ホーム > 特許ランキング > Ｇｌｙｃｏｍ Ａ／Ｓ
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特表2024-505126シアル酸付加ＨＭＯの産生における新規の主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）タンパク質（ＦＲＥＤ）
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-05
(54)【発明の名称】シアル酸付加ＨＭＯの産生における新規の主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）タンパク質（ＦＲＥＤ）
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20240129BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240129BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240129BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240129BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240129BHJP
C12P 19/04 20060101ALI20240129BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31
C12N1/21 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N5/10
C12P19/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023540080
(86)(22)【出願日】2022-01-21
(85)【翻訳文提出日】2023-08-14
(86)【国際出願番号】 EP2022051295
(87)【国際公開番号】W WO2022157280
(87)【国際公開日】2022-07-28
(31)【優先権主張番号】PCT/EP2021/051479
(32)【優先日】2021-01-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21185379.1
(32)【優先日】2021-07-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508278309
【氏名又は名称】グリコム・アクティーゼルスカブ
【氏名又は名称原語表記】Ｇｌｙｃｏｍ Ａ／Ｓ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100128381
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 義憲
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(72)【発明者】
【氏名】ペダーセン， マルギット
(72)【発明者】
【氏名】ダリゴ， イソッタ
(72)【発明者】
【氏名】ビッチ カンプマン， カトリーヌ
(72)【発明者】
【氏名】パパダキス， マノス
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AF04
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA10
4B065AA01Y
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BC01
4B065CA21
4B065CA41
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、遺伝子改変細胞における生物学的分子の組み換え産生の分野に関する。より具体的には、主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）のタンパク質（発現されるタンパク質はＦｒｅｄである）を発現する遺伝子改変細胞を使用するシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の組み換え産生のための方法に関する。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
シアリル部分を含む１種以上のヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる遺伝子改変細胞であって、前記遺伝子改変細胞が、（ｉ）配列番号１の主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）ポリペプチド、又は配列番号１と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログをコードする異種核酸配列、及び
（ｉｉ）シアリル－トランスフェラーゼをコードする異種核酸配列；並びに
（ｉｉｉ）シアル酸糖ヌクレオチドを作製するための生合成経路
を含む、遺伝子改変細胞。
【請求項2】
１種以上の産生された前記ＨＭＯが、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ、ＦＳＬ、ＤＳ－ＬＮＴ、ＬＳＴｃ、ＬＳＴａ及びＬＳＴｂからなる群から選択される、請求項１に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項3】
配列番号１の前記ＭＦＳポリペプチド又はその機能的ホモログの発現が、前記ＭＦＳポリペプチドを有しない細胞と比較して、前記ＨＭＯの排出の増加をもたらす、請求項１又は２に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項4】
前記シアリル－トランスフェラーゼが、表２に示されるものなどのα－２，３－シアリル－トランスフェラーゼ及びα－２，６－シアリル－トランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項5】
前記α－２，３－シアリル－トランスフェラーゼが、Ｎｓｔ（配列番号３）若しくはＰｄ２（配列番号４）、及び／又は配列番号３若しくは配列番号４と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログから選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項6】
前記シアル酸糖ヌクレオチドが、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃである、請求項１～５のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項7】
シアル酸糖ヌクレオチドを作製するための前記生合成経路が、配列番号１７のｎｅｕＢＣＡ遺伝子クラスター又は配列番号１２の１種以上の異種遺伝子ＮｅｕＢ及び配列番号１４のＮｅｕＣ及び配列番号１６のＮｅｕＡ又は配列番号１７、１２、１４若しくは１６と少なくとも８０％同一な核酸配列を有するその機能的ホモログによってコードされる、請求項１～６のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項8】
前記細胞がさらに、前記異種核酸配列の発現の調節のための調節エレメントを含む核酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項9】
前記調節エレメントが、配列番号１の前記ＭＦＳポリペプチド、又は配列番号１と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログの発現を調節する、請求項８に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項10】
前記調節エレメントが、ＰｇｌｐＦ（配列番号５）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４（配列番号６）及びＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７（配列番号７）からなる群から選択される、請求項８又は９に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項11】
前記遺伝子改変細胞が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの微生物細胞である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項12】
核酸構築物であって、（ｉ）配列番号１によるＭＦＳポリペプチド、又は配列番号１と７０％を超える配列同一性を有するその機能的ホモログをコードする核酸配列（前記ＭＦＳポリペプチドをコードする前記核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する）、及び
（ｉｉ）事項（ｉ）の前記核酸配列のいずれか１つ以上の発現を調節する調節エレメントを含む核酸配列
を含む、核酸構築物。
【請求項13】
前記調節エレメントが、ＰｇｌｐＦ（配列番号５）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４（配列番号６）及びＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７（配列番号７）からなる群から選択される、請求項１２に記載の核酸構築物。
【請求項14】
１種以上のシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖の生合成産生のための方法であって、（ｉ）請求項１～１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞を提供する工程；
（ｉｉ）配列番号１の主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）ポリペプチド、又は配列番号１と７０％を超えて同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログをコードする前記異種核酸配列、及び１種以上のシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を産生するシアリル－トランスフェラーゼをコードする前記異種核酸配列を発現するのに好適な細胞培養培地において前記遺伝子改変細胞を培養する工程；並びに
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において産生される１種以上のシアル酸付加ＨＭＯを収集する工程
を含む方法。
【請求項15】
１種以上のシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の生合成産生のための請求項１～１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞又は請求項１２若しくは１３のいずれか一項に記載の核酸構築物の使用。
【請求項16】
前記シアル酸付加ＨＭＯが、３’－ＳＬ及び６’－ＳＬからなる群から選択される、請求項１５に記載の遺伝子改変細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［分野］
本発明は、遺伝子改変細胞における生物学的分子の組み換え産生の分野に関する。より具体的には、それは、主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）のタンパク質（発現されるタンパク質はＦｒｅｄである）を発現する遺伝子改変細胞を使用するシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の組み換え産生のための方法に関する。
本発明は、遺伝子改変細胞における生物学的分子の組み換え産生の分野に関する。より具体的には、それは、主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）のタンパク質（発現されるタンパク質はＦｒｅｄである）を発現する遺伝子改変細胞を使用するシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の組み換え産生のための方法に関する。
【0002】
［背景］
ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）は、非消化性炭水化物であり、母乳の３番目に大きい構成成分を占める。ヒト母乳と比較して同様の非消化性オリゴ糖の濃度又は複雑さを有する哺乳動物は存在しない。現在までに、２００種を超えるＨＭＯが同定されている（ＸＩ ＣＨｅｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１５，Ｖｏｌｕｍｅ ７２のチャプター４及びＵｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．：Ｍｉｌｋ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１１，ＩＳＢＮ：９７８－１－６１１２２－８３１－１を参照のこと）。
ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）は、非消化性炭水化物であり、母乳の３番目に大きい構成成分を占める。ヒト母乳と比較して同様の非消化性オリゴ糖の濃度又は複雑さを有する哺乳動物は存在しない。現在までに、２００種を超えるＨＭＯが同定されている（ＸＩ ＣＨｅｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１５，Ｖｏｌｕｍｅ ７２のチャプター４及びＵｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．：Ｍｉｌｋ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１１，ＩＳＢＮ：９７８－１－６１１２２－８３１－１を参照のこと）。
【0003】
ＨＭＯは、ヒト発生における重要な機能性の発見により、過去１０年の間で非常に感心が高くなった。それらのプレバイオティクス特性の他に、ＨＭＯは、それらの適用分野を拡大する追加のプラスの効果と結び付けられている（Ｋｕｎｚ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｆｏｏｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ，１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ５－２０，Ｅｄｓ．Ｍｏｒｅｎｏ Ｊ．ａｎｄ Ｌｕｚ Ｓａｎｚ Ｍ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ）。ＨＭＯの健康上の利点は、乳児用調製粉乳及び乳児食などの食品における使用、並びに消費者用健康食品のためのそれらの承認を可能にした。
【0004】
ＨＭＯは化学的に合成することができるが、大量生産に関して課題がある。ＨＭＯの化学合成と関連する課題を克服するために、いくつかの酵素的方法及び発酵手法が開発されている。発酵に基づくプロセスは、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、３’－シアリルラクトース及び６’－シアリルラクトースなどのいくつかのＨＭＯのために開発されている。発酵に基づくプロセスは通常、組み換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの遺伝子改変細菌株を利用する（概説に関して、Ｂｙｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１９，５６：１３０－１３７を参照のこと）。
【0005】
ＨＭＯの生物工学的産生における最近の開発は、細菌発現系の所定の固有の限界を克服することを可能にしてきた。例えば、ＨＭＯ産生細菌細胞は、細菌内でのヌクレオチド糖の制限された細胞内プールを増加させるため（国際公開第２０１２／１１２７７７号パンフレット）、ＨＭＯ産生に関与する酵素の活性を改良するため（国際公開第２０１６／０４０５３１号パンフレット）又は合成されたＨＭＯの細胞外培地中への分泌を促進するため（国際公開第２０１０／１４２３０５号パンフレット、国際公開第第２０１７／０４２３８２号パンフレット）に遺伝子改変され得る。さらに、組み換え細胞内の目的の遺伝子の発現は、例えば、国際公開第２０１９／１２３３２４号パンフレットに記載されるとおりの特定のプロモーター又は他の遺伝子発現調節因子を使用することによって調節され得る。
【0006】
糖排出トランスポーターの使用は、国際公開第２０１０／１４２３０５号パンフレット及び国際公開第２０１７／０４２３８２号パンフレットにおいて記載されており、産生中にＨＭＯを細胞から排出させることによって高レベルのＨＭＯを産生することにより細胞に与えられる代謝負荷を低減する利点を有する。この手法は、組み換えＨＭＯ産生細胞の操作において一層多くの注目を集めており、例えば、最近では、タンパク質をコードする数種の新規の糖トランスポーター遺伝子及びヒト母乳の最も豊富なＨＭＯである組み換え産生された２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）の排出を促進できる発酵プロセスについて記載されている（国際公開第２０１８／０７７８９２号パンフレット、米国特許出願公開第２０１９／００３２３０５３号明細書、米国特許出願公開第２０１９／００３２３０５２号明細書）。
【0007】
シアル酸付加ＨＭＯの産生は、国際公開第２００７／１０１８６２号パンフレットにおいて記載されており、例えば、微生物から３’－ＳＬを産生するのに必要な改変を記載している。シアル酸付加ＨＭＯの産生は、シアリル部分の酸性度に起因して細胞の酸性化をもたらし、その結果、細胞酸性化の生理学的影響により全体的に好ましくない産生結果をもたらす。したがって、特に細胞からのシアル酸付加ＨＭＯの排出の増強は細胞に関して生理学的な利点を有することになる一方で、シアル酸付加ＨＭＯの下流の収集及び精製も単純化して、全体的にシアル酸付加ＨＭＯの大量生産において多大な利点を有する。
【0008】
しかしながら、現時点では、糖トランスポーターの基質特異性を定義する構造－機能の関連性は、依然として明確に研究されておらず、極めて予測不能なままであるため、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔなどの複数のタンパク質データベースにおける予測されたトランスポーター機能を備える極めて多数の細菌タンパク質間で様々な組み換え産生されたＨＭＯ構造の排出が可能な正しいトランスポータータンパク質を正確に特定できるアルゴリズムは、存在しない。
【0009】
本開示は、他の有利な産生上の利点とともに産生される生成物の量を増加させるためのシアル酸付加ＨＭＯ産生株における特定の異種糖排出トランスポータータンパク質の使用を初めて示す。
【0010】
［概要］
最近、本出願の発明者らは、３－ＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮｎＴ及びＬＮＦＰ－Ｉなどの他のＨＭＯを輸送することができる主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）におけるいくつかのトランスポーターを同定した（国際公開第２０２１／１４８６１５号パンフレット及び国際公開第２０２１／１４８６１４号パンフレット及び国際公開第２０２１／１４８６１１号パンフレット及び国際公開第２０２１／１１０６１０号パンフレット及びＰＣＴ／欧州特許第２０２１／０５１４６６２号明細書及び国際公開第２０２１／１４８６２０号パンフレット及び国際公開第２０２１／１４８６１８号パンフレット）。本開示は、有利な産生上の利点のためのシアル酸付加ＨＭＯ産生株における異種糖排出トランスポータータンパク質Ｆｒｅｄの使用を初めて示す。
最近、本出願の発明者らは、３－ＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮｎＴ及びＬＮＦＰ－Ｉなどの他のＨＭＯを輸送することができる主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）におけるいくつかのトランスポーターを同定した（国際公開第２０２１／１４８６１５号パンフレット及び国際公開第２０２１／１４８６１４号パンフレット及び国際公開第２０２１／１４８６１１号パンフレット及び国際公開第２０２１／１１０６１０号パンフレット及びＰＣＴ／欧州特許第２０２１／０５１４６６２号明細書及び国際公開第２０２１／１４８６２０号パンフレット及び国際公開第２０２１／１４８６１８号パンフレット）。本開示は、有利な産生上の利点のためのシアル酸付加ＨＭＯ産生株における異種糖排出トランスポータータンパク質Ｆｒｅｄの使用を初めて示す。
【0011】
本開示は、主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）由来のＦｒｅｄタンパク質をコードする異種遺伝子ｆｒｅｄのシアル酸付加ＨＭＯ産生株における過剰発現が、ＨＭＯの全体的な産生に影響を及ぼすことなく細胞から排出されるＨＭＯの量を増加させることを示す。様々な組み換え産生ＨＭＯに対して特異性を有する新規の効率的な糖排出トランスポータータンパク質の同定及び前記タンパク質を発現する組み換え細胞の開発は、大規模な工業的ＨＭＯ製造にとって有利である。
【0012】
産生されたＨＭＯは、１つ以上のシアリル部分を含み得る。その点において、産生されたＨＭＯは、３’－ＳＬ（３’－シアリルラクトース）、６’－ＳＬ（６’－シアリルラクトース）、ＬＳＴｃ（シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオースｃ）、ＬＳＴａ（シアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ）、ＬＳＴｂ（シアリルラクト－Ｎ－テトラオースｂ）、３’－Ｓ，３－ＦＬ（シアリル－３－フコシルラクトース）及びＤＳ－ＬＮＴ（ジシアリルラクト－Ｎ－テトラオース）からなる群から選択されてもよい。特に、３’－ＳＬ及び６’－ＳＬは、これらが最も豊富なシアル酸付加ＨＭＯであるため興味深い。
【0013】
したがって、本発明は、１種以上のシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる遺伝子改変細胞に関し、前記遺伝子改変細胞は、配列番号１の主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）ポリペプチド、又は配列番号１と７０％を超えて同一、例えば、配列番号１と少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９９％又は例えば少なくとも９９．７％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログをコードする異種核酸を含む。
【0014】
さらに、遺伝子改変細胞は、シアリル－トランスフェラーゼを発現する。特に、シアリル－トランスフェラーゼは、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ及びα－２，６－シアリルトランスフェラーゼ、例えば、表２のシアリルトランスフェラーゼからなる群から選択される。
【0015】
一実施形態では、Ｆｒｅｄ発現遺伝子改変細胞はさらに、配列番号３のα－２，３－シアリル－トランスフェラーゼ及び／又は配列番号３と少なくとも７０％同一、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９９％若しくは例えば、少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを異種性に発現するように改変され得る。加えて、遺伝子改変細胞は、シアル酸糖ヌクレオチドを作製するための生合成経路を含有する。
【0016】
一実施形態では、Ｆｒｅｄ発現遺伝子改変細胞はさらに、配列番号４のα－２，６－シアリル－トランスフェラーゼ及び／又は配列番号４と少なくとも７０％同一、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９９％若しくは例えば、少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを異種性に発現するように改変され得る。加えて、遺伝子改変細胞は、シアル酸糖ヌクレオチドを作製するための生合成経路を含有する。
【0017】
一実施形態では、Ｆｒｅｄ発現遺伝子改変細胞はさらに、配列番号３のα－２，３－シアリル－トランスフェラーゼ及び配列番号４のα－２，６－シアリル－トランスフェラーゼ並びに／又は配列番号３若しくは４と少なくとも７０％同一、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９９％若しくは例えば、少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する配列番号３若しくは４の機能的ホモログを異種性に発現するように改変され得る。加えて、遺伝子改変細胞は、シアル酸糖ヌクレオチドを作製するための生合成経路を含有する。
【0018】
本発明による遺伝子改変細胞はさらに、異種核酸配列の発現の調節のための調節エレメントを含む核酸配列を含み得る。調節エレメントは、目的のポリペプチドをコードする核酸の発現を調節することができ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、及びＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７からなる群から選択することができる。
【0019】
本発明の一実施形態では、前記調節エレメントは、配列番号１に示されるＭＦＳポリペプチド、又は配列番号１と７０％を超えて同一、例えば、配列番号１と少なくとも８０、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９９％又は例えば、少なくとも９９．７％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログの発現を調節する。
【0020】
好ましい態様では、前記調節エレメントは、配列番号１に示されるＭＦＳポリペプチド、又は配列番号１と９５．４％を超えて、例えば、９９．７％を超えて、例えば、１００％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログの発現を調節する。本発明は、Ｆｒｅｄタンパク質を発現するＨＭＯ産生組み換え細胞の使用が、ＨＭＯの発酵及び精製の両方に関連するＨＭＯ製造プロセスの極めて顕著な改良をもたらすことを示す。本明細書で開示されるＨＭＯ産生のための組み換え細胞及び方法は、細胞から上清へのＨＭＯのより高い分泌、より低い副生成物形成又は副生成物対生成物比、及び発酵ブロスの下流処理中のＨＭＯの容易な回収の両方を提供する。
【0021】
様々なＨＭＯ産生細胞におけるＦｒｅｄをコードするＤＮＡ配列の発現は、細胞外培地中でのいくつかの特定のＨＭＯの蓄積及び産生細胞の内部での他のＨＭＯの蓄積、並びにＨＭＯの総産生量の増加と関連することが見出されている（国際公開第２０２１／１４８６２０号パンフレットを参照のこと）。驚くべきことに、産生されたＨＭＯの排出の増加は、本明細書の実施例からわかるとおり、３又は４単位の単糖のいずれかからなるＨＭＯ、すなわち、三糖又は四糖であるＨＭＯ、例えば、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、３－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、ラクト－Ｎ－トリオース２、（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）又はラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、特に、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、又はラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）に関する特徴であるが、産生細胞の内部で蓄積する五糖又は六糖のようなより大きいオリゴ糖構造に関する特徴ではないことが見出されている。
【0022】
一態様では、前記細胞により産生されるＨＭＯは、３’－ＳＬ及び６’－ＳＬからなる群から選択される１種以上のヒトミルクオリゴ糖などであるがこれらに限定されないシアル酸付加ＨＭＯである。好ましい実施形態では、シアル酸付加ＨＭＯは、３’－ＳＬである。
【0023】
さらに驚くべきことに、ｆｒｅｄ遺伝子を発現する対応するＨＭＯ産生細胞において、ＨＭＯ、３’－ＳＬはほとんど全て３’－ＳＬであり、発酵培地中においてほとんど独占的に見出されることが判明した。
【0024】
本発明はまた、主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）のポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構築物に関し、主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％及びさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、本発明はまた、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である核酸構築物を含む遺伝子改変細胞に関する。
【0025】
さらに、本発明は、１種以上のシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の生合成産生のための方法であって、
（ｉ）本発明による遺伝子改変細胞を提供する工程；
（ｉｉ）安定した細胞培養培地中で（ｉ）による遺伝子改変細胞を培養して、排出糖輸送が可能な前記ポリペプチドを発現させ、１種以上のシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を産生させる工程及び；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において産生される１種以上のシアル酸付加ＨＭＯを収集する工程
を含む方法を提供する。
（ｉ）本発明による遺伝子改変細胞を提供する工程；
（ｉｉ）安定した細胞培養培地中で（ｉ）による遺伝子改変細胞を培養して、排出糖輸送が可能な前記ポリペプチドを発現させ、１種以上のシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を産生させる工程及び；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において産生される１種以上のシアル酸付加ＨＭＯを収集する工程
を含む方法を提供する。
【0026】
本発明はまた、１種以上のシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の生合成産生のための、主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）ポリペプチドをコードする異種核酸配列であって、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する前記核酸配列を含む遺伝子改変細胞又は核酸構築物の使用に関する。
【0027】
好ましい実施形態では、本発明はまた、（ｉ）配列番号１によるＭＦＳポリペプチド、又は配列番号１と７０％を超える、８０％、９４．５％又は９９．７％の配列同一性を有するその機能的ホモログをコードする１種以上の核酸配列（ＭＦＳポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％の配列同一性を有する）、（ｉｉ）シアリル－トランスフェラーゼ能を有する１種以上のポリペプチドをコードする１種以上の異種核酸配列、並びに事項（ｉ）及び／又は（ｉｉ）の核酸配列のいずれか１種以上の発現を調節する調節エレメントを含む１種以上の核酸配列を含む遺伝子改変細胞又は核酸構築物の使用に関する。
【0028】
上述のとおり、１種以上のシアル酸付加ＨＭＯを産生することができる、Ｆｒｅｄトランスポータータンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子改変細胞の培養中、驚くべきことに、副生成物及びバイオマス形成を減少させながら、対応する１種以上のシアル酸付加ＨＭＯが高収率で産生されることが見出されている。これは、下流プロセス中のＨＭＯの回収の改良を促進し、例えば、全体的な回収及び精製手順は、より少ない工程を含む場合があり、精製の全体的な時間が短くなる場合がある。
【0029】
特に、改良された生成物の回収の効果により、本発明は先行技術の開示よりも優れたものになる。
【0030】
本発明の他の態様及び有利な特徴について、下記の非限定的な実施例によって詳細に記載し、例示する。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】それぞれ株２及び１において配列番号１のＦｒｅｄ ＭＦＳトランスポータータンパク質の発現のためにコードする配列番号２のｆｒｅｄ遺伝子の統合を（株２）有する及び（株１）有しない改変された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の相対的な３’－ＳＬ産生を示す。データは、ディープウェルフィードバッチアッセイから得られる。
【図2】配列番号１のＦｒｅｄ ＭＦＳトランスポータータンパク質の発現のためにコードする配列番号２のｆｒｅｄ遺伝子の統合を（株２）有する及び（株１）有しない改変された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の細胞の内部及び外部の３’－ＳＬの相対的な分布を示す。データは、ディープウェルフィードバッチアッセイから得られる。
【図3】配列番号１のＦｒｅｄ ＭＦＳトランスポータータンパク質の発現のためにコードする配列番号２のｆｒｅｄ遺伝子の統合を（株２、バッチＧＤＦ２１１７３及びＧＤＦ２１１７７）有する及び（株１、バッチＧＤＦ２１１７０及びＧＤＦ２１１７４）有しない改変された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の細胞における発酵ブロスのペレットと上清画分の間の３’－ＳＬ分布の時間プロファイルを示す。
【図4】配列番号１のＦｒｅｄ ＭＦＳトランスポータータンパク質の発現のためにコードする配列番号２のｆｒｅｄ遺伝子の統合を（株２、バッチＧＤＦ２１１７３及びＧＤＦ２１１７７）有する及び（株１、バッチＧＤＦ２１１７０及びＧＤＦ２１１７４）有しない改変された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の細胞における発酵全体にわたるウェットバイオマス（ＢＷＭ）の発達の時間プロファイルを示す。
【図5】配列番号１のＦｒｅｄ ＭＦＳトランスポータータンパク質の発現のためにコードする配列番号２のｆｒｅｄ遺伝子の統合を（株４）有する及び（株３）有しない改変された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の細胞における発酵ブロスのペレットと上清画分の間の３’－ＳＬ分布の時間プロファイルを示す。
【図6】配列番号１のＦｒｅｄ ＭＦＳトランスポータータンパク質の発現のためにコードする配列番号２によるｆｒｅｄ遺伝子の統合を（株４）有する及び（株３）有しない改変された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の細胞における発酵全体にわたるウェットバイオマス（ＢＷＭ）の発達の時間プロファイルを示す。株３及び株４は、ゲノムから統合され、過剰発現されるｎｅｕＢＣＡ遺伝子を有する。
【図7A】トランスポーターを有しない細胞（株１）と比較した、代替的なＭＦＳトランスポーター、ＹｂｅｒＣを発現する細胞（株５）における３’－ＳＬの相対的な産生（Ａ）を示す。
【図7B】トランスポーターを有しない細胞（株１）と比較した、代替的なＭＦＳトランスポーター、ＹｂｅｒＣを発現する細胞（株５）におけるペレットと上清の間の分布（Ｂ）を示す。データは、ディープウェルフィードバッチアッセイから得られる。
【0032】
［詳細な説明］
下記では、本発明の実施形態についてさらに詳細に記載する。特徴のそれぞれの特定の変形形態は、他に特に記載しない限り、本発明の他の実施形態に適用され得る。
下記では、本発明の実施形態についてさらに詳細に記載する。特徴のそれぞれの特定の変形形態は、他に特に記載しない限り、本発明の他の実施形態に適用され得る。
【0033】
一般に、本明細書で使用する全ての用語は、他に明示的に規定又は記載されない限り、当技術分野におけるそれらの通常の意味に従って解釈されるべきであり、本発明の全ての態様及び実施形態に適用することができる。
【0034】
「１つの（ａ）／１つの（ａｎ）／その［細胞、配列、遺伝子、トランスポーター、工程など］」についての全ての言及は、他のことが明示的に記載されない限り、前記細胞、配列、遺伝子、トランスポーター、工程などの少なくとも１つの例についての言及であると開放的に解釈されるべきである。
【0035】
本明細書に開示した任意の方法の工程は、明示的に規定されない限り、本明細書に開示した正確な順序で実施される必要はない。
【0036】
本発明は、一般に、オリゴ糖の効率的な産生のための遺伝子改変細胞及びオリゴ糖を産生させる方法における前記遺伝子改変細胞の使用に関する。特に、本発明は、オリゴ糖、好ましくは異種オリゴ糖、特にヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を合成することを可能にされた遺伝子改変細胞に関する。
【0037】
したがって、本発明の遺伝子改変細胞は、下記のとおりのグリコシルトランスフェラーゼ活性を備える１種以上の酵素をコードする遺伝子など、（宿主細胞が１種以上のＨＭＯを合成することを可能にする）細胞による１種以上のＨＭＯの合成に必要な一連の組み換え核酸を発現するように改変されている宿主細胞である。本発明のオリゴ糖産生組み換え細胞は、異種組み換え核酸配列、好ましくは、細菌エルシニア・フレデリクセニイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ）を起源とする推定上のＭＦＳ（主要ファシリテータースーパーファミリー）トランスポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むようにさらに改変される。
【0038】
具体的には、本発明は、Ｆｒｅｄタンパク質をコードする組み換え核酸を含む、１種以上の特定のオリゴ糖、特に、１種以上の特定のＨＭＯの産生のために最適化された遺伝子改変細胞に関する。
【0039】
配列番号２の核酸配列を有するＦｒｅｄタンパク質をコードする核酸配列は、「Ｆｒｅｄコード核酸／ＤＮＡ」又は「ｆｒｅｄ遺伝子」又は「ｆｒｅｄ」として本明細書で特定される。
【0040】
「Ｆｒｅｄタンパク質」又は「Ｆｒｅｄトランスポーター」又は「Ｆｒｅｄ ＭＦＳ（主要ファシリテータースーパーファミリー）トランスポータータンパク質」又は「Ｆｒｅｄ」として互換的に本明細書で特定されるＭＦＳトランスポータータンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有し；配列番号１として本明細書で特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入ＩＤ ＷＰ＿０８７８１７５５６．１を有するアミノ酸配列と１００％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【0041】
したがって、本発明の一態様は、１種以上のヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる遺伝子改変細胞に関し、前記遺伝子改変細胞は、糖輸送が可能なポリペプチドをコードする異種核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％及びさらにより好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0042】
したがって、本発明の一態様は、１種以上のシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる遺伝子改変細胞に関し、前記遺伝子改変細胞は、糖輸送が可能なポリペプチドをコードする異種核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％及びさらにより好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0043】
さらに、本発明は、１種以上の特定のオリゴ糖、特に、１種以上の特定のＨＭＯの産生のために最適化された遺伝子改変細胞であって、配列番号１のアミノ酸配列と９５．４％を超える、例えば、少なくとも９５．５％の配列同一性、好ましくは、少なくとも９６％、より好ましくは、少なくとも９７％、より好ましくは、少なくとも９８％、及びさらにより好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードする組み換え核酸を含む遺伝子改変細胞に関する。
【0044】
さらに、好ましい態様では、本発明は、１種以上のシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる遺伝子改変細胞であって、配列番号１のアミノ酸配列と７０％を超える、例えば、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、より好ましくは、少なくとも９９％、及びさらにより好ましくは、少なくとも９９．９％の配列同一性を有するタンパク質をコードする組み換え核酸を含む遺伝子改変細胞に関する。
【0045】
遺伝子改変ＨＭＯ産生細胞におけるＦｒｅｄトランスポーターの存在は、ＨＭＯ、特に、シアル酸付加ＨＭＯの排出の増加をもたらし、その結果、より大きい割合のＨＭＯが、Ｆｒｅｄトランスポーターを有しない同じ細胞と比較して培養ブロスの上清中に存在する。好ましくは、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ、ＦＳＬ、ＤＳ－ＬＮＴ、ＬＳＴｃ、ＬＳＴａ及びＬＳＴｂなどのシアル酸付加ＨＭＯの少なくとも８０％が細胞の外部に排出される。特に、３’－ＳＬ又は６’－ＳＬの少なくとも８０％が細胞の外部に排出される。好ましくは、３’－ＳＬ又は６’－ＳＬなどのＨＭＯの全体的な産生は、Ｆｒｅｄトランスポーターの存在によって著しくは影響されない。
【0046】
本明細書の文脈における用語「機能的ホモログ」は、配列番号１と７０％を超える、例えば、７１％～９９．９％、例えば、９５．４％、例えば、９５．５％～９９．７％又は１００％同一なアミノ酸配列を有し、且つ本発明の少なくとも１つの有利な効果、例えば、産生されるＨＭＯの回収率、ＨＭＯ産生効率及び／又はＨＭＯ産生細胞の生存率の増加を達成するのに有利な機能を有するタンパク質を意味する。
【0047】
用語「主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）」は、糖、薬物、疎水性分子、ペプチド、有機イオンなどを含むある範囲の様々な物質を輸送することを担っている第２の活性トランスポータークラスの大きく且つ並外れて広汎なファミリーを意味する。糖トランスポータータンパク質の特異性は、高度に予測不能であり、例えば、オリゴ糖に対する特異性を備える新規のトランスポータータンパク質の同定には、極めて負担の大きい実験室実験を必要とする（より詳細については、Ｒｅｄｄｙ Ｖ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２０１２），ＦＥＢＳ Ｊ．２７９（１１）：２０２２－２０３５による概説を参照されたい）。用語「ＭＦＳトランスポーター」は、本明細書の文脈において、オリゴ糖、好ましくはＨＭＯの細胞膜を通した輸送、好ましくは、例えば、２’－ＦＬ、３－ＦＬ、ＬＮＴ－２、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、３’－ＳＬ又は６’－ＳＬの３又は４糖単位を含むＨＭＯ／オリゴ糖の細胞の細胞質ゾルから細胞培地への遺伝子改変細胞により合成されたＨＭＯ／オリゴ糖の輸送を促進するタンパク質を意味する。加えて、又はこれに代えて、ＭＦＳトランスポーターは、ラクトース、グルコース、細胞代謝産物又は毒素などの本発明によるＨＭＯ又はオリゴ糖とみなされない分子の排出も促進し得る。
【0048】
用語「Ｆｒｅｄ」は、ＭＦＳトランスポーターのクラスの１つのメンバーを説明するために使用される。配列番号１として本明細書で特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入ＩＤ ＷＰ＿０８７８１７５５６．１を有するアミノ酸配列と１００％同一なアミノ酸配列である。配列番号１のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータータンパク質は、「Ｆｒｅｄタンパク質」又は「Ｆｒｅｄトランスポーター」又は「Ｆｒｅｄ ＭＦＳ（主要ファシリテータースーパーファミリー）トランスポータータンパク質」又は「Ｆｒｅｄ」として互換的に本明細書で特定される。Ｆｒｅｄタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２「Ｆｒｅｄコード核酸／ＤＮＡ」又は「ｆｒｅｄ遺伝子」又は「ｆｒｅｄ」として本明細書で特定される。
【0049】
用語「シアリル－トランスフェラーゼ」は、本明細書で使用する場合、シアル酸を活性化されたドナー分子からオリゴ糖アクセプターに移してグリコシド結合を形成することができるタンパク質又はポリペプチドを指す。シアリル－トランスフェラーゼは、Ｃａｚｙファミリー２９に分類される。ある種類のシアリル－トランスフェラーゼは、アルファ－２，３結合でガラクトースにシアル酸を付加することができる一方で、別の種類のシアリルトランスフェラーゼは、アルファ－２，６結合でガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミンにシアル酸を付加する。活性化されたドナー分子は、好ましくは、ＣＭＰ－シアル酸又はＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃである。
【0050】
２つ以上の核酸又はアミノ酸配列の文脈において、用語「［所定の］％の配列同一性」は、２つ以上の配列が、核酸又はアミノ酸の比較ウィンドウ又は指定された配列にわたって最大一致について比較及び整列されたとき、所与のパーセントで共通するヌクレオチド又はアミノ酸残基を有することを意味する（すなわち、配列は、少なくとも９０パーセント（％）の同一性を有する）。核酸配列又はアミノ酸配列の同一性パーセントは、デフォルトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴ ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、又は手動によるアラインメント及び視覚的検査によって測定することができる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照されたい）。この定義は、欠失及び／又は付加を有する試験配列の相補体及び配列並びに置換を有する相補体及び配列にも適用される。同一性パーセント、配列同一性を決定するために及びアラインメントのために好適なアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５－３３８９（１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴ ２．２．２０＋アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ ２．２．２０＋は、本発明の核酸及びタンパク質に対する配列同一性パーセントを決定するために使用される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。配列アラインメントアルゴリズムの例は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｏｍｅｇａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）、ＭＡＦＦＴ（ｈｔｔｐ：／／ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｅｒｖｅｒ／）又はＭＵＳＣＬＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）である。
【0051】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏ／．Ｂｉｏｌ．４８；４４３－４５３）を使用して決定される。使用されるパラメーターは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ伸長ペナルティ、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（３０ ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長の同一性」と表示されたＮｅｅｄｌｅ出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）が同一性パーセントとして使用され、以下のとおりに計算される：（同一の残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント内のギャップの総数）。
【0052】
本発明の目的のために、２つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、１０、好ましくは、バージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１ ９７０，前掲）を使用して決定される。使用されるパラメーターは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ伸長ペナルティ、及びＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長の同一性」と表示されたＮｅｅｄｌｅ出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）が同一性パーセントとして使用され、以下のとおりに計算される：（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント内のギャップの総数）。
【0053】
本発明の文脈において、用語「オリゴ糖」は、いくつかの単糖単位を含有する糖ポリマーを意味する。いくつかの実施形態では、好ましいオリゴ糖は、３又は４個の単糖単位、すなわち、三糖又は四糖からなる糖ポリマーである。本発明の好ましいオリゴ糖は、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）である。
【0054】
［ＨＭＯ］
本発明に関連して、用語「ヒトミルクオリゴ糖」又は「ＨＭＯ」は、ヒト母乳中で見出される複合糖質を意味する（参考のために、Ｕｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．：Ｍｉｌｋ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ（２０１１）；又はＣｈｅｎ，Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，１１３（２０１５）を参照されたい）。ＨＭＯは、１つ以上のβ－Ｎ－アセチル－ラクトサミニル及び／又は１つ以上のβ－ラクト－Ｎ－ビオシル単位によって伸長され得る還元末端でラクトース単位を含むコア構造を有し、このコア構造は、α－Ｌ－フコピラノシル及び／又はα－Ｎ－アセチル－ノイラミニル（シアリル）部分によって置換され得る。この点に関して、非酸性（又は中性）ＨＭＯは、シアリル残基を欠き、酸性ＨＭＯは、それらの構造内に少なくとも１つのシアリル残基を有する。非酸性（又は中性）ＨＭＯは、フコシル化されてもよいし、フコシル化されなくてもよい。そのような中性非フコシル化ＨＭＯの例としては、ラクト－Ｎ－トリオース２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ｐＬＮＨ）及びラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＬＮＨ）が挙げられる。中性フコシル化ＨＭＯの例としては、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ（ＬＮＤＦＨ－Ｉ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩＩ（ＦＬＮＨ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦｐＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（Ｆ－ｐＬＮｎＨ ＩＩ）及びフコシル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＦＬＮｎＨ）が挙げられる。
本発明に関連して、用語「ヒトミルクオリゴ糖」又は「ＨＭＯ」は、ヒト母乳中で見出される複合糖質を意味する（参考のために、Ｕｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．：Ｍｉｌｋ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ（２０１１）；又はＣｈｅｎ，Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，１１３（２０１５）を参照されたい）。ＨＭＯは、１つ以上のβ－Ｎ－アセチル－ラクトサミニル及び／又は１つ以上のβ－ラクト－Ｎ－ビオシル単位によって伸長され得る還元末端でラクトース単位を含むコア構造を有し、このコア構造は、α－Ｌ－フコピラノシル及び／又はα－Ｎ－アセチル－ノイラミニル（シアリル）部分によって置換され得る。この点に関して、非酸性（又は中性）ＨＭＯは、シアリル残基を欠き、酸性ＨＭＯは、それらの構造内に少なくとも１つのシアリル残基を有する。非酸性（又は中性）ＨＭＯは、フコシル化されてもよいし、フコシル化されなくてもよい。そのような中性非フコシル化ＨＭＯの例としては、ラクト－Ｎ－トリオース２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ｐＬＮＨ）及びラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＬＮＨ）が挙げられる。中性フコシル化ＨＭＯの例としては、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ（ＬＮＤＦＨ－Ｉ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩＩ（ＦＬＮＨ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦｐＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（Ｆ－ｐＬＮｎＨ ＩＩ）及びフコシル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＦＬＮｎＨ）が挙げられる。
【0055】
酸性及びシアル酸付加ＨＭＯの例としては、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、３－フコシル－３’－シアリルラクトース（ＦＳＬ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴ ａ）、フコシル－ＬＳＴ ａ（ＦＬＳＴ ａ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースｂ（ＬＳＴ ｂ）、フコシル－ＬＳＴ ｂ（ＦＬＳＴ ｂ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴ ｃ）、フコシル－ＬＳＴ ｃ（ＦＬＳＴ ｃ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴ ｄ）、フコシル－ＬＳＴ ｄ（ＦＬＳＴ ｄ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＳＬＮＨ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ（ＳＬＮＨ－Ｉ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（ＳＬＮＨ－ＩＩ）及びジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオース（ＤＳＬＮＴ）が挙げられる。本発明に関連して、ラクトースは、ＨＭＯ種であるとみなされない。
【0056】
本発明の１つの好ましい態様では、特に、３’－ＳＬ及び６’－ＳＬから選択される三糖、特に、３’－ＳＬなどの三糖ＨＭＯが好ましい。
【0057】
本発明の別の好ましい態様では、四糖ＨＭＯ、特に、ＦＳＬなどの四糖が好ましい。
【0058】
［２’－ＦＬ］
２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ又は２’Ｏ－フコシルラクトース）は、三糖、より正確には、Ｌ－フコース、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるフコシル化中性三糖である。それは、ヒト母乳中において天然に存在する最も支配的なヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）であり、全てのＨＭＯの約３０％を占める。遺伝子改変細胞又は酵素反応において、２’－ＦＬは、ラクトース及びフコシルドナーとのα１，２－フコシルトランスフェラーゼ酵素反応によって主に産生される。
２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ又は２’Ｏ－フコシルラクトース）は、三糖、より正確には、Ｌ－フコース、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるフコシル化中性三糖である。それは、ヒト母乳中において天然に存在する最も支配的なヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）であり、全てのＨＭＯの約３０％を占める。遺伝子改変細胞又は酵素反応において、２’－ＦＬは、ラクトース及びフコシルドナーとのα１，２－フコシルトランスフェラーゼ酵素反応によって主に産生される。
【0059】
［３－ＦＬ］
３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）は、三糖、より正確には、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－フコース、及びＤ－グルコース（Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）で構成されるフコシル化中性三糖である。それは、ヒト母乳中に天然に存在する。遺伝子改変細胞又は酵素反応において、３－ＦＬは、ラクトース及びフコシルドナーとのα１，３－フコシルトランスフェラーゼ又はα１，３／４－フコシルトランスフェラーゼ酵素反応によって主に産生される。
３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）は、三糖、より正確には、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－フコース、及びＤ－グルコース（Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）で構成されるフコシル化中性三糖である。それは、ヒト母乳中に天然に存在する。遺伝子改変細胞又は酵素反応において、３－ＦＬは、ラクトース及びフコシルドナーとのα１，３－フコシルトランスフェラーゼ又はα１，３／４－フコシルトランスフェラーゼ酵素反応によって主に産生される。
【0060】
［ＬＮＴ］
ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）は、四糖、より正確には、ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、ガラクトース、及びグルコース（ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成される中性四糖である。それは、ヒト母乳中に天然に存在する。
ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）は、四糖、より正確には、ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、ガラクトース、及びグルコース（ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成される中性四糖である。それは、ヒト母乳中に天然に存在する。
【0061】
［ＤＦＬ］
ジフコシルラクトース（ＤＦＬ又は２’，３－ジ－Ｏ－フコシルラクトース）は、オリゴ糖、より正確には、Ｌ－フコース、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－フコース、及びＤ－グルコース（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）で構成されるフコシル化中性四糖である。それは、ヒト母乳中に天然に存在する。遺伝子改変細胞又は酵素反応において、ＤＦＬは、ラクトース及び２個のフコシルドナーとのα１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ及び／又はα１，３／４－フコシルトランスフェラーゼ酵素反応によって主に産生される。
ジフコシルラクトース（ＤＦＬ又は２’，３－ジ－Ｏ－フコシルラクトース）は、オリゴ糖、より正確には、Ｌ－フコース、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－フコース、及びＤ－グルコース（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）で構成されるフコシル化中性四糖である。それは、ヒト母乳中に天然に存在する。遺伝子改変細胞又は酵素反応において、ＤＦＬは、ラクトース及び２個のフコシルドナーとのα１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ及び／又はα１，３／４－フコシルトランスフェラーゼ酵素反応によって主に産生される。
【0062】
［３’－ＳＬ及び６’－ＳＬ］
３’－シアリルラクトース及び６’－シアリルラクトースは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミニル、ガラクトース、及びグルコース（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－３Ｇａｌβ１－４－Ｇｌｃ又はＮｅｕ５Ａｃ－α２－６Ｇａｌβ１－４－Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加三糖である。それらは、ヒト母乳中に天然に存在する。３’－ＳＬの特定の機能的利点は、病原性細菌、例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）及びそれらの毒素又はウイルス、例えば、ロタウイルスの接着を阻害することによって感染のリスクを低減することを含む。３’－ＳＬ及び６’－ＳＬは、特に、ニューロンに必須の構成要素であるシアル酸を供給することによって乳児の脳の発達を促進する。
３’－シアリルラクトース及び６’－シアリルラクトースは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミニル、ガラクトース、及びグルコース（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－３Ｇａｌβ１－４－Ｇｌｃ又はＮｅｕ５Ａｃ－α２－６Ｇａｌβ１－４－Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加三糖である。それらは、ヒト母乳中に天然に存在する。３’－ＳＬの特定の機能的利点は、病原性細菌、例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）及びそれらの毒素又はウイルス、例えば、ロタウイルスの接着を阻害することによって感染のリスクを低減することを含む。３’－ＳＬ及び６’－ＳＬは、特に、ニューロンに必須の構成要素であるシアル酸を供給することによって乳児の脳の発達を促進する。
【0063】
［ＦＳＬ（３’－Ｓ，３－ＦＬ）］
３’－シアリル－３－フコシルラクトースは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－フコース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－３Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加及びフコシル化四糖である。それは、ヒト母乳中に天然に存在する。
３’－シアリル－３－フコシルラクトースは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－フコース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－３Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加及びフコシル化四糖である。それは、ヒト母乳中に天然に存在する。
【0064】
［ＬＳＴ－ａ］
シアリルラクト－Ｎ－テトラオースＡは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－３Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加五糖である。それは、ヒト母乳中に天然に存在する。
シアリルラクト－Ｎ－テトラオースＡは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－３Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加五糖である。それは、ヒト母乳中に天然に存在する。
【0065】
［ＬＳＴ－ｂ］
シアリルラクト－Ｎ－テトラオースＢは、オリゴ糖、より正確には、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｇａｌβ１－３（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６）ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加五糖である。それは、ヒト母乳中に天然に存在する。
シアリルラクト－Ｎ－テトラオースＢは、オリゴ糖、より正確には、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｇａｌβ１－３（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６）ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加五糖である。それは、ヒト母乳中に天然に存在する。
【0066】
［ＬＳＴ－ｃ］
シアリルラクト－Ｎ－テトラオースＣは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加五糖である。それは、ヒト母乳中に天然に存在する。
シアリルラクト－Ｎ－テトラオースＣは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加五糖である。それは、ヒト母乳中に天然に存在する。
【0067】
［ＤＳ－ＬＮＴ］
ジシアリルラクト－Ｎ－テトラオースは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－３Ｇａｌβ１－３（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６）ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加六糖である。それは、ヒト母乳中に天然に存在する。
ジシアリルラクト－Ｎ－テトラオースは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－３Ｇａｌβ１－３（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６）ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加六糖である。それは、ヒト母乳中に天然に存在する。
【0068】
［Ｓ－ｐＬＮｎＨ］
シアリル－パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加七糖である。
シアリル－パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加七糖である。
【0069】
［Ｓ－ＬＮｎＨ－Ｉ］
シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６（Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加七糖である。
シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６（Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加七糖である。
【0070】
［ＤＳ－Ｆ－ＬＮＨ ＩＩ］
ジシアリル－フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩＩは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｌ－フコース、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－３Ｇａｌβ１－３（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６）ＧｌｃＮＡｃβ１－３（Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－６）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加フコシル化九糖である。
ジシアリル－フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩＩは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｌ－フコース、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－３Ｇａｌβ１－３（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６）ＧｌｃＮＡｃβ１－３（Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－６）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加フコシル化九糖である。
【0071】
［ＦＳ－ＬＮｎＨ－Ｉ］
フコシル－シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－フコース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３（Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－６）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加フコシル化八糖である。
フコシル－シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－フコース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３（Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－６）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加フコシル化八糖である。
【0072】
［ＦＳ－ＬＮＨ］
フコシル－シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｌ－フコース、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加フコシル化八糖である。
フコシル－シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｌ－フコース、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加フコシル化八糖である。
【0073】
［フコシル－ＬＳＴ－ａ（ＦＬＳＴ－ａ）］
フコシル－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースＡは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－フコース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－３Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加フコシル化六糖である。
フコシル－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースＡは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－フコース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－３Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加フコシル化六糖である。
【0074】
［フコシル－ＬＳＴ－ｂ（ＦＬＳＴ－ｂ）］
フコシル－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースＢは、オリゴ糖、より正確には、Ｌ－フコース、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６）ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加フコシル化六糖である。
フコシル－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースＢは、オリゴ糖、より正確には、Ｌ－フコース、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６）ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加フコシル化六糖である。
【0075】
［フコシル－ＬＳＴ－ｃ（ＦＬＳＴ－ｃ）］
フコシル－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースＣは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－フコース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加フコシル化六糖である。
フコシル－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースＣは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－フコース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加フコシル化六糖である。
【0076】
［ＳＬＮＨ］
シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６（Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加七糖である。
シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６（Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加七糖である。
【0077】
［ＳＬＮｎＨ－ＩＩ］
シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３（Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加七糖である。
シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩは、オリゴ糖、より正確には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位（Ｎｅｕ５Ａｃ－α２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３（Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成されるシアル酸付加七糖である。
【0078】
［ＨＭＯ合成のための機能的酵素］
１種以上のＨＭＯを合成することができるように、本発明の組み換え細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を備える機能的酵素をコードする少なくとも１つの組み換え核酸を含む。ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、遺伝子改変細胞のゲノム内に（染色体への統合によって）統合され得るか、或いはプラスミドＤＮＡ内に含まれてプラスミド性として発現され得る。ＨＭＯの産生のために２種以上のグリコシルトランスフェラーゼ、例えばＬＮＴ又はＬＮｎＴが必要とされる場合、グリコシルトランスフェラーゼ活性を備える異なる酵素をコードする２つ以上の組み換え核酸、例えばＬＮＴを産生するためにβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（第２のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第２の組み換え核酸）と組み合わせたβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（第１のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第１の組み換え核酸）がゲノム内に組み込まれてもよく、且つ／又はプラスミドから発現されてもよく、ここで、第１及び第２の組み換え核酸は、相互に独立して、染色体内又はプラスミド上に統合され得る。
１種以上のＨＭＯを合成することができるように、本発明の組み換え細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を備える機能的酵素をコードする少なくとも１つの組み換え核酸を含む。ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、遺伝子改変細胞のゲノム内に（染色体への統合によって）統合され得るか、或いはプラスミドＤＮＡ内に含まれてプラスミド性として発現され得る。ＨＭＯの産生のために２種以上のグリコシルトランスフェラーゼ、例えばＬＮＴ又はＬＮｎＴが必要とされる場合、グリコシルトランスフェラーゼ活性を備える異なる酵素をコードする２つ以上の組み換え核酸、例えばＬＮＴを産生するためにβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（第２のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第２の組み換え核酸）と組み合わせたβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（第１のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第１の組み換え核酸）がゲノム内に組み込まれてもよく、且つ／又はプラスミドから発現されてもよく、ここで、第１及び第２の組み換え核酸は、相互に独立して、染色体内又はプラスミド上に統合され得る。
【0079】
好ましい一実施形態では、第１及び第２の組み換え核酸は、産生細胞の染色体内に安定に統合され；別の実施形態では、第１及び第２のグリコシルトランスフェラーゼの少なくとも一方は、プラスミド性である。グリコシルトランスフェラーゼ活性を備えるタンパク質／酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）は、様々な実施形態では、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３／４－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，４－フコシルトランスフェラーゼ、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ、α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ及びβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼの活性を有する酵素から選択され得る。例えば、２’－ＦＬの産生は、改変細胞が活性型α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ酵素を発現することを必要とする。３－ＦＬの産生のために、改変細胞は、活性型α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素の発現を必要とする。ＬＮＴの産生のために、改変細胞は、少なくとも２つのグリコシルトランスフェラーゼ、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼを発現する必要がある。６’－ＳＬの産生のために、改変細胞は、活性型α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ酵素及びＣＭＰ－シアル酸合成、特に、ＣＭＰ－ｎｅｕ５Ａの合成のための経路などのシアル酸糖ヌクレオチドを生成するための経路を発現しなければならない。３’－ＳＬの産生のために、改変細胞は、活性型α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ酵素及びＣＭＰ－シアル酸合成、特に、ＣＭＰ－ｎｅｕ５Ａの合成のための経路などのシアル酸糖ヌクレオチドを生成するための経路を発現しなければならない。産生細胞に含まれる組み換え遺伝子によってコードされ得るグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質のいくつかの非限定的実施形態は、表１の非限定的例から選択され得る。
【0080】
【表1】
【0081】
【表2】
【0082】
【表3】
【0083】
【表4】
【0084】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞は、配列番号３に示されるとおりのα－２，３－シアリル－トランスフェラーゼ及び／又は配列番号３と少なくとも７０％同一、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９９％若しくは例えば、１００％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを異種性に発現するように改変される。加えて、遺伝子改変細胞は、シアル酸糖ヌクレオチドを作製するための生合成経路を含有する。
【0085】
別の実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞は、配列番号４に示されるとおりのα－２，６－シアリル－トランスフェラーゼ及び／又は配列番号４と少なくとも７０％同一、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９９％若しくは例えば、１００％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを異種性に発現するように改変される。加えて、遺伝子改変細胞は、シアル酸糖ヌクレオチドを作製するための生合成経路を含有する。
【0086】
シアル酸糖ヌクレオチドを作製するための生合成経路は、細胞において固有のものであってもよいし、配列番号１７のｎｅｕＢＣＡ遺伝子クラスターなどの１種以上の異種遺伝子によって提供されてもよく、異種ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼは、配列番号１６のｎｅｕＡによってコードされ、異種シアル酸シンターゼは、配列番号１２のｎｅｕＢによってコードされ、異種ＧｌｃＮＡｃ－６－ホスファート２エピメラーゼは、配列番号１４のｎｅｕＣによってコードされる。
【0087】
一実施形態では、Ｆｒｅｄ発現遺伝子改変細胞はさらに、配列番号４に示されるとおりのα－２，６－シアリル－トランスフェラーゼ及び／又は配列番号４と少なくとも７０％同一、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９９％若しくは例えば、１００％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを異種性に発現するように改変され得る。加えて、遺伝子改変細胞は、シアル酸糖ヌクレオチドを作製するための生合成経路を含有する。これは、細胞において固有のものであってもよいし、配列番号１７のｎｅｕＢＣＡ遺伝子クラスターなどの１種以上の異種遺伝子によって提供されてもよく、異種ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼは、配列番号１６のｎｅｕＡによってコードされ、異種シアル酸シンターゼは、配列番号１２のｎｅｕＢによってコードされ、異種ＧｌｃＮＡｃ－６－ホスファート２エピメラーゼは、配列番号１４のｎｅｕＣによってコードされる。
【0088】
［ＭＦＳトランスポーターをコードする異種核酸配列］
本発明のある態様は、配列番号１に示されるとおりの主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）ポリペプチド、又は配列番号１と９５．４％を超えて又は９９．７％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログである糖輸送が可能なポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む核酸構築物を提供し、糖輸送ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％の配列同一性を有する。
本発明のある態様は、配列番号１に示されるとおりの主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）ポリペプチド、又は配列番号１と９５．４％を超えて又は９９．７％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログである糖輸送が可能なポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む核酸構築物を提供し、糖輸送ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【0089】
好ましくは、配列番号２、又はそのホモログの核酸配列は、調節エレメント、特に、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４及びＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７からなる群から選択されるエレメントによって調節される。さらなる実施形態では、核酸構築物はさらに、シアリル－トランスフェラーゼ、特に、本明細書の表２から選択されるシアリル－トランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む。
【0090】
用語「異種核酸配列」、「組み換え遺伝子／核酸／ＤＮＡコーディング」又は「コーディング核酸配列」は、適切な制御配列、すなわち、プロモーターの制御下にある場合、ｍＲＮＡ内に転写されてポリペプチドに翻訳される一連の連続的非重複トリプレット（コドン）を含む、人工的（すなわち、核酸配列を作製するために標準的な実験室方法を使用してインビトロで生成される）核酸配列を意味する。コーディング配列の境界は、一般に、ｍＲＮＡの５’末端、翻訳開始コドン（ＡＵＧ、ＧＵＧ又はＵＵＧ）及び翻訳終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）でのオープンリーディングフレームのすぐ上流に配置されるリボソーム結合部位によって決定される。コーディング配列として、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成及び組み換え核酸配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【0091】
用語「核酸」には、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びｃＤＮＡ分子が含まれる。遺伝コードの縮重の結果として、所与のタンパク質をコードする複数のヌクレオチド配列が産生され得ると理解されている。核酸という用語は、用語「ポリヌクレオチド」と互換的に使用される。
【0092】
「オリゴヌクレオチド」は、短鎖核酸分子である。
【0093】
「プライマー」は、精製された制限消化物中のように天然に存在するか、又は合成的に生成されるかを問わず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下において且つ好適な温度及びｐＨ）に置かれたときに、合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドである。プライマーは、好ましくは、増幅における最大効率のための一本鎖であるが、代わりに二本鎖であり得る。二本鎖である場合、プライマーは、伸長生成物を調製するために使用される前に、最初にその鎖を分離するために処理される。好ましくは、プライマーは、デオキシリボヌクレオチド配列である。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長生成物の合成を開始させるために十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源及び本方法の使用を含む多数の因子に依存するであろう。
【0094】
本発明の組み換え核酸配列は、コーディングＤＮＡ配列、例えば、遺伝子、又は非コーディングＤＮＡ配列、例えば、プロモーター配列などの調節ＤＮＡであり得る。本発明の一態様は、組み換え細胞であって、１種以上のＨＭＯの産生のために必要な酵素をコードする組み換えＤＮＡ配列及びＦｒｅｄトランスポーターをコードするＤＮＡ配列を含む組み換え細胞を提供することに関する。したがって、一実施形態では、本発明は、核酸構築物であって、コーディング核酸配列、すなわち、目的の遺伝子の組み換えＤＮＡ配列、例えばグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子若しくはｆｒｅｄ遺伝子、及び非コーディングＤＮＡ配列、例えばプロモーターＤＮＡ配列、例えばｌａｃオペロン若しくはｇｌｐオペロンのプロモーターに由来する組み換えプロモーター配列、又は別のゲノムプロモーターＤＮＡ配列に由来するプロモーター配列、或いは合成プロモーター配列を含む核酸構築物に関し、ここで、コーディング配列及びプロモーター配列は、作動可能に連結している。
【0095】
用語「作動可能に連結した」は、２つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）断片間の機能的関係を指す。典型的には、それは、転写調節配列の転写配列との機能的関係を指す。例えば、プロモーター配列は、それが適切な宿主細胞又は他の発現系におけるコーディング配列の転写を刺激又は調節する場合、コーディング配列と作動可能に連結している。一般に、転写配列に作動可能に連結しているプロモーター転写調節配列は、転写配列に物理的に隣接しており、すなわち、それらは、シス作用性である。
【0096】
一実施形態では、本発明の核酸構築物は、ベクターＤＮＡの一部であってもよく、別の実施形態では、構築物は、宿主細胞のゲノム内に統合されている発現カセット／カートリッジである。したがって、用語「核酸構築物」は、ゲノムの遺伝子の発現を修飾するか、又は構築物中に含まれ得る遺伝子／コーディングＤＮＡ配列を発現させるために標的細胞、例えば細菌細胞中に移植されることが意図される、核酸の人工的に構築された断片、特にＤＮＡ断片を意味する。本発明に関連して、核酸構築物は、２つ以上の組み換えＤＮＡ配列：本質的に、プロモーターＤＮＡ配列を含む非コーディングＤＮＡ配列及び目的の遺伝子、例えばＦｒｅｄタンパク質をコードするコーディングＤＮＡ配列、宿主細胞内のＨＭＯの産生に有用な別の遺伝子のグリコシルトランスフェラーゼを含む組み換えＤＮＡ配列を含有する。好ましくは、構築物はさらに、構築物のコーディングＤＮＡの転写又は翻訳のいずれかを調節する非コーディングＤＮＡ配列、例えば、転写物へのリボソーム結合を促進するＤＮＡ配列、転写物を安定化するリーディングＤＮＡ配列を含む。
【0097】
構築物（発現カセット）内に含まれる目的の組み換え核酸の細菌ゲノム内への統合は、従来法により、例えばａｔｔＴｎ７部位について記載されているとおり、染色体上の特異的部位に相同であるフランキング配列を含有する線状カートリッジを用いることにより（Ｗａｄｄｅｌｌ Ｃ．Ｓ．ａｎｄ Ｃｒａｉｇ Ｎ．Ｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（１９８８）Ｆｅｂ；）；組み換えがファージλのＲｅｄリコンビナーゼ機能又はＲａｃプロファージのＲｅｃＥ／ＲｅｃＴリコンビナーゼ機能によって媒介される核酸配列のゲノム統合のための方法により（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８）；１８０（８）：２０６３－７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８）２０：１２３－１２８ Ｍｕｙｒｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．（２０００）１（３）：２３９－２４３）；Ｒｅｄ／ＥＴ組み換えに基づく方法により（Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．（２００５），１２（３）：３４９－５６．；Ｖｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００５）；７１（４）：１８２９－３５）；又は陽性クローン、すなわち、例えばマーカー遺伝子若しくは遺伝子機能の損失若しくは獲得によって選択され得る発現カセットを有するクローンにより達成され得る。
【0098】
目的の遺伝子を含む発現カセットの単一コピーは、本発明による所望のＨＭＯの産生を確実にし、所望の効果を達成するために十分であり得る。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、細胞のゲノムＤＮＡ内に統合された目的の遺伝子の１つ、２つ又は３つのコピーを含む組み換えＨＭＯ産生細胞に関する。いくつかの実施形態では、遺伝子の単一コピーが好ましい。
【0099】
好ましい一実施形態では、本発明の核酸構築物の組み換えコーディング核酸配列は、プロモーターに関して異種であり、これは、起源の種のゲノム内の同等の天然コーディング配列が別のプロモーター配列の制御下で転写されている（すなわち、構築物のプロモーター配列ではない）ことを意味する。さらに、宿主細胞に関して、コーディングＤＮＡは、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）宿主細胞内で発現したＦｒｅｄタンパク質をコードするＤＮＡ配列などの異種（すなわち、別の生物学的種若しくは属に由来する）又は例えばコラン酸オペロンの遺伝子、ｗｃａ遺伝子などの相同なもの（すなわち、宿主細胞に由来する）であり得る。
【0100】
好ましくは、遺伝子改変細胞中で発現されるＨＭＯ、プロモーターＤＮＡ配列、及びリボソーム結合部位配列（例えば、シャイン・ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列などの他の調節配列の生合成産生に関連する遺伝子を含む本発明の構築物は、遺伝子改変細胞の懸濁液を含む１リットルの発酵培地の少なくとも０．０３ｇ／ＯＤ（光学密度）のレベル、例えば、およそ０．０５ｇ／ｌ／ＯＤ～およそ０．５ｇ／ｌ／ＯＤのレベルでのＨＭＯの産生を可能にする。本発明のために、ＨＭＯ産生の後者のレベルは、「十分であり」、このレベルの所望のＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞は、「好適な遺伝子改変細胞」であるとみなされ、すなわち、細胞はさらに、ＨＭＯ産生のために有利である本明細書に記載される少なくとも１つの効果を達成するために、ＨＭＯトランスポータータンパク質、例えば、Ｆｒｅｄを発現するように改変され得る。
【0101】
本発明の遺伝子改変細胞又は核酸構築物は、推定上のＦｒｅｄ ＭＦＳ（主要ファシリテータースーパーファミリー）トランスポータータンパク質をコードする異種遺伝子などの核酸配列を含む。
【0102】
したがって、本発明の核酸構築物は、機能的ＭＦＳトランスポーターをコードすることができる遺伝子、ｆｒｅｄ、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含有する。好ましくは、配列番号２、又はそのホモログの核酸配列は、調節エレメント、特に、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４及びＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７からなる群から選択されるエレメントによって調節される。さらなる実施形態では、核酸構築物はさらに、シアリル－トランスフェラーゼ、特に、本明細書の表２から選択されるシアリル－トランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む。
【0103】
遺伝子改変細胞又は核酸構築物中に含有される核酸配列は、配列番号１のタンパク質、又は配列番号１と７０％を超えて同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログをコードする。
【0104】
遺伝子改変細胞又は核酸構築物中に含有される核酸配列は、配列番号１のタンパク質、又は配列番号１と９５．４％を超えて同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログをコードする。
【0105】
配列番号１のタンパク質の機能的ホモログは、変異誘発によって得られてもよい。機能的ホモログは、配列番号１のアミノ酸配列の機能性と比較して少なくとも５０％、例えば、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の残存した機能性を有するべきである。機能的ホモログは、配列番号１のアミノ酸配列の機能性と比較してより高い機能性を有し得る。配列番号１の機能的ホモログは、本発明による遺伝子改変細胞のＨＭＯ産生を増強することができなければならない。
【0106】
［遺伝子改変細胞］
本明細書で使用する場合、「遺伝子改変細胞」は、遺伝子材料が遺伝子工学技術を使用して人間の介入によって改変されている細胞として理解され、そのような技術は、例えば、以下に限定されないが、例えば、異種ポリヌクレオチド配列、Ｃｒｉｓｐｅｒ／Ｃａｓ編集及び／又はランダム変異誘発による形質転換又は形質移入である。本発明の文脈において、用語「遺伝子改変細胞」及び「宿主細胞」は、互換的に使用される。
本明細書で使用する場合、「遺伝子改変細胞」は、遺伝子材料が遺伝子工学技術を使用して人間の介入によって改変されている細胞として理解され、そのような技術は、例えば、以下に限定されないが、例えば、異種ポリヌクレオチド配列、Ｃｒｉｓｐｅｒ／Ｃａｓ編集及び／又はランダム変異誘発による形質転換又は形質移入である。本発明の文脈において、用語「遺伝子改変細胞」及び「宿主細胞」は、互換的に使用される。
【0107】
本発明において、「遺伝子改変細胞」は、好ましくは、外来ポリヌクレオチド配列によって形質転換又は形質移入されている宿主細胞である。
【0108】
遺伝子改変細胞は、好ましくは、原核細胞である。宿主細胞として機能し得る適切な微生物細胞としては、酵母細胞、細菌細胞、古細菌細胞、藻類細胞、及び真菌細胞が挙げられる。
【0109】
遺伝的に操作された細胞は、例えば、細菌又は真菌であり得る。好ましい一実施形態では、遺伝的に操作された細胞は、細菌細胞である。
【0110】
［宿主細胞］
遺伝子改変細胞（宿主細胞又は組み換え細胞）は、例えば、細菌細胞又は酵母細胞であり得る。好ましい一実施形態では、遺伝子改変細胞は、細菌細胞である。
遺伝子改変細胞（宿主細胞又は組み換え細胞）は、例えば、細菌細胞又は酵母細胞であり得る。好ましい一実施形態では、遺伝子改変細胞は、細菌細胞である。
【0111】
細菌宿主細胞に関して、原則として、限定されないが、それらは、目的の遺伝子を挿入するための遺伝的操作を可能にする限り、真正細菌（グラム陽性又はグラム陰性）又は古細菌であってもよく、製造規模で培養することができる。好ましくは、宿主細胞は、高細胞密度への培養を可能にする特性を有する。本発明に従うＨＭＯの産業的組み換え生産に好適な細菌宿主細胞の非限定的な例として、エルウィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）（パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ））、シトロバクター・フロインジイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）、ペクトバクテリウム・カロトボルム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、又はキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）があり得る。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ラテロスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、及びバチルス・サーキュサンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）を含むバチルス属（ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の細菌も使用され得る。同様に、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ヘルベチクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）及びラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）含むが、これらに限定されないラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌は、本発明の方法を使用して改変され得る。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）及びプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）も、本明細書に記載した本発明のための好適な細菌種である。本発明の一部としてさらに含まれるのは、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）及びエンテロコッカス・サーモフィルス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ））、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）及びビフィドバクテリウム・ビフィズム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ））、スポロラクトバチルス属の種（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ミクロモモスポラ種（Ｍｉｃｒｏｍｏｍｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）、ミクロコッカス属の種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ロドコッカス属の種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、及びシュードモナス属の種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）及び緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））に由来する本明細書に記載されるとおりに改変された株である。
【0112】
本明細書に記載される特徴を含む細菌は、ラクトース及び細胞によって産生されたＨＭＯなどのオリゴ糖の存在下で培養され、細菌自体又は細菌の培養上清のいずれかから回収される。好ましい一実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である。
【0113】
別の好ましい実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）などである。
【0114】
別の実施形態では、宿主細胞は、アスパルギルス属種（Ａｓｐａｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ）又はトリコデルマ属種（Ｔｈｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｓｐ）などの糸状菌であり、例示的な種は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ｆ．ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）、Ｆ．グラミネアラム（ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）及びＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）である。
【0115】
本発明の遺伝子改変細胞は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｓｏｎ＆Ｗａｌｋｅｒ，“Ｍａｎｉａｔｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．による要覧に記載されたものなど、当技術分野の標準的な方法を使用して提供され得る。
【0116】
ＨＭＯ産生に好適な宿主、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、内因性β－ガラクトシダーゼ遺伝子又は外因性β－ガラクトシダーゼ遺伝子を含んでもよく、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、内因性ｌａｃＺ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｖ００２９６（ＧＩ：４１９０１））を含む。本発明のために、ＨＭＯ産生宿主細胞は、任意のβ－ガラクトシダーゼ遺伝子を含むか、又は不活性化されている当該遺伝子を含むように遺伝的に操作される。遺伝子は、細菌ゲノム由来の対応する核酸配列の完全若しくは部分欠失によって不活性化され得るか、又は遺伝子配列は、それが転写される方法で変異されるか、又は転写される場合、転写物は、翻訳されないか、又はタンパク質（すなわち、β－ガラクトシダーゼ）に翻訳される場合、そのタンパク質は、対応する酵素活性を有していない。このように、ＨＭＯ産生細菌は、ＨＭＯの産生のために有益である増加した細胞内ラクトースプールを蓄積する。
【0117】
いくつかの実施形態では、操作された細胞、例えば、細菌は、欠損性シアル酸異化経路を含有する。「シアル酸異化経路」は、シアル酸の分解を生じさせる、通常、酵素によって制御され、触媒される一連の反応を意味する。本明細書に記載される例示的なシアル酸異化経路は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）経路である。この経路において、シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ；Ｎ－アセチルノイラミン酸）は、全てｎａｎＡＴＥＫ－ｙｈｃＨオペロンによってコードされ、且つＮａｎＲによって抑制される酵素ＮａｎＡ（Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ）及びＮａｎＫ（Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ）及びＮａｎＥ（Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸エピメラーゼ）によって分解される（ｈｔｔｐ：／／ｅｃｏｃｙｃ．ｏｒｇ／ＥＣＯＬＩ）。欠損性シアル酸異化経路は、内因性ｎａｎＡ（Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｄ０００６７．１（ＧＬ２１６５８８））及び／又はｎａｎＫ（Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ）遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号（アミノ酸）ＢＡＥ７７２６５．１（ＧＬ８５６７６０１５））及び／又はｎａｎＥ（Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸エピメラーゼ、ＧＩ：９４７７４５）内に変異を導入することにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主内に与えられる。任意選択により、ｎａｎＴ（Ｎ－アセチルノイラミン酸トランスポーター）遺伝子も不活化されるか又は変異している。シアル酸代謝の他の中間体として、（ＭａｎＮＡｃ－６－Ｐ）Ｎ－アセチルマンノサミン－６－ホスファート；（ＧｌｃＮＡｃ－６－Ｐ）Ｎ－アセチルグルコサミン－６－ホスファート；（ＧｌｃＮ－６－Ｐ）グルコサミン－６－ホスファート及び（Ｆｒｕｃ－６－Ｐ）フルクトース－６－ホスファートが挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、ｎａｎＡは、変異している。他の好ましい実施形態では、ｎａｎＡ及びｎａｎＫは、変異している一方、ｎａｎＥは、機能的なままである。別の好ましい実施形態では、ｎａｎＡ及びｎａｎＥは、変異している一方、ｎａｎＫは、変異、不活化又は欠失されていない。変異は、ｎａｎＡ、ｎａｎＫ、ｎａｎＥ及び／又はｎａｎＴの遺伝子産物をコードする核酸配列内の１つ以上の変化である。例えば、変異は、核酸配列内の１個、２個、最大５個、最大１０個、最大２５個、最大５０個又は最大１００個の変化であり得る。例えば、ｎａｎＡ、ｎａｎＫ、ｎａｎＥ及び／又はｎａｎＴ遺伝子は、ヌル変異によって変異している。本明細書に記載されるヌル変異は、酵素の機能の消失（すなわち活性の低下又は活性なし）又は酵素の消失（すなわち遺伝子産物なし）のいずれかを引き起こすアミノ酸の置換、付加、欠失又は挿入を包含する。「欠失した」は、（機能的）遺伝子産物が産生されないように、コーディング領域が完全に又は部分的に除去されていることを意味する。「不活化された」は、結果として生じる遺伝子産物が機能的に不活性であるか、又は固有の天然に存在する内因性遺伝子産物の活性の１００％未満、例えば９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％若しくは２０％の遺伝子産物をコードするようにコーディング配列が変更されていることを意味する。「非変異」遺伝子又はタンパク質は、天然の、天然に存在する、若しくは内因性のコーディング配列から１個、２個、最大５個、最大１０個、最大２０個、最大５０個、最大１００個、最大２００個若しくは最大５００個以上のコドンが異ならないか、又は対応するコードされたアミノ酸配列と異ならないことを意味する。
【0118】
好ましい実施形態では、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））は、シアル酸合成能を含み、すなわち、遺伝子改変細胞は、シアル酸糖ヌクレオチドを作製するための生合成経路を含む。例えば、遺伝子改変細菌は、外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ ２－エピメラーゼ（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）のｎｅｕＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２７．１）若しくは均等物（例えば、（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＲ０４５６１．１）、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ（例えば、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のｎｅｕＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２６．１）若しくは均等物、（例えば、フラボバクテリウム・リムノセディミニス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｎｏｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）シアル酸シンターゼ、ＧｅｎＢａｎｋ ＷＰ＿０２３５８０５１０．１）、及び／又はＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼ（例えば、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のｎｅｕＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２８．１）若しくは均等物（例えば、ビブリオ・ブラジリエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）ＣＭＰ－シアル酸シンターゼ、ＧｅｎＢａｎｋ ＷＰ＿００６８８１４５２．１）の提供を介してシアル酸合成能を含む。
【0119】
一実施形態では、遺伝子改変細胞は、配列番号１３（ＮｅｕＣ）のＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ ２－エピメラーゼ及び／若しくは配列番号１１（ＮｅｕＢ）のＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼ及び／若しくは配列番号１５（ＮｅｕＡ）のＮｅｕ５Ａｃシンターゼ、又はそれぞれ配列番号１１若しくは１３若しくは１５と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％若しくは例えば少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有するその機能的バリアントを含む。
【0120】
改変細菌中での天然Ｎ－アセチルグルコサミン含有ＨＭＯの産生もまた、当技術分野において知られている（例えば、Ｇｅｂｕｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６３ ８３－９０を参照されたい）。
【0121】
３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、３－フコシル－３’－シアリルラクトース（ＦＳＬ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴ ａ）、フコシル－ＬＳＴ ａ（ＦＬＳＴ ａ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースｂ（ＬＳＴ ｂ）、フコシル－ＬＳＴ ｂ（ＦＬＳＴ ｂ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴ ｃ）、フコシル－ＬＳＴ ｃ（ＦＬＳＴ ｃ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＳＬＮＨ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ（ＳＬＮＨ－Ｉ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（ＳＬＮＨ－ＩＩ）及びジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオース（ＤＳＬＮＴ）、シアリル－パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（Ｓ－ｐＬＮｎＨ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ（Ｓ－ＬＮｎＨ－Ｉ）、ジシアリル－フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩＩ（ＤＳ－Ｆ－ＬＮＨ ＩＩ）、フコシル－シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ（ＦＳ－ＬＮｎＨ－Ｉ）及び／又はフコシル－シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＦＳ－ＬＮＨ）などのＮ－アセチルノイラミン酸（シアリル）含有ＨＭＯの産生のために、前記遺伝子改変細胞は、外因性Ｎ－アセチルノイラミン酸トランスフェラーゼ（すなわち、シアリルトランスフェラーゼ）、又はその機能的バリアント若しくは断片を含むように改変される。外因性シアリルトランスフェラーゼ遺伝子は、表２に列挙されるシアリルトランスフェラーゼなどであるがこれらに限定されない、いくつかの供給源のいずれか１つから得られてもよい。
【0122】
上記のとおりのラクト－Ｎ－トリオース２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ（ＬＤＦＨ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＤＦＨ－ＩＩ）及びラクト－Ｎ－ネオジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ）などのＮ－アセチルグルコサミン含有ＨＭＯの産生のために、前記遺伝子改変細胞は、外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒ β－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子又はその機能的バリアント若しくは断片を含むように改変される。この外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒ β－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子は、いくつかの供給源のいずれか１つ、例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質目録 ＡＡＦ４２２５８．１）又は淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質目録 ＡＣＦ３１２２９．１）から記載されるｌｇｔＡ遺伝子から得られてもよい。任意選択により、追加の外因性グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒ β－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを含む細菌内で共発現されてもよい。例えば、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒ β－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子と共発現される。この外因性β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、いくつかの供給源のいずれかの１つ、例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）から記載される１つであるｌｇｔＢ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質目録 ＡＡＦ４２２５７．１）、又はＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）から記載される１つであるＨＰ０８２６／ｇａｌＴ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質目録 ＮＰ＿２０７６１９．１）から得ることができる。任意選択により、外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒ β－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子を含む細菌内で共発現される追加の外因性グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）０５５：Ｈ７から記載されるＰ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、ｗｂｇＯ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質目録 ＷＰ＿０００５８２５６３．１）、又はＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）からのｊｈｐ０５６３遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質目録 ＡＥＺ５５６９６．１）、又はストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）からのＩｂ型ＯＩ２のｃｐｓｌＢＪ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質目録 ＡＢ０５０７２３）である。上記の酵素のいずれかの機能的バリアント及び断片もまた、開示される本発明によって包含される。
【0123】
シアリルトランスフェラーゼ遺伝子、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子及び／又はガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子もまた、Ｐｇｌｐプロモーターに作動可能に連結することができ、対応するゲノム統合カセットから発現され得る。一実施形態では、ゲノムに統合されている遺伝子は、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、例えば、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）由来のＧａｌＴ酵素をコードするＨＰ０８２６遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質目録 ＮＰ＿２０７６１９．１）であり；別の実施形態では、ゲノムに統合されている遺伝子は、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のｌｇｔＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質目録 ＡＡＦ４２２５８．１）であり；本発明で好ましい実施形態では、ゲノムに統合されている遺伝子は、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、例えば、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＮＳＴ（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質目録 ＡＡＣ４４５４１．１又は配列番号３）である。これらの実施形態では、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ又はガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、同様に、ゲノムに統合された又はプラスミド性のカセットから発現され得る。第２の遺伝子は、任意選択により、ｇｌｐプロモーター（配列番号５）の制御下又は発現系にとって好適である任意の他のプロモーター、例えばＰｌａｃ（配列番号８）の制御下のいずれかで発現され得る。
【0124】
ＨＭＯ産生宿主細胞は通常、機能性ｌａｃＹ及び機能障害性ｌａｃＺ遺伝子を含む。
【0125】
本発明の組み換え細胞によって産生されるＨＭＯは、当技術分野において利用できる好適な手法を使用して精製され得る（例えば、国際公開第２０１５／１８８８３４号パンフレット、国際公開第２０１７／１８２９６５号パンフレット又は国際公開第２０１７／１５２９１８号パンフレットに記載されるものなど）。
【0126】
［糖輸送が可能なコードされたポリペプチド］
糖輸送は、オリゴ糖などであるがこれに限定されない糖の輸送、並びに本発明に関連して、遺伝子改変細胞の細胞質若しくは周辺質から産生培地及び／又は産生培地から遺伝子改変細胞の細胞質若しくは周辺質への１種／又は１種以上のＨＭＯの流入及び／又は流出輸送に関する。したがって、遺伝子改変細胞の細胞質若しくは周辺質から産生培地及び／又は産生培地から遺伝子改変細胞の細胞質若しくは周辺質にＨＭＯを輸送できる遺伝子改変細胞において発現されるポリペプチドは、糖輸送が可能なポリペプチドである。したがって、本発明において、糖輸送は、オリゴ糖などであるがこれに限定されない糖の流出及び／又は流入輸送を意味し得る。
糖輸送は、オリゴ糖などであるがこれに限定されない糖の輸送、並びに本発明に関連して、遺伝子改変細胞の細胞質若しくは周辺質から産生培地及び／又は産生培地から遺伝子改変細胞の細胞質若しくは周辺質への１種／又は１種以上のＨＭＯの流入及び／又は流出輸送に関する。したがって、遺伝子改変細胞の細胞質若しくは周辺質から産生培地及び／又は産生培地から遺伝子改変細胞の細胞質若しくは周辺質にＨＭＯを輸送できる遺伝子改変細胞において発現されるポリペプチドは、糖輸送が可能なポリペプチドである。したがって、本発明において、糖輸送は、オリゴ糖などであるがこれに限定されない糖の流出及び／又は流入輸送を意味し得る。
【0127】
その点において、糖輸送が可能なポリペプチドは、主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）に属するポリペプチドである。基本的には、ポリペプチドは、配列番号１と７０％を超える、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、９５％、９９％又は９９．９％の配列同一性を有するか又はそれは、本明細書に記載されるとおりのその機能的バリアントである。特に、ポリペプチドは、配列番号１と９５．４％を超える、例えば、少なくとも９５．５％、例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するか又はそれは、本明細書に記載されるとおりのその機能的バリアントである。配列番号１は、Ｆｒｅｄタンパク質のアミノ酸配列である。
【0128】
本発明の遺伝子改変細胞又は核酸構築物は、Ｆｒｅｄタンパク質をコードする異種遺伝子などの核酸配列を含む。前記核酸配列は、配列番号２に示されるとおりのｆｒｅｄ遺伝子と少なくとも７０％の配列同一性、例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％などの配列同一性を有する。
【0129】
一実施形態では、核酸配列構築物は、配列番号１のタンパク質、又は配列番号１と７０％を超えて、例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、若しくは９９．９％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログをコードする。
【0130】
別の実施形態では、核酸配列構築物は、配列番号１のタンパク質、又は配列番号１と９５．４％を超えて、例えば、少なくとも９５．５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログをコードする。
【0131】
配列番号１のタンパク質の機能的ホモログは、変異誘発によって得られてもよい。機能的ホモログは、配列番号１のアミノ酸配列の機能性と比較して少なくとも５０％、例えば、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の残存した機能性を有するべきである。機能的ホモログは、配列番号１のアミノ酸配列の機能性と比較してより高い機能性を有し得る。配列番号１の機能的ホモログは、本発明による遺伝子改変細胞のＨＭＯ産生を増強することができなければならない。特に、配列番号１の機能的ホモログは、本発明による遺伝子改変細胞の細胞外でのシアル酸付加ＨＭＯの比率を高めることができなければならない。
【0132】
遺伝子改変細胞又は核酸構築物は、糖輸送が可能なポリペプチドをコードする１種以上の核酸配列を含有し得る。より多くの場合、本発明の遺伝子改変細胞又は核酸構築物は、単一コピーの糖輸送が可能なポリペプチドをコードする。
【0133】
目的の遺伝子を含む発現カセットの単一コピーは、本発明による所望のＨＭＯの産生を確実にし、所望の効果を達成するために十分であり得る。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、細胞のゲノムＤＮＡ内に統合された目的の遺伝子の１つ、２つ又は３つのコピーを含む組み換えＨＭＯ産生細胞に関する。いくつかの実施形態では、単一コピーの遺伝子が好ましい。
【0134】
遺伝子改変細胞又は核酸構築物はまた、糖輸送ポリペプチドをコードする核酸配列の発現の調節のための１種以上の調節エレメントを含有してもよく、前記核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する。
【0135】
［核酸構築物］
宿主細胞の形質移入又は形質転換のために、核酸構築物が必要となる。これらは、細胞内にプラスミド構築物として存在してもよいし、ゲノム統合のために適合させられてもよい。
宿主細胞の形質移入又は形質転換のために、核酸構築物が必要となる。これらは、細胞内にプラスミド構築物として存在してもよいし、ゲノム統合のために適合させられてもよい。
【0136】
本発明の一態様は、ｉ）配列番号１によるＭＦＳポリペプチド、又は配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性、例えば、配列番号１と８０％、例えば、９０％、例えば、９５％、例えば、９９．７％、例えば、１００％の配列同一性を有するその機能的ホモログをコードする核酸配列（ＭＦＳポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性、例えば、配列番号２と８０％、例えば、９０％、例えば、９５％、例えば、１００％の配列同一性を有する）、及び／又はｉｉ）配列番号３若しくは配列番号４のポリペプチド又は配列番号３若しくは配列番号４と少なくとも７０％、例えば、８０％、例えば、９０％、例えば、９５％を有するその機能的バリアントなどのシアリル－トランスフェラーゼ能を有する１種以上のポリペプチドをコードする核酸配列、並びにｉｉｉ）事項ｉ）及び／又はｉｉ）の核酸配列の発現を調節する調節エレメントを含む核酸配列を含む核酸構築物である。
【0137】
本発明の一実施形態では、核酸構築物は、ｉ）配列番号１によるＭＦＳポリペプチド、又は配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性、例えば、配列番号１と８０％、例えば、９０％、例えば、９５％、例えば、１００％の配列同一性を有するその機能的ホモログをコードする核酸配列（ＭＦＳポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性、例えば、配列番号２と８０％、例えば、９０％、例えば、９５％、例えば、１００％の配列同一性を有する）、及びｉｉ）配列番号３若しくは配列番号４のポリペプチド又は配列番号３若しくは配列番号４と少なくとも７０％、例えば、８０％、例えば、９０％、例えば、９５％を有するその機能的バリアント若しくはその機能的バリアントなどのシアリル－トランスフェラーゼ能を有する１種以上のポリペプチドをコードする核酸配列、並びにｉｉｉ）事項ｉ）及びｉｉ）の両方の核酸配列の発現を調節する調節エレメントを含む核酸配列を含む。
【0138】
本発明の一実施形態では、核酸構築物は、ｉ）配列番号１によるＭＦＳポリペプチド、又は配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性、例えば、配列番号１と８０％、例えば、９０％、例えば、９５％、例えば、１００％の配列同一性を有するその機能的ホモログをコードする核酸配列（ＭＦＳポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性、例えば、配列番号２と８０％、例えば、９０％、例えば、９５％、例えば、１００％の配列同一性を有する）、及びｉｉ）事項ｉ）の両方の核酸配列の発現を調節する調節エレメントを含む核酸配列を含む。
【0139】
本発明の一実施形態では、核酸構築物は、ｉ）配列番号３若しくは配列番号４のポリペプチド、又は配列番号３若しくは配列番号４と少なくとも７０％、例えば、８０％、例えば、９０％、例えば、９５％を有するその機能的バリアント若しくはその機能的バリアントなどのシアリル－トランスフェラーゼ能を有する１種以上のポリペプチドをコードする核酸、並びにｉｉ）事項ｉ）及びｉｉ）の両方の核酸配列の発現を調節する調節エレメントを含む核酸配列を含む。
【0140】
本発明の一実施形態では、核酸構築物は、ｉ）配列番号１によるＭＦＳポリペプチド、又は配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性、例えば、配列番号１と８０％、例えば、９０％、例えば、９５％、例えば、１００％の配列同一性を有するその機能的ホモログをコードする核酸配列（ＭＦＳポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性、例えば、配列番号２と８０％、例えば、９０％、例えば、９５％、例えば、１００％の配列同一性を有する）、及びｉｉ）配列番号３若しくは配列番号４のポリペプチド又は配列番号３若しくは配列番号４と少なくとも７０％、例えば、８０％、例えば、９０％、例えば、９５％を有するその機能的バリアント若しくはその機能的バリアントなどのシアリル－トランスフェラーゼ能を有する１種以上のポリペプチドをコードする核酸配列、並びにｉｉｉ）事項ｉ）及びｉｉ）の核酸配列の発現を独立して調節する調節エレメントを含む少なくとも２種の核酸配列を含む。
【0141】
本発明の核酸構築物の調節エレメントは、好ましくは、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４及びＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７からなる群から選択される。
【0142】
［調節エレメント］
上述のとおり、遺伝子改変細胞又は核酸構築物はさらに、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列などであるがこれに限定されない核酸配列、表２のシアリルトランスフェラーゼ及び／又は表１の代替的なトランスフェラーゼの発現の調節のための調節エレメントを含む核酸配列を含み得る。調節領域の核酸配列は、異種又は同種のものであり得る。
上述のとおり、遺伝子改変細胞又は核酸構築物はさらに、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列などであるがこれに限定されない核酸配列、表２のシアリルトランスフェラーゼ及び／又は表１の代替的なトランスフェラーゼの発現の調節のための調節エレメントを含む核酸配列を含み得る。調節領域の核酸配列は、異種又は同種のものであり得る。
【0143】
用語「調節エレメント」、又は「プロモーター」、又は「プロモーター領域」、又は「プロモーターエレメント」は、転写の開始中にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識及び結合される核酸配列である。プロモーターは、他の転写及び翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）と一緒に、所与の遺伝子又は遺伝子の群（１つのオペロン）を発現するために必要である。一般に、転写及び翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列並びにエンハンサー又はアクチベーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。「転写開始部位」は、転写される第１ヌクレオチドを意味し、＋１と指定される。開始部位の下流のヌクレオチドは、＋２、＋３、＋４などと番号付けされ、５’逆（上流）方向にあるヌクレオチドは、－１、－２、－３などと番号付けされる。構築物のプロモーターは、種のゲノムにおいてコードされる任意の遺伝子のプロモーター領域に由来し得る。好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のゲノムＤＮＡのプロモーター領域。したがって、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始することができる任意のプロモーターが、本発明を実施するために好適である。原則として、任意のプロモーターを使用して、本発明のＭＦＳトランスポーター又はグリコシルトランスフェラーゼなどの組み換え遺伝子の転写を制御することができる。本発明の実行において、異なる又は同一のプロモーター配列を使用して、宿主細胞のゲノムに統合されたか又は発現ベクターＤＮＡ中の異なる目的の遺伝子の転写を促進してもよい。一例において、プロモーター配列Ａが、ＭＦＳトランスポーターの発現を促進しており、別のプロモーター配列Ｂ又は同一のプロモーター配列Ａが、グリコシルトランスフェラーゼの発現を促進している。
【0144】
構築物中に含まれる組み換え遺伝子を最適に発現させるために、構築物は、さらなる調節配列、例えば、リボソーム結合のための配列である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｇｌｐ遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に由来するＤＮＡ配列などのリーディングＤＮＡ配列を含み得る。後者の配列の例は、国際公開第２０１９／１２３３２４号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に記載され、本明細書の非限定的実施例に例示されている。
【0145】
本発明の一態様では、１種以上の調節エレメントが、本発明に従って、配列番号２によるｆｒｅｄ遺伝子をコードするＤＮＡ構築物及び／又は１種以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ構築物に挿入され得る。本発明の別の態様では、配列番号２によるｆｒｅｄ遺伝子の１つ以上のコピーが、本発明に従ってＤＮＡ構築物に挿入され得る。本発明のさらに別の態様では、配列番号２によるｆｒｅｄ遺伝子は、本発明に従って、１種以上の同一の又は同一ではないＤＮＡ構築物に挿入され得る。
【0146】
本発明の一態様では、本発明の構築物に含まれる組み換え遺伝子の発現の調節のための調節エレメントは、ｇｌｐＦＫＸオペロンプロモーター、ＰｇｌｐＦ（配列番号５）である。本発明の別の態様では、プロモーターは、ｌａｃオペロンプロモーター、Ｐｌａｃ（配列番号８）である。本発明のさらに別の態様では、調節エレメントは、プロモーター配列の下流の改変されたリボソーム結合部位配列を含むＰｇｌｐＦ配列の改変されたバージョンであるＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４（配列番号６）及び／又はＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７（配列番号７）である。しかしながら、本発明による１種以上のポリペプチドをコードする１種以上の組み換え核酸の転写及び／又は転写のレベルの調節を可能にするいずれかのプロモーターが、本発明の実施のために好適である。
【0147】
通常、本発明による異種遺伝子の発現のためのプロモーターは、表３から選択される。
【0148】
【表5】
【0149】
本発明の遺伝子改変細胞内又は核酸構築物中に存在する好ましい調節エレメントは、ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ２、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９、Ｐｌａｃ＿１６ＵＴＲ、Ｐｌａｃ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ及びＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４からなる群から選択される。
【0150】
本発明の遺伝子改変細胞内又は核酸構築物中に存在する特に好ましい調節エレメントは、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４及びＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７からなる群から選択される。
【0151】
［生合成産生のための遺伝子改変細胞］
本発明において、プロモーターは、遺伝子改変細胞における１種以上のＨＭＯの生合成産生の最適なレベルを達成し、本発明による所望の効果を達成するのに必要であり得るか又は有利であり得る。したがって、本発明のプロモーター配列は、糖輸送が可能なポリペプチド及び／又は本発明のグリコシルトランスフェラーゼの転写を可能にし且つ発現を調節して、ＨＭＯ若しくはＨＭＯ前駆体の最適化された生合成及び輸送並びに／又はＨＭＯ産生の副生成物の分解をもたらす。
本発明において、プロモーターは、遺伝子改変細胞における１種以上のＨＭＯの生合成産生の最適なレベルを達成し、本発明による所望の効果を達成するのに必要であり得るか又は有利であり得る。したがって、本発明のプロモーター配列は、糖輸送が可能なポリペプチド及び／又は本発明のグリコシルトランスフェラーゼの転写を可能にし且つ発現を調節して、ＨＭＯ若しくはＨＭＯ前駆体の最適化された生合成及び輸送並びに／又はＨＭＯ産生の副生成物の分解をもたらす。
【0152】
本発明の遺伝子改変細胞において、１種以上のＨＭＯの生合成産生に関連する少なくとも１種の遺伝子、プロモーターＤＮＡ配列、及びリボソーム結合部位配列（例えば、シャイン・ダルガーノ配列）などの他の調節配列をコードする核酸構築物が遺伝子改変細胞中に含まれる。遺伝子改変細胞における１種以上のＨＭＯの生合成産生に関連する遺伝子の発現によって、ＨＭＯの産生を可能にして、記載されるとおりの本発明を実行するための宿主細胞「好適な宿主細胞」を作製する。遺伝子改変細胞において、上述のとおりのＨＭＯの生合成産生に関連する遺伝子の発現は、遺伝子改変細胞の懸濁液を含む１リットルの発酵培地から０．０３ｇ／ｌ／ＯＤ（光学密度）のレベルでの１種以上のＨＭＯの産生を可能にする。したがって、ＨＭＯレベルは、およそ０．０５ｇ／ｌ／ＯＤ～およそ０．５ｇ／ｌ／ＯＤ、例えば、少なくとも０．４ｇ／ｌ／ＯＤであり得る。本発明のために、ＨＭＯ産生のレベルは、「十分」であるとみなされ、このレベルの所望のＨＭＯ又はＨＭＯの混合物を産生することができる遺伝子改変細胞は、本発明を実行するための好適な遺伝子改変細胞とみなされる。
【0153】
したがって、本発明に照らして、「好適な遺伝子改変細胞」はさらに、ＭＦＳファミリー、例えば、ｆｒｅｄの糖輸送が可能な糖ポリペプチドを発現して、何らかの方法で、より高いＨＭＯレベルの生合成産生、生合成産生におけるより高いレベルの純度、より速い産生時間及び／又はより効率的なＨＭＯの生合成産生などであるがこれらに限定されない有利なＨＭＯ産生を達成するように上記のとおりに改変され得る。
【0154】
［産生の方法］
本発明のある態様は、１種以上のシアル酸付加ＨＭＯの産生のための方法であって、
ａ）ＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞を提供する工程（前記細胞は、
ｉ．配列番号１のタンパク質又は配列番号１と７０％を超えて、例えば、少なくとも８０％同一な、好ましくは、少なくとも９０％同一な、より好ましくは、少なくとも９４．５％、最も好ましくは、少なくとも９９．７％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログをコードする組み換え核酸；及び
ｉｉ．シアリル－トランスフェラーゼ、好ましくは、表２から選択されるシアリル－トランスフェラーゼ、さらにより好ましくは、配列番号３若しくは配列番号４の異種シアリル－トランスフェラーゼ又は配列番号３若しくは配列番号４と少なくとも７０％、例えば、８０％、例えば、９０％、例えば、９５％を有するその機能的バリアントをコードする異種核酸配列；及び
ｉｉｉ．シアル酸糖ヌクレオチドを作製するための生合成経路を含む）；並びに
ｂ）好適な細胞培養培地中で（ｉ）の前記細胞を培養して、ＨＭＯ産生及びＤＮＡ配列の発現を可能にして、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号１と７０％を超えて、例えば、少なくとも８０％同一な、好ましくは、少なくとも９０％同一な、より好ましくは、少なくとも９５、最も好ましくは、少なくとも９９．７％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを産生させる工程；
ｃ）工程（ｉｉ）において産生された１種以上のシアル酸付加ＨＭＯを収集する工程を含む方法に関する。
本発明のある態様は、１種以上のシアル酸付加ＨＭＯの産生のための方法であって、
ａ）ＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞を提供する工程（前記細胞は、
ｉ．配列番号１のタンパク質又は配列番号１と７０％を超えて、例えば、少なくとも８０％同一な、好ましくは、少なくとも９０％同一な、より好ましくは、少なくとも９４．５％、最も好ましくは、少なくとも９９．７％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログをコードする組み換え核酸；及び
ｉｉ．シアリル－トランスフェラーゼ、好ましくは、表２から選択されるシアリル－トランスフェラーゼ、さらにより好ましくは、配列番号３若しくは配列番号４の異種シアリル－トランスフェラーゼ又は配列番号３若しくは配列番号４と少なくとも７０％、例えば、８０％、例えば、９０％、例えば、９５％を有するその機能的バリアントをコードする異種核酸配列；及び
ｉｉｉ．シアル酸糖ヌクレオチドを作製するための生合成経路を含む）；並びに
ｂ）好適な細胞培養培地中で（ｉ）の前記細胞を培養して、ＨＭＯ産生及びＤＮＡ配列の発現を可能にして、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号１と７０％を超えて、例えば、少なくとも８０％同一な、好ましくは、少なくとも９０％同一な、より好ましくは、少なくとも９５、最も好ましくは、少なくとも９９．７％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを産生させる工程；
ｃ）工程（ｉｉ）において産生された１種以上のシアル酸付加ＨＭＯを収集する工程を含む方法に関する。
【0155】
本発明によれば、用語「培養する（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」（又は「培養する（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）」、又は「培養」、又は「発酵」とも呼ばれる）は、当産業において知られている方法に従った制御されたバイオリアクター内での細菌発現細胞の増殖に関する。
【0156】
１種以上のＨＭＯを産生させるために、本明細書に記載されるとおりのＨＭＯ産生細菌は、当技術分野において知られている手法に従って、好適な炭素源、例えばグルコース、グリセロール、ラクトースなどの存在下で培養され、産生されたＨＭＯは、培養培地及び培養プロセス中に形成される微生物バイオマスから収集される。その後、ＨＭＯは、当技術分野において知られている手法、例えば国際公開第２０１５／１８８８３４号パンフレット、国際公開第２０１７／１８２９６５号パンフレット又は国際公開第２０１７／１５２９１８号パンフレットに記載されるものなどの手法に従って精製され、精製されたＨＭＯは、栄養補助食品、医薬品として又は例えば研究用などの任意の他の目的に使用される。
【0157】
ＨＭＯの製造は通常、大量で培養を実施することによって行われる。本発明の意味における用語「製造する工程」及び「製造規模」は、最小体積が５Ｌの培養ブロスを用いた発酵を規定する。通常、「製造規模」プロセスは、目的の生成物を含有する大量の調製物を処理することができ、例えば、治療用化合物又は組成物の場合、臨床試験及び市場供給の需要を満たす量の目的のタンパク質を産生することができることによって規定される。大量であることに加えて、製造規模の方法は、振盪フラスコによる培養のような単純な実験室規模の方法とは対照的に、撹拌、通気、栄養素供給、プロセスパラメーター（ｐＨ、温度、溶存酸素圧、背圧など）のモニタリング及び制御のための機器を装備しているバイオリアクター（発酵槽）の技術システムの使用を特徴とする。大体のところ、本開示の実施例に記載される振盪フラスコ、卓上バイオリアクター又はディープウェル形式などの実験室規模の方法における発現系の挙動は、バイオリアクターの複雑な環境におけるそのシステムの挙動の予測を可能にする。
【0158】
発酵プロセスに使用される好適な細胞培地に関して、制限はない。培養培地は、半規定（すなわち、複雑な培地化合物（例えば、酵母抽出物、大豆ペプトン、カザミノ酸など）を含有する）であり得るか、又はそれは、いかなる複雑な化合物も含めずに化学的に規定され得る。
【0159】
用語「１種以上のＨＭＯ」は、ＨＭＯ産生細胞が単一のＨＭＯ構造（第１のＨＭＯ）又は複数のＨＭＯ構造（第２、第３などのＨＭＯ）を産生することができる可能性があることを意味する。いくつかの実施形態では、単一のＨＭＯを産生する遺伝子改変細胞が好ましい可能性があり、他の好ましい実施形態では、複数のＨＭＯ構造を産生する遺伝子改変細胞が好ましい可能性がある。単一のＨＭＯ構造を産生する遺伝子改変細胞についての非限定的例は、２’－ＦＬ、３－ＦＬ、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ又はＬＮＴ－２産生細胞である。複数のＨＭＯ構造を産生することができる遺伝子改変細胞の非限定的な例は、ＤＦＬ、ＦＳＬ、ＬＮＴ ＬＮｎＴ、ＬＮＦＰ Ｉ、ＬＮＦＰ ＩＩ、ＬＮＦＰ ＩＩＩ、ＬＮＦＰ ＩＶ、ＬＮＦＰ Ｖ、ｐＬＮｎＨ、ｐＬＮＨ２、ＬＳＴａ、ＬＳＴｂ、ＬＳＴｃ、ＤＳＬＮＴ、Ｆ－ＬＳＴａ及びＦ－ＬＳＴｂ産生細胞であり得る。
【0160】
特に、本発明は、３’－ＳＬ及び／又は６’－ＳＬ産生細胞からなる群から選択される１種以上の単一のＨＭＯ構造を産生する遺伝子改変細胞に関する。
【0161】
本発明の文脈における用語「収集する」は、発酵の終了に続いて産生されたＨＭＯを回収することに関する。異なる実施形態では、それは、バイオマス（すなわち、遺伝子改変細胞）及び培養培地の両方に含まれる、すなわち、バイオマスからの発酵ブロスの分離前に／分離せずにＨＭＯを回収することを含み得る。他の実施形態では、産生されたＨＭＯは、バイオマス及び発酵ブロスから個別に、すなわち培養培地（すなわち発酵ブロス）からのバイオマスの分離後／分離に続いて回収され得る。培地からの細胞の分離は、当業者によく知られる方法のいずれか、例えば、任意の好適な種類の遠心分離又は濾過により実行することができる。培地からの細胞の分離は、発酵ブロスの収集直後に続けるか、又は適切な条件で発酵ブロスを貯蔵した後の段階で実行することができる。残留しているバイオマス（又は全発酵）からの産生されたＨＭＯの回収には、バイオマス（産生細胞）からの抽出が含まれる。これは、当技術分野の任意の好適な方法により、例えば超音波処理、煮沸、均質化、リゾチームを用いる酵素的溶解、又は凍結及び破砕によりなされ得る。
【0162】
発酵からの回収後、ＨＭＯは、さらなる加工処理及び精製に利用可能である。
【0163】
発酵によって産生されたＨＭＯの精製は、国際公開第２０１６／０９５９２４号パンフレット、国際公開第２０１５／１８８８３４号パンフレット、国際公開第２０１７／１５２９１８号パンフレット、国際公開第２０１７／１８２９６５号パンフレット、米国特許出願公開第２０１９／０１１９３１４号明細書（全てが参照により組み込まれる）に記載される好適な手法を使用してなされ得る。
【0164】
記載されるとおりの本発明のＨＭＯ生成物、好ましくは、３’－ＳＬ及び／又は６’－ＳＬ。
【0165】
［使用］
本発明はまた、１種以上のヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の産生における使用のための本明細書に記載されるとおりの宿主細胞の使用に関する。特に、本発明は、特定のＨＭＯの産生のための本明細書に記載されるとおりの宿主細胞の使用に関し、宿主細胞は、好ましくは、３’－ＳＬ及び６’－ＳＬから選択され、最も好ましくは、３’－ＳＬである１種の特定のＨＭＯの大部分を生成する目的で選択される。
本発明はまた、１種以上のヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の産生における使用のための本明細書に記載されるとおりの宿主細胞の使用に関する。特に、本発明は、特定のＨＭＯの産生のための本明細書に記載されるとおりの宿主細胞の使用に関し、宿主細胞は、好ましくは、３’－ＳＬ及び６’－ＳＬから選択され、最も好ましくは、３’－ＳＬである１種の特定のＨＭＯの大部分を生成する目的で選択される。
【0166】
［配列］
本出願は、参照によって本明細書に組み込まれるテキストフォーマット及び電子フォーマットの配列表を含有する。
本出願は、参照によって本明細書に組み込まれるテキストフォーマット及び電子フォーマットの配列表を含有する。
【0167】
配列の概要が本明細書で提供され、列挙される配列と公的な参考文献の間に不一致がある場合、配列表における配列が優先される。
【0168】
【表6】
【0169】
ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤと配列番号の間に配列の不一致が生じる場合、配列番号が正しい配列であるとみなされる。
【0170】
［全般］
記載される発明と関連させて上で論じられたいずれかの特徴及び／又は態様は、本明細書に記載される方法に類似して適用されることが理解されるべきである。
記載される発明と関連させて上で論じられたいずれかの特徴及び／又は態様は、本明細書に記載される方法に類似して適用されることが理解されるべきである。
【0171】
以下の図面及び実施例は、本発明を例示するために以下で提供される。それらは、例示のためのものであることが意図され、決して限定として解釈されるべきではない。
【0172】
［項目］
１．シアリル部分を含む１種以上のヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）（シアル酸付加ＨＭＯ）を産生することができる遺伝子改変細胞であって、前記遺伝子改変細胞が、
（ｉ）配列番号１の主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）ポリペプチド、又は配列番号１と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログをコードする異種核酸配列、及び
（ｉｉ）シアリル－トランスフェラーゼをコードする異種核酸配列；並びに
（ｉｉｉ）シアル酸糖ヌクレオチドを作製するための生合成経路を含む、遺伝子改変細胞。
２．１種以上の産生されたＨＭＯが、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ、ＦＳＬ、ＤＳ－ＬＮＴ、ＬＳＴｃ、ＬＳＴａ及びＬＳＴｂからなる群から選択される、項目１による遺伝子改変細胞。
３．前記細胞によって産生されるＨＭＯが、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ及びＬＳＴａからなる群から選択される、項目２による遺伝子改変細胞。
４．ＨＭＯが、３’－ＳＬ又は６’－ＳＬである、項目２又は３による遺伝子改変細胞。
５．前記機能的ホモログが、配列番号１と少なくとも９４．６％同一である、先行する項目のいずれか１つによる遺伝子改変細胞。
６．配列番号１の前記ＭＦＳポリペプチド又はその機能的ホモログの発現が、ＭＦＳポリペプチドを有しない細胞と比較して、前記ＨＭＯの排出の増加をもたらす、先行する項目のいずれか１つによる遺伝子改変細胞。
７．シアル酸付加ＨＭＯの少なくとも８０％が、遺伝子改変細胞の外部に排出される、項目６による遺伝子改変細胞。
８．シアリル－トランスフェラーゼが、表２に示されるものなどのα－２，３－シアリル－トランスフェラーゼ及びα－２，６－シアリル－トランスフェラーゼからなる群から選択される、先行する項目のいずれか１つによる遺伝子改変細胞。
９．α－２，３－シアリル－トランスフェラーゼが、Ｎｓｔ（配列番号３）若しくはＰｄ２（配列番号４）、及び／又は配列番号３若しくは配列番号４と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログから選択される、先行する項目のいずれか１つによる遺伝子改変細胞。
１０．シアル酸糖ヌクレオチドが、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃである、先行する項目のいずれか１つによる遺伝子改変細胞。
１１．細胞が、配列番号１１のＮｅｕＢ、配列番号１３のＮｅｕＣ及び配列番号１５のＮｅｕＡ、又はそれぞれ配列番号１１、１３若しくは１５と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログをコードする核酸配列を含む、項目１０による遺伝子改変細胞。
１２．細胞が、ｎｅｕＢＣＡクラスターをコードする配列番号１７の異種核酸配列、又は配列番号１７と少なくとも８０％の配列同一性を有するその機能的ホモログを含む、項目１０又は１１による遺伝子改変細胞。
１３．細胞がさらに、異種核酸配列の発現の調節のための調節エレメントを含む核酸配列を含む、先行する項目のいずれか１つによる遺伝子改変細胞。
１４．調節エレメントが、配列番号１のＭＦＳポリペプチド、又は配列番号１と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログの発現を調節する、項目１３による遺伝子改変細胞。
１５．調節エレメントが、ＰｇｌｐＦ（配列番号５）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４（配列番号６）及びＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７（配列番号７）からなる群から選択される、項目１３又は１４による遺伝子改変細胞。
１６．遺伝子改変細胞が、微生物細胞である、先行する項目のいずれか１つによる遺伝子改変細胞。
１７．微生物細胞が、細菌又は真菌である、項目１６による遺伝子改変細胞。
１８．前記真菌が、コマガタエラ属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）若しくはハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の酵母細胞から又はアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）若しくはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）の糸状菌から選択される、項目１７による遺伝子改変細胞。
１９．前記細菌が、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ラクトバチルス属（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種及びカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種からなる群から選択される、項目１７による遺伝子改変細胞。
２０．細菌が、Ｋ－１２又はＢ２１などの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、項目１７又は１９による遺伝子改変細胞。
２１．核酸構築物であって、
（ｉ）配列番号１によるＭＦＳポリペプチド、又は配列番号１と７０％を超える配列同一性を有するその機能的ホモログをコードする核酸配列（ＭＦＳポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する）、及び
（ｉｉ）事項（ｉ）の核酸配列のいずれか１つ以上の発現を調節する調節エレメントを含む核酸配列
を含む、核酸構築物。
２２．核酸構築物であって、
（ｉ）配列番号１によるＭＦＳポリペプチド、又は配列番号１と７０％を超える配列同一性を有するその機能的ホモログをコードする核酸配列（ＭＦＳポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する）、及び
（ｉｉ）シアリル－トランスフェラーゼ能を有する１種以上のポリペプチドをコードする核酸配列、並びに／又は
（ｉｉｉ）事項（ｉ）及び／又は（ｉｉ）の核酸配列のいずれか１つ以上の発現を調節する調節エレメントを含む核酸配列
を含む、核酸構築物。
２３．調節エレメントが、ＰｇｌｐＦ（配列番号５）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４（配列番号６）及びＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７（配列番号７）からなる群から選択される、項目２１又は２２による核酸構築物。
２４．１種以上のシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の生合成産生のための方法であって、
（ｉ）項目１～２０のいずれか１つによる遺伝子改変細胞を提供する工程；
（ｉｉ）配列番号１の主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）ポリペプチド、又は配列番号１と７０％を超えて同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログをコードする前記異種核酸配列、及び１種以上のシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を産生するシアリル－トランスフェラーゼをコードする異種核酸配列を発現するのに好適な細胞培養培地において遺伝子改変細胞を培養する工程；並びに
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において産生される１種以上のシアル酸付加ＨＭＯを収集する工程
を含む方法。
２５．シアル酸付加ＨＭＯの少なくとも８０％が、細胞培養物の上清に存在する、項目２４による方法。
２６．シアル酸付加ＨＭＯが、細胞培養物の上清から収集される、項目２４又は２５による方法。
２７．産生するシアル酸付加ＨＭＯが、３’－ＳＬ及び６’－ＳＬから選択される、項目２４～２６による方法。
２８．培養培地が、グルコース、スクロース、フルクトース、キシロース及びグルコースからなる群から選択されるエネルギー源を含む、項目２４～２７のいずれか１つによる方法。
２９．ラクトースが、ＨＭＯ形成のための基質として、遺伝的に操作された細胞の培養中に添加される、項目２４～２８のいずれか１つによる方法。
３０．１種以上のシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の生合成産生のための項目１～２０のいずれか１つによる遺伝子改変細胞、又は項目２１～２３のいずれか１つによる核酸構築物の使用。
３１．３’－ＳＬ及び６’－ＳＬからなる群から選択されるＨＭＯの生合成産生のための項目１～２０のいずれかによる遺伝子改変細胞、又は項目２１～２３のいずれか１つによる核酸構築物の使用。
１．シアリル部分を含む１種以上のヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）（シアル酸付加ＨＭＯ）を産生することができる遺伝子改変細胞であって、前記遺伝子改変細胞が、
（ｉ）配列番号１の主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）ポリペプチド、又は配列番号１と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログをコードする異種核酸配列、及び
（ｉｉ）シアリル－トランスフェラーゼをコードする異種核酸配列；並びに
（ｉｉｉ）シアル酸糖ヌクレオチドを作製するための生合成経路を含む、遺伝子改変細胞。
２．１種以上の産生されたＨＭＯが、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ、ＦＳＬ、ＤＳ－ＬＮＴ、ＬＳＴｃ、ＬＳＴａ及びＬＳＴｂからなる群から選択される、項目１による遺伝子改変細胞。
３．前記細胞によって産生されるＨＭＯが、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ及びＬＳＴａからなる群から選択される、項目２による遺伝子改変細胞。
４．ＨＭＯが、３’－ＳＬ又は６’－ＳＬである、項目２又は３による遺伝子改変細胞。
５．前記機能的ホモログが、配列番号１と少なくとも９４．６％同一である、先行する項目のいずれか１つによる遺伝子改変細胞。
６．配列番号１の前記ＭＦＳポリペプチド又はその機能的ホモログの発現が、ＭＦＳポリペプチドを有しない細胞と比較して、前記ＨＭＯの排出の増加をもたらす、先行する項目のいずれか１つによる遺伝子改変細胞。
７．シアル酸付加ＨＭＯの少なくとも８０％が、遺伝子改変細胞の外部に排出される、項目６による遺伝子改変細胞。
８．シアリル－トランスフェラーゼが、表２に示されるものなどのα－２，３－シアリル－トランスフェラーゼ及びα－２，６－シアリル－トランスフェラーゼからなる群から選択される、先行する項目のいずれか１つによる遺伝子改変細胞。
９．α－２，３－シアリル－トランスフェラーゼが、Ｎｓｔ（配列番号３）若しくはＰｄ２（配列番号４）、及び／又は配列番号３若しくは配列番号４と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログから選択される、先行する項目のいずれか１つによる遺伝子改変細胞。
１０．シアル酸糖ヌクレオチドが、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃである、先行する項目のいずれか１つによる遺伝子改変細胞。
１１．細胞が、配列番号１１のＮｅｕＢ、配列番号１３のＮｅｕＣ及び配列番号１５のＮｅｕＡ、又はそれぞれ配列番号１１、１３若しくは１５と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログをコードする核酸配列を含む、項目１０による遺伝子改変細胞。
１２．細胞が、ｎｅｕＢＣＡクラスターをコードする配列番号１７の異種核酸配列、又は配列番号１７と少なくとも８０％の配列同一性を有するその機能的ホモログを含む、項目１０又は１１による遺伝子改変細胞。
１３．細胞がさらに、異種核酸配列の発現の調節のための調節エレメントを含む核酸配列を含む、先行する項目のいずれか１つによる遺伝子改変細胞。
１４．調節エレメントが、配列番号１のＭＦＳポリペプチド、又は配列番号１と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログの発現を調節する、項目１３による遺伝子改変細胞。
１５．調節エレメントが、ＰｇｌｐＦ（配列番号５）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４（配列番号６）及びＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７（配列番号７）からなる群から選択される、項目１３又は１４による遺伝子改変細胞。
１６．遺伝子改変細胞が、微生物細胞である、先行する項目のいずれか１つによる遺伝子改変細胞。
１７．微生物細胞が、細菌又は真菌である、項目１６による遺伝子改変細胞。
１８．前記真菌が、コマガタエラ属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）若しくはハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の酵母細胞から又はアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）若しくはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）の糸状菌から選択される、項目１７による遺伝子改変細胞。
１９．前記細菌が、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ラクトバチルス属（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種及びカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種からなる群から選択される、項目１７による遺伝子改変細胞。
２０．細菌が、Ｋ－１２又はＢ２１などの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、項目１７又は１９による遺伝子改変細胞。
２１．核酸構築物であって、
（ｉ）配列番号１によるＭＦＳポリペプチド、又は配列番号１と７０％を超える配列同一性を有するその機能的ホモログをコードする核酸配列（ＭＦＳポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する）、及び
（ｉｉ）事項（ｉ）の核酸配列のいずれか１つ以上の発現を調節する調節エレメントを含む核酸配列
を含む、核酸構築物。
２２．核酸構築物であって、
（ｉ）配列番号１によるＭＦＳポリペプチド、又は配列番号１と７０％を超える配列同一性を有するその機能的ホモログをコードする核酸配列（ＭＦＳポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する）、及び
（ｉｉ）シアリル－トランスフェラーゼ能を有する１種以上のポリペプチドをコードする核酸配列、並びに／又は
（ｉｉｉ）事項（ｉ）及び／又は（ｉｉ）の核酸配列のいずれか１つ以上の発現を調節する調節エレメントを含む核酸配列
を含む、核酸構築物。
２３．調節エレメントが、ＰｇｌｐＦ（配列番号５）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４（配列番号６）及びＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７（配列番号７）からなる群から選択される、項目２１又は２２による核酸構築物。
２４．１種以上のシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の生合成産生のための方法であって、
（ｉ）項目１～２０のいずれか１つによる遺伝子改変細胞を提供する工程；
（ｉｉ）配列番号１の主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）ポリペプチド、又は配列番号１と７０％を超えて同一なアミノ酸配列を有するその機能的ホモログをコードする前記異種核酸配列、及び１種以上のシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を産生するシアリル－トランスフェラーゼをコードする異種核酸配列を発現するのに好適な細胞培養培地において遺伝子改変細胞を培養する工程；並びに
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において産生される１種以上のシアル酸付加ＨＭＯを収集する工程
を含む方法。
２５．シアル酸付加ＨＭＯの少なくとも８０％が、細胞培養物の上清に存在する、項目２４による方法。
２６．シアル酸付加ＨＭＯが、細胞培養物の上清から収集される、項目２４又は２５による方法。
２７．産生するシアル酸付加ＨＭＯが、３’－ＳＬ及び６’－ＳＬから選択される、項目２４～２６による方法。
２８．培養培地が、グルコース、スクロース、フルクトース、キシロース及びグルコースからなる群から選択されるエネルギー源を含む、項目２４～２７のいずれか１つによる方法。
２９．ラクトースが、ＨＭＯ形成のための基質として、遺伝的に操作された細胞の培養中に添加される、項目２４～２８のいずれか１つによる方法。
３０．１種以上のシアル酸付加ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の生合成産生のための項目１～２０のいずれか１つによる遺伝子改変細胞、又は項目２１～２３のいずれか１つによる核酸構築物の使用。
３１．３’－ＳＬ及び６’－ＳＬからなる群から選択されるＨＭＯの生合成産生のための項目１～２０のいずれかによる遺伝子改変細胞、又は項目２１～２３のいずれか１つによる核酸構築物の使用。
【0173】
［実施例］
［材料及び方法］
他に明記しない限り、分子生物学の分野において知られている標準的な技術、ベクター、制御配列エレメント及び他の発現系エレメントは、核酸の操作、形質転換及び発現のために使用される。そのような標準的な技術、ベクター及びエレメントは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｕｋｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ＤＮＡ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ Ｅｐｉｓｏｍｅｓ（１９７７）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２．）（Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）に見出すことができる。
［材料及び方法］
他に明記しない限り、分子生物学の分野において知られている標準的な技術、ベクター、制御配列エレメント及び他の発現系エレメントは、核酸の操作、形質転換及び発現のために使用される。そのような標準的な技術、ベクター及びエレメントは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｕｋｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ＤＮＡ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ Ｅｐｉｓｏｍｅｓ（１９７７）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２．）（Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）に見出すことができる。
【0174】
以下に記載される実施形態は、本発明を例示するために選択されたものであり、決して本発明を限定するものではない。
【0175】
［株］
本実施例で利用される株は、以下の表５に記載される。
本実施例で利用される株は、以下の表５に記載される。
【0176】
【表7】
【0177】
［培養］
他に明記しない限り、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、０．２％のグルコースを含有する基本最少培地中において３７℃で撹拌しながら増殖させた。寒天プレートを、３７℃で一晩インキュベートした。
他に明記しない限り、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、０．２％のグルコースを含有する基本最少培地中において３７℃で撹拌しながら増殖させた。寒天プレートを、３７℃で一晩インキュベートした。
【0178】
基本最少培地は、以下の組成を有した：ＮａＯＨ（１ｇ／Ｌ）、ＫＯＨ（２．５ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（７ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４（７ｇ／Ｌ）、クエン酸（０．５ｇ／ｌ）、微量ミネラル溶液（５ｍＬ／Ｌ）。微量ミネラル原液は、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ ０．８２ｇ／Ｌ、クエン酸 ２０ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ ０．９８ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ ３．９２５ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌを含有した。基本最少培地のｐＨを、５ＮのＮａＯＨを用いて７．０に調整し、オートクレーブにかけた。播種の前に、基本最少培地に、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、４μｇ／ｍＬ チアミン、０．５％の所与の炭素源（グリセロール（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ））を供給した。チアミン、及び抗生物質を、濾過により滅菌した。全てのパーセンテージでの濃度は、グリセロールについて体積／体積として、グルコースについて重量／体積として表される。
【0179】
［化学的コンピテント細胞及び形質転換］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、ＬＢプレートから、ＯＤ６００が約０．４になるまで３７℃で振盪しながら、０．２％のグルコースを含有する５ｍＬのＬＢ内で播種した。１３０００ｇで２５秒間にわたる遠心分離により、２ｍＬの培養物を収集した。上清を除去し、細胞ペレットを６００μＬの低温ＴＢ溶液（１０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１５ｍＭのＣａＣｌ２、２５０ｍＭのＫＣｌ）中で再懸濁させた。細胞を氷上で２０分間インキュベートした後、１３０００ｇで１５秒間ペレット化した。上清を除去し、細胞ペレットを１００μＬの低温ＴＢ溶液中で再懸濁させた。プラスミドの形質転換は、１００μＬのコンピテント細胞及び１～１０ｎｇのプラスミドＤＮＡを使用してなされた。細胞及びＤＮＡを、氷上で２０分間インキュベートした後、４２℃で４５秒間熱ショックを与えた。氷上での２分間のインキュベーション後、４００μＬのＳＯＣ（２０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．１８６ｇ／ＬのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４及び２０ｍＭのグルコース）を添加し、細胞培養を１時間にわたり振盪しながら３７℃でインキュベートした後、選択プレート上にプレーティングした。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、ＬＢプレートから、ＯＤ６００が約０．４になるまで３７℃で振盪しながら、０．２％のグルコースを含有する５ｍＬのＬＢ内で播種した。１３０００ｇで２５秒間にわたる遠心分離により、２ｍＬの培養物を収集した。上清を除去し、細胞ペレットを６００μＬの低温ＴＢ溶液（１０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１５ｍＭのＣａＣｌ２、２５０ｍＭのＫＣｌ）中で再懸濁させた。細胞を氷上で２０分間インキュベートした後、１３０００ｇで１５秒間ペレット化した。上清を除去し、細胞ペレットを１００μＬの低温ＴＢ溶液中で再懸濁させた。プラスミドの形質転換は、１００μＬのコンピテント細胞及び１～１０ｎｇのプラスミドＤＮＡを使用してなされた。細胞及びＤＮＡを、氷上で２０分間インキュベートした後、４２℃で４５秒間熱ショックを与えた。氷上での２分間のインキュベーション後、４００μＬのＳＯＣ（２０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．１８６ｇ／ＬのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４及び２０ｍＭのグルコース）を添加し、細胞培養を１時間にわたり振盪しながら３７℃でインキュベートした後、選択プレート上にプレーティングした。
【0180】
プラスミドを、供給業者（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって推奨された条件において、ＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞に形質転換させた。
【0181】
［ＤＮＡ技術］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のプラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の染色体ＤＮＡを、ＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＤｒｅａｍＴａｑ ＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＵホットスタートＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＵＳＥＲ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を、供給業者によって推奨されるとおりに使用した。プライマーは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙによって供給された。ＰＣＲ断片及びプラスミドは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによってシーケンシングされた。コロニーＰＣＲは、Ｔ１００（商標）サーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）においてＤｒｅａｍＴａｑ ＰＣＲマスターミックスを使用してなされた。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のプラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の染色体ＤＮＡを、ＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＤｒｅａｍＴａｑ ＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＵホットスタートＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＵＳＥＲ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を、供給業者によって推奨されるとおりに使用した。プライマーは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙによって供給された。ＰＣＲ断片及びプラスミドは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによってシーケンシングされた。コロニーＰＣＲは、Ｔ１００（商標）サーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）においてＤｒｅａｍＴａｑ ＰＣＲマスターミックスを使用してなされた。
【0182】
本発明の遺伝子改変ＨＭＯ産生細胞において発現される異種タンパク質は、表６に記載され、本発明の以下の例証において使用されたプロモーターエレメントは、表７に記載され、プラスミド骨格、プロモーター、エレメント、及びｆｒｅｄの増幅のために使用されるオリゴは、表８に記載される。
【0183】
【表8】
【0184】
【表9】
【0185】
【表10】
【0186】
［プラスミドの構築］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム内への相同組み換えのために適切な２個のＤＮＡ断片によって分離された２つのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位及びＴ１転写終結配列を含有するプラスミド骨格を合成した。例えば、１本のプラスミド骨格（ｐＵＣ５７：：ｇａｌ）では、ｇａｌオペロン（ｇａｌＫにおける相同組み換えのために必要とされる）、及びＴ１転写終結配列を合成した（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）。ｇａｌオペロン内の相同組み換えのために使用されるＤＮＡ配列は、配列の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＭＧ１５５完全ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＩＤ：ＣＰ０１４２２５．１）内で塩基対３．６２８．６２１～３．６２８．７２０及び３．６２７．５７２～３．６２７．６７１をカバーした。相同組み換えによる挿入は、ｇａｌＫ及びｇａｌＫ－表現型の９４９塩基対の欠失を生じさせるであろう。同様の方法で、ｐＵＣ５７（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）に基づく骨格又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム内への相同組み換えのために適切な２個のＤＮＡ断片によって分離された２つのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位及びＴ１転写終結配列を含有する任意の他の適切なベクターを合成することができるであろう。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１染色体ＤＮＡの特異的ＤＮＡ配列のプライマーの設計及び増幅のために、分子生物学の分野においてよく知られる標準的な技術を使用した。そのような標準的な技術、ベクター及びエレメントは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｕｋｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）に見出すことができる。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム内への相同組み換えのために適切な２個のＤＮＡ断片によって分離された２つのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位及びＴ１転写終結配列を含有するプラスミド骨格を合成した。例えば、１本のプラスミド骨格（ｐＵＣ５７：：ｇａｌ）では、ｇａｌオペロン（ｇａｌＫにおける相同組み換えのために必要とされる）、及びＴ１転写終結配列を合成した（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）。ｇａｌオペロン内の相同組み換えのために使用されるＤＮＡ配列は、配列の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＭＧ１５５完全ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＩＤ：ＣＰ０１４２２５．１）内で塩基対３．６２８．６２１～３．６２８．７２０及び３．６２７．５７２～３．６２７．６７１をカバーした。相同組み換えによる挿入は、ｇａｌＫ及びｇａｌＫ－表現型の９４９塩基対の欠失を生じさせるであろう。同様の方法で、ｐＵＣ５７（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）に基づく骨格又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム内への相同組み換えのために適切な２個のＤＮＡ断片によって分離された２つのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位及びＴ１転写終結配列を含有する任意の他の適切なベクターを合成することができるであろう。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１染色体ＤＮＡの特異的ＤＮＡ配列のプライマーの設計及び増幅のために、分子生物学の分野においてよく知られる標準的な技術を使用した。そのような標準的な技術、ベクター及びエレメントは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｕｋｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）に見出すことができる。
【0187】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１から得られた染色体ＤＮＡを使用して、オリゴＯ２６１及びＯ２６２を用いてプロモーターＰｇｌｐＦ、オリゴＯ２６１及びＯ４５９を用いてＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、並びにオリゴＯ２６１及びＯ４６２を用いてＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７を含有する３００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した（表８）。
【0188】
エルシニア・フレデリクセニイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ）に由来するｆｒｅｄ遺伝子、配列番号２のコドン最適化バージョンを含有する１．１８２ｂｐのＤＮＡ断片を、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔによって合成した（表６）。ｆｒｅｄ遺伝子を、オリゴＫＡＢＹ７３３及びＫＡＢＹ７３４を使用して増幅した。
【0189】
全てのＰＣＲ断片（プラスミド骨格、エレメントを含有するプロモーター及びｆｒｅｄ遺伝子）を精製し、プラスミド骨格、プロモーターエレメント（Ｐｌａｃ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４又はＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７）、及びＤＮＡ断片を含有するｆｒｅｄ（又は目的の他の遺伝子、表６を参照のこと）を組み立てた。プラスミドを、標準ＵＳＥＲクローニングによってクローン化した。任意の適切なプラスミドにおけるクローニングは、任意の標準のＤＮＡクローニング技術を用いて実施することができるであろう。プラスミドを、ＴＯＰ１０細胞内に形質転換させ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（又は任意の適切な抗生物質）及び０．２％のグルコースを含有するＬＢプレート上で選択した。構築されたプラスミドを精製し、プロモーター配列及びｆｒｅｄ遺伝子の５’末端は、ＤＮＡシーケンシング（ＭＷＧ Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）によって検証した。このように、ｆｒｅｄ（又は目的の他の遺伝子、表６を参照のこと）遺伝子に連結された目的の任意のプロモーターを含有する遺伝子カセットを構築した。
【0190】
［株の構築］
使用される細菌株であるＭＤＯは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１から構築した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１の遺伝子型は、Ｆ－、λ－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１に加えて、遺伝子型ＭＤＯは、以下の改変：ｌａｃＺ：１．５ｋｂｐの欠失、ｌａｃＡ：０．５ｋｂｐの欠失、ｎａｎＫＥＴＡ：３．３ｋｂｐの欠失、ｍｅｌＡ：０．９ｋｂｐの欠失、ｗｃａＪ：０．５ｋｂｐの欠失、ｍｄｏＨ：０．５ｋｂｐの欠失、及びｇｍｄ遺伝子の上流へのＰｌａｃプロモーターの挿入
を有する。
使用される細菌株であるＭＤＯは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１から構築した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１の遺伝子型は、Ｆ－、λ－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１に加えて、遺伝子型ＭＤＯは、以下の改変：ｌａｃＺ：１．５ｋｂｐの欠失、ｌａｃＡ：０．５ｋｂｐの欠失、ｎａｎＫＥＴＡ：３．３ｋｂｐの欠失、ｍｅｌＡ：０．９ｋｂｐの欠失、ｗｃａＪ：０．５ｋｂｐの欠失、ｍｄｏＨ：０．５ｋｂｐの欠失、及びｇｍｄ遺伝子の上流へのＰｌａｃプロモーターの挿入
を有する。
【0191】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１ ＭＤＯの染色体ＤＮＡにおけるｆｒｅｄ遺伝子及びＴ１転写終結配列に連結されたプロモーターを含有する発現カセットの挿入は、Ｈｅｒｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｈｅｒｒｉｎｇ，Ｃ．Ｄ．，Ｇｌａｓｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ Ｂｌａｔｔｎｅｒ，Ｆ．Ｒ．（２００３）．Ｇｅｎｅ（３１１）．１５３－１６３）によって基本的に記載されるとおりにＧｅｎｅ Ｇｏｒｇｉｎｇによって実施された。簡潔に述べると、ドナープラスミド及びヘルパープラスミドを、ＭＤＯに同時形質転換させ、０．２％のグルコース、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）又はカナマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレート上で選択した。単一コロニーを、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）及び１０μＬの２０％のＬ－アラビノースを含有する１ｍＬのＬＢ中に播種し、７～８時間にわたり振盪しながら３７℃でインキュベートした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｇａｌＫ遺伝子座内への統合のために、次に、細胞をＭ９－ＤＯＧプレート上にプレーティングし、３７℃で４８時間インキュベートした。ＭＭ－ＤＯＧプレート上で形成される単一コロニーを、０．２％ グルコースを含有するＬＢプレート上で再びストリークし、３７℃で２４時間インキュベートした。ＭｃａＣｏｎｋｅｙ－ガラクトース寒天プレート上で白色に見え、アンピシリン及びクロラムフェニコールの両方に感受性であったコロニーは、ドナー及びヘルパープラスミドを消失しており、ｇａｌＫ遺伝子座における挿入物を含有すると予測された。ｇａｌＫ部位での挿入を、プライマーＯ４８（配列番号２０）及びＯ４９（配列番号２１）を使用するコロニーＰＣＲによって同定し、挿入されたＤＮＡを、シーケンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって検証した。
【0192】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体ＤＮＡ内の他の遺伝子座での遺伝子カセットの挿入は、異なる選択マーカー遺伝子及び異なるスクリーニング方法を使用して同様の方法でなされた。
【0193】
［ディープウェルアッセイ］
ディープウェルアッセイは、最初にＬｖ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓｔ Ｅｎｇ（２０１６）３９：１７３７－１７４７）によって記載されるとおりに実施され、本発明の目的のために最適化された。
ディープウェルアッセイは、最初にＬｖ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓｔ Ｅｎｇ（２０１６）３９：１７３７－１７４７）によって記載されるとおりに実施され、本発明の目的のために最適化された。
【0194】
より詳細には、実施例に開示される株は、４日間プロトコルを用いて２４ディープウェルプレート内でスクリーニングされた。最初の２４時間において、振盪機培養細胞を、７００ｒｐｍの振盪により３４℃で増殖させて高密度にした一方、２’－ＦＬ、３－ＦＬ及び３’－ＳＬ産生細胞に関して次の４８時間、並びにＬＮＴ産生細胞に関して７２時間において、細胞を遺伝子発現及び生成物形成の誘導を可能にする培地に移した。詳細には、１日目の間に、硫酸マグネシウム、チアミン及びグルコースが補給された基本最少培地を用いて新鮮な播種材料を調製した。インキュベーションの２４時間後、細胞を、硫酸マグネシウム及びチアミンが補給された新しい基本最少培地（２ｍｌ）に移し、２０％ グルコース溶液（１μＬ）及び１０％ ラクトース溶液（０．１ｍｌ）からなる初期ボーラスを添加し、続いて炭素源としての５０％ スクロース溶液（０．０４ｍｌ）を、スクロースヒドロラーゼ（インベルターゼ、５μｌの０．１ｇ／Ｌの溶液）の添加を伴う細胞に供給し、その結果、グルコースが、インベルターゼによるスクロースの切断によって増殖のために遅い速度で供給された。新規培地の播種の後、細胞を、４８時間にわたり２８℃、７００ｒｐｍで振盪した。変性及びその後の遠心分離の後、上清をＨＰＬＣによって分析した。試料全体の分析のために、煮沸によって調製した細胞溶解液は、４７００ｒｐｍで１０分間にわたる遠心分離によってペレット化した。上清中のＨＭＯ濃度を、ＨＰＬＣ又はＨＰＡＣ法によって決定した。
【0195】
［３’－ＳＬ発酵プロセス及び関連する測定］
全て発酵を、２００ｍＬのＤａｓｂｏｘバイオリアクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で実行し、それぞれの開始体積は１００ｍＬであった。培地は、２５ｇ／ｋｇ 炭素源（グルコース）、３０ｇ／ｋｇ ラクトース、ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、微量元素溶液、クエン酸、消泡剤及びチアミンからなる規定の最少培養培地であった。微量金属溶液（ＴＭＳ）は、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、硫酸塩としてＺｎ及びクエン酸を含有した。発酵は、上述の規定の最少培地中において増殖された２％（ｖ／ｖ）の前培養による播種によって開始された。バッチ培地中に含有される炭素源の枯渇の後、グルコース、ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、ＴＭＳ、消泡剤及びラクトースを含有する無菌フィード溶液を、既定の線形プロファイルを使用して限定的なグルコースの様式で連続的に供給した。
全て発酵を、２００ｍＬのＤａｓｂｏｘバイオリアクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で実行し、それぞれの開始体積は１００ｍＬであった。培地は、２５ｇ／ｋｇ 炭素源（グルコース）、３０ｇ／ｋｇ ラクトース、ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、微量元素溶液、クエン酸、消泡剤及びチアミンからなる規定の最少培養培地であった。微量金属溶液（ＴＭＳ）は、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、硫酸塩としてＺｎ及びクエン酸を含有した。発酵は、上述の規定の最少培地中において増殖された２％（ｖ／ｖ）の前培養による播種によって開始された。バッチ培地中に含有される炭素源の枯渇の後、グルコース、ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、ＴＭＳ、消泡剤及びラクトースを含有する無菌フィード溶液を、既定の線形プロファイルを使用して限定的なグルコースの様式で連続的に供給した。
【0196】
発酵全体にわたるｐＨは、ＮＨ４ＯＨ溶液による滴定によって６．８で制御された。エアレーションは、大気を使用して１ ＶＶＭで制御され、溶存酸素は、２０％超の空気飽和で維持され、撹拌機速度によって制御された。温度は、３４℃で連続的に維持された。
【0197】
発酵全体にわたって、試料は、ＨＰＬＣを使用して３’－ＳＬ、シアル酸、ラクトース及び他の微量な副生成物の濃度を決定するために採取された。全ブロス試料を、脱イオン水中で３倍に希釈し、２０分間煮沸し、これに続いて１７０００ｇで３分間遠心分離し、得られた上清をＨＰＬＣによって分析した後、生成された３’－ＳＬの全ブロス画分を得た。３’－ＳＬの上清画分を、煮沸を伴わずにＨＰＬＣにより分析し、１７０００ｇで３分間の遠心分離によってペレットから分離した。
【0198】
ウェットバイオマス（ＢＷＭ）は、１ｍＬの発酵ブロスを既知の重量（ｇ）を有する２ｍＬの微量遠心機チューブに分注することによって決定され、ブロス試料の重量（ｇ）を測定し、遠心分離（３分間１７０００ｇ）後に上清を除去し、最終的にペレットの重量を測定した。ペレットの重量（ｇ）をブロスの重量（ｇ）で割り、その結果に１０００を掛けることによって、ｇ／ｋｇでＢＷＭを得た。全ての重量測定は、３桁の小数精度を使用する化学天秤で実施された。
【0199】
上清及びペレット分布は、ＢＷＭ（ｇ／ｋｇ）を使用して得られる各試料に関する上清の重量（ｋｇ）及び蓄積された発酵ブロス重量（ｋｇ）を計算することによって計算された。上清重量（ｋｇ）は、上清中の３’－ＳＬの濃度（ｇ／Ｌ）によって掛けられ、全ブロス中の３’－ＳＬの重量（ｇ）によって割られ、最終的に１００によって掛けられて、上清中の３’－ＳＬの比率（％）が計算された。発酵ブロス上清の密度は、１ｇ／ｃｍ３であった。
【0200】
［実施例１－ＭＦＳトランスポーター、Ｆｒｅｄの有り無し両方での３’－ＳＬの産生］
［ｆｒｅｄ遺伝子を発現する３’－ＳＬ産生のための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の操作］
［ｆｒｅｄ遺伝子を発現する３’－ＳＬ産生のための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の操作］
【0201】
【表11】
【0202】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２（ＤＨ１）ＭＤＯ株は、目的の異種遺伝子を発現するように操作され得る。例えば、株１及び株３は、アルファ－２，３－シアリル－トランスフェラーゼ、ｎｓｔ及びＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ合成酵素、ｎｅｕＢＣＡ遺伝子を過剰発現する３’－ＳＬ産生株である。ｎｅｕＢＣＡ遺伝子は、ｐＢＳ－ｎａｄＣ－ｎｅｕＢＣＡプラスミドから発現され得るか（株１）又はゲノム中に統合され得る（株３）。単一コピーにおいてｆｒｅｄに連結されたプロモーターエレメント（ＰｇｌｐＦ）を含有する発現カセットの株１又は株３のバックグラウンドへの挿入は、それぞれ株２及び株４をもたらした。
【0203】
株は、「材料及び方法」の節に記載されるとおりのディープウェルアッセイにおいて試験された。
【0204】
ディープウェルアッセイからの結果は、３’－ＳＬの発現がＦｒｅｄトランスポーターの挿入によって影響されないことを示した（図１）。しかしながら、３’－ＳＬの分布は、Ｆｒｅｄトランスポーターの存在により著しく変化させられ、Ｆｒｅｄトランスポーターが、細胞から上清への３’－ｓｌの輸送を促進して、ほんの一部の３’－ＳＬをペレット中に残した一方で、Ｆｒｅｄトランスポーターがない場合、４０％の３’－ＳＬが細胞内部に残存することを明白に示している（図２）。
【0205】
株のさらなる評価は、「材料及び方法」の節に記載されるとおりに株を発酵させた後に実施された。
【0206】
発酵データから、Ｆｒｅｄトランスポーターを有しない株（株１及び３）に関して、３’－ＳＬは細胞内で最初は高く、経時的にそれが上清に放出される一方で、Ｆｒｅｄトランスポーターを有する細胞（株２及び４）は、上清中に高レベルの３’－ＳＬで始まるように見えることがわかる（図３及び５）。
【0207】
Ｆｒｅｄトランスポーターの存在はまた、バイオマスの発達に影響するようであり、同じ量の３’－ＳＬが産生されるが、Ｆｒｅｄトランスポーターが存在する場合、同じ量の３’－ＳＬを産生するのに必要なバイオマスの量が著しく少なくなり（図４及び６）、これはエネルギー消費の点でも、バイオマス除去のための下流の処理においても有利である。
【0208】
［実施例２－ＭＦＳトランスポーター、ＹｂｅｒＣの有り無し両方での３’－ＳＬの産生］
［ｙｂｅｒＣ遺伝子を発現する３’－ＳＬ産生のための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の操作］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２（ＤＨ１）ＭＤＯ株は、実施例１に記載されるとおりに目的の異種遺伝子を発現するように操作され得る。本実施例において、Ｆｒｅｄの代わりに異種のコピーのＹｂｅｒＣを発現したことを除いて、株２と類似する株が作製された。簡潔に述べると、単一コピーでコドン最適化されたｙｂｅｒＣ遺伝子に連結されたプロモーターエレメント（ＰｇｌｐＦ）を含有する発現カセットを、株１に挿入することによって、株５を作製した。
［ｙｂｅｒＣ遺伝子を発現する３’－ＳＬ産生のための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の操作］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２（ＤＨ１）ＭＤＯ株は、実施例１に記載されるとおりに目的の異種遺伝子を発現するように操作され得る。本実施例において、Ｆｒｅｄの代わりに異種のコピーのＹｂｅｒＣを発現したことを除いて、株２と類似する株が作製された。簡潔に述べると、単一コピーでコドン最適化されたｙｂｅｒＣ遺伝子に連結されたプロモーターエレメント（ＰｇｌｐＦ）を含有する発現カセットを、株１に挿入することによって、株５を作製した。
【0209】
株は、「材料及び方法」の節に記載されるとおりのディープウェルアッセイにおいて試験された。ディープウェルアッセイからの結果は、ＰｇｌｐＦ（５）を使用するｙｂｅｒＣ遺伝子の発現が、ＹｂｅｒＣを有しない株（株１）と比較して３’－ＳＬ産生のおよそ１６％の減少をもたらすことを示した（図７Ａ）。これは、ＹｂｅｒＣトランスポーターが、Ｆｒｅｄトランスポーターと比較して３’－ＳＬ産生に対して負の影響を及ぼすことを示す。
【0210】
上清への分泌に関して、ＹｂｅｒＣは、Ｆｒｅｄと同様に、ペレット画分中の３’－ＳＬの量を減少させ、培地中の３’－ＳＬの量を増加させることによって３’－ＳＬ生成物の分布を改善する（図７Ｂを参照のこと）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】