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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-02
(54)【発明の名称】改善された抗がん活性を有するＴ細胞の選択方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20240126BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240126BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02 ZNA
C12N5/0783
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023550709
(86)(22)【出願日】2021-11-05
(85)【翻訳文提出日】2023-07-07
(86)【国際出願番号】 EP2021080796
(87)【国際公開番号】W WO2022096659
(87)【国際公開日】2022-05-12
(31)【優先権主張番号】20306327.6
(32)【優先日】2020-11-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517001192
【氏名又は名称】メタフォラ，バイオシステムズ
(71)【出願人】
【識別番号】514124403
【氏名又は名称】ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ
(71)【出願人】
【識別番号】523083735
【氏名又は名称】セントレ ナショナル デ ラ リシェルシェ サイエンティフィケ
(71)【出願人】
【識別番号】516344465
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ ドゥ モンペリエ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】テイラー，ナオミ
(72)【発明者】
【氏名】プゾル，マリー シャルロット シャンタル
(72)【発明者】
【氏名】ダーダルホン，バレリ
(72)【発明者】
【氏名】プティ，ヴィンセント
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QX02
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA43
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、改善された抗がん活性を有するＴ細胞を選択する方法であって、ａ）Ｔ細胞集団の細胞表面で、ＧＬＵＴ１リガンドを用いてグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）発現レベルを定量化すること、ｂ）ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞を選択すること、を含み、ＧＬＵＴ１発現レベルが低い前記Ｔ細胞が改善された抗がん活性を有する方法に関する。本発明はまた、がんの処置に使用するための改善された抗がん活性を有するＴ細胞集団、改善された抗がん活性を有するＴ細胞を選択するためのＧＬＵＴ１リガンドの使用、及びＴ細胞の抗がん治療有効性のバイオマーカーとしてのＧＬＵＴ１の使用に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
改善された抗がん活性を有するＴ細胞を選択する方法であって、ａ）Ｔ細胞集団の細胞表面でＧＬＵＴ１リガンドを用いてグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）発現レベルを定量化すること、
ｂ）ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞を選択すること、
を含み、
ＧＬＵＴ１発現レベルが低い前記Ｔ細胞が改善された抗がん活性を有する方法。
【請求項2】
ａ０）それらの細胞表面でＧＬＵＴ１を発現する、又はそれらの細胞表面でＧＬＵＴ１を発現し易いＴ細胞集団を、ＧＬＵＴ１リガンドと接触させること、ａ１）前記Ｔ細胞の細胞表面におけるＧＬＵＴ１に対する前記ＧＬＵＴ１リガンドの結合を検出及び／又は定量化すること、
ａ２）前記Ｔ細胞の細胞表面におけるＧＬＵＴ１発現レベルを定量化すること、
ｂ）ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞を選択すること、及び
ｃ）任意に、ＧＬＵＴ１発現レベルが低い選択されたＴ細胞を単離すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＧＬＵＴ１発現レベルが低い前記Ｔ細胞が、全ＧＬＵＴ１＋Ｔ細胞集団の中でＧＬＵＴ１発現レベルが最も低い多くて５０％、４０％、３０％、２０％、１０％又は５％の分画に対応する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記Ｔ細胞の細胞表面におけるＧＬＵＴ１発現レベルの定量化が、フローサイトメトリーによって行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
がんの処置で使用するための改善された抗がん活性を有するＴ細胞集団であって、請求項１～４に記載の方法によって選択されるＴ細胞集団。
【請求項6】
改善された抗がん活性を有するＴ細胞を選択するためのグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）リガンドの使用。
【請求項7】
前記ＧＬＵＴ１リガンドが標識される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法、請求項５に記載の使用のためのＴ細胞集団、又は請求項６に記載の使用。
【請求項8】
前記ＧＬＵＴ１リガンドが、霊長類Ｔリンパ球向性ウイルス（ＰＴＬＶ）のエンベロープ糖タンパク質の可溶性部分に由来する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むか、又は抗体若しくはその抗原結合断片を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法、使用、又は使用のためのＴ細胞集団。
【請求項9】
前記ＧＬＵＴ１リガンドが、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）、Ｔ細胞白血病ウイルス２型（ＨＴＬＶ－２）、Ｔ細胞白血病ウイルス３型（ＨＴＬＶ－３）、Ｔ細胞白血病ウイルス４型（ＨＴＬＶ－４）、サルＴ細胞白血病ウイルス１型（ＳＴＬＶ－１）、サルＴ細胞白血病ウイルス２型（ＳＴＬＶ－２）、サルＴ細胞白血病ウイルス３型（ＳＴＬＶ－３）、又はサルＴ細胞白血病ウイルス５型（ＳＴＬＶ－５）のエンベロープ糖タンパク質の可溶性部分に由来する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む、請求項８に記載の方法、使用、又は使用のためのＴ細胞集団。
【請求項10】
前記ＧＬＵＴ１リガンドが、Ｔ細胞白血病ウイルス２型（ＨＴＬＶ－２）のエンベロープ糖タンパク質の可溶性部分に由来する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む、請求項９に記載の方法、使用、又は使用のためのＴ細胞集団。
【請求項11】
前記受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）が、配列番号１５のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項１０に記載の方法、使用、又は使用のためのＴ細胞集団。
【請求項12】
Ｔ細胞の抗がん治療有効性のバイオマーカーとしてのグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）の使用。
【請求項13】
前記Ｔ細胞が、従来のＣＤ４＋Ｔ細胞、従来のＣＤ８＋Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞及びダブルネガティブ（ＤＮ）Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法、使用、又は使用のためのＴ細胞集団。
【請求項14】
前記Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法、使用、又は使用のためのＴ細胞集団。
【請求項15】
前記がんは血液がん又は固形腫瘍である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法、使用、又は使用のためのＴ細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、がんを処置するための細胞治療の分野に関する。特に、本発明は、改善された抗がん活性を有するＴ細胞を選択する方法であって、ａ）Ｔ細胞集団の細胞表面におけるグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）の発現レベルを、ＧＬＵＴ１リガンドを用いて定量化すること、ｂ）ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞を選択することを含み、ＧＬＵＴ１発現レベルが低い前記Ｔ細胞が改善された抗がん活性を有する方法に関する。本発明はまた、がんの処置に使用するための改善された抗がん活性を有するＴ細胞集団、改善された抗がん活性を有するＴ細胞を選択するためのＧＬＵＴ１リガンドの使用、及びＴ細胞の抗がん治療有効性のバイオマーカーとしてのＧＬＵＴ１の使用にも関する。
本発明は、がんを処置するための細胞治療の分野に関する。特に、本発明は、改善された抗がん活性を有するＴ細胞を選択する方法であって、ａ）Ｔ細胞集団の細胞表面におけるグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）の発現レベルを、ＧＬＵＴ１リガンドを用いて定量化すること、ｂ）ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞を選択することを含み、ＧＬＵＴ１発現レベルが低い前記Ｔ細胞が改善された抗がん活性を有する方法に関する。本発明はまた、がんの処置に使用するための改善された抗がん活性を有するＴ細胞集団、改善された抗がん活性を有するＴ細胞を選択するためのＧＬＵＴ１リガンドの使用、及びＴ細胞の抗がん治療有効性のバイオマーカーとしてのＧＬＵＴ１の使用にも関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
がんの処置のためのＴ細胞療法の開発は大きく進歩している。しかし、養子移入されたＴ細胞の存続及び機能を最適化することは依然として課題であり、その結果、新しい戦略の探索及び開発が行われている。
がんの処置のためのＴ細胞療法の開発は大きく進歩している。しかし、養子移入されたＴ細胞の存続及び機能を最適化することは依然として課題であり、その結果、新しい戦略の探索及び開発が行われている。
【0003】
Ｔ細胞の増殖及び機能に影響を与える重要な一態様は、宿主環境である。養子移入Ｔリンパ球の活性化及びエフェクター機能は、エネルギー需要及び生合成需要の増加に関連し、一般的に栄養素の流入と利用の増加によって保証されている。実際に、細胞表面でのグルコース及びアミノ酸輸送体のＴＣＲ刺激による上方制御は、最適なＴ細胞の増殖及びエフェクター機能に重要な役割を果たし得る。しかし重要なことに、別々のＴリンパ球サブセットは異なる代謝プロファイルを示す：エフェクターＴ細胞は、高度に糖分解性であり、脂質生成性でもあるが、抑制性の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、脂質酸化レベルの増加を伴う混合代謝を示す。この点に関して、グルコース、グルタミン又はロイシン輸送などの栄養素輸送が制限されている条件下では、ＴｅｆｆではなくＴｒｅｇの生成が維持されることに注目することは興味深い（Ｍａｃｉｎｔｙｒｅら，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ ２０，６１－７２（２０１４）；Ｎａｋａｙａら Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４０，６９２－７０５（２０１４）；Ｓｉｎｃｌａｉｒら，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４，５００－５０８（２０１３）。
【0004】
さらに、操作された抗腫瘍Ｔ細胞が腫瘍抗原に応答する潜在性は、腫瘍の代謝環境によって負に調節される場合が多い。この環境は、とりわけ、栄養素組成、「老廃」物、酸素濃度、ｐＨ、温度及び物理的な力によって調整される。実際に、がん細胞の制御されない成長は、細胞外環境に直接影響を及ぼし得て、複数の研究により、腫瘍の代謝表現型がその後の免疫応答を支配することがわかっている（Ｍａｙｅｒｓ ＆ Ｖａｎｄｅｒ Ｈｅｉｄｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ７７，３１３１－３１３４（２０１７））で概説されている）。
【発明の概要】
【0005】
腫瘍病変における複雑な細胞、シグナル伝達及び代謝の状況を考慮して、本発明者らは、特に高レベルの栄養素を消費し、嫌気性である場合が多い「敵対的な」腫瘍組織において、最適なインビボＴ細胞抗腫瘍エフェクター機能を促進する代謝特性を解明しようと試みた。この目的のために、本発明者らは、例えば、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）技術を用いて栄養輸送体の発現を具体的に評価し、別々の栄養輸送体プロファイルを有するＴ細胞の亜集団のインビボ抗腫瘍特性を分析した。
【0006】
驚くべきことに、本発明者らは、細胞表面におけるＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞が改善された抗がん活性を示すことを示した。特に、本発明者らは、担がんマウスに養子移入された、細胞表面でのＧＬＵＴ－１発現レベルが低いＴ細胞は、細胞表面でのＧＬＵＴ－１発現レベルが高いＴ細胞よりも腫瘍負荷を減少させることが可能であったことを示した。
【0007】
そのため、本発明者らは、細胞表面における低いＧＬＵＴ１発現レベルに基づいて選択されたＴ細胞が、増加した抗がん活性を示すことを示した。
【0008】
本発明は、改善された抗がん活性を有するＴ細胞を選択する方法であって、
ａ）ＧＬＵＴ１リガンドを用いてＴ細胞集団の細胞表面におけるグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）発現レベルを定量化すること、
ｂ）ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞を選択すること、
を含み、
ＧＬＵＴ１発現レベルが低い前記Ｔ細胞は改善された抗がん活性を有する方法に関する。
ａ）ＧＬＵＴ１リガンドを用いてＴ細胞集団の細胞表面におけるグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）発現レベルを定量化すること、
ｂ）ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞を選択すること、
を含み、
ＧＬＵＴ１発現レベルが低い前記Ｔ細胞は改善された抗がん活性を有する方法に関する。
【0009】
第１の実施形態によれば、前記方法は、
ａ０）それらの細胞表面でＧＬＵＴ１を発現する、又はそれらの細胞表面でＧＬＵＴ１を発現し易いＴ細胞集団を、ＧＬＵＴ１リガンドと接触させること、
ａ１）Ｔ細胞の細胞表面におけるＧＬＵＴ１に対する前記ＧＬＵＴ１リガンドの結合を検出及び／又は定量化すること、
ａ２）Ｔ細胞の細胞表面におけるＧＬＵＴ１発現レベルを定量化すること、
ｂ）ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞を選択すること、及び
ｃ）任意に、ＧＬＵＴ１発現レベルが低い選択されたＴ細胞を単離すること、
を含む。
ａ０）それらの細胞表面でＧＬＵＴ１を発現する、又はそれらの細胞表面でＧＬＵＴ１を発現し易いＴ細胞集団を、ＧＬＵＴ１リガンドと接触させること、
ａ１）Ｔ細胞の細胞表面におけるＧＬＵＴ１に対する前記ＧＬＵＴ１リガンドの結合を検出及び／又は定量化すること、
ａ２）Ｔ細胞の細胞表面におけるＧＬＵＴ１発現レベルを定量化すること、
ｂ）ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞を選択すること、及び
ｃ）任意に、ＧＬＵＴ１発現レベルが低い選択されたＴ細胞を単離すること、
を含む。
【0010】
第２の実施形態によれば、ＧＬＵＴ１発現レベルが低い前記Ｔ細胞は、全ＧＬＵＴ１＋Ｔ細胞集団の中でＧＬＵＴ１発現レベルが最も低い多くて５０％、４０％、３０％、２０％、１０％又は５％の分画に対応する。
【0011】
第３の実施形態によれば、Ｔ細胞の細胞表面におけるＧＬＵＴ１発現レベルの定量化は、フローサイトメトリーによって行われる。
【0012】
本発明はまた、がんの処置で使用するための改善された抗がん活性を有するＴ細胞集団であって、前記Ｔ細胞が本発明の方法によって選択される、Ｔ細胞集団にも関する。
【0013】
本発明はさらに、改善された抗がん活性を有するＴ細胞を選択するためのグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）リガンドの使用にも関する。
【0014】
いくつかの実施形態では、前記ＧＬＵＴ１リガンドは標識される。
【0015】
いくつかの実施形態では、前記ＧＬＵＴ１リガンドは、霊長類Ｔリンパ球向性ウイルス（ＰＴＬＶ）のエンベロープ糖タンパク質の可溶性部分に由来する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むか、又は抗体若しくはその抗原結合断片を含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、前記ＧＬＵＴ１リガンドは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）、Ｔ細胞白血病ウイルス２型（ＨＴＬＶ－２）、Ｔ細胞白血病ウイルス３型（ＨＴＬＶ－３）、Ｔ細胞白血病ウイルス４型（ＨＴＬＶ－４）、サルＴ細胞白血病ウイルス１型（ＳＴＬＶ－１）、サルＴ細胞白血病ウイルス２型（ＳＴＬＶ－２）、サルＴ細胞白血病ウイルス３型（ＳＴＬＶ－３）、又はサルＴ細胞白血病ウイルス５型（ＳＴＬＶ－５）のエンベロープ糖タンパク質の可溶性部分に由来する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、前記ＧＬＵＴ１リガンドは、Ｔ細胞白血病ウイルス２型（ＨＴＬＶ－２）のエンベロープ糖タンパク質の可溶性部分に由来する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、前記受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【0019】
本発明はまた、Ｔ細胞の抗がん治療有効性のバイオマーカーとしてのグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）の使用に関する。
【0020】
いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞は、従来のＣＤ４＋Ｔ細胞、従来のＣＤ８＋Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞及びダブルネガティブ（ＤＮ）Ｔ細胞からなる群から選択される。
【0021】
いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である。
【0022】
いくつかの実施形態では、前記がんは、血液がん又は固形腫瘍である。
【0023】
詳細な説明
本発明は、改善された抗がん活性を有するＴ細胞を選択する方法、好ましくはインビトロ法であって、
ａ）ＧＬＵＴ１リガンドを用いてＴ細胞集団の細胞表面におけるグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）発現レベルを定量化すること、
ｂ）ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞を選択すること
を含み、
ＧＬＵＴ１発現レベルが低い前記Ｔ細胞が改善された抗がん活性を有する、方法に関する。
本発明は、改善された抗がん活性を有するＴ細胞を選択する方法、好ましくはインビトロ法であって、
ａ）ＧＬＵＴ１リガンドを用いてＴ細胞集団の細胞表面におけるグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）発現レベルを定量化すること、
ｂ）ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞を選択すること
を含み、
ＧＬＵＴ１発現レベルが低い前記Ｔ細胞が改善された抗がん活性を有する、方法に関する。
【0024】
ＧＬＵＴ１はグルコースの細胞表面輸送体であり、より正確にはグルコース取り込み輸送体である。本明細書で使用する場合、「ＧＬＵＴ１」は、後生動物、特にヒトによって発現されるグルコース取り込み輸送体を指し、ウイルス、特にヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）によって受容体として使用される。一実施形態では、ＧＬＵＴ１は、ヒトＧＬＵＴ１（受託番号ＮＰ＿００６５０７．２、配列番号１）である。一実施形態では、ＧＬＵＴ１は、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは配列番号１と少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％又はそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる。一実施形態では、ＧＬＵＴ１は、配列番号１の断片、好ましくは少なくとも約１００アミノ酸の断片、より好ましくは少なくとも約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００又は４５０アミノ酸の断片を含むか、又はそれらからなる。
【0025】
一実施形態では、本発明の方法は、ＧＬＵＴ１の発現レベルを決定、測定又は定量化することを含む。
【0026】
本明細書で使用する用語「発現」は、ＧＬＵＴ１コードするｓｌｃ２ａ１遺伝子の転写（すなわちＲＮＡの発現）又はＧＬＵＴ１の翻訳（すなわちタンパク質の発現）、又は細胞の表面におけるＧＬＵＴ１の存在を代替的に指し得る。発現レベルを決定、測定又は定量化する方法は、当業者に周知であり、限定するものではないが、細胞のトランスクリプトーム（発現がｓｌｃ２ａ１又はＧＬＵＴ１の転写に関する実施形態では）又はプロテオーム（発現がＧＬＵＴ１の翻訳に関する実施形態では）を決定することを含む。
【0027】
一実施形態では、ＧＬＵＴ１の発現レベルを「決定する」、「測定する」又は「定量化する」という用語は等価である。本明細書において「ＧＬＵＴ１の発現レベルを定量化する」とは、細胞表面に存在するＧＬＵＴ１を定量化することを意味する。細胞表面に存在するＧＬＵＴ１の発現レベルを定量化することは、細胞表面でＧＬＵＴ１を検出することを含み得る。細胞表面におけるタンパク質の存在を分析する方法は、当業者に周知である。実施形態では、ＧＬＵＴ１の発現レベルの決定、測定又は定量化は、フローサイトメトリー又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって行われる。別の実施形態では、ＧＬＵＴ１の発現レベルの決定、測定又は定量化は、ビーズベースのアッセイ、例えば、磁気ビーズベースのアッセイによって行われる。
【0028】
一実施形態では、ＧＬＵＴ１の発現レベルを決定、測定又は定量化することは、細胞表面に存在するＧＬＵＴ１に対するリガンドの結合を検出及び／又は定量化することに対応する。
【0029】
そのため、本発明の別の目的は、改善された抗がん活性を有するＴ細胞を選択する方法であって、
ａ０）それらの細胞表面でＧＬＵＴ１を発現する、又はそれらの細胞表面でＧＬＵＴ１を発現し易いＴ細胞集団を、ＧＬＵＴ１リガンドと接触させること、
ａ１）Ｔ細胞の細胞表面におけるＧＬＵＴ１に対する前記ＧＬＵＴ１リガンドの結合を検出及び／又は定量化すること、
ａ２）Ｔ細胞の細胞表面におけるＧＬＵＴ１発現レベルを定量化すること、
ｂ）ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞を選択すること、及び
ｃ）任意に、ＧＬＵＴ１発現レベルが低い選択されたＴ細胞を単離すること
を含む方法である。
ａ０）それらの細胞表面でＧＬＵＴ１を発現する、又はそれらの細胞表面でＧＬＵＴ１を発現し易いＴ細胞集団を、ＧＬＵＴ１リガンドと接触させること、
ａ１）Ｔ細胞の細胞表面におけるＧＬＵＴ１に対する前記ＧＬＵＴ１リガンドの結合を検出及び／又は定量化すること、
ａ２）Ｔ細胞の細胞表面におけるＧＬＵＴ１発現レベルを定量化すること、
ｂ）ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞を選択すること、及び
ｃ）任意に、ＧＬＵＴ１発現レベルが低い選択されたＴ細胞を単離すること
を含む方法である。
【0030】
用語「リガンド」は、別の分子と結合する、特異的に結合する、又はそれと複合体を形成する任意の物質を指す。典型的なリガンドは、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣化合物並びに他の有機及び無機小分子化合物などの小分子を含むが、これらに限定されない。
【0031】
好ましくは、ＧＬＵＴ１リガンドは、細胞表面でＧＬＵＴ１と相互作用する分子であり、本発明の方法は、前記リガンドとＧＬＵＴ１との間に形成される複合体を検出及び／又は定量化することを含む。
【0032】
「細胞表面でＧＬＵＴ１と相互作用する」という表現は、リガンドが細胞表面に存在するＧＬＵＴ１受容体を認識しやすいことを意味する。一実施形態では、細胞表面でＧＬＵＴ１と相互作用するリガンドは、そのため、細胞表面において前記ＧＬＵＴ１と複合体を形成し、この複合体を、本明細書上記の方法によって検出してもよい。
【0033】
一実施形態では、リガンドはＧＬＵＴ１に結合する。一実施形態では、リガンドはＧＬＵＴ１に特異的に結合する。
【0034】
本明細書で使用する「特異的に結合する」という表現は、他のタンパク質及び生体分子の不均一な集団の存在下で、特定の標的若しくはエピトープ、又はそのドメインに関するある分子又はそのドメインの結合特異性及び親和性を指す。そのため、一実施形態では、指定されたアッセイ条件下で、本発明に記載のリガンドは、その標的に優先的に結合するが、試験試料又は対象内に存在する他の成分には有意な量で結合しない。一実施形態では、そのようなリガンドは、１×１０－６Ｍ以下（例えば、少なくとも０．５×１０－６、１×１０－７、１×１０－８、１×１０－９、１×１０－１０以下）の平衡解離定数でその標的に対して高い親和性結合を示す。例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡ及びフローサイトメトリーを含む、２つの生体分子の結合能を評価するための標準的なアッセイが当技術分野で公知である。分子の結合動態（例えば、結合親和性）はまた、Ｂｉａｃｏｒｅ分析などの当技術分野で公知の標準的なアッセイによって評価することもできる。
【0035】
「リガンド、例えば、ＧＬＵＴ１リガンドのＧＬＵＴ１に対する結合を検出及び／又は定量化する」という表現は、ＧＬＵＴ１が細胞表面に存在する場合に、ＧＬＵＴ１とリガンドとの間に複合体が形成されることを意味する。その複合体は、リガンドが、例えば、限定されないが、抗体定常断片（Ｆｃ）若しくは蛍光化合物などの検出可能な標識又は分子に共有結合している場合に検出することができる。複合体はまた、リガンドが当業者に周知の異なる手段でタグ付けされている場合にも検出することができる。したがって、リガンドの使用は、一方では使用されるリガンドに応じて細胞表面でのＧＬＵＴ１の同定及び検出を可能にし、他方では形成された複合体の定量化を可能にする。
【0036】
一実施形態では、ＧＬＵＴ１リガンドは標識される。
【0037】
一実施形態では、ＧＬＵＴ１リガンドは蛍光標識で標識される。蛍光標識の例としては、蛍光有機色素、量子ドット及び蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。これらのリガンドは、光学イメージングプローブとして有用であり得る。
【0038】
蛍光有機色素の例としては、市販のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素、フルオレセイン、ローダミン、又はＣｙ（登録商標）色素（Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、及びＣｙ７．５など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0039】
蛍光タンパク質の例としては、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＰｌｕｍ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－Ｒｅｄ、ＤＳ－Ｒｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、Ｙｐｅｔ、ＹＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄなどが挙げられるが、これらに限定されない。蛍光タンパク質の別の例はフィコエリスリンである。蛍光タンパク質は、当技術分野において周知の分子クローニングの技術によってリガンドに融合され得る。あるいは、蛍光タンパク質は、当技術分野で周知の技術によってリガンドに化学的にコンジュゲートされ得る。
【0040】
一実施形態では、ＧＬＵＴ１リガンドはペプチドタグで標識される。
【0041】
ペプチドタグの例としては、抗体結晶化可能領域（Ｆｃ）、酵素（アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ヘマグルチニンタグ、ポリアルギニンタグ、ポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓタグ、ＨＡＴタグ、３×Ｆｌａｇタグ、カルモジュリン結合ペプチドタグ、ＳＢＰタグ、キチン結合ドメインタグ、ＧＳＴタグ、マルトース結合タンパク質タグ、蛍光ペプチドタグ、Ｔ７タグ、Ｖ５タグ、Ｘ－ｐｒｅｓｓタグなどが挙げられるが、これらに限定されない。ペプチドタグは、当技術分野で周知の分子クローニングの技術によってリガンドに融合されるか、又はリガンドに共有結合され得る。
【0042】
一実施形態では、本明細書に記載されるように標識されたＧＬＵＴ１リガンドは、例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰなどの蛍光タンパク質及び関連タンパク質、又はＦｃ断片などの検出タグに融合された（本明細書に記載の）ＧＬＵＴ１リガンドを含む融合タンパク質である。一実施形態では、ＧＬＵＴ１リガンドは、Ｆｃ断片又は蛍光タンパク質に融合される。一実施形態では、本明細書に記載されるように標識されたＧＬＵＴ１リガンドは、フィコエリスリンに化学的にコンジュゲートされた（本明細書に記載の）ＧＬＵＴ１リガンドを含む。
【0043】
配列番号２のアミノ酸配列は、ＧＦＰ配列の非限定的な例である。Ｆｃ断片の例としては、ウサギＦｃ断片（配列番号３のアミノ酸配列）、マウスＦｃ断片（配列番号４のアミノ酸配列）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0044】
一実施形態では、結合の検出及び／又は定量化は、フローサイトメトリー、又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって行われる。別の実施形態では、結合の検出及び／又は定量化は、ビーズベースのアッセイ、例えば、磁気ビーズベースのアッセイによって行われる。
【0045】
本発明の態様では、リガンドは、細胞表面でＧＬＵＴ１と相互作用するエンベロープウイルスの糖タンパク質の可溶性部分に由来する受容体結合ドメインを含む。好ましくは、リガンドは可溶性であり、すなわち膜貫通ドメインを含まず、したがって膜に固定されない。
【0046】
「ウイルスのエンベロープ糖タンパク質の可溶性部分に由来する」という表現は、リガンドがウイルスエンベロープの糖タンパク質の断片であり、例えば、クローニング又は遺伝子合成によって得ることができることを意味する。用語「糖タンパク質」は、エンベロープ糖タンパク質、コート糖タンパク質又は融合糖タンパク質を意味するものとして理解されるべきであり、用語「糖タンパク質」は、ポリペプチド側鎖に共有結合したオリゴ糖鎖を含むタンパク質を指す。
【0047】
エンベロープウイルスの糖タンパク質の可溶性部分に由来する受容体結合ドメインはまた、非グリコシル化ペプチド又はポリペプチドであり得、すなわち、エンベロープウイルスの糖タンパク質の可溶性部分の非グリコシル化形態に由来し得る。
【0048】
一実施形態では、前記ウイルスは、レトロウイルス、好ましくは、例えば、霊長類Ｔ細胞白血病ウイルス（ＰＴＬＶ）などのデルタレトロウイルスである。霊長類Ｔ細胞白血病ウイルス（ＰＴＬＶ）の例としては、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）及びサルＴ細胞白血病ウイルス（ＳＴＬＶ）が挙げられる。
【0049】
デルタレトロウイルスは、成熟レトロウイルスビリオンに存在するエンベロープ糖タンパク質をコードする。用語「エンベロープタンパク質」（ｅｎｖ遺伝子によってコードされる「Ｅｎｖ」）は、プロペプチドの形態で単一のポリタンパク質として合成され、続いてフーリンペプチダーゼによってゴルジ体内で２つの成分：アミノ末端表面エンベロープタンパク質（「ＳＵタンパク質」）及びカルボキシ末端膜貫通エンベロープタンパク質（「ＴＭタンパク質」）へと切断されるタンパク質を指す。Ｅｎｖタンパク質はグリコシル化される。ＳＵタンパク質は、宿主受容体との結合に関与している。これは、宿主細胞膜受容体と相互作用しやすい受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）と、ＴＭドメインとの相互作用のドメインとを含む。ＴＭタンパク質は、脂質二重層の内側に位置しており、ＳＵタンパク質をウイルス粒子の表面に固定する。ＴＭタンパク質は、宿主細胞との膜融合反応を媒介する。
【0050】
実施形態では、ＧＬＵＴ１リガンドに含まれる受容体結合ドメインは、ヒトＴ細胞白血病ウイルスのエンベロープ糖タンパク質の可溶性部分から単離されるか、又はそれに由来する。
【0051】
実施形態では、受容体結合ドメインは、ヒトＴ細胞白血病ウイルスの全表面エンベロープタンパク質（ＳＵ）を含むか又はそれからなる。
【0052】
実施形態では、受容体結合ドメインは、ヒトＴ細胞白血病ウイルスの表面エンベロープタンパク質（ＳＵ）の断片である。
【0053】
実施形態では、ＧＬＵＴ１リガンドに含まれる受容体結合ドメインは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のエンベロープ糖タンパク質の可溶性部分から単離されるか、又はそれに由来する。
【0054】
実施形態では、受容体結合ドメインは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）の全表面エンベロープタンパク質（ＳＵ）を含むか又はそれからなり、好ましくは、配列番号５、配列番号３２のアミノ酸配列、又はそれらの断片若しくは変異体を含むか又はそれらからなる配列を有する。
【0055】
実施形態では、受容体結合ドメインは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）の表面エンベロープタンパク質（ＳＵ）の断片であり、好ましくは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３３、配列番号３４のアミノ酸配列、又はそれらの断片若しくは変異体を含むか又はそれらからなる配列を有する。
【0056】
実施形態では、ＧＬＵＴ１リガンドに含まれる受容体結合ドメインは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス２型（ＨＴＬＶ－２）のエンベロープ糖タンパク質の可溶性部分から単離されるか、又はそれに由来する。
【0057】
実施形態では、受容体結合ドメインは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス２型（ＨＴＬＶ－２）の全表面エンベロープタンパク質（ＳＵ）を含むか又はそれからなり、好ましくは、配列番号１３、配列番号３５のアミノ酸配列、又はそれらの断片若しくは変異体を含むか又はそれらからなる配列を有する。
【0058】
実施形態では、受容体結合ドメインは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス２型（ＨＴＬＶ－２）の表面エンベロープタンパク質（ＳＵ）の断片であり、好ましくは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３６又は配列番号３７のアミノ酸配列、又はそれらの断片若しくは変異体を含むか又はそれらからなる配列を有する。
【0059】
実施形態では、ＧＬＵＴ１リガンドに含まれる受容体結合ドメインは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス３型（ＨＴＬＶ－３）のエンベロープ糖タンパク質の可溶性部分から単離されるか、又はそれに由来する。
【0060】
実施形態では、受容体結合ドメインは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス３型（ＨＴＬＶ－３）の全表面エンベロープタンパク質（ＳＵ）を含むか、又はそれらからなり、好ましくは、配列番号１７、配列番号３８のアミノ酸配列、又はそれらの断片若しくは変異体を含むか又はそれらからなる配列を有する。
【0061】
実施形態では、受容体結合ドメインは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス３型（ＨＴＬＶ－３）の表面エンベロープタンパク質（ＳＵ）の断片であり、好ましくは、配列番号１８、配列番号３９のアミノ酸配列、又はそれらの断片若しくは変異体を含むか又はそれらの配列を有する。
【0062】
実施形態では、ＧＬＵＴ１リガンドに含まれる受容体結合ドメインは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス４型（ＨＴＬＶ－４）のエンベロープ糖タンパク質の可溶性部分から単離されるか、又はそれに由来する。
【0063】
実施形態では、受容体結合ドメインは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス４型（ＨＴＬＶ－４）の全表面エンベロープタンパク質（ＳＵ）を含むか又はそれからなり、好ましくは、配列番号１９、配列番号４０のアミノ酸配列、又はそれらの断片若しくは変異体を含むか又はそれらからなる配列を有する。
【0064】
実施形態では、受容体結合ドメインは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス４型（ＨＴＬＶ－４）の表面エンベロープタンパク質（ＳＵ）の断片であり、好ましくは、配列番号２０若しくは配列番号２１、配列番号４１、配列番号４２のアミノ酸配列、又はそれらの断片若しくは変異体を含むか又はそれらからなる配列を有する。
【0065】
実施形態では、ＧＬＵＴ１リガンドに含まれる受容体結合ドメインは、サルＴ細胞白血病ウイルス１型（ＳＴＬＶ－１）のエンベロープ糖タンパク質の可溶性部分から単離されるか、又はそれに由来する。
【0066】
実施形態では、受容体結合ドメインは、サルＴ細胞白血病ウイルス１型（ＳＴＬＶ－１）の全表面エンベロープタンパク質（ＳＵ）を含むか又はそれからなり、好ましくは、配列番号２２、配列番号４３のアミノ酸配列、又はそれらの断片若しくは変異体を含むか又はそれらからなる配列を有する。
【0067】
実施形態では、受容体結合ドメインは、サルＴ細胞白血病ウイルス１型（ＳＴＬＶ－１）の表面エンベロープタンパク質（ＳＵ）の断片であり、好ましくは、配列番号２３、配列番号４４のアミノ酸配列、又はそれらの断片若しくは変異体を含むか又はそれらからなる配列を有する。
【0068】
実施形態では、ＧＬＵＴ１リガンドに含まれる受容体結合ドメインは、サルＴ細胞白血病ウイルス２型（ＳＴＬＶ－２）のエンベロープ糖タンパク質の可溶性部分から単離されるか、又はそれに由来する。
【0069】
実施形態では、受容体結合ドメインは、サルＴ細胞白血病ウイルス２型（ＳＴＬＶ－２）の全表面エンベロープタンパク質（ＳＵ）を含むか又はそれからなり、好ましくは、配列番号２４、配列番号４５のアミノ酸配列、又はそれらの断片若しくは変異体を含むか又はそれらからなる配列を有する。
【0070】
実施形態では、受容体結合ドメインは、サルＴ細胞白血病ウイルス２型（ＳＴＬＶ－２）の表面エンベロープタンパク質（ＳＵ）の断片であり、好ましくは、配列番号２５、配列番号４６のアミノ酸配列、又はそれらの断片若しくは変異体を含むか又はそれらからなる配列を有する。
【0071】
実施形態では、ＧＬＵＴ１リガンドに含まれる受容体結合ドメインは、サルＴ細胞白血病ウイルス３型（ＳＴＬＶ－３）のエンベロープ糖タンパク質の可溶性部分から単離されるか、又はそれに由来する。
【0072】
実施形態では、受容体結合ドメインは、サルＴ細胞白血病ウイルス３型（ＳＴＬＶ－３）の全表面エンベロープタンパク質（ＳＵ）を含むか又はそれからなり、好ましくは、配列番号２６、配列番号４７のアミノ酸配列、又はそれらの断片若しくは変異体を含むか又はそれらからなる配列を有する。
【0073】
実施形態では、受容体結合ドメインは、サルＴ細胞白血病ウイルス３型（ＳＴＬＶ－３）の表面エンベロープタンパク質（ＳＵ）の断片であり、好ましくは、配列番号２７、配列番号４８のアミノ酸配列、又はそれらの断片若しくは変異体を含むか又はそれらからなる配列を有する。
【0074】
実施形態では、ＧＬＵＴ１リガンドに含まれる受容体結合ドメインは、サルＴ細胞白血病ウイルス５型（ＳＴＬＶ－５）のエンベロープ糖タンパク質の可溶性部分から単離されるか、又はそれに由来する。
【0075】
実施形態では、受容体結合ドメインは、サルＴ細胞白血病ウイルス５型（ＳＴＬＶ－５）の全表面エンベロープタンパク質（ＳＵ）を含むか又はそれからなり、好ましくは、配列番号２８、配列番号４９のアミノ酸配列、又はそれらの断片若しくは変異体を含むか又はそれらからなる配列を有する。
【0076】
実施形態では、受容体結合ドメインは、サルＴ細胞白血病ウイルス３型（ＳＴＬＶ－３）の表面エンベロープタンパク質（ＳＵ）の断片である。
【0077】
好ましくは、受容体結合ドメインは、Ｔ細胞白血病ウイルス２型（ＨＴＬＶ－２）のエンベロープ糖タンパク質の可溶性部分から単離されるか又はそれに由来し、本明細書ではＨＴＬＶ２．ＲＢＤ又はＨ２．ＲＢＤと呼ばれる配列番号１５のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる配列を有する。
【0078】
ＧＬＵＴ１リガンドに含まれる受容体結合ドメインは、全ＲＢＤ又はその断片若しくは変異体からなり得る。
【0079】
参照配列の「断片」とは、本明細書において、参照配列の連続するアミノ酸の鎖によって構成され、そのサイズが参照配列のサイズよりも小さい配列を意味する。本発明の文脈において、断片は、例えば６～２００、６～１８５、６～１７５、６～１５０、６～１２５、６～１００、６～７５、６～５０、６～２５、６～１５、６～１０アミノ酸のサイズ、又は６～１８５、１０～１８５、２５～１８５、５０～１８５、７５～１８５、１００～１８５、１２５～１８５、１５０～１８５、１７５～１８５アミノ酸のサイズを有する。
【0080】
本明細書において用語「変異体」は、「同族体」又は「誘導体」と同じ意味を有する。「変異体」は、参照配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の配列を含むと定義される。
【0081】
本明細書において「（例えば）参照配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列」とは、本明細書において参照配列と同一の配列を意味するが、この配列は、参照配列の１００アミノ酸の各部分当たり最大２０個の変異（置換、欠失及び／又は挿入）を含み得る。したがって、１００アミノ酸の参照配列について、参照配列と比較して８０アミノ酸の断片及び２０個の置換を含む１００アミノ酸の配列は、参照配列と８０％の配列同一性を有する配列の２つの例である。
【0082】
同一性のパーセンテージは、一般的に、配列解析ソフトウェア（例えば、遺伝子コンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）の配列解析ソフトウェアパッケージ、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５）を使用して決定される。比較されるアミノ酸配列を、最大のパーセンテージ同一性が得られるように整列させる。この目的のために、配列に人為的にギャップを追加する必要がある場合もある。アライメントは、手動又は自動で実行することができる。ヌクレオチド配列の自動アライメントアルゴリズムは、当業者に周知であり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９で説明され、Ｂｌａｓｔソフトウェアなどのソフトウェアによって実施される。分離することができるアルゴリズムの１つは、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ （１９７０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８：４４３－５３）である。最適なアライメントが達成されると、位置の総数と比較して、２つの比較される配列のアミノ酸が同一である全ての位置を記録することによって、パーセンテージ同一性が確立される。
【0083】
これらの変異体配列は、これらの改変がポリペプチドの生物活性にいかなる有意な影響も及ぼさないような位置で、１以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入によって参照配列と異なってもよい。置換は、特に、保存的置換又は非天然アミノ酸若しくは擬似アミノ酸による天然アミノ酸の置換に対応し得る。
【0084】
１つの特定の実施形態では、ポリペプチドの配列は、保存的置換の存在によってのみ参照配列と異なる。保存的置換は、非荷電側鎖（アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、及びチロシンなど）を有するアミノ酸、塩基性側鎖を有するアミノ酸（リジン、アルギニン及びヒスチジンなど）、酸性側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸など）、非極性側鎖を有するアミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン及びトリプトファンなど）との置換などの同じクラスのアミノ酸の置換である。
【0085】
本明細書で使用する場合、参照タンパク質の「変異体」は、参照ポリペプチドと同じ生物活性を示す。特に、受容体結合ドメインの変異体は同じ受容体に結合可能であり、ＧＬＵＴ１リガンドの変異体はＧＬＵＴ１に結合可能である。
【0086】
本発明のリガンドの等価な変異体若しくは一部、又はさらには改良された変異体若しくは一部を作製するためにポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが望まれる場合、当業者は、典型的には、コードするＤＮＡ配列の１以上のコドンを変化させる。例えば、特定のアミノ酸は、細胞表面栄養輸送体に結合する能力を明らかに失うことなく、タンパク質構造中の他のアミノ酸によって置換され得る。そのタンパク質の生物機能活性を定義するのはタンパク質の結合能力及び性質であるため、タンパク質配列、及びもちろん、その基礎となるＤＮＡコード配列に特定のアミノ酸配列置換を行っても、同様の特性を有するタンパク質を得ることができる。そのため、それらの生物学的有用性又は活性を明らかに失うことなく、ペプチド配列又は前記ペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列に様々な変化がなされ得ることが企図される。
【0087】
好ましい実施形態では、変異体ポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸の置換、欠失又は付加によって参照配列とは異なる。
【0088】
一実施形態では、受容体結合ドメインを抗体定常断片（例えば、ウサギ、マウス、ヒト、サル又は他の哺乳動物のＦｃ断片など）に融合し、及び／又は化学修飾して、蛍光色素、若しくは蛍光化合物（例えば、シアニン色素、Ａｌｅｘａ色素、Ｑｕａｎｔｕｍ色素など）を付加することができる。
【0089】
一実施形態では、ＧＬＵＴ１リガンドは、例えばＦｃ断片又はＧＦＰなどの検出タグ又は標識に融合された受容体結合ドメイン、又は前記受容体結合ドメインの断片若しくは変異体を含む。ＧＦＰタンパク質の例としては、配列番号２のアミノ酸配列が挙げられるが、これに限定されない。Ｆｃ断片の例としては、ウサギＦｃ断片（例えば、配列番号３のアミノ酸配列など）、マウスＦｃ断片（例えば、配列番号４のアミノ酸配列など）、ヒトＦｃ断片又はサルＦｃ断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【0090】
いくつかの実施形態では、受容体結合ドメインは、リンカーを介して検出タグ又は標識に融合される。そのようなリンカーは、立体障害を防止するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０個のアミノ酸残基を有する。リンカー配列は、天然に存在する配列又は天然に存在しない配列であり得る。リンカー配列の１つの有用な群は、重鎖抗体のヒンジ領域に由来するリンカーである。他の例は、ポリアラニンリンカー配列である。リンカー配列のさらに好ましい例は、異なる長さのＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー、すなわち１以上のグリシン（複数可）とそれに続く１以上のセリン（複数可）からなるリンカーである。
【0091】
実施形態では、ＧＬＵＴ１リガンドに含まれる受容体結合ドメインは、例えばＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー（配列番号２９又は配列番号５０のアミノ酸配列）を介してＧＦＰに融合されたＨＴＬＶ２．ＲＢＤである。実施形態では、ＧＬＵＴ１リガンドに含まれる受容体結合ドメインは、例えばＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー（配列番号３０又は配列番号５１のアミノ酸配列）を介してウサギＦｃ断片に融合されたＨＴＬＶ２．ＲＢＤである。実施形態では、ＧＬＵＴ１リガンドに含まれる受容体結合ドメインは、例えばＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー（配列番号３１又は配列番号５２のアミノ酸配列）を介してマウスＦｃ断片に融合されたＨＴＬＶ２．ＲＢＤである。
【0092】
実施形態では、ＧＬＵＴ１リガンドに含まれる受容体結合ドメインは、例えばＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーを介してヒトＦｃ断片に融合されたＨＴＬＶ２．ＲＢＤである。
【0093】
別の実施形態では、前記リガンドは、抗体又はその抗原結合断片である。特に、前記リガンドは、ＧＬＵＴ１に特異的な抗原結合断片であり、本発明の方法は、前記抗原結合断片とＧＬＵＴ１との間に形成される複合体を検出及び／又は定量化することを含む。
【0094】
本明細書で使用する用語「抗原結合断片」は、抗原のエピトープと特異的に相互作用する（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）能力を有する抗体の断片を指す。抗原結合断片は、特にインタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域又は可変領域を含み得る。抗原結合断片の例としては、抗体のＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＨ及びＣＨＩドメインからなるＦｄ断片、線状抗体、ｓｄＡｂなどの単一ドメイン抗体（ＶＬ又はＶＨのいずれか）、ラクダ科ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む２価断片などの抗体断片から形成される多重特異性抗体、及び単離されたＣＤＲ又は他のエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。抗原結合断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ及びｂｉｓ－ｓｃＦｖに組み込むことができる。抗原結合断片はまた、フィブロネクチンＩＩＩ型などのポリペプチドに基づく足場に移植することもできる。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、及び容易に結晶化する能力を反映して命名された残りの「Ｆｃ」断片を生じる。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）および１つの重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）と共にＬ鎖全体からなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価であり、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、２価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片にほぼ対応し、なおも抗原を架橋することができる単一の大きなＦ（ａｂ'）２断片が得られる。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域由来の１以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に追加のいくつかの残基を有するという点でＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ'－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ'の本明細書における呼称である。Ｆ（ａｂ'）２抗体断片は、当初それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片のペアとして生成された。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
【0095】
実施形態では、前記リガンドは抗体である。特に、前記リガンドはＧＬＵＴ１に特異的な抗体であり、本発明の方法は、前記抗体とＧＬＵＴ１との間に形成される複合体を検出及び／又は定量化することを含む。
【0096】
ＧＬＵＴ１に特異的な抗体は、当技術分野において周知である。好ましくは、該抗体は、ＧＬＵＴ１に結合するための透過処理を必要としない。ＧＬＵＴ１に特異的な抗体の非限定的な例としては、例えば、参照ａｂ２０９４４９の下でＡｂｃａｍから入手可能な組換え抗グルコース輸送体ＧＬＵＴ１抗体クローン＃ ＥＰＲ３９１５、又は参照ＭＡＢ１４１８の下でＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なモノクローナルマウスＩｇＧ２Ｂクローン＃ ２０２９１５が挙げられる。
【0097】
Ｔ細胞の細胞表面におけるＧＬＵＴ１レベルの発現レベルを決定、測定又は定量化することに加えて、本発明の方法は、ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞を選択する工程をさらに含む。
【0098】
用語「陽性」、「陰性」、「低」及び「高」は、細胞表面マーカーの発現レベルを指す場合、当技術分野において周知である。
【0099】
用語「発現」、「陽性」、又は「＋」及び「発現しない」、「陰性」、又は「－」は、当技術分野において周知であり、目的の細胞マーカーの発現レベルを指し、「＋」に対応する細胞マーカーの発現レベルは、高い又は中間又は低く（すなわち、該細胞マーカーは、細胞表面で発現しているか又は細胞表面に存在しており）、「－」に対応する細胞マーカーの発現レベルは、ゼロである（すなわち、該細胞マーカーは、細胞表面で発現していないか、又は細胞表面に存在しない）。
【0100】
用語「低」又は「ｌｏ」又は「ｌｏ／－」は、当技術分野において周知であり、細胞マーカーの発現レベルは、全体として分析される細胞の全集団におけるその細胞マーカーの発現レベルと比較して低いという点における目的の細胞マーカーの発現レベルを指す。より詳しくは、用語「ｌｏ」は、１以上の他の別々の細胞集団よりも低いレベルで細胞マーカーを発現する別々の細胞集団を指す。
【0101】
用語「高い」又は「ｈｉ」又は「明るい」は、当技術分野において周知であり、細胞マーカーの発現レベルが、全体として分析される細胞の全集団におけるその細胞マーカーの発現レベルと比較して高いという点における目的の細胞マーカーの発現レベルを指す。より詳しくは、用語「ｈｉ」は、１以上の他の別々の細胞集団よりも高いレベルで細胞マーカーを発現する別々の細胞集団を指す。
【0102】
非限定的な例として、染色強度の上位２、３、４、５、１０又は１５％の細胞は「ｈｉ」と命名され、残りの細胞は、「中間」として分類される集団の上位半分に分類される。また、非限定的な例として、「陽性」（又は「＋」）細胞のうち、蛍光強度の５０％を下回る細胞は、「ｌｏ」細胞と指定される。
【0103】
いくつかの実施形態では、ＧＬＵＴ１の発現レベルの決定、測定又は定量化することは、フローサイトメトリー又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって行われる。
【0104】
いくつかの実施形態では、ＧＬＵＴ１の発現レベルを決定、測定又は定量化することは、好ましくはＦＡＣＳによってＧＬＵＴ１を発現する細胞集団からの細胞のパーセンテージ又は分画を決定することを含む（すなわち、ＧＬＵＴ１については細胞「＋」）。
【0105】
ＧＬＵＴ１の発現レベルは、ＧＬＵＴ１に特異的な蛍光リガンドで染色された細胞集団由来の細胞の蛍光強度（ＦＩ）を、同じ非染色細胞集団由来の細胞のＦＩと比較するか、又は特異性は無関係であるが、アイソタイプは同じで、蛍光プローブも同じで、同一種に由来する（アイソタイプ対照と称する）蛍光抗体で染色された細胞集団由来の細胞のＦＩ、又は特異性は無関係であるが、蛍光プローブは同じである蛍光リガンド（対照リガンドと称する）、例えば、集団の細胞表面に存在しない受容体に特異的なリガンドで染色された細胞集団由来の細胞の蛍光強度（ＦＩ）と比較することによって決定される。ＧＬＵＴ１に特異的な蛍光抗体で染色され、染色されていない細胞と同等のＦＩ又はより低いＦＩを示す細胞、又はアイソタイプ対照若しくは対照リガンドで染色された細胞は、このマーカーを発現していないと見なされ、「－」又は「陰性」と指定される。アイソタイプ対照で染色された細胞よりも優れたＦＩ値を示し、ＧＬＵＴ１特異的な蛍光抗体で染色された細胞は、ＧＬＵＴ１を発現していると見なされ、「＋」又は「陽性」と指定される。
【0106】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、より低いレベルでＧＬＵＴ１を発現する細胞集団からの細胞のパーセンテージ又は割合を決定することを含む。好ましい実施形態では、より低いレベルでＧＬＵＴ１を発現する細胞集団からの細胞のパーセンテージ又は分画を決定することは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって行われる。
【0107】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｔ細胞の細胞表面におけるＧＬＵＴ１レベルの発現レベルを定量化することと同時に又は後に、ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞を選択することを含む。いくつかの実施形態では、ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞を選択することは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって行われる。
【0108】
実施形態では、ＧＬＵＴ１発現レベルが低い、選択されたＴ細胞又はＴ細胞集団は、全ＧＬＵＴ１＋Ｔ細胞集団の中で最も低いＧＬＵＴ１発現レベルの最大９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、又は５％の分画に対応する。
【0109】
別の実施形態では、ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞又はＴ細胞亜集団（選択される又は選択されるべきであるＴ細胞亜集団）は、全ＧＬＵＴ１＋Ｔ細胞集団の中で最も低いＧＬＵＴ１発現レベルの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％又は５％の分画に対応する。
【0110】
一実施形態では、ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞を選択することがＦＡＣＳによって行われる場合、ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞（選択される又は選択されるべきである）は、全ＧＬＵＴ１＋細胞集団内で１５％の最も低いＧＬＵＴ１染色を有する細胞であると同定される。
【0111】
好ましくは、ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞又はＴ細胞集団は、全Ｔ細胞集団、又はＧＬＵＴ１発現が高いＴ細胞と比較して改善された抗がん活性を有する。
【0112】
特定の実施形態によれば、全集団におけるＴ細胞の細胞表面で測定されたＧＬＵＴ１レベルは、「分位数」と呼ばれるカットオフ値によって等サイズの群に分割され、各群は、全集団におけるＴ細胞の決定されたパーセンテージに対応する。分位数の例としては、限定されないが、中央値（ＧＬＵＴ１レベルに基づいて２つの群を定義し、各々が全集団中のＴ細胞の５０％を含む）、三分位数（ｔｅｒｃｉｌｅ）又は三分位数（ｔｅｒｔｉｌｅ）（ＧＬＵＴ１レベルに基づいて３つの群を定義し、各々が全集団中のＴ細胞の３分の１を含む）、四分位数（ＧＬＵＴ１レベルに基づいて４つの群を定義し、各々が全集団中のＴ細胞の２５％を含む）、五分位数（ＧＬＵＴ１レベルに基づいて５つの群を定義し、各々が全集団中のＴ細胞の２０％を含む）及び十分位数（ＧＬＵＴ１レベルに基づいて１０の群を定義し、各々が全集団中のＴ細胞の１０％を含む）が挙げられる。
【0113】
「分位数」は、時にＧＬＵＴ１レベルに基づいて、全集団におけるＴ細胞の決定されたパーセンテージに入る値よりも下又は上のカットオフＧＬＵＴ１値を指す。したがって、測定されたＧＬＵＴ１レベルが第１分位数より低い対象は、ＧＬＵＴ１レベルが最も低い対象であり、測定されたＧＬＵＴ１レベルが最後の分位数より高い対象は、最も高いＧＬＵＴ１レベルを有するヒト対象である。
【0114】
さらに、用語「分位数」は、前記カットオフ値によってそのように定義される群を指す場合もある。そのため、本発明に適用される用語「分位数」はまた、カットオフＧＬＵＴ１値によって定義されるＴ細胞の群も指し得る。例えば、第１十分位数は、全集団において測定されたＧＬＵＴ１レベルの最低１０％に対応するＴ細胞の群を指し得る。したがって、第１十分位数にあるＧＬＵＴ１値は、Ｔ細胞集団で測定されたＧＬＵＴ１レベルの最低の１０％に含まれるＧＬＵＴ１値であるということになる。
【0115】
本明細書で使用する用語「分位数」は、好ましくは、前記カットオフ値によってそのように定義される群を指す。
【0116】
実施形態では、所定のＧＬＵＴ１値は、全ＧＬＵＴ１＋Ｔ細胞集団におけるＧＬＵＴ１「Ｑ１」とも呼ばれるＧＬＵＴ１の第１四分位数である。
【0117】
実施形態では、ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞又はＴ細胞亜集団（選択されるか又は選択されるべきであるＴ細胞亜集団）は、全ＧＬＵＴ１＋Ｔ細胞集団におけるＧＬＵＴ１発現の第１四分位数に対応する。
【0118】
特定の実施形態では、ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞又はＴ細胞亜集団（選択されるか又は選択されるべきであるＴ細胞亜集団）は、全ＧＬＵＴ１＋Ｔ細胞集団におけるＧＬＵＴ１発現の第１の中央値、三分位数、四分位数、五分位数又は十分位数に対応する。
【0119】
一実施形態では、全集団におけるＴ細胞の細胞表面で測定されたＧＬＵＴ１レベルは、全集団におけるＴ細胞の所与のパーセンテージに対応する群に分割される。上述のように、Ｔ細胞集団において測定されたＧＬＵＴ１レベルをそのように分割するカットオフ値（「分位数」）を「百分位数」と呼ぶ。
【0120】
そのため、一実施形態では、所定のＧＬＵＴ１値は、全Ｔ細胞集団における第１のＧＬＵＴ１百分位数である。
【0121】
一実施形態では、好ましくは、ＧＬＵＴ１＋Ｔ細胞亜集団を単離した後に、ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞を選択することは、例えばビーズなどの磁性粒子を用いて行われる。例えば、ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞を選択することは、細胞上に存在するＧＬＵＴ１に対するリガンドを用いた陰性の磁気免疫接着によって行われ、ＧＬＵＴ１発現レベルが低いＴ細胞は「選択されない」細胞である。
【0122】
陽性選択又は陰性選択による所望の細胞集団の単離のために、特に、陽性選択によってＧＬＵＴ１発現が高いＴ細胞を枯渇させるため、又は陰性選択によってＧＬＵＴ１発現が低い未結合のＴ細胞を回収するために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変化させることができる。
【0123】
特定の実施形態では、ビーズと細胞が混合される体積を有意に増加させ（すなわち、細胞の濃度を低下させ）、細胞とビーズの接触を減少させることが望ましい場合がある。低い細胞濃度の使用は、ＧＬＵＴ１を弱く発現するＴ細胞、又は細胞表面で低レベルのＧＬＵＴ１を発現するＴ細胞の捕捉効率を低下させ得る。
【0124】
一実施形態では、発現レベルは正規化され、すなわち発現レベルは、ＧＬＵＴ１発現と別の遺伝子又はタンパク質発現との間の比に対応する。例えば、正規化に使用される他の遺伝子又はタンパク質は、別の栄養輸送体、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８などの表現型マーカー、又はキメラ抗原受容体若しくはＴＣＲなどの操作された受容体あり得る。
【0125】
本発明において、２つの数値、特に２つの発現レベルは、第１の数値が、第２の数値よりも高い（例えば、第１の数値が第２の数値よりも約２０％高い、好ましくは第２の数値よりも約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％又はそれ以上高いなど）、又は第２の数値よりも低い（例えば、第１の数値が第２の数値よりも約２０％低い、好ましくは第２の数値よりも約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％又はそれ以上低いなど）場合に、異なるとみなされる。
【0126】
本発明の細胞はＴ細胞である。それは、哺乳動物Ｔ細胞、好ましくはヒトＴ細胞、家畜（例えば、ウシ、ブタ、又はウマ）のＴ細胞、又はペット（例えば、ネコ又はイヌ）のＴ細胞であり得る。
【0127】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、従来の細胞傷害性Ｔ細胞又は従来のヘルパーＴ細胞である。
【0128】
Ｔ細胞はリンパ球の一種である。Ｔ細胞は、骨髄由来の前駆細胞として発生し、胸腺に移動し、そこでいくつかの別々の種類のＴ細胞に分化する。
【0129】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の低レベルのＧＬＵＴ１を発現するＴ細胞の亜集団を選択する前に、細胞を対象から得る。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多くの源から得ることができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離、赤血球溶解及び単球枯渇に続くＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介した遠心分離、向流遠心エルトリエーション、白血球アフェレーシス、及びその後の細胞表面マーカーベースの磁気単離又はフローサイトメトリー単離などの当業者に公知の任意の数の技術を使用して対象から収集した血液単位から得ることができる。いくつかの実施形態では、個体の循環血液からの細胞はアフェレーシスによって得られる。アフェレーシス生成物は、典型的には、Ｔ細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含む。いくつかの実施形態では、個体の循環血液からの細胞は、白血球アフェレーシスによって得られる。
【0130】
いくつかの実施形態では、白血球アフェレーシスによって収集した細胞を洗浄して、血漿分画を除去し、後続の処理工程のために細胞を適切な緩衝液又は培地に入れてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムを欠いており、マグネシウムを欠いていてもよいし、又は全てではないにしても多くの二価カチオンを欠いていてもよい。洗浄後、細胞は、例えばＣａ２＋を含まないＰＢＳ、Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、又は緩衝剤を含む若しくは含まない他の生理食塩水などの様々な生体適合性緩衝液のいずれかに再浮遊させてもよい。あるいは、白血球アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培地に直接再浮遊させてもよい。
【0131】
別の実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介した遠心分離によって、又は向流遠心エルトリエーションによって、末梢血リンパ球から単離される。Ｔ細胞の特定の亜集団は、陽性又は陰性選択技術によってさらに単離することができる。例えば、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な期間、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コンジュゲートビーズとのインキュベーションによって単離される。Ｔ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズに結合させる時間を単純に短縮又は延長することによって、及び／又はビーズのＴ細胞に対する比率を増加又は減少させることによって、Ｔ細胞の亜集団を、培養開始時又はプロセス中の他の時点で優先的に選択することができる。さらに、ビーズ又は他の表面上の抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体の比率を増加又は減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団を、培養開始時又は他の所望の時点で優先的に選択することができる。当業者は、本発明の文脈において複数ラウンドの選択も使用することができることを認識するであろう。
【0132】
いくつかの実施形態では、選択手順を実行し、活性化及び増殖プロセスにおいて「選択されない」細胞を使用することが望ましい場合がある。「選択されない」細胞に、さらなる選択ラウンドを行うこともできる。陰性選択によるＴ細胞集団の濃化は、陰性選択細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせによって達成することができる。１つの方法は、陰性磁気免疫接着による、又は陰性選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用するフローサイトメトリーによる細胞の選別及び／又は選択である。例えば、陰性選択によってＣＤ４＋細胞を濃化するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤ８に対する抗体を含む。
【0133】
陽性又は陰性選択による所望の細胞集団の単離のために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変化させることができる。特定の実施形態では、細胞とビーズが確実に最大限に接触するように、ビーズと細胞を混合する体積を有意に減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。さらに、高い細胞濃度を使用すると、目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞、又は多数の腫瘍細胞が存在する試料（すなわち、白血病血液、腫瘍組織など）からの細胞をより効率的に捕捉することが可能になる。
【0134】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、従来のＣＤ４＋Ｔ細胞、従来のＣＤ８＋Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、及びダブルネガティブ（ＤＮ）Ｔ細胞からなる群から選択される。
【0135】
特定の実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、又はエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞などの従来のＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【0136】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、又はエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞などの従来のＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【0137】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＤＮ Ｔ細胞である。
【0138】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はγδ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＴＥＧγδ（定義されたガンマデルタＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞）である。
【0139】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、定義されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面で発現するように操作されたＴ細胞である。
【0140】
本明細書で使用する用語「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）又は「キメラ受容体」（ＣＲ）は、１つのポリペプチド又はポリペプチドのセット、典型的には、最も単純な実施形態では２つを指し、免疫細胞内に存在する場合には、標的リガンドに対する特異性を細胞に提供し、細胞内シグナル生成をもたらす。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ポリペプチドのセットを含むキメラ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのセットは、二量体化分子の存在時に、ポリペプチドを互いに結合させることができる、例えば、リガンド結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合させることができる二量体化スイッチを含む。
【0141】
いくつかの実施形態では、「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）は、
（ａ）決定された特異性を有する細胞外結合ドメイン、
（ｂ）任意に細胞外ヒンジドメイン、
（ｃ）膜貫通ドメイン、及び
（ｄ）Ｔ細胞一次シグナル伝達ドメイン及び任意にＴ細胞共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む。
（ａ）決定された特異性を有する細胞外結合ドメイン、
（ｂ）任意に細胞外ヒンジドメイン、
（ｃ）膜貫通ドメイン、及び
（ｄ）Ｔ細胞一次シグナル伝達ドメイン及び任意にＴ細胞共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む。
【0142】
組換え複合膜受容体として、ＣＡＲは、抗体由来の細胞外ドメインによって標的がん細胞上の表面抗原を認識し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）由来の細胞内シグナル伝達ドメインによって操作されたＴ細胞を活性化する。腫瘍抗原との相互作用後に、Ｔ細胞は、ＣＤ２８共刺激ドメイン、又は４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３５）、及びＩＣＯＳなどのＴＮＦ受容体ファミリーの共刺激ドメインを個々に又は組み合わせて含み得るＣＡＲ上の異なるシグナル伝達部分の組み合わせを介して活性化される。
【0143】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、定義されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を細胞表面で発現するように操作されたＴ細胞である。
【0144】
いくつかの実施形態では、本発明の方法によって選択される改善された抗がん活性を有するＴ細胞は、操作されたＴ細胞である。
【0145】
実施形態では、初期Ｔ細胞集団は、操作されたＴ細胞集団であり、本発明による改善された抗がん活性を有するＴ細胞を選択する方法は、前記の既に操作されたＴ細胞において実施される。この実施形態では、Ｔ細胞は、最初に操作され、続いて、本発明による改善された抗がん活性を有するＴ細胞を選択する方法に供される。
【0146】
別の実施形態では、本発明による改善された抗がん活性を有するＴ細胞を選択する方法は、最初に、操作されていないＴ細胞集団において実施され、選択されたＴ細胞はその後に操作される。
【0147】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。
【0148】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞である。特定の実施形態では、エフェクターＴ細胞はＣＤ４＋エフェクターＴ細胞である。ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の例としては、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ９細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、及びＣＤ４＋Ｔ濾胞ヘルパー（Ｔｆｈ）細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ８＋ＴエフェクターＴ細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞はエフェクターγδ Ｔ細胞である。一実施形態では、免疫細胞はエフェクターＤＮ Ｔ細胞である。
【0149】
発明者らは、驚くべきことに、担がんＮＳＧマウスに対するＧＬＵＴ１ｌｏｗＴ細胞の養子移入が、ＧＬＵＴ１ｈｉｇｈＴ細胞の養子移入と比較して腫瘍拒絶反応を実質的に改善することを示した。
【0150】
さらに本発明者らは、腫瘍負荷が低いことは、養子移入後４３日目にＧＬＵＴ１ｈｉｇｈＴ細胞群よりも、ＧＬＵＴ１ｌｏｗＴ細胞群におけるＴ細胞のパーセンテージが高いことに関連することを示した。
【0151】
したがって、本発明者らは、驚くべきことに、担がんマウスに養子移入されたＧＬＵＴ１ｌｏｗＴ細胞集団が、ＧＬＵＴ１ｈｉｇｈＴ細胞集団又は全Ｔ細胞集団よりも腫瘍負荷をより良好に減少させることができることを示した。このように、低いＧＬＵＴ１発現レベルに基づいて選択されたＴ細胞は、改善された抗がん活性及びエフェクター機能を示した。
【0152】
したがって、本発明の目的は、がんの処置に使用するための、改善された抗がん活性を有するＴ細胞集団であり、前記Ｔ細胞は本発明の選択方法によって選択される。
【0153】
本明細書で使用する用語「処置する」又は「処置」又は「軽減」は、標的となる病理学的状態又は障害を遅らせる（弱める）ことを目的とする、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は防止的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）措置を除く治療的処置を指す。処置が必要な人は、すでに障害を有する人及び障害を有することが疑われる人を含む。対象は、本発明による細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物又は医薬の治療量を投与された後に、特定の疾患又は状態に関連する症状の１以上の観察可能及び／若しくは測定可能な低下又は非存在、罹患率及び死亡率の低下、並びに／又はクオリティオブライフの問題の改善を示す場合に、標的となる病的状態又は障害について良好に「処置」される。疾患の処置及び改善の成功を評価するための上記のパラメータは、医師が使いやすい日常的な手順によって容易に測定可能である。
【0154】
本発明の別の態様は、改善された抗がん活性を有するＴ細胞を選択するためのＧＬＵＴ１リガンドの使用である。
【0155】
前記ＧＬＵＴ１リガンドは、本明細書に記載の通りであることが好ましい。
【0156】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、例えば本明細書に記載されるように、それらのＧＬＵＴ１発現に基づいて選択される。好ましい実施形態では、選択されたＴ細胞はＧＬＵＴ１ｌｏｗＴ細胞である。
【0157】
さらなる態様は、Ｔ細胞の抗がん治療有効性のバイオマーカーとしてのＧＬＵＴ１の使用である。
【0158】
本明細書で使用する場合、それを必要とする対象における病理学的疾患、状態又は障害に対する化合物又は医薬の「治療有効性」は、例えば、化合物又は医薬の治療量を投与された後に、対象が特定の疾患、状態若しくは障害に関連する症状の１以上において観察可能及び／若しくは測定可能な低下又は非存在、罹患率及び死亡率の低下、並びに／又はクオリティオブライフの問題の改善を示す場合に明らかになり得る。疾患の処置及び改善の成功を評価するための上記のパラメータは、医師が使いやすい日常的な手順によって容易に測定可能である。
【0159】
特に、疾患ががんである場合、化合物又は医薬の「抗がん治療有効性」又は「抗がん活性」は、例えば、前記化合物又は医薬が、腫瘍若しくは転移のサイズを縮小する、又は腫瘍の成長若しくは転移の発生若しくは拡大を防止する能力に対応し得る。
【0160】
本明細書において、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、
－本発明による選択方法により改善された抗がん活性を有するＴ細胞を選択すること、及び
－改善された抗がん活性を有する前記Ｔ細胞の治療量を対象に投与すること
を含む方法も開示される。
－本発明による選択方法により改善された抗がん活性を有するＴ細胞を選択すること、及び
－改善された抗がん活性を有する前記Ｔ細胞の治療量を対象に投与すること
を含む方法も開示される。
【0161】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、それらのＧＬＵＴ１発現に基づいて選択される。好ましくは、選択されたＴ細胞はＧＬＵＴ１ｌｏｗＴ細胞である。
【0162】
本明細書で使用する用語「対象」は、温血動物、好ましくは哺乳動物を指す。本明細書で用語「哺乳動物」は、ヒト、家畜及び農場動物、並びに動物園、競技用、又はペットの動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギを含む任意の哺乳動物を指す。好ましくは、哺乳動物は霊長類であり、より好ましくはヒトである。一実施形態では、対象は、「患者」、すなわち、医療を受けることを待っている、又は医療を受けている、又は医療処置の対象であった／である／の予定の対象、又は疾患の発症についてモニターされている対象であり得る。
【0163】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は異種細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は同種異系細胞である。
【0164】
さらなる態様は、がんを処置するための医薬を製造するための本発明のＴ細胞又はＴ細胞集団の使用である。
【0165】
別の態様は、がんの処置に使用するための本発明のＴ細胞又はＴ細胞集団を含む組成物、医薬組成物、又は医薬である。
【0166】
本明細書で使用する用語「がん」は、当技術分野においてその一般的な意味を有し、特に、異常細胞の制御されない分裂によって引き起こされる疾患を指す。用語「がん」は、固形腫瘍及び血液がんを包含し、原発性がん及び転移性がんの両方を包含する。
【0167】
がんの例としては、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、消化管、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、又は子宮のがん細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【0168】
一実施形態では、前記がんは、例えば固形腫瘍などの腫瘍である。
【0169】
別の実施形態では、前記がんは血液がんである。別の態様では、前記がんは血液悪性腫瘍である。血液がんの例としては、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫）及び血液がん、例えば急性又は慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群が挙げられるが、これらに限定されない。
【0170】
がんの例としては、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、腺様嚢胞癌、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、Ｂ細胞白血病、リンパ腫又は他のＢ細胞悪性腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、中枢神経系がん、子宮頸がん、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、胚芽腫、子宮内膜がん、上衣芽腫、上衣腫、食道がん、感覚神経芽細胞腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん、骨線維性組織球腫及び骨肉腫、胆嚢がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、軟部組織肉腫、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、膵島細胞腫（膵内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、白血病、口唇及び口腔がん、肝臓がん（原発性）、上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）、肺がん、リンパ腫、マクログロブリン血症、男性乳がん、骨の悪性線維性組織球腫、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、ＮＵＴ遺伝子が関与する潜在性原発性正中線癌を伴う転移性扁平上皮頸部がん、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、骨髄性白血病、慢性（ＣＭＬ）骨髄性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患、鼻腔及び副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口がん、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔がん及び鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、中間分化型松果体実質腫瘍、松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫及び乳がん、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞（腎臓）がん、腎盂及び尿管、移行上皮がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、セザリー症候群、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、頸部扁平上皮がん、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））がん、テント上原始神経外胚葉腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚がん、精巣がん、咽頭がん、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺がん、腎盂及び尿管の移行上皮がん、栄養膜腫瘍、尿管及び腎盂がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【0171】
いくつかの態様において、がんはＢ細胞悪性腫瘍である。Ｂ細胞悪性腫瘍の例としては、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ／ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、節外性（例えば、ＭＡＬＴ）リンパ腫、結節性（例えば、モノサイトイドＢ細胞）リンパ腫、脾リンパ腫、びまん性大細胞リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病／リンパ腫、バーキットリンパ腫及びリンパ芽球性リンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【0172】
「がん」は、がん／腫瘍抗原などの表面抗原、又はがん／腫瘍マーカーに関連し得る。
【0173】
本明細書で使用する用語「がん抗原」は、「腫瘍抗原」と同等であり、がん細胞によって差次的に発現され、したがってがん細胞を標的とするために利用することができる抗原を指す。がん抗原は、明らかに腫瘍特異的な免疫応答を潜在的に刺激できる抗原である。これらの抗原のいくつかは、必ずしも発現されるわけではないが、正常細胞によってコードされている。これらの抗原は、正常細胞において通常は沈黙している（すなわち発現していない）抗原、分化の特定の段階でのみ発現する抗原、並びに胚及び胎児抗原などの一過的に発現する抗原として特徴付けることができる。他のがん抗原は、がん遺伝子（例えば、活性化ｒａｓがん遺伝子）、サプレッサー遺伝子（例えば、突然変異体ｐ５３）、及び内部欠失又は染色体転座から生じる融合タンパク質などの変異細胞遺伝子によってコードされる。さらに他のがん抗原は、ＲＮＡ及びＤＮＡ腫瘍ウイルスが有する遺伝子などのウイルス遺伝子によってコードされ得る。多くの腫瘍抗原：ＭＡＧＥ１、２、＆３（免疫によって定義される）、ＭＡＲＴ－ｌ／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２、ムチン（すなわち、ＭＵＣ－１）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、及び前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）は、複数の固形腫瘍に関して定義されている。加えて、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、エプスタインバー（ＥＢＶ）、及びヒト乳頭腫（ＨＰＶ）によってコードされるタンパク質などのウイルスタンパク質は、それぞれ肝細胞癌、リンパ腫、及び子宮頸がんの発症に重要であることが示されている。
【0174】
他のがん抗原には、７０７－ＡＰ（７０７アラニンプロリン）、ＡＦＰ（アルファ（ａ）－フェトプロテイン）、ＡＲＴ－４（Ｔ４細胞によって認識される腺癌抗原）、ＢＡＧＥ（Ｂ抗原；ｂ－カテニン／ｍ、ｂ－カテニン／変異）、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）、Ｂｃｒ－ａｂｌ（ブレークポイントクラスター領域－アベルソン）、ＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素ＩＸ）、ＣＤ１９（ＣＤ分類１９）、ＣＤ２０（ＣＤ分類２０）、ＣＤ２２（ＣＤ分類２２）、ＣＤ３０（ＣＤ分類３０）、ＣＤ３３（ＣＤ分類３３）、ＣＤ４４ｖ７／８（ＣＤ分類４４、エクソン７／８）、ＣＡＭＥＬ（黒色腫に対するＣＴＬ認識抗原）、ＣＡＰ－１（癌胎児性抗原ペプチド－１）、ＣＡＳＰ－８（カスパーゼ－８）、ＣＤＣ２７ｍ（細胞分裂周期２７変異型）、ＣＤＫ４／ｍ（サイクリン依存性キナーゼ４変異型）、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）、ＣＴ（がん／精巣（抗原））、Ｃｙｐ－Ｂ（サイクロフィリンＢ）、ＤＡＭ（分化抗原黒色腫）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（上皮成長因子受容体、バリアントＩＩＩ）、ＥＧＰ－２（上皮性糖タンパク質２）、ＥＧＰ－４０（上皮性糖タンパク質４０）、Ｅｒｂｂ２、３、４（赤芽球性白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ－２、－３、４）、ＥＬＦ２Ｍ（伸長因子２変異型）、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１（Ｅｔｓバリアント遺伝子６／急性骨髄性白血病１遺伝子ＥＴＳ）、ＦＢＰ（葉酸結合タンパク質）、ｆＡｃｈＲ（胎児アセチルコリン受容体）、Ｇ２５０（糖タンパク質２５０）、ＧＡＧＥ（Ｇ抗原）、ＧＤ２（ジシアロガングリオシド２）、ＧＤ３（ジシアロガングリオシド３）、ＧｎＴ－Ｖ（Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ）、Ｇｐ１００（糖タンパク質１００ｋＤ）、ＨＡＧＥ（ヘリコース抗原（ｈｅｌｉｃｏｓｅ ａｎｔｉｇｅｎ））、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ（ヒト表皮受容体－２／神経；ＥＧＦＲ２としても知られる）、ＨＬＡ－Ａ（ヒト白血球抗原－Ａ）ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）、ＨＳＰ７０－２Ｍ（ヒートショックタンパク質７０－２変異型）、ＨＳＴ－２（ヒト印環腫瘍－２）、ｈＴＥＲＴ又はｈＴＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）、ｉＣＥ（腸管カルボキシルエステラーゼ）、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２（インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２）、ＫＩＡＡ０２０５、ＫＤＲ（キナーゼインサートドメイン受容体）、κ軽鎖、ＬＡＧＥ（Ｌ抗原）、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ（低密度脂質受容体／ＧＤＰ－Ｌ－フコース：ｂ－Ｄ－ガラクトシダーゼ２－ａ－Ｌフコシルトランスフェラーゼ）、ＬｅＹ（ルイス－Ｙ抗体）、Ｌ１ ＣＡＭ（Ｌ１細胞接着分子）、ＭＡＧＥ（黒色腫抗原）、ＭＡＧＥ－Ａ１（黒色腫関連抗原１）、メソテリン、マウスＣＭＶ感染細胞、ＭＡＲＴ－１／メラン－Ａ（Ｔ細胞－Ｉによって認識される黒色腫抗原／黒色腫抗原Ａ）、ＭＣ１ Ｒ（メラノコルチン１受容体）、ｙｏｓｉｎ／ｍ（ミオシン変異型）、ＭＵＣ１（ムチン１）、ＭＵＭ－１、－２、－３（黒色腫遍在性変異－１、－２、－３）、ＮＡ８８－Ａ（患者Ｍ８８のＮＡ ｃＤＮＡクローン）、ＮＫＧ２Ｄ（ナチュラルキラーグループ２、メンバーＤ）リガンド、ＮＹ－ＢＲ－１（ニューヨーク乳房分化抗原１）、ＮＹ－ＥＳＯ－１（ニューヨーク食道扁平上皮癌－１）、腫瘍胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、Ｐ１５（タンパク質１５）、ｐ１９０マイナーｂｃｒ－ａｂｌ（１９０ＫＤ ｂｃｒ－ａｂｌのタンパク質）、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ（前骨髄球性白血病／レチノイン酸受容体ａ）、ＰＲＡＭＥ（黒色腫の優先的に発現する抗原）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）、ＲＡＧＥ（腎抗原）、ＲＵ１又はＲＵ２（腎遍在１又は２）、ＳＡＧＥ（肉腫抗原）、ＳＡＲＴ－１又はＳＡＲＴ－３（扁平上皮抗原拒絶腫瘍１又は３）、滑膜肉腫Ｘ－１、－２、－３、－４（ＳＳＸ－１、－２、－３、－４）、ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）、ＴＡＧ－７２（腫瘍関連糖タンパク質７２）、ＴＥＬ／ＡＭＬ１（転座Ｅｔｓファミリー白血病／急性骨髄性白血病１）、ＴＰＩ／ｍ（トリオースリン酸イソメラーゼ変異型）、ＴＲＰ－１（チロシナーゼ関連タンパク質１、又はｇｐ７５）、ＴＲＰ－２（チロシナーゼ関連タンパク質２）、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２（ＴＲＰ－２／イントロン２）、ＶＥＧＦ－Ｒ２（血管内皮増殖因子受容体２）、又はＷＴ１（ウィルムス腫瘍遺伝子）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0175】
本発明のＴ細胞集団は、単独で、又は医薬組成物として投与され得る。好ましくは、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。
【0176】
用語「薬学的に許容される賦形剤」は、あらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。前記賦形剤は、動物、好ましくはヒトに投与された場合に、有害なアレルギー又は他の望ましくない反応を生じない。ヒトでの投与の場合、調製物は、ＦＤＡ当局及びＥＭＡなどの規制当局が要求する無菌性、発熱性、並びに一般的な安全性及び純度の基準を満たさなければならない。
【0177】
これらの組成物において使用され得る薬学的に許容される賦形剤には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム）、ポリエチレングリコール、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂肪が含まれるが、これらに限定されない。
【0178】
一実施形態では、本発明による医薬組成物は、対象に注射することが可能な製剤用の薬学的に許容されるビヒクルを含む。これらは、場合によっては、滅菌水又は生理食塩水の添加時に、注射可能な溶液の構成を可能にする特に等張性の滅菌生理食塩水（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウムなど又はそのような塩の混合物）、又は乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得る。
【0179】
本発明のＴ細胞集団は、注射、摂取、輸血、注入又は移植を含む任意の適切な様式で対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞集団は、非経口投与によって対象に投与され得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のＴ細胞集団は、対象に皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、胸骨内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、注入技術によって、又は腹腔内に投与され得る。特定の実施形態では、本発明のＴ細胞集団は、皮内又は皮下注射によって対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明のＴ細胞集団は、ｉ．ｖ．注射により投与され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞集団は、リンパ節又は腫瘍部位に直接注射され得る。
【0180】
いくつかの実施形態では、対象は、自己細胞と共に投与される（又は投与されるべきである）。いくつかの実施形態では、対象は、異種細胞と共に投与される（又は投与されるべきである）。いくつかの実施形態では、対象は、同種異系細胞と共に投与される（又は投与されるべきである）。
【0181】
Ｔ細胞の投与の量と頻度は、対象の状態及び対象の疾患の種類と重症度などの要因によって決定されるが、適切な投薬量は臨床試験によって決定され得る。
【0182】
「有効量」又は「治療量」が示される場合、投与されるべき本発明のＴ細胞集団又は組成物の正確な量は、対象の年齢、体重、抗体価、及び状態の個人差を考慮して決定され得る。一般的に、本明細書に記載のＴ細胞を含む医薬組成物は、少なくとも１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８又は１×１０９細胞／ｋｇ体重又は１×１０５～１００×１０５細胞／ｋｇ体重（これらの範囲内の全ての整数値を含む）の投薬量で投与され得ると述べることができる。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投薬量のいずれか又はそれらの任意の組み合わせで複数回投与され得る。Ｔ細胞は、免疫療法において一般的に知られている注入技術を用いることによって投与することができる。特定の対象に対する最適な投薬量及び処置レジメンは、対象を疾患の徴候についてモニターし、それに応じて処置を調整することによって容易に決定することができる。
【0183】
いくつかの実施形態では、対象（例えば、ヒト）は、本発明のＴ細胞又は集団の初期投与を受け、１以上のその後の投与を受け、１以上のその後の投与は、前の投与後１５日、例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２日未満に投与される。
【0184】
いくつかの実施形態では、本発明のＴ細胞の治療有効数が対象に投与されるか、又は投与されるべきである。
【0185】
いくつかの実施形態では、対象に投与される本発明のＴ細胞集団のＴ細胞の数は、少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８又は１０９細胞である。
【0186】
いくつかの実施形態では、対象に投与される本発明のＴ細胞集団のＴ細胞の数は、約１０２～約１０９、約１０３～約１０８、約１０４～約１０７、又は約１０５～約１０６細胞の範囲である。
【0187】
いくつかの実施形態では、対象に投与される本発明のＴ細胞集団のＴ細胞の数は、約１０２～約１０９、約１０２～１０８、約１０２～１０７、約１０２～１０６、約１０２～１０５、約１０２～１０４、又は約１０２～１０３細胞の範囲である。いくつかの実施形態では、対象に投与される本発明のＴ集団のＴ細胞の数は、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、又は約１０９細胞である。
【0188】
いくつかの実施形態では、対象に投与される本発明のＴ細胞集団のＴ細胞の数は、少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８又は１０９細胞／ｋｇ体重である。
【0189】
いくつかの実施形態では、対象に投与される本発明のＴ細胞集団のＴ細胞の数は、約１０２～１０９細胞／ｋｇ体重又は１０３～１０８細胞／ｋｇ体重の範囲（これらの範囲内の全ての整数値を含む）である。
【0190】
いくつかの実施形態では、対象は、週当たり本発明のＴ細胞集団の２回以上の投与、例えば、対象に週当たり投与される本発明のＴ細胞集団の２、３、又は４回の投与を受ける。
【0191】
一実施形態では、本発明のＴ細胞集団は、別の治療薬の前、それと同時、又はその後に投与されるべきである。
【0192】
いくつかの実施形態では、本発明のＴ細胞は、例えば、化学療法剤などの薬剤による処置を含むが、これに限定されない任意の数の関連する処置様式と併せて（例えば、その前、同時又は後に）対象に投与され得る。
【0193】
化学療法剤の例としては、白金配位化合物（例えば、シスプラチン、カルボプラチン又はオキサリプラチンなど）；タキサン化合物（例えば、パクリタキセル又はドセタキセルなど）；トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカン又はトポテカンなど）；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド又はテニポシドなど）；ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン又はビノレルビンなど）；抗腫瘍ヌクレオシド誘導体（例えば、５－フルオロウラシル、ゲムシタビン又はカペシタビンなど）；アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード又はニトロソ尿素、シクロホスファミド、クロラムブシル、カルムスチン又はロムスチン；抗腫瘍アントラサイクリン誘導体（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン又はミトキサントロンなど）；抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブなど）；エストロゲン受容体アンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体モジュレーター（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ドロロキシフェン、ファスロデックス又はラロキシフェンなど）；アロマターゼ阻害剤（例えば、エキセメスタン、アナストロゾール、レトラゾール又はボロゾールなど）；分化剤（例えば、レチノイド、ビタミンＤ及びアキュテインなどのレチノイン酸代謝遮断剤[ＲＡＭＢＡ]）；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、アザシチジンなど）；キナーゼ阻害剤（例えば、フラボペリドール、メシル酸イマチニブ又はゲフィチニブなど）；ファルネシル転移酵素阻害剤；及びＨＤＡＣ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【0194】
本発明のＴ細胞は、化学療法剤の前、後、又は同時に対象に投与され得る。
【0195】
本明細書に記載のＴ細胞、細胞集団、及び組成物は、本明細書に記載の処置方法において使用され得ること、本明細書に記載の薬学的に使用するためのものであり得ること、本明細書に記載の処置に使用するためのものであり得ること、及び／又は本明細書に記載の処置のための医薬の製造において使用するためのものであり得ることが理解される。
【0196】
配列表
存在する場合の予測されるシグナルペプチドを以下の表に太字で示す。
存在する場合の予測されるシグナルペプチドを以下の表に太字で示す。
【表1】
【図面の簡単な説明】
【0197】
【図2】図２：プロテインＬ染色によるフローサイトメトリーによってモニターしたＣＤ４＋又はＣＤ８＋ Ｔ細胞集団のＧＬＵＴ１－Ｌｏ及びＧＬＵＴ１－Ｈｉサブセットにおける７日目のＣＤ１９－ＣＤ２８ ＣＡＲ（Ａ）及びＣＤ１９－４－１－ＢＢ ＣＡＲ（Ｂ）構築物の形質導入有効性の評価。４つの独立した実験のうちの１つの代表的なデータを示す（ｎ＝４の独立したドナー）。
【図3】図３：増大の７日目にＣＤ１９－ＣＤ２８ ＣＡＲ又はＣＤ１９－４－１－ＢＢ ＣＡＲ構築物で形質導入された細胞のＣＤ４及びＣＤ８発現プロファイルのフローサイトメトリーによる評価。ＧＬＵＴ１－Ｌｏ及びＧＬＵＴ１－ＨｉサブセットにおけるＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージを示す。データは、４つの独立した実験のうちの１つにおける結果の代表である。
【図4】図４：培養６日目におけるＧＬＵＴ１－Ｌｏ及びＧＬＵＴ１－ＨｉサブセットにおけるＣＤ４＋ Ｔ細胞（Ａ）及びＣＤ８＋ Ｔ細胞（Ｂ）の中のナイーブ（Ｔナイーブ、ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）、セントラルメモリー（ＴＣＭ、ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４５ＲＡ－）、エフェクターメモリー（ＴＥＭ、ＣＤ６２Ｌ－／ＣＤ４５ＲＡ－）及びＣＤ４５ＲＡを再発現するエフェクターメモリー（ＴＥＭＲＡ、ＣＤ６２Ｌ－/ＣＤ４５ＲＡ＋）のパーセンテージ。３人の独立したドナーの発現データを示す。
【図5】図５：ＣＤ１９＋ ＧＬ－Ｎａｌｍ６白血病細胞を注射し、３日目に偽Ｔ細胞、全ＣＡＲ Ｔ細胞、ＧＬＵＴ１－Ｌｏ ＣＡＲ Ｔ細胞又はＧＬＵＴ１－Ｈｉ ＣＡＲ Ｔ細胞を養子移入したＮＳＧマウスにおける生物発光イメージングによる腫瘍成長の経過観察。
【0198】
実施例
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。
【0199】
白血病腫瘍担持ＮＳＧマウスにおけるＧＬＵＴ１－Ｈｉ Ｔ細胞対ＧＬＵＴ１－Ｌｏ Ｔ細胞のそれぞれの抗がん活性を試験するために、担がんマウスに注射する前に、Ｔ細胞を異なるＣＡＲ構築物で形質導入し、ＧＬＵＴ１発現に基づいて選別した（以下の実施例を参照されたい）。
【0200】
実施例１：低い又は高いＧＬＵＴ１発現レベルを有するＴ細胞サブセットの作製のための実験手順
材料と方法
健康なドナーのリンパ球
ヒト健常ドナー末梢血単核球をＮＩＨ血液バンクから得て、１０％ＦＢＳ中で凍結し、液体窒素の中で保存した。
材料と方法
健康なドナーのリンパ球
ヒト健常ドナー末梢血単核球をＮＩＨ血液バンクから得て、１０％ＦＢＳ中で凍結し、液体窒素の中で保存した。
【0201】
ヒトＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の作製
ＣＤ２８又は４－１ＢＢ共刺激ドメインのいずれかを共発現するＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを、２９３Ｔ細胞（Ｌｅｎｔｉ－Ｘ，Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）の一過性トランスフェクションによって生成した。２９３Ｔ細胞に、リポフェクタミン３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、パッキング及びエンベロープベクターをコードするプラスミド（ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ，ｐＭＤ．２Ｇ，ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ，ｐ３０００）、並びにＥＦ１ａプロモーターの制御下でＣＤ１９ ＣＡＲをコードするプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間及び４８時間後にトランスフェクト細胞からウイルス上清を採取し、上清を３，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、細胞デブリを除去した。
ＣＤ２８又は４－１ＢＢ共刺激ドメインのいずれかを共発現するＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを、２９３Ｔ細胞（Ｌｅｎｔｉ－Ｘ，Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）の一過性トランスフェクションによって生成した。２９３Ｔ細胞に、リポフェクタミン３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、パッキング及びエンベロープベクターをコードするプラスミド（ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ，ｐＭＤ．２Ｇ，ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ，ｐ３０００）、並びにＥＦ１ａプロモーターの制御下でＣＤ１９ ＣＡＲをコードするプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間及び４８時間後にトランスフェクト細胞からウイルス上清を採取し、上清を３，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、細胞デブリを除去した。
【0202】
ヒトリンパ球を解凍し、１×１０６個／ｍＬの濃度で培養した。それらを、ＩＬ－２（４０ＩＵ／ｍＬ）の存在下で、細胞あたり１：１の比率のダイナビーズ（登録商標）ヒトＴ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で４８時間、ＡＩＭ－Ｖ培地中で活性化した。次いで、Ｔ細胞を、５ｍＬ ＡＩＭ－Ｖ、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、及び１０μｇ／ｍＬの硫酸プロタミンを補充したレンチウイルス上清（１０ｍｌ）中２×１０６個／ｍＬで再浮遊させ、その後、６ウェルプレート中で、３２℃で２時間、２，０００×ｇで遠心分離した。次いで、プレートを３７℃で一晩インキュベートし、３日目にこのプロセスを繰り返した。２回目の一晩インキュベーション後に、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズを除去し、Ｔ細胞を選別し（下記参照）、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充したＡＩＭ－Ｖ培地に０．３×１０６／ｍＬで再浮遊させた。次いで、実験に使用する前に、細胞をさらに４８～７２時間培養した。作製後、Ｔ細胞（ＣＡＲ形質導入した及び偽の両方）を、５％熱不活化ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍｍｏｌ／Ｌのｌ－グルタミン、１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充したＡＩＭ－Ｖ培地中で培養した。
【0203】
ＧＬＵＴ１発現に基づく細胞選別
表面ＧＬＵＴ１発現を、以前に記載された（Ｍａｎｅｌら，２００３．Ｃｅｌｌ．１１５（４）：４４９－５９；Ｋｉｍら，２００４．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ．１：４１）ようにｅＧＦＰ（配列の配列番号２９の融合タンパク質）に融合したＨＴＬＶ受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）リガンド（配列番号１５）に対する結合によってモニターした（Ｍｅｔａｆｏｒａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＧＬＵＴ１発現に基づく細胞の選別のために、５０×１０６個の細胞を、刺激後４日目、すなわち、ＣＤ１９－ＣＡＲによる２回目の形質導入の直後に、又は刺激後２日目、すなわち、ＣＤ１９－ＣＡＲによる形質導入の前に染色した（同様の結果、データは示さず）。陰性染色を、無染色細胞と比較して評価した。ＧＬＵＴ１－Ｌｏ及びＧＬＵＴ１－Ｈｉと命名した細胞を、ＣＤ１９－ＣＡＲ染色に関係なく陽性染色集団（一般的に全Ｔ細胞の８５％超）内で区別した。陽性集団内で、ＧＬＵＴ１－Ｌｏ細胞及びＧＬＵＴ１－Ｈｉ細胞を、それぞれ１５％の最低及び最高のＧＬＵＴ１染色で染色された細胞として同定した。細胞をＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で選別し、評価前にさらに７２～９６時間培養した。
表面ＧＬＵＴ１発現を、以前に記載された（Ｍａｎｅｌら，２００３．Ｃｅｌｌ．１１５（４）：４４９－５９；Ｋｉｍら，２００４．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ．１：４１）ようにｅＧＦＰ（配列の配列番号２９の融合タンパク質）に融合したＨＴＬＶ受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）リガンド（配列番号１５）に対する結合によってモニターした（Ｍｅｔａｆｏｒａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＧＬＵＴ１発現に基づく細胞の選別のために、５０×１０６個の細胞を、刺激後４日目、すなわち、ＣＤ１９－ＣＡＲによる２回目の形質導入の直後に、又は刺激後２日目、すなわち、ＣＤ１９－ＣＡＲによる形質導入の前に染色した（同様の結果、データは示さず）。陰性染色を、無染色細胞と比較して評価した。ＧＬＵＴ１－Ｌｏ及びＧＬＵＴ１－Ｈｉと命名した細胞を、ＣＤ１９－ＣＡＲ染色に関係なく陽性染色集団（一般的に全Ｔ細胞の８５％超）内で区別した。陽性集団内で、ＧＬＵＴ１－Ｌｏ細胞及びＧＬＵＴ１－Ｈｉ細胞を、それぞれ１５％の最低及び最高のＧＬＵＴ１染色で染色された細胞として同定した。細胞をＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で選別し、評価前にさらに７２～９６時間培養した。
【0204】
フローサイトメトリー解析
細胞表面タンパク質の検出には、以下のヒトモノクローナル抗体：ＣＤ３－ＡＰＣ／Ｃｙ７、ＣＤ８－ＢＶ６０５、ＣＤ４－ＡＰＣ－Ｒ７００、ＣＤ４－Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、及びＣＤ６９－ＡＰＣ（全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を使用した。死細胞を、ｅＦｌｕｏｒ ５０６ ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて同定した。ＧＦＰ発現白血病をＦＩＴＣチャネルにより特定した。
細胞表面タンパク質の検出には、以下のヒトモノクローナル抗体：ＣＤ３－ＡＰＣ／Ｃｙ７、ＣＤ８－ＢＶ６０５、ＣＤ４－ＡＰＣ－Ｒ７００、ＣＤ４－Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、及びＣＤ６９－ＡＰＣ（全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を使用した。死細胞を、ｅＦｌｕｏｒ ５０６ ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて同定した。ＧＦＰ発現白血病をＦＩＴＣチャネルにより特定した。
【0205】
細胞表面のＣＡＲ発現を、コンジュゲートＣＤ１９－Ｆｃ－ＰＥタンパク質による染色、又はプロテインＬ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）による染色後にストレプトアビジン－ＰＥとのインキュベーションのいずれかによって７日目に評価した。染色を、ＬＳＲ ＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施するフローサイトメトリーによって評価し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータを分析した。
【0206】
マウス
Ｂｌ６バックグラウンドのＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ｇｃ－／－（ＮＳＧ）マウスは、フレデリックのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供された。このマウスをベセスダのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの標準の病原体のない施設に収容した。動物の世話及び実験は、米国立衛生研究所（ＮＩＨ）のガイドラインに従って実施した。
Ｂｌ６バックグラウンドのＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ｇｃ－／－（ＮＳＧ）マウスは、フレデリックのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供された。このマウスをベセスダのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの標準の病原体のない施設に収容した。動物の世話及び実験は、米国立衛生研究所（ＮＩＨ）のガイドラインに従って実施した。
【0207】
細胞株
Ｂ－ＡＬＬ細胞株は、ＧＦＰ－ルシフェラーゼ安定形質導入Ｎａｌｍ６株（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｒａｎｃｈ，ＮＣＩ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ)を含んだ。Ｎａｌｍ６を、１０％熱不活化ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地で培養した。
Ｂ－ＡＬＬ細胞株は、ＧＦＰ－ルシフェラーゼ安定形質導入Ｎａｌｍ６株（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｒａｎｃｈ，ＮＣＩ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ)を含んだ。Ｎａｌｍ６を、１０％熱不活化ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地で培養した。
【0208】
インビボ腫瘍実験
動物実験は、ＮＣＩベセスダ動物管理及び使用委員会（ＮＣＩ Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認されたプロトコルの下で実施した。Ｂ－ＡＬＬ細胞株をＮＳＧマウスにＩＶ注射し（１×１０６個）、４日後、マウスに２００万個のＣＡＲ Ｔ細胞又は同数の非形質導入ＭＯＣＫ対照Ｔ細胞を静脈内注射した。白血病の負荷を、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して評価した。３ｍgのＤ－ルシフェリン（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をマウスに腹腔内注射した後、マウスを４分後に３０秒の露光時間でイメージングした。発光画像を、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅバージョン４．１ソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、光子／ｓ／ｃｍ２／ｓｒとして評価した。表現型決定のための脾臓及び骨髄を採取するために、白血病細胞の増殖後にマウスから採取した。
動物実験は、ＮＣＩベセスダ動物管理及び使用委員会（ＮＣＩ Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認されたプロトコルの下で実施した。Ｂ－ＡＬＬ細胞株をＮＳＧマウスにＩＶ注射し（１×１０６個）、４日後、マウスに２００万個のＣＡＲ Ｔ細胞又は同数の非形質導入ＭＯＣＫ対照Ｔ細胞を静脈内注射した。白血病の負荷を、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して評価した。３ｍgのＤ－ルシフェリン（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をマウスに腹腔内注射した後、マウスを４分後に３０秒の露光時間でイメージングした。発光画像を、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅバージョン４．１ソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、光子／ｓ／ｃｍ２／ｓｒとして評価した。表現型決定のための脾臓及び骨髄を採取するために、白血病細胞の増殖後にマウスから採取した。
【0209】
結果
Ｔ細胞を、ＧＬＵＴ１グルコース輸送体発現に基づいて選択した（図１）。
Ｔ細胞を、ＧＬＵＴ１グルコース輸送体発現に基づいて選択した（図１）。
【0210】
実施例２：ＧＬＵＴ１－Ｈｉ ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＧＬＵＴ１－Ｌｏ ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞よりも高い形質導入有効性を示した。
材料と方法
ＣＤ１９－ＣＤ２８又はＣＤ１９－４－１ＢＢ ＣＡＲ構築物を保有するＴ細胞を、実施例１に記載のように作製した。ＧＬＵＴ１－Ｌｏ細胞及びＧＬＵＴ１－Ｈｉ細胞を、実施例１に記載したように、４日目に選別した。７日目に、形質導入の有効性を、実施例１に記載したように、タンパク質Ｌ染色によってモニターした表面ＣＤ１９－ＣＡＲ発現レベルの関数として、ゲートを設定したＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞についてフローサイトメトリーによって評価した。
材料と方法
ＣＤ１９－ＣＤ２８又はＣＤ１９－４－１ＢＢ ＣＡＲ構築物を保有するＴ細胞を、実施例１に記載のように作製した。ＧＬＵＴ１－Ｌｏ細胞及びＧＬＵＴ１－Ｈｉ細胞を、実施例１に記載したように、４日目に選別した。７日目に、形質導入の有効性を、実施例１に記載したように、タンパク質Ｌ染色によってモニターした表面ＣＤ１９－ＣＡＲ発現レベルの関数として、ゲートを設定したＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞についてフローサイトメトリーによって評価した。
【0211】
結果
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の両方のサブセットに形質導入したが、ＣＤ４＋細胞の形質導入はＣＤ８＋細胞よりも有意に高く、どちらの場合も、ＧＬＵＴ１－Ｈｉリンパ球はＧＬＵＴ１－Ｌｏリンパ球よりも高い頻度で形質導入された（図２）。
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の両方のサブセットに形質導入したが、ＣＤ４＋細胞の形質導入はＣＤ８＋細胞よりも有意に高く、どちらの場合も、ＧＬＵＴ１－Ｈｉリンパ球はＧＬＵＴ１－Ｌｏリンパ球よりも高い頻度で形質導入された（図２）。
【0212】
実施例３：ＧＬＵＴ１－Ｈｉ Ｔ細胞は偏ったＣＤ４／ＣＤ８比を示した。
材料と方法
ＣＤ１９－ＣＤ２８又はＣＤ１９－４－１ＢＢ ＣＡＲ構築物を保有するＴ細胞を、実施例１に記載したように作製した。ＧＬＵＴ１－Ｌｏ及びＧＬＵＴ１－Ｈｉ細胞を、実施例１に記載したように、４日目に選別した。７日目に、形質導入細胞のＣＤ４及びＣＤ８発現プロファイルをフローサイトメトリーにより評価した。
材料と方法
ＣＤ１９－ＣＤ２８又はＣＤ１９－４－１ＢＢ ＣＡＲ構築物を保有するＴ細胞を、実施例１に記載したように作製した。ＧＬＵＴ１－Ｌｏ及びＧＬＵＴ１－Ｈｉ細胞を、実施例１に記載したように、４日目に選別した。７日目に、形質導入細胞のＣＤ４及びＣＤ８発現プロファイルをフローサイトメトリーにより評価した。
【0213】
結果
ＧＬＵＴ１－Ｈｉ Ｔ細胞は、ＧＬＵＴ１－Ｌｏ Ｔ細胞よりも高いレベルで形質導入されたが、両方のサブセットは顕著なレベルで形質導入された。興味深いことに、ＧＬＵＴ１－Ｈｉサブセット内では、およそ１：３の偏ったＣＤ４＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞比であったが、この比率はＧＬＵＴ１－低サブセット内では１：１に近くなった（図３）。
ＧＬＵＴ１－Ｈｉ Ｔ細胞は、ＧＬＵＴ１－Ｌｏ Ｔ細胞よりも高いレベルで形質導入されたが、両方のサブセットは顕著なレベルで形質導入された。興味深いことに、ＧＬＵＴ１－Ｈｉサブセット内では、およそ１：３の偏ったＣＤ４＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞比であったが、この比率はＧＬＵＴ１－低サブセット内では１：１に近くなった（図３）。
【0214】
実施例４：ＧＬＵＴ１－Ｈｉサブセットは、ＧＬＵＴ１－Ｌｏサブセットと比較して減少したＣＤ８ナイーブＴ細胞を含んだ。
材料と方法
ＣＤ１９－ＣＤ２８又はＣＤ１９－４－１ＢＢ ＣＡＲ構築物を保有するＴ細胞を、実施例１に記載したように作製した。ＧＬＵＴ１－Ｌｏ及びＧＬＵＴ１－Ｈｉ細胞を、実施例１に記載したように、４日目に選別した。６日目に、ＧＬＵＴ１－Ｌｏ及びＧＬＵＴ１－Ｈｉサブセット内のＴリンパ球の表現型を、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＡマーカーで染色し、ナイーブ（ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）、セントラルメモリー（ＴＣＭ、ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４５ＲＡ－）、エフェクターメモリー（ＥＭ、ＣＤ６２Ｌ－／ＣＤ４５ＲＡ－）及びＣＤ４５ＲＡを再発現するエフェクターメモリー（ＴＥＭＲＡ、ＣＤ６２Ｌ－／ＣＤ４５ＲＡ＋）を分離することにより、フローサイトメトリーによって評価した。
材料と方法
ＣＤ１９－ＣＤ２８又はＣＤ１９－４－１ＢＢ ＣＡＲ構築物を保有するＴ細胞を、実施例１に記載したように作製した。ＧＬＵＴ１－Ｌｏ及びＧＬＵＴ１－Ｈｉ細胞を、実施例１に記載したように、４日目に選別した。６日目に、ＧＬＵＴ１－Ｌｏ及びＧＬＵＴ１－Ｈｉサブセット内のＴリンパ球の表現型を、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＡマーカーで染色し、ナイーブ（ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）、セントラルメモリー（ＴＣＭ、ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４５ＲＡ－）、エフェクターメモリー（ＥＭ、ＣＤ６２Ｌ－／ＣＤ４５ＲＡ－）及びＣＤ４５ＲＡを再発現するエフェクターメモリー（ＴＥＭＲＡ、ＣＤ６２Ｌ－／ＣＤ４５ＲＡ＋）を分離することにより、フローサイトメトリーによって評価した。
【0215】
結果
ＣＤ８＋ Ｔ細胞の表現型の差は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞よりも顕著であり、ＧＬＵＴ１－ＬｏサブセットではナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージが有意により高く、ＧＬＵＴ１－ＨｉサブセットではエフェクターメモリーとセントラルメモリーＣＤ８リンパ球がより高い傾向があった（図４）。
ＣＤ８＋ Ｔ細胞の表現型の差は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞よりも顕著であり、ＧＬＵＴ１－ＬｏサブセットではナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージが有意により高く、ＧＬＵＴ１－ＨｉサブセットではエフェクターメモリーとセントラルメモリーＣＤ８リンパ球がより高い傾向があった（図４）。
【0216】
実施例５：ＧＬＵＴ１発現レベルに基づいて選択されたＴ細胞の強力な抗白血病活性
材料と方法
ＮＳＧマウスに、１×１０６個のＣＤ１９＋ＧＬ－Ｎａｌｍ６白血病細胞を注射し、３日目に、実施例１に記載したように、低い又は高いＧＬＵＴ１発現に基づいて全ての又はＦＡＣＳ選別した２×１０６個のＣＤ１９－ＢＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞をマウスに養子移入した。腫瘍成長後に、実施例１に記載したように生物発光イメージングを行った。
材料と方法
ＮＳＧマウスに、１×１０６個のＣＤ１９＋ＧＬ－Ｎａｌｍ６白血病細胞を注射し、３日目に、実施例１に記載したように、低い又は高いＧＬＵＴ１発現に基づいて全ての又はＦＡＣＳ選別した２×１０６個のＣＤ１９－ＢＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞をマウスに養子移入した。腫瘍成長後に、実施例１に記載したように生物発光イメージングを行った。
【0217】
結果
移入されたＧＬＵＴ１－Ｌｏ及びＧＬＵＴ１－ＨｉＴ細胞の活性を、担がんＮＳＧマウスにおいてモニターした。ルシフェラーゼ陽性ＣＤ１９＋Ｎａｌｍ６白血病細胞を保有するＮＳＧマウスのデータから、ＧＬＵＴ１－Ｈｉ ＣＤ１９－ＢＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＧＬＵＴ１－Ｌｏの養子移入時に実質的に改善された腫瘍拒絶反応が実証された（図５）。
移入されたＧＬＵＴ１－Ｌｏ及びＧＬＵＴ１－ＨｉＴ細胞の活性を、担がんＮＳＧマウスにおいてモニターした。ルシフェラーゼ陽性ＣＤ１９＋Ｎａｌｍ６白血病細胞を保有するＮＳＧマウスのデータから、ＧＬＵＴ１－Ｈｉ ＣＤ１９－ＢＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＧＬＵＴ１－Ｌｏの養子移入時に実質的に改善された腫瘍拒絶反応が実証された（図５）。
【0218】
実施例６：ＧＬＵＴ１発現レベルに基づいて選択された様々な種類のＴ細胞の強力な抗白血病活性
材料と方法
ＮＳＧマウスに１×１０６個のＣＤ１９＋ＧＬ－Ｎａｌｍ６白血病細胞を注射し、３日目に、実施例１に記載したように、低い又は高いＧＬＵＴ１発現に基づいて全ての又はＦＡＣＳ選別した２×１０６個のＣＤ１９－２８－ＣＡＲ（図６Ａ）又はＣＤ１９－１－４ＢＢ－ＣＡＲ（図６Ｂ）Ｔ細胞をマウスに養子移入した。腫瘍成長後に、実施例１に記載したように生物発光イメージングを行った。
材料と方法
ＮＳＧマウスに１×１０６個のＣＤ１９＋ＧＬ－Ｎａｌｍ６白血病細胞を注射し、３日目に、実施例１に記載したように、低い又は高いＧＬＵＴ１発現に基づいて全ての又はＦＡＣＳ選別した２×１０６個のＣＤ１９－２８－ＣＡＲ（図６Ａ）又はＣＤ１９－１－４ＢＢ－ＣＡＲ（図６Ｂ）Ｔ細胞をマウスに養子移入した。腫瘍成長後に、実施例１に記載したように生物発光イメージングを行った。
【0219】
結果
これらの実験を、複数のＴ細胞ドナーについて繰り返し、ＣＤ１９－２８－ＣＡＲとＣＤ１９－４－１ＢＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞の両方で実験を行った。図７に示すように、最少数の養子移入されたＴ細胞を使用したストレスモデルでは、ＧＬＵＴ１－Ｈｉ Ｔ細胞を投与した全てのマウスは４３日目に有意な腫瘍負荷を有し、ＣＤ１９－２８－ＣＡＲ構築物を投与したマウスは白血病のために死亡した。全部の「標準の」ＣＤ１９－２８－ＣＡＲ又はＣＤ１９－４－１ＢＢ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与した４匹のマウスのうち３匹は、有意な白血病負荷を有したか、又は疾患のために死亡したが、ＣＤ１９－２８－ＣＡＲ ＧＬＵＴ１－Ｌｏ群の４匹のマウスのうち２匹及びＣＤ１９－４－１ＢＢ－ＣＡＲ ＧＬＵＴ１－Ｌｏ群の６匹のマウスのうち５匹は低い腫瘍負荷を有した（図６）。
これらの実験を、複数のＴ細胞ドナーについて繰り返し、ＣＤ１９－２８－ＣＡＲとＣＤ１９－４－１ＢＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞の両方で実験を行った。図７に示すように、最少数の養子移入されたＴ細胞を使用したストレスモデルでは、ＧＬＵＴ１－Ｈｉ Ｔ細胞を投与した全てのマウスは４３日目に有意な腫瘍負荷を有し、ＣＤ１９－２８－ＣＡＲ構築物を投与したマウスは白血病のために死亡した。全部の「標準の」ＣＤ１９－２８－ＣＡＲ又はＣＤ１９－４－１ＢＢ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与した４匹のマウスのうち３匹は、有意な白血病負荷を有したか、又は疾患のために死亡したが、ＣＤ１９－２８－ＣＡＲ ＧＬＵＴ１－Ｌｏ群の４匹のマウスのうち２匹及びＣＤ１９－４－１ＢＢ－ＣＡＲ ＧＬＵＴ１－Ｌｏ群の６匹のマウスのうち５匹は低い腫瘍負荷を有した（図６）。
【0220】
実施例７：低いＧＬＵＴ１発現レベルに基づいて選択された養子移入Ｔ細胞の存続の増加
材料と方法
ＮＳＧマウスに、１×１０６個のＣＤ１９＋ＧＬ－Ｎａｌｍ６白血病細胞を注射し、３日目に、実施例１に記載したように、２×１０６個のＦＡＣＳ選別したＣＤ４－１－１ＢＢ－ＣＡＲ ＧＬＵＴ１－Ｌｏ又はＧＬＵＴ１－ＨｉＴ細胞をマウスに養子移入した。腫瘍成長後に、実施例１に記載したように生物発光イメージングを行った。４３日目に、各マウスの脾臓におけるヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって測定し、養子移入されたＴ細胞の存続を定量化した。
材料と方法
ＮＳＧマウスに、１×１０６個のＣＤ１９＋ＧＬ－Ｎａｌｍ６白血病細胞を注射し、３日目に、実施例１に記載したように、２×１０６個のＦＡＣＳ選別したＣＤ４－１－１ＢＢ－ＣＡＲ ＧＬＵＴ１－Ｌｏ又はＧＬＵＴ１－ＨｉＴ細胞をマウスに養子移入した。腫瘍成長後に、実施例１に記載したように生物発光イメージングを行った。４３日目に、各マウスの脾臓におけるヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって測定し、養子移入されたＴ細胞の存続を定量化した。
【0221】
結果
腫瘍負荷が低いことは、養子移入後４３日目にＧＬＵＴ１－Ｈｉ群よりもＧＬＵＴ１－Ｌｏ群において養子移入されたＴ細胞のパーセンテージが高いことに関連した（図７）。
腫瘍負荷が低いことは、養子移入後４３日目にＧＬＵＴ１－Ｈｉ群よりもＧＬＵＴ１－Ｌｏ群において養子移入されたＴ細胞のパーセンテージが高いことに関連した（図７）。
【0222】
結論として、担がんマウスに養子移入したＧＬＵＴ１－Ｌｏ Ｔ細胞は、ＧＬＵＴ１－Ｈｉ Ｔ細胞及び全Ｔ細胞よりも腫瘍負荷をより良好に減少させることができる。したがって、低いＧＬＵＴ１発現レベルに基づいて選択されたＴ細胞は、増加した抗がん活性及びエフェクター機能を示す。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-07-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】