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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-05
(54)【発明の名称】ヒドロゲルケージ中の細胞及び／又はオルガネラの分析
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20240129BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240129BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20240129BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 A ZNA
C12N15/09 200
C12Q1/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023541889
(86)(22)【出願日】2022-01-12
(85)【翻訳文提出日】2023-08-16
(86)【国際出願番号】 EP2022050518
(87)【国際公開番号】W WO2022152739
(87)【国際公開日】2022-07-21
(31)【優先権主張番号】21305027.1
(32)【優先日】2021-01-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
２．ＰＹＴＨＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521286743
【氏名又は名称】パリ シアンス エ レットル
【氏名又は名称原語表記】ＰＡＲＩＳ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ＥＴ ＬＥＴＴＲＥＳ
【住所又は居所原語表記】６０， ｒｕｅ Ｍａｚａｒｉｎｅ， ７５００６ Ｐａｒｉｓ， ＦＲＡＮＣＥ
(71)【出願人】
【識別番号】518364366
【氏名又は名称】エコール シュペリュール ドゥ フィシック エ ドゥ シミー アンダストリエル ドゥ ラ ビル ドゥ パリ
(71)【出願人】
【識別番号】501089863
【氏名又は名称】サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェ サイアンティフィク
(71)【出願人】
【識別番号】523261632
【氏名又は名称】マイクロファクトリー
(71)【出願人】
【識別番号】507416908
【氏名又は名称】ソルボンヌ・ユニヴェルシテ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100197169
【弁理士】
【氏名又は名称】柴田 潤二
(72)【発明者】
【氏名】ユベール ジェスレ
(72)【発明者】
【氏名】パトリック タベラン
(72)【発明者】
【氏名】アンドルー グリフィス
(72)【発明者】
【氏名】ステファヌ シロン
(72)【発明者】
【氏名】ファブリス モンティ
(72)【発明者】
【氏名】ガエル ブリベ－バイイ
(72)【発明者】
【氏名】マージャン アブドラヒム
(72)【発明者】
【氏名】イベット トラン－アマレリ
(72)【発明者】
【氏名】フィリップ ヌゲ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029CC03
4B029CC08
4B029DG01
4B029GA03
4B029GB02
4B029GB04
4B029HA05
4B063QA01
4B063QQ02
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR55
4B063QR62
4B063QR82
4B063QS25
4B063QS36
(57)【要約】
マイクロ流体デバイス（１０）であって、－複数の閉鎖パターン（１６）が上にグラフトされた第１の基材（１４）を含む第１の壁（１２）と、－第２の基材（２０）を含む、第１の壁（１２）に対向した第２の壁（１８）と、－第１の基材（１４）又は第２の基材（２０）のいずれかの上にグラフトされた複数の核酸（２２）と、を含み、各核酸（２２）が、当該第１の基材（１４）又は第２の基材（２０）上の核酸の位置をコードするバーコードを含み、少なくとも複数の閉鎖パターン（１６）又は第２の基材（２０）が、収縮状態と、閉鎖パターン（１６）及び第２の基材（２０）が接触した膨潤状態との間で膨潤可能である作動可能なヒドロゲルから作製されている、マイクロ流体デバイス（１０）。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
マイクロ流体デバイス（１０）であって、－複数の閉鎖パターン（１６）が上にグラフトされた第１の基材（１４）を含む第１の壁（１２）と、
－前記第１の壁（１２）に対向し、第２の基材（２０）を含む第２の壁（１８）と、
－前記第１の基材（１４）又は前記第２の基材（２０）のいずれかの上にグラフトされた複数の核酸（２２）であって、各核酸（２２）が、前記第１の基材（１４）又は前記第２の基材（２０）上の前記核酸の位置をコードするバーコードを含む、複数の核酸（２２）と、を含み、
少なくとも前記複数の閉鎖パターン（１６）又は前記第２の基材（２０）が、収縮状態と、前記閉鎖パターン（１６）及び前記第２の基材（２０）が接触した膨潤状態との間で膨潤可能である作動可能なヒドロゲルで作製されている、マイクロ流体デバイス（１０）。
【請求項2】
作動可能な膨潤性ヒドロゲルが、温度応答性膨潤性ヒドロゲルである、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス（１０）。
【請求項3】
前記温度応答性ヒドロゲルが、４℃～９８℃、好ましくは２０℃～５０℃、より好ましくは２５℃～４０℃の範囲の臨界溶液温度を有する、請求項２に記載のマイクロ流体デバイス（１０）。
【請求項4】
前記臨界溶液温度が、下限臨界溶液温度であり、その上では、前記温度応答性ヒドロゲルが前記収縮状態にあり、その下では、前記温度応答性ヒドロゲルが前記膨潤状態にある、請求項３に記載のマイクロ流体デバイス（１０）。
【請求項5】
前記臨界溶液温度が、上限臨界溶液温度であり、その上では、前記温度応答性ヒドロゲルが前記膨潤状態にあり、その下では、前記温度応答性ヒドロゲルが前記収縮状態にある、請求項３に記載のマイクロ流体デバイス（１０）。
【請求項6】
前記ヒドロゲルのポリマーマトリックスが、アクリル酸、アルキル（メタ）アクリレート、アルキル（メタ）アクリルアミド、オリゴエチレン（メタ）アクリレート、スルホベタイン（メタ）アクリレート及びＮ－アクリロイルグリシンアミドのホモポリマー、コポリマー及びターポリマー並びにそれらの任意の混合物から選択される、好ましくはアルキル（メタ）アクリルアミドのホモポリマー、コポリマー及びターポリマー並びにそれらの任意の混合物から選択される熱応答性ポリマーを含み、好ましくはそれからなり、より好ましくは、前記ポリマーが、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）である、請求項１～５のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス（１０）。
【請求項7】
前記デバイス（１０）への反応物の導入又は除去をそれぞれ可能にする少なくとも１つの入口（２４）及び少なくとも１つの出口（２６）を更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス（１０）。
【請求項8】
前記第１の基材（１４）及び前記第２の基材（２０）が、独立して、シリコン、石英、ガラス、ポリジメチルシロキサン、環状オレフィンコポリマー及びポリカーボネートなどの熱可塑性物質から、好ましくはガラス及びポリジメチルシロキサンから選択される材料で作製されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス（１０）。
【請求項9】
前記複数の閉鎖パターン（１６）が、前記作動可能な膨潤性ヒドロゲルから作製され、前記第２の基材（２０）が、非膨潤性材料から作製されている、請求項１～８のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス（１０）。
【請求項10】
前記第２の基材（２０）が、前記作動可能な膨潤性ヒドロゲルから作製され、前記閉鎖パターン（１６）が、非膨潤性材料から作製されている、請求項１～８のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス（１０）。
【請求項11】
複数のリガンドが、前記第１の基材（１４）上及び／又は前記第２の基材（２０）上にグラフトされている、請求項１～１０のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス（１０）。
【請求項12】
核酸とコンジュゲートされた複数のリガンドが、グラフトされた前記核酸（２２）の少なくとも一部へのハイブリダイゼーションによって会合されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス（１０）。
【請求項13】
各リガンドが、独立して、抗体、抗体断片、レクチン、及びアプタマーからなる群から選択される、請求項１１又は１２に記載のマイクロ流体デバイス（１０）。
【請求項14】
同じバーコードを共有する核酸（２２）が、複数の配列を有する、請求項１～１３のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス（１０）。
【請求項15】
核酸（２２）が、以下の配列：１）核酸放出のための制限部位又は光切断可能部位、
２）更なる増幅のための増幅プライマーに相補的な配列、
３）インビトロ転写（ＩＶＴ）のためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、
４）核酸標識のための、ハイブリダイゼーション部位、ライゲーション部位又は組換え部位、及び
５）ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）として機能するランダム化ヌクレオチド残基の配列、のうちの１つ又は任意の組み合わせを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス（１０）。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項に記載のデバイス（１０）の製造方法であって、ａ）第１の基材（１４）を提供することと、
ｂ）前記第１の基材（１４）の表面上に複数の閉鎖パターン（１６）をグラフトすることと、
ｃ）第２の基材（２０）を提供することと、
ｄ）前記第１の基材（１４）の表面上又は前記第２の基材（２０）の表面上のいずれかに複数の核酸（２２）をグラフトすることであって、各核酸（２２）が、前記第１の基材（１４）又は前記第２の基材（２０）上の前記核酸（２２）の位置をコードするバーコードを含む、グラフトすることと、
ｅ）前記第１の基材（１４）と前記第２の基材（２０）との間に前記閉鎖パターン（１６）及び前記核酸（２２）を配置することによって、前記第１の基材（１４）及び前記第２の基材（２０）を位置決めすることと、
ｆ）前記第１の基材（１４）と前記第２の基材（２０）とを結合することと、を含む、方法。
【請求項17】
Ａ）前記第１の基材（１４）の表面上及び／又は前記第２の基材（２０）の表面上に、複数のリガンドをグラフトするステップ、及び／又はＢ）グラフトされた前記複数の核酸（２２）に、ハイブリダイゼーションによって複数のリガンドを会合させるステップであって、前記複数のリガンドが、前記グラフトされた核酸（２２）の少なくとも一部に相補的な核酸とコンジュゲートされる、会合させるステップ、及び／又は
Ｃ）前記第１の基材（１４）及び／又は前記第２の基材（２０）の表面の少なくとも一部に接着コーティングをコーティングし、前記接着コーティングに、非共有結合によって複数のリガンドを会合させるステップ、のうちの少なくとも１つを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記方法が、１）グラフトされた核酸（２２）中に存在する定常配列の全部又は一部に相補的な配列を含むＤＮＡをハイブリダイズさせるステップ、
２）重合によりハイブリダイズＤＮＡを伸長させるステップ、
３）前記グラフトされた核酸（２２）をＤＮＡ配列とライゲーションするステップ、
４）場合によっては１）、２）又は３）によるハイブリダイゼーション、伸長又はライゲーションによって予め修飾された、前記グラフトされた核酸（２２）の全部又は一部を、前記第１の基材（１４）又は前記第２の基材（２０）の表面から、切断によって放出するステップ、のうちの１つ以上を更に含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項19】
細胞又はオルガネラの分析を実施する方法であって、ａ）請求項１～１５のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス（１０）と、細胞又はオルガネラの調製物とを提供することと、
ｂ）任意選択で、前記細胞又はオルガネラの全て又は一部を、共通の標識核酸配列又は複数の異なる標識核酸配列と会合させることと、
ｃ）ヒドロゲルが収縮状態にある条件下で、懸濁液中の前記細胞又はオルガネラを前記マイクロ流体デバイス（１０）に注入することと、
ｄ）前記条件を修正して前記ヒドロゲルを膨潤状態に作動させ、それによって、前記マイクロ流体デバイス（１０）の第１の壁（１４）及び第２の壁（２０）、並びに膨潤状態のヒドロゲルの閉鎖パターン（１６）によって形成されるケージ内に細胞又はオルガネラを捕捉することと、
ｅ）任意選択で、捕捉された細胞若しくはオルガネラ及び／又はそれらが分泌する分子を、光学イメージングを使用して分析することと、
ｆ）任意選択で、前記マイクロ流体デバイス（１０）の第１の基材（１４）又は第２の基材（２０）の表面から、グラフトされた核酸（２２）を前記ケージ内に放出させることと、
ｇ）任意選択で、捕捉された細胞又はオルガネラを溶解させ、それによって、細胞核酸又はオルガネラ核酸を前記ケージ内に放出させることと
ｈ）前記核酸（２２）のバーコードを、放出された前記細胞又はオルガネラの核酸のいずれかと会合させ、かつ／又は核酸配列を標識し、それによって、バーコード化された核酸を形成させることと、
ｉ）前記条件を修正して前記ヒドロゲルを前記収縮状態に作動させることと、
ｊ）ｆ）において放出されない場合、前記マイクロ流体デバイス（１０）の前記第１の基材（１４）又は前記第２の基材（２０）から前記グラフトされた核酸（２２）を放出させることと、
ｋ）前記バーコード化された核酸を回収し、配列決定することと、
ｌ）任意選択で、バーコード化された配列決定データを、ｅ）で得られた光学イメージングからのデータ上にマッピングすることと、を含む、方法。
【請求項20】
前記方法が、ｅ１）前記第１の基材（１４）の表面及び／又は前記第２の基材（２０）の表面上に直接又は間接的にグラフトされたリガンドに、前記捕捉された細胞又はオルガネラにより分泌又は放出された分析物（単数又は複数）を結合させること、
ｅ２）結合した前記分析物（単数又は複数）に特異的である標識された第２のリガンド（単数又は複数）と結合させることによって、前記グラフトされたリガンドに結合した前記分析物（単数又は複数）を検出すること、を更に含む、請求項１９に記載の細胞又はオルガネラの分析を実施する方法。
【請求項21】
ステップｅ２）において、検出が、ｉ）蛍光標識された第２のリガンド（単数又は複数）により直接的に実施されるか、又は
ｉｉ）前記グラフトされたリガンドに結合している前記分析物（単数又は複数）に特異的なリガンド同定核酸で標識された第２のリガンド（単数又は複数）により間接的に実施され、前記リガンド同定核酸の配列が、前記リガンド及び前記グラフトされたリガンドに結合している前記分析物（単数又は複数）の同定を可能にし、前記核酸（２２）のバーコードと関連付けられ、それによってバーコード化された核酸を形成する、請求項２０に記載の細胞又はオルガネラの分析を実施する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物学的分析、特に細胞及び／又はオルガネラの分析のためのデバイスに関する。本発明はまた、当該デバイスの製造プロセス及び生物学的分析のためのその様々な用途に関する。
【背景技術】
【0002】
単一細胞マルチオミクス分析は、成長分野である。２０１８年の市場は３億ドルであり、２０２２年には１６億ドルになると予測されている（ＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，ＬＬＣ）。単一細胞分析は、健常組織及び罹患組織の細胞不均一性を克服するための不可欠なツールである。実際、細胞のセットの分析は、その組成の不均一性を明らかにすることができない。例えば、腫瘍は、典型的には、複数のタイプの腫瘍細胞を含み、乳がん患者由来のがん性組織は、例えば、ＨＥＲ２陽性細胞及びＨＥＲ２陰性細胞の両方を含み得、前者は、治療抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））による治療に応答し、後者は応答しない。更に、腫瘍は、典型的には、広範囲の間質及び腫瘍浸潤免疫細胞も含有する。腫瘍全体の分析は、この細分性を決して明らかにしない。
【0003】
バーコード化された次世代配列決定を使用する「オミクス」分析（ゲノム、エピゲノム及びトランスクリプトーム分析）は、現在、単一細胞スケールでハイスループットで可能である。単一細胞は区画内で単離され、細胞から放出された核酸は、各区画、したがって各細胞に固有の核酸配列バーコードで標識される。標識された核酸をプールし、次世代配列決定によって分析する。その後のバイオインフォマティクス分析は、同じ細胞からのリードが同じバーコードを有するので、リードを単一細胞に割り当てることを可能にする。同様に、表現型分析もまた現在、顕微鏡、フローサイトメトリー及びマスサイトメトリーを使用して、単一細胞スケールでハイスループットで可能である。ＣＩＴＥ－ｓｅｑは更に、細胞表面上に提示されたプロテオームのサブ画分の分析を、バーコード化次世代配列決定を介したトランスクリプトーム分析と組み合わせることを可能にする。しかしながら、バーコード化された次世代配列決定からのハイスループット単一細胞オミクスデータは、イメージングからの表現型データ上にマッピングされていない。
【0004】
今日、単一細胞についての表現型（タンパク質発現、タンパク質分泌、グリコシル化、翻訳後修飾、代謝、細胞形態、外部刺激に対する細胞応答など）及びオミクス情報の両方の取得を必要とする複雑かつ不均一な生物学的システムのより良い理解に対する強いニーズが研究及び臨床コミュティによって表されており、そしてこれは、生物学的サンプルの数千の細胞についてである。
【0005】
いくつかの研究又は臨床上の質問に答えるためには、関心のある部分集団を分析するだけでよい場合がある。配列決定されるべき細胞の数を減少させることは、稀な事象、細胞集団の複雑なセットに焦点を合わせること、又は競合的セラノスティックな目的のためのツールを提供することを可能にする。細胞の部分集団は、例えば、蛍光活性化細胞選別（fluorescence-activated cell sorting、ＦＡＣＳ）によって、又は単一細胞配列決定の前に磁気ビーズを使用して、事前に濃縮することができるが、細胞を監視し、特定の１つ又は複数の表現型を有する細胞の部分集団の単一細胞配列決定を選択的に行うことを可能にする統合システムは現在存在しない。更に、ＦＡＣＳ又は磁気ビーズを使用する予備濃縮は、少数の細胞（例えば、腫瘍生検由来）の分析にはあまり適合せず、細胞の一時的モニタリングに基づく、又は分泌分子（例えば、抗体及びサイトカイン）の検出に基づく、細胞の分類を可能にするものではない。
【0006】
［技術的現状（State of the art）］
現在のシステムは、次世代配列決定の前に、区画内の細胞を単離し、細胞から核酸を放出させ、各区画に、すなわち各細胞に固有の核酸配列バーコードでそれらを標識することを可能にする。しかしながら、現在、多数の細胞（＞１０，０００）の分析を可能にし、光学イメージングによって決定された細胞の表現型をその染色体特性（ゲノム、エピゲノム、トランスクリプトームなど）に直接結びつけることも、対象の細胞を選択してそれらを個々に配列決定することも、可能にするシステムは存在しない。
現在のシステムは、次世代配列決定の前に、区画内の細胞を単離し、細胞から核酸を放出させ、各区画に、すなわち各細胞に固有の核酸配列バーコードでそれらを標識することを可能にする。しかしながら、現在、多数の細胞（＞１０，０００）の分析を可能にし、光学イメージングによって決定された細胞の表現型をその染色体特性（ゲノム、エピゲノム、トランスクリプトームなど）に直接結びつけることも、対象の細胞を選択してそれらを個々に配列決定することも、可能にするシステムは存在しない。
【0007】
既存の技術は、以下を可能にするだけである：
１．液滴マイクロ流体工学を使用して、多数の細胞（＞１０，０００）の細胞のバーコード化された単一細胞の配列決定を実施することであって、単一細胞は、液滴のイメージング、蛍光測定又はソーティングなしで、各ビーズに固有の核酸配列バーコードを保有する単一ビーズと一緒に液滴中に区画化される、
２．バルブマイクロ流体工学を使用して、少数の細胞（≦８００）細胞の単一細胞の分析を実施することであって、単一細胞は、空気バルブによって分離された微細加工チャンバー内に区画化され、顕微鏡による時間的イメージングを伴い、続いて、特定の表現型を有する細胞の選別又は選択的配列決定を伴わずに、単一細胞の配列決定を行う（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃ１、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｐｏｌａｒｉｓ）、
３．少数の細胞（＜２，０００）の単一細胞の配列決定であって、単一細胞は、細胞のイメージング、蛍光測定又は選別を伴わずに、単一細胞の配列決定のためにマイクロプレートウェル中に区画化される。
１．液滴マイクロ流体工学を使用して、多数の細胞（＞１０，０００）の細胞のバーコード化された単一細胞の配列決定を実施することであって、単一細胞は、液滴のイメージング、蛍光測定又はソーティングなしで、各ビーズに固有の核酸配列バーコードを保有する単一ビーズと一緒に液滴中に区画化される、
２．バルブマイクロ流体工学を使用して、少数の細胞（≦８００）細胞の単一細胞の分析を実施することであって、単一細胞は、空気バルブによって分離された微細加工チャンバー内に区画化され、顕微鏡による時間的イメージングを伴い、続いて、特定の表現型を有する細胞の選別又は選択的配列決定を伴わずに、単一細胞の配列決定を行う（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃ１、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｐｏｌａｒｉｓ）、
３．少数の細胞（＜２，０００）の単一細胞の配列決定であって、単一細胞は、細胞のイメージング、蛍光測定又は選別を伴わずに、単一細胞の配列決定のためにマイクロプレートウェル中に区画化される。
【0008】
液滴マイクロ流体工学、バルブマイクロ流体工学又はマイクロプレートウェルを使用する場合、細胞の部分集団は、細胞マーカー（＜５０）、典型的には細胞表面マーカーの小パネルの蛍光標識及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づいて、又は細胞表面マーカーに対するリガンドで標識された磁気ビーズを使用して、区画化の前に予め濃縮することができる。しかしながら、分析される各細胞についての配列決定データに対する蛍光データの１対１マッピングは存在しない。しかしながら、マイクロプレートウェルを使用する場合、個々の細胞は、単一細胞配列決定の前に、オミクスデータに対する細胞の蛍光プロファイルの１対１マッピングを用いて、ＦＡＣＳによって個々のウェルに選別されることができる。更に、例えば、ＣｅｌｌｅｎＯＮＥシステム及びＢｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ ｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃｓシステムなどの他のシステムは、個々の細胞のイメージングを可能にし、その後、個々の細胞をマイクロプレートウェルに選択的に分配する。
【0009】
しかしながら、現在利用可能な技術は、配列決定によって分析される部分集団を選択する可能性を有する、＞１０，０００個の細胞の区画化後の表現型モニタリングを可能にするものではない。
【0010】
特に、現在利用可能な技術は、オミクス解析（ゲノム解析、エピゲノム解析、トランスクリプトーム解析及びプロテオミクス解析）を光学イメージングによる表現型の解析に結びつけることを可能にするものではない。
【0011】
Ｄ’Ｅｒａｍｏ Ｌ．；ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ＆Ｎａｎｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１８，４，１７０６９，ｄｏｉ：１０．１０３８は、温度応答性ヒドロゲルに基づくマイクロ流体アクチュエータを備えるマイクロ流体デバイスを教示している。しかしながら、その開示されたデバイスは、核酸アレイと組み合わせた温度応答性ヒドロゲルから構成される壁を有するケージのアレイを含まず、核酸アレイは、基材のうちの１つの上にグラフトされた複数の核酸を含み、各核酸は、基材上の核酸の位置をコードするバーコードを含む。したがって、開示されたデバイスは、バーコード化された単一細胞の配列決定のために使用することができない。
【発明の概要】
【0012】
［本発明の利点］
本発明によるマイクロ流体デバイスは、特にハイスループット（１０，０００個を超える細胞）で、かつ非常に競合的なコスト条件下で、バーコード付き次世代配列決定からの単細胞オミクスデータへの光学イメージングからの表現型データの１対１マッピングを用いて、単一又は小群の細胞の分析を可能にする。それは更に、光学イメージングからの表現型データに基づく細胞の部分集団の選択的配列決定を可能にする。
本発明によるマイクロ流体デバイスは、特にハイスループット（１０，０００個を超える細胞）で、かつ非常に競合的なコスト条件下で、バーコード付き次世代配列決定からの単細胞オミクスデータへの光学イメージングからの表現型データの１対１マッピングを用いて、単一又は小群の細胞の分析を可能にする。それは更に、光学イメージングからの表現型データに基づく細胞の部分集団の選択的配列決定を可能にする。
【0013】
特に、本発明によるマイクロ流体デバイスは、活性化可能なヒドロゲルで作製された微小区画（ケージ）内の単一細胞又はオルガネラを単離することを可能にし、単離された各細胞内に見出される細胞及び遺伝物質の可視化、標識、及び生物学的分析を可能にする。膨張性ゲルの使用は、ケージ間に生物学的シールを提供しながら、単一の細胞又はオルガネラがケージ内に配置されるように、要求に応じて、微小区画内の細胞又はオルガネラの集団を導入及び単離する能力を与える。ケージ内に固定されたバーコード化された核酸の使用は、ケージ内の細胞又はオルガネラから放出された、又はそれと会合した任意の核酸の標識（「バーコード化」）を可能にする。
【0014】
この新規な技術は、細胞溶解及び配列決定の前に、光学イメージングによる単一細胞の表現型のハイスループット分析及びモニタリングを可能にし、これは、細胞表現型（タンパク質発現、タンパク質分泌、グリコシル化、翻訳後修飾、代謝、細胞形態、外部刺激に対する細胞応答、など）の１対１マッピングを可能にする。しかしながら、本システムはまた、以下を含む多数の他の有利な特徴を有する：
－イメージングにより、実験の品質管理を可能にし、細胞をロードしたケージの割合、細胞のタイプ、細胞の生存率及び細胞溶解の効率についての情報を提供する、
－イメージングにより、バイオインフォーマティック分析中に誤った数の細胞を有するケージからの配列決定データの除外を可能にし、例えば、単一細胞を有するケージからのデータのみが保持され得る、
－本発明の一実施形態では、光学イメージングからの表現型データに基づいて同定された細胞の部分集団のみが配列決定によって分析される、
－液滴における区画化に基づくシステムとは対照的に、ケージを開放する、部分的に開放する、又は閉鎖する能力のおかげで、分析中の異なるステップにおいて試薬を追加又は除去することができ、これにより、競合する技術では現在可能でないプロトコルにおける所定のレベルの柔軟性が誘導される、
－分析はユーザフレンドリであり、完全に自動化可能である。
－イメージングにより、実験の品質管理を可能にし、細胞をロードしたケージの割合、細胞のタイプ、細胞の生存率及び細胞溶解の効率についての情報を提供する、
－イメージングにより、バイオインフォーマティック分析中に誤った数の細胞を有するケージからの配列決定データの除外を可能にし、例えば、単一細胞を有するケージからのデータのみが保持され得る、
－本発明の一実施形態では、光学イメージングからの表現型データに基づいて同定された細胞の部分集団のみが配列決定によって分析される、
－液滴における区画化に基づくシステムとは対照的に、ケージを開放する、部分的に開放する、又は閉鎖する能力のおかげで、分析中の異なるステップにおいて試薬を追加又は除去することができ、これにより、競合する技術では現在可能でないプロトコルにおける所定のレベルの柔軟性が誘導される、
－分析はユーザフレンドリであり、完全に自動化可能である。
【0015】
イメージングによる単一細胞のオミクス解析と表現型解析とを組み合わせることにより、バイオシステムの複雑さをよりよく理解することができる。本発明はまた、患者のより正確な診断及び層別化、並びにより良好なセラノスティック精度を可能にする。
【0016】
［発明の概要］
本発明は、マイクロ流体デバイスに関し、マイクロ流体デバイスは、
－複数の閉鎖パターンが上にグラフトされた第１の基材を含む第１の壁と、
－第１の壁に対向し、第２の基材を含む第２の壁と、
－第１の基材又は第２の基材のいずれかの上にグラフトされた複数の核酸であって、各核酸が、当該第１又は第２の基材上の核酸の位置をコードするバーコードを含む、複数の核酸と、を含み、
少なくとも複数の閉鎖パターン又は第２の基材は、収縮状態と、閉鎖パターン及び第２の基材が接触した膨潤状態との間で膨潤可能である作動可能なヒドロゲルで作製されている。
本発明は、マイクロ流体デバイスに関し、マイクロ流体デバイスは、
－複数の閉鎖パターンが上にグラフトされた第１の基材を含む第１の壁と、
－第１の壁に対向し、第２の基材を含む第２の壁と、
－第１の基材又は第２の基材のいずれかの上にグラフトされた複数の核酸であって、各核酸が、当該第１又は第２の基材上の核酸の位置をコードするバーコードを含む、複数の核酸と、を含み、
少なくとも複数の閉鎖パターン又は第２の基材は、収縮状態と、閉鎖パターン及び第２の基材が接触した膨潤状態との間で膨潤可能である作動可能なヒドロゲルで作製されている。
【0017】
本発明は更に、本発明によるデバイスの製造方法に関し、当該方法は、
１）第１の基材を提供することと、
２）当該第１の基材の表面上に複数の閉鎖パターンをグラフトすることと、
３）第２の基材を提供することと、
４）第１の基材の表面上又は第２の基材の表面上のいずれかに複数の核酸をグラフトすることであって、各核酸が、当該第１又は第２の基材上の核酸の位置をコードするバーコードを含む、グラフトすることと、
５）第１の基材と第２の基材との間に閉鎖パターン及び核酸を配置することによって、第１の基材と第２の基材とを位置決めすることと、
６）第１及び第２の基材を結合することと、を含む。
１）第１の基材を提供することと、
２）当該第１の基材の表面上に複数の閉鎖パターンをグラフトすることと、
３）第２の基材を提供することと、
４）第１の基材の表面上又は第２の基材の表面上のいずれかに複数の核酸をグラフトすることであって、各核酸が、当該第１又は第２の基材上の核酸の位置をコードするバーコードを含む、グラフトすることと、
５）第１の基材と第２の基材との間に閉鎖パターン及び核酸を配置することによって、第１の基材と第２の基材とを位置決めすることと、
６）第１及び第２の基材を結合することと、を含む。
【0018】
本発明は更に、細胞又はオルガネラの分析を実施する方法に関し、方法は、
ａ）本発明によるマイクロ流体デバイス、及び細胞又はオルガネラの調製物を提供することと、
ｂ）任意選択で、細胞又はオルガネラの全て又は一部を、共通の標識核酸配列又は複数の異なる標識核酸配列と会合させることと、
ｃ）ヒドロゲルが収縮状態にある条件下で、懸濁液中の細胞又はオルガネラをマイクロ流体デバイスに注入することと、
ｄ）条件を修正してヒドロゲルを膨潤状態に作動させ、それによって、マイクロ流体デバイスの第１の壁及び第２の壁、並びに膨潤状態のヒドロゲルの閉鎖パターンによって形成されるケージ内に細胞又はオルガネラを捕捉することと、
ｅ）任意選択で、捕捉された細胞若しくはオルガネラ及び／又はそれらが分泌する分子を、光学イメージングを使用して分析することと、
ｆ）任意選択で、マイクロ流体デバイスの第１又は第２の基材の表面から、グラフトされた核酸をケージ内に放出させることと、
ｇ）任意選択で、捕捉された細胞又はオルガネラを溶解させ、それによって、細胞核酸又はオルガネラ核酸をケージ内に放出させることと、
ｈ）核酸のバーコードを、放出された細胞核酸若しくはオルガネラ核酸のいずれかと会合させ、かつ／又は核酸配列を標識し、それによって、バーコード化された核酸を形成させることと、
ｉ）条件を修正してヒドロゲルを収縮状態に作動させることと、
ｊ）ｆ）において放出されない場合、マイクロ流体デバイスの第１又は第２の基材からグラフトされた核酸を放出させることと、
ｋ）バーコード化された核酸を回収し、配列決定することと、を含む。
ａ）本発明によるマイクロ流体デバイス、及び細胞又はオルガネラの調製物を提供することと、
ｂ）任意選択で、細胞又はオルガネラの全て又は一部を、共通の標識核酸配列又は複数の異なる標識核酸配列と会合させることと、
ｃ）ヒドロゲルが収縮状態にある条件下で、懸濁液中の細胞又はオルガネラをマイクロ流体デバイスに注入することと、
ｄ）条件を修正してヒドロゲルを膨潤状態に作動させ、それによって、マイクロ流体デバイスの第１の壁及び第２の壁、並びに膨潤状態のヒドロゲルの閉鎖パターンによって形成されるケージ内に細胞又はオルガネラを捕捉することと、
ｅ）任意選択で、捕捉された細胞若しくはオルガネラ及び／又はそれらが分泌する分子を、光学イメージングを使用して分析することと、
ｆ）任意選択で、マイクロ流体デバイスの第１又は第２の基材の表面から、グラフトされた核酸をケージ内に放出させることと、
ｇ）任意選択で、捕捉された細胞又はオルガネラを溶解させ、それによって、細胞核酸又はオルガネラ核酸をケージ内に放出させることと、
ｈ）核酸のバーコードを、放出された細胞核酸若しくはオルガネラ核酸のいずれかと会合させ、かつ／又は核酸配列を標識し、それによって、バーコード化された核酸を形成させることと、
ｉ）条件を修正してヒドロゲルを収縮状態に作動させることと、
ｊ）ｆ）において放出されない場合、マイクロ流体デバイスの第１又は第２の基材からグラフトされた核酸を放出させることと、
ｋ）バーコード化された核酸を回収し、配列決定することと、を含む。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明は、第１に、マイクロ流体デバイスに関し、マイクロ流体デバイスは、
－複数の閉鎖パターンが上にグラフトされた第１の基材を含む第１の壁と、
－第１の壁に対向し、第２の基材を含む第２の壁と、
－第１の基材又は第２の基材のいずれかの上にグラフトされた複数の核酸であって、各核酸が、当該第１又は第２の基材上の核酸の位置をコードするバーコードを含む、複数の核酸と、を含み、
少なくとも複数の閉鎖パターン又は第２の基材は、収縮状態と、閉鎖パターン及び第２の基材が接触した膨潤状態との間で膨潤可能である作動可能なヒドロゲルで作製されている。
－複数の閉鎖パターンが上にグラフトされた第１の基材を含む第１の壁と、
－第１の壁に対向し、第２の基材を含む第２の壁と、
－第１の基材又は第２の基材のいずれかの上にグラフトされた複数の核酸であって、各核酸が、当該第１又は第２の基材上の核酸の位置をコードするバーコードを含む、複数の核酸と、を含み、
少なくとも複数の閉鎖パターン又は第２の基材は、収縮状態と、閉鎖パターン及び第２の基材が接触した膨潤状態との間で膨潤可能である作動可能なヒドロゲルで作製されている。
【0020】
本発明はまた、上記で定義したマイクロ流体デバイスの製造方法に関する。
【0021】
本発明は更に、上記で定義したマイクロ流体デバイスを使用することによって、生物学的分析、特に細胞又はオルガネラ分析を実施する方法に関する。
【0022】
以下に詳述される全ての実施形態及び優先的な特徴は、本発明の全ての目的、特にデバイス、製造プロセス、及びその異なる用途に独立して適用される。
【0023】
デバイス
膨潤状態では、閉鎖パターンとデバイスの第２の基材とが接触している。したがって、デバイスは複数のケージを備え、各ケージは、閉鎖パターンで作製された側壁と、第１及び第２の基材から構成される端壁とによって画定される。
膨潤状態では、閉鎖パターンとデバイスの第２の基材とが接触している。したがって、デバイスは複数のケージを備え、各ケージは、閉鎖パターンで作製された側壁と、第１及び第２の基材から構成される端壁とによって画定される。
【0024】
収縮状態では、閉鎖パターンと第２の基材とはもはや接触していない。閉鎖パターンと第２の基材との間の間隙は、流体及び細胞がデバイス内を自由に循環することを可能にする。
【0025】
収縮状態と膨潤状態との間で、本発明によるデバイスは、作動可能なヒドロゲルが部分的にしか膨潤していない多数の中間状態を経る。これらの構成では、閉鎖パターンと第２の基材との間に間隙が依然として存在する。しかしながら、間隙の高さは、ケージ内に捕捉された細胞がケージ内に保持されるように、収縮状態に対して十分に低減される。これらの中間構成は、典型的には、細胞ではなく流体の選択的通過を可能にするために使用され得る。
【0026】
したがって、各閉鎖パターンは、閉鎖及び開放が外部刺激によって開始される、細胞の捕捉部位を画定する。好ましい実施形態において、外部刺激は、ｐＨ、光強度、温度又は電流強度の変化である。非常に好ましい実施形態では、外部刺激は温度変化である。
【0027】
マイクロ流体デバイスは、少なくとも２つの閉鎖パターンを含む。好ましくは、マイクロ流体デバイスは、多数の閉鎖パターン、典型的には１００、１，０００、１０，０００、１００，０００・・・のそれを含む。
【0028】
第１の壁及び第２の壁は、－２０℃～１００℃の範囲の温度変動に耐えることができる剛性材料で作製されている。第１の実施形態によれば、壁（第１の壁及び／又は第２の壁）は、特有の均質な材料で作製されている。したがって、壁は基材からなる。
【0029】
第２の実施形態によれば、壁は、基材が上に固定／コーティングされた支持材料を更に含む。典型的には、壁は、基材層でコーティングされたガラス又はポリジメチルシロキサンで作製された支持材料からなる。
【0030】
本発明によるデバイスは、等価的に、２つの単層壁、２つの多層壁、又は１つの単層壁及び１つの多層壁を含み得る。
【0031】
第１の基材は、典型的には、シリコン、石英、ガラス、ポリジメチルシロキサン、環状オレフィンコポリマー及びポリカーボネートなどの熱可塑性物質から、好ましくはガラス及びポリジメチルシロキサンから選択される材料から作製されている。
【0032】
好ましくは、第１の基材はポリジメチルシロキサンで作製されている。
【0033】
一実施形態によれば、第１の基材の表面の少なくとも一部は、構造化及び／又は官能化される。
【0034】
「構造化される」とは、本発明の文脈において、基材の表面が不規則であることを意味する。基材の表面は多孔質であってもよく、微視的に構造化されていてもよい。特に、それは、微視的な縞、柱などを含むことができる。
【0035】
基材の構造化は、任意の既知のプロセスに従って実施され得る。例えば、十分に確立されている標準的なソフトリソグラフィ技術を挙げることができる。
【0036】
「官能化される」とは、本発明の文脈において、基材の表面上に化学官能基を固定することを意味する。典型的には、第１の基材の表面は、ヒドロキシド基、シラノール基及びこれらの混合物から選択される化学基、好ましくはシラノール基で官能化される。
【0037】
基材の構造化及び／又は官能化は、閉鎖パターン及び／又は核酸のそれらの表面上へのグラフトを促進することを可能にする。
【0038】
好ましい実施形態によれば、第１の壁は、構造化及び／又は官能化されたポリジメチルシロキサン基材、好ましくは構造化及び官能化されたポリジメチルシロキサン基材から作製されている。
【0039】
閉鎖パターンは、多種多様な形状を有し得る。好ましくは、閉鎖パターンは長方形、正方形、円形又は六角形である。
【0040】
好ましくは、閉鎖パターンは、第１の基材に共有結合的にグラフトされる。
【0041】
特定の実施形態によれば、第２の基材はヒドロゲルで作製され、閉鎖パターンは非膨潤性材料で作製されている。
【0042】
好ましくは、この特定の実施形態によれば、第２の壁は、膨潤性ヒドロゲルが上に堆積された非膨潤性支持材料を含む。
【0043】
非膨潤性支持材料は、構造化及び／又は官能化されてもよい。非膨潤性材料の構造化及び／又は官能化は、第１の基材に関連して上述したものと同様になされる。
【0044】
したがって、この実施形態によれば、閉鎖パターンは非膨潤性であり、ケージの閉鎖を可能にするのは第２の基材の膨潤である。
【0045】
好ましくは、この実施形態によれば、閉鎖パターンは、シリコン、石英、ガラス、ポリジメチルシロキサン、環状オレフィンコポリマー及びポリカーボネートなどの熱可塑性材料から、好ましくはガラス又はポリジメチルシロキサンから選択される材料から作製されている。
【0046】
好ましくは、閉鎖パターンは、０．１μｍ～１００μｍ、好ましくは１μｍ～３０μｍの範囲の高さを有する。
【0047】
好ましくは、閉鎖パターンの壁は、０．１～５００μｍ、好ましくは１μｍ～２０μｍの範囲の厚さを有する。
【0048】
有利には、この実施形態によれば、第２の基材は、閉鎖パターンと接触する膨潤状態で測定して、１μｍ～５００μｍ、好ましくは１μｍ～１００μｍの範囲の厚さを有する。
【0049】
有利には、更にこの実施形態によれば、ヒドロゲルを含む第２の基材は、乾燥状態で測定して、０．５μｍ～１５０μｍ、好ましくは０．５μｍ～５０μｍの範囲の厚さを有する。
【0050】
好ましい実施形態によれば、閉鎖パターンはヒドロゲルで作製され、第２の基材は非膨潤性材料で作製されている。
【0051】
したがって、この実施形態によれば、第２の基材は非膨潤性であり、閉鎖パターンは膨潤してケージを閉鎖する。
【0052】
好ましくは、この好ましい実施形態によれば、第２の基材は、シリコン、石英、ガラス、ポリジメチルシロキサン、環状オレフィンコポリマー及びポリカーボネートなどの熱可塑性物質から、好ましくはガラス又はポリジメチルシロキサンから選択される材料から作製されている。有利には、ヒドロゲルパターンは、ヒドロゲルパターンが第２の壁と接触しているときの膨潤状態で測定して、０．１μｍ～５００μｍ、好ましくは１μｍ～２５０μｍ、より好ましくは１μｍ～１００μｍの範囲の高さを有する。
【0053】
有利には、ヒドロゲルパターンは、乾燥状態で測定して、０．１μｍ～１５０μｍ、好ましくは０．５μｍ～１００μｍ、より好ましくは０．５μｍ～５０μｍの範囲の高さを有する。
【0054】
好ましくは、ヒドロゲルパターンの壁は、ヒドロゲルパターンが第２の壁と接触しているときの膨潤状態で測定して、０．１μｍ～１００μｍ、好ましくは１μｍ～１０μｍの範囲の解像度を有する。
【0055】
好ましくは、ヒドロゲルパターンの壁は、乾燥状態で測定して、０．１μｍ～１００μｍ、好ましくは０．５μｍ～５μｍの範囲の解像度を有する。
【0056】
「ヒドロゲル」とは、本発明の文脈において、水性媒体、特に水中に置かれた場合に、特定の物理的及び／又は化学的条件下で、当該水相を吸収及び保持することによって膨潤するポリマー材料を指す。
【0057】
「ヒドロゲル」とは、ゲルの文脈において、特定の物理化学的条件下で、水の存在下で膨潤することができる三次元網目構造を形成するポリマーマトリックスを指す。特に、ヒドロゲルの膨潤は、熱的、光学的、化学的又は電気的刺激によって開始及び／又は調節され得る。
【0058】
例えば、ヒドロゲルの膨潤（又は収縮）は、それが配置される媒体の温度、圧力又はｐＨ値の変化によって開始及び／又は調節され得る。
【0059】
好ましくは、ヒドロゲルは温度応答性膨潤性ヒドロゲルである。「温度応答性膨潤性ヒドロゲル」とは、本発明の文脈において、温度を変化させることによって膨潤又は収縮が誘導されるヒドロゲルを指す。温度応答性膨潤性ヒドロゲルは、典型的には、温度に伴う水溶解度の劇的な変化を示す。
【0060】
特定の温度範囲において、ヒドロゲルは水溶性であり、大量の水を吸収する。
【0061】
逆に、媒体の温度を変化させることによって、ヒドロゲルはもはや水溶性ではなくなる。次いで、ヒドロゲルは水を放出し、収縮する。
【0062】
「膨潤状態」とは、本発明の文脈において、閉鎖パターン及び第２の基材が、デバイスが複数の気密封止ケージを含むように接触しているヒドロゲルの状態を指す。
【0063】
「収縮状態」とは、本発明の文脈において、閉鎖パターン及び第２の基材が接触していないヒドロゲルの状態であって、閉鎖パターンと第２の基材との間の間隙が存在し、マイクロ流体デバイス内部の流体及び細胞の自由な循環を可能にする状態を指す。「収縮状態」は、ヒドロゲルが完全に水を含まないわけではないという点で、以下に定義する「乾燥状態」とは異なる。収縮状態では、ヒドロゲルは依然として少なくとも部分的に水和されている。
【0064】
「乾燥状態」とは、本発明の文脈において、ヒドロゲルがほぼ完全に水を含まない状態を指す。典型的には、ヒドロゲルは、マイクロ流体デバイスの製造中、特にヒドロゲルパターンのグラフト中のヒドロゲル基材による第２の壁のコーティング中、乾燥状態にある。
【0065】
ヒドロゲルの水溶性特性が劇的に変化する温度は、臨界溶液温度（critical solution temperature、ＣＳＴ）として示される。
【0066】
好ましくは、ヒドロゲルは、４℃～９８℃、より好ましくは２０℃～５０℃、更により好ましくは２５℃～４０℃の範囲の臨界溶液温度（ＣＳＴ）を有する。
【0067】
第１の変形形態によれば、ヒドロゲルの臨界溶液温度（ＣＳＴ）は、下限臨界溶液温度（lower critical solution temperature、ＬＣＳＴ）である。ＬＳＣＴより高い温度では、ヒドロゲルは収縮状態にあり、ＬＣＳＴより低い温度では、ヒドロゲルは膨潤状態にある。
【0068】
第２の変形形態によれば、ヒドロゲルの臨界溶液温度（ＣＳＴ）は、上限臨界溶液温度（upper critical solution temperature、ＵＣＳＴ）である。ＵＣＳＴより高い温度では、ヒドロゲルは膨潤状態にあり、ＵＳＣＴより低い温度では、ヒドロゲルは収縮状態にある。
【0069】
ヒドロゲルのポリマーマトリックスを構成するポリマーは、典型的には、アクリル酸、アルキル（メタ）アクリレート、アルキル（メタ）アクリルアミド、オリゴエチレン（メタ）アクリレート、スルホベタイン（メタ）アクリレート及びＮ－アクリロイルグリシンアミドのホモポリマー、コポリマー及びターポリマーから選択され、好ましくはアルキル（メタ）アクリルアミドのホモポリマー、コポリマー及びターポリマー並びにそれらの任意の混合物から選択され、より好ましくは、ヒドロゲルはポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）を含む。
【0070】
ポリマーは、ＬＣＳＴポリマー、ＵＣＳＴポリマー及びこれらの混合物から選択され得る。
【0071】
ヒドロゲルの文脈において上で述べたものと同様に、
－「ＬＣＳＴポリマー」という表現は、下限臨界溶液温度を有する熱応答性ポリマーを示し、
－「ＵＣＳＴポリマー」という表現は、上限臨界溶液温度を有する熱応答性ポリマーを示す。
－「ＬＣＳＴポリマー」という表現は、下限臨界溶液温度を有する熱応答性ポリマーを示し、
－「ＵＣＳＴポリマー」という表現は、上限臨界溶液温度を有する熱応答性ポリマーを示す。
【0072】
ヒドロゲルの全体的な挙動（ＵＣＳＴ及び／又はＬＣＳＴ挙動）は、ヒドロゲル中に存在する異なるポリマーの性質及び量に依存する。
【0073】
ポリマーがＵＣＳＴポリマーから選択される場合、それは好ましくは、アクリル、アルキル（メタ）アクリレート、アルキル（メタ）アクリルアミド、オリゴエチレン（メタ）アクリレート、スルホベタイン（メタ）アクリレート、Ｎ－アクリロイルグリシンアミド及びそれらの混合物のホモポリマー、コポリマー及びターポリマーから選択される。
【0074】
好ましくは、ＵＣＳＴポリマーは、メタクリルアミド、アクリルアミド及びアリルメタクリレートのターポリマーである。
【0075】
ポリマーがＬＣＳＴポリマーから選択される場合、それは、好ましくはアクリル、アルキル（メタ）アクリレート、アルキル（メタ）アクリルアミド、オリゴエチレン（メタ）アクリレート及びそれらの混合物のホモポリマー、コポリマー及びターポリマーから、より好ましくはアルキル（メタ）アクリルアミドのホモポリマー、コポリマー及びターポリマーから選択され、より好ましくはＬＣＳＴポリマーはポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）である。
【0076】
好ましくは、ＬＣＳＴポリマーはポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）である。
【0077】
有利には、ポリマーは、１つ又はいくつかのＵＣＳＴ又はＬＣＳＴポリマーを含み、好ましくはそれらからなる。
【0078】
有利には、マイクロ流体デバイスは、デバイスへの反応物の導入及び除去をそれぞれ可能にする少なくとも１つの入口及び少なくとも１つの出口を更に含む。
【0079】
好ましくは、加熱手段が本発明によるデバイスに組み込まれる。
【0080】
一実施形態によれば、各ケージは独立した加熱手段を含む。この実施形態は、各ケージを独立して開閉することができる点で特に有利である。
【0081】
例えば、局所加熱手段は、光で照射されると熱くなる（プラズモン効果）ナノ粒子から構成され得る。ナノ粒子は、例えば、ヒドロゲルと、それが上にコーティングされる壁との間に堆積され得、又はヒドロゲルのポリマーマトリックス中に分散され得る。好ましくは、ナノ粒子は、金属ナノ粒子及びプラズモンナノ粒子から選択され、好ましくは金、グラフェン、銀、銅及び窒化チタンを含む。
【0082】
別の例では、局所加熱はマイクロ抵抗器を使用して実施される。例えば、クロム／金二重層又はＴｉＯ２構造を含むマイクロ抵抗器である。
【0083】
マイクロ流体デバイスは、第１の基材又は第２の基材のいずれかの上にグラフトされた複数の核酸を更に含み、各核酸は、当該第１又は第２の基材上の核酸の位置をコードする配列バーコードを含む。
【0084】
有利には、核酸は、ヒドロゲルが膨潤状態にあるときにケージの内側に配置されるようにグラフトされる。
【0085】
より有利には、核酸は、閉鎖パターンの内側の第１の基材上、又は閉鎖パターンの反対側の第２の基材上のいずれかにグラフトされる。
【0086】
好ましくは、閉鎖パターンがヒドロゲルから作製されているとき、核酸は、第２の基材の表面上にグラフトされる。好ましくは、第２の基材がヒドロゲルから作製されているとき、核酸は、第１の基材の表面上にグラフトされる。
【0087】
グラフトされた核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡ、好ましくはＤＮＡである。グラフトされた核酸は、一本鎖、二本鎖又は部分的に二本鎖であり得る。
【0088】
グラフトされた核酸は、好ましくは６０～１００ヌクレオチド長である。
【0089】
グラフトされた核酸は、３’末端又は５’末端において、直接的に、又はリンカーによってのいずれかで、基材に結合され得る。
【0090】
一実施形態によれば、同じバーコードを共有するグラフトされた核酸は、複数の配列を有する。別の実施形態によれば、同じバーコードを共有するグラフトされた核酸は、同じ配列を有する。
【0091】
一実施形態によれば、グラフトされた核酸の全て又は一部は、別の核酸又は複数の核酸にハイブリダイズされ、部分的又は完全な二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ、又は二本鎖ＲＮＡを形成する。
【0092】
一実施形態によれば、グラフトされた核酸は、以下の配列のうちの１つ又は任意の組み合わせを含む：
１）核酸放出のための制限部位又は光切断可能部位、
２）更なる増幅のための増幅プライマーに相補的な配列、
３）更なるインビトロ転写（in vitro transcription、ＩＶＴ）のためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、
４）核酸標識のためのハイブリダイゼーション部位、核酸標識のためのライゲーション部位、又は核酸標識のための組換え部位、及び
５）ユニーク分子識別子（unique molecular identifier、ＵＭＩ）として機能するランダム化ヌクレオチド残基の配列。
１）核酸放出のための制限部位又は光切断可能部位、
２）更なる増幅のための増幅プライマーに相補的な配列、
３）更なるインビトロ転写（in vitro transcription、ＩＶＴ）のためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、
４）核酸標識のためのハイブリダイゼーション部位、核酸標識のためのライゲーション部位、又は核酸標識のための組換え部位、及び
５）ユニーク分子識別子（unique molecular identifier、ＵＭＩ）として機能するランダム化ヌクレオチド残基の配列。
【0093】
好ましくは、グラフトされた核酸は、少なくとも、ｉ）当該第１又は第２の基材上の核酸の位置をコードする配列バーコード、及びｉｉ）制限部位又は光切断可能部位、及び任意選択で更にｉｉｉ）プライマー配列、及び／又はＴ７配列及び／又はハイブリダイゼーション、ライゲーション又は組換え部位、を含む。
【0094】
一実施形態によれば、マイクロ流体デバイスのグラフトされた核酸は、定常配列、すなわち全てのグラフトされた核酸中に存在する配列を含む。マイクロ流体デバイスのグラフトされた核酸は、グラフトされた核酸の定常配列の全部又は一部に相補的な配列を含むＤＮＡにハイブリダイズし得る。定常配列の全部又は一部に相補的な配列を含む１つ又は複数の異なるＤＮＡを、グラフトされた核酸にハイブリダイズさせ得る。
【0095】
本発明によるマイクロ流体デバイスは、細胞又はオルガネラを捕捉することができる構造を更に含み得る。そのような構造は、典型的には、Ｖｉｇｎｅｓｗａｒａｎ Ｎ．ｅｔ ａｌ，２０１７，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｒａｐｐｉｎｇ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｎａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，９，３７５１－３７７２などの刊行物の記載から選択される。
【0096】
好ましくは、細胞又はオルガネラを捕捉することができる構造は、閉鎖パターンの内側の第１の基材上又は閉鎖パターンの反対側の第２の基材上のいずれかに局在化される。
【0097】
好ましくは、各ケージは、細胞又はオルガネラを捕捉することができる少なくとも１つの構造を含む。
【0098】
特定の実施形態によれば、複数のリガンドが、閉鎖パターンの反対側の第１の基材（１４）上及び／又は第２の基材（２０）上に、直接的又は間接的に、共有結合的又は非共有結合的にグラフトされる。
【0099】
有利には、リガンドは、ヒドロゲルが膨潤状態にあるときにケージの内側に配置されるようにグラフトされる。
【0100】
特に、第１の基材（１４）上にグラフトされる場合、リガンドは、典型的には、閉鎖パターン（１６）の内側にグラフトされる。
【0101】
あるいは、第２の基材（２０）上にグラフトされる場合、リガンドは閉鎖パターンに対向している。
【0102】
リガンドは全て同じ基材上にグラフトされてもよい。あるいは、リガンドのいくつかは第１の基材（１４）上にグラフトされ、他は第２の基材（２０）上にグラフトされる。
【0103】
好ましくは、第１の基材（１４）又は第２の基材（２０）上に直接グラフトされるとき、複数のリガンドは、第１の基材（１４）又は第２の基材（２０）上に共有結合的にグラフトされる。
【0104】
より具体的な実施形態によれば、複数のリガンドは間接的にグラフトされ、すなわち、複数のリガンドが中間構造にグラフトされ、当該中間構造が第１の基材（１４）又は第２の基材（２０）上に直接グラフトされる。したがって、この特定の実施形態によれば、複数のリガンドと基材（１４、２０）との間に直接的な結合はない。
【0105】
好ましくは、第１の基材（１４）又は第２の基材（２０）上に間接的にグラフトされるとき、複数のリガンドは、第１の基材（１４）又は第２の基材（２０）上に非共有結合的にグラフトされる。
【0106】
第１の例によれば、複数のリガンドは、核酸とコンジュゲートされ、グラフトされた核酸（２２）の少なくとも一部へのハイブリダイゼーションによって会合される。
【0107】
別の例によれば、複数のリガンドは、第１の基材（１４）又は第２の基材（２０）上に予めコーティングされた接着コーティングに非共有結合的にグラフトされる。接着コーティングとして、特にストレプトアビジンコーティングを挙げることができる。
【0108】
これらの実施形態において、好ましくは、各リガンドは、独立して、抗体、抗体断片、レクチン、及びアプタマーからなる群から選択される。
【0109】
リガンドは、通常、マイクロ流体デバイス（１０）の第１の壁（１４）及び第２の壁（２０）によって形成されたケージ内に捕捉された細胞又はオルガネラの溶解によって分泌又は放出された１つ又は複数の分析物、並びに膨潤状態のヒドロゲルの閉鎖パターン（１６）に結合するように選択される。
【0110】
製造プロセス
本発明はまた、上記で定義したマイクロ流体デバイスの製造方法に関する。
本発明はまた、上記で定義したマイクロ流体デバイスの製造方法に関する。
【0111】
好ましくは、製造方法は、以下のステップを含む：
１）第１の基材を提供するステップ、
２）当該第１の基材の表面上に複数の閉鎖パターンをグラフトするステップ、
３）第２の基材を提供するステップ、
４）第１の基材の表面上又は第２の基材の表面上のいずれかに複数の核酸をグラフトするステップであって、各核酸が、当該第１又は第２の基材上の核酸の位置をコードするバーコードを含む、グラフトするステップ、
５）第１の基材と第２の基材との間に閉鎖パターン及び核酸を配置することによって、第１の基材と第２の基材とを位置決めするステップ、
６）第１及び第２の基材を結合するステップ。
１）第１の基材を提供するステップ、
２）当該第１の基材の表面上に複数の閉鎖パターンをグラフトするステップ、
３）第２の基材を提供するステップ、
４）第１の基材の表面上又は第２の基材の表面上のいずれかに複数の核酸をグラフトするステップであって、各核酸が、当該第１又は第２の基材上の核酸の位置をコードするバーコードを含む、グラフトするステップ、
５）第１の基材と第２の基材との間に閉鎖パターン及び核酸を配置することによって、第１の基材と第２の基材とを位置決めするステップ、
６）第１及び第２の基材を結合するステップ。
【0112】
閉鎖パターンのグラフトは、任意の既知のプロセスに従って実施され得る。
【0113】
閉鎖パターンが非膨潤性材料で作製されているとき、閉鎖パターンのグラフトは、典型的には、ソフトリソグラフィ技術によって実施される。
【0114】
特定の実施形態によれば、第１の基材及び閉鎖パターンは、１つのユニークなステップで一緒に調製される。
【0115】
閉鎖パターンがヒドロゲルから作製されているとき、閉鎖パターンのグラフトは、典型的には、好ましくはＵＶ（紫外線）放射下で、フォトパターニングによって実施される。フォトパターニング法は、第１の基材上へのヒドロゲルのポリマーマトリックスの表面グラフトと、同時のヒドロゲルのポリマーマトリックスの架橋とにある。
【0116】
好ましくは、ポリマーは共有結合的に架橋される。
【0117】
より好ましくは、ポリマーの架橋は、例えばジチオエリスリオールなどのジチオール分子から選択される架橋剤の存在下でなされる。
【0118】
ヒドロゲルのパターニングは、典型的には、標準的なフォトリソグラフィ技術によって、又は直接レーザ書き込みデバイスを用いて実施される。
【0119】
これらの技術は、特に、Ｃｈｏｌｌｅｔ，Ｂ．，Ｄ’Ｅｒａｍｏ，Ｌ．，Ｍａｒｔｗｏｎｇ，Ｅ．，Ｌｉ，Ｍ．，Ｍａｃｒｏｎ，Ｊ．，Ｍａｉ，Ｔ．Ｑ．，Ｔａｂｅｌｉｎｇ，Ｐ．ａｎｄ Ｔｒａｎ，Ｙ．，２０１６．Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ－ａｔｔａｃｈｅｄ ｍｕｌｔｉｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎｅｔｗｏｒｋｓ．ＡＣＳ ａｐｐｌｉｅｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ＆ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，８（３７），ｐｐ．２４８７０－２４８７９に開示されている。
【0120】
核酸のグラフトは、典型的には、それぞれＤｅＲｉｓｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｕｓｅ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｔｏ ａｎａｌｙｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ １４，４５７－４６０（１９９６）、及びＦｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｌｉｇｈｔ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ，ｓｐａｔｉａｌｌｙ ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（８０－．）．２５１，７６７－７７３（１９９１）に詳述されているスポッティング又はインサイチュー光特異的合成により実施される。
【0121】
有利には、ステップ５）の間、第１及び第２の基材は、ヒドロゲルが膨潤状態にあるとき、核酸がケージの内側にあることを可能にするように配置される。
【0122】
より有利には、核酸は、閉鎖パターンの内側の第１の基材上、又は閉鎖パターンの反対側の第２の基材上のいずれかにグラフトされる。
【0123】
結合ステップは、任意の公知の方法に従って実施され得る。
【0124】
第１の実施形態によれば、結合ステップは、酸素プラズマ処理によって実施される。
【0125】
好ましくは、酸素プラズマ処理は、室温で、典型的には５℃～５０℃、より好ましくは１０℃～４０℃、更により好ましくは１５℃～３０℃の範囲の温度で実施される。
【0126】
好ましくは、酸素プラズマ処理の持続時間は、１０秒～２分、より好ましくは３０秒～１分の範囲である。
【0127】
好ましくは、この第１の実施形態によれば、本方法は、ステップ６）の前に、酸素プラズマへの曝露中に核酸を保護することができるマスクを核酸上に堆積させる調製ステップを更に含む。
【0128】
マスクは、典型的には接着テープで作製され、好ましくはプラスチックフィルム、紙、布、発泡体、又は接着剤でコーティングされた箔から選択される材料で作製されている。
【0129】
マスクは、プラズマ処理の後、典型的には剥離によって最終的に除去される。
【0130】
第２の実施形態によれば、結合ステップは、デバイスの表面上に圧力を加えることによって実施される。
【0131】
好ましくは、この実施形態によれば、デバイスの表面上への圧力は、主要設計を取り囲む外部マイクロ流体チャネル内に負圧を印加することによって実施される。
【0132】
第３の実施形態によれば、結合ステップは、少なくとも１種のポリマー及び任意選択で少なくとも１種の架橋剤を含む架橋性組成物を使用することによって実施される。
【0133】
この第３の実施形態によれば、結合ステップは以下のように実施される：
ａ）第１の壁と第２の壁とを合わせる、
ｂ）少なくとも１つのポリマー及び少なくとも１つの架橋剤を含む組成物の層を、２つの壁の間に堆積させて、第１の壁と第２の壁との間の間隙を充填する、
ｃ）少なくとも１種のポリマーを架橋、好ましくは自己架橋させる。
ａ）第１の壁と第２の壁とを合わせる、
ｂ）少なくとも１つのポリマー及び少なくとも１つの架橋剤を含む組成物の層を、２つの壁の間に堆積させて、第１の壁と第２の壁との間の間隙を充填する、
ｃ）少なくとも１種のポリマーを架橋、好ましくは自己架橋させる。
【0134】
好ましくは、ポリマーはポリエポキシドの中から選択される。
【0135】
本プロセスは、更に以下を含み得る：
－ステップ１）とステップ２）との間の、第１の基材の表面を構造化及び／又は官能化する中間ステップ、及び／又は
－ステップ３）とステップ４）との間の、第２の基材の表面を構造化及び／又は官能化する中間ステップ。
－ステップ１）とステップ２）との間の、第１の基材の表面を構造化及び／又は官能化する中間ステップ、及び／又は
－ステップ３）とステップ４）との間の、第２の基材の表面を構造化及び／又は官能化する中間ステップ。
【0136】
基材がヒドロゲルから作製されているとき、基材の官能化は、典型的には、Ｃｈｏｌｌｅｔ，Ｂ．Ｄ’ｅｒａｍｏ，Ｌ．，Ｍａｒｔｗｏｎｇ，Ｅ．，Ｌｉ，Ｍ．，Ｍａｃｒｏｎ，Ｊ．，Ｍａｉ，Ｔ．Ｑ．，Ｔａｂｅｌｉｎｇ，Ｐ．ａｎｄ Ｔｒａｎ，Ｙ．，２０１６．Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ－ａｔｔａｃｈｅｄ ｍｕｌｔｉｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎｅｔｗｏｒｋｓ．ＡＣＳ ａｐｐｌｉｅｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ＆ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，８（３７），ｐｐ．２４８７０－２４８７９に開示されているプロトコルに従うことによって実施され得る。
【0137】
構造体がヒドロゲルから作製されていないとき、官能化は、典型的には、Ｂｅａｌ，Ｊｏｈｎ Ｈ Ｌ ｅｔ ａｌ．「Ａ ｒａｐｉｄ，ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｈａｎｎｅｌｓ．」Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｖｏｌ．６，３ ３６５０３．３０ Ｊｕｌ．２０１２に詳述されるプロトコルに従って実施され得る。
【0138】
基材がヒドロゲルから作製されているとき、基材の構造化は、典型的には、Ｃｈｏｌｌｅｔ，Ｂ．Ｄ’ｅｒａｍｏ，Ｌ．，Ｍａｒｔｗｏｎｇ，Ｅ．，Ｌｉ，Ｍ．，Ｍａｃｒｏｎ，Ｊ．，Ｍａｉ，Ｔ．Ｑ．，Ｔａｂｅｌｉｎｇ，Ｐ．ａｎｄ Ｔｒａｎ，Ｙ．，２０１６．Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ－ａｔｔａｃｈｅｄ ｍｕｌｔｉｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎｅｔｗｏｒｋｓ．ＡＣＳ ａｐｐｌｉｅｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ＆ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，８（３７），ｐｐ．２４８７０－２４８７９に開示されているプロトコルに従うことによって実施され得る。
【0139】
基材が非膨潤性材料から作製されているとき、基材の構造化は、典型的には、標準的なリソグラフィプロトコル、特に標準的なフォトリソグラフィプロトコルに従って実施され得る。
【0140】
特定の実施形態によれば、本方法は、ヒドロゲル材料の堆積の前に、ナノ粒子層、好ましくはパターン化されたクロム／金二重層の基材の表面上への堆積からなる追加のステップを更に含み得る。
【0141】
パターニングされた層の堆積は、例えば、標準的なフォトリソグラフィによって実施され得る。
【0142】
特定の実施形態によれば、本方法は、以下のステップのうちの少なくとも１つを更に含む：
ａ）第１の基材（１４）の表面上及び／又は第２の基材（２０）の表面上に複数のリガンドを（直接）グラフトするステップ、及び／又は
ｂ）第１の基材（１４）の表面上及び／又は第２の基材（２０）の表面上に複数のリガンドを（間接的に）グラフトするステップ。
ａ）第１の基材（１４）の表面上及び／又は第２の基材（２０）の表面上に複数のリガンドを（直接）グラフトするステップ、及び／又は
ｂ）第１の基材（１４）の表面上及び／又は第２の基材（２０）の表面上に複数のリガンドを（間接的に）グラフトするステップ。
【0143】
上記で定義されたステップａ）は、上記で定義された製造方法の任意の時点で実施され得る。特に、ステップａ）は、閉鎖パターン（１６）のグラフトの前又は後、核酸（２２）のグラフトの前又は後に実施され得る。
【0144】
第１の実施形態によれば、リガンドの間接的なグラフトは、グラフトされた複数の核酸（２２）に、ハイブリダイゼーションによって複数のリガンドを会合させることによって実施され、当該複数のリガンドは、グラフトされた核酸（２２）の少なくとも一部との相補性を有する核酸とコンジュゲートされる。
【0145】
この第１の実施形態によれば、ステップｂ）は、好ましくは、核酸（２２）のグラフト後に実施される。ステップｂ）は、ヒドロゲルを膨潤状態に作動させ、それによってマイクロ流体デバイス（１０）の第１の壁（１４）及び第２の壁（２０）、並びに膨潤状態のヒドロゲルの閉鎖パターン（１６）によって形成されるケージ内に細胞又はオルガネラを捕捉するように、条件が修正されるまで、実施することができる。
【0146】
第２の実施形態によれば、リガンドの間接的なグラフトは、ｉ）第１の基材（１４）及び／又は第２の基材（２０）の表面の少なくとも一部に接着コーティングをコーティングするステップと、ｉｉ）当該接着コーティングにリガンドをグラフトするステップとを含む。
【0147】
ステップｉ）は、閉鎖パターン（１６）のグラフトの前又は後、核酸（２２）のグラフトの前又は後に実施することができる。
【0148】
ステップｉｉ）は、好ましくは、接着コーティングの堆積後に実施される。ステップｉｉ）は、条件を修正してヒドロゲルを膨潤状態に作動させ、それによってマイクロ流体デバイス（１０）の第１の壁（１４）及び第２の壁（２０）、並びに膨潤状態のヒドロゲルの閉鎖パターン（１６）によって形成されるケージ内に細胞又はオルガネラを捕捉するまで、実施することができる。
【0149】
マイクロ流体デバイスの製造のための方法は、以下のステップのうちの１つ以上を更に含む：
１）グラフトされた核酸中に存在する定常配列の全部又は一部に相補的な配列を含むＤＮＡ、特にグラフトされた核酸の全部又は一部に存在するＤＮＡをハイブリダイズさせるステップ、特に、定常配列の全部又は一部に相補的な配列を含む１つ又は複数の異なるＤＮＡを使用し得るステップ、
２）（例えば、Ｍａｘｉｍａ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴ、Ｐｈｕｓｉｏｎ又はＱ５ポリメラーゼを使用する）重合によりハイブリダイズＤＮＡを伸長させるステップ、
３）グラフトされた核酸、特にグラフトされたＤＮＡを、あるＤＮＡ配列又は別のＤＮＡ配列とライゲーションするステップ、及び／又は
４）場合によっては１）、２）又は３）によるハイブリダイゼーション、伸長又はライゲーションによって予め修飾された、グラフトされた核酸の全部又は一部を、第１の基材又は第２の基材の表面から、切断（例えば、光切断又はエンドヌクレアーゼによって触媒される切断）によって放出するステップ。
１）グラフトされた核酸中に存在する定常配列の全部又は一部に相補的な配列を含むＤＮＡ、特にグラフトされた核酸の全部又は一部に存在するＤＮＡをハイブリダイズさせるステップ、特に、定常配列の全部又は一部に相補的な配列を含む１つ又は複数の異なるＤＮＡを使用し得るステップ、
２）（例えば、Ｍａｘｉｍａ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴ、Ｐｈｕｓｉｏｎ又はＱ５ポリメラーゼを使用する）重合によりハイブリダイズＤＮＡを伸長させるステップ、
３）グラフトされた核酸、特にグラフトされたＤＮＡを、あるＤＮＡ配列又は別のＤＮＡ配列とライゲーションするステップ、及び／又は
４）場合によっては１）、２）又は３）によるハイブリダイゼーション、伸長又はライゲーションによって予め修飾された、グラフトされた核酸の全部又は一部を、第１の基材又は第２の基材の表面から、切断（例えば、光切断又はエンドヌクレアーゼによって触媒される切断）によって放出するステップ。
【0150】
いくつかの態様において、ハイブリダイズするＤＮＡは、グラフトされた核酸とともに、エンドヌクレアーゼの制限部位を含有する二本鎖ＤＮＡを形成する。
【0151】
本方法はまた、細胞又はオルガネラを捕捉することができる構造を固定する更なるステップを含んでもよい。
【0152】
この補足的なステップは、通常、標準的なフォトリソグラフィによって実現される。
【0153】
用途
本発明のマイクロ流体デバイスは、細胞又はオルガネラの分析方法において使用することができ、単一の細胞の表現型情報と、単一の細胞若しくはオルガネラ、又は例えば相互作用する２つ以上の細胞、及びこれは同時に何千もの細胞についてのオミクス情報とを組み合わせる可能性を有する。
本発明のマイクロ流体デバイスは、細胞又はオルガネラの分析方法において使用することができ、単一の細胞の表現型情報と、単一の細胞若しくはオルガネラ、又は例えば相互作用する２つ以上の細胞、及びこれは同時に何千もの細胞についてのオミクス情報とを組み合わせる可能性を有する。
【0154】
細胞又はオルガネラの分析を行う方法は、以下を含む：
ａ）本発明によるマイクロ流体デバイス、及び細胞又はオルガネラの調製物を提供することと、
ａ）任意選択で、細胞又はオルガネラの全て又は一部を、共通の標識核酸配列又は複数の異なる標識核酸配列と会合させることと、
ｂ）ヒドロゲルが収縮状態にある条件下で、懸濁液中の細胞又はオルガネラをマイクロ流体デバイスに注入することと、
ｃ）条件を修正してヒドロゲルを膨潤状態に作動させ、それによって、マイクロ流体デバイスの第１の壁及び第２の壁、並びに膨潤状態のヒドロゲルの閉鎖パターンによって形成されるケージ内に細胞又はオルガネラを捕捉することと、
ｄ）任意選択で、捕捉された細胞若しくはオルガネラ及び／又はそれらが分泌する分子を、光学イメージングを使用して分析することと、
ｅ）任意選択で、マイクロ流体デバイスの第１又は第２の基材の表面から、グラフトされた核酸をケージ内に放出させることと、
ｆ）任意選択で、捕捉された細胞又はオルガネラを溶解させ、それによって、細胞核酸又はオルガネラ核酸をケージ内に放出させることと、
ｇ）核酸のバーコードを、放出された細胞核酸若しくはオルガネラ核酸のいずれかと会合させ、かつ／又は核酸配列を標識し、それによって、バーコード化された核酸を形成させることと、
ｈ）条件を修正してヒドロゲルを収縮状態に作動させることと、
ｉ）ｆ）において放出されない場合、マイクロ流体デバイスの第１又は第２の基材からグラフトされた核酸を放出させることと、
ｊ）バーコード化された核酸を回収し、配列決定することと、
ｋ）任意選択で、バーコード化された配列決定データを、ｅ）で得られた光学イメージングからのデータ上にマッピングすること。
ａ）本発明によるマイクロ流体デバイス、及び細胞又はオルガネラの調製物を提供することと、
ａ）任意選択で、細胞又はオルガネラの全て又は一部を、共通の標識核酸配列又は複数の異なる標識核酸配列と会合させることと、
ｂ）ヒドロゲルが収縮状態にある条件下で、懸濁液中の細胞又はオルガネラをマイクロ流体デバイスに注入することと、
ｃ）条件を修正してヒドロゲルを膨潤状態に作動させ、それによって、マイクロ流体デバイスの第１の壁及び第２の壁、並びに膨潤状態のヒドロゲルの閉鎖パターンによって形成されるケージ内に細胞又はオルガネラを捕捉することと、
ｄ）任意選択で、捕捉された細胞若しくはオルガネラ及び／又はそれらが分泌する分子を、光学イメージングを使用して分析することと、
ｅ）任意選択で、マイクロ流体デバイスの第１又は第２の基材の表面から、グラフトされた核酸をケージ内に放出させることと、
ｆ）任意選択で、捕捉された細胞又はオルガネラを溶解させ、それによって、細胞核酸又はオルガネラ核酸をケージ内に放出させることと、
ｇ）核酸のバーコードを、放出された細胞核酸若しくはオルガネラ核酸のいずれかと会合させ、かつ／又は核酸配列を標識し、それによって、バーコード化された核酸を形成させることと、
ｈ）条件を修正してヒドロゲルを収縮状態に作動させることと、
ｉ）ｆ）において放出されない場合、マイクロ流体デバイスの第１又は第２の基材からグラフトされた核酸を放出させることと、
ｊ）バーコード化された核酸を回収し、配列決定することと、
ｋ）任意選択で、バーコード化された配列決定データを、ｅ）で得られた光学イメージングからのデータ上にマッピングすること。
【0155】
ステップｃ）において、ヒドロゲルが収縮状態にある条件下で懸濁液中の細胞又はオルガネラをマイクロ流体デバイスに注入することは、典型的には、ヒドロゲルが収縮状態にあるように、作動可能なヒドロゲルの性質に応じて、温度、圧力又はｐＨを設定することによって実施される。例えば、マイクロ流体デバイスが下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）温度応答性ヒドロゲルを含む場合、マイクロ流体デバイスの温度は、ヒドロゲルを収縮させるために下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を超えて上昇される。ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ）を含むか又はそれからなる温度応答性ヒドロゲルについては、ヒドロゲルは≦２８℃で完全に膨張し、≧３６℃で完全に収縮し、これらの温度間で部分的に膨張し（温度応答については図７を参照されたい）、３７℃ではケージが完全に開いて細胞又はオルガネラのロードが可能となる（Ｄ’Ｅｒａｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ＆Ｎａｎｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１８）４，１７０６９）。例えば、マイクロ流体デバイスが上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）温度応答性ヒドロゲルを含む場合、マイクロ流体デバイスの温度を上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）未満に低下させて、ヒドロゲルを収縮させる。Ｐ（ＭＡ－ＡＭ－ＡＭＡ）を含むか又はそれからなる温度応答性ヒドロゲルの場合、ヒドロゲルは≦１０℃で完全に収縮し、≧５０℃で完全に膨張し、これらの温度の間で部分的に膨張し、１０℃ではケージが完全に開いて細胞又はオルガネラのロードが可能となる。一実施形態によれば、ステップｄ）において、単一細胞又は単一オルガネラがケージ内に捕捉される。別の実施形態によれば、２つ（又はそれ以上）の相互作用する細胞、例えば、形質細胞及びレポーター細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（又はＣＡＲ Ｔ細胞）及び標的細胞（例えば、腫瘍細胞）、Ｔ細胞及び抗原提示細胞、がケージ内に捕捉される。
【0156】
ヒドロゲルを膨潤状態に作動させるために、温度、圧力又はｐＨ（作動可能なヒドロゲルの性質に依存する）を、ヒドロゲルが膨潤して第２の基材と接触するように修正する。例えば、マイクロ流体デバイスが下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）温度応答性ヒドロゲルを含む場合、マイクロ流体デバイスの温度は、ヒドロゲルを膨張させるために下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）未満に低下される。ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）を含むか又はそれからなる温度応答性ヒドロゲルについては、温度は、典型的には≦２８℃に設定することができ、ここでヒドロゲルは完全に膨張する（Ｄ’Ｅｒａｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ＆Ｎａｎｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１８）４，１７０６９）。例えば、マイクロ流体デバイスが上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）温度応答性ヒドロゲルを含む場合、マイクロ流体デバイスの温度を上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）超に上昇させて、ヒドロゲルを膨張させる。Ｐ（ＭＡ－ＡＭ－ＡＭＡ）を含むか又はそれからなる温度応答性ヒドロゲルでは、ヒドロゲルは≧５０℃で完全に膨張する。
【0157】
本方法は、ステップｄ）とｈ）との間に、細胞又はオルガネラの周囲条件を変化させることを更に含み得る。周囲条件を変化させることは、例えば、塩、界面活性剤、タンパク質、及び／又は核酸配列を含有する水相をマイクロ流体デバイス内で循環させることを含む。周囲条件を変化させることは、ケージが細胞若しくはオルガネラを捕捉することができる構造も含む場合にケージを完全に開放することによって、又はケージを部分的に開放することによって、閉鎖したケージのヒドロゲルを通過する塩などの分子を交換することを含む。
【0158】
一実施形態によれば、本方法は、例えば、ステップｄ）の後であってステップｅ）の前に、必須ではないが、以下を更に含む：
ｅ１）第１の基材（１４）の表面及び／又は第２の基材（２０）の表面上に直接又は間接的にグラフトされたリガンドに、捕捉された細胞又はオルガネラにより分泌又は放出された分析物（単数又は複数）を結合させること、
ｅ２）結合した分析物（単数又は複数）に特異的である標識された第２のリガンド（単数又は複数）と結合させることによって、グラフトされたリガンドに結合した分析物（単数又は複数）を検出すること。
ｅ１）第１の基材（１４）の表面及び／又は第２の基材（２０）の表面上に直接又は間接的にグラフトされたリガンドに、捕捉された細胞又はオルガネラにより分泌又は放出された分析物（単数又は複数）を結合させること、
ｅ２）結合した分析物（単数又は複数）に特異的である標識された第２のリガンド（単数又は複数）と結合させることによって、グラフトされたリガンドに結合した分析物（単数又は複数）を検出すること。
【0159】
第１の実施形態によれば、ステップｅ２において、検出は、蛍光標識された第２のリガンド（単数又は複数）を用いて直接実施される。
【0160】
第２の実施形態によれば、ステップｅ２において、検出は、グラフトされたリガンドに結合された分析物（単数又は複数）に特異的なリガンド同定核酸で標識された第２のリガンド（単数又は複数）を用いて間接的に行われ、当該リガンド同定核酸の配列は、リガンド及びグラフトされたリガンドに結合された分析物（単数又は複数）の同定を可能にする。
【0161】
この第２の実施形態によれば、本方法は、当該リガンド同定核酸の配列を増幅することを更に含んでもよい。増幅は、好ましくは線形増幅からなり、より好ましくは少なくとも１つのポリメラーゼ及び少なくとも１つの制限酵素又はニッキング酵素を使用することによる。
【0162】
本方法のこの第２の実施形態によれば、ステップｈ）において、本方法は、核酸（２２）のバーコードをリガンド同定核酸と会合させ、それによってバーコード化された核酸を形成するステップを更に含んでもよい。
【0163】
一実施形態によれば、ステップｂ）で提供される共通の標識ＤＮＡ配列又は複数の異なる標識ＤＮＡ配列は、細胞又はオルガネラの表現型選別のためのＤＮＡツールボックス反応（又は動的ＤＮＡ反応ネットワーク）に使用され、それによって、ステップｆ）又はｊ）における移植された核酸の放出を作動させる。ＤＮＡツールボックス反応の原理は、例えば、国際公開第２０１７／１４１０６８号及び同第２０１７／１４１０６７号に記載されている。
【0164】
一実施形態によれば、ステップｇ）において、捕捉された細胞又はオルガネラは、浸透圧ショックによって溶解される。これは、マイクロ流体デバイス内で低－又は高－浸透水相を循環させることによって、当業者によって容易に実施され得る。ケージは、この操作のために閉鎖したままであってもよい。
【0165】
一実施形態によれば、ステップｈ）は、マイクロ流体デバイスの第１又は第２の基材の表面に依然としてグラフトされ得るか、又はマイクロ流体デバイスの第１又は第２の基材の表面から放出され得るバーコードを含む核酸を、放出された細胞又はオルガネラ核酸及び／又は標識核酸配列に対する相補性によってハイブリダイズさせることを含む。特に、バーコードを含む核酸がＤＮＡである場合、ステップｈ）［又はステップｉ）とｊ）との間の方法］は、放出された細胞又はオルガネラ核酸（又は標識核酸配列）にハイブリダイズしたバーコードを含むＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させて、バーコードを含む放出された細胞又はオルガネラ核酸（又は標識核酸配列）の相補鎖を作製するステップを更に含み得る。核酸は、例えば、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールへのハイブリダイゼーションのための配列オリゴｄ（Ｔ）又はオリゴｄ（Ｔ）ＶＮの３’領域（ｍＲＮＡ配列決定のため）、特定のＲＮＡ（標的化ＲＮＡ配列決定のため）又はＤＮＡ（標的化ＤＮＡ配列決定のため）の配列に相補的な配列の３’領域、ランダム配列、例えばｄ（Ｎ）６の３’領域（ＲＮＡ配列決定又はＤＮＡ配列決定のため）、逆転写酵素テンプレートスイッチングのための３つのリボ（Ｇ）ヌクレオチドを有する３’領域（ＲＮＡ配列決定のため）、又は例えばＴｎ５トランスポザーゼによって触媒される「タグメント化」後の組換えによって導入されるヌクレオチド配列に相補的な３’領域を含み得る。後者は、例えば、ゲノムＤＮＡ配列決定、又はＤＮＡメチレーション（Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑ又はバイサルファイト配列決定を使用する）若しくはクロマチン構造（配列決定を伴うトランスポザーゼアクセス可能クロマチン、ＡＴＡＣ－Ｓｅｑを使用する）のエピゲノム分析、又は細胞若しくはオルガネラによって放出されたＲＮＡに対する第１鎖ｃＤＮＡ合成後に形成されたＲＮＡ－ＤＮＡデュプレックス若しくは第１鎖及び第２鎖ｃＤＮＡ合成後に形成された二本鎖ＤＮＡのタグメント化後のＲＮＡ配列決定に使用することができる。
【0166】
別の実施形態によれば、バーコードを含む核酸はＤＮＡであり、完全に又は部分的に二本鎖であってもよく、ステップｈ）は、バーコードを含むＤＮＡを細胞又はオルガネラによって放出されたＤＮＡにライゲーションすることを含む。例えば、バーコードは、例えば、制限消化後（ゲノムＤＮＡ配列決定又はＤＮＡメチル化の分析のため）、又は小球菌ヌクレアーゼによる消化後（ＭＮａｓｅ－ｓｅｑ又はＣｈＩＰ－ｓｅｑを使用するメタゲノム分析のため）に、ゲノムＤＮＡにライゲーションされ得る。
【0167】
更に別の実施形態によれば、バーコードを含む核酸はＤＮＡであり、完全に又は部分的に二本鎖であってもよく、ステップｈ）は、バーコードを含むＤＮＡを細胞又はオルガネラによって放出されたＤＮＡと組換えることを含む。例えば、バーコードは、ゲノムＤＮＡ配列決定、又はＤＮＡメチレーション（Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑ又はバイサルファイト配列決定を使用する）若しくはクロマチン構造（配列決定、ＡＴＡＣ－Ｓｅｑを有するトランスポザーゼアクセス可能クロマチンを使用する）のエピゲノム分析のためにゲノムＤＮＡと組換えられ得る。あるいは、バーコードを含む核酸は、細胞若しくはオルガネラによって放出されたＲＮＡ上での第１鎖ｃＤＮＡ合成後に形成されたＲＮＡ－ＤＮＡ二本鎖と再結合するか、又は細胞若しくはオルガネラによって放出されたＲＮＡ上での第１鎖及び第２鎖ｃＤＮＡ合成後に形成された二本鎖ＤＮＡと再結合する（ＲＮＡ配列決定のため）。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、Ｔｎ５トランスポザーゼによって触媒されるＤＮＡと組換えるモザイク末端（Mosaic End、ＭＥ）配列を含む。
【0168】
一実施形態によれば、本方法は、ステップｄ）とｈ）との間に、例えば近接ライゲーションアッセイ又は近接伸長アッセイによって、ケージ内に細胞又はオルガネラ物質（例えば、表面分子、分泌分子、又は溶解産物）が存在するとバーコードを含む核酸を放出するステップを更に含む。
【0169】
本発明を、以下の図面及び実施例によって更に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0170】
【図1】本発明によるデバイスの閉鎖パターンの概略図である。 本発明によるマイクロ流体デバイス１０は、テーブルの形態で配置された複数の閉鎖パターン１６を含む。示される閉鎖パターン１６は、正方形の形態であるが、同等に、長方形、円形、又は六角形の形態であってもよい。閉鎖パターン１６は、厚さｅ及び高さｈを有する。
【図2】本発明の第１の実施形態によるマイクロ流体デバイスの概略図であり、パターンは作動可能なヒドロゲルから作製されている。 マイクロ流体デバイス１０は、複数の閉鎖パターン１６が上にグラフトされた第１の基材１４を含む第１の壁１２を含む。第１の壁１２に面する第２の壁１８は、第２の基材２０を含む。第２の基材２０には、複数の核酸２２がグラフトされている。閉鎖パターン１６は、収縮状態と、閉鎖パターン１６及び第２の基材２０が接触した膨潤状態との間で膨潤可能である作動可能なヒドロゲルで作製されている。マイクロ流体デバイス１０は、デバイス１０への反応物の導入及び除去をそれぞれ可能にする入口２４及び出口２６を更に含む。 スキームＡでは、閉鎖パターン１６は収縮状態にある。閉鎖パターン１４と第２の基材２０との間の間隙２８は、デバイスの内部に存在する流体及び細胞がデバイス１０の内部を自由に循環することを可能にする。 特定の物理化学的条件に置かれると、閉鎖パターン１６は水を吸収して膨潤し始める。したがって、閉鎖パターン１６は、第２の基材２０に接触するまで伸長する。 スキームＢでは、閉鎖パターン１６は膨潤状態にあり、第２の基材２０と接触している。したがって、デバイス１０は複数のケージ３０を備え、各ケージ３０は、閉鎖パターン１６のうちの１つで作製された側壁と、第１の基材１４及び第２の基材２０の一部で構成された端壁とによって画定される。
【図3】本発明の第２の実施形態によるマイクロ流体デバイスの概略図であり、第２の基材は作動可能なヒドロゲルから作製されている。 マイクロ流体デバイス１０は、複数の閉鎖パターン１６が上にグラフトされた第１の基材１４を含む第１の壁１２を含む。第１の壁１２に面する第２の壁１８は、第２の基材２０を含む。第１の基材１４上には、複数の核酸２２がグラフトされている。第２の基材２０は、収縮した状態と、閉鎖パターン１６と第２の基材２０とが接触した膨潤状態との間で膨潤可能である作動可能なヒドロゲルから作製されている。マイクロ流体デバイス１０は、デバイス１０への反応物の導入及び除去をそれぞれ可能にする入口２４及び出口２６を更に含む。 スキームＡでは、第２の基材２０は収縮状態にある。閉鎖パターン１４と第２の基材２０との間の間隙２８は、デバイスの内部に存在する流体及び細胞がデバイス１０の内部を自由に循環することを可能にする。 特定の物理化学的条件下に置かれると、第２の基材２０は水を吸収し始め、膨潤する。したがって、第２の基材２０の厚さは、閉鎖パターン１６に接触するまで増加する。 スキームＢでは、第２の基材２０は膨潤状態にあり、閉鎖パターン１６と接触している。したがって、デバイス１０は複数のケージ３０を備え、各ケージ３０は、閉鎖パターン１６のうちの１つで作製された側壁と、第１の基材１４及び第２の基材２０の一部で構成された端壁とによって画定される。
【図4】本発明による細胞又はオルガネラの分析を実施する方法の主なステージの概略図である。ステージは、上から下へ昇順で識別される。 ステージ１：解離した細胞を温度Ａでマイクロ流体デバイスに注入し、ケージを収縮状態にする。 ステージ２：マイクロ流体デバイスの温度を、細胞の捕捉を可能にする温度Ｂに変更することによって、ケージを膨潤させる。次いで、周囲の緩衝液を交換することによって、例えば、低塩緩衝液を使用して、細胞を溶解させる。捕捉されなかった細胞を洗い流す。 ステージ３：依然として温度Ｂで、緩衝液を再び交換して、各ケージの底のグラフトされたオリゴヌクレオチド上での核酸ハイブリダイゼーションを可能にする。 ステージ４：マイクロ流体デバイスの温度を温度Ａに変更することによってケージを後退させる。これにより、グラフトされたオリゴヌクレオチド上に存在する各ケージに特異的なバーコードを、細胞から放出されたハイブリダイズした核酸に結合させるために、反応混合物の注入及びインキュベーションが可能になる。 ステージ５：依然として温度Ａで、マイクロ流体デバイスからグラフト又はハイブリダイズされたバーコード化ｃＤＮＡ及び／又はタグを放出させるために、新しい反応混合物が注入される。次いで、回収されたサンプルを精製し、増幅し、配列決定する。
【図5】トランスクリプトーム解析に基づく、本発明による細胞又はオルガネラの解析を実施する例示的な方法において実施される一連の操作の概略図である。灰色の長方形は、細胞（丸）及び捕捉プライマー（棒）を含有するヒドロゲルケージを表す。プロセスは、上から下に向かって、以下を含む： ａ－細胞の捕捉後にケージを閉鎖する、ｂ－浸透圧ショックによる細胞の溶解及びケージ中のマーカー上のｍＲＮＡのハイブリダイゼーション、ｃ－ケージの開放、ＲＴ（トランスクリプトームの場合）、ｄ－ｃＤＮＡの切断及び回収。
【図6】２００個のケージを含むチップを表す。ケージ上のズームは、上から下に、捕捉（右の線）、ケージ間の蒸留水の循環によって誘導される浸透圧ショックによる溶解（第２の線）、及び溶解された細胞物質の放出（最後の線）、を示す。
【図7】実施例１で合成されたＰＮＩＰＡＭヒドロゲルの膨潤比を、温度の関数として、４つの異なる水溶液中で示す。曲線１は純水中で得られたものであり、曲線２はリン酸塩緩衝液中で得られたものであり、曲線３はｐＨ＝２で得られたものであり、曲線４はｐＨ＝９で得られたものである。
【図8】実施例１のマイクロ流体デバイスにおけるＤＮＡ鎖のマイクロアレイ構造を表す。図８ａは、実施例１のマイクロ流体デバイスに含まれるマイクロアレイの断面を表す。矢印は、ＤＮＡ鎖の位置を示す。各ＤＮＡスポットは、ＤＮＡ鎖のセットから構成される。図８ｂは、実施例１のマイクロ流体デバイスに含まれるＤＮＡアレイのＤＮＡスポットを構成するＤＮＡ鎖の組成の例を表す。ＤＮＡスポットの全てのＤＮＡ鎖は同一である。各ＤＮＡスポット間で、ＤＮＡ鎖はそれらのスポット特異的バーコードによって異なる。１００万までのスポット特異的バーコードが設計されている。
【図9】蛍光タグに基づく局在化グリッドの部分的表現である。形状及び色は、固有の位置を定義する。
【図10】実施例３で合成されたポリ（メタクリルアミド－アクリルアミオド－アリルメタクリレート）ヒドロゲルの温度の関数としてのリン酸生理食塩水緩衝液中での膨潤比を表す。
【図11】実施例４で使用したデバイスにおけるＤＮＡマイクロウェルの構造を表す。図１１ａは、実施例４のマイクロ流体デバイスに含まれるマイクロアレイの断面を表す。矢印は、ＤＮＡ鎖の位置を示す。各ＤＮＡスポットは、ＤＮＡ鎖のセットから構成される。垂直の黒い棒は、ケージ壁を構成するＰＤＭＳ製の壁を表す。図１１ｂは、実施例４のマイクロ流体デバイスに含まれるＤＮＡアレイのＤＮＡスポットを構成するＤＮＡ鎖の組成の例を表す。ＤＮＡスポットの全てのＤＮＡ鎖は同一である。各ＤＮＡスポット間で、ＤＮＡ鎖はそれらのスポット特異的バーコードによって異なる。１００万までのスポット特異的バーコードが設計されている。
【図12】実施例５において細胞部分集団を特異的に標識するために使用されたビオチン化オリゴの組成を表す。細胞を、抗体特異的バーコードを保有する部分集団特異的抗体で標識する。抗体は、ストレプトアビジンにカップリングされる（例えば、ａｂｃａｍ－ａｂ１０２９２１からのストレプトアビジンコンジュゲーションキット－Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ－Ｌｉｎｋを使用）。細胞標識の前に、本図に記載されるようなビオチンコンジュゲートオリゴを、１２：１の関係で抗体溶液に添加する。
【図13】実施例６のマイクロ流体デバイスにおけるＤＮＡ鎖のマイクロアレイ構造を表す。図１３ａは、実施例６のＤＮＡアレイ調製の概略図である。この方法は、各グラフト鎖を隣接するグラフト鎖にハイブリダイズさせ、次いで各グラフト鎖をハイブリダイゼーション部位の５’においてニッキング制限酵素で切断することにより、ＤＮＡアレイの各ＤＮＡスポット内のオリゴヌクレオチドを逆転させることを含む。図１３ｂは、実施例６のマイクロ流体デバイスに含まれるマイクロアレイの断面を表す。矢印は、ＤＮＡ鎖の位置を示す。各ＤＮＡスポットは、ＤＮＡ鎖のセットから構成される。垂直の黒い棒は、ケージ壁を構成するＰＤＭＳ製の壁を表す。パネルｃ．は、実施例６のマイクロ流体デバイスに含まれるＤＮＡアレイのＤＮＡスポットを構成するＤＮＡ鎖の組成の例を表す。ＤＮＡスポットの全てのＤＮＡ鎖は同一である。各ＤＮＡスポット間で、ＤＮＡ鎖はそれらのスポット特異的バーコードによって異なる。１００万までのスポット特異的バーコードが設計されている。
【図14】実施例７のマイクロ流体デバイスにおけるＤＮＡ鎖のマイクロアレイ構造を表す。図１４ａは、実施例７のマイクロ流体デバイスに含まれるマイクロアレイの断面を表す。矢印は、ＤＮＡ鎖の位置を示す。各ＤＮＡスポットは、ＤＮＡ鎖のセットから構成される。図１４ｂは、実施例７のマイクロ流体デバイスに含まれるＤＮＡアレイのＤＮＡスポットを構成するＤＮＡ鎖の組成の例を表す。ＤＮＡスポットの全てのＤＮＡ鎖は同一である。各ＤＮＡスポット間で、ＤＮＡ鎖はそれらのスポット特異的バーコードによって異なる。１００万までのスポット特異的バーコードが設計されている。
【図15】実施例８のマイクロ流体デバイスにおけるＤＮＡ鎖のマイクロアレイ構造を表す。図１５ａは、実施例８のマイクロ流体デバイスに含まれるマイクロアレイの断面を表す。矢印は、ＤＮＡ鎖の位置を示す。各ＤＮＡスポットは、ＤＮＡ鎖のセットから構成される。図１５ｂは、実施例８のマイクロ流体デバイスに含まれるＤＮＡアレイのＤＮＡスポットを構成するＤＮＡ鎖の組成の例を表す。ＤＮＡスポットの全てのＤＮＡ鎖は同一である。各ＤＮＡスポット間で、ＤＮＡ鎖はそれらのスポット特異的バーコードによって異なる。１００万までのスポット特異的バーコードが設計されている。
【図16】実施例８のマイクロ流体デバイスの一部におけるＤＮＡアレイスポット及びケージのインフォーマティック識別である。識別は、マイクロ流体デバイスの明視野イメージ及び蛍光イメージ（６５０ｎｍでの励起及び６７０ｎｍでの発光）の重ね合わせに基づく。明視野イメージは、ケージを識別することを可能にする。黒丸Ａ、Ｂ及びＣによって表される蛍光イメージは、蛍光ＤＮＡプローブが上に予めハイブリダイズされている特定のスポットを同定することを可能にする。黒丸Ａ、Ｂ及びＣの相対位置は、チップ上の固有の位置を規定し、重ね合わされたイメージ上にＤＮＡアレイの元の構成をマッピングすることを可能にする。最後に、この識別のおかげで、スポット特異的バーコードを各ケージと関連付けることができる。
【図17】実施例８の配列決定データにおいて有効な遺伝子を提示するリードから抽出された１４，７５２個のバーコードのマイクロ流体デバイスにおける空間再分割を表す。各黒丸は、そのバーコードが配列決定データ中の少なくとも１つのｃＤＮＡに関連するＤＮＡアレイからのＤＮＡスポットを表す。欠けている円は、配列決定データにおいて少なくとも１つのｃＤＮＡに関連してバーコードが見出されなかったＤＮＡアレイからのＤＮＡスポットである。回収されたバーコードの位置によって表される六角形形状は、マイクロ流体デバイス製造中に酸素プラズマから保護された領域に対応する。保護領域におけるスポットの大部分は、配列決定データにおいて同定されている。
【図18】実施例８において配列決定によって同定された遺伝子の長さ分布を表す。図１８ａは、Ｅｎｓｅｍｂｌバージョン１０４．３８によってアノテートされたＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍのアセンブリＧＲＣｈ３８．ｐ１３ Ｇｅｎｏｃｏｄｅ ３８におけるタンパクコード遺伝子としてアノテートされた２０，４６５個の遺伝子の長さ分布を表す（ｈｔｔｐ：／／ｍａｙ２０２１．ａｒｃｈｉｖｅ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ／Ｉｎｆｏ／Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎを参照）。遺伝子長は、エキソン長の合計として決定される。各遺伝子について、選択的スプライシング変異体の平均サイズを使用した。図１８ｂは、実施例８の配列決定データにおいて有効な遺伝子及び有効なバーコードを提示するリードから同定された１４，５０７個の固有の遺伝子のみの同じデータベースからの長さ分布を表す。パネルａ及びｂにおけるサイズ分布の類似性は、実施例８における遺伝子回収においてサイズバイアスが存在しないことを実証する。
【図19】２つの異なる細胞株を用いた実施例８の３つの反復のクラスタリングのための注釈付きＵＭＡＰを表す（ＭｃＩｎｎｅｓ，Ｌ，Ｈｅａｌｙ，Ｊ，ＵＭＡＰ：Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ，ＡｒＸｉｖ ｅ－ｐｒｉｎｔｓ １８０２．０３４２６，２０１８）。実施例８に記載のＲＮＡ－ｓｅｑを、ＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞で２回、ＲａｍｏｓヒトＢ細胞で１回繰り返した。各実験について、１５，０００個のバーコードをランダムにグループ化して、２００個のスーパーバーコードを形成して、浅い配列決定深さ及びクラスタリングを防止するバーコード当たりの同定されたｃＤＮＡの数が少ないことに対処する。次に、Ｓｃａｎｐｙ Ｐｙｔｈｏｎソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｃａｎｐｙ．ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ．ｉｏ）を使用して、主成分分析（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ、ＰＣＡ）を実行し、次いでライデングラフクラスタリング法（Ｔｒａａｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｆｒｏｍ Ｌｏｕｖａｉｎ ｔｏ Ｌｅｉｄｅｎ：ｇｕａｒａｎｔｅｅｉｎｇ ｗｅｌｌ－ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ）を使用してクラスターを検出し、注釈を追加する前にＵＭＡＰグラフを介して２次元でクラスタリングを表す。完全な手順は、以下のリンクでＳｃａｎｐｙウェブサイト上で詳述される：ｈｔｔｐｓ：／／ｓｃａｎｐｙ－ｔｕｔｏｒｉａｌｓ．ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ．ｉｏ／ｅｎ／ｌａｔｅｓｔ／ｐｂｍｃ３ｋ．ｈｔｍｌ＃Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ－ｔｈｅ－ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ－ｇｒａｐｈ。 ２つのクラスターが同定され、一方（クラスター１）は、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｔ細胞）を用いた２つの実験からのデータから構成され、他方（クラスター２）は、Ｒａｍｏｓ細胞（Ｂ細胞）を用いた実験からのデータから構成され、この方法が、異なる（密接に関連する）細胞型を同定するために使用され得ることを実証する。
【実施例】
【0171】
実施例で使用されるオリゴヌクレオチドは、表１に開示される配列を有する。
【表1】
【0172】
実施例１－ＤＮＡアレイを用いたＬＣＳＴケージにおける全ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ
熱作動性ヒドロゲルの合成
エン官能化ポリ（ｎ－イソプロピルアクリルアミド）は、Ｄ’Ｅｒａｍｏ Ｌ．；ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ＆Ｎａｎｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１８，４，１７０６９，ｄｏｉ：１０．１０３８の追加情報に記載のステップに従い合成する。
熱作動性ヒドロゲルの合成
エン官能化ポリ（ｎ－イソプロピルアクリルアミド）は、Ｄ’Ｅｒａｍｏ Ｌ．；ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ＆Ｎａｎｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１８，４，１７０６９，ｄｏｉ：１０．１０３８の追加情報に記載のステップに従い合成する。
【0173】
得られたポリマーの膨潤特性を、温度の関数として、種々の水溶液：純水、ｐＨ２及びｐＨ９のリン酸生理食塩水緩衝液、中で評価する。結果を図７に示す。
【0174】
第１の基材の準備
ポリジメチルシロキサン（polydimethylsiloxane、ＰＤＭＳ）製の第１の基材は、標準的なソフトリソグラフィ技術によって調製され、微細構造及びチャンバーを含む。構造及びチャンバーの高さは、対物レンズに依存し、１０分の数ミクロンから１００ミクロンまでの高さであり得る。
ポリジメチルシロキサン（polydimethylsiloxane、ＰＤＭＳ）製の第１の基材は、標準的なソフトリソグラフィ技術によって調製され、微細構造及びチャンバーを含む。構造及びチャンバーの高さは、対物レンズに依存し、１０分の数ミクロンから１００ミクロンまでの高さであり得る。
【0175】
第１の基材の官能化
ＰＤＭＳ基材を、イソプロパノールで洗浄した後、酸素プラズマに５０秒間曝露する。表面活性化の直後に、３体積％のメルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＡＢＣＲ Ｇｅｌｅｓｔ）を含む無水トルエンの溶液を、窒素下の反応器内で３時間基材と接触させる。表面のチオール修飾に続いて、基材をトルエンでリンスし、最後に窒素流で乾燥させる。
ＰＤＭＳ基材を、イソプロパノールで洗浄した後、酸素プラズマに５０秒間曝露する。表面活性化の直後に、３体積％のメルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＡＢＣＲ Ｇｅｌｅｓｔ）を含む無水トルエンの溶液を、窒素下の反応器内で３時間基材と接触させる。表面のチオール修飾に続いて、基材をトルエンでリンスし、最後に窒素流で乾燥させる。
【0176】
第１の基材上へのヒドロゲルフィルムの光パターニング
予め形成された官能化ｐＮＩＰＡＭ（エン反応性である）を、ジチオール架橋剤を用いてチオール修飾及び微細構造化ＰＤＭＳ基材上にスピンコーティングする。３～１５重量％の濃度の官能化ｐＮＩＰＡＭ及び３～１０重量％の濃度のジチオエリスリトール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入、ＣＡＳ番号３４８３－１２－３）架橋剤を含有する、数百μＬの微量のブタノール及びメタノール（Ｖ／Ｖ＝１／１）の溶液を、基材上に堆積させる。スピンコーティングの条件は、３０秒のスピン時間に対して５００ｒｐｍ～３０００ｒｐｍの間で変化する角速度で固定する。広げたフィルムを９０℃のオーブンで５分間加熱することによって乾燥させる。得られる層の厚さは１０分の数ミクロン～１５ミクロンまで変化する。
予め形成された官能化ｐＮＩＰＡＭ（エン反応性である）を、ジチオール架橋剤を用いてチオール修飾及び微細構造化ＰＤＭＳ基材上にスピンコーティングする。３～１５重量％の濃度の官能化ｐＮＩＰＡＭ及び３～１０重量％の濃度のジチオエリスリトール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入、ＣＡＳ番号３４８３－１２－３）架橋剤を含有する、数百μＬの微量のブタノール及びメタノール（Ｖ／Ｖ＝１／１）の溶液を、基材上に堆積させる。スピンコーティングの条件は、３０秒のスピン時間に対して５００ｒｐｍ～３０００ｒｐｍの間で変化する角速度で固定する。広げたフィルムを９０℃のオーブンで５分間加熱することによって乾燥させる。得られる層の厚さは１０分の数ミクロン～１５ミクロンまで変化する。
【0177】
多数の微細構造ケージを提示するクロムマスクをチャンバーのデザインと整列させ、ＵＶランプの下に置でディープＵＶ曝露（８ワット、２５０ｎｍ波長）を行う。曝露後、基材を超純水浴中で５分間洗浄することによって遊離ポリマー鎖を洗い流す。ヒドロゲルパターン化基材を窒素流で乾燥させる。
【0178】
第２の基材の準備
使用される第２の基材は、ＤＮＡ鎖がスポットされたスライドガラスである（Ａｇｉｌｅｎｔから購入、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｆｏｒｍａｔとして参照）。
使用される第２の基材は、ＤＮＡ鎖がスポットされたスライドガラスである（Ａｇｉｌｅｎｔから購入、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｆｏｒｍａｔとして参照）。
【0179】
このアイテムは、異なるＤＮＡ鎖がグラフトされた１００万個までの固有のスポットを提示しつつ、各スポット上に異なるバーコードを提供する。各スポットは何百万ものＤＮＡ鎖を含有する。
【0180】
ＤＮＡのマイクロアレイ構造を図８に示し、各スポットが異なるバーコードを有する。
【0181】
局在化システムがアレイの設計中に組み込まれる。多数の独特なスポットの中で、それらのいくつかは、蛍光標識捕捉（２つ以上）のための特異的配列を有する。それらは、図９に示すように、三角形、四角形及び円形を含む複数の形状を形成するように配置される。
【0182】
デバイスの閉鎖
第１の基材と第２の基材との間の結合は、Ｏ２プラズマ処理を５０秒間使用することによって実施される。酸素プラズマがそこで活性になることを回避するために、保護層が関心領域上にタップされる。曝露の終了後、関心領域がヒドロゲル構造に面するように、ＰＤＭＳ基材をＤＮＡアレイの上に配置する。チップを７０℃のオーブン内に保管することによって、少なくとも３０分間、硬化ステップを適用する。
第１の基材と第２の基材との間の結合は、Ｏ２プラズマ処理を５０秒間使用することによって実施される。酸素プラズマがそこで活性になることを回避するために、保護層が関心領域上にタップされる。曝露の終了後、関心領域がヒドロゲル構造に面するように、ＰＤＭＳ基材をＤＮＡアレイの上に配置する。チップを７０℃のオーブン内に保管することによって、少なくとも３０分間、硬化ステップを適用する。
【0183】
特異的捕捉のためのチップの調製：全ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ
１００ｍＭ酢酸カリウムの溶液（３０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５））及び２０μＭのオリゴヌクレオチドＡ、Ｂ及びＣ、Ｄ、Ｅをマイクロ流体チャンバー内に４０℃（ケージ開放）で注入して、更なる捕捉配列を着座したＤＮＡ鎖上にハイブリダイズさせ、局在化ステップに進める。フローを停止し、混合オリゴヌクレオチドを有するチップを６０℃超で２分間加熱し、次いで室温で１０分間冷却し、３７℃のＰＢＳ溶液でリンスする。
１００ｍＭ酢酸カリウムの溶液（３０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５））及び２０μＭのオリゴヌクレオチドＡ、Ｂ及びＣ、Ｄ、Ｅをマイクロ流体チャンバー内に４０℃（ケージ開放）で注入して、更なる捕捉配列を着座したＤＮＡ鎖上にハイブリダイズさせ、局在化ステップに進める。フローを停止し、混合オリゴヌクレオチドを有するチップを６０℃超で２分間加熱し、次いで室温で１０分間冷却し、３７℃のＰＢＳ溶液でリンスする。
【0184】
主チャンバーの５２０ｎｍ、５６３ｎｍ、６６５ｎｍ、７０４ｎｍの連続波長で蛍光イメージングを行い、蛍光形状及びスポットをケージに対して位置決めする。
【0185】
単一細胞の捕捉
試験は、異なるマイクロ流体幾何学形状を用いて実施され、全てがヒドロゲルケージをホストする大型チャンバーである共通特徴を有することを示す。
試験は、異なるマイクロ流体幾何学形状を用いて実施され、全てがヒドロゲルケージをホストする大型チャンバーである共通特徴を有することを示す。
【0186】
ＴＢＳ中の１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｆ６８、１５％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ及び１％ＢＳＡを含む１ｍＬ当たり１０００万個の濃度の細胞懸濁液を調製する。細胞を１００μｌ／ｈでチップ内に注入し、ケージを開放するためにチップを３７℃に加熱する。細胞がケージの周囲及び上方を循環したら、流れを停止し、温度を２０℃に下げてケージを閉鎖する。細胞はケージ内に捕捉される。
【0187】
溶解を行うために、膨潤したヒドロゲルケージによって塞がれていない追加の入口を通して低塩水の溶液をチャンバー内に注入する。
【0188】
細胞のＲＮＡ鎖は、その後、ケージの周りの水相がＰＢＳで交換されるにつれて、グラフトされた捕捉配列にハイブリダイズする。
【0189】
１０分間の流れ停止後、ケージを開放し（温度を３７℃に上昇させ）、チャンバー内にＰＢＳを流すことによって洗浄ステップを行う。
【0190】
完全に洗浄した後、１０Ｕ／μｌの逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍａｘｉｍａ Ｈ＋）、０．５ｍＭのｄＮＴＰ及び１Ｕ／μｌのＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤並びに２６μＭのオリゴヌクレオチドＦをＲＴ緩衝液１×中に含む混合物をチャンバー内に注入し、続いて流れを止め、捕捉された鎖の逆転写を５５℃で２時間進行させる。酵素を直ちにＰＢＳ水溶液でフラッシュしてＲＴを停止させる。
【0191】
１ｍＭ ＡＴＰを補充したＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液１×中に酵素ＢｍｔＩ及びＨｉ－Ｔ４リガーゼを含有する第２の混合物を３７℃で注入し、次いで、チャンバー内で停止させて、バーコード化鎖をｃＤＮＡにライゲーションし、ＤＮＡアレイからｃＤＮＡを分離する。次いで、内容物をＰＢＳ溶液で押し出すことによって回収する。
【0192】
次いで、回収チューブを６５℃で２０分間インキュベートして、先に注入した酵素を不活性化する。
【0193】
ＥｘｏＩ処理の後、プライマーＧ及びＨを使用して、回収した試料に対してＰＣＲ増幅を実施する。
【0194】
次いで、ＰＣＲ産物を精製し、定量した後、配列決定する。
【0195】
配列決定データの脱多重化は、位置３０～４４のバーコード、位置６５～７６のＵＭＩ、及びリード１の位置１０９から始まるＲＮＡ転写物を見て実施する。
【0196】
実施例２－ＤＮＡアレイを用いたＬＣＳＴケージにおける標的化ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ
マイクロ流体デバイスは実施例１と同一である。
マイクロ流体デバイスは実施例１と同一である。
【0197】
特異的捕捉のためのチップの調製
調製は実施例１に詳述されるとおりであり、オリゴヌクレオチドＢの３’末端のポリ（ｄＴ）ＶＮを遺伝子特異的配列で置換する。異なる遺伝子又は遺伝子の異なる部分を標的とするオリゴヌクレオチドの混合物を使用することができる。
調製は実施例１に詳述されるとおりであり、オリゴヌクレオチドＢの３’末端のポリ（ｄＴ）ＶＮを遺伝子特異的配列で置換する。異なる遺伝子又は遺伝子の異なる部分を標的とするオリゴヌクレオチドの混合物を使用することができる。
【0198】
捕捉、溶解及びライブラリー調製
捕捉、溶解及びハイブリダイゼーションステップは実施例１に詳述されるとおりである。
捕捉、溶解及びハイブリダイゼーションステップは実施例１に詳述されるとおりである。
【0199】
逆転写の間、オリゴヌクレオチドＦの３’末端ｒＧｒＧ＋Ｇは、オリゴヌクレオチドＢと同様の遺伝子を標的とする遺伝子特異的配列で置換されるが、逆方法で置換される。異なる遺伝子又は遺伝子の異なる部分を標的とするオリゴヌクレオチドの混合物を使用することができる。
【0200】
放出から配列決定までのステップは実施例１に詳述されるとおりである。
【0201】
配列決定データの脱多重化を実施例１と同様に行う。
【0202】
実施例３－ＤＮＡアレイを用いたＵＣＳＴケージにおける全ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ
ＵＣＳＴ挙動を示す熱作動性ヒドロゲルの合成
２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロリド（Ｖ５０）を熱ラジカル開始剤として使用して、メタクリルアミド（methacrylamide、ＭＡ）、アクリルアミド（acrylamide、ＡＭ）及びアリルメタクリレート（allylmethacrylate、ＡＭＡ）を９０：５：５のモル比でフリーラジカル重合することによって、エン官能化ＵＣＳＴポリマーを合成する。ＭＡ（８ｇ、９４ｍｍｏｌ）、ＡＭ（０．３７１ｇ、５．２ｍｍｏｌ）、ＡＭＡ（０．６５９ｇ、５．２ｍｍｏｌ）及びＶ５０（０．０７１ｇ、０．３ｍｍｏｌ）を２４７ｍＬの水及び１２３ｍＬのホルムアミド中で混合した。溶液を、還流条件下、５５℃で１時間、窒素バブリングにより脱酸素化した。媒体を窒素下、５５℃で２４時間還流条件下で進行させた。次いで、ポリマー溶液を純水中で７０℃で４日間透析した。エン官能化ＵＣＳＴ Ｐ（ＭＡ－ＡＭ－ＡＭＡ）ターポリマーを凍結乾燥によって回収した。
ＵＣＳＴ挙動を示す熱作動性ヒドロゲルの合成
２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロリド（Ｖ５０）を熱ラジカル開始剤として使用して、メタクリルアミド（methacrylamide、ＭＡ）、アクリルアミド（acrylamide、ＡＭ）及びアリルメタクリレート（allylmethacrylate、ＡＭＡ）を９０：５：５のモル比でフリーラジカル重合することによって、エン官能化ＵＣＳＴポリマーを合成する。ＭＡ（８ｇ、９４ｍｍｏｌ）、ＡＭ（０．３７１ｇ、５．２ｍｍｏｌ）、ＡＭＡ（０．６５９ｇ、５．２ｍｍｏｌ）及びＶ５０（０．０７１ｇ、０．３ｍｍｏｌ）を２４７ｍＬの水及び１２３ｍＬのホルムアミド中で混合した。溶液を、還流条件下、５５℃で１時間、窒素バブリングにより脱酸素化した。媒体を窒素下、５５℃で２４時間還流条件下で進行させた。次いで、ポリマー溶液を純水中で７０℃で４日間透析した。エン官能化ＵＣＳＴ Ｐ（ＭＡ－ＡＭ－ＡＭＡ）ターポリマーを凍結乾燥によって回収した。
【0203】
得られたポリマーの膨潤特性を、温度の関数として、リン酸生理食塩水緩衝液中で評価する。結果を図１０に示す。
【0204】
第１の基材の準備
詳細は実施例１に示すとおりである。
詳細は実施例１に示すとおりである。
【0205】
第１の基材の官能化
詳細は実施例１に示すとおりである。
詳細は実施例１に示すとおりである。
【0206】
第１の基材上へのヒドロゲルフィルムの光パターニング
Ｐ（ＭＡ－ＡＭ－ＡＭＡ）ターポリマー（エン反応性ＵＣＳＴポリマー）を、少なくとも４０℃の温度でジチオール架橋剤を用いてチオール修飾及び微細構造化ＰＤＭＳ基材上にスピンコーティングする。３～１５重量％の濃度のＰ（ＭＡ－ＡＭ－ＡＭＡ）ポリマーと、３～１０重量％の濃度のジチオエリスリトール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入、ＣＡＳ番号３４８３－１２－３）架橋剤とを含有する数百ｕＬの微量の酢酸溶液（Ｖ／Ｖ＝１／１）を基材上に堆積させる。スピンコーティングの条件は、３０秒のスピン時間に対して５００ｒｐｍ～３０００ｒｐｍの間で変化する角速度で固定する。広げられたフィルムを、水飽和環境において９０℃のオーブン中で５分間加熱することによって乾燥させる。得られる層の厚さは１０分の数ミクロン～１５ミクロンまで変化する。
Ｐ（ＭＡ－ＡＭ－ＡＭＡ）ターポリマー（エン反応性ＵＣＳＴポリマー）を、少なくとも４０℃の温度でジチオール架橋剤を用いてチオール修飾及び微細構造化ＰＤＭＳ基材上にスピンコーティングする。３～１５重量％の濃度のＰ（ＭＡ－ＡＭ－ＡＭＡ）ポリマーと、３～１０重量％の濃度のジチオエリスリトール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入、ＣＡＳ番号３４８３－１２－３）架橋剤とを含有する数百ｕＬの微量の酢酸溶液（Ｖ／Ｖ＝１／１）を基材上に堆積させる。スピンコーティングの条件は、３０秒のスピン時間に対して５００ｒｐｍ～３０００ｒｐｍの間で変化する角速度で固定する。広げられたフィルムを、水飽和環境において９０℃のオーブン中で５分間加熱することによって乾燥させる。得られる層の厚さは１０分の数ミクロン～１５ミクロンまで変化する。
【0207】
多数の微細構造ケージを提示するクロムマスクをチャンバーのデザインと整列させ、ＵＶランプの下に配置してディープＵＶ曝露（８ワット、２５０ｎｍ波長）を行う。曝露後、基材を超純水浴中で５分間洗浄することによって遊離ポリマー鎖を洗い流す。ヒドロゲルパターン化基材を窒素流で乾燥させる。
【0208】
第２の基材の準備
詳細は実施例１に示すとおりである。
詳細は実施例１に示すとおりである。
【0209】
特異的捕捉のためのチップの調製：ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ
チップの調製は実施例１に詳述するとおりである。これらのステップの温度のみが異なる：オリゴヌクレオチドの注入及びリンスは２０℃で行う。
チップの調製は実施例１に詳述するとおりである。これらのステップの温度のみが異なる：オリゴヌクレオチドの注入及びリンスは２０℃で行う。
【0210】
単一細胞の捕捉
捕捉ステップは実施例１に詳述されるとおりであり、細胞注入は２０℃で実施する。チップを３７℃より高く加熱することによってケージを閉鎖する。
捕捉ステップは実施例１に詳述されるとおりであり、細胞注入は２０℃で実施する。チップを３７℃より高く加熱することによってケージを閉鎖する。
【0211】
溶解及びハイブリダイゼーションステップは実施例１に詳述されるとおりである。
【0212】
この場合、洗浄ステップは室温で実施する。
【0213】
最後のステップは実施例１に詳述されるとおりである。
【0214】
実施例４－ＬＣＳＴのフィルム及びマイクロウェル中にスポットされた鎖をホストするＰＤＭＳ基質を用いた全ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ
熱作動性ヒドロゲルの合成
詳細は実施例１に示すとおりである。
熱作動性ヒドロゲルの合成
詳細は実施例１に示すとおりである。
【0215】
第１の基材の準備
清浄で新しいスライドガラス（厚さ１ｍｍ）を第１の基材として使用する。
清浄で新しいスライドガラス（厚さ１ｍｍ）を第１の基材として使用する。
【0216】
第１の基材の官能化
基質のチオール修飾は、実施例１に記載されるのと同じプロトコルに従って実施する。
基質のチオール修飾は、実施例１に記載されるのと同じプロトコルに従って実施する。
【0217】
ヒドロゲルフィルムの光パターニング
プロトコルは、マスク設計を除いて、すなわち、マイクロ流体チャンバーの幅及び長さに一致する大きな長方形を提示する異なる設計を除いて、実施例１に詳述されるものと同一とする。
プロトコルは、マスク設計を除いて、すなわち、マイクロ流体チャンバーの幅及び長さに一致する大きな長方形を提示する異なる設計を除いて、実施例１に詳述されるものと同一とする。
【0218】
第２の基材の準備
使用される第２の基材はＰＤＭＳ製であり、ソフトリソグラフィの標準的な技術に従って構造化する。チャンバーの内側には、数ミクロン～１００ミクロンまで変化する深さを有するマイクロウェルのアレイが構造化される。
使用される第２の基材はＰＤＭＳ製であり、ソフトリソグラフィの標準的な技術に従って構造化する。チャンバーの内側には、数ミクロン～１００ミクロンまで変化する深さを有するマイクロウェルのアレイが構造化される。
【0219】
ガラス及びポリ（ジメチルシロキサン）表面上に共有結合的に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドプローブを使用する、微細藻類を引き起こす有害な藻類ブルームの検出に基づき（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１３．１０．１１１７／１２．２０３４０１１）、基材を官能化して、マイクロウェル内にアミン修飾ＤＮＡ鎖を固定化する。
【0220】
標準的なＤＮＡスポッティングプロトコルを使用して、５’アミン修飾された一本鎖ＤＮＡが堆積され、その後、各マイクロウェルにおいて異なるバーコードを有するマイクロウェル内にグラフトされる。
【0221】
ＤＮＡマイクロウェルの構造を図１１に示す。
【0222】
実施例１と同じプロトコルに従って、局在化システムをアレイの設計に組み込む。
【0223】
デバイスの閉鎖
デバイスの閉鎖は、保護するマイクロアレイがＰＤＭＳ基材上にあることを示す実施例１と同一である。
デバイスの閉鎖は、保護するマイクロアレイがＰＤＭＳ基材上にあることを示す実施例１と同一である。
【0224】
特異的捕捉のためのチップの調製：ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ
１００ｍＭ酢酸カリウム；３０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び１００μＭのオリゴヌクレオチドＣ、Ｄ、Ｅ及びＩの溶液を、４０℃でマイクロ流体チャンバー内に注入する（ケージは開いている）。フローを停止し、混合オリゴヌクレオチドを有するチップを６０℃超で２分間加熱し、次いで室温で１０分間冷却し、４０℃のＰＢＳ溶液でリンスする。
１００ｍＭ酢酸カリウム；３０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び１００μＭのオリゴヌクレオチドＣ、Ｄ、Ｅ及びＩの溶液を、４０℃でマイクロ流体チャンバー内に注入する（ケージは開いている）。フローを停止し、混合オリゴヌクレオチドを有するチップを６０℃超で２分間加熱し、次いで室温で１０分間冷却し、４０℃のＰＢＳ溶液でリンスする。
【0225】
局在化のための蛍光イメージングを実施例１と同様に行う。
【0226】
単一細胞の捕捉
捕捉、溶解、ハイブリダイゼーション及びＲＴステップは実施例１に詳述されるとおりである。
捕捉、溶解、ハイブリダイゼーション及びＲＴステップは実施例１に詳述されるとおりである。
【0227】
ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液１×中に酵素ＢｍｔＩを含有する溶液を３７℃で注入し、次いで、チャンバー内で停止させて、バーコード化鎖をｃＤＮＡにライゲーションし、ｃＤＮＡをチップの表面から分離する。次いで、内容物をＰＢＳ溶液で押し出すことによって回収する。
【0228】
次いで、回収チューブを６５℃で２０分間インキュベートして、先に注入した酵素を不活性化する。
【0229】
ＥｘｏＩ処理の後、プライマーＪ及びＨを使用して、回収した試料に対してＰＣＲ増幅を実施する。
【0230】
次いで、ＰＣＲ産物を精製し、定量した後、配列決定する。
【0231】
配列決定データの脱多重化は、位置１～１５のバーコード、位置１６～２７のＵＭＩ、及びリード１の位置６０から始まるＲＮＡ転写物を見て実施する。
【0232】
実施例５－ｓｃＣＩＴＥアレイを有するＬＣＳＴケージにおけるＤＮＡ－ｓｅｑ
マイクロ流体デバイスは実施例１と同一である。
マイクロ流体デバイスは実施例１と同一である。
【0233】
特異的捕捉のためのチップの調製
調製は実施例１に詳述されるとおりであり、オリゴヌクレオチドＢに１０％のオリゴヌクレオチドＫを補充する。
調製は実施例１に詳述されるとおりであり、オリゴヌクレオチドＢに１０％のオリゴヌクレオチドＫを補充する。
【0234】
細胞標識
細胞を、図１２に示すように、抗体特異的バーコードを保有する部分集団特異的抗体で標識する。
細胞を、図１２に示すように、抗体特異的バーコードを保有する部分集団特異的抗体で標識する。
【0235】
抗体は、ストレプトアビジンにカップリングされる（例えば、ａｂｃａｍ－ａｂ１０２９２１からのストレプトアビジンコンジュゲーションキット－Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ－Ｌｉｎｋを使用）。細胞標識の前に、図６ｂに記載するようなビオチンコンジュゲートオリゴを１２：１の比で抗体溶液に加える。
【0236】
捕捉、溶解及びライブラリー調製
捕捉、溶解及びハイブリダイゼーションステップは実施例１に詳述されるとおりである。
捕捉、溶解及びハイブリダイゼーションステップは実施例１に詳述されるとおりである。
【0237】
完全に洗浄した後、１０Ｕ／μｌの逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍａｘｉｍａ Ｈ＋）、０．５ｍＭのｄＮＴＰ及び１Ｕ／μｌのＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤並びに２６μＭのオリゴヌクレオチドＦをＲＴ緩衝液１×中に含む混合物をチャンバー内に注入し、続いて流れを止め、捕捉された鎖の逆転写を５５℃で２時間進行させる。酵素を直ちにＰＢＳ水溶液でフラッシュしてＲＴを停止させる。
【0238】
１ｍＭ ＡＴＰを補充したＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液１×中に酵素ＢｍｔＩ及びＨｉ－Ｔ４リガーゼを含有する第２の混合物を３７℃で注入し、次いで、チャンバー内で停止させて、バーコード化鎖をｃＤＮＡにライゲーションし、ＤＮＡアレイからｃＤＮＡを分離する。次いで、ＰＢＳの溶液を流すことによって内容物を回収する。
【0239】
次いで、回収チューブを６５℃で２０分間インキュベートして、先に注入した酵素を不活性化する。
【0240】
ＥｘｏＩ処理の後、プライマーＧ、Ｈ及びＬを使用して、回収した試料に対してＰＣＲ増幅を実施する。
【0241】
次いで、ＰＣＲ産物を精製し、定量した後、配列決定する。
【0242】
配列決定データの脱多重化を実施例１のように行い、更に、リード１の９７位から始まる抗体タグを調べる。
【0243】
実施例６－ブリッジ型ＤＮＡアレイを用いたＬＣＳＴケージにおける全ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ
第１の基材の準備
プロトコルは実施例１に詳述するとおりである。
第１の基材の準備
プロトコルは実施例１に詳述するとおりである。
【0244】
第２の基材の準備
ＤＮＡアレイは実施例１に詳述されているが、本例では代わりに図１３に示される配列を有する。
ＤＮＡアレイは実施例１に詳述されているが、本例では代わりに図１３に示される配列を有する。
【0245】
デバイスの閉鎖
実施例１に詳述するとおりである。
実施例１に詳述するとおりである。
【0246】
特異的捕捉のためのチップの調製：ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ
ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液１×中に酵素Ｎｂ．ＢｓｔＩを含有する溶液を、マイクロ流体チャンバー内に３７℃（ケージ開放）で注入して、フリッピングステップに進める。
ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液１×中に酵素Ｎｂ．ＢｓｔＩを含有する溶液を、マイクロ流体チャンバー内に３７℃（ケージ開放）で注入して、フリッピングステップに進める。
【0247】
流れを３７℃で１０分間停止し、３７℃のＰＢＳ溶液でリンスする。
【0248】
１ｍＭのＡＴＰ及び２０μＭのオリゴヌクレオチドＭ、Ｎを補充したＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液１×中に酵素Ｈｉ－Ｔ４リガーゼを含有する溶液を、マイクロ流体チャンバー内に３７℃（ケージは開いている）で注入して、伸長ステップに進む。
【0249】
流れを３７℃で１０分間停止し、３７℃のＰＢＳ溶液でリンスする。
【0250】
次に、１００ｍＭ酢酸カリウムの溶液（３０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５））及び２０μＭのオリゴヌクレオチドＣ、Ｄ、Ｅをマイクロ流体チャンバー内に４０℃で注入して、蛍光配列を固定されたＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせる（局在化ステップ）。
【0251】
フローを停止し、混合オリゴヌクレオチドを有するチップを６０℃超で２分間加熱し、次いで室温で１０分間冷却し、３７℃のＰＢＳ溶液でリンスする。
【0252】
局在化のための蛍光イメージングを実施例１と同様に行う。
【0253】
捕捉、溶解及びライブラリー調製
捕捉、溶解及びハイブリダイゼーションステップは実施例１に詳述されるとおりである。
捕捉、溶解及びハイブリダイゼーションステップは実施例１に詳述されるとおりである。
【0254】
完全に洗浄した後、１０Ｕ／μｌの逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍａｘｉｍａ Ｈ＋）、０．５ｍＭのｄＮＴＰ及び１Ｕ／μｌのＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤並びに２６μＭのオリゴヌクレオチドＦをＲＴ緩衝液１×中に含む混合物をチャンバー内に注入し、続いて流れを止め、捕捉された鎖の逆転写を５５℃で２時間進行させる。酵素を直ちにＰＢＳ水溶液でフラッシュしてＲＴを停止させる。
【0255】
ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液１×中に酵素ＮｈｅＩを含有する第２の混合物を３７℃で注入し、次いで、チャンバー内で停止させて、バーコード化鎖をｃＤＮＡにライゲーションし、ＤＮＡアレイからｃＤＮＡを分離する。次いで、内容物をＰＢＳ溶液で押し出すことによって回収する。
【0256】
次いで、回収チューブを６５℃で２０分間インキュベートして、先に注入した酵素を不活性化する。
【0257】
ＥｘｏＩ処理の後、プライマーＯ及びＨを使用して、回収した試料に対してＰＣＲ増幅を実施する。
【0258】
次いで、ＰＣＲ産物を精製し、定量した後、配列決定する。
【0259】
配列決定データの脱多重化は、位置２２～３６のバーコード、位置６３～７４のＵＭＩ、及びリード１の位置１０７から始まるＲＮＡ転写物を見て実施する。
【0260】
実施例７－ＵＣＳＴケージにおけるｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑ
第１の基材の準備
プロトコルは実施例３に詳述するとおりである。
第１の基材の準備
プロトコルは実施例３に詳述するとおりである。
【0261】
第２の基材の準備
ＤＮＡアレイは実施例３に詳述されているが、本例では図１４に示される配列を有する。
ＤＮＡアレイは実施例３に詳述されているが、本例では図１４に示される配列を有する。
【0262】
デバイスの閉鎖
実施例３に詳述するとおりである。
実施例３に詳述するとおりである。
【0263】
特異的捕捉のためのチップの調製：ｓｃＡｔＡＣ－ｓｅｑ
１× Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液中に酵素Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ Ｍ０２０１）を含有する溶液を、２０℃でマイクロ流体チャンバー内に注入し（ケージは開いている）、３７℃で３０分間インキュベートして、ＤＮＡアレイ上に固定された鎖の５’リン酸化を進行させる。
１× Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液中に酵素Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ Ｍ０２０１）を含有する溶液を、２０℃でマイクロ流体チャンバー内に注入し（ケージは開いている）、３７℃で３０分間インキュベートして、ＤＮＡアレイ上に固定された鎖の５’リン酸化を進行させる。
【0264】
次いで、チャンバーを２０℃のＰＢＳ溶液でリンスする。
【0265】
１００ｍＭ酢酸カリウムの溶液；３０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５））及び２０μＭのオリゴヌクレオチドＣ、Ｄ、Ｅをマイクロ流体チャンバー内に２０℃で注入して、更なる蛍光配列を固定されたＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせる（局在化ステップ）。
【0266】
フローを停止し、混合オリゴヌクレオチドを有するチップを６０℃超で２分間加熱し、次いで室温で１０分間冷却し、２０℃のＰＢＳ溶液でリンスする。
【0267】
局在化のための蛍光イメージングを実施例１と同様に行う。
【0268】
２０μｍのオリゴヌクレオチドＡを含む１×ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液中に酵素ｐｈｉ２９を含有する溶液を、２０℃でマイクロ流体チャンバー（ケージ開放）内に注入して、二本鎖ＤＮＡアダプター（バーコード化ＭＥＤＳ）を作製する。
【0269】
３７℃で１０分間インキュベートした後、チャンバーを２０℃のＰＢＳ溶液でリンスする。
【0270】
捕捉、溶解及びライブラリー調製
捕捉及び溶解は実施例３に詳述されるとおりである。
捕捉及び溶解は実施例３に詳述されるとおりである。
【0271】
ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液１×中に酵素ＢｍｔＩを含有する混合物を３７℃で注入し、次いでチャンバー内で停止させ、３７℃で１０分間インキュベートして、ＤＮＡアレイからｄｓＤＮＡを放出させる。
【0272】
次いで、１×ＴＤ反応緩衝液中にＮｅｘｔｅｒａ Ｔｎ５トランスポザーゼ（ＴＤＥ１）を含む混合物を３７℃でチャンバー内に注入し、その後、３７℃で３０分間フローを固定化して転位を進行させる。
【0273】
次いで、２０℃の水の溶液を流すことによって内容物を回収する。
【0274】
ＥｘｏＩ処理の後、プライマーＧ及びＰを使用して、回収した試料に対してＰＣＲ増幅を実施する。
【0275】
次いで、ＰＣＲ産物を精製し、定量した後、配列決定する。
【0276】
配列決定データの脱多重化は、位置３０～４４のバーコード、及びリード１の位置６４から開始するＤＮＡ転写物を見て実施する。
【0277】
参考文献：Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ，Ｊ．，Ｗｕ，Ｂ．，Ｌｉｔｚｅｎｂｕｒｇｅｒ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｒｅｖｅａｌｓ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｖａｒｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ５２３，４８６－４９０（２０１５）
【0278】
実施例８－精製ＲＮＡを有するＤＮＡアレイ株を用いたＬＣＳＴケージ中の全ＲＮＡ配列決定
熱作動性ヒドロゲルの合成
詳細は実施例１に示すとおりである。
熱作動性ヒドロゲルの合成
詳細は実施例１に示すとおりである。
【0279】
第１の基材の準備
詳細は実施例１に示すとおりである。
詳細は実施例１に示すとおりである。
【0280】
第１の基材の官能化
詳細は実施例１に示すとおりである。
詳細は実施例１に示すとおりである。
【0281】
第１の基材上へのヒドロゲルフィルムの光パターニング
詳細は実施例１に示すとおりである。
詳細は実施例１に示すとおりである。
【0282】
第２の基材の準備
使用される第２の基材は、ＤＮＡ鎖がスポットされたスライドガラスである（Ａｇｉｌｅｎｔから購入、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｆｏｒｍａｔとして参照）。
使用される第２の基材は、ＤＮＡ鎖がスポットされたスライドガラスである（Ａｇｉｌｅｎｔから購入、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｆｏｒｍａｔとして参照）。
【0283】
このアイテムは、異なるＤＮＡ鎖がグラフトされた１００万個までの固有のスポットを提示しつつ、各スポット上に異なるバーコードを提供する。各スポットは何百万ものＤＮＡ鎖を含有する。
【0284】
ＤＮＡのマイクロアレイ構造を図１５に示し、各スポットは異なるバーコードを有する。
【0285】
局在化システムがアレイの設計中に組み込まれる。多数の独特なスポットの中で、それらのいくつかは、ハイブリダイゼーションによる蛍光標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチド（２つ以上）の捕捉のための特異的配列を有する。それらは、図９に示すように、三角形、四角形及び円形を含む複数の形状を形成するように配置される。
【0286】
デバイスの閉鎖
詳細は実施例１に示すとおりである。
詳細は実施例１に示すとおりである。
【0287】
特異的捕捉のためのチップの調製：全ＲＮＡ－ｓｅｑ
オリゴヌクレオチドをインシリコで設計し、標準的な脱塩を行ったＩＤＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）中、２５～１００μＭの濃度でＩＤＴから購入した。
オリゴヌクレオチドをインシリコで設計し、標準的な脱塩を行ったＩＤＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）中、２５～１００μＭの濃度でＩＤＴから購入した。
【0288】
１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５及び１０μＭのオリゴヌクレオチドＱ、Ｒ及びＳの溶液を、マイクロ流体チャンバー内に４０℃（ケージ開放）で注入して、更なる捕捉配列を固定されたＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせ、局在化ステップに進める。フローを停止し、混合オリゴヌクレオチドを有するチップを６０℃超で２分間加熱し、次いで室温で１０分間インキュベートし、４０℃で１×ＳＳＣ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃１５４１３５４９）でリンスする。
【0289】
メインチャンバーの明視野蛍光イメージング（６５０ｎｍで励起及び６７０ｎｍで発光）を行う。ＤＮＡアレイスポット及びケージのインフォーマティック識別を、図１６に示すように実施する。識別は、両方のイメージの重ね合わせに基づく。明視野イメージは、ケージを識別することを可能にする。図１６の黒丸Ａ、Ｂ及びＣによって表される蛍光イメージは、蛍光ＤＮＡプローブが上に予めハイブリダイズされている特定のスポットを同定することを可能にする。これらの円の相対位置は、チップ上の固有の位置を規定し、ＤＮＡアレイの元の構成を重ね合わせたイメージ上にマッピングすることを可能にする。最後に、この識別のおかげで、スポット特異的バーコードを各ケージと関連付けることができる。
【0290】
プライマー合成。
【0291】
１ｍＭ ＡＴＰ（ＮＥＢ＃Ｐ０７５６Ｓ）を補充したＴｈｅｒｍｏｐｏｌ １×（ＮＥＢ＃Ｂ９００４Ｓ）中にＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩＶ（ＮＥＢ＃Ｍ０３２７Ｓ）及びＨｉ－Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ＃Ｍ２６２２Ｓ）を含有する混合物を４０℃で注入し、次いで、チャンバー内で５０℃で２時間インキュベートして、バーコード化したプライマーを重合及びライゲーションする。次いで、内容物を４０℃の１×ＳＳＣ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃１５４１３５４９）でリンスする。
【0292】
細胞培養
ＪｕｒｋａｔヒトＴリンパ球ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－１５２を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ＃１００８２１４７）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０１２２）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ＃６１８７００４４）中で培養する。細胞を、ＡＴＣＣ推奨に従って、５％ＣＯ２を含む３７℃で、２５ｃｍ２又は７５ｃｍ２培養フラスコに播種する。７５～８０％コンフルエンスに達したら、細胞を希釈する。細胞培養物から回収した後、最後に細胞を１３０ｒ．ｃ．ｆ．で５分間遠心分離する。
ＪｕｒｋａｔヒトＴリンパ球ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－１５２を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ＃１００８２１４７）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０１２２）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ＃６１８７００４４）中で培養する。細胞を、ＡＴＣＣ推奨に従って、５％ＣＯ２を含む３７℃で、２５ｃｍ２又は７５ｃｍ２培養フラスコに播種する。７５～８０％コンフルエンスに達したら、細胞を希釈する。細胞培養物から回収した後、最後に細胞を１３０ｒ．ｃ．ｆ．で５分間遠心分離する。
【0293】
ｍＲＮＡ鎖の捕捉
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ＃７４１０４）を使用してＪｕｒｋａｔ細胞から全ＲＮＡを精製し、１×ＳＳＣ及び１Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃１１５８１５０５）とともに４０℃で注入した。次いで、マイクロ流体デバイスを６５℃で５分間インキュベートし、次いで４℃まで下げ、続いて２５℃で５分間インキュベートする。続いて、ｍＲＮＡ鎖を、グラフトされた捕捉配列にハイブリダイズさせる。
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ＃７４１０４）を使用してＪｕｒｋａｔ細胞から全ＲＮＡを精製し、１×ＳＳＣ及び１Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃１１５８１５０５）とともに４０℃で注入した。次いで、マイクロ流体デバイスを６５℃で５分間インキュベートし、次いで４℃まで下げ、続いて２５℃で５分間インキュベートする。続いて、ｍＲＮＡ鎖を、グラフトされた捕捉配列にハイブリダイズさせる。
【0294】
バーコード化ｃＤＮＡ合成
３７℃でケージを開放し、チャンバーの内容積の２０倍に相当する体積のＲＴ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃ＥＰ０７４２）をチャンバーに３分間流すことによって、洗浄ステップを行う。
３７℃でケージを開放し、チャンバーの内容積の２０倍に相当する体積のＲＴ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃ＥＰ０７４２）をチャンバーに３分間流すことによって、洗浄ステップを行う。
【0295】
洗浄後、１×ＲＴ緩衝液中に１０Ｕ／μｌの逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃ＥＰ０７４２）、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ（ＮＥＢ＃Ｎ０４４７Ｓ）及び１Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃１１５８１５０５）を含む混合物をチャンバー内に注入し、続いてフローの固定化及び捕捉された鎖の逆転写を５０℃で２時間行う。酵素を直ちに１×ＳＳＣ溶液でフラッシュして、逆転写を停止させる。
【0296】
１×Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ反応緩衝液（ＮＥＢ＃Ｍ０２９３Ｓ）中に２Ｕ／μｌのエキソヌクレアーゼＩを含有する第２の混合物を注入し、３７℃で３０分間インキュベートする。酵素を直ちに１×ＳＳＣ溶液でフラッシュして反応を停止させる。
【0297】
ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ不含蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１０９７７０２３）をチャンバーに注入し、９８℃まで加熱して合成ｃＤＮＡを脱ハイブリダイズする。次いで、追加の水を流すことによって内容物を回収する。
【0298】
１０μＬのＮＥＢ２緩衝液（ＮＥＢ＃Ｍ０２１２Ｌ）及び１０μＬの１０μＭオリゴヌクレオチドＴを、６５ｕＬの回収した試料に添加する。
【0299】
溶液を９５℃で２分間インキュベートし、直ちに氷に移す。次いで、８μＬの１０ｎｍ ｄＮＴＰ及び７μＬのＫｌｅｎｏｗ ｅｘｏ（ＮＥＢ＃Ｍ０２１２Ｌ）を添加する。
【0300】
混合物を４℃に予冷したサーモサイクラーに入れ、温度をゆっくりと３７℃に上げ、３０分間保持して第２鎖の合成を行う。
【0301】
次いで、ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ＃Ｂ２３３１７）を製造業者の指示に従って使用してｃＤＮＡを精製する。
【0302】
次いで、プライマーＧ及びＨ並びにＱ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ＃Ｍ０４９１）を使用して、精製された試料に対して、３０秒の伸長を伴う２段階ＰＣＲ増幅を１５サイクル行う。
【0303】
ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ＃Ｂ２３３１７）を使用してＰＣＲ産物を精製し、定量した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォームを使用して配列決定する。
【0304】
配列決定データの逆多重化は、各リードについて、Ｉｎｄｅｘ１リードの１～１５位からのバーコード、Ｒｅａｄ１リードの１～１２位からのＵＭＩ、及びＲｅａｄ２リードの１位から始まるＲＮＡ転写物を検索することによって実施される。
【0305】
１，５０４，９５７個の完全な配列決定されたリードのうち、本発明者らは、ユニークバーコード、ユニーク遺伝子及びユニークＵＭＩを有するリードとして決定された７３８，４８３個のユニークｃＤＮＡを同定した。本発明者らは、バーコード当たり平均１０２リード及びバーコード当たり５０ＵＭＩの中央値を同定した。配列決定は、ＵＭＩ当たりのリード数が少ないことによって示されるように、飽和するほど十分に深くなかった。
【0306】
図１７は、配列決定データにおいて有効な遺伝子を提示するリードから抽出された１４，７５２個のバーコードのマイクロ流体デバイスにおける空間再分割を表す。各黒丸は、そのバーコードが配列決定データ中の少なくとも１つのｃＤＮＡに関連するＤＮＡアレイからのＤＮＡスポットを表す。欠けている円は、配列決定データにおいて少なくとも１つのｃＤＮＡに関連してバーコードが見出されなかったＤＮＡアレイからのＤＮＡスポットである。回収されたバーコードの位置によって表される六角形形状は、マイクロ流体デバイス製造中に酸素プラズマから保護された領域に対応する。保護領域におけるスポットの大部分は、配列決定データにおいて同定されている。
【0307】
１４，５０７個のユニークな遺伝子を、有効なバーコードを提示するリードから抽出した。
【0308】
図１８は、実施例８において配列決定によって同定された遺伝子の長さ分布を表す。パネルａは、Ｅｎｓｅｍｂｌバージョン１０４．３８によってアノテートされたＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍのアセンブリＧＲＣｈ３８．ｐ１３ Ｇｅｎｏｃｏｄｅ ３８におけるタンパクコード遺伝子としてアノテートされた２０，４６５個の遺伝子の長さ分布を表す（ｈｔｔｐ：／／ｍａｙ２０２１．ａｒｃｈｉｖｅ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ／Ｉｎｆｏ／Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎを参照）。遺伝子長は、エキソン長の合計として決定される。各遺伝子について、選択的スプライシング変異体の平均サイズを使用した。パネルｂは、配列決定データにおいて有効な遺伝子及び有効なバーコードを提示するリードから同定された１４，５０７個の固有の遺伝子のみの同じデータベースからの長さ分布を表す。パネルａ及びｂにおけるサイズ分布の類似性は、遺伝子回収におけるサイズバイアスの非存在を実証する。
【0309】
これをＪｕｒｋａｔ細胞で２回繰り返し、Ｊｕｒｋａｔ細胞と同様の条件で培養したＲａｍｏｓヒトＢリンパ球ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１９２３細胞で１回繰り返した。図１９は、２つの異なる細胞株を用いた実施例８の３つの反復のクラスタリングのための注釈付きＵＭＡＰを表す（ＭｃＩｎｎｅｓ，Ｌ，Ｈｅａｌｙ，Ｊ，ＵＭＡＰ：Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ，ＡｒＸｉｖ ｅ－ｐｒｉｎｔｓ １８０２．０３４２６，２０１８）。実施例８に記載のＲＮＡ－ｓｅｑを、ＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞で２回、ＲａｍｏｓヒトＢ細胞で１回繰り返した。各実験について、１５，０００個のバーコードをランダムにグループ化して、２００個のスーパーバーコードを形成して、浅い配列決定深さ及びクラスタリングを防止するバーコード当たりの同定されたｃＤＮＡの数が少ないことに対処する。次に、Ｓｃａｎｐｙ Ｐｙｔｈｏｎソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｃａｎｐｙ．ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ．ｉｏ）を使用して、主成分分析（ＰＣＡ）を実行し、次いでライデングラフクラスタリング法（Ｔｒａａｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｆｒｏｍ Ｌｏｕｖａｉｎ ｔｏ Ｌｅｉｄｅｎ：ｇｕａｒａｎｔｅｅｉｎｇ ｗｅｌｌ－ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ）を使用してクラスターを検出し、注釈を追加する前にＵＭＡＰグラフを介して２次元でクラスタリングを表す。完全な手順は、以下のリンクでＳｃａｎｐｙウェブサイト上で詳述される：ｈｔｔｐｓ：／／ｓｃａｎｐｙ－ｔｕｔｏｒｉａｌｓ．ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ．ｉｏ／ｅｎ／ｌａｔｅｓｔ／ｐｂｍｃ３ｋ．ｈｔｍｌ＃Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ－ｔｈｅ－ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ－ｇｒａｐｈ。
【0310】
２つのクラスターが同定され、一方（クラスター１）は、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｔ細胞）を用いた２つの実験からのデータから構成され、他方（クラスター２）は、Ｒａｍｏｓ細胞（Ｂ細胞）を用いた実験からのデータから構成され、この方法が、異なる（密接に関連する）細胞型を同定するために使用され得ることを実証する。
【0311】
実施例９－Ｊｕｒｋａｔ及びＲａｍｏｓヒト細胞の混合物から開始するＤＮＡアレイを用いたＬＣＳＴケージにおける全ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ。
【0312】
手順は、マイクロ流体デバイスに精製ＲＮＡを注入する代わりに、実施例１に記載されるようにチップに細胞を注入し、捕捉し、溶解することを除いて、実施例８と同一である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】
【国際調査報告】