特表 2024-505150 トランスジェニックＣｏｒｙ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-05

(54)【発明の名称】トランスジェニックＣｏｒｙ

(51)【国際特許分類】

   A01K 67/027 20240101AFI20240129BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240129BHJP

【ＦＩ】

A01K67/027

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023541962

(86)(22)【出願日】2022-01-12

(85)【翻訳文提出日】2023-08-24

(86)【国際出願番号】 US2022012158

(87)【国際公開番号】W WO2022155230

(87)【国際公開日】2022-07-21

(31)【優先権主張番号】63/136,454

(32)【優先日】2021-01-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/136,464

(32)【優先日】2021-01-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/136,460

(32)【優先日】2021-01-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519351303

【氏名又は名称】グローフィッシュ，リミティド ライアビリティ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100225598

【弁理士】

【氏名又は名称】桐島 拓也

(72)【発明者】

【氏名】アラン ブレイク

(72)【発明者】

【氏名】リチャード クロケット

(72)【発明者】

【氏名】アイダス ナセビシウス

(57)【要約】

本発明は、トランスジェニック観賞魚、並びに生殖細胞移植技術によってそのような魚を作製する方法に関する。また、そのようなトランスジェニック魚の個体群を確立する方法、及びマーケティングを目的として観賞魚産業にそれらを提供する方法も開示される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含むトランスジェニックＣｏｒｙであって、前記Ｃｏｒｙが、「Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」を含む、トランスジェニックＣｏｒｙ。

【請求項2】

繁殖力のあるトランスジェニックＣｏｒｙとして更に定義され、前記Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含む凍結保存された成体生殖幹細胞が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２７０９４として寄託されている、請求項１に記載のトランスジェニックＣｏｒｙ。

【請求項3】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してホモ接合性である、請求項１に記載のトランスジェニックＣｏｒｙ。

【請求項4】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項１に記載のトランスジェニックＣｏｒｙ。

【請求項5】

トランスジェニックＣｏｒｙを観賞魚市場に提供する方法であって、請求項１に記載のトランスジェニックＣｏｒｙを得ることと、前記魚を観賞魚市場に流通させることと、を含む、方法。

【請求項6】

前記魚が、養殖者によって商業的流通業者に流通される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記魚が、養殖者又は商業的流通業者によって小売業者に流通される、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

前記小売業者が、観賞魚部門を有する多品種小売業者である、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

トランスジェニックＣｏｒｙを生産する方法であって、
（ａ）蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含むＣｏｒｙを得ることであって、前記Ｃｏｒｙが、「Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」を含む、得ることと、
（ｂ）得られた前記Ｃｏｒｙを第２のＣｏｒｙと繁殖させて、前記Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＣｏｒｙを提供することと、を含む、方法。

【請求項10】

前記第２のＣｏｒｙが、非トランスジェニックＣｏｒｙである、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含む、請求項１に記載のトランスジェニックＣｏｒｙの子孫であって、前記Ｃｏｒｙ及び前記子孫が、蛍光を呈し、「Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」を含み、前記Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含む凍結保存された成体生殖幹細胞が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２７０９４として寄託されている、子孫。

【請求項12】

繁殖力のあるトランスジェニックＣｏｒｙとして更に定義される、請求項１１に記載の子孫の魚。

【請求項13】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してホモ接合性である、請求項１１に記載の子孫の魚。

【請求項14】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項１１に記載の子孫の魚。

【請求項15】

トランスジェニック魚を観賞魚市場に提供する方法であって、請求項１１に記載の子孫の魚を得ることと、前記魚を観賞魚市場に流通させることと、を含む、方法。

【請求項16】

前記魚が、養殖者によって商業的流通業者に流通される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記魚が、養殖者又は商業的流通業者によって小売業者に流通される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記小売業者が、観賞魚部門を有する多品種小売業者である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

トランスジェニック魚を生産する方法であって、
（ａ）請求項１１に記載のトランスジェニック魚を得ることと、
（ｂ）得られた前記魚を第２の魚と繁殖させて、前記Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含むトランスジェニック魚を提供することと、を含む、方法。

【請求項20】

前記第２の魚が、非トランスジェニック魚である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含むトランスジェニックＣｏｒｙであって、前記Ｃｏｒｙが、「Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」を含む、トランスジェニックＣｏｒｙ。

【請求項22】

繁殖力のあるトランスジェニックＣｏｒｙとして更に定義され、前記Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含む凍結保存された成体生殖幹細胞が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２７０９５として寄託されている、請求項２１に記載のトランスジェニックＣｏｒｙ。

【請求項23】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してホモ接合性である、請求項２１に記載のトランスジェニックＣｏｒｙ。

【請求項24】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項２１に記載のトランスジェニックＣｏｒｙ。

【請求項25】

トランスジェニックＣｏｒｙを観賞魚市場に提供する方法であって、請求項２１に記載のトランスジェニックＣｏｒｙを得ることと、前記魚を観賞魚市場に流通させることと、を含む、方法。

【請求項26】

前記魚が、養殖者によって商業的流通業者に流通される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記魚が、養殖者又は商業的流通業者によって小売業者に流通される、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記小売業者が、観賞魚部門を有する多品種小売業者である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

トランスジェニックＣｏｒｙを生産する方法であって、
（ａ）蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含むＣｏｒｙを得ることであって、前記Ｃｏｒｙが、「Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」を含む、得ることと、
（ｂ）得られた前記Ｃｏｒｙを第２のＣｏｒｙと繁殖させて、前記Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＣｏｒｙを提供することと、を含む、方法。

【請求項30】

前記第２のＣｏｒｙが、非トランスジェニックＣｏｒｙである、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含む、請求項２１に記載のトランスジェニックＣｏｒｙの子孫であって、前記Ｃｏｒｙ及び前記子孫が、蛍光を呈し、「Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」を含み、前記Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含む凍結保存された成体生殖幹細胞が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２７０９５として寄託されている、子孫。

【請求項32】

繁殖力のあるトランスジェニックＣｏｒｙとして更に定義される、請求項３１に記載の子孫の魚。

【請求項33】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してホモ接合性である、請求項３１に記載の子孫の魚。

【請求項34】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項３１に記載の子孫の魚。

【請求項35】

トランスジェニック魚を観賞魚市場に提供する方法であって、請求項３１に記載の子孫の魚を得ることと、前記魚を観賞魚市場に流通させることと、を含む、方法。

【請求項36】

前記魚が、養殖者によって商業的流通業者に流通される、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記魚が、養殖者又は商業的流通業者によって小売業者に流通される、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記小売業者が、観賞魚部門を有する多品種小売業者である、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

トランスジェニック魚を生産する方法であって、
（ａ）請求項３１に記載のトランスジェニック魚を得ることと、
（ｂ）得られた前記魚を第２の魚と繁殖させて、前記Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含むトランスジェニック魚を提供することと、を含む、方法。

【請求項40】

前記第２の魚が、非トランスジェニック魚である、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含むトランスジェニックＣｏｒｙであって、前記Ｃｏｒｙが、「Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」を含む、トランスジェニックＣｏｒｙ。

【請求項42】

繁殖力のあるトランスジェニックＣｏｒｙとして更に定義され、前記Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含む凍結保存された成体生殖幹細胞が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２７０９６として寄託されている、請求項４１に記載のトランスジェニックＣｏｒｙ。

【請求項43】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してホモ接合性である、請求項１に記載のトランスジェニックＣｏｒｙ。

【請求項44】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項４１に記載のトランスジェニックＣｏｒｙ。

【請求項45】

トランスジェニックＣｏｒｙを観賞魚市場に提供する方法であって、請求項１に記載のトランスジェニックＣｏｒｙを得ることと、前記魚を観賞魚市場に流通させることと、を含む、方法。

【請求項46】

前記魚が、養殖者によって商業的流通業者に流通される、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記魚が、養殖者又は商業的流通業者によって小売業者に流通される、請求項４５に記載の方法。

【請求項48】

前記小売業者が、観賞魚部門を有する多品種小売業者である、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

トランスジェニックＣｏｒｙを生産する方法であって、
（ａ）蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含むＣｏｒｙを得ることであって、前記Ｃｏｒｙが、「Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」を含み、前記Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含む凍結保存された成体生殖幹細胞が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２７０９６として寄託されている、得ることと、
（ｂ）得られた前記Ｃｏｒｙを第２のＣｏｒｙと繁殖させて、前記Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＣｏｒｙを提供することと、を含む、方法。

【請求項50】

前記第２のＣｏｒｙが、非トランスジェニックＣｏｒｙである、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含む、請求項４１に記載のトランスジェニックＣｏｒｙの子孫であって、前記Ｃｏｒｙ及び前記子孫が、蛍光を呈し、「Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」を含み、前記Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含む凍結保存された成体生殖幹細胞が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２７０９６として寄託されている、子孫。

【請求項52】

繁殖力のあるトランスジェニックＣｏｒｙとして更に定義される、請求項５１に記載の子孫の魚。

【請求項53】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してホモ接合性である、請求項５１に記載の子孫の魚。

【請求項54】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項５１に記載の子孫の魚。

【請求項55】

トランスジェニック魚を観賞魚市場に提供する方法であって、請求項５１に記載の子孫の魚を得ることと、前記魚を観賞魚市場に流通させることと、を含む、方法。

【請求項56】

前記魚が、養殖者によって商業的流通業者に流通される、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記魚が、養殖者又は商業的流通業者によって小売業者に流通される、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

前記小売業者が、観賞魚部門を有する多品種小売業者である、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

トランスジェニック魚を生産する方法であって、
（ａ）請求項５１に記載のトランスジェニック魚を得ることと、
（ｂ）得られた前記魚を第２の魚と繁殖させて、前記Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含むトランスジェニック魚を提供することと、を含む、方法。

【請求項60】

前記第２の魚が、非トランスジェニック魚である、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

緑色蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットと、オレンジ色蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットと、を含む、トランスジェニックｃｏｒｙ。

【請求項62】

繁殖力のあるトランスジェニックｃｏｒｙとして更に定義される、請求項６１に記載のトランスジェニックｃｏｒｙ。

【請求項63】

繁殖不能なトランスジェニックＹｅｌｌｏｗ Ｃｏｒｙとして更に定義される、請求項６１に記載のトランスジェニックｃｏｒｙ。

【請求項64】

前記魚が、前記組み込み発現カセットのうちの少なくとも１つに対してホモ接合性である、請求項６１に記載のトランスジェニックｃｏｒｙ。

【請求項65】

前記魚が、前記組み込み発現カセットのうちの少なくとも１つに対してヘテロ接合性である、請求項６１又は６４に記載のトランスジェニックｃｏｒｙ。

【請求項66】

トランスジェニックｃｏｒｙを観賞魚市場に提供する方法であって、請求項６１に記載のトランスジェニックｃｏｒｙを得ることと、前記魚を観賞魚市場に流通させることと、を含む、方法。

【請求項67】

前記魚が、養殖者によって商業的流通業者に流通される、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記魚が、養殖者又は商業的流通業者によって小売業者に流通される、請求項６６に記載の方法。

【請求項69】

前記小売業者が、観賞魚部門を有する多品種小売業者である、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

トランスジェニックｃｏｒｙを生産する方法であって、
（ａ）緑色蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットと、オレンジ色蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットと、を含むｃｏｒｙを得ることと、
（ｂ）得られた前記ｃｏｒｙを第２のｃｏｒｙで繁殖させることと、を含む、方法。

【請求項71】

前記第２のｃｏｒｙが、非トランスジェニックｃｏｒｙである、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

緑色蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットと、オレンジ色蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットと、を含む、請求項６１に記載のトランスジェニックｃｏｒｙの子孫。

【請求項73】

繁殖力のあるトランスジェニックｃｏｒｙとして更に定義される、請求項７２に記載の子孫の魚。

【請求項74】

繁殖不能なＹｅｌｌｏｗ Ｃｏｒｙとして更に定義される、請求項７２に記載の子孫の魚。

【請求項75】

前記魚が、ＧＦＰ又はＹＦＰ組み込み発現カセットのうちの少なくとも１つに対してホモ接合性である、請求項７２に記載の子孫の魚。

【請求項76】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項７２に記載の子孫の魚。

【請求項77】

トランスジェニック魚を観賞魚市場に提供する方法であって、請求項７２に記載の子孫の魚を得ることと、前記魚を観賞魚市場に流通させることと、を含む、方法。

【請求項78】

前記魚が、養殖者によって商業的流通業者に流通される、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

前記魚が、養殖者又は商業的流通業者によって小売業者に流通される、請求項７７に記載の方法。

【請求項80】

前記小売業者が、観賞魚部門を有する多品種小売業者である、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

トランスジェニック魚を生産する方法であって、
（ａ）請求項７２に記載のトランスジェニック魚を得ることと、
（ｂ）得られた前記魚を第２の魚と繁殖させて、Ｙｅｌｌｏｗ ｃｏｒｙ １形質転換イベント形質転換イベントを含むトランスジェニック魚を提供することと、を含む、方法。

【請求項82】

前記第２の魚が、非トランスジェニック魚である、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

緑色蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットと、オレンジ色蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットと、を含む、トランスジェニックｃｏｒｙ。

【請求項84】

繁殖力のあるトランスジェニックｃｏｒｙとして更に定義される、請求項８３に記載のトランスジェニックｃｏｒｙ。

【請求項85】

繁殖不能なトランスジェニックＹｅｌｌｏｗ Ｃｏｒｙとして更に定義される、請求項８３に記載のトランスジェニックｃｏｒｙ。

【請求項86】

前記魚が、前記組み込み発現カセットのうちの少なくとも１つに対してホモ接合性である、請求項８３に記載のトランスジェニックｃｏｒｙ。

【請求項87】

前記魚が、前記組み込み発現カセットのうちの少なくとも１つに対してヘテロ接合性である、請求項８３又は８６に記載のトランスジェニックｃｏｒｙ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、ＰＣＴ国際特許出願として２０２２年１月１１日に出願され、全てが２０２１年１月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／１３６，４５４号、同第６３／１３６，４６０号、及び同第６３／１３６，４６４号の優先権及び利益を主張し、それらの各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、トランスジェニック魚、特に、赤色、ピンク色、オレンジ色、緑色、及び黄色のトランスジェニックＣｏｒｙに関する。

【0003】

導入
トランスジェニック技術は、宿主が新しい遺伝的形質を獲得することを可能にする宿主生物への外来遺伝子の移行を伴う。トランスジェニック技術には多くの潜在用途がある。例えば、それは、魚の新しい品種を作成するために、導入遺伝子を魚に導入するために使用することができる。マイクロインジェクション（例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８５、Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、エレクトロポレーション（Ｐｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、精子媒介性遺伝子導入（Ｋｈｏｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２、Ｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、遺伝子衝突又は遺伝子銃（Ｚｅｌｅｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、リポソーム媒介性遺伝子導入（Ｓｚｅｌｅｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、及び筋肉組織へのＤＮＡの直接注入（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９）を含む、外来遺伝子を魚に導入する多くの方法が存在する。

【0004】

最初のトランスジェニック魚の報告は、マウスメタロチオネイン遺伝子プロモーター及びヒト成長ホルモン遺伝子からなるキメラ遺伝子構築物を使用してＺｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）によって公開された。初期のトランスジェニック魚の研究のほとんどは、急速に成長する魚を生成することを目的とした成長ホルモン遺伝子導入に焦点を当ててきた。初期の試みの大部分は、異種成長ホルモン遺伝子及びプロモーターを使用し、これらの魚を生産することができなかったが（例えば、Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，１９８６、Ｐｅｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０、Ｂｒｅｍ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、トランスジェニック魚の増強された成長は、タイセイヨウサケ、タイヘイヨウサケのいくつかの種、及びドジョウを含むいくつかの魚種で示されている（例えば、Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，１９９２、Ｄｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，１９９５、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。

【0005】

Ｃｏｒｙｄｏｒａｓ（Ｃｏｒｙ）は、Ｃａｌｌｉｃｈｔｈｙｉｄａｅ及び亜科Ｃｏｒｙｄｏｒａｄｉｎａｅの淡水ナマズの属である。Ｃｏｒｙｄｏｒａｓに割り当てられた種は、体の色の幅広い多様性を示す。この属は、その多くの種について水族館管理者の間で周知である。それらの種は、他の種とうまくやっていて、まったく攻撃的ではないため、熱帯の淡水コミュニティ水族館に十分に好適である。しかし、観賞魚業界にとって、青銅、アルビノ、又は黒色の体は、様々な色の効率的な表示を助けない。蛍光タンパク質による遺伝子導入のための修飾された色素沈着を有するそのようなＣｏｒｙの利用可能性は、様々な色のより良好な視覚化に起因して、観賞魚産業のためのより良好な製品をもたらすであろう。

【0006】

多くの蛍光タンパク質が当該技術分野で既知であり、様々な緑色、赤色、ピンク色、黄色、オレンジ色、青色、又は紫色を呈する蛍光タンパク質を含む様々な細胞プロセスを調査するために使用されている。蛍光タンパク質を含むトランスジェニック実験は、遺伝子導入のための新しいマーカー及びレポーターを提供してきたが、そのようなタンパク質を発現するＣｏｒｙの開発及び生産の分野における進歩は限られている。

【0007】

トランスジェニックＣｏｒｙ
ある特定の実施形態では、本開示は、トランスジェニック蛍光魚を作製し、そのような魚を観賞魚産業に提供することに関する。

【0008】

いくつかの実施形態では、トランスジェニック魚又はトランスジェニック魚を作製する方法が提供される。ある特定の態様では、トランスジェニック魚は、繁殖力のあるトランスジェニック蛍光魚である。特定の実施形態では、開示される構築物及び方法とともに使用するための魚は、Ｃｏｒｙである。Ｃｏｒｙの皮膚の色は、皮膚内の色素細胞によって決定され、それは、メラノソーム（黒色又は茶色）、キサントソーム（黄色）、エリスロソーム（オレンジ色又は赤色）、又はイリドソーム（白色を含む虹色）と称される色素顆粒を含む。色素細胞当たりの色素顆粒の数、サイズ、及び密度は、魚の皮膚の色に影響を及ぼす。

【0009】

ある特定の具体的な実施形態では、本明細書において形質転換イベントと称される特定のトランスジェニック組み込みイベントを含むトランスジェニックＣｏｒｙ又はその子孫が提供される。これらの魚は、例えば、審美的に好ましい赤色を具現化するため、特に興味深いものである。これらの特定のトランスジェニックイベントを含むトランスジェニック魚は、形質転換イベントに対してホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、ヘミ接合性を含む）であり得る。形質転換イベントを欠く魚で繁殖したホモ接合性魚は、ほぼ全てのケースで１００％ヘテロ接合性子孫を生産する。これらの特定のトランスジェニックイベントを含む生殖細胞、卵子、精子、及び胚もまた、本発明の一部として含まれる。

【0010】

特定のトランスジェニック組み込みイベントに関する１つのそのような実施形態では、染色体組み込み導入遺伝子を含む赤色のトランスジェニックＣｏｒｙ又はその子孫が提供され、Ｃｏｒｙは、「Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」を含み、Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含む凍結保存された成体生殖幹細胞は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２７０９４として寄託されている。染色体組み込み導入遺伝子は、１つの組み込み発現カセット又は２つ以上の組み込み発現カセット上に存在してもよい。ある特定の態様では、そのようなトランスジェニックＣｏｒｙは、繁殖力のあるトランスジェニックＣｏｒｙである。そのようなトランスジェニックＣｏｒｙは、導入遺伝子又は組み込み発現カセットに対してホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、ヘミ接合性を含む）であり得る。

【0011】

また、Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＣｏｒｙを観賞魚市場に提供する方法も開示される。いくつかの実施形態では、方法は、染色体組み込み導入遺伝子を含むトランスジェニックＣｏｒｙ又はその子孫を得ることであって、Ｃｏｒｙは、「Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」を含み、Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含む凍結保存された成体生殖幹細胞は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２７０９４として寄託されている、得ることと、魚を観賞魚市場に流通させることと、を含む。そのような魚は、養殖者によって商業的流通業者に流通され得るか、又はそのような魚は、養殖者若しくは商業的流通業者によって、例えば、観賞魚部門を有する多品種小売業者などの小売業者に流通され得る。

【0012】

いくつかの態様では、（ａ）蛍光を呈し、かつ１つ以上の染色体組み込み導入遺伝子又は発現カセットを含むＣｏｒｙを得ることであって、Ｃｏｒｙが、「Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」を含み、Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含む凍結保存された成体生殖幹細胞が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２７０９４として寄託されている、得ることと、（ｂ）得られたＣｏｒｙを第２のＣｏｒｙと繁殖させて、Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＣｏｒｙを提供することと、を含むトランスジェニックＣｏｒｙを生産する方法が提供される。第２のＣｏｒｙは、トランスジェニック又は非トランスジェニックＣｏｒｙであり得る。

【0013】

更なる実施形態では、トランスジェニック生物を生産する方法もまた提供され、方法は、トランスジェニック子孫を生産するために、生殖細胞移植を使用して、Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １形質転換を生み出すことを含み、そのような凍結保存された成体生殖幹細胞は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２７０９４として寄託されている。そのような子孫は、例えば、Ｃｏｒｙ、Ｃｏｒｙｄｏｒａｓ科の種、Ｃｏｒｙに関連する魚種若しくは属、又は別の魚種若しくは属であり得る。

【0014】

特定のトランスジェニック組み込みイベントに関する別の実施形態では、染色体組み込み導入遺伝子を含むオレンジ色のトランスジェニックＣｏｒｙ又はその子孫が提供され、Ｃｏｒｙは、「Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」を含み、Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含む凍結保存された成体生殖幹細胞は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２７０９５として寄託されている。染色体組み込み導入遺伝子は、１つの組み込み発現カセット又は２つ以上の組み込み発現カセット上に存在してもよい。ある特定の態様では、そのようなトランスジェニックＣｏｒｙは、繁殖力のあるトランスジェニックＣｏｒｙである。そのようなトランスジェニックＣｏｒｙは、導入遺伝子又は組み込み発現カセットに対してホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、ヘミ接合性を含む）であり得る。

【0015】

また、Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＣｏｒｙを観賞魚市場に提供する方法も開示される。いくつかの実施形態では、方法は、染色体組み込み導入遺伝子を含むトランスジェニックＣｏｒｙ又はその子孫を得ることであって、Ｃｏｒｙは、「Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」を含み、Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含む凍結保存された成体生殖幹細胞は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２７０９５として寄託されている、得ることと、魚を観賞魚市場に流通させることと、を含む。そのような魚は、養殖者によって商業的流通業者に流通され得るか、又はそのような魚は、養殖者若しくは商業的流通業者によって、例えば、観賞魚部門を有する多品種小売業者などの小売業者に流通され得る。

【0016】

いくつかの態様では、（ａ）蛍光を呈し、かつ１つ以上の染色体組み込み導入遺伝子又は発現カセットを含むＣｏｒｙを得ることであって、Ｃｏｒｙが、「Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」を含み、Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含む凍結保存された成体生殖幹細胞が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２７０９５として寄託されている、得ることと、（ｂ）得られたＣｏｒｙを第２のＣｏｒｙと繁殖させて、Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＣｏｒｙを提供することと、を含むトランスジェニックＣｏｒｙを生産する方法が提供される。第２のＣｏｒｙは、トランスジェニック又は非トランスジェニックＣｏｒｙであり得る。

【0017】

更なる実施形態では、トランスジェニック生物を生産する方法もまた提供され、方法は、トランスジェニック子孫を生産するために、生殖細胞移植を使用して、Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換を生み出すことを含み、そのような凍結保存された成体生殖幹細胞は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２７０９５として寄託されている。そのような子孫は、例えば、Ｃｏｒｙ、Ｃｏｒｙｄｏｒａｓ科の種、Ｃｏｒｙに関連する魚種若しくは属、又は別の魚種若しくは属であり得る。

【0018】

特定のトランスジェニック組み込みイベントに関する別の実施形態では、染色体組み込み導入遺伝子を含む緑色のトランスジェニックＣｏｒｙ又はその子孫が提供され、Ｃｏｒｙは、「Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」を含み、Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含む凍結保存された成体生殖幹細胞は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２７０９６として寄託されている。染色体組み込み導入遺伝子は、１つの組み込み発現カセット又は２つ以上の組み込み発現カセット上に存在してもよい。ある特定の態様では、そのようなトランスジェニックＣｏｒｙは、繁殖力のあるトランスジェニックＣｏｒｙである。そのようなトランスジェニックＣｏｒｙは、導入遺伝子又は組み込み発現カセットに対してホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、ヘミ接合性を含む）であり得る。

【0019】

また、Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＣｏｒｙを観賞魚市場に提供する方法も開示される。いくつかの実施形態では、方法は、染色体組み込み導入遺伝子を含むトランスジェニックＣｏｒｙ又はその子孫を得ることであって、Ｃｏｒｙは、「Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」を含み、Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含む凍結保存された成体生殖幹細胞は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２７０９６として寄託されている、得ることと、魚を観賞魚市場に流通させることと、を含む。そのような魚は、養殖者によって商業的流通業者に流通され得るか、又はそのような魚は、養殖者若しくは商業的流通業者によって、例えば、観賞魚部門を有する多品種小売業者などの小売業者に流通され得る。

【0020】

いくつかの態様では、（ａ）蛍光を呈し、かつ１つ以上の染色体組み込み導入遺伝子又は発現カセットを含むＣｏｒｙを得ることであって、Ｃｏｒｙが、「Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」を含み、Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含む凍結保存された成体生殖幹細胞が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２７０９６として寄託されている、得ることと、（ｂ）得られたＣｏｒｙを第２のＣｏｒｙと繁殖させて、Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＣｏｒｙを提供することと、を含むトランスジェニックＣｏｒｙを生産する方法が提供される。第２のＣｏｒｙは、トランスジェニック又は非トランスジェニックＣｏｒｙであり得る。

【0021】

更なる実施形態では、トランスジェニック生物を生産する方法もまた提供され、方法は、トランスジェニック子孫を生産するために、生殖細胞移植を使用して、Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換を生み出すことを含み、そのような凍結保存された成体生殖幹細胞は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２７０９６として寄託されている。そのような子孫は、例えば、Ｃｏｒｙ、Ｃｏｒｙｄｏｒａｓ科の種、Ｃｏｒｙに関連する魚種若しくは属、又は別の魚種若しくは属であり得る。

【0022】

更なる実施形態では、黄色のｃｏｒｙは、２つの発現カセットを含む。両方のカセットは、ホモ接合性であり得る。他の実施形態では、カセットの各々は、ヘテロ接合性であり得る。代替的な実施形態では、一方の発現カセットは、ホモ接合性であり得、他方の発現カセットは、ヘテロ接合性であり得る。異なる接合性の魚は、繁殖時に異なる比率の子孫を生み出すことを理解されたい。

【0023】

少なくとも１つの例示的な実施形態では、ｃｏｒｙは、特定のトランスジェニック組み込みイベントを含み、染色体組み込み導入遺伝子を含む黄色のトランスジェニックｃｏｒｙ又はその子孫が提供される。染色体組み込み導入遺伝子は、緑色蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットと、オレンジ色蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットと、を含む。

【0024】

いくつかの例示的な実施形態では、黄色のｃｏｒｙは、緑色蛍光タンパク質、若しくはその一部、及び／又はオレンジ色蛍光タンパク質、若しくはその一部を含む。少なくともこれらの例示的な実施形態では、トランスジェニックｃｏｒｙは、繁殖力のあるトランスジェニックｃｏｒｙである。そのようなトランスジェニックｃｏｒｙは、導入遺伝子又は組み込み発現カセットに対してホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、ヘミ接合性を含む）であり得る。

【0025】

染色体組み込み導入遺伝子は、１つの組み込み発現カセット又は２つ以上の組み込み発現カセット上に存在してもよい。いくつかの例示的な実施形態では、黄色のｃｏｒｙは、緑色蛍光タンパク質、又はその一部、及びオレンジ色蛍光タンパク質、又はその一部を含む。少なくともこれらの例示的な実施形態では、トランスジェニック緑色ｃｏｒｙは、繁殖力のあるトランスジェニックｃｏｒｙであり、繁殖力のあるトランスジェニックｃｏｒｙであるトランスジェニックオレンジ色ｃｏｒｙと交配される。より具体的な態様では、そのような交配の子孫は、トランスジェニック黄色ｃｏｒｙである。少なくともこれらの例示的な実施形態では、そのようなトランスジェニックｃｏｒｙは、導入遺伝子又は組み込み発現カセットに対してホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、ヘミ接合性を含む）であり得る。

【0026】

また、観賞魚市場に黄色のｃｏｒｙを含むトランスジェニックｃｏｒｙを提供する方法も開示される。いくつかの実施形態では、方法は、染色体組み込み導入遺伝子を含むトランスジェニックｃｏｒｙ又はその子孫を得ることと、魚を観賞魚市場に流通させることと、を含む。そのような魚は、養殖者によって商業的流通業者に流通され得るか、又はそのような魚は、養殖者若しくは商業的流通業者によって、例えば、観賞魚部門を有する多品種小売業者などの小売業者に流通され得る。

【0027】

いくつかの態様では、（ａ）蛍光を呈し、かつ１つ以上の染色体組み込み導入遺伝子又は発現カセットを含むｃｏｒｙを得ることと、（ｂ）得られたｃｏｒｙを第２のｃｏｒｙと繁殖させて、トランスジェニックｃｏｒｙを提供することと、を含むトランスジェニックｃｏｒｙを生産する方法が提供される。第２のｃｏｒｙは、トランスジェニック又は非トランスジェニックｃｏｒｙであり得る。更なる実施形態では、トランスジェニック生物を生産する方法も提供され、方法は、黄色のｃｏｒｙを使用してトランスジェニック子孫を生産することを含む。そのような子孫は、例えば、ｃｏｒｙ、ｃｏｒｙに関連する魚種若しくは属、又は別の魚種若しくは属であり得る。

【0028】

本明細書で使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。本明細書で特許請求の範囲で使用される場合、単語「含む」とともに使用される場合、単語「ａ」又は「ａｎ」は、１つ又は１つ超を意味し得る。

【0029】

特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物のみを指すように明示的に示されない限り、又は代替物が相互に排他的である場合を除いて、「及び／又は」を意味するように使用されるが、本開示は、代替物のみ及び「及び／又は」のみを指す定義も支持する。本明細書で使用される場合、「別の」とは、少なくとも第２の、又はそれ以上を意味し得る。

【0030】

本出願全体を通して、「約」という用語は、値が、その値を決定するために用いられる方法についてのデバイスの固有の誤差の変動、又は研究対象の間に存在する変動を含むことを示すために使用される。

【0031】

本方法、キット、及び組成物のうちのいずれかの任意の実施形態は、記載された特徴及び／又はステップを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）／含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）／含む（ｃｏｎｔａｉｎ）／有するのではなく、それらからなるか、又は本質的にそれらからなることができる。したがって、特許請求の範囲のいずれかにおいて、「～からなる」又は「～から本質的になる」という用語は、所与の特許請求の範囲を、オープンエンドの連結動詞を使用する別の方法でなるであろうものから変更するために、上記のオープンエンドの連結動詞のうちのいずれかに置換され得る。

【0032】

本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明から、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正が当業者に明らかになるため、詳細な説明及び好ましい実施例は、本発明の特定の実施形態を示しながら、例示としてのみ与えられることを理解されたい。

【発明を実施するための形態】

【0033】

トランスジェニック魚
いくつかの態様では、本開示は、トランスジェニック魚に関する。トランスジェニック魚を作製する方法は、例えば、米国特許第７，１３５，６１３号、同第７，７００，８２５号、同第７，８３４，２３９号に記載されており、それらの各々は参照によりその全体が組み込まれる。例えば、トランスジェニック赤色Ｃｏｒｙは、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ２、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｅｑＦＰ５７８、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ２、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ＲＲｖＴ、ｃｇｆＴａｇＲＦＰ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ３、ｍＮｅｃｔａｒｉｎｅ、ｍｅｆｆＲＦＰ、ｍＳｃａｒｌｅｔ－Ｉ、及びａｍｉｌＦＰ５９３などの赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）をコードする発現カセットを使用して生成され得る。トランスジェニックオレンジ色Ｃｏｒｙは、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、Ｅ２－Ｏｒａｎｇｅ、ｐｈｉＹＦＰ、ｚＦＰ５３８、Ｖｅｎｕｓ、ｙＰｅｔ、ｃｃａｌＹＦＰ１、ｍＧｏｌｄ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｔｏｐａｚ、ｍＰａｐａｙａ、及びｍＢａｎａｎａなどの黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）をコードする発現カセットを使用して生成され得る。トランスジェニック緑色Ｃｏｒｙは、ｚｓＧｒｅｅｎ１、ｅＹＧＦＰｄｐ、ＡａｕｓＦＰ１、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ｍａｘＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ｍＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎ、Ｃｌｏｖｅｒ、ｍＣｌｏｖｅｒ３、ＰｌａｍＧＦＰ、ａｅｕｒＧＦＰ、ａｆｒａＧＦＰ、ＷａｓＣＦＰ、ＮｏｗＧＦＰ、ｃｅｒＦＰ５０５、ｐｐｏｒＧＦＰ、Ｋｏｈｉｎｏｏｒ、ｅｆａｓＧＦＰ、ｅｅｃｈＧＦＰ１、ｂｆｌｏＧＦＰａ１、ＬａｎＦＰ１、及びＬａｎＦＰ２などの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする発現カセットを使用して生成され得る。トランスジェニック黄色Ｃｏｒｙは、ｚｓＧｒｅｅｎ１などの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びＺｓＹｅｌｌｏｗ１などの黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）をコードする発現カセットを使用して生成され得る。

【0034】

商業的価値、特に観賞魚産業内の商業的価値のある魚の種及び品種に属する魚を使用することが好ましい。そのような魚には、これらに限定されないが、ｃｏｒｙ、ナマズ、ゼブラフィッシュ、及び他のｄａｎｉｏ、メダカ、コイ（ｃａｒｐ）、ティラピア、金魚、テトラ、バーブ、サメ（レインボーシャークなどのｃｙｐｒｉｎｉｄａｅ科）、エンゼルフィッシュ、ドジョウ、コイ（ｋｏｉ）、グラスフィシュ、ディスカス、ウナギ、ハゼ、グーラミ、グッピー、Ｘｉｐｈｏｐｈｏｒｕｓ、ハチェットフィッシュ、モリーフィッシュ、又はｐａｎｇａｓｉｕｓが含まれる。本開示の文脈における使用のための特定の魚は、Ｃｏｒｙである。Ｃｏｒｙはますます人気のある観賞動物であり、様々な色で商業的価値が付加されるであろう。Ｃｏｒｙ胚は簡単に入手可能である。Ｃｏｒｙの皮膚の色は、皮膚内の色素細胞によって決定され、それは、メラノソームと称される色素顆粒を含む。色素細胞当たりのメラノソームの数、サイズ、及び密度は、魚の皮膚の色に影響を及ぼす。

【0035】

商業養殖では、Ｃｏｒｙは自然に産卵する。１つの例示的な実施形態では、雌及び雄の群は、ＰＶＣタイルが産卵培地として水槽側から吊り下げられる水槽内に配置される。卵が堆積したタイルを収集し、水槽に移し、稚魚が孵化するまで（すなわち、約３～５日）華氏７４～８２度でインキュベートする。この時点でタイルは除去される。稚魚は、およそ２週間にわたって孵化したばかりのＡｒｔｅｍｉａ ｎａｕｐｌｉｉを与えられる。この時点で、稚魚は安全に扱うことができ、成長水槽又は土の池の外に移すことができる。ｃｏｒｙが成熟するまでには約６カ月かかる。関連する実施形態では、系統繁殖は、凍結保存された精巣によって維持される。

【0036】

胚細胞移植
魚の生殖腺凍結法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３）、及びＳｅｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）を参照されたく、これらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に開示されるトランスジェニック魚を得るために、分離した凍結Ｃｏｒｙ生殖腺から得られた生殖細胞を使用してもよい。

【0037】

例示的な実施形態では、あまり成熟していない若い雌のＣｏｒｙを、トリカインなどの鎮静剤の過剰摂取を使用して安楽死させ、続いて、ハサミを使用して脳破壊を行う。魚は、拭き取って乾燥され、解剖され、それらの卵巣が除去され、氷冷Ｌ－１５培地に移される。理想的には、収集された組織は、成熟卵母細胞がないか、又は非常に少ないはずである。所望の量の組織が得られると、卵巣を浸軟してはさみを使用して、約１～２ｍｍの断片にする。組織断片を沈降させ、Ｌ－１５培地を除去し、２Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅＩを含む１×ＰＢＳ中の０．２５％のトリプシンを組織に添加し、これは、４～５匹の魚から収集された組織に対して約１ｍｌの溶液である。組織を３０分間氷上でインキュベートし、１０分毎に混合する。その後、組織を室温に移し、１時間インキュベートし、５分毎に穏やかに粉砕する。インキュベーション後、残りの組織断片とともに得られた細胞懸濁液を４０ミクロンのふるいに通して濾過する。保持された組織をＬ－１５培地ですすぎ、濾過し、以前に得られた濾液と組み合わせる。濾液を、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地で作製された４０％のＰｅｒｃｏｌｌの上に重ね、１０℃で、１５００ＲＰＭで１５分間スイングローターで遠心分離する。界面相を収集し、２倍体積のＬ－１５培地を添加する。懸濁液を１０℃で、１０００ＲＰＭで５分間スイングローターで遠心分離する。上清を除去して廃棄し、ペレットを冷たいＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地中に懸濁する。懸濁液を氷上で維持する。細胞を凍結するために、１×ＨＢＳＳ中の１００μＬの氷冷１．８Ｍ ＤＭＳＯをクライオバイアルに移す。３３μＬの細胞懸濁液を添加し、混合し、１分当たり１℃の凍結速度のためにｉＣｅｌｌＢｏｘ又は同等の細胞凍結容器に移す。ｉＣｅｌｌＢｏｘがいっぱいになると、それをドライアイスを含むクーラーに移し、一晩又は少なくとも１２時間凍結させる。凍結後、クライオバイアルをｉＣｅｌｌＢｏｘから液体窒素に移し、長期保存する。

【0038】

赤色のＣｏｒｙ系統を回収する例の方法では、クライオバイアルを液体窒素から１０～１５℃の水浴に移すこと、及び細胞懸濁液が解凍されるまで、およそ１分間、インキュベートすることによって、凍結保存された細胞を解凍する。１ｍｌの氷冷Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地を懸濁液に添加し、混合し、１０℃で、１０００ＲＰＭで５分間スイングローターで遠心分離する。５０μＬを除く上清を除去して廃棄し、０．５ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地をペレットに添加する。ペレットを懸濁し、懸濁液を３０℃で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、懸濁液を１０℃で、１０００ＲＰＭで５分間スイングローターで遠心分離する。１５μＬを除く上清を除去して廃棄し、細胞を残りの上清中で再懸濁する。次いで、細胞懸濁液を、プリモルダジンＢで処理した、トリカインで麻酔された５～６日齢のＣｏｒｙ稚魚に注入し、稚魚当たりおよそ１００～２００ｎｌの懸濁液である。注入された稚魚は成体まで育てられ、赤色のＣｏｒｙ子孫を得るために通常のプロトコルを使用して産卵する。ｃｏｒｙ胚をプリモルダジンＢで処理するために、およそ２００～３００個の１時間未満齢のｃｏｒｙ卵をタイルから除去し、魚に好適な４０ｍｌの水を含むペトリ皿に移す。ＤＭＳＯ中のプリモルダジンＢ溶液を、５．５μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、混合する。卵を、室温で２４時間、溶液中でインキュベートし、次いで、孵化のためにタンクに移す。

【0039】

本開示は、Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含むトランスジェニック魚、並びにトランスジェニック魚卵、精子細胞、胚、又は遺伝子組換えトランスジェニック構築物を含む他の細胞に由来するそのようなトランスジェニック魚の子孫を更に包含する。「子孫」は、用語が本明細書で使用される場合、本発明の２匹のトランスジェニック魚を繁殖させること、又は本発明の第１のトランスジェニック魚を本発明のトランスジェニック魚ではない第２の魚に繁殖させることから生じ得る。後者の場合、第２の魚は、例えば、野生型魚、特殊な魚株、変異魚、又は他のトランスジェニック魚であり得る。第２の魚は、同じ種であってもよく、又は異なる種若しくは属であってもよい。これらの交配のハイブリッド子孫は、これらの他の系統に由来する利点と組み合わせた蛍光のための導入遺伝子の利点を有する。

【0040】

Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含む魚を識別する最も単純な方法は、問題の魚が赤色であり、非トランスジェニック魚と直ちに区別されるため、目視検査によるものである。使用される特定のＲＦＰ及び／又は発現カセットの挿入位置に応じて、トランスジェニック赤色Ｃｏｒｙは、トランスジェニック赤色Ｃｏｒｙの生涯にわたって、及び／又は複数世代にわたって維持される色を有し得ることを理解されたい。また、使用される特定のＲＦＰ及び／又は発現カセットの挿入位置に応じて、トランスジェニック赤色Ｃｏｒｙは、トランスジェニック赤色Ｃｏｒｙの生涯にわたって色褪せする色を有し得ることも理解されたい。例えば、赤色のトランスジェニックＣｏｒｙは、赤色から淡い赤色、又は赤色からピンク色に色が変化し得る。更に、使用される特定のＲＦＰ及び／又は発現カセットの挿入位置に応じて、トランスジェニック赤色Ｃｏｒｙは、世代にわたって色褪せする色を有し得る。例えば、赤色のトランスジェニックＣｏｒｙは、古い世代が赤色を呈し得るが、若い世代が淡い赤色、又はピンク色に見え得るように、ある世代から次の世代に色が変化し得る。

【0041】

オレンジ色のＣｏｒｙ系統を回収する例の方法では、クライオバイアルを液体窒素から１０～１５℃の水浴に移すこと、及び細胞懸濁液が解凍されるまで、およそ１分間、インキュベートすることによって、凍結保存された細胞を解凍する。１ｍｌの氷冷Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地を懸濁液に添加し、混合し、１０℃で、１０００ＲＰＭで５分間スイングローターで遠心分離する。５０μＬを除く上清を除去して廃棄し、０．５ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地をペレットに添加する。ペレットを懸濁し、懸濁液を３０℃で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、懸濁液を１０℃で、１０００ＲＰＭで５分間スイングローターで遠心分離する。１５μＬを除く上清を除去して廃棄し、細胞を残りの上清中で再懸濁する。次いで、細胞懸濁液を、プリモルダジンＢで処理した、トリカインで麻酔された５～６日齢のＣｏｒｙ稚魚に注入し、稚魚当たりおよそ１００～２００ｎｌの懸濁液である。注入された稚魚は成体まで育てられ、オレンジ色のＣｏｒｙ子孫を得るために通常のプロトコルを使用して産卵する。ｃｏｒｙ胚をプリモルダジンＢで処理するために、およそ２００～３００個の１時間未満齢のｃｏｒｙ卵をタイルから除去し、魚に好適な４０ｍｌの水を含むペトリ皿に移す。ＤＭＳＯ中のプリモルダジンＢ溶液を、５．５μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、混合する。卵を、室温で２４時間、溶液中でインキュベートし、次いで、孵化のためにタンクに移す。

【0042】

本開示は、Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含むトランスジェニック魚、並びにトランスジェニック魚卵、精子細胞、胚、又は遺伝子組換えトランスジェニック構築物を含む他の細胞に由来するそのようなトランスジェニック魚の子孫を更に包含する。「子孫」は、用語が本明細書で使用される場合、本発明の２匹のトランスジェニック魚を繁殖させること、又は本発明の第１のトランスジェニック魚を本発明のトランスジェニック魚ではない第２の魚に繁殖させることから生じ得る。後者の場合、第２の魚は、例えば、野生型魚、特殊な魚株、変異魚、又は他のトランスジェニック魚であり得る。第２の魚は、同じ種であってもよく、又は異なる種若しくは属であってもよい。これらの交配のハイブリッド子孫は、これらの他の系統に由来する利点と組み合わせた蛍光のための導入遺伝子の利点を有する。

【0043】

Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含む魚を識別する最も単純な方法は、問題の魚がオレンジ色であり、非トランスジェニック魚と直ちに区別されるため、目視検査によるものである。

【0044】

緑色のＣｏｒｙ系統を回収する例の方法では、クライオバイアルを液体窒素から１０～１５℃の水浴に移すこと、及び細胞懸濁液が解凍されるまで、およそ１分間、インキュベートすることによって、凍結保存された細胞を解凍する。１ｍｌの氷冷Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地を懸濁液に添加し、混合し、１０℃で、１０００ＲＰＭで５分間スイングローターで遠心分離する。５０μＬを除く上清を除去して廃棄し、０．５ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地をペレットに添加する。ペレットを懸濁し、懸濁液を３０℃で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、懸濁液を１０℃で、１０００ＲＰＭで５分間スイングローターで遠心分離する。１５μＬを除く上清を除去して廃棄し、細胞を残りの上清中で再懸濁する。次いで、細胞懸濁液を、プリモルダジンＢで処理した、トリカインで麻酔された５～６日齢のＣｏｒｙ稚魚に注入し、稚魚当たりおよそ１００～２００ｎｌの懸濁液である。注入された稚魚は成体まで育てられ、緑色のＣｏｒｙ子孫を得るために通常のプロトコルを使用して産卵する。ｃｏｒｙ胚をプリモルダジンＢで処理するために、およそ２００～３００個の１時間未満齢のｃｏｒｙ卵をタイルから除去し、魚に好適な４０ｍｌの水を含むペトリ皿に移す。ＤＭＳＯ中のプリモルダジンＢ溶液を、５．５μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、混合する。卵を、室温で２４時間、溶液中でインキュベートし、次いで、孵化のためにタンクに移す。

【0045】

本開示は、Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含むトランスジェニック魚、並びにトランスジェニック魚卵、精子細胞、胚、又は遺伝子組換えトランスジェニック構築物を含む他の細胞に由来するそのようなトランスジェニック魚の子孫を更に包含する。「子孫」は、用語が本明細書で使用される場合、本発明の２匹のトランスジェニック魚を繁殖させること、又は本発明の第１のトランスジェニック魚を本発明のトランスジェニック魚ではない第２の魚に繁殖させることから生じ得る。後者の場合、第２の魚は、例えば、野生型魚、特殊な魚株、変異魚、又は他のトランスジェニック魚であり得る。第２の魚は、同じ種であってもよく、又は異なる種若しくは属であってもよい。これらの交配のハイブリッド子孫は、これらの他の系統に由来する利点と組み合わせた蛍光のための導入遺伝子の利点を有する。

【0046】

Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含む魚を識別する最も単純な方法は、問題の魚が緑色であり、非トランスジェニック魚と直ちに区別されるため、目視検査によるものである。

【0047】

黄色のＣｏｒｙ系統を回収する例の方法では、クライオバイアルを液体窒素から１０～１５℃の水浴に移すこと、及び細胞懸濁液が解凍されるまで、およそ１分間、インキュベートすることによって、凍結保存された細胞を解凍する。１ｍｌの氷冷Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地を懸濁液に添加し、混合し、１０℃で、１０００ＲＰＭで５分間スイングローターで遠心分離する。５０μＬを除く上清を除去して廃棄し、０．５ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地をペレットに添加する。ペレットを懸濁し、懸濁液を３０℃で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、懸濁液を１０℃で、１０００ＲＰＭで５分間スイングローターで遠心分離する。１５μＬを除く上清を除去して廃棄し、細胞を残りの上清中で再懸濁する。次いで、細胞懸濁液を、プリモルダジンＢで処理した、トリカインで麻酔された５～６日齢のＣｏｒｙ稚魚に注入し、稚魚当たりおよそ１００～２００ｎｌの懸濁液である。注入された稚魚は成体まで育てられ、黄色のＣｏｒｙ子孫を得るために通常のプロトコルを使用して産卵する。ｃｏｒｙ胚をプリモルダジンＢで処理するために、およそ２００～３００個の１時間未満齢のｃｏｒｙ卵をタイルから除去し、魚に好適な４０ｍｌの水を含むペトリ皿に移す。ＤＭＳＯ中のプリモルダジンＢ溶液を、５．５μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、混合する。卵を、室温で２４時間、溶液中でインキュベートし、次いで、孵化のためにタンクに移す。

【0048】

本開示は、Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント及びＯｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントを含むトランスジェニック魚、すなわち、黄色のトランスジェニックｃｏｒｙ、並びにトランスジェニック魚卵、精子細胞、胚、又は遺伝子組換えトランスジェニック構築物を含む他の細胞に由来するそのようなトランスジェニック魚の子孫を更に包含する。「子孫」は、用語が本明細書で使用される場合、本発明の２匹のトランスジェニック魚を繁殖させること、又は本発明の第１のトランスジェニック魚を本発明のトランスジェニック魚ではない第２の魚に繁殖させることから生じ得る。後者の場合、第２の魚は、例えば、野生型魚、特殊な魚株、変異魚、又は他のトランスジェニック魚であり得る。第２の魚は、同じ種であってもよく、又は異なる種若しくは属であってもよい。これらの交配のハイブリッド子孫は、これらの他の系統に由来する利点と組み合わせた蛍光のための導入遺伝子の利点を有する。

【0049】

黄色のトランスジェニックｃｏｒｙを識別する最も単純な方法は、問題の魚が黄色であり、非トランスジェニック魚と直ちに区別されるため、目視検査によるものである。

【実施例】

【0050】

本発明のある特定の実施形態は、以下の実施例を参照して更に説明される。これらの実施例は、本発明の単なる例示を意図するものであり、いかようにも本発明の範囲をいかなる方法でも限定又は制限することを意図するものではなく、本発明の技術を実施するためにのみ利用されなければならない条件、パラメータ、試薬、又は出発材料を提供するものと解釈されるべきではない。

【0051】

実施例１－赤色のトランスジェニックＣｏｒｙ
赤色を呈するトランスジェニック魚が提供される。これらの魚において具現化された特定のトランスジェニックイベントは、「Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」に指定される。これらの魚由来の生殖細胞をＣｏｒｙ卵に移植し、それによって特定のトランスジェニック組み込みイベントを含むトランスジェニックＣｏｒｙを得ることができる。この系統由来の凍結保存された成体生殖幹細胞は、ブダペスト条約の条項に基づいて「Ｒｅｄ Ｃｏｒｙ １」としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託された（寄託は受託番号ＰＴＡ－１２７０９４として指定された）。

【0052】

蛍光トランスジェニック魚は、市場で観賞魚として使用されている。安定的に発現しているトランスジェニック系統は、トランスジェニック個体を野生型魚、変異魚、又は他のトランスジェニック魚で繁殖させることによって発達させることができる。所望のトランスジェニック魚は、白色光、日光、紫外線、青色光、又はトランスジェニック魚の赤色の可視化を可能にする任意の他の有用な光条件で魚を観察することによって、非トランスジェニック魚と区別することができる。

【0053】

実施例２－オレンジ色のトランスジェニックＣｏｒｙ
オレンジ色を呈するトランスジェニック魚が提供される。これらの魚において具現化された特定のトランスジェニックイベントは、「Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」に指定される。これらの魚由来の生殖細胞をＣｏｒｙ卵に移植し、それによって特定のトランスジェニック組み込みイベントを含むトランスジェニックＣｏｒｙを得ることができる。この系統由来の凍結保存された成体生殖幹細胞は、ブダペスト条約の条項に基づいて「Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｒｙ １」としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託された（寄託は受託番号ＰＴＡ－１２７０９５として指定された）。

【0054】

蛍光トランスジェニック魚は、市場で観賞魚として使用されている。安定的に発現しているトランスジェニック系統は、トランスジェニック個体を野生型魚、変異魚、又は他のトランスジェニック魚で繁殖させることによって発達させることができる。所望のトランスジェニック魚は、白色光、日光、紫外線、青色光、又はトランスジェニック魚のオレンジ色の可視化を可能にする任意の他の有用な光条件で魚を観察することによって、非トランスジェニック魚と区別することができる。

【0055】

実施例３－緑色のトランスジェニックＣｏｒｙ
緑色を呈するトランスジェニック魚が提供される。これらの魚において具現化された特定のトランスジェニックイベントは、「Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」に指定される。これらの魚由来の生殖細胞をＣｏｒｙ卵に移植し、それによって特定のトランスジェニック組み込みイベントを含むトランスジェニックＣｏｒｙを得ることができる。この系統由来の凍結保存された成体生殖幹細胞は、ブダペスト条約の条項に基づいて「Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｒｙ １」としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託された（寄託は受託番号ＰＴＡ－１２７０９６として指定された）。

【0056】

蛍光トランスジェニック魚は、市場で観賞魚として使用されている。安定的に発現しているトランスジェニック系統は、トランスジェニック個体を野生型魚、変異魚、又は他のトランスジェニック魚で繁殖させることによって発達させることができる。所望のトランスジェニック魚は、白色光、日光、紫外線、青色光、又はトランスジェニック魚の緑色の可視化を可能にする任意の他の有用な光条件で魚を観察することによって、非トランスジェニック魚と区別することができる。

【0057】

実施例４－黄色のトランスジェニックＣｏｒｙ
黄色を呈するトランスジェニック魚が提供される。これらの魚において具現化された特定のトランスジェニックイベントは、「Ｙｅｌｌｏｗ Ｃｏｒｙ １形質転換イベント」に指定される。黄色を呈するトランスジェニック魚が提供される。これらの魚において具現化された特定のトランスジェニックイベントは、Ｙｅｌｌｏｗ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントに指定される。これらの魚由来の成体生殖幹細胞は、例えば、緑色蛍光ｃｏｒｙ及びオレンジ色蛍光ｃｏｒｙを交配した子孫から得ることができる。「色が交配された」組み合わせを含む色を表示するトランスジェニック魚を提供する能力は、当業者には容易には明らかではなく、過度の実験なしに容易に得られる新規の色を得る能力でもないことを理解されたい。これは、Ｙｅｌｌｏｗ Ｃｏｒｙ １形質転換イベントの一貫した可視化を複数世代にわたって望む場合に特に明白である。以下の実施例は、得ることができる黄色のｃｏｒｙの様々な関連する例を示す。

【0058】

いくつかの例示的な実施形態では、ｚｓＧｒｅｅｎ１、ｅＹＧＦＰｄｐ、ＡａｕｓＦＰ１、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ｍａｘＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ｍＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎ、Ｃｌｏｖｅｒ、ｍＣｌｏｖｅｒ３、ＰｌａｍＧＦＰ、ａｅｕｒＧＦＰ、ａｆｒａＧＦＰ、ＷａｓＣＦＰ、ＮｏｗＧＦＰ、ｃｅｒＦＰ５０５、ｐｐｏｒＧＦＰ、Ｋｏｈｉｎｏｏｒ、ｅｆａｓＧＦＰ、ｅｅｃｈＧＦＰ１、ｂｆｌｏＧＦＰａ１、ＬａｎＦＰ１、及びＬａｎＦＰ２などの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする発現カセット、並びにＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、Ｅ２－Ｏｒａｎｇｅ、ｐｈｉＹＦＰ、ｚＦＰ５３８、Ｖｅｎｕｓ、ｙＰｅｔ、ｃｃａｌＹＦＰ１、ｍＧｏｌｄ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｔｏｐａｚ、ｍＰａｐａｙａ、及びｍＢａｎａｎａなどの黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）をコードする発現カセットが注入され、それによって、緑色及びオレンジ色の両方をコードするが、Ｃｏｒｙは、黄色の可視化効果を含む。

【0059】

他の実施形態では、各蛍光タンパク質の１つの組み込み発現カセット又は各蛍光タンパク質の２つ以上の組み込み発現カセット上に存在し得る染色体組み込み導入遺伝子を含む特定のトランスジェニック組み込みイベント、ＧＦＰ及びＹＦＰ Ｃｏｒｙ又はその子孫が提供される。ある特定の態様では、そのようなトランスジェニックＣｏｒｙは、繁殖力のあるトランスジェニックＣｏｒｙである。そのようなトランスジェニックＣｏｒｙは、導入遺伝子又は組み込み発現カセットに対してホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、ヘミ接合性を含む）であり得る。関連する実施形態では、黄色のｃｏｒｙは、緑色蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含むｃｏｒｙを、黄色蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含むｃｏｒｙで繁殖させることから形成される。そのような繁殖の子孫は、繁殖力のある次世代の魚の系統をもたらす。いくつかの例では、繁殖不能な子孫系統が所望され、黄色のｃｏｒｙが、例えば、（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３など）などの特定の世代系統から供給されることを可能にする。

【0060】

蛍光トランスジェニック魚は、市場で観賞魚として使用されている。安定的に発現しているトランスジェニック系統は、トランスジェニック個体を野生型魚、変異魚、又は他のトランスジェニック魚で繁殖させることによって発達させることができる。所望のトランスジェニック魚は、白色光、日光、紫外線、青色光、又はトランスジェニック魚の黄色の可視化を可能にする任意の他の有用な光条件で魚を観察することによって、非トランスジェニック魚と区別することができる。

【0061】

蛍光トランスジェニック魚は、細胞系統及び細胞遊走を追跡するなどの胚研究に使用され得るため、科学研究ツールの市場でも価値があるはずである。更に、これらの魚は、遺伝子モザイク実験及び魚のがんモデルで細胞をマークするために使用され得る。

【0062】

本明細書に開示及び特許請求される全ての組成物及び／又は方法は、本開示に照らして、過度の実験なしに作製及び実施することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して説明されてきたが、当業者には、本明細書に記載の組成物及び／又は方法並びにステップ又は方法の一連のステップに、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく、変形例が適用され得ることが明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的の両方に関連する特定の薬剤が、同じ又は同様の結果が達成されるとともに、本明細書に記載の薬剤と置き換えられ得ることが明らかであろう。当業者に明らかである全てのそのような同様の代替物及び修飾は、添付の特許請求項の範囲によって定義されるように、本発明の趣旨、範囲、及び概念内にあるとみなされる。

【0063】

上記の明細書、実施例、及びデータは、本発明の組成物の製造及び使用の完全な説明を提供する。本発明の多くの実施形態は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく行われ得るため、本発明は以下に添付される特許請求の範囲に属する。

【国際調査報告】