記コンパートメントを通る前記熱交換流体の流れを誘導するように構成されたバッフルを有する、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項3】
生物学的材料を保持するために前記コンパートメント内に受容可能な構造体を含み、前記構造体がトレイ、ラックおよびバスケットのうちの１つ以上である、ことを特徴とする請求項１または２に記載の装置。
【請求項4】
前記コンパートメントが、複数のサブコンパートメントを画定する複数の内部仕切りを有し、各サブコンパートメントが、前記構造体の１つを受容するように構成されている、ことを特徴とする請求項３に記載の装置。
【請求項5】
前記外側断熱タンクは、前記インサートが前記外側断熱タンク内に配置されたときに、前記インサートの前記面に隣接する１つの側面を有し、前記側面は、少なくとも１つの入口および少なくとも１つの出口を含み、前記入口は、使用時に、前記外側断熱タンクの外側から前記コンパートメント内に連通し、前記出口は、使用時に、前記コンパートメントから前記外側断熱タンクの外側に連通し、作動中、前記熱交換流体は、前記少なくとも１つの入口を介して前記タンクに導入され、前記少なくとも１つの出口を介して前記タンクから除去される、ことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項6】
前記コンパートメント内の前記生物学的材料の凍結後に、前記生物学的材料を保持する１つ以上の容器を受容するように構成された乾燥タンクをさらに備え、前記乾燥タンクは、前記容器上に存在する残留流体を乾燥するように構成される、請求項１から５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項7】
ａ．熱交換流体が、前記乾燥タンクを冷却するために前記乾燥タンク内に導かれること、ｂ．前記装置が、熱交換流体を前記外側断熱タンクおよび前記乾燥タンクの一方または両方に選択的に導くための電磁制御弁を備えること、
ｃ．前記乾燥タンクは、前記生物学的材料を保持する前記１つ以上の容器を所定の温度で貯蔵するように構成されていること
の少なくともひとつであることを特徴とする請求項６に記載の装置。
【請求項8】
生物学的材料を保存する方法であって、ａ．前記生物学的材料の試料の近似形状の総表面積を決定する工程であって、前記生物学的材料および任意の包装は、試料を画定する、工程と、
ｂ．前記試料の熱特性を推定する工程と、
ｃ．試料の近似形状、前記試料の熱的性質、前記装置の形状、前記装置内の試料の所定の配置、熱交換流体の所定の入口温度、および入口から出口への前記熱交換流体の所定の温度上昇のいずれか１つ以上を含む流れ制約に基づいて、請求項１から７のいずれか一項に記載の装置の前記コンパートメント内の前記試料に対して計算流体力学解析を実行する工程と、
ｄ．前記試料の液－固相転移の開始を概算する工程と、
ｅ．相転移の前記開始付近までの所定の試料表面温度における前記試料の前記コアの平均温度低下率、および所定の徐冷速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
ｆ．相転移の前記開始付近から所定の試料表面温度における前記試料の前記コアの平均温度低下率、および所定の急速冷却速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
ｇ．請求項１から７のいずれか一項に記載の装置の前記コンパートメント内の試料を、相転移の前記開始付近まで前記徐冷速度で冷却する工程と、
ｈ．前記コンパートメント内の前記試料を、相転移の前記開始付近から前記急速冷却速度で冷却する工程と
を備える方法。
【請求項9】
前記試料が凍結保護剤を含まない、ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項10】
生物学的材料が貯蔵されるコンパートメント、および熱交換流体を前記コンパートメントに流入および／またはそこから流出させるポンプ機械を有する装置内で前記生物学的材料を保存する方法であって、前記生物学的材料の熱特性、ならびに前記ポンプ機械のポンプ能力、熱交換流体、および前記生物学的材料の温度の少なくとも１つに基づいて、前記コンパートメントへの熱交換流体の流入および／または前記コンパートメントからの熱交換流体の流出を調整する工程を備える、方法。
【請求項11】
保存前に生物学的材料に添加されるべき凍結保護剤の量を決定する方法であって、ａ．初期量の凍結保護剤を含む、保存されるべき前記生物学的材料の近似形状の総表面積を決定する工程であって、前記生物学的産物、凍結保護剤および任意の包装が試料を画定する、工程と、
ｂ．前記試料の熱特性を推定する工程と、
ｃ．前記試料の近似形状、前記試料の熱特性、前記装置の形状、前記装置内の試料の所定の配置、熱交換流体の所定の入口温度、および入口から出口への前記熱交換流体の所定の温度上昇のいずれか１つ以上を含む流れ制約に基づいて、請求項１から７のいずれか一項に記載の装置の前記コンパートメント内の前記試料について計算流体力学解析を実行する工程と、
ｄ．前記試料の液－固相転移の開始を近似する工程と、
ｅ．相転移の開始付近までの所定の試料表面温度における前記試料の前記コアの平均温度低下率、および所定の徐冷速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
ｆ．相転移の開始付近から所定の試料表面温度における前記試料の前記コアの平均温度低下率、および所定の急冷速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
ｇ．工程（ｆ）で計算された前記熱交換流体流量が、所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティを超える前記装置のポンプデューティまたはエバポレータデューティにそれぞれ対応する場合、前記初期量よりも所定量多い凍結保護剤の量を選択して、新たな初期量を定義するか、または工程（ｆ）で計算された前記熱交換流体流量が、所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティ以下であるポンプデューティまたはエバポレータデューティにそれぞれ対応する場合、凍結保護剤の前記初期量を、保存前に生物学的材料に添加されるべき凍結保護剤の前記量として選択する工程と、
ｈ．工程（ｆ）で計算された前記熱交換流体流量が、前記所定のポンプデューティまたは前記所定のエバポレータデューティを超えるポンプデューティまたはエバポレータデューティにそれぞれ対応する場合、工程（ｆ）で計算された前記熱交換流体流量が、前記所定のポンプデューティまたは前記所定のエバポレータデューティ以下であるポンプデューティまたはエバポレータデューティにそれぞれ対応するまで、工程（ａ）から（ｇ）を繰り返す工程と
を備える方法。
【請求項12】
工程（ａ）から（ｇ）のいずれかを繰り返す前の凍結保護剤の前記初期量がゼロである、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記徐冷速度が、
ａ．毎分約１０℃までであること、
ｂ．毎分約０．１℃と約１０℃との間であること
のいずれかであることを特徴とする請求項８から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記急冷速度が、
ａ．毎分約１００℃より大きいこと、
ｂ．毎分約２００℃より大きいこと
のいずれかであることを特徴とする請求項８から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ａ．液－固相転移の前記開始が、一定の冷却速度で凍結中の前記試料の冷却曲線から近似されること、ｂ．凍結中の前記試料の前記冷却曲線が、前記試料に対する前記計算流体力学解析から得られること
の少なくともひとつであることを特徴とする請求項８から１４のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】