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特表2024-505430抗ＴＲＰＶ６モノクローナル抗体及びその応用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-06

(54)【発明の名称】抗ＴＲＰＶ６モノクローナル抗体及びその応用

(51)【国際特許分類】

C12N 15/13 20060101AFI20240130BHJP

C07K 16/18 20060101ALI20240130BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20240130BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20240130BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20240130BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20240130BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20240130BHJP

C07K 16/46 20060101ALI20240130BHJP

C12N 15/62 20060101ALI20240130BHJP

C12N 5/12 20060101ALI20240130BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20240130BHJP

A61K 31/7088 20060101ALI20240130BHJP

A61K 35/12 20150101ALI20240130BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20240130BHJP

C12P 21/08 20060101ALN20240130BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C07K16/18

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K16/46

C12N15/62 Z

C12N5/12

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61K31/7088

A61K35/12

A61P35/00

C12P21/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023542926

(86)(22)【出願日】2022-01-14

(85)【翻訳文提出日】2023-07-14

(86)【国際出願番号】 CN2022071976

(87)【国際公開番号】W WO2022152236

(87)【国際公開日】2022-07-21

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/072249

(32)【優先日】2021-01-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202210029357.7

(32)【優先日】2022-01-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521330068

【氏名又は名称】コヒレントバイオファーマ（スーチョウ），リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷優子

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田裕

(74)【代理人】

【識別番号】100162503

【弁理士】

【氏名又は名称】今野智介

(74)【代理人】

【識別番号】100144794

【弁理士】

【氏名又は名称】大木信人

(74)【代理人】

【識別番号】100204582

【弁理士】

【氏名又は名称】大栗由美

(72)【発明者】

【氏名】フアン，バオファロバート

(72)【発明者】

【氏名】タン，ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ツォンボ

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ウェイ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B064AG27

4B064CA10

4B064CC24

4B064DA03

4B064DA14

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA90Y

4B065AB02

4B065BA02

4B065BD39

4B065CA44

4B065CA46

4C085AA16

4C085AA19

4C085AA25

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB43

4C085CC02

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB26

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB63

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB26

4H045BA40

(57)【要約】

ＴＲＰＶ６タンパク質特徴的なポリペプチド抗原を選択してマウスへの免疫をしてからスクリーニングすることによりハイブリドーマ細胞系１２ＣＴ９．５．１、１６ＣＴ１８．１．１．２と１６ＣＴ４．１．１．２を得て、該シリーズの細胞は、ＴＲＰＶ６に対するモノクローナル抗体を分泌し、ＴＲＰＶ６タンパク質及び腫瘍組織を特異的に認識することができる。該シリーズの抗体は、人工的又は自動的に、免疫組織化学（ＩＨＣ）、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光（ＩＦ）、化学発光（ＣＬＩＡ）、免疫比濁（ＴＩＡ）又はウェスタンブロット（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ）方式によって細胞におけるＴＲＰＶ６レベルを検出することができ、それによって腫瘍組織の診断方法に使用され、バイオアッセイの分野に属する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＲＰＶ６に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片であって、前記抗体又はその抗原結合性断片は、以下の重鎖可変領域に含まれる三つの重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１と、ＨＣＤＲ２と、ＨＣＤＲ３とを含み、即ち
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２５に示される重鎖可変領域、
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２７に示される重鎖可変領域、又は、
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２９に示される重鎖可変領域である、ＴＲＰＶ６に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項2】

前記抗体又はその抗原結合性断片は、以下の群から選択される三つの重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１と、ＨＣＤＲ２と、ＨＣＤＲ３とを含み、即ち
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ３、又は、
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１９に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１に示されるＨＣＤＲ３である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項3】

前記抗体又はその抗原結合性断片は、さらに、以下の軽鎖可変領域に含まれる三つの軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１と、ＬＣＤＲ２と、ＬＣＤＲ３とを含み、即ち
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示される軽鎖可変領域、
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２８に示される軽鎖可変領域、又は、
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３０に示される軽鎖可変領域である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項4】

前記抗体又はその抗原結合性断片は、さらに、以下の群から選択される三つの軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１と、ＬＣＤＲ２と、ＬＣＤＲ３とを含み、即ち
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示されるＬＣＤＲ３、
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：１８に示されるＬＣＤＲ３、又は、
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３である、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項5】

前記抗体又はその抗原結合性断片は、以下の群から選択される三つの重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び三つの軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、即ち
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示されるＬＣＤＲ３、
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：１８に示されるＬＣＤＲ３、又は、
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１９に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項6】

前記抗体又はその抗原結合性断片は、以下の群から選択される重鎖可変領域Ｖ_Ｈを含み、即ち
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２５に示される重鎖可変領域、
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２７に示される重鎖可変領域、又は、
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２９に示される重鎖可変領域である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項7】

前記抗体又はその抗原結合性断片は、さらに、以下の群から選択される軽鎖可変領域Ｖ_Ｌを含み、即ち
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示される軽鎖可変領域、
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２８に示される軽鎖可変領域、又は、
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３０に示される軽鎖可変領域である、請求項６に記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項8】

前記抗体又はその抗原結合性断片は、以下の群から選択される重鎖可変領域Ｖ_Ｈと軽鎖可変領域Ｖ_Ｌとを含み、即ち
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２５に示される重鎖可変領域とＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示される軽鎖可変領域、
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２７に示される重鎖可変領域とＳＥＱＩＤＮＯ：２８に示される軽鎖可変領域、又は、
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２９に示される重鎖可変領域とＳＥＱＩＤＮＯ：３０に示される軽鎖可変領域である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項9】

前記抗体又はその抗原結合性断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を特異的に認識又は結合する、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項10】

前記抗体又はその抗原結合性断片と、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＫｄ値は、１０^－７Ｍ未満である、請求項９に記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項11】

前記Ｋｄ値は、表面プラズモン共鳴法によって検出される、請求項１０に記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項12】

前記抗原結合性断片は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又はｄＡｂから選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項13】

前記抗体又はその抗原結合性断片は、重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域をさらに有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項14】

前記重鎖定常領域は、マウスＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ２ａ由来である、請求項１３に記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項15】

前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１由来である、請求項１３に記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項16】

前記抗体又はその抗原結合性断片は、コンジュゲート部分をさらに有する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項17】

前記コンジュゲート部分は、治療剤、放射性同位体、検出可能な標識、薬物動態学的に修飾された部分又は精製された部分である、請求項１６に記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項18】

前記コンジュゲート部分は、直接的に連結され又はリンカーを介して連結される、請求項１５又は１６に記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項19】

請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片をコードする、単離された核酸。

【請求項20】

（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３１に示される核酸配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：３１と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列と、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２に示される核酸配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：３２と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列とのうちの一方又は両方、
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３３に示される核酸配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：３３と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列と、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４に示される核酸配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：３４と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列とのうちの一方又は両方、又は、
（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３５に示される核酸配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：３５と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列と、ＳＥＱＩＤＮＯ：６に示される核酸配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：６と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列とのうちの一方又は両方を含む、請求項１９に記載の核酸。

【請求項21】

請求項１９又は２０に記載の核酸配列を含む、ベクター。

【請求項22】

請求項２１に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項23】

請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片と、他の抗原に特異的に結合する一つ又は複数の抗体又はその抗原結合部分とを含む、多重特異性抗体。

【請求項24】

請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片、又は請求項２３に記載の多重特異性抗体を含む、抗体複合体。

【請求項25】

抗ＴＲＰＶ６モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株であって、前記ハイブリドーマ細胞株は、１２ＣＴ９．５．１、１６ＣＴ４．１．１．２又は１６ＣＴ１８．１．１．２であり、中国典型培養物保存センターに保存され、ここで前記１２ＣＴ９．５．１の保存番号は、ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０２１１９であり、前記１６ＣＴ４．１．１．２の保存番号は、ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０２１２４であり、前記１６ＣＴ１８．１．１．２の保存番号は、ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０２１２５である、抗ＴＲＰＶ６モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株。

【請求項26】

請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片、請求項１９又は２０に記載の単離された核酸、請求項２１に記載のベクター、請求項２２に記載の宿主細胞、請求項２３に記載の多重特異性抗体又は請求項２４に記載の抗体複合体と、薬学的に許容されるベクターとを含む、医薬組成物。

【請求項27】

請求項１から１８に記載の一種又は複数種の抗体又はその抗原結合性断片を含む、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を分析と検出するための試薬。

【請求項28】

前記試薬は、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を分析と検出するために用いられる、請求項２７に記載の試薬。

【請求項29】

被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を検出する方法であって、
（１）前記試料を、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合性断片と接触することと、
（２）任意選択的に、未結合の抗体又は抗体断片を除去することと、
（３）前記試料におけるＴＲＰＶ６に結合した抗体又は抗体断片を検出することとを含む、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を検出する方法。

【請求項30】

前記ステップ（１）における前記の、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合性断片は、基板上に固定される、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記ステップ（１）における前記試料は、基板上に固定される、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

前記ステップ（３）は、二次抗体を使用することを含み、任意選択的に、前記二次抗体は、前記試料におけるＴＲＰＶ６に直接的又は間接的に結合可能であり、任意選択的に、前記二次抗体のエピトープは、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合性断片のエピトープと異なり、任意選択的に、前記二次抗体のエピトープは、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合性断片のエピトープと同じであり、任意選択的に、前記二次抗体のエピトープとＴＲＰＶ６との結合は、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合性断片の影響を受けず、任意選択的に、前記二次抗体のエピトープとＴＲＰＶ６との結合は、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合性断片の影響を受ける、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記ステップ（３）は、二次抗体を使用することを含み、任意選択的に、前記二次抗体は、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合性断片に直接的又は間接的に結合可能であり、任意選択的に、前記二次抗体は、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合性断片の定常領域部分に結合可能である、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記二次抗体は、検出分子にカップリングし、任意選択的に、前記検出分子は、酵素、蛍光標識物質とビオチンを含む、請求項３２又は３３に記載の方法。

【請求項35】

前記検出分子は、酵素であり、任意選択的に、前記酵素は、ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ又はその誘導体を含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記検出分子は、フルオレセインであり、任意選択的に、前記フルオレセインは、ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリスリン又はＤｙｌｉｇｈｔを含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項37】

前記検出分子は、ビオチン又はその誘導体である、請求項３４に記載の方法。

【請求項38】

前記試料におけるＴＲＰＶ６に結合した抗体を定量することをさらに含む、請求項２９から３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光（ＩＦ）、化学発光（ＣＬＩＡ）、免疫比濁（ＴＩＡ）又はウェスタンブロット（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ）である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記被験者は、ヒトである、請求項２９から３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記試料における、細胞表面上に発現するＴＲＰＶ６の細胞の比率を評価するために用いられる、請求項２９から４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

請求項２９から４１のいずれか一項に記載の方法を使用して前記被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を検出することを含む、被験者疾患の形成又は形成のリスクを判断し、被験者疾患の進展又は予後を評価し、又は疾患治療を受けている被験者において前記被験者の治療への応答を予測又はモニタリングする方法。

【請求項43】

前記方法は、前記試料における、細胞表面上に発現するＴＲＰＶ６の細胞の比率を評価することを含み、前記比率が所定の閾値を超えた場合、前記被験者が前記疾患を有するか又は治療により利益を得る可能性がより高いと考えられ、ここで前記閾値は、１０％であり、好ましくは、前記治療は、標的薬による治療である、請求項４１に記載の方法。

【請求項44】

前記疾患は、癌疾患である、請求項４２又は４３に記載の方法。

【請求項45】

前記癌疾患は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胆管癌、胃癌、食道癌、肺癌、腸癌、膵臓癌であり、好ましくは、前記癌疾患は、ＨＥＲ２^＋乳癌、トリプルネガティブ乳癌又は結直腸癌である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片を含み、任意選択的に、前記抗体又はその抗原結合性断片とＴＲＰＶ６との結合状況を検出するための試薬をさらに含む、キット。

【請求項47】

被験者疾患の形成又は形成のリスクを診断し、被験者疾患の進展又は予後を評価し、又は疾患治療を受けている被験者において前記被験者の治療への応答を予測又はモニタリングするために用いられる、請求項４６に記載のキット。

【請求項48】

免疫組織化学による病理診断に用いられる、請求項４６に記載のキット。

【請求項49】

腫瘍組織の免疫組織化学による病理診断に用いられる、請求項４８に記載のキット。

【請求項50】

前記疾患は、癌疾患である、請求項４７に記載のキット。

【請求項51】

前記疾患は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胆管癌、胃癌、食道癌、肺癌、腸癌、膵臓癌であり、好ましくは、前記疾患は、ＨＥＲ２^＋乳癌、トリプルネガティブ乳癌又は結直腸癌である、請求項４８に記載のキット。

【請求項52】

ＴＲＰＶ６に特異的に結合する抗体を作製する方法であって、
（１）ＳＥＱＩＤＮＯ：３に示されるアミノ酸配列とベクタータンパク質とをカップリングして、ＴＲＰＶ６抗原ペプチドを得ることと、
（２）ステップ（１）によって得られた前記ＴＲＰＶ６抗原ペプチドを免疫原としてマウスへの免疫をすることと、
（３）細胞融合と免疫ペプチドのクローンスクリーニングを経て、ＴＲＰＶ６に特異的に結合する抗体を高分泌する陽性ハイブリドーマ細胞系を得ることと、
（４）ＴＲＰＶ６に特異的に結合する抗体を得ることとを含む、ＴＲＰＶ６に特異的に結合する抗体を作製する方法。

【請求項53】

前記ベクタータンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）タンパク質である、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

ＳＥＱＩＤＮＯ：３に示されるアミノ酸配列のＮ末端に一つのＣｙｓを追加し、且つ遊離チオール基を介して前記ベクタータンパク質にカップリングする、請求項５２又は５３に記載の方法。

【請求項55】

前記ハイブリドーマ細胞系は、マウスハイブリドーマ細胞系１２ＣＴ９．５．１、１６ＣＴ１８．１．１．２又は１６ＣＴ４．１．１．２である、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片、請求項１９又は２０に記載の単離された核酸、請求項２１に記載のベクター、請求項２２に記載の宿主細胞、請求項２３に記載の多重特異性抗体、請求項２４に記載の抗体複合体及び請求項２５に記載の医薬組成物の、ＴＲＰＶ６に関連する疾患を治療及び／又は予防及び／又は診断するための医薬における用途。

【請求項57】

疾患を治療、予防又は診断する方法であって、請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片、請求項１９又は２０に記載の単離された核酸、請求項２１に記載のベクター、請求項２２に記載の宿主細胞、請求項２３に記載の多重特異性抗体、請求項２４に記載の抗体複合体及び請求項２５に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験者に投与することを含む、疾患を治療、予防又は診断する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒトＴＲＰＶ６タンパク質を認識できる一連の抗体、及び該シリーズの抗体を分泌できるハイブリドーマ細胞系に関する。具体的には、本発明は、腫瘍細胞膜／質内のＴＲＰＶ６分子に特異的に結合する一連のモノクローナル抗体を提供し、該抗体の重鎖と軽鎖可変領域のアミノ酸配列及び可変領域をコードするＤＮＡ配列を確定し、該抗体又はその抗原断片を人工的又は自動的に、免疫組織化学（ＩＨＣ）、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光（ＩＦ）、化学発光（ＣＬＩＡ）、免疫比濁（ＴＩＡ）又はウェスタンブロット（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ）方式による細胞におけるＴＲＰＶ６レベルの検出に用いることができ、それによってこれらの腫瘍の診断方法に使用され、バイオアッセイの分野に属する。

【背景技術】

【0002】

一過性受容体カチオンチャンネルサブファミリーＶメンバ６（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｃａｔｉｏｎｃｈａｎｎｅｌｓｕｂｆａｍｉｌｙＶｍｅｍｂｅｒ６）、即ちＴＲＰＶ６は、高選択性のカルシウムイオンの膜貫通輸送チャンネルであり、細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの能動的な輸送を媒介する。ＴＲＰＶ６は、ヒトの正常な腎臓、胃と腸管、膵臓、乳腺、唾液腺などにおいて発現するが、主に腸管上皮細胞に発現し、それが細胞内へのカルシウムイオンの輸送に関与するため、ＴＲＰＶ６チャンネルの数又は機能が変化するとき、カルシウムイオンによる調節の変化を引き起こし、さらにそれに関連する組織と器官の構造又は機能の異常を引き起こすことがある。

【0003】

正常な組織に比べ、ＴＲＰＶ６は、乳癌、胆管癌、卵巣癌、肺扁平上皮癌、前立腺癌などの悪性腫瘍における発現が顕著に上昇し、その異常発現は、腫瘍の形成及び進展と関連する可能性がある。Ｐｒｅｖａｒｓｋａｙａチームの発見によると、ＴＲＰＶ６を高発現するヒト前立腺癌ＬＮＣａｐ細胞のカルシウムイオンの摂取は、ＴＲＰＶ６によって媒介され、ｓｉＲＮＡ処理してＴＲＰＶ６タンパク質のレベルを下げると、そのＳ期の細胞数が減少し、細胞増殖が抑制される。リドカインを利用してヒト乳癌ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、前立腺癌ＰＣ－３細胞と卵巣癌ＥＳ－２細胞を処理して、ＴＲＰＶ６ｍＲＮＡとタンパク質のレベルを下げることもあり、細胞増殖が抑制されると同時に、カルシウムイオンの細胞内への進入速度が低下し、これは、癌細胞の抑制がカルシウムイオンの減少と関連する可能性があり、そしてＴＲＰＶ６レベルと関連する可能性もあることを示している。このことから分かるように、ＴＲＰＶ６は、ヒトの多種類の腫瘍と密接な関係があり、その細胞内外のカルシウムイオン濃度変化の調節と関連する可能性がある。

【0004】

ＴＲＰＶ６は、腫瘍細胞マーカーとして、その検出が病理診断及び該当標的薬の使用にとって重要な意義を有する。現在、市販の診断のための抗ＴＲＰＶ６抗体がなく、本特許に係る抗体は、この面の空白を埋めることができる。

【発明の概要】

【0005】

本出願の一態様によれば、ＴＲＰＶ６に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片を提供し、ここで前記抗体又はその抗原結合性断片は、以下の重鎖可変領域に含まれる三つの重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１と、ＨＣＤＲ２と、ＨＣＤＲ３とを含み、即ちＳＥＱＩＤＮＯ：２５に示される重鎖可変領域、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７に示される重鎖可変領域、又はＳＥＱＩＤＮＯ：２９に示される重鎖可変領域である。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片は、以下の群から選択される三つの重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１と、ＨＣＤＲ２と、ＨＣＤＲ３とを含み、即ちＳＥＱＩＤＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱＩＤＮＯ：１９に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１に示されるＨＣＤＲ３である。

【0006】

いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片は、さらに、以下の軽鎖可変領域に含まれる三つの軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１と、ＬＣＤＲ２と、ＬＣＤＲ３とを含み、即ちＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示される軽鎖可変領域、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８に示される軽鎖可変領域、又はＳＥＱＩＤＮＯ：３０に示される軽鎖可変領域である。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片は、さらに、以下の群から選択される三つの軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１と、ＬＣＤＲ２と、ＬＣＤＲ３とを含み、即ちＳＥＱＩＤＮＯ：１０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示されるＬＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：１８に示されるＬＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３である。

【0007】

いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片は、以下の群から選択される三つの重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び三つの軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、即ちＳＥＱＩＤＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示されるＬＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：１８に示されるＬＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３である。

【0008】

いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示されるＬＣＤＲ３を含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：１８に示されるＬＣＤＲ３を含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３を含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片は、以下の群から選択される重鎖可変領域Ｖ_Ｈを含み、即ちＳＥＱＩＤＮＯ：２５に示される重鎖可変領域、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７に示される重鎖可変領域、又はＳＥＱＩＤＮＯ：２９に示される重鎖可変領域である。

【0012】

いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片は、さらに、以下の群から選択される軽鎖可変領域Ｖ_Ｌを含み、即ちＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示される軽鎖可変領域、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８に示される軽鎖可変領域、又はＳＥＱＩＤＮＯ：３０に示される軽鎖可変領域である。

【0013】

いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片は、以下の群から選択される重鎖可変領域Ｖ_Ｈと軽鎖可変領域Ｖ_Ｌとを含み、即ちＳＥＱＩＤＮＯ：２５に示される重鎖可変領域とＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示される軽鎖可変領域、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７に示される重鎖可変領域とＳＥＱＩＤＮＯ：２８に示される軽鎖可変領域、又はＳＥＱＩＤＮＯ：２９に示される重鎖可変領域とＳＥＱＩＤＮＯ：３０に示される軽鎖可変領域である。

【0014】

いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５に示される重鎖可変領域とＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示される軽鎖可変領域とを含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７に示される重鎖可変領域とＳＥＱＩＤＮＯ：２８に示される軽鎖可変領域とを含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９に示される重鎖可変領域とＳＥＱＩＤＮＯ：３０に示される軽鎖可変領域とを含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を特異的に認識又は結合する。

【0018】

いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片と、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＫｄ値は、１０^－７～１０^－１０Ｍである。いくつかの実施形態では、前記Ｋｄ値は、１０^－７～１０^－１０Ｍ、１０^－８～１０^－１０Ｍ又は１０^－９～１０^－１０Ｍである。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片と、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＫｄ値は、１０^－７Ｍ程度未満である。いくつかの実施形態では、前記Ｋｄ値は、１０^－７Ｍ程度未満、１０^－８Ｍ程度未満、１０^－９Ｍ程度未満又は１０^－１０Ｍ程度未満である。いくつかの実施形態では、Ｋｄ値は、表面プラズモン共鳴法によって検出される。

【0019】

いくつかの実施形態では、前記抗原結合性断片は、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又はｄＡｂから選択される。

【0020】

いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片は、重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域をさらに有する。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、マウスＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ２ａ由来である。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１由来である。

【0021】

いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片は、コンジュゲート部分をさらに有する。いくつかの実施形態では、前記コンジュゲート部分は、治療剤、放射性同位体、検出可能な標識、薬物動態学的に修飾された部分又は精製された部分である。前記コンジュゲート部分は、直接的に連結され又はリンカーを介して連結される。

【0022】

一態様によれば、本出願は、単離された核酸をさらに提供し、それは、本出願に記載の、ＴＲＰＶ６に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片をコードする。

【0023】

いくつかの実施形態では、前記核酸は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１に示される核酸配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：３１と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列と、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２に示される核酸配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：３２と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列とのうちの一方又は両方を含む。いくつかの実施形態では、前記核酸は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３に示される核酸配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：３３と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列と、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４に示される核酸配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：３４と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列とのうちの一方又は両方を含む。いくつかの実施形態では、前記核酸は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５に示される核酸配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：３５と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列と、ＳＥＱＩＤＮＯ：６に示される核酸配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：６と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列とのうちの一方又は両方を含む。

【0024】

一態様によれば、本出願は、ベクターをさらに提供し、それは、本出願に記載の核酸配列を含む。

【0025】

一態様によれば、本出願は、宿主細胞をさらに提供し、それは、本出願に記載のベクターを含む。

【0026】

一態様によれば、本出願は、多重特異性抗体をさらに提供し、それは、本出願に記載の抗体又はその抗原結合性断片と、他の抗原に特異的に結合する一つ又は複数の抗体又はその抗原結合部分とを含む。

【0027】

一態様によれば、本出願は、抗体複合体をさらに提供し、それは、本出願に記載の抗体又はその抗原結合性断片、又は本出願に記載の多重特異性抗体を含む。

【0028】

一態様によれば、本出願は、抗ＴＲＰＶ６モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株をさらに提供し、前記ハイブリドーマ細胞株は、１２ＣＴ９．５．１、１６ＣＴ４．１．１．２及び／又は１６ＣＴ１８．１．１．２であり、中国典型培養物保存センターに保存され、ここで１２ＣＴ９．５．１の保存番号は、ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０２１１９であり、１６ＣＴ４．１．１．２の保存番号は、ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０２１２４であり、１６ＣＴ１８．１．１．２の保存番号は、ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０２１２５である。

【0029】

一態様によれば、本出願は、医薬組成物をさらに提供し、それは、本出願に記載の抗体又はその抗原結合性断片、本出願に記載の単離された核酸、本出願に記載のベクター、本出願に記載の宿主細胞、本出願に記載の多重特異性抗体又は本出願に記載の抗体複合体と、薬学的に許容されるベクターとを含む。

【0030】

一態様によれば、本出願は、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を分析と検出するための試薬をさらに提供し、前記試薬は、本出願に記載の一種又は複数種の抗体又はその抗原結合性断片を含む。いくつかの実施形態では、前記試薬は、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を分析と検出するために用いられる。

【0031】

一態様によれば、本出願は、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を検出する方法をさらに提供し、前記方法は、（１）前記試料を、本出願に記載の抗体又は抗原結合性断片と接触することと、（２）任意選択的に、未結合の抗体又は抗体断片を除去することと、（３）前記試料におけるＴＲＰＶ６に結合した抗体又は抗体断片を検出することとを含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を検出する方法のステップ（１）において、本出願に記載の抗体又は抗原結合性断片は、基板上に固定される。いくつかの実施形態では、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を検出する方法のステップ（１）において、前記試料は、基板上に固定される。

【0033】

いくつかの実施形態では、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を検出する方法のステップ（３）において、二次抗体を使用することをさらに含み、任意選択的に、前記二次抗体は、前記試料におけるＴＲＰＶ６に直接的又は間接的に結合可能であり、任意選択的に、前記二次抗体のエピトープは、本出願に記載の抗体又は抗原結合性断片のエピトープと異なり、任意選択的に、前記二次抗体のエピトープは、本出願に記載の抗体又は抗原結合性断片のエピトープと同じであり、任意選択的に、前記二次抗体のエピトープとＴＲＰＶ６との結合は、本出願に記載の抗体又は抗原結合性断片の影響を受けず、任意選択的に、前記二次抗体のエピトープとＴＲＰＶ６との結合は、本出願に記載の抗体又は抗原結合性断片の影響を受ける。

【0034】

【0035】

いくつかの実施形態では、前記二次抗体は、検出分子にカップリングし、任意選択的に、前記検出分子は、酵素、蛍光標識物質とビオチンを含む。いくつかの実施形態では、前記検出分子は、酵素であり、任意選択的に、前記酵素は、ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ又はその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、前記検出分子は、フルオレセインであり、任意選択的に、前記フルオレセインは、ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリスリン又はＤｙｌｉｇｈｔを含む。いくつかの実施形態では、前記検出分子は、ビオチン又はその誘導体である。

【0036】

いくつかの実施形態では、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を検出する方法は、前記試料におけるＴＲＰＶ６に結合した抗体を定量することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫蛍光（ＩＦ）、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）、化学発光（ＣＬＩＡ、ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、免疫比濁（ＴＩＡ、Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）又はウェスタンブロット（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ）である。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記試料における、細胞表面上に発現するＴＲＰＶ６の細胞の比率を評価することができる。

【0037】

いくつかの実施形態では、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を検出する方法において、前記被験者は、ヒトである。

【0038】

一態様によれば、本出願は、被験者疾患の形成又は形成のリスクを判断し、被験者疾患の進展又は予後を評価し、又は疾患治療を受けている被験者において前記被験者の治療への応答を予測又はモニタリングする方法をさらに提供し、前記方法は、本出願に記載の、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を検出する方法によって、前記被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を検出することを含む。

【0039】

いくつかの実施形態では、被験者疾患の形成又は形成のリスクを判断し、被験者疾患の進展又は予後を評価し、又は疾患治療を受けている被験者において前記被験者の治療への応答を予測又はモニタリングする方法は、前記試料における、細胞表面上に発現するＴＲＰＶ６の細胞の比率を評価することを含み、前記比率が所定の閾値を超えた場合、前記被験者が前記疾患を有するか又は治療により利益を得る可能性がより高いと考えられ、ここで前記閾値は、１０％である。いくつかの実施形態では、前記治療は、標的薬による治療である。

【0040】

いくつかの実施形態では、本出願に記載の疾患は、癌疾患である。いくつかの実施形態では、癌疾患は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胆管癌、胃癌、食道癌、肺癌、腸癌、膵臓癌である。

【0041】

一態様によれば、本出願は、キットをさらに提供し、前記キットは、本出願に記載の抗体又はその抗原結合性断片を含み、任意選択的に、前記抗体又はその抗原結合性断片とＴＲＰＶ６との結合状況を検出するための試薬をさらに含む。

【0042】

いくつかの実施形態では、本出願に記載のキットは、被験者疾患の形成又は形成のリスクを診断し、被験者疾患の進展又は予後を評価し、又は疾患治療を受けている被験者において前記被験者の治療への応答を予測又はモニタリングするために用いられる。いくつかの実施形態では、本出願に記載のキットは、免疫組織化学による病理診断に用いられる。いくつかの実施形態では、本出願に記載のキットは、腫瘍組織の免疫組織化学による病理診断に用いられる。いくつかの実施形態では、前記疾患は、癌疾患であり、いくつかの実施形態では、癌疾患は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胆管癌、胃癌、食道癌、肺癌、腸癌、膵臓癌である。

【0043】

一態様によれば、本出願は、ＴＲＰＶ６に特異的に結合する抗体を作製する方法をさらに提供し、前記方法は、（１）ＳＥＱＩＤＮＯ：３に示されるアミノ酸配列とベクタータンパク質とをカップリングして、ＴＲＰＶ６抗原ペプチドを得ることと、（２）ステップ（１）によって得られた前記ＴＲＰＶ６抗原ペプチドを免疫原としてマウスへの免疫をすることと、（３）細胞融合と免疫ペプチドのクローンスクリーニングを経て、ＴＲＰＶ６に特異的に結合する抗体を高分泌する陽性ハイブリドーマ細胞系を得ることと、（４）ＴＲＰＶ６に特異的に結合する抗体を得ることとを含む。

【0044】

いくつかの実施形態では、前記ベクタータンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）タンパク質である。

【0045】

いくつかの実施形態では、ＳＥＱＩＤＮＯ：３に示されるアミノ酸配列のＮ末端に一つのＣｙｓを追加し、且つ遊離チオール基を介して前記ベクタータンパク質にカップリングする。

【0046】

いくつかの実施形態では、本出願に記載のハイブリドーマ細胞系は、マウスハイブリドーマ細胞系１２ＣＴ９．５．１、１６ＣＴ１８．１．１．２と１６ＣＴ４．１．１．２である。

【0047】

一態様によれば、本出願は、本出願に記載の抗体又はその抗原結合性断片、本出願に記載の単離された核酸、本出願に記載のベクター、本出願に記載の宿主細胞、本出願に記載の多重特異性抗体、本出願に記載の抗体複合体及び本出願に記載の医薬組成物の、ＴＲＰＶ６レベルに関連する疾患を治療及び／又は予防及び／又は診断するための医薬における用途をさらに提供する。

【0048】

一態様によれば、本出願は、疾患を治療、予防又は診断する方法をさらに提供し、前記方法は、本出願に記載の抗体又はその抗原結合性断片、本出願に記載の多重特異性抗体、本出願に記載の抗体複合体及び本出願に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験者に投与することを含む。
図面は、本明細書の一部を構成し、本開示のいくつかの態様を示す。これらの図面のうちの一つ又は複数を参照し、本開示に記載の具体的な実施形態の詳細な説明を結び付けることで、本開示をよりよく理解することができる。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1A】ＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１により免疫細胞を介してＴＲＰＶ６プラスミドトランスフェクション２９３Ｔ細胞におけるＴＲＰＶ６タンパク質を化学特異的に検出できるが（左図）、非ＴＲＰＶ６プラスミドトランスフェクション２９３Ｔ細胞におけるＴＲＰＶ６タンパク質検出の指示はない（右図）ことが示されている。

【図1B】ＣＢ－Ａｎｔｉ－０００２により免疫細胞を介してＴＲＰＶ６プラスミドトランスフェクション２９３Ｔ細胞におけるＴＲＰＶ６タンパク質を化学特異的に検出できるが（左図）、非ＴＲＰＶ６プラスミドトランスフェクション２９３Ｔ細胞におけるＴＲＰＶ６タンパク質検出の指示はない（右図）ことが示されている。

【図1C】ＣＢ－Ａｎｔｉ－０００３により免疫細胞を介してＴＲＰＶ６プラスミドトランスフェクション２９３Ｔ細胞におけるＴＲＰＶ６タンパク質を化学特異的に検出できるが（左図）、非ＴＲＰＶ６プラスミドトランスフェクション２９３Ｔ細胞におけるＴＲＰＶ６タンパク質検出の指示はない（右図）ことが示されている。

【図2A】ＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１抗体の免疫組織化学による検出結果が示されている。

【図2B】ＣＢ－Ａｎｔｉ－０００２抗体の免疫組織化学による検出結果が示されている。

【図2C】ＣＢ－Ａｎｔｉ－０００３抗体の免疫組織化学による検出結果が示されている。

【図3】ヒト膀胱移行細胞乳頭腫細胞（ＲＴ４）に対するＡＣＣ－０２８抗体、ＭＡＢＮ８３９抗体とＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１抗体のＩＨＣ比較結果実験が示されている。ここで図面３Ａは、ＡＣＣ－０２８抗体のＩＨＣ結果であり、図面３Ｂは、ＭＡＢＮ８３９抗体のＩＨＣ結果であり、図面３Ｃは、ＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１抗体のＩＨＣ結果である。図から分かるように、図面３Ｃにおける細胞膜は、鮮明で、顕著な染色効果を有する。

【図4】異なる条件下で保存した抗体の組織染色強度と染色比率には顕著な変化がないことが示されている。ここで図面４Ａは、４°Ｃで１４日間保存したＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１抗体原液のＩＨＣ結果であり、図面４Ｂは、３７°Ｃで１４日間保存したＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１抗体原液のＩＨＣ結果であり、図面４Ｃは、３７°Ｃで１４日間保存したＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１抗体作動液のＩＨＣ結果である。

【発明を実施するための形態】

【0050】

以下の記述は、本出願の様々な実施形態を説明するためのものに過ぎない。そのため、ここの具体的な実施形態は、出願範囲に対する制限として解釈されるべきではない。当業者であれば、本発明の趣旨及び本明細書の記述に基づいて、複数の同等な形態と修正を容易に得ることができ、これらの同等な実施形態は、本発明の範囲内に含まれると理解すべきである。本出願に援用された、刊行物、特許及び特許出願を含むすべての文献は、その全体が参照により本出願に組み込まれる。

【0051】

文脈で別途明確に指摘されていない限り、本明細書で使用される単数形「一」、「一つ」、「一種」及び「該」又は「前記」は、複数の援用を含む。

【0052】

本出願で使用される、例えば「含む」、「包含」、「含有」、「含有」と「有する」などの表現は、包括的又は開放式であり、追加的な、記載されていない要素又は方法ステップを排除するものではない。本出願で使用される、「……から構成される」という表現は、閉鎖式である。

【0053】

出願者は、ハイブリドーマ細胞株（系）１２ＣＴ９．５．１、１６ＣＴ４．１．１．２と１６ＣＴ１８．１．１．２を中国典型培養物保存センターに寄託した。１２ＣＴ９．５．１の保存番号は、ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０２１１９であり、１６ＣＴ４．１．１．２の保存番号は、ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０２１２４であり、１６ＣＴ１８．１．１．２の保存番号は、ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０２１２５であり、三つのハイブリドーマ細胞株の保存アドレスは、中国武漢大学であり、保存日付は、２０２１年１月１３日であり、保存先は、中国典型培養物保存センターである。

【0054】

本出願の一態様は、ＴＲＰＶ６に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片を開示し、ここで前記抗体又はその抗原結合性断片は、以下の重鎖可変領域に含まれる三つの重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１と、ＨＣＤＲ２と、ＨＣＤＲ３とを含み、即ちＳＥＱＩＤＮＯ：２５に示される重鎖可変領域、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７に示される重鎖可変領域、又はＳＥＱＩＤＮＯ：２９に示される重鎖可変領域である。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片は、以下の群から選択される三つの重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１と、ＨＣＤＲ２と、ＨＣＤＲ３とを含み、即ちＳＥＱＩＤＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱＩＤＮＯ：１９に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１に示されるＨＣＤＲ３である。いくつかの実施形態では、本出願の抗体又はその抗原結合性断片は、さらに、以下の軽鎖可変領域に含まれる三つの軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１と、ＬＣＤＲ２と、ＬＣＤＲ３とを含み、即ちＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示される軽鎖可変領域、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８に示される軽鎖可変領域、又はＳＥＱＩＤＮＯ：３０に示される軽鎖可変領域である。いくつかの実施形態では、本出願の抗体又はその抗原結合性断片は、さらに、以下の群から選択される三つの軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１と、ＬＣＤＲ２と、ＬＣＤＲ３とを含み、即ちＳＥＱＩＤＮＯ：１０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示されるＬＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：１８に示されるＬＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３である。

【0055】

いくつかの実施形態では、本出願の抗体又はその抗原結合性断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示されるＬＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、本出願の抗体又はその抗原結合性断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：１８に示されるＬＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、本出願の抗体又はその抗原結合性断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１に示されるＨＣＤＲ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３に示されるＬＣＤＲ２及びＳＥＱＩＤＮＯ：２４に示されるＬＣＤＲ３を含む。

【0056】

いくつかの実施形態では、本出願の抗体又はその抗原結合性断片は、以下の群から選択される重鎖可変領域Ｖ_Ｈを含み、即ちＳＥＱＩＤＮＯ：２５に示される重鎖可変領域、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７に示される重鎖可変領域、又はＳＥＱＩＤＮＯ：２９に示される重鎖可変領域である。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片は、さらに、以下の群から選択される軽鎖可変領域Ｖ_Ｌを含み、即ちＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示される軽鎖可変領域、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８に示される軽鎖可変領域、又はＳＥＱＩＤＮＯ：３０に示される軽鎖可変領域である。

【0057】

いくつかの実施形態では、本出願の抗体又はその抗原結合性断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５に示される重鎖可変領域とＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示される軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、本出願の抗体又はその抗原結合性断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７に示される重鎖可変領域とＳＥＱＩＤＮＯ：２８に示される軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、本出願の抗体又はその抗原結合性断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９に示される重鎖可変領域とＳＥＱＩＤＮＯ：３０に示される軽鎖可変領域とを含む。

【0058】

本出願で使用される「抗体」という用語は、任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体又は二重特異性（二価）抗体を含む。一つの天然のインタクト抗体は、ジスルフィド結合を介して互いに連結される二本の重鎖と二本の軽鎖とを含む。抗体の各重鎖は、一つの可変領域（Ｖ_Ｈ）及び第１、第２と第３の定常領域（それぞれＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３である）から構成されるが、抗体の各軽鎖は、一つの可変領域（Ｖ_Ｌ）及び一つの定常領域（Ｃ_Ｌ）から構成される。軽鎖と重鎖の可変領域は、抗原結合に関与する。各鎖における可変領域は、大きく３つの超可変領域に分けられ、相補性決定領域と呼ばれる（ＣＤＲ）（ここで軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１と、ＬＣＤＲ２と、ＬＣＤＲ３とを含み、重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１と、ＨＣＤＲ２と、ＨＣＤＲ３とを含む）。

【0059】

本出願で使用される抗体の「抗原結合性断片」、抗体の「抗原結合部分」などは、天然に存在する、酵素触媒により得られる、合成された、又は遺伝子操作された任意のポリペプチドを含み、前記ポリペプチドは、抗原に特異的に結合して複合物を形成する。抗体の抗原結合性断片は、例えば、任意の適切な標準技術を使用することによってインタクトな抗体分子から誘導されてもよく、前記適切な標準技術は、例えばタンパク質加水分解消化、又は抗体の可変ドメインと任意選択的な定常ドメインをコードするＤＮＡの操作と発現に係る遺伝子組換え工学技術である。ＤＮＡは、化学方法又は分子生物学的技術の使用によって配列決定と操作を行うことができ、それによって例えば、一つ又は複数の可変及び／又は定常ドメインを適切な構成に並べ替え、又はコドンを導入して、システイン残基を作製し、アミノ酸を修飾、追加又は削除するなどである。抗原結合性断片の非限定的な実例として、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えばＣＤＲ３ペプチド）又はＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドを含む。他の改造分子、例えばドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価のナノボディ、二価のナノボディなど）、小型モジュール化免疫薬（ＳＭＩＰ）とサメ変異体ＩｇＮＡＲドメインも、本明細書に用いる「抗原結合性断片」の表現内に含まれる。

【0060】

本出願に開示された抗体と抗原結合性断片のＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ命名法に従って命名又は認識されてもよい。（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ，Ｂ．，Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３（４），９２７（１９９７）、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃら，ＪＭｏｌＢｉｏｌ．Ｄｅｃ５；１８６（３）：６５１－６３（１９８５）、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．とＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃら，Ｎａｔｕｒｅ．Ｄｅｃ２１－２８；３１（６２５２）：８７７－８３（１９８９）、ＫａｂａｔＥ．Ａ．ら，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。いくつかの実施形態では、Ｋａｂａｔデータベースに基づいて抗体のＣＤＲ境界を確定する。三つのＣＤＲは、フレームワーク領域と呼ばれる（ＦＲであって、重鎖ＦＲは、ＨＦＲ１と、ＨＦＲ２と、ＨＦＲ３と、ＨＦＲ４とを含み、軽鎖ＦＲは、ＬＦＲ１と、ＬＦＲ２と、ＬＦＲ３と、ＬＦＲ４とを含む）ものの側面の連続的な部分によって隔てられ、フレームワーク領域は、ＣＤＲよりも高度に保存され、ステントを形成して超可変ループを支持する。そのため、Ｖ_ＨとＶ_Ｌは、それぞれ以下の順番で配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲとを含み（ヒトアミノ酸残基Ｎ末端からＣ末端）、即ちＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４である。重鎖と軽鎖の定常領域は、抗原結合に関与しないが、様々なエフェクター機能を示す。哺乳類の重鎖は、α、δ、ε、γとμに分けられ、哺乳類の軽鎖は、λ又はκに分けられる。抗体は、その重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づき、α、δ、ε、γとμがそれぞれ存在するか否かに基づいて大別して、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという５つのクラスに分けられる。いくつかの主要な抗体クラスのサブクラスとして、例えばＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）又はＩｇＡ２（α２重鎖）がある。

【0061】

いくつかの実施形態では、本出願の抗体又はその抗原結合性断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を特異的に認識又は結合する。

【0062】

ＳＥＱＩＤＮＯ：２：

【表1】

【0063】

いくつかの実施形態では、本出願の抗体又はその抗原結合性断片と、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＫｄ値は、１０^－７～１０^－１０Ｍである。いくつかの実施形態では、前記Ｋｄ値は、１０^－７～１０^－１０Ｍ、１０^－８～１０^－１０Ｍ又は１０^－９～１０^－１０Ｍである。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片と、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＫｄ値は、１０^－７Ｍ程度未満である。いくつかの実施形態では、前記Ｋｄ値は、１０^－７Ｍ程度未満、１０^－８Ｍ程度未満、１０^－９Ｍ程度未満又は１０^－１０Ｍ程度未満である。いくつかの実施形態では、Ｋｄ値は、表面プラズモン共鳴法によって検出される。

【0064】

いくつかの実施形態では、本出願の抗原結合性断片は、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又はｄＡｂから選択される。いくつかの実施形態では、本出願の抗体又はその抗原結合性断片は、重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域をさらに有する。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、マウスＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ２ａ由来である。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１由来である。

【0065】

いくつかの実施形態では、本出願の抗体又はその抗原結合性断片は、コンジュゲート部分をさらに有する。いくつかの実施形態では、前記コンジュゲート部分は、治療剤、放射性同位体、検出可能な標識、薬物動態学的に修飾された部分又は精製された部分である。前記コンジュゲート部分は、直接的に連結され又はリンカーを介して連結される。

【0066】

本出願で使用される「治療剤」という用語は、被験者における疾患を治療又は予防するための任意の医薬化合物であってもよく、分子量が５００未満の小分子、ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマーなど）、短いペプチド、タンパク質（例えば、酵素）を含む。

【0067】

いくつかの実施形態では、放射性同位体は、以下の群、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１４Ｃ、^１８Ｆ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、 ^３５Ｓ、^４５Ｔｉ、^４７Ｓｃ、^５２Ｆｅ、^５９Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、 ^７５Ｓｃ、^７７Ａｓ、^８６Ｙ、^８９Ｓｒ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^９０Ｎｂ、^９４Ｔｃ、^９９Ｔｃ、^９９Ｍｏ、^１０５Ｐｄ、^１０５Ｒｈ、^１１１Ａｇ、^１１１Ｉｎ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１３３Ｘｅ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１４９Ｐｍ、^１５３Ｓｍ、^１５４Ｇｄ、^１５５Ｇｄ、^１５６Ｇｄ、^１５７Ｇｄ、^１５８Ｇｄ、^１６１Ｔｂ、^１６６Ｄｙ、^１６９Ｅｒ、^１７５Ｌｕ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１８９Ｒｅ、^１９４Ｉｒ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２１１Ａｔ、^２１１Ｐｂ、^２１２Ｂｉ、^２１２Ｐｂ、^２１３Ｂｉ、^２２３Ｒａ及び^２２５Ａｃから選択されてもよい。

【0068】

本出願で使用される「検出可能な標識」という用語は、本発明の抗体に直接的又は間接的にカップリングすると同時に、ＴＲＰＶ６レベルの検出に適し又は役立つ任意の検出分子であってもよい。いくつかの実施形態では、前記検出分子は、酵素、蛍光標識物質とビオチンを含む。前記酵素は、ペルオキシダーゼ（例えば、ワサビペルオキシダーゼ）、アルカリフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、糖質酸化酵素、ウレアーゼ、複素環オキシダーゼ（例えば、キサンチンオキシダーゼ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ又はそれらの誘導体を含む。前記蛍光標識物質は、フルオレセインであってもよく、任意選択的に、前記フルオレセインは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリスリン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｄｙｌｉｇｈｔ、Ｃｙ３又はＣｙ５を含む。

【0069】

別の態様によれば、本出願は、単離された核酸をさらに開示し、それは、本出願に記載の、ＴＲＰＶ６に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片をコードする。いくつかの実施形態では、前記核酸は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１に示される核酸配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：３１と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列と、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２に示される核酸配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：３２と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列とのうちの一方又は両方を含む。いくつかの実施形態では、前記核酸は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３に示される核酸配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：３３と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列と、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４に示される核酸配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：３４と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列とのうちの一方又は両方を含む。いくつかの実施形態では、前記核酸は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５に示される核酸配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：３５と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列と、ＳＥＱＩＤＮＯ：６に示される核酸配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：６と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列とのうちの一方又は両方を含む。

【0070】

別の態様によれば、本出願は、ベクターをさらに開示し、それは、本出願に記載の核酸配列を含む。

【0071】

別の態様によれば、本出願は、宿主細胞をさらに開示し、それは、本出願に記載のベクターを含む。

【0072】

別の態様によれば、本出願は、多重特異性抗体をさらに開示し、それは、本出願に記載の抗体又はその抗原結合性断片と、他の抗原に特異的に結合する一つ又は複数の抗体又はその抗原結合部分とを含む。

【0073】

別の態様によれば、本出願は、抗体複合体をさらに開示し、それは、本出願に記載の抗体又はその抗原結合性断片、又は本出願に記載の多重特異性抗体を含む。

【0074】

別の態様によれば、本出願は、抗ＴＲＰＶ６モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株をさらに開示し、前記ハイブリドーマ細胞株は、１２ＣＴ９．５．１、１６ＣＴ４．１．１．２及び／又は１６ＣＴ１８．１．１．２であり、中国典型培養物保存センターに保存され、ここで１２ＣＴ９．５．１の保存番号は、ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０２１１９であり、１６ＣＴ４．１．１．２の保存番号は、ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０２１２４であり、１６ＣＴ１８．１．１．２の保存番号は、ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０２１２５である。

【0075】

別の態様によれば、本出願は、医薬組成物をさらに開示し、それは、本出願に記載の抗体又はその抗原結合性断片、本出願に記載の単離された核酸、本出願に記載のベクター、本出願に記載の宿主細胞、本出願に記載の多重特異性抗体又は本出願に記載の抗体複合体と、薬学的に許容されるベクターとを含む。

【0076】

本出願で使用される「薬学的に許容される」という表現は、合理的な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激性、アレルギー反応などを有さずに、ヒト及び他の動物の細胞との接触に適するとともに、合理的な利益／リスク比に見合っていることを意味する。

【0077】

本出願で使用される「薬学的に許容されるベクター」という用語は、本出願による抗体又はその抗原結合性断片、単離された核酸、ベクター、宿主細胞、多重特異性抗体又は抗体複合体を被験者に送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁剤又は任意の他の薬学的に不活性なキャリア剤を指し、それは、抗体又はその抗原結合性断片、単離された核酸、ベクター、宿主細胞、多重特異性抗体又は抗体複合体の構造、形態と性質に影響を与えない。一部のこのようなベクターにより、抗体又はその抗原結合性断片、単離された核酸、ベクター、宿主細胞、多重特異性抗体又は抗体複合体を、被験者が口から服用するために、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤、トローチ剤などとして製剤化することができる。一部のこのようなベクターにより、抗体又はその抗原結合性断片、単離された核酸、ベクター、宿主細胞、多重特異性抗体又は抗体複合体を、注射、注入、局所投与用の製剤として製剤化することができる。

【0078】

本出願による医薬組成物に用いる薬学的に許容されるベクターは、例えば薬学的に許容される液体、ゲル又は固体ベクター、水性キャリア剤（例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張性ブドウ糖注射液、滅菌水注射液又はブドウ糖及び乳酸リンゲル注射液）、非水性キャリア剤（例えば、植物由来の不揮発性油、綿実油、コーン油、ごま油又は落花生油）、抗菌剤、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム又はブドウ糖）、緩衝剤（例えば、リン酸又はクエン酸緩衝剤）、酸化防止剤（例えば、硫酸水素ナトリウム）、麻酔剤（例えば、塩酸プロカイン）、懸濁剤／分散剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はポリビニルピロリドン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）又はＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸））、乳化剤（例えば、ポリソルベート８０（ツイーン８０））、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は無毒性の補助物質、本分野における公知の他の成分又はその様々な組み合わせを含むが、これらに限らない。適切な成分として、例えば充填剤、バインダー、緩衝剤、防腐剤、潤滑剤、調味剤、増粘剤、着色剤又は乳化剤を含んでもよい。

【0079】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、注射用製剤である。注射用製剤は、滅菌水溶液又は分散剤、懸濁剤又は乳剤を含む。あらゆる状況下で、注射用製剤は、滅菌であるとともに、注射を容易にする流体であるべきである。注射用製剤は、生産と保存の条件下で安定性を維持するとともに、細菌や真菌などの微生物による汚染を防止しなければならない。ベクターは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）とその適切な混合物及び／又は植物油を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。注射用製剤は、適度な流動性を保つべきである。例えば、レシチンのようなコーティングを使用し、界面活性剤などを使用することによって適度な流動性を保つことができる。様々な抗細菌剤と抗真菌剤によって微生物阻止の作用を実現することができ、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどである。

【0080】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、経口投与製剤である。経口投与製剤は、カプセル、扁平カプセル、丸剤、錠剤、トローチ剤（調味基質を使用し、一般的にはショ糖とアラビアガム又はトラガントガムである）、粉剤、顆粒剤、又は水性か非水性液体における溶液剤又は懸濁剤、又は水中油か油中水型液体乳剤、又はエリキシル剤かシロップ、又はソフトトローチ剤（不活性基質を使用し、例えばゼラチンとグリセリン、又はショ糖とアラビアガムである）及び／又は洗口剤などを含むが、これらに限らない。

【0081】

経口投与用の固体剤型（例えば、カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤など）では、抗体又はその抗原結合性断片、単離された核酸、ベクター、宿主細胞、多重特異性抗体又は抗体複合体と、薬学的に許容される一種又は複数種のベクター、例えばクエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム、及び／又は以下のうちのいずれか一つとを混合し、即ち（１）充填剤又は増量剤、例えば、デンプン、乳糖、ショ糖、グルコース、マンニトール及び／又はケイ酸、（２）バインダー、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖及び／又はアラビアガム、（３）保湿剤、例えば、グリセリン、（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、馬鈴薯デンプン又はタピオカデンプン、アルギン酸、一部のケイ酸塩と炭酸ナトリウム、（５）溶液遅延剤、例えば、パラフィン、（６）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物、（７）湿潤剤、例えば、アセチル基アルコールとモノグリセリド、（８）吸収剤、例えば、カオリンとベントナイト、（９）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びその混合物、及び（１０）着色剤である。

【0082】

経口投与用の液体剤型では、抗体又はその抗原結合性断片、単離された核酸、ベクター、宿主細胞、多重特異性抗体又は抗体複合体と、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルション、溶液、懸濁剤、シロップ剤及びエリキシル剤のうちのいずれか一つとを混合する。抗体又はその抗原結合性断片、単離された核酸、ベクター、宿主細胞、多重特異性抗体又は抗体複合体以外、液体剤型は、本分野でよく使われる不活性希釈剤、例えば、水又は他の溶媒、可溶化剤と乳化剤、例えば、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、イソプロピルアルコール、１，３－ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、オリーブ油、ひまし油とごま油）、グリセリン、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールとソルビタン脂肪酸エステル及びその混合物を含有してもよい。不活性希釈剤以外、経口組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤と懸濁剤、甘味料、調味剤、着色剤、着香剤と防腐剤をさらに含んでもよい。

【0083】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、口腔用スプレー製剤又は鼻用スプレー製剤である。スプレー製剤は、水性エアゾール剤、非水性懸濁剤、リポソーム製剤又は固体顆粒製剤などを含むが、これらに限らない。水性エアゾール剤は、薬剤の水溶液又は懸濁液と、薬学的に許容される一般的なベクター及び安定剤とを混合することで製造される。ベクター及び安定剤は、具体的な薬物成分の需要に基づいて変更されるが、一般的には、それは、非イオン界面活性剤（ツイーン又はポリエチレングリコール）、オレイン酸、レシチン、アミノ酸、例えば、グリシン、緩衝溶液、塩、糖又は糖アルコールを含む。エアゾール剤は、一般的には等張液によって製造され、そしてスプレーによって送達することができる。

【0084】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、一種又は複数種の他の医薬と混合することで使用してもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも一種の他の医薬を含有する。いくつかの実施形態では、その他の医薬は、抗悪性腫瘍薬、心臓血管薬、抗炎症薬、抗ウイルス薬、消化器官用薬、神経系用薬、呼吸器系用薬、免疫系用薬、皮膚疾患用薬、代謝系用薬などである。

【0085】

いくつかの実施形態では、適切な経路を介して必要のある被験者に医薬組成物を投与してもよく、経口投与、注射（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、心腔内、脊髄腔内、胸膜腔内、腹腔内注射など）、粘膜（例えば、鼻腔内、口腔内投与など）、舌下、直腸、経皮、眼投与と経肺投与を含むが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内、皮下、経口投与、筋肉内又は心腔内投与されてもよい。

【0086】

別の態様によれば、本出願は、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を分析と検出するための試薬をさらに開示し、前記試薬は、本出願に記載の一種又は複数種の抗体又はその抗原結合性断片を含む。いくつかの実施形態では、前記試薬は、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を分析と検出するために用いられる。

【0087】

別の態様によれば、本出願は、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を検出する方法をさらに開示し、前記方法は、（１）前記試料を、本出願に記載の抗体又は抗原結合性断片と接触することと、（２）任意選択的に、未結合の抗体又は抗体断片を除去することと、（３）前記試料におけるＴＲＰＶ６に結合した抗体又は抗体断片を検出することとを含む。

【0088】

本出願で使用される「検出」という用語は、分子（例えば、ポリペプチド、タンパク質又は核酸分子）の存在又は非存在を確定と測定し、又は分子間の相互作用（例えば、結合、アゴニスト又はアンタゴニストなどの作用）、例えばタンパク質－タンパク質の相互作用（例えば、抗体と抗原との間の相互作用）、タンパク質－核酸の相互作用、又は核酸－核酸の相互作用を確定と測定することであってもよい。いくつかの実施形態では、「検出」と「測定」は、定量的検出と測定を含む。いくつかの実施形態では、検出は、抗体に直接的又は間接的にカップリングする検出分子の信号を確定と測定することによって行われる。当業者によく知られている方法によって検出を行ってもよい。いくつかの実施形態では、免疫組織化学（ＩＨＣ）、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光（ＩＦ）、化学発光（ＣＬＩＡ）、免疫比濁（ＴＩＡ）又はウェスタンブロット（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ）を使用して検出を行う。

【0089】

いくつかの実施形態では、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を検出する方法のステップ（１）において、本出願に記載の抗体又は抗原結合性断片は、基板上に固定される。いくつかの実施形態では、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を検出する方法のステップ（１）において、前記試料は、基板上に固定される。いくつかの実施形態では、試料は、細胞又は組織である。試料は、細胞遠心分離作製物、細胞学的塗抹、コア生検、細針穿刺及び／又は組織切片（例えば、クライオスタット組織切片、パラフィン包埋組織切片）を含むが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、試料は、生細胞を含む。いくつかの実施形態では、試料は、腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、化学固定剤を使用して前記固定を行う。架橋固定剤（例えばアルデヒド類、例えばホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドを含む）を使用して組織学的試料を作製してもよい。組織試料は、ホルムアルデヒドで固定されてパラフィンに包埋されてもよい。パラホルムアルデヒドを使用して、温度感受性低温材料に包埋されて、液体窒素で急速凍結してもよい。その他の種類の化学固定剤として、酸化剤とアルコール固定剤をさらに含む。さらに、物理的方法によって固定してもよい。

【0090】

【0091】

本出願で使用される「エピトープ」という用語は、抗体分子の可変領域における特定の抗原結合部位（相補的部位という）と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、一つを超えるエピトープを有してもよい。そのため、異なる抗体は、一つの抗原上の異なる領域に結合できるとともに異なる生物的作用を有することができる。エピトープは、立体配座エピトープ又は線状エピトープであってもよい。立体配座エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからのアミノ酸が空間的に並置されることによって形成される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖における隣接するアミノ酸残基によって形成されるエピトープである。いくつかの状況では、エピトープは、抗原上の糖、ホスホリル基又はスルホニル基の部分を含んでもよい。

【0092】

いくつかの実施形態では、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を検出する方法のステップ（３）において、二次抗体を使用することをさらに含み、任意選択的に、前記二次抗体は、本出願に記載の抗体又は抗原結合性断片に直接的又は間接的に結合可能であり、任意選択的に、前記二次抗体は、本出願に記載の抗体又は抗原結合性断片の定常領域部分に結合可能である。本明細書で使用される「二次抗体」は、抗ＴＲＰＶ６抗体をより良く検出するためのものであり、二次抗体は、一般的には市販で購入できる。いくつかの実施形態では、本出願に記載の二次抗体は、検出分子にカップリングし、任意選択的に、前記検出分子は、酵素、蛍光標識物質とビオチンを含む。いくつかの実施形態では、前記検出分子は、酵素であり、任意選択的に、前記酵素は、ペルオキシダーゼ（例えば、ワサビペルオキシダーゼ）、アルカリフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、糖質酸化酵素、ウレアーゼ、複素環オキシダーゼ（例えば、キサンチンオキシダーゼ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ又はその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、前記検出分子は、フルオレセインであり、任意選択的に、前記フルオレセインは、ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリスリン、ＧＦＰ、Ｃｙ３、Ｃｙ５又はＤｙｌｉｇｈｔを含む。いくつかの実施形態では、前記検出分子は、ビオチン又はその誘導体である。

【0093】

いくつかの実施形態では、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を検出する方法は、前記試料におけるＴＲＰＶ６に結合した抗体を定量することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光（ＩＦ）、化学発光（ＣＬＩＡ）、免疫比濁（ＴＩＡ）又はウェスタンブロット（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ）である。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記試料における、細胞表面上に発現するＴＲＰＶ６の細胞の比率を評価することができる。

【0094】

いくつかの実施形態では、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を検出する方法において、前記被験者は、ヒトである。

【0095】

別の態様によれば、本出願は、被験者疾患の形成又は形成のリスクを判断し、被験者疾患の進展又は予後を評価し、又は疾患治療を受けている被験者において前記被験者の治療への応答を予測又はモニタリングする方法をさらに開示し、前記方法は、本出願に記載の、被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を検出する方法によって、前記被験者由来の試料におけるＴＲＰＶ６を検出することを含む。

【0096】

【0097】

本出願で使用される「得する」、「利益を得る」又は「有益である」という表現は、あらゆる期待される効果を意味し、（１）疾患の進行をある程度抑制（例えば軽減、緩和又は完全に停止させ）し、速度低減と完全停止を含み、（２）疾患の発症及び／又は症状の数を減少させ、（３）病変のサイズを縮小させ、（４）疾患細胞の隣接する周りの器官及び／又は組織への浸潤を抑制し、（５）疾患の伝播を抑制し、（６）当該疾患に関連する一種又は複数種の症状を一定程度緩和し、（７）治療後の無病生存期間を延長し、（８）自己免疫反応が軽減し、疾患病変の消退又はアブレーションを引き起こし得るが必ずしもそうではなく、例えば無増悪生存期間であり、（９）全生存率を高め、（１０）応答率をより高くし、及び／又は（１１）治療後の所定時点における死亡率を低下させることを含むが、これらに限らない。

【0098】

いくつかの実施形態では、前記被験者の治療への応答を予測又はモニタリングすることは、被験者の腫瘍が軽減又は増悪したかどうかを評価することを含む。いくつかの実施形態では、前記被験者の治療への応答を予測又はモニタリングすることは、被験者が治療（例えば、特定の医薬品による治療）を受けた後に好転したかどうか、及び／又は好転の可能性を評価することを含む可能性がある。本出願の予測又は監督の方法は、臨床における治療決定に用いられてもよい。治療計画（例えば、所定の治療計画、例えば所定の治療剤又は組み合わせの投与、手術介入など）を実行した後、本出願の予測又は監督の方法は、特定の被験者の長期間生存の可能性を評価する際に有用なツールである。

【0099】

いくつかの実施形態では、本出願に記載の疾患は、癌疾患である。いくつかの実施形態では、癌疾患は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胆管癌、胃癌、食道癌、肺癌、腸癌、膵臓癌である。いくつかの実施形態では、癌疾患は、ＨＥＲ２^＋乳癌、トリプルネガティブ乳癌又は結直腸癌である。

【0100】

別の態様によれば、本出願は、キットをさらに開示し、前記キットは、本出願に記載の抗体又はその抗原結合性断片を含み、任意選択的に、前記抗体又はその抗原結合性断片とＴＲＰＶ６との結合状況を検出するための試薬をさらに含む。

【0101】

【0102】

別の態様によれば、本出願は、ＴＲＰＶ６に特異的に結合する抗体を作製する方法をさらに開示し、前記方法は、（１）ＳＥＱＩＤＮＯ：３に示されるアミノ酸配列とベクタータンパク質とをカップリングして、ＴＲＰＶ６抗原ペプチドを得ることと、（２）ステップ（１）によって得られた前記ＴＲＰＶ６抗原ペプチドを免疫原としてマウスへの免疫をすることと、（３）細胞融合と免疫ペプチドのクローンスクリーニングを経て、ＴＲＰＶ６に特異的に結合する抗体を高分泌する陽性ハイブリドーマ細胞系を得ることと、（４）ＴＲＰＶ６に特異的に結合する抗体を得ることとを含む。

【0103】

いくつかの実施形態では、前記ベクタータンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）タンパク質である。

【0104】

【0105】

ＳＥＱＩＤＮＯ：３：ＰＬＫＰＲＴＮＮＲＴＳＰＲＤＮＴＬＬＱＱＫＬＬＱＥＡＹＭＴＰＫ。

【0106】

いくつかの実施形態では、本出願に記載のハイブリドーマ細胞系は、マウスハイブリドーマ細胞系１２ＣＴ９．５．１、１６ＣＴ１８．１．１又は１６ＣＴ４．１．１．２である。ここで、細胞系１２ＣＴ９．５．１によって産生される抗体は、ＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１抗体を含み、細胞系１６ＣＴ４．１．１．２によって産生される抗体は、ＣＢ－Ａｎｔｉ－０００２抗体を含み、細胞系１６ＣＴ１８．１．１によって産生される抗体は、ＣＢ－Ａｎｔｉ－０００３抗体を含む。

【0107】

別の態様によれば、本出願は、本出願に記載の抗体又はその抗原結合性断片、本出願に記載の多重特異性抗体、本出願に記載の抗体複合体及び本出願に記載の医薬組成物の、ＴＲＰＶ６に関連する疾患を治療及び／又は予防及び／又は診断するための医薬における用途をさらに開示する。

【0108】

別の態様によれば、本出願は、疾患を治療、予防又は診断する方法をさらに開示し、前記方法は、本出願に記載の抗体又はその抗原結合性断片、本出願に記載の多重特異性抗体、本出願に記載の抗体複合体及び本出願に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験者に投与することを含む。
実施例

【0109】

以下の実施例は、本発明をより良く説明するために用いられ、本発明の範囲を限定するものとして理解すべきではない。以下に記載のすべての特定の組成物、材料と方法は、その全体と部分が、いずれも本発明の範囲内に属する。これらの特定の組成物、材料と方法は、本発明を限定するためのものではなく、特定の実施形態が本発明の範囲内に属することを説明するために用いられる。当業者であれば、創造性を追加することなく、本発明の範囲から逸脱せずに同等な組成物、材料と方法を開発することができる。理解すべきこととして、本発明の方法に対して行う様々な変更は、依然として本発明の範囲内に含まれる。発明者は、このような変更を本発明の範囲内に含めることを意図している。
実施例１抗原ポリペプチドの合成と組換え抗原の作製

【0110】

１．抗原ポリペプチドの選択
Ｕｎｉｐｒｏｔ及びＧｅｎｂａｎｋにおける、登録番号がＱ９Ｈ１Ｄ０とＧＩ：１９１８０１７２９３のタンパク質配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示される）に対して配列と二次構造の解析を行った。該ＴＲＰＶ６タンパク質の全長は、７６５個のアミノ酸であり、その分子量は、約８７ｋＤａである。オンラインサーバｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＳｕｒｆＰ／で該タンパク質の二次構造及び表面アクセシビリティ（ＳｕｒｆａｃｅＡｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）パラメータを予測し、その抗原性指数の分析結果によって、アミノ酸配列ＩＦＱＴＥＤＰＥＥＬＧＨＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）、ＤＧＰＡＮＹＮＶＤＬＰＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）又はＰＬＫＰＲＴＮＮＲＴＳＰＲＤＮＴＬＬＱＱＫＬＬＱＥＡＹＭＴＰＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）を抗原として選択し化学合成を行った。カップリングを容易にするために、該ポリペプチドのアミノ末端に、チオ基を提供するように一つのシステインを追加した。

【0111】

２．ポリペプチドのカップリング及び精製
ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのマレイミド活性化キーホールリンペットヘモシアニンタンパク質キットを選択して、キットにより提供されるフローに従って操作した。

【0112】

カップリングすべきポリペプチドに対し、まず以下のようにＥｌｌｍａｎ試薬を用いてポリペプチドにおける遊離チオ基を検出した。９６ウェルプレートに１００μＬのＥｌｌｍａｎ試薬ストック液を加え、さらに１０μＬのポリペプチド溶液を加え、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いてλ＝４１２ｎｍでその紫外線吸収値を測定し、ＯＤ値＞０．１５であれば、次のステップを実行し、ＯＤ値＜０．１５且つ＞０．０５であれば、要件を満たすまでポリペプチドを追加して添加し、ＯＤ値＜０．０５であれば、ポリペプチド合成ステップに戻って改めて品質管理する。

【0113】

カップリング開始する時、各ｍｃＫＬＨ包装に２００μＬの脱イオン水を加えて、１０ｍｇ／ｍＬのＫＬＨ溶液を調製し、５００μＬのＩｍｊｅｃｔＥＤＣカップリング緩衝液に２ｍｇのハプテンを溶解させ、５００μＬのポリペプチド溶液を２００μＬのベクタータンパク質溶液に加えた。１ｍＬの脱イオン水を１包装のＥＤＣ（１０ｍｇ）に加え、完全に溶解させるまでゆっくりと振盪し、５０μＬを取ってｍｃＫＬＨポリペプチド溶液に加え、２時間反応させてから、脱塩カラムで処理して未カップリングの架橋剤と塩類を除去した。
実施例２ハイブリドーマ細胞系の構築

【0114】

１．免疫
実施例１における架橋されたポリペプチドをフロイント完全アジュバントで乳化し、４～６週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（北京維通利華実験動物技術有限公司から購入）への免疫を行い、マウス毎に６箇所で、６０μｇ／匹の用量で腹部皮下注射した。１４日毎に１回追加免疫し、抗原をフロイント不完全アジュバントで乳化し、用量は、３０μｇ／匹である。３回目の追加免疫してから７日目に、間接ＥＬＩＳＡ（波長４５０ｎｍ）でマウス血清中の抗免疫原のポリクローナル抗体力価を検出し、力価が最も高いマウスに対して尾静脈内注射してラッシュ免疫し、抗原を生理食塩水で均一に混合し、用量は、５０μｇ／匹である。

【0115】

２．細胞融合
免疫の標準に達したマウスの脾細胞懸濁液を作製し、マウス骨髄腫細胞Ｆ０と５：１の比率で混合し、１５００ｒｐｍで、５分間遠心分離した。上清を捨ててから、遠沈管を３７°Ｃの水浴中に入れ、１分以内で１ｍＬのＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ社）をゆっくりと加えて、細胞をかき回した。温水中で１分間静置してから、１０ｍＬの無血清ＩＭＤＭ（Ｓｉｇｍａ社）を加え、均一に混合し、１０００ｒｐｍで、５分間遠心分離した。上清を捨ててから、１０ｍＬの血清（ＰＡＡ社）を加え、細胞を注意深く繰り返して吸引吐出し、１０ＸＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ社）を混合した胸腺細胞を５ｍＬ加え、均一に混合した。さらに２．１％のニトロセルロース（Ｓｉｇｍａ社）を含有する半固形培地を２５ｍＬ加えて、十分に均一に混合させてから、２０個の細胞培養ディッシュに均一に注いだ。細胞培養ディッシュをウェットボックスに入れ、３７°Ｃで、５％ＣＯ_２のインキュベータに入れて培養した。

【0116】

３．クローン化及びＥＬＩＳＡによる陽性ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
融合してから７日目に、クローン細胞塊の大きさと密度がちょうどよく、実体顕微鏡下で、丸くて、コンパクトで、大きなクローン塊を吸い取り、事前に培地を用意した９６ウェル培養プレートに吐出し、３７°Ｃで、５％ＣＯ_２のインキュベータに入れて培養した。

【0117】

３日後に、細胞量は、およそ底面積の２／３を占め、１００μＬの上清を取り、免疫原と合成ポリペプチドを用いてそれぞれＥＬＩＳＡスクリーニングを行った。陽性クローンの培地を完全に交換し、フィーダー細胞と１％のＨＴ（Ｓｉｇｍａ社）を含有する完全培地を２００μＬ加えた。２日後に、２回目のＥＬＩＳＡスクリーニングを行い、陽性クローンを、事前に培地（フィーダー細胞とＨＴ含有）を用意した２４ウェルプレートに移して培養した。５日後に、１００μＬの上清を取り、３回目のＥＬＩＳＡスクリーニングを行い、スクリーニングにより１２ＣＴ９．５．１と１６ＣＴ１８．１．１．２と１６ＣＴ４．１．１．２との三つの力価の高い陽性クローンを得て、逐次６ウェルプレートと細胞培養フラスコに移して拡大培養し、凍結保存した。
実施例３腹水誘導法によるモノクローナル抗体の作製

【0118】

１．腹水の作製
対数増殖期の細胞を無血清培地で洗浄して浮遊させ、計数～５ｘ１０^５／ｍＬで、１ｍＬの浮遊細胞を、事前にパラフィン油で感作したマウスに腹腔内注射した。７日後に、腹水採取し始めた。取り出された腹水を、４°Ｃで、４０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離した。中間にある腹水を注意深く吸い取って遠沈管に入れ、４°Ｃ又は－２０°Ｃで保存した。

【0119】

２．モノクローナル抗体の精製
ＰｒｏｔｅｉｎＧ（ＧＥ社）アフィニティークロマトグラフィー法を利用し、取扱説明書に従って腹水から抗体を精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルでの純度を同定し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により濃度を測定した。精製された抗体を－２０°Ｃで保存した。
実施例４モノクローナル抗体特性同定

【0120】

１．亜型の同定
１００ｍＬのＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いてコーティングされたヤギ抗マウスＩｇＧを０．５μｇ／ｍＬに希釈し、ウェル毎に１００μＬ加え、４°Ｃで一晩放置した。液を残らずに出し、０．０５％のＴｗｅｅｎを含有するＰＢＳで３回洗浄し、ウェル毎に２００μＬのブロッキング溶液（２％のＢＳＡと３％のショ糖を含有するＰＢＳ）を加え、３７°Ｃで１時間インキュベートし、液を残らずに出し、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ウェル毎に０．１ｍＬのハイブリドーマ上清を加え、３７°Ｃで１時間インキュベートし、液を残らずに出し、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ブロッキング溶液を用いて１：１０００でＨＲＰによりマークされたヤギ抗マウス（κ、λ）抗体を希釈し、又は１：２０００でＨＲＰによりマークされたヤギ抗マウス（ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ）抗体を希釈し、１ウェルあたり０．１ｍＬでそれぞれ適切なウェルに加え、３７°Ｃで１時間インキュベートし、液を残らずに出し、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ウェル毎に０．１５％のＡＢＴＳと０．０３％のＨ_２Ｏ_２を含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）を５０μＬ加えて発色反応を行い、１０～２０分以内で４０５ｎｍ波長におけるＯＤ値を測定した。結果によると、得られたＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１とＣＢ－Ａｎｔｉ－０００２抗体は、ＩｇＧ１型マウス由来モノクローナル抗体であり、ＣＢ－Ａｎｔｉ－０００３抗体は、ＩｇＧ２ａ型マウス由来モノクローナル抗体である。

【0121】

２．親和定数の測定
まず、得られた抗ＴＲＰＶ６抗体をＳＰＲチップ上に固定し、それから１×ＰＢＳＴを希釈液として、免疫ペプチドを１１．５２ｎＭに希釈し、その後、１．３倍に希釈し、最終的な濃度は、４．０４ｎＭであり、計５つの濃度勾配である。ＳＰＲ機器を利用して親和性の検出を行い、機器の自動分析により、ＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１の親和定数は、５．１９ｘ１０^－１０であると算出された。

【0122】

３．モノクローナル抗体の反応特異性と応用効果
ＴＲＰＶ６タンパク質をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を選択し、免疫細胞化学の方法で本発明のモノクローナル抗体の認識特異性を検出し、免疫細胞化学の実験プロセスは、以下のとおりである。２９３Ｔ細胞にＴＲＰＶ６プラスミドをトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を、カバースリップを含む２４ウェルプレートに敷き、ＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳの培地において細胞を７２時間培養し、上清を除去し、ＰＢＳで１回洗浄し、メタノールを加えて３０秒固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。抗体希釈液を用いて適切な希釈比に従って抗ＴＲＰＶ６抗体作動液を調製し、２４ウェルプレートにおけるＰＢＳを除去し、抗体作動液を加えて、摂氏４度で一晩インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体（Ｅｌｉｖｉｓｉｏｎ^ＴＭｐｌｕｓＰｏｌｙｅｒＨＲＰ（Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｂｂｉｔ）ＩＨＣＫｉｔ、福州邁新生物技術開発有限公司から購入、製品番号ＫＩＴ－９９０３）を滴加し、室温で１５～２０分間インキュベートし、ＰＢＳで３Ｘ３分間洗い流し（即ち、３回洗い流し、毎回３分間持続する）、ＰＢＳを振り捨て、新鮮に調製されたＤＡＢ発色液を用いて３分間発色させた。ヘマトキシリンで二次的な染色を２５秒行い、ＰＢＳで色出しを３０秒実施した。７５％、９５％、１００％、１００％のアルコール勾配に従って順に脱水し、最後にキシレンで透徹を３分間行い、中性ガムで封入をした。

【0123】

図１Ａ～１Ｃに示すように、ＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１抗体、ＣＢ－Ａｎｔｉ－０００２抗体とＣＢ－Ａｎｔｉ－０００３抗体は、それぞれ、ＴＲＰＶ６プラスミドをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞において免疫細胞化学によってＴＲＰＶ６タンパク質を特異的に検出できるが、それとともにＴＲＰＶ６プラスミドをトランスフェクトしていない２９３Ｔ細胞においてＴＲＰＶ６タンパク質の検出は、示されていない。該結果によると、得られた抗ＴＲＰＶ６抗体は、ＴＲＰＶ６タンパク質を特異的に認識することができ、即ち認識特性を有する。
実施例５抗体の可変領域配列の測定

【0124】

培養したハイブリドーマ細胞系を１ｘ１０^６取り、遠心分離して上清を取り、細胞の沈殿を蘇州金唯智生物科技有限公司に依頼して抗体の重鎖と軽鎖可変領域配列の測定を行い、例示的な抗体重鎖可変領域配列と抗体軽鎖可変領域配列を以下に示す。

【表2】

【表3】

【表4】

実施例６組織切片の染色と同定

【0125】

１．切片の作製プロセス
組織パラフィンブロックを粗切してから連続して切片にし、厚さを５μｍにし、連続切片を４５°Ｃの温水において広げ、正電荷付き剥離防止スライドグラスに切片を貼り付け、室温で陰干しを一晩してから、－２０°Ｃで長期保存した。

【0126】

２．ＩＨＣ染色及び分析
通常のキシレンで脱パラフィンを２回行い、毎回１５分間実行し、１００％、１００％、９５％、７５％の勾配のエタノールにおいて水和をし、毎回３分間実行し、最後に水道水で洗い流した。抗原修復を行い、そして切片をウェットボックスに入れて、ＰＢＳで３Ｘ３分間洗い流した。３％のＨ_２Ｏ_２を滴加して１０分間インキュベートし、ＰＢＳで３Ｘ３分間洗い流した。ＰＢＳを振り捨て、ブロッキング溶液（動物非免疫血清）を滴加して室温で６０分間インキュベートした。切片を振って乾燥させ、適切な比率に希釈された一次抗体を滴加し、４°Ｃで一晩インキュベートし、ＰＢＳで３Ｘ３分間洗い流し、二次抗体（Ｅｌｉｖｉｓｉｏｎ^ＴＭｐｌｕｓＰｏｌｙｅｒＨＲＰ（Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｂｂｉｔ）ＩＨＣＫｉｔ、福州邁新生物技術開発有限公司から購入、製品番号ＫＩＴ－９９０３）を滴加し、室温で１５～２０分間インキュベートし、ＰＢＳで３Ｘ３分間洗い流し、ＰＢＳを振り捨て、新鮮に調製されたＤＡＢ発色液を用いて３分間発色させた。ヘマトキシリンで二次的な染色を２５秒行い、ＰＢＳで色出しを３０秒実施した。７５％、９５％、１００％、１００％のアルコール勾配に従って順に脱水し、最後にキシレンで透徹を３分間行い、中性ガムで封入をした。

【0127】

３．データ統計
図２Ａ～２Ｃに示すように、ＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１抗体、ＣＢ－Ａｎｔｉ－０００２抗体とＣＢ－Ａｎｔｉ－０００３抗体は、それぞれ免疫組織化学によって組織切片におけるＴＲＰＶ６タンパク質を検出することができる。

【0128】

なお、発明者は、さらにＨ－ｓｃｏｒｅ採点方法を用いて腫瘍細胞の細胞膜の染色状況を記録し、Ｈ－ｓｃｏｒｅ６０点以上を強染色として記録し、Ｈ－ｓｃｏｒｅ１～６０点を弱染色として記録し、強染色及び弱染色の合計を陽性とし、Ｈ－ｓｃｏｒｅ０を陰性とした。ＩＨＣ検出による各腫瘍組織におけるＴＲＰＶ６のレベルをそれぞれ統計し、ＴＣＧＡデータベースにおけるＴＲＰＶ６ｍＲＮＡレベルとの比較検証を行うことによって、抗体の特異性を評価し、記録情報を表４に示す。結果によると、本発明の抗体によるＴＲＰＶ６タンパク質レベルの検出において、陽性率が高い（特に強染色の比率が高い）癌種は、癌ゲノムアトラスデータベース（ｔｈｅＣａｎｃｅｒＧｅｎｏｍｅＡｔｌａｓＰｒｏｇｒａｍ、即ちＴＣＧＡデータベース）において統計されたＴＲＰＶ６ｍＲＮＡレベルも、それに対応して高い（例えば、ＴＰＭが１よりも大きい）。このことから分かるように、本発明の抗体の使用により、細胞表面におけるＴＲＰＶ６の発現状況を正確に評価し、さらに被検試料がＴＲＰＶ６を発現する癌細胞である否かを判断することができる。

【表5】

実施例７ＩＨＣ比較実験

【0129】

市販の抗体「Ａｎｔｉ－ＨｕｍａｎＴＲＰＶ６（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ」（品番ＡＣＣ－０２８、ＡｌｏｍｏｎｅＬａｂｓから購入、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２７５６５４５、本明細書では「ＡＣＣ－０２８抗体」と略す）、抗体「Ａｎｔｉ－ＴｒｐＶ６Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｃｌｏｎｅ４Ａ５．１」（品番ＭＡＢＮ８３９、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入、本明細書では「ＭＡＢＮ８３９抗体」と略す）とＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１抗体に対して、比較実験を行った。

【0130】

実施例６の第２の部分と同様な手順を使用して、ＣＤＸ腫瘍モデルＲＴ４（ヒト膀胱移行細胞乳頭腫細胞）の切片を取得した。ＡＣＣ－０２８抗体（希釈比率１：５０）、ＭＡＢＮ８３９抗体（希釈比率１：５０）とＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１抗体（希釈比率１：２０００）を滴加し、４°Ｃで一晩インキュベートし、ＰＢＳで３Ｘ３分間洗い流し、二次抗体（Ｅｌｉｖｉｓｉｏｎ^ＴＭｐｌｕｓＰｏｌｙｅｒＨＲＰ（Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｂｂｉｔ）ＩＨＣＫｉｔ、福州邁新生物技術開発有限公司から購入、製品番号ＫＩＴ－９９０３）を滴加し、室温で１５～２０分間インキュベートし、ＰＢＳで３Ｘ３分間洗い流し、ＰＢＳを振り捨て、新鮮に調製されたＤＡＢ発色液を用いて３分間発色させた。ヘマトキシリンで二次的な染色を２５秒行い、ＰＢＳで色出しを３０秒実施した。７５％、９５％、１００％、１００％のアルコール勾配に従って順に脱水し、最後にキシレンで透徹を３分間行い、中性ガムで封入をし、染色結果を読み取った。結果によると、ＡＣＣ－０２８抗体は、検出感度が低く、わずかな量のＲＴ４細胞膜上で特異的信号が検出されており（図面３Ａを参照）、ＭＡＢＮ８３９抗体は、特異性に劣り、すべての組織細胞と間葉系細胞において信号が検出されており（図面３Ｂを参照）、これらに比べ、ＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１抗体は、検出信号の位置決めが正確かつ明瞭で、特異性に優れ、感度が高く（図面３Ｃを参照）、好ましいＩＨＣ応用抗体である。
実施例８安定性実験

【0131】

加速破壊方法を用いてＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１抗体安定性の検証を行い、即ちそれぞれに対し、（１）抗体原液を４°Ｃで１４日間保存し、（２）抗体原液を３７°Ｃの恒温インキュベーターに入れて１４日間インキュベートし、且つ（３）抗体作動液（中杉金橋ＺＬＩ－９０２８抗体希釈液を使用し１：２０００の比率で抗体原液を希釈して該抗体作動液を得る）を３７°Ｃの恒温インキュベーターに入れて１４日間インキュベートした。同じ実験条件下で、上記三種類の抗体液を使用してＩＨＣ検出を行うことにより、三つの処理方式における抗体の安定性を評価した。

【0132】

検出によると、異なる条件下で保存した抗体は、組織染色強度と染色比率にいずれも顕著な変化がなかった（図面４を参照し、ここで図面４Ａは、４°Ｃで１４日間保存したＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１抗体原液のＩＨＣ結果であり、図面４Ｂは、３７°Ｃで１４日間保存したＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１抗体原液のＩＨＣ結果であり、図面４Ｃは、３７°Ｃで１４日間保存したＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１抗体作動液のＩＨＣ結果である）。このことから分かるように、ＣＢ－Ａｎｔｉ－０００１抗体作動液を３７°Ｃの温度下で１４日間保存した後も、抗体は、依然として安定し、良好な検出能力を保持している。

【表6】