(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-02
(54)【発明の名称】アミノ酸脱水素酵素突然変異体及びその応用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/53 20060101AFI20240126BHJP
C12N 9/06 20060101ALI20240126BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240126BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240126BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240126BHJP
C12P 13/04 20060101ALI20240126BHJP
【ＦＩ】
C12N15/53
C12N9/06 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/19
C12N1/21
C12P13/04
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023543130
(86)(22)【出願日】2021-03-02
(85)【翻訳文提出日】2023-07-18
(86)【国際出願番号】 CN2021078740
(87)【国際公開番号】W WO2022156042
(87)【国際公開日】2022-07-28
(31)【優先権主張番号】202110078514.9
(32)【優先日】2021-01-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516156282
【氏名又は名称】▲凱▼菜英生命科学技▲術▼（天津）有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100158920
【弁理士】
【氏名又は名称】上野 英樹
(72)【発明者】
【氏名】洪 浩
(72)【発明者】
【氏名】ジェイムズ，ゲイジ
(72)【発明者】
【氏名】肖 毅
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ 娜
(72)【発明者】
【氏名】焦 学成
(72)【発明者】
【氏名】李 瑞
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ 燕青
(72)【発明者】
【氏名】▲楊▼ 益明
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AE03
4B064CA21
4B064CB30
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA28
(57)【要約】
アミノ酸脱水素酵素突然変異体及びその応用を提供し、前記アミノ酸脱水素酵素のアミノ酸配列は、配列番号１に示される如き配列を備え、アミノ酸突然変異が起こった部位は、Ｋ１４４Ｇ部位を含む。前記アミノ酸脱水素酵素突然変異体は、タンパク質の構造と機能を変えることを実現し、酵素活性が向上し、アミノ酸脱水素酵素の使用量を低減させ、且つ酵素特異性もこれに応じて向上しており、アミノ酸の産業的生産のコストを削減している。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１に示される配列にアミノ酸突然変異が起こった配列を備え、前記アミノ酸突然変異が起こった部位は、Ｋ１４４Ｇ部位であることを特徴とするアミノ酸脱水素酵素突然変異体。
【請求項2】
前記アミノ酸突然変異が起こった部位は、Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｌ１３５Ｖ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｔ１１５Ｉ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ４１Ｉ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ４１Ｋ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ４１Ｌ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ４１Ｓ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ４１Ｔ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｇ４２Ｖ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｇ４３Ｎ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｇ１１４Ｓ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｔ１１５Ｉ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｔ１１５Ｌ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｔ１１５Ｖ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｍ１１７Ａ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｍ１１７Ｌ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｍ１１７Ｔ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｍ１１７Ｖ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｍ１１７Ｙ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｇ１１８Ａ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｇ１１８Ｈ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｇ１１８Ｎ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｇ１１８Ｑ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｇ１１８Ｓ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｇ１１８Ｙ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｔ１１９Ａ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｔ１１９Ｃ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｔ１１９Ｅ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｔ１１９Ｌ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｔ１１９Ｎ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｔ１１９Ｓ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｐ１２１Ｍ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｐ１２１Ｓ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｐ１２１Ｔ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｐ１２１Ｗ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ１３５Ｉ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ１３５Ｖ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｋ１８４Ｈ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｋ１８４Ｍ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｋ１８４Ｎ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｋ１８４Ｓ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｇ２９３Ａ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｇ２９３Ｐ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｇ２９３Ｓ又はＫ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｖのいずれか一つの組み合わせ突然変異部位であることを特徴とする請求項１に記載のアミノ酸脱水素酵素突然変異体。
【請求項3】
前記アミノ酸脱水素酵素突然変異体は、アミノ酸突然変異Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｌ１３５Ｖを備え、且つギ酸脱水素酵素ＦＤＨと共発現されることを特徴とする請求項１に記載のアミノ酸脱水素酵素突然変異体。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載のアミノ酸脱水素酵素突然変異体をコードすることを特徴とするＤＮＡ分子。
【請求項5】
請求項４に記載のＤＮＡ分子が連結されていることを特徴とする組換えプラスミド。
【請求項6】
前記組換えプラスミドは、ｐＥＴ－２２ａ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－３ａ（＋）、ｐＥＴ－３ｄ（＋）、ｐＥＴ－１１ａ（＋）、ｐＥＴ－１２ａ（＋）、ｐＥＴ－１４ｂ、ｐＥＴ－１５ｂ（＋）、ｐＥＴ－１６ｂ（＋）、ｐＥＴ－１７ｂ（＋）、ｐＥＴ－１９ｂ（＋）、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ｂ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）、ｐＥＴ－２９ａ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ（＋）、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａ（＋）、ｐＥＴ－３５ｂ（＋）、ｐＥＴ－３８ｂ（＋）、ｐＥＴ－３９ｂ（＋）、ｐＥＴ－４０ｂ（＋）、ｐＥＴ－４１ａ（＋）、ｐＥＴ－４１ｂ（＋）、ｐＥＴ－４２ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ｂ（＋）、ｐＥＴ－４４ａ（＋）、ｐＥＴ－４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ－Ａ、ｐＲＳＥＴ－Ｂ、ｐＲＳＥＴ－Ｃ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２－８、ｐＵＣ－１８、ｐＲＳＦＤｕｅｔ１又はｐＵＣ－１９であることを特徴とする請求項５に記載の組換えプラスミド。
【請求項7】
請求項５又は６に記載の組換えプラスミドを含有することを特徴とする宿主細胞。
【請求項8】
前記宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞を含むことを特徴とする請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項9】
前記原核細胞は、大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌ＤＨ５α形質転換受容性細胞であり、前記真核細胞は、酵母であることを特徴とする請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項10】
アミノ酸脱水素酵素を用いてケトン類化合物の接触還元アミノ化反応を行うステップを含むアミノ酸の生産方法において、前記アミノ酸脱水素酵素は、請求項１～３のいずれか１項に記載のアミノ酸脱水素酵素突然変異体であることを特徴とする方法。
【請求項11】
前記ケトン類化合物は、【化1】
【化2】
【請求項12】
前記ケトン類化合物は、【化3】
【請求項13】
前記接触還元アミノ化反応におけるアミノ供与体は、ギ酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、水酸化アンモニウム、シュウ酸アンモニウム、シュウ酸水素アンモニウム、乳酸アンモニウム又はリン酸アンモニウムであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記アミノ酸脱水素酵素による接触還元アミノ化反応の条件は、３０℃～５０℃であり、撹拌速度は、５０ｒｐｍ～２５０ｒｐｍであり、前記接触還元アミノ化反応は、０．１ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬのギ酸脱水素酵素の使用をさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、具体的に言えば、アミノ酸脱水素酵素突然変異体及びその応用に関する。
【背景技術】
【0002】
アミノ酸脱水素酵素（Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、略称ＡＡＤＨ）の酵素分類番号はＥＣ（１．４．１．Ｘ）であり、可逆的なアミノ酸の酸化的脱アミノ化とケト酸の還元的アミン化反応を触媒することができ、アミノ酸の合成と代謝経路で重要な酵素である。そのうち、アミノ酸脱水素酵素は、キラル化合物の合成分野で、プロキラルケト酸又はケトンの対称還元によるキラルアミンの製造において、立体選択性が高く、効率が高く、反応が温和であり、環境に優しいなどの利点を有する。アミノ酸脱水素酵素によって触媒される反応で、還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）と酸化型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を含む補因子の関与が必要である。
【0003】
ケトンの還元反応を行うプロセスでは、一般に還元型の補因子ＮＡＤＨの関与が必要であり、実際の反応では、酸化型の補因子ＮＡＤ＋を加え、次に適切な補因子再生系によって還元型のＮＡＤＨとして再生させる。よく使用される補因子再生系は、グルコースとグルコース脱水素酵素、ギ酸塩とギ酸脱水素酵素、第二級アルコールと第二級アルコール脱水素酵素、亜リン酸塩と亜リン酸脱水素酵素及び他の同様の系を含む。一般に、補酵素再生系を変えてもアミノ酸脱水素酵素の機能に実質的な影響はない。
【0004】
アミノ酸脱水素酵素は幅広い商業的価値を持っているが、その由来は比較的限定されており、しかも酵素生産菌株には収量が低いという問題があるため、定向進化の方法により優れた特性を備えるアミノ酸脱水素酵素菌株を得ることは、アミノ酸脱水素酵素の生産、応用にとって重要な意義を持っている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、アミノ酸脱水素酵素突然変異体及びその応用を提供することにより、野生型のアミノ酸脱水素酵素は産業的生産への使用に適さないという従来技術の技術的課題を解決することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
前記目的を達成するための本発明の一態様によれば、アミノ酸脱水素酵素突然変異体を提供する。当該アミノ酸脱水素酵素突然変異体は、配列番号１に示される配列にアミノ酸突然変異が起こった配列を備え、アミノ酸突然変異が起こった部位は、Ｋ１４４Ｇ部位を含む。
【0007】
さらに、アミノ酸突然変異が起こった部位は、Ｌ４１Ｉ／Ｌ／Ｔ、Ｇ４２Ｖ、Ｇ４３Ｎ、Ｔ１１５Ｉ／Ｌ／Ｖ、Ｍ１１７Ｌ／Ｙ、Ｇ１１８Ｎ、Ｔ１１９Ｃ／Ｅ／Ｌ／Ｓ、Ｐ１２１Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｗ、Ｌ１３５Ｉ／Ｖ、Ｋ１８４Ｍ／Ｎ／Ｓ、Ｇ２９３Ａ及びＧ２９４Ｉ／Ｖのいずれか１つ又は複数をさらに含み、ここで、「／」は「又は」を表す。
【0008】
さらに、アミノ酸突然変異が起こった部位は、Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｌ１３５Ｖ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｔ１１５Ｉのいずれか一つの組み合わせ突然変異部位を含む。
【0009】
さらに、アミノ酸脱水素酵素突然変異体は、アミノ酸突然変異Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｌ１３５Ｖを備え、且つギ酸脱水素酵素ＦＤＨと共発現される。
【0010】
本発明の別の態様によれば、ＤＮＡ分子を提供する。当該ＤＮＡ分子は、前記アミノ酸脱水素酵素突然変異体をコードする。
【0011】
本発明のもう１つの態様によれば、組換えプラスミドを提供する。当該組換えプラスミドに前記ＤＮＡ分子が連結されている。
【0012】
さらに、組換えプラスミドは、ｐＥＴ－２２ａ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－３ａ（＋）、ｐＥＴ－３ｄ（＋）、ｐＥＴ－１１ａ（＋）、ｐＥＴ－１２ａ（＋）、ｐＥＴ－１４ｂ、ｐＥＴ－１５ｂ（＋）、ｐＥＴ－１６ｂ（＋）、ｐＥＴ－１７ｂ（＋）、ｐＥＴ－１９ｂ（＋）、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ｂ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）、ｐＥＴ－２９ａ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ（＋）、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａ（＋）、ｐＥＴ－３５ｂ（＋）、ｐＥＴ－３８ｂ（＋）、ｐＥＴ－３９ｂ（＋）、ｐＥＴ－４０ｂ（＋）、ｐＥＴ－４１ａ（＋）、ｐＥＴ－４１ｂ（＋）、ｐＥＴ－４２ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ｂ（＋）、ｐＥＴ－４４ａ（＋）、ｐＥＴ－４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ－Ａ、ｐＲＳＥＴ－Ｂ、ｐＲＳＥＴ－Ｃ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２－８、ｐＵＣ－１８、ｐＲＳＦＤｕｅｔ１又はｐＵＣ－１９である。
【0013】
本発明のさらにもう１つの態様によれば、宿主細胞を提供する。当該宿主細胞は、前記いずれか一つの組換えプラスミドを含有する。
【0014】
さらに、宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞を含み、好ましくは、原核細胞は、大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌ＤＨ５α形質転換受容性細胞であり、真核細胞は、酵母である。
【0015】
本発明のもう１つの態様によれば、アミノ酸の生産方法を提供する。当該方法は、アミノ酸脱水素酵素を用いてケトン類化合物の接触還元アミノ化反応を行うステップを含み、アミノ酸脱水素酵素は、前記いずれか一つのアミノ酸脱水素酵素突然変異体である。
【0016】
さらに、ケトン類化合物は、
であり、還元的アミノ化反応の生成物は、
であり、式中、Ｒ１は、－ＯＨ、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ又は－ＣＨ３を表し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、それぞれ、独立的に、－Ｈ、－ＯＨ、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ又は－ＣＨ３を表し、好ましくは、ケトン類化合物は、
である。
【化1】
【化2】
【化3】
【0017】
さらに、接触還元アミノ化反応におけるアミノ供与体は、ギ酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、水酸化アンモニウム、シュウ酸アンモニウム、シュウ酸水素アンモニウム、乳酸アンモニウム又はリン酸アンモニウムであり、好ましくは、アミノ酸脱水素酵素による接触還元アミノ化反応の条件は、３０～５０℃であり、撹拌速度は、５０～２５０ｒｐｍであり、接触還元アミノ化反応は、０．１～１ｍｇ／ｍＬのギ酸脱水素酵素の使用をさらに含む。
【発明の効果】
【0018】
本発明の前記アミノ酸脱水素酵素突然変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸脱水素酵素において、部位特異的突然変異の方法により突然変異させることによって、そのアミノ酸配列を変えて、タンパク質の構造と機能を変えることを実現し、さらに定向型スクリーニングの方法により、前記突然変異部位を備えるアミノ酸脱水素酵素を獲得し、本発明のアミノ酸脱水素酵素突然変異体は、酵素活性が大幅に向上しているという利点を備え、そしてアミノ酸脱水素酵素の使用量を低減させ、且つ酵素特異性もこれに応じて向上しており、これによってアミノ酸の産業的生産のコストを大幅に削減している。
【発明を実施するための形態】
【0019】
なお、矛盾がなければ、本願の実施例及び実施例の特徴を互いに組み合わせることができる。以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。
【0020】
特許（ＣＮ１０８７９５８９３Ａ）では、サーモアクチノマイセス・インターメディウス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）ＡＴＣＣ３３２０５に由来するアミノ酸脱水素酵素突然変異体Ａ１３５Ｌ（テンプレートテンプレート）は標的基質を触媒して生成物を得ることができるが、触媒活性が悪い。本発明は、定向進化の方法によりその触媒活性を向上させ、アミノ酸脱水素酵素の使用量を低減させる。本発明のテンプレートアミノ酸の配列は、配列番号１（ＭＲＤＶＦＥＭＭＤＲＹＧＨＥＱＶＩＦＣＲＨＰＱＴＧＬＫＡＩＩＡＬＨＮＴＴＡＧＰＡＬＧＧＣＲＭＩＰＹＡＳＴＤＥＡＬＥＤＶＬＲＬＳＫＧＭＴＹＫＣＳＬＡＤＶＤＦＧＧＧＫＭＶＩＩＧＤＰＫＫＤＫＳＰＥＬＦＲＶＩＧＲＦＶＧＧＬＮＧＲＦＹＴＧＴＤＭＧＴＮＰＥＤＦＶＨＡＡＲＥＳＫＳＦＬＧＬＰＫＳＹＧＧＫＧＤＴＳＩＰＴＡＬＧＶＦＨＧＭＲＡＴＡＲＦＬＷＧＴＤＱＬＫＧＲＶＶＡＩＱＧＶＧＫＶＧＥＲＬＬＱＬＬＶＥＶＧＡＹＣＫＩＡＤＩＤＳＶＲＣＥＱＬＫＥＫＹＧＤＫＶＱＬＶＤＶＮＲＩＨＫＥＳＣＤＩＦＳＰＣＡＫＧＧＶＶＮＤＤＴＩＤＥＦＲＣＬＡＩＶＧＳＡＮＮＱＬＶＥＤＲＨＧＡＬＬＱＫＲＳＩＣＹＡＰＤＹＬＶＮＡＧＧＬＩＱＶＡＤＥＬＥＧＦＨＥＥＲＶＬＡＫＴＥＡＩＹＤＭＶＬＤＩＦＨＲＡＫＮＥＮＩＴＴＣＥＡＡＤＲＩＶＭＥＲＬＫＫＬＴＤＩＲＲＩＬＬＥＤＰＲＮＳＡＲＲＬＥ＊、＊はアミノ酸終止コドンを表す。）であり、対応するヌクレオチド配列は、配列番号２（ＡＴＧＣＧＴＧＡＣＧＴＡＴＴＣＧＡＡＡＴＧＡＴＧＧＡＴＣＧＣＴＡＣＧＧＣＣＡＣＧＡＧＣＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＧＣＡＧＡＣＴＧＧＣＣＴＧＡＡＡＧＣＧＡＴＣＡＴＣＧＣＴＣＴＧＣＡＴＡＡＣＡＣＣＡＣＴＧＣＣＧＧＴＣＣＧＧＣＡＣＴＧＧＧＣＧＧＴＴＧＴＣＧＣＡＴＧＡＴＴＣＣＡＴＡＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＧＡＴＧＡＡＧＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＴＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＧＴＡＴＧＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＴＧＴＴＧＡＴＴＴＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＡＡＡＴＧＧＴＧＡＴＴＡＴＣＧＧＣＧＡＴＣＣＧＡＡＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＧＣＣＣＡＧＡＡＣＴＧＴＴＣＣＧＴＧＴＴＡＴＣＧＧＴＣＧＣＴＴＣＧＴＴＧＧＣＧＧＣＣＴＧＡＡＣＧＧＴＣＧＴＴＴＣＴＡＴＡＣＣＧＧＴＡＣＴＧＡＴＡＴＧＧＧＣＡＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＴＣＧＣＧＡＡＡＧＣＡＡＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＡＡＡＴＣＴＴＡＣＧＧＴＧＧＴＡＡＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＧＡＣＣＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＴＡＴＴＴＣＡＣＧＧＣＡＴＧＣＧＣＧＣＧＡＣＣＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＴＧＴＧＧＧＧＣＡＣＣＧＡＴＣＡＡＣＴＧＡＡＡＧＧＴＣＧＴＧＴＴＧＴＴＧＣＴＡＴＣＣＡＧＧＧＴＧＴＴＧＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＣＡＴＡＣＴＧＣＡＡＡＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＴＡＣＧＴＴＧＴＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＴＡＣＧＧＣＧＡＣＡＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＡＧＡＣＧＴＧＡＡＣＣＧＴＡＴＣＣＡＣＡＡＡＧＡＧＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＣＣＧＴＧＣＧＣＡＡＡＡＧＧＣＧＧＣＧＴＡＧＴＣＡＡＣＧＡＣＧＡＣＡＣＴＡＴＴＧＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧＣＴＧＣＣＴＧＧＣＧＡＴＴＧＴＴＧＧＴＴＣＣＧＣＧＡＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＡＡＧＡＴＣＧＴＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＡＡＡＣＧＣＴＣＣＡＴＴＴＧＣＴＡＴＧＣＣＣＣＧＧＡＴＴＡＴＣＴＧＧＴＴＡＡＣＧＣＴＧＧＣＧＧＴＣＴＧＡＴＣＣＡＧＧＴＣＧＣＡＧＡＣＧＡＡＣＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＣＡＣＧＡＧＧＡＧＣＧＴＧＴＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＡＣＧＧＡＡＧＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＧＴＴＣＴＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣＣＧＣＧＣＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＡＴＣＡＣＴＡＣＣＴＧＣＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＣＣＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＡＡＣＧＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＣＧＧＡＣＡＴＣＣＧＴＣＧＴＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＣＧＣＧＴＡＡＣＴＣＣＧＣＧＣＧＴＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡ）である。
【0021】
最初に、部位特異的突然変異によりアミノ酸脱水素酵素に突然変異部位を導入し、突然変異体に対し活性の検出を行って、活性が向上している突然変異体を選択する。そのうち、突然変異体Ｋ１４４Ｇは、最初のテンプレートと比べて活性が約５倍向上している。後に、触媒活性の向上がより顕著な突然変異体を得るために、Ｋ１４４Ｇをテンプレートとして引き続き突然変異させる。
【0022】
ここで、部位特異的突然変異：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの方法により目的ＤＮＡ断片（ゲノムでもプラスミドでもよい）に所望の変化（通常、有利な方向を特徴付ける変化）を導入することを指し、塩基の追加、削除、点突然変異などを含む。部位特異的突然変異は、ＤＮＡが発現する目的タンパク質の性状及び特徴付けを迅速かつ効率的に向上させることができ、遺伝子研究作業において非常に有用な手段である。
【0023】
全プラスミドＰＣＲを利用して部位特異的突然変異を導入する方法は簡単かつ有効であり、現在では比較的多く用いられている手段である。その原理は、突然変異部位を含む１対のプライマー（正、逆）と、テンプレートプラスミドとをアニーリングした後にポリメラーゼを用いて「サイクリック伸長」することであり（いわゆるサイクリック伸長とは、ポリメラーゼがテンプレートに従ってプライマーを伸長し、一周後プライマーの５’端に戻って終了し、さらに加熱、アニーリング及び伸長を繰り返すことを経るサイクルを指す。）、この反応はローリングサークル増幅とは異なり、多数のタンデムコピーを形成しない。正逆プライマーの伸長産物はアニーリング後に対合して刻み目の付いた開環プラスミドとなる。Ｄｐｎ Ｉ酵素を用いて伸長産物を切断し、元のテンプレートプラスミドは通常の大腸菌由来であり、ｄａｍメチル化により修飾され、Ｄｐｎ Ｉに敏感であるため切断されるが、インビトロで合成された突然変異配列を含むプラスミドはメチル化がないため切断されず、従ってその後の形質転換において成功に形質転換され、突然変異プラスミドのクローンを得ることができる。突然変異プラスミドを大腸菌細胞内に形質転換し、そして超音波で細胞を破砕する方法により粗酵素を得る。
【0024】
上記では突然変異プラスミドを大腸菌細胞の中に形質転換して、大腸菌の中で過剰に発現させなければならない。次に、超音波による細胞破砕の方法で粗酵素を得る。アミノ酸脱水素酵素の誘導発現の最適条件は、２５℃、０．１ ｍＭ ＩＰＴＧで１６時間誘導することである。
【0025】
ソフトウェアを用いてアミノ酸脱水素酵素の三次元的構造に対してコンピュータシミュレーション解析を行うことにより、突然変異部位の殆どが活性部位の近くに位置することを発見し、突然変異後に基質と酵素の結合を強めているという可能性があるため、これによって触媒効率が向上している。本発明の典型的な一実施形態によれば、アミノ酸脱水素酵素突然変異体を提供する。当該アミノ酸脱水素酵素突然変異体は、配列番号１に示される配列にアミノ酸突然変異が起こった配列を備え、前記アミノ酸突然変異が起こった部位は、Ｋ１４４Ｇ部位を含む。
【0026】
好ましくは、アミノ酸突然変異が起こった部位は、Ｌ４１Ｉ／Ｌ／Ｔ、Ｇ４２Ｖ、Ｇ４３Ｎ、Ｔ１１５Ｉ／Ｌ／Ｖ、Ｍ１１７Ｌ／Ｙ、Ｇ１１８Ｎ、Ｔ１１９Ｃ／Ｅ／Ｌ／Ｓ、Ｐ１２１Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｗ、Ｌ１３５Ｉ／Ｖ、Ｋ１８４Ｍ／Ｎ／Ｓ、Ｇ２９３Ａ及びＧ２９４Ｉ／Ｖのいずれか１つ又は複数をさらに含み、ここで、「／」は「又は」を表し、より好ましくは、アミノ酸突然変異が起こった部位は、Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｌ１３５Ｖ、Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｔ１１５Ｉのいずれか一つの組み合わせ突然変異部位を含む。
【0027】
本発明の典型的な一実施形態によれば、アミノ酸脱水素酵素突然変異体は、アミノ酸突然変異Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｌ１３５Ｖを備え、且つギ酸脱水素酵素ＦＤＨと共発現される。
【0028】
本発明の前記アミノ酸脱水素酵素突然変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸脱水素酵素において、部位特異的突然変異の方法により突然変異させることによって、そのアミノ酸配列を変えて、タンパク質の構造と機能を変えることを実現し、さらに定向型スクリーニングの方法により、前記突然変異部位を備えるアミノ酸脱水素酵素を獲得し、本発明のアミノ酸脱水素酵素突然変異体は、酵素活性が大幅に向上しているという利点を備え、且つ酵素特異性もこれに応じて向上しており、これによって産業的生産のコストを大幅に削減している。
【0029】
本発明の典型的な一実施形態によれば、ＤＮＡ分子を提供する。前記ＤＮＡによってコードされるアミノ酸脱水素酵素は、酵素活性と酵素の安定性が向上しており、アミノ酸の産業的生産では酵素の添加量を減少させ、後処理の難しさを軽減させることができる。
【0030】
本発明の上記ＤＮＡ分子は、「発現カセット」の形態で存在してもよい。「発現カセット」とは適切な宿主細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができるＤＮＡ及びＲＮＡ配列を包含する、線形又は環状の核酸分子を指す。一般に、目的ヌクレオチドに効果的に連結されたプロモーターを含み、これは任意選択で停止シグナル及び／又は他の調節エレメントに効果的に連結されている。発現カセットは、また、ヌクレオチド配列の正確な翻訳に必要な配列を含んでもよい。コード領域は、通常、目的タンパク質をコードするが、センス又はアンチセンス方向に目的機能性ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡもコードする。目的ポリヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってもよく、ここで、キメラとは、少なくとも１つのその成分と、その少なくとも１つの他の成分とが異種であることを意味する。発現カセットは、また、天然に存在するが、異種発現のための効果的な組換え形成によって得られることができる。
【0031】
本発明の典型的な一実施形態によれば、組換えプラスミドを提供する。当該組換えプラスミドは、上記いずれかのＤＮＡ分子を含有する。上記組換えプラスミド中のＤＮＡ分子は、組換えプラスミドの適切な位置に配置されることにより、上記ＤＮＡ分子は、複製、転写又は発現を正確かつ円滑に行うことができる。
【0032】
本発明において上記ＤＮＡ分子を限定する際に用いる限定語は「含有」であるが、ＤＮＡ配列の両端にその機能に関与しない他の配列を任意に付加できることを意味するものではない。当業者は、組換え操作の要求を満たすために、ＤＮＡ配列の両端に適切な制限酵素の酵素切断部位を付加するか、又は開始コドン、終止コドンなどをさらに付加する必要があることを知っており、従って、閉鎖式の表現で限定すれば、これらの状況を真実にカバーすることができない。
【0033】
本発明において用いられる用語「プラスミド」は、二本鎖又は一本鎖の線形又は環状の形態の任意のプラスミド、コスミド、バクテリオファージ又はアグロバクテリウム二元核酸分子を含み、好ましくは組換え発現プラスミドであり、原核生物発現プラスミドであっても真核生物発現プラスミドであってもよいが、好ましくは原核生物発現プラスミドであり、ある実施形態では、組換えプラスミドは、ｐＥＴ－２２ａ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－３ａ（＋）、ｐＥＴ－３ｄ（＋）、ｐＥＴ－１１ａ（＋）、ｐＥＴ－１２ａ（＋）、ｐＥＴ－１４ｂ、ｐＥＴ－１５ｂ（＋）、ｐＥＴ－１６ｂ（＋）、ｐＥＴ－１７ｂ（＋）、ｐＥＴ－１９ｂ（＋）、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ｂ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）、ｐＥＴ－２９ａ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ（＋）、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａ（＋）、ｐＥＴ－３５ｂ（＋）、ｐＥＴ－３８ｂ（＋）、ｐＥＴ－３９ｂ（＋）、ｐＥＴ－４０ｂ（＋）、ｐＥＴ－４１ａ（＋）、ｐＥＴ－４１ｂ（＋）、ｐＥＴ－４２ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ｂ（＋）、ｐＥＴ－４４ａ（＋）、ｐＥＴ－４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ－Ａ、ｐＲＳＥＴ－Ｂ、ｐＲＳＥＴ－Ｃ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２－８、ｐＵＣ－１８、ｐＲＳＦＤｕｅｔ１又はｐＵＣ－１９から選ばれる。より好ましくは、前記組換えプラスミドは、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）である。
【0034】
本発明の典型的な一実施形態によれば、上記いずれか一つの組換えプラスミドを含有する宿主細胞を提供する。本発明に適用する宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞を含むが、これらに限定されない。原核細胞は大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌ＤＨ５α形質転換受容性細胞であり、真核細胞は酵母であることが好ましい。
【0035】
本発明の典型的な一実施形態によれば、アミノ酸の生産方法を提供する。当該方法は、アミノ酸脱水素酵素によるケトン類化合物及びアミノ供与体の接触アミノ基転移反応のステップを含み、アミノ酸脱水素酵素は、前記いずれか一つのアミノ酸脱水素酵素突然変異体である。本発明の前記アミノ酸脱水素酵素突然変異体がより高い酵素触媒活性を備えるため、本発明のアミノ酸脱水素酵素突然変異体を利用してアミノ酸を製造する場合は生産コストを削減できるだけでなく、得られるアミノ酸のｅ．ｅ．値（エナンチオマー過剰率）はより高い。
【0036】
本発明の典型的な一実施形態によれば、ケトン類化合物は、
であり、還元的アミノ化反応の生成物は、
であり、式中、Ｒ１は、－ＯＨ、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ又は－ＣＨ３を表し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、それぞれ、独立的に、－Ｈ、－ＯＨ、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ又は－ＣＨ３を表し、
好ましくは、ケトン類化合物は、
である。
【化4】
【化5】
好ましくは、ケトン類化合物は、
【化6】
【0037】
好ましくは、接触還元アミノ化反応におけるアミノ供与体は、ギ酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、水酸化アンモニウム、シュウ酸アンモニウム、シュウ酸水素アンモニウム、乳酸アンモニウム又はリン酸アンモニウムであり、アミノ酸脱水素酵素による接触還元アミノ化反応の条件は、３０～５０℃であり、撹拌速度は、５０～２５０ｒｐｍであり、接触還元アミノ化反応は、０．１～１ｍｇ／ｍＬのギ酸脱水素酵素の使用をさらに含む。
【0038】
以下、特定の実施例を用いて本発明の有益な効果をさらに説明する。
【0039】
基質１、２、３、４の反応検証：
基質１：
２－（１－アダマンタン）－２－オキソ酢酸
基質２：
２－（２－ヒドロキシ－１－アダマンタン）－２－オキソ酢酸
基質３：
２－（３－フルオロ－１－アダマンタン）－２－オキソ酢酸
基質４：
２－（３－メチル－１－アダマンタン）－２－オキソ酢酸
基質１：
【化7】
基質２：
【化8】
基質３：
【化9】
基質４：
【化10】
【0040】
（実施例１）
Ａ１３５Ｌ（テンプレート、Ａ１３５Ｌは、１３５位のアミノ酸ＡがＬによって置換されることを表す。）に対し部位特異的突然変異を行って、Ｔ１１５、Ｌ１３５、Ｋ１４４、Ｔ１４７、Ｌ２９４とＶ２９７の合計で６つの突然変異部位による４０個の突然変異体を得て、基質１と基質２を入れて反応で検証し、反応系は、０．１ｇの基質、０．００１ｇのアミノ酸脱水素酵素、０．００１ｇのギ酸脱水素酵素、０．０２５６ｍｇのＮＡＤ＋、０．０５６ｇのギ酸アンモニウム、０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ８．０）で、１．１ｍＬであり、４０℃、１６時間であり、そのうち、Ｋ１４４Ｇ突然変異体の転化率が最も高い。結果の詳細は表１を参照する。
備考：－は０．５～２０％を、＋は２０～４０％を、＋＋は４０～６０％を、＋＋＋は６０～８０％を、＋＋＋＋は８０～９０％を、＋＋＋＋＋は９０％を超えることを表す。
Ａ１３５Ｌ（テンプレート、Ａ１３５Ｌは、１３５位のアミノ酸ＡがＬによって置換されることを表す。）に対し部位特異的突然変異を行って、Ｔ１１５、Ｌ１３５、Ｋ１４４、Ｔ１４７、Ｌ２９４とＶ２９７の合計で６つの突然変異部位による４０個の突然変異体を得て、基質１と基質２を入れて反応で検証し、反応系は、０．１ｇの基質、０．００１ｇのアミノ酸脱水素酵素、０．００１ｇのギ酸脱水素酵素、０．０２５６ｍｇのＮＡＤ＋、０．０５６ｇのギ酸アンモニウム、０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ８．０）で、１．１ｍＬであり、４０℃、１６時間であり、そのうち、Ｋ１４４Ｇ突然変異体の転化率が最も高い。結果の詳細は表１を参照する。
【表1】
【0041】
（実施例２）
Ｋ１４４Ｇをテンプレートとして、引き続きＬ４１、Ｇ４２、Ｇ４３、Ｇ１１４、Ｔ１１５、Ｍ１１７、Ｇ１１８、Ｔ１１９、Ｐ１２１、Ｌ１３５、Ｋ１８４、Ｇ２９３及びＬ２９４の１３の部位に対し突然変異を行って、合計で４３個の突然変異体を得て、基質１と基質２を入れて反応で検証し、反応条件は、０．１ｇの基質、０．０００５ｇのアミノ酸脱水素酵素、０．００１ｇのギ酸脱水素酵素、０．０２５６ｍｇのＮＡＤ＋、０．０５６ｇのギ酸アンモニウム、０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ ８．０）で、１ｍＬであり、４０℃、１６時間であり、そのうち、部位Ｌ１３５Ｖ、Ｔ１１５ＩとＬ２９４Ｉを加えると転化率が向上する。結果の詳細は表２を参照する。
備考：－は０．５～２０％を、＋は２０～４０％を、＋＋は４０～６０％を、＋＋＋は６０～８０％を、＋＋＋＋は８０～９０％を、＋＋＋＋＋は９０％を超えることを表す。
Ｋ１４４Ｇをテンプレートとして、引き続きＬ４１、Ｇ４２、Ｇ４３、Ｇ１１４、Ｔ１１５、Ｍ１１７、Ｇ１１８、Ｔ１１９、Ｐ１２１、Ｌ１３５、Ｋ１８４、Ｇ２９３及びＬ２９４の１３の部位に対し突然変異を行って、合計で４３個の突然変異体を得て、基質１と基質２を入れて反応で検証し、反応条件は、０．１ｇの基質、０．０００５ｇのアミノ酸脱水素酵素、０．００１ｇのギ酸脱水素酵素、０．０２５６ｍｇのＮＡＤ＋、０．０５６ｇのギ酸アンモニウム、０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ ８．０）で、１ｍＬであり、４０℃、１６時間であり、そのうち、部位Ｌ１３５Ｖ、Ｔ１１５ＩとＬ２９４Ｉを加えると転化率が向上する。結果の詳細は表２を参照する。
【表2】
【0042】
（実施例３）
組み合わせ飽和突然変異は、複数の突然変異部位による相乗効果を備える突然変異体を得ることができ、且つそのアミノ酸の構成を最適化し組み合わせることができる。Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉをテンプレートとして、それぞれ、反応が比較的良好な突然変異部位Ｌ１３５ＶとＴ１１５Ｉとを重ね合わせ、反応条件は、０．１ｇの基質、０．０００５ｇのアミノ酸脱水素酵素、０．００１ｇのギ酸脱水素酵素、０．０２５６ｍｇのＮＡＤ＋、０．０５６ｇのギ酸アンモニウム、０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ ８．０）で、１ｍＬであり、４０℃、１００ｒｐｍ、１６時間であり、そのうち、活性が最も高いのはＫ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｌ１３５Ｖである。結果は表３を参照する。
備考：－は０．５～２０％を、＋は２０～４０％を、＋＋は４０～６０％を、＋＋＋は６０～８０％を、＋＋＋＋は８０～９０％を、＋＋＋＋＋は９０％を超えることを表す。
組み合わせ飽和突然変異は、複数の突然変異部位による相乗効果を備える突然変異体を得ることができ、且つそのアミノ酸の構成を最適化し組み合わせることができる。Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉをテンプレートとして、それぞれ、反応が比較的良好な突然変異部位Ｌ１３５ＶとＴ１１５Ｉとを重ね合わせ、反応条件は、０．１ｇの基質、０．０００５ｇのアミノ酸脱水素酵素、０．００１ｇのギ酸脱水素酵素、０．０２５６ｍｇのＮＡＤ＋、０．０５６ｇのギ酸アンモニウム、０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ ８．０）で、１ｍＬであり、４０℃、１００ｒｐｍ、１６時間であり、そのうち、活性が最も高いのはＫ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｌ１３５Ｖである。結果は表３を参照する。
【表3】
【0043】
（実施例４）
基質１、２、３と４の反応の増幅：Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｌ１３５Ｖで反応してｅ．ｅ．を検出し、反応条件は、１ｇの基質、０．００５ｇのアミノ酸脱水素酵素、０．０１ｇのギ酸脱水素酵素、０．２５６ｍｇのＮＡＤ＋、０．０５６ｇのギ酸アンモニウム、０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ８．０）で、１ｍＬであり、４０℃、１００ｒｐｍである。
基質１、２、３と４の反応の増幅：Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｌ１３５Ｖで反応してｅ．ｅ．を検出し、反応条件は、１ｇの基質、０．００５ｇのアミノ酸脱水素酵素、０．０１ｇのギ酸脱水素酵素、０．２５６ｍｇのＮＡＤ＋、０．０５６ｇのギ酸アンモニウム、０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ８．０）で、１ｍＬであり、４０℃、１００ｒｐｍである。
【0044】
活性検出のサンプル採取方法：反応系から０．５ｍＬ取り出して、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、０．０５０ｍＬの上清を取得して１ｍＬの精製水を加え、均一に混合した後にＨＰＬＣにより転化率を検出する。
【0045】
ｅ．ｅ．検出のサンプル採取方法：反応による転化済みの系を１ｍＬ取得して、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨを１０～１１に調整し、０．１ｍＬの（ＢＯＣ）２Ｏを加え、３０℃、２００ｒｐｍ、３０分間であり、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨを１０～１１に調整し、３０℃、２００ｒｐｍ、３０分間であり、等量体積の酢酸イソプロピルを加えて、６Ｍ ＨＣｌでｐＨを２．０に調整し、０．５ｍＬの系を取得して１ｍＬの酢酸エチルを加え、振盪して均一に混合し、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を取得して乾燥し、無水エタノールを加えて溶解してｅ．ｅ．を検出する。結果は表４を参照する。
備考：－は０．５～２０％を、＋は２０～４０％を、＋＋は４０～６０％を、＋＋＋は６０～８０％を、＋＋＋＋は８０～９０％を、＋＋＋＋＋は９０％を超えることを表す。
【表4】
【0046】
（実施例５）
突然変異体Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｌ１３５Ｖを選択して、ギ酸脱水素酵素の最適化を行い、反応条件は、０．１ｇの基質、０．０００５ｇのアミノ酸脱水素酵素、０．０２５６ｍｇのＮＡＤ＋、０．０５６ｇのギ酸アンモニウム、０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ８．０）で、１ｍＬであり、４０℃、１００ｒｐｍであり、そのうち、ギ酸脱水素酵素は０．３ｍｇ以下でしか活性が明らかに低下しないことから、反応の過程でギ酸脱水素酵素は非制限要因であることが示される。結果は表５を参照する。
備考：－は０．５～２０％を、＋は２０～４０％を、＋＋は４０～６０％を、＋＋＋は６０～８０％を、＋＋＋＋は８０～９０％を、＋＋＋＋＋は９０％を超えることを表す。
突然変異体Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｌ１３５Ｖを選択して、ギ酸脱水素酵素の最適化を行い、反応条件は、０．１ｇの基質、０．０００５ｇのアミノ酸脱水素酵素、０．０２５６ｍｇのＮＡＤ＋、０．０５６ｇのギ酸アンモニウム、０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ８．０）で、１ｍＬであり、４０℃、１００ｒｐｍであり、そのうち、ギ酸脱水素酵素は０．３ｍｇ以下でしか活性が明らかに低下しないことから、反応の過程でギ酸脱水素酵素は非制限要因であることが示される。結果は表５を参照する。
【表5】
【0047】
（実施例６）
０．３ｍｇのギ酸脱水素酵素という条件において、酵素Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｌ１３５Ｖの量を最適化し、反応条件は、０．１ｇの基質、０．０２５６ｍｇのＮＡＤ＋、０．０５６ｇのギ酸アンモニウム、０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ８．０）で、１．１ｍＬであり、４０℃、１００ｒｐｍであり、酵素の量の低減につれて、転化率が明らかに下がることから、反応でアミノ酸脱水素酵素は制限要因であることが示される。結果は表６を参照する。
備考：－は０．５～２０％を、＋は２０～４０％を、＋＋は４０～６０％を、＋＋＋は６０～８０％を、＋＋＋＋は８０～９０％を、＋＋＋＋＋は９０％を超えることを表す。
０．３ｍｇのギ酸脱水素酵素という条件において、酵素Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｌ１３５Ｖの量を最適化し、反応条件は、０．１ｇの基質、０．０２５６ｍｇのＮＡＤ＋、０．０５６ｇのギ酸アンモニウム、０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ８．０）で、１．１ｍＬであり、４０℃、１００ｒｐｍであり、酵素の量の低減につれて、転化率が明らかに下がることから、反応でアミノ酸脱水素酵素は制限要因であることが示される。結果は表６を参照する。
【表6】
【0048】
（実施例７）
共発現菌株の反応条件を最適化し、Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｌ１３５Ｖとギ酸脱水素酵素ＦＤＨとを、共発現プラスミドｐＲＳＦＤｕｅｔ１に構築して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、基質１を入れて反応で検証し、反応条件として温度、速度を最適化し、反応条件は、０．１ｇの基質、０．００５ｇのアミノ酸脱水素酵素、０．０２５６ｍｇのＮＡＤ＋、０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ８．０）で、１．１ｍＬである。結果は、最良の反応条件は、４０℃、１００ｒｐｍであることを示す。結果は表７を参照する。
備考：－は０．５～２０％を、＋は２０～４０％を、＋＋は４０～６０％を、＋＋＋は６０～８０％を、＋＋＋＋は８０～９０％を、＋＋＋＋＋は９０％を超えることを表す。
共発現菌株の反応条件を最適化し、Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｌ１３５Ｖとギ酸脱水素酵素ＦＤＨとを、共発現プラスミドｐＲＳＦＤｕｅｔ１に構築して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、基質１を入れて反応で検証し、反応条件として温度、速度を最適化し、反応条件は、０．１ｇの基質、０．００５ｇのアミノ酸脱水素酵素、０．０２５６ｍｇのＮＡＤ＋、０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ８．０）で、１．１ｍＬである。結果は、最良の反応条件は、４０℃、１００ｒｐｍであることを示す。結果は表７を参照する。
【表7】
【0049】
（実施例８）
基質１、２、３と４の反応の増幅：共発現菌株Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｌ１３５Ｖ＋ＦＤＨで反応してｅ．ｅ．を検出し、反応条件は、１ｇの基質、０．０５ｇのアミノ酸脱水素酵素、０．２５６ｍｇのＮＡＤ＋、０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ８．０）で、１ｍＬであり、４０℃、１００ｒｐｍである。
基質１、２、３と４の反応の増幅：共発現菌株Ｋ１４４Ｇ＋Ｌ２９４Ｉ＋Ｌ１３５Ｖ＋ＦＤＨで反応してｅ．ｅ．を検出し、反応条件は、１ｇの基質、０．０５ｇのアミノ酸脱水素酵素、０．２５６ｍｇのＮＡＤ＋、０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ８．０）で、１ｍＬであり、４０℃、１００ｒｐｍである。
【0050】
活性検出のサンプル採取方法：反応系から０．５ｍＬ取り出して、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、０．０５０ｍＬの上清を取得して１ｍＬの精製水を加え、均一に混合した後にＨＰＬＣにより転化率を検出する。
【0051】
ｅ．ｅ．検出のサンプル採取方法：反応による転化済みの系を１ｍＬ取得して、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨを１０～１１に調整し、０．１ｍＬの（ＢＯＣ）２Ｏを加え、３０℃、２００ｒｐｍ、３０分間であり、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨを１０～１１に調整し、３０℃、２００ｒｐｍ、３０分間であり、等量体積の酢酸イソプロピルを加えて、６Ｍ ＨＣｌでｐＨを２．０に調整し、０．５ｍＬの系を取得して１ｍＬの酢酸エチルを加え、振盪して均一に混合し、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を取得して乾燥し、無水エタノールを加えて溶解してｅ．ｅ．を検出する。結果は表８を参照する。
備考：－は０．５～２０％を、＋は２０～４０％を、＋＋は４０～６０％を、＋＋＋は６０～８０％を、＋＋＋＋は８０～９０％を、＋＋＋＋＋は９０％を超えることを表す。
【表8】
【0052】
完全に反応した後に、系の温度を１０～３０℃に下げて、１０Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを９．８～１０．２に調整し、二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチルを加えて、１０～３０℃に保温して反応させ（ｐＨ＝９．８～１０．２）、反応が完了したら、３５％の硫酸でｐＨを７．５～８．５に調整し、１０体積の酢酸イソプロピルを加え、再び３５％の硫酸でｐＨを１．８～２．２に調整して、５～１０分間撹拌し、次に珪藻土を加え、系を珪藻土を敷き詰めた加圧濾過タンクに通し、濾過ケーキを５体積の酢酸イソプロピルで洗浄し、合わせた後に濾液は１０Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを８．２～８．５に調整し、１時間撹拌した後、静置して分液し、下層の水相に１５体積の酢酸イソプロピルを加え、３５％の硫酸でｐＨを１．８～２．２に調整し、系の温度を約４０℃に上げて、保温して３時間撹拌した後に、１時間静置して分液し、水相に１５体積の酢酸イソプロピルを加え、温度を約４０℃に調整して３時間保温した後に、１時間静置して分液し、有機相を合わせ、温度をＴ≦５０℃に制御して約９体積に濃縮し、１０～１５分間以内に温度を８２～８９℃に制御しながら２０体積のｎ－ヘプタンを加え、系の温度を徐々に下げて、ジャケットの温度を７０℃に制御して１時間保温し、系の温度を引き続き４０℃に下げて、３０分間保温した後に、引き続き温度を０～５℃に下げて、１時間保温し、系を吸引濾過し、１０体積のｎ－ヘプタンで濾過ケーキを洗い流し、生成物を５５℃で乾燥する。秤量して０．８ｇの産物を得て、収率は８０％である。
【0053】
本発明では、突然変異部位の他の任意の組み合わせも良好な効果を得る可能性があり、突然変異部位を他の相同性の高いアミノ酸脱水素酵素において再現させると、比較的良好な効果を得るはずである。
【0054】
上述したのは、本発明を限定するものではなく、本発明の好ましい実施例に過ぎず、当業者にとって、本発明には様々な補正と変化があってもよい。本発明の趣旨と原則内において、補正、同等の置換、改良などを行う場合、そのいずれも本発明の請求範囲に含まれるものとする。
【国際調査報告】