特表 2024-505106 アズレン系化合物及びその作製方法と使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-02

(54)【発明の名称】アズレン系化合物及びその作製方法と使用

(51)【国際特許分類】

   C07C 35/34 20060101AFI20240126BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240126BHJP

   A61K 31/122 20060101ALI20240126BHJP

   A61K 36/63 20060101ALI20240126BHJP

   C07C 29/74 20060101ALI20240126BHJP

【ＦＩ】

C07C35/34 CSP

A61P29/00

A61K31/122

A61K36/63

C07C29/74

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023548289

(86)(22)【出願日】2022-08-12

(85)【翻訳文提出日】2023-08-07

(86)【国際出願番号】 CN2022111978

(87)【国際公開番号】W WO2023045612

(87)【国際公開日】2023-03-30

(31)【優先権主張番号】202111114354.5

(32)【優先日】2021-09-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523300942

【氏名又は名称】江西本草天工科技有限責任公司

【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＸＩ ＢＥＮＣＡＯ ＴＩＡＮＧＯＮＧ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． ５６ Ｙａｎｇｍｉｎｇ Ｒｏａｄ， Ｄｏｎｇｈｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｎａｎｃｈａｎｇ， Ｊｉａｎｇｘｉ ３３０００６， Ｃｈｉｎａ

(71)【出願人】

【識別番号】521558329

【氏名又は名称】江西中医薬大学

【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＸＩ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＲＡＤＩＴＩＯＮＡＬ ＣＨＩＮＥＳＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ

【住所又は居所原語表記】１６８８ Ｍｅｉｌｉｎｇ Ａｖｅｎｕｅ，Ｗａｎｌｉ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｎａｎｃｈａｎｇ，Ｊｉａｎｇｘｉ ３３００００，Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100146374

【弁理士】

【氏名又は名称】有馬 百子

(72)【発明者】

【氏名】馮 育林

(72)【発明者】

【氏名】何 明珍

(72)【発明者】

【氏名】李 志強

(72)【発明者】

【氏名】李 志峰

(72)【発明者】

【氏名】欧陽 輝

(72)【発明者】

【氏名】李 軍茂

(72)【発明者】

【氏名】楊 世林

【テーマコード（参考）】

4C088

4C206

4H006

【Ｆターム（参考）】

4C088AB64

4C088AC05

4C088BA08

4C088BA10

4C088BA32

4C088CA06

4C088CA07

4C088CA08

4C088CA14

4C088MA16

4C088MA22

4C088MA35

4C088MA37

4C088MA38

4C088MA41

4C088MA43

4C088MA52

4C088MA66

4C088NA20

4C088ZB11

4C206AA01

4C206AA02

4C206AA04

4C206CB24

4C206KA04

4C206KA18

4C206MA01

4C206MA04

4C206MA36

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4C206MA57

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4C206MA86

4C206NA20

4C206ZB11

4H006AA01

4H006AA02

4H006AB20

4H006AD15

4H006AD16

4H006AD17

4H006BB11

4H006BB14

4H006BB16

4H006FC26

4H006FE12

4H006FG30

(57)【要約】

【課題】アズレン系化合物及びその作製方法と使用を提供する。
【解決手段】アズレン系化合物は、互いに異性体となる２つの化合物を備え、その化学名が８－（１，２－ジヒドロキシプロパン－２－イル）－２－ヒドロキシ－１，１０－ジメチル－９－ジヒドロアズレン－３，４－ジオンである。アズレン系化合物の作製方法は、操作が簡単であり、純粋な化合物が分離して得られ、実験によると、両化合物では、２４ｈ内にＲＡＷ２６４．７マクロファージの増殖に対する明らかな影響がなく、ＬＰＳで誘発されるＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ放出と、細胞におけるＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αの過剰分泌が顕著に抑制され、明らかな抗炎症作用がある。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記の構造式で示される化合物１または化合物２である、ことを特徴とするアズレン系化合物。

【請求項2】

請求項１に記載のアズレン系化合物の作製方法であって、
薬用材料であるライラックの茎に、エタノール溶液を投入して抽出し、濾過後に抽出液を収集し、抽出液をエキスとして濃縮するステップ（１）と、
エキスを取り出し、水で分散し、ジクロロメタン、及び酢酸エチルで順に抽出し、２つの溶媒抽出液及び水を収集し、溶媒を減圧・濃縮して乾燥することにより、ジクロロメタン抽出部、酢酸エチル抽出部及び水部を得るステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた酢酸エチル抽出部を取り出し、クロマトグラフィーによる分離精製を行い、アズレン系化合物を得るステップ（３）と、を備え、
ステップ（３）におけるクロマトグラフィーによる分離精製は、
ステップ（２）で得られた酢酸エチル抽出部をメタノールで溶解し、シリカゲルを投入して攪拌し、得られた試料をシリカゲルカラムに入れ、カラムクロマトグラフィーによる分離を行い、体積比の異なる石油エーテル／アセトンによりグラジエント溶出を行い、１１個のフラクション１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１１を得るステップＡと、
フラクション４を取り、ＯＤＳカラムを用いた中圧クロマトグラフィーによる分離を行い、体積比の異なるメタノール／水でグラジエント溶出を行い、５個のフラクションＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥを得るステップＢと、
フラクションＢを取って液相クロマトグラフィーによる分離を行い、体積濃度が１３％であるアセトニトリル／水で溶出し、各クロマトグラフィーピークのピーク時間に応じてフラクションを収集し、各フラクションを濃縮して純粋な化合物１及び２の結晶を得るステップＣと、を備え、
ステップＡにおける、攪拌用のシリカゲルは、１００～２００メッシュであり、前記酢酸エチル抽出部と攪拌用のシリカゲルとの質量比は、１：１０であり、前記シリカゲルカラムのシリカゲルは、２００～３００メッシュであり、グラジエント溶出を行う石油エーテルとアセトンの体積比は、それぞれ５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、及び０：１であり、
ステップＢにおいて、グラジエント溶出を行うメタノール水溶液の体積濃度は、それぞれ５％、１５％、３０％、５０％、７０％、及び１００％であり、前記ＯＤＳカラムを用いた中圧クロマトグラフィーは、ＯＤＳ－Ｃ１８のクロマトグラフィーカラムを用い、クロマトグラフィーカラムサイズは８００×２５ｍｍで、粒度は２０～４５μｍで、流速は３０ｍｌ／ｍｉｎで、カラム温度は２５℃であり、
ステップＣにおける、液相クロマトグラフィーは、ＹＭＣ－Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８のクロマトグラフィーカラムを用い、クロマトグラフィーカラムサイズは２５０×２０ｍｍで、粒度は５μｍで、流速は１０ｍｌ／ｍｉｎである、ことを特徴とするアズレン系化合物の作製方法。

【請求項3】

ステップ（１）におけるエタノール溶液は、５～９５％体積濃度のエタノール水溶液であり、前記抽出は、冷浸法、浸透法、マイクロ波抽出法、超音波抽出法、還流抽出法または連続還流抽出法による抽出である、ことを特徴とする請求項２に記載のアズレン系化合物の作製方法。

【請求項4】

ステップ（１）における抽出回数は、１～３回であり、エタノール溶液の投入量と薬用材料であるライラックの茎の質量比は、（８～３０）：１であり、ステップ（２）におけるジクロロメタン、及び酢酸エチルでの抽出の回数は、それぞれ４～６回であり、各回のジクロロメタン、及び酢酸エチルの使用量は、抽出される液の体積の１／２～１／４である、ことを特徴とする請求項２に記載のアズレン系化合物の作製方法。

【請求項5】

抗炎症薬の作製における請求項１に記載のアズレン系化合物の使用。

【請求項6】

前記抗炎症薬は、前記アズレン系化合物を、薬学的に許容される担体または賦形剤に直接または間接的に投入して作製した経口剤または注射剤であり、前記経口剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、脂肪乳剤、マイクロカプセルまたは滴丸であり、前記注射剤は、注射液または粉末注射剤である、ことを特徴とする請求項５に記載のアズレン系化合物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医薬の技術分野に属し、具体的にアズレン系化合物及びその製造方法と使用に関し、特に抗炎症薬の作製における使用に関するものである。

【背景技術】

【0002】

炎症は、例えば、病原体、損傷された細胞、刺激物といった有害な刺激に対する組織の複雑な生物学的応答である。これは通常、有害な刺激を除去し、組織の治癒過程を起こさせるための生物体による保護的な試みである。しかし、炎症は、十分に制限されないと、さまざまな病気の発症を招く可能性がある。体の免疫反応状態が異常になる場合には、不適切や過剰な免疫反応を引き起こし、組織や細胞を損傷して炎症が引き起こす可能性がある。免疫反応による組織損傷は、例えば、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹といったＩ型アレルギーと、抗基底膜糸球体腎炎といったＩＩ型アレルギーと、免疫複合体の沈着による糸球体腎炎といったＩＩＩ型アレルギーと、結核、腸チフスといったＩＶ型アレルギーと、さらに、リンパ性甲状腺炎、潰瘍性大腸炎などの多くの自己免疫疾患と、のさまざまな型の過敏反応で最も一般的である。

【0003】

ライラックは、モクセイ科ライラック属の植物としてのライラック（Ｓｙｒｉｎｇａ ｏｂｌａｔａ Ｌｉｎｄｌ．）である。その根、茎、葉及び心材は、薬として利用可能であり、暑さや湿気の取り除き、抗菌、抗肝炎などの機能を有し、ライラックの根及び心材は、モンゴル医学で心臓の熱さやうずき、めまい、不眠症、動悸、喘息、および「ヘイ」病（Ｋｈｉｉｇｅｎｏｕｓ）の治療に用いられている。ライラックは、観賞用の花として我が国で広く栽培されて資源が豊富であるが、その薬用の開発が主に葉に対する開発に注目されており、その茎に関する研究や報告が少なく、その薬効や薬効成分について深く研究や開発が必要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、ライラックの茎の化学成分に対して深く研究し、ライラックの茎におけるアズレン系化合物の作製方法及びその使用を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

アズレン系化合物であって、互いに異性体（Ｉｓｏｍｅｒｉｄｅ）となる２つの化合物１及び化合物２を備え、化学名が８－（１，２－ジヒドロキシプロパン－２－イル）－２－ヒドロキシ－１，１０－ジメチル－９－ジヒドロアズレン－３，４－ジオンであり、構造式が、以下の通りである。

【0006】

【0007】

アズレン系化合物。
さらに、上記アズレン系化合物の作製方法は、

【0008】

ライラックの茎の薬用材料を取り、エタノール溶液を投入して抽出し、濾過後に抽出液を収集し、抽出液をエキス（Ｅｘｔｒａｃｔｕｍ）として濃縮するステップ（１）と、

【0009】

エキスを取り、水で分散し、ジクロロメタン、酢酸エチルで順に抽出し、２つの溶媒抽出液及び水を収集し、溶媒を減圧・濃縮して乾燥することにより、ジクロロメタン抽出部位、酢酸エチル抽出部位及び水部位を得るステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた酢酸エチル抽出部位を取り、クロマトグラフィーによる分離精製を行い、前記アズレン系化合物を得るステップ（３）と、を備える。
さらに、ステップ（３）におけるクロマトグラフィーによる分離精製は、具体的に、

【0010】

ステップ（２）で得られた酢酸エチル抽出部位を取ってメタノールで溶解し、シリカゲルを投入して試料攪拌を行い、シリカゲルカラムへ試料を添加し、カラムクロマトグラフィーによる分離を行い、体積比の異なる石油エーテル－アセトンによりグラジエント溶出を行い、１１個のフラクション（Ｆｒａｃｔｉｏｎ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１を得るステップＡと、

【0011】

フラクション４を取り、ＯＤＳ中圧でクロマトグラフィーによる分離を作製し、体積濃度の異なるメタノール－水でグラジエント溶出を行い、５個のフラクションＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅを得るステップＢと、

【0012】

フラクションＢを取って液相クロマトグラフィーによる分離を作製し、体積濃度が１３％であるアセトニトリル－水で溶出し、各クロマトグラフィーピークのピーク時間に応じてフラクションを収集し、各フラクションを濃縮して純粋な化合物１、２の結晶を得るステップＣと、を備える。

【0013】

さらに、ステップ（１）におけるエタノール溶液は、５～９５％体積濃度のエタノール水溶液であり、前記抽出方法は、冷浸法、浸透法（Ｐｅｒｃｏｌａｔｉｏｎ）、マイクロ波抽出法、超音波抽出法、還流抽出法または連続還流抽出法である。

【0014】

さらに、ステップ（１）における抽出回数は、１～３回であり、エタノール溶液の投入量とライラックの茎の薬用材料との質量比は、（８～３０）：１であり、ステップ（２）におけるジクロロメタン、酢酸エチル抽出の回数は、それぞれ４～６回であり、毎回のジクロロメタン、酢酸エチルの使用量は、抽出される液の体積の１／２～１／４である。

【0015】

さらに、ステップＡにおいて、試料攪拌用のシリカゲルは、１００～２００メッシュであり、前記酢酸エチル抽出部位と試料攪拌用のシリカゲルとの質量比は、１：１０であり、前記シリカゲルカラムは、２００～３００メッシュのシリカゲルカラムであり、グラジエント溶出が行われる石油エーテル－アセトンの体積比は、それぞれ５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、０：１である。

【0016】

さらに、ステップＢにおいて、グラジエント溶出が行われるメタノール－水の体積濃度は、それぞれ５％、１５％、３０％、５０％、７０％、１００％であり、前記ＯＤＳ中圧でクロマトグラフィーを作製するクロマトグラフィー条件は、ＯＤＳ－Ｃ１８のクロマトグラフィーカラム、８００×２５ｍｍのクロマトグラフィーカラムサイズ、２０～４５μｍの粒度、３０ｍｌ／ｍｉｎの流速、２５℃のカラム温度である。

【0017】

さらに、ステップＣにおいて、液相クロマトグラフィーを作製するクロマトグラフィー条件は、ＹＭＣ－Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８のクロマトグラフィーカラム、２５０×２０ｍｍのクロマトグラフィーカラムサイズ、５μｍの粒度、１０ｍｌ／ｍｉｎの流速である。
本発明は、抗炎症薬の作製における上記アズレン系化合物の使用をさらに提供する。

【0018】

本発明は、上記アズレン系化合物を、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、接着剤等の薬学的に許容され通常に使用される各種の補助材料に直接または間接的に投入して経口剤または注射剤を作製してもよい。

【0019】

前記経口剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、脂肪乳剤、マイクロカプセル、滴丸であり、前記注射剤は、注射液または粉末注射剤である。

【発明の効果】

【0020】

有益効果：本発明に係るアズレン系化合物の作製方法は、操作が簡単であり、分離により純粋な化合物が得られる。実験によると、本発明に係るアズレン系化合物は、２４ｈ内でＲＡＷ２６４．７マクロファージの増殖対する明な影響がなく、ＬＰＳで誘発されるＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ放出と、細胞におけるＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αの過剰分泌が顕著に抑制される。従って、本発明に係る化合物は、抗炎症薬の作製に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１は、本発明に係るアズレン系化合物の化学平面図である。

【図2】図２は、本発明に係るアズレン系化合物のＥＣＤ測定値及び計算値スペクトルグラムである。

【図3】図３は、本発明に係る化合物１の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルグラムである。

【図4】図４は、本発明に係る化合物１の^１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルグラムである。

【図5】図５は、本発明に係る化合物１の質量スペクトルグラムである。

【図6】図６は、本発明に係る化合物１のＤＥＰＴ炭素スペクトルグラムである。

【図7】図７は、本発明に係る化合物１のＨＭＢＣ炭素スペクトルグラムである。

【図8】図８は、本発明に係る化合物１のＨＳＱＣ炭素スペクトルグラムである。

【図9】図９は、本発明に係る化合物１のＮＯＥＳＹ炭素スペクトルグラムである。

【図10】図１０は、本発明に係る化合物１のＨ－Ｈ－ＣＯＳＹ炭素スペクトルグラムである。

【図11】図１１は、本発明に係る化合物２の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルグラムである。

【図12】図１２は、本発明に係る化合物２の^１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルグラムである。

【図13】図１３は、本発明に係る化合物２の質量スペクトルグラムである。

【図14】図１４は、本発明に係る化合物２のＤＥＰＴ炭素スペクトルグラムである。

【図15】図１５は、本発明に係る化合物２のＨＭＢＣ炭素スペクトルグラムである。

【図16】図１６は、本発明に係る化合物２のＨＳＱＣ炭素スペクトルグラムである。

【図17】図１７は、本発明に係る化合物２のＮＯＥＳＹ炭素スペクトルグラムである。

【図18】図１８は、本発明に係る化合物２のＨ－Ｈ－ＣＯＳＹ炭素スペクトルグラムである。

【図19】図１９は、ＲＡＷ２６４．７細胞活性に対する本発明に係る化合物１の影響の模式図である。

【図20】図２０は、ＲＡＷ２６４．７細胞活性に対する本発明に係る化合物２の影響の模式図である。

【図21】図２１は、ＬＰＳで誘発されるＲＡＷ２６４．７細胞脂質過酸化反応に対する本発明に係る化合物１の影響の模式図である。

【図22】図２２は、ＬＰＳで誘発されるＲＡＷ２６４．７細胞脂質過酸化反応に対する本発明に係る化合物２の影響の模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下、本発明に係る実施例における技術案を明確かつ完全に説明するが、記載の実施例が本発明の一部の実施例に過ぎずその全体ではないことは、明らかである。当業者であれば、本発明における実施例に基づいて、創造的な労働付かずに取得する他のすべての実施例は、何れも本発明の保護請求範囲に属する。

【0023】

本発明に係る実施例に関連する試剤は、特に断りのない限り、いずれも市販品であり、商業ルートにより購入できるものである。
実施例１

【0024】

本実施例は、ライラックにおけるアズレン系化合物であって、互いに異性体となる２つの化合物１及び化合物２を備え、化学名が８－（１，２－ジヒドロキシプロパン－２－イル）－２－ヒドロキシ－１，１０－ジメチル－９－ジヒドロアズレン－３，４－ジオンであり、構造式が、以下の通りである。

【0025】

【0026】

アズレン系化合物を提供する。
上記ライラックにおけるアズレン系化合物の作製方法は、

【0027】

乾燥したライラックの茎の薬用材料を取り、８倍量の７０％（体積濃度）エタノールを投入し、加熱・還流抽出を３回行い、時間をそれぞれ２時間、２時間、１時間とし、濾過して抽出液を併せて、アルコール臭がなくなるまで減圧・濃縮することにより、エキスを抽出物として得るステップ（１）と、

【0028】

エキスを取り、水で分散し、ジクロロメタンで５回、酢酸エチルで５回順に抽出し、毎回のジクロロメタン、酢酸エチルの使用量を抽出される液の体積の１／３とし、２つの溶媒抽出液及び水を収集し、溶媒を減圧・濃縮して乾燥することにより、ジクロロメタン抽出部位、酢酸エチル抽出部位及び水部位を得るステップ（２）と、

【0029】

ステップ（２）で得られた酢酸エチル抽出部位を取り、メタノールで完全に溶解し、１００～２００メッシュのシリカゲルを投入して乾式試料攪拌を行い、予め充填された２００～３００メッシュのシリカゲルカラムへ試料を添加し、カラムクロマトグラフィーによる分離を行い、石油エーテル－アセトン（体積比が５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、０：１である）でグラジエント溶出を行い、シリカゲルＧＦ２５４及びＧ薄層板で識別し、類似スポット含有のフラクションを併せて１１個のフラクション１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１を得、フラクション４を取ってメタノールで溶解し、濾過し、濾液をＯＤＳ中圧でクロマトグラフィーによる分離を作製し、５％、１５％、３０％、５０％、７０％、１００％のメタノール－水でグラジエント溶出を行い、シリカゲルＧＦ２５４及び薄層板で検査し、類似スポット含有のフラクションを併せ、濃縮・乾燥することにより、５個のフラクションＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅを得、フラクションＢを取って５０％のアセトニトリルで溶解し、濾過し、液相クロマトグラフィーによる分離を作製し、１３％のアセトニトリル－水で溶出し、各クロマトグラフィーピークのピーク時間に応じてフラクションを収集し、各フラクションを濃縮して純粋な化合物１（２００ｍｇ）、２（４５０ｍｇ）の結晶を得、ただし、ＨＰＬＣ面積正規化法で検出される両化合物の純度は、いずれも９８％以上であるステップ（３）と、を備える。

【0030】

ただし、ＯＤＳ中圧でクロマトグラフィーを作製するクロマトグラフィー条件は、ＯＤＳ－Ｃ１８のクロマトグラフィーカラム、８００×２５ｍｍのクロマトグラフィーカラムサイズ、２０～４５μｍの粒度、３０ｍｌ／ｍｉｎの流速、２５℃のカラム温度である。

【0031】

液相クロマトグラフィーを作製するクロマトグラフィー条件は、ＹＭＣ－Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８のクロマトグラフィーカラム、２５０×２０ｍｍのクロマトグラフィーカラムサイズ、５μｍの粒度、１０ｍｌ／ｍｉｎの流速である。
実施例２
本実施例は、ライラックにおけるアズレン系化合物を提供し、その作製方法は、

【0032】

乾燥したライラックの茎の薬用材料を取り、１５倍量の８０％濃度のエタノールを投入し、冷浸法で抽出し、毎回２４時間で冷浸を２回行い、濾過して抽出液を併せて、アルコール臭がなくなるまで減圧・濃縮することにより、エキスを抽出物として得るステップ（１）と、

【0033】

エキスを取り、水で分散し、ジクロロメタンで４回、酢酸エチルで４回順に抽出し、毎回のジクロロメタン、酢酸エチルの使用量を抽出される液の体積の１／２とし、２つの溶媒抽出液及び水を収集し、溶媒を減圧・濃縮して乾燥することにより、ジクロロメタン抽出部位、酢酸エチル抽出部位及び水部位を得るステップ（２）と、

【0034】

ステップ（２）で得られた酢酸エチル抽出部位を取り、メタノールで完全に溶解し、１００～２００メッシュのシリカゲルを投入して乾式試料攪拌を行い、予め充填された２００～３００メッシュのシリカゲルカラムへ試料を添加し、カラムクロマトグラフィーによる分離を行い、石油エーテル－アセトン（体積比が５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、０：１である）でグラジエント溶出を行い、シリカゲルＧＦ２５４及びＧ薄層板で識別し、類似スポット含有のフラクションを併せて１１個のフラクション１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１を得、フラクション４を取ってメタノールで溶解し、濾過し、濾液をＯＤＳ中圧でクロマトグラフィーによる分離を作製し、５％、１５％、３０％、５０％、７０％、１００％のメタノール－水でグラジエント溶出を行い、シリカゲルＧＦ２５４及び薄層板で検査し、類似スポット含有のフラクションを併せ、濃縮・乾燥することにより、５個のフラクションＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅを得、フラクションＢを取って５０％のアセトニトリルで溶解し、濾過し、液相クロマトグラフィーによる分離を作製し、１３％のアセトニトリル－水で溶出し、各クロマトグラフィーピークのピーク時間に応じてフラクションを収集し、各フラクションを濃縮して純粋な化合物１、２の結晶を得、ただし、ＨＰＬＣ面積正規化法で検出される両化合物の純度は、いずれも９８％以上であるステップ（３）と、を備える。

【0035】

その他は、実施例１と同じである。
実施例３
本実施例は、ライラックにおけるアズレン系化合物を提供し、その作製方法は、

【0036】

乾燥したライラックの茎の薬用材料を取り、３０倍量の９５％濃度のエタノールを投入し、浸透法で抽出し、１週間浸透させ、濾過して抽出液を併せて、アルコール臭がなくなるまで減圧・濃縮することにより、エキスを抽出物として得るステップ（１）と、

【0037】

エキスを取り、水で分散し、ジクロロメタンで６回、酢酸エチルで６回順に抽出し、毎回のジクロロメタン、酢酸エチルの使用量を抽出される液の体積の１／４とし、２つの溶媒抽出液及び水を収集し、溶媒を減圧・濃縮して乾燥することにより、ジクロロメタン抽出部位、酢酸エチル抽出部位及び水部位を得るステップ（２）と、

【0038】

ステップ（２）で得られた酢酸エチル抽出部位を取り、メタノールで完全に溶解し、１００～２００メッシュのシリカゲルを投入して乾式試料攪拌を行い、予め充填された２００～３００メッシュのシリカゲルカラムへ試料を添加し、カラムクロマトグラフィーによる分離を行い、石油エーテル－アセトン（体積比が５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、０：１である）でグラジエント溶出を行い、シリカゲルＧＦ２５４及びＧ薄層板で識別し、類似スポット含有のフラクションを併せて１１個のフラクション１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１を得、フラクション４を取ってメタノールで溶解し、濾過し、濾液をＯＤＳ中圧でクロマトグラフィーによる分離を作製し、５％、１５％、３０％、５０％、７０％、１００％のメタノール－水でグラジエント溶出を行い、シリカゲルＧＦ２５４及び薄層板で検査し、類似スポット含有のフラクションを併せ、濃縮・乾燥することにより、５個のフラクションＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅを得、フラクションＢを取って５０％のアセトニトリルで溶解し、濾過し、液相クロマトグラフィーによる分離を作製し、１３％のアセトニトリル－水で溶出し、各クロマトグラフィーピークのピーク時間に応じてフラクションを収集し、各フラクションを濃縮して純粋な化合物１、２の結晶を得、ただし、ＨＰＬＣ面積正規化法で検出される両化合物の純度は、いずれも９８％以上であるステップ（３）と、を備える。
その他は、実施例１と同じである。
実施例４
本実施例は、ライラックにおけるアズレン系化合物を提供し、その作製方法におけるステップ（１）は、

【0039】

乾燥したライラックの茎の薬用材料を取り、２０倍量の５％（体積濃度）エタノールを投入し、加熱・還流抽出を３回行い、時間をそれぞれ３時間、２時間、１時間とし、濾過して抽出液を併せて、アルコール臭がなくなるまで減圧・濃縮することにより、エキスを抽出物として得ることである。
その他は、実施例１と同じである。
一、本発明に係る化合物の構造解析

【0040】

その構造は、主に紫外、赤外、質量スペクトル、核磁気共鳴（^１Ｈ－ＮＭＲ、^１３Ｃ－ＮＭＲ、２Ｄ－ＮＭＲ）などの分光法技術により鑑定され、具体的なスペクトルグラムが図 ２～１８に示され、そのスペクトルデータ及び解析過程は、以下の通りである。

【0041】

（１）実施例１で得られた化合物１、２を取って構造解析を行い、ただし、化合物１、２は淡黄色の非晶質粉末であり、高分解能質量スペクトルＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＳｍ／ｚが３０１．１０４６［Ｍ＋Ｎａ］_＋である。

【0042】

化合物１及び化合物２は、分子式がいずれもＣ_１５Ｈ_１８Ｏ_５であり、正確な分子量が２７８．１１５４であり、不飽和度が７である。且つ、両化合物の^１Ｈ ＮＭＲ、^１３Ｃ ＮＭＲ、ＨＭＢＣ、ＤＥＰＴ及びＨＳＱＣスペクトルグラムは、ほぼ一致している。

【0043】

^１Ｈ ＮＭＲ、^１３Ｃ ＮＭＲを総合的に分析して分かるように、化合物の構造には、３つのメチル基［δＣ２４．２，２３．５及び１１．０（それぞれがＣ－１１，Ｃ－１５及びＣ－１２に対応する），δＨ２．０６（ｓ，Ｍｅ－１２），δＨ１．３８（ｓ，Ｍｅ－１５）及びδＨ１．３７（ｓ，Ｍｅ－１１）］と、２つのメチレン基［δＣ６９．１及び３８．６（それぞれがＣ－１４及びＣ－９である），δＨ３．６５（ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，Ｈ－１４ａ）及びδＨ３．５３（ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，Ｈ－１４ｂ），δＨ３．０２（ｄ，Ｊ＝１７．７Ｈｚ，Ｈ－９ａ）及び２．００（ｄｄ，Ｊ＝２．０，１７．６Ｈｚ，Ｈ－９ｂ）］と、２つのメチン［δＣ１２６．２及び１２５．５（それぞれがＣ－５及びＣ－７に対応する），δＨ６．７８（ｓ，Ｈ－５），δＨ６．４９（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｈ－７）］と、８つの四級炭素［δＣ１８９．３，１８１．８，１７１．２，１６０．０，１４７．０，１３５．９，７６．６及び４５．７（それぞれがＣ－３，Ｃ－４，Ｃ－８，Ｃ－６，Ｃ－２，Ｃ－１，Ｃ－１３及びＣ－１０である）］と、が存在している。

【0044】

ＨＭＢＣ、ＤＥＰＴ及びＨＳＱＣスペクトルなどの２次元核磁気共鳴スペクトルデータを組み合わせることで化合物の平面構造が確定され、その化学平面構造式が図１に示され、化学名が８－（１，２－ジヒドロキシプロパン－２－イル）－２－ヒドロキシ－１，１０－ジメチル－９－ジヒドロアズレン－３，４－ジオンである。この化合物には、２つのキラル中心、つまりＣ－１０及びＣ－１３があるため、この平面構造には、（１０Ｒ，１３Ｓ）、（１０Ｓ，１３Ｒ）、（１０Ｒ，１３Ｒ）、（１０Ｓ，１３Ｓ）という４つの立体配置がある。測定された電子円二色性スペクトル（ＥＣＤ）と理論的に計算された（Ｇａｕｓｓｉａｎ ０９Ｗソフトウェアによって計算された）ＥＣＤスペクトルグラムとを比べて確定できるように、化合物の絶対配置は、（１０Ｒ，１３Ｒ）及び（１０Ｒ，１３Ｓ）であり、具体的なスペクトルグラムが図２に示される。ＮＯＥＳＹスペクトルデータから分かるように、化合物１のＣ－１１、Ｃ－１２、Ｃ－１５メチル水素関連信号があるが、化合物２にはＣ－１１及びＣ－１２メチル水素の関連信号のみが生成されるため、化合物１及び化合物２の絶対配置がそれぞれ（１０Ｒ，１３Ｒ）及び（１０Ｒ，１３Ｓ）であることは判定でき、その構造式が実施例１に示される。
（２）化合物１、２のスペクトルデータは、以下のようにまとめられる。

【0045】

化合物１：^１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ６．７９（ｓ，１Ｈ，Ｈ－５），６．４９（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－７），３．７０（ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－１４ａ），３．６２（ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－１４ｂ），３．１４（ｄ，Ｊ＝１７．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－９ａ），２．４３（ｄｄ，Ｊ＝１７．６，２．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－９ｂ），２．０７（ｓ，３Ｈ，Ｈ－１２），１．３８（ｓ，３Ｈ，Ｈ－１５），１．３６（ｓ，３Ｈ，Ｈ－１１）。

【0046】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ１８７．９（Ｃ－３），１８０．５（Ｃ－４），１６９．７（Ｃ－８），１５８．７（Ｃ－６），１４５．６（Ｃ－２），１３４．６（Ｃ－１），１２４．７（Ｃ－５），１２４．１（Ｃ－７），７４．９（Ｃ－１３），６８．１（Ｃ－１４），４４．２（Ｃ－１０），３７．０（Ｃ－９），２２．９（Ｃ－１１），２２．１（Ｃ－１５），９．６（Ｃ－１２）。

【0047】

化合物２：^１ＨＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ６．７９（ｓ，１Ｈ，Ｈ－５），６．５１（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－７），３．６８（ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－１４ａ），３．５６（ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－１４ｂ），３．０５（ｄ，Ｊ＝１７．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－９ａ），２．４７（ｄｄ，Ｊ＝１７．６，２．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－９ｂ），２．０８（ｓ，３Ｈ，Ｈ－１２），１．４０（ｓ，３Ｈ，Ｈ－１５），１．３８（ｓ，３Ｈ，Ｈ－１１）。

【0048】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ１８７．９（Ｃ－３），１８０．４（Ｃ－４），１６９．８（Ｃ－８），１５８．６（Ｃ－６），１４５．６（Ｃ－２），１３４．５（Ｃ－１），１２４．８（Ｃ－５），１２３．６（Ｃ－７），７５．２（Ｃ－１３），６７．７（Ｃ－１４），４４．２（Ｃ－１０），３７．２（Ｃ－９），２２．８（Ｃ－１１），２２．１（Ｃ－１５），９．６（Ｃ－１２）。

【0049】

二、本発明に係る化合物の抗炎症作用についての研究
（一）実験材料及び試薬
１．薬物及び試薬

【0050】

実施例１で作製された２つの化合物１、２（自己抽出、純度９８％以上）；マウス腹腔マクロファージＲＡＷ２６４．７（上海Heng科生物技術株式会社）；ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ／Ｇｉｂｃｏ会社）。ＣＣＫ－８試薬キット、ＩＬ－１β試薬キット、ＩＬ－６試薬キット、ＴＮＦ－α試薬キット、ＤＭＥＭ培地、ペニシリン及びストレプトマイシン混合液（１００×）（北京索来宝科技株式会社）、ＤＭＳＯ、ＬＰＳ（米国ｓｉｇｍａ会社））；一酸化窒素検出試薬キット（上海碧雲天生物技術株式会社）。
２．実験器具

【0051】

ＢＴ １２５Ｄ型電子天秤（北京ザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）科学器具株式会社）；ＳＰＥＣＴＲＯ ｓｔａｒ Ｎａｎｏ全波長マイクロプレートリーダー（ＢＭＧＬＡＢＴＥＣＨ）；Ｆｏｒｍ ３１１型二酸化炭素インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ会社）。
３．被験薬物及び処理方法

【0052】

１２７．８２ｍｇの化合物及び２２７．７９ｍｇの化合物をそれぞれ精密に量り、５ｍｌのメスフラスコに置き、少量のＤＭＳＯで溶解し、ＤＭＥＭ完全培地で希釈して標線の量に調整することにより、化合物濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌ、１９．９８ｍｍｏｌ／Ｌの薬含有のＤＭＥＭ培地母液をそれぞれ取得し、実験中にＤＭＥＭ培地で需要な濃度まで希釈する。ＤＭＳＯの体積比を千分の三以内に制御する。
（二）実験方法

【0053】

１．細胞培養：ＲＡＷ２６４．７細胞を１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン及びストレプトマイシン混合液含有のＤＭＥＭ培地に投入し、５％ＣＯ_２含有、３７℃のインキュベーター中で継代し、隔日継代培養する。
２．ＲＡＷ２６４．７細胞活性に対する両化合物の影響の評価

【0054】

対数増殖期のＲＡＷ２６４．７細胞を取り、１０％ＦＢＳ培養液含有のＤＭＥＭ培地で細胞密度を１×１０^４ｍｌ^－１までに調整し、９６孔板に播種し、薬物濃度の異なる化合物含有の細胞培養液を１００μＬ／孔で９６孔板に入れ、薬物濃度がそれぞれ１２．５、２５、５０、１００、２００、４００μｍｏｌ／Ｌである薬供給群を設計し、正常細胞対照群を別途に設定し、正常群に薬物なしの細胞培養液を添加し、各群で６個の複数孔とする。３７℃、５％ＣＯ_２で２４ｈ培養した後、上清を捨て、１０％ＣＣＫ－８溶液を１孔毎に１００μＬを添加し、マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍで吸光度（ＯＤ値）を測定し、細胞生存率を計算する。
ＬＰＳで誘発されるＲＡＷ２６４．７細胞脂質過酸化反応に対する両化合物の影響の評価

【0055】

（１）標準曲線の描き方：標準品を濃度が０、１．５６、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００ｍＭである溶液に希釈し、等量のＧｒｉｅｓｓ試薬を添加し、マイクロプレートリーダーにより波長５５０ｎｍで吸光度を測定し、標準曲線を描く。

【0056】

（２）ＬＰＳで誘発されるＲＡＷ２６４．７のＮＯ産生に対する抑制作用をＧｒｉｅｓｓ法により測定する。対数増殖期のＲＡＷ２６４．７細胞を９６孔板に播種し（５×１０^４細胞／孔）、３７℃、５％ＣＯ_２で２４ｈ培養し、旧培地を捨て、薬供給群の孔毎に薬含有のＤＭＥＭ培地（低用量５０μｍｏｌ／Ｌ、中用量１００μｍｏｌ／Ｌ、高用量２００μｍｏｌ／Ｌ）を１００μＬ添加し、モデル群及びブランク群の孔毎に１００μＬのブランク培地を添加し、１ｈ培養した後、ブランク群を除く残りの各群に１００μＬのＬＰＳ（２μｇ／ｍｌ）溶液を添加し、２４ｈ培養し続いた後、各孔から５０μＬの上清を新たな９６孔板に吸い取り、５０μＬのＧｒｉｅｓｓI液及び５０μＬのＧｒｉｅｓｓＩＩ液を順次添加し、マイクロプレートリーダーにより５５０ｎｍでそのＯＤ値を測定し、ＮＯ抑制率を計算する。
４．炎症因子ＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αの含有量をＥＬＩＳＡ法により検出する

【0057】

試験群の分割、モデリング及び薬供給プロセスをステップ３（２）と同じようにとし、細胞上清を収集し、細胞因子検出試薬キットの操作説明に従って３、６、１２、２４ｈでの各試験群のＲＡＷ２６４．７細胞上清におけるＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αの分泌量を測定する。
５．データ処理及び分析

【0058】

データをＥｘｃｅｌソフトウェアによりｔ検定分析を行い、結果を「ｘ±ｓ」で表す。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．２ソフトウェアによりヒストグラムを描く。
（三）実験結果
１．ＲＡＷ２６４．７細胞活性に対する両化合物の影響の評価結果

【0059】

ＣＣＫ－８法による検出結果を図１９、２０に示すように、４００μｍｏｌ／Ｌの場合、両化合物は２４ｈ内でＲＡＷ２６４．７マクロファージの増殖に対して明らかに影響しない。
２．ＬＰＳで誘発されるＲＡＷ２６４．７細胞脂質過酸化反応に対する両化合物の影響の評価
ＬＰＳで誘発されるＲＡＷ２６４．７細胞ＮＯ放出に対する両化合物の影響の結果を下記の表１及び図２１、２２に示す。

【0060】

分析の結果、化合物１、２のモデル群と対照群とを比べて分かるように、両者が極めて顕著的な差があり（Ｐ＜０．０１）、ＬＰＳ刺激によりＲＡＷ２６４．７細胞におけるＮＯ産生が顕著的に増加されてモデリングが成功した。薬供給群とモデル群とを比べて分かるように、化合物１、２の高、中用量群には極めて顕著的な差があり（Ｐ＜０．０１）、低用量群には顕著的な差があり（Ｐ＜０．０５）、化合物１、２が、ＬＰＳにより刺激されるＲＡＷ２６４．７細胞におけるＮＯ産生に対して明らかな抑制作用を奏する。

【0061】

表１ ＬＰＳで誘発されるＲＡＷ２６４．７細胞脂質過酸化反応に対する両化合物の影響

【0062】

３．炎症因子ＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αの含有量をＥＬＩＳＡ法により検出する

【0063】

実験結果を表２、３に示すように、モデル群とブランク群とを比べて分かるように、ＬＰＳ刺激後、モデル群の細胞上清におけるＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αの含有量は、いずれも極めて顕著的に上昇し、モデリングは成功した。薬供給群とモデル群とを比べて分かるように、化合物１、２の高用量群、化合物２の中用量群におけるＩＬ－１βの含有量は、４つの時点でいずれも極めて顕著的な下降傾向を表現し、また、化合物１の中用量群におけるＩＬ－１βもある程度の下降傾向を表現し、且つ、両化合物は、同じ時点で用量依存関係を表現し、化合物１の高用量群におけるＩＬ－６の含有量は、４つの時点でいずれも極めて顕著的に下降し、化合物１の中用量群及び化合物２の高、中用量群も下降傾向を表現する。化合物１、２の高用量群におけるＴＮＦ－αの含有量は、いずれも極めて顕著的に下降し、一方、化合物１、２における低用量群は、ＴＮＦ－αの含有量に対してある程度の抑制効果を奏し、これから分かるように、化合物１、２は、ＬＰＳ誘発条件でのＲＡＷ２６４．７細胞によるＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αの過剰分泌をある程度に明らかに抑制することができ、化合物１、２が明らかな抗炎症作用を有することは分かった。

【0064】

表２ ＬＰＳ誘発でのＲＡＷ２６４．７細胞の炎症因子ＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－α分泌に対する化合物１の影響

【0065】

表３ ＬＰＳ誘発でのＲＡＷ２６４．７細胞の炎症因子ＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－α分泌に対する化合物２の影響

【0066】

備考：上記の表１、２、３及び図２１、２２において、^＃はモデル群とブランク群との比較を意味し、^＃はＰ＜０．０５を表し、^＃＃はＰ＜０．０１を表し、^＊は化合物（高、中、低）用量群とモデル群との比較を意味し、^＊はＰ＜０．０５を表し、^＊＊はＰ＜０．０１を表す。

【0067】

最後に、上記は本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明を限定するためのものではなく、前述実施例を参照しながら本発明を詳細に説明したが、当業者にとっては、依然として前述実施例に記載の技術案を修正したりその一部の技術特徴を同等に置き換えたりしてもよい。本発明の精神及び原理でなされたあらゆる修正、同等置換、改善などは、いずれも本発明の保護範囲に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【国際調査報告】