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特表2024-505512タンパク質のイン・シチュ合成のための遺伝子操作された電気刺激されたエフェクター細胞
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-06
(54)【発明の名称】タンパク質のイン・シチュ合成のための遺伝子操作された電気刺激されたエフェクター細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240130BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240130BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20240130BHJP
A61K 35/36 20150101ALI20240130BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240130BHJP
A61K 38/21 20060101ALI20240130BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240130BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240130BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20240130BHJP
C07K 14/555 20060101ALN20240130BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240130BHJP
C12N 15/20 20060101ALN20240130BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
A61K35/17
A61K35/545
A61K35/36
A61K35/12
A61K38/21
A61P37/04
A61P31/14
A61K49/00
C07K14/555
C12N15/12
C12N15/20
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023545759
(86)(22)【出願日】2022-01-27
(85)【翻訳文提出日】2023-09-25
(86)【国際出願番号】 US2022014161
(87)【国際公開番号】W WO2022165079
(87)【国際公開日】2022-08-04
(31)【優先権主張番号】63/142,311
(32)【優先日】2021-01-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501228071
【氏名又は名称】エスアールアイ インターナショナル
【氏名又は名称原語表記】ＳＲＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
【住所又は居所原語表記】３３３ Ｒａｖｅｎｓｗｏｏｄ Ａｖｅｎｕｅ， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４０２５， Ｕ．Ｓ．Ａ．
(74)【代理人】
【識別番号】100081961
【弁理士】
【氏名又は名称】木内 光春
(74)【代理人】
【識別番号】100112564
【弁理士】
【氏名又は名称】大熊 考一
(74)【代理人】
【識別番号】100163500
【弁理士】
【氏名又は名称】片桐 貞典
(74)【代理人】
【識別番号】230115598
【弁護士】
【氏名又は名称】木内 加奈子
(72)【発明者】
【氏名】パリジャット バトナガー
(72)【発明者】
【氏名】シェリー ニューマイヤー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BD50
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA02
4C084DA21
4C084DA22
4C084DA23
4C084NA14
4C084ZB09
4C084ZB33
4C085HH11
4C085KA27
4C085KB44
4C085KB82
4C085LL20
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB48
4C087BB61
4C087BB63
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB33
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA15
4H045DA16
4H045DA17
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】
【解決手段】
電気センサー要素と、アクチュエーター要素と、エフェクター要素とを含む外因性ポリヌクレオチド配列を備える遺伝子操作された電気刺激された（ＥＳ）エフェクター細胞の例である。電気センサー要素は、電気刺激に応答して閉状態から開状態へと遷移するように構成される電位依存性カルシウムイオンチャンネル（ＣａＶ）をコードする。アクチュエーター要素は、ＣａＶの開状態への遷移に応答してエフェクタータンパク質の合成をアップレギュレートする転写因子結合部位をコードする。エフェクター要素は、エフェクタータンパク質をコードし、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、ＣａＶの開状態への遷移に応答して、活性化し、エフェクタータンパク質を合成及び分泌するように構成される。
【選択図】図１
【解決手段】
電気センサー要素と、アクチュエーター要素と、エフェクター要素とを含む外因性ポリヌクレオチド配列を備える遺伝子操作された電気刺激された（ＥＳ）エフェクター細胞の例である。電気センサー要素は、電気刺激に応答して閉状態から開状態へと遷移するように構成される電位依存性カルシウムイオンチャンネル（ＣａＶ）をコードする。アクチュエーター要素は、ＣａＶの開状態への遷移に応答してエフェクタータンパク質の合成をアップレギュレートする転写因子結合部位をコードする。エフェクター要素は、エフェクタータンパク質をコードし、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、ＣａＶの開状態への遷移に応答して、活性化し、エフェクタータンパク質を合成及び分泌するように構成される。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
電気刺激に応答して閉状態から開状態へと遷移するように構成される電位依存性カルシウムイオンチャンネル（ＣａＶ）をコードする電気センサー要素と、前記ＣａＶの前記開状態への遷移に応答してエフェクタータンパク質の合成をアップレギュレートする転写因子結合部位をコードするアクチュエーター要素と、
前記エフェクタータンパク質をコードするエフェクター要素と、
を作動的に関連して含む外因性ポリヌクレオチド配列を備え、
前記ＣａＶの前記開状態への遷移に応答して活性化し、前記エフェクタータンパク質を合成及び分泌するように構成される遺伝子操作された電気刺激（ＥＳ）エフェクター細胞。
【請求項2】
前記電気刺激及び前記ＣａＶの前記開状態への遷移に応答してＣａ２＋の流入を引き起こすことにより活性化するように構成され、前記Ｃａ２＋の流入は前記転写因子結合部位を活性化し、前記エフェクタータンパク質の合成をアップレギュレートする、
請求項１の細胞。
【請求項3】
Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、多能性幹細胞、上皮細胞、又はＫ５６２細胞を備える請求項１の細胞。
【請求項4】
前記エフェクター要素は、前記エフェクタータンパク質に対して非天然である、前記エフェクタータンパク質の上流のシグナルペプチドをさらにコードする請求項１の細胞。
【請求項5】
前記エフェクタータンパク質は、治療タンパク質、検出可能レポーターペプチド、下流シグナル伝達タンパク質、及びそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項１の細胞。
【請求項6】
前記外因性ポリヌクレオチド配列は、前記検出可能レポーターペプチドをさらにコードする、請求項１の細胞。
【請求項7】
前記検出可能レポーターペプチドは、ルシフェラーゼ又はその生物発光変異体、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその蛍光変異体、及びｌａｃＺ又はその比色変異体から成る群から選択される、請求項６の細胞。
【請求項8】
前記ＣａＶは、前記遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の細胞表面にチャンネルを形成するように構成される細孔形成サブユニットと、
前記ＣａＶのチャンネル開口の遷移を制御し、前記ＣａＶを細胞表面に輸送するように構成される補助サブユニットのセットと、
を含む、請求項１の細胞。
【請求項9】
前記エフェクタータンパク質は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＩＩ型ＩＦＮ、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される治療用タンパク質を含む、請求項１の細胞。
【請求項10】
前記ＣａＶは、ＣａＶ１．２、ＣａＶ１．３、及びそれらの変異体から成る群から選択される細孔形成サブユニットを含む、請求項１の細胞。
【請求項11】
転写因子結合部位は、前記活性化Ｔ細胞核因子（ＮＦＡＴ）応答要素、血清応答要素（ＳＲＥ）、及びサイクリックＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）から成る群から選択される、請求項１の細胞。
【請求項12】
前記エフェクタータンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に感染した細胞に作用するように構成される治療用タンパク質を含む、請求項１の細胞。
【請求項13】
遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の集団であって、各前記遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞が、アクチュエーター要素と、エフェクター要素と、電気センサー要素とを含む外因性ポリヌクレオチド配列を備え、
前記電気センサー要素は、細孔形成サブユニットと補助サブユニットのセットとを含むＣａＶをコードし、
前記ＣａＶは、電気刺激に応答して閉状態から開状態へと遷移するように構成され、
前記補助サブユニットのセットは、前記ＣａＶのチャンネルを制御し、前記ＣａＶを前記遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の表面に輸送するように構成され、
前記アクチュエーター要素は、前記ＣａＶの開状態への遷移に応答してエフェクタータンパク質の合成をアップレギュレートする転写因子結合部位をコードし、
前記遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、前記ＣａＶの開状態への遷移に応答して活性化し、前記エフェクタータンパク質を合成及び分泌するように構成される、
遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の集団。
【請求項14】
ゼンキ補助サブユニットのセットは、α２δサブユニット及びαβサブユニットを含む、請求項１３の遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の集団。
【請求項15】
前記補助サブユニットのセットは、α２δ１サブユニット及びαβ３サブユニットを含む、請求項１３の遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の集団。
【請求項16】
印加された電気刺激及び前記印加された電気刺激の持続時間の関数として、較正量の前記エフェクタータンパク質を提供するように構成される、請求項１３の遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の集団。
【請求項17】
複数の細胞を、細孔形成サブユニットと補助サブユニットのセットとを含む電位依存性カルシウムイオンチャンネル（ＣａＶ）をコードする電気センサー要素と、転写因子結合部位をコードするエフェクター要素と、エフェクタータンパク質をコードするエフェクター要素と、を含むポリヌクレオチド配列を備える遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞に接触させることと、複数の細胞を遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞に接触させた後、前記遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞に電場を印加して、前記ＣａＶを電気刺激することと、
前記電気刺激に応答して、
前記ＣａＶを閉状態から開状態へと遷移させることと、
前記アクチュエーター要素により前記エフェクタータンパク質の発現を開始させることと、
シグナルペプチドにより前記エフェクタータンパク質を分泌させることと、
を備える方法。
【請求項18】
電源に結合される２つの電極を含む電気回路を前記遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の近傍に配置し、前記２つの電極の間に電圧を印加することにより前記電場を印加することをさらに備える、請求項１７の方法。
【請求項19】
前記分泌されたＥＳエフェクター細胞の量は、前記電気刺激により前記遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞に印加された電場及び印加された電気刺激の持続時間の関数として提供される、請求項１８の方法。
【請求項20】
前記電気刺激の電圧、合計持続時間、パルス持続時間、及び周波数の少なくとも１つの関数として、前記遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を活性化させることをさらに備える、請求項１８の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、国防高等研究計画局から授与された契約番号Ｄ１９ＡＰ０００２４による政府の支援を受けて行われた。政府は本開示について一定の権利を有する。
【0002】
２０２２年１月２５日に作成され、本明細書と同時に提出され、以下の「Ｓ１６４７１３３１１１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」と識別され、１４４ｋｂのサイズのＡＳＣＩＩテキストファイルであるコンピュータ読み取り可能ヌクレオチド配列リストの全体が参照として組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
様々な標準治療薬が診断時に疾患を治療するために設計されている。現在、低分子製剤や生物製剤が、多くの免疫疾患（例えば、ウイルス性疾患、癌、自己免疫疾患等）に対する標準治療薬である。例えば、ウイルス性疾患について、現在、ワクチン接種が、病気や死さえ引き起こす新興ウイルス及び循環性ウイルスを治療する最も効果的な手段である。残念ながら、ワクチン開発には資源と時間がかかり、ウイルス特異的抗原の同定や、新たに出現する病原体ごとに安全で効果的な投与法を決定する必要がある。さらに、ワクチンによって誘導される免疫から逃れ、新たな病気の波を引き起こし、ワクチン開発が水泡に帰するような変異型が進化する可能性もある。
【発明の概要】
【0004】
本開示は、治療及びその他の目的に関連する上記の課題等を克服することを目的とし、標的部位においてエフェクタータンパク質の合成を起こすためにイン・シチュで電気的に活性化できる遺伝子操作された電気刺激（ＥＳ）エフェクター細胞株を含む。実施例は、治療薬に限定されず、研究、手術、及びその他の検出の実施等を含む。
【0005】
様々な様態は、電気刺激に応答して閉状態から開状態へと遷移するように構成される電位依存性カルシウムイオンチャンネル（ＣａＶ）をコードする電気センサー要素と、ＣａＶの開状態への遷移に応答してエフェクタータンパク質の合成をアップレギュレートする転写因子結合部位をコードするアクチュエーター要素と、エフェクタータンパク質をコードするエフェクター要素と、を作動的に関連して含む外因性ポリヌクレオチド配列を備え、ＣａＶの開状態への遷移に応答して活性化し、エフェクタータンパク質を合成及び分泌するように構成される遺伝子操作された電気刺激（ＥＳ）エフェクター細胞を対象とする。
【0006】
いくつかの様態において、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、電気刺激及びＣａＶの開状態への遷移に応答してＣａ２＋の流入を引き起こすことにより活性化するように構成され、Ｃａ２＋の流入は転写因子結合部位を活性化し、エフェクタータンパク質の合成をアップレギュレートする。
【0007】
いくつかの様態において、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、多能性幹細胞、上皮細胞、又はＫ５６２細胞を備える。
【0008】
いくつかの様態において、エフェクター要素は、エフェクタータンパク質に対して非天然である、エフェクタータンパク質の上流のシグナルペプチドをさらにコードする。
【0009】
いくつかの様態において、エフェクタータンパク質は、治療用タンパク質、検出可能レポーターペプチド、下流シグナル伝達タンパク質、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
【0010】
いくつかの様態において、外因性ポリヌクレオチド配列は、検出可能レポーターペプチドをさらにコードする。
【0011】
いくつかの様態において、検出可能レポーターペプチドは、ルシフェラーゼ又はその生物発光変異体、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその蛍光変異体、及びｌａｃＺ又はその比色変異体から成る群から選択される。
【0012】
いくつかの様態において、ＣａＶは、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の細胞表面にチャンネルを形成するように構成される細孔形成サブユニットと、ＣａＶのチャンネル開口の遷移を制御し、ＣａＶを細胞表面に輸送するように構成される補助サブユニットのセットと、を含む。
【0013】
いくつかの様態において、エフェクタータンパク質は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＩＩ型ＩＦＮ、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される治療用タンパク質を含む。
【0014】
いくつかの様態において、ＣａＶは、ＣａＶ１．２、ＣａＶ１．３、及びそれらの変異体から成る群から選択される細孔形成サブユニットを含む。
【0015】
いくつかの様態において、転写因子結合部位は、活性化Ｔ細胞核因子（ＮＦＡＴ）応答要素、血清応答要素（ＳＲＥ）、及びサイクリックＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）から成る群から選択される。
【0016】
いくつかの様態において、エフェクタータンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に感染した細胞に作用するように構成される治療用タンパク質を含む。
【0017】
様々な様態は、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の集団を対象とし、各遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞が、アクチュエーター要素と、エフェクター要素と、電気センサー要素とを含む外因性ポリヌクレオチド配列を備え、電気センサー要素は、細孔形成サブユニットと補助サブユニットのセットとを含むＣａＶをコードし、ＣａＶは、電気刺激に応答して閉状態から開状態へと遷移するように構成され、補助サブユニットのセットは、ＣａＶのチャンネルを制御し、ＣａＶを遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の表面に輸送するように構成され、アクチュエーター要素は、ＣａＶの開状態への遷移に応答してエフェクタータンパク質の合成をアップレギュレートする転写因子結合部位をコードし、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、ＣａＶの開状態への遷移に応答して活性化し、エフェクタータンパク質を合成及び分泌するように構成される。
【0018】
いくつかの様態において、補助サブユニットのセットは、α２δサブユニット及びαβサブユニットを含む。
【0019】
いくつかの様態において、補助サブユニットのセットは、α２δ１サブユニット及びαβ３サブユニットを含む。
【0020】
いくつかの様態において、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の集団は、印加された電気刺激及び印加された電気刺激の持続時間の関数として、較正量のエフェクタータンパク質を提供するように構成される。
【0021】
様々な様態は、複数の細胞を、細孔形成サブユニットと補助サブユニットのセットとを含む電位依存性カルシウムイオンチャンネル（ＣａＶ）をコードする電気センサー要素と、転写因子結合部位をコードするエフェクター要素と、エフェクタータンパク質をコードするエフェクター要素と、を含むポリヌクレオチド配列を備える遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞に接触させることと、複数の細胞を遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞に接触させた後、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞に電場を印加して、ＣａＶを電気刺激することと、電気刺激に応答して、ＣａＶを閉状態から開状態へと遷移させることと、アクチュエーター要素によりエフェクタータンパク質の発現を開始させることと、シグナルペプチドによりエフェクタータンパク質を分泌させることと、を備える方法を対象とする。
【0022】
いくつかの様態において、方法は、電源に結合される２つの電極を含む電気回路を遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の近傍に配置し、２つの電極の間に電圧を印加することにより電場を印加することをさらに備える。
【0023】
いくつかの様態において、分泌されたＥＳエフェクター細胞の量は、電気刺激により遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞に印加された電場及び印加された電気刺激の持続時間の関数として提供される。
【0024】
いくつかの様態において、方法は、電気刺激の電圧、合計持続時間、パルス持続時間、及び周波数の少なくとも１つの関数として、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を活性化させることをさらに含む。
【0025】
様々な実施形態は、付される図面に関連して、以下の詳細な説明を考慮してより完全に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【0041】
【0042】
【0043】
【発明を実施するための形態】
【0044】
以下の詳細な説明において、本明細書の一部を構成し、本開示が実施され得る特定の実施例の説明として例示される、付される図面を参照する。他の実施例が利用可能であり、本開示の範囲から逸脱せずに様々な変更を加えることができる点が理解される。従って、以下の詳細な説明は限定的な意味で捉えられるものではなく、本開示の範囲は付される請求の範囲により画定される。特別記載しない限り、本明細書において説明される様々な実施例は、その一部又は全部を互いに組み合わせることができることが理解される。
【0045】
いくつかの様態において、細胞は、アクチュエーター要素、エフェクター要素、及び電気刺激を介して細胞内転写機構を制御する電位依存性カルシウムイオンチャンネル（ＣａＶ）を含む遺伝的要素を発現するように操作可能であり、本明細書において「遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞」と呼称される。ＣａＶは、電気感受性であり、電気刺激（例えば、特定の電気パルス）に応答して、細胞はアクチュエーター要素及びエフェクター要素を介して１つ以上の特定のタンパク質に至る下流経路を活性化させる。ＥＳエフェクター細胞の遺伝的要素はモジュール化可能であってよく、及び／又は細胞は様々なイン・ビトロ、エクス・ビボ、及びイン・ビボ応用のためのベクターとして機能する能力を有する遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を産出する複数の遺伝的要素を含んでいてよい。そのような細胞は、部分的に保存できるという点でモジュール化可能であり、異なる応答のために部分的に変更である。複数の種類の遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、イン・ビボにおいて複雑な疾患を治療対象とするための強固で再現性のある細胞システムを提供可能である。また、そのような遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、様々な用途において、信頼性の高いイン・ビボイメージング技術や、信頼性の高いイン・ビトロセンサー技術を提供する。
【0046】
本開示に係る実施形態は、異なる標的タンパク質のバイオ工場として機能する細胞シャーシ又はベクターとして使用される、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を対象とする。本明細書において使用されるバイオファクトリーは、１つ以上のタンパク質を産生するように遺伝子操作された生体細胞を含む及び／又は指し、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞と互換的に呼称されてよい。遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、電気刺激に応答し、特定のタンパク質又は複数のタンパク質の発現を活性化する。遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、重症の疾患を治療するための治療薬として使用されてよく、また、免疫系を回避する又はその誤作動を伴う癌、新興病原体等を含む軽度／中度から重度の疾患の進行を予防するための予防薬として使用されてよい。いくつかの実施形態において、バイオ工場は、生物兵器による攻撃が流行した際に、各ウイルス病原体に特異的なワクチンを開発する必要なく、体外装置を使用して迅速に配備及び活性化することができる広域スペクトルの抗ウイルス細胞の備蓄を容易に利用可能にできる。
【0047】
本明細書において使用する際、「遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞」及び／又は「ＥＳエフェクター細胞」は、各々がモジュール性である（ｉ）電気センサー要素、（ｉｉ）アクチュエーター要素、及び（ｉｉｉ）エフェクター要素を有するように遺伝子操作された又は組み換えされたＮＫ細胞を含む及び／又は指す。本明細書において使用する際、「モジュール」及び「モジュール性」の用語は、細胞へ導入するために様々な組み合わせで組み立てられた際の組み換え配列ドメイン及び得られる組み換えポリペプチドに関連する汎用性を含む及び／又は指す。
【0048】
本明細書において使用する際、「電気センサー要素」は、タンパク質を合成するために使用され得る、電気刺激に応答して閉状態から開状態へと遷移するように構成されるＣａＶをコードするポリヌクレオチド配列を含む及び／又は指す。ＣａＶは、チャンネルタイプを定義する細孔形成サブユニットと、細孔形成サブユニットの機能を変化させ、ＥＳエフェクター細胞の細胞膜へのチャンネルの輸送を制御する補助サブユニットのセットとを含むヘテロ多量体タンパク質複合体である。様々な実施形態において、ＣａＶは、エフェクター細胞の表面にチャンネルを形成するように構成される細孔形成サブユニット（例えば、α１）と、ＣａＶのチャンネル開口の遷移を制御し、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の表面へとＣａＶを輸送するように構成された補助サブユニットのセット（例えば、α２δ及びβサブユニット）とを含む。ＣａＶは、通常はＣａＶの細孔様チャンネルが閉じた閉状態にあり、電気刺激に応答して、細孔様チャンネルが開き、遺伝子操作ＥＳエフェクター細胞へのＣａ２＋の流入を可能にする開状態へと遷移する。本明細書でさらに説明するように、Ｃａ２＋の流入は、転写及び翻訳イベントを開始する転写因子結合部位をコードするアクチュエーター要素の活性化を介して、イン・シチュにおいて、本明細書ではしばしば「エフェクタータンパク質」と呼称されることもある操作されたタンパク質の合成を誘発する。
【0049】
本明細書において使用する際、「アクチュエーター要素」は、トリガーシグナル（例えば、電気刺激に応答するＣａＶの遷移）の下流で転写及び翻訳イベントを開始する転写因子結合部位をコードするポリヌクレオチド配列を含む及び／又は指す。一般に、アクチュエーター要素の基礎となる分子メカニズムは、細胞内カルシウム［Ｃａ２＋］ｉの動態に基づき、これは、ほぼ全ての種類の細胞がその機能を制御するために使用するメカニズムである。応答要素は、ＮＦＡＴ（「活性化Ｔ細胞の核因子」）応答要素（ＮＦＡＴ－ＲＥ）、血清応答要素（ＳＲＥ）、及びサイクリックＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）を含むが、これらには限定されない。
【0050】
本明細書において使用する際、「エフェクター要素」は、エフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、そしていくつかの例ではシグナルペプチドに作動可能に連結したエフェクタータンパク質を含む及び／又は指す。例えば、エフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ヒト遺伝子に由来する配列、非ヒト種の遺伝子に由来する配列、組み換え配列、検出可能なレポーター分子をコードする配列、検出可能なイメージング分子をコードする配列、及び治療用分子をコードする配列等である。
【0051】
電気センサー要素、アクチュエーター要素、及びエフェクター要素が導入される遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、ヒト細胞又は非ヒト細胞（例えば、哺乳類、爬虫類、植物等）を含む任意の細胞タイプであってよい。この態様において、モジュール要素の遺伝子組み換えされた細胞「ソース」は、とりわけ、電気センサー要素、アクチュエーター要素、及びエフェクター要素の発現及び提示のための転写及び翻訳機械を提供する細胞シャーシ又はフレームを提供する。いくつかの実施形態において、ＥＳエフェクター細胞は、ソース（例えば、一人目のヒト）に由来し、改変され、ソースとは異なる生物（例えば、二人目のヒトである宿主）に投与されてよい。他の実施形態において、エフェクター細胞は、ソース（例えば、一人目のヒト）に由来し、改変され、ソース（例えば、ソースが宿主である）に戻すように投与されてよい。
【0052】
様々な異なる種類の細胞が遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を形成するために改変されてよい。例えば、エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含んでよい。使用され得る他の細胞タイプは、他の免疫細胞（例えば、プライマリーＴ細胞、ナチュラルキラー細胞）、間葉系幹細胞、造血幹細胞、上皮細胞、ＨＥＫ２９３細胞、及びＣＨＯ細胞等を含むが、それらに限定されない。
【0053】
モジュール性に加えて、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、モジュール要素の一部又は全ての複数（例えば、２つ以上）を提供することにより、様々な応用のために改変することができる。例えば、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、複数のアクチュエーター要素（例えば、２つ以上のアクチュエーター要素）及び／又はエフェクター要素（例えば、検出可能なレポーターポリペプチド、検出可能なイメージングポリペプチド、及び治療用ポリペプチド）を含むように設計されてよい。いくつかの場合において、多重性は、疾患を治療又は予防するための複数の治療「課題」を提供するために、複数のＥＳエフェクター細胞（例えば、複数の細胞）を被験体に提供する形をとる。このような遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の人工的な細胞シグナル伝達経路は、遺伝子操作されたESエフェクター細胞が電気刺激によってトリガーされた時に、較正量のタンパク質ベースの治療薬を産生し、意図されたオートクリン及びパラクリンシグナル伝達を誘導することにより、ベクターとして機能する能力を導入することができる。遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、全身毒性を制限することにより、より良い患者の転帰のために、標的部位、標的時間、及び／又は治療期間の延長において生物製剤の集中的合成を可能にする。
【0054】
図面を参照すると、図１は、本開示に係る、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の例を示す。本明細書において参照を容易にするために通常「ＥＳエフェクター細胞」と呼称される遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞１００は、遺伝的要素１０２、１０６、１１０を異なる目的のために及び異なるエフェクタータンパク質を合成するために調整可能であるという点でモジュール化できる。
【0055】
ＥＳエフェクター細胞１００は、電気センサー要素１０２と、アクチュエーター要素１０６と、エフェクター要素１１０と、を作動的に関連して含む外因性ポリヌクレオチド配列１０１を備える。様々な異なる種類の細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、多能性幹細胞、上皮細胞、又はＫ５６２細胞等のＥＳエフェクター細胞１００を生成するために使用されてよい。ＥＳエフェクター細胞１００を生成するために改変された細胞は、構造的及び機能的要素を含む基本的な膜結合ユニット等の、生物由来の生細胞含んでよい。いくつかの実施形態において、外因性ポリヌクレオチド配列１０１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２〜１７から選択されてよい。しかしながら、実施形態はそれほど限定されず、外因性ポリヌクレオチド配列１０１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１７に記載される配列の１つに対して少なくとも８０パーセント（％）、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有する配列等の他の配列を含んでよい。
【0056】
電気センサー要素１０２は、ＣａＶ１０４をコードする。本明細書において使用する際、ＣａＶは、ＥＳエフェクター細胞１００の細胞表面にチャンネルを形成する人工的に構築されたヘテロ多量体複合体を含む及び／又は指す。ＣａＶ１０４は、電気刺激に応答して閉状態から開状態へと遷移するように構成される。例えば、ＣａＶ１０４は、しばしばα１と呼称される細孔形成サブユニット１０３と、補助サブユニット１０７のセットとを含む。細孔形成サブユニット１０３は、エフェクター細胞の表面にチャンネルを形成するように構成される。細孔形成サブユニット１０３の例は、ＣａＶ１．２及びＣａＶ１．３を含む。細孔形成サブユニット１０３の他の例は、ＣａＶ１．１、ＣａＶ２．１、ＣａＶ２．２、ＣａＶ２．３、ＣａＶ３．１、ＣａＶ３．２、及びＣａＶ３．３を含む。補助サブユニット１０７のセットは、ＣａＶ１０４の開状態（チャンネルの開口）への遷移を制御し、ＥＳエフェクター細胞１００の表面にＣａＶ１０４を輸送するように構成される。補助サブユニットの例は、α２δ及びβサブユニットを含む。いくつかの実施例において、補助サブユニットのセットは、α２δ１及びβ３サブユニットを含む。いくつかの実施形態において、細孔形成サブユニット１０３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２によりコードされる及び／又はそれらを含んでよい。いくつかの実施形態において、補助サブユニット１０７のセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５等のそれらの組み合わせによりコードされる及び／又はそれらを含む。このように、いくつかの実施形態において、電気センサー要素１０２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の組み合わせを含んでよい。しかしながら、実施形態はそれらに限定されず、電気センサー要素１０２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～５に記載される１つ以上の配列に対して少なくとも８０パーセント（％）、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有する配列等の他の配列を含んでよい。
【0057】
閉状態において、ＣａＶ１０４のチャンネルは閉じられていてよい。電気刺激に応答して、ＣａＶ１０４は、チャンネルが開いており、Ｃａ２＋イオンがチャンネルを通って移動できる開状態へと遷移する。開状態は、細胞内Ｃａ２＋放出のために内部Ｃａ２＋貯蔵を動員できる。以下にさらに述べるように、Ｃａ２＋の流入はＥＳエフェクター細胞１００を活性化し、エフェクタータンパク質１１２の合成を引き起こす。本明細書でさらに説明するように、合成は電気刺激に応答するため、合成されるエフェクタータンパク質１１２の量は、電気刺激により制御できる。
【0058】
アクチュエーター要素１０６は、転写因子結合部位１０８をコードする。本明細書においてさらに説明されるように、ＥＳエフェクター細胞１００は、電気刺激に応答するＣａ２＋の流入とＣａＶ１０４の開状態への遷移とを引き起こすことにより活性化するように構成され、Ｃａ２＋の流入は転写因子結合部位１０８（例えば、核因子）を活性化し、エフェクタータンパク質１１２の合成をアップレギュレートする。転写因子結合部位１０８は、ＣａＶ１０４の開状態への遷移に応答してエフェクタータンパク質１１２の合成をアップレギュレートするタンパク質のための部位を含む及び／又は指す。転写因子結合部位１０８は、上記のように、電気刺激及びＣａＶ１０４の遷移に応答して放出される［Ｃａ２＋］によりトリガーされる転写因子に結合してよい。いくつかの実施形態において、転写因子結合部位１０８は、ＮＦＡＴ－ＲＥ、血清応答要素（ＳＲＥ）、及びサイクリックＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）から選択される。それにより、アクチュエーター要素１０６は、［Ｃａ２＋］によりトリガーされる因子を結合するための配列を含んでよく、［Ｃａ２＋］ｉの上昇に応答してエフェクタータンパク質１１２の増幅された合成をトリガーできる。
【0059】
いくつかの実施形態において、アクチュエーター要素１０６は、転写因子タンパク質のための少なくとも１つのＮＦＡＴ転写因子結合部位をコードする。いくつかの実施例において、アクチュエーター要素１０６は、少なくとも２つの転写因子結合部位、３つの転写因子結合部位、又は６つの転写因子結合部位等の複数の転写因子結合部位をコードする。ＮＦＡＴ転写因子ファミリーは、ＮＦＡＴｃ１、ＮＦＡＴｃ２、ＮＦＡＴｃ３、ＮＦＡＴｃ４、及びＮＦＡＴ５の５つの部分から成る。Ｓｈａｒｍａ Ｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＮＡＳ、１０８（２８）；Ｈｏｇａｎ ＰＧ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２８；Ｒａｏ Ａ、Ｈｏｇａｎ ＰＧ （２００９） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ、２３１（１）；ＲａｏＡ（２００９年）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１０（１）Ｍ．Ｒ．Ｍüｌｌｅｒ及びＡ．Ｒａｏ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１０、１０、６４５～６５６；Ｍ．Ｏｈ－Ｈｏｒａ及びＡ．Ｒａｏ、Ｃｕｒｒ、Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００８、２０、２５０～２５８．Ｃｒａｂｔｒｅｅ＆Ｏｌｓｏｎ ＥＮ（Ａｐｒ２００２）、Ｃｅｌｌ１０９Ｓｕｐｐｌ（２）：Ｓ６７～７９に記載されており、これらの文献は、それぞれ、その教示のためにその全体が本明細書に組み込まれる。ＮＦＡＴｃ１からＮＦＡＴｃ４は、カルシウムシグナルにより制御される。既知のカルシウムセンサータンパク質であるカルモジュリンがセリン／スレオニンホスファターゼカルシニューリンを活性化するため、カルシウムシグナル伝達はＮＦＡＴの活性化に不可欠である。（図２にさらに示されるように）この戦略の基礎となる分子メカニズムは、細胞内カルシウムＣａ２＋（［Ｃａ２＋］ｉ）の動態に基づく。［Ｃａ２＋］ｉの動態は、ほぼ全ての種類の細胞に共通であり、従って、実施形態は広く適用可能である。ＣＡＲを介した細胞の刺激による［Ｃａ２＋］ｉの上昇は、（Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性セリンホスファターゼカルシニューリンを介した）活性化されたＥＳエフェクター細胞１００の核因子の脱リン酸化をもたらし、その後、核に移動し、ＮＦＡＴ－ＲＥと相互作用してエフェクタータンパク質１１２の発現をアップレギュレートする。並行して、ＮＦＡＴ－ＲＥは、活性化されたＥＳエフェクター細胞１００においてインターロイキン－２を誘導するという本来の機能を果たす。
【0060】
エフェクター要素１１０は、エフェクタータンパク質１１２をコードし、いくつかの実施形態において、シグナルペプチド１１４に作動可能に連結するエフェクタータンパク質１１２をコードする。本明細書でさらに示されるように、いくつかの実施形態において、シグナルペプチド１１４は、エフェクタータンパク質１１２の上流にある。シグナルペプチド１１４は、エフェクタータンパク質１１２に対して非天然状態であってよい。例えば、エフェクタータンパク質１１２は、シグナルペプチド１１４の付加なしに細胞外環境へと分泌され得ない。しかしながら、実施形態はそれほど限定されず、いくつかの実施形態において、エフェクタータンパク質１１２は、天然状態のシグナルペプチドを含む。例えば、エフェクタータンパク質１１２は、シグナルペプチド１１４を（天然状態で）含んでよい。他の実施例において、エフェクタータンパク質１１２の天然状態のシグナルペプチドは、除去され、非天然状態のシグナルペプチド１１４が付加されてよい。いくつかの実施形態において、エフェクタータンパク質１１２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０によりコードされる及び／又はそれらを含んでよい。このように、いくつかの実施形態において、エフェクター要素１１０は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の１つ以上を含んでよい。しかしながら、実施形態はそれほど限定されず、エフェクター要素１１０は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６～１０に記載される配列の１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有する配列等の他の配列を含んでよい。
【0061】
本明細書において使用する際、「分泌体」、「分泌ペプチド」、及び「シグナルペプチド」の用語は、互換的に使用され、合成されたエフェクタータンパク質１１２を細胞外環境へと補助又は誘導する（例えば、エフェクター要素１１０の移動を補助）ペプチドを含む及び／又は指す。シグナルペプチド１１４は、細胞外環境への放出のために、エフェクタータンパク質１１２に作動可能に連結又は融合されてよい。このように、シグナルペプチド１１４は、エフェクタータンパク質１１２の移動をＥＳエフェクター細胞１００の外側へと向けることができる。シグナルペプチド１１４は、天然に移動できない及び／又は最小限の移動しかできないエフェクタータンパク質１１２を発現するＥＳエフェクター細胞１００に含まれる場合に特に有益であり、エフェクタータンパク質１１２は、シグナルペプチド１１４の不在下でＥＳエフェクター細胞１００内に留まることができる及び／又は閾値未満の速度で移動できる。一般に、シグナルペプチドは、新生分泌タンパク質のＮ末端に位置し、３つのドメイン：（１）Ｎ末端の基本ドメイン、（２）中央の疎水性コア、（３）カルボキシ末端の開裂領域を特徴的に有する。任意の適切なシグナルペプチドが使用されてよい。例えば、シグナルペプチド１１４は、インターロイキン－６又はインターロイキン－２のシグナルペプチドであってよい。
【0062】
様々な実施形態において、ＣａＶ１０４の開状態への遷移に応答して、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞１００は、活性化し、エフェクタータンパク質１１２を合成及び分泌するように構成される。例えば、本明細書においてさらに記載されるように、ＥＳエフェクター細胞１００は、印加された電気刺激及び印加された電気刺激の持続時間の関数として、エフェクタータンパク質１１２を合成及び分泌し得る。
【0063】
エフェクタータンパク質１１２は、様々な異なる種類のタンパク質を含んでよい。例えば、エフェクタータンパク質１１２は、検出可能なレポータータンパク質、治療用タンパク質、下流シグナル伝達タンパク質、及びそれらの組合せを含んでよい。本明細書において使用する際、検出可能なレポータータンパク質は、光学的、電気的、又は他の種類の検出可能なシグナルを提供するタンパク質等の発現時に検出可能なタンパク質を含む及び／又は指す。検出可能なレポータータンパク質の例は、ルシフェラーゼ又はその生物発光変異体、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその蛍光変異体、及びｌａｃＺ又はその比色変異体を含む。治療用タンパク質は、宿主及び／又は患者等の対象に治療効果を提供するタンパク質を含む及び／又は指す。治療用タンパク質の例は、抗ウイルス性タンパク質、抗腫瘍性タンパク質、細胞毒性タンパク質、免疫刺激性タンパク質、及び免疫抑制性タンパク質等を含む。下流シグナル伝達タンパク質は、細胞成長、増殖、分化、及びアポトーシスの制御等のシグナル伝達経路の下流要素を駆動するタンパク質を含む及び／又は指す。
【0064】
エフェクタータンパク質の非限定的な例は、細菌由来の細胞毒性ポリペプチド（例えば、パラスポリン、プランタリシンＡ）；昆虫由来（例えば、ポリビア－ＭＰ１）；ウイルス由来の抗ウイルスポリペプチド（例えば、αヘリックスペプチド（ＡＨＰ））；ウイルス由来の抗ウイルスポリペプチド（例えば、抗ウイルスペプチド（ＡＶＰ））；真菌由来の免疫抑制ペプチド（例えば、コルテリンＡ）；血管拡張剤（例えば、レラキシン、ブラジキニン）及びエンドペプチダーゼ（例えば、ヘパラナーゼ、レラキシン、コラゲナーゼ）；並びに細胞透過性カチオン性ペプチド（例えば、ＬＬ－３７、ＴＡＴペプチド）を含む。
【0065】
上記のように、いくつかの実施形態において、エフェクタータンパク質１１２は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、標的細胞に直接作用してよい。別の実施形態において、治療用タンパク質は、標的細胞に隣接する細胞、又は非細胞成分に作用してよい。治療用タンパク質の例は、細胞毒性タンパク質、抗腫瘍性タンパク質、免疫刺激タンパク質、及び免疫抑制タンパク質を含む。
【0066】
いくつかの特定の実施例において、エフェクタータンパク質１１２は、抗ウイルス性タンパク質を含む治療用タンパク質を含む。例えば、エフェクタータンパク質１１２は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＩＩ型ＩＦＮ、及びそれらの組み合わせを含んでよく、患者のウイルス感染を治療するために使用されてよい。例えば、エフェクタータンパク質１１２は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に感染した細胞を殺すあるいはそれに対して作用するように構成される治療用タンパク質を含んでよい。しかしながら、実施例はそれほど限定されない。
【0067】
ＥＳエフェクター細胞１００の遺伝子要素１０２、１０６、１１０の異なる部分はモジュールであってよく、他の部分は保存されてよい（例えば、異なる実装例においても変更しなくてよい）。例えば、いくつかの実施形態において、電気センサー要素１０２、アクチュエーター要素１０６、及び任意のシグナルペプチド１１４は定常ドメインであり、エフェクタータンパク質１１２は可変ドメインである。一例として、エフェクタータンパク質１１２は異なるタンパク質のイン・シチュ合成を引き起こすために変更できるが、電気センサー要素１０２、アクチュエーター要素１０６、及び／又はシグナルペプチド１１４は異なる実装例において同じままである。部分を保存しておくことにより、生成時間を短縮できる。しかしながら、実施態様はそれほど限定されず、ＥＳエフェクター細胞１００の任意の部分を改変してよい。
【0068】
いくつかの実施形態において、ＥＳエフェクター細胞１００は、遺伝子要素１０２、１０６、１１０の一部又は全ての内の複数（例えば、２つ以上）を含んでよい。例えば、ＥＳエフェクター細胞１００は、複数のアクチュエーター要素１０６及び／又は複数のエフェクター要素１１０を含んでよい。いくつかの実施形態において、多重性は、疾患を治療又は予防するための及び／又は研究等の他の目的のための複数の作業を提供するために、本明細書に記載されるように改変した複数の遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞（例えば、複数の細胞）を宿主に提供する形態をとる。
【0069】
いくつかの実施形態において、外因性ポリヌクレオチド配列１０１は、２つ以上のエフェクタータンパク質をコードする。例えば、外因性ポリヌクレオチド配列１０１は、検出可能なレポーターペプチドをさらにコードしてよい。いくつかの実施形態において、ＥＳエフェクター細胞１００は、検出可能なレポーターペプチドをコードする追加のエフェクター要素を含む、及び／又はエフェクター要素１００は、検出可能なレポーターペプチドをさらにコードしてよい。例えば、検出可能なレポーターペプチドは、２Ａリンカーペプチドによりエフェクタータンパク質１１２に連結してよい。いくつかの実施形態において、エフェクター要素１１０は、２Ａリンカーペプチドにより連結された２つの治療用タンパク質等の複数の治療用タンパク質を含んでよい。本明細書において使用する際、２Ａリンカーペプチドは、タンパク質複合体が独立して折り畳まれる２つのタンパク質に翻訳されるように、細胞内のタンパク質複合体の翻訳（例えば、２Ａリンカーペプチドにより連結された２つのタンパク質又はペプチドをコード）中にリボソームスキップを誘発するペプチドを含む及び／又は指す。２Ａリンカーペプチドの例は、Ｆ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＴ２Ａ等を含む。このようなペプチドは、一般に、１８～２２アミノ酸長であり、ウイルスに由来してよい。
【0070】
いくつかの実施形態において、アクチュエーター要素１０６は、エフェクター要素１１０に関連する又は結合する。いくつかの実施形態において、外因性ポリヌクレオチド配列１０１は、エフェクター要素１１０に関連する又は結合するアクチュエーター要素１０６を含む。電気センサー要素１０２は、エフェクター要素１１０又はアクチュエーター要素１０６のいずれかに関連する又は結合する。例えば、電気センサー要素１０２は、エフェクター要素１１０及びアクチュエーター要素１０６と同じプラスミド上の任意の部分に配置されてよく、電気センサー要素１０２は、細胞を遺伝子操作してＥＳエフェクター細胞１００を形成するために使用される、異なる別のプラスミド上に配置されてもよい。例えば、外因性ポリヌクレオチド配列１０１は、エフェクター要素１１０の上流にあるアクチュエーター要素１０６と、電気センサー要素１０２の上流又は下流にあるエフェクター要素１１０を含んでよい。（非天然状態の）シグナルペプチド１１４を含む実施例において、シグナルペプチド１１４は、エフェクタータンパク質１１２の上流にある。
【0071】
図２は、本開示に係る、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞及びイン・シチュにおいてトリガーされる一連のイベントの例を示す。説明を容易にするために本明細書において基本的に「ＥＳエフェクター細胞２００」と呼称される遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞２００は、抗ウイルス性タンパク質（ＡＶＰ）により示される人工的な細胞シグナル伝達経路を使用してエフェクタータンパク質２１２を合成するための、及び／又は一連のイベント２２０をトリガーするためのリビングベクターとして使用される又はそのように作用し得る。２２４で示されるように、ＥＳエフェクター細胞２００は、電気刺激との相互作用時に、イン・シチュにおいて、エフェクタータンパク質２１２を合成する。
【0072】
上記のように、ＥＳエフェクター細胞２００は、細孔形成サブユニット２０３と補助サブユニットのセット２０７－１、２０７－２とを含むＣａＶ２０４をコードする電気センサー要素と、少なくとも１つの転写因子結合部位（例えば、ＮＦＡＴ）をコードするアクチュエーター要素２０６と、エフェクタータンパク質２１２及び任意にシグナルペプチド２１４をコードするエフェクター要素２１０とを含むポリヌクレオチド配列２０１を備える。ＥＳエフェクター細胞２００は、シス配置される３つの定常ドメイン（例えば、アクチュエーター要素２０６、シグナルペプチド２１４、及び電気センサー要素）及び可変ドメイン（例えば、エフェクタータンパク質２１２）を備える単一のプラスミド（例えば、それぞれを含む単一の構築物）を備えてよい。他の実施形態において、ＥＳエフェクター細胞２００は、アクチュエーター要素２０６及びエフェクター要素２１０を備える第１のプラスミドと、電気センサー要素を備える第２のプラスミド等の複数のプラスミドを備えてよい。
【0073】
定常ドメインは、ＥＳエフェクター細胞２００に機能性を提供するように構成されてよい。定常ドメインは、細胞内シグナル伝達経路の一部を形成し、エフェクター導入遺伝子を細胞外空間２２３に輸送することを補助するシグナルペプチド２１４に任意に融合されてよいエフェクタータンパク質２１２をアップレギュレートするためにカルシウム依存性転写機械（例えば、アクチュエーター要素２０６）を動員するＣａＶ２０４を含む。
【0074】
可変ドメインは、様々な異なる疾患、標的細胞、治療、及び／又は他の用途へのＥＳエフェクター細胞２００の適用可能性を担い得る。例えば、可変ドメインは、ＥＳエフェクター細胞２００に特定の疾患に対する特異性を付与できる。いくつかの実施形態において、エフェクタータンパク質２１２は、ＥＳエフェクター細胞２００を活性化した病理を中和し、既製のリビングベクターを本質的に作製する等のために、異なる治療用導入遺伝子によりＥＳエフェクター細胞２００を再プログラムするように交換又は修正されてよい。
【0075】
図２は、Ｉ型ＩＦＮ－β１発現のための電気応答性人工シグナル伝達経路を含むように操作された特定の実施例の細胞２００（ＩＦＮ－βを有するＥＳエフェクター細胞）を示す。いくつかの実施例において、Ｋ５６２細胞株は、ＥＳエフェクター細胞２００を形成するように改変される。図２を参照すると、細胞は、ＣａＶ２０４を含むように操作される。ＣａＶ２０４は、本明細書において細孔形成サブユニットと呼称されることもあるＣａＶ１．２又はＣａＶ１．１等のＬ型電位依存性Ｃａ２＋チャンネルと、α２β１、β２、又はβ３等の補助サブユニット２０７－１、２０７－２とを含んでよい。補助サブユニット２０７－１、２０７－２は、チャンネルの開閉を制御し、チャンネルを細胞表面に輸送することにより、Ｃａ２＋流入を増加させる。
【0076】
いくつかの実施例において、ウイルスの攻撃を阻止するために進化したＩＦＮベースの自然免疫を活性化するために、電気刺激が使用される。ＩＦＮをコードするＥＳエフェクター細胞２００は、病原性ウイルスによりしばしばハイジャックされるＩＦＮシグナル伝達を活性化するパターン認識受容体の抗原刺激を回避するための治療薬及び／又はワクチンとして使用されてよい。標的特異的なメモリー細胞及び抗体を生成することをウイルス抗原サブユニットに依存する現在のワクチンアプローチとは異なり、ＥＳエフェクター細胞２００は、各ウイルスに特異的な改変を必要しない普遍的な介入であり、代替的なＩＦＮ合成経路を提供することにより汎ウイルス免疫を発揮する。いくつかの実験的な実施形態において、以下にさらに説明されるように、哺乳動物細胞株が、電気刺激されると、Ｉ型ＩＦＮ応答をリクルートして、多くの病原性ウイルスが破棄するように進化したものを補う電圧感受性人工シグナル伝達経路を有するように操作された。電気刺激は、ウイルスがハイジャックするために進化することのない非天然経路をトリガーし、その結果、生産を制御する生来の経路からＩＦＮ合成を切り離す。このアプローチは、自然免疫を活性化する既存の直接ＩＦＮ注入方法とは一線を画すものである。
【0077】
図２に示されるように、１において、静止している及び電気刺激がない時、２２２においてＣａＶ２０４は閉状態にある。２において、ＥＳエフェクター細胞２００の近傍に電気刺激が提供され、これにより、３に示されるように、ＣａＶ２０４が開状態へと遷移する。４に示されるように、開状態は、電気刺激によりトリガーされるＣａ２＋の流入を吹き起こし、ＮＦＡＴ転写因子を活性化する第２のメッセンジャーシステムとして機能し、ＮＦＡＴ転写因子を、アクチュエーター要素２０６のＮＦＡＴ転写因子と相互作用する核へと輸送して、細胞２００を活性化する。これにより、細胞２００の転写機械が動員され、抑制の観点において臨床的な利点を示すトランスジェニックにコードされたエフェクタータンパク質２１２、この場合は１型ＩＦＮ－β１、が合成される。活性化に応答して、５に示されるように、エフェクタータンパク質２１２は、ＮＦＡＴにより転写及び翻訳され、６において、シグナルペプチド２１４が切断され、エフェクタータンパク質２１２が細胞外空間２２３へと輸送される。いくつかの実施形態において、エフェクタータンパク質２１２は、細胞に作用する、又はウイルスに感染した細胞を殺す等の作用をしてよい。
【0078】
図３は、本開示に係る、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の集団の例を示す図である。集団３３１は、複数の遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞３００－１、３００－２、３００－３、３００－４、３００－５、３００－６、３００－Ｎ（本明細書において、参照を容易にするために「ＥＳエフェクター細胞３００」として概して参照する）を含んでよい。ＥＳエフェクター細胞３００の各々は、図１のＥＳエフェクター細胞１００と少なくとも実質的に同じ特徴及び成分を含んでよく、説明を容易にするためにその詳細は繰り返さない。
【0079】
図３に示される実施例において、環境は、疾患環境と呼称できる、（複数の）標的細胞を含む（存在する）細胞外空間３３０である。しかしながら、実施例はそれほど限定されず、環境は、電気刺激３３２が印加されてよい特定の組織、身体の位置、又は他のイン・シチュ環境に関連してよい。ＥＳエフェクター細胞３００の集団３３１は、電気刺激３３２に応答して活性化し得る。例えば、電気刺激３３２に応答して、ＥＳエフェクター細胞３００のＣａＶは開状態に遷移し、応答して、ＥＳエフェクター細胞３００が活性化してエフェクタータンパク質を合成する。いくつかの実施例において、ＥＳエフェクター細胞３００は、校正量のエフェクタータンパク質を提供してよい。例えば校正量のエフェクタータンパク質は細胞外環境３３０又はサンプルに印加される電気刺激及び印加された電気刺激の持続時間の関数であってよい。細胞外環境３３０は、ＥＳエフェクター細胞３００を示すが、さらに、細胞外環境３３０は、他の非細胞成分のうち、正常細胞及び／又は疾患細胞等の複数の（宿主）細胞を含んでよい。
【0080】
図４は、本開示に係る、複数の細胞を遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞に接触させる方法の例を示す。方法４４０は、図１に示されるＥＳエフェクター細胞１００及び／又は図３に示されるＥＳエフェクター細胞３００の集団３３１を使用して実装できる。
【0081】
４４２において、方法４４０は、複数の細胞を遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞と接触させることを含む。細胞は、サンプルに接触させる、又は遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を患者等の宿主に投与することにより接触させることができる。遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、図１の遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞１００により上記において説明されたものと実質的に同じ特徴及び成分の少なくともいくつかを含むことができ、参照を容易にするためにその詳細は繰り返さない。例えば、そして上記のように、ＥＳエフェクター細胞は、細孔形成サブユニットと補助サブユニットのセットとを含むＣａＶをコードする電気センサー要素と、転写因子結合部位をコードするアクチュエーター要素と、エフェクタータンパク質をコードするエフェクター要素とを備える。
【0082】
４４４において、複数の細胞を遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞に接触させたことに応答して、方法４４０は、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞に電場を印加してＣａＶを電気刺激することを含む。いくつかの実施形態において、電場は、電気回路を使用して印加される外因性の電場を含んでよい。電気回路は、外部電源と、電源に結合される２つ（以上）の電極とを含んでよい。方法４４０は、電源に結合される２つの電極を含む電気回路を遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の近傍に配置し、電源を使用して２つの電極の間に電圧を印加することにより電場を印加することをさらに含む。
【0083】
４４６において、電気刺激に応答して、方法４４０は、ＣａＶを閉状態から開状態へと遷移させ、アクチュエーター要素によりエフェクタータンパク質の発現（例えば、転写及び翻訳）を開始させ、シグナルペプチドによりエフェクタータンパク質を分泌させることと、を含む。上記のように、エフェクタータンパク質は、天然状態又は非天然状態のシグナルペプチドを介して分泌可能である。ＣａＶの開状態への遷移に応答して、方法４４０は、転写因子結合部位（例えば、核因子）を活性化させるＣａ２＋の流入を引き起こし、エフェクタータンパク質を発現させることを含む。
【0084】
いくつかの実施形態において、分泌されたエフェクタータンパク質の量は、電気刺激により遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞に印加された電場及び印加された電気刺激の持続時間の関数として提供される。例えば、遺伝子組み換えされたＥＳ細胞は、電気刺激の電圧、合計持続時間、パルス持続時間、及び周波数の少なくとも１つの関数として活性化し、活性化は、ＣａＶの開状態に関連する。
【0085】
様々な実施形態は、図１のＥＳエフェクター細胞１００及び／又は図３のＥＳエフェクター細胞３００の集団３３１等の、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞と、薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む医薬組成物を対象とする。
【0086】
例えば、医薬組成物等のＥＳエフェクター細胞組成物は、本明細書に記載される複数の遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞及びその許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤（例えば、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、又はそれらの組み合わせ）を備えてよい。そのような組成物を作製する手段は当分野において既知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、Ｍａｃｋ，ｅｄ（１９８０年））。好ましくは、組成物は、生体へのＥＳエフェクター細胞の投与を容易にするように調製される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載の複数のＥＳエフェクター細胞、及び例えば緩衝塩類溶液、好ましくはＨａｎｋｓ緩衝塩類溶液又は生理食塩水を備える。
【0087】
いくつかの実施形態は、図１のＥＳエフェクター細胞１００に記載される成分及び特徴を有するように生きた細胞を遺伝子操作又は遺伝子組み換えする等の、ＥＳエフェクター細胞を形成する方法を対象とする。
【0088】
本明細書に提供される遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞及び細胞組成物は、様々なイン・ビトロ、エクス・ビボ、及びイン・ビボ用途において使用するために有利な特性を有する。例えば、本明細書で提供されるＥＳエフェクター細胞及び細胞組成物のイン・ビトロ用途は、限定されないが、研究である。
【0089】
本明細書に提供される遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞及び細胞組成物のイン・ビボ用途は、限定されないが、疾患部位のイン・ビボイメージング、疾患部位（例えば、卵巣癌の標的療法）又は病原体の感染部位（例えば、デングウイルス、ジカウイルス、西ナイルウイルス、黄熱、ＨＩＶ、又は肝炎ウイルス（例えばＨｅｐＢ、ＨｅｐＣ）に感染した細胞に対する標的療法）における局所療法のための方法を含む。
【0090】
様々な実施形態は、異なるエフェクタータンパク質を同時に分泌するために使用される、異なるエフェクタータンパク質により操作された複数のＥＳエフェクター細胞等の異なる種類の遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞のパネルを対象とする。
【0091】
いくつかの実施形態は、ＣａＶ及び治療用タンパク質を発現する遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を使用して疾患を治療又は予防する方法を対象とする。例えば、本明細書は、ＣａＶ及び治療用タンパク質を発現する遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を投与することを含む方法である。ＣａＶを発現するＥＳエフェクター細胞が投与される疾患は、ＥＳエフェクター細胞が電気刺激により活性化するため、特に限定されない。疾患の例は、癌（例えば、血液癌（白血病）、固形癌）、炎症性疾患／自己免疫疾患（例えば、喘息、湿疹）、肝炎、並びにジカウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザ、及びＨＩＶ等のウイルス、細菌、又は真菌を原因とし、例えば、結核、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌感染症（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌感染症（ＶＲＥ）、及び深在性真菌症等の感染症である。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質を発現する遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、上記の疾患の治療のために標的細胞を低減又は排除するために使用されてよく、すなわち、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原等であり、このような疾患を治療又は予防するために投与される。本明細書において使用する際、「治療する」及び「予防する」という用語及びそれに由来する言葉は、必ずしも１００％又は完全な治療又は予防を意味しない。むしろ、当業者が潜在的に有益又は治療効果を有すると認識する治療又は予防の程度は様々である。この点、本明細書に記載の方法は、哺乳動物における癌の治療又は予防を任意のレベル及び任意の量で提供できる。さらに、例示的な方法により提供される治療又は予防は、治療又は予防される例えば癌等の状態又は症状の１つ以上の治療又は予防を含んでよい。また、本明細書では、「予防」は、疾患、その症状又は状態の発症を遅らせることを包含してよい。
【0092】
いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、本明細書に記載される適切な遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を含む組成物、及び担体、希釈剤又は賦形剤として、それを必要とする宿主（例えば、対象者）に投与される。宿主に改変ＣａＶ発現細胞を提供する任意の適切な方法を、本明細書に記載の方法に使用してよい。いくつかの実施形態において、ＥＳエフェクター細胞を宿主に提供する方法は、ドナー由来の免疫細胞をヒト宿主に注入するための細胞療法及び養子免疫療法の臨床プロトコルから適応させてよい。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法に適する適応された臨床プロトコルは、宿主からＥＳエフェクター細胞を取得することと、本明細書に記載されるＣａＶ及びＮＦＡＴ－ＲＥ制御タンパク質導入遺伝子を発現するようにＥＳエフェクター細胞を遺伝子操作（例えば、改変）することと、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を宿主に注入して戻すこととを含む。本明細書で使用される宿主は、ヒト、動物（例えば、哺乳類、爬虫類、鳥類）、昆虫、植物等の任意の生物を含む及び／又は指し、これらは研究又は試験の対象及び／又は患者となり得る。「対象」はしばしば「宿主」と互換可能に使用される。宿主細胞は、宿主から得られた細胞を含む。
【0093】
本明細書において提供される遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の投与は、静脈内、腫瘍内、筋肉内、皮下、腹腔内、動脈内、又は求心性リンパ管への投与、非経口投与、例えば注射又は注入による投与等の任意の適切な経路により投与することができるが、これらに限定されない。遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞又はそのようなＥＳエフェクター細胞の集団が投与されるいくつかの実施形態において、ＥＳエフェクター細胞は、哺乳動物等の宿主に対して同種又は自家由来である細胞であってよい。好ましくは、ＥＳエフェクター細胞は、宿主に対して自家由来である。
【0094】
いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞が提供される宿主は、増加した（例えば、改善した、より強固な）腫瘍クリアランスについて、又は検出可能なレポータータンパク質の発現を引き起こす電気刺激にトリガーされる別の監視のために、監視又は評価される。様々な実施形態は、癌治療に使用される方法を対象とする。いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞が提供される宿主は、細胞のクリアランスについて監視又は評価され、検出可能なレポータータンパク質は、標的細胞に結合するように構成されてよい。
【0095】
いくつかの実施形態は、目的の病原体の細胞ベースの治療又は予防のための方法を対象とする。そのような方法のために、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、検出可能なレポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の代わりに又はそれに加えて、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、細胞外輸送を補助するポリヌクレオチド配列の３’末端にシグナルペプチド（ｓｅｃ）と融合される。カスケードＥＳエフェクター細胞の活性化イベント及びＮＦＡＴ－ＲＥの活性化がトリガーされると、治療用タンパク質の発現が誘発される。方法は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞、感染細胞）の部位における治療用タンパク質の局所的な生産、及び疾患微小環境における治療用タンパク質の細胞外分泌を含んでよい。
【0096】
本明細書において記載される遺伝子操作された検出可能なレポータータンパク質細胞の追加の用途は、以下を含む。
【0097】
抗癌化学療法プロドラッグを腫瘍部位に標的化するために、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞に酵素的に活性化可能なプロドラッグを装填可能であり、薬剤活性化酵素は電気刺激に応答して合成され、従って、プロドラッグを局所的にその活性形態へと変換することができる。いくつかの実施形態において、プロドラッグはＥＳエフェクター細胞には装填できず、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の注入に続いて複数回投与されてよい。代替的に、プロドラッグは、イメージングナノ粒子又は活性薬物送達の画像誘導手段の他の手段に結合してよい。イメージング導入遺伝子を発現するようにプロドラッグをイメージングナノ粒子に結合させる又はＥＳエフェクター細胞を操作することにより、操作されたＥＳエフェクター細胞は、手術の準備において患者の適切な病期分類を導き、細胞還元手術を補助するために腫瘍縁を視覚的に識別及び／又はイメージングすることができる。
【0098】
いくつかの実施形態は、化学療法剤を疾患の部位（例えば、腫瘍塊、自己免疫疾患の部位）に局所的に送達する方法であって、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を宿主細胞の集団に接触させることを含む方法を対象とし、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、（ｉ）ＣａＶをコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、（ｉｉ）酵素をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結するＮＦＡＴ－ＲＥとを含み、電気刺激に応答して、ＮＦＡＴ－ＲＥを活性化して酵素の発現を開始させ、酵素は、この酵素により活性化するように予め設計されるプロドラッグに作用し、その疎水性に起因する膜透過性を使用して放出される。
【0099】
癌を治療するための外科的介入について、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ変異体）又は生物発光酵素（例えば、ルシフェラーゼ）等の検出可能なレポータータンパク質の発現を介して、腫瘍マージンの可視化及び／又はイメージングに使用できる。例えば、このようなＥＳエフェクター細胞は、外科的切除を補助するために腫瘍縁をマークすること、及び残存する全ての陽性腫瘍マージンを識別することのために使用できる。
【0100】
いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、電気刺激に応答して発現したイメージング酵素（例えば、チミジンキナーゼは放射性プローブあるいはその他の検出可能なプローブを捕捉でき；光音響イメージング又は磁気共鳴イメージングにより検出されるチロシナーゼ）の発現に基づいて腫瘍を非侵襲的に検出及びイメージングするために使用される。
【0101】
いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、フラビウイルスに対するワクチンに関連する安全性の懸念を回避するために使用されてよい。例えば、４つの異なるデングウイルス血清型間の抗原多様性は、抗体媒介免疫の欠如の原因であり、複数の連続感染の可能性がある。一次感染では抗体が有効であるが、二次感染ではその中和度が低下し、急性期の大きな感染細胞塊に対して補体系を活性化させ、出血熱を増悪させることが分かっている。また、先にデング熱に感染しているとジカ熱の感染を悪化させることも判明している。本明細書に記載されるように、ＥＳエフェクター細胞は電気刺激に応答してヒト又は非ヒト又は合成由来の抗ウイルスタンパク質を発現するように操作可能であるため、ＥＳエフェクター細胞を使用することによりフラビウイルスに関するこれらの安全性に関する懸念を回避できる。
【0102】
いくつかの実施形態遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞は、電気刺激に応答して開状態へと遷移するＣａＶと、抗ウイルスタンパク質を誘発するＮＦＡＴ応答要素とを含む。そのような実施形態は、新興病原体（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ジカウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、黄熱ウイルス）を治療する輸血医療に使用できる。
【0103】
他の非限定的な遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の使用例は、以下の：ｉ）外科的切除を補助又は疾患の進行／退行を監視するための疾患微小環境の位置のイメージング；ｉｉ）疾患細胞を殺すための細胞毒性；ｉｉｉ）Ｔ細胞の持続性を高めるための増殖；ｉｖ）他の免疫細胞を補充するための免疫刺激、ｖ）他の免疫細胞を補充するためのケモカイン；ｖｉ）局所的な免疫抑制微環境を作るための免疫抑制；及びｖｉｉ）組織の治癒を高めるための再生、を含む。
【0104】
本明細書において使用する際、標的細胞（しばしば「宿主の標的細胞」、「目的の標的細胞」、「疾患細胞」、又は「標的疾患細胞」と互換的に呼称される）は、生体（例えば、目的の生物学的成分）に関連する目的の細胞を含む及び／又は指す。ＥＳエフェクター細胞は、ヒト及び非ヒト細胞等の様々な異なる種類の細胞から取得可能であり、本明細書において「ソース」と呼称することもある。本明細書において使用する際、「遺伝子組み換え」及び「遺伝子操作」という用語は、互換的に使用され、挿入に使用される方法にかかわらず、外因性ポリヌクレオチドを含む原核細胞又は真核細胞を含む及び／又は指す。いくつかの実施形態において、ＥＳエフェクター細胞は、人の手により（例えば、組み換えデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）技術を使用して）作製又は改変された非自然発生核酸分子を含むように改変される、又は（例えば、転写、翻訳等により）そのような分子に由来する。外因性、組み換え、合成、及び／又はその他の方法で改変されたポリヌクレオチドを含むＥＳエフェクター細胞は、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞であるとみなされる。
【0105】
本明細書において使用する際、「核酸」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸分子」を含む及び／又は指し、一般に、ＤＮＡ又はリボ核酸（ＲＮＡ）のポリマーを意味し、これらは、一本鎖又は二本鎖であり得、合成される又は天然源から得られる（例えば、天然源から単離及び／又は精製）、天然、非天然、又は改変されたヌクレオチドを含んでよく、非改変オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見られるホスホジエステルの代わりにホスホロアミデート結合又はホスホロチオエート結合等の天然、非天然、又は改変したヌクレオチド間結合を含んでよい。いくつかの実施形態において、核酸は、いかなる挿入、欠失、逆位、及び／又は置換も含まない。しかしながら、本明細書において説明されるように、いくつかの実施態様において、核酸が１つ以上の挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を含むことは好適であり得る。いくつかの実施形態において、核酸は、ＣａＶ及びポリヌクレオチドの機能に影響を与えず、宿主細胞による核酸の発現時に翻訳されてもされなくてもよい、追加のアミノ酸配列をコードし得る。
【0106】
核酸は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ．２８０－２８１ （１９８２）及び／又は米国特許出願公開第ＵＳ２００２／０１９０６６３号に記載されているものを含む、任意の適切な方法を使用して取得されてよく、これらの各々は、その教示のために全体が本明細書に完全に組み込まれる。生物学的サンプルから得られた核酸は、典型的には、分析に適した断片を作製するために断片化される。
【0107】
核酸及び／又は他の部位は、単離されてよい。本明細書において使用される際、「単離された」とは、天然に存在する供給源に由来するか合成的に作られるかにかかわらず、通常関連する成分の少なくとも一部から、全体的又は部分的に分離することを含む及び／又は指す。本発明の核酸及び／又は他の部位は、精製できる。本明細書において使用される際、「精製された」は、他の大多数の化合物又は実体から分離されたものを含む及び／又は指す。化合物又は部位は、部分的に精製することも、実質的に精製することも可能である。純度は、重量基準で示すことができ、質量分析、ＨＰＬＣ等であってこれらに限定されない様々な分析技術を使用して特定できる。
【0108】
遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を生成し、ＥＳエフェクター細胞の機能性を特徴付けるために、多くの実験的な実施形態を実施した。遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を生成するために使用された構築物の例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１７に記載されるヌクレオチド配列を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１７は、それぞれ、合成ＤＮＡである。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１７は、ＥＳエフェクター細胞を生成するために使用されるプラスミド配列の例を含み、電気センサー要素、アクチュエーター要素、及びエフェクター要素の例を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～２は、細孔形成サブユニットをコードするための配列の例を提供し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～５は、補助サブユニットをコードするための配列の例を提供し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６～１０は、エフェクタータンパク質をコードするための配列の例を提供する。
【0109】
様々な実験的な実施形態は、Ｉ型ＩＦＮ及びＩＩＩ型ＩＦＮ等のＩＦＮを発現するＥＳエフェクター細胞を形成し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞に対するＩＦＮ－βを有するＥＳエフェクター細胞から産生されたＩ型ＩＦＮ及びＩＩＩ型ＩＦＮの予防及び治療の効果を評価することを対象とする。ＥＳエフェクター細胞の注入に伴う潜在的な発癌関連リスクを軽減するために、ＩＦＮ産生能を損なうことなく細胞を非増殖性にする放射線量（γ線）が検討された。これは、臨床第Ｉ／ＩＩ相試験のために現行の適正製造基準（ｃＧＭＰ）に準拠して製造可能なＩＦＮ－βを有するＥＳエフェクター細胞の安全な投与を保証するものであり、トランスレーショナルアプローチを提示する。レポーター酵素を使用した評価の後、ＩＦＮ産生のためのＥＳエフェクター細胞を産生し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｌｕ－３細胞に対するＩＦＮの抗ウイルス治療効果を評価するために様々な実験が行われた。
【0110】
図５Ａ乃至５Ｄは、様々な実施形態に係る、電気刺激による遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の活性化を特徴付けするプロットの例を示す。いくつかの実験的な実施形態において、感受性及びオフターゲット活性化の観点からＥＳエフェクター細胞の出力を評価するために、レポータータンパク質（ｎルシフェラーゼ）の発現を使用した。２種類のＥＳエフェクター細胞を産生した。第１のＥＳエフェクター細胞は、ｎＬｕｃｉｆｅｒｅｎｃｅのエフェクタータンパク質をコードするエフェクター要素と、６つのＮＦＡＴ－ＲＥをコードするアクチュエーター要素と、ＣａＶ１．２とα２δ１、β３の補助サブユニットとを含むＣａＶをコードする電気センサー要素とを含むように改変され、参照しやすいように一般に「ＣａＶ１．２細胞」と呼ばれる。第２のＥＳエフェクター細胞は、ｎＬｕｃｉｆｅｒｅｎｃｅのエフェクタータンパク質をコードするエフェクター要素と、６つのＮＦＡＴ－ＲＥをコードするアクチュエーター要素と、ＣａＶ１．３とα２δ１、β３の補助サブユニットとを含むＣａＶをコードする電気センサー要素とを含むように改変され、参照しやすいように一般に「ＣａＶ１．３細胞」と呼ばれる。電気センサー要素を含まない細胞を含む対照Ｎｕｌｌを使用した。図５Ａは、電気刺激によるＣａＶ１．２細胞及びＣａＶ１．３細胞の活性化を刺激時間の関数として示す。図５Ｂは、電気刺激によるＣａＶ１．２細胞及びＣａＶ１．３細胞の活性化を印加電圧の関数として示す。図５Ｃは、電気刺激によるＣａＶ１．２細胞及びＣａＶ１．３細胞の活性化を印加された電気刺激の周波数の関数として示す。図５Ｄは、電気刺激によるＣａＶ１．２細胞及びＣａＶ１．３細胞の活性化をパルス持続時間の関数として示す。図５Ｂ乃至５Ｄについて、漏れレポーター発現を補正するために、レポーター発現を非刺激シグナルでバックグラウンド減算した。特に指示がない限り、細胞を１０電圧（Ｖ）、４０ヘルツ（Ｈｚ）、パルス時間２ｍｓｅｃで１６時間刺激した。
【0111】
図６Ａ及び６Ｂは、本開示に係る、レポーター細胞と比較した、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の活性化を特徴付けするプロットの例を示す。図５Ａ及び５Ｂのように、様々な実験において、Ｔ細胞を、ＣａＶ１．２又はＣａＶ１．３と補助サブユニットとをコードする電気センサー要素と、レポータータンパク質をコードするエフェクター要素と、６つのＮＦＡＴ－ＲＥを有するアクチュエーター要素とを含むように改変した。電気センサー要素を含まないレポータータンパク質をコードする対照細胞を作製した。図６Ａ及び６Ｂに示されるように、電気センサー要素を含むように改変されたＴ細胞は、異なる電気刺激Ｖにおいて、レポータータンパク質の発現が対照株よりも大きかった。
【0112】
図９Ａ乃至９Ｃにさらに示されるように、ＥＳエフェクター細胞を活性化又はトリガーする電圧範囲における電気センサー要素の成分に使用及びその定義するためにさらに実験を行った。図９Ａに示されるように、リンパ球におけるＣａ２＋シグナル伝達を媒介する補助サブユニット一式（α２δ１、β３）共発現を使用して、印加電圧を感知するためのＣａＶチャンネル（ＣａＶ１．２、ＣａＶ１．３）を実装した。レポータータンパク質（ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（Ｎｌｕｃ））の発現をエフェクタータンパク質のための代用マーカー（Ｎｌｕｃを有するＥＳエフェクター細胞）として使用し、これは、他の種類のタンパク質の中でも特定の疾患適応に対する治療用タンパク質と交換できる。図９Ｃに示されるように、初期の実験は、細胞生存率に若干の妥協が観察されたものの（図９Ｂ参照）、３０Ｖの閾値がＥＳエフェクター細胞のエフェクタータンパク質発現をトリガーしたことを示した。初期実験中の周波数とパルス持続時間は、２０Ｈｚ及び２ｍｓｅｃで一定に保たれた。エフェクタータンパク質を合成するＥＳエフェクター細胞の電気的活性化は、印加されたＶＥよりも、印加電圧÷電極間隔と定義できる印加電場の関数であった。これは、異なる電極間隔の２つの電極間に細胞が配置された時に細胞をトリガーするＶを比較することにより確認された。追加の実験は、１２ｍｍ（２４ウェルプレート）と比較して、電極間隔２８ｍｍ（６ウェルプレート）には約２．５倍高いＶが必要であることを示した（図１０Ａ及び１０Ｂ参照）。さらに、６ウェルプレートを使用して実験を行った。
【0113】
図７Ａ乃至７Ｄは、本開示に係る、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞からエフェクタータンパク質の発現を駆動するために使用される電気的パラメータの例を示す。ＥＳエフェクター細胞を活性化及び／又はトリガーする電気的パラメータを特定し、電気センサー要素を２つの異なる電圧依存性Ｃａ２＋チャンネル又は細孔形成サブユニット（ＣａＣ１．２、ＣａＶ１．３）から選択するために、様々な実験を使用した。図７Ａは、代表的なデータを示し、ｘ軸は１Ｖの分解能における印加電圧を示す。データは、２９Ｖ～３３Ｖの間の電圧上昇に伴いエフェクタータンパク質の発現が増加したことを示し、この傾向は、ＣａＶ１．２及びＣａＶ１．３チャンネルの電圧依存性ゲーティングにおいて観察されたものと同等である。エフェクタータンパク質の発現は、約３３Ｖであった特定の印加Ｖ値を超えると低下した。調査により、高いＶにおける細胞生存率の低下には潜在的な原因があることが判明した（図１１を参照）。追加実験により、３０Ｖを６０分印加（２０Ｈｚの周波数、２ｍｓｅｃのパルス持続時間）することが最適な刺激であると明らかになった。これは、電気的パラメータの範囲内で刺激した時に細胞生存率（図１２Ｂを参照）を顕著に損なうことなく生細胞数（図１２Ａを参照）で正規化したエフェクタータンパク質の発現において観察された最小変動に基づく。反復的に行われた一連の実験により、最適なエフェクタータンパク質の発現を電気的に誘発するために使用できる異なる工程パラメータの範囲が得られた。
【0114】
エフェクタータンパク質の合成を駆動するパルス持続時間及び周波数の関係を示す代表的なデータが図７Ｂ及び７Ｃにそれぞれ示される。３０Ｖにおいて、２ｍｓｅｃのパルス持続時間及び２０Ｈｚの周波数がＥＳエフェクター細胞をトリガーするために最適であると分かった。ＥＳエフェクター細胞を刺激するためのＶは、刺激周波数の増加に伴い減少した。エフェクターの発現を活性化するために、ＥＳエフェクター細胞を、２ｍｓｅｃのパルス持続時間、２０Ｖで処理し、４５Ｈｚの周波数が必要であった（図１３を参照）。ＥＳエフェクター細胞を１時間刺激することによりエフェクタータンパク質の発現がトリガーされ、これは、ＣａＶ１．２ベースの電気センサー要素について、９時間以内に検出され、４８時間にわたって増加したことが図７Ｄに示される。持続時間後に生細胞の数に対して正規化されたエフェクタータンパク質の発現がｘ軸に図示される（非正規化データについては図１４Ａ及び１４Ｂを参照）。ＣａＶを含まない２つの陰性対照におけるエフェクタータンパク質の発現の減少は、Ｔ細胞における内因性ＣａＶ発現により説明され得る。２つの陰性対照は、補助サブユニットを含む場合と含まない場合のアクチュエーター要素に誘発されたエフェクタータンパク質の発現を含んだ。
【0115】
印加電圧、パルス持続時間、周波数、及び刺激後時間に対する電圧感受性人工シグナル伝達経路の電気センサー要素の両方のＣａＶの傾向は同じであった。同じ電気刺激に応答したＣａＶ１．２を含むＥＳエフェクター細胞におけるエフェクタータンパク質の発現は、ＣａＶ１．３を含むＥＳエフェクター細胞におけるエフェクタータンパク質の発現よりも強固であった。従って、図７Ａ乃至７Ｄの全パネルにおいて報告された観察に基づいて、ＣａＶ１．２は、電気センサー要素を作製する電圧依存性Ｃａ２＋チャンネルとして経験的に選択され、α２δ１、β３と共発現した。
【0116】
上記のように、ＮＦＡＴ－ＲＥ誘導エフェクター要素及び電気センサー要素無しで、又は単独又はＣａＶ１．２若しくはＣＶ１．３と組み合わせたα２δ１及びβ３サブユニットをコードする電気センサー要素で、Ｊｕｒｋａｔ細胞を操作した。ｘ軸において特別記載されない限り３０Ｖ、２０Ｈｚ、２ｍｓｅｃのパルス持続時間により１６５００個の細胞を１時間電気刺激した後、２４時間、Ｎｌｕｃ活性を評価した。電圧、パルス持続時間、及び周波数の範囲を分析することによりＣａＶ１．２を介してＮｌｕｃ活性を刺激するために使用されたパラメータの範囲が示され、Ｎｌｕｃ活性の時間的分析は正規化されたエフェクタータンパク質の発現が４８時間後まで誘発されたことを示した。細胞増殖を考慮して、Ｎｌｕｃ応答を細胞数により正規化した。全ての観察において、ｎ＝４を使用してＮｌｕｃ活性を判定し、エラーバーは、±１ＳＤを示し、平均値の６８％信頼区間の半値幅とみなすこともできる。
【0117】
図８Ａ乃至８Ｄは、本開示に係る、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞からエフェクタータンパク質の発現を駆動させるために使用される生物学的パラメータの例を示す。
異なる生物学的パラメータを評価して、βアイソフォームによる電気センサー要素の制御及び他の種類の細胞において機能するための合成回路の適用性を決定するために、様々な実験を行った。そのような生物学的パラメータは、補助サブユニットの発現及び細胞シャーシを含む。
異なる生物学的パラメータを評価して、βアイソフォームによる電気センサー要素の制御及び他の種類の細胞において機能するための合成回路の適用性を決定するために、様々な実験を行った。そのような生物学的パラメータは、補助サブユニットの発現及び細胞シャーシを含む。
【0118】
図８Ａ及び８Ｂは、ＥＳエフェクター細胞を作製するために使用されるＪｕｒｋａｔ細胞シャーシを示し、Ｊｕｒｋａｔ細胞シャーシにおいてβ３及びβ２補助サブユニットの両方がエフェクタータンパク質の発現を駆動する電気センサー要素の電気的なトリガーを支持したことを示す。図８Ｃ及び８Ｄは、ＥＳエフェクター細胞を作製するために使用されるＫ５６２細胞シャーシを示し、Ｋ５６２細胞シャーシにおいてβ２補助サブユニットがエフェクタータンパク質の発現を駆動する電気センサー要素の電気的なトリガーを支持し、β３は支持しなかったことを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞シャーシを使用したエフェクタータンパク質の発現は、Ｋ５６２細胞シャーシを使用したそれよりも早かった。Ｊｕｒｋａｔ細胞シャーシにおいて、発現は２４時間以内に検出され、少なくとも４８時間後まで増加し続けた。比較すると、Ｋ５６２細胞において発現は４８時間で検出され、２４時間で最少となった。実験により、ＥＳエフェクター細胞を形成するように改変されたＫ５６２細胞の電気センサー要素によるシグナル伝達をより良好に支持することが分かり、これは恐らく、プラズマ膜へのＣａＶ１．２の輸送の増加によるものである。細胞表面上におけるチャンネルの局所化は、ＣａＶ１．２孔を介したＣａ２＋流入をより良く駆動し、ＮＦＡＴを核へとトランスロケーションするために必要な細胞内Ｃａ２＋の上昇を提供できる。これらの実験は、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＫ５６２細胞において、ＣａＶ１．２／α２β１β２からなる電気的センサー要素によりエフェクタータンパク質の発現が電気的に誘導され、さらに他の細胞シャーシにも及ぶ可能性があることを示した。
【0119】
図８Ａ乃至８Ｄに示されるように、補助サブユニットβ２及びβ３を、ＣａＶ１．２／α２β１及びＮＦＡＴ－ＲＥ誘導エフェクタータンパク質（Ｎｌｕｃ）を発現するＪｕｒｋａｔ細胞株及びＫ５６２細胞株の両方の電気的活性化に対する支持について比較した。３０Ｖ、２０Ｈｚ、２ｍｓｅｃのパルス持続時間において、１６５００個の細胞に１時間の電気刺激を開始してから２４時間及び４８時間後にＮｌｕｃ活性を測定した。両方のβサブユニットがＪｕｒｋａｔ細胞におけるレポーターの発現を促進した。β２はＫ５６２細胞におけるレポーター発現のみを促進した。全ての観察において、ｎ＝４を使用してＮｌｕｃ活性を判定し、エラーバーは、±１ＳＤを示し、平均値の６８％信頼区間の半値幅とみなすこともできる。
【0120】
様々な実験において、上記のＥＳエフェクター細胞は、抗ウイルスタンパク質等の治療用タンパク質をコードするエフェクター要素を含むようにさらに改変されてよい。パンデミック状況下で公衆衛生上の対応を実施する場合、完璧な解決策はめったにない。各ウイルスは異なる方法で発現し、大きく異なる臨床症状を示し、異なる分子構造を有する。汎ウイルス免疫を発揮する普遍的な介入は、ひとたび食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認されれば、大流行の際に即座に配備することができる社会的信用を得ることができる。様々な実験により、病原性ウイルスに対する自然免疫を誘発する操作された細胞を外因的に活性化する能力が実証されている。実験において、電気刺激を印加するとＩＦＮ－β１を発現する細胞を操作することにより、この業績が実証された。細胞は電気刺激により活性化するため、ウイルスの分子構造に関する予備知識を必要としない。ＥＳエフェクター細胞は広く応用可能であり、コロナウイルスに限らず、あらゆるウイルス感染症の発生時に迅速に配備できる。
【0121】
ほとんど全ての病原性ウイルスは、ウイルス攻撃に抵抗するための前駆期における初期応答で、ＩＦＮ経路を妨害することにより増殖する。様々な実験的な実施形態において、そして少なくとも上記の理由から、前臨床試験及び臨床試験において抗ウイルス効果を発揮することが知られる異なるＩ型及びＩＩＩ型ＩＦＮを発現するように操作された細胞の中から、Ｉ型ＩＦＮであるＩＦＮ－β１をエフェクタータンパク質として使用した。実験は、対照として市販のＩＦＮ－β１で処理した場合と比較して、ＥＳエフェクター細胞から産生されたＩＦＮ－β１で宿主細胞を処理した場合に同様のＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）シグネチャーを示した。現在は公衆衛生危機にあるため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が新興ウイルスをモデルとして使用した。しかしながら、この研究の影響はウイルスにとどまらない。例えば、ＩＦＮ－β１は、細菌感染、自己免疫疾患、神経疾患、固形腫瘍等の免疫系を回避する他の疾患にも使用されている。上記のように、ＥＳエフェクター細胞は、治療を考慮した組み換えバージョンのＩＦＮ－β１を含む、ヒト又は非ヒトタンパク質を収容できる。従って、例えば体外装置である電気回路から外因的に刺激された操作された細胞からの治療用タンパク質の部位特異的合成は、多くの疾患を標的とする能力を提供する。
【0122】
感染の初期にＣＯＶＩＤ－１９を治療するためのＩＦＮ－β１の実施は、Ｂ型肝炎及びＭＥＲＳのようなウイルス性疾患の治療において以前に観察されたその有用性の証である。また、リポソーム、ペグ化、ヒドロゲル、微粒子等の治療薬の直接全身注入のための製剤が、免疫原性を低減し、バイオアベイラビリティを改善することにより有効性及び安全性を改善するために開発されてきた。とはいえ、多くの課題が存在する。例えば、（１）ＩＦＮ－β１ａ及びＩＦＮ－β１ｂである利用可能な２つの哺乳動物細胞及び細菌発現製剤は、炎症、組織損傷、多臓器不全等の全身毒性を示し、後者は適切な翻訳後修飾を欠いており、（２）持続的なバイオアベイラビリティのためには依然として反復投与が必要であり、（３）多くの治療に必要とされる局所的なバイオアベイラビリティに焦点を当てた時間分解能は達成されていない。これらの問題を解決するために、イン・シチュにおいてタンパク質を生物学的生産のための細胞を操作した。いくつかの実施形態において、ＥＳエフェクター細胞は、Ｒｅｐｅｌｌｉｎ ＣＥ ｅｔ ａｌの『Ｍｏｄｕｌａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ』、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、２（１２）：１８００２１０（２０１８）、及びＲｅｐｅｌｌｉｎ ＣＥ ｅｔ ａｌの「ＮＫ－Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｙ ａｓ ａｎ Ｏｆｆ－ｔｈｅ－Ｓｈｅｌｆ Ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題する、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ ５（７）．２０００３９８ （２０２１）に記載される成分及び特徴の少なくともいくつかを含み、抗原提示標的細胞と係合すると、Ｃａ２＋誘導セカンドメッセンジャーシステムを動員する抗原感知キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、それらの教示はその全体が参照として本明細書に組み込まれる。実験的な実施形態において、イン・ビボシグナルから活性化トリガーを切り離すために、ＣＡＲ分子を、電場を感知すると下流のＣａ２＋誘導セカンドメッセンジャーシステムを動員するＣａＶをコードする電気感知エレメントにより置換した。これにより細胞の転写機構が活性化され、所望のタンパク質を産生するように設計された下流経路が活性化した。このようなＥＳエフェクター細胞は、エフェクタータンパク質の合成を位置選択的に組織に局所化させるため、炎症や組織損傷等の全身注入による有害な副作用を防ぐことができる。
【0123】
プラットフォーム自己複製細胞ベースの抗ウイルス剤であるＩＦＮ－βを有するＥＳエフェクター細胞は、ほとんどの病原性ウイルスを普遍的に標的とすることが可能であり、パンデミックになる前にアウトブレイクを抑制することができ、より小型の分散型バイオリアクターにおける製造可能性を広げる。従って、現在のワクチンにとって流通の大きな障害となっている、腐敗の原因となるコールドチェーンの維持への依存を最小限に抑えることができる可能性がある。ＥＳエフェクター細胞ベースの抗ウイルスアプローチは、ウイルス培養の開発、ウイルス向性の決定、ウイルス抗原／宿主受容体の調査、配列の決定、臨床グレードの免疫原生の構築及び適格性確認、設計－構築－試験／安全性サイクルの反復実施等、新規の病原体毎に特異性を備える回復期を導入するワクチン開発に不可欠である時間及び資源集約的なプロセスを回避できる。ＩＦＮ－βを有するＥＳエフェクター細胞は、新興パンデミックを治療するための現在のワクチンベースのアプローチに対して新しい補完的な養生法を提供し、前駆症状の段階で感染症を治療するための前段階として投与される。
【0124】
図９Ａ乃至９Ｃは、本開示に係る、異なる細孔形成サブユニット及び補助サブユニットを有する遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞の結果の例を示す。電圧依存性Ｃａ２＋チャンネル及び補助サブユニットの操作を介した合成ＮＦＡＴ制御Ｎｌｕｃレポーターの発現の電気的なトリガーを実験的に評価した。ＣａＶ１．２及びＣａＶ１．３並びにα２β１及びβ３補助サブユニットを、Ｃａ２＋誘導性レポータータンパク質と共にＪｕｒｋａｔ細胞株へと共操作した。Ｎｌｕｃ活性は、図９Ａに示されるように、補助サブユニットの発現の識別を同定し、図９Ｂに示されるように、ＮＦＡＴアクチュエーター要素の電気感知活性化のトリガーとなる電圧要求を同定した。図９Ａは、α２β１β３及びＣａＶ１．２の共発現を示し、少ない程度であるが、ＣａＶ１．３は顕著な電圧依存性エフェクタータンパク質の発現を支持した。図９Ｂ及び９Ｃは、電圧印加により活性化したレポータータンパク質の発現の増加、及び細胞生存率の低下を示す。また、レポータータンパク質の発現のＮＦＡＴ媒介転写は、ＰＭＡ／イオノマイシン処理（図９Ｂにおける破線）により誘発された。全ての場合において、３０Ｖ（又は図９Ｂ及び９Ｃに示されるように）、２０Ｈｚ、及び２ｍｓｅｃのパルス持続時間で細胞（１６５００ｋ）を刺激した。刺激後２４時間、Ｎｌｕｃ活性を測定した。全ての観察において、ｎ＝４を使用してＮｌｕｃ活性を判定し、エラーバーは、±１ＳＤを示し、平均値の６８％信頼区間の半値幅とみなすこともできる。
【0125】
図１０Ａ及び１０Ｂは、本開示に係る、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を電気刺激するために異なる電極間距離を使用した結果の例を示す。示されるように、電極間の距離を短くすることにより、ＥＳエフェクター細胞の活性化のための電圧閾値が減少した。図１０Ａに示される電極間距離１２．５ｍｍ及び図１０Ｂに示される電極間距離２８ｍｍの２つのイオンオプティクスのＣ－ｐａｃｅ ｌｉｄ構成を使用して、ＣａＶ１．２／α２β１β３を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を刺激した。電気刺激の開始の２４時間後にＮｌｕｃ活性を判定した（１時間、３０Ｖ、２０Ｈｚ、２ｍｓｅｃ）。電極間距離を２８ｍｍから１２．５ｍｍに減らしたことに比例してレポータータンパク質の発現するＶが減少した。全ての観察において、ｎ＝４を使用してＮｌｕｃ活性を判定し、エラーバーは、±１ＳＤを示し、平均値の６８％信頼区間の半値幅とみなすこともできる。
【0126】
図１１は、本開示に係る、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を電気刺激するための電圧印加の関数としての細胞生存率の例を示す。図１１に示されるように、電圧印加が増加すると、細胞生存率は低下した。１時間、２０Ｈｚ、２ｍｓｅｃのパルス持続時間により示される電圧印加の開始から２４時間後のＣａＶ１．２／α２β１β３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を数えた。ｎ＝２を使用するＴｒｙｐａｎＢｌｕｅにより細胞数を数え、エラーバーは、±１ＳＤを示し、平均値の６８％信頼区間の半値幅とみなすこともできる。
【0127】
図１２Ａ及び１２Ｂは、本開示に係る、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を電気刺激するために異なる持続時間を使用した結果の例を示す。電気刺激の持続時間は、エフェクタータンパク質の発現及び細胞生存率の両方に影響を及ぼす。ＣａＶ１．２／α２β１β３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を、示された時間にわたり電気刺激（３０Ｖ、２０Ｈｚ、２ｍｓｅｃのパルス持続時間）し、図１２Ａに示されるように刺激開始から２４時間後にＮｌｕｃエフェクター活性について分析し、また、図１２Ｂに示されるようにＡＯ／ＰＩにより特定された細胞生存率について分析した。４つの試験は、ＮＦＡＴ媒介Ｎｌｕｃ発現の活性化には６０分の電気刺激が必要であり、この枠を超える刺激は活性化を促進するが細胞生存率を低減させることを示した。全ての観察において、ｎ＝４を使用してＮｌｕｃ活性を判定し、エラーバーは、±１ＳＤを示し、平均値の６８％信頼区間の半値幅とみなすこともできる。４つの試験のＮｌｕｃ活性を、未処理の細胞用のシグナルを０％、ＰＭＡ／イオノマイシンにより処理された細胞用のシグナルを１００％と設定して正規化した。細胞生存率の数は４つの試験で得られたＡＯ／ＰＩ測定の平均を示し、エラーバーは、±１ＳＤを示し、平均値の６８％信頼区間の半値幅とみなすこともできる。
【0128】
図１３は、本開示に係る、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を電気刺激するために異なる周波数を使用した結果の例を示す。図１３に示されるように、電圧強度が低下すると、刺激周波数が増加した。図１３のプロットは、ｘ軸に周波数の範囲が示される、２０Ｖ及び２ｍｓｅｃのパルス持続時間における１６５００個の細胞に対する１時間の電気刺激の開始から２４時間後のＮｌｕｃ活性により評価されたレポーター発現を示す。２０Ｈｚの周波数によりレポータータンパク質が発現した図７Ｃの３０Ｖで刺激された細胞と比較して、２０ＶでＣａＶ１．２発現細胞を刺激した際には、Ｎｌｕｃ活性を検出するために４５Ｈｚまで増加した周波数が必要であった。全ての観察において、ｎ＝４を使用してＮｌｕｃ活性を判定し、エラーバーは、±１ＳＤを示し、平均値の６８％信頼区間の半値幅とみなすこともできる。
【0129】
図１４Ａ及び１４Ｂは、本開示に係る、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を電気刺激するために異なる持続時間を使用した結果の例を示す。より具体的には、図１４Ａ及び１４Ｂは、ＥＳエフェクター細胞のＮｌｕｃ発現の持続時間を示す。３０Ｖ、２０Ｈｚ、２ｍｓｅｃのパルス持続時間で１時間、細胞を刺激し、図１４Ａに示されるＮｌｕｃ活性及び図１４Ｂに示される生存細胞数を示された時間について評価した。電気刺激されたＣａＶ１．２及びＣａＶ１．３発現細胞において顕著なレポーター発現が観察された。また、細胞活性は、時間依存的な細胞増殖とともに増加した。従って、Ｎｌｕｃ活性を、相対細胞数に対して正規化し、図７Ｄにおいて報告した。全ての観察において、ｎ＝４を使用してＮｌｕｃ活性及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ活性を判定し、エラーバーは、±１ＳＤを示し、平均値の６８％信頼区間の半値幅とみなすこともできる。
【0130】
図１５Ａ及び１５Ｂは、本開示に係る、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を生成するためのプラスミドの例を示す。より具体的には、図１５Ａ及び１５Ｂは、それぞれ、下記の表１に記載されるプラスミドＡ及びプラスミドＢを示す。
【0131】
図１６Ａ及び１６Ｂは、本開示に係る、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を電気刺激した結果の例を示す。より具体的には、図１６Ａ及び１６Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ細胞シャーシ及びＫ５６２細胞シャーシの両方が電気刺激された産生を支持することを示す。ｎルシフェラーゼレポーター発現の動態から観察されたように、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、刺激後２４時間以内に分泌されたサイトカインを検出することにより、より早くＩＦＮを産生した（図１６Ａ）。比較すると、電気的な活性化に応答して産生されたＩＦＮは、刺激後４８時間で観察された（図１６Ｂ）。いずれにしても、電気センサーを両細胞株に操作することにより、疾患バイオマーカーに依存しないオンデマンドＩＦＮ産生が可能となる。
【0132】
より具体的には、図１６Ａ及び１６Ｂは、ＥＳエフェクター細胞によりＩＦＮ分泌の時間経過を示す。Ｎｌｕｃ発現を駆動した電気的パラメータを、ＩＦＮ分泌をトリガーするために使用した（３０Ｖ（Ｊｕｒｋａｔ）及び３４Ｖ（Ｋ５６２）、２０Ｈｚ、２ミリ秒のパルス持続時間における１時間の刺激）。ＩＦＮ産生を、刺激後のＥＳエフェクター細胞上清を分離し、ＩＦＮ感知レポーター細胞株を使用して分泌されたエフェクタータンパク質を定量することにより特定した。
【0133】
図１７Ａ及び１７Ｂは、本開示に係る、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を電気刺激した結果の例を示す。より具体的には、図１７Ａ及び１７Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を防止するＥＳエフェクター細胞により分泌されたＩＦＮを示す。電気刺激されたＥＳ細胞から分離されたＩＦＮ含有上清を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染する前にＶｅｒｏ－Ｅ６細胞の前処理に使用して、分泌されたＩＦＮの予防活性を評価した。Ｊｕｒｋａｔ細胞株及びＫ５６２細胞株（それぞれ、図１６Ａ及び図１６Ｂ）において、ＩＦＮ回路を産生するＥＳエフェクター細胞は、刺激されていないＥＳエフェクター細胞と比較して、ウイルス感染を顕著に抑制する電場に応答するＩＦＮ産生を可能にした。Ｋ５６２ベースの細胞により合成されたＩＦＮによりウイルス感染を処理することにより、Ｊｕｒｋａｔ細胞と比較して、ウイルス感染がより効果的に抑制され、これは、Ｋ５６２細胞に観察された強固なＩＦＮ産生を反映していると思われる。これらの実施形態は、ウイルス感染を処理するための遠隔トリガーを使用したＥＳエフェクター細胞の刺激及びＩＦＮのオンデマンド合成￥を示す。さらに、ＥＳエフェクター細胞の回路を利用してＫ５６２細胞株における薬剤産生を指示することにより、イン・ビボ応用の道が開かれた。
【0134】
図１７Ａ及び１７Ｂにおいて、細胞複製及び細胞死を抑制するために、ＥＳエフェクター細胞の上清（図１７Ａ：Ｊｕｒｋａｔ細及び図１７Ｂ：Ｋ５６２）を連続して希釈し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染する前のＶｅｒｏ－Ｅ６を前処理するために使用した。処理後４８時間の電気刺激されたＥＳエフェクター細胞から上清を取り出し、照射及び非照射のものを両方、刺激されていない細胞の上清と比較した。青の破線は、精製組み換えＩＦＮのウイルス防御効果を示す。
【0135】
図１８Ａ及び１８Ｂは、本開示に係る、遺伝子操作されたＥＳエフェクター細胞を電気刺激した結果の例を示す。示されるように、ＥＳエフェクター細胞により分泌されたＩＦＮは、活性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を抑制した。ＥＳエフェクター細胞を、感染したばかりのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｖｅｒｏ－Ｅ６－Ｌｕｃ２細胞と共に培養し、イン・シチュにおけるＩＦＢ送達の進行中のウイルス感染に対する治療効果を調査した。Ｊｕｒｋａｔ及びＫ５６２ベースのＥＳ細胞（それぞれ、図１８Ａ及び図１８Ｂ）において、電気応答回路は、刺激されていないＥＳエフェクター細胞と比較して、確立されたウイルス感染を顕著に抑制したＩＦＮ産生を可能にした。ＥＳエフェクター細胞上清の前処理試験（図１７Ａ及び１７Ｂ）とは対称的に、ＩＦＮを産生したＪｕｒｋａｔベースのＥＳエフェクター細胞は、Ｋ５６２ベースの薬剤送達と比較して、発症中のウイルス感染及び続く細胞死を顕著に減少させた。ＪｕｒｋａｔベースのＥＳエフェクター細胞は電気刺激後により早くＩＦＮを分泌したため（図１６Ａ及び１６Ｂ）、予防防薬としてより効果的と思われるＫ５６２ベースのＥＳエフェクター細胞により示された強固なＩＦＮ発現に対して、より迅速なＩＦＮ送達が活性ウイルス感染の抑制においてより効果的であると思われる。
【0136】
より具体的には、図１８Ａ及び１８Ｂにおいて、ＥＳエフェクター細胞（図１７Ａ：Ｊｕｒｋａｔ細及び図１７Ｂ：Ｋ５６２）を、連続して希釈し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した少し後のＶｅｒｏ－Ｅ６－Ｌｕｃ２細胞と共培養した。Ｖｅｒｏ－Ｅ６－Ｌｕｃ２細胞のルシフェラーゼ活性を、感染／共培養した４８時間後に調査して、細胞生存率を特定した。共培養の前に、非照射及び照射されたＥＳエフェクター細胞の両方を電気刺激した。刺激されなかった細胞は、陰性対照として使用した。青の破線は、精製組み換えＩＦＮのウイルス防御効果を示す。
【0137】
以下は、様々な材料及び方法を示す。
【0138】
操作されたＪｕｒｋａｔＥ６－１（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃ＴＩＢ－１５２）及びＫ５６２（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃ＭＣＣＬ－２４３）細胞株を、完全ＲＰＭＩ培地［ＲＰＭＩ１６４０（コーニング、Ｃａｔ＃１０－０４１－ＣＶ）、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（シグマアルドリッチ、Ｃａｔ＃Ｆ２４４２－５００ＭＬ）、及び１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン溶液（コーニング、Ｃａｔ＃３０－００２－Ｃｌ）］中に維持した。操作されたＶｅｒｏ－Ｅ６細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃ＣＲＬ－１５８６）を、完全Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ［１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（シグマアルドリッチ、Ｃａｔ＃Ｆ２４４２－５００ＭＬ）、及び１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン溶液（コーニング、Ｃａｔ＃３０－００２－Ｃｌにより補足したＥＭＥＭ（コーニング、Ｃａｔ＃１０－００９－ＣＶ）］中で培養した。全ての細胞を増殖させ、凍結培地（５０％ＦＢＳ、４０％ＲＰＭＩ、及び１０％ＤＭＳＯ）を使用して液体窒素ストックを維持した。異なる遺伝子ペイロードをコードするプラスミド（トランスファープラスミド）を、ＳｎａｐＧｅｎｅソフトウェア（ＧＳＬ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＬＬＣ）により設計し、ｐｉｇｇｙＢａｃベクタープラスミド（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ＃ＣＤ５１０Ｂ－１）又はｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクタープラスミド（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ＃ＰＢ５１０Ｂ－１）にサブクローニングした。ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポナーゼ配列は、その教示のために全体が参照として本明細書に組み込まれる、Ｄｏｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（２０１２）；Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅ ｐｉｇｇｙＢａｃ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３，３１１－３２０に記載されるようなものがジョンズ・ホプキンズ大学により提供された。「ＥＦ１アルファプロモーター－ｉ７ｐＢ導入遺伝子－ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル」のためのインサートを、化学合成し、オーバーラップＰＣＲ産物を使用してｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ０９１３７、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃Ｎ３０４１）に組み込んだ。全てのプラスミド調製サービス（ＤＮＡ挿入配列の化学合成、各ベクターバックボーンへのサブクローニング、及び増幅）を、Ｅｐｏｃｈ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社（ミズーリ市、ＴＸ）から入手した。Ｊｕｒｋａｔ細胞株及びＫ５６２細胞株の操作には、製造指示書に従って、それぞれ、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎキット：ＳＥ Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ Ｘ Ｋｉｔ Ｓ（ロンザ株式会社、Ｃａｔ＃Ｖ４ＸＣ－１０３２）及びＳＦ Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ Ｘ Ｋｉｔ Ｌ（ロンザ株式会社、Ｃａｔ＃Ｖ４ＸＣ－２０２４）を使用した。ピューロマイシン二塩酸塩（サーモフィッシャーサイエンティフィック、Ｃａｔ＃Ａ１１１３８０３）及びＧ４１８硫酸塩（コーニング、Ｃａｔ＃３０－２３４－ＣＩ）を、安定な細胞株を選択するために使用した。Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ（プロメガ株式会社、＃Ｎ１１５０）を使用してＮｌｕｃ活性を測定した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ２．０（プロメガ株式会社、＃Ｇ９２４２）又はＶｉａＳｔａｉｎＴＭＡＯ／ＰＩ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ、Ｃａｔ＃ＣＳ２－０１０６）のいずれかにより細胞生存率を特定した。Ｖｅｒｏ－Ｅ６－Ｌｕｃ２＋細胞を、記載のように操作し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による細胞殺傷のレポーターとして使用した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２培養株［ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、ＮＩＨ；香港／ＶＭ２０００１０６１／２０２０（ＣａｔＮＲ－５２２８２）］を提供した。Ｖｅｒｏ－Ｅ６－Ｌｕｃ２＋細胞の生存率を、Ｌｕｃ２活性のためのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ２．０細胞生存率アッセイ（プロメガ、Ｃａｔ＃ＰＲＧ７５７０）又はＯｎｅ－Ｇｌｏアッセイ（プロメガ、Ｃａｔ＃Ｅ６１１０）のいずれかを使用して評価した。完全ＤＭＥＭ［１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（シグマアルドリッチ、Ｃａｔ＃Ｆ２４４２－５００ＭＬ）及び１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン溶液（コーニング、Ｃａｔ＃３０－００２－Ｃｌ）により補足したＤＭＥＭ成長培地］中で、製造指示に従い、ＩＦＮ－βを有するＥＳエフェクター細胞により産生されたＩＦＮの量を定量化するために、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／β細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｃａｔ＃ｈｋｂ－ｉｆｎａｂ）を使用した。Ｒ＆Ｄシステムズからの組み換えヒトＩＦＮ－β１ａタンパク質（Ｃａｔ＃８４９９－ＩＦ－０１０／ＣＦ）を対照として使用した。
【0139】
ＥＳエフェクター細胞の生成（Ｎｌｕｃを有するＥＳエフェクター細胞；ＩＦＮ－βを有するＥＳエフェクター細胞）
その教示のために全体が本明細書に組み込まれるＲｅｐｐｅｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．２０２０に記載されるｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムにより、Ｊｕｒｋａｔお酔いＫ５６２懸濁細胞株を操作した。トランスファープラスミドは、以下の：ＣａＶ１．２：Ｑ１３９３６－２０；ＣａＶ１．３：Ｑ０１６６８－１；α２δ１：Ｐ５４２８９－２；β３：Ｐ５４２８４－１；β２ａ：Ｑ０８２８９－２；Ｎｌｕｃ：ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ４３７３７０．１、ＩＦＮ－β１：Ｐ０１５７４の遺伝子成分を含む。トランスファープラスミド及びｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターのｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎの後、トランスフェクトされた細胞を４８時間培養し、その後、０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン二塩酸塩又は１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を使用して選択した。選択の後、細胞を、様々なアッセイに必要なように増殖させ、凍結培地を使用して凍結した。Ｎｌｕｃを有するＥＳエフェクター細胞及びＩＦＮ－βを有するＥＳエフェクター細胞は、
プラスミドＡ）ＣａＶ１．２又はＣａＶ１．３、アクチュエーター及びエフェクター要素（ピューロマイシン選択）、並びにプラスミドＢ）α２δ１及びβ補助サブユニット（Ｇ－４１８選択）の導入に２回のヌクレオフェクションを必要とした。照射について、１３７Ｃｓγ線照射装置ＭａｒｋＩ－６８Ａ（ＪＬ Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を使用して、２２２ｍＧｙ／分の線量率、３０Ｇｙで（又は指示の通りに）ＥＳエフェクター細胞を照射した。対照細胞を、照射以外は同様に処理した。
その教示のために全体が本明細書に組み込まれるＲｅｐｐｅｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．２０２０に記載されるｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムにより、Ｊｕｒｋａｔお酔いＫ５６２懸濁細胞株を操作した。トランスファープラスミドは、以下の：ＣａＶ１．２：Ｑ１３９３６－２０；ＣａＶ１．３：Ｑ０１６６８－１；α２δ１：Ｐ５４２８９－２；β３：Ｐ５４２８４－１；β２ａ：Ｑ０８２８９－２；Ｎｌｕｃ：ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ４３７３７０．１、ＩＦＮ－β１：Ｐ０１５７４の遺伝子成分を含む。トランスファープラスミド及びｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターのｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎの後、トランスフェクトされた細胞を４８時間培養し、その後、０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン二塩酸塩又は１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を使用して選択した。選択の後、細胞を、様々なアッセイに必要なように増殖させ、凍結培地を使用して凍結した。Ｎｌｕｃを有するＥＳエフェクター細胞及びＩＦＮ－βを有するＥＳエフェクター細胞は、
プラスミドＡ）ＣａＶ１．２又はＣａＶ１．３、アクチュエーター及びエフェクター要素（ピューロマイシン選択）、並びにプラスミドＢ）α２δ１及びβ補助サブユニット（Ｇ－４１８選択）の導入に２回のヌクレオフェクションを必要とした。照射について、１３７Ｃｓγ線照射装置ＭａｒｋＩ－６８Ａ（ＪＬ Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を使用して、２２２ｍＧｙ／分の線量率、３０Ｇｙで（又は指示の通りに）ＥＳエフェクター細胞を照射した。対照細胞を、照射以外は同様に処理した。
【0140】
ＥＳエフェクター細胞の二相性電場刺激
細胞を、Ｃ－ＤｉｓｈＴＭ蓋（ＩｏｎＯｐｔｉｘ Ｃａｔ＃ＣＬＤ６ＷＦＣ及びＣＬＤ２４ＷＦ）を取り付けた６ウェル又は２４ウェルのディッシュで培養し、各ウェルに２つの炭素電極素子を浸した。ＩｏｎＯｐｔｉｘ Ｃ－Ｐａｃｅ ＥＭ刺激装置により、細胞を電気刺激した。一般的な実験において、１ウェル当たり３ｍｌの細胞が０．１７ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度でプレーティングされる。プレーティングの２４時間後、細胞を1時間電気刺激し、その後、電気刺激の開始から２４時間～４８時間後のエフェクタータンパク質の発現を評価した。
細胞を、Ｃ－ＤｉｓｈＴＭ蓋（ＩｏｎＯｐｔｉｘ Ｃａｔ＃ＣＬＤ６ＷＦＣ及びＣＬＤ２４ＷＦ）を取り付けた６ウェル又は２４ウェルのディッシュで培養し、各ウェルに２つの炭素電極素子を浸した。ＩｏｎＯｐｔｉｘ Ｃ－Ｐａｃｅ ＥＭ刺激装置により、細胞を電気刺激した。一般的な実験において、１ウェル当たり３ｍｌの細胞が０．１７ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度でプレーティングされる。プレーティングの２４時間後、細胞を1時間電気刺激し、その後、電気刺激の開始から２４時間～４８時間後のエフェクタータンパク質の発現を評価した。
【0141】
Ｎｌｕｃレポーターアッセイ
製造指示に従って、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏアッセイ（プロメガ、Ｃａｔ＃Ｎ１１２０）により、エフェクタータンパク質の発現を測定した。Ｎｌｕｃ基質を、細胞溶解バッファーで希釈し、９６ウェルプレートへと移した処理した細胞に１：１で加えた。マイクロプレートリーダー（パーキンエルマー、ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ，Ｍｏｄｅｌ：２１０４－００１０Ａ）により、生物発光を読み取った。
製造指示に従って、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏアッセイ（プロメガ、Ｃａｔ＃Ｎ１１２０）により、エフェクタータンパク質の発現を測定した。Ｎｌｕｃ基質を、細胞溶解バッファーで希釈し、９６ウェルプレートへと移した処理した細胞に１：１で加えた。マイクロプレートリーダー（パーキンエルマー、ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ，Ｍｏｄｅｌ：２１０４－００１０Ａ）により、生物発光を読み取った。
【0142】
ＩＦＮ－βレポーターアッセイ
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーター細胞を使用してＩＦＮ－β産生を特定した。分泌されたＩＦＮを、処理した細胞を５００ｇで５分間遠心した後、上清を回収することにより分離した。製造指示に従って、５０μｌの連続して希釈した上清をＤＭＥＭ増殖培地中の１５０μｌの５０，０００ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーター細胞と混合し、９６ウェルプレートの１つのウェルにプレーティングした。ＤＭＥＭ培地において連続して希釈した組み換えＩＦＮ－β１ａを並行してプレーティングし、ＩＦＮ濃度の標準曲線を作製した。２４時間培養した後、２０μＬのＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／β（又はＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－λ）上清を、１８０μＬのＱｕａｎｔｉ－ｂｌｕｅ基質（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に添加し、３７℃でインキュベートした。マイクロプレートリーダー（パーキンエルマー、ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）を使用して、６５０ｎｍで吸光度を測定した。
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーター細胞を使用してＩＦＮ－β産生を特定した。分泌されたＩＦＮを、処理した細胞を５００ｇで５分間遠心した後、上清を回収することにより分離した。製造指示に従って、５０μｌの連続して希釈した上清をＤＭＥＭ増殖培地中の１５０μｌの５０，０００ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーター細胞と混合し、９６ウェルプレートの１つのウェルにプレーティングした。ＤＭＥＭ培地において連続して希釈した組み換えＩＦＮ－β１ａを並行してプレーティングし、ＩＦＮ濃度の標準曲線を作製した。２４時間培養した後、２０μＬのＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／β（又はＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－λ）上清を、１８０μＬのＱｕａｎｔｉ－ｂｌｕｅ基質（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に添加し、３７℃でインキュベートした。マイクロプレートリーダー（パーキンエルマー、ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）を使用して、６５０ｎｍで吸光度を測定した。
【0143】
ＩＮＦ－βを有するＥＳエフェクター細胞の抗ウイルス予防効果
完全ＲＰＭＩ培地３ｍｌ中に１×１０６の細胞をプレーティングしてから２４時間後、ＩＦＮ－βを有するＥＳエフェクター細胞を、３０Ｖ、２０Ｈｚ、２ｍｓｅｃで１時間電気刺激した。刺激開始から４８時間後、上清を５００ｇの遠心分離で５分間分離し、完全ＥＭＥＭ培地で連続希釈した。連続希釈した細胞上清１００μＬを、９６ウェルプレートで２４時間、Ｖｅｒｏ－Ｅ６－Ｌｕｃ２＋細胞の単層を前処理するために使用した（２００００細胞／ウェル、３回）。陽性対照として、組み換えヒトＩＦＮ－β１ａ（１μｇ／ｍｌ）を加えた。その後、前処理した細胞を、０．１のＭＯＩで、４８時間、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス培地に感染させた。細胞生存率を、製造指示に従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ２．０ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを使用して特定した。簡単に説明すると、Ｎｌｕｃ基質を、細胞溶解バッファーで希釈し、１００μｌを上清前処理したウイルス感染Ｖｅｒｏ－Ｅ６－Ｌｕｃ２＋細胞に添加し、細胞生存率を評価した。得られた生物発光を、マイクロプレートリーダー（パーキンエルマー、ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）により測定した。
完全ＲＰＭＩ培地３ｍｌ中に１×１０６の細胞をプレーティングしてから２４時間後、ＩＦＮ－βを有するＥＳエフェクター細胞を、３０Ｖ、２０Ｈｚ、２ｍｓｅｃで１時間電気刺激した。刺激開始から４８時間後、上清を５００ｇの遠心分離で５分間分離し、完全ＥＭＥＭ培地で連続希釈した。連続希釈した細胞上清１００μＬを、９６ウェルプレートで２４時間、Ｖｅｒｏ－Ｅ６－Ｌｕｃ２＋細胞の単層を前処理するために使用した（２００００細胞／ウェル、３回）。陽性対照として、組み換えヒトＩＦＮ－β１ａ（１μｇ／ｍｌ）を加えた。その後、前処理した細胞を、０．１のＭＯＩで、４８時間、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス培地に感染させた。細胞生存率を、製造指示に従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ２．０ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを使用して特定した。簡単に説明すると、Ｎｌｕｃ基質を、細胞溶解バッファーで希釈し、１００μｌを上清前処理したウイルス感染Ｖｅｒｏ－Ｅ６－Ｌｕｃ２＋細胞に添加し、細胞生存率を評価した。得られた生物発光を、マイクロプレートリーダー（パーキンエルマー、ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）により測定した。
【0144】
ＩＮＦ－βを有するＥＳエフェクター細胞の抗ウイルス治癒効果
完全ＲＰＭＩ培地３ｍｌ中に１×１０６の細胞をプレーティングしてから２４時間後、ＩＦＮ－βを有するＥＳエフェクター細胞を、３０Ｖ、２０Ｈｚ、２ｍｓｅｃで１時間電気刺激した。同時に、Ｖｅｒｏ－Ｅ６－Ｌｕｃ２＋細胞の単層（９６ウェルプレート中の２００００／ウェル）を、０．１のＭＯＩで、４８時間、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス培地に感染させ、2時間インキュベートさせてウイルスを付着させた。２時間後、ウイルス接種液を除去し、連続希釈されたＩＦＮ－βを有するＥＳエフェクター細胞の１μｌを３回に分けてウェルに加えた。
完全ＲＰＭＩ培地３ｍｌ中に１×１０６の細胞をプレーティングしてから２４時間後、ＩＦＮ－βを有するＥＳエフェクター細胞を、３０Ｖ、２０Ｈｚ、２ｍｓｅｃで１時間電気刺激した。同時に、Ｖｅｒｏ－Ｅ６－Ｌｕｃ２＋細胞の単層（９６ウェルプレート中の２００００／ウェル）を、０．１のＭＯＩで、４８時間、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス培地に感染させ、2時間インキュベートさせてウイルスを付着させた。２時間後、ウイルス接種液を除去し、連続希釈されたＩＦＮ－βを有するＥＳエフェクター細胞の１μｌを３回に分けてウェルに加えた。
【0145】
組み換えヒトＩＦＮ－β１ａ（１μｇ／ｍＬ）及び非感染Ｖｅｒｏ－Ｅ６－Ｌｕｃ２＋細胞を対照として使用した。４８時間の共培養後、Ｏｎｅ－Ｇｌｏアッセイキットを使用して製造指示に従ってＬｕｃ２活性を評価することにより、Ｖｅｒｏ－Ｅ６－Ｌｕｃ２＋細胞の生存率を特定した。Ｌｕｃ２酵素基質を細胞溶解試薬で希釈し、９６ウェルプレート中のＶｅｒｏ－Ｅ６－Ｌｕｃ２＋細胞に添加し、生存細胞集団に関連するＬｕｃ２酵素活性を評価した。１０分間のインキュベーション後、マイクロプレートリーダーで生物発光を読み取った。
【0146】
以下の表１は、プラスミドについての異なるＥＳエフェクター細胞及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯを提供する。
【表1】
【0147】
以下の表２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１７にリストされる異なる遺伝的要素の概要を提供する。
【表2】
【0148】
様々な実施形態は、その利益を主張し、その一般及び特定の教示について参照により本明細書に完全に組み込まれる２０２１年０１月２７日に出願された「Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｆａｃｔｒｏｙ」と題する基礎となる仮出願セル番号６３／１０６，８３８に従い実施される。例えば、本明細書及び／又は仮出願の実施形態は、様々な程度で（完全に含む）組み合わせることができる。また、基礎となる仮出願において提供される実験的な教示及び基礎となる参考文献を参照することもできる。仮出願において記載された実施形態は、特に記載しない限り、技術開示全体、又は請求された開示の一部を限定することを、いかなる意味においても意図しない。
【0149】
本明細書では特定の実施例を図示及び説明したが、本開示の範囲から逸脱することなく、様々な代替及び／又は同等の実施例を図示及び説明する特定の実施例に置換できる。本出願は、本明細書で記載される具体例の任意の適応例又は変形例を包含することを意図する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【国際調査報告】