特表 2024-505114 核酸合成のための再利用可能な開始剤を再生するための方法およびキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-02

(54)【発明の名称】核酸合成のための再利用可能な開始剤を再生するための方法およびキット

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/34 20060101AFI20240126BHJP

   C12N 9/24 20060101ALN20240126BHJP

   C12N 9/16 20060101ALN20240126BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20240126BHJP

【ＦＩ】

C12P19/34

C12N9/24 ZNA

C12N9/16 B

C12N15/11 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023562633

(86)(22)【出願日】2021-12-20

(85)【翻訳文提出日】2023-08-17

(86)【国際出願番号】 US2021064298

(87)【国際公開番号】W WO2022140232

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】17/128,677

(32)【優先日】2020-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523234876

【氏名又は名称】チェン，チェン－ヤオ

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100126354

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 尚

(72)【発明者】

【氏名】チェン，チェン－ヤオ

(72)【発明者】

【氏名】チェン，イー－ウェン

【テーマコード（参考）】

4B064

【Ｆターム（参考）】

4B064AF27

4B064CA21

4B064CB04

4B064CB07

4B064CB30

(57)【要約】

核酸合成および再利用可能な合成開始剤の再生のための方法であって、ポリメラーゼを使用して固定化された開始剤に連結ヌクレオチドを組み込む工程、ポリメラーゼを使用して前記連結ヌクレオチドの直後に核酸を合成する工程、核酸中の連結ヌクレオチドの基質塩基をＤＮＡグリコシラーゼによって塩基切除して脱塩基部位を生成させる工程、前記脱塩基部位をエンドヌクレアーゼによって切断して前記核酸を前記開始剤から放出する工程、ならびに３’ホスファターゼ活性保有酵素によって前記開始剤の３’末端をその元の形態に戻すよう変換する工程を含む方法。前述の方法に基づくキットおよび再利用可能な開始剤を再生するための方法も開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸合成およびそのような合成のための再利用可能な開始剤の再生のための方法であって、以下の工程を含む方法：
核酸合成のために固体支持体に接着させた開始剤を、基質塩基、基質糖および３’ヒドロキシル基を有する連結ヌクレオチドにポリメラーゼの存在下で曝露して、その結果、前記連結ヌクレオチドが前記開始剤に組み込まれるようにする工程；
前記連結ヌクレオチドを含有する前記開始剤をヌクレオチドモノマーに前記ポリメラーゼの存在下で曝露して、その結果、核酸が合成されて前記連結ヌクレオチドの直後で前記開始剤に結合されるようにする工程；
前記基質塩基を有する連結ヌクレオチドを認識可能かつ切除可能である単官能性ＤＮＡグリコシラーゼを提供する工程；
前記基質塩基を前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによる切除処理に供し、その結果、前記基質塩基が前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによって切除されて脱塩基部位が生成されるされるようにする工程；
得られた脱塩基部位を認識可能であり、前記基質糖を切断可能な脱塩基部位エンドヌクレアーゼを提供する工程；
前記脱塩基部位を前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼによる切断処理に供し、その結果、前記脱塩基部位において前記基質糖および前記核酸の骨格の両方が切断されて、前記核酸が前記開始剤から放出され、その結果、前記開始剤の３’末端ヌクレオチドが３’リン酸基を有し、その結果、前記合成された核酸の５’末端ヌクレオチドが５’リン酸基を有するようにする工程；
３’ホスファターゼ活性保有酵素を提供する工程；ならびに
前記開始剤の３’末端ヌクレオチドを、前記３’ホスファターゼ活性保有酵素による脱リン酸化処理に供し、その結果、前記開始剤の３’末端ヌクレオチドの３’リン酸基が、元の３’ヒドロキシル基に戻るよう変換される工程。

【請求項2】

前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼが、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、一本鎖選択的単官能性ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ１、メチル結合ドメイングリコシラーゼ４、チミンＤＮＡグリコシラーゼ、ｍｕｔＹホモログＤＮＡグリコシラーゼ、アルキルプリングリコシラーゼＣ、アルキルプリングリコシラーゼＤ、脱塩基部位リアーゼ活性を有さない８－オキソ－グアニングリコシラーゼ１、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＩＩＩ様１、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ様グリコシラーゼ１、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ様グリコシラーゼ２、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ様グリコシラーゼ３、およびその酵素的に活性な断片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼがウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼおよびアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼのうちの１つである、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、およびそれらの酵素的に活性な断片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記３’ホスファターゼ活性保有酵素が、ポリヌクレオチドキナーゼ３’－ホスファターゼ、３’－ホスホエステラーゼ、およびそれらの酵素的に活性な断片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記３’ホスファターゼ活性保有酵素が、３’－ホスファターゼ活性を有するＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ、およびジンクフィンガーＤＮＡ ３’－ホスホエステラーゼ、からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記連結ヌクレオチドの基質塩基が、ウラシル、ヒポキサンチン、チミン、シトシン、グアニン、５－フルオロウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシルシトシン、３－メチルアデニン、３－メチルグアニン、７－メチルアデニン、７－メチルグアニン、Ｎ^６－メチルアデニン、８－オキソ－７，８－ジヒドログアニン、５－ヒドロキシルシトシン、５－ヒドロキシウラシル、ジヒドロキシウラシル、エテノシトシン、エテノアデニン、チミングリコール、シトシングリコール、２，６－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－Ｎ－メチルホルムアミドピリミジン、アデニンのホルムアミドピリミジン誘導体、グアニンのホルムアミドピリミジン誘導体、グアニンに対合したアデニン、グアニンに対合したウラシル、アデニンに対合したウラシル、グアニンに対合したチミン、グアニンに対合したエテノシトシン、８－オキソ－７，８－ジヒドログアニンに対合したアデニン、およびグアニンに対合した２－ヒドロキシルアデニンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記連結ヌクレオチドの基質塩基が、ウラシルまたはヒポキサンチンである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記開始剤、前記合成された核酸および前記連結ヌクレオチドが、それぞれ鋳型非依存型および鋳型依存型のうちの１つである、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記ポリメラーゼが、ファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＣ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＸ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＹ ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、およびそれらの酵素的に活性な断片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

核酸合成およびそのような合成のための再利用可能な核酸の再生のためのキットであって、
核酸合成のためのポリメラーゼおよび連結ヌクレオチド；
単官能性ＤＮＡグリコシラーゼ；
脱塩基部位エンドヌクレアーゼ：ならびに
３’ホスファターゼ活性保有酵素；
を含み、請求項１に記載の方法に従って使用されるキット。

【請求項13】

核酸合成のための再利用可能な開始剤を再生する方法であって、以下の工程を含む方法：
単官能性ＤＮＡグリコシラーゼを提供する工程；
固体支持体に接着させた核酸合成のための開始剤と、基質塩基および基質糖を有する連結ヌクレオチドの直後で前記開始剤に連結されている合成された核酸とを提供し、前記基質塩基を有する連結ヌクレオチドが、前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによって認識可能および切除可能である工程；
前記基質塩基を前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによる切除処理に供し、その結果、前記基質塩基が前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによって切除されて、脱塩基部位が生成されるようにする工程；
得られた脱塩基部位を認識可能であり、前記基質糖を切断可能な脱塩基部位エンドヌクレアーゼを提供する工程；
前記脱塩基部位を前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼによる切断処理に供し、その結果、前記脱塩基部位において前記基質糖および前記核酸の骨格の両方が切断されて、前記合成された核酸が前記開始剤から放出され、その結果、前記開始剤の３’末端ヌクレオチドが３’リン酸基を有し、その結果、前記合成された核酸の５’末端ヌクレオチドが５’リン酸基を有するようにする工程；
３’ホスファターゼ活性保有酵素を提供する工程；ならびに
前記開始剤の３’末端ヌクレオチドを、前記３’ホスファターゼ活性保有酵素による脱リン酸化処理に供し、その結果、前記開始剤の３’末端ヌクレオチドの３’リン酸基が、元の３’ヒドロキシル基に戻るよう変換される工程。

【請求項14】

前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼが、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、一本鎖選択的単官能性ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ１、メチル結合ドメイングリコシラーゼ４、チミンＤＮＡグリコシラーゼ、ｍｕｔＹホモログＤＮＡグリコシラーゼ、アルキルプリングリコシラーゼＣ、アルキルプリングリコシラーゼＤ、脱塩基部位リアーゼ活性を有さない８－オキソ－グアニングリコシラーゼ１、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＩＩＩ様１、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ様グリコシラーゼ１、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ様グリコシラーゼ２、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ様グリコシラーゼ３、およびその酵素的に活性な断片からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼがウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼおよびアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼのうちの１つである、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、およびそれらの酵素的に活性な断片からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。

【請求項17】

前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記３’ホスファターゼ活性保有酵素が、ポリヌクレオチドキナーゼ３’－ホスファターゼ、３’－ホスホエステラーゼ、およびそれらの酵素的に活性な断片からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。

【請求項19】

前記３’ホスファターゼ活性保有酵素が、３’－ホスファターゼ活性を有するＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ、およびジンクフィンガーＤＮＡ ３’－ホスホエステラーゼ、からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記連結ヌクレオチドの基質塩基が、ウラシル、ヒポキサンチン、チミン、シトシン、グアニン、５－フルオロウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシルシトシン、３－メチルアデニン、３－メチルグアニン、７－メチルアデニン、７－メチルグアニン、Ｎ^６－メチルアデニン、８－オキソ－７，８－ジヒドログアニン、５－ヒドロキシルシトシン、５－ヒドロキシウラシル、ジヒドロキシウラシル、エテノシトシン、エテノアデニン、チミングリコール、シトシングリコール、２，６－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－Ｎ－メチルホルムアミドピリミジン、アデニンのホルムアミドピリミジン誘導体、グアニンのホルムアミドピリミジン誘導体、グアニンに対合したアデニン、グアニンに対合したウラシル、アデニンに対合したウラシル、グアニンに対合したチミン、グアニンに対合したエテノシトシン、８－オキソ－７，８－ジヒドログアニンに対合したアデニン、およびグアニンに対合した２－ヒドロキシルアデニンからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。

【請求項21】

前記開始剤、前記合成された核酸および前記連結ヌクレオチドが、それぞれ鋳型非依存型および鋳型依存型のうちの１つである、請求項１３に記載の方法。

【請求項22】

核酸を合成する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）固体支持体に接着させ、基質塩基、基質糖および３’ヒドロキシル基を有する連結ヌクレオチドと結合させた開始剤を提供する工程；
ｂ）前記連結ヌクレオチドに結合させた前記開始剤を、ポリメラーゼの存在下でヌクレオチドモノマーに曝露して、その結果、核酸が合成されて、前記ヌクレオチドモノマーの１つと前記連結ヌクレオチドの３’ヒドロキシル基とを反応させることによって、前記開始剤と結合させるようにする工程；
ｃ）前記基質塩基を単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによる切除処理に供し、その結果、前記基質塩基が前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによって切除されて、脱塩基部位が生成される工程；
ｄ）前記脱塩基部位を脱塩基部位エンドヌクレアーゼによる切断処理に供し、その結果、前記脱塩基部位において前記基質糖および糖リン酸骨格の両方が切断されて、前記核酸が前記開始剤から放出され、それにより、前記開始剤の３’末端ヌクレオチドに３’リン酸基が形成される工程；ならびに
ｅ）前記３’リン酸基を有する３’末端ヌクレオチドを、３’ホスファターゼ活性保有酵素で脱リン酸化処理して、その結果、前記３’末端ヌクレオチドにヒドロキシル基が形成されて、前記開始剤を再生させる工程。

【請求項23】

前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼが、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、一本鎖選択的単官能性ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ１、メチル結合ドメイングリコシラーゼ４、チミンＤＮＡグリコシラーゼ、ｍｕｔＹホモログＤＮＡグリコシラーゼ、アルキルプリングリコシラーゼＣ、アルキルプリングリコシラーゼＤ、脱塩基部位リアーゼ活性を有さない８－オキソ－グアニングリコシラーゼ１、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＩＩＩ様１、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ様グリコシラーゼ１、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ様グリコシラーゼ２、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ様グリコシラーゼ３である、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼがウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼまたはアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼである、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩの酵素的に活性な断片、またはエンドヌクレアーゼＩＩＩの酵素的に活性な断片である、請求項２２に記載の方法。

【請求項26】

前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである、請求項２２に記載の方法。

【請求項27】

前記３’ホスファターゼ活性保有酵素が、ポリヌクレオチドキナーゼ３’－ホスファターゼ、または３’－ホスホエステラーゼである、請求項２２に記載の方法。

【請求項28】

前記３’ホスファターゼ活性保有酵素が、３’－ホスファターゼ活性を有するＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ、またはジンクフィンガーＤＮＡ ３’－ホスホエステラーゼ、である、請求項２２に記載の方法。

【請求項29】

前記連結ヌクレオチドの基質塩基が、ウラシル、ヒポキサンチン、チミン、シトシン、グアニン、５－フルオロウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシルシトシン、３－メチルアデニン、３－メチルグアニン、７－メチルアデニン、７－メチルグアニン、Ｎ６－メチルアデニン、８－オキソ－７，８－ジヒドログアニン、５－ヒドロキシルシトシン、５－ヒドロキシウラシル、ジヒドロキシウラシル、エテノシトシン、エテノアデニン、チミングリコール、シトシングリコール、２，６－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－Ｎ－メチルホルムアミドピリミジン、アデニンのホルムアミドピリミジン誘導体、グアニンのホルムアミドピリミジン誘導体、グアニンに対合したアデニン、グアニンに対合したウラシル、アデニンに対合したウラシル、グアニンに対合したチミン、グアニンに対合したエテノシトシン、８－オキソ－７，８－ジヒドログアニンに対合したアデニン、またはグアニンに対合した２－ヒドロキシルアデニンである、請求項２２に記載の方法。

【請求項30】

前記連結ヌクレオチドの基質塩基が、ウラシルまたはヒポキサンチンである、請求項２２に記載の方法。

【請求項31】

前記基質塩基がウラシルであり、それによりデオキシウリジンが形成される、請求項２２に記載の方法。

【請求項32】

前記基質塩基がヒポキサンチンであり、それによりデオキシイノシンが形成される、請求項２２に記載の方法。

【請求項33】

前記開始剤が、鋳型非依存型または鋳型依存型である、請求項２２に記載の方法。

【請求項34】

前記ポリメラーゼが、ファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＣ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＸ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＹ ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素に由来する、請求項２２に記載の方法。

【請求項35】

核酸を合成するためのキットであって、
ポリメラーゼ；
固体支持体に接着させた開始剤；
単官能性ＤＮＡグリコシラーゼ；
脱塩基部位エンドヌクレアーゼ；ならびに
３’ホスファターゼ活性保有酵素；
を含み、請求項２２に記載の方法に従って使用されるキット。

【請求項36】

核酸合成のための開始剤を再生する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）固体支持体に接着させ、基質塩基および基質糖を有する連結ヌクレオチドおよび新たに合成された核酸と結合させた前記開始剤を提供する工程；
ｂ）前記基質塩基を単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによる切除処理に供し、その結果、前記基質塩基が前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによって切除されて、脱塩基部位が生成される工程；
ｃ）前記脱塩基部位を脱塩基部位エンドヌクレアーゼによる切断処理に供し、その結果、前記脱塩基部位において前記基質糖および糖リン酸骨格の両方が切断されて、前記新たに合成された核酸が前記開始剤から放出され、それにより、前記開始剤の３’末端ヌクレオチドに３’リン酸基が形成される工程；ならびに
ｄ）前記３’リン酸基を有する３’末端ヌクレオチドを、３’ホスファターゼ活性保有酵素で脱リン酸化処理して、その結果、前記３’末端ヌクレオチドにヒドロキシル基が形成されて、さらなる核酸合成のために再利用される前記開始剤を再生させる工程。

【請求項37】

前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼが、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、一本鎖選択的単官能性ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ１、メチル結合ドメイングリコシラーゼ４、チミンＤＮＡグリコシラーゼ、ｍｕｔＹホモログＤＮＡグリコシラーゼ、アルキルプリングリコシラーゼＣ、アルキルプリングリコシラーゼＤ、脱塩基部位リアーゼ活性を有さない８－オキソ－グアニングリコシラーゼ１、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＩＩＩ様１、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ様グリコシラーゼ１、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ様グリコシラーゼ２、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ様グリコシラーゼ３である、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼがウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼまたはアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼである、請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩの酵素的に活性な断片、またはエンドヌクレアーゼＩＩＩの酵素的に活性な断片である、請求項３４に記載の方法。

【請求項40】

前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである、請求項３６に記載の方法。

【請求項41】

前記３’ホスファターゼ活性保有酵素が、ポリヌクレオチドキナーゼ３’－ホスファターゼ、または３’－ホスホエステラーゼである、請求項３６に記載の方法。

【請求項42】

前記３’ホスファターゼ活性保有酵素が、３’－ホスファターゼ活性を有するＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ、またはジンクフィンガーＤＮＡ ３’－ホスホエステラーゼ、である、請求項３６に記載の方法。

【請求項43】

前記連結ヌクレオチドの基質塩基が、ウラシル、ヒポキサンチン、チミン、シトシン、グアニン、５－フルオロウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシルシトシン、３－メチルアデニン、３－メチルグアニン、７－メチルアデニン、７－メチルグアニン、Ｎ６－メチルアデニン、８－オキソ－７，８－ジヒドログアニン、５－ヒドロキシルシトシン、５－ヒドロキシウラシル、ジヒドロキシウラシル、エテノシトシン、エテノアデニン、チミングリコール、シトシングリコール、２，６－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－Ｎ－メチルホルムアミドピリミジン、アデニンのホルムアミドピリミジン誘導体、グアニンのホルムアミドピリミジン誘導体、グアニンに対合したアデニン、グアニンに対合したウラシル、アデニンに対合したウラシル、グアニンに対合したチミン、グアニンに対合したエテノシトシン、８－オキソ－７，８－ジヒドログアニンに対合したアデニン、またはグアニンに対合した２－ヒドロキシルアデニンである、請求項３６に記載の方法。

【請求項44】

前記連結ヌクレオチドの基質塩基が、ウラシルまたはヒポキサンチンである、請求項３６に記載の方法。

【請求項45】

前記基質塩基がウラシルであり、それによりデオキシウリジンが形成される、請求項３６に記載の方法。

【請求項46】

前記基質塩基がヒポキサンチンであり、それによりデオキシイノシンが形成される、請求項３６に記載の方法。

【請求項47】

前記開始剤が、鋳型非依存型または鋳型依存型である、請求項３６に記載の方法。

【請求項48】

核酸合成のための開始剤を再生するためのキットであって、
固体支持体に接着させた開始剤；
単官能性ＤＮＡグリコシラーゼ；
脱塩基部位エンドヌクレアーゼ；ならびに
３’ホスファターゼ活性保有酵素；
を含み、請求項３６に記載の方法に従って使用されるキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月２１日に出願された米国特許出願第１７／１２８，６７７号の優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、酵素による核酸合成のための再使用可能な開始剤を再生するための方法およびキットに関する。

【背景技術】

【0003】

鋳型依存性および鋳型非依存性ＤＮＡ合成法を含むＤＮＡ合成法は、ヌクレオチド付加のためのプライマーとして働く開始剤（すなわち、短鎖ポリヌクレオチド）を必要とする。しかし、ＤＮＡ合成後、そのような開始剤は通常再利用できず廃棄される。したがって、新しいＤＮＡ合成の各回に新しい開始剤が必要とされ、その全体的な製造コストが増加し、そのような合成を不便にする。

【0004】

費用効率が高く堅牢なＤＮＡ合成プロセスを容易にするために、ＤＮＡを合成し、新しい合成のための再利用可能な開始剤をもたらす新規なアプローチを開発する必要がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、本開示の目的は、先行技術の欠点の少なくとも１つを軽減することができる、核酸合成およびそのような合成のための再利用可能な開始剤の再生のための方法およびキットを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

このような方法は以下の工程を含む：
核酸合成のために固体支持体に接着させた開始剤を、基質塩基、基質糖および３’ヒドロキシル基を有する連結ヌクレオチドにポリメラーゼの存在下で曝露して、その結果、前記連結ヌクレオチドが前記開始剤に組み込まれるようにする工程；
前記連結ヌクレオチドを含有する前記開始剤をヌクレオチドモノマーに前記ポリメラーゼの存在下で曝露して、その結果、核酸が合成されて前記連結ヌクレオチドの直後で前記開始剤に結合されるようにする工程；
前記基質塩基を有する連結ヌクレオチドを認識可能かつ切除可能である単官能性ＤＮＡグリコシラーゼを提供する工程；
前記基質塩基を前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによる切除処理に供し、その結果、前記基質塩基が前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによって切除されて脱塩基部位が生成されるようにする工程；
得られた脱塩基部位を認識可能であり、前記基質糖を切断可能な脱塩基部位エンドヌクレアーゼを提供する工程；
前記脱塩基部位を前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼによる切断処理に供し、その結果、前記脱塩基部位において前記基質糖および前記核酸の骨格の両方が切断されて、前記新たに合成された核酸が前記開始剤から放出され、その結果、前記開始剤の３’末端ヌクレオチドが３’リン酸基を残し、その結果、前記新たに合成された核酸の５’末端ヌクレオチドが５’リン酸基を有するようにする工程；
３’ホスファターゼ活性保有酵素を提供する工程；ならびに
前記開始剤の３’末端ヌクレオチドを、前記３’ホスファターゼ活性保有酵素による脱リン酸化処理に供し、その結果、前記開始剤の３’末端ヌクレオチドの３’リン酸基が、前記開始剤が新たな合成反応用に再利用可能となるために、元の３’ヒドロキシル基に戻るよう変換される工程。

【0007】

キットは、ポリメラーゼ、連結ヌクレオチド、単官能性ＤＮＡグリコシラーゼ、脱塩基部位エンドヌクレアーゼ、および３’ホスファターゼ活性保有酵素を含む。キットは前述の方法に従って使用される。

【0008】

本開示の別の目的は、先行技術の欠点の少なくとも１つを軽減することができる、核酸合成のための再利用可能な開始剤を再生する方法を提供することである。

【0009】

このような方法は以下の工程を含む：
単官能性ＤＮＡグリコシラーゼを提供する工程；
固体支持体に連結された開始剤と、基質塩基および基質糖を有する連結ヌクレオチドの直後で前記開始剤に連結されている新たに合成された核酸とを提供し、前記基質塩基を有する連結ヌクレオチドが、前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによって認識可能および切除可能である工程；
前記基質塩基を前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによる切除処理に供し、その結果、前記基質塩基が前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによって切除されて、脱塩基部位が生成されるようにする工程；
得られた脱塩基部位を認識可能であり、前記基質糖を切断可能な脱塩基部位エンドヌクレアーゼを提供する工程；
前記脱塩基部位を前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼによる切断処理に供し、その結果、前記脱塩基部位において前記基質糖および前記核酸の骨格の両方が切断されて、前記新たに合成された核酸が前記開始剤から放出され、その結果、前記開始剤の３’末端ヌクレオチドが３’リン酸基を残し、その結果、前記新たに合成された核酸の５’末端ヌクレオチドが５’リン酸基を有するようにする工程；
３’ホスファターゼ活性保有酵素を提供する工程；ならびに
前記開始剤の３’末端ヌクレオチドを、前記３’ホスファターゼ活性保有酵素による脱リン酸化処理に供し、その結果、前記開始剤の３’末端ヌクレオチドの３’リン酸基が、前記開始剤が新たな合成反応用に再利用可能となるために、元の３’ヒドロキシル基に戻るよう変換される工程。

【図面の簡単な説明】

【0010】

本開示の他の特徴および利点は、実施形態の以下の詳細な説明および添付の図面の参照により明らかになると思われる：

【0011】

【図1】下記の実施例１で適用されるような鋳型非依存性核酸合成および開始剤をその元の形態へ戻す復帰を示す概略図であり、記号「Ｕ」は連結デオキシウリジンを表し、記号「Ｎ」は組み込まれたヌクレオシドモノマーを表し、記号「ＵＤＧ」はウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼを表し、記号「Ｎｅｉ」はエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを表し、記号「Ｔ４ ＰＮＫＰ」は３’ホスファターゼ活性を有するＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを表す。

【0012】

【図2】下記の実施例１で検証された鋳型非依存性核酸合成の実現可能性を示す尿素－ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像である。

【0013】

【図3】下記の実施例１の結果を示す尿素－ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像であり、記号「Ｓ」は開始剤と連結デオキシウリジンを含む新たに合成された核酸とを含むポリヌクレオチドを表し、記号「Ｕ」はＵＤＧのみによる処理を表し、記号「Ｎ」はＮｅｉのみによる処理を表し、記号「Ｕ＋Ｎ」はＵＤＧおよびＮｅｉによる処理を表し、記号「Ｕ＋Ｎ＋Ｐ」はＵＤＧ、ＮｅｉおよびＴ４ ＰＮＫＰによる処理を表す。

【0014】

【図4】下記の実施例２で適用されるような鋳型非依存性核酸合成および開始剤のその元の形態への復帰を示す概略図であり、記号「Ｉ」は連結デオキシイノシンを表し、記号「Ｎ」は組み込まれたヌクレオシドモノマーを表し、記号「ＡＡＧ」はアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼを表し、記号「Ｎｅｉ」はエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを表し、記号「Ｔ４ ＰＮＫＰ」は３’ホスファターゼ活性を有するＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを表す。

【0015】

【図5】下記の実施例２で検証された鋳型非依存性核酸合成の実現可能性を示す尿素－ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像である。

【0016】

【図6】下記の実施例２の結果を示す尿素－ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像であり、記号「Ｓ」は、開始剤と連結デオキシイノシンを含む新たに合成された核酸とを含むポリヌクレオチドを表し、記号「Ａ」は、ＡＡＧのみによる処理を表し、記号「Ｎ」は、Ｎｅｉのみによる処理を表し、記号「Ａ＋Ｎ」は、ＡＡＧおよびＮｅｉによる処理を表し、記号「Ａ＋Ｎ＋Ｐ」は、ＡＡＧ、ＮｅｉおよびＴ４ ＰＮＫＰによる処理を表す。

【0017】

【図7】下記の実施例３で適用されるような鋳型依存性核酸合成および開始剤のその元の形態への復帰を示す概略図であり、記号「Ｕ」は連結デオキシウリジンを表し、記号「Ｎ」はヌクレオシドを表し、記号「ＵＤＧ」はウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼを表し、記号「Ｎｅｉ」はエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを表し、記号「Ｔ４ ＰＮＫＰ」は３’ホスファターゼ活性を有するＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを表す。

【0018】

【図8】下記の実施例３の結果を示す尿素－ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像であり、記号「Ｓ」は開始剤と連結デオキシウリジンを含む新たに合成された核酸とを含む二重ポリヌクレオチド表し、記号「Ｕ」はＵＤＧのみによる処理を表し、記号「Ｎ」はＮｅｉのみによる処理を表し、記号「Ｕ＋Ｎ」はＵＤＧおよびＮｅｉによる処理を表し、記号「Ｕ＋Ｎ＋Ｐ」はＵＤＧ、ＮｅｉおよびＴ４ ＰＮＫＰによる処理を表す。

【0019】

【図9】下記の実施例４で適用されるような鋳型依存性核酸合成および開始剤のその元の形態への復帰を示す概略図であり、記号「Ｉ」は連結デオキシイノシンを表し、記号「Ｎ」は組み込まれたヌクレオシドモノマーを表し、記号「ＡＡＧ」はアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼを表し、記号「Ｎｅｉ」はエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを表し、記号「Ｔ４ ＰＮＫＰ」は３’ホスファターゼ活性を有するＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを表す。ならびに

【0020】

【図10】下記の実施例４の結果を示す尿素－ポリアクリルアミドゲルの蛍光画像であり、記号「Ｓ」は、開始剤と連結デオキシイノシンを含む新たに合成された核酸とを含む二重ポリヌクレオチドを表し、記号「Ａ」は、ＡＡＧのみによる処理を表し、記号「Ｎ」は、Ｎｅｉのみによる処理を表し、記号「Ａ＋Ｎ」は、ＡＡＧおよびＮｅｉによる処理を表し、記号「Ａ＋Ｎ＋Ｐ」は、ＡＡＧ、ＮｅｉおよびＴ４ ＰＮＫＰによる処理を表す。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本明細書において任意の先行技術の刊行物が言及される場合、そのような言及が、その刊行物が台湾または任意の他の国における当分野の共通の一般知識の一部を形成することの承認を構成しないことを理解されたい。

【0022】

本明細書の目的のために、「含むこと（comprising）」という単語は「含むが、限定するものではない」ことを意味し、「含む（comprises）」という単語は対応する意味を有することが明確に理解されよう。

【0023】

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。当業者は、本開示の実施に使用することができる、本明細書に記載のものと類似または同等の多くの方法および材料を認識すると思われる。実際、本開示は、記載された方法および材料に決して限定されない。

【0024】

本開示は、核酸合成およびそのような合成のための再利用可能な開始剤の再生のための方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
核酸合成のために固体支持体に接着させた開始剤を、基質塩基、基質糖および３’ヒドロキシル基を有する連結ヌクレオチドにポリメラーゼの存在下で曝露して、その結果、前記連結ヌクレオチドが前記開始剤に組み込まれるようにする工程；
前記連結ヌクレオチドを含有する前記開始剤をヌクレオチドモノマーに前記ポリメラーゼの存在下で曝露して、その結果、核酸が合成されて前記連結ヌクレオチドの直後で前記開始剤と結合されるようにする工程；
前記基質塩基を有する連結ヌクレオチドを認識可能かつ切除可能である単官能性ＤＮＡグリコシラーゼを提供する工程；
前記基質塩基を前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによる切除処理に供し、その結果、前記基質塩基が前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによって前記連結ヌクレオチドから切除されて脱塩基部位が生成されるようにする工程；
得られた脱塩基部位を認識可能であり、前記基質糖を切断可能な脱塩基部位エンドヌクレアーゼを提供する工程；
前記脱塩基部位を前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼによる切断処理に供し、その結果、前記脱塩基部位において前記基質糖および前記核酸の骨格の両方が切断されて、前記新たに合成された核酸が前記開始剤から放出され、その結果、前記開始剤の３’末端ヌクレオチドが３’リン酸基を残し、その結果、前記合成された核酸の５’末端ヌクレオチドが５’リン酸基を有するようにする工程；
３’ホスファターゼ活性保有酵素を提供する工程；ならびに
前記開始剤の３’末端ヌクレオチドを、前記３’ホスファターゼ活性保有酵素による脱リン酸化処理に供し、その結果、前記開始剤の３’末端ヌクレオチドの３’リン酸基が、前記開始剤が新たな合成反応用に再利用可能となるために、元の３’ヒドロキシル基に戻るよう変換される工程。

【0025】

本開示によれば、切除処理、切断処理および脱リン酸化処理は、同時に行ってもよいし、順次行ってもよい。

【0026】

本明細書で使用される「核酸」、「核酸配列」および「核酸断片」という用語は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を指し、天然に存在するヌクレオチドまたは人工化学模倣物を含む。本明細書で使用される「核酸」という用語は、使用時に「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「遺伝子」、「ＤＮＡ」、「ｃＤＮＡ」、「ＲＮＡ」および「ｍＲＮＡ」という用語と互換的である。

【0027】

「開始剤」という用語は、それにより核酸が合成されるモノヌクレオシド、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはそれらの修飾類似体を指す。「開始剤」という用語はまた、３’－ヒドロキシル基を有するゼノ核酸（ＸＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を指し得る。

【0028】

本開示によれば、開始剤は、鋳型非依存型であっても、または鋳型依存型であってもよい（すなわち、開始剤は、相補的な鋳型にアニールまたはハイブリダイズされなくてもよく、または鋳型にアニールされて二重鎖または二本鎖を形成してもよい）。

【0029】

開始剤が鋳型非依存型である場合、開始剤は、非自己相補的配列および非自己相補性形成配列から選択される配列を有し得る。「自己相補的」という用語は、配列（例えば、ヌクレオチド配列、ＸＮＡ配列またはＰＮＡ配列）がそれ自体の上に折り返され（すなわち、配列の領域が、配列の別の領域に結合またはハイブリダイズする）、核酸合成の鋳型として働くことができる二重鎖、二本鎖様構造を生成することを意味する。配列の相補的領域がどれだけ近接しているかに応じて、鎖は、例えば、ヘアピンループ、接合部、バルジまたは内部ループを形成し得る。「自己相補性形成」という用語は、鋳型として働く場合、それにより相補的な伸長部分が形成される配列（例えば、ヌクレオチド配列、ＸＮＡ配列またはＰＮＡ配列）を表すために使用される（すなわち、鋳型として働くそのような配列に基づいて自己相補的配列が形成される）。例えば、自己相補性形成配列は「ＡＴＣＣ」であり得る。「ＡＴＣＣ」配列が鋳型として働く場合、そのような配列と相補的な伸長部分「ＧＧＡＴ」がそのような配列から形成される（すなわち、自己相補的配列「ＡＴＣＣＧＧＡＴ」が形成される）。

【0030】

一般に、「鋳型」は、標的ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。いくつかの例では、用語「標的配列」、「鋳型ポリヌクレオチド」、「標的核酸」、「標的ポリヌクレオチド」、「核酸鋳型」、「鋳型配列」、およびそれらの変形は、互換的に使用される。具体的には、「鋳型」という用語は、鋳型依存性核酸ポリメラーゼの活性を介してヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体から相補的コピーが合成される核酸の鎖を指す。二重鎖内では、鋳型鎖は、慣例により、「ボトム（bottom）」鎖として示され、記載される。同様に、非鋳型鎖は、多くの場合、「トップ（top）」鎖として示され、記載される。「鋳型」鎖は「センス」鎖とも呼ばれ、非鋳型鎖は「アンチセンス」鎖とも呼ばれる。

【0031】

本開示によれば、開始剤は、固体支持体に連結された５’末端を有し、連結ヌクレオチドは、開始剤の３’末端ヌクレオチドおよび合成された核酸の５’末端ヌクレオチドに結合される。開始剤は、支持体に直接結合していてもよく、またはリンカーを介して支持体に結合していてもよい。

【0032】

固体支持体の例としては、限定するものではないが、マイクロアレイ、ビーズ（コート又はノンコート）、カラム、光ファイバー、ワイプ、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、石英、ジアゾ化膜（紙またはナイロン）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、紙、セラミックス、金属、半金属、半導体材料、磁性粒子、プラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリスチレンなど）、ゲル形成材料［タンパク質（例えば、ゼラチン）、リポ多糖、ケイ酸塩、アガロース、ポリアクリルアミド、メチルメタクリレートポリマーなど］、ゾルゲル、多孔性ポリマーヒドロゲル、ナノ構造表面、ナノチューブ（カーボンナノチューブなど）、およびナノ粒子（金ナノ粒子、量子ドットなど）が挙げられる。

【0033】

本開示によれば、開始剤の形態に応じて、合成された核酸および連結ヌクレオチドは、それぞれ鋳型非依存型または鋳型依存型であり得る。

【0034】

本明細書で使用される場合、「組み込まれる」または「組み込み」という用語は、核酸の一部になることを指す。核酸前駆体の組み込みに関する用語には、公知の柔軟性がある。

【0035】

例えば、ヌクレオチドｄＧＴＰはデオキシリボヌクレオシド三リン酸である。ＤＮＡに組み込まれると、ｄＧＴＰはｄＧＭＰ、すなわちデオキシグアノシン一リン酸部分になる。ＤＮＡはｄＧＴＰ分子を含まないが、ｄＧＴＰをＤＮＡに組み込むと言うことができる。

【0036】

本開示によれば、ヌクレオチドモノマーは、糖、リン酸基および窒素塩基を構成要素とする天然の核酸ヌクレオチドであり得る。糖は、ＲＮＡ中のリボースまたはＤＮＡ中の２’－デオキシリボースであり得る。合成される核酸がＤＮＡであるかＲＮＡであるかに応じて、窒素塩基は、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシンおよびチミンから選択される。あるいは、ヌクレオチドモノマーは、３つの構成要素の少なくとも１つが修飾されたヌクレオチドであってもよい。例として、修飾は、修飾生成物を生成する塩基のレベル（例えば、イノシン、メチル－５－デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ－５－デオキシウリジン、ジアミノ－２，６－プリンまたはブロモ－５－デオキシウリジン、およびハイブリダイゼーションを可能にする任意の他の修飾塩基）、糖のレベル（例えば、類似体によるデオキシリボースの置換）、またはリン酸基のレベル（例えば、ボロネート、アルキルホスホネートまたはホスホロチオエート誘導体）で起こり得る。
本開示によれば、ヌクレオチドモノマーは、除去可能なブロッキング部分を有し得る。除去可能なブロッキング部分の例としては、限定するものではないが、３’－Ｏ－ブロッキング部分、塩基ブロッキング部分、およびそれらの組み合わせが挙げられる。

【0037】

除去可能なブロッキング部分を有するヌクレオチドモノマーは、可逆的ターミネーターとも呼ばれる。したがって、３’－Ｏ－ブロッキング部分を有するヌクレオチドモノマーは、３’－ブロック可逆的ターミネーターまたは３’－Ｏ－修飾可逆的ターミネーターとも呼ばれ、塩基ブロッキング部分を有するヌクレオチドモノマーは、３’－非ブロック可逆的ターミネーターまたは３’－ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターとも呼ばれる。

【0038】

本明細書で使用される場合、「可逆的ターミネーター」という用語は、化学修飾ヌクレオチドモノマーを指す。そのような可逆的ターミネーターがポリメラーゼによって成長中の核酸に組み込まれると、ポリメラーゼによる別のヌクレオチドモノマーのさらなる組み込みをブロックする。そのような「可逆的ターミネーター」塩基および核酸は、化学的または物理的処理によって脱保護することができ、そのような脱保護に続いて、核酸をポリメラーゼによってさらに伸長することができる。

【0039】

３’－Ｏ－ブロッキング部分の例としては、限定するものではないが、Ｏ－アジドメチル、Ｏ－アミノ、Ｏ－アリル、Ｏ－フェノキシアセチル、Ｏ－メトキシアセチル、Ｏ－アセチル、Ｏ－（ｐ－トルエン）スルホネート、Ｏ－ホスフェート、Ｏ－ニトレート、Ｏ－［４－メトキシ］－テトラヒドロチオピラニル、Ｏ－テトラヒドロチオピラニル、Ｏ－［５－メチル］－テトラヒドロフラニル、Ｏ－［２－メチル，４－メトキシ］－テトラヒドロピラニル、Ｏ－［５－メチル］－テトラヒドロピラニルおよびＯ－テトラヒドロチオフラニル、０－２－ニトロベンジル、０－メチル、ならびにＯ－アシルが挙げられる。

【0040】

３’非ブロック可逆的ターミネーターの例としては、限定するものではないが、７－［（Ｓ）－１－（５－メトキシ－２－ニトロフェニル）－２，２－ジメチル－プロピルオキシ］メチル－７－デアザ－ｄＡＴＰ、５－［（Ｓ）－１－（５－メトキシ－２－ニトロフェニル）－２，２－ジメチル－プロピルオキシ］メチル－ｄＣＴＰ、１－（５－メトキシ－２－ニトロフェニル）－２，２－ジメチル－プロピルオキシ］メチル－７－デアザ－ｄＧＴＰ、５－［（Ｓ）－１－（５－メトキシ－２－ニトロフェニル）－２，２－ジメチル－プロピルオキシ］メチル－ｄＵＴＰ、および５－［（Ｓ）－１－（２－ニトロフェニル）－２，２－ジメチル－プロピルオキシ］メチル－ｄＵＴＰが挙げられる。

【0041】

本開示によれば、塩基ブロック部分は可逆的ダイターミネーターであり得る。可逆的ダイターミネーターの例としては、限定するものではないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑの可逆的ダイターミネーター、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑの可逆的ダイターミネーター、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑの可逆的ダイターミネーター、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑの可逆的ダイターミネーター、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩＸの可逆的ダイターミネーター、ＬａｓｅｒＧｅｎのｌｉｇｈｔｎｉｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅの可逆的ダイターミネーターが挙げられる。

【0042】

可逆的ターミネーターは周知であり、当業者により一般的に使用されているので、簡潔にするために、本明細書ではそのさらなる詳細は省略する。しかしながら、適用可能な３’ブロック可逆的ターミネーター、適用可能な３’非ブロック可逆的ターミネーター、および保護および脱保護のための適用可能な条件（すなわち、除去可能なブロッキング部分を付加および除去するための条件）は、例えば、Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４０（１５）：７４０４－７４１５，Ｌｉｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９（６）：ｅ３９、およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１１：３４－４０に見出すことができる。

【0043】

本開示によれば、ポリメラーゼは、鋳型依存性ポリメラーゼまたは鋳型非依存性ポリメラーゼであり得る。

【0044】

本開示によれば、ポリメラーゼは、ファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ γ、θおよびν）、ファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ Ｂ、Ｐｏｌ ζ、Ｐｏｌ α、δおよびε）、ファミリーＣ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｏｌ ＩＩＩ）、ファミリーＤ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＰｏｌＤ）、ファミリーＸ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｏｌ β、Ｐｏｌ σ、Ｐｏｌ λ、Ｐｏｌ μおよび末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）、ファミリーＹ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｏｌ ι、Ｐｏｌ κ、Ｐｏｌ η、ＤｉｎＢ、Ｐｏｌ ＩＶおよびＰｏｌ Ｖ）、逆転写酵素（例えば、テロメラーゼおよびＢ型肝炎ウイルス）、およびそれらの酵素的に活性な断片からなる群から選択され得る。

【0045】

広く使用されている鋳型依存性ポリメラーゼの非限定的な例としては、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるファージＴ７のＴ７ ＤＮＡポリメラーゼおよびファージＴ３のＴ３ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであるファージＴ７のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびファージＴ３のＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである大腸菌（Escherichia coli）のＤＮＡポリメラーゼＩまたはクレノウ断片として公知のその断片、耐熱性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるサーモフィルス・アクアティカス（Thermophilus aquaticus）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼおよびｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである真核生物ＤＮＡポリメラーゼβ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるテロメラーゼ、ならびに修飾ＲＮＡ（リボザイム；Ｕｎｒａｕ＆Ｂａｒｔｅｌ、１９９８年）および鋳型依存性ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡなどの非タンパク質触媒分子が挙げられる。

【0046】

鋳型非依存性ポリメラーゼの非限定的な例としては、逆転写酵素、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼシータ（θ）、ＤＮＡポリメラーゼミュー（μ）および末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼが挙げられる。

【0047】

核酸合成、連結ヌクレオチド付加および核酸合成に適したポリメラーゼは、当業者の専門知識および日常的な技能の範囲内であるため、簡潔にするために、本明細書ではそれらのさらなる詳細は省略する。

【0048】

本明細書で使用される場合、「単官能性ＤＮＡグリコシラーゼ」という用語は、元々グリコシラーゼ活性のみを有する天然に存在する単官能性グリコシラーゼを指す。「単官能性ＤＮＡグリコシラーゼ」という用語はまた、元々グリコシラーゼ活性と脱塩基部位リアーゼ活性とを有する二官能性ＤＮＡグリコシラーゼの脱塩基部位リアーゼドメインを除去または不活性化することによって、二官能性ＤＮＡグリコシラーゼから誘導される単官能性グリコシラーゼを指す。

【0049】

本開示によれば、単官能性ＤＮＡグリコシラーゼは、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧまたはＵＮＧ）、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＡＡＧ；メチルプリンＤＮＡグリコシラーゼ（ＭＰＧ）とも呼ばれる）、一本鎖選択的単官能性ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ１（ＳＭＵＧ１）、メチル結合ドメイングリコシラーゼ４（ＭＢＤ４）、チミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）、ｍｕｔＹホモログＤＮＡグリコシラーゼ（ＭＹＨ）、アルキルプリングリコシラーゼＣ（ＡｌｋＣ）、アルキルプリングリコシラーゼＤ（ＡｌｋＤ）、脱塩基部位リアーゼ活性を有さない８－オキソ－グアニングリコシラーゼ１（ＯＧＧ１）、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＩＩＩ様１（ＮＴＨＬ１）、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ様グリコシラーゼ１（ＮＥＩＬ１）、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ様グリコシラーゼ２（ＮＥＩＬ２）、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ様グリコシラーゼ３（ＮＥＩＬ３）、およびその酵素的に活性な断片からなる群から選択され得る。

【0050】

単官能性グリコシラーゼを得るために二官能性ＤＮＡグリコシラーゼの脱塩基部位リアーゼドメインを除去または不活性化することは、当業者の専門知識および日常的な技能の範囲内であるため、簡潔にするために、本明細書ではそれらの詳細は省略する。

【0051】

本明細書で使用される場合、「酵素的に活性な断片」という用語は、断片が由来するタンパク質またはポリペプチドの活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、またはさらにより好ましくは少なくとも９５％を含有する触媒的または酵素的に活性なタンパク質またはポリペプチドの断片を指す。

【0052】

本開示の例示的一実施形態では、単官能性ＤＮＡグリコシラーゼはウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼである。本開示の別の例示的実施形態では、単官能性ＤＮＡグリコシラーゼはアルキルアデニン－ＤＮＡグリコシラーゼである。

【0053】

「脱塩基の」、「脱プリンの／脱ピリミジンの」、およびＤ－スペーサーという用語は、塩基が存在しないが、糖リン酸骨格は無傷のままである部位を示すために互換的に使用することができる。したがって、脱塩基部位エンドヌクレアーゼは、脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼとしても公知である。

【0054】

本開示によれば、脱塩基部位エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（Ｎｅｉ）、エンドヌクレアーゼＩＩＩ（ＥｎｄｏＩＩＩまたはＮｔｈ）、およびそれらの酵素的に活性な断片からなる群から選択され得る。例示的実施形態では、脱塩基部位エンドヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである。

【0055】

本開示によれば、３’ホスファターゼ活性保有酵素は、ポリヌクレオチドキナーゼ３’－ホスファターゼ、３’－ホスホエステラーゼ、およびそれらの酵素的に活性な断片からなる群から選択され得る。３’ホスファターゼ活性保有酵素は、３’ホスファターゼ活性を有するＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）（Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ／ホスファターゼ（Ｔ４ ＰＮＫＰ）とも呼ばれる）、ならびにジンクフィンガーＤＮＡ ３’－ホスホエステラーゼ（ＺＤＰ）であり得る。

【0056】

適用可能な３’ホスファターゼ活性保有酵素は、当業者の専門知識および日常的な技能の範囲内であるため、簡潔にするために、本明細書ではそれらのさらなる詳細は省略する。しかしながら、適用可能な３’ホスファターゼ活性保有酵素は、例えば、Ｂｌｏｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２８０（７）：５１８８－５１９４、Ｄｏｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４（８）：２２３０－２２３７、Ｂｌａｓｉｕｓ ｅｔ ａｌ．（２００７），ＢＭＣ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８：６９、Ｃｏｑｕｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１），ＰＮＡＳ，１０８（５２）：２１０２２－２１０２７、Ｖａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２７６（１８）：１５７０３－１５７８１、およびｔｈｅ ＮＣＢＩ ｗｅｂｓｉｔｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ？Ｄｂ＝ｇｅｎｅ＆Ｃｍｄ＝ＤｅｔａｉｌｓＳｅａｒｃｈ＆Ｔｅｒｍ＝１１２８４＃ｇｅｎｅｒａｌ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｉｎｆｏ）に見出すことができる。

【0057】

本開示によれば、開始剤に結合される連結ヌクレオチドの基質塩基は、ウラシル、ヒポキサンチン、チミン、シトシン、グアニン、５－フルオロウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシルシトシン、３－メチルアデニン、３－メチルグアニン、７－メチルアデニン、７－メチルグアニン、Ｎ^６－メチルアデニン、８－オキソ－７，８－ジヒドログアニン、５－ヒドロキシルシトシン、５－ヒドロキシウラシル、ジヒドロキシウラシル、エテノシトシン、エテノアデニン、チミングリコール、シトシングリコール、２，６－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－Ｎ－メチルホルムアミドピリミジン、アデニンのホルムアミドピリミジン誘導体、グアニンのホルムアミドピリミジン誘導体、グアニンに対合したアデニン、グアニンに対合したウラシル、アデニンに対合したウラシル、グアニンに対合したチミン、グアニンに対合したエテノシトシン、８－オキソ－７，８－ジヒドログアニンに対合したアデニン、およびグアニンに対合した２－ヒドロキシルアデニンからなる群から選択され得る。本開示の例示的一実施形態では、連結ヌクレオチドの基質塩基はウラシルである。本開示の別の例示的実施形態では、連結ヌクレオチドの基質塩基はヒポキサンチンである。

【0058】

適切な単官能性ＤＮＡグリコシラーゼおよびそれらの対応する基質塩基は、、当業者の専門知識および日常的な技能の範囲内であるため、簡潔にするために、本明細書ではそれらの詳細は省略する。しかしながら、適切な単官能性ＤＮＡグリコシラーゼおよびそれらの対応する基質塩基は、例えば、Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，１２１：１－２０、Ｋｒｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３２５：１－１６、およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５：３－１３に見出すことができる。

【0059】

「連結ヌクレオチド」という用語は、新たに合成された核酸に関して開始剤に組み込まれる第１のヌクレオチドを指す。

【0060】

「基質塩基」という用語は、酵素の基質として働く連結ヌクレオチドの塩基を指す。「基質糖」という用語は、酵素の基質として働く連結ヌクレオチドのヌクレオシド糖部分を指す。

【0061】

さらに、本開示は、核酸合成およびそのような合成のための再利用可能な開始剤の再生のためのキットであって、前述のポリメラーゼ、前述の単官能性ＤＮＡグリコシラーゼ、単官能性ＤＮＡグリコシラーゼの基質として働く前述の連結ヌクレオチド、前述の脱塩基部位エンドヌクレアーゼ、および前述の３’ホスファターゼ活性保有酵素を含むキットを提供する。キットは本開示の前述の方法に従って使用される。

【0062】

さらに、本開示は、核酸合成のための再利用可能な開始剤を再生する方法であって、
上記の単官能性ＤＮＡグリコシラーゼを提供する工程；
上記の核酸合成のための開始剤と、上記の連結ヌクレオチドの直後で前記開始剤に連結されている合成された核酸とを提供する工程；
前記基質塩基を、単官能性ＤＮＡグリコシラーゼを用いて上記の切除処理に供する工程；
上記の脱塩基部位エンドヌクレアーゼを提供する工程；
前記脱塩基部位を、前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼを用いて上記の切断処理に供する工程；
上記の３’ホスファターゼ活性保有酵素を提供する工程；ならびに
前記開始剤の３’末端ヌクレオチドを、３’ホスファターゼ活性保有酵素を用いて上記の脱リン酸化処理に供する工程；
を含む方法を提供する。

【0063】

本開示を、以下の実施例によってさらに説明する。しかしながら、以下の実施例は単に例示を目的とするものであり、実際に本開示を限定するものと解釈されるべきではないことを理解されたい。

【実施例】

【0064】

実施例１．
鋳型非依存性核酸合成、ならびにウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（Ｎｅｉ）および３’ホスファターゼ活性を有するＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ ＰＮＫＰ）による、合成開始剤をその元の形態へ戻す復帰

【0065】

鋳型非依存性核酸合成に使用される開始剤が核酸合成後にその元の形態に戻るよう変換され得るかどうかを試験するために、以下の実験工程を行った。この実施例で適用される、連結デオキシウリジンヌクレオチドを使用した鋳型非依存性核酸合成および酵素を利用した開始剤のその元の形態への復帰の詳細なスキームを図１に例示する。
Ａ．連結デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）を用いて開始された鋳型非依存性核酸合成

【0066】

５’末端に５’－ヘキサクロロ－フルオレセイン（ＨＥＸ）標識を有し、３’末端にヒドロキシル基を有する開始剤（配列番号１の一本鎖２１ ｍｅｒのポリヌクレオチド）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）により合成された。鋳型非依存性核酸合成反応を、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ欠損Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ^ｅｘｏ－）（２００ ｎＭ）を使用して実施して、連結デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）（１００μＭ）を開始剤の３’末端に組み込んだ。

【0067】

具体的には、Ｐｆｕ^ｅｘｏ－ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号８のアミノ酸配列を有する）を以下のように調製した。インテインを含まないＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子構築物は、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＢｉｏＳｃｉ ａｎｄ Ｔｅｃｈ Ｃｏ．（Ｎｅｗ Ｔａｉｐｅｉ Ｃｉｔｙ、Ｔａｉｗａｎ）によって合成された。Ｐｆｕ^ｅｘｏ－ＤＮＡポリメラーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）製のＱ５ Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用して、遺伝子骨格上でそのＡｓｐ^１４１をＡｌａ に変更し（Ｄ１４１Ａ）、そのＧｌｕ^１４３をＡｌａに変更する（Ｅ１４３Ａ）ことによって作出した。Ｐｆｕ^ｅｘｏ－ＤＮＡポリメラーゼを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞において発現させ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）製のＡｋｔａ ＦＰＬＣシステムを使用してＳｅｐｈａｒｏｓｅ－Ｑおよびヘパリンカラムによって精製した。図２に例示するように、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）は、Ｐｆｕ^ｅｘｏ－ＤＮＡポリメラーゼによって開始剤の３’末端に効率的に組み込まれた。
Ｂ．開始剤の３’末端にある連結ｄＵＭＰの直後への鋳型非依存性核酸合成

【0068】

合成開始剤の３’末端にある連結ｄＵＭＰの直後への鋳型非依存性核酸合成を実証するために、Ｐｆｕ^ｅｘｏ－ＤＮＡポリメラーゼ（２００ ｎＭ）を使用して、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰおよび３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰ（１００μＭ）（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｅｒｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、３’末端に連結ｄＵＭＰを含有する開始剤に段階的に組み込んだ。１０ ｍＭマンガンカチオンの添加によって合成反応を開始し、次いで７５℃で３０分間インキュベートした。２倍クエンチ溶液（９５％脱イオンホルムアミドおよび２５ ｍＭ ＥＤＴＡ）１０μＬを添加することによって反応を停止させ、９８℃で１０分間熱変性に供した。反応生成物を１５％変性尿素－ポリアクリルアミドゲルによって分析し、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｉｍａｇｅｒ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）によって可視化した。

【0069】

図２に例示するように、Ｐｆｕ^ｅｘｏ－ＤＮＡポリメラーゼを使用する鋳型非依存性核酸合成は、開始剤の３’末端にある連結ｄＵＭＰの直後にｄＡＭＰおよびｄＴＭＰを順次組み込むことができる（開始剤、連結ｄＵＭＰ、ならびにｄＡＭＰおよびｄＴＭＰを含む得られた生成物は、配列番号２を有する）。したがって、鋳型非依存性核酸合成反応は、配列番号３の１６－ｍｅｒの核酸のポリヌクレオチドを合成し続けることができ、したがって、開始剤、連結ｄＵＭＰおよび新たに合成された１６－ｍｅｒの核酸のポリヌクレオチドを含有する３８－ｍｅｒの核酸（配列番号４）を生成することができる。

【0070】

鋳型非依存性核酸合成は当業者の専門知識および日常的な技能の範囲内であるので、配列番号３の１６－ｍｅｒの核酸の核酸は、本明細書に提供される情報を用いて当業者によって新規に合成され得ることに留意されたい。この実施例では、実験手順を単純化するために、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）によって１６－ｍｅｒの核酸を合成し、以下のセクションＣに記載のように連結ｄＵＭＰを用いて開始剤と連結して、１６－ｍｅｒの核酸の鋳型非依存性核酸合成を象徴した。
Ｃ．ＵＤＧ、ＮｅｉおよびＴ４ ＰＮＫＰの組み合わせ処理による、新たに合成された核酸の放出および合成開始剤をその元の形態へ戻す復帰

【0071】

新たに合成された核酸を放出し、酵素によって合成開始剤を再生することの実現可能性を実証するために、開始剤、連結ｄＵＭＰおよび新たに合成された１６－ｍｅｒの核酸のポリヌクレオチドを含有する３８－ｍｅｒの核酸（配列番号４）を調製した。具体的には、１６－ｍｅｒの核酸のポリヌクレオチドを、Ｐｆｕ^ｅｘｏ－ＤＮＡポリメラーゼを使用して連結ｄＵＭＰを用いて開始剤に連結した。

【0072】

３８－ｍｅｒの核酸（２５ ｎＭ）を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）から購入したＵＤＧ、ＮｅｉおよびＴ４ ＰＮＫＰをそれぞれ１０ユニット添加することにより、ウラシル切除、脱塩基部位／核酸骨格切断および脱リン酸化反応に供した。１倍切断緩衝液［１０ ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ ｍＭ ＫＣｌ、５ ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５］中で、３７℃で１５分間反応を行った。このような３８－ｍｅｒの核酸（配列番号４）の調製は、上記のように１５％変性尿素－ポリアクリルアミドゲルによって確認した。
対照実験では、３８－ｍｅｒの核酸（配列番号４）も、上記の同一の実験条件下でＵＤＧ、ＮｅｉまたはＵＤＧとＮｅｉとの混合物による処理に供した。次いで、２倍クエンチ溶液（９５％ ホルムアミドおよび２５ ｍＭ ＥＤＴＡ）１０μＬを添加することによって各反応を停止させ、酵素を９８℃で１０分間加熱することによって不活性化した。反応生成物を２０％変性尿素－ポリアクリルアミドゲルによって分析し、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｉｍａｇｅｒ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）によって可視化した。

【0073】

図３に例示するように、ＵＤＧ、ＮｅｉおよびＴ４ ＰＮＫＰの混合物による処理は、一本鎖３８－ｍｅｒの核酸からの連結ｄＵＭＰの除去、新たに合成された１６－ｍｅｒのポリヌクレオチド（配列番号３）の放出、および３’末端にヒドロキシル基を有する開始剤（配列番号１）の再生をもたらした。ＵＤＧ単独、Ｎｅｉ単独、またはＵＤＧとＮｅｉとの組み合わせのいずれも、新たに合成された核酸を効率的かつ完全に放出し、同時に３’末端にヒドロキシル基を有する開始剤を再生することができない。
実施例２．鋳型非依存性核酸合成、ならびにアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＡＡＧ）、ＮｅｉおよびＴ４ ＰＮＫＰによる、合成開始剤のその元の形態への復帰

【0074】

鋳型非依存性核酸合成に使用される開始剤が核酸合成後にその元の形態に戻るよう変換され得るかどうかを試験するために、以下の実験手順を行った。この実施例で適用される、連結デオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）を使用した鋳型非依存性核酸合成および酵素を利用した開始剤の元の形態への復帰の詳細なスキームを図４に例示する。
Ａ．連結ｄＩＴＰを用いて開始された鋳型非依存性核酸合成

【0075】

５’末端に５’－ヘキサクロロ－フルオレセイン（ＨＥＸ）標識を有し、３’末端に保護されていないヒドロキシル基を有する開始剤（配列番号１）を使用した。鋳型非依存性核酸合成反応を、実施例１に記載のＰｆｕ^ｅｘｏ－ＤＮＡポリメラーゼ（２００ ｎＭ）を使用して実施して、連結ｄＩＴＰ（１００ μＭ）を開始剤の３’末端に組み込んだ。図５に例示するように、デオキシイノシン一リン酸（ｄＩＭＰ）は、Ｐｆｕ^ｅｘｏ－ＤＮＡポリメラーゼによって開始剤の３’末端に効率的に組み込まれた。
Ｂ．開始剤の３’末端にある連結ｄＩＭＰの直後への鋳型非依存性核酸合成

【0076】

合成開始剤の３’末端にある連結ｄＩＭＰの直後への鋳型非依存性核酸合成を実証するために、Ｐｆｕ^ｅｘｏ－ＤＮＡポリメラーゼ（２００ ｎＭ）を使用して、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰおよび３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰ（１００μＭ）（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｅｒｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、３’末端に連結ｄＩＭＰを含有する開始剤に段階的に組み込んだ。１０ ｍＭマンガンカチオンの添加によって合成反応を開始し、次いで７５℃で３０分間インキュベートした。２倍クエンチ溶液（９５％脱イオンホルムアミドおよび２５ ｍＭ ＥＤＴＡ）１０μＬを添加することによって反応を停止させ、９８℃で１０分間熱変性に供した。反応生成物を１５％変性尿素－ポリアクリルアミドゲルによって分析し、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｉｍａｇｅｒ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）によって可視化した。

【0077】

図５に例示するように、Ｐｆｕ^ｅｘｏ－ＤＮＡポリメラーゼを使用する鋳型非依存性核酸合成は、開始剤の３’末端にある連結ｄＩＭＰの直後にｄＡＭＰおよびｄＴＭＰを順次組み込むことができる（開始剤、連結ｄＩＭＰ、ならびにｄＡＭＰおよびｄＴＭＰを含む得られた生成物は、配列番号５を有する）。したがって、鋳型非依存性核酸合成反応は、配列番号３の１６－ｍｅｒの核酸のポリヌクレオチドを合成し続けることができ、開始剤、連結ｄＩＭＰおよび新たに合成された１６－ｍｅｒの核酸のポリヌクレオチドを含有する３８－ｍｅｒの核酸（配列番号６）を生成することができる。このような３８－ｍｅｒの核酸（配列番号６）の調製は、上記のように１５％変性尿素－ポリアクリルアミドゲルによって確認した。

【0078】

鋳型非依存性核酸合成は当業者の専門知識および日常的な技能の範囲内であるので、配列番号３の１６－ｍｅｒの核酸の核酸は、本明細書に提供される情報を用いて当業者によって新規に合成され得ることに留意されたい。この実施例では、実験手順を単純化するために、１６－ｍｅｒの核酸を、以下のセクションＣに記載のように連結ｄＩＭＰを用いて開始剤と連結して、１６－ｍｅｒの核酸の鋳型非依存性核酸合成を象徴した。
Ｃ．ＡＡＧ、ＮｅｉおよびＴ４ ＰＮＫＰの組み合わせ処理による、新たに合成された核酸の放出および合成開始剤をその元の形態へ戻す復帰

【0079】

新たに合成された核酸を放出し、酵素によって合成開始剤を再生することの実現可能性を実証するために、開始剤（配列番号１）、連結ｄＩＭＰおよび新たに合成された１６－ｍｅｒのポリヌクレオチド（配列番号３）を含有する一本鎖３８－ｍｅｒの核酸（配列番号６）を調製した。具体的には、１６－ｍｅｒのポリヌクレオチドを、Ｐｆｕ^ｅｘｏ－ＤＮＡポリメラーゼを使用して連結ｄＵＭＰを用いて開始剤に連結した。

【0080】

一本鎖３８－ｍｅｒの核酸（２５ ｎＭ）を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）から購入したＡＡＧ、ＮｅｉおよびＴ４ ＰＮＫＰをそれぞれ１０ユニット添加することにより、イノシン切除、脱塩基部位／核酸骨格切断および脱リン酸化反応に供した。１倍切断緩衝液［１０ ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ ｍＭ ＫＣｌ、５ ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ；ｐＨ７．５］中で、３７℃で１５分間反応を行った。

【0081】

対照実験では、一本鎖３８－ｍｅｒの核酸（配列番号６）も、同一の実験条件下でＡＡＧ、ＮｅｉまたはＡＡＧとＮｅｉとの混合物による処理に供した。次いで、２倍クエンチ溶液（９５％ ホルムアミドおよび２５ ｍＭ ＥＤＴＡ）１０μＬを添加することによって各反応を停止させ、酵素を９８℃で１０分間加熱することによって不活性化した。反応生成物を２０％変性尿素－ポリアクリルアミドゲルによって分析し、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｉｍａｇｅｒ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）によって可視化した。

【0082】

図６に例示するように、ＡＡＧ、ＮｅｉおよびＴ４ ＰＮＫＰの混合物による処理は、一本鎖３８－ｍｅｒの核酸からの連結ｄＩＭＰの除去、新たに合成された１６－ｍｅｒポリヌクレオチド（配列番号３）の放出、および３’末端にヒドロキシル基を有する開始剤（配列番号１）の再生をもたらした。ＡＡＧ単独、Ｎｅｉ単独、またはＡＡＧとＮｅｉとの組み合わせのいずれも、新たに合成された核酸を効率的かつ完全に切り離し、同時に３’末端にヒドロキシル基を有する開始剤を再生することができない。
実施例３．
鋳型依存性核酸合成、ならびにＵＤＧ、ＮｅｉおよびＴ４ ＰＮＫＰによる、合成開始剤を元の形態へ戻す復帰

【0083】

鋳型依存性核酸合成に使用される開始剤が核酸合成後にその元の形態に戻るよう変換され得るかどうかを試験するために、以下の実験手順を行った。この実施例で適用される、連結ｄＵＴＰを使用した鋳型依存性核酸合成および酵素を利用した開始剤の元の形態への復帰の詳細なスキームを図７に例示する。
Ａ．ＵＤＧ、ＮｅｉおよびＴ４ ＰＮＫＰの組み合わせ処理による、新たに合成された核酸の放出および合成開始剤をその元の形態へ戻す復帰

【0084】

新たに合成された核酸を放出し、酵素によって合成開始剤を再生することの実現可能性を実証するために、開始剤、連結ｄＵＭＰおよび新たに合成された１６－ｍｅｒのポリヌクレオチドを含有する一本鎖３８－ｍｅｒの核酸（配列番号４）を、実施例１に記載のように調製した。鋳型依存性核酸合成を例示するために、一本鎖３８－ｍｅｒの核酸（配列番号４）を、９５℃で１０分間加熱することによって相補的一本鎖３８－ｍｅｒ核酸（配列番号７）とハイブリダイズさせ、続いて４℃にゆっくり冷却して、二重の平滑末端二本鎖３８－ｍｅｒの核酸を形成した。相補的一本鎖３８－ｍｅｒの核酸（配列番号７）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）から入手した。

【0085】

２５ ｎＭの二重３８－ｍｅｒの核酸を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）から購入したＵＤＧ、ＮｅｉおよびＴ４ ＰＮＫＰをそれぞれ１０ユニット添加することにより、ウラシル切除、脱塩基部位／核酸骨格切断および脱リン酸化反応に供した。１倍切断緩衝液［１０ ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ ｍＭ ＫＣｌ、５ ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ；ｐＨ７．５］中で、３７℃で１５分間反応を行った。

【0086】

対照実験では、二重３８－ｍｅｒの核酸を、同一の実験条件下でＵＤＧ、ＮｅｉまたはＵＤＧとＮｅｉとの混合物による処理に供した。次いで、２倍クエンチ溶液（９５％ ホルムアミドおよび２５ ｍＭ ＥＤＴＡ）１０μＬを添加することによって各反応を停止させ、酵素を９８℃で１０分間加熱することによって不活性化し、二重３８－ｍｅｒの核酸を変性させた。反応生成物を２０％変性尿素－ポリアクリルアミドゲルによって分析し、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｉｍａｇｅｒ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）によって可視化した。

【0087】

図８に示すように、ＵＤＧ、ＮｅｉおよびＴ４ ＰＮＫＰの混合物による処理は、３８－ｍｅｒの核酸からの連結ｄＵＭＰの除去、二重３８－ｍｅｒの核酸の熱変性後に新たに合成された１６－ｍｅｒポリヌクレオチド（配列番号３）の放出、および３’末端にヒドロキシル基を有する開始剤（配列番号１）の再生をもたらした。ＵＤＧ単独、Ｎｅｉ単独、またはＵＤＧとＮｅｉとの組み合わせのいずれも、二重３８－ｍｅｒの核酸の熱変性後に新たに合成された核酸を効率的かつ完全に放出し、同時に３’末端にヒドロキシル基を有する開始剤を再生することができない。
実施例４．
鋳型依存性核酸合成、ならびにＡＡＧ、ＮｅｉおよびＴ４ ＰＮＫＰによる、合成開始剤を元の形態へ戻す復帰

【0088】

鋳型依存性核酸合成に使用される開始剤が核酸合成後にその元の形態に戻るよう変換され得るかどうかを試験するために、以下の実験手順を行った。この実施例で適用される、連結ｄＩＴＰを使用した鋳型依存性核酸合成および酵素を利用した開始剤の元の形態への復帰の詳細なスキームを図９に例示する。
Ａ．ＡＡＧ、ＮｅｉおよびＴ４ ＰＮＫＰの組み合わせ処理による、新たに合成された核酸の放出および合成開始剤を元の形態へ戻す復帰

【0089】

新たに合成された核酸を放出し、酵素によって合成開始剤を再生することの実現可能性を実証するために、開始剤、連結ｄＩＭＰおよび新たに合成された１６ ｍｅｒのポリヌクレオチドを含有する一本鎖３８ｍｅｒの核酸（配列番号６）を、実施例２に記載のように調製した。鋳型依存性核酸合成を例示するために、一本鎖３８－ｍｅｒの核酸（配列番号６）を、９５℃で１０分間加熱することによって相補的３８－ｍｅｒの核酸（配列番号７）とハイブリダイズさせ、続いて４℃にゆっくり冷却して、二重の平滑末端二本鎖３８－ｍｅｒの核酸を形成した。相補的一本鎖３８－ｍｅｒの核酸（配列番号７）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）から入手した。２５ ｎＭの二重３８－ｍｅｒの核酸を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）から購入したＡＡＧ、ＮｅｉおよびＴ４ ＰＮＫＰをそれぞれ１０ユニット添加することにより、イノシン切除、脱塩基部位／核酸骨格切断および脱リン酸化反応に供した。１倍切断緩衝液［１０ ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ ｍＭ ＫＣｌ、５ ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ；ｐＨ７．５］中で、３７℃で１５分間反応を行った。

【0090】

対照実験では、二重３８－ｍｅｒの核酸を、同一の実験条件下でＡＡＧ、ＮｅｉまたはＡＡＧとＮｅｉとの混合物による処理に供した。次いで、２倍クエンチ溶液（９５％ ホルムアミドおよび２５ ｍＭ ＥＤＴＡ）１０μＬを添加することによって各反応を停止させ、酵素を９８℃で１０分間加熱することによって不活性化し、二重核酸を変性させた。反応生成物を２０％変性尿素－ポリアクリルアミドゲルによって分析し、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｉｍａｇｅｒ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）によって可視化した。

【0091】

図１０に示すように、ＡＡＧ、ＮｅｉおよびＴ４ ＰＮＫＰの混合物による処理は、二重３８－ｍｅｒの核酸からの連結ｄＩＭＰの除去、二重３８－ｍｅｒの核酸の熱変性後に新たに合成された１６－ｍｅｒのポリヌクレオチド（配列番号３）の放出、および３’末端にヒドロキシル基を有する開始剤（配列番号１）の再生をもたらした。ＡＡＧ単独、Ｎｅｉ単独、またはＡＡＧとＮｅｉとの組み合わせのいずれも、二重３８－ｍｅｒの核酸の熱変性後に新たに合成された核酸を効率的かつ完全に放出し、同時に３’末端にヒドロキシル基を有する開始剤を再生することができない。

【0092】

本明細書で引用されるすべての特許および参考文献は、参照としてその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合は、定義を含むこの場合の説明が優先する。

【0093】

本開示は、例示的実施形態と考えられるものに関連して説明されてきたが、本開示は、開示された実施形態に限定されるものではなく、最も広い解釈の精神および範囲内に含まれる様々な構成を網羅し、そのようなすべての修正および同等の構成を包含することを意図していることが理解されよう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

2024505114000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-08-17

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸合成および前記核酸合成のための再利用可能な開始剤の再生のための方法であって、以下の工程：
前記核酸合成のために、固体支持体に接着させた開始剤をポリメラーゼの存在下で連結ヌクレオチドに曝露して、前記連結ヌクレオチドが前記開始剤に組み込まれるようにする工程であって、前記連結ヌクレオチドが、基質塩基、基質糖、および３’ヒドロキシル基を有する、工程；
前記連結ヌクレオチドを含有する前記開始剤を前記ポリメラーゼの存在下でヌクレオチドモノマーに曝露して、核酸が合成されて前記連結ヌクレオチドの直後で前記開始剤に結合されるようにする工程；
単官能性ＤＮＡグリコシラーゼを提供する工程であって、前記基質塩基を有する前記連結ヌクレオチドが、前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによって認識可能かつ切除可能である、工程；
前記基質塩基を前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによる切除処理に供し、前記基質塩基が前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによって切除されて脱塩基部位が生成されるされるようにする工程；
脱塩基部位エンドヌクレアーゼを提供する工程であって、前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼによって、得られた前記脱塩基部位が認識可能であり、前記基質糖が切断可能である、工程；
前記脱塩基部位を前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼによる切断処理に供しする工程であって、前記脱塩基部位において前記基質糖および前記核酸の骨格の両方が切断されて、前記核酸が前記開始剤から放出され、前記開始剤の３’末端ヌクレオチドが３’リン酸基を有し、前記合成された核酸の５’末端ヌクレオチドが５’リン酸基を有するようにする工程；
３’ホスファターゼ活性保有酵素を提供する工程；ならびに
前記開始剤の３’末端ヌクレオチドを、前記３’ホスファターゼ活性保有酵素による脱リン酸化処理に供し、前記開始剤の３’末端ヌクレオチドの３’リン酸基が、元の３’ヒドロキシル基に戻るよう変換される工程、
を含む方法。

【請求項2】

核酸合成のための再利用可能な開始剤を再生する方法であって、以下の工程：
単官能性ＤＮＡグリコシラーゼを提供する工程；
前記核酸合成のための開始剤と合成された核酸とを提供する工程であって、前記開始剤が、固体支持体に接着されており、前記合成された核酸が、基質塩基および基質糖を有する連結ヌクレオチドの直後で前記開始剤に連結されており、前記基質塩基を有する前記連結ヌクレオチドが、前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによって認識可能および切除可能である工程；
前記基質塩基を前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによる切除処理に供する工程であって、前記基質塩基が前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによって切除されて、脱塩基部位が生成されるようにする工程；
脱塩基部位エンドヌクレアーゼを提供する工程であって、前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼによって、得られた前記脱塩基部位が認識可能であり、前記基質糖が切断可能である、工程；
前記脱塩基部位を前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼによる切断処理に供し、前記脱塩基部位において前記基質糖および前記核酸の骨格の両方が切断されて、前記合成された核酸が前記開始剤から放出され、前記開始剤の３’末端ヌクレオチドが３’リン酸基を有し、前記合成された核酸の５’末端ヌクレオチドが５’リン酸基を有するようにする工程；
３’ホスファターゼ活性保有酵素を提供する工程；ならびに
前記開始剤の３’末端ヌクレオチドを、前記３’ホスファターゼ活性保有酵素による脱リン酸化処理に供し、前記開始剤の３’末端ヌクレオチドの３’リン酸基が、元の３’ヒドロキシル基に戻るよう変換される工程、
を含む方法。

【請求項3】

核酸を合成する方法であって、以下の工程：
ａ）固体支持体に接着させた開始剤を提供する工程であって、前記開始剤が、基質塩基、基質糖、および３’ヒドロキシル基を有する連結ヌクレオチドに結合されている、工程；
ｂ）前記連結ヌクレオチドに結合させた前記開始剤を、ポリメラーゼの存在下でヌクレオチドモノマーに曝露する工程であって、前記ヌクレオチドモノマーの１つと前記連結ヌクレオチドの３’ヒドロキシル基とを反応させることによって、前記核酸が合成され、前記開始剤と結合するようにする工程；
ｃ）前記基質塩基を単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによる切除処理に供する工程であって、前記基質塩基が前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによって切除されて、脱塩基部位が生成される工程；
ｄ）前記脱塩基部位を脱塩基部位エンドヌクレアーゼによる切断処理に供する工程であって、前記脱塩基部位において前記基質糖および糖リン酸骨格の両方が切断されて、前記核酸が前記開始剤から放出され、それにより、前記開始剤の３’末端ヌクレオチドに３’リン酸基が形成される工程；ならびに
ｅ）前記３’リン酸基を有する３’末端ヌクレオチドを、３’ホスファターゼ活性保有酵素での脱リン酸化処理に供する工程であって、前記３’末端ヌクレオチドにヒドロキシル基が形成されて、前記開始剤を再生させる工程、
を含む方法。

【請求項4】

核酸合成のための開始剤を再生する方法であって、以下の工程：
ａ）固体支持体に接着させた開始剤を提供する工程であって、前記開始剤が、連結ヌクレオチドおよび合成された核酸と結合されており、前記連結ヌクレオチドが基質塩基および基質糖を有する、工程；
ｂ）前記基質塩基を単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによる切除処理に供する工程であって、前記基質塩基が前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼによって切除されて、脱塩基部位が生成される工程；
ｃ）前記脱塩基部位を脱塩基部位エンドヌクレアーゼによる切断処理に供する工程であって、前記脱塩基部位において前記基質糖および糖リン酸骨格の両方が切断されて、前記合成された核酸が前記開始剤から放出され、それにより、前記開始剤の３’末端ヌクレオチドに３’リン酸基が形成される工程；ならびに
ｄ）前記３’リン酸基を有する３’末端ヌクレオチドを、３’ホスファターゼ活性保有酵素による脱リン酸化処理に供する工程であって、前記３’末端ヌクレオチドにヒドロキシル基が形成されて、さらなる核酸合成のために再利用される前記開始剤を再生させる工程、
を含む方法。

【請求項5】

前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼが、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、一本鎖選択的単官能性ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ１、メチル結合ドメイングリコシラーゼ４、チミンＤＮＡグリコシラーゼ、ｍｕｔＹホモログＤＮＡグリコシラーゼ、アルキルプリングリコシラーゼＣ、アルキルプリングリコシラーゼＤ、脱塩基部位リアーゼ活性を有さない８－オキソ－グアニングリコシラーゼ１、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＩＩＩ様１、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ様グリコシラーゼ１、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ様グリコシラーゼ２、脱塩基部位リアーゼ活性を有さないエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ様グリコシラーゼ３、およびその酵素的に活性な断片からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記単官能性ＤＮＡグリコシラーゼがウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼおよびアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼのうちの１つである、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、およびそれらの酵素的に活性な断片からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記脱塩基部位エンドヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記３’ホスファターゼ活性保有酵素が、ポリヌクレオチドキナーゼ３’－ホスファターゼ、３’－ホスホエステラーゼ、およびそれらの酵素的に活性な断片からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記３’ホスファターゼ活性保有酵素が、３’－ホスファターゼ活性を有するＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ、およびジンクフィンガーＤＮＡ ３’－ホスホエステラーゼ、からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記連結ヌクレオチドの基質塩基が、ウラシル、ヒポキサンチン、チミン、シトシン、グアニン、５－フルオロウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシルシトシン、３－メチルアデニン、３－メチルグアニン、７－メチルアデニン、７－メチルグアニン、Ｎ^６－メチルアデニン、８－オキソ－７，８－ジヒドログアニン、５－ヒドロキシルシトシン、５－ヒドロキシウラシル、ジヒドロキシウラシル、エテノシトシン、エテノアデニン、チミングリコール、シトシングリコール、２，６－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－Ｎ－メチルホルムアミドピリミジン、アデニンのホルムアミドピリミジン誘導体、グアニンのホルムアミドピリミジン誘導体、グアニンに対合したアデニン、グアニンに対合したウラシル、アデニンに対合したウラシル、グアニンに対合したチミン、グアニンに対合したエテノシトシン、８－オキソ－７，８－ジヒドログアニンに対合したアデニン、およびグアニンに対合した２－ヒドロキシルアデニンからなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記連結ヌクレオチドの基質塩基が、ウラシルまたはヒポキサンチンである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記基質塩基がウラシルであり、それによりデオキシウリジンが形成される、請求項３または４に記載の方法。

【請求項14】

前記基質塩基がヒポキサンチンであり、それによりデオキシイノシンが形成される、請求項３または４に記載の方法。

【請求項15】

前記開始剤、前記合成された核酸および前記連結ヌクレオチドが、それぞれ鋳型非依存型および鋳型依存型のうちの１つである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記ポリメラーゼが、ファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＣ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＸ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＹ ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、およびそれらの酵素的に活性な断片からなる群から選択される、請求項１または３に記載の方法。

【請求項17】

核酸合成および前記核酸合成のための再利用可能な核酸の再生のためのキットであって、
前記核酸合成のためのポリメラーゼおよび連結ヌクレオチド；
単官能性ＤＮＡグリコシラーゼ；
脱塩基部位エンドヌクレアーゼ：ならびに
３’ホスファターゼ活性保有酵素；
を含み、請求項１に記載の方法に従って使用されるキット。

【請求項18】

核酸を合成するためのキットであって、
ポリメラーゼ；
固体支持体に接着させた開始剤；
単官能性ＤＮＡグリコシラーゼ；
脱塩基部位エンドヌクレアーゼ；ならびに
３’ホスファターゼ活性保有酵素；
を含み、請求項３に記載の方法に従って使用されるキット。

【請求項19】

核酸合成のための開始剤を再生するためのキットであって、
固体支持体に接着させた開始剤；
単官能性ＤＮＡグリコシラーゼ；
脱塩基部位エンドヌクレアーゼ；ならびに
３’ホスファターゼ活性保有酵素；
を含み、請求項４に記載の方法に従って使用されるキット。

【国際調査報告】