知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ シェンツェン ヘパリンク ファーマスーティカル グループ カンパニー リミテッドの特許一覧
特表2024-505364サンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の含有量を検出するための方法及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-06
(54)【発明の名称】サンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の含有量を検出するための方法及びその使用
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20210101AFI20240130BHJP
G01N 30/72 20060101ALI20240130BHJP
G01N 30/06 20060101ALI20240130BHJP
G01N 30/88 20060101ALI20240130BHJP
G01N 30/04 20060101ALI20240130BHJP
G01N 30/26 20060101ALI20240130BHJP
G01N 30/34 20060101ALI20240130BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240130BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240130BHJP
C08B 37/00 20060101ALI20240130BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 V
G01N27/62 X
G01N30/72 C
G01N30/06 E
G01N30/88 N
G01N30/04 P
G01N30/26 A
G01N30/34 E
G01N33/50 U
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
C08B37/00 Q
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023540536
(86)(22)【出願日】2021-12-30
(85)【翻訳文提出日】2023-06-30
(86)【国際出願番号】 CN2021142793
(87)【国際公開番号】W WO2022143853
(87)【国際公開日】2022-07-07
(31)【優先権主張番号】202011624408.8
(32)【優先日】2020-12-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518230854
【氏名又は名称】シェンツェン ヘパリンク ファーマスーティカル グループ カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＥＮＺＨＥＮ ＨＥＰＡＬＩＮＫ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＧＲＯＵＰ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】王 景文
(72)【発明者】
【氏名】任 麗鴿
(72)【発明者】
【氏名】林 森茂
(72)【発明者】
【氏名】李 ▲リ▼
【テーマコード（参考）】
2G041
2G045
4C090
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041DA05
2G041EA04
2G041EA12
2G041FA10
2G041GA09
2G041HA01
2G041JA02
2G041LA09
2G045CA25
2G045CB03
2G045DA30
2G045FA36
2G045FB06
4C090AA01
4C090BA62
4C090BB55
4C090BB63
4C090BB92
4C090BC27
4C090DA23
(57)【要約】
本願は、サンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の含有量を検出するための方法及びその使用に関し、本願に係る方法は、カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を加水分解することにより、特定構造の加水分解生成物を安定的に得ることができ、この構造はＭＳにより検出され、そのうちの高い質量分析存在量を有する加水分解生成物を選択することができるので、カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の量を間接的に算出することができ、そして、この検出方法は専門性がよく、確度が高く、精度がよく、定量限界が低く、検出限界が低い。本願の検出方法は、（１）サンプルを加水分解し、式（Ｉ）で表される化合物を含有する加水分解液を得るステップと、（２）液体クロマトグラフィータンデム質量分析により加水分解液を検出するステップと、（３）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を標準品として、その異なる勾配の濃度の溶液をステップ（１）の方法に従って加水分解し、ステップ（２）の方法に従って異なる濃度の標準品溶液の加水分解液中の式（Ｉ）で表される化合物のマススペクトルシグナルピーク面積を検出し、マススペクトルシグナルピーク面積でカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体標準品の量に対して検量線を作成し、この検量線に基づいて、ステップ（２）で測定された式（Ｉ）で表される化合物のマススペクトルピーク面積によりサンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の含有量を算出するステップとを含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の含有量を検出するための方法であって、前記方法は、（１）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を含有するサンプルを加水分解し、式（Ｉ）で表される化合物を含有する加水分解液を得るステップと、
【化1】
（ただし、各Ｒａは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈであり、各Ｒｂは独立してＨ、－ＳＯ３Ｈ又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、各Ｒｃは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈであり、ｎは０、１、２、３、４又は５である。）
（２）液体クロマトグラフィータンデム質量分析によりステップ（１）で得られた加水分解液を検出するステップと、
（３）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を標準品として、その異なる勾配の濃度の溶液をステップ（１）の方法に従って加水分解し、ステップ（２）の方法に従って異なる濃度の標準品溶液の加水分解液中の式（Ｉ）で表される化合物のマススペクトルシグナルピーク面積を検出し、マススペクトルシグナルピーク面積でカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体標準品の量に対して検量線を作成し、この検量線に基づいて、ステップ（２）で測定された式（Ｉ）で表される化合物のマススペクトルピーク面積によりサンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の含有量を算出するステップと、を含み、
前記カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体は、式（ＩＩ）で表される構造単位と選択的な式（ＩＩＩ）で表される構造単位とを含むグリコサミノグリカン系化合物である、ことを特徴とするサンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の含有量を検出するための方法。
【化2】
【化3】
（ただし、各Ｒａは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈであり、Ｒｂは独立してＨ、－ＳＯ３Ｈ又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、Ｒｃは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈである。）
【請求項2】
前記グリコサミノグリカンはヘパリン又はヘパラン硫酸であり、前記カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体は、（１）グリコサミノグリカン中でウロン酸における隣接されるジオールが酸化開環されてジアルデヒド構造を形成することと、（２）ジアルデヒド構造がさらに酸化されてジカルボン酸構造を得ることとの２段階の酸化反応を経て得られる、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記式（Ｉ）で表される化合物は、以下の構造式の少なくとも１種の構造を有する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。【化4】
【化5】
【化6】
【請求項4】
前記カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の重量平均分子量は３０００～２００００Ｄａであり、好ましくは７０００～１４０００Ｄａであり、さらに好ましくは８０００～１３５００Ｄａであり、前記カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の開環度は１０％～１００％であり、好ましくは２５％～８０％であり、さらに好ましくは２５％～６０％である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項5】
ステップ（１）に記載のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を含有するサンプルを加水分解する処理方式は加熱であり、好ましくは、前記加熱の温度は７０～１００℃であり、８５～９５℃であることが好ましく、
好ましくは、前記加熱の時間は１２～１６８ｈであり、１２～１２０ｈであることが好ましい、ことを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記液体クロマトグラフィーは逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー又は親水クロマトグラフィーであり、好ましくは、前記液体クロマトグラフィーの移動相は移動相Ａ及び移動相Ｂであり、前記移動相Ａはヘキサフルオロイソプロパノールとペンチルアミンとの水溶液であり、前記移動相Ｂはヘキサフルオロイソプロパノールとペンチルアミンとのアセトニトリル－水溶液であり、
好ましくは、前記移動相Ａは４５～５５ｍＭのヘキサフルオロイソプロパノールと１３～１７ｍＭのペンチルアミンとを含有する水溶液であり、前記移動相Ｂは４５～５５ｍＭのヘキサフルオロイソプロパノールと１３～１７ｍＭのペンチルアミンとを含有するアセトニトリル－水溶液であり、前記移動相Ｂでは、アセトニトリルと水との体積比は７０：３０～８０：２０であり、
好ましくは、前記液体クロマトグラフィーの移動相は移動相Ａ及び移動相Ｂであり、具体的には以下の表で示される通りである、ことを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【表1】
【請求項7】
前記カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を含有するサンプルは生物サンプルである場合に、ステップ（１）で得られた加水分解液に対して検出前処理を行う必要があり、前記前処理は、加水分解液をトリフルオロ酢酸溶液及びアセトニトリル－メタノール溶液と混合させ、その後、静置し、遠心し、上清を回収し乾燥させた後に水で再溶解することを含み、好ましくは、前記生物サンプルは血液、尿を含み、
好ましくは、前記トリフルオロ酢酸溶液の添加量は体積で加水分解液の体積の０．５％～１．５％であり、
好ましくは、前記トリフルオロ酢酸溶液の濃度は４％～６％であり、
好ましくは、前記アセトニトリル－メタノール溶液の添加量は体積で加水分解液の体積の１～５倍であり、好ましくは１～３倍であり、より好ましくは１．５～２．５倍であり、
好ましくは、前記アセトニトリル－メタノール溶液では、アセトニトリルとメタノールとの体積比は１：０．５～１：１．５であり、
好ましくは、前記静置の温度は－２５～－１５℃であり、時間は１５～２５ｍｉｎである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
構造は式（Ｉ）の通りである、ことを特徴とする化合物。【化7】
（ただし、各Ｒａは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈであり、各Ｒｂは独立してＨ、－ＳＯ３Ｈ又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、各Ｒｃは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈであり、ｎは０、１、２、３、４又は５である。）
【請求項9】
以下の構造の１つを有する、ことを特徴とする請求項８に記載の化合物。【化8】
【化9】
【化10】
【請求項10】
請求項１～７のいずれか一項に記載のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の検出方法の、カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の薬物動態学研究における使用。
【請求項11】
請求項１～６のいずれか一項に記載のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の検出方法の、カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の医薬製剤品質検出における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は分析化学の技術分野に属しており、具体的にはサンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の含有量を検出するための方法及びその使用に関し、特に、専門性がよく、確度が高く、精度がよく、定量限界が低く、検出限界が低い、サンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の含有量を検出するための方法及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
従来技術、例えば、特許文献１及び特許文献２の２編の専利は、カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体が薬物として抗腫瘍及び抗腫瘍転移活性を有し、広い使用将来性があることを公開的に報道している。カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体は、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）が２段階の酸化反応を経た後に得られる、ウロン酸隣接ジオール構造の酸化開環を含んだジカルボン酸誘導体であり、即ち、（１）グリコサミノグリカン中でウロン酸における隣接されるジオールが酸化開環されてジアルデヒド構造を形成し、（２）ジアルデヒド構造がさらに酸化されてジカルボン酸構造が得られる。カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体は、ヘパリン誘導体に属しており、鎖状で、構造不均一なムコ多糖物質である。薬物代謝の研究において、薬物の薬物代謝動態性質を評価するために、生物サンプル中の当該薬物の含有量を測定する必要がある。生物サンプルから完全な構造を直接的に検出することは実現しにくく、そして、生物サンプルには複数種の内因性物質、例えば、蛋白質、リン脂質などがあるので、通常の多糖テスト方法は内因性物質によって影響されやすくてカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体に対して定量測定することができない。従って、正確なカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の検出方法を如何に提供するかは、早急に解決すべき課題となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】中国特許出願公開第１０５７４４９４０号明細書
【特許文献2】中国特許出願公開第１１１６７００３８号明細書
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ｇｕｅｒｒｉｎｉ，Ｍ．，Ｇｕｇｌｉｅｒｉ，Ｓ，Ｎａｇｇｉ，Ａ，Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ，（２００７）．Ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｈｅｐａｒｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｂｉｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，３３，４７８－４８７
【発明の概要】
【0005】
以下は、本明細書に詳しく説明する主題についての略述である。本略述は特許請求の範囲の保護範囲を限定するためのものではない。
【0006】
従来技術の不足に対して、本願の目的は、サンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の含有量を検出するための方法及びその使用を提供し、特に専門性がよく、確度が高く、精度がよく、定量限界が低く、検出限界が低い、サンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の含有量を検出するための方法及びその使用を提供することにある。
【0007】
この目的を達成するために、本願は以下の技術的態様を採用する。
【0008】
第１態様において、本願は、サンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の含有量を検出するための方法を提供し、前記方法は、
（１）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を含有するサンプルを加水分解し、式（Ｉ）で表される化合物を含有する加水分解液を得るステップと、
（１）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を含有するサンプルを加水分解し、式（Ｉ）で表される化合物を含有する加水分解液を得るステップと、
【0009】
【化1】
【0010】
（ただし、各Ｒａは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈであり、各Ｒｂは独立してＨ、－ＳＯ３Ｈ又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、各Ｒｃは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈであり、ｎは０、１、２、３、４又は５である。）
（２）液体クロマトグラフィータンデム質量分析によりステップ（１）で得られた加水分解液を検出するステップと、
（３）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を標準品として、その異なる勾配の濃度の溶液をステップ（１）の方法に従って加水分解し、ステップ（２）の方法に従って異なる濃度の標準品溶液の加水分解液中の式（Ｉ）で表される化合物のマススペクトルシグナルピーク面積を検出し、マススペクトルシグナルピーク面積でカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体標準品の量に対して検量線を作成し、この検量線に基づいて、ステップ（２）で測定された式（Ｉ）で表される化合物のマススペクトルピーク面積によりサンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の含有量を算出するステップと、を含み、
前記カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体は、式（ＩＩ）で表される構造単位と選択的な式（ＩＩＩ）で表される構造単位とを含むグリコサミノグリカン系化合物である。
（２）液体クロマトグラフィータンデム質量分析によりステップ（１）で得られた加水分解液を検出するステップと、
（３）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を標準品として、その異なる勾配の濃度の溶液をステップ（１）の方法に従って加水分解し、ステップ（２）の方法に従って異なる濃度の標準品溶液の加水分解液中の式（Ｉ）で表される化合物のマススペクトルシグナルピーク面積を検出し、マススペクトルシグナルピーク面積でカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体標準品の量に対して検量線を作成し、この検量線に基づいて、ステップ（２）で測定された式（Ｉ）で表される化合物のマススペクトルピーク面積によりサンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の含有量を算出するステップと、を含み、
前記カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体は、式（ＩＩ）で表される構造単位と選択的な式（ＩＩＩ）で表される構造単位とを含むグリコサミノグリカン系化合物である。
【0011】
【化2】
【0012】
【化3】
【0013】
（ただし、各Ｒａは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈであり、Ｒｂは独立してＨ、－ＳＯ３Ｈ又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、Ｒｃは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈである。）
【0014】
好ましくは、前記グリコサミノグリカンはヘパリン又はヘパラン硫酸であり、前記カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体は、（１）グリコサミノグリカン中でウロン酸における隣接されるジオールが酸化開環されてジアルデヒド構造を形成することと、（２）ジアルデヒド構造がさらに酸化されてジカルボン酸構造が得られることとの２段階の酸化反応を経て得られる。
【0015】
好ましくは、前記式（Ｉ）で表される化合物は、以下の構造式の少なくとも１種の構造を有する。
【0016】
【化4】
【0017】
【化5】
【0018】
【化6】
【0019】
ただし、化合物（ａ）のマススペクトルシグナルはＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：４３２．０［Ｍ－Ｈ］－であり、
化合物（ｂ）のマススペクトルシグナルはＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：３９０．０［Ｍ－Ｈ］－であり、
化合物（ｃ）のマススペクトルシグナルはＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：５２２．９８［Ｍ－２Ｈ］２－である。
化合物（ｂ）のマススペクトルシグナルはＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：３９０．０［Ｍ－Ｈ］－であり、
化合物（ｃ）のマススペクトルシグナルはＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：５２２．９８［Ｍ－２Ｈ］２－である。
【0020】
本願に係るカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体は、前記式（ＩＩ）で表される構造単位と選択的な式（ＩＩＩ）で表される構造単位とを含み、即ちグリコサミノグリカン化合物中でヘキスロン酸構造が一部又は全部開環される。
【0021】
本願に係るカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体は加水分解された後に式（Ｉ）で表される化合物を得ることができ、反応機構は態様１及び２の通りであり、ただし、各Ｒａは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈであり、各Ｒｂは独立してＨ、－ＳＯ３Ｈ又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、各Ｒｃは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈであり、ｎは０、１、２、３、４又は５である。
【0022】
態様１：
【0023】
【化7】
【0024】
態様２：
【0025】
【化8】
【0026】
本願に係るカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の各多糖鎖において、各二糖構造単位は任意の順番で配列される。
【0027】
好ましくは、前記カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の重量平均分子量は３０００～２００００Ｄａであり、例えば、３０００Ｄａ、５０００Ｄａ、７０００Ｄａ、８０００Ｄａ、９０００Ｄａ、１００００Ｄａ、１１０００Ｄａ、１２０００Ｄａ、１３０００Ｄａ、１３５００Ｄａ、１４０００Ｄａ、１６０００Ｄａ、１８０００Ｄａ又は２００００Ｄａなどであり、この数値範囲内の他の具体的な点値はいずれも選択可能であり、ここで説明を省略する。好ましくは７０００～１４０００Ｄａであり、さらに好ましくは８０００～１３５００Ｄａである。
【0028】
前記カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の開環度は１０％～１００％であり、例えば、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％などであり、この数値範囲内の他の具体的な点値はいずれも選択可能であり、ここで説明を省略する。好ましくは２５％～８０％であり、さらに好ましくは２５％～６０％である。
【0029】
本願における用語「開環度」とは、開環されたウロン酸残基数と総ウロン酸残基数との比であり、その検出及び計算は、文献の非特許文献１における核磁気方法を参照して行われる。
【0030】
好ましくは、ステップ（１）に記載のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を含有するサンプルを加水分解する処理方式は加熱である。
【0031】
好ましくは、前記加熱の温度は７０～１００℃であり、例えば、７０℃、７５℃、８０℃、８２℃、８５℃、８７℃、９５℃又は１００℃などであり、この数値範囲内の他の具体的な点値はいずれも選択可能であり、ここで説明を省略する。好ましくは８５～９５℃である。
【0032】
好ましくは、前記加熱の時間は１２～１６８ｈであり、例えば、１２ｈ、１６ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ、５５ｈ、６０ｈ、７０ｈ、７２ｈ、７５ｈ、７８ｈ、８０ｈ、９０ｈ、９６ｈ、１２０ｈ、１４４ｈ又は１６８ｈなどであり、この数値範囲内の他の具体的な点値はいずれも選択可能であり、ここで説明を省略する。好ましくは１２～１２０ｈである。
【0033】
上記加熱温度及び加熱時間の条件で、本願に係るカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体は加水分解されて、質量分析存在量が高い化合物（ａ）、化合物（ｂ）又は化合物（ｃ）を得ることができ、検出効率、検出確度精度などを総合的に考慮して反応の温度及び時間を選択する。
【0034】
前記カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を含有するサンプルは生物サンプル（例えば、血液、尿）である場合に、ステップ（１）で得られた加水分解液に対して検出前処理を行う必要があり、前記前処理は、加水分解液をトリフルオロ酢酸溶液及びアセトニトリル－メタノール溶液と混合させ、その後、静置し、遠心し、上澄み液を取って乾燥させた後に水で再溶解することを含む。
【0035】
好ましくは、前記トリフルオロ酢酸溶液の添加量は体積で加水分解液の０．５％～１．５％であり、例えば、０．５％、０．８％、１．０％、１．２％又は１．５％などであり、この数値範囲内の他の具体的な点値はいずれも選択可能であり、ここで説明を省略する。
【0036】
好ましくは、前記トリフルオロ酢酸溶液の濃度は４％～６％であり、例えば、４％、５％又は６％などであり、この数値範囲内の他の具体的な点値はいずれも選択可能であり、ここで説明を省略する。
【0037】
好ましくは、前記アセトニトリル－メタノール溶液の添加量は体積で加水分解液の体積の１～５倍であり、例えば、１倍、１．５倍、１．８倍、２．０倍、２．２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍などであり、この数値範囲内の他の具体的な点値はいずれも選択可能であり、ここで説明を省略する。好ましくは１～３倍であり、より好ましくは１．５～２．５倍である。
【0038】
好ましくは、前記アセトニトリル－メタノール溶液では、アセトニトリルとメタノールとの体積比は１：０．５～１：１．５であり、例えば、１：０．５、１：０．８、１：１、１：１．２又は１：１．５などであり、この数値範囲内の他の具体的な点値はいずれも選択可能であり、ここで説明を省略する。
【0039】
好ましくは、前記静置の温度は－２５～－１５℃であり、例えば、－２５℃、－２０℃、－１５℃などであり、時間は１５～２５ｍｉｎであり、例えば、１５ｍｉｎ、１８ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、２２ｍｉｎ、２５ｍｉｎなどであり、上記各項の数値範囲内の他の具体的な点値がいずれも選択可能であり、ここで説明を省略する。
【0040】
好ましくは、前記液体クロマトグラフィーは逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー又は親水クロマトグラフィーである。
【0041】
好ましくは、前記液体クロマトグラフィーの移動相は移動相Ａ及び移動相Ｂであり、前記移動相Ａはヘキサフルオロイソプロパノールとペンチルアミンとの水溶液であり、前記移動相Ｂはヘキサフルオロイソプロパノールとペンチルアミンとのアセトニトリル－水溶液であり、
前記移動相Ａは４５～５５ｍＭ（例えば、４５ｍＭ、４８ｍＭ、５０ｍＭ、５２ｍＭ、５５ｍＭなど）のヘキサフルオロイソプロパノールと１３～１７ｍＭ（例えば、１３ｍＭ、１５ｍＭ、１７ｍＭなど）のペンチルアミンとを含有する水溶液であり、前記移動相Ｂは４５～５５ｍＭ（例えば、４５ｍＭ、４８ｍＭ、５０ｍＭ、５２ｍＭ、５５ｍＭなど）のヘキサフルオロイソプロパノールと１３～１７ｍＭ（例えば、１３ｍＭ、１５ｍＭ、１７ｍＭなど）のペンチルアミンとを含有するアセトニトリル－水溶液であり、前記移動相
Ｂでは、アセトニトリルと水との体積比は７０：３０～８０：２０（例えば、７０：３０、７５：２５、８０：２０など）である。上記各項の数値範囲内の他の具体的な点値はいずれも選択可能であり、ここで説明を省略する。
前記移動相Ａは４５～５５ｍＭ（例えば、４５ｍＭ、４８ｍＭ、５０ｍＭ、５２ｍＭ、５５ｍＭなど）のヘキサフルオロイソプロパノールと１３～１７ｍＭ（例えば、１３ｍＭ、１５ｍＭ、１７ｍＭなど）のペンチルアミンとを含有する水溶液であり、前記移動相Ｂは４５～５５ｍＭ（例えば、４５ｍＭ、４８ｍＭ、５０ｍＭ、５２ｍＭ、５５ｍＭなど）のヘキサフルオロイソプロパノールと１３～１７ｍＭ（例えば、１３ｍＭ、１５ｍＭ、１７ｍＭなど）のペンチルアミンとを含有するアセトニトリル－水溶液であり、前記移動相
Ｂでは、アセトニトリルと水との体積比は７０：３０～８０：２０（例えば、７０：３０、７５：２５、８０：２０など）である。上記各項の数値範囲内の他の具体的な点値はいずれも選択可能であり、ここで説明を省略する。
【0042】
さらに好ましくは、前記液体クロマトグラフィーの移動相は移動相Ａ及び移動相Ｂであり、具体的には、下表の通りである。
【0043】
【表1】
【0044】
好ましくは、前記液体クロマトグラフィーの溶離手順は下表の通りである。
【0045】
【表2】
【0046】
本願において、前記マススペクトル条件は例示的に、以下のような条件内容を選択することができる。
【0047】
【表3】
【0048】
第１態様の内容に基づいて、本願はさらに新たな化合物を提供し、具体的な内容は以下の通りである。
【0049】
第２態様において、本願は、構造が式（Ｉ）に示す化合物を提供する。
【0050】
【化9】
【0051】
（ただし、各Ｒａは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈであり、各Ｒｂは独立してＨ、－ＳＯ３Ｈ又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、各Ｒｃは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈであり、ｎは０、１、２、３、４又は５である。）
【0052】
好ましくは、前記化合物は、以下の構造の１つを有する。
【0053】
【化10】
【0054】
【化11】
【0055】
【化12】
【0056】
第３態様において、本願は第１態様に記載のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の検出方法のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の薬物動態学研究における使用を提供する。
【0057】
第４態様において、本願は第１態様に記載のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の検出方法のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の医薬製剤品質検出における使用を提供する。
【0058】
従来技術に対して、本願は、以下の有益的な効果を持っている。
カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体は非均一物質であるので、生物サンプルから完全な構造を直接的に検出することを実現しにくく、本願発明者は、カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体は加水分解を経て、上記に記載の特定構造の加水分解生成物の化合物（ａ）、化合物（ｂ）又は化合物（ｃ）を安定的に得ることができて、このような化合物はマススペクトルにより検出できるものであることを見出した。化合物（ａ）、化合物（ｂ）又は化合物（ｃ）を測定し、異なる濃度のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体標準品を化合物（ａ）、化合物（ｂ）又は化合物（ｃ）のマススペクトルピーク面積に対して検量線を作成すること、また、サンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を加水分解して化合物（ａ）、化合物（ｂ）又は化合物（ｃ）のマススペクトルピーク面積を検出することによって、カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を含有するサンプルが加水分解された後に液体クロマトグラフ質量分析で化合物（ａ）、化合物（ｂ）又は化合物（ｃ）のマススペクトルピーク面積を測定し、検量線に基づいて、サンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の量を間接的に算出することができる。この検出方法は専門性がよく、確度が高く、精度がよく、定量限界が低く、検出限界が低い。
カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体は非均一物質であるので、生物サンプルから完全な構造を直接的に検出することを実現しにくく、本願発明者は、カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体は加水分解を経て、上記に記載の特定構造の加水分解生成物の化合物（ａ）、化合物（ｂ）又は化合物（ｃ）を安定的に得ることができて、このような化合物はマススペクトルにより検出できるものであることを見出した。化合物（ａ）、化合物（ｂ）又は化合物（ｃ）を測定し、異なる濃度のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体標準品を化合物（ａ）、化合物（ｂ）又は化合物（ｃ）のマススペクトルピーク面積に対して検量線を作成すること、また、サンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を加水分解して化合物（ａ）、化合物（ｂ）又は化合物（ｃ）のマススペクトルピーク面積を検出することによって、カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を含有するサンプルが加水分解された後に液体クロマトグラフ質量分析で化合物（ａ）、化合物（ｂ）又は化合物（ｃ）のマススペクトルピーク面積を測定し、検量線に基づいて、サンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の量を間接的に算出することができる。この検出方法は専門性がよく、確度が高く、精度がよく、定量限界が低く、検出限界が低い。
【0059】
詳細な説明を読んで理解した後に、他の態様を明らかにすることができる。
【図面の簡単な説明】
【0060】
【図1】化合物（ａ）のマスクロマトグラムである。
【図2】化合物（ａ）の二次マスクロマトグラムである。
【図3】化合物（ａ）の水素スペクトルである。
【図4】化合物（ａ）の炭素スペクトルである。
【図5】化合物（ａ）の１３Ｃ ＤＥＰＴ １３５°スペクトルである。
【図6】化合物（ａ）の１Ｈ－１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルである。
【図7】化合物（ａ）のＴＯＣＳＹスペクトルである。
【図8】化合物（ａ）のＨＳＱＣスペクトルである。
【図9】化合物（ａ）のＨＭＢＣスペクトルである。
【図10】化合物（ｃ）のマスクロマトグラムである。
【図11】化合物（ｃ）の二次マスクロマトグラムである。
【図12】化合物（ｃ）の水素スペクトルである。
【図13】化合物（ｃ）の炭素スペクトルである。
【図14】化合物（ｃ）の１３Ｃ ＤＥＰＴ １３５°スペクトルである。
【図15】化合物（ｃ）の１Ｈ－１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルである。
【図16】化合物（ｃ）のＴＯＣＳＹスペクトルである。
【図17】化合物（ｃ）のＲＯＥＳＹスペクトルである。
【図18】化合物（ｃ）のＨＳＱＣスペクトルである。
【図19】化合物（ｃ）のＨＭＢＣスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【0061】
以下、具体的な実施形態により本願の技術的態様をさらに説明する。当業者は、前記実施例が本願に対する理解を支援するだけのものであり、本願に対する具体的な制限とみなすべきではないことを明らかにすべきである。
【0062】
下記実施例に係るＳＤラットは北京維通利華実験動物技術有限公司から購入した。
【0063】
下記実施例に係るカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体Ｈ１０１１は特許文献２における実施例３に開示された調製方法により調製して得られ、その重量平均分子量は９１６１Ｄａであり、開環度は４３．１％である。
【0064】
実施例１
化合物（ａ）、化合物（ｂ）及び化合物（ｃ）の調製：
Ｈ１０１１（４００ｍｇ）を秤量して水（４．０ｍＬ）に溶解し、Ｈ１０１１水溶液を８５℃に加熱して７２ｈ反応させ、その後、２５℃に冷却させ、反応生成物はクロマトグラフィー技術で分離精製（クロマトグラフィーカラムはＤｉｏｎｅｘ ＩｏｎＰａｃ ＡＳ１１－ＨＣであり、溶離液はＭ及びＮである（具体的な成分は表１を参照する））されて、続いて脱塩、凍結乾燥されて化合物（ａ）、化合物（ｂ）及び化合物（ｃ）が得られる。
化合物（ａ）、化合物（ｂ）及び化合物（ｃ）の調製：
Ｈ１０１１（４００ｍｇ）を秤量して水（４．０ｍＬ）に溶解し、Ｈ１０１１水溶液を８５℃に加熱して７２ｈ反応させ、その後、２５℃に冷却させ、反応生成物はクロマトグラフィー技術で分離精製（クロマトグラフィーカラムはＤｉｏｎｅｘ ＩｏｎＰａｃ ＡＳ１１－ＨＣであり、溶離液はＭ及びＮである（具体的な成分は表１を参照する））されて、続いて脱塩、凍結乾燥されて化合物（ａ）、化合物（ｂ）及び化合物（ｃ）が得られる。
【0065】
【化13】
【0066】
【化14】
【0067】
【化15】
【0068】
【表4】
【0069】
濃化して得られた化合物（ａ）、化合物（ｂ）及び化合物（ｃ）は、質量分析及び核磁気共鳴スペクトル法（一次元１Ｈ－ＮＭＲ、一次元１３ＣＮＭＲ、１３Ｃ ＤＥＰＴ １３５°、１Ｈ－１Ｈ ＣＯＳＹ、二次元ＴＯＣＳＹ、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、二次元ＤＯＳＹ）により構造を同定する。
【0070】
化合物（ａ）の特徴データは以下の通りである。
ＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：４３２．０［Ｍ－Ｈ］－；
１Ｈ ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ ４．８７（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），４．３４（ｄｄ，Ｊ＝１１．２，３．７Ｈｚ，１Ｈ），４．２９（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２７（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２０（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ），４．０５（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．１，３．７，２．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９６（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，３．５Ｈｚ，１Ｈ），３．８１（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．５９（ｄｄ，Ｊ＝１０．１，９．２Ｈｚ，１Ｈ），２．０７（ｓ，３Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ ２４．７９，５６．２３，６９．３９，７１．９５，７３．０４，７４．１４，７６．５１，８３．２５，９９．５６，１７７．３４，１７８．７９，１７９．９９．
ＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：４３２．０［Ｍ－Ｈ］－；
１Ｈ ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ ４．８７（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），４．３４（ｄｄ，Ｊ＝１１．２，３．７Ｈｚ，１Ｈ），４．２９（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２７（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２０（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ），４．０５（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．１，３．７，２．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９６（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，３．５Ｈｚ，１Ｈ），３．８１（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．５９（ｄｄ，Ｊ＝１０．１，９．２Ｈｚ，１Ｈ），２．０７（ｓ，３Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ ２４．７９，５６．２３，６９．３９，７１．９５，７３．０４，７４．１４，７６．５１，８３．２５，９９．５６，１７７．３４，１７８．７９，１７９．９９．
【0071】
【0072】
化合物（ｂ）の特徴データは以下の通りである。
ＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：３９０．０［Ｍ－Ｈ］－；
ＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：３９０．０［Ｍ－Ｈ］－；
【0073】
化合物（ｃ）の特徴データは以下の通りである。
ＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：５２２．９８［Ｍ－２Ｈ］２－；
１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ ５．３７（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），５．２５ー５．２３（ｍ，１Ｈ），５．１６（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），５．１５ー５．１２（ｍ，１Ｈ），４．３８ー４．２８（ｍ，５Ｈ），４．２３（ｄｄ，Ｊ＝１１．４，２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１９（ｄｄ，Ｊ＝１１．１，２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１３（ｄｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．８７（ｄｔ，Ｊ＝９．７，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．８４（ｄｔ，Ｊ＝９．９，２．６Ｈｚ，１Ｈ），３．７８ー３．７０（ｍ，２Ｈ），３．６４（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），３．６０（ｄｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，１Ｈ），３．５６（ｄｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ），３．２５（ｄｄ，Ｊ＝１０．１，３．５Ｈｚ，３Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ ６０．４５，６０．６３，６８．９２，６９．１０，７０．４４，７０．６０，７１．８２，７２．４４，７２．８０，７３．０５，７３．５０，７４．５４，７７．５４，７８．７４，７９．５１，８１．２４，１００．９０，１０１．３８，１０１．６９，１７５．６９，１７６．１８，１７７．２３．
ＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：５２２．９８［Ｍ－２Ｈ］２－；
１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ ５．３７（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），５．２５ー５．２３（ｍ，１Ｈ），５．１６（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），５．１５ー５．１２（ｍ，１Ｈ），４．３８ー４．２８（ｍ，５Ｈ），４．２３（ｄｄ，Ｊ＝１１．４，２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１９（ｄｄ，Ｊ＝１１．１，２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１３（ｄｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．８７（ｄｔ，Ｊ＝９．７，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．８４（ｄｔ，Ｊ＝９．９，２．６Ｈｚ，１Ｈ），３．７８ー３．７０（ｍ，２Ｈ），３．６４（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），３．６０（ｄｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，１Ｈ），３．５６（ｄｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ），３．２５（ｄｄ，Ｊ＝１０．１，３．５Ｈｚ，３Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ ６０．４５，６０．６３，６８．９２，６９．１０，７０．４４，７０．６０，７１．８２，７２．４４，７２．８０，７３．０５，７３．５０，７４．５４，７７．５４，７８．７４，７９．５１，８１．２４，１００．９０，１０１．３８，１０１．６９，１７５．６９，１７６．１８，１７７．２３．
【0074】
【0075】
実施例２
本実施例は、本願に係るカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の検出方法を薬物動態学研究（化合物（ａ）を検出対象とする）に使用し、具体的な内容は以下の通りである。
本実施例は、本願に係るカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の検出方法を薬物動態学研究（化合物（ａ）を検出対象とする）に使用し、具体的な内容は以下の通りである。
【0076】
（１）試験方法
（１．１）実験動物：６匹の健康雄成獣ＳＤラットは、３匹がブランク血漿を取って検量線を作成するために用いられ、３匹がラットに１回投薬した後の血中濃度の検出を行うために用いられる。
（１．１）実験動物：６匹の健康雄成獣ＳＤラットは、３匹がブランク血漿を取って検量線を作成するために用いられ、３匹がラットに１回投薬した後の血中濃度の検出を行うために用いられる。
【0077】
（１．２）薬物調製：カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体Ｈ１０１１を秤量して水で６０ｍｇ／ｋｇの薬物溶液を調製する。
【0078】
（１．３）投薬及びサンプル採取：皮下注射で６０ｍｇ／ｋｇ投薬した後に、それぞれ
時点０ｈ、０．２５ｈ、０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、２４ｈで採血し、全血を採取した後にＫ２ＥＤＴＡ抗凝固試験管に置いてから、１５ｍｉｎ遠心し、分離して血漿サンプルを得る。
時点０ｈ、０．２５ｈ、０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、２４ｈで採血し、全血を採取した後にＫ２ＥＤＴＡ抗凝固試験管に置いてから、１５ｍｉｎ遠心し、分離して血漿サンプルを得る。
【0079】
（１．４）検量線の作成：
（１．４．１）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体Ｈ１０１１を秤量して１ｍｇ／ｍＬの水溶液に調製し、上記ブランク血漿を希釈液としてＨ１０１１水溶液を段階的に希釈し、２μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、１２８μｇ／ｍＬ、２５６μｇ／ｍＬの標準溶液を調製し、８５℃の条件で７２ｈ加水分解する。
（１．４．２）加水分解後の標準溶液に対して検出前処理を行い、加水分解後の標準溶液へ１％の体積比のトリフルオロ酢酸（５％、ｖ／ｖ）及び２倍の体積のアセトニトリル／メタノール（ｖ／ｖ、５０／５０）を添加し、均一に混合して、－２０℃で２０ｍｉｎ静置し、遠心して、上清を回収し乾燥した後に超純水で再溶解する。
（１．４．３）液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を行い、スペクトルを測定して得られ、クロマトグラフィー条件は表２の通りであり、質量分析条件は表３の通りである。
（１．４．１）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体Ｈ１０１１を秤量して１ｍｇ／ｍＬの水溶液に調製し、上記ブランク血漿を希釈液としてＨ１０１１水溶液を段階的に希釈し、２μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、１２８μｇ／ｍＬ、２５６μｇ／ｍＬの標準溶液を調製し、８５℃の条件で７２ｈ加水分解する。
（１．４．２）加水分解後の標準溶液に対して検出前処理を行い、加水分解後の標準溶液へ１％の体積比のトリフルオロ酢酸（５％、ｖ／ｖ）及び２倍の体積のアセトニトリル／メタノール（ｖ／ｖ、５０／５０）を添加し、均一に混合して、－２０℃で２０ｍｉｎ静置し、遠心して、上清を回収し乾燥した後に超純水で再溶解する。
（１．４．３）液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を行い、スペクトルを測定して得られ、クロマトグラフィー条件は表２の通りであり、質量分析条件は表３の通りである。
【0080】
【表5】
【0081】
【表6】
【0082】
（１．４．４）Ｈ１０１１標準溶液と化合物（ａ）のマススペクトルピーク面積との線形関係により検量線を作成し、化合物（ａ）のマススペクトルシグナルはＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：４３２．０［Ｍ－Ｈ］－であり、線形方程式はｙ＝３６．２１５４ｘ－０．３２１６であり、相関係数はＲ２＝０．９９８７であり、ただし、ｙはマススペクトルピーク面積であり、ｘは標準溶液濃度である。
【0083】
（１．５）血漿サンプル中のＨ１０１１の含有量の検出：
（１．５．１）ステップ（１．３）で得られた血漿サンプルを８５℃の条件で７２ｈ加水分解し、その後、その中へ１％の体積比のトリフルオロ酢酸（５％、ｖ／ｖ）及び２倍の体積のアセトニトリル／メタノール（ｖ／ｖ、５０／５０）を添加し、均一に混合して、－２０℃で２０ｍｉｎ静置し、遠心して、上清を回収し乾燥した後に超純水で再溶解する。
（１．５．２）液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を行い、化合物（ａ）のマススペクトルピーク面積を測定して得られ、クロマトグラフィー条件は上記表２の通りであり、質量分析条件は上記表３の通りである。
（１．５．３）化合物（ａ）のマススペクトルピーク面積から、ステップ（１．４）で作成された検量線と結び付けて、各時点の血漿サンプル中のＨ１０１１の濃度を算出し得て、薬物濃度－時間曲線に基づいて、薬物動態パラメータを算出する。
（１．５．１）ステップ（１．３）で得られた血漿サンプルを８５℃の条件で７２ｈ加水分解し、その後、その中へ１％の体積比のトリフルオロ酢酸（５％、ｖ／ｖ）及び２倍の体積のアセトニトリル／メタノール（ｖ／ｖ、５０／５０）を添加し、均一に混合して、－２０℃で２０ｍｉｎ静置し、遠心して、上清を回収し乾燥した後に超純水で再溶解する。
（１．５．２）液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を行い、化合物（ａ）のマススペクトルピーク面積を測定して得られ、クロマトグラフィー条件は上記表２の通りであり、質量分析条件は上記表３の通りである。
（１．５．３）化合物（ａ）のマススペクトルピーク面積から、ステップ（１．４）で作成された検量線と結び付けて、各時点の血漿サンプル中のＨ１０１１の濃度を算出し得て、薬物濃度－時間曲線に基づいて、薬物動態パラメータを算出する。
【0084】
（２）試験結果は表４の通りである。
【0085】
【表7】
【0086】
（３）方法学検証
（３．１）専門性
超純水対照溶液及びブランク血漿対照溶液を調製し、上記と同様な高温加水分解、前処理過程を経た後に、上記と同様な条件の液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を経て、超純水対照及び血漿対照溶液に４３２．０Ｄａのシグナルピーク、即ち化合物（ａ）のマススペクトルシグナルピークが検出されず、超純水及びブランク血漿が検出に影響を与えず、本検出方法の専門性がよいことを表明する。
（３．１）専門性
超純水対照溶液及びブランク血漿対照溶液を調製し、上記と同様な高温加水分解、前処理過程を経た後に、上記と同様な条件の液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を経て、超純水対照及び血漿対照溶液に４３２．０Ｄａのシグナルピーク、即ち化合物（ａ）のマススペクトルシグナルピークが検出されず、超純水及びブランク血漿が検出に影響を与えず、本検出方法の専門性がよいことを表明する。
【0087】
（３．２）定量限界及び検出限界
計算を経て、本方法の定量限界は０．８μｇ／ｍＬであり、検出限界は０．２μｇ／ｍＬである。
計算を経て、本方法の定量限界は０．８μｇ／ｍＬであり、検出限界は０．２μｇ／ｍＬである。
【0088】
（３．３）確度
１μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１２０μｇ／ｍＬの３つの濃度を設定し、Ｈ１０１１血漿サンプルをテストし、計算を経て回収率は８２．６％～１１０．８％であり、且つ各濃度の６回の実験結果のＲＳＤ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ：相対標準偏差）値は順に４．２％、２．２％及び１．３％である。
１μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１２０μｇ／ｍＬの３つの濃度を設定し、Ｈ１０１１血漿サンプルをテストし、計算を経て回収率は８２．６％～１１０．８％であり、且つ各濃度の６回の実験結果のＲＳＤ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ：相対標準偏差）値は順に４．２％、２．２％及び１．３％である。
【0089】
（３．４）精度
５０μｇ／ｍＬのＨ１０１１血漿溶液を選択し、２名の異なる検出員によりそれぞれ６回検出し、第１名の検出員による６回の実験結果のＲＳＤは２．０％であり、第２名の検出員による６回の実験結果のＲＳＤは１．８％であり、２名の検出員による１２回の実験結果のＲＳＤは２．１％であり、いずれも≦１０．０％の許容可能な標準を満たす。方法精度がよい。
５０μｇ／ｍＬのＨ１０１１血漿溶液を選択し、２名の異なる検出員によりそれぞれ６回検出し、第１名の検出員による６回の実験結果のＲＳＤは２．０％であり、第２名の検出員による６回の実験結果のＲＳＤは１．８％であり、２名の検出員による１２回の実験結果のＲＳＤは２．１％であり、いずれも≦１０．０％の許容可能な標準を満たす。方法精度がよい。
【0090】
（３．５）溶液安定性
５０μｇ／ｍＬのＨ１０１１血漿溶液を選択し、加水分解して前処理を行い、サンプル溶液の５日目の検出結果は０時間の９７．２％であり、標準を満たす。
５０μｇ／ｍＬのＨ１０１１血漿溶液を選択し、加水分解して前処理を行い、サンプル溶液の５日目の検出結果は０時間の９７．２％であり、標準を満たす。
【0091】
実施例３
本実施例は、本願に係るカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の検出方法を薬物動態学研究（化合物（ｂ）を検出対象とする）に使用し、具体的な内容は以下の通りである。
本実施例は、本願に係るカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の検出方法を薬物動態学研究（化合物（ｂ）を検出対象とする）に使用し、具体的な内容は以下の通りである。
【0092】
（１）試験方法
（１．１）実験動物：６匹の健康雄成獣ＳＤラットは、３匹がブランク血漿を取って検量線を作成するために用いられ、３匹がラットに１回投薬した後の血中濃度の検出を行うために用いられる。
（１．１）実験動物：６匹の健康雄成獣ＳＤラットは、３匹がブランク血漿を取って検量線を作成するために用いられ、３匹がラットに１回投薬した後の血中濃度の検出を行うために用いられる。
【0093】
（１．２）薬物調製：カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体Ｈ１０１１を秤量して水で６０ｍｇ／ｋｇの薬物溶液を調製する。
【0094】
（１．３）投薬及びサンプル採取：皮下注射で６０ｍｇ／ｋｇ投薬した後に、それぞれ時点０ｈ、０．２５ｈ、０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、２４ｈで採血し、全血を採取した後にＫ２ＥＤＴＡ抗凝固試験管に置いてから、１５ｍｉｎ遠心し、分離して血漿サンプルを得る。
【0095】
（１．４）検量線の作成：
（１．４．１）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体Ｈ１０１１を秤量して１ｍｇ／ｍＬの水溶液に調製し、上記ブランク血漿を希釈液としてＨ１０１１水溶液を段階的に希釈し、２μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、１２８μｇ／ｍＬ、２５６μｇ／ｍＬの標準溶液を調製し、９０℃の条件で４８ｈ加水分解する。
（１．４．２）加水分解後の標準溶液に対して検出前処理を行い、加水分解後の標準溶液へ１％の体積比のトリフルオロ酢酸（５％、ｖ／ｖ）及び２倍の体積のアセトニトリル／メタノール（ｖ／ｖ、５０／５０）を添加し、均一に混合して、－２０℃で２０ｍｉｎ静置し、遠心して、上清を回収し乾燥した後に超純水で再溶解する。
（１．４．３）液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を行い、スペクトルを測定して得られ、クロマトグラフィー条件は上記表２の通りであり、質量分析条件は上記表３の通りであり、分子量を３９０．０Ｄａとする。
（１．４．４）Ｈ１０１１標準溶液と化合物（ｂ）のマススペクトルピーク面積との線形関係により検量線を作成し、化合物（ｂ）のマススペクトルシグナルはＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：３９０．０［Ｍ－Ｈ］－であり、作成された線形方程式はｙ＝２６．０２３５ｘであり、相関係数は０．９９８１であり、ただし、ｙはマススペクトルピーク面積であり、ｘは標準溶液濃度である。
（１．４．１）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体Ｈ１０１１を秤量して１ｍｇ／ｍＬの水溶液に調製し、上記ブランク血漿を希釈液としてＨ１０１１水溶液を段階的に希釈し、２μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、１２８μｇ／ｍＬ、２５６μｇ／ｍＬの標準溶液を調製し、９０℃の条件で４８ｈ加水分解する。
（１．４．２）加水分解後の標準溶液に対して検出前処理を行い、加水分解後の標準溶液へ１％の体積比のトリフルオロ酢酸（５％、ｖ／ｖ）及び２倍の体積のアセトニトリル／メタノール（ｖ／ｖ、５０／５０）を添加し、均一に混合して、－２０℃で２０ｍｉｎ静置し、遠心して、上清を回収し乾燥した後に超純水で再溶解する。
（１．４．３）液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を行い、スペクトルを測定して得られ、クロマトグラフィー条件は上記表２の通りであり、質量分析条件は上記表３の通りであり、分子量を３９０．０Ｄａとする。
（１．４．４）Ｈ１０１１標準溶液と化合物（ｂ）のマススペクトルピーク面積との線形関係により検量線を作成し、化合物（ｂ）のマススペクトルシグナルはＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：３９０．０［Ｍ－Ｈ］－であり、作成された線形方程式はｙ＝２６．０２３５ｘであり、相関係数は０．９９８１であり、ただし、ｙはマススペクトルピーク面積であり、ｘは標準溶液濃度である。
【0096】
（１．５）血漿サンプル中のＨ１０１１の含有量の検出：
（１．５．１）ステップ（１．３）で得られた血漿サンプルを９０℃の条件で４８ｈ加水分解してから、その中へ１％の体積比のトリフルオロ酢酸（５％、ｖ／ｖ）及び２倍の体積のアセトニトリル／メタノール（ｖ／ｖ、５０／５０）を添加し、均一に混合して、－２０℃で２０ｍｉｎ静置し、遠心して、上清を回収し乾燥した後に超純水で再溶解する。
（１．５．２）液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を行い、化合物（ｂ）のマススペクトルピーク面積を測定して得られ、クロマトグラフィー条件は上記表２の通りであり、質量分析条件は上記表３の通りであり、分子量を３９０．０Ｄａとする。
（１．５．３）化合物（ｂ）のマススペクトルピーク面積から、ステップ（１．４）で作成された検量線と結び付けて、各時点の血漿サンプル中のＨ１０１１の濃度を算出し得て、薬物濃度－時間曲線に基づいて、薬物動態パラメータを算出する。
（１．５．１）ステップ（１．３）で得られた血漿サンプルを９０℃の条件で４８ｈ加水分解してから、その中へ１％の体積比のトリフルオロ酢酸（５％、ｖ／ｖ）及び２倍の体積のアセトニトリル／メタノール（ｖ／ｖ、５０／５０）を添加し、均一に混合して、－２０℃で２０ｍｉｎ静置し、遠心して、上清を回収し乾燥した後に超純水で再溶解する。
（１．５．２）液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を行い、化合物（ｂ）のマススペクトルピーク面積を測定して得られ、クロマトグラフィー条件は上記表２の通りであり、質量分析条件は上記表３の通りであり、分子量を３９０．０Ｄａとする。
（１．５．３）化合物（ｂ）のマススペクトルピーク面積から、ステップ（１．４）で作成された検量線と結び付けて、各時点の血漿サンプル中のＨ１０１１の濃度を算出し得て、薬物濃度－時間曲線に基づいて、薬物動態パラメータを算出する。
【0097】
（２）試験結果は表５の通りである。
【0098】
【表8】
【0099】
（３）方法学検証
（３．１）専門性
超純水対照溶液及びブランク血漿対照溶液を調製し、上記と同様な高温加水分解、前処理過程を経た後に、上記と同様な条件の液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を経て、超純水対照及び血漿対照溶液に３９０．０Ｄａのシグナルピーク、即ち化合物（ｂ）のマススペクトルシグナルピークが検出されず、超純水及びブランク血漿が検出に影響を与えず、本検出方法の専門性がよいことを表明する。
（３．１）専門性
超純水対照溶液及びブランク血漿対照溶液を調製し、上記と同様な高温加水分解、前処理過程を経た後に、上記と同様な条件の液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を経て、超純水対照及び血漿対照溶液に３９０．０Ｄａのシグナルピーク、即ち化合物（ｂ）のマススペクトルシグナルピークが検出されず、超純水及びブランク血漿が検出に影響を与えず、本検出方法の専門性がよいことを表明する。
【0100】
（３．２）定量限界及び検出限界
計算を経て、本方法の定量限界は１．１μｇ／ｍＬであり、検出限界は０．５５μｇ／ｍＬである。
計算を経て、本方法の定量限界は１．１μｇ／ｍＬであり、検出限界は０．５５μｇ／ｍＬである。
【0101】
（３．３）確度
１μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１２０μｇ／ｍＬの３つの濃度を設定し、Ｈ１０１１血漿サンプルをテストし、計算を経て回収率は８１．２％～１１５．８％であり、且つ各濃度の６回の実験結果のＲＳＤ値は順に５．４％、１．８％及び２．０％である。
１μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１２０μｇ／ｍＬの３つの濃度を設定し、Ｈ１０１１血漿サンプルをテストし、計算を経て回収率は８１．２％～１１５．８％であり、且つ各濃度の６回の実験結果のＲＳＤ値は順に５．４％、１．８％及び２．０％である。
【0102】
（３．４）精度
５０μｇ／ｍＬのＨ１０１１血漿溶液を選択し、２名の異なる検出員によりそれぞれ６回検出し、第１名の検出員による６回の実験結果のＲＳＤは１．６％であり、第２名の検出員による６回の実験結果のＲＳＤは２．６％であり、２名の検出員による１２回の実験結果のＲＳＤは２．２％であり、いずれも≦１０．０％の許容可能な標準を満たす。方法精度がよい。
５０μｇ／ｍＬのＨ１０１１血漿溶液を選択し、２名の異なる検出員によりそれぞれ６回検出し、第１名の検出員による６回の実験結果のＲＳＤは１．６％であり、第２名の検出員による６回の実験結果のＲＳＤは２．６％であり、２名の検出員による１２回の実験結果のＲＳＤは２．２％であり、いずれも≦１０．０％の許容可能な標準を満たす。方法精度がよい。
【0103】
（３．５）溶液安定性
５０μｇ／ｍＬのＨ１０１１血漿溶液を選択し、加水分解して前処理を行い、サンプル溶液の５日目の検出結果は０時間の９７．８％であり、標準を満たす。
５０μｇ／ｍＬのＨ１０１１血漿溶液を選択し、加水分解して前処理を行い、サンプル溶液の５日目の検出結果は０時間の９７．８％であり、標準を満たす。
【0104】
実施例４
本実施例は、本願に係るカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の検出方法を薬物動態学研究（化合物（ｃ）を検出対象とする）に使用し、具体的な内容は以下の通りである。
本実施例は、本願に係るカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の検出方法を薬物動態学研究（化合物（ｃ）を検出対象とする）に使用し、具体的な内容は以下の通りである。
【0105】
（１）試験方法
（１．１）実験動物：６匹の健康雄成獣ＳＤラットは、３匹がブランク血漿を取って検量線を作成するために用いられ、３匹がラットに１回投薬した後の血中濃度の検出を行うために用いられる。
（１．１）実験動物：６匹の健康雄成獣ＳＤラットは、３匹がブランク血漿を取って検量線を作成するために用いられ、３匹がラットに１回投薬した後の血中濃度の検出を行うために用いられる。
【0106】
（１．２）薬物調製：カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体Ｈ１０１１を秤量して水で２０ｍｇ／ｋｇの薬物溶液を調製する。
【0107】
（１．３）投薬及びサンプル採取：皮下注射で２０ｍｇ／ｋｇ投薬した後に、それぞれ時点０ｈ、０．２５ｈ、０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、２４ｈで採血し、全血を採取した後にＫ２ＥＤＴＡ抗凝固試験管に置いてから、１５ｍｉｎ遠心し、分離して血漿サンプルを得る。
【0108】
（１．４）検量線の作成：
（１．４．１）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体Ｈ１０１１を秤量して１ｍｇ／ｍＬの水溶液に調製し、上記ブランク血漿を希釈液としてＨ１０１１水溶液を段階的に希釈し、２μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、１２８μｇ／ｍＬ、２５６μｇ／ｍＬの標準溶液を調製し、９０℃の条件で３６ｈ加水分解する。
（１．４．２）加水分解後の標準溶液に対して検出前処理を行い、加水分解後の標準溶液へ１％の体積比のトリフルオロ酢酸（５％、ｖ／ｖ）及び２倍の体積のアセトニトリル／メタノール（ｖ／ｖ、５０／５０）を添加し、均一に混合して、－２０℃で２０ｍｉｎ静置し、遠心して、上清を回収し乾燥した後に超純水で再溶解する。
（１．４．３）液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を行い、スペクトルを測定して得られ、クロマトグラフィー条件は上記表２の通りであり、質量分析条件は上記表３の通りであり、分子量を５２２．９８Ｄａとする。
（１．４．４）Ｈ１０１１標準溶液と化合物（ｃ）のマススペクトルピーク面積との線形関係により検量線を作成し、化合物（ｃ）のマススペクトルシグナルはＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：５２２．９８［Ｍ－２Ｈ］２－であり、作成された線形方程式はｙ＝２３．６２２５ｘであり、相関係数は０．９９８６であり、ただし、ｙはマススペクトルピーク面積であり、ｘは標準溶液濃度である。
（１．４．１）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体Ｈ１０１１を秤量して１ｍｇ／ｍＬの水溶液に調製し、上記ブランク血漿を希釈液としてＨ１０１１水溶液を段階的に希釈し、２μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、１２８μｇ／ｍＬ、２５６μｇ／ｍＬの標準溶液を調製し、９０℃の条件で３６ｈ加水分解する。
（１．４．２）加水分解後の標準溶液に対して検出前処理を行い、加水分解後の標準溶液へ１％の体積比のトリフルオロ酢酸（５％、ｖ／ｖ）及び２倍の体積のアセトニトリル／メタノール（ｖ／ｖ、５０／５０）を添加し、均一に混合して、－２０℃で２０ｍｉｎ静置し、遠心して、上清を回収し乾燥した後に超純水で再溶解する。
（１．４．３）液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を行い、スペクトルを測定して得られ、クロマトグラフィー条件は上記表２の通りであり、質量分析条件は上記表３の通りであり、分子量を５２２．９８Ｄａとする。
（１．４．４）Ｈ１０１１標準溶液と化合物（ｃ）のマススペクトルピーク面積との線形関係により検量線を作成し、化合物（ｃ）のマススペクトルシグナルはＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：５２２．９８［Ｍ－２Ｈ］２－であり、作成された線形方程式はｙ＝２３．６２２５ｘであり、相関係数は０．９９８６であり、ただし、ｙはマススペクトルピーク面積であり、ｘは標準溶液濃度である。
【0109】
（１．５）血漿サンプル中のＨ１０１１の含有量の検出：
（１．５．１）ステップ（１．３）で得られた血漿サンプルを９０℃の条件で３６ｈ加水分解し、その後、その中へ１％の体積比のトリフルオロ酢酸（５％、ｖ／ｖ）及び２倍の体積のアセトニトリル／メタノール（ｖ／ｖ、５０／５０）を添加し、均一に混合して、－２０℃で２０ｍｉｎ静置し、遠心して、上清を回収し乾燥した後に超純水で再溶解する。
（１．５．２）液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を行い、化合物（ｃ）のマススペクトルピーク面積を測定して得られ、クロマトグラフィー条件は上記表２の通りであり、質量分析条件は上記表３の通りである。
（１．５．３）化合物（ｃ）のマススペクトルピーク面積から、ステップ（１．４）で作成された検量線と結び付けて、各時点の血漿サンプル中のＨ１０１１の濃度を算出し得て、薬物濃度－時間曲線に基づいて、薬物動態パラメータを算出する。
（１．５．１）ステップ（１．３）で得られた血漿サンプルを９０℃の条件で３６ｈ加水分解し、その後、その中へ１％の体積比のトリフルオロ酢酸（５％、ｖ／ｖ）及び２倍の体積のアセトニトリル／メタノール（ｖ／ｖ、５０／５０）を添加し、均一に混合して、－２０℃で２０ｍｉｎ静置し、遠心して、上清を回収し乾燥した後に超純水で再溶解する。
（１．５．２）液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を行い、化合物（ｃ）のマススペクトルピーク面積を測定して得られ、クロマトグラフィー条件は上記表２の通りであり、質量分析条件は上記表３の通りである。
（１．５．３）化合物（ｃ）のマススペクトルピーク面積から、ステップ（１．４）で作成された検量線と結び付けて、各時点の血漿サンプル中のＨ１０１１の濃度を算出し得て、薬物濃度－時間曲線に基づいて、薬物動態パラメータを算出する。
【0110】
（２）試験結果は表６の通りである。
【0111】
【表9】
【0112】
（３）方法学検証
（３．１）専門性
超純水対照溶液及びブランク血漿対照溶液を調製し、上記と同様な高温加水分解、前処理過程を経た後に、上記と同様な条件の液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を経て、超純水対照及び血漿対照溶液に５２２．９８Ｄａのシグナルピーク、即ち化合物（ｃ）のマススペクトルシグナルピークが検出されず、超純水及びブランク血漿が検出に影響を与えず、本検出方法の専門性がよいことを表明する。
（３．１）専門性
超純水対照溶液及びブランク血漿対照溶液を調製し、上記と同様な高温加水分解、前処理過程を経た後に、上記と同様な条件の液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を経て、超純水対照及び血漿対照溶液に５２２．９８Ｄａのシグナルピーク、即ち化合物（ｃ）のマススペクトルシグナルピークが検出されず、超純水及びブランク血漿が検出に影響を与えず、本検出方法の専門性がよいことを表明する。
【0113】
（３．２）定量限界及び検出限界
計算を経て、本方法の定量限界は２．０μｇ／ｍＬであり、検出限界は１．０μｇ／ｍＬである。
計算を経て、本方法の定量限界は２．０μｇ／ｍＬであり、検出限界は１．０μｇ／ｍＬである。
【0114】
（３．３）確度
２μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１２０μｇ／ｍＬの３つの濃度を設定し、Ｈ１０１１
血漿サンプルをテストし、計算を経て回収率は８０．３％～１０８．８％であり、且つ各濃度の６回の実験結果のＲＳＤ値は順に８．９％、６．５％及び５．４％である。
２μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１２０μｇ／ｍＬの３つの濃度を設定し、Ｈ１０１１
血漿サンプルをテストし、計算を経て回収率は８０．３％～１０８．８％であり、且つ各濃度の６回の実験結果のＲＳＤ値は順に８．９％、６．５％及び５．４％である。
【0115】
（３．４）精度
５０μｇ／ｍＬのＨ１０１１の血漿溶液を選択し、２名の異なる検出員によりそれぞれ６回検出し、第１名の検出員による６回の実験結果のＲＳＤは６．５％であり、第２名の検出員による６回の実験結果のＲＳＤは７．２％であり、２名の検出員による１２回の実験結果のＲＳＤは７．４％であり、いずれも≦１０．０％の許容可能な標準を満たす。方法精度がよい。
５０μｇ／ｍＬのＨ１０１１の血漿溶液を選択し、２名の異なる検出員によりそれぞれ６回検出し、第１名の検出員による６回の実験結果のＲＳＤは６．５％であり、第２名の検出員による６回の実験結果のＲＳＤは７．２％であり、２名の検出員による１２回の実験結果のＲＳＤは７．４％であり、いずれも≦１０．０％の許容可能な標準を満たす。方法精度がよい。
【0116】
（３．５）溶液安定性
５０μｇ／ｍＬのＨ１０１１血漿溶液を選択し、加水分解して前処理を行い、サンプル溶液の５日目の検出結果は０時間の９０．２％であり、標準を満たす。
５０μｇ／ｍＬのＨ１０１１血漿溶液を選択し、加水分解して前処理を行い、サンプル溶液の５日目の検出結果は０時間の９０．２％であり、標準を満たす。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【手続補正書】
【提出日】2023-06-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の含有量を検出するための方法であって、前記方法は、（１）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を含有するサンプルを加水分解し、式（Ｉ）で表される化合物を含有する加水分解液を得るステップと、
【化1】
（ただし、各Ｒａは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈであり、各Ｒｂは独立してＨ、－ＳＯ３Ｈ又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、各Ｒｃは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈであり、ｎは０、１、２、３、４又は５である。）
（２）液体クロマトグラフィータンデム質量分析によりステップ（１）で得られた加水分解液を検出するステップと、
（３）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を標準品として、その異なる勾配の濃度の溶液をステップ（１）の方法に従って加水分解し、ステップ（２）の方法に従って異なる濃度の標準品溶液の加水分解液中の式（Ｉ）で表される化合物のマススペクトルシグナルピーク面積を検出し、カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体標準品の量とマススペクトルシグナルピーク面積との間の検量線を作成し、この検量線に基づいて、ステップ（２）で測定された式（Ｉ）で表される化合物のマススペクトルピーク面積によりサンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の含有量を算出するステッ
プと、を含み、
前記カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体は、式（ＩＩ）で表される構造単位と選択的な式（ＩＩＩ）で表される構造単位とを含むグリコサミノグリカン系化合物である、ことを特徴とするサンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の含有量を検出するための方法。
【化2】
【化3】
（ただし、各Ｒａは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈであり、Ｒｂは独立してＨ、－ＳＯ３Ｈ又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、Ｒｃは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈである。）
【請求項2】
前記カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体は、（１）グリコサミノグリカン中でウロン酸における隣接されるジオールが酸化開環されてジアルデヒド構造を形成することと、（２）ジアルデヒド構造がさらに酸化されてジカルボン酸構造を得ることとの２段階の酸化反応を経て得られ、
その中、前記グリコサミノグリカンはヘパリン又はヘパラン硫酸である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記式（Ｉ）で表される化合物は、以下の構造式からなる群から選ばれる、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。【化4】
【化5】
【化6】
【請求項4】
前記カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の重量平均分子量は３０００～２００００Ｄａであり、好ましくは７０００～１４０００Ｄａであり、さらに好ましくは８０００～１３５００Ｄａであり、前記カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の開環度は１０％～１００％であり、好ましくは２５％～８０％であり、さらに好ましくは２５％～６０％である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項5】
ステップ（１）に記載のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を含有するサンプルを加水分解する処理方式は加熱であり、好ましくは、前記加熱の温度は７０～１００℃であり、８５～９５℃であることが好ましく、
好ましくは、前記加熱の時間は１２～１６８ｈであり、１２～１２０ｈであることが好ましい、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記液体クロマトグラフィーは逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー又は親水クロマトグラフィーであり、好ましくは、前記液体クロマトグラフィーの移動相は移動相Ａ及び移動相Ｂであり、前記移動相Ａはヘキサフルオロイソプロパノールとペンチルアミンとの水溶液であり、前記移動相Ｂはヘキサフルオロイソプロパノールとペンチルアミンとのアセトニトリル－水溶液であり、
好ましくは、前記移動相Ａは４５～５５ｍＭのヘキサフルオロイソプロパノールと１３～１７ｍＭのペンチルアミンとを含有する水溶液であり、前記移動相Ｂは４５～５５ｍＭのヘキサフルオロイソプロパノールと１３～１７ｍＭのペンチルアミンとを含有するアセトニトリル－水溶液であり、前記移動相Ｂでは、アセトニトリルと水との体積比は７０：３０～８０：２０であり、
好ましくは、前記液体クロマトグラフィーの移動相は移動相Ａ及び移動相Ｂであり、具体的には以下の表で示される通りである、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【表1】
【請求項7】
前記カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を含有するサンプルは生物サンプルである場合に、ステップ（１）で得られた加水分解液に対して検出前処理を行う必要があり、前記前処理は、加水分解液をトリフルオロ酢酸溶液及びアセトニトリル－メタノール溶液と混合させ、その後、静置し、遠心し、上清を回収し乾燥させた後に水で再溶解することを含み、
好ましくは、前記生物サンプルは血液、尿を含み、
好ましくは、前記トリフルオロ酢酸溶液の添加量は体積で加水分解液の体積の０．５％～１．５％であり、
好ましくは、前記トリフルオロ酢酸溶液の濃度は４％～６％であり、
好ましくは、前記アセトニトリル－メタノール溶液の添加量は体積で加水分解液の体積の１～５倍であり、好ましくは１～３倍であり、より好ましくは１．５～２．５倍であり、
好ましくは、前記アセトニトリル－メタノール溶液では、アセトニトリルとメタノールとの体積比は１：０．５～１：１．５であり、
好ましくは、前記静置の温度は－２５～－１５℃であり、時間は１５～２５ｍｉｎである、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
構造は式（Ｉ）の通りである、ことを特徴とする化合物。【化7】
（ただし、各Ｒａは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈであり、各Ｒｂは独立してＨ、－ＳＯ３Ｈ又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、各Ｒｃは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈであり、ｎは０、１、２、３、４又は５である。）
【請求項9】
以下の構造の１つを有する、ことを特徴とする請求項８に記載の化合物。【化8】
【化9】
【化10】
【請求項10】
請求項１に記載のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の検出方法を含む、カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の薬物動態学研究方法。
【請求項11】
請求項１に記載のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の検出方法を含む、カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の医薬製剤の品質検出方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0010】
（ただし、各Ｒａは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈであり、各Ｒｂは独立してＨ、－ＳＯ３Ｈ又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、各Ｒｃは独立して－ＳＯ３Ｈ又は－Ｈであり、ｎは０、１、２、３、４又は５である。）
（２）液体クロマトグラフィータンデム質量分析によりステップ（１）で得られた加水分解液を検出するステップと、
（３）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を標準品として、その異なる勾配の濃度の溶液をステップ（１）の方法に従って加水分解し、ステップ（２）の方法に従って異なる濃度の標準品溶液の加水分解液中の式（Ｉ）で表される化合物のマススペクトルシグナルピーク面積を検出し、カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体標準品の量とマススペクトルシグナルピーク面積との間の検量線を作成し、この検量線に基づいて、ステップ（２）で測定された式（Ｉ）で表される化合物のマススペクトルピーク面積によりサンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の含有量を算出するステップと、を含み、
前記カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体は、式（ＩＩ）で表される構造単位と選択的な式（ＩＩＩ）で表される構造単位とを含むグリコサミノグリカン系化合物である。
（２）液体クロマトグラフィータンデム質量分析によりステップ（１）で得られた加水分解液を検出するステップと、
（３）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体を標準品として、その異なる勾配の濃度の溶液をステップ（１）の方法に従って加水分解し、ステップ（２）の方法に従って異なる濃度の標準品溶液の加水分解液中の式（Ｉ）で表される化合物のマススペクトルシグナルピーク面積を検出し、カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体標準品の量とマススペクトルシグナルピーク面積との間の検量線を作成し、この検量線に基づいて、ステップ（２）で測定された式（Ｉ）で表される化合物のマススペクトルピーク面積によりサンプル中のカルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体の含有量を算出するステップと、を含み、
前記カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体は、式（ＩＩ）で表される構造単位と選択的な式（ＩＩＩ）で表される構造単位とを含むグリコサミノグリカン系化合物である。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0014】
好ましくは、前記カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体は、（１）グリコサミノグリカン中でウロン酸における隣接されるジオールが酸化開環されてジアルデヒド構造を形成することと、（２）ジアルデヒド構造がさらに酸化されてジカルボン酸構造が得られることとの２段階の酸化反応を経て得られ、その中、前記グリコサミノグリカンはヘパリン又はヘパラン硫酸である。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0015】
好ましくは、前記式（Ｉ）で表される化合物は、以下の構造式からなる群から選ばれる。
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0082】
（１．４．４）Ｈ１０１１標準溶液と化合物（ａ）のマススペクトルピーク面積との間の検量線を作成し、化合物（ａ）のマススペクトルシグナルはＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：４３２．０［Ｍ－Ｈ］－であり、線形方程式はｙ＝３６．２１５４ｘ－０．３２１６であり、相関係数はＲ２＝０．９９８７であり、ただし、ｙはマススペクトルピーク面積であり、ｘは標準溶液濃度である。
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0095】
（１．４）検量線の作成：
（１．４．１）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体Ｈ１０１１を秤量して１ｍｇ／ｍＬの水溶液に調製し、上記ブランク血漿を希釈液としてＨ１０１１水溶液を段階的に希釈し、２μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、１２８μｇ／ｍＬ、２５６μｇ／ｍＬの標準溶液を調製し、９０℃の条件で４８ｈ加水分解する。
（１．４．２）加水分解後の標準溶液に対して検出前処理を行い、加水分解後の標準溶液へ１％の体積比のトリフルオロ酢酸（５％、ｖ／ｖ）及び２倍の体積のアセトニトリル／メタノール（ｖ／ｖ、５０／５０）を添加し、均一に混合して、－２０℃で２０ｍｉｎ静置し、遠心して、上清を回収し乾燥した後に超純水で再溶解する。
（１．４．３）液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を行い、スペクトルを測定して得られ、クロマトグラフィー条件は上記表２の通りであり、質量分析条件は上記表３の通りであり、分子量を３９０．０Ｄａとする。
（１．４．４）Ｈ１０１１標準溶液と化合物（ｂ）のマススペクトルピーク面積との間の検量線を作成し、化合物（ｂ）のマススペクトルシグナルはＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：３９０．０［Ｍ－Ｈ］－であり、作成された線形方程式はｙ＝２６．０２３５ｘであり、相関係数は０．９９８１であり、ただし、ｙはマススペクトルピーク面積であり、ｘは標準溶液濃度である。
（１．４．１）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体Ｈ１０１１を秤量して１ｍｇ／ｍＬの水溶液に調製し、上記ブランク血漿を希釈液としてＨ１０１１水溶液を段階的に希釈し、２μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、１２８μｇ／ｍＬ、２５６μｇ／ｍＬの標準溶液を調製し、９０℃の条件で４８ｈ加水分解する。
（１．４．２）加水分解後の標準溶液に対して検出前処理を行い、加水分解後の標準溶液へ１％の体積比のトリフルオロ酢酸（５％、ｖ／ｖ）及び２倍の体積のアセトニトリル／メタノール（ｖ／ｖ、５０／５０）を添加し、均一に混合して、－２０℃で２０ｍｉｎ静置し、遠心して、上清を回収し乾燥した後に超純水で再溶解する。
（１．４．３）液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を行い、スペクトルを測定して得られ、クロマトグラフィー条件は上記表２の通りであり、質量分析条件は上記表３の通りであり、分子量を３９０．０Ｄａとする。
（１．４．４）Ｈ１０１１標準溶液と化合物（ｂ）のマススペクトルピーク面積との間の検量線を作成し、化合物（ｂ）のマススペクトルシグナルはＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：３９０．０［Ｍ－Ｈ］－であり、作成された線形方程式はｙ＝２６．０２３５ｘであり、相関係数は０．９９８１であり、ただし、ｙはマススペクトルピーク面積であり、ｘは標準溶液濃度である。
【手続補正7】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0108】
（１．４）検量線の作成：
（１．４．１）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体Ｈ１０１１を秤量して１ｍｇ／ｍＬの水溶液に調製し、上記ブランク血漿を希釈液としてＨ１０１１水溶液を段階的に希釈し、２μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、１２８μｇ／ｍＬ、２５６μｇ／ｍＬの標準溶液を調製し、９０℃の条件で３６ｈ加水分解する。
（１．４．２）加水分解後の標準溶液に対して検出前処理を行い、加水分解後の標準溶液へ１％の体積比のトリフルオロ酢酸（５％、ｖ／ｖ）及び２倍の体積のアセトニトリル／メタノール（ｖ／ｖ、５０／５０）を添加し、均一に混合して、－２０℃で２０ｍｉｎ静置し、遠心して、上清を回収し乾燥した後に超純水で再溶解する。
（１．４．３）液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を行い、スペクトルを測定して得られ、クロマトグラフィー条件は上記表２の通りであり、質量分析条件は上記表３の通りであり、分子量を５２２．９８Ｄａとする。
（１．４．４）Ｈ１０１１標準溶液と化合物（ｃ）のマススペクトルピーク面積との間の検量線を作成し、化合物（ｃ）のマススペクトルシグナルはＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：５２２．９８［Ｍ－２Ｈ］２－であり、作成された線形方程式はｙ＝２３．６２２５ｘであり、相関係数は０．９９８６であり、ただし、ｙはマススペクトルピーク面積であり、ｘは標準溶液濃度である。
（１．４．１）カルボン酸化したグリコサミノグリカン誘導体Ｈ１０１１を秤量して１ｍｇ／ｍＬの水溶液に調製し、上記ブランク血漿を希釈液としてＨ１０１１水溶液を段階的に希釈し、２μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、１２８μｇ／ｍＬ、２５６μｇ／ｍＬの標準溶液を調製し、９０℃の条件で３６ｈ加水分解する。
（１．４．２）加水分解後の標準溶液に対して検出前処理を行い、加水分解後の標準溶液へ１％の体積比のトリフルオロ酢酸（５％、ｖ／ｖ）及び２倍の体積のアセトニトリル／メタノール（ｖ／ｖ、５０／５０）を添加し、均一に混合して、－２０℃で２０ｍｉｎ静置し、遠心して、上清を回収し乾燥した後に超純水で再溶解する。
（１．４．３）液体クロマトグラフィータンデム質量分析検出を行い、スペクトルを測定して得られ、クロマトグラフィー条件は上記表２の通りであり、質量分析条件は上記表３の通りであり、分子量を５２２．９８Ｄａとする。
（１．４．４）Ｈ１０１１標準溶液と化合物（ｃ）のマススペクトルピーク面積との間の検量線を作成し、化合物（ｃ）のマススペクトルシグナルはＭＳ（ＥＳＩ，ｎｅｇ．ｉｏｎ）ｍ／ｚ：５２２．９８［Ｍ－２Ｈ］２－であり、作成された線形方程式はｙ＝２３．６２２５ｘであり、相関係数は０．９９８６であり、ただし、ｙはマススペクトルピーク面積であり、ｘは標準溶液濃度である。
【国際調査報告】