特表 2024-505519 がんを処置するための近赤外光免疫療法（ＮＩＲ－ＰＩＴ）併用療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-06

(54)【発明の名称】がんを処置するための近赤外光免疫療法（ＮＩＲ－ＰＩＴ）併用療法

(51)【国際特許分類】

   A61K 41/17 20200101AFI20240130BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240130BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240130BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240130BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20240130BHJP

   A61K 38/21 20060101ALI20240130BHJP

【ＦＩ】

A61K41/17

A61K39/395 T

A61K39/395 U

A61K39/395 P

A61P35/00

A61P43/00 121

A61K38/20

A61K38/21

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023545802

(86)(22)【出願日】2022-01-28

(85)【翻訳文提出日】2023-09-26

(86)【国際出願番号】 US2022014448

(87)【国際公開番号】W WO2022165277

(87)【国際公開日】2022-08-04

(31)【優先権主張番号】63/143,068

(32)【優先日】2021-01-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】309004585

【氏名又は名称】ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ アズ リプリゼンテッド バイ ザ セクレタリー、デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ Ｕ．Ｓ．Ａ．ＡＳ ＲＥＰＲＥＳＥＮＴＥＤ ＢＹ ＴＨＥ ＳＥＣＲＥＴＡＲＹ，ＤＥＰＡＲＴＭＥＮＴ ＯＦ ＨＥＡＬＴＨ ＡＮＤ ＨＵＭＡＮ ＳＥＲＶＩＣＥＳ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】小林 久隆

(72)【発明者】

【氏名】チョイケ， ピーター

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

【Ｆターム（参考）】

4C084AA11

4C084BA44

4C084DA12

4C084DA24

4C084MA02

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA05

4C084ZB26

4C084ZC75

4C085AA14

4C085BB01

4C085BB11

4C085CC23

4C085EE03

4C085GG02

(57)【要約】

治療有効量の１つまたは複数の腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子を使用して、がんを有する対象を処置する方法が、本明細書において提供される。方法は、対象に、治療有効量の（ａ）１つもしくは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数のＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子、またはこれらの組合せ、（ｂ）１つまたは複数の還元剤、（ｃ）１つまたは複数の免疫活性化因子、あるいはａ、ｂ、およびｃの組合せを、例えば、腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子と同時にもしくは実質的に同時に、または逐次的に（例えば、約０～２４時間以内に）投与するステップをさらに含み得る。方法はまた、対象または対象におけるがん細胞（例えば、腫瘍または血液中のがん細胞）に、６６０～７４０ｎｍの波長において少なくとも１Ｊ／ｃｍ^２の線量で照射するステップを含む。１つまたは複数の還元剤の使用により、処置により生じる浮腫を低減することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象におけるがんを処置するための方法であって、
（ａ）前記対象に、治療有効量の
（ｉ）１つもしくは複数の抗体－ＩＲ７００分子であって、前記抗体が、がん細胞の表面上の腫瘍特異的タンパク質に特異的に結合し、前記腫瘍特異的タンパク質が、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１）、メソテリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２、ＣＤ３、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα受容体）、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＤ２０６、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ルイスＹ、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）、グリピカン－１、グリピカン－２、グリピカン－３、ｇｐＡ３３、ムチン、ＣＡＩＸ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド、インテグリンαＶβ３、インテグリンα５ β３，１、Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ３（ＥＲＢＢ３）、ＭＥＴ癌原遺伝子、受容体チロシンキナーゼ（ＭＥＴ）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、エフリンＡ型受容体３（ＥＰＨＡ３）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬＲ１）、ＴＲＡＩＬＲ２、核内因子カッパ－Ｂリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、テネイシン、ＢＣＲ複合体、ｇｐ７２、ＨＬＡ－ＤＲ１０β、ＨＬＡ－ＤＲ抗原、ＩｇＥ、ＣＡ２４２、多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）抗原、ＳＫ－１抗原、プログラム死１（ＰＤ－１）、もしくはプログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）を含む、抗体－ＩＲ７００分子、ならびに／または
（ｉｉ）１つもしくは複数の免疫活性化因子
を投与するステップと、
（ｂ）前記対象に、治療有効量の１つもしくは複数の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数のプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）抗体－ＩＲ７００分子、またはこれらの組合せを投与するステップと、
（ｃ）続いて、６６０～７４０ｎｍの波長において少なくとも１Ｊ／ｃｍ^２の線量で前記対象に照射するステップおよび／または前記対象におけるがん細胞に照射するステップと
を含み、
前記１つもしくは複数の抗体－ＩＲ７００分子、前記１つもしくは複数の免疫活性化因子、前記１つもしくは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、および／または前記１つもしくは複数のＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子が、逐次的または同時に投与され、
それによって、前記対象における前記がんを処置する、方法。

【請求項2】

投与するステップ（ａ）および（ｂ）が、静脈内投与を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

対象におけるがんを処置するための方法であって、
前記対象に、治療有効量の１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子を投与するステップであって、前記抗体が、がん細胞の表面上の腫瘍特異的タンパク質または免疫細胞の表面上の免疫細胞特異的タンパク質に特異的に結合する、ステップと、
前記対象に、治療有効量の１つまたは複数の還元剤を投与するステップと、
６６０～７４０ｎｍの波長において少なくとも１Ｊ／ｃｍ^２の線量で前記対象に照射するステップおよび／または前記対象におけるがん細胞に照射するステップと
を含み、
前記１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子および前記１つまたは複数の還元剤が、逐次的または同時に投与される、方法。

【請求項4】

前記１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子が、静脈内投与され、前記１つまたは複数の還元剤が、腹腔内投与される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記照射するステップが、両方の投与するステップの後に行われる、請求項３または４に記載の方法。

【請求項6】

前記１つまたは複数の還元剤が、前記対象に照射するステップおよび／または前記対象におけるがん細胞に照射するステップの前に投与される、請求項３または４に記載の方法。

【請求項7】

前記腫瘍特異的タンパク質が、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２、ＣＤ３、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα受容体）、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＤ２０６、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ルイスＹ、ＴＡＧ７）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、グリピカン－１、グリピカン－２、グリピカン－３、ｇｐＡ３３、ムチン、ＣＡＩＸ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド、インテグリンαＶβ３、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＢＣＲ複合体、ｇｐ７２、ＨＬＡ－ＤＲ１０β、ＨＬＡ－ＤＲ抗原、ＩｇＥ、ＣＡ２４２、ＰＥＭ抗原、ＳＫ－１抗原、ＰＤ－１、またはＰＤ－Ｌ２を含み、前記免疫細胞特異的タンパク質が、ＣＴＬＡ４またはＰＤ－Ｌ１を含む、請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記腫瘍特異的タンパク質が、ＥＧＦＲを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記ＥＧＦＲ抗体が、パニツムマブまたはセツキシマブを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項10】

前記免疫細胞特異的タンパク質が、ＣＴＬＡ４またはＰＤ－Ｌ１を含む、請求項３～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記がんまたはがん細胞が、乳房、肝臓、結腸、卵巣、前立腺、膵臓、脳、子宮頸部、腎臓、骨、皮膚、頭頸部、中咽頭、または血液のがんまたはがん細胞である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記ＣＴＬＡ４抗体が、イピリムマブもしくはトレメリムマブを含む、および／または
前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、コシベリマブ、ＫＮ０３５（エンバフォリマブ）、ＢＭＳ－９３６５５９、ＢＭＳ９３５５５９、ＭＥＤＩ－４７３６、ＭＰＤＬ－３２８０Ａ、もしくはＭＥＤＩ－４７３７である、請求項１～２または７～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子の治療有効量が、少なくとも１５ｍｇであり、１つまたは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子の治療有効量が、少なくとも１５ｍｇであり、１つまたは複数のＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子の治療有効量が、少なくとも１５ｍｇである、請求項１～２または５～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子の治療有効量が、少なくとも１５ｍｇであり、１つまたは複数の還元剤の治療有効量が、５～５０ｇである、請求項３～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記対象および／または前記がん細胞が、６８０ｎｍまたは６９０ｎｍの波長において１０～６０Ｊ／ｃｍ^２の線量で照射される、請求項１～１４のいずれかに記載の方法。

【請求項16】

前記がん細胞が、対象の血液中にあり、前記がん細胞に照射するステップが、前記対象によって着用されるデバイスを使用することによって前記血液に照射することを含み、前記デバイスが、近赤外（ＮＩＲ）発光ダイオード（ＬＥＤ）を含む、請求項１～１５のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

前記抗体－ＩＲ７００分子に特異的に結合する前記腫瘍特異的タンパク質を発現するがんを有する対象を選択するステップ
をさらに含む、請求項１～１６のいずれかに記載の方法。

【請求項18】

前記がんの重量、体積、もしくはサイズを、処置がない状態と比べて少なくとも２５％低減させる、
６６０～７４０ｎｍの波長において照射されておらず、前記腫瘍もしくは病変部の照射された領域から遠位に位置する転移の重量、体積、もしくはサイズを、処置がない状態と比べて少なくとも２５％低減させる、
前記対象の生存期間を、処置がない状態と比べて増加させる、
前記対象の無増悪生存期間を、処置がない状態と比べて増加させる、
前記対象の無疾患生存期間を、処置がない状態と比べて増加させる、または
これらの組合せを行う、請求項１～１７のいずれかに記載の方法。

【請求項19】

ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ Ｔｒｅｇを選択的に殺滅する、
前記がん内の全生細胞およびＴ細胞集団から、ＣＴＬＡ４^＋細胞を選択的に枯渇させるが、領域リンパ節もしくは脾臓内では枯渇させず、
ＣＤ８^＋／ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋比を増加させる、
ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比を増加させる、
ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^－細胞：ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞比を増加させる、
腫瘍内血液灌流を減少させる、または
これらの組合せを行う、請求項１～２または１０～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記処置された対象において、浮腫および／または急性炎症性反応を、前記１つまたは複数の還元剤の非存在下における浮腫および／または急性炎症性反応の量と比較して少なくとも２０％低減させる、請求項３～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記がんが、気道または縦隔におけるがんである、請求項３～１８または２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記１つまたは複数の還元剤が、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、Ｌ－システイン、グルタチオン、またはこれらの組合せを含む、請求項３～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記１つまたは複数の還元剤が、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウムである、請求項３～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記対象に、治療有効量の１つもしくは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数のＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子、またはこれらの組合せを投与するステップをさらに含む、請求項３～９、１１、１３～１８、または２０～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記対象に照射するステップおよび／または前記対象におけるがん細胞に照射するステップが、６６０～７４０ｎｍの波長における少なくとも１Ｊ／ｃｍ^２の線量での２回またはそれよりも多くの照射線量を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記２回またはそれよりも多くの照射線量は、互いに約１２～３６時間、例えば、約２４時間以内に投与される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記対象に、前記がん細胞の表面上の前記腫瘍特異的タンパク質に特異的に結合する、２回またはそれよりも多くの用量の前記１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子が投与される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記がん細胞の表面上の前記腫瘍特異的タンパク質に特異的に結合する、前記１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子の前記２回またはそれよりも多くの用量が、約２４～４８時間離れている、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記照射するステップの約０～４８時間後に、蛍光寿命イメージングにより前記がん細胞を検出するステップ
をさらに含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記対象に、２回またはそれよりも多くの用量の前記１つもしくは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子および／または前記１つもしくは複数のＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子が投与される、請求項１～２、７、または１０～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記対象に、治療有効量の１つまたは複数の免疫活性化因子を投与するステップをさらに含む、請求項３～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記１つまたは複数の免疫活性化因子が、ＩＬ－１５、インターフェロンガンマ、またはその両方を含む、請求項１、２、または３１に記載の方法。

【請求項33】

前記方法が、対象の血液中のがん細胞を殺滅する方法であり、前記照射するステップが、前記がん細胞に、ＮＩＲ ＬＥＤを用いて、６６０～７４０ｎｍの波長において少なくとも１Ｊ／ｃｍ２の線量で照射することを含み、前記ＮＩＲ ＬＥＤが、前記対象によって着用される着用可能デバイスに存在する、請求項１～３２のいずれかに記載の方法。

【請求項34】

対象におけるＥＧＦＲを発現するがんを処置するための方法であって、
前記対象に、治療有効量の１つまたは複数の抗ＥＧＦＲ－ＩＲ７００分子を投与するステップと、
前記対象に、治療有効量の１つまたは複数の抗ＣＴＬＡ４－ＩＲ７００分子を投与するステップと、
続いて、６７０～７００ｎｍの波長において４～１００Ｊ／ｃｍ^２の線量で前記対象に照射するステップおよび／または前記対象におけるＥＧＦＲを発現するがん細胞に照射するステップと
を含み、
前記１つまたは複数の抗ＥＧＦＲ－ＩＲ７００分子および前記１つまたは複数の抗ＣＴＬＡ４－ＩＲ７００分子が、逐次的または同時に投与され、
それによって、前記対象における前記ＥＧＦＲを発現するがんを処置する、方法。

【請求項35】

前記ＥＧＦＲ抗体が、パニツムマブまたはセツキシマブを含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記ＣＴＬＡ４抗体が、イピリムマブまたはトレメリムマブを含む、請求項３４～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

対象におけるがんを処置するための方法であって、
前記対象に、治療有効量の１つまたは複数の抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００分子を投与するステップと、
前記対象に、治療有効量の１つまたは複数の免疫活性化因子を投与するステップと、
続いて、６７０～７００ｎｍの波長において４～１００Ｊ／ｃｍ^２の線量で前記対象に照射するステップおよび／または前記対象におけるがん細胞に照射するステップと
を含み、
前記１つまたは複数の抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００分子および前記１つまたは複数の免疫活性化因子が、逐次的または同時に投与され、
それによって、前記対象における前記がんを処置する、方法。

【請求項38】

前記抗ＰＤ－Ｌ１が、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、コシベリマブ、ＫＮ０３５（エンバフォリマブ）、ＢＭＳ－９３６５５９、ＢＭＳ９３５５５９、ＭＥＤＩ－４７３６、ＭＰＤＬ－３２８０Ａ、またはＭＥＤＩ－４７３７である、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記１つまたは複数の免疫活性化因子が、ＩＬ－１５、インターフェロンガンマ、またはその両方を含む、請求項３７または３８に記載の方法。

【請求項40】

前記対象に、治療有効量の１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子を投与するステップであって、前記抗体が、がん細胞の表面上の腫瘍特異的タンパク質に特異的に結合し、前記腫瘍特異的タンパク質が、上皮成長因子受容体ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ、ＣＴＬＡ４、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２、ＣＤ３、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα受容体）、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＤ２０６、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ルイスＹ、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、グリピカン－３、ｇｐＡ３３、ムチン、ＣＡＩＸ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド、インテグリンαＶβ３、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＢＣＲ複合体、ｇｐ７２、ＨＬＡ－ＤＲ１０β、ＨＬＡ－ＤＲ抗原、ＩｇＥ、ＣＡ２４２、ＰＥＭ抗原、ＳＫ－１抗原、ＰＤ－１、またはＰＤ－Ｌ２を含む、ステップをさらに含む、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記ＣＴＬＡ４抗体が、イピリムマブまたはトレメリムマブを含み、前記ＥＧＦＲ抗体が、パニツムマブまたはセツキシマブを含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

対象におけるがん処置により生じる浮腫を低減させるための方法であって、
前記対象に、治療有効量の１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子を投与するステップであって、前記抗体が、がん細胞の表面上の腫瘍特異的タンパク質に特異的に結合するか、または免疫細胞の表面上のタンパク質に結合する、ステップと、
前記対象に、治療有効量のＬ－アスコルビン酸ナトリウムを投与するステップと、
６６０～７４０ｎｍの波長において少なくとも１Ｊ／ｃｍ^２の線量で前記対象に照射するステップおよび／または前記対象におけるがん細胞に照射するステップと
を含み、
前記１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子および前記１つまたは複数の還元剤が、逐次的または同時に投与され、
それによって、対象におけるがん処置により生じる浮腫を低減させる、方法。

【請求項43】

免疫細胞の表面上の前記タンパク質が、ＣＴＬＡ４であり、前記腫瘍特異的タンパク質が、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ、ＰＤ－Ｌ１、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２、ＣＤ３、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα受容体）、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＤ２０６、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ルイスＹ、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、グリピカン－３、ｇｐＡ３３、ムチン、ＣＡＩＸ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド、インテグリンαＶβ３、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＢＣＲ複合体、ｇｐ７２、ＨＬＡ－ＤＲ１０β、ＨＬＡ－ＤＲ抗原、ＩｇＥ、ＣＡ２４２、ＰＥＭ抗原、ＳＫ－１抗原、ＰＤ－１、またはＰＤ－Ｌ２を含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記がんが、高度または中等度に免疫原性のがんである、請求項１～４３のいずれかに記載の方法。

【請求項45】

前記高度または中等度に免疫原性のがんが、黒色腫、肺がん、または腎細胞癌である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記がんが、低免疫原性がんである、請求項１～４３のいずれかに記載の方法。

【請求項47】

前記低免疫原性がんが、乳がん、膵臓がん、中咽頭がん、または口腔扁平上皮細胞がんである、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

アブスコパル効果を有する、請求項１～４７のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／１４３，０６８号のより早い出願日の優先権の利益を主張し、その全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

分野
本開示は、近赤外（ＮＩＲ）光での照射後に、抗体－ＩＲ７００コンジュゲートを、他の治療剤、例えば、１つもしくは複数の抗ＣＴＬＡ４－ＩＲ７００コンジュゲート、抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００コンジュゲート、１つもしくは複数の免疫活性化因子、および／または１つもしくは複数の還元剤と組み合わせて使用して、細胞、例えば、がん細胞を殺滅する、方法に関する。

【0003】

政府の支援に関する謝辞
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによりプロジェクト番号Ｚ０１ ＺＩＡ ＢＣ ０１１５１３のもとに政府の支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

【背景技術】

【0004】

背景
がんの治療法はいくつか存在するが、非がん性細胞を損傷することなく腫瘍細胞を効果的に殺滅する治療法に対する必要性が残っている。

【0005】

外科手術、放射線照射、および化学療法を含む、従来的ながん療法の副作用を最小限に抑えるために、分子標的化がん療法が開発されている。既存の標的化療法のなかでも、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）療法が、もっとも長い歴史を有する。多数の治療用ＭＡｂが、Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）によって承認されている（Waldmann, Nat Med 9:269-277, 2003、Reichert et al., Nat Biotechnol 23:1073-1078, 2005）。有効なＭＡｂ療法は、従来的に、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、および受容体遮断の３つの機序に依存し、複数回の高用量のＭＡｂを必要とする。ＭＡｂはまた、放射性核種（Goldenberg et al., J Clin Oncol 24, 823-834, 2006）または化学的もしくは生物学的毒素（Pastan et al., Nat Rev Cancer 6:559-565, 2006）などの治療を送達するためのベクターとしてより低い用量で使用されている。最終的には、しかしながら、用量制限毒性は、抗体コンジュゲートの生体分布および異化に関連する。

【0006】

光感受性物質を非イオン化光の物理的エネルギーを組み合わせて細胞を殺滅する従来的な光線力学的療法は、現在利用可能な非標的化光感作剤が、正常組織にも取り込まれ、したがって、励起光自体は近赤外（ＮＩＲ）範囲で無害であるが副作用を引き起こすため、がん療法には一般的にあまり用いられていない。免疫調節性抗体、がんワクチン、および細胞に基づく治療法の使用を含む、がん免疫療法もまた、がんを制御する戦略となっている（Chen and Mellman, Immunity 39:1-10, 2013、Childs and Carsten, Nat. Rev. Drug Discov. 14:487-498, 2015、June et al., Sci. Transl. Med. 7:280ps7, 2015、Melero et al., Nat. Rev. Cancer 15:457-472, 2015）。

【0007】

近赤外光免疫療法（ＮＩＲ－ＰＩＴ）は、標的化モノクローナル抗体－光吸収剤コンジュゲート（ＡＰＣ）を用いるがん処置である。腫瘍細胞表面抗原へのＡＰＣの抗体局在化の後に、ＮＩＲ光を使用して、高度に選択的な細胞溶解を誘導する。ＮＩＲ－ＰＩＴは、急速な壊死性細胞死を誘導し、これにより、免疫原性細胞死（ＩＣＤ）と調和して樹状細胞（ＤＣ）を活性化する自然免疫リガンドが生じる。ＮＩＲ－ＰＩＴが腫瘍細胞を殺滅する方法についての説明は、Sato et al. (ACS Cent. Sci. 4:1559-69, 2018)に記載されている。簡単に述べると、抗体－ＩＲ７００コンジュゲートがその標的に結合した後、ＮＩＲ光による活性化により、抗体－抗原複合体の形状に物理的変化が生じ、これが、細胞膜内の物理的応力を誘導し、膜をまたぐ水流の増加をもたらし、これが、最終的に、細胞の破裂および壊死性細胞死を引き起こす。２０２０年９月、ヒト使用のための最初のＡＰＣであるセツキシマブ－ＩＲ７００（ＡＳＰ１９２９）が、日本においてＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ａｇｅｎｃｙ（ＰＭＤＡ）により臨床使用が条件的に承認され、登録された。

【0008】

細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）は、抗腫瘍免疫抑制を媒介する主要な免疫チェックポイントリガンド分子である。抗ＣＴＬＡ４免疫療法の抗腫瘍有効性は、１９９６年に初めて報告され、２０１１年にＣＴＬＡ４標的化抗体であるイピリムマブのＦＤＡ承認につながった。ＣＴＬＡ４標的化療法に加えて、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を標的とする治療法は、抗腫瘍効果を誘導することが示されている。Ｔｒｅｇが通常抗腫瘍免疫を下方調節する３つの重要な機序が存在する：（ｉ）ＣＴＬＡ４軸を促進すること、（ｉｉ）エフェクターＴ細胞に利用可能なＩＬ－２の量を低減させること、ならびに（ｉｉｉ）免疫抑制性サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０およびＴＧＦ－βを産生させること。実際に、抗ＣＴＬＡ４免疫療法は、ＣＴＬＡ４経路に干渉するという理由だけでなく、腫瘍内Ｔｒｅｇの枯渇をもたらすという理由でも、有効であると考えられている。しかしながら、抗ＣＴＬＡ４療法およびＴｒｅｇ枯渇を含む全身がん免疫療法は、多くの場合、自己免疫有害事象を誘導し、したがって、より腫瘍特異的な方法が、望ましいであろう。

【0009】

抗腫瘍免疫抑制を媒介する別の主要な免疫チェックポイントリガンド分子は、プログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）であり、これは、Ｔリンパ細胞上に発現するＰＤ－１受容体に結合し、細胞機能を抑制する。ＰＤ－Ｌ１は、がん細胞を含む様々な細胞に条件的に発現する。細胞傷害性Ｔ細胞に依拠する抗腫瘍宿主免疫は、ＰＤ－Ｌ１発現微小環境下において抑制され得る。これらの分子に対する抗体を使用したＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸の遮断は、抗ＣＴＬＡ４療法と同様に免疫チェックポイントを阻害し、いくらかの割合の患者においてがん細胞に対する有効な免疫活性化をもたらした。しかしながら、抗ＣＴＬＡ４療法と同様に、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法を含む全身がん免疫療法は、多くの場合、自己免疫有害事象を誘導し、したがって、より腫瘍特異的な方法が、望ましいであろう。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Waldmann, Nat Med 9:269-277, 2003

【非特許文献2】Reichert et al., Nat Biotechnol 23:1073-1078, 2005

【非特許文献3】Goldenberg et al., J Clin Oncol 24, 823-834, 2006

【非特許文献4】Pastan et al., Nat Rev Cancer 6:559-565, 2006

【非特許文献5】Chen and Mellman, Immunity 39:1-10, 2013

【非特許文献6】Childs and Carsten, Nat. Rev. Drug Discov. 14:487-498, 2015

【非特許文献7】June et al., Sci. Transl. Med. 7:280ps7, 2015

【非特許文献8】Melero et al., Nat. Rev. Cancer 15:457-472, 2015

【非特許文献9】Sato et al. ACS Cent. Sci. 4:1559-69, 2018

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

本開示の概要
がんを有する対象を、ＮＩＲ－光免疫療法（ＰＩＴ）を使用して、（１）１つもしくは複数の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数のプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）抗体－ＩＲ７００分子、またはこれらの組合せ、（２）１つまたは複数の還元剤、あるいは（１）および（２）の両方と組み合わせた、腫瘍特異的タンパク質抗体－ＩＲ７００分子（抗体－光吸収剤コンジュゲート（ＡＰＣ））および／または１つもしくは複数の免疫活性化因子の組合せで処置する方法が、本明細書において提供される。

【0012】

１つの例では、方法は、がんを有する対象に、治療有効量の（ａ）（ｉ）１つもしくは複数の抗体－ＩＲ７００分子であって、抗体が、がん細胞表面分子、例えば、腫瘍特異的抗原に特異的に結合する、抗体－ＩＲ７００分子、および／または（ｉｉ）１つもしくは複数の免疫活性化因子（例えば、ＩＬ－１５、インターフェロンガンマ、もしくはその両方）、ならびに（ｂ）１つもしくは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数のＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子、またはその両方を投与するステップを含む。一部の例では、腫瘍特異的タンパク質は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１）、メソテリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２、ＣＤ３、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα受容体）、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＤ２０６、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ルイスＹ、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）、グリピカン－１、グリピカン－２、グリピカン－３、ｇｐＡ３３、ムチン（例えば、ＭＵＣ１、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、もしくはがん抗原１２５（ＣＡ１２５））、ＣＡＩＸ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ１、もしくはＧＭ２）、インテグリンαＶβ３、インテグリンα５ β３，１、Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ３（ＥＲＢＢ３）、ＭＥＴ癌原遺伝子、受容体チロシンキナーゼ（ＭＥＴ）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、エフリンＡ型受容体３（ＥＰＨＡ３）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬＲ１）、ＴＲＡＩＬＲ２、核内因子カッパ－Ｂリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、テネイシン、ＢＣＲ複合体、ｇｐ７２、ＨＬＡ－ＤＲ１０β、ＨＬＡ－ＤＲ抗原、ＩｇＥ、ＣＡ２４２、多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）抗原、ＳＫ－１抗原、プログラム死１（ＰＤ－１）、またはプログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）を含む。具体的な例では、腫瘍特異的タンパク質は、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１であり、それらの例のうちの一部では、抗体－ＩＲ７００分子は、パニツムマブまたはセツキシマブを含む。具体的な例では、ＥＧＦＲ抗体－ＩＲ７００およびＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００が、投与される。具体的な例では、ＩＬ－１５およびＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００が、投与される。具体的な例では、ＩＦＮ－ガンマおよびＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００が、投与される。具体的な例では、ＥＧＦＲ抗体－ＩＲ７００およびＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００が、投与される。具体的な例では、ＩＬ－１５およびＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００が、投与される。具体的な例では、ＩＦＮ－ガンマおよびＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００が、投与される。（ａ）および（ｂ）の分子は、同時に、実質的に同時に、または逐次的に（例えば、互いに約０～２４時間以内に）投与され得る。一部の例では、（ａ）および（ｂ）の分子は、静脈内投与される。次いで、対象または対象におけるがん細胞（例えば、腫瘍、または血液中のがん細胞）は、続いて、６６０～７４０ｎｍ、例えば、６６０～７１０ｎｍ、または６８０もしくは６９０ｎｍの波長において少なくとも１Ｊ／ｃｍ^２（例えば、少なくとも１０Ｊ／ｃｍ^２または少なくとも２０Ｊ／ｃｍ^２、例えば、１０～６０Ｊ／ｃｍ^２、１０Ｊ／ｃｍ^２～５０Ｊ／ｃｍ^２、２０～５０Ｊ／ｃｍ^２、２０Ｊ／ｃｍ^２～６０Ｊ／ｃｍ^２、または２０～３０Ｊ／ｃｍ^２）の線量で照射される。

【0013】

対象におけるがんを処置するための方法であって、ＮＩＲ－ＰＩＴ療法の望まれない副作用、例えば、浮腫を低減させるために１つまたは複数の還元剤の投与を含む、方法が、提供される。そのような方法は、対象に、治療有効量の１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子を投与するステップであって、抗体が、がん細胞の表面上の腫瘍特異的タンパク質または免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の表面上の免疫細胞特異的タンパク質に特異的に結合する、ステップを含み得る。一部の例では、腫瘍特異的タンパク質または免疫細胞特異的タンパク質は、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ１、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２、ＣＤ３、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα受容体）、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＤ２０６、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ルイスＹ、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、グリピカン－１、グリピカン－２、グリピカン－３、ｇｐＡ３３、ムチン（例えば、ＭＵＣ１、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、もしくはがん抗原１２５（ＣＡ１２５））、ＣＡＩＸ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ１、もしくはＧＭ２）、インテグリンαＶβ３、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＢＣＲ複合体、ｇｐ７２、ＨＬＡ－ＤＲ１０β、ＨＬＡ－ＤＲ抗原、ＩｇＥ、ＣＡ２４２、ＰＥＭ抗原、ＳＫ－１抗原、ＰＤ－１、またはＰＤ－Ｌ２であるか、またはこれらを含む。１つの例では、腫瘍特異的タンパク質は、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲであるか、またはそれを含み、それらの例のうちの一部では、抗体は、パニツムマブまたはセツキシマブであるか、またはそれを含む。１つの例では、免疫細胞特異的タンパク質は、ＣＴＬＡ４であるか、またはそれを含み、それらの例のうちの一部では、抗体は、イピリムマブまたはトレメリムマブであるか、またはそれを含む。１つの例では、腫瘍特異的タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１であるか、またはそれを含み、それらの例のうちの一部では、抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、コシベリマブ、ＫＮ０３５（エンバフォリマブ）、ＢＭＳ－９３６５５９、ＢＭＳ９３５５５９、ＭＥＤＩ－４７３６、ＭＰＤＬ－３２８０Ａ、またはＭＥＤＩ－４７３７であるか、またはそれを含む。方法は、対象に、治療有効量の１つまたは複数の還元剤、例えば、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、Ｌ－システイン、グルタチオン、またはこれらの組合せを投与するステップをさらに含む。１つの例では、１つまたは複数の還元剤は、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウムであるか、またはそれを含む。一部の例では、方法は、対象に、治療有効量の１つもしくは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数のＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数の免疫活性化因子、またはこれらの組合せを投与するステップをさらに含む。１つまたは複数の腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子および１つまたは複数の還元剤（ならびに必要に応じて１つもしくは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数のＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数の免疫活性化因子、またはこれらの組合せ）は、逐次的または同時に投与され得る。一部の例では、抗体－ＩＲ７００分子は、静脈内投与され、還元剤は、腹腔内投与される。方法はまた、６６０～７４０ｎｍ、例えば、６６０～７１０ｎｍ、または６８０もしくは６９０ｎｍの波長において少なくとも１Ｊ／ｃｍ^２（例えば、少なくとも１０Ｊ／ｃｍ^２または少なくとも２０Ｊ／ｃｍ^２、例えば、１０～６０Ｊ／ｃｍ^２、１０Ｊ／ｃｍ^２～５０Ｊ／ｃｍ^２、２０～５０Ｊ／ｃｍ^２、２０Ｊ／ｃｍ^２～６０Ｊ／ｃｍ^２、または２０～３０Ｊ／ｃｍ^２）の線量で対象に照射するステップおよび／または対象におけるがん細胞に照射するステップも含む。一部の例では、照射は、１つまたは複数の腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子および１つまたは複数の還元剤の投与の後に行われる。一部の例では、１つまたは複数の還元剤は、照射するステップの前に投与される。一部の例では、１つまたは複数の還元剤は、照射するステップの後に投与される。１つまたは複数の還元剤の使用は、ＮＩＲ－ＰＩＴの望ましくない効果、例えば、浮腫、急性炎症性反応、またはその両方を低減することができる。一部の例では、ＮＩＲ－ＰＩＴと組み合わせた１つまたは複数の還元剤の使用は、処置される対象における浮腫を、ＮＩＲ－ＰＩＴとともに１つまたは複数の還元剤を使用しない浮腫の量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはさらには少なくとも９５％低減させる。一部の例では、ＮＩＲ－ＰＩＴと組み合わせた１つまたは複数の還元剤の使用は、処置される対象における急性炎症性反応を、ＮＩＲ－ＰＩＴとともに１つまたは複数の還元剤を使用しない急性炎症性反応の量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはさらには少なくとも９５％低減させる。

【0014】

一部の例では、本明細書に提供される方法は、抗体－ＩＲ７００分子に特異的に結合し得るがん細胞表面タンパク質を発現する腫瘍またはがんを有するがんを有する対象を選択するステップをさらに含む。

【0015】

一部の例では、開示される方法で処置されるがんまたはがん細胞は、乳房、肝臓、結腸、卵巣、前立腺、膵臓、脳、子宮頸部、腎臓、骨、皮膚、頭頸部、中咽頭、または血液のがんまたはがん細胞である。１つの例では、がんが、気道または縦隔におけるがんである、がん（caner）またはがん細胞。一部の例では、処置されるがんは、高度または中等度に免疫原性のがん、例えば、黒色腫、肺がん、または腎細胞癌である。一部の例では、処置されるがんは、低免疫原性がん、例えば、乳がん、膵臓がん、中咽頭がん、または口腔扁平上皮細胞がんである。

【0016】

一部の例では、開示される方法は、アブスコパル効果を有する。

【0017】

一部の例では、方法は、対象の血液におけるがん細胞を殺滅する方法であり、照射するステップは、がん細胞に、ＮＩＲ ＬＥＤを用いて６６０～７４０ｎｍの波長において少なくとも１Ｊ／ｃｍ^２の線量で（例えば、６８０ｎｍまたは６９０ｎｍ、１０～６０Ｊ／ｃｍ^２の線量、例えば、２０～５０Ｊ／ｃｍ^２または２０～３０Ｊ／ｃｍ^２の線量で）照射することを含み、ＮＩＲ ＬＥＤは、対象によって着用される着用可能デバイスに存在する。

【0018】

開示される方法の照射するステップは、６６０～７４０ｎｍの波長における少なくとも１Ｊ／ｃｍ^２の線量での２回またはそれよりも多くの照射線量を投与することを含み得る。例えば、２回またはそれよりも多くの照射線量は、互いに約１２～３６時間、例えば、約２４時間以内に投与される。

【0019】

一部の例では、対象は、がん細胞の表面上の腫瘍特異的タンパク質に特異的に結合する、２回またはそれよりも多くの用量、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回の用量の１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子を投与される。一部の例では、がん細胞の表面上の腫瘍特異的タンパク質に特異的に結合する、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子の２回またはそれよりも多くの用量は、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、または少なくとも１週間、例えば、約２４～４８時間、離れている。

【0020】

一部の例では、ＩＲ７００にコンジュゲートしたＣＴＬＡ４抗体は、イピリムマブまたはトレメリムマブであるか、またはそれを含む。

【0021】

一部の例では、ＩＲ７００にコンジュゲートしたＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、コシベリマブ、ＫＮ０３５（エンバフォリマブ）、ＢＭＳ－９３６５５９、ＢＭＳ９３５５５９、ＭＥＤＩ－４７３６、ＭＰＤＬ－３２８０Ａ、またはＭＥＤＩ－４７３７であるか、またはそれを含む。一部の例では、ＩＲ７００にコンジュゲートしたＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブまたはアベルマブであるか、またはそれを含む。一部の例では、ＩＲ７００にコンジュゲートしたＰＤ－Ｌ１抗体は、デュルバルマブ、ＫＮ０３５、またはコシベリマブであるか、またはそれを含む。一部の例では、ＩＲ７００にコンジュゲートしたＰＤ－Ｌ１抗体は、ＢＭＳ－９３６５５９、ＢＭＳ９３５５５９、ＭＥＤＩ－４７３６、ＭＰＤＬ－３２８０Ａ、またはＭＥＤＩ－４７３７を含むか、またはそれからなる。

【0022】

一部の例では、ＥＧＦＲ抗体－ＩＲ７００分子において使用されるＥＧＦＲ抗体は、パニツムマブまたはセツキシマブであるか、またはそれを含む。

【0023】

一部の例では、対象は、２回またはそれよりも多くの用量、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回の用量の、ＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、および／または１つもしくは複数のＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子が投与される。一部の例では、２回またはそれよりも多くの用量は、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、または少なくとも１週間、例えば、約２４～４８時間、離れている。

【0024】

一部の例では、腫瘍特異的抗体は、がん細胞表面上の１つまたは複数のタンパク質（例えば、受容体）に結合し、ここで、がん細胞表面上のタンパク質は、非がん細胞（例えば、正常な健常細胞）には有意に見出されず、したがって、抗体は、非がん細胞には有意に結合しない。１つの例では、腫瘍特異的タンパク質は、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲである。具体的な例では、ＥＧＦＲに特異的なＥＧＦＲ抗体は、パニツムマブまたはセツキシマブであるか、またはそれを含む。１つの例では、腫瘍特異的タンパク質は、ＨＥＲ２またはＰＳＭＡである。１つの例では、腫瘍特異的タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ４である。腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子（例えば、これらの抗原のうちの１つまたは複数に特異的な抗体を含む）によって認識され得る追加の例示的な腫瘍特異的タンパク質としては、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＣＤ３、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα受容体）、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＤ２０６、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ルイスＹ、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、グリピカン－１、グリピカン－２、グリピカン－３、ｇｐＡ３３、ムチン（例えば、ＭＵＣ１、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、またはがん抗原１２５（ＣＡ１２５））、ＣＡＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ１、またはＧＭ２）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）、インテグリンαＶβ３、インテグリンα５ β３，１、インテグリンαＶβ３、インテグリンα５ β３，１、Ｅｒｂ－Ｂ２ ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＢＣＲ複合体、ｇｐ７２、ＨＬＡ－ＤＲ１０β、ＨＬＡ－ＤＲ抗原、ＩｇＥ、ＣＡ２４２、多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）抗原、ＳＫ－１抗原、ＰＤ－Ｌ１、およびプログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）が挙げられる。追加の例示的な腫瘍特異的タンパク質および抗体は、本明細書に提供される（以下の表１を含む）。

【0025】

一部の例では、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子（例えば、ＥＧＦＲ抗体－ＩＲ７００）の治療有効量は、少なくとも１００ｍｇ／ｍ^２、例えば、少なくとも２００ｍｇ／ｍ^２、少なくとも３００ｍｇ／ｍ^２、少なくとも４００ｍｇ／ｍ^２、または少なくとも５００ｍｇ／ｍ^２、例えば、１００～８００ｍｇ／ｍ^２、１００～５００ｍｇ／ｍ^２、２５０～７００ｍｇ／ｍ^２、２５０～５００ｍｇ／ｍ^２、または３００～５００ｍｇ／ｍ^２である。一部の例では、１つまたは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子の治療有効量は、少なくとも１００ｍｇ／ｍ^２、例えば、少なくとも２００ｍｇ／ｍ^２、少なくとも３００ｍｇ／ｍ^２、少なくとも４００ｍｇ／ｍ^２、または少なくとも５００ｍｇ／ｍ^２、例えば、１００～８００ｍｇ／ｍ^２、１００～５００ｍｇ／ｍ^２、２５０～７００ｍｇ／ｍ^２、２５０～５００ｍｇ／ｍ^２、または３００～５００ｍｇ／ｍ^２である。一部の例では、１つまたは複数のＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子の治療有効量は、少なくとも１００ｍｇ／ｍ^２、例えば、少なくとも２００ｍｇ／ｍ^２、少なくとも３００ｍｇ／ｍ^２、少なくとも４００ｍｇ／ｍ^２、または少なくとも５００ｍｇ／ｍ^２、例えば、１００～８００ｍｇ／ｍ^２、１００～５００ｍｇ／ｍ^２、２５０～７００ｍｇ／ｍ^２、２５０～５００ｍｇ／ｍ^２、または３００～５００ｍｇ／ｍ^２である。一部の例では、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子（例えば、ＥＧＦＲ抗体－ＩＲ７００）の治療有効量は、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも１００ｍｇ、少なくとも２００ｍｇ、少なくとも３００ｍｇ、少なくとも４００ｍｇ、または少なくとも５００ｍｇ、例えば、１０～１０００ｍｇ、１５～１０００ｍｇ、１０～５００ｍｇ、１５～３００ｍｇ、または１５～１００ｍｇである。一部の例では、１つまたは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子の治療有効量は、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも１００ｍｇ、少なくとも２００ｍｇ、少なくとも３００ｍｇ、少なくとも４００ｍｇ、または少なくとも５００ｍｇ、例えば、１０～１０００ｍｇ、１５～１０００ｍｇ、１０～５００ｍｇ、１５～３００ｍｇ、または１５～１００ｍｇである。一部の例では、１つまたは複数のＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子の治療有効量は、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも１００ｍｇ、少なくとも２００ｍｇ、少なくとも３００ｍｇ、少なくとも４００ｍｇ、または少なくとも５００ｍｇ、例えば、１０～１０００ｍｇ、１５～１０００ｍｇ、１０～５００ｍｇ、１５～３００ｍｇ、または１５～１００ｍｇである。一部の例では、１つまたは複数の還元剤の治療有効量は、少なくとも１ｇ、例えば、少なくとも５ｇ、少なくとも１０ｇ、少なくとも２５ｇ、少なくとも５０ｇ、少なくとも１００ｇ、少なくとも２００ｇ、または少なくとも３００ｇ、例えば、１～３００ｇ、１０～３００ｇ、５～５０ｇ、５～２５ｇ、５～１００ｇ、または１００～３００ｇである。

【0026】

一部の例では、がん細胞は、対象の血液中にあり、がん細胞に照射するステップは、対象によって着用されるデバイスを使用することによって血液に照射することを含み、デバイスは、近赤外（ＮＩＲ）発光ダイオード（ＬＥＤ）を含む。

【0027】

一部の例では、方法は、抗体－ＩＲ７００分子に特異的に結合する腫瘍特異的タンパク質を発現するがんを有する対象を選択するステップをさらに含む。

【0028】

一部の例では、開示される方法は、がんの重量、体積、もしくはサイズを、処置がない状態と比べて少なくとも２５％低減させる、６６０～７４０ｎｍの波長で照射されておらず、腫瘍もしくは病変部の照射されたエリアから遠位に位置する転移の重量、体積、もしくはサイズを、処置がない状態と比べて少なくとも２５％低減させる（例えば、アブスコパル効果が存在する）、対象の生存期間を、処置がない状態と比べて増加させる、対象の無増悪生存期間を、処置がない状態と比べて増加させる、対象の無疾患生存期間を、処置がない状態と比べて増加させる、またはこれらの組合せを行う。

【0029】

一部の例では、開示される方法、例えば、ＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子を利用するものは、ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ Ｔｒｅｇを選択的に殺滅する、がん内の全生細胞およびＴ細胞集団からＣＴＬＡ４^＋細胞を選択的に枯渇させるが、領域リンパ節もしくは脾臓内では枯渇させず、ＣＤ８^＋／ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋比を増加させる、ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比を増加させる、腫瘍内血液灌流を減少させる、またはこれらの組合せを行う。

【0030】

一部の例では、開示される方法は、例えば、照射するステップの約０～４８時間後に、蛍光寿命イメージングによりがん細胞を検出するステップをさらに含む。

【0031】

一部の例では、開示される方法は、対象に、治療有効量の１つまたは複数の免疫活性化因子、例えば、ＩＬ－１５、インターフェロンガンマ、またはその両方を投与するステップをさらに含む。特定の実施形態では、免疫活性化因子は、１つまたは複数の免疫系活性化因子および／または免疫サプレッサー細胞の阻害剤、例えば、アンタゴニストＰＤ－１抗体、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体、またはＣＤ２５抗体－ＩＲ７００分子を含む。一部の例では、免疫サプレッサー細胞の阻害剤は、活性を阻害し、かつ／または調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を殺滅する。他の例では、免疫系活性化因子は、１つまたは複数のインターロイキン（例えば、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５）を含む。免疫モジュレーターは、一部の例では、がん細胞によって発現される１つまたは複数のタンパク質に特異的なメモリーＴ細胞の産生を増加させ得る。一部の例では、１つまたは複数の免疫活性化因子の治療有効量は、少なくとも０．１ｍｇ、少なくとも０．５ｍｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも２ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、もしくは少なくとも５０ｍｇ、例えば、０．１～１００ｍｇ、０．５～５０ｍｇ、０．５～２５ｍｇ、０．５～１０ｍｇ、１～５ｍｇ、２～４ｍｇ、もしくは１～１０ｍｇ（例えば、ｉｖ投与に関して）であるか、または少なくとも０．０１ｍｇ、少なくとも０．０５ｍｇ、少なくとも０．１ｍｇ、もしくは少なくとも１ｍｇ、例えば、０．０１～１ｍｇ、０．１～１ｍｇ、０．０１～０．０７５ｍｇ、０．５～１ｍｇ、０．１～０．５ｍｇ、もしくは０．０５～０．５ｍｇ（例えば、腫瘍内投与に関して）である。

【0032】

一部の例では、１つまたは複数の免疫活性化因子は、ＮＩＲ照射の投与の前に投与される。一部の例では、１つまたは複数の免疫活性化因子は、ＮＩＲ照射の投与の後に投与される。一部の例では、１つまたは複数の免疫活性化因子は、ＮＩＲ照射の投与の前および後に投与される。

【0033】

対象におけるＥＧＦＲを発現するがんを処置するための方法が、本明細書において提供される。そのような方法は、対象に、（１）治療有効量の１つまたは複数の抗ＥＧＦＲ－ＩＲ７００分子、および（２）治療有効量の１つまたは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子を投与するステップを含み得る。投与の後に、方法は、６７０～７００ｎｍの波長において４～１００Ｊ／ｃｍ^２の線量で（例えば、６８０ｎｍまたは６９０ｎｍ、１０～６０Ｊ／ｃｍ^２、例えば、２０～５０Ｊ／ｃｍ^２、または２０～３０Ｊ／ｃｍ^２の線量で）、対象に照射および／または対象におけるＥＧＦＲを発現するがん細胞に照射し、それによって、対象におけるＥＧＦＲを発現するがんを処置するステップをさらに含む。一部の例では、方法は、例えば、照射の前または後（またはその両方）に、対象に、治療有効量の１つまたは複数の免疫活性化因子、例えば、ＩＬ－１５、インターフェロンガンマ、またはその両方を投与するステップをさらに含む。一部の例では、方法は、例えば、照射の前または後（またはその両方）に、対象に、治療有効量の１つまたは複数の還元剤、例えば、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウムを投与するステップをさらに含む。１つまたは複数の抗ＥＧＦＲ－ＩＲ７００分子および１つまたは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子は、逐次的または同時に投与され得る。一部の例では、ＩＲ７００にコンジュゲートしたＥＧＦＲ抗体は、パニツムマブまたはセツキシマブを含むか、またはそれである。一部の例では、ＩＲ７００にコンジュゲートしたＣＴＬＡ４抗体は、イピリムマブまたはトレメリムマブを含むか、またはそれである。

【0034】

対象におけるがんを処置するための方法が、本明細書において提供される。そのような方法は、対象に、治療有効量の１つまたは複数の抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００分子を投与するステップと、対象に、治療有効量の１つまたは複数の免疫活性化因子（例えば、ＩＬ－１５、インターフェロンガンマ、またはその両方）を投与するステップと、続いて、６７０～７００ｎｍの波長において４～１００Ｊ／ｃｍ^２の線量で対象に照射するステップおよび／または対象におけるがん細胞に照射するステップとを含み得る。１つまたは複数の抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００分子および１つまたは複数の免疫活性化因子は、逐次的または同時に投与され得る。一部の例では、ＩＲ７００にコンジュゲートしたＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、コシベリマブ、ＫＮ０３５（エンバフォリマブ）、ＢＭＳ－９３６５５９、ＢＭＳ９３５５５９、ＭＥＤＩ－４７３６、ＭＰＤＬ－３２８０Ａ、またはＭＥＤＩ－４７３７を含むか、またはそれらである。一部の例では、方法は、例えば、照射の前または後（またはその両方）に、対象に、治療有効量の１つまたは複数の還元剤、例えば、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウムを投与するステップをさらに含む。一部の例では、方法は、対象に、治療有効量の１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子を投与するステップであって、抗体が、がん細胞の表面上の腫瘍特異的タンパク質に特異的に結合する、ステップをさらに含む。一部の例では、腫瘍特異的タンパク質は、上皮成長因子受容体ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ、ＣＴＬＡ４、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２、ＣＤ３、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα受容体）、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＤ２０６、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ルイスＹ、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、グリピカン－３、ｇｐＡ３３、ムチン、ＣＡＩＸ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド、インテグリンαＶβ３、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＢＣＲ複合体、ｇｐ７２、ＨＬＡ－ＤＲ１０β、ＨＬＡ－ＤＲ抗原、ＩｇＥ、ＣＡ２４２、ＰＥＭ抗原、ＳＫ－１抗原、ＰＤ－１、またはＰＤ－Ｌ２を含む。

【0035】

対象におけるがん処置、例えば、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子を使用するＮＩＲ－ＰＩＴ療法により生じる浮腫を低減させるための方法もまた、提供される。そのような方法は、対象に、治療有効量の１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子を投与するステップであって、抗体が、がん細胞の表面上の腫瘍特異的タンパク質（例えば、ＥＧＦＲもしくはＶＥＧＦ）または免疫細胞（例えば、ＣＴＬＡ４）に特異的に結合する、ステップと、対象に、治療有効量の還元剤、例えば、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウムを投与するステップとを含み得る。対象および／またはがん細胞は、６６０～７４０ｎｍの波長において少なくとも１Ｊ／ｃｍ^２の線量で照射される。１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子および１つまたは複数の還元剤は、逐次的または同時に投与され得る。

【0036】

本開示の上述および他の特色は、以下のいくつかの実施形態の詳細な説明、続いて添付の図面への参照により、さらに明らかとなろう。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1A-B】ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ細胞系の特徴、およびパニツムマブまたはＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴによる評価。（Ａ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるパニツムマブ－ＩＲ７００およびＣＴＬＡ４－ＩＲ７００の検証（左：コロイダルブルー染色、右：７００ｎｍ蛍光）。それぞれの希釈した抗体を対照として使用した。（Ｂ）ＮＩＲ－ＰＩＴによって誘導されたｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ細胞の膜損傷を、ＰＩ染色を使用して測定した。各値は、独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。（Ｃ）ＭＴＴアッセイによって測定した代謝活性。対照群は、ＡＰＣ投与を有さなかったか、またはＮＩＲ光照射のみを有した。各値は、独立した実験の平均（対照に対する％の平均）±ＳＥＭを表す。（Ｄ）Ｈ－Ｅ染色による組織学的評価。パニツムマブＮＩＲ－ＰＩＴは、光曝露後１時間以内に腫瘍細胞の膨潤および空胞化を誘導したが、ＣＴＬＡ４ ＮＩＲ－ＰＩＴは、明らかな変化を誘導しなかった。スケールバーは、１００μｍ（上部）または５０μｍ（下部）を表す。（Ｅ）ＬＬ／２－ｌｕｃ、ＭＣ３８－ｌｕｃ、およびｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍の代表的な多重免疫組織化学検査の画像。上部はｐＣＫおよびＤＡＰＩ染色の複合画像、下部はＣＤ４、ＦｏｘＰ３、およびＣＤ８染色の複合画像。腫瘍内ＣＤ８^＋ Ｔ細胞を、多重ＩＨＣ画像内で計数した。データは、ｍｍ^２当たりの細胞計数として示されている。腫瘍内ＣＤ８^＋ Ｔ細胞密度は、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍において、他の腫瘍よりも有意に低かった。腫瘍内ＣＤ８ρ／Ｔｒｅｇ比もまた、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍において、他の腫瘍と比較して低かった（画像、×２００；スケールバー、１００μｍ。ｎ＝４；一方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。

【図1C-D】同上。

【図1E】同上。

【図2A】二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴによるＣＴＬＡ４発現細胞の枯渇。（Ａ）ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍におけるいくつかの細胞のＣＴＬＡ４発現を、フローサイトメトリーによって分析した。腫瘍細胞（ｈＥＧＦＲ＋ＣＤ４５－）、ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ３^＋ＣＤ８＋）、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－ Ｔ細胞、およびＴｒｅｇ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋）におけるＣＴＬＡ４発現の代表的なヒストグラム、ならびにＣＴＬＡ４のＲＦＩが、示されている（ｎ＝５、一方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１）。（Ｂ）代表的なドットプロットは、各ＮＩＲ－ＰＩＴの３時間後のフローサイトメトリーによるｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍内の生細胞におけるＣＴＬＡ４発現を示す。（Ｃ）ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍、腫瘍流入領域リンパ節、および脾臓内の全生細胞中のＣＴＬＡ４^＋細胞のパーセンテージ。ＣＴＬＡ４ ＮＩＲ－ＰＩＴまたは二重ＮＩＲＰＩＴ後の腫瘍内のＣＴＬＡ４発現細胞は、有意に減少した。（Ｄ）代表的なドットプロットは、各ＮＩＲ－ＰＩＴの３時間後のｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍内のＴｒｅｇ集団を示す。（Ｅ）散布図は、腫瘍、腫瘍流入領域リンパ節、および脾臓内のＴｒｅｇ／ＣＤ３ρ、非調節性ＣＤ４^＋（ＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３－）／Ｔｒｅｇ、およびＣＤ８^＋／Ｔｒｅｇの比を示す。ＣＴＬＡ４および二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群において、Ｔｒｅｇ／ＣＤ３^＋比は、有意に減少したが、ＣＤ４^＋／ＴｒｅｇおよびＣＤ８^＋／Ｔｒｅｇ比は、増加した。（ｎ＝４；一方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意差なし）。

【図2B-C】同上。

【図2D】同上。

【図2E】同上。

【図3A】パニツムマブ－ＩＲ７００または抗ＣＴＬＡ４－ＩＲ７００の注射後のｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏ ＩＲ７００蛍光イメージング。ＩＲ７００蛍光および白色光画像を、Ｐｅａｒｌ Ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の７００ｎｍ蛍光チャネルを使用して取得し、Ｐｅａｒｌ Ｃａｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。ＩＲ７００シグナルの連続背側蛍光画像を、５０μｇのｐａｎ－ＩＲ７００またはＣＴＬＡ４－ＩＲ７００を尾静脈から静脈内注射する前、ならびに注射の１／４時間後、１時間後、３時間後、６時間後、９時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、および１２０時間後に取得した。目的の領域（ＲＯＩ）を、腫瘍に設定し、隣接する非腫瘍領域（左背側）をバックグラウンドとして設定した。蛍光強度の平均値を、各ＲＯＩについて計算した。標的対バックグラウンド比（ＴＢＲ）を、以下の式によって腫瘍の蛍光強度およびバックグラウンドの蛍光強度から計算した：（腫瘍の平均蛍光強度）／（バックグラウンドの平均蛍光強度）。（Ａ）一連の７００ｎｍ蛍光画像を、示される時点で取得した。（Ｂ）ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍における平均蛍光強度の定量分析が示されている。（Ｃ）ＴＢＲの定量分析が示されている（Ｂ、Ｃ；ｎ＝５、平均±ＳＥＭ）。

【図3B-C】同上。

【図4】ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍に関するｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの有効性。（Ａ）処置スケジュール。（Ｂ）ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍保持マウスにおけるＮＩＲ－ＰＩＴの前および後の７００ｎｍ蛍光イメージング。（Ａ．Ｕ．；任意単位）（Ｃ）腫瘍体積曲線（ｎ＝１０；平均±ＳＥＭ、反復測定二方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。（Ｄ）生存曲線（ｎ＝１０；ボンフェローニ補正を用いたログランク検定；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。

【図5】ｉｎ ｖｉｖｏでのｈＥＧＦＲおよびＣＴＬＡ４を標的とする組合せＮＩＲ－ＰＩＴの有効性。（Ａ）処置スケジュール。（Ｂ）ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍保持マウスにおけるＮＩＲ－ＰＩＴの前および後の７００ｎｍ蛍光イメージング。腫瘍の７００ｎｍ蛍光は、Ｉ．Ｖ．群を除き、光曝露の直後に減少した。黄色の円は、腫瘍の位置を表す。（Ｃ）腫瘍体積曲線（ｎ＝１２～１３；平均±ＳＥＭ；反復測定二方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、組合せＰＩＴ群と対比）。（Ｄ）生存曲線（ｎ＝１２～１３、ボンフェローニ補正を用いたログランク検定、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；Ｎ．Ｓ．有意差なし）。パニツムマブＮＩＲ－ＰＩＴ、ＣＴＬＡ４ ＮＩＲ－ＰＩＴ、二重ＮＩＲ－ＰＩＴは、それぞれ、１／１２匹、３／１２匹、５／１３匹のマウスにおいて、腫瘍を排除した。

【図6A-B】ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ４４およびＣＴＬＡ４を標的とする組合せＮＩＲ－ＰＩＴの有効性。（Ａ）処置スケジュール。（Ｂ）ＬＬ／２－ｌｕｃ腫瘍保持マウスにおけるＮＩＲ－ＰＩＴの前および後の７００ｎｍ蛍光イメージング。７００ｎｍ蛍光は、Ｉ．Ｖ．群を除き、ＮＩＲ光曝露の直後に減少した。黄色の円は、腫瘍の位置を表す。（Ｃ）ＬＬ／２－ｌｕｃ腫瘍保持マウスにおけるＮＩＲ－ＰＩＴの前および後のＢＬＩ。（Ｄ）ＢＬＩから計算したルシフェラーゼ活性（ｎ＝１０～１２；平均±ＳＥＭ；反復測定二方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；＊、Ｐ＜０．０５；Ｎ．Ｓ．、有意差なし；二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群と対比）。（Ｅ）腫瘍体積曲線（ｎ＝１０～１２；平均±ＳＥＭ；反復測定二方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；Ｎ．Ｓ．、有意差なし；二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群と対比）。（Ｆ）生存曲線（ｎ＝１０～１２、ボンフェローニ補正を用いたログランク検定；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；Ｎ．Ｓ．有意差なし；二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群と対比）。

【図6C-D】同上。

【図6E-F】同上。

【図7A-C】二重ＮＩＲ－ＰＩＴは、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍内の免疫抑制環境を改善した。（Ａ～Ｃ）領域リンパ節内の細胞集団を、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲモデルにおいてフローサイトメトリーによって各ＮＩＲ－ＰＩＴの２日後に分析した。樹状細胞上の活性化マーカー（ＣＤ４０（Ａ）、ＣＤ８（Ｂ）、ＣＤ９６（Ｃ））の発現を、計算した。二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群におけるＣＤ８６発現は、すべての他の群と比較して有意に高かった。（Ｄ）ＮＩＲ光曝露の７日後の腫瘍の多重免疫組織化学染色。右：ＣＤ８（マゼンタ）、ＣＤ４（緑色）、およびＦｏｘｐ３（黄色）のリンパ球マーカー染色。左：統合画像。スケールバー、１００μｍ。（Ｅ）ＣＤ８＋細胞（マゼンタの矢印）、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３－細胞（緑色の矢印）、およびＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞（黄色の矢印）の例。（Ｆ）腫瘍内ＣＤ８＋細胞密度は、二重ＰＩＴ群において、対照群よりも有意に高かった（ｎ＝５、一方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定、＊ｐ＜０．０５）。（Ｇ）腫瘍内ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比もまた、二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群において、すべての他の群と比較して増加した（ｎ＝５、一方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定、＊ｐ＜０．０５）。

【図7D-G】同上。

【図7H】二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、流入領域リンパ節においてＣＤ８^＋ Ｔ細胞を活性化する。ＣＤ８^＋ Ｔ細胞内の活性化マーカー（ＣＤ２５^＋およびＣＤ６９^＋）の発現を、計算した。ＣＤ２５発現は、すべてのＮＩＲ－ＰＩＴ群において有意に増加した。（ｎ＝５；一方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；＊、ｐ＜０．０５；Ｎ．Ｓ．、有意差なし；Ｉ．Ｖ．群と対比）。

【図8】二重ＮＩＲ－ＰＩＴにより、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍に対する長期免疫が得られた。二重ＮＩＲ－ＰＩＴにより完全寛解を達成したマウスに、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍を反対側の側腹部に再接種した。（Ａ）処置スケジュールおよび再接種の位置。（Ｂ）腫瘍体積曲線。対照＝新しく接種した腫瘍；再接種＝二重ＮＩＲ－ＰＩＴによる完全な排除後に再接種した腫瘍（ｎ＝５；平均±ＳＥＭ；反復測定二方向反復測定ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定、＊＊＊＊ｐ＜０．００００１）。（Ｃ）生存曲線（ログランク検定、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

【図9】両側腫瘍モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ二重ＮＩＲ－ＰＩＴの有効性。（Ａ）処置スケジュール。（Ｂ）ＮＩＲ光曝露の図。赤色の円は、ＮＩＲ光が照射された場所を示す。ＮＩＲ光を、右側の腫瘍にのみ曝露した。灰色のマークは、接種された腫瘍を示す。（Ｃ）ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍保持マウスにおけるＮＩＲ－ＰＩＴの前および後の７００ｎｍ蛍光イメージング。７００ｎｍ蛍光は、ＮＩＲ光曝露後に右側でのみ減少し、一方で、７００ｎｍ蛍光は、反対側の腫瘍においては持続した。（Ｄ）腫瘍体積曲線。両方の腫瘍の腫瘍成長は、二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群において、Ｉ．Ｖ．群と比較して有意に抑制された（ｎ＝１０、平均±ＳＥＭ、Ｉ．Ｖ．群の同じ側のみと対比；二方向ＡＮＯＶＡ反復測定に続いてテューキーの検定、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）（Ｅ）生存曲線（ｎ＝１０、ログランク検定、＊＊ｐ＜０．０１；Ｎ．Ｓ．有意差なし）。二重ＮＩＲ－ＰＩＴは、１／１０匹のマウスにおいて腫瘍を排除した）。

【図10】二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴが腫瘍内血液灌流を損なう。処置後の血液灌流分析。ウシアルブミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、ＩＲ７００に使用されるのと同じ方法を使用して、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ ＮＨＳエステル（ＩＲ８００、ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とコンジュゲートした。本発明者らは、コンジュゲートを、アルブミン－ＩＲ８００と略す。ＮＩＲ光曝露の２４時間後に、５０μｇのアルブミン－ＩＲ８００を、静脈内注射した。一連の背側８００ｎｍ蛍光画像を、Ｐｅａｒｌ Ｉｍａｇｅｒの８００ｎｍのチャネルで取得した。（Ａ）腫瘍のウシアルブミン－ＩＲ８００蛍光に基づく灌流の画像を注射の前および５分後、１０分後、１５分後に取得した。（Ｂ）標的対バックグラウンドの比の棒グラフを示す（ｎ＝５；反復測定二方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；＊、Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１）。

【図11A-B】抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００（ＣＤ２７４－Ａｂ－ＩＲ７００）の合成およびＰＤ－Ｌ１標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの細胞殺滅の特異性。（Ａ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００の評価（左：コロイダルブルー染色、右：７００ｎｍ蛍光）。非コンジュゲート抗ＰＤ－Ｌ１抗体を、対照として使用した。（Ｂ）ＳＥＣによる抗ＣＴＬＡ４－ＩＲ７００の評価。ＡＰＣは、２８０および６８９ｎｍの光吸収ならびに対応する蛍光を示した。したがって、コンジュゲートの純度は良好である。（Ｃ）がん細胞系におけるＰＤ－Ｌ１発現のフローサイトメトリー分析。ＭＣ３８－ｌｕｃ（上部）およびＬＬ２－ｌｕｃ（底部）の代表的なヒストグラムを示す。（Ｄ）インターフェロンガンマありまたはなしの細胞培養物およびｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍から得られたがん細胞系ＭＣ３８－ｌｕｃ（左）およびＬＬ２－ｌｕｃ（右）におけるＰＤ－Ｌ１発現のフローサイトメトリー分析。インターフェロンガンマは、ＰＤ－Ｌ１の発現を条件的に増強させる。（Ｅ）ＮＩＲ－ＰＩＴを標的とするｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＤ－Ｌ１は、インターフェロンガンマで処置したＭＣ３８－ｌｕｃ細胞に対してより良好な細胞殺滅を示した。

【図11C-D】同上。

【図11E】同上。

【図12】２０ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮｇａｍｍａ（ＩＦＮγ）での刺激の前および後のがん細胞系におけるＰＤ－Ｌ１発現を示すフローサイトメトリー分析。

【図13】腫瘍浸潤免疫細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現を示すフローサイトメトリー分析。

【図14】ｉｎ ｖｉｖｏで抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００を使用したＭＣ３８－ｌｕｃ腫瘍の処置の効果を示す、グラフ。腫瘍体積（上部のグラフ）および生存（下部のグラフ）に対する効果を、ビヒクル単独（対照）、ＮＩＲ光なしの抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００（Ｉ．Ｖ．）、またはＮＩＲ光ありの抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００（ＰＩＴ）の存在下で示す。（Ａ）もともとの腫瘍の処置、（Ｂ）再接種したマウスの処置。

【図15】ｉｎ ｖｉｖｏで抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００コンジュゲートおよびＩＬ１５プレコンディショニングを使用したＬＬ２－ｌｕｃ腫瘍処置の効果。ビヒクル単独（対照）、ＮＩＲ光なしの抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００（Ｉ．Ｖ．のみ）、ＮＩＲ光ありの抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００（ＰＩＴ）、ＩＬ－１５のみ、ＮＩＲ光なしの抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００＋ＩＬ１５プレコンディショニング（ＩＬ１５＋ＡＰＣ）、またはＮＩＲ光ありの抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７０＋ＩＬ１５プレコンディショニング（ＩＬ１５＋ＰＩＴ）。

【図16】ＳｉＰｃの光分解分析。ＩＲ７００と同軸のリガンドを有するＰｃ ３の合成スキーム。

【図17A-C】Ｌ－ＮａＡＡは、ＩＲ７００からのリガンド放出を加速させる。（Ａ）ＰＢＳ中の様々な濃度のＬ－ＮａＡＡを有する２５μＭのＰｃ ３に、ＮＩＲ光を照射し、７００ｎｍ蛍光イメージングを使用してイメージングした。（Ｂ）平均７００ｎｍ蛍光強度は、ＮＩＲ光およびＬ－ＮａＡＡの両方の用量依存性の様式で減少した（ｎ＝４、平均±ＳＥＭ）。（Ｃ）Ｌ－ＮａＡＡを有するＰｃ ３のＮＩＲ光曝露後の凝集。親水性から疎水性への可溶性の変化とともに、ＩＲ７００のシアン色が減少し、凝集が出現し、同時に、７００ｎｍ蛍光は、Ｌ－ＮａＡＡの用量依存性の様式で消失した。（Ｄ）ＰＢＳ中の様々な濃度のＬ－ＮａＡＡを有する３μＭのパニツムマブ－ＩＲ７００に、ＮＩＲ光を照射し、７００ｎｍ蛍光イメージングを使用してイメージングした。（Ｅ）ＰＢＳ中１ｍＭを上回るＬ－ＮａＡＡを使用した場合、平均蛍光強度は、ＮＩＲ光の線量依存性の様式で減少した（ｎ＝４、平均±ＳＥＭ）。（Ｆ）任意の濃度のＮａＮ_３を有するＰＢＳ中３μＭのパニツムマブ－ＩＲ７００では、ＮＩＲ光曝露後の平均蛍光強度は、変化しなかった（ｎ＝４、平均±ＳＥＭ）。（Ｇ）以下の５つの群においてアルゴン飽和条件下（左側）または空気の存在下（右側）においてＮＩＲ光を照射した、ＰＢＳ中のＩＲ７００（０．５ｍＭ）およびＬ－ＮａＡＡ（１０ｍＭ）を含有する試料のＥＳＲスペクトル；（ｉ）対照スペクトル（薬物なし）、（ｉｉ）ＮＩＲ曝露なしのＰＢＳ中のＩＲ７００（０．５ｍＭ）およびＬ－ＮａＡＡ（１０ｍＭ）を含有する試料の対照スペクトル、（ｉｉｉ）（ｉｉ）の条件下においてＮＩＲ光曝露ありのＥＳＲスペクトル、（ｉｖ）ＰＢＳ中のＩＲ７００（０．５ｍＭ）、Ｌ－ＮａＡＡ（１０ｍＭ）、およびＮａＮ３（１００ｍＭ）を含有する、ＮＩＲ曝露なしの試料の対照スペクトル、（ｖ）（ｉｖ）の条件下においてＮＩＲ光曝露ありのＥＳＲスペクトル。△；実施例７に記載されるクオーツＥＳＲチューブを起源とする望ましくないが無視できる程度のシグナル。（Ｈ）条件（ｉｉｉ）および（ｖ）におけるＩＲ７００（後／前）の残存パーセンテージ。平均値が、示される（ｎ＝２）。

【図17D-F】同上。

【図17G-H】同上。

【図18A-C】Ｌ－システインは、ＮＩＲ光曝露後のリガンド放出を加速させるが、ＮａＮ_３は、この反応を阻害する。（Ａ）ＰＢＳ中の様々な濃度のＬ－システインを有する２５μＭのＰｃ ３における平均７００ｎｍ蛍光強度は、ＮＩＲ光およびＬ－システインの両方の用量依存性の様式で減少した（ｎ＝４、平均±ＳＥＭ）。（Ｂ）Ｌ－システイン混合物を有するＰｃ ３におけるＮＩＲ光曝露後の凝集。ＩＲ７００のシアン色が減少し、凝集が出現し、同時に、７００ｎｍ蛍光は、Ｌ－システインの用量依存性の様式で消失した。（Ｃ）ＰＢＳ中の様々な濃度のＬ－システインを有する３μＭのパニツムマブ－ＩＲ７００に、ＮＩＲ光を照射し、７００ｎｍ蛍光イメージングを使用してイメージングした。ＰＢＳ中１ｍＭを上回るＬ－システイン条件下において、平均７００ｎｍ蛍光強度は、ＮＩＲ光の線量依存性の様式で減少した（ｎ＝４、平均±ＳＥＭ）。（Ｄ）ＰＢＳ中３μＭのパニツムマブ－ＩＲ７００を有する１ｍＭを上回るＮａＮ３下において、ＮＩＲ光曝露後の平均７００ｎｍ蛍光強度は、有意に減少した（ｎ＝４、平均±ＳＥＭ、０ｍＭのＮａＮ３と対比；二方向ＡＮＯＶＡ反復測定に続いてダネットの検定；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）。（Ｅ）１ｍＭのＬ－ＮａＡＡおよびＬ－システインの両方を有するＰＢＳ中３μＭのパニツムマブ－ＩＲ７００において、ＮａＮ３は、ＮＩＲ光曝露後の平均７００ｎｍ蛍光強度に影響を及ぼさなかった（ｎ＝４、平均±ＳＥＭ）。（Ｆ）アルゴン飽和条件下においてＮＩＲ光を照射した場合のＰＢＳ中のＩＲ７００（０．５ｍＭ）およびＬ－システイン（１０ｍＭ）を含有する試料から得られたＥＳＲスペクトル。（ｉ）ＮＩＲ光曝露なしのＰＢＳ中のＩＲ７００（０．５ｍＭ）およびＬ－システイン（１０ｍＭ）を含有する試料の対照スペクトル。（ｉｉ）試料にＮＩＲ光を照射したときに得られたＥＳＲスペクトル。（ｉｉｉ）赤色で示されるＥＳＲスペクトルは、１００ｍＭのＮａＮ_３をＰＢＳ中のＩＲ７００（０．５ｍＭ）およびＬ－システイン（１０ｍＭ）を含有する試料に添加し、それらにアルゴン飽和条件下においてＮＩＲを照射することによって得られた。灰色を重ねたＥＳＲスペクトルは、（ｉｉ）に示されるＮａＮ３の非存在下において得られたＥＳＲスペクトルと同一である。△；クオーツＥＳＲチューブを起源とする望ましくないが無視できる程度のシグナル。Ｃｙｓ；Ｌ－システイン。（Ｇ）条件（ｉｉ）および（ｉｉｉ）における残存ＩＲ７００％（後／前）。平均値が、示される（ｎ＝２）。（Ｈ）いくつかの条件におけるＩＲ７００の存在下でのシスチンおよびシステインのＨＰＬＣのチャート。システインを含有するＩＲ７００の溶液に、低酸素条件下で照射した場合、システインおよびシスチンのピークは観察されたが、照射なしの場合にはシスチンのピークは存在しなかった。一方で、好気性条件の場合、システインのピークは、照射後にほとんど消失した。

【図18D-E】同上。

【図18F-G】同上。

【図18H】同上。

【図19A-B】ｉｎ ｖｉｔｒｏでＮａＮ_３を添加した、還元剤を用いたＡ４３１ ＧＦＰ－ｌｕｃ細胞におけるパニツムマブＮＩＲ－ＰＩＴの有効性。Ｌ－ＮａＡＡ（Ａ）またはＬ－システイン（Ｂ）を用いたパニツムマブＮＩＲ－ＰＩＴによって誘導されるＡ４３１ ＧＦＰ－ｌｕｃ細胞の膜損傷を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を使用して測定した（ｎ＝４、平均±ＳＥＭ、Ｌ－ＮａＡＡまたはＬ－システインなしのＮＩＲ－ＰＩＴと対比；一方向ＡＮＯＶＡに続いてダネットの検定；＊＊、ｐ＜０．０１；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。（Ｃ）Ｌ－ＮａＡＡおよびＬ－システインの両方を用いたＮＩＲ－ＰＩＴによるＡ４３１ ＧＦＰ－ｌｕｃ細胞の膜損傷を、ＰＩ染色を使用して測定した（ｎ＝４、平均±ＳＥＭ、還元剤なしのＮＩＲ－ＰＩＴと対比；一方向ＡＮＯＶＡに続いてダネットの検定；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。１０ｍＭのＮａＮ３条件下において、Ｌ－ＮａＡＡ（Ｄ）またはＬ－システイン（Ｅ）を用いたパニツムマブＮＩＲ－ＰＩＴによって誘導されるＡ４３１ ＧＦＰ－ｌｕｃ細胞の膜損傷を、ＰＩ染色によって測定した（ｎ＝４、平均の±ＳＥＭ；一方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。

【図19C】同上。

【図19D-E】同上。

【図20A-B】Ｌ－ＮａＡＡ（Ａ）またはＬ－システイン（Ｂ）を用いたパニツムマブＮＩＲ－ＰＩＴによって誘導されるＭＤＡＭＢ４６８ ＧＦＰ－ｌｕｃ細胞の膜損傷を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を使用して測定した（ｎ＝４；＊＊、ｐ＜０．０１；Ｎ．Ｓ．、有意差なし；Ｌ－ＮａＡＡまたはＬ－システインなしのＮＩＲ－ＰＩＴと対比；一方向ＡＮＯＶＡに続いてダネットの検定）。１０ｍＭのＮａＮ_３条件下において、Ｌ－ＮａＡＡ（Ｃ）またはＬ－システイン（Ｅ）を用いたパニツムマブＮＩＲ－ＰＩＴによって誘導されるＭＤＡＭＢ４６８ ＧＦＰ－ｌｕｃ細胞の膜損傷を、ＰＩ染色によって測定した。（ｎ＝４；＊、ｐ＜０．０５；Ｎ．Ｓ．、有意差なし；一方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定）。各値は、独立した実験の平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝４）。

【図20C-D】同上。

【図21A-B】生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって細胞生存率を評価した。細胞を、ＮＩＲ－ＰＩＴ処置の１時間後にＤ－ルシフェリン（１５０ｍｇ ｍＬ－１、１ウェル当たり１０μＬ；Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に曝露し、Ｍ３ Ｖｉｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ）を使用して、ＢＬＩを行った（Ｐｈｏｔｏｎ Ｉｍａｇｅｒ；Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）。ＲＯＩを、ウェル全体を含むように設定し、平均ルシフェラーゼ活性を測定した。１０ｍＭのＮａＮ３の条件下において、Ｌ－ＮａＡＡまたはＬ－システインを用いたパニツムマブＮＩＲ－ＰＩＴによって誘導されるＡ４３１ ＧＦＰ－ｌｕｃ細胞（Ａ、Ｂ）およびＭＤＡＭＢ４６８ ＧＦＰ－ｌｕｃ細胞（Ｃ、Ｄ）の細胞生存率を、ＢＬＩによって測定した。（ｎ＝４；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；Ｎ．Ｓ．、有意差なし；一方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定）。各値は、独立した実験の平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝４）。

【図21C-D】同上。

【図22A-B】アルブミン－ＩＲ７００プロセシングに対する還元剤の効果。（Ａ）処置スケジュール。（Ｂ）Ｌ－ＮａＡＡありまたはなしの蛍光の代表的な画像。（Ｃ）無胸腺マウスにおけるＬ－ＮａＡＡありまたはなしのＮＩＲ光曝露の前および後の平均蛍光強度（ｎ＝４、平均±ＳＥＭ；反復測定二方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；＊、ｐ＜０．０５；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。（Ｅ）Ｌ－システインありまたはなしの蛍光の代表的な画像。（Ｅ）無胸腺マウスにおけるＬ－システインありまたはなしのＮＩＲ光曝露の前および後の平均蛍光強度（ｎ＝４、平均±ＳＥＭ；反復測定二方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。

【図22C-D】同上。

【図22E】同上。

【図23】ＭＣ３８－ｌｕｃ腫瘍に対するＬ－ＮａＡＡ単独のｉｎ ｖｉｖｏ有効性。（Ａ）処置スケジュール。（Ｂ）ＭＣ３８－ｌｕｃ腫瘍保持マウスにおけるＬ－ＮａＡＡ投与の前（６日目）ならびに後（８日目、１０日目、および１２日目）のＢＬＩ。（Ｃ）ＢＬＩから計算したルシフェラーゼ活性（ｎ＝１０、平均±ＳＥＭ；反復測定二方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。

【図24A-B】ＭＣ３８－ｌｕｃ腫瘍モデルにおけるＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴに関するＬ－ＮａＡＡの有効性。（Ａ）処置スケジュール。（Ｂ）蛍光イメージング、ならびに（Ｃ）ＭＣ３８－ｌｕｃ腫瘍保持マウスにおけるＬ－ＮａＡＡありまたはなしのＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの前および後の平均７００ｎｍ蛍光強度（ｎ＝１０、平均±ＳＥＭ；対応のあるｔ検定；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。（Ｄ）ＭＣ３８－ｌｕｃ腫瘍保持マウスにおけるＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの前（６日目）および後（８～１２日目）のＢＬＩ。（Ｅ）ＢＬＩから計算したルシフェラーゼ活性（ｎ＝１０；反復測定二方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。（Ｆ）浮腫の形成（赤色の矢印）が、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの１日後に示された。（Ｇ）体重曲線（ｎ＝１０、平均の±ＳＥＭ；反復測定二方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。（Ｈ）ＮＩＲ－ＰＩＴの１日後のＴ２ＷＩ脂肪抑制ＭＲＩイメージング。赤色の矢印は、ＭＣ３８－ｌｕｃ皮下腫瘍を示す。（Ｉ）冠状方向Ｔ２ＷＩ脂肪抑制ＭＲ画像から計算した平均高強度面積（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ；対応のないｔ検定；＊、ｐ＜０．０５）。

【図24C-D】同上。

【図24E-G】同上。

【図24H-I】同上。

【図25A-C】ＬＬ／２－ｌｕｃおよびＭＯＣ２－ｌｕｃ腫瘍に対するＬ－ＮａＡＡを用いたＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴのｉｎ ｖｉｖｏ有効性。（Ａ）処置スケジュール。（Ｂ）蛍光イメージング、ならびに（Ｃ）ＬＬ／２－ｌｕｃ腫瘍保持マウスにおけるＬ－ＮａＡＡありまたはなしでのＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの前および後の平均蛍光強度（ｎ＝１０、平均±ＳＥＭ；対応のあるｔ検定；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。（Ｄ）ＬＬ／２－ｌｕｃ腫瘍保持マウスにおけるＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの前（６日目）および後（８～１１日目）のＢＬＩ。（Ｅ）ＬＬ／２－ｌｕｃおよび（Ｆ）ＭＯＣ２－ｌｕｃ腫瘍においてＢＬＩから計算したルシフェラーゼ活性（ｎ＝１０、平均±ＳＥＭ；反復測定二方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。（Ｇ）ＬＬ／２－ｌｕｃおよびＭＯＣ２－ｌｕｃ腫瘍におけるＬ－ＮａＡＡありまたはなしのＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの１日後の浮腫の形成（赤色の矢印）。（Ｈ）ＬＬ／２－ｌｕｃおよび（Ｉ）ＭＯＣ２－ｌｕｃ腫瘍保持マウスにおける体重曲線。（ｎ＝１０、平均±ＳＥＭ；一方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。

【図25D-F】同上。

【図25G-I】同上。

【図26A-C】Ａ４３１ ＧＦＰ－ｌｕｃ腫瘍に対するＬ－ＮａＡＡを用いたパニツムマブＮＩＲ－ＰＩＴのｉｎ ｖｉｖｏ有効性。（Ａ）処置スケジュール。（Ｂ）蛍光イメージング、ならびに（Ｃ）Ａ４３１ ＧＦＰ－ｌｕｃ腫瘍保持マウスにおけるＬ－ＮａＡＡありまたはなしでのパニツムマブＮＩＲ－ＰＩＴの前および後の平均蛍光強度（ｎ＝８、平均±ＳＥＭ；対応のあるｔ検定；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。（Ｄ）Ａ４３１ ＧＦＰ－ｌｕｃ腫瘍保持マウスにおけるパニツムマブＮＩＲ－ＰＩＴの前（６日目）および後（８～１２日目）のＢＬＩ。（Ｅ）ＢＬＩから計算したルシフェラーゼ活性（ｎ＝８、平均±ＳＥＭ；反復測定二方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。

【図26D-E】同上。

【図27】浮腫の磁気共鳴イメージング。（Ａ）ＭＣ３８－ｌｕｃ腫瘍におけるＬ－ＮａＡＡありまたはなしのＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの１日後の冠状方向Ｔ２ＷＩ ＳＴＩＲ画像。（Ｂ）ＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴ後の冠状方向Ｔ２ＷＩ ＳＴＩＲ ＭＲ画像から計算した平均高強度面積（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ；対応のないｔ検定；＊、ｐ＜０．０５）。

【図28A-C】Ｌ－ＮａＡＡを用いたＮＩＲ－ＰＩＴ後の活性酸素標本（ＲＯＳ）のイメージングおよび定量化。Ｌ－ＮａＡＡありまたはなしのＮＩＲ－ＰＩＴ後のＲＯＳを評価するために、ＲＯＳを、化学発光イメージング（ＣＬＩ）で評価し、ここで、Ｌ－０１２（０．５ｍｇマウス^－１；ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｕ．Ｓ．Ａ Ｃｏｒｐ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）を、マウスに腹腔内注射した。光子計数を、Ｐｈｏｔｏｎ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ）で相対光単位を使用して評価した。ＲＯＩを、腫瘍全体にわたって配置した。相対光単位の１分当たりの計数を、Ｍ３ Ｖｉｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ）を使用して計算し、以下の式を使用してＮＩＲ－ＰＩＴ前のものに基づくパーセンテージに変換した：［（処置後の相対光単位）／（処置前の相対光単位）×１００（％）］。化学発光画像を、ＮＩＲ－ＰＩＴの１時間後および３時間後に継続して記録した。（Ａ）処置スケジュール。（Ｂ）ＭＣ３８－ｌｕｃ腫瘍保持マウスにおけるＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの前および後のＣＬＩ。（Ｃ）ＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴ後のＭＣ３８－ｌｕｃにおけるＣＬＩから計算した光子計数（ｎ＝５、平均±ＳＥＭ；反復測定二方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；＊、ｐ＜０．０５）。（Ｄ）ＭＣ３８－ｌｕｃ腫瘍保持マウスにおけるＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの前および後のＢＬＩ。（Ｅ）ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴ後のＭＣ３８－ｌｕｃにおけるＢＬＩから計算した光子計数（ｎ＝５、平均±ＳＥＭ；反復測定二方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；＊、ｐ＜０．０５）。

【図28D-E】同上。

【図29A-C】ＭＣ３８－ｌｕｃ腫瘍モデルにおけるＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴに関するＬ－ＮａＡＡの早期有効性。（Ａ）処置スケジュール。（Ｂ）蛍光イメージング、ならびに（Ｄ）ＭＣ３８－ｌｕｃ腫瘍保持マウスにおけるＬ－ＮａＡＡありまたはなしでのＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの前および後の平均蛍光強度（ｎ＝１０、平均±ＳＥＭ；対応のあるｔ検定；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。（Ｄ）ＭＣ３８－ｌｕｃ腫瘍保持マウスにおけるＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの前（６日目）および後（８～１３日目）のＢＬＩ。（Ｅ）ＢＬＩから計算したルシフェラーゼ活性（ｎ＝１０；反復測定二方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。（Ｇ）浮腫の形成（赤色の矢印）が、ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの１日後に示された。（Ｇ）ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの１日後のＴ２ＷＩ脂肪抑制ＭＲＩイメージング。赤色の矢印は、ＭＣ３８－ｌｕｃ皮下腫瘍を示す。（Ｈ）冠状方向Ｔ２ＷＩ脂肪抑制ＭＲＩ画像から計算した平均高強度面積（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ；対応のないｔ検定；＊＊、ｐ＜０．０１）。（Ｉ）体重曲線（ｎ＝１０、平均の±ＳＥＭ；一方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；＊、ｐ＜０．０５）。（Ｊ）Ｌ－ＮａＡＡを用いたＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの３時間後の全生細胞間のＣＴＬＡ４^ｈｉ細胞のパーセンテージ（ｎ＝４、一方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定；＊、ｐ＜０．０５；Ｎ．Ｓ．、有意差なし）。

【図29D-E】同上。

【図29F-H】同上。

【図29I-J】同上。

【図30A】スキームは、Ｌ－ＮａＡＡによるＲＯＳクエンチおよびＩＲ７００のリガンド放出の加速に関する提案された機序を示す。（Ａ）ＩＲ７００の光誘導性リガンド放出反応のエネルギー図。ＩＲ７００は、電子を受け取り、ラジカルアニオンとなる。Ｌ－システインおよびＬ－ＮａＡＡは、電子供与体として作用する。ラジカルアニオンからのリガンド放出反応は、酸性条件において加速される。したがって、リガンド放出反応は、Ｌ－ＮａＡＡによって加速される。（Ｂ）ＮＩＲ－ＰＩＴ後の急性浮腫を抑制するためのＬ－ＮａＡＡの機序。ＮＩＲ－ＰＩＴの間、ＲＯＳもまた生成され、浮腫を引き起こす。Ｌ－ＮａＡＡは、ＲＯＳをクエンチし、急性浮腫の防止をもたらすが、光誘導性リガンド放出を促進する。

【図30B】同上。

【発明を実施するための形態】

【0038】

いくつかの実施形態の詳細な説明
別途説明されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、開示される本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」という用語は、文脈により別途明確に示されない限り、複数形の参照物を含む。同様に、「または」という言葉は、文脈により別途明確に示されない限り、「および」を含むことを意図する。「含む（comprising）」は、「含む（including）」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含む（comprising）」とは、「Ａを含む（including）」、または「Ｂを含む（including）」、または「ＡおよびＢを含む（including）」ことを意味する。

【0039】

本開示の実施形態の実施および／または試験に好適な方法および材料を、以下に記載する。そのような方法および材料は、例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。本明細書に記載されるものと類似または同等の他の方法および材料を、使用することができる。例えば、従来的な方法は、様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されており、これには、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (and Supplements to 2000)、Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., Wiley & Sons, 1999、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990、およびHarlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999が挙げられる。

【0040】

本明細書において参照されるすべてのＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号と関連付けられた配列は、２０２１年１月２９日の時点で利用可能な配列に関して参照により組み込まれる。

【0041】

本明細書におけるすべての参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。

【0042】

本開示の様々な実施形態の考察を容易にするために、特定の用語の説明を、以下に提供する。

【0043】

アブスコパル効果：局所治療（例えば、ＮＩＲ－ＰＩＴ）の直接的な標的ではない身体の一部における、腫瘍、例えば、転移の処置。例えば、適切な抗体－ＩＲ７００コンジュゲートと組み合わせたＮＩＲ光での特定の腫瘍の照射は、ＮＩＲ光を照射していない異なる腫瘍（例えば、転移）のサイズを低減させ得る。未照射／遠位腫瘍は、一部の例において（例えば、ヒトにおいて）、ＮＩＲ光で処置される腫瘍から少なくとも３インチ離れており、例えば、ＮＩＲ光で処置される腫瘍から少なくとも４インチ、少なくとも５インチ、少なくとも１０インチ、少なくとも１２インチ、少なくとも１８インチ、または少なくとも２４インチ離れている。

【0044】

投与：対象に、薬剤、例えば、抗体－ＩＲ７００分子、還元剤、および／または免疫モジュレーターを、任意の有効な経路によって提供または供与すること。投与の例示的な経路としては、局部、全身、または局所注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、腫瘍内、骨内、前立腺内、および静脈内）、経口、眼内、舌下、直腸、経皮、鼻内、膣内、ならびに吸入の経路が挙げられるが、これらに限定されない。１つの例では、投与は、静脈内である。１つの例では、投与は、腹腔内である。

【0045】

抗体：抗原のエピトープ、例えば、腫瘍特異的タンパク質、または免疫細胞、例えば、Ｔ細胞上に特異的に発現されるタンパク質を特異的に認識しそれに結合する、少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンド。抗体は、重鎖および軽鎖から構成され、これらのそれぞれは、可変重鎖（Ｖ_Ｈ）領域および可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）領域と称される可変領域を有する。まとめて、Ｖ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域は、抗体によって認識される抗原に結合することを担う。

【0046】

抗体、例えば、抗体－ＩＲ７００分子におけるものは、インタクトな免疫グロブリンならびに抗体のバリアントおよび部分、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’_２断片、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、およびジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）を含む。ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域および免疫グロブリンの重鎖可変領域が、リンカーによって結合された融合タンパク質であるが、一方で、ｄｓＦｖの場合は、鎖が、鎖の会合を安定させるためにジスルフィド結合を導入するように突然変異されている。用語はまた、遺伝子操作された形態、例えば、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）も含む。Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)、Kuby, J., Immunology, 3^rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997もまた参照されたい。

【0047】

典型的には、天然に存在する免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。ラムダ（λ）およびカッパ（κ）の２つのタイプの軽鎖が存在する。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主要な重鎖のクラス（またはアイソタイプ）が存在する：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ。

【0048】

各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含有する（領域は、「ドメイン」としても公知である）。組み合わせて、重鎖および軽鎖可変領域は、抗原を特異的に結合する。軽鎖および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも称される３つの超可変領域により分断される「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、定義されている（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991を参照されたく、これは、参照により本明細書に組み込まれる）。Ｋａｂａｔのデータベースは、現在、オンラインで維持されている。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種、例えば、ヒト内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成要素である軽鎖および重鎖の合わせたフレームワーク領域は、三次元空間においてＣＤＲを位置付けおよびアライメントするように機能する。

【0049】

ＣＤＲは、主として、抗原のエピトープへの結合を担う。各鎖のＣＤＲは、典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称され、Ｎ末端から開始して順番に番号付けされ、また、典型的に、特定のＣＤＲが位置する鎖によって特定される。したがって、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、一方で、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するＣＤＲ１である。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。抗体ごとに変動するのはＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の限定された数のアミノ酸位置のみが、抗原結合に直接的に関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と称される。

【0050】

「Ｖ_Ｈ」または「ＶＨ」への言及は、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指し、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂのものを含む。「Ｖ_Ｌ」または「ＶＬ」への言及は、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指し、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂのものを含む。

【0051】

「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、Ｂリンパ球の単一のクローンによって、または単一の抗体の軽鎖および重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生された抗体である。モノクローナル抗体は、例えば、骨髄腫細胞の免疫脾臓細胞との融合体からハイブリッド抗体形成細胞を作製することによって、産生される。モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体を含む。一部の例では、抗体－ＩＲ７００分子における抗体は、ｍＡｂ、例えば、ヒト化ｍＡｂである。

【0052】

「キメラ抗体」は、１つの種、例えば、ヒトに由来するフレームワーク残基、および別の種、例えば、メソテリンを特異的に結合するマウス抗体に由来するＣＤＲ（一般に、抗原結合を付与する）を有する。

【0053】

「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域、および非ヒト（例えば、マウス、ラット、または合成）免疫グロブリンに由来する１つまたは複数のＣＤＲを含む、免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と称され、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と称される。一実施形態では、すべてのＣＤＲは、ヒト化免疫グロブリンにおけるドナー免疫グロブリンに由来する。定常領域は、存在しなくてもよいが、存在する場合は、それらは、ヒト免疫グロブリン定常領域に実質的に同一、例えば、少なくとも約８５～９０％、例えば、約９５％、またはそれを超えて同一でなければならない。したがって、可能性としてＣＤＲを除く、ヒト化免疫グロブリンのすべての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分に実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化免疫グロブリンまたは抗体のアクセプターフレームワークは、限定された数の、ドナーフレームワークから得られたアミノ酸による置換を有し得る。ヒト化または他のモノクローナル抗体は、抗原結合にも他の免疫グロブリン機能にも実質的に効果を有さない追加の保存的アミノ酸置換を有し得る。ヒト化免疫グロブリンは、遺伝子操作を用いて構築することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい）。

【0054】

「ヒト」抗体（「完全ヒト」抗体とも称される）は、ヒトフレームワーク領域、およびヒト免疫グロブリンに由来するすべてのＣＤＲを含む、抗体である。１つの例では、フレームワークおよびＣＤＲは、同じ起源のヒト重鎖および／または軽鎖アミノ酸配列に由来する。しかしながら、１つのヒト抗体に由来するフレームワークを、異なるヒト抗体に由来するＣＤＲを含むように操作することができる。ヒト免疫グロブリンのすべての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分に実質的に同一である。

【0055】

「特異的に結合する」とは、無関連のタンパク質、例えば、非腫瘍タンパク質、例えば、β－アクチンへの結合と比べて、抗原、例えば、腫瘍特異的抗原と特異的に免疫反応する個々の抗体の能力を指す。例えば、ＥＧＦＲ特異的結合剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、実質的にＥＧＦＲタンパク質のみに結合する。本明細書において使用される場合、「腫瘍特異的結合剤」という用語は、腫瘍特異的抗体（およびそれらの断片）ならびにその調製物において実質的に腫瘍特異的タンパク質にのみ結合する他の薬剤を含む。

【0056】

結合は、抗体分子と、Ｔ細胞表面分子の抗原性決定基との間の非ランダム結合反応である。所望される結合特異性は、典型的に、Ｔ細胞表面分子および無関連の抗原を差次的に結合し、したがって、特に、２つの抗原が固有のエピトープを有する場合に２つの異なる抗原を区別する、抗体の能力の参照点から、決定される。特定のエピトープに特異的に結合する抗体は、「特異的抗体」と称される。

【0057】

一部の例では、抗体（例えば、抗体－ＩＲ７００分子におけるもの）は、標的（例えば、細胞表面タンパク質、例えば、腫瘍特異的タンパク質）に、試料または対象における他の分子に対する結合定数よりも少なくとも１０^３Ｍ^－１高い、１０^４Ｍ^－１高い、または１０^５Ｍ^－１高い結合定数で、特異的に結合する。一部の例では、抗体（例えば、ｍＡｂ）またはその断片は、１ｎＭまたはそれを下回る平衡定数（Ｋｄ）を有する。例えば、抗体は、標的、例えば、腫瘍特異的タンパク質に、少なくとも約０．１×１０^－８Ｍ、少なくとも約０．３×１０^－８Ｍ、少なくとも約０．５×１０^－８Ｍ、少なくとも約０．７５×１０^－８Ｍ、少なくとも約１．０×１０^－８Ｍ、少なくとも約１．３×１０^－８Ｍ、少なくとも約１．５×１０^－８Ｍ、または少なくとも約２．０×１０^－８Ｍの結合親和性で結合する。Ｋｄ値は、例えば、競合的ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）によって、または表面プラズモン共鳴デバイス、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから入手可能なＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００を使用して、決定することができる。

【0058】

抗体－ＩＲ７００分子または抗体－ＩＲ７００コンジュゲート：ＩＲ７００にコンジュゲートし、抗体、例えば、腫瘍特異的抗体の両方を含む、分子。一部の例では、抗体は、がん細胞上の表面タンパク質、例えば、腫瘍特異的抗原に特異的に結合する、ヒト化抗体（例えば、ヒト化ｍＡｂ）である。

【0059】

抗原（Ａｇ）：動物において抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することができる、化合物、組成物、または物質で、動物に注射または吸収される組成物（例えば、腫瘍特異的タンパク質を含むもの）を含む。抗原は、異種抗原、例えば、開示される抗原によって誘導されるものを含む、特異的な体液性または細胞性免疫の産物と反応する。「エピトープ」または「抗原性決定基」は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原の領域を指す。一実施形態では、エピトープが、ＭＨＣ分子と併せて提示された場合、Ｔ細胞はエピトープに応答する。エピトープは、連続的なアミノ酸またはタンパク質の三次フォールディングによって並置される非連続的なアミノ酸の両方から形成され得る。連続的なアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的に、変性溶媒に曝露された際に保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的に、変性溶媒での処置の際に失われる。エピトープは、固有の空間コンフォメーションにおいて、典型的には少なくとも３個のアミノ酸、より通例的には少なくとも５個、約９個、または約８～１０個のアミノ酸を含む。エピトープの空間コンフォメーションを決定する方法としては、例えば、Ｘ線結晶構造解析および核磁気共鳴が挙げられる。

【0060】

抗原の例としては、抗原性決定基、例えば、免疫細胞によって認識されるものを含有する、ペプチド、脂質、多糖、および核酸が挙げられるが、これらに限定されない。一部の例では、抗原としては、腫瘍特異的タンパク質もしくはペプチド（例えば、細胞、例えば、がん細胞の表面上に見出されるもの）、またはその免疫原性断片が挙げられる。一部の例では、抗原としては、免疫細胞特異的タンパク質もしくはペプチド（例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、調節性Ｔ細胞の表面上に見出されるもの）、またはその免疫原性断片が挙げられる。

【0061】

がん：異常または無制御な細胞成長によって特徴付けられる、悪性腫瘍。多くの場合がんと関連する他の特色としては、転移、隣接する細胞の正常な機能性への干渉、サイトカインまたは他の分泌産物の異常なレベルでの放出、および炎症性応答または免疫応答の抑制または悪化、周囲または遠位組織または器官、例えば、リンパ節の浸潤などが挙げられる。「転移性疾患」は、もともとの腫瘍部位から出て、例えば、血流またはリンパ系を介して、身体の他の部分へと移動する、がん細胞を指す。１つの例では、開示される方法によって殺滅される細胞は、がん細胞である。

【0062】

ＣＤ２５（ＩＬ－２受容体アルファ鎖）：（例えば、ＯＭＩＭ １４７７３０）活性化されたＴ細胞、活性化されたＢ細胞、一部の胸腺細胞、骨髄系前駆体、および乏突起膠細胞に存在する、Ｉ型膜貫通タンパク質。ＣＤ２５は、マウスにおいてＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞を特定するためのマーカーとして使用されている。ＣＤ２５は、Ｂ細胞新生物、一部の急性非リンパ球性白血病、神経芽細胞腫、肥満細胞症、および腫瘍浸潤リンパ球を含む、一部のがん細胞の表面において見出される。それは、ＨＴＬＶ－１の受容体として機能し、その結果、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病において新生物細胞に発現される。例示的なＣＤ２５配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースにおいて見出すことができる（例えば、受託番号ＣＡＡ４４２９７．１、ＮＰ＿０００４０８．１、およびＮＰ＿００１２９５１７１．１）。ＣＤ２５に特異的な例示的なｍＡｂは、ダクリズマブおよびバシリキシマブであり、これらを、ＩＲ７００に付着させ、ダクリズマブ－ＩＲ７００またはバシリキシマブ－ＩＲ７００を形成することができ、これを、ＣＤ２５を発現するがん細胞を標的とするために開示される方法において使用するか、または免疫調節分子として（例えば、腫瘍内の腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ細胞を低減させるために）使用することができる。

【0063】

接触させること：直接的な物理的会合におくことで、固体形態および液体形態の両方を含む。接触させることは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、例えば、単離された細胞、例えば、腫瘍細胞で、または対象（例えば、腫瘍、例えば、がんを有する対象）に投与することによってｉｎ ｖｉｖｏで生じてもよい。

【0064】

細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）：（例えば、ＯＭＩＭ １２３８９０）抗腫瘍免疫抑制を媒介する主要な免疫チェックポイント分子。ＣＴＬＡ４は、調節性Ｔ細胞において構成的に発現されるが、活性化後の従来的なＴ細胞においては上方調節のみがなされ、これは、がんにおいて特に顕著な現象である。例示的なＣＴＬＡ４配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースにおいて見出すことができる（例えば、受託番号ＡＡＬ０７４７３．１、ＡＡＦ０１４８９．１、およびＡＦ４１４１２０．１）。ＣＴＬＡ４に特異的な例示的なｍＡｂは、イピリムマブであり、これを、ＩＲ７００に付着させてイピリムマブ－ＩＲ７００を形成することができ、これを、開示される方法において使用して、ＣＴＬＡ４を発現する細胞、例えば、黒色腫のＣＴＬＡ４を発現する細胞またはＣＴＬＡ４を発現するＴ細胞を標的とすることができる。

【0065】

減少：あるものの品質、量、または強度を低減させること。１つの例では、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子を含む治療用組成物は、抗体－ＩＲ７００分子が特異的に結合する細胞の生存率を、細胞にＮＩＲ（例えば、約６８０ｎｍまたは６９０ｎｍの波長）を少なくとも１Ｊ／ｃｍ^２（例えば、４～１００Ｊ／ｃｍ^２）の線量で照射した後に、例えば、抗体－ＩＲ７００分子の非存在下における応答と比較して、減少させる。一部の例では、そのような減少は、細胞、例えば、がん細胞または腫瘍床におけるＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ Ｔｒｅｇの殺滅によって証明される。一部の例では、細胞の生存率の減少は、抗体－ＩＲ７００分子を含まない組成物で観察される生存率と比べて、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、またはさらには少なくとも９０％である。他の例では、減少は、倍数変化、例えば、細胞生存率の、抗体－ＩＲ７００分子を含まない組成物で観察される生存率と比べて、２分の１以下、３分の１以下、４分の１以下、５分の１以下、８分の１以下、１０分の１以下、またはさらには１５もしくは２０分の１以下の減少として表される。そのような減少は、本明細書に開示される方法を使用して測定することができる。

【0066】

上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）：（例えば、ＯＭＩＭ １３１５５０）細胞外タンパク質リガンドの上皮成長因子ファミリー（ＥＧＦファミリー）のメンバーの受容体である膜貫通タンパク質。上皮成長因子受容体は、４つの緊密に関連する受容体チロシンキナーゼのサブファミリーである、受容体のＥｒｂＢファミリーのメンバーである：ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ－１）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ－２）、Ｈｅｒ ３（ＥｒｂＢ－３）、およびＨｅｒ ４（ＥｒｂＢ－４）。ＥＧＦＲは、ＨＥＲ２および他のＨＥＲファミリーメンバーとヘテロ二量体を形成することができる。ＥＧＦＲの発現または活性に影響を及ぼす突然変異は、肺の腺癌、肛門がん、神経膠芽腫、および頭頸部の上皮腫瘍を含む、がんをもたらし得る。例示的なＥＧＦＲ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースにおいて見出すことができる（例えば、受託番号ＮＰ＿００１３３３８２６．１、ＣＡＡ５５５８７．１、およびＡＡＦ１４００８．１）。ＥＧＦＲに特異的な例示的なｍＡｂは、パニツムマブであり、これを、ＩＲ７００に付着させてパニツムマブ－ＩＲ７００を形成することができ、これを、開示される方法において使用して、ＥＧＦＲを発現する細胞を標的とすることができる。

【0067】

免疫モジュレーター：免疫モジュレーターは、免疫系の１つまたは複数の機能を変更させる（例えば、増加または減少させる）物質である。一部の例では、免疫モジュレーターは、免疫系を活性化する。他の例では、免疫モジュレーターは、免疫サプレッサー細胞の活性を阻害する（または殺滅する）。一部の例では、免疫モジュレーターは、ｍＡｂであり、これを、ＩＲ７００に付着させてｍＡｂ－ＩＲ７００を形成することができ、これを、開示される方法において使用して、ｍＡｂによって認識されるタンパク質を発現する細胞を標的とすることができる。例示的な免疫モジュレーターとしては、免疫活性化因子ＩＬ－１５およびＩＦＮ－ガンマが挙げられる。

【0068】

ＩＲ７００（ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ）：以下の式を有する色素である。

【化1】

【0069】

ＬＩ－ＣＯＲ（Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）から市販されている。アミノ反応性ＩＲ７００は、比較的親水性の色素であり、ＩＲ７００のＮＨＳエステルを使用して抗体と共有結合的にコンジュゲートすることができる。ＩＲ７００はまた、従来的な光感作剤、例えば、ヘマトポルフィリン誘導体Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）（６３０ｎｍで１．２×１０^３Ｍ^－１ｃｍ^－１）、メタ－テトラヒドロキシフェニルクロリン、Ｆｏｓｃａｎ（登録商標）（６５２ｎｍで２．２×１０^４Ｍ^－１ｃｍ^－１）、およびモノ－Ｌ－アスパルチルクロリンｅ６、ＮＰｅ６／Ｌａｓｅｒｐｈｙｒｉｎ（登録商標）（６５４ｎｍで４．０×１０^４Ｍ^－１ｃｍ^－１）よりも、５倍を上回って高い消散係数を有する（最大６８９ｎｍの吸光で２．１×１０^５Ｍ^－１ｃｍ^－１）。

【0070】

医薬組成物：対象に適切に投与された場合に、所望される治療効果または予防効果を誘導することができる、化学的化合物または組成物。医薬組成物は、治療剤、例えば、１つもしくは複数の抗体－ＩＲ７００分子、還元剤、および／または１つもしくは複数の免疫活性化因子を含み得る。治療剤または医薬剤は、単独または追加の化合物と一緒に、所望される応答を誘導する（例えば、対象に投与された場合に治療効果または予防効果を誘導する）ものである。特定の例では、医薬組成物は、治療有効量の少なくとも１つの抗体－ＩＲ７００分子を含む。

【0071】

薬学的に許容されるビヒクル：本開示において有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は、従来的なものである。Remington: The Science and Practice of Pharmacy, The University of the Sciences in Philadelphia, Editor, Lippincott, Williams, & Wilkins, Philadelphia, PA, 21^st Edition (2005)は、１つまたは複数の治療用化合物、例えば、１つもしくは複数の抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数の還元剤、および／または１つもしくは複数の免疫活性化因子の薬学的送達に好適な組成物および製剤について記載している。

【0072】

一般に、担体の性質は、用いられる特定の投与様式に依存することになる。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどといった、薬学的および生理学的に許容される流体を含む、注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態）については、従来的な非毒性の固体担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与しようとする医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有してもよい。

【0073】

光免疫療法（ＰＩＴ）：細胞タンパク質（例えば、細胞表面上のもの）を標的とするモノクローナル抗体（ＭＡｂ）にコンジュゲートした、近赤外（ＮＩＲ）フタロシアニン色素ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ（ＩＲ７００）に基づく標的特異的光感作剤を利用する、分子標的化治療。１つの例では、細胞表面タンパク質は、がん細胞または免疫細胞上に特異的に見出されるものであり、したがって、ＰＩＴは、そのような細胞を殺滅するために使用することができる。細胞死は、抗体－ＩＲ７００コンジュゲートが細胞に結合し、細胞に、ＮＩＲを照射した場合に生じるが、一方で、抗体－ＩＲ７００分子により認識される細胞表面タンパク質を発現しない細胞は、多数が殺滅されることはない。

【0074】

プログラム死１（ＰＤ－１）：（例えば、ＯＭＩＭ ６００２４４）免疫系を下方調節することによってヒト身体の細胞に対する免疫系の応答を調節し、Ｔ細胞炎症性活性を抑制することによって自己寛容性を促進する役割を有する、細胞の表面上の１型膜タンパク質。ＰＤ－１は、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２の２つのリガンドに結合する。例示的なＰＤ－１配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースにおいて見出すことができる（例えば、受託番号ＣＡＡ４８１１３．１、ＮＰ＿００５００９．２、およびＮＰ＿００１０７６９７５．１）。開示される方法と組み合わせて使用することができるＰＤ－１に特異的な例示的なアンタゴニストｍＡｂとしては、Ｊｏｕｎｃｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによるＪＴＸ－４０１４、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、セミプリマブ、スパルタリズマブ（ＰＤＲ００１）、カムレリズマブ（ＳＨＲ１２１０）、シンチリマブ（ＩＢＩ３０８）、チスレリズマブ（ＢＧＢ－Ａ３１７）、トリパリマブ（ＪＳ ００１、ドスタルリマブ（ＴＳＲ－０４２、ＷＢＰ－２８５）、ＩＮＣＭＧＡ０００１２（ＭＧＡ０１２）、ＡＭＰ－２２４、およびＡＭＰ－５１４が挙げられる。ＰＤ－１に特異的な例示的なｍＡｂは、ニボルマブであり、これを、開示される方法と組み合わせて使用することができる。

【0075】

プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）：（例えば、ＯＭＩＭ ６０５４０２）特定の事象、例えば、妊娠、組織同種移植、自己免疫疾患、および肝炎の際に免疫系の適応アームを抑制する、細胞の表面上の１型膜タンパク質。阻害性チェックポイント分子ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合は、免疫受容体チロシンに基づくスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）モチーフを介したホスファターゼ（ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２）との相互作用に基づく阻害性シグナルを伝達する。ＰＤ－Ｌ１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、および骨髄系細胞上に見出されるＰＤ－１に結合して、活性化または阻害をモジュレートする。例示的なＰＤ－Ｌ１配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースにおいて見出すことができる（例えば、受託番号ＡＤＫ７０９５０．１、ＮＰ＿０５４８６２．１、およびＮＰ＿００１１５６８８４．１）。ＰＤ－Ｌ１活性をアンタゴナイズする抗体を、ＩＲ７００にコンジュゲートし（抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００を形成し）、本明細書に提供される方法を、例えば、腫瘍特異的抗原Ａｂ－ＩＲ７００分子と組み合わせて使用することができる。ＰＤ－Ｌ１に特異的な例示的なアンタゴニストｍＡｂとしては、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、コシベリマブ、ＫＮ０３５（エンバフォリマブ）、ＢＭＳ－９３６５５９、ＢＭＳ９３５５５９、ＭＥＤＩ－４７３６、ＭＰＤＬ－３２８０Ａ、およびＭＥＤＩ－４７３７が挙げられ、これらのうちのいずれかを、ＩＲ７００にコンジュゲートすることができる。例えば、ＰＤ－Ｌ１に特異的な１つの例示的なｍＡｂは、デュルバルマブであり、これを、ＩＲ７００に付着させてデュルバルマブ－ＩＲ７００を形成することができ、これを、開示される方法において使用して、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞を標的とすることができる。

【0076】

還元剤：酸化還元化学反応において、電子を電子レシピエント（酸化剤）にわたす（または「供与する」）エレメントまたは化合物。還元剤は、したがって、酸化還元反応において電子を失うと、酸化される。還元剤は、酸化剤を「還元する」（またはそれによって「酸化される」）。したがって、１つまたは複数の還元剤を、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＮＩＲ－ＰＩＴと組み合わせて使用して、ＮＩＲ光への曝露後にＩＲ７００から生じる活性酸素種に起因する望まれない非特異的組織損傷を低減することができる。例えば、還元剤は、結合していないかまたは腫瘍のエリア内にある活性酸素種を不活性化し、身体の他のエリア内の望まれない急性炎症を低減させることができる。本明細書に提供される方法において使用することができる例示的な還元剤としては、Ｌ－システイン、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム（Ｌ－ＮａＡＡ）、アスコルビン酸（例えば、Ｌ－またはＲ－アスコルビン酸）、およびグルタチオンが挙げられる。一部の例では、アジ化ナトリウムは、その毒性に起因して、ｉｎ ｖｉｖｏでは使用されない。したがって、一部の例では、開示される方法において使用される還元剤は、アジ化ナトリウムではない。１つの例では、開示される方法において使用される還元剤は、Ｌ－ＮａＡＡである。

【0077】

対象または患者：ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む用語。１つの例では、対象は、ヒトまたは獣医学的対象、例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、または非ヒト霊長類である。一部の例では、対象は、がんを有するかまたはがんに関して処置されている哺乳動物（例えば、ヒト）である。

【0078】

治療有効量：単独、または追加の治療剤（例えば、抗ＣＴＬＡ４－ＩＲ７００分子、抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００分子、免疫モジュレーター、および／または還元剤）と一緒に、薬剤で処置されている対象または細胞において所望される効果を達成するのに十分な組成物の量である。薬剤（例えば、単独または他の薬剤と組み合わせた抗体－ＩＲ７００分子）の有効量は、処置されている対象または細胞、特定の治療剤、および治療用組成物の投与様式を含むがこれらに限定されない、いくつかの因子に依存し得る。１つの例では、抗体－ＩＲ７００分子および／または免疫モジュレーターの治療有効量または濃度は、疾患の進展（例えば、転移）を予防する、その進行を遅延させる、もしくはその退縮を引き起こすのに十分であるもの、または疾患、例えば、がんによって引き起こされる症状を低減することができるものである。１つの例では、抗体－ＩＲ７００分子および／または免疫モジュレーターの治療有効量または濃度は、腫瘍を有する患者の生存期間を増加させるのに十分であるものである。１つの例では、還元剤の治療有効量または濃度は、ＮＩＲ－ＰＩＴで処置された対象における浮腫、急性炎症性反応、またはその両方を減少させるのに十分であるものである。

【0079】

１つの例では、所望される応答は、がんと関連する１つまたは複数の症状を低減または阻害することである。１つまたは複数の症状は、組成物が有効であるために、完全に排除される必要はない。例えば、本明細書に提供されるモダリティでの処置は、一部の例では、腫瘍のサイズ（例えば、腫瘍または腫瘍の転移の体積または重量）を、処置がない状態における（または本明細書に提供される治療法のサブセットのみでの）腫瘍サイズと比較して、例えば、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらには少なくとも１００％減少させる。１つの特定の例では、本明細書に提供されるモダリティでの処置は、細胞（例えば、がん細胞）の集団を、処置がない状態における（または本明細書に提供される治療法のサブセットのみでの）細胞殺滅と比較して、例えば、細胞の少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらには少なくとも１００％を殺滅することによって、殺滅する。１つの特定の例では、本明細書に提供されるモダリティでの処置は、腫瘍を有する患者（または最近腫瘍が除去されたもの）の生存期間を増加させる、例えば、処置がない状態における（または本明細書に提供される治療法のサブセットのみでの）生存期間と比較して、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、または少なくとも５００％生存を増加させる。一部の例では、本明細書に提供されるモダリティでの処置は、対象におけるメモリーＴ細胞の量を、処置がない状態における（または本明細書に提供される治療法のサブセットのみでの）メモリーＴ細胞の量と比較して、例えば、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、または少なくとも５００％の増加で、増加させる。一部の例では、本明細書に提供されるモダリティでの処置は、対象におけるＭＨＣ Ｉ型拘束性の腫瘍特異的抗原に対するポリクローナル抗原特異的ＴＩＣ応答の量を増加させる、例えば、処置がない状態における（または本明細書に提供される治療法のサブセットのみでの）ＭＨＣ Ｉ型拘束性の腫瘍特異的抗原に対するポリクローナル抗原特異的ＴＩＣ応答の量と比較して、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、または少なくとも５００％増加させる。一部の例では、本明細書に提供されるモダリティでの処置は、標的とされる腫瘍におけるＴｒｅｇ（例えば、ＦＯＸＰ３^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋ Ｔｒｅｇ細胞）の量を減少させる、例えば、処置がない状態における（または本明細書に提供される治療法のサブセットのみでの）標的とされる腫瘍におけるＴｒｅｇの量と比較して、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも１００％減少させる。一部の例では、本明細書に提供されるモダリティでの処置は、処置される対象におけるＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比を増加させる、例えば、処置がない状態における（または本明細書に提供される治療法のサブセットのみでの）ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比と比較して、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、または少なくとも５００％増加させる。一部の例では、これらの効果の組合せが、開示される方法によって達成される。

【0080】

ヒトまたは獣医学的対象に投与される治療剤の有効量は、その対象と関連するいくつかの因子、例えば、対象の全般的な健康状態に応じて変動し得る。薬剤の有効量は、組成物の投薬量を変動させ、結果として得られる治療応答、例えば、腫瘍の退縮を測定することによって、決定することができる。有効量はまた、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｓｉｔｕでのイムノアッセイを通じて決定することもできる。開示される薬剤は、所望される応答を得るために必要に応じて、単回用量または複数回用量で投与することができる。しかしながら、有効量は、適用されている処置、処置されている対象、処置されている状態の重症度および種類、ならびに投与の様式に依存し得る。

【0081】

特定の例では、抗体－ＩＲ７００分子の治療有効用量は、例えば、ｉ．ｖ．投与される場合、少なくとも６０キログラム当たり０．５ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）、少なくとも５ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも３０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも５０ｍｇ／６０ｋｇ、例えば、０．５～５０ｍｇ／６０ｋｇ、例えば、１ｍｇ／６０ｋｇ、２ｍｇ／６０ｋｇ、５ｍｇ／６０ｋｇ、２０ｍｇ／６０ｋｇ、または５０ｍｇ／６０ｋｇの用量である。別の例では、抗体－ＩＲ７００分子の治療有効用量は、例えば、腫瘍内またはｉｐ投与される場合、少なくとも１０μｇ／ｋｇ、例えば、少なくとも１００μｇ／ｋｇ、少なくとも５００μｇ／ｋｇ、または少なくとも５００μｇ／ｋｇ、例えば、１０μｇ／ｋｇ～１０００μｇ／ｋｇ、例えば、１００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、または１０００μｇ／ｋｇの用量である。１つの例では、抗体－ＩＲ７００分子の治療有効用量は、局部溶液で投与される、少なくとも１μｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも５００μｇ／ｍｌ、例えば、２０μｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌの間、例えば、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、または１００μｇ／ｍｌである。しかしながら、当業者であれば、例えば、特定の抗体－ＩＲ７００分子に応じて、より高いかまたは低い投薬量もまた使用され得ることを認識するであろう。特定の例では、そのような一日投薬量は、１つもしくは複数の分割された用量（例えば、２、３、もしくは４つの用量）で、または単一の製剤において、投与される。開示される抗体－ＩＲ７００分子は、単独で、薬学的に許容される担体の存在下で、他の治療剤（例えば、他の抗新生物剤）の存在下で、投与され得る。

【0082】

一般的に、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子（および一部の例では還元剤も）の投与後の好適な照射線量は、６６０～７４０ｎｍの波長において少なくとも１Ｊ／ｃｍ^２、例えば、６６０～７４０ｎｍの波長において少なくとも１０Ｊ／ｃｍ^２、６６０～７４０ｎｍの波長において少なくとも２０Ｊ／ｃｍ^２、６６０～７４０ｎｍの波長において少なくとも２５Ｊ／ｃｍ^２、６６０～７４０ｎｍの波長において少なくとも５０Ｊ／ｃｍ^２、または６６０～７４０ｎｍの波長において少なくとも１００Ｊ／ｃｍ^２、例えば、６６０～７４０ｎｍの波長において１～５００Ｊ／ｃｍ^２である。一部の例では、波長は、６６０～７１０ｎｍである。具体的な例では、抗体－ＩＲ７００分子の投与後の好適な照射線量は、６８０もしくは６９０ｎｍの波長において少なくとも１Ｊ／ｃｍ^２、例えば、６８０もしくは６９０ｎｍの波長において少なくとも１０Ｊ／ｃｍ^２、６８０もしくは６９０ｎｍの波長において少なくとも２０Ｊ／ｃｍ^２、６８０もしくは６９０ｎｍの波長において少なくとも２５Ｊ／ｃｍ^２、６８０もしくは６９０ｎｍの波長において少なくとも５０Ｊ／ｃｍ^２、または６８０もしくは６９０ｎｍの波長において少なくとも１００Ｊ／ｃｍ^２、例えば、６８０または６９０ｎｍの波長において４～５０Ｊ／ｃｍ^２または１０～２５Ｊ／ｃｍ^２である。特定の例では、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子の投与後に（ならびに一部の例では、免疫モジュレーターおよび／または還元剤の投与後も）複数回の照射（例えば、少なくとも２回、少なくとも３回、または少なくとも４回の照射、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回の別個の投与）が行われる。

【0083】

処置すること：治療剤での細胞または組織の処置を指して使用される場合、１つもしくは複数の薬剤（例えば、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子、ならびに一部の例では、１つもしくは複数の免疫活性化因子および／または１つもしくは複数の還元剤も）を、細胞もしくは組織と接触させるかもしくはそれとともにインキュベートすること、および／または１つまたは複数の薬剤を対象、例えば、がんを有する対象に投与することを含む、用語。処置された細胞は、所望される応答に十分な量および条件下で、所望される組成物と接触されている細胞である。１つの例では、処置された細胞は、抗体が細胞上の表面タンパク質に結合するのに十分な条件下で抗体－ＩＲ７００分子に曝露されており、必要に応じて、還元剤と接触され、十分な細胞殺滅が達成されるまで、ＮＩＲ光が照射されている、細胞である。他の例では、処置された対象は、抗体が細胞上の表面タンパク質に結合するのに十分な条件下で１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子が投与されており、必要に応じて、１つまたは複数の還元剤が投与され、十分な細胞殺滅が達成されるまで、ＮＩＲ光が照射されている、対象である。

【0084】

腫瘍、新形成、悪性腫瘍、またはがん：新生物は過剰な細胞分裂により生じる組織または細胞の異常な成長である。新生物性成長により、腫瘍が生じ得る。個体における腫瘍の量は、「腫瘍量」であり、これは、腫瘍の数、体積、または重量として測定することができる。転移しない腫瘍は、「良性」と称される。周囲の組織に侵入する、および／または転移し得る腫瘍は、「悪性」と称される。「非がん性組織」は、悪性新生物が形成されたが、新生物の特徴的な病理を有さない、同じ器官に由来する組織である。一般的に、非がん性組織は、組織学的に正常に見える。「正常組織」は、器官ががんまたはその器官の別の疾患もしくは障害に罹患していない、器官に由来する組織である。「無がん」対象は、その器官のがんを有すると診断されておらず、検出可能ながんを有さない。

【0085】

腫瘍は、もともとの（原発性）腫瘍、再発性腫瘍、および転移性（二次）腫瘍を含む。腫瘍再発は、もともとの（原発性）腫瘍と同じ部位において、例えば、腫瘍が、外科手術で、薬物、もしくは他の処置によって除去されたか、またはそれ以外の方法で消滅した後に、腫瘍が再来することである。転移は、身体の１つの部分から別の部分への腫瘍の拡がりである。拡がった細胞から形成された腫瘍は、二次腫瘍と称され、もともとの（原発性）腫瘍におけるもののような細胞を含有する。原発性腫瘍または転移のいずれかの再発があり得る。

【0086】

開示される方法で処置することができる例示的な腫瘍、例えば、がんとしては、固形腫瘍、例えば、乳癌（例えば、小葉癌および乳管癌）、肉腫、肺の癌腫（例えば、非小細胞癌、大細胞癌、扁平上皮癌、および腺癌）、肺の中皮腫、結腸直腸腺癌、頭頸部がん（例えば、腺癌、扁平上皮細胞癌、転移性扁平上皮、例えば、ＨＰＶまたはエプスタイン・バーウイルス、例えば、ＨＰＶ１６によって引き起こされるがんには、口腔、舌、頬、鼻咽頭、喉、下咽頭、中咽頭、喉頭、および気管のがんが含まれる）、胃癌、前立腺腺癌、卵巣癌（例えば、漿液性嚢胞腺癌および粘液性嚢胞腺癌）、卵巣生殖細胞腫瘍、精巣癌および生殖細胞腫瘍、膵臓腺癌、胆管腺癌、肝細胞癌、膀胱癌（例えば、移行細胞癌、腺癌、および扁平上皮癌を含む）、腎細胞腺癌、子宮内膜癌（例えば、腺癌およびミュラー管混合腫瘍（癌肉腫）を含む）、子宮頸内膜、子宮頸外膜、および膣の癌（例えば、それらのそれぞれの腺癌および扁平上皮癌）、皮膚の腫瘍（例えば、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、悪性黒色腫、皮膚付属器腫瘍（skin appendage tumor）、カポジ肉腫、皮膚リンパ腫、皮膚付属器腫瘍（skin adnexal tumor）、ならびに様々なタイプの肉腫およびメルケル細胞癌）、食道癌、鼻咽頭および中咽頭の癌（それらの扁平上皮癌および腺癌を含む）、唾液腺癌、脳および中枢神経系腫瘍（例えば、神経膠、神経、および髄膜起源の腫瘍を含む）、末梢神経の腫瘍、軟部組織肉腫、および骨および軟骨の肉腫、ならびにリンパ系腫瘍（Ｂ細胞およびＴ細胞悪性リンパ腫を含む）が挙げられる。１つの例では、腫瘍は、腺癌である。１つの例では、腫瘍は、中咽頭がんである。１つの例では、腫瘍は、扁平上皮癌、例えば、頭頸部または皮膚のものである。

【0087】

方法はまた、液性腫瘍（例えば、血液学的悪性腫瘍）、例えば、リンパ系、白血球、または他の種類の白血病を処置するために使用することができる。具体的な例では、処置される腫瘍は、血液の腫瘍、例えば、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞性白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）、大顆粒リンパ球性白血病、および成人Ｔ細胞性白血病）、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、ならびに骨髄腫である。

【0088】

十分な条件下：所望される活性を可能にする任意の環境を説明して使用される語句。１つの例では、「～に十分な条件下」は、対象に、抗体－ＩＲ７００分子を、抗体－ＩＲ７００分子がその標的とされる細胞表面タンパク質（例えば、腫瘍特異的抗原または免疫細胞特異的抗原）に結合することを可能にするのに十分に投与することを含む。特定の例では、所望される活性は、抗体－ＩＲ７００分子が結合した細胞の、細胞の治療的照射後の殺滅である。

【0089】

未処置：未処置細胞は、治療剤、例えば、抗体－ＩＲ７００分子および／または照射と接触していない細胞である。ある例では、未処置細胞は、治療剤が送達されるビヒクルを受容する細胞である。同様に、未処置対象は、治療剤、例えば、抗体－ＩＲ７００分子および／または照射が投与されていない対象である。ある例では、未処置対象は、治療剤が送達されるビヒクルを受容する対象である。

【0090】

ある特定の具体的な例の開示は、他の実施形態の排除を意味するものではない。加えて、本明細書に記載されるいずれの処置も、必ずしも他の処置を排除するものではなく、他の生体活性剤または処置モダリティと組み合わせることができる。

【0091】

技術の概要
近赤外光免疫療法（ＮＩＲ－ＰＩＴ）は、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ（ＩＲ７００）と称される光吸収性シリコン－フタロシアニン色素誘導体にコンジュゲートしたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびＮＩＲ光を利用して壊死性／免疫原性細胞死を誘導する、高度に選択的ながん処置である。静脈内投与のおよそ１日後に、抗体－光吸収剤コンジュゲート（ＡＰＣ、本明細書において、抗体－ＩＲ７００分子とも称される）は、がん細胞表面マーカーに結合する。ＡＰＣの結合後のＮＩＲ光の適用により、色素におけるリガンドの放出、ＡＰＣ－抗原複合体の可溶性の劇的な変化、およびがん細胞の急速な不可逆的細胞膜損傷が高度に選択的な様式で生じ、高度に免疫原性の細胞死がもたらされる。臨床的に、このプロセスは、活性酸素種（ＲＯＳ）によって媒介される処置後の浮腫をもたらす。

【0092】

ＣＴＬＡ４は、抗腫瘍免疫抑制を媒介する主要な免疫チェックポイント分子である。ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴ（多くは調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である腫瘍内ＣＴＬＡ４^＋細胞を枯渇させる）を、腫瘍標的化ＮＩＲ－ＰＩＴ（例えば、ＩＲ７００にコンジュゲートした腫瘍特異的抗体を使用する）と組み合わせて使用した腫瘍処置に対する相乗効果を示すデータが、本明細書に提供される。したがって、ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、ＣＴＬＡ４軸を遮断すること、ならびにＣＴＬＡ４を発現する免疫サプレッサー細胞を排除することによって、潜在的なＴ細胞に媒介される抗腫瘍免疫の誘導をもたらすことで、腫瘍を効果的に処置することができる。ＮＩＲ－ＰＩＴを、例えば、腫瘍特異的抗原抗体－ＩＲ７００コンジュゲートと組み合わせて使用した、腫瘍床における局所的なＣＴＬＡ４を発現する細胞の枯渇は、様々な腫瘍型を処置するために使用することができる。

【0093】

抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００は、がん細胞を標的とし、免疫抑制のＰＤ１－ＰＤＬ１軸を遮断し、それが一部のマウス患者を治癒したため、ＮＩＲ－ＰＩＴともに抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００を使用することが、がん＋免疫療法として位置付けられ得ることを示すデータもまた、提供される。加えて、例えば、ＩＬ－１５、インターフェロンガンマ、またはその両方と組み合わせた、さらなる免疫活性化により、完全奏功（ＣＲ）率を向上させ、これを使用して腫瘍を処置し生存を増加させることができる。

【0094】

治療効果を損なうことなく一過性の急性炎症性浮腫を最小限に抑えるために、還元剤、例えば、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム（Ｌ－ＮａＡＡ）またはＬ－システインを投与して、有害なＲＯＳをクエンチし、リガンド放出反応を加速させた。Ｌ－ＮａＡＡおよびＬ－システインは、ＮＩＲ－ＰＩＴ後のＲＯＳを還元することによって急性浮腫を抑制したが、治療効果を変更させることはなかった。ＮＩＲ－ＰＩＴは、Ｌ－ＮａＡＡまたはＬ－システインの存在下において、不必要なＲＯＳ産生によって引き起こされる副作用を有することなく、安全に行うことができた。したがって、還元剤、例えば、Ｌ－システインおよびＬ－アスコルビン酸ナトリウムを、ＮＩＲ－ＰＩＴと組み合わせて使用して、活性酸素種に起因する望まれない非特異的組織損傷、例えば、浮腫（例えば、一過性急性浮腫）および急性炎症性反応を低減することができる。一部の例では、還元剤は、ＲＯＳをクエンチするが、ＮＩＲ光に誘導されるＩＲ７００のリガンド放出反応を促進する電子供与体である。１つの例では、処置される腫瘍は、浮腫が気道閉塞および咳嗽などの副作用を引き起こし得る重要な構造体、例えば、頸部または縦隔の気道の近傍に位置し、それを、開示される方法で処置することができる。

【0095】

これらの観察に基づいて、ＮＩＲ－ＰＩＴを使用して対象におけるがんを処置する方法、例えば、（１）１つもしくは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数のＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子、またはこれらの組合せ、（２）１つもしくは複数の腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００コンジュゲート、１つもしくは複数の免疫活性化因子、またはその両方、および必要に応じて（３）１つまたは複数の還元剤の投与が、本明細書に提供される。一部の例では、方法は、ＮＩＲ－ＰＩＴを使用して対象におけるがんを処置すること、例えば、（１）１つまたは複数の腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００コンジュゲート、（２）１つまたは複数の還元剤、および必要に応じて（３）１つまたは複数の免疫活性化因子の投与を含む。一部の例では、方法は、ＮＩＲ－ＰＩＴを使用して対象におけるＥＧＦＲを発現するがんを処置すること、例えば、（１）１つまたは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、（２）１つまたは複数のＥＧＦＲ抗体－ＩＲ７００コンジュゲート、および必要に応じて（３）１つもしくは複数の還元剤、１つもしくは複数の免疫活性化因子、またはその両方の投与を含む。一部の例では、方法は、ＮＩＲ－ＰＩＴを使用して対象におけるがんを処置すること、例えば、（１）１つまたは複数のＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子、（２）１つまたは複数の免疫活性化因子、および必要に応じて（３）１つもしくは複数の還元剤、１つもしくは複数の腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００コンジュゲート、またはその両方の投与を含む。

【0096】

そのような方法は、ＮＩＲ光を照射した部位、ならびに照射されていない遠位転移において、がん細胞を殺滅する。還元剤の存在は、ＩＲ７００分子の照射により生じる活性酸素種を除去または低減させることができ、これにより、望まれない炎症および浮腫が低減される。そのような方法は、局所的、およびさらには処置された部位から離れた遠位転移の両方で、様々ながんの高度に有効な処置を提供する（アブスコパル効果）。

【0097】

がんを処置するための方法
本開示は、がんを有する対象、例えば、固形腫瘍または血液学的悪性腫瘍を有する対象を処置するための方法を提供する。方法は、対象に、色素ＩＲ７００にコンジュゲートした抗体（本明細書において、抗体－ＩＲ７００分子または抗体－光吸収剤コンジュゲート（ＡＰＣ）と称される）を投与するステップであって、抗体が、一部の例では、がん（例えば、腫瘍）細胞表面タンパク質（本明細書において、腫瘍特異的抗原またはタンパク質とも称される）に特異的に結合する、ステップを含む。腫瘍特異的タンパク質は、がん細胞に固有であるか、またはがん細胞において、他の細胞、例えば、正常細胞と比較してはるかに豊富である、タンパク質である。例えば、ＨＥＲ２は、一般的に、乳がんにおいて見出されるが、ＨＥＲ１は、典型的には、腺癌において見出され、これは、多数の器官、例えば、膵臓、乳房、前立腺、および結腸において見出され得る。一部の例では、ＡＰＣの抗体は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、調節性細胞上のタンパク質に特異的に結合する。１つの例では、抗体に特異的に結合する免疫細胞特異的タンパク質は、ＣＴＬＡ４である。方法は、（ａ）対象に、治療有効量の１つもしくは複数の免疫活性化因子（例えば、ＩＬ－１５もしくはＩＦＮ－ガンマ）を投与するステップ、（ｂ）対象に、治療有効量の１つもしくは複数の還元剤を投与するステップ（例えば、浮腫を低減するため）、または（ａ）および（ｂ）の両方をさらに含み得る。

【0098】

対象は、治療有効量の１つまたは複数の腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子（例えば、薬学的に許容される担体、例えば、薬学的および生理学的に許容される流体の存在下で）を、抗体ががん細胞表面タンパク質に特異的に結合するのを許容する条件下において投与される。例えば、抗体－ＩＲ７００分子は、ビヒクルとして、薬学的に有効な担体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩溶液（例えば、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ）、水性デキストロース、ゴマ油、グリセロール、エタノール、これらの組合せなどにおいて存在し得る。担体および組成物は、滅菌であり得、製剤は、投与の様式に適している。具体的な例では、抗体－ＩＲ７００分子は、ＥＧＦＲ抗体－ＩＲ７００である。一部の例では、腫瘍特異的抗体は、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ、ＰＤ－Ｌ１、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２、ＣＤ３、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα受容体）、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＤ２０６、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ルイスＹ、ＴＡＧ７）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、グリピカン－１、グリピカン－２、グリピカン－３、ｇｐＡ３３、ムチン、ＣＡＩＸ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド、インテグリンαＶβ３、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＢＣＲ複合体、ｇｐ７２、ＨＬＡ－ＤＲ１０β、ＨＬＡ－ＤＲ抗原、ＩｇＥ、ＣＡ２４２、ＰＥＭ抗原、ＳＫ－１抗原、ＰＤ－１、またはＰＤ－Ｌ２に特異的である。

【0099】

一部の例では、対象は、治療有効量の１つもしくは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数のＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子、またはこれらの組合せ（例えば、薬学的に許容される担体、例えば、薬学的および生理学的に許容される流体の存在下で）を、抗体ががん細胞表面タンパク質に特異的に結合するのを許容する条件下においてさらに投与される。例えば、ＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、ＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子、またはこれらの組合せは、ビヒクルとして、薬学的に有効な担体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩溶液（例えば、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ）、水性デキストロース、ゴマ油、グリセロール、エタノール、これらの組合せなどにおいて存在し得る。

【0100】

一部の例では、腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子、およびＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、ＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子、またはこれらの組合せは、単一の組成物に存在し、同時に投与される。他の例では、腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子、およびＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、ＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子、またはこれらの組合せは、別個の組成物に存在し、同時もしくは同時期に、または逐次的に（例えば、少なくとも１分間、少なくとも５分間、少なくとも３０分間、もしくは少なくとも６０分間の間隔で）投与される。

【0101】

一部の例では、対象は、例えば、治療有効量の１つもしくは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、および／または１つもしくは複数のＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子と組み合わせて、治療有効量の１つまたは複数の免疫活性化因子がさらに投与される。免疫活性化因子は、免疫系活性化因子、および／または免疫サプレッサー細胞の１つもしくは複数の阻害剤（例えば、薬学的に許容される担体、例えば、薬学的および生理学的に許容される流体の存在下で）を含む。具体的な例では、免疫活性化因子剤は、ＩＬ－１５である。別の具体的な例では、免疫調節剤は、インターフェロンガンマである。一部の例では、１つまたは複数の免疫活性化因子は、対象に、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子と同時に（例えば、同時にまたは実質的に同時に）、例えば、同じ組成物において、投与される。他の例では、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子および１つまたは複数の免疫活性化因子は、対象に、逐次的に（いずれかの順序で）例えば、互いに少なくとも約１時間（例えば、約５分間、約１０分間、約１５分間、約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間、約６０分間、約２時間、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、または約７日間以内）離れて、投与される。

【0102】

一部の例では、対象は、例えば、ＮＩＲ－ＰＩＴにより生じ得る浮腫を低減させるために、治療有効量の１つまたは複数の還元剤がさらに投与される。一部の例では、抗体－ＩＲ７００分子および還元剤は、単一の組成物に存在し、同時に投与される。他の例では、抗体－ＩＲ７００分子および還元剤は、別個の組成物に存在し、同時もしくは同時期に、または逐次的に（例えば、腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子に続いて還元剤を、例えば、少なくとも１分間、少なくとも５分間、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも１２時間、または少なくとも２４時間の間隔で）投与される。

【0103】

一部の例では、腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子は、静脈内投与される。一部の例では、ＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、ＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子、またはこれらの組合せは、静脈内投与される。一部の例では、１つまたは複数の還元剤は、腹腔内投与される。一部の例では、腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子、およびＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、ＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子、またはこれらの組合せは、静脈内投与される。一部の例では、腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子は、静脈内投与され、１つまたは複数の還元剤は、腹腔内投与される。一部の例では、１つまたは複数の免疫活性化因子（例えば、ＩＬ１５）は、静脈内投与される。１つの例では、１つまたは複数の免疫活性化因子は、例えば、１～１０ｍｇの用量で静脈内投与される、ＩＬ１５である。一部の例では、１つまたは複数の免疫活性化因子（例えば、ＩＦＮγ）は、腫瘍内投与される。１つの例では、１つまたは複数の免疫活性化因子は、例えば、１ｍｇを上回らない、例えば、０．０１～１ｍｇの用量で腫瘍内投与される、ＩＦＮγである。

【0104】

１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子（例えば、腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子）を投与した後に、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子は、標的とされる腫瘍または腫瘍の免疫細胞内に蓄積することが可能である。同様に、１つもしくは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数のＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子、またはこれらの組合せを投与した後に、そのような分子は、それらのそれぞれのタンパク質（それぞれ、ＣＴＬＡ４またはＰＤ－Ｌ１）、例えば、そのようなタンパク質を発現する細胞に、例えば、腫瘍床に存在するＣＴＬＡ４またはＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に、結合することが可能である。腫瘍細胞および腫瘍床（またはがんを有する対象）における他の細胞は、次いで、抗体－ＩＲ７００コンジュゲートが結合した細胞の殺滅を許容する条件下において、例えば、６６０～７４０ｎｍ（例えば、６００～７１０ｎｍ）の波長において、少なくとも１Ｊ／ｃｍ^２の線量で（例えば、６８０ｎｍまたは６９０ｎｍ、１０～６０Ｊ／ｃｍ^２の線量、例えば、２０～５０Ｊ／ｃｍ^２または２０～３０Ｊ／ｃｍ^２の線量で）の照射で、照射される。

【0105】

１つの例では、抗体－ＩＲ７００コンジュゲートの投与と照射の間には、少なくとも約１０分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約１時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、または少なくとも約４８時間（例えば、約１～４時間、３０分間～１時間、１０分間～６０分間、３０分間～８時間、２～１０時間、１２～２４時間、１８～３６時間、または２４～４８時間）ある。１つの例では、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００コンジュゲートが投与され（例えば、ｉ．ｖ．）、少なくとも約１０分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約１時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、または少なくとも約４８時間（例えば、約１～４時間、３０分間～１時間、１０分間～６０分間、３０分間～８時間、２～１０時間、１２～２４時間、１８～３６時間、または２４～４８時間、例えば、約１２時間または約２４時間）後に、腫瘍（または対象）が照射される。１つまたは複数の免疫活性化因子は、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００コンジュゲートの前または後、および照射の前または後に、投与され得る（例えば、全身、例えば、ｉｖまたはｉｐ）。一部の例では、１つまたは複数の免疫活性化因子は、照射の前および後に投与され、例えば、照射の前に少なくとも１回の用量の免疫活性化因子、および照射の後に少なくとも１回の用量の免疫活性化因子（例えば、照射の２４時間前、および照射の２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、またはそれよりも後の１つまたは複数）が、投与される。追加の例では、免疫活性化因子の用量はまた、少なくとも１回の照射処置と同じ日に投与されてもよい。１つまたは複数の還元剤は、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００コンジュゲートの前または後であるが、照射の前（例えば、照射の少なくとも５分前、少なくとも１０分前、少なくとも１５分前、または少なくとも３０分前、例えば、５～６０分前）に、投与され得る（例えば、全身、例えば、ｉｖまたはｉｐ）。

【0106】

一部の例では、抗体－ＩＲ７００分子のうちの１つまたは複数の複数回の用量は、対象に、例えば、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または少なくとも１０回の別個の用量（または投与）で投与される。一部の例では、１つもしくは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数のＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子、またはこれらの組合せの複数回の用量は、対象に、例えば、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または少なくとも１０回の別個の用量（または投与）で投与される。一部の例では、１つまたは複数の免疫活性化因子の複数回の用量は、対象に、例えば、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または少なくとも１０回の別個の用量（または投与）で投与される。一部の例では、１つまたは複数の還元剤の複数回の用量は、対象に、例えば、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または少なくとも１０回の別個の用量（または投与）で投与される。一部の例では、ＮＩＲでの複数回の照射線量は、対象に、例えば、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または少なくとも１０回の別個の線量（または投与）で投与される。具体的な例では、対象は、抗体－ＩＲ７００分子のうちの１つまたは複数の少なくとも１回の用量、１つまたは複数の免疫活性化因子の少なくとも２回の用量、および少なくとも２回の別個のＮＩＲ照射の投与が投与される。

【0107】

ＮＩＲ励起光波長は、組織内への少なくとも数センチメートルの透過を可能にする。例えば、ディフューザーチップ付きファイバー結合型レーザーダイオードを使用することによって、ＮＩＲ光は、身体表面に対して深部に位置する、それ以外ではアクセス不可能な腫瘍の数センチメートル内部へと送達され得る。固形がんを処置することに加えて、循環腫瘍細胞（血液学的悪性腫瘍を含むがこれらに限定されない）を、（例えば、本明細書に記載されるＮＩＲ ＬＥＤ着用可能デバイスを使用して）表在血管を移動する際に励起することができるため、それらを標的とすることができる。

【0108】

１つの例では、開示される方法は、例えば、開示される方法での処置がない状態（例えば、（ａ）１つもしくは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数のＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子、またはこれらの組合せ、（ｂ）１つまたは複数の還元剤、（ｃ）１つまたは複数の免疫活性化因子、あるいはａ、ｂ、およびｃの組合せと組み合わせた、１つまたは複数の腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子の投与なし、ならびにＮＩＲ照射なし）と比べて、処置された標的細胞（例えば、腫瘍特異的抗原を発現するがん細胞、または腫瘍床内の免疫細胞、例えば、腫瘍床内のＰＤ－Ｌ１もしくはＣＴＬＡ４を発現するＴ細胞、例えば、ＣＴＬＡ４を発現する腫瘍床内の４ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ Ｔｒｅｇ）のうちの少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはそれよりも多くを殺滅する。

【0109】

１つの例では、開示される方法は、使用される抗体－ＩＲ７００コンジュゲートの抗体に特異的に結合するタンパク質（例えば、腫瘍特異的抗原、ＣＴＬＡ４、またはＰＤ－Ｌ１）を発現する細胞を選択的に殺滅し、それによって、腫瘍を処置する。例えば、正常細胞と比べて腫瘍細胞を選択的に殺滅することにより、方法は、正常細胞、例えば、例として、投与される抗体に特異的に結合するタンパク質（例えば、腫瘍特異的抗原）を発現しない細胞などよりも効果的に腫瘍細胞を殺滅することができる。一部の例では、開示される方法は、腫瘍の重量、サイズ、および／または体積を減少させるか、腫瘍の成長を減速させるか、腫瘍の再発を減少もしくは減速させるか、腫瘍の転移を減少もしくは減速させる（例えば、転移の数を低減させるか、もしくは転移の重量／体積／サイズを減少させることによって）か、またはこれらの組合せを行う。例えば、開示される方法は、一部の例では、腫瘍サイズ（例えば、腫瘍の重量または体積）を、例えば、開示される方法での処置がない状態（例えば、（ａ）１つもしくは複数の還元剤、（ｂ）１つもしくは複数の免疫活性化因子、またはこれらの組合せと組み合わせた、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子の投与なし、ならびに／あるいはＮＩＲ照射なし）と比べて、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらには１００％、低減させる。一部の例では、開示される方法は、転移の重量、体積、またはサイズを、例えば、開示される方法での処置がない状態（例えば、（ａ）１つもしくは複数の還元剤、（ｂ）１つもしくは複数の免疫活性化因子、またはこれらの組合せと組み合わせた、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子の投与なし、ならびに／あるいは原発性腫瘍のＮＩＲ照射なし）と比べて、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらには１００％、減少させる。一部の例では、開示される方法は、アブスコパル効果を有し、それ自体が６６０～７４０ｎｍの波長において少なくとも１Ｊ ｃｍ^－２の線量（例えば、少なくとも４Ｊ ｃｍ^－２の線量または４～５０Ｊ ｃｍ^－２の線量）で照射されておらず、腫瘍または病変部の照射されたエリアから遠位に位置する転移の重量、体積、またはサイズを減少させる。一部の例では、照射されていない転移の重量、体積、またはサイズは、開示される方法での処置によって（例えば、（ａ）１つもしくは複数の還元剤、（ｂ）１つもしくは複数の免疫活性化因子、またはこれらの組合せと組み合わせた、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子の投与なし、ならびに／あるいは原発性腫瘍のＮＩＲ照射なしで）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらには１００％減少する。

【0110】

他の免疫細胞と比べてＴｒｅｇ細胞（例えば、ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ Ｔｒｅｇ）の選択的な殺滅により、方法は、他の免疫細胞、例えば、腫瘍床内にないＴｒｅｇなどよりも効果的に照射されたＴｒｅｇ細胞を殺滅することができる。１つの例では、開示される方法（例えば、ＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００を使用するもの）は、Ｔｒｅｇを減少させる（例えば、腫瘍床内のＦＯＸＰ３^＋ ＣＤ４^＋ Ｔｒｅｇ細胞を減少させるが、身体の他の部分、例えば、脾臓または領域リンパ節においては減少させない）。例えば、開示される方法は（例えば、ＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００またはＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００が投与される例では）、一部の例では、腫瘍床内のＦＯＸＰ３^＋ ＣＤ４^＋ Ｔｒｅｇ細胞の数を、開示される方法での処置がない状態（例えば、１つもしくは複数の抗体－ＩＲ７００分子の投与なし、および／またはＮＩＲ照射なし）と比べて、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはそれを上回って、減少させる。一部の例では、開示される方法は、ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^－細胞：ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞の比を、開示される方法での処置がない状態（例えば、１つもしくは複数の抗体－ＩＲ７００分子の投与なし、および／またはＮＩＲ照射なし）と比べて、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、またはそれを上回って、増加させる。一部の例では、開示される方法は、脾臓または腫瘍の領域リンパ節内のＦＯＸＰ３^＋ ＣＤ４^＋ Ｔｒｅｇ細胞の数を、実質的に減少させず、例えば、開示される方法での処置がない状態（例えば、１つもしくは複数の抗体－ＩＲ７００分子の投与なし、および／またはＮＩＲ照射なし）と比べて、１０％以下、５％以下、１％以下、または０．５％以下で減少させる。

【0111】

一部の例では、開示される方法は、腫瘍内血管灌流を、開示される方法での処置がない状態（例えば、１つもしくは複数の抗体－ＩＲ７００分子の投与なし、および／またはＮＩＲ照射なし）と比べて、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはそれを上回って、減少させる。

【0112】

一部の例では、開示される方法は、腫瘍、再発、および／または転移性腫瘍と関連する１つまたは複数の症状を減少させる。１つの例では、開示される方法は、腫瘍の成長を、開示される方法での処置がない状態（例えば、１つもしくは複数の抗体－ＩＲ７００分子の投与なし、および／またはＮＩＲ照射なし）と比べて、例えば、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれを上回って、減速させる。１つの例では、開示される方法は、腫瘍の再発を、開示される方法での処置がない状態（例えば、１つもしくは複数の抗体－ＩＲ７００分子の投与なし、および／またはＮＩＲ照射なし）と比べて、例えば、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはさらには１００％、低減または排除する。

【0113】

一部の例では、開示される方法は、対象（例えば、腫瘍を有するかまたは腫瘍が以前に除去されている対象）の生存期間を、例えば、開示される方法での処置がない状態（例えば、１つもしくは複数の抗体－ＩＲ７００分子の投与なし、および／またはＮＩＲ照射なし）と比べて増加させる。一部の例では、対象の生存期間は、例えば、開示される方法での処置がない状態（例えば、１つもしくは複数の抗体－ＩＲ７００分子の投与なし、および／またはＮＩＲ照射なし）と比べて、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれを上回って増加する。一部の例では、対象の生存期間は、例えば、開示される方法での処置がない状態（例えば、１つもしくは複数の抗体－ＩＲ７００分子の投与なし、および／またはＮＩＲ照射なし）と比べて、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１年間、少なくとも１．５年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、少なくとも５年間、またはそれを上回って増加する。例えば、開示される方法は、一部の例では、対象の無増悪生存期間または無疾患生存期間（例えば、原発性腫瘍の再発の欠如または転移の欠如）を、開示される方法での処置がない状態（例えば、１つもしくは複数の抗体－ＩＲ７００分子の投与なし、および／またはＮＩＲ照射なし）での平均生存期間と比べて、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間、少なくとも３６ヶ月間、少なくとも４８ヶ月間、少なくとも６０ヶ月間、またはそれを上回って増加させる。

【0114】

一部の例では、ＮＩＲ－ＰＩＴと組み合わせた１つまたは複数の還元剤の使用は、処置される対象における浮腫を、ＮＩＲ－ＰＩＴとともに１つまたは複数の還元剤を使用しない浮腫の量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはさらには少なくとも９５％低減させる。一部の例では、ＮＩＲ－ＰＩＴと組み合わせた１つまたは複数の還元剤の使用は、処置される対象における急性炎症性反応を、ＮＩＲ－ＰＩＴとともに１つまたは複数の還元剤を使用しない急性炎症性反応の量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはさらには少なくとも９５％低減させる。

【0115】

１つの例では、上に列挙される効果の組合せが、開示される方法で達成される。

【0116】

開示される方法は、身体における固定腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍および／または循環中の腫瘍（例えば、白血病細胞、転移、および／もしくは循環腫瘍細胞）を処置するために使用することができる。しかしながら、循環細胞は、それらの性質により、それほど長く光に曝露することができない。したがって、殺滅しようとする細胞が、身体全体を循環しているものである場合、方法は、着用することができるデバイスまたは身体の部分を覆うものを使用することによって、達成することができる。例えば、そのようなデバイスは、長期間着用することができる。ＮＩＲ放出発光ダイオード（ＬＥＤ）およびバッテリーパックを組み込んだ日常の着用可能物品（例えば、腕時計、ジュエリー（例えば、ネックレスまたはブレスレット）、ブランケット、衣服（例えば、下着、靴下、および靴の中敷き）、ならびに他の日常の着用可能物品）を使用することができる。そのようなデバイスは、長い期間にわたって、デバイスの下にある皮膚に光を生成し、長期間にわたって、表在血管への継続的な光の曝露をもたらす。循環腫瘍細胞は、デバイスの下にあるエリアを通るときに、光に曝露される。例として、このデバイスの腕時計またはブレスレットバージョンは、一連のＮＩＲ ＬＥＤをバッテリーパワーパックとともに含み得、１日の大半の間着用される。１つまたは複数の腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子の（例えば、１つもしくは複数のＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数のＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数の還元剤、１つもしくは複数の免疫活性化因子、またはこれらの組合せと組み合わせた、全身的に、例えば、ｉｖおよび／またはｉｐでの）投与の後に、循環細胞は、抗体－ＩＲ７００コンジュゲートに結合し、ＰＩＴによる殺滅に対して感受性となる。これらの細胞が、日常の着用可能物品（例えば、ブレスレットまたは腕時計）に存在するＬＥＤに隣接する血管内を流動するときに、それらは、ＮＩＲ光に曝露され、それらが細胞殺滅に対して感受性となるであろう。光線量は、診断および細胞型に応じて調整可能であり得る。

【0117】

一部の例では、方法は、治療法、例えば、腫瘍細胞の殺滅、Ｔｒｅｇの殺滅、またはその両方をモニタリングするステップをさらに含む。そのような例では、対象は、例えば、１つもしくは複数の還元剤、１つもしくは複数の免疫活性化因子、またはこれらの組合せと組み合わせた、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子（例えば、腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子および／または免疫細胞特異的抗体－ＩＲ７００分子）が投与され、本明細書に記載されるように照射される。しかしながら、より低い用量の抗体－ＩＲ７００コンジュゲートおよびＮＩＲ光を、モニタリング（細胞殺滅は、必要とされない場合があるため、治療法のモニタリングのみ）に使用してもよい。１つの例では、モニタリングするために投与される抗体－ＩＲ７００コンジュゲートの量は、多くとも２分の１（例えば、治療用量の多くとも３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、または１０分の１）である。１つの例では、モニタリングするために投与される抗体－ＩＲ７００コンジュゲートの量は、治療用量よりも少なくとも２０％または少なくとも２５％低い。１つの例では、モニタリングするために使用されるＮＩＲ光の量は、治療線量の少なくとも１／１０００または少なくとも１／１０，０００である。これは、処置されている細胞の検出を可能にする。例えば、そのような方法を使用することによって、腫瘍のサイズおよび転移を、モニタリングすることができる。

【0118】

一部の例では、方法は、外科手術、例えば、内視鏡術中に有用である。例えば、抗体－ＩＲ７００分子（例えば、腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子および／または免疫細胞特異的抗体－ＩＲ７００分子）が、例えば、１つもしくは複数の還元剤、１つもしくは複数の免疫活性化因子、またはこれらの組合せと組み合わせて投与され、細胞／対象に、上述のように照射した後、これは、細胞殺滅をもたらすだけでなく、外科医または他の医療従事者が、腫瘍の境界部を視認することを可能にし、腫瘍（例えば、皮膚、乳房、肺、結腸、頭頸部、または前立腺の腫瘍）の切除が完了すること、および境界部を明瞭にすることを確実にするのに役立つ。一部の例では、多くとも２分の１（例えば、治療用量の多くとも３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、または１０分の１）などの、より低い用量の抗体－ＩＲ７００コンジュゲートを、視覚化に使用することができる。

【0119】

１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子（例えば、腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子および／または免疫細胞特異的抗体－ＩＲ７００分子）、１つまたは複数の還元剤、および１つまたは複数の免疫活性化因子は、例えば、腫瘍、例えば、がんを有する対象、または腫瘍が以前に除去された（例えば、外科手術によって）対象に、局所的または全身的に投与され得る。具体的な例が提供されているが、当業者であれば、開示される治療剤の代替的な投与方法を使用してもよいことを理解するであろう。そのような方法としては、例えば、処置を必要とする対象に数時間から数日間の期間にわたって連続的な注入を提供する、カテーテルまたは埋込み可能なポンプの使用を挙げることができる。

【0120】

１つの例では、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子（例えば、腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子および／または免疫細胞特異的抗体－ＩＲ７００分子）、１つまたは複数の還元剤、および１つまたは複数の免疫活性化因子は、腫瘍（腫瘍内）または器官（例えば、前立腺）への直接的な注射または注入を含む、非経口手段によって投与される。一部の例では、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子（例えば、腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子および／または免疫細胞特異的抗体－ＩＲ７００分子）、１つまたは複数の還元剤、および１つまたは複数の免疫活性化因子は、薬剤を腫瘍に適用する、例えば、治療剤の局所注射、治療剤を含有する溶液に腫瘍を浸すことによって、または治療剤を腫瘍に注ぐことよって、腫瘍に投与される。

【0121】

加えて、または代替的に、開示される組成物は、腫瘍（例えば、がん）を有する対象に、全身的に、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、皮下、または経口で投与され得る。１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子（例えば、腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子および／または免疫細胞特異的抗体－ＩＲ７００分子）、１つまたは複数の還元剤、および１つまたは複数の免疫活性化因子は、同じかまたは異なる経路によって、投与され得る。１つの例では、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子は、ｉｖ投与され、１つまたは複数の還元剤は、腹腔内に送達される。１つの例では、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子および１つまたは複数の免疫活性化因子は、ｉｖおよび／または腫瘍内に投与され、１つまたは複数の還元剤は、腹腔内に送達される。別の例では、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子（例えば、腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子および／または免疫細胞特異的抗体－ＩＲ７００分子）、１つまたは複数の還元剤、および１つまたは複数の免疫活性化因子は、全身的に（例えば、静脈内または腹腔内に）投与される。１つの例では、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子（例えば、腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子および／または免疫細胞特異的抗体－ＩＲ７００分子）、１つまたは複数の還元剤、および１つまたは複数の免疫活性化因子は、腹腔内投与される。１つの例では、１つまたは複数の腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子、１つまたは複数の免疫活性化因子、および１つまたは複数の還元剤は、静脈内投与される。

【0122】

対象に投与しようとする本明細書に提供される治療剤の投薬量は、絶対限界値の対象ではなく、組成物の性質、その活性成分、およびその可能性のある不必要な副作用（例えば、抗体に対する免疫応答）、処置されている対象および処置されている状態の種類、ならびに投与の様式に依存し得る。一般的に、用量は、治療有効量、例えば、所望される生物学的効果を達成するのに十分な量、例えば、腫瘍のサイズ（例えば、体積および／または重量）を減少させるか、または腫瘍のさらなる成長を減弱させるか、または腫瘍の望まれない症状を減少させるのに有効な量であろう。

【0123】

抗体－ＩＲ７００分子（腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子、ならびにＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子を含む）の静脈内投与に関して、単回処置での対象への投与のための例示的な投薬量は、０．５～２００ｍｇ／６０ｋｇ体重、１～１００ｍｇ／６０ｋｇ体重、１～５０ｍｇ／６０ｋｇ体重、１～２０ｍｇ／６０ｋｇ体重、例えば、約１または２ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。なおも別の例では、腹腔内または腫瘍内に投与される抗体－ＩＲ７００分子（腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子、ならびにＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子を含む）の治療有効量は、体重１ｋｇ当たり１０μｇ～５０００μｇの抗体－ＩＲ７００分子、例えば、１０μｇ／ｋｇ～１０００μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ～５００μｇ／ｋｇ、または１００μｇ／ｋｇ～１０００μｇ／ｋｇである。１つの例では、ヒト患者に投与される抗体－ＩＲ７００分子（腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子、ならびにＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子を含む）の用量は、少なくとも５０ｍｇ、例えば、少なくとも１００ｍｇ、少なくとも３００ｍｇ、少なくとも５００ｍｇ、少なくとも７５０ｍｇ、またはさらには１ｇである。

【0124】

還元剤の静脈内投与に関して、単回処置での対象への投与のための例示的な投薬量は、０．５～３００ｇ／６０ｋｇ体重、１～３００ｇ／６０ｋｇ体重、１～５０ｇ／６０ｋｇ体重、１～２０ｇ／６０ｋｇ体重、１～１０ｇ／６０ｋｇ体重、１０～３００ｇ／６０ｋｇ体重、例えば、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、または３００ｇ／６０ｋｇ体重の範囲であり得る。なおも別の例では、腹腔内または腫瘍内に投与される還元剤の治療有効量は、体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ～５０００ｍｇの還元剤、例えば、１０ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇである。１つの例では、ヒト患者に投与される還元剤の用量は、少なくとも１ｇ、少なくとも１０ｇ、少なくとも２０ｇ、少なくとも５０ｇ、少なくとも１００ｇ、少なくとも２００ｇ、少なくとも３００ｇ、例えば、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、または３００ｇである。

【0125】

免疫活性化剤、例えば、ＩＬ－１５の静脈内投与に関して、単回処置での対象への投与のための例示的な投薬量は、０．１～１００ｍｇ、例えば、１～１０ｍｇまたは０．５～２０ｍｇの範囲であり得る。免疫活性化剤、例えば、ＩＦＮガンマの腫瘍内投与に関して、単回処置での対象への投与のための例示的な投薬量は、０．０１～１ｍｇ、例えば、０．１～０．５ｍｇまたは０．０５～５ｍｇの範囲であり得る。

【0126】

開示される抗体－ＩＲ７００分子（腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子、ならびにＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子を含む）、１つもしくは複数の還元剤、および／または１つもしくは複数の免疫活性化因子での処置は、１日で完了し得るか、または同じかもしくは異なる投薬量を用いて複数日間反復的に行われてもよい。反復処置は、同日、連日、または１～３日ごと、３～７日ごと、１～２週間ごと、２～４週間ごと、１～２ヶ月ごと、またはさらに長い間隔で、行われてもよい。一部の例では、抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数の還元剤、および／または１つもしくは複数の免疫活性化因子は、同日に投与される。他の例では、抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数の還元剤、および／または１つもしくは複数の免疫活性化因子は、異なる日に投与され、例えば、１つまたは複数の免疫活性化因子が、抗体－ＩＲ７００分子の前日に投与されるか、または抗体－ＩＲ７００分子が、１つまたは複数の還元剤の前日に投与される）。１つの非限定的な例では、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子および１つまたは複数の免疫活性化因子は、同日に対象に投与され、１つまたは複数の免疫活性化因子の反復用量（同じかまたは異なる投薬レベルで）が、連日、または１～３日ごと、３～７日ごと、１～２週間ごと、２～４週間ごと、１～２ヶ月ごと、またはさらに長い間隔で、対象に投与される（例えば、１回、２回、３回、４回、５回、またはそれよりも多くの追加の用量の１つまたは複数の免疫活性化因子）。一部の例では、１つまたは複数の免疫活性化因子の反復用量の量は、初回用量と比較して低減される（例えば、５０％低減される）。

【0127】

例示的な処置の組合せは、表１に提供されている。

【表1-1】

【表1-2】

【0128】

一部の例、実施例７～１３および１９～３８のうちのいずれか１つでは、免疫活性化因子は、ＩＬ－１５である。一部の例、実施例７～１３および１９～３８のうちのいずれか１つでは、免疫活性化因子は、インターフェロンガンマである。一部の例、実施例１４～２４、３１～３６、および３８～３９のうちのいずれか１つでは、還元剤は、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウムである。

【0129】

追加の実施形態では、方法はまた、対象に、１つまたは複数の追加の治療剤を投与するステップを含む。国際特許出願公開第ＷＯ ２０１３／００９４７５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、照射（例えば、６６０～７１０ｎｍの波長における、少なくとも１０Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも２０Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも３０Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも４０Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも５０Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも７０Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも８０Ｊ／ｃｍ^２、または少なくとも１００Ｊ／ｃｍ^２、例えば、少なくとも１０～１００Ｊ／ｃｍ^２の線量での照射）の後に約８時間のウインドウがあり、その間、ＰＩＴ処置細胞による追加の薬剤（例えば、ナノサイズ剤、例えば、直径が少なくとも約１ｎｍ、直径が少なくとも１０ｎｍ、直径が少なくとも１００ｎｍ、または直径が少なくとも２００ｎｍ、例えば、直径が１～５００ｎｍのもの）の取り込みが、増強される。したがって、１つまたは複数の追加の治療剤が、さらに、ＰＩＴと同時期または逐次的に、対象に投与され得る。１つの例では、追加の治療剤は、照射後、例えば、細胞に照射した約０～８時間後（例えば、照射の少なくとも１０分後、少なくとも３０分後、少なくとも６０分後、少なくとも２時間後、少なくとも３時間後、少なくとも４時間後、少なくとも５時間後、少なくとも６時間後、または少なくとも７時間後、例えば、照射後１０時間以内、９時間以内、または８時間以内、例えば、１時間～１０時間、１時間～９時間、１時間～８時間、２時間～８時間、または４時間～８時間）に投与される。別の例では、追加の治療剤は、照射の直前（例えば、照射の約１０分～１２０分前、例えば、照射の１０分～６０分前、または１０分～３０分前）に投与される。使用することができる追加の治療剤は、以下に考察されている。

【0130】

追加の実施形態では、リアルタイムでの細胞の殺滅の検出またはモニタリングを可能にする方法が、提供される。そのような方法は、例えば、十分な量の抗体－ＩＲ７００分子（腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子、ならびにＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子を含む）、１つもしくは複数の還元剤、ならびに／または１つもしくは複数の免疫活性化因子、あるいは十分な量の照射が、細胞殺滅を促進するために細胞または腫瘍に送達されたことを確実にするのに有用である。これらの方法は、形態学的変化が明らかになる前に細胞殺滅の検出を可能にする。１つの例では、方法は、細胞表面タンパク質を有する細胞を、治療有効量の１つもしくは複数の抗体－ＩＲ７００分子（腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子、ならびにＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子を含む）、１つもしくは複数の還元剤、ならびに／または１つもしくは複数の免疫活性化因子と接触させるステップと、細胞に、６６０～７４０ｎｍの波長において少なくとも１０Ｊ／ｃｍ^２の線量で照射するステップと、細胞を、細胞に照射した約０～４８時間後（例えば、細胞に照射した少なくとも１時間後、少なくとも２時間後、少なくとも４時間後、少なくとも６時間後、少なくとも１２時間後、少なくとも１８時間後、少なくとも２４時間後、少なくとも３６時間後、少なくとも４８時間後、または少なくとも７２時間後、例えば、細胞に照射した１分～３０分後、１０分～３０分後、１０分～１時間後、１時間～８時間後、６時間～２４時間後、または６時間～４８時間後）に蛍光寿命イメージングで検出し、それによって、リアルタイムで細胞殺滅を検出するステップとを含む。ＦＬＴの短縮は、ＰＩＴによって誘導される急性膜損傷の指標としての機能を果たす。したがって、細胞は、ＩＲ７００ ＦＬＴを少なくとも２５％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７５％短縮するのに十分な条件下で照射される。１つの例では、細胞は、６６０ｎｍ～７４０ｎｍ（例えば、６８０ｎｍ～７００ｎｍ、例えば、６８０または６９０ｎｍ）の波長において、少なくとも１０Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも２０Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも３０Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも４０Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも５０Ｊ／ｃｍ^２、または少なくとも６０Ｊ／ｃｍ^２、例えば、１０～６０Ｊ／ｃｍ^２、２０～５０Ｊ／ｃｍ^２、２０～２５Ｊ／ｃｍ^２、または３０～５０Ｊ／ｃｍ^２の線量で照射される。

【0131】

一部の例では、リアルタイムで細胞殺滅を検出する方法は、例えば、細胞に照射した約０～８時間後に、細胞を、１つまたは複数の追加の治療剤と接触させるステップを含む。リアルタイムイメージングは、細胞を、１つまたは複数の追加の治療剤と接触させる前または後に生じ得る。例えば、リアルタイムイメージングによって決定した場合に、１つもしくは複数の抗体－ＩＲ７００分子（腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子、ならびにＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子を含む）、１つもしくは複数の還元剤、および／または１つもしくは複数の免疫活性化因子の投与後に不十分な細胞殺滅が生じた場合には、細胞を、１つまたは複数の追加の治療剤と接触させることができる。しかしながら、一部の例では、細胞は、リアルタイムで細胞殺滅を検出する前に、抗体－ＩＲ７００分子（腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子、ならびにＣＴＬＡ４およびＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子を含む）、１つもしくは複数の還元剤、および／または１つもしくは複数の免疫活性化因子、ならびに追加の治療剤と接触される。

【0132】

例示的な細胞
標的細胞は、望ましくない細胞またはその成長が望ましくない細胞、例えば、がん細胞（例えば、腫瘍細胞）または免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、例えば、Ｔｒｅｇ）であり得る。細胞は、処置しようとする哺乳動物、例えば、がんを有する対象（例えば、ヒトまたは獣医学的対象）に存在し得る。任意の標的細胞を、特許請求される方法で処置することができる。１つの例では、標的細胞は、他の正常な（所望される）細胞の表面上には実質的に見出されない細胞表面タンパク質を発現し、そのようなタンパク質に特異的に結合する抗体を選択することができ、そのタンパク質に対する抗体－ＩＲ７００分子を生成することができる。１つの例では、細胞表面タンパク質は、腫瘍特異的タンパク質（例えば、抗原）、例えば、ＥＧＦＲである。１つの非限定的な例では、細胞表面タンパク質は、ＣＴＬＡ４（例えば、腫瘍床におけるＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ Ｔｒｅｇを標的とするため）である。１つの非限定的な例では、細胞表面タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１である。

【0133】

１つの例では、腫瘍細胞は、がん細胞、例えば、がんを有する患者における細胞である。開示される方法を用いて殺滅することができる例示的な細胞としては、以下の腫瘍の細胞が挙げられる：血液学的悪性腫瘍、例えば、急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）を含む、白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病）。別の例では、細胞は、固形腫瘍細胞、例えば、肉腫および癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、肺がん、結腸直腸がん、扁平上皮細胞癌、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮細胞癌）、基底細胞癌、腺癌（例えば、膵臓、結腸、卵巣、肺、乳房、胃、前立腺、子宮頸部、または食道の腺癌）、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、ウイルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、膀胱癌、ならびにＣＮＳがん（例えば、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫（craniopharyogioma）、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（menangioma）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）に由来する細胞である。１つの例では、腫瘍は、中咽頭がんである。

【0134】

具体的な例では、細胞は、肺がん細胞である。

【0135】

具体的な例では、細胞は、乳がん細胞である。

【0136】

具体的な例では、細胞は、結腸がん細胞である。

【0137】

具体的な例では、細胞は、頭頸部がん細胞である。

【0138】

具体的な例では、細胞は、前立腺がん細胞である。

【0139】

具体的な例では、細胞は、中咽頭がん細胞である。

【0140】

具体的な例では、細胞は、扁平上皮細胞癌細胞、例えば、頭頸部または皮膚がんのもの）である。

【0141】

一部の例では、方法は、アブスコパル効果を有し得るため、処置されるがんまたはがん細胞は、照射される腫瘍から遠位の部位にあるもの、例えば、６６０～７４０ｎｍの波長における少なくとも１Ｊ／ｃｍ^２の線量での照射を受けない、例えば、１ｍｍ離れた、１インチ離れた、２インチ離れた、３インチ離れた、４インチ離れた、６インチ離れた、１２インチ離れた、またはそれよりも遠くの遠位転移である。

【0142】

一部の例では、処置されるがんまたはがん細胞は、中等度または高度に免疫原性であり、免疫応答を誘起することができる。一部の例では、ＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００および／またはＰＤ－Ｌ抗体－ＩＲ７００の投与を含むＮＩＲ－ＰＩＴ方法は、中等度または高度に免疫原性の腫瘍を処置するために使用される。中等度または高度に免疫原性のがんの例としては、黒色腫、肺がん（例えば、ＮＳＣＬＣ）、結腸がん、および腎細胞がんが挙げられる。１つの例では、高度に免疫原性のがんは、前立腺がんである。一部の例では、処置されるがんまたはがん細胞は、高度に免疫原性でなく、免疫応答を誘起することができない。一部の例では、ＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００および／またはＰＤ－Ｌ抗体－ＩＲ７００を伴うＮＩＲ－ＰＩＴは、低免疫原性腫瘍を処置するために、抗腫瘍－ＩＬ７００（例えば、抗ＥＧＦＲ－ＩＲ７００または抗ＰＳＡ抗原－ＩＲ７００）と組み合わせて使用される。低免疫原性のがんの例としては、口腔扁平上皮細胞がん、乳がん、膵臓がん、および多発性骨髄腫が挙げられる。一部の例では、腫瘍免疫原性スコアを使用して、がんが、低免疫原性であるか、中等度に免疫原性であるか、または高度に免疫原性であるかを決定する（例えば、Wang et al, eLife, 8:e49020, 2019を参照されたい）。

【0143】

例示的な対象
一部の例では、開示される方法は、がんを有する対象、または腫瘍、例えば、本明細書に記載される腫瘍を有する対象を処置するために使用される。一部の例では、腫瘍は、以前に処置されており、例えば、外科手術または化学的に除去されており、開示される方法は、それに続いて、患者に残存している可能性のある任意の残存している望まれない腫瘍細胞を殺滅するため、および／または腫瘍の再発もしくは転移を低減させるために使用される。

【0144】

開示される方法は、腫瘍、例えば、がんを有するか、またはそれが以前に除去もしくは処置されている、任意の哺乳動物対象（例えば、ヒトまたは獣医学的対象、例えば、イヌもしくはネコ）、例えば、ヒトを処置するために使用され得る。開示される治療法を必要とする対象としては、がん、例えば、腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子に特異的に結合し得る腫瘍特異的タンパク質を細胞表面上に発現するがん、または免疫細胞特異的抗体－ＩＲ７００分子（例えば、ＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００）に結合し得る免疫細胞が浸潤したがんを有する、ヒト対象が挙げられ得る。例えば、開示される方法は、単独で、または放射線照射もしくは他の化学療法もしくは外科手術と組み合わせて、がんの初回処置として使用され得る。開示される方法はまた、以前の放射線照射または化学療法が失敗した患者においても、使用され得る。したがって、一部の例では、対象は、他の治療法を受けているが、他の治療法が、所望される治療応答をもたらさなかったものである。開示される方法はまた、限局型および／もしくは転移性がん、ならびに／または原発性腫瘍の再発を有する患者においても使用され得る。

【0145】

一部の例では、方法は、開示される治療法から利益を得るであろう対象を選択するステップ、例えば、抗体－ＩＲ７００分子に特異的に結合し得る細胞表面タンパク質（例えば、腫瘍特異的タンパク質）を発現する腫瘍を有する対象を選択するステップを含む。例えば、対象が、ＨＥＲ２を発現する乳がんを有すると決定された場合、対象は、例えば、ＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、ＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数の還元剤、１つもしくは複数の免疫活性化因子、またはこれらの組合せと組み合わせた、抗ＨＥＲ２－ＩＲ７００分子、例えば、トラスツズマブ－ＩＲ７００で処置することに選択され得、対象は、続いて、本明細書に記載されるように照射される。

【0146】

例示的な細胞表面タンパク質
１つの例では、殺滅しようとする標的細胞の細胞表面上のタンパク質は、他の細胞上には有意な量で存在しない。例えば、細胞表面タンパク質は、標的細胞型においてのみ見出される受容体であり得る。

【0147】

具体的な例では、細胞表面タンパク質は、がんまたは腫瘍特異的タンパク質（腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原とも称される）、例えば、ＥＧＦ受容体ファミリーのメンバー（例えば、ＨＥＲ１、２、３、および４）、ならびにサイトカイン受容体（例えば、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＩＬ－１３Ｒ、ＣＤ５、ＣＤ５２など）である。したがって、一部の例では、細胞表面タンパク質は、腫瘍細胞の細胞膜上に発現される抗原である。腫瘍特異的タンパク質は、がん細胞に固有であるか、またはがん細胞において、他の細胞、例えば、正常細胞と比較してはるかに豊富である、タンパク質である。例えば、ＨＥＲ２は、主として、乳がんにおいて見出されるが、ＨＥＲ１は、主として、腺癌において見出され、これは、多数の器官、例えば、膵臓、乳房、前立腺、および結腸において見出され得る。

【0148】

標的細胞において見出すことができる例示的な腫瘍特異的タンパク質（およびそのタンパク質に特異的な抗体を使用して抗体－ＩＲ７００分子を製剤化することができるもの）としては、ＭＡＧＥ １（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ７７４８１およびＡＡＡ０３２２９）、ＭＡＧＥ ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ１８９２０およびＡＡＡ１７７２９）、ＭＡＧＥ ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０３７３５およびＡＡＡ１７４４６）、ＭＡＧＥ ４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ３２０７５およびＡ０６８４１．１）などを含む、様々なＭＡＧＥ（黒色腫関連抗原Ｅ）のうちのいずれか、様々なチロシナーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０１８７３およびＡＡＢ６０３１９）のうちのいずれか、突然変異体ｒａｓ、突然変異体ｐ５３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５４１５６、ＣＡＡ３８０９５、およびＡＡ４９４３１１）、ｐ９７黒色腫抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１２１５４およびＡＡＡ５９９９２）、乳房腫瘍と関連するヒト乳脂肪球（ＨＭＦＧ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ５６１５１およびＡＡＢ１９７７１）、ＢＡＧＥ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ１３０７２）およびＢＡＧＥ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１８２４８２およびＮＰ＿８７２２８８）を含む様々なＢＡＧＥ（ヒトＢ黒色腫関連抗原Ｅ）のうちのいずれか、ＧＡＧＥ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ１３０６５）またはＧＡＧＥ２～６のうちのいずれかを含む様々なＧＡＧＥ（Ｇ抗原）のうちのいずれか、様々なガングリオシド、ＣＤ２５（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００４０８．１およびＮＭ＿０００４１７．２）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0149】

他の腫瘍特異的抗原としては、子宮頸がんと関連するＨＰＶ １６／１８およびＥ６／Ｅ７抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１５２６、ＦＪ９５２１４２．１、ＡＤＢ９４６０５、ＡＤＢ９４６０６、およびＵ８９３４９）、乳癌と関連するムチン（ＭＵＣ １）－ＫＬＨ抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０３６５１およびＡＡＡ３５７５６）、結腸直腸がんと関連するＣＥＡ（癌胎児性抗原）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ９８３１１およびＣＡＡ６６９５５）、例えば、黒色腫と関連するｇｐ１００（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ７３００３およびＡＡＣ６０６３４）、黒色腫と関連するＭＡＲＴ１抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５５０２）、卵巣がんおよび他のがんと関連するがん抗原１２５（ＣＡ１２５、ムチン１６またはＭＵＣ１６としても公知）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２４６９０およびＮＰ＿０７８９６６）、肝臓がんと関連するアルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１３４およびＮＰ＿００１１２５）、結腸直腸がん、胆管がん、乳がん、小細胞肺がん、および他のがんと関連するルイスＹ抗原、腺癌と関連する腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、グリピカン１（膵臓がん、神経膠腫、および乳がんと関連するＧＰＣ１）、グリピカン２（神経芽細胞腫と関連する）、およびグリピカン３（肝細胞癌と関連する）、ならびに前立腺がんと関連するＰＳＡ抗原（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１４８１０およびＣＡＡ３２９１５）が挙げられる。

【0150】

他の例示的な腫瘍特異的タンパク質としては、固形腫瘍血管新生ならびに前立腺がんと関連するＰＭＳＡ（前立腺膜特異的抗原、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６０２０９およびＡＡＢ８１９７１．１）、乳がん、卵巣がん、胃がん、および子宮がんと関連するＨＥＲ－２（ヒト上皮成長因子受容体２、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１６７８９．１、Ｍ１６７９０．１、Ｍ１６７９１．１、Ｍ１６７９２．１、およびＡＡＡ５８６３７）、肺がん、肛門がん、および神経芽細胞腫、ならびに腺癌と関連するＨＥＲ－１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２２８およびＮＰ＿００５２１９）、黒色腫、肉腫、精巣癌、および他のがんと関連するＮＹ－ＥＳＯ－１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８７４５９およびＡＡＢ４９６９３）、ｈＴＥＲＴ（別名テロメラーゼ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１９８２５３およびＮＰ＿９３７９８３（バリアント１）、ＮＭ＿１９８２５５およびＮＰ＿９３７９８６（バリアント２））、プロテイナーゼ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２９１４２、Ｍ７５１５４、Ｍ９６８３９、Ｘ５５６６８、ＮＭ ００２７７、Ｍ９６６２８、Ｘ５６６０６、ＣＡＡ３９９４３、およびＡＡＡ３６３４２）、ならびにウイルムス腫瘍１（ＷＴ－１、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３７８およびＮＰ＿０００３６９（バリアントＡ）、ＮＭ＿０２４４２４およびＮＰ＿０７７７４２（バリアントＢ）、ＮＭ＿０２４４２５およびＮＰ＿０７７７４３（バリアントＣ）、ならびにＮＭ＿０２４４２６およびＮＰ＿０７７７４４（バリアントＤ））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0151】

１つの例では、腫瘍特異的タンパク質は、ＥＧＦＲであり、一部の例では、ＥＧＦＲ抗体－ＩＲ７００は、パニツムマブまたはセツキシマブであるか、またはそれを含む。

【0152】

１つの例では、腫瘍特異的タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１であり、一部の例では、ＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、またはコシベリマブであるか、またはそれを含む。

【0153】

１つの例では、腫瘍特異的タンパク質は、慢性リンパ球性白血病と関連するＣＤ５２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ２７４９５．１およびＣＡＩ１５８４６．１）、急性骨髄性白血病と関連するＣＤ３３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２３０６８およびＣＡＤ３６５０９．１）、ならびに非ホジキンリンパ腫と関連するＣＤ２０（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６８７６９ ＮＰ＿０３１６６７）である。

【0154】

具体的な例では、腫瘍特異的タンパク質は、ＣＤ４４（例えば、ＯＭＩＭ １０７２６９、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣＩ４６５９６．１およびＮＰ＿０００６０１．３）である。ＣＤ４４は、がん幹細胞様細胞および様々なタイプのがんのマーカーであり、細胞間接着、細胞遊走、細胞の空間配置、およびマトリックス由来生存シグナルの促進に関係している。腫瘍の形質膜上のＣＤ４４の高い発現は、腫瘍の侵攻性および予後の不良と関連付けられ得る。

【0155】

したがって、開示される方法は、腫瘍特異的タンパク質を発現する任意のがんを処置するために使用することができる。

【0156】

例示的な抗体－ＩＲ７００分子
細胞表面タンパク質配列は、公的に利用可能である（例えば、上述のように）ため、そのようなタンパク質に特異的な抗体（またはＩＲ７００にコンジュゲートすることができる他の小分子）の作製または購入は、達成することができる。例えば、腫瘍特異的タンパク質ＨＥＲ２が、標的として選択される場合、ＨＥＲ２に特異的な抗体（例えば、トラスツズマブ）を、購入または生成し、ＩＲ７００色素に付着させることができる。他の具体的な例は、本明細書における表２および他の箇所に提供されている。１つの例では、ＩＲ７００にコンジュゲートした抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。

【0157】

１つの例では、抗体－ＩＲ７００分子は、ＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００分子、例えば、アテゾリズマブ－ＩＲ７００、アベルマブ－ＩＲ７００、デュルバルマブ－ＩＲ７００、コシベリマブ－ＩＲ７００、ＫＮ０３５－ＩＲ７００、ＢＭＳ９３５５５９－ＩＲ７００、ＭＥＤＩ－４７３６－ＩＲ７００、ＭＥＤｆＩ－４７３７－ＩＲ７００、ＢＭＳ－９３６５５９－ＩＲ７００、ＭＰＤＬ－３２８０Ａ－ＩＲ７００、またはＣＫ－３０１－ＩＲ７００である。

【0158】

１つの例では、抗体－ＩＲ７００分子は、ＥＧＦＲ抗体－ＩＲ７００分子、例えば、パニツムマブ－ＩＲ７００またはセツキシマブ－ＩＲ７００である。

【0159】

抗体－ＩＲ７００分子は、ＷＯ ２０１３／００９４７５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどの方法を使用して、生成することができる。

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【0160】

ＩＲ７００にコンジュゲートし、開示される方法において使用することができる、追加の抗体としては、３Ｆ８、アバゴボマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アルツモマブペンテテート、アナツモマブマフェナトクス、アポリズマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベシレソマブ、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、シタツズマブボガトクス、デツモマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エプラツズマブ、エリツマキソマブ、ガリキシマブ、グレンバツムマブベドチン、イゴボマブ、イムシロマブ、ルミリキシマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミツモマブ、モロリムマブ、ナコロマブタフェナトクス、ナプツモマブエスタフェナトクス、ノフェツモマブメルペンタン、ピンツモマブ、サツモマブペンデチド、ソネプシズマブ、タプリツモマブパプトクス、テナツモマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（トレメリムマブ）、ＴＮＸ－６５０、またはトレメリムマブが挙げられる。

【0161】

一部の例では、ＩＲ７００にコンジュゲートした抗体によって認識される細胞表面タンパク質は、免疫細胞、例えば、Ｔｒｅｇに見出されるものである。１つの例では、タンパク質は、ＣＴＬＡ４である。１つの例では、抗体－ＩＲ７００分子は、ＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００分子、例えば、イピリムマブ－ＩＲ７００またはトレメリムマブ－ＩＲ７００である。

【0162】

１つの例では、患者は、がん細胞表面抗原に特異的な少なくとも２つの異なる抗体－ＩＲ７００分子で処置される。１つの例では、２つの異なる抗体－ＩＲ７００分子は、同じタンパク質（例えば、ＨＥＲ－２）に特異的であるが、タンパク質の異なるエピトープ（例えば、ＨＥＲ－２のエピトープ１およびエピトープ２）に特異的である。別の例では、２つの異なる抗体－ＩＲ７００分子は、２つの異なるタンパク質または抗原に特異的である。例えば、抗ＨＥＲ１－ＩＲ７００および抗ＨＥＲ２－ＩＲ７００は、ＨＥＲ１またはＨＥＲ２のいずれかを有する細胞の殺滅を促進するために、カクテルとして一緒に注射されてもよい。

【0163】

免疫モジュレーター／免疫活性化因子
開示される方法において使用される免疫活性化因子は、免疫系を活性化する、および／または免疫サプレッサー細胞（本明細書においてサプレッサー細胞とも称される）を阻害する、薬剤または組成物を含む。免疫サプレッサー細胞の阻害および／または免疫応答の活性化は、腫瘍細胞殺滅を増加させ得、メモリーＴ細胞の産生をもたらし、これによって、再発および／または遠位腫瘍もしくは転移に対する「ワクチン」効果を提供することができる。一部の例では、１つまたは複数の免疫活性化因子は、１つもしくは複数の腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子、１つもしくは複数の還元剤、またはその両方と組み合わせて使用される。

【0164】

一部の実施形態では、免疫活性化因子は、免疫サプレッサー細胞の阻害剤、例えば、免疫サプレッサー細胞の活性を阻害または低減させる薬剤である。一部の場合には、免疫モジュレーターは、免疫サプレッサー細胞を殺滅する。一部の例では、免疫サプレッサー細胞は、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞である。一部の例では、自己免疫の発症につながる可能性があるため、サプレッサー細胞のすべてがｉｎ ｖｉｖｏで殺滅されるわけではない。したがって、一部の例では、方法は、対象のあるエリア、例えば、腫瘍のエリアまたは腫瘍を以前有していたエリアにおいて、免疫サプレッサーの活性または数を、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減させる。一部の例では、方法は、対象におけるサプレッサー細胞の総数を、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減させる。

【0165】

免疫サプレッサー細胞の阻害剤としては、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ソラフェニブ、スニチニブ、およびイマチニブ）、化学療法剤（例えば、シクロホスファミドまたはインターロイキン－毒素融合体、例えば、デニロイキンジフチトクス（ＩＬ２－ジフテリア毒素融合体）、または抗ＣＤ２５抗体（例えば、ダクリズマブもしくはバシリキシマブ）、またはサプレッサー細胞表面タンパク質に結合する他の抗体（例えば、以下に記載されるもの）が挙げられる。他の例では、免疫サプレッサー細胞の阻害剤としては、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、それによってＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を予防する、抗ＰＤ－Ｌ１アンタゴナイズ抗体（本明細書において、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂに媒介される免疫チェックポイント遮断（ＩＣＢ）と称される）が挙げられる。したがって、一部の例では、免疫モジュレーターは、ＰＤ－Ｌ１アンタゴナイズ抗体、例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、コシベリマブ、ＫＮ０３５（エンバフォリマブ）、ＢＭＳ－９３６５５９、ＢＭＳ９３５５５９、ＭＥＤＩ－４７３６、ＭＰＤＬ－３２８０Ａ、またはＭＥＤＩ－４７３７（または本明細書に提供される他の例）である。チェックポイント阻害剤には、イピリムマブおよびトレメリムマブを含むＣＴＬＡ－４抗体も含まれる。免疫サプレッサー細胞の阻害剤はまた、ＬＡＧ－３またはＢ７－Ｈ３アンタゴニスト、例えば、ＢＭＳ－９８６０１６、およびＭＧＡ２７１であり得る。一部の例では、免疫サプレッサー細胞の阻害剤のうちの２つまたはそれよりも多くを、対象に投与することができる。１つの非限定的な例では、対象は、抗ＰＤ１および抗ＬＡＧ－３抗体を投与される。

【0166】

一部の例では、サプレッサー細胞の活性を阻害または低減させる薬剤としては、１つまたは複数の抗体‐ＩＲ７００分子であって、抗体が、サプレッサー細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ４、Ｃ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体４型（ＣＸＣＲ４）、Ｃ－Ｃケモカイン受容体４型（ＣＣＲ４）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、グルココルチコイド誘導型ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０、葉酸受容体４（ＦＲ４）、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ８、ＣＤ１２２、ＣＤ２３、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ－１、ＣＤ１４、インターロイキン４受容体アルファ鎖（ＩＬ－４Ｒａ）、インターロイキン－１受容体アルファ（ＩＬ－１Ｒａ）、インターロイキン－１デコイ受容体、ＣＤ１０３、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＸＣＲ２、ＣＤ３３、およびＣＤ６６ｂ））に特異的に結合する、抗体‐ＩＲ７００分子が挙げられる。

【0167】

非限定的な例では、免疫モジュレーターは、ＣＤ２５抗体－ＩＲ７００分子、例えば、ダクリズマブ－ＩＲ７００またはバシリキシマブ－ＩＲ７００である。

【0168】

他の実施形態では、免疫モジュレーターは、免疫系活性化因子（免疫活性化因子）である。一部の例では、免疫系活性化因子は、１つまたは複数のＴ細胞および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を刺激（活性化）する。１つの例では、免疫系活性化因子は、１つまたは複数のインターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、および／またはＩＬ－２１を含む。非限定的な例では、免疫モジュレーターは、ＩＬ－１５を含むか、またはそれからなる。非限定的な例では、免疫モジュレーターは、ＩＬ－２およびＩＬ－１５を含む。非限定的な例では、免疫モジュレーターは、インターフェロンガンマを含むか、またはそれからなる。別の例では、免疫系活性化因子は、共刺激受容体、例えば、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、またはＧＩＴＲに対する１つまたは複数のアゴニストを含む。非限定的な例では、免疫モジュレーターは、刺激性抗４－１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体、および／または抗ＧＩＴＲ抗体を含む。

【0169】

一部の例では、１回または複数（例えば、１回、２回、３回、４回、５回、またはそれよりも多く）の用量の免疫モジュレーターが、対象に投与される。したがって、免疫モジュレーターを投与するステップは、１日に完了し得るか、または同じかもしくは異なる投薬量を用いて複数日間反復的に行われてもよい（例えば、少なくとも異なる２回、異なる３回、異なる４回、異なる５回、または異なる１０回の投与）。一部の例では、反復投与は、同じ用量である。他の例では、反復投与は、異なる用量（例えば、先行する用量よりも高い後続の用量、または先行する用量よりも低い後続の用量）である。免疫モジュレーターの反復投与は、同日、連続日、１日おき、１～３日ごと、３～７日ごと、１～２週間ごと、２～４週間ごと、１～２ヶ月ごと、またはさらに長い間隔で、行われてもよい。一部の例では、免疫モジュレーターの少なくとも１回の用量は、照射の前に投与され、免疫モジュレーターの少なくとも１回の用量は、照射の後に投与される。

【0170】

照射
対象に１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子が投与された後、対象（または対象における腫瘍）は、照射される。標的タンパク質を発現する細胞のみが、抗体によって認識されるため、それらの細胞のみに、細胞を殺滅するのに十分な量の抗体－ＩＲ７００分子が会合することになる。照射は、抗体－ＩＲ７００分子が結合した細胞のみを殺滅し、他の細胞は殺滅しないため、これにより、望まれない副作用、例えば、非腫瘍細胞の殺滅の可能性が減少する。

【0171】

対象（例えば、対象における腫瘍）は、６６０～７４０ｎｍ、例えば、６６０～７１０ｎｍ、６６０～７００ｎｍ、６８０～７００ｎｍ、６７０～６９０ｎｍ、例えば、６８０ｎｍまたは６９０ｎｍの波長において、治療照射線量で照射される。特定の例では、細胞、腫瘍、または対象は、少なくとも１Ｊ／ｃｍ^２、例えば、少なくとも１０Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも２０Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも２５Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも３０Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも５０Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも１００Ｊ／ｃｍ^２、または少なくとも５００Ｊ／ｃｍ^２、例えば、１～１０００Ｊ／ｃｍ^２、１～５００Ｊ／ｃｍ^２、１～１００Ｊ／ｃｍ^２、４～５０Ｊ／ｃｍ^２、３０～５０Ｊ／ｃｍ^２、１０～１００Ｊ／ｃｍ^２、２０～３０Ｊ／ｃｍ^２、２０～５０Ｊ／ｃｍ^２、または１０～５０Ｊ／ｃｍ^２の線量で照射される。

【0172】

対象は、１回または複数回照射され得る。したがって、照射は、１日に完了し得るか、または同じかもしくは異なる投薬量を用いて複数日間反復的に行われてもよい（例えば、少なくとも異なる２回、異なる３回、異なる４回、異なる５回、または異なる１０回の照射）。一部の例では、反復照射は、同じ線量である。他の例では、反復照射は、異なる線量（例えば、先行する線量よりも高い後続の線量、または先行する線量よりも低い後続の線量）である。反復照射は、同日、連日、１日おき、１～３日ごと、３～７日ごと、１～２週間ごと、２～４週間ごと、１～２ヶ月ごと、またはさらに長い間隔で、行われてもよい。１つの例では、第１の照射は、５０Ｊ／ｃｍ^２であり、第２の照射は、１００Ｊ／ｃｍ^２であり、照射は、連続した日に行われる（例えば、約２４時間間隔で）。１つの例では、第１の照射は、１０～５０Ｊ／ｃｍ^２であり、第２の照射は、１０～５０Ｊ／ｃｍ^２であり、照射は、連続した日に行われる（例えば、約２４時間間隔で）。

【0173】

一部の例では、照射は、ＮＩＲ ＬＥＤを組み込んだ着用可能デバイスで提供される。他の例では、開示される方法とともに使用することができる別のタイプのデバイスは、ＮＩＲ ＬＥＤを有する懐中電灯様デバイスである。そのようなデバイスは、外科手術中に病変部の限局療法に使用され得るか、または１つもしくは複数のＰＩＴ剤の投与後に体表面にＮＩＲ光を適用する内視鏡に組み込まれ得る。そのようなデバイスは、身体の特定の標的への処置を誘導するように、医師または有資格医療従事者によって使用され得る。

【0174】

着用可能ＮＩＲ ＬＥＤを使用した処置
本明細書に記載されるように、開示される方法は、がん細胞（または例えば、ＣＴＬＡ４抗体－ＩＲ７００が使用される場合は腫瘍床におけるＴｒｅｇ）に高度に特異的である。しかしながら、身体内を循環するかまたは皮膚上に存在する細胞を殺滅するために、患者は、ＮＩＲ ＬＥＤを組み込んだデバイスを着用することができる。一部の例では、患者は、少なくとも２つのデバイス、例えば、日中には衣料品またはジュエリー、および夜間にはブレスレットを使用する。一部の例では、患者は、少なくとも２つのデバイス、例えば、２つの衣料品を同時に使用する。これらのデバイスは、処置が人目につかないままとなり、日々の活動に干渉しないように、患者が、持ち運び可能な日常的な衣料品およびジュエリーを使用してＮＩＲ光に曝露されるのを可能にする。一部の例では、デバイスは、ＰＩＴ療法のために、日中、さり気なく着用することができる。ＮＩＲ ＬＥＤを組み込んだ例示的なデバイスは、国際特許出願公開第ＷＯ ２０１３／００９４７５号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

【0175】

１つの例では、患者は、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子を、本明細書に記載される方法を使用して、例えば、１つもしくは複数の還元剤および／または１つもしくは複数の免疫活性化因子と組み合わせて、投与される。患者は、次いで、長期治療、および血液またはリンパ節または皮膚に存在する腫瘍細胞の処置を可能にする、ＮＩＲ ＬＥＤを組み込んだデバイスを着用する。一部の例では、線量は、少なくとも１Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも４Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも１０Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも２０Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも３０Ｊ／ｃｍ^２、少なくとも４０Ｊ／ｃｍ^２、または少なくとも５０Ｊ／ｃｍ^２、例えば、１０～１００Ｊ／ｃｍ^２、１０～５０Ｊ／ｃｍ^２、例えば、２０Ｊ／ｃｍ^２または３０Ｊ／ｃｍ^２である。一部の例では、例えば、１つもしくは複数の還元剤および／または１つもしくは複数の免疫活性化因子と組み合わせた、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子の投与は、治療レベルが確実に身体に存在するように、ある期間にわたって反復される（例えば、２週間ごとまたは１ヶ月ごと）。

【0176】

一部の例では、患者は、少なくとも１週間、例えば、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、またはさらには少なくとも１年間、デバイス、またはデバイスの組合せを着用または使用する。一部の例では、患者は、少なくとも１日に４時間、例えば、少なくとも１日に１２時間、少なくとも１日に１６時間、少なくとも１日に１８時間、またはさらには１日に２４時間、デバイスまたはデバイスの組合せを着用または使用する。同様の「日常的な」性質の複数のデバイス（ブランケット、ブレスレット、ネックレス、下着、靴下、靴の中敷き）が、処置期間の間、同じ患者によって着用され得ることは、十分可能である。夜間には、患者は、ＮＩＲ ＬＥＤブランケットまたは他のカバーを使用し得る。

【0177】

追加の治療の投与
上記に考察されるように、例えば、１つもしくは複数の還元剤および／または１つもしくは複数の免疫活性化因子と組み合わせた、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子の投与、ならびに照射の前、最中、または後に、対象は、１つまたは複数の他の治療を受けてもよい。１つの例では、対象は、例えば、１つもしくは複数の還元剤および／または１つもしくは複数の免疫活性化因子と組み合わせた、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子の投与、ならびに照射の前に、腫瘍を除去または低減させるための１つまたは複数の処置を受ける。他の例では、追加の処置または治療剤（例えば、抗新生物剤）は、処置しようとする対象に、例えば、照射の後、例えば、細胞に照射した約０～８時間後（例えば、照射の少なくとも１０分後、少なくとも３０分後、少なくとも６０分後、少なくとも２時間後、少なくとも３時間後、少なくとも４時間後、少なくとも５時間後、少なくとも６時間後、または少なくとも７時間後、例えば、照射後１０時間以内、９時間以内、または８時間以内、例えば、１時間～１０時間、１時間～９時間、１時間～８時間、２時間～８時間、または４時間～８時間）に投与され得る。別の例では、追加の治療剤は、照射の直前（例えば、照射の約１０分～１２０分前、例えば、照射の１０分～６０分前、または１０分～３０分前）に投与される。

【0178】

一部の例では、ＰＩＴの後に約８時間、腫瘍の追加の治療剤へのアクセス性を増強させる、開示される方法と組み合わせて使用することができるそのような治療の例としては、腫瘍の除去または低減のための外科処置（例えば、外科的切除、低温療法、もしくは化学塞栓術）、ならびに放射線療法剤、抗新生物化学療法剤、抗生物質、アルキル化剤、および抗酸化剤、キナーゼ阻害剤、および他の薬剤を含み得る抗腫瘍医薬処置が挙げられるが、これらに限定されない。一部の例では、追加の治療剤は、ナノ粒子にコンジュゲートする。使用することができる追加の治療剤の特定の例としては、微小管結合剤、ＤＮＡインターカレーターまたは架橋剤、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、ならびに遺伝子調節因子が挙げられる。これらの薬剤（治療有効量で投与される）および処置は、単独または組み合わせて使用され得る。

【0179】

「微小管結合剤」は、チューブリンと相互作用して微小管形成を安定化または脱安定化し、それによって、細胞分裂を阻害する、薬剤を指す。開示される方法と併せて使用することができる微小管結合剤の例としては、限定することなく、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン（ナベルビン）、エポチロン、コルヒチン、ドラスタチン１５、ノコダゾール、ポドフィロトキシン、およびリゾキシンが挙げられる。そのような化合物のアナログおよび誘導体もまた、使用することができる。例えば、好適なエポチロンおよびエポチロンアナログは、国際公開第ＷＯ ２００４／０１８４７８号に記載されている。米国特許第６，６１０，８６０号、同第５，５３０，０２０号、および同第５，９１２，２６４号に教示されるタキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル、ならびにパクリタキセルのアナログを、使用することができる。

【0180】

以下のクラスの化合物を、本明細書に開示される方法とともに使用することができる：限定することなく、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ならびにそれらの誘導体およびアナログを含む、好適なＤＮＡおよび／またはＲＮＡ転写調節剤もまた、開示される治療法と組み合わせた使用に好適である。対象に投与することができるＤＮＡインターカレーターおよび架橋剤としては、限定することなく、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ならびにこれらの誘導体およびアナログが挙げられる。治療剤として使用するのに好適なＤＮＡ合成阻害剤としては、限定することなく、メトトレキセート、５－フルオロ－５’－デオキシウリジン、５－フルオロウラシル、およびこれらのアナログが挙げられる。好適な酵素阻害剤の例としては、限定することなく、カンプトテシン、エトポシド、ホルメスタン、トリコスタチン、ならびにこれらの誘導体およびアナログが挙げられる。遺伝子調節に影響を及ぼす好適な化合物としては、１つまたは複数の遺伝子の発現の増加または減少をもたらす薬剤、例えば、ラロキシフェン、５－アザシチジン、５－アザ－２’－デオキシシチジン、タモキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、ミフェプリストン、ならびにこれらの誘導体およびアナログが挙げられる。キナーゼ阻害剤としては、成長因子のリン酸化および活性化を予防する、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（イマチニブ）、Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）（ゲフィチニブ）、およびＴａｒｃｅｖａ（登録商標）（エルロチニブ）が挙げられる。

【0181】

抗血管新生剤の非限定的な例としては、タンパク質、酵素、多糖、オリゴ糖、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および組換えベクターなどの分子、ならびに血管成長を低減またはさらには阻害するように機能する小分子が挙げられる。好適な血管新生阻害剤の例としては、限定することなく、アンジオスタチンＫ１－３、スタウロスポリン、ゲニステイン、フマギリン、メドロキシプロゲステロン、スラミン、インターフェロン－アルファ、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血小板因子４、ソマトスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、サリドマイド、ならびにこれらの誘導体およびアナログが挙げられる。例えば、一部の実施形態では、抗血管新生剤は、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体（例えば、Ａｖａｓｔｉｎ、Ｒｏｃｈｅ）またはＶＥＧＦ受容体に特異的に結合する抗体（例えば、ＶＥＧＦＲ２抗体）である。１つの例では、抗血管新生剤は、ＶＥＧＦＲ２抗体またはＤＭＸＡＡ（バジメザンもしくはＡＳＡ４０４としても公知で、例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されている）、またはその両方を含む。抗血管新生剤は、ベバシズマブ、スニチニブ、抗血管新生チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、例えば、スニチニブ、キシチニブ（xitinib）、およびダサチニブであり得る。これらは、個別に、または任意の組合せで使用してもよい。

【0182】

上述の分類のうちの１つまたは複数に入る場合も入らない場合もある他の治療剤、例えば、抗腫瘍剤もまた、開示される方法と組み合わせた投与に好適である。例として、そのような薬剤としては、アドリアマイシン、アピゲニン、ラパマイシン、ゼブラリン、シメチジン、ならびにこれらの誘導体およびアナログが挙げられる。

【0183】

一部の例では、治療用抗体－ＩＲ７００分子を受容する対象はまた、例えば、静脈内投与によって、インターロイキン－２（ＩＬ－２）も投与される。特定の例では、ＩＬ－２（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）は、少なくとも５００，０００ＩＵ／ｋｇの用量で、抗体－ＩＲ７００分子の投与の翌日に開始し、最大５日間継続して、８時間ごとに１５分間の期間にわたって、静脈内ボーラスとして投与される。投薬は、対象の寛容性に応じてスキップしてもよい。

【0184】

例示的な追加の治療剤としては、抗新生物剤、例えば、化学療法剤および抗血管新生剤または治療法、例えば、放射線療法が挙げられる。１つの例では、薬剤は、化学療法免疫抑制剤（例えば、リツキシマブ、ステロイド）またはサイトカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）である。例示的な化学療法剤は、例えば、Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86 in Harrison’s Principles of Internal Medicine, 14th edition、Perry et al., Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2nd ed., 2000 Churchill Livingstone, Inc、Baltzer and Berkery. (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995、Fischer Knobf, and Durivage (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993)に提供されている。組合せ化学療法は、がんを処置するための１つを上回る薬剤の投与である。

【0185】

本明細書に提供される方法とともに使用することができる例示的な化学療法剤としては、カルボプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、トポテカン、イリノテカン、ゲムシタビン、イアゾフリン（iazofurine）、ゲムシタビン、エトポシド、ビノレルビン、タモキシフェン、バルスポダル、シクロホスファミド、メトトレキセート、フルオロウラシル、ミトキサントロン、Ｄｏｘｉｌ（リポソーム封入ドキソルビシン（doxiorubicine））、およびビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる化学療法剤の追加の例としては、アルキル化剤、抗代謝剤、天然産物、またはホルモンおよびそれらのアンタゴニストが挙げられる。アルキル化剤の例としては、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタード、またはクロラムブシル）、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、またはダカルバジン）が挙げられる。アルキル化剤の具体的な非限定的な例は、テモゾロミドおよびダカルバジンである。抗代謝剤の例としては、葉酸アナログ（例えば、メトトレキセート）、ピリミジンアナログ（例えば、５－ＦＵまたはシタラビン）、およびプリンアナログ、例えば、メルカプトプリンまたはチオグアニンが挙げられる。天然産物の例としては、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビンデシン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドまたはテニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、またはマイトマイシンＣ）、および酵素（例えば、Ｌ－アスパラギナーゼ）が挙げられる。その他の薬剤の例としては、白金配位錯体（例えば、シスプラチンとしても公知のｃｉｓ－ジアミン－ジクロロ白金ＩＩ）、置換尿素（例えば、ヒドロキシ尿素）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン）、および副腎皮質抑制剤（例えば、ミトタンおよびアミノグルテチミド）が挙げられる。ホルモンおよびアンタゴニストの例としては、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）、抗エストロゲン薬（例えば、タモキシフェン）、ならびにアンドロゲン（例えば、プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン）が挙げられる。

【0186】

例示的な化学療法薬としては、アドリアマイン、アルケラン、Ａｒａ－Ｃ、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン（Carboplatinum）、シスプラチン（Cisplatinum）、シトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（または他のタキサン、例えば、ドセタキセル）、ベルバン、ビンクリスチン、ＶＰ－１６、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ハーセプチン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ－１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキサンＳＴＩ－５７１、タキソテール、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）、ゼローダ（カペシタビン）、ゼベリン（Zevelin）、およびカルチトリオールが挙げられる。使用することができる免疫活性化因子の非限定的な例としては、ＡＳ－１０１（Ｗｙｅｔｈ－Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、ガンマインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ－２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ－ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ、Ｌａ．のＩｍｒｅｇより）、ＳＫ＆Ｆ １０６５２８、およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられる。

【0187】

一部の例では、追加の治療剤は、ナノ粒子、例えば、少なくとも１ｎｍの直径（例えば、少なくとも１０ｎｍの直径、少なくとも３０ｎｍの直径、少なくとも１００ｎｍの直径、少なくとも２００ｎｍの直径、少なくとも３００ｎｍの直径、少なくとも５００ｎｍの直径、または少なくとも７５０ｎｍの直径、例えば、１ｎｍ～５００ｎｍ、１ｎｍ～３００ｎｍ、１ｎｍ～１００ｎｍ、１０ｎｍ～５００ｎｍ、または１０ｎｍ～３００ｎｍの直径）のものに、コンジュゲートする（またはそれと会合する）。

【0188】

１つの例では、腫瘍（例えば、転移性腫瘍）の少なくとも一部分は、開示される治療の投与（例えば、例として、１つもしくは複数の還元剤および／または１つもしくは複数の免疫活性化因子と組み合わせた、１つまたは複数の腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００分子の投与、ならびに照射）の前に、外科的に除去される（例えば、外科的切除および／もしくは低温療法による）、照射される（例えば、腫瘍を根絶もしくは縮小するのを補助する腫瘍部位への放射性材料もしくはエネルギーの投与（例えば、体外照射療法））、化学的に処置される（例えば、化学塞栓術による）、またはこれらの組合せが行われる。例えば、転移性腫瘍を有する対象は、開示される治療の投与の前に、腫瘍のすべてまたは一部が、外科的に切除されていてもよい。ある例では、１つまたは複数の化学療法剤は、例えば、１つもしくは複数の還元剤および／または１つもしくは複数の免疫活性化因子と組み合わせた、１つまたは複数の抗体－ＩＲ７００分子での処置、ならびに照射、ならびに照射の後に、投与される。別の特定の例では、対象は、転移性腫瘍を有し、放射線療法、化学塞栓療法、またはその両方が、開示される治療の投与と同時に投与される。

【0189】

一部の例では、投与される追加の治療剤は、モノクローナル抗体、例えば、３Ｆ８、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブペンテテート、アナツモマブマフェナトクス、アポリズマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、カンツズマブメルタンシン、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、ＣＣ４９、セツキシマブ、シタツズマブボガトクス、シクスツムマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、ダセツズマブ、デツモマブ、エクロメキシマブ、エクリムマブ、エドレコロマブ、エプラツズマブ、エリツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィギツムマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ギレンツキシマブ、グレンバツムマブベドチン、イブリツモマブチウキセタン、イゴボマブ、イムシロマブ、インテツムマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、ラキサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミツモマブ、モロリムマブ、ナコロマブタフェナトクス、ナプツモマブエスタフェナトクス、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オファツムマブ、オララツマブ、オポルツズマブモナトクス、オレゴボマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブペンデチド、シブロツズマブ、ソネプシズマブ、タカツズマブテトラキセタン、タプリツモマブパプトクス、テナツモマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（トレメリムマブ）、チガツズマブ、ＴＮＸ－６５０、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ベルツズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ、ザルタムマム、またはこれらの組合せである。

【0190】

例示的な還元剤
本明細書に提供される方法において使用することができる例示的な還元剤としては、酸化還元化学反応において電子を電子レシピエント（酸化剤）にわたす（または「供与する」）薬剤が挙げられる。本明細書に提供される方法において使用することができる例示的な還元剤としては、Ｌ－システイン、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム（Ｌ－ＮａＡＡ）、アスコルビン酸（例えば、Ｌ－またはＲ－アスコルビン酸）、およびグルタチオンが挙げられる。一部の例では、開示される方法において使用される還元剤は、アジ化ナトリウムではない。一部の例では、開示される方法において使用される還元剤は、Ｌ－システインではない。１つの例では、還元剤は、Ｌ－ＮａＡＡ（例えば、５～５０ｇ、ｉ．ｐ．）である。

【実施例】

【0191】

（実施例１）
材料および方法
この実施例は、実施例２における結果を得るために使用される材料および方法について説明する。

【0192】

細胞培養物
ＨＰＶ １６ Ｅ６／Ｅ７およびｈＲＡＳのＣ５７ＢＬ／６由来中咽頭上皮細胞への形質導入によって、親ｍＥＥＲＬ細胞を構築した（Hoover et al., Arch OtolaryngolHead Neck Surg 2007; 133: 495-502、Spanos et al., J Virol 2008; 82:2493-500、Williams et al., Head Neck 2009; 31:911-8）。ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲは、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｃ．Ｓｐａｎｏｓ博士から入手した（Ｓａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Okada et al., EBioMedicine 2021;67:103345）。加えて、ルシフェラーゼを安定に発現するＭＣ３８細胞（結腸がん、ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿Ｂ２８８、Ｃｌａｕｄｉａ Ｐａｌｅｎａ、ＮＣＩ、２０１５より）およびＭＯＣ２細胞（口腔がん、ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿ＺＤ３３、Ｋｅｒａｆａｓｔより）（ＭＣ３８－ｌｕｃおよびＭＯＣ２－ｌｕｃ、製造業者の推奨に従ってＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製のＲｅｄｉＦｅｃｔ Ｒｅｄ－Ｆｌｕｃレンチウイルスの安定な形質導入により生成）、ならびにＬＬ／２－ｌｕｃ細胞（ルイス肺癌、ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿Ａ４ＣＭ、Ｉｍａｎｉｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）を使用した。ＭＣ３８－ｌｕｃ、ＭＯＣ２－ｌｕｃ、およびＬＬ／２－ｌｕｃ細胞における高いルシフェラーゼ発現を、１０継代まで確認した。ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ細胞を、以前の報告（Mermod et al., Int J Cancer 2018; 142:2518-28）から修正し、１０％ ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１×ヒトケラチノサイト成長補助剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において培養した。ＭＣ３８－ｌｕｃおよびＬＬ／２－ｌｕｃ細胞を、１０％ ＦＢＳおよび１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０において培養した。ＭＯＣ２－ｌｕｃ細胞を、５％ウシ胎児血清、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、５ｎｇ／ｍＬのインスリン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）、４０ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）、および３．５ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＥＧＦ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を補充したＩＭＤＭ培地およびＨａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２培地の混合物（２：１の比、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において培養した。すべての細胞を、９５％空気および５％ ＣＯ_２の雰囲気下において３７℃で加湿インキュベーターにおいて培養し、３０継代以下で培養した。細胞系の同一性を、短いタンデムリピート（ＳＴＲ）のプロファイリングによって試験した。ＭＣ３８－ｌｕｃ、ＭＯＣ２－ｌｕｃ、およびＬＬ２－ｌｕｃについては、一致スコアは、８０％を上回り、細胞系の同一性が信頼できるものであったことを示す。ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲについては、ＳＴＲプロファイルは、いずれの公知の細胞系とも一致しなかった。マイコプラズマ試験を、ＭＣ３８－ｌｕｃ、ＭＯＣ２－ｌｕｃ、およびＬＬ２－ｌｕｃについてはＰＣＲによって、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲについてはＭｙｃｏＡｌｅｒｔ ＰＬＵＳ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔによって行い、すべての細胞系は試験で陰性であった。

【0193】

試薬
水溶性シリコンフタロシアニン誘導体であるＩＲＤｙｅ７００ＤＸ ＮＨＳエステル（ＩＲ７００）を、ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）から得た。ｈＥＧＦＲに対する完全ヒト化ＩｇＧ２ ｍＡｂであるパニツムマブを、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）から得た。抗マウス／ヒトＣＤ４４（クローンＩＭ７、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１１０６４９）、抗マウスＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４）（クローン９Ｄ９、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１０９４９６０９）を、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ（Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ）から得た。すべての他の化学物質は、試薬グレードのものであった。

【0194】

ＩＲ７００にコンジュゲートしたパニツムマブ、抗ＣＤ４４、および抗ＣＴＬＡ－４の合成
ＩＲ７００のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）とのコンジュゲーションを、以前の報告に従って行った。簡単に述べると、１ｍｇのいずれかのｍＡｂを、５倍モル過剰量のＩＲ７００ ＮＩＨエステル（ＤＭＳＯ中１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ８．５）とともに、室温で１時間インキュベートした。混合物を、ろ過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２５カラム、ＰＤ－１０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。ＡＰＣの品質を、４％～２０％の勾配のポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で評価した。非コンジュゲート抗体を、対照に使用した。８０Ｖで２．５時間の電気泳動の後に、ゲルを、７００ｎｍの蛍光チャネルを使用して、Ｐｅａｒｌ Ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で観察した。ゲルを、次いで、コロイダルブルーで染色して、コンジュゲートの分子量を、非コンジュゲート抗体のものと比較した。ＩＲ７００にコンジュゲートしたパニツムマブ、抗ＣＤ４４抗体、および抗ＣＴＬＡ４抗体は、本明細書において、それぞれ、ｐａｎ－ＩＲ７００、ＣＤ４４－ＩＲ７００、およびＣＴＬＡ４ ＩＲ７００と略す。

【0195】

動物および腫瘍モデル
すべての手順は、Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsを遵守して行い、地域のＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されていた。６～８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＩＭＳＲ＿ＪＡＸ：０００６６４））を、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。侵襲手順の間、マウスは、３％イソフルランの吸入および／または７５０ｍｇのペントバルビタールナトリウム（Ｎｅｍｂｕｔａｌ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｏｖａｔｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）の腹腔内注射により麻酔した。

【0196】

マウスの下半身を、ＮＩＲ光照射および画像分析の前に剃毛した。腫瘍を、各モデルの背側腹部の右側または両側への１×１０^６個の細胞の皮下注射によって構築した。およそ５０～１００ｍｍ^３の体積に達した腫瘍を有するマウスを、実験に使用した。マウスを、毎日モニタリングし、腫瘍体積（腫瘍体積＝長さ×幅^２×０．５）を、腫瘍体積が２，０００ｍｍ^３に達するまで１週間に２回測定し、達した時点で、マウスを、二酸化炭素ガスの吸入により安楽死させた。両側モデルの場合、マウスは、いずれかの腫瘍がその人道的エンドポイントに達したときに安楽死させた。処置後４週間またはそれよりも長い期間の腫瘍消失を、完全寛解として定義した。

【0197】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＮＩＲ－ＰＩＴ
ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ、ＭＣ３８－ｌｕｃ、およびＬＬ／２－ｌｕｃ細胞（２×１０^５個）を、１２ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートし、次いで、ｐａｎ－ＩＲ７００またはＣＤ４４－ＩＲ７００（１０μｇ／ｍＬ）を含有する培地に、３７℃で１時間曝露した。ＰＢＳで洗浄した後、フェノールレッド不含ＲＰＭＩ １６４０培地を添加した。ＮＩＲ光（６９０ｎｍ）を、がん細胞に、ＭＬ７７１０レーザーシステム（Ｍｏｄｕｌｉｇｈｔ、Ｔａｍｐｅｒｅ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて１５０ｍＷ／ｃｍ^２の出力密度で照射した。ＮＩＲ－ＰＩＴの１時間後に、細胞を、トリプシンで収集し、室温で５分間、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、１μｇ／ｍＬ）で染色し、次いで、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）を使用し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてＰＩ陽性について評価した。細胞生存率を評価するために、細胞増殖を、３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニル－２Ｈ－テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイによって評価した。上述のように、細胞をインキュベートし、処置した。ＮＩＲ－ＰＩＴの１時間後に、培地を除去し、５００μｌのＭＴＴ試薬（ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ、０．５ｍｇ／ｍｌ）を、各ウェルに添加した。１時間のインキュベーション後に、上清を除去し、５００μＬの２－プロパノールを各ウェルに添加して、結晶ホルマザンン色素を溶解した。上清を１００μＬずつ９６ウェルプレートに移した後、吸光を、マイクロプレートリーダー（ＳｙｎｅｒｇｙＴＭ Ｈ１）において５７０ｎｍで測定した。相対的定量のために、各群における吸光の値を、対照群におけるものに対して正規化した。

【0198】

ｉｎ ｖｉｖｏ ＮＩＲ－ＰＩＴ
二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴ実験のために、腫瘍保持マウスを、４つの群にランダム化し、混合型抗体／ＡＰＣの静脈内注射、続いてＮＩＲ光曝露を、次のように行った：（ｉ）混合した２５ｍｇのパニツムマブおよび２５ｍｇの抗ＣＴＬＡ４抗体（Ｉ．Ｖ．群）、（ｉｉ）混合した２５ｍｇのｐａｎ－ＩＲ７００および２５ｍｇの抗ＣＴＬＡ４抗体（パニツムマブＮＩＲ－ＰＩＴ群）、（ｉｉｉ）混合した２５ｍｇのパニツムマブおよび２５ｍｇのＣＴＬＡ４－ＩＲ７００（ＣＴＬＡ４ ＮＩＲ－ＰＩＴ群）、ならびに（ｉｖ）混合した２５ｍｇのｐａｎ－ＩＲ７００および２５ｍｇのＣＴＬＡ４－ＩＲ７００（二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群）。ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴ単剤療法の実験のために、腫瘍保持マウスを、また、以下のように３つの群にランダム化した：（ｉ）処置なし（対照群）、（ｉｉ）ＮＩＲ光曝露なしのＣＴＬＡ４－ＩＲ７００（２５ｍｇ）の静脈内投与（ＡＰＣ Ｉ．Ｖ．群）、および（ｉｉｉ）ＣＴＬＡ４－ＩＲ７００（２５ｍｇ）の静脈内投与に続いてＮＩＲ光曝露（ＮＩＲ－ＰＩＴ群）。混合型抗体／ＡＰＣを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのがん細胞の接種の６日後に注射した。投与の２４時間後に、ＮＩＲ光（６９０ｎｍ、１５０ｍＷ／ｃｍ２）を、すべての群において５０Ｊ／ｃｍ２で腫瘍に照射した。腫瘍以外のマウスの表面は、アルミニウム箔で被覆した。二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群において腫瘍を排除したマウスを、反対側の側腹部へのｈＥＧＦＲｍＥＥＲＬ（１×１０^６個）細胞の皮下注射によって再チャレンジした。両側モデルの場合には、ＮＩＲ光（６９０ｎｍ、１５０ｍＷ／ｃｍ２）を、右側の腫瘍にのみ５０Ｊ／ｃｍ^２で与え、マウスの残り（左側の腫瘍を含む）は、照射中、アルミニウム箔で被覆した。

【0199】

組織学的分析
ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ、ＭＣ３８－ｌｕｃ、およびＬＬＣ腫瘍に由来する腫瘍を採取し、ホルマリンで固定しパラフィンに包埋し、４ｍｍで切片を作製した。標準的なヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色の後に、明視野顕微鏡写真を、Ｍａｎｔｒａ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して得た。

【0200】

多重免疫組織化学検査
多重免疫組織化学検査（ＩＨＣ）を、Ｏｐａｌ ７－Ｃｏｌｏｒ ＡｕｔｏｍａｔｉｏｎＩＨＣ Ｋｉｔ（ＡＫＯＹＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＢＯＮＤ ＲＸｍ自動染色装置（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。以下の抗体を使用した：抗ＣＤ８（クローンＥＰＲ２０３０５、Ａｂｃａｍ、１：５００希釈）、抗ＣＤ４（クローンＥＰＲ１９５１４、Ａｂｃａｍ、１：１，０００希釈）、抗ＦｏｘＰ３（クローン１０５４Ｃ、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、１：１，０００希釈）、抗汎サイトケラチン（ウサギポリ、Ｂｉｏｓｓ、１：５００希釈）。染色は、製造業者が提供するＯｐａｌ ７カラープロトコールに従い、以下の修正を用いて行った：（ｉ）抗原賦活化は、ＢＯＮＤ ＥＲ２溶液（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して２０分間行い、（ｉｉ）ＩｍｍＰＲＥＳＳ ＨＲＰ抗ウサギＩｇＧ（ペルオキシダーゼ）Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、キットで提供されている抗マウス／ヒト二次抗体の代わりに使用した。染色したスライドを、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｈａｒｄｓｅｔ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で封入し、次いで、Ｍａｎｔｒａ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用してイメージングした。画像を、ｉｎＦｏｒｍソフトウェア（ＡＫＯＹＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。ＩｎＦｏｒｍソフトウェアは、以下の基準に従って組織および細胞表現型を自動で検出するように訓練されていた：それぞれ、汎サイトケラチン発現を有するエリア＝腫瘍、他のエリ＝間質、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞＝Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－＝ＣＤ４ Ｔ細胞、またはＣＤ８＋＝ＣＤ８＋ Ｔ細胞。各表現型の細胞計数をエクスポートし、メガピクセルエリア当たりの計数として示した。３つの腫瘍試料を、各群について試験した。５つの写真を、各標本について取得し、細胞計数および組織エリアを、５つすべての写真について組み合わせた。

【0201】

フローサイトメトリー分析
ＣＴＬＡ４の発現を評価するために、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍保持マウスを、構築された腫瘍の体積がおよそ１５０ｍｍ^３に達したときに安楽死させた。ＮＩＲ－ＰＩＴ後のＣＴＬＡ４を発現する細胞の消失を確認するために、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍保持マウスの腫瘍または脾臓を、ＮＩＲ光曝露の３時間後に採取した。腫瘍流入領域リンパ節および脾臓もまた、全身効果について評価するために分析した。領域リンパ節における免疫反応を評価するために、同側鼠径リンパ節を、ＮＩＲ－ＰＩＴの２日後に採取した。腫瘍試料に由来する単一細胞懸濁液を、以下のプロトコールを使用して調製した。腫瘍全体を、コラゲナーゼＩＶ型（１ｍｇ／ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＤＮａｓｅ Ｉ（２０ｍｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、ハサミで優しく切断し、３ｍＬのシリンジのプランジャーの背面で潰した。組織を、７０μｍの細胞ストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）に通した。脾細胞もまた、全身効果を決定するために分析した。合計３．０×１０^６個の細胞を染色し、５．０×１０^５個の細胞のデータを、各腫瘍について収集した。細胞を、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ［抗ＣＤ３ｅ（１４５－２Ｃ１１、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿３１２６６０）、抗ＣＤ８α（５３－６．７、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２８８８８８３）、抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿３１２７９１）、抗ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿３１４１７３）、抗ＣＤ２５（ＰＣ６１．５、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿３１２８４７）、抗Ｆ４／８０（ＢＭ８、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿８９３４８１）、抗ＣＤ４５（３０－Ｆ１１、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２５６３５９８）、および抗ＩＡ／Ｉ－Ｅ（Ｍ５／１１４．１５．２、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿３１３３２８）］、またはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ［抗ＣＤ４（ＲＭ４－５、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４６４９０２）、抗ＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１２１０７９５）、および抗ＮＫ１．１（１３６、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２５３４４３１）］のいずれかから得た抗体で染色した。生細胞を死細胞と区別するために、細胞はまた、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でも染色した。ＣＴＬＡ４発現を評価するために、抗ＣＴＬＡ４（９Ｄ９）またはアイソタイプ対照［マウスＩｇＧ２ｂ（ＭＰＣ－１１、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１１０７７９１）、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ］を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７ ＮＨＳエステル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とコンジュゲートした。コンジュゲーションは、ＩＲ７００コンジュゲーションと同じ方法で行った。ＦｏｘＰ３の染色のために、細胞を、固定し、ＦｏｘＰ３ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で透過処理し、続いて、抗ＦｏｘＰ３（ＦＪＫ－１６ｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともにインキュベートした。細胞の蛍光を、次いで、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒまたはＦＡＣＳＬｙｒｉｃ、ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿０００４０１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ、ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００８５２０）で分析した。死細胞を、ＦＳＣ、ＳＳＣ、およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎでの染色に基づいて、分析から除去した。Ｔｒｅｇ集団を、ＣＤ３ρ Ｔ細胞間でのＣＤ４ρＦｏｘＰ３ρ Ｔ細胞のゲーティングによって定義した。

【0202】

統計学的分析
定量的データを、平均±ＳＥＭとして表した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験については、一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いて、テューキーの検定を使用した。ｉｎ ｖｉｖｏ実験については、二方向ＡＮＯＶＡに続いて、テューキーの検定を、多重比較（３つを上回る群）に使用した。生存の累積確率を、カプラン－マイヤーの生存曲線分析によって分析し、結果を、ログランク検定で比較した。統計学的分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）で行った。０．０５未満のＰ値を、統計学的に有意とみなした。

【0203】

（実施例２）
がん細胞標的化およびＣＴＬＡ４標的化を同時に組み合わせたＮＩＲ－ＰＩＴは、同系マウスモデルにおいて相乗的処置効果をもたらす
この実施例は、腫瘍標的化ＮＩＲ－ＰＩＴ（例えば、腫瘍特異的抗体－ＩＲ７００コンジュゲート、例えば、抗ＥＧＦＲ－ＩＲ７００コンジュゲートを使用）と組み合わせた、ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴを使用したＴｒｅｇ細胞殺滅による、Ｔｒｅｇに媒介される免疫抑制を低減させる方法を使用した結果について説明する。細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）を発現する細胞およびがん細胞を標的とする組合せＮＩＲ－ＰＩＴを、新しく構築したｈＥＧＦＲを発現するマウス中咽頭がん細胞（ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ）を含む４つの腫瘍モデルにおいて調査した。単一分子標的化療法（ｈＥＧＦＲまたはＣＴＬＡ４を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴ）は、免疫原性の乏しいｍＥＥＲＬｈＥＧＦＲ腫瘍において、腫瘍進行を阻害しなかったが、二重（ＣＴＬＡ４／ｈＥＧＦＲ）標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、腫瘍成長を有意に抑制し、生存を延長させ、３８％の完全奏功率をもたらした。二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの後に、主として調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であるＣＴＬＡ４を発現する細胞の枯渇、および腫瘍床におけるＣＤ８ρ／Ｔｒｅｇ比の増加が観察され、宿主抗腫瘍免疫の増強が示された。さらに、二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、同じタイプの遠位未処置腫瘍において、抗腫瘍免疫を示した。したがって、同時のがん細胞標的化ＮＩＲ－ＰＩＴおよびＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、特に、ＮＩＲ－ＰＩＴ単剤療法が最適とは言えない免疫原性の乏しい腫瘍において、新しいがん治療戦略である。

【0204】

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ細胞に対するパニツムマブおよびＣＴＬＡ－４ ＮＩＲ－ＰＩＴの有効性
ＩＲ７００色素およびパニツムマブまたは抗ＣＴＬＡ４抗体のコンジュゲートを確認するために、ＳＤＳ－ｐａｇｅゲル電気泳動を使用した。ｐａｎ－ＩＲ－７００および非コンジュゲート対照パニツムマブは、ほぼ同一の分子量を示した（図１Ａ）。コンジュゲートは、強い蛍光強度を示したが、認識できる凝集は検出されなかった。抗ＣＴＬＡ４ ＩＲ－７００において、ほぼ同一の結果が示された。

【0205】

ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の組込みおよびＭＴＴアッセイに基づいて、がん細胞死が、ｐａｎ－ＩＲ７００に曝露したｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲマウスにおいて、ＮＩＲ光の線量依存性の様式で、ＮＩＲ－ＰＩＴによって誘導された（図１Ｂ、１Ｃ）。ＮＩＲ光単独でも、パニツムマブＩＲ７００単独でも、細胞生存率に有意な変化は誘導されなかった。また、ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴを行った場合に、ｈＥＧＦＲｍＥＥＲＬ細胞において、有意な細胞損傷は検出されなかった。これらのデータにより、ｈＥＧＦＲ標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ細胞において標的細胞特異的細胞死を誘導したが、一方でＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで影響を及ぼさなかったことが検証された。

【0206】

パニツムマブＩＲ７００ ＮＩＲ－ＰＩＴは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて腫瘍細胞を即座に破壊する
各ＮＩＲ－ＰＩＴ処置後のｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍における細胞損傷を、組織学的分析によって評価した。腫瘍を、光曝露の１時間後に採取した。Ｈ－Ｅ染色は、パニツムマブＮＩＲ－ＰＩＴで処置した腫瘍において、腫瘍細胞の膨潤および空胞化を示したが、ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴで処置した腫瘍において、明らかな変化は見出されなかった（図１Ｄ）。したがって、病理学的データにより、パニツムマブＮＩＲ－ＰＩＴが、腫瘍細胞の即座の死を引き起こしたが、ＣＴＬＡ４ ＮＩＲ－ＰＩＴは引き起こさなかったことが示された。

【0207】

ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍におけるより少ない腫瘍浸潤Ｔ細胞
様々な腫瘍モデルの免疫原性を比較するために、３つのマウス同系腫瘍モデルＬＬ／２－ｌｕｃ、ＭＣ３８－ｌｕｃ、およびｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍におけるＣＤ８^＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、ＩＨＣによって検査した。ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍におけるＣＤ８^＋ ＴＩＬの数は、他の２つの腫瘍モデルのものよりも低かった（図１Ｅ）。ＴＩＬのＣＤ８^＋／ＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３^＋ρ（Ｔｒｅｇ）比を決定したが、それは、この比が、強力な抗腫瘍免疫応答の指標であるためである。腫瘍内ＣＤ８^＋／Ｔｒｅｇ比もまた、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍において、他の２つの腫瘍におけるものよりも有意に低かった。これらの結果により、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍が、他の同系腫瘍モデルと比較して、免疫原性が乏しかったことが示された。

【0208】

Ｔｒｅｇは、腫瘍床内でＣＴＬＡ４を発現する
ＣＴＬＡ４発現細胞をｉｎ ｖｉｖｏで検証するために、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍に由来する様々な細胞型のＣＴＬＡ４発現を、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＴＬＡ４発現は、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ細胞（ｈＥＧＦＲ^＋ＣＤ４５－）、骨髄系細胞（ＣＤ３－ＣＤ１１ｂ^＋）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋）、およびヘルパーＴ細胞（ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３－、図２Ａ）では、無視できる程度かまたは最小限であった。Ｔｒｅｇ（ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３^＋）では、ＣＴＬＡ４は、高度に発現され、Ｔｒｅｇの相対蛍光強度（ＲＦＩ）は、他の細胞型のものよりも有意に高かった。

【0209】

ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴ後の腫瘍内のＴｒｅｇの枯渇
次に、ＣＴＬＡ４を発現する細胞の選択的枯渇を、各ＮＩＲ－ＰＩＴの後に、フローサイトメトリーによって、腫瘍、腫瘍流入領域リンパ節、および脾臓において評価した（図２Ｂ）。処置有効性を、４つの群間で比較した；パニツムマブおよび抗ＣＴＬＡ４抗体注射（Ｉ．Ｖ．群）、ｐａｎ－ＩＲ７００および抗ＣＴＬＡ４抗体注射（ｐａｎ ＮＩＲＰＩＴ群）、パニツムマブおよびＣＴＬＡ４－ＩＲ７００注射（ＣＴＬＡ４ ＮＩＲＰＩＴ群）、ならびにｐａｎ－ＩＲ７００およびＣＴＬＡ４－ＩＲ７００の組合せ注射（二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群）。ＮＩＲ光を、注射の１日後にすべての群に適用した。腫瘍内のＣＴＬＡ４を発現する細胞は、ＣＴＬＡ４ ＮＩＲ－ＰＩＴおよび二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群では、Ｉ．Ｖ．群と比較して減少したが、領域リンパ節においても脾臓においても有意な変化は検出されなかった（図２Ｃ）。次に、ＮＩＲ－ＰＩＴによって選択的に枯渇されたＴ細胞のタイプを決定した。Ｔｒｅｇは、ＣＴＬＡ４ ＮＩＲ－ＰＩＴおよび二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群において有意に低減された（図２Ｄおよび２Ｅ）。ＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３－およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞の集団は、インタクトなままであった。この結果に関して、ＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３－／ＴｒｅｇおよびＣＤ８^＋／Ｔｒｅｇの比は、増加した（図２Ｅ）。リンパ節および脾臓において、４つの群間で有意な変化は観察されなかった。これらの結果により、ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴが、単剤療法およびパニツムマブＮＩＲ－ＰＩＴとの組合せの両方で、主としてＴｒｅｇを枯渇させ、この効果が処置部位に限定されていたことが示された。

【0210】

ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ ７００ｎｍ蛍光イメージング
各ＡＰＣの腫瘍への蓄積を評価するために、７００ｎｍの連続蛍光画像を得た。ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍におけるｐａｎ－ＩＲ７００および抗ＣＴＬＡ４－ＩＲ７００の両方の蛍光強度は、ＡＰＣ注射後１日以内にピーク強度を示し、これは、その後数日間にわたって徐々に減少した（図３Ａ～３Ｂ）。標的対バックグラウンド比は、同様の傾向を示した（図３Ｃ）。したがって、ＡＰＣとの１日間のインキュベーションを使用して、腫瘍とバックグラウンドの正常組織との間の最大の差を得た。

【0211】

ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍におけるＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの単剤療法の効果
ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍に対するＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの単剤療法の抗腫瘍効果を、図４Ａに示されるように評価した。ＥＥＲＬ腫瘍は、高度に免疫原性ではない。処置有効性を、３つの群間で比較した；非処置群（対照群）、ＮＩＲ光照射なしのＡＰＣ注射（ＡＰＣ Ｉ．Ｖ．群）、およびＡＰＣ注射に続いてＮＩＲ光照射（ＮＩＲ－ＰＩＴ群）。ＣＴＬＡ４ ＩＲ７００のｉｖ注射の１日後に、腫瘍は、ＣＴＬＡ４－ＩＲ７００なしの腫瘍よりも高い７００ｎｍ蛍光強度を示した（図４Ｂ）。５０Ｊ／ｃｍ^２のＮＩＲ光への曝露後に、腫瘍のＩＲ７００蛍光シグナルは、即座に減少したが、ＡＰＣ Ｉ．Ｖ．またはＮＩＲ－ＰＩＴ群では、対照群と比較して変化はなく、有意差は検出されなかった（図４Ｃ）。生存曲線において、ＮＩＲ－ＰＩＴ群は、他の群と比較して改善された生存を示さなかった（図４Ｄ）。これらの結果により、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ同種移植モデルにおいて、ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＴ－ＰＩＴ単独では、有意な治療効果は存在しなかったことが示された。

【0212】

ｈＥＧＦＲおよびＣＴＬＡ４を標的とする同時の二重ＮＩＲ－ＰＩＴは、いずれかの単一分子標的化療法単独よりも良好に、腫瘍成長を阻害する
ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍に対する同時の二重ＮＩＲ－ＰＩＴの有効性を評価するために、ｐａｎ－ＩＲ７００および抗ＣＴＬＡ４ ＩＲ－７００を使用したｉｎ ｖｉｖｏ実験を行った。４つの腫瘍群を比較した；パニツムマブおよびＣＴＬＡ４抗体（ＩＶのみ）、ｐａｎ－ＩＲ７００およびＣＴＬＡ４抗体（パニツムマブＮＩＲ－ＰＩＴ）、パニツムマブおよびＣＴＬＡ４ ＩＲ７００（ＣＴＬＡ４ ＮＩＲ－ＰＩＴ）、ならびにｐａｎ－ＩＲ７００およびＣＴＬＡ４ ＩＲ７００（二重ＮＩＲ－ＰＩＴ）（図５Ａ）。すべての群を、薬物投与の１日後に、１回だけ、ＮＩＲ光曝露に曝露させた（５０Ｊ／ｃｍ^２）。腫瘍における７００ｎｍの蛍光が、ＡＰＣを注射した群（パニツムマブＮＩＲ－ＰＩＴ、ＣＴＬＡ４ ＮＩＲ－ＰＩＴ、および二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群）において検出され、このシグナルは、ＮＩＲ光曝露後即座に減少した（図５Ｂ）。二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群における腫瘍体積は、任意の他の群と比較して、有意に減少した（ｐ＜０．００１、各群対二重ＰＩＴ群）（図５Ｃ）。パニツムマブおよびＣＴＬＡ４ ＮＩＲ－ＰＩＴの両方の群における腫瘍進行は、Ｉ．Ｖ．群と比較して有意に減少しなかった。さらに、二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群は、ＩＶのみの群（ｐ＜０．０１）およびパニツムマブＮＩＲ－ＰＩＴ群（Ｐ＜０．０５）と比較して有意な生存の延長を達成した（図５Ｄ）。二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群の生存は、ＣＴＬＡ４ ＮＩＲ－ＰＩＴ群と比較して有意に延長されなかったが、より多数の腫瘍が、二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群において、ＣＴＬＡ４－ＮＩＲ－ＰＩＴ単剤療法におけるものよりも排除された（３８％対２５％）。

【0213】

ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴおよび他のがん細胞標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの組合せ効果を評価するために、二重ＮＩＲ－ＰＩＴの有効性を、ＬＬ／２－ｌｕｃ、ＭＣ３８－ｌｕｃ、およびＭＯＣ２－ｌｕｃ腫瘍において、ＣＤ４４およびＣＴＬＡ４抗体を利用して調査した（図６Ａ～６Ｆ）。ＣＴＬＡ４／ＣＤ４４二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴ実験のために、腫瘍保持マウスを、４つの群にランダム化し、混合型抗体／ＡＰＣの静脈内注射、続いてＮＩＲ光曝露を、次のように行った：ｉ）混合型２５μｇの抗ＣＤ４４抗体および２５μｇの抗ＣＴＬＡ４抗体（Ｉ．Ｖ．群）、ｉｉ）混合型２５μｇのＣＤ４４－ＩＲ７００および２５μｇの抗ＣＴＬＡ４抗体（ＣＤ４４ ＮＩＲ－ＰＩＴ群）、ｉｉｉ）混合型２５μｇの抗ＣＤ４４抗体および２５μｇのＣＴＬＡ４－ＩＲ７００（ＣＴＬＡ４ ＮＩＲ－ＰＩＴ群）、ならびにｉｖ）混合型２５μｇのＣＤ４４－ＩＲ７００および２５μｇのＣＴＬＡ４－ＩＲ７００（二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群）。混合型抗体／ＡＰＣを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのがん細胞の接種の６日後に注射した。投与の２４時間後に、ＮＩＲ光（６９０ｎｍ、１５０ｍＷ／ｃｍ^２）を、すべての群において５０Ｊ／ｃｍ^２で腫瘍に適用した。腫瘍外のすべてのエリアを、アルミニウム箔で被覆した。ＭＣ３８－ｌｕｃ、ＭＯＣ２－ｌｕｃ、およびＬＬ／２－ｌｕｃ腫瘍保持マウスにおいて生物発光画像を得るために、Ｄ－ルシフェリン（ＭＣ３８－ｌｕｃおよびＭＯＣ２－ｌｕｃについては１５ｍｇ／ｍＬで２００ｍＬ、ＬＬ／２－ｌｕｃについては３ｍｇ／ｍＬで２００ｍＬ、Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を、マウスに腹腔内注射した。ルシフェラーゼ活性を、相対光単位を使用してＢＬＩシステム（Ｐｈｏｔｏｎ Ｉｍａｇｅｒ、Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ、Ｎｅｓｌｅｓ ｌａ Ｖａｌｌｅｅ、Ｆｒａｎｃｅ）で分析した。ＲＯＩを、腫瘍全体にわたって配置した。相対光単位の１分当たりの計数を、Ｍ３ Ｖｉｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ）を使用して計算し、以下の式を使用してＮＩＲ－ＰＩＴ前のものに基づくパーセンテージに変換した：［（処置後の相対光単位）／（処置前の相対光単位）×１００（％）］。ＣＴＬＡ４／ＣＤ４４二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群は、すべての腫瘍モデルにおいて、Ｉ．Ｖ．群と比較して腫瘍進行を有意に阻害し、ＬＬ／２－ｌｕｃおよびＭＣ３８－ｌｕｃ腫瘍において生存を延長した。ＣＴＬＡ４／ＣＤ４４二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、それぞれ、構築されたＬＬ／２－ｌｕｃおよびＭＣ３８－ｌｕｃ腫瘍の４４％および４０％を根絶させたが、試験した腫瘍モデルにおいて、ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴ単剤療法とＣＴＬＡ４／ＣＤ４４二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴとの間でさらなる効果は観察されなかった。

【0214】

二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、抗腫瘍宿主免疫を活性化する
各ＮＩＲ－ＰＩＴ後の樹状細胞（ＤＣ）およびＣＤ８ρ Ｔ細胞の活性化を評価するために、同側鼠径リンパ節を、ＮＩＲ－ＰＩＴの２日後に採取し、フローサイトメトリーによって分析した。ＤＣにおけるＣＤ４０およびＣＤ８０の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群において、非処置群（対照群、図７Ａおよび７Ｂ）と比較して有意に高かった。ＣＤ８６において、二重群におけるＭＦＩは、任意の他の群のものよりも高かった（図７Ｃ）。さらに、リンパ節内のＣＤ８^＋ Ｔ細胞中のＣＤ２５^＋細胞のパーセンテージは、ＮＩＲ－ＰＩＴによって処置したすべての群において、Ｉ．Ｖ．群と比較して、有意に高かった（図７Ｈ）。これらの結果は、ＤＣ成熟およびがん細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答の活性化が、二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴ後に活性化ＤＣによって増強されたことを示す。

【0215】

二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、腫瘍組織におけるＣＤ８^＋ Ｔ細胞の蓄積をもたらす
各治療法後のＴＭＥにおけるリンパ球の蓄積を評価するために、ＴＩＬを、多重ＩＨＣによって分析した（図７Ｄおよび７Ｅ）。ＣＤ８^＋、ＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３^－、およびＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３^＋ Ｔ細胞を、各標本について計数した。ＣＤ８^＋ Ｔ細胞は、二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群において、対照群と比較して有意に高い密度を有し（図７Ｆ）、一方で、二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群におけるＣＤ８^＋／Ｔｒｅｇ比は、すべての他の群よりも有意に高かった（図７Ｇ）。これらの結果は、二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴが、免疫抑制性ＴＭＥを逆転させ、Ｔ細胞活性化をもたらし、これが、いずれかの単一の分子を標的とする治療法と比較して、腫瘍進行を強力に抑制したことを示した。

【0216】

二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、免疫記憶をもたらす
免疫学的記憶を検査するために、処置したｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍が、二重ＮＩＲ－ＰＩＴ後に消滅したマウスに、反対側の背側への初回ＮＩＲ ＰＩＴのおよそ１５週間後に、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ細胞を再接種した（図８Ａ）。二重ＮＩＲ－ＰＩＴによって以前に接種した腫瘍が排除されたすべてのマウスが、新しく埋め込んだｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ細胞を完全に拒絶したが、対照マウスにおいて、拒絶は観察されなかった（図８Ｂ）。加えて、二重ＮＩＲ－ＰＩＴによって以前の接種腫瘍が排除されたすべてのマウスは生存したが、すべての対照マウスは約５０日以内に死亡した（図８Ｃ）。これは、二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴ後の免疫記憶の発生を示す。

【0217】

二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、両側腫瘍モデルにおいて、アブスコパル効果を示す
全身抗腫瘍免疫の発生を評価するために、両側ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍モデルを構築し、処置有効性を、Ｉ．Ｖ．群と二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群との間で比較した。処置およびイメージングレジメンを、図９Ａに示す。反対側の腫瘍は、ＮＩＲ光曝露から遮蔽した（図９Ｂ）。同側腫瘍の５０Ｊ／ｃｍ２のＮＩＲ光への曝露後、二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群において、ＮＩＲ光を照射した［ＮＩＲ光（＋）］腫瘍の７００ｎｍ蛍光シグナルは、減少したが、反対側の腫瘍［ＮＩＲ光（－）］の７００ｎｍ蛍光は、変化しなかった（図９Ｃ）。腫瘍成長は、二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群では、ＮＩＲ光＋）腫瘍だけでなく、ＮＩＲ光（－）腫瘍についても、Ｉ．Ｖ．群と比較して有意に抑制された［Ｐ＜０．０００１（両側）対Ｉ．Ｖ．群、図９Ｄ］。各群で、ＮＩＲ光（＋）およびＮＩＲ光（－）の腫瘍間で、有意差は観察されなかった。また、二重ＮＩＲ－ＰＩＴ群の生存は、Ｉ．Ｖ．群と比較して、有意に延長された（図９Ｅ）。さらに、片側二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴを使用した両側腫瘍の完全寛解が、１０匹中１匹のマウスにおいて達成された。

【0218】

考察
同時ＣＴＬＡ４／ｈＥＧＦＲ二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、同じ抗体用量であっても、いずれかの処置単独よりも強力な腫瘍応答を示した。二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの３時間後および７日後におけるＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比は、他の治療法と比較して、有意に増加した。さらに、アブスコパル効果が、二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴ後に両側腫瘍のモデルにおいて観察された。これらの結果は、二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴが、免疫抑制性ＴＭＥを変更し得、腫瘍成長抑制に対する強力な相乗効果をもたらしたことを示す。

【0219】

非コンジュゲートＣＴＬＡ４およびｈＥＧＦＲ抗体単剤療法の投与は、いずれの治療効果も示さなかった（図４～６）。実際に、脾臓におけるＴｒｅｇ数に変化はなかったため（図２ＣおよびＤ）、治療用抗体用量の半分未満を使用したので、抗ＣＴＬＡ４抗体がＴｒｅｇ数を低減させた可能性は低い（Nagaya et al., Cancer Immunol Res 2019;7:401-13、Maruoka et al., Cancer Immunol Res 2020;8:345-55、Okada et al., Bioconjug Chem 2019;30:2624-33）。しかしながら、かなりの治療効果が、より低い用量の抗ＣＴＬＡ４抗体を使用した二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴで観察された。ＩＣＩを含むがん免疫療法と関連する重篤な自己免疫有害効果が、ヒトにおいて、抗ＣＴＬＡ４抗体（イピリムマブ）で頻繁に報告されていた（Hodi et al., N Engl J Med 2010;363:711-23、Weber et al., Lancet Oncol 2015;16:375-84、Weber et al., N Engl J Med 2017;377:1824-35、Robert et al., N Engl J Med 2011;364:2517-26、Quirk et al., Transl Res 2015;166:412-24）。イピリムマブは、他のＩＣＩよりも高頻度で免疫関連の有害効果（ｉｒＡＥ）を誘導し、特に、黒色腫療法のために３ｍｇ／ｋｇの用量を受けた患者の約４０％において消化管症状を引き起こす（Dougan et al., Support Care Cancer 2020;28: 6129-43、Dougan M. Front Immunol 2017;8:1547、Eggermont et al., N Engl J Med 2016;375:1845-55、Puzanov et al., J Immunother Cancer 2017;5:95.）。ＰＤ－Ｌ１を遮断するイピリムマブまたはペンブロリズマブのｉｒＡＥは、報告によると用量依存性である（Dougan et al., Support Care Cancer 2020;28: 6129-43、Puzanov et al., J Immunother Cancer 2017;5:95、Maughan et al., Front Oncol 2017;7:56）。したがって、低用量のＩＣＩの投与により、ｉｒＡＥを最小限に抑えられる可能性がある。したがって、二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、ＩＣＩと比較したその優れた治療効果のためだけでなく、抗体用量により有害効果を低減することができるため、高い有益性を有する。

【0220】

ＣＴＬＡ４は、ＦｏｘＰ３ρ Ｔｒｅｇおよび様々な他の細胞において発現される。ＣＴＬＡ４のエンドサイトーシスは、極めて急速であるため、細胞表面上のＣＴＬＡ４の発現を捕捉することは困難である。いずれにせよ、ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、腫瘍内のＴｒｅｇを依然として枯渇させることができた。さらに、骨髄由来サプレッサー細胞および数種類のがん細胞もまた、細胞膜にＣＴＬＡ４を発現していた（Yu et al., Oncoimmunology 2016;5:e1151594、Pico de Coana et al., Cancer Immunol Immunother 2014;63:977-83、Chaudhary et al., Vaccines 2016;4:28）。これらの細胞もまた、抗腫瘍宿主免疫をさらに増強させることができるＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴによって、枯渇させることができた。加えて、ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、腫瘍内血液灌流を抑制することが報告されている（Okada et al., Adv Ther 2021;n/a:2000269、Kurebayashi et al., Cancer Res 2021;81:3092-104）。腫瘍内血流の低減が、ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの単剤療法と同様に、二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴ後に観察された（図１０Ａ、１０Ｂ）。この早期血管効果はまた、全体的な治療効果にも寄与し得る。

【0221】

ＣＤ２５標的化ＮＩＲ－ＰＩＴはまた、選択的Ｔｒｅｇ枯渇も誘導したが、ＣＤ２５は、ＩＬ２受容体であるため、光曝露後の残存ＡＰＣの存在は、活性化エフェクター細胞におけるＩＬ２／ＩＬ２Ｒ結合を遮断し、それらの阻害をもたらし得る。ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、ＣＴＬＡ４抗体が、ＩＬ２結合を遮断せず、ＣＴＬＡ４－ＩＲ７００は、ＣＴＬＡ４免疫チェックポイント経路を遮断し、宿主抗腫瘍免疫の増強をもたらし得るため、ＣＤ２５標的化ＮＩＲ－ＰＩＴよりも良好であり得る（Okada et al., Adv Ther 2021;n/a:2000269）。

【0222】

がん標的化剤としてＣＤ４４と組み合わせたＣＴＬＡ４を利用した二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴもまた、評価したが、ＣＤ４４を発現するＬＬ／２－ｌｕｃ、ＭＣ３８－ｌｕｃおよびＭＯＣ２－ ｌｕｃ腫瘍モデルにおいて、相乗効果は観察されなかった（図６Ａ～６Ｆ）。これらのモデルにおけるＣＴＬＡ４／ＣＤ４４の組合せが、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲモデルにおけるＣＴＬＡ４／ｈＥＧＦＲよりも有効性が低かった理由については、いくつかあり得る。第１に、ＭＣ３８－ｌｕｃおよびＬＬ／２－ｌｕｃ腫瘍は、高度に免疫原性の腫瘍である。宿主腫瘍免疫は、可能性としては、腫瘍がいずれの処置の前にすでにリンパ球が高度に浸潤していたため、ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴ単独によって増強された（図１Ｅ）。対照的に、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍は、Ｔ細胞の低い浸潤（図１Ｅ）およびＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴのそれ自体による治療効果の欠如によって示されるように、免疫原性の乏しい腫瘍であると考えられた。ＣＴＬＡ４／ｈＥＧＦＲ二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ同種移植モデルにおいて、腫瘍進行を阻害し、ＤＣ成熟およびＴ細胞応答の活性化を増強した（図５および７）。別の理由としては、標的外細胞殺滅があるであろう。ＭＯＣ２－ｌｕｃ腫瘍もまた、免疫原性の乏しい腫瘍であったが、ＣＴＬＡ４／ＣＤ４４二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの相乗効果は、このモデルにおいては見られなかった。ＣＤ４４は、がん細胞上だけでなく、一部の免疫細胞、例えば、エフェクターＴ細胞およびメモリーＴ細胞上にも発現される（Govindaraju et al., Matrix Biol 2019;75-76:314-30）。ＣＤ８＋ Ｔ細胞のＣＤ４４陽性サブセットは、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴによって枯渇された（Maruoka et al. Vaccines 2020;8:528）。したがって、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴはまた、エフェクターＴ細胞を損傷し、抗腫瘍効果の減弱化をもたらし得る。一方で、ｈＥＧＦＲを標的とするＮＩＲ－ＰＩＴは、ｈＥＧＦＲを発現しない宿主免疫細胞を損傷することなく、ｈＥＧＦＲを発現するがん細胞のみを殺滅する。したがって、ｍＥＥＲＬ－ｈＥＧＦＲ腫瘍モデルにおけるＣＴＬＡ４／ｈＥＧＦＲ二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、がん細胞のみを標的化することによって抗腫瘍免疫活性化を誘導し、一般に免疫抑制性であるＣＴＬＡ４を発現する細胞を排除することによって効果を増幅させることに成功した。

【0223】

結論として、データは、ＣＴＬＡ４／ｈＥＧＦＲ二重標的化ＮＩＲ－ＰＩＴが、がん細胞および腫瘍内組織におけるＣＴＬＡ４を発現する細胞を枯渇させることに成功し、いずれかの薬剤単独を上回って、細胞成長に対して有意な影響を有したことを示す。この組合せのＮＩＲ－ＰＩＴアプローチは、特に、ＮＩＲ－ＰＩＴ単剤療法の有効性が不十分である場合に、治療効果を増強させることができる。

【0224】

（実施例３）
ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００＋ＩＬ－１５プレコンディショニングは、マウスにおいて相乗的抗腫瘍効果を提供する
実施例１に記載される材料および方法を、ＰＤ－Ｌ１標的化ＮＩＲ－ＰＩＴにおけるＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００コンジュゲートの効果を示すために使用したが、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ（Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ、ＵＳＡ）から得た抗マウスＣＤ２７４抗体（１０Ｆ．９Ｇ２モノクローナル抗体）を、抗マウスＣＴＬＡ４抗体（９Ｄ９）の代わりに使用したことを除く。方法は、ＰＤ－Ｌ１抗体－ＩＲ７００コンジュゲートの投与の前にＩＬ１５でのプレコンディショニングをさらに含んだ。

【0225】

抗ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）とコンジュゲートしたＩＲ７００
ＡＰＣを合成するために、ＩＲ７００を、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（クローン１０Ｆ．９Ｇ２）にコンジュゲートし、コンジュゲート（抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００またはＣＤ２７４Ａｂ－ＩＲ７００）を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。抗ＰＤ－Ｌ１および抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００は、およそ同じ分子量を有したが、抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００のみが、７００ｎｍの蛍光を有した（図１１Ａ）。ＡＰＣを、ＳＥＣでも評価した。メインピークとして２８０ｎｍの吸収で検出されたタンパク質の大部分（１１．５分で溶出）は、６８９ｎｍの吸光および蛍光（励起６８９ｎｍ、放出７００ｎｍ）を有した（図１１Ｂ）。これらの結果により、ＡＰＣのコンジュゲーションの成功が検証された。

【0226】

がん細胞および免疫細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現
がん細胞系におけるＰＤ－Ｌ１発現のフローサイトメトリー分析を行った。ＭＣ３８－ｌｕｃ（上部）およびＬＬ２－ｌｕｃ（底部）の代表的なヒストグラムを、図１１Ｃに示す。がん細胞系ＭＣ３８－ｌｕｃおよびＬＬ２－ｌｕｃにおけるＰＤ－Ｌ１発現のフローサイトメトリー分析を、インターフェロンガンマありまたはなしの細胞培養物およびｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍から得た。図１１Ａに示されるように、インターフェロンガンマは、ＰＤ－Ｌ１の発現を条件的に増強させた。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したがん細胞に対するＰＤ－Ｌ１を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴの前および後の顕微鏡画像は、細胞が、形状が変化し、粉砕されていることを示した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＤ－Ｌ１標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、インターフェロンガンマで処置したＭＣ３８－ｌｕｃ細胞に対してより良好な細胞殺滅を示した（図１１Ｅ）。

【0227】

図１２に示されるように、ＰＤ－Ｌ１発現は、ＩＦＮ－ガンマへの曝露後に、がん細胞において増加する。図１３に示されるように、ＰＤ－Ｌ１は、腫瘍浸潤免疫細胞において発現される。

【0228】

抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００およびＩＬ－１５でのがんの処置
抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００を、ＭＣ３８－ｌｕｃ腫瘍を保持するマウスに投与した。腫瘍を、５×１０^５個のＭＣ３８細胞のｓ．ｃ．投与によって構築した。８日後に、抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００（または対照ＩｇＧ－ＩＲ７００）を、ｉ．ｖ．投与し、腫瘍を、ＮＩＲ光（５０Ｊ／ｃｍ２）に供したか（ＰＩＴ）、またはしなかった。図１４Ａ（左パネル）に示されるように、ＮＩＲ光ありの抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００は、ＮＩＲ光ありの抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００単独よりも高い程度で、腫瘍体積を有意に低減させ、生存を増加させた。マウスに、続いて、追加用量のＭＣ３８細胞を投与し、腫瘍体積および生存に対する効果を測定した。図１４Ｂ（右パネル）に示されるように、抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００で以前に処置したマウスは、ナイーブマウスとは対照的に、腫瘍の再発を有さず、生存した。

【0229】

抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００ ＰＩＴと組み合わせたＩＬ１５プレコンディショニングの効果を、図１５に示す。腫瘍を、マウスに５×１０^５個のＬＬ２細胞のｓ．ｃ．投与によって構築した。４日後に、ＩＬ１５（１ｕｇ ｉ．ｐ．）を投与し、続いて、１日後に、抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００（またはビヒクル対照）を投与し、続いて、さらに１日後に、ＮＩＲ光（５０Ｊ／ｃｍ２）を行ったかまたは行わなかった。図１５（左パネル）に示されるように、ＮＩＲ光と組み合わせた抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００は、ＮＩＲ光なしの抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００よりも高い程度で、腫瘍体積を有意に低減させ、生存を増加させた。図１５（右パネル）に示されるように、ＩＬ－１５プレコンディショニングの追加は、ＮＩＲを用いた抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＲ７００よりも高い程度に、腫瘍体積を実質的に低減させ、生存を増加させた。

【0230】

（実施例４）
材料および方法
この実施例は、実施例５～１１における結果を得るために使用される材料および方法について説明する。

【0231】

試薬
水溶性シリカ－フタロシアニン誘導体であるＩＲＤｙｅ７００ＤＸ ＮＨＳエステルを、ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）から得た。ＥＧＦＲに対する完全ヒト化ＩｇＧ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるパニツムマブを、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）から得た。抗マウスＣＴＬＡ４抗体（クローン；９Ｄ９）を、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ（Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ）から得た。Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム（Ｌ－ＮａＡＡ）およびＬ－システインを、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から得た。アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）を、ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＬＬＣ（Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）から得た。

【0232】

合成
化合物を、以前に報告されている方法（図１６）のわずかな修正によって調製した（Sato et al., ACS central science 2018, 4:1559-1569）。全般的な化学物質は、入手可能な最良グレードのものであり、ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｃｏ， Ｌｔｄ．、ＫＡＮＴＯ ＣＨＥＭＩＣＡＬ Ｃｏ．，ＩＮＣ．、およびＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｊａｐａｎ Ｋ．Ｋ．によって供給されており、さらなる精製なしに使用した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、ＪＮＭ－ＥＣＸ４００ＰまたはＪＭＮ－ＥＣＳ４００（ＪＥＯＬ Ｌｔｄ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）機器において４００ＭＨｚで記録し、重水素化溶媒シグナルと比べて報告する。

【0233】

シリコンフタロシアニンジヒドロキシド（Ｐｃ １）
四塩化ケイ素（１．９３ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）および１，３－ジイミノイソインドリン（１．１０ｇ、７．５９ｍｍｏｌ）を、キノリン（１３ｍＬ）中に溶解させ、混合物を、アルゴン雰囲気下において２時間還流した。混合物を、室温（ＲＴ）に冷却した後、５ＭのＮａＯＨ水溶液（１０ｍＬ）を添加し、混合物を、２時間還流した。産物を、ろ過によって回収し、ＭｅＯＨで洗浄し、真空下で乾燥させた（９７０ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）。産物を、さらなる精製なしに次の反応に使用した。

【0234】

ビス（３－アミノプロピルジメチルシリルオキシド）シリコンフタロシアニン（Ｐｃ ２）
Ｐｃ １（５００ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）および３－アミノプロピルジメチルエトキシシラン（１．１２ｇ、６．９６ｍｍｏｌ）を、ピリジン（２５０ｍＬ）中に溶解させ、混合物を、アルゴン雰囲気下において終夜還流し、回転式蒸発によって濃縮した。残渣を、希釈し、ろ過し、Ｈ_２Ｏ－エタノール溶液（２：１）で洗浄し、真空下で乾燥させた（６５０ｍｇ、０．８０７ｍｍｏｌ、収率８２％（２ステップ））。1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ -2.86 (s, 12 H), -2.33～-2.27 (m, 4 H), -1.28～-1.19 (m, 4 H), 1.18 (t, J = 7.2 Hz, 4 H), 8.35 (dd, J = 5.7, 2.8 Hz, 8 H), 9.66 (dd, J = 5.7, 2.8 Hz, 8 H).

【0235】

ビス｛３－［トリス（３－スルホプロピル）］アンモニオプロピルジメチルシリルオキシド｝シリコンフタロシアニン（Ｐｃ ３）
Ｐｃ ２（３００ｍｇ、０．３７３ｍｍｏｌ）、１，３－プロパンスルトン（２．２７ｇ、１８．６ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、４．８２ｇ、３７．４ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（１５ｍＬ）中に溶解させ、混合物を、５０℃で１２０時間、アルゴン雰囲気下において撹拌した。産物を、溶離液Ａ（Ｈ_２Ｏ、０．１Ｍのトリ－エチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ））および溶離液Ｂ（９９％のＭｅＣＮ、１％のＨ_２Ｏ）（１５分間でＡ／Ｂ＝８０／２０から５０／５０、５分間で５０／５０から０／１００）を使用して、逆相カラムＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３（１０ｍｍ×２５０ｍｍ）（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏ．、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）によって精製した。産物を、Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）およびカチオン交換樹脂で脱塩し、Ｐｃ ３を得た（２１６ｍｇ、０．１３２ｍｍｏｌ、収率３６％、ナトリウム塩として）。1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ -2.79 (s, 12 H), -2.12～-2.18 (m, 4 H), -0.88～-0.98 (m, 4 H), 1.75-1.66 (m, 12H), 2.05-1.98 (m, 4 H), 2.80-2.73 (m, 24 H) 8.52 (dd, J = 5.7, 3.0 Hz, 8 H), 9.79 (dd, J = 5.7, 3.0 Hz, 8 H).

【0236】

ＩＲ７００にコンジュゲートしたウシアルブミン、パニツムマブ、抗ＣＤ４４抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体の合成
ウシアルブミン（１ｍｇ、１５．０ｎｍｏｌ）、パニツムマブ（１ｍｇ、６．８ｎｍｏｌ）、抗ＣＤ４４および抗ＣＴＬＡ４抗体（１ｍｇ、６．７ｎｍｏｌ）を、０．１ｍｏｌ Ｌ^－１のＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．５）中において、５倍モル過剰量のＩＲ７００ ＮＨＳエステルとともに室温で１時間インキュベートした（アルブミン；１４６．９μｇ、７５．２ｎｍｏｌ、パニツムマブ；６６．９μｇ、３４．２ｎｍｏｌ、抗ＣＤ４４および抗ＣＴＬＡ４抗体；６５．１μｇ、３３．３ｎｍｏｌ、ＤＭＳＯ中１０ｍｍｏｌ Ｌ^－１）。混合物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＰＤ－１０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）で精製した。ＩＲ７００の濃度を、ＵＶ－Ｖｉｓ（８４５３ Ｖａｌｕｅ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して６８９ｎｍにおける吸光によって決定した。タンパク質濃度を、５９５ｎｍにおける吸光を測定することによって、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）で確認した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、各コンジュゲートの品質管理として行った。パニツムマブ－ＩＲ７００はｐａｎ－ＩＲ７００、アルブミン－ＩＲ７００はａｌｂ－ＩＲ７００、抗ＣＤ４４－ＩＲ７００はＣＤ４４－ＩＲ７００、および抗ＣＴＬＡ４－ＩＲ７００はＣＴＬＡ４－ＩＲ７００と略す。

【0237】

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＮＩＲ光曝露後のＰｃ ３またはｍＡｂ－ＩＲ７００の７００ｎｍ蛍光評価
ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中、０、０．１、０．５、１．０、および１０ｍＭのＬ－ＮａＡＡまたはＬ－システインを有する２５μＭのＰｃ ３または３μＭのｐａｎ－ＩＲ７００溶液を、調製した。ＮａＮ３と混合した分析のために、ＰＢＳによって希釈した、異なる濃度のＮａＮ３（０、０．０１、０．１、１、１０、または１００ｍＭ）を添加した、１ｍＭのＬ－システインおよび／または１ｍＭのＬ－ＮａＡＡを有する３μＭのｍＡｂ－ＩＲ７００溶液を、調製した。ｐａｎ－ＩＲ７００を、ＭＬ７７１０レーザーシステム（Ｍｏｄｕｌｉｇｈｔ、Ｔａｍｐｅｒｅ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて各条件（０、５、１０、２５、５０、１００、１５０、および２００Ｊ）においてＮＩＲ光（６９０ｎｍ、１５０ｍＷ ｃｍ－２、５０Ｊ ｃｍ－２）に曝露した。各照射の前および後に、７００ｎｍ蛍光強度を、蛍光イメージャー（Ｐｅａｒｌ Ｉｍａｇｅｒ、ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ、ＵＳＡ）によって取得した。Ｐｅａｒｌ Ｃａｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、蛍光を分析するために使用した。同じ目的の領域（ＲＯＩ）を、各チューブの溶液に設置し、次いで、平均７００ｎｍ蛍光強度を測定した。ＮＩＲ光照射の前および後のチューブの外観を、イメージングした。すべての実験は、室温で行った。

【0238】

電子スピン共鳴（ＥＳＲ）分光法
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の０．５ｍＭのＩＲ７００、３０マイクロリットルを、１０ｍＭのＬ－システインまたは１０ｍＭのＬ－ＮａＡＡありまたはなしで、気体透過性ポリメチルペンテン（ＴＰＸＴＭ）チューブ（内径０．７６ｍｍ×外径１．０ｍｍ×長さ６０ｍｍ、Ｔｏｈｏ Ｋａｓｅｉ Ｓａｎｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）に充填し、これを、次いで、両端を封止し、このＴＰＸチューブを、天然クオーツＥＳＲチューブ（外径５ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、Ｓ－５－ＥＰＲ－２５０Ｓ、Ｎｏｒｅｌｌ Ｉｎｃ．、ＮＣ）に入れた。ＥＳＲ試料チューブを、円筒ＴＥ０１１モードのキャビティ（ＪＥＯＬ）に設置し、アルゴンガスを、長いキャピラリーガラスチューブからＥＳＲ試料チューブへ流入させて、試料から酸素を除去した。５分間のアルゴンガスでの排気後に、ＥＳＲ試料チューブを封止し、Ｘ－ｂａｎｄ ＣＷ－ＥＳＲ測定を、ＪＥＯＬ－ＲＥ１Ｘ分光計（ＪＥＯＬ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して周囲温度で行った。ＮＩＲ光の照射を開始したのと同時に、ＥＳＲスキャン（スキャン時間：８分／１０ｍＴ）を低磁場側から開始した。ＥＳＲパラメーターは、次の通りであった：入射マイクロ波；電力１０ｍＷ、マイクロ波周波数；９．１５０ＧＨｚ、変調周波数；１００ｋＨｚ、磁場変調振幅；０．１ｍＴ、時間定数；０．３秒、スキャン範囲；３２５．１７±５ｍＴ、およびレシーバーゲイン；５．０×１０２。ＥＳＲシグナルの線幅、強度、およびｇ値を、キャビティ内の同時搭載されているＭｎ２＋マーカー（ＥＳ－ＤＭ１、ＪＥＯＬ）のシグナルおよびＷｉｎ－Ｒａｄソフトウェア（Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して推測した。

【0239】

システインからのシスチンの形成のＨＰＬＣ分析
１ｍＭのＬ－システインを含有する１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の０．２５ｍＭのＩＲ７００の溶液を、封止したキュベットにおいて調製し、アルゴンを、キュベットのゴム製セプタムキャップに２０分間吹き込んだ。脱酸素化した溶液に、次いで、レーザー（ＭＬＬ－ＩＩＩ－６９０、Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ Ｎｅｗ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．Ｌｔｄ、Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ、Ｃｈｉｎａ）（６９０ｎｍ、１Ｗ ｃｍ－２）を１時間照射した。アルゴン吹き込みなしの溶液もまた、上述のように照射した。照射した溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ－ＬＨフィルター（細孔サイズ：０．４５μｍ、親水性、ＰＴＦＥ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳ）でろ過した。溶液を、溶離液Ａ（Ｈ_２Ｏ、０．１％のトリフルオロ酢酸）および溶離液Ｂ（９９％のＭｅＣＮ、１％のＨ_２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９９／１）を１ｍＬ 分^－１の流速で使用して、逆相カラムＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いてＨＰＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏ．、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）によって分析した。検出波長は、２０２ｎｍであった。溶液はまた、Ｌ－システインおよびＬ－シスチンのピークを特定するために基準化合物を共注入した。

【0240】

細胞培養物
ルシフェラーゼを発現するマウスがん細胞系、Ａ４３１ ＧＦＰ－ｌｕｃ（ＥＧＦＲを発現する表皮がん）、ＭＤＡＭＢ４６８ ＧＦＰ－ｌｕｃ（ＥＧＦＲを発現する乳がん）、ＭＣ３８－ｌｕｃ（結腸がん）、ＬＬ／２－ｌｕｃ（肺がん）、およびＭＯＣ２－ｌｕｃ（口腔がん）を使用した。Ａ４３１ ＧＦＰ－ｌｕｃ、ＭＤＡＭＢ４６８ ＧＦＰ－ｌｕｃ、ＭＣ３８－ｌｕｃ、およびＬＬ／２－ｌｕｃ細胞を、１０％のウシ胎児血清、１００Ｉ．Ｕ．ｍＬ^－１のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において培養した。ＭＯＣ２－ｌｕｃ細胞を、５％ウシ胎児血清、１００Ｉ．Ｕ．ｍＬ^－１のペニシリン／ストレプトマイシン、５ｎｇ ｍＬ^－１のインスリン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）、４０ｎｇ ｍＬ^－１のヒドロコルチゾン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）、および３．５ｎｇ ｍＬ^－１のヒト組換えＥＧＦ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を補充したＩＭＤＭ培地およびＨａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２培地の混合物（２：１の比、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において培養した。すべての細胞を、９５％空気および５％ ＣＯ_２の雰囲気下において３７℃で加湿インキュベーターにおいて培養した。

【0241】

還元剤を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ ＮＩＲ－ＰＩＴ
Ａ４３１ ＧＦＰ－ｌｕｃまたはＭＤＡＭＢ４６８ ＧＦＰ－ｌｕｃ細胞（４×１０^５個）を、１２ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートし、次いで、パニツムマブ－ＩＲ７００（１０μｇ ｍＬ^－１）を含有する培地に３７℃で１時間曝露した。ＡＰＣを有する培地を吸引した後、様々な濃度のＬ－ＮａＡＡ、Ｌ－システイン、および／またはＮａＮ_３を含有するフェノールレッド不含培地を、各ウェルに添加した。ＮＩＲ光（６９０ｎｍ、１５０ｍＷ ｃｍ^－２、Ａ４３１ ＧＦＰ－ｌｕｃについては１または２Ｊ ｃｍ^－２、ＭＤＡＭＢ４６８ ＧＦＰ－ｌｕｃについては２０Ｊ ｃｍ^－２）を、がん細胞に照射した。フローサイトメトリー分析のために、細胞を、ＮＩＲ光曝露の１時間後に、トリプシンで収集した。細胞を、次いで、室温で５分間、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、１μｇ ｍＬ^－１）で染色した。細胞の蛍光を、次いで、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。

【0242】

動物および腫瘍モデル
すべてのｉｎ ｖｉｖｏ手順は、Guide for the Care and Use of Laboratory Animal Resources (1996), US National Research Councilを遵守して行った。６～８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびホモ接合性無胸腺ヌードマウスを、それぞれ、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）およびＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）から得た。Ａ４３１ ＧＦＰ－ｌｕｃ（１×１０^６個）、ＭＣ３８－ｌｕｃ（１×１０^６個）、ＬＬ／２－ｌｕｃ（０．５×１０^６個）、またはＭＯＣ２－ｌｕｃ（１×１０^６個）細胞を、背側の右側に接種した。腫瘍部位を覆う毛は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＮＩＲ－ＰＩＴおよびイメージングの前に除去した。体重を、ＮＩＲ光曝露の前日から、４～６日後まで測定した。マウスを、ＣＯ_２で安楽死させ、ＢＬＩを含むすべての実験を終了した。

【0243】

ｉｎ ｖｉｖｏ ＮＩＲ－ＰＩＴ
Ｃ５７ＢＬ／６腫瘍保持マウスを、以下のように３つの群にランダム化した：ｉ）処置なし（対照）、ｉｉ）Ｌ－ＮａＡＡなしで、ＡＰＣの静脈内投与に続いてＮＩＲ光曝露（ＮＩＲ－ＰＩＴ）、ｉｉｉ）Ｌ－ＮａＡＡありのＮＩＲ－ＰＩＴ。ＡＰＣを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのがん細胞の接種の６日後に注射した。同様に、無胸腺マウスの腫瘍保持マウスを、以下のように２つの群にランダム化した：ｉ）Ｌ－ＮａＡＡなしのＮＩＲ－ＰＩＴ、ｉｉ）Ｌ－ＮａＡＡありのＮＩＲ－ＰＩＴ。ＡＰＣの用量は、それぞれ、ＣＤ４４－ＩＲ７００については１００μｇ、ＣＴＬＡ４－ＩＲ７００については５０μｇであった。ＮＩＲ光（６９０ｎｍ、１５０ｍＷ ｃｍ－２、５０Ｊ ｃｍ－２）を、翌日に曝露した。Ｌ－ＮａＡＡ（８０ｍｇ マウス－１）またはＰＢＳを、ＮＩＲ光曝露の１５分前に腹腔内注射した。ＮＩＲ光曝露の際、腫瘍に隣接する正常組織は、確実にＮＩＲ光曝露が腫瘍部位に限定されるように、アルミニウム箔で被覆した。ＩＲ７００の背側蛍光画像を、Ｐｅａｒｌ Ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の７００ｎｍ蛍光チャネルで得た。画像を、ＮＩＲ－ＰＩＴの前および後に取得した。ＲＯＩを、腫瘍に配置した。ＮＩＲ光照射の１日後の処置マウスの背側浮腫形成を、カメラでイメージングした。急性処置の有効性を、ＢＬＩ分析で評価し、ここで、Ｄ－ルシフェリン（３ｍｇ マウス－１、Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をマウスに腹腔内注射した。ルシフェラーゼ活性を、相対光単位を使用してＢＬＩシステム（Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ）で分析した。ＲＯＩを、腫瘍全体にわたって配置した。相対光単位の１分当たりの計数を、Ｍ３ Ｖｉｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ）を使用して計算し、以下の式を使用してＮＩＲ－ＰＩＴ前のものに基づくパーセンテージに変換した：［（処置後の相対光単位）／（処置前の相対光単位）×１００（％）］。生物発光画像を、脱毛に誘導される皮膚の色素沈着の発症により正確な測定ができなくなるまで継続的に記録した。

【0244】

磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）
ペントバルビタール麻酔下において、ＭＲＩを、ＮＩＲ光曝露の１日後に、社内１０インチの円形マウスレシーバーコイルアレイ（Ｅｌｉｔｉｏｎ ３Ｔ、Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｓｔ、Ｎｅｔｈｅｒ－ｌａｎｄｓ）を使用して３－Ｔスキャナーで行った。腫瘍を正確に位置付けるために、スカウト画像を得た。すべてのマウスに、Ｔ２強調脂肪抑制イメージング（Ｔ２ＷＩ脂肪抑制）および短いＴＩ反転回復イメージング（ＳＴＩＲ）を行った。すべての画像を冠状面で取得し、Ｔ２ＷＩ脂肪抑制画像は、軸面でも取得した。すべての画像を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して分析し、３Ｄイメージングを再構築した。Ｔ２ＷＩ脂肪抑制およびＳＴＩＲにおいて各画像から導出された高シグナル強度面積を、Ｉｍａｇｅ Ｊによって計算した。

【0245】

フローサイトメトリー分析
ＣＴＬＡ４を発現する細胞の抑制を確認するために、ＭＣ３８－ｌｕｃの腫瘍を、ＮＩＲ光曝露の３時間後に採取した。腫瘍試料に由来する単一細胞懸濁液を、以下のプロトコールを使用して調製した。腫瘍全体を、コラゲナーゼＩＶ型（１ｍｇ ｍＬ^－１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＤＮａｓｅ Ｉ（２０μｇ ｍＬ^－１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、ハサミで優しく切断し、３ｍＬのシリンジのプランジャーの背面で潰した。組織を、７０μｍの細胞ストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に通した。合計３．０×１０^６個の細胞を染色し、５．０×１０^５個の細胞のデータを、各腫瘍について収集した。細胞を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得た抗ＣＴＬＡ４抗体（クローン、ＵＣ１０－４Ｂ９）で染色した。生細胞を死細胞と区別するために、細胞はまた、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でも染色した。細胞の蛍光を、次いで、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）で分析した。死細胞を、ＦＳＣ、ＳＳＣ、およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎでの染色に基づいて、分析から除去した。

【0246】

統計学的分析
データを、平均±ＳＥＭとして表す。統計学的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で行った。各実験の試料サイズ（ｎ）は、各図の凡例に記載されている。１回での測定のために、両側対応のないｔ検定（２つの群）または一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの検定またはダネットの検定（３つもしくはそれを上回る群）を使用した。ルシフェラーゼ活性、生体分布、および体重の比較のために、反復測定二方向ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの検定を使用した。０．０５未満のｐ値を、有意とみなした。

【0247】

（実施例５）
Ｌ－ＮａＡＡは、アジ化ナトリウム（ＮａＮ_３）の存在に関係なく、ＮＩＲ照射により軸リガンドの放出を加速させる
ＩＲ７００のフタロシアニンシアニン部分である化合物Ｐｃ ３を、図１６に従って合成した。ＮＩＲ光曝露後のＰｃ ３の光誘導性リガンド放出反応は、電子供与体であるＬ－ＮａＡＡの存在下において、用量依存性の様式で加速された。Ｐｃ ３の７００ｎｍ蛍光は、ＮＩＲ光およびＬ－ＮａＡＡの用量依存性の様式で減少した（図１７Ａ、１７Ｂ）。蛍光の消失は、Ｐｃ ３が、光曝露後にその可溶性を劇的に変化させたため、Ｌ－ＮａＡＡの用量依存性の様式でのＰｃ ３の沈降と関連していた（図１７Ｃ）。パニツムマブとコンジュゲートされたＩＲ７００（パニツムマブ－ＩＲ７００）の蛍光放出は、ＮＩＲ光およびＬ－ＮａＡＡの用量依存性の様式で減少した（図１７Ｄ、１７Ｅ）。ＮａＮ３の存在により、Ｌ－ＮａＡＡは、ＮＩＲ光照射後のパニツムマブ－ＩＲ７００の蛍光の減少を阻害しなかった（図１７Ｆ）。

【0248】

ＩＲ７００およびＬ－ＮａＡＡラジカルの中間産物を特定するために、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）分光法を行った。ブロードシグナルが、中心場に観察されたが（図１７Ｇ（ｉ））、このシグナルは、空のクオーツＥＳＲチューブでも観察されており、このシグナルが、クオーツＥＳＲチューブ自体に由来することが示された。したがって、このシグナルは、差し引くことができ、ＥＳＲ測定に干渉しなかった。アルゴン飽和条件下において（図１７Ｇ、左）、２．００５１のｇ値および０．１８ｍＴの分割幅を有する小さいが明確なダブレットシグナルが、単純にＩＲ７００をＬ－ＮａＡＡと数分間混合することによって観察された（図１７Ｇ（ｉｉ））。このシグナルのＥＳＲパラメーターは、Ｌ－ＮａＡＡの酸化中に産生される、Ｌ－ＮａＡＡラジカルについて以前に報告されたものとほとんど同じである。この観察は、Ｌ－ＮａＡＡラジカルが、ＮＩＲ光照射なしでＩＲ７００およびＬ－ＮａＡＡの間の酸化還元相互作用によって産生されることを示す。１０ｍＭのＬ－ＮａＡＡおよび０．５ｍＭのＩＲ７００を含有する試料にＮＩＲ光を照射した場合、図１７Ｇ（ｉｉｉ）の左のスペクトルにおいてアスタリスクで示されるように、０．８７ｍＴのブロード線幅および２．０００６のｇ値を有する小さなシグナルが出現した。このシグナルは、電子供与体、例えば、Ｌ－ＮａＡＡの非存在下では観察されておらず、求電子性分子である酸素が存在する場合に、空気中のシグナルの強度が、アルゴン飽和条件下のものよりもはるかに小さかったため、このＥＳＲシグナルを、Ｌ－ＮａＡＡからＮＩＲ光に誘導されるトリプレット状態のＩＲ７００への電子移動によって産生されたＩＲ７００アニオンラジカルに割り当てた。この手順において、磁場のスキャンおよび試料照射は、同時に開始し、８分／１０ｍＴで継続した。したがって、ＩＲ７００アニオンラジカルに起因するシグナルが検出された中心領域は、スキャン開始から約４分で生じた。ＩＲ７００アニオンラジカルに由来するこのシグナルは、ＮＩＲ光照射後少なくとも１６分間観察された。このシグナルは、ＩＲ７００アニオンラジカルに由来し、ＮＩＲ光照射が、Ｌ－ＮａＡＡの存在下においてＩＲ７００アニオンラジカルを産生することを示した。図１７Ｇ（ｉｖ）および（ｖ）の左のスペクトルにおいて、Ｌ－ＮａＡＡラジカルおよびＮＩＲ光に誘導されるＩＲ７００アニオンラジカルの形成に対するＮａＮ３の効果を、検査した。結果は、１００ｍＭのＮａＮ_３の添加が、Ｌ－ＮａＡＡラジカルを減弱させたが、ＮＩＲ光照射によって産生されるＩＲ７００アニオンラジカルの形成には影響を及ぼさなかったことを示した。

【0249】

類似の実験を、酸素の存在下において行った。図１７Ｇ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の右のスペクトルに示されるように、空気中でのＩＲ７００のＬ－ＮａＡＡとの反応は、アルゴン飽和条件下におけるものよりも強力な、Ｌ－ＮａＡＡラジカルに由来するラジカルシグナルを示し、Ｌ－ＮａＡＡラジカルは、ＮＩＲ光照射によってさらに増強された。さらに、ＮＩＲ光照射は、空気中でＩＲ７００アニオンラジカルを産生したが、これは、アルゴン飽和条件と比較して大幅に低減されたことも観察された。Ｌ－ＮａＡＡラジカルおよびＩＲ７００アニオンラジカルに対するＮａＮ３の効果は、図１７Ｇ（ｉｖ）および（ｖ）の右のスペクトルに示されている。１００ｍＭのＮａＮ３の試料への添加により、Ｌ－ＮａＡＡラジカルに由来するＥＳＲシグナル強度が減少したが、ＮＩＲ照射によって産生されるＩＲ７００アニオンラジカルの形成に影響を及ぼすようであった。軸リガンド切断が、Ｌ－ＮａＡＡ添加条件下において観察され、これは、ＮａＮ_３によって増強されなかった（図１７Ｈ）。

【0250】

（実施例６）
Ｌ－システインを電子供与体として添加した場合に、ＮａＮ３は、ＩＲ７００のリガンド放出を阻害した。
Ｐｃ ３およびパニツムマブ－ＩＲ７００の光誘導性リガンド放出反応を、Ｌ－ＮａＡＡの代替的な電子供与体であるＬ－システイン添加の条件下において評価した。同様の現象が観察されたが、Ｌ－ＮａＡＡを使用した場合よりも低いＮＩＲ光照射レベルで生じた（図１８Ａ～１８Ｃ）。１０ｍＭまたはそれよりも高い濃度のＮａＮ_３を、１ｍＭのＬ－システインと組み合わせることで、Ｌ－システイン単独で見られるパニツムマブ－ＩＲ７００蛍光の消失が、低下した（図１８Ｄ）。しかしながら、１ｍＭのＬ－ＮａＡＡの１ｍＭのＬ－システインへの添加により、ＮａＮ_３の効果に対抗した（図１８Ｅ）。

【0251】

照射なしの０．５ｍＭのＩＲ７００および１０ｍＭのＬ－システインの対照ＥＳＲスペクトルは、図１８Ｆ（ｉ）に示されている。０．５ｍＭのＩＲ７００および１０ｍＭのＬ－システインの試料を、１００ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）に溶解させ、アルゴン飽和条件下においてＮＩＲ光を照射すると、ＩＲ７００アニオンラジカルに割り当てられる０．８７ｍＴの線幅および２．０００６のｇ値を有する対称的なＥＳＲスペクトルが、図１８Ｆ（ｉｉ）に示されるように、観察された。さらに、ＮＩＲ光に誘導されるＩＲ７００アニオンラジカルに対するＮａＮ_３の効果を評価するために、類似の実験を、試料中の１００ｍＭのＮａＮ_３の存在下において行った。ＮａＮ_３の存在下におけるＥＳＲスペクトル（赤色）を、ＮａＮ_３の非存在下におけるスペクトル（灰色、図１８Ｆ（ｉｉ）と同じスペクトル）に、図１８Ｆ（ｉｉｉ）に示されるように、重ねた。これらの結果は、ＮａＮ_３が、ＩＲ７００アニオンラジカルのシグナルを減少させたことを示した。ＮａＮ_３を添加した場合、リガンド切断が減少された（図１８Ｇ）。この結果は、ラジカルアニオンの形成が阻害されたＥＳＲの結果と一致する。

【0252】

Ｌ－シスチンが、Ｌ－システインから産生されるかどうかを決定するために、ＩＲ７００の溶液に、Ｌ－システインの存在下において照射し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析した。ＩＲ７００に、低酸素条件下において照射した場合、Ｌ－システインおよびＬ－シスチンのピークが観察されたが、ＮＩＲ光照射なしの場合にはＬ－シスチンのピークは存在しなかった（図１８Ｈ）。一方で、酸素の存在下においてＮＩＲ光照射すると、Ｌ－システインのピークは、大幅に低減され、一方で、Ｌ－シスチンのピークは、低酸素条件下におけるものよりも大きかった。これらの結果は、Ｌ－システインが、励起状態においてＩＲ７００に対する還元体として作用し、Ｌ－シスチンに変換されたことを示した。加えて、Ｌ－システインは、酸素の存在下において、酸素の非存在下よりも効率的に消費された。これは、酸素が、トリプレット励起状態のＩＲ７００または基底状態におけるアニオンラジカルをクエンチし、より効率的なサイクルの励起および還元をもたらすためであり得る。

【0253】

（実施例７）
Ｌ－ＮａＡＡは、ＮａＮ_３によって引き起こされるＮＩＲ－ＰＩＴ細胞傷害性の抑制に対抗する
ＮＩＲ－ＰＩＴの有効性に対する還元剤の効果を調査するために、がん細胞を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴの細胞傷害性効果を、細胞生存率アッセイによって定量的に評価した。低い濃度または薬理学的濃度下において、Ｌ－ＮａＡＡは、パニツムマブ－ＩＲ７００ ＮＩＲ－ＰＩＴ（Ｐａｎ－ＰＩＴ）の細胞傷害性損傷を増加させた。超生理学的濃度のＬ－ＮａＡＡ（例えば、１ｍＭを上回る）下において、Ｐａｎ－ＰＩＴによる細胞傷害性損傷は、わずかに阻害された。対照的に、Ｌ－システインは、０．００１ｍＭなどの非常に低い濃度においてのみであるが、Ｐａｎ－ＰＩＴの細胞傷害性損傷をわずかに増強し、一方で、０．１ｍＭまたはそれよりも高い濃度では細胞傷害性を低下させた（図１９Ａ～１９Ｂ）。Ｌ－システインおよびＬ－ＮａＡＡの両方が同等の濃度で存在する場合、Ｌ－システインは、Ｌ－システインのＬ－ＮａＡＡと比較して高い酸化還元能に起因して、Ｌ－ＮａＡＡの効果に対抗する傾向があった（図１９Ａ）。

【0254】

次に、ＮａＮ_３の存在下におけるＰａｎ－ＰＩＴの細胞傷害性に対する各還元剤の影響を評価した。Ｌ－ＮａＡＡは、ＮａＮ３によって引き起こされる細胞傷害性の低減を克服したが、Ｌ－システインは、ＮａＮ３の効果を逆転させることはできなかった（図１９Ｄ、１９Ｅ）。別の細胞系であるＭＤＡＭＢ４６８において、Ｌ－ＮａＡＡはまた、ＮａＮ３によって抑制されるＰａｎ－ＰＩＴの細胞傷害性を回復させた（図２０Ａ～２０Ｄ）。同様の傾向が、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって観察された（図２１Ａ～２１Ｄ）。これらの結果は、ＮａＮ_３によるＮＩＲ－ＰＩＴ細胞傷害性の抑制が、Ｌ－ＮａＡＡによって克服されたが、Ｌ－システインによっては、その高い酸化還元能にもかかわらず、おそらくは、添加されたＬ－システインが、Ｌ－システインのスルフヒドリル基とジスルフィド結合を形成し、それによって、光誘導性リガンド放出反応を加速させるその能力が低下したため、克服されなかったことを示す。

【0255】

（実施例８）
Ｌ－ＮａＡＡは、ＮＩＲ光曝露後のＩＲ７００のリガンド放出を加速させる
Ｌ－ＮａＡＡまたはＬ－システインが、ｉｎ ｖｉｖｏでＩＲ７００からのリガンド放出を良好に促進するかどうかを評価するために、アルブミン－ＩＲ７００（ａｌｂ－ＩＲ７００）を使用し、蛍光の消失を測定した（図２２Ａ）。コンジュゲートされたａｌｂ－ＩＲ７００（５０μｇ）を、ＮＩＲ光曝露の２時間前に、非腫瘍保持無胸腺ヌードマウスに、外側尾静脈から注射した。Ｌ－ＮａＡＡ（８０ｍｇ）、Ｌ－システイン（１０．５ｍｇ）、またはＰＢＳを、マウスにＮＩＲ光を照射する２分前に、尾静脈から注射した。腹部を、ＮＩＲ光（６９０ｎｍ、１５０ｍＷ ｃｍ^－２、２０Ｊ ｃｍ^－２）に曝露した。腹側蛍光を、Ｐｅａｒｌ Ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＮＩＲ光曝露の前および後に測定した。ＮＩＲ光照射および蛍光イメージングのサイクルを、５回反復した。ＲＯＩは、肝臓および照射部位に設置した。各ＲＯＩの平均蛍光強度を計算した。

【0256】

ａｌｂ－ＩＲ７００をＮＩＲ光に曝露した後、７００ｎｍ蛍光シグナルは、照射部位では減少したが、肝臓内のシグナルは、ＮＩＲ光の線量依存性の様式で増加した（図２２Ｂ、２２Ｄ）。Ｌ－ＮａＡＡ投与下において、蛍光は、Ｌ－ＮａＡＡなしの条件と比較して有意に減少したが、Ｌ－システインでは蛍光に明らかな変化はなかった（図２２Ｃ、２２Ｅ）。リガンド放出は蛍光の消失をもたらすため、肝臓における７００ｎｍ蛍光の減少は、ＮＩＲ光曝露後にａｌｂ－ＩＲ７００で高いリガンド放出が生じたことを意味する。したがって、Ｌ－ＮａＡＡは、ｉｎ ｖｉｖｏでアルブミンにコンジュゲートしたＩＲ７００のリガンド放出を加速させたが、Ｌ－システインは加速させなかった。

【0257】

（実施例９）
Ｌ－ＮａＡＡは、がん細胞標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの有効性に影響を及ぼさなかった
Ｌ－ＮａＡＡが、がん細胞標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの抗腫瘍効果に影響を及ぼしたかどうかを、ＣＤ４４－ＩＲ７００ ｉｎ ｖｉｖｏ同種移植腫瘍モデルを利用して、決定した。まず、Ｌ－ＮａＡＡは、腫瘍成長に影響を及ぼさないことを確認した。処置およびイメージングレジメンが、示されている（図２３Ａ）。ＭＣ３８－ｌｕｃ腫瘍内のＣＤ４４－ＩＲ７００の蓄積を、蛍光イメージングによって確認し、これは、ＮＩＲ光曝露後に、Ｌ－ＮａＡＡが存在するかどうかに関係なく、減少した（図２３Ｂ、２３Ｃ）。ＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの治療有効性を、リードアウトとしてＢＬＩで評価した（図２４Ｄ）。Ｌ－ＮａＡＡの存在に関係なく、両方のＮＩＲ－ＰＩＴ群が、ＢＬＩにおいて、がん細胞死を示す、対照群と比較して有意に低い強度を示し、Ｌ－ＮａＡＡありのＮＩＲ－ＰＩＴとＬ－ＮａＡＡなしのＮＩＲ－ＰＩＴとの間で有意差はなかった（図２４Ｅ）。Ｌ－ＮａＡＡなしのＮＩＲ－ＰＩＴ群において１日目に、重度の浮腫形成が、腫瘍の上の皮膚で観察された。これは、生物発光シグナルの多くを減弱させた可能性が高い。ＭＣ３８－ｌｕｃ、ＬＬ／２－ｌｕｃ、およびＭＯＣ２－ｌｕｃ腫瘍モデルは、すべてが、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの抗腫瘍効果が、Ｌ－ＮａＡＡで変化しなかったことを示した（図２５Ａ～２５Ｉ）。無胸腺マウスにおいて、Ｌ－ＮａＡＡはまた、ｐａｎ－ＰＩＴの有効性に影響を及ぼさなかった（図２６Ａ～２６Ｅ）。

【0258】

（実施例１０）
Ｌ－ＮａＡＡは、ＮＩＲ－ＰＩＴでの処置後の浮腫の形成を抑制した
浮腫の形成を、Ｌ－ＮａＡＡありおよびなしのＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴ後に評価した。ＭＣ３８－ｌｕｃ、ＬＬ／２－ｌｕｃ、およびＭＯＣ２－ｌｕｃ腫瘍保持マウスにおいて、浮腫は、Ｌ－ＮａＡＡなしで、ＮＩＲ－ＰＩＴの１日後に、マウスにおいて、皮下腫瘍周辺の背側表面に観察された（図２４Ｆおよび２５Ｇ）。しかしながら、Ｌ－ＮａＡＡ注射ありのＮＩＲ－ＰＩＴによって処置したマウスにおいて、浮腫は検出されなかった。２つの群間で、体重における有意差は観察されなかった（図２４Ｇ）。他の同種移植モデルにおいて、Ｌ－ＮａＡＡありのＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴ後に体重における有意差は検出されなかった（図２５Ｈ、２５Ｉ）。

【0259】

浮腫の程度を定量するために、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの１日後に行った。非Ｌ－ＮａＡＡ群において、Ｔ２強調および脂肪抑制画像（Ｔ２ＷＩ脂肪抑制）は、ＮＩＲ－ＰＩＴにおいて、高シグナル強度面積として示される、末梢腫瘍部位から胸郭の低端および尾部の近位側までに及ぶ広範囲の浮腫を示した。対照的に、Ｌ－ＮａＡＡ群においては、処置した腫瘍の周囲のみに、最小限の浮腫が観察された（図２５Ｈ）。Ｔ２ＷＩ脂肪抑制画像における処置後の浮腫に対応する高シグナル強度の面積を定量し、高シグナル面積は、Ｌ－ＮａＡＡなしで処置した群において、Ｌ－ＮａＡＡ群と比べて、有意に大きかったことが示された（図２５Ｉ）。これはまた、短いＴＩ反転回復画像（ＳＴＩＲ）でも確認された（図２７Ａ～２７Ｂ）。

【0260】

浮腫形成の原因を調査するために、ＲＯＳを、ＮＩＲ－ＰＩＴの前および後に、ＭＣ３８－ｌｕｃ腫瘍保持マウスにおいてＬ－０１２を使用して、化学発光イメージング（ＣＬＩ）で評価した（図２８Ａ～２８Ｃ）。Ｌ－ＮａＡＡありのＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、ＣＬＩにおいて、Ｌ－ＮａＡＡなしのＮＩＲ－ＰＩＴと比較して、有意に低い強度（低ＲＯＳ）示した。これらのデータは、Ｌ－ＮａＡＡが、ＮＩＲ－ＰＩＴ後にＲＯＳによって誘導される浮腫形成を阻害したことを示した。

【0261】

（実施例１１）
Ｌ－ＮａＡＡは、有効性に干渉することなく、免疫抑制性細胞を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴ後の浮腫の形成を抑制した
Ｌ－ＮａＡＡありおよびなしのＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの有効性を、ＭＣ３８－ｌｕｃ腫瘍において評価した。両方の群において、ＣＴＬＡ４－ＩＲ７００蛍光を、注射の１日後、ＮＩＲ－ＰＩＴの前に観察したが、ＮＩＲ光曝露後に減少した（図２９Ａ～２９Ｃ）。Ｌ－ＮａＡＡなしのＮＩＲ－ＰＩＴ群は、ＮＩＲ光曝露後１日目から３日目に、Ｌ－ＮａＡＡありのＮＩＲ－ＰＩＴ群よりも低いＢＬＩ腫瘍シグナルを有した（図２９Ｄ）。しかしながら、ＮＩＲ－ＰＩＴ後６日目までに、２つの群間で差は観察されず、両方のＮＩＲ－ＰＩＴ群が、対照群と比較して有意に低いＢＬＩ強度を示した（図２９Ｅ）。ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴは、ＣＤ４４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴよりも強力な浮腫形成を示したため、Ｌ－ＮａＡＡなしのＮＩＲ－ＰＩＴ群において、皮膚肥厚化に起因してＢＬＩでより低い強度が示された。Ｌ－ＮａＡＡありのＮＩＲ－ＰＩＴによって処置したマウスにおける浮腫の形成もまた、肉眼的およびＭＲＩの両方で、抑制された（図２９Ｆ～２９Ｈ）。ＮＩＲ－ＰＩＴの翌日に、有意な重量低下が、Ｌ－ＮａＡＡありのＮＩＲ－ＰＩＴ群のマウスにおいて観察されたが（図２９Ｉ）、浮腫が比較的少ないためと思われた。

【0262】

ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴにおいて、より高いＲＯＳもまた、Ｌ－ＮａＡＡなしのＮＩＲ－ＰＩＴ群において検出された（図２８Ｄ、２８Ｅ）。ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの選択的な細胞傷害性が、Ｌ－ＮａＡＡありのＮＩＲ－ＰＩＴ群において保存されていたかどうかを確認するために、ＣＴＬＡ４を発現する細胞の選択的な枯渇を、ＭＣ３８－ｌｕｃ腫瘍において、ＣＴＬＡ４標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの３時間後の評価した（図２９Ｊ）。ＣＴＬＡ４ｈｉ細胞は、Ｌ－ＮａＡＡありおよびなしの両方のＮＩＲ－ＰＩＴ群において、選択的に枯渇された。したがって、Ｌ－ＮａＡＡは、免疫抑制性細胞標的化ＮＩＲ－ＰＩＴの有効性に対して効果を有さなかったが、ＲＯＳによる浮腫形成を抑制した。

【0263】

ＮＩＲ－ＰＩＴによって誘導される選択的な細胞傷害性は、低酸素の電子供与体が豊富な条件下において生じる、光誘導性リガンド放出反応によって引き起こされる。リガンド放出は、ＡＰＣ－抗原複合体の可溶性の劇的な変化を引き起こし、細胞膜の損傷および細胞死を引き起こす。しかしながら、正常酸素条件または高酸素条件下において、ＮＩＲ光は、ＡＰＣにおいてＲＯＳ産生を誘導し、これは、ＮＩＲ－ＰＩＴ後の非選択的細胞傷害性および局所的な浮腫に寄与する可能性が高い。別の可能性のある局所的な浮腫の形成の原因は、ＮＩＲ－ＰＩＴに起因する直接的なリンパ系損傷と関連するリンパ管閉塞であり得る。しかしながら、ＮＩＲ－ＰＩＴによる明らかなリンパ性閉鎖または形態学的変化は観察されなかった。したがって、ＲＯＳは、血管透過性を増加させ、浮腫の形成をもたらす。Ｌ－ＮａＡＡは、ＮＩＲ－ＰＩＴリガンド放出反応を促進するべき電子供与体であるが、ＲＯＳの大半をクエンチし、それによって、ＭＲＩで図２４Ｈおよび２９Ｇに示されるように浮腫を低減させる。ＲＯＳのクエンチは、がん細胞の細胞傷害性に干渉し得るため、ＮＩＲ－ＰＩＴの治療効果に影響を及ぼし得る。しかしながら、Ｌ－ＮａＡＡ注射ありのＮＩＲ－ＰＩＴは、依然として、許容可能な細胞傷害性を示したが、浮腫形成は伴わない。したがって、ＮＩＲ－ＰＩＴにおけるＬ－ＮａＡＡ投与は、例えば、浮腫が気道または縦隔に影響を及ぼし得る場合に、より安全である有効な治療法を提供する。

【0264】

低酸素条件下において、Ｌ－ＮａＡＡラジカル産生は、最小限であるが、正常酸素条件下においては、Ｌ－ＮａＡＡラジカル産生の量は、極めて多く（図１７Ｇ（ｉｉ）および（ｉｉｉ））、酸素分子が、Ｌ－ＮａＡＡラジカルの産生に関与することを示す。ＩＲ７００アニオンラジカルが、酸素の存在下において、１つの電子を酸素に供与して、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２－・）を生成するか、または光励起によって生成されたトリプレット状態ＩＲ７００が、トリプレット酸素（^３Ｏ２）にエネルギーを与えて、シングレット酸素（^１Ｏ２）を産生することが、可能である。Ｌ－ＮａＡＡが、Ｏ２－・および^１Ｏ２と反応して、Ｌ－ＮａＡＡラジカルおよび過酸化水素を形成することが、報告されている。したがって、酸素の存在下において、Ｌ－ＮａＡＡが、これらのＲＯＳと反応し、多数のＬ－ＮａＡＡラジカルの生成をもたらし得ることが、可能である。この事例では、高用量のＬ－ＮａＡＡにより、生成されたＲＯＳを消費し、臨床実施において、ＮＩＲ－ＰＩＴの副作用を低減することができる。

【0265】

ＩＲ７００アニオンラジカルは、Ｌ－システインを還元剤として使用した場合に明確に観察されているが（図１８Ｆ（ｉｉ））、シグナルは、Ｌ－ＮａＡＡを還元剤として使用した場合、非常に低い（図１７Ｇ（ｉｉｉ））。これは、還元剤としてのＬ－システインおよびＬ－ＮａＡＡの特性における差に起因し得る。Ｌ－システインは、１つの電子の還元能力を有する単純な還元体であるが、一方で、Ｌ－ＮａＡＡは、水中でイオン化してＬ－ＮａＡＡモノアニオンとなり、このＬ－ＮａＡＡモノアニオンが、反応プロセスにおいて還元体として作用する。Ｌ－ＮａＡＡモノアニオンは、１つの電子の還元能力を有するだけでなく、１つの水素の供与体としても作用し、比較的長い寿命を有するＥＳＲで検出可能なＬ－ＮａＡＡラジカルを産生する（Njus and Kelley, Biochim Biophys Acta 1993, 1144:235-48.）。量子化学的計算を用いる場合、１つの電子の還元体、例えば、Ｌ－システインの存在下におけるＩＲ７００の光還元において、軸リガンド切断は、Ｌ－ＮａＡＡで生じるような、還元体からの１つの電子の移動による加水分解およびＨ_２Ｏからの１つのプロトンの移動を必要とすることが以前に示された（Kobayashi et al., Chempluschem 2020, 85:1959-1963）。Ｌ－システインを還元剤として使用した場合、１つの電子が、ＩＲ７００に供与され、Ｈ_２ＯからＩＲ７００アニオンラジカルへのプロトン移動が比較的緩徐であったため、寿命の長いＩＲ７００アニオンラジカルが、ＥＳＲによって検出された。しかしながら、Ｌ－ＮａＡＡを還元剤として使用した場合、Ｌ－ＮａＡＡモノアニオンからＩＲ７００分子への１つの電子および１つのプロトンの供与は、同時に生じ、そのため、ＩＲ７００アニオンラジカルは、それが生成されると同時に軸リガンド切断反応へと迅速に進み、したがって、ＥＳＲによって検出することができなかった（図１７Ｇおよび３０Ａ）。

【0266】

以前の研究により、公知のシングレット酸素およびＲＯＳクエンチャーであるＮａＮ_３が、ＮＩＲ－ＰＩＴの細胞傷害性を部分的に抑制することが示されている。しかしながら、これらの実験は、ＮａＮ_３の必要な用量が、生きている動物にとってｉｎ ｖｉｖｏで毒性であるため、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われていた。本明細書において、ＮａＮ_３は、ＥＳＲで示されるように、ＩＲ７００ラジカルアニオン形成をクエンチすることによって、ＩＲ７００のＮＩＲ光誘導性リガンド放出反応を直接的に抑制したことが示されている（図１７Ｇおよび１８Ｆ）。リガンド放出の抑制は、ＩＲ７００蛍光消失によって測定可能であり、これは、処置の有効性にも等しい。ＮａＮ_３は、ＩＲ７００のＮＩＲ光誘導性リガンド放出反応を抑制することによって、細胞傷害性を部分的に抑制する。したがって、ＮＩＲ－ＰＩＴ細胞傷害性の作用機序におけるＲＯＳの役割は、文献において誇張されていた（Kishimoto et al., Free radical biology & medicine 2015, 85:24-32.、Railkar, et al., Molecular cancer therapeutics 2017, 16:2201-2214）。

【0267】

Ｌ－システインは、Ｌ－ＮａＡＡよりも高いその酸化還元能および臨床使用に起因して、還元剤として、Ｌ－ＮａＡＡの代替物である。ＩＲ７００溶液において、Ｌ－システインは、特に低酸素条件下において、電子供与によって光誘導性リガンド放出を加速させた。しかしながら、ＩＲ７００が抗体にコンジュゲートすると、ＮＩＲ光誘導性リガンド放出反応は低酸素状態で優勢となり、Ｌ－システインによって高度に影響を受けない。抗体のＬ－システイン側鎖上のスルフヒドリル基は、共有結合でコンジュゲートされ、ＮＩＲ光によって活性化されると、ＩＲ７００に電子を供与し得ることが可能である。Ｌ－システイン添加は、さらには、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＮＩＲ－ＰＩＴから細胞を保護したが、おそらくはこれは、Ｌ－システインが、正常酸素細胞培養条件下において、抗体上の遊離スルフヒドリル基とジスルフィド結合を形成するためである。Ｌ－シスチンの形成は、光に活性化されるＩＲ７００への有効な電子供与を阻止し、リガンド放出反応を抑制する。Ｌ－ＮａＡＡは、電子供与体であるとともに、リガンド放出反応を促進する励起されたＩＲ７００のプロトン化の補助も行い得る。したがって、Ｌ－システインは、良好な還元剤であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでリガンド放出反応を加速させ得るが、ｉｎ ｖｉｖｏでこの目的のために使用することは困難であり得る。

【0268】

まとめると、ＩＲ７００への直接的な電子供与体およびＮＩＲ－ＰＩＴ中のＲＯＳの還元剤の両方として作用するＬ－ＮａＡＡは、ＮＩＲ－ＰＩＴの選択的な細胞傷害性を促進しながら、局所的な浮腫を抑制する。本明細書において使用される用量でのＬ－ＮａＡＡの比較的低い毒性および安全性臨床プロファイルに基づいて、これは、その安全性プロファイルを改善しながら、その有効性を妨害しない、ＮＩＲ－ＰＩＴの有用なアジュバントとしての機能を果たし得る（図３０Ｂ）。したがって、１つまたは複数の還元剤、例えば、Ｌ－ＮａＡＡを、ＩＲ７００を利用する開示される方法と組み合わせて使用することができる。１つまたは複数の還元剤は、一部の例では、例えば、ＮＩＲ－ＰＩＴの直後に、浮腫を有意に抑制する。臨床的に、浮腫は、ＮＩＲ－ＰＩＴでの臨床上の問題である。例えば、身体の重要な部分（例えば、気道または縦隔、例えば、気管の後方）で生じる腫瘍を処置する場合、浮腫は、望ましくない事象、例えば、窒息をもたらし得る。

【0269】

本開示の原理を適用することができる多数の可能性のある実施形態を考慮して、例示された実施形態が、本開示の例にすぎず、本発明の範囲を制限するものとみなされるべきではないことを理解されたい。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定められる。したがって、我々は、これらの特許請求の範囲の範囲および趣旨の範囲内のすべてを、我々の発明として主張する。

【図1A-B】

【図1C-D】

【図1E】

【図2A】

【図2B-C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B-C】

【図4】

【図5】

【図6A-B】

【図6C-D】

【図6E-F】

【図7A-C】

【図7D-G】

【図7H】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A-B】

【図11C-D】

【図11E】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A-C】

【図17D-F】

【図17G-H】

【図18A-C】

【図18D-E】

【図18F-G】

【図18H】

【図19A-B】

【図19C】

【図19D-E】

【図20A-B】

【図20C-D】

【図21A-B】

【図21C-D】

【図22A-B】

【図22C-D】

【図22E】

【図23】

【図24A-B】

【図24C-D】

【図24E-G】

【図24H-I】

【図25A-C】

【図25D-F】

【図25G-I】

【図26A-C】

【図26D-E】

【図27】

【図28A-C】

【図28D-E】

【図29A-C】

【図29D-E】

【図29F-H】

【図29I-J】

【図30A】

【図30B】

【国際調査報告】