特表 2024-505583 ＲＴＥＬ１発現を阻害するための増強されたオリゴヌクレオチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-06

(54)【発明の名称】ＲＴＥＬ１発現を阻害するための増強されたオリゴヌクレオチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240130BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20240130BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20240130BHJP

   A61K 47/56 20170101ALI20240130BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240130BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240130BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

A61K31/7125

A61P31/20

A61K47/56

A61K48/00

A61P43/00 111

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023547105

(86)(22)【出願日】2022-02-02

(85)【翻訳文提出日】2023-08-31

(86)【国際出願番号】 EP2022052417

(87)【国際公開番号】W WO2022167456

(87)【国際公開日】2022-08-11

(31)【優先権主張番号】21154701.3

(32)【優先日】2021-02-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】21207002.3

(32)【優先日】2021-11-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100157923

【弁理士】

【氏名又は名称】鶴喰 寿孝

(72)【発明者】

【氏名】フンダー，イーレク

(72)【発明者】

【氏名】フルシュカ，ナターシャ

(72)【発明者】

【氏名】カムラー，ズザンネ

(72)【発明者】

【氏名】コーラー，エーリヒ

(72)【発明者】

【氏名】レナード，ブライアン

(72)【発明者】

【氏名】ルアンサイ，スーファローネ

(72)【発明者】

【氏名】モール，ズザンネ

(72)【発明者】

【氏名】ニルソン，トビアス

(72)【発明者】

【氏名】オトスン，セーアン

(72)【発明者】

【氏名】ピーダスン，ルゲ

(72)【発明者】

【氏名】ラスムッセン，セーアン・ヴェ

(72)【発明者】

【氏名】シュミット，シュテッフェン

(72)【発明者】

【氏名】ゼビング，ザビーネ

(72)【発明者】

【氏名】ターリー，ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】バルター，ヨハンナ・マリエ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076CC35

4C076CC41

4C076EE59

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB33

4C084ZC41

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB33

4C086ZC41

(57)【要約】

本発明は、テロメア伸長ヘリカーゼ１の制御因子（ＲＴＥＬ１）の発現の調節又はＲＴＥＬ１活性の調節をもたらす、ＲＴＥＬ１を標的とする増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。本発明は、特に、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症、特に慢性ＨＢＶ感染症の処置及び／又は予防に使用するための、ＲＴＥＬ１を標的とする増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。本発明は、特に、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ等のｃｃｃＤＮＡを不安定化するためのＲＴＥＬ１を標的とする増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。また、本発明には、医薬組成物、並びにＨＢＶ感染症の処置及び／又は予防におけるその使用も含まれる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
ＴＴａｃａｔａｃｔｃｔｇｇｔＣＡＡＡ（配列番号５）、
ＡＡＴＴｔｔａｃａｔａｃｔｃｔｇＧＴ（配列番号３）、
ＡＡｔｔｔｔａｃａｔａｃｔｃｔＧＧＴＣ（配列番号４）、及び
ＣＴｔｔａｔｔａｔａａｃｔＴｇａＡｔＣＴＣ（配列番号６）
からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの群から選択され、
大文字はベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項2】

請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート。

【請求項3】

前記少なくとも１つのコンジュゲート部分が、アシアロ糖タンパク質受容体に結合することができる、請求項２に記載のコンジュゲート。

【請求項4】

前記コンジュゲート部分が、図５の三価ＧａｌＮＡｃ部分のうち１つから選択される、請求項２又は３に記載のコンジュゲート。

【請求項5】

前記コンジュゲート部分が、図５Ｄの三価ＧａｌＮＡｃ部分、例えば図５Ｄ－１若しくは図５Ｄ－２の三価ＧａｌＮＡｃ部分、又は両方の混合物である、請求項４に記載のコンジュゲート。

【請求項6】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドと前記コンジュゲート部分との間に位置するリンカーを含む、請求項２～５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項7】

前記リンカーが、２～５個の連続するホスホジエステル結合ヌクレオシドを含むか、又はそれからなる、請求項６に記載のコンジュゲート。

【請求項8】

図１、図２、図３及び図４に示されるコンジュゲートからなる群から選択されるコンジュゲート。

【請求項9】

請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項２～８のいずれか一項に記載のコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩。

【請求項10】

請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項９に記載の薬学的に許容され得る塩と、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む、医薬組成物。

【請求項11】

ＲＴＥＬ１を発現している標的細胞におけるＲＴＥＬ１発現を調節するためのｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、前記方法が、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項９に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項１０に記載の医薬組成物を有効量で前記細胞に投与することを含む、方法。

【請求項12】

疾患を処置又は予防するための方法であって、前記疾患に罹患しているか、又は罹患しやすい対象に、治療有効量又は予防有効量の請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項９に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項１０に記載の医薬組成物を投与することを含み、前記疾患が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症、例えば慢性ＨＢＶ感染症である、方法。

【請求項13】

薬に使用するための、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項９に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項14】

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症、例えば慢性ＨＢＶ感染症の処置又は予防に使用するための、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項９に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項15】

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症、例えば慢性ＨＢＶ感染症を処置又は予防するための医薬の調製のための、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項９に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項１０に記載の医薬組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、テロメア伸長ヘリカーゼ１の制御因子（ＲＴＥＬ１）の発現の調節又はＲＴＥＬ１活性の調節をもたらす、ＲＴＥＬ１を標的とする増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。本発明は、特に、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症、特に慢性ＨＢＶ感染症の処置及び／又は予防に使用するための、ＲＴＥＬ１を標的とする増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。本発明は、特に、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ等のｃｃｃＤＮＡを不安定化するためのＲＴＥＬ１を標的とする増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。また、本発明には、医薬組成物、並びにＨＢＶ感染症の処置及び／又は予防におけるその使用も含まれる。

【背景技術】

【0002】

Ｂ型肝炎は、逆転写を介して複製する小型肝臓指向性ウイルスであるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に起因する感染性疾患である。慢性ＨＢＶ感染症は、肝硬変及び肝細胞癌腫のような重篤な肝疾患に対する重要な因子である。慢性ＨＢＶ感染症に対する現在の処置は、多機能逆転写酵素であるウイルスポリメラーゼを標的とする、ラミブジン、アデホビル、エンテカビル、テノホビルジイソプロキシル、及びテノホビル・アラフェナミド等のペグ化１型インターフェロン又はヌクレオシ（チ）ド類似体の投与に基づいている。処置の成功は、通常、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の消失として測定される。しかしながら、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡは感染後も体内に残存するため、完全なＨＢｓＡｇクリアランスが達成されることは稀である。ＨＢＶの持続は、核内で安定に維持されているＨＢＶゲノムのエピソーム型によって媒介される。このエピソーム型は「共有結合閉環状（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ）ＤＮＡ」（ｃｃｃＤＮＡ）と呼ばれる。ｃｃｃＤＮＡは、ウイルス複製中間体であるプレゲノム（ｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ）ＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）を含む、全てのＨＢＶ転写物の鋳型として役立つ。数コピーのｃｃｃＤＮＡの存在は、ＨＢＶ感染症を再開させるのに十分であろう。ＨＢＶに対する現在の処置はｃｃｃＤＮＡを標的としない。しかしながら、慢性ＨＢＶ感染症の治癒には、ｃｃｃＤＮＡの排除が必要であろう（Ｎａｓｓａｌ，Ｇｕｔ．２０１５ Ｄｅｃ；６４（１２）：１９７２－８４．ｄｏｉ：１０．１１３６／ｇｕｔｊｎｌ－２０１５－３０９８０９によって概説される）。

【0003】

テロメア伸長ヘリカーゼ１調節因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｈｅｌｉｃａｓｅ １：ＲＴＥＬ１）は、テロメアの安定性、保護、及び伸長において機能し、ＤＮＡ複製時にテロメアを保護することが知られているシェルタリン複合体中のタンパク質と相互作用するＤＮＡヘリカーゼをコードする。この遺伝子の突然変異は、先天性角化異常症及びＨｏｙｅｒａｌｌ－Ｈｒｅｉｄａｒｓｓｏｎ症候群と関連している（例えば、Ｖａｎｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ ２４ ｐ．４１６による概説を参照）。

【0004】

核内に位置するＲＴＥＬ１は、テロメア長調節、ＤＮＡ修復、及びゲノム安定性の維持に関与するＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼとして機能する。ＲＴＥＬ１は抗リコンビナーゼとして作用して、毒性組換えに対抗し、減数分裂の間の交差を制限し、鎖侵入事象を物理的に解離することにより減数分裂組換え及び交差ホメオスタシスを制御し、これによって、減数分裂の合成依存性鎖アニーリング（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｒａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ：ＳＤＳＡ）及びＤループ組換え中間体の分解による非交差修復を促進する。その上、ＲＴＥＬ１はＴ－ループを分解し、テロメアのＧ４－ＤＮＡ構造に拮抗することによってテロメアの脆弱性を防ぎ、テロメアの動態及び安定性を共に確保する。

【0005】

ＲＴＥＬ１は、ｓｉＲＮＡスクリーニングにおいてＨＰＶエピソームの安定剤として同定されている：（Ｅｄｗａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ Ｖｏｌ ８，ｅ７５４０６）。ＲＴＥＬ１を標的とするｓｉＲＮＡも、同様に、Ｈｏｙｅｒａａｌ－Ｈｒｅｉｄａｒｓｓｏｎ症候群におけるＲＴＥＬ１との相互作用物質を同定するために使用されている（Ｓｃｈｅｒｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ Ｖｏｌ ４３ ｐ．１８３４）。加えて、ＲＴＥＬ１は、ＨＩＶ感染症を阻害する標的を提供する必須宿主タンパク質に対するｓｉＲＮＡスクリーニングから、ＨＩＶ宿主依存性因子として同定された（国際公開第２００７／０９４８１８号）。

【0006】

国際公開第２０２０／０１１９０２号は、アンチセンスオリゴヌクレオチドでＲＴＥＬ１を標的化すると、ＲＴＥＬ１が減少することが示された。さらに、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ、ｐｇＲＮＡ、ＨＢｓＡｇ、及びＨＢｅＡｇ等のＨＢＶ感染症のパラメータに対する効果が観察された。

【0007】

ＲＴＥＬ１を特異的に阻害することができる治療剤が必要とされている。本発明者らは、ヒトＲＴＥＬ１を標的とする１０００個を超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングし、ヒトＲＴＥＬ１を特異的に標的とするのに特に強力かつ有効な配列及び化合物を同定した。具体的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＲＴＥＬ１の強い下方制御を付与する４つのＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドを同定した。同定されたＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドは、ヒトＲＴＥＬ１プレｍＲＮＡのイントロン領域を標的とする。

【0008】

発明の目的
本発明は、ＲＴＥＬ１（「テロメア伸長ヘリカーゼ１の調節因子」）発現を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びそのコンジュゲートを提供する。本発明者らは、有効なＲＴＥＬ１阻害を与えるためにアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートによって標的化され得るヒトＲＴＥＬ１プレｍＲＮＡに存在するイントロン標的配列を同定した。例えば、配列番号１の位置８６８１～８７０１又は１１７５３～１１７７４を標的とすることは、ＲＴＥＬ１を減少させる点で有利である。したがって、本発明の目的は、ＲＴＥＬ１を標的とする増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートを提供することであり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＲＴＥＬ１の発現を阻害することができ、それによってＨＢＶ感染細胞においてｃｃｃＤＮＡを減少させることができる。ＲＴＥＬ１又はそのコンジュゲートを標的とする増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ感染症の処置に使用することができる。

【発明の概要】

【0009】

本発明は、ＲＴＥＬ１核酸に相補的であり、その発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲート、及び医薬におけるそれらの使用を提供する。

【0010】

本発明は、配列番号１のヌクレオチド８６８１～８７０１又はヌクレオチド１１７５３～１１７７４からの領域等のヒトＲＴＥＬ１プレｍＲＮＡ（配列番号１に示される）の領域に相補的である、例えば完全に相補的である連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

【0011】

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド８６８１～８７０１の領域に相補的である、例えば完全に相補的である。

【0012】

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド１１７５３～１１７７４からの領域、例えば配列番号１のヌクレオチド１１７５７～１１７７４、１１７５６～１１７７４又は１１７５３～１１７７０からの領域に相補的、例えば完全に相補的である。

【0013】

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には１２～２４ヌクレオチド長、例えば１２～２２、例えば１６～２２ヌクレオチド長であり、配列番号１のヌクレオチド８６８１～８７０１及び１１７５３～１１７７４から選択されるヒトＲＴＥＬ１プレｍＲＮＡ（配列番号１に示される）の領域に相補的である、例えば完全に相補的である少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。

【0014】

本発明は、１２～２２ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、１２～２２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、該連続ヌクレオチド配列が、配列番号７、８、９、及び／又は１０に相補的、例えば、完全に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

【0015】

本発明は、１２～２２ヌクレオチド長（例えば、１５、１６、１７、又は１８ヌクレオチド長）のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、１２～１８ヌクレオチド長（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチド長）の連続ヌクレオチド配列を含み、該連続ヌクレオチド配列が、配列番号１１に相補的、例えば、完全に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

【0016】

本発明は、１０～３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列が、配列番号３、４、５、及び６からなる群より選択される配列、又はその少なくとも１４個の連続ヌクレオチドと１００％同一であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

【0017】

本発明は、１０～３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列が、配列番号３、４、５、及び６からなる群より選択される配列、又はその少なくとも１５個の連続ヌクレオチドと１００％同一であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

【0018】

本発明は、１０～３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列が、配列番号３、４、５、及び６からなる群より選択される配列、又はその少なくとも１６個の連続ヌクレオチドと１００％同一であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

【0019】

本発明は、配列番号３、４、５、及び６からなる群から選択される配列、又はその１４個の連続ヌクレオチドと１００％同一である連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

【0020】

本発明は、配列番号３、４、５、及び６からなる群から選択される連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

【0021】

本発明は、配列番号３（ＡＡＴＴＴＴＡＣＡＴＡＣＴＣＴＧＧＴ）と１００％同一である連続ヌクレオチド配列、又はその少なくとも１４、１５、１６若しくは１７個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

【0022】

本発明は、配列番号４（ＡＡＴＴＴＴＡＣＡＴＡＣＴＣＴＧＧＴＣ）と１００％同一である連続ヌクレオチド配列、又はその少なくとも１４、１５、１６、１７若しくは１８個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

【0023】

本発明は、配列番号５（ＴＴＡＣＡＴＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＡＡ）と１００％同一である連続ヌクレオチド配列、又はその少なくとも１４、１５、１６若しくは１７個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

【0024】

本発明は、配列番号６（ＣＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＣＴＴＧＡＡＴＣＴＣ）と１００％同一である連続ヌクレオチド配列、又はその少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２１個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

【0025】

本発明は、化合物ＩＤ番号３＿１、４＿１、５＿１及び６＿１（例えば以下の表６を参照）からなる群から選択される化合物の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

【0026】

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開第２０２０／０１１９０２号Ａ１（例えば、国際公開第２０２０／０１１９０２号Ａ１の表６を参照さ）の化合物ＩＤ番号３６＿１、３５＿１．３３＿１、３４＿１及び３７＿１からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。

【0027】

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開第２０２０／０１１９０２号Ａ１（例えば、国際公開第２０２０／０１１９０２号Ａ１の表６を参照）のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物ＩＤ番号２３＿１ではない。

【0028】

本発明は、表１に列挙される群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

【0029】

本発明は、以下からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する：
ＡＡＴＴｔｔａｃａｔａｃｔｃｔｇＧＴ（配列番号３、化合物ＩＤ番号３＿１）、
ＡＡｔｔｔｔａｃａｔａｃｔｃｔＧＧＴＣ（配列番号４、化合物ＩＤ番号４＿１）、
ＴＴａｃａｔａｃｔｃｔｇｇｔＣＡＡＡ（配列番号５、化合物ＩＤ番号５＿１）、及び
ＣＴｔｔａｔｔａｔａａｃｔＴｇａＡｔＣＴＣ（配列番号６、化合物ＩＤ番号６＿１）、
大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、全てのＬＮＡ ＣはＬＮＡ５－メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0030】

本発明はまた、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容され得る塩を提供する。

【0031】

本発明は、表１に列挙される群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

【表1】

【0032】

Ｈｅｌｍアノテーションキー：
［ＬＲ］（Ｇ）は、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡグアニンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（Ｔ）は、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡチミンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（Ａ）は、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡアデニンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（［５ｍｅＣ］）は、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ５－メチルシトシンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ｇ）は、ＤＮＡグアニンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ｔ）は、ＤＮＡチミンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ａ）は、ＤＮＡアデニンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ｃ）はＤＮＡシトシンヌクレオシドであり、
［ｓＰ］は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、
Ｐは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合である。

【0033】

したがって、本発明は、化合物ＩＤ番号３＿１、４＿１、５＿１及び６＿１からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

【0034】

本発明は更に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、該アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲートを提供する。

【0035】

いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体等のアシアロ糖タンパク質受容体に結合することができる。例えば、コンジュゲート部分は、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－ホルミル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブタノイル－ガラクトサミン、及びＮ－イソブタノイルガラクサミンからなる群より選択される、少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分を含んでもよい。

【0036】

いくつかの実施形態では、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む少なくとも１つのコンジュゲート部分、例えば以下に記載される少なくとも１つのＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む少なくとも１つのコンジュゲート部分にコンジュゲートされ得る。本発明の一態様によれば、コンジュゲート部分は、本明細書中で以下に記載されるようなＧａｌＮＡｃ残基Ｒである。

【0037】

いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、少なくとも三価、例えば、二価、三価又は四価のＧａｌＮＡｃ残基Ｒである。好ましくは、コンジュゲート部分は三価ＧａｌＮＡｃ残基Ｒである。本明細書で使用される場合、「三価ＧａｌＮＡｃ残基」という用語は、３つのＮ－アセチルガラクトサミン部分、すなわち好ましくは以下の式の３つの部分を含む残基を指す。

【化1】

【0038】

コンジュゲート部分又はＧａｌＮＡｃ残基Ｒ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、生体切断可能なリンカーＬ等のリンカーＬを介して一緒に連結されていてもよい。したがって、コンジュゲート化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとコンジュゲート部分又はＧａｌＮＡｃ残基Ｒとの間にそれぞれ位置するリンカーＬを含んでもよい。

【0039】

一実施形態では、コンジュゲート部分は、図５に示すような三価のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。一実施形態では、コンジュゲート部分は、図５Ａ－１若しくは図５Ａ－２の三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、又はその両方の混合物である。一実施形態では、コンジュゲート部分は、図５Ｂ－１若しくは図５Ｂ－２の三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、又はその両方の混合物である。一実施形態では、コンジュゲート部分は、図５Ｃ－１若しくは図５Ｃ－２の三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、又はその両方の混合物である。一実施形態では、コンジュゲート部分は、図５Ｄ－１若しくは図５Ｄ－２の三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、又はその両方の混合物である。コンジュゲート部分及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、生物切断性リンカー等のリンカーを介して互いに連結され得る。したがって、コンジュゲート化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとコンジュゲート部分との間に位置するリンカーを含み得る。

【0040】

いくつかの実施形態では、リンカーは、１個～１０個の連結されたヌクレオシド、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個の連結されたヌクレオシド、例えば２個～６個の連結されたヌクレオシド、例えば２個～５個の連結されたヌクレオシド、例えば２個～４個の連結されたヌクレオシドを含むか、又はそれらからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは２つの連結されたヌクレオチドを含む。したがって、ヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり得る。典型的には、ヌクレオシドは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介して結合される。さらに、リンカーは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介してアンチセンス化合物に連結していてもよい。

【0041】

例示的なコンジュゲートを（ＨＥＬＭ注釈形式で）表２に提供する。表１に示す化合物に加えて、化合物は、５’末端に切断可能なリンカーとして２つのヌクレオチド「ｃａ」を含む。これは、表２の配列のＨＥＬＭ注釈の一部である。切断可能なリンカーは、ＧａｌＮＡｃ媒介送達の成功後に切断され、化合物を活性薬物として残す。

【0042】

本発明は、表２に列挙されるコンジュゲートの群から選択されるコンジュゲート又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

【0043】

【表2】

【0044】

上記の表において、５ｇｎ２ｃ６は、図５Ｄ－１又は図５Ｄ－２の三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、又は両方の混合物である。いくつかの実施形態では、５ｇｎ２ｃ６は、以下の式を有するＧａｌＮＡｃ残基Ｒである。

【化2】

【0045】

上記の図に示されるＲは、図５Ｄ１及び図５Ｄ２に示される２つの立体異性体の混合物であることが理解されるべきである。

【0046】

本発明の更なる態様によれば、上記の図に示されるＲは、図５Ｄ１に示される立体異性体である。

【0047】

本発明の更なる態様によれば、上記の図に示されるＲは、図５Ｄ２に示される立体異性体である。表２に提供されるコンジュゲートの構造を図１～４に示す。

【0048】

本発明は、図１のコンジュゲート又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。本発明は、化合物番号３＿１のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

【0049】

本発明は、図２のコンジュゲート又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。本発明は、化合物番号４＿１のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

【0050】

本発明は、図３のコンジュゲート又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。本発明は、化合物番号６＿１のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

【0051】

本発明は、図４のコンジュゲート又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。本発明は、化合物番号５＿１のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。
式（Ｉ）の化合物

【0052】

本発明はまた、以下の式（Ｉ）の化合物を提供する。

【化3】

式中、
ｎは０又は１であり
ｐは０又は１であり
ただし、ｎが１である場合、ｐは好ましくは１であり、
かつ、ｎが０でありｐが０である場合、Ｒは好ましくはＨであり、
Ｌはリンカーであり、好ましくはＬは、２～１０個のヌクレオシド、例えば２～５個のヌクレオシドを含むか又はそれからなるリンカーであり、
ＲはＧａｌＮＡｃ残基、好ましくは三価のＧａｌＮＡｃ残基であり、
Ａは、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド残基である。

【0053】

「アンチセンスオリゴヌクレオチド残基」という用語は、その５’末端を介して－（Ｌ）_ｎ－（Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＨ）－）_ｐ－を介して残基Ｒに結合している本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば表６に示すアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチド残基を図１Ａ、図２Ａ、図３Ａ、図４Ａ、図５Ａ、図６Ａ、図７Ａ及び図８Ａに示す。
ＧａｌＮＡｃ残基Ｒ

【0054】

ＲはＧａｌＮＡｃ残基、好ましくは三価のＧａｌＮＡｃ残基である。本明細書で使用される場合、「ＧａｌＮＡｃ残基」という用語は、少なくとも１つのＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分、すなわち以下の式の少なくとも１つの部分を含む残基を指す。

【化4】

【0055】

本明細書で使用される場合、「三価ＧａｌＮＡｃ残基」という用語は、３つのＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分、すなわち好ましくは以下の式の３つの部分を含む残基を指す。

【化5】

【0056】

好ましくは、ＧａｌＮＡｃ残基は、以下の構造を有する少なくとも１つ、好ましくは３つのＧａｌＮＡｃ構成単位（Ｌ^ａ）を含み、

【化6】

式中、リンカー^ａは、アルキル基、アルキル－オキシ－アルキル基、少なくとも１つのホスホジエステル結合を含むアルキル基、少なくとも１つのアミド結合を含むアルキル基、少なくとも１つのホスホジエステル結合を含むアルキル－オキシ－アルキル基、及び少なくとも１つのアミド結合を含むアルキル－オキシ－アルキル基から選択される。

【0057】

「アルキル」という用語は、置換又は非置換の直鎖又は分岐のアルキル基、例えばＣ１～Ｃ２０アルキル基、好ましくはＣ２～Ｃ８、例えばＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７又はＣ８アルキル基を指す。好ましくは、アルキル基は、非置換、より好ましくは直鎖及び非置換のアルキル基である。

【0058】

「アルキルオキシアルキル」基という用語は、酸素を介して連結された少なくとも２つのアルキル基、好ましくはエチル－オキシ－エチル基、例えば－（ＣＨ_２－Ｏ）_ｘ－基を指し、整数ｘは、好ましくは２～２０の範囲、より好ましくは２～６の範囲、例えば２、３、４、５又は６であり、より好ましくはｘは３又は５である。

【0059】

本発明の一態様によれば、ＧａｌＮＡｃ構成単位（Ｌ^ａ）は、以下の構造（Ｌ^ａ）の群から選択される。

【0060】

３価のＧａｌＮＡｃ残基中の３つの残基等、１つよりも多くの残基（Ｌ^ａ）がＧａｌＮＡｃ残基中に存在する場合、全ての残基が同じであることが好ましい。

【0061】

最も好ましくは、Ｌ^ａは、以下の構造を有する。

【化7】

【0062】

コンジュゲート部分Ｒが複数、例えば好ましくは３個のＧａｌＮＡｃ部分を含む場合、Ｒは、ＧａｌＮＡｃ構成単位（Ｌ^ａ）の他に、好ましくは構成単位（Ｌ^ａ）が－（Ｌ）_ｎ－（Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＨ）－）_ｐ－を介してアンチセンスオリゴヌクレオチド残基Ａに結合している、多価、好ましくは四価の構成単位（Ｌ^ｂ）を含む。

【0063】

Ｌ^ｂは、好ましくは以下の構造の１つから選択される。

【化8】

【0064】

式中、ＸはＯ又はＳであり、ＺはＯ又はＮＨであり、ｎは１～４、好ましくは２又は３、より好ましくは２である。

【0065】

より好ましくは、Ｌ^ｂは、以下の構造を有する。

【化9】

Ｌ^ｂは、構造Ｌ^ｂ＊又は構造Ｌ^ｂ＊＊のいずれかを有するか、又はそれらの混合物であることを理解されたい。好ましい態様によれば、Ｌ^ｂは、Ｌ^ｂ＊とＬ^ｂ＊＊の混合物である。

【化10】

【0066】

したがって、コンジュゲート部分Ｒは、好ましくは構造（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂ－を含み、より好ましくはＲは以下の構造のうちの１つを含み、

【化11】

より好ましくは、以下の構造を含む。

【化12】

【0067】

式中、Ｌ^ｂは、好ましくはＬ^ｂ＊とＬ^ｂ＊＊の混合物であり、
ＸはＯ又はＳであり、ＺはＯ又はＮＨであり、ｎは１～３、好ましくは２であり、Ｌ^ａは上記の通りであり、好ましくはＬ^ａは以下

【化13】

及びそれらの混合物からなる群から選択され、好ましくは、ＧａｌＮＡｃ残基内の全ての残基（Ｌ^ａ）は同じである。

【0068】

（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂが以下である場合、

【化14】

Ｌ^ａは、より好ましくは、以下からなる群から選択される。

【0069】

【化15】

（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂが以下である場合、

【化16】

好ましくは、

【化17】

Ｌ^ａは、好ましくは以下である。

【化18】

【0070】

任意に、コンジュゲート部分ＲはリンカーＬ^ｃを更に含む。したがって、Ｒは、好ましくは構造（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂ－（Ｌ^ｃ）_ｃ－を有し、整数ｃは１又は０である。

【0071】

このようなリンカー化合物は当業者に公知であり、化合物の残りの部分、アンチセンスオリゴヌクレオチド残基に、すなわち－（Ｌ）_ｎ－（Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＨ）－）_ｐ－を介して（Ｌ^ａ）_３－Ｌ_ｂを結合させるように適切に選択される。

【0072】

Ｌ^ｂの構造に応じて、Ｌ^ｃは、アルキル、アルキル－オキシ－アルキル、アミノ－アルキル（－ＮＨ－アルキル－）、アミノ－アルキル－オキシ－アルキル、非天然アミノ酸残基、及び天然アミノ酸残基からなる群から選択される。本発明の一態様によれば、Ｌ^ｃは、置換又は非置換リジン基である。

【0073】

本発明の一態様によれば、Ｒは（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂ－（Ｌ^ｃ）_ｃであり、ｃ＝１であり（Ｌ^ａ）_３－Ｌ_ｂは以下である。

【化19】

【0074】

Ｌ^ｃは、好ましくはアミノ－アルキル基、又は置換若しくは非置換リジン基等のアミノ酸であり、特にＬ^Ｃは、例えば、以下からなる群から選択され、

【化20】

アミノ基がＬ^ｂのカルボニル基に結合して、それによりアミド結合を形成する。この態様による好ましい残基Ｒを図５Ａ１、図５Ａ２、図５Ｃ１、図５Ｃ２、図５Ｄ１、図５Ｄ２に示す。したがって、本発明の一態様によれば、Ｒは、図５Ａ１、図５Ａ２；図５Ｃ１、図５Ｃ２、図５Ｄ１、及び図５Ｄ２に示される残基からなる群から選択される。

【0075】

本発明の更なる態様によれば、Ｒは、構造（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂ－（Ｌ^ｃ）_ｃを有し、ｃは０であり、（Ｌ^ａ）_３－Ｌ_ｂは以下である。

【化21】

【0076】

本発明のこの態様による好ましい残基Ｒを図５Ｂ１及び図５Ｂ２に示す。

【0077】

本発明の更なる態様によれば、Ｒは、構造（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂ－（Ｌ^ｃ）_ｃを有し、（Ｌ ^ａ ）_３－Ｌ_ｂは以下であり、

【化22】

ＺはＯである。この場合、ｃは好ましくは１であり、Ｌ^ｃは好ましくはアルキル基、より好ましくはＣ３～Ｃ６アルキル基、より好ましくはプロピル基、最も好ましくはｎ－プロピル基である。この態様による好ましい残基Ｒを図５Ｅ１、図５Ｆ１、図５Ｇ１及び図５Ｈ１に示す。したがって、本発明の一態様によれば、Ｒは、図５Ｅ１、図５Ｆ１、図５Ｇ１及び図５Ｈ１に示される残基からなる群から選択される。

【0078】

本発明の更なる態様によれば、Ｒは、構造（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂ－（Ｌ^ｃ）_ｃを有し、（Ｌ ^ａ ）_３－Ｌ_ｂは以下であり、

【化23】

ＺはＮＨである。この場合、ｃは好ましくは１であり、Ｌ^ｃは好ましくはアルキル基、アミノ酸含有基、又は以下の構造を有する基である。

【化24】

【0079】

特に、この場合、Ｌ^ｃは以下である。

【化25】

【0080】

本発明のこの態様による好ましい残基Ｒを図５Ｊ１に示す。
本発明の更なる態様によれば、Ｒは、構造（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂ－（Ｌ^ｃ）_ｃを有し、（Ｌ ^ａ ）_３－Ｌ_ｂは以下であり、

【化26】

ＺはＮＨであり、ｃは０である。本発明のこの態様による好ましい残基Ｒを図５Ｉ１に示す。

【0081】

本発明の一態様によれば、Ｒは、（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂ－（Ｌ^ｃ）_ｃであり、ｃ＝０であり、（Ｌ^ａ）_３－Ｌ_ｂは以下である。

【化27】

【0082】

本発明のこの態様による好ましい残基Ｒを図５Ｌ１及び図５Ｌ２に示す。

【0083】

したがって、Ｒは、好ましくは、図５Ａ１、５Ａ２；５Ｂ１、５Ｂ２、５Ｃ１、５Ｃ２、５Ｄ１、５Ｄ２、５Ｅ１、５Ｆ１、５Ｇ１、５Ｈ１、５Ｉ１、５Ｊ１、５Ｌ１ ５Ｌ２に示される残基及びそれらの混合物、例えば５Ａ１及び５Ａ２；５Ｂ１及び５Ｂ２、５Ｃ１及び５Ｃ２又は５Ｄ１及びＤ２の立体異性体混合物から選択され、より好ましくはＲは、５Ｄ１、５Ｄ２に示される残基及びそれらの混合物から選択され、より好ましくはＲは、５Ｄ１及び５Ｄ２に示される残基の混合物、例えば１０：９０～９０：１０の範囲、例えば３０：７０～７０：３０の範囲、例えば４５：５５～５５：４５の範囲の５Ｄ１対５Ｄ２のモル比を有する混合物である。

【0084】

したがって、化合物（Ｉ）は、好ましくは、図６Ａ１、図６Ａ２、６Ｂ１、６Ｂ２、６Ｃ１、６Ｃ２、６Ｄ１、６Ｄ２、６Ｅ１、６Ｆ１、６Ｇ１、６Ｈ１、６Ｉ１、６Ｊ１、６Ｌ１、６Ｌ２に示される化合物及びそれらの混合物、例えば６Ａ１及び６Ａ２；６Ｂ１及び６Ｂ２、６Ｃ１及び６Ｃ２又は６Ｄ１及び６Ｄ２の立体異性体混合物、より好ましくは化合物（Ｉ）は、６Ｄ１、６Ｄ２に示される化合物及びそれらの混合物からなる群から選択され、より好ましくは化合物（Ｉ）は、６Ｄ１及び６Ｄ２に示される化合物の混合物、例えば１０：９０～９０：１０の範囲、例えば３０：７０～７０：３０の範囲、例えば４５：５５～５５：４５の範囲の６Ｄ１対６Ｄ２のモル比を有する混合物である。

【0085】

リンカーＬ
上記式において、Ｌは、本明細書で定義されるリンカーであり、好ましくは、Ｌは、２～１０個のヌクレオシド、例えば２～５個のヌクレオシド、例えば２個のヌクレオシドを含むか、又はそれらからなるリンカーであり、任意に、ヌクレオシドはホスホジエステル結合ヌクレオシドである。

【0086】

リンカーＬは、１個～１０個の連結されたヌクレオシド、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個の連結されたヌクレオシド、例えば２個～６個の連結されたヌクレオシド、例えば２個～５個の連結されたヌクレオシド、例えば２個～４個の連結されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは２つの連結されたヌクレオチドを含む。したがって、ヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり得る。典型的には、ヌクレオシドは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介して連結される。さらに、リンカーＬは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介してアンチセンス化合物に連結されていてもよい。さらに、リンカーＬは、適切な官能基を介して、例えば、アミド、アミン、エーテル、エステル、ホスホジエステル（－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＨ）－Ｏ－）又はチオホスホジエステル（－Ｏ－Ｐ（＝Ｓ）（－ＯＨ）－Ｏ－）結合を介して、コンジュゲート部分Ｒに連結している。Ｌは、ヌクレオシドとＬをＲに連結する官能基との間にアルキル基又はアルキル－オキシ－アルキル基を任意に更に含んでもよいことが理解されるべきである。この場合では、ヌクレオシドは、好ましくは、ホスホジエステル結合を介してアルキル基又はアルキル－オキシ－アルキル基に連結され、これが、例えばアミド、アミン、エーテル、エステル、ホスホジエステル（－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＨ）－Ｏ－）又はチオホスホジエステル（－Ｏ－Ｐ（＝Ｓ）（－ＯＨ）－Ｏ－）結合を介して等、適切な官能基を介してＲに連結される。

【0087】

好ましい実施形態によれば、Ｌは以下である。

【化28】

【0088】

アンチセンス（Ａ）オリゴヌクレオチド残基
Ａは、その５’末端を介してＲに－（Ｌ）_ｎ－（Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＨ）－）_ｐを介して結合している、表６に示すアンチセンスオリゴヌクレオチド等の本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド残基である。好ましくは、Ａは、図１Ａ、図２Ａ、図３Ａ及び図４に示される残基から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド残基である。

【0089】

したがって、化合物（Ｉ）は、好ましくは、図 ６Ａ１、６Ａ２；６Ｂ１、６Ｂ２、６Ｃ１、６Ｃ２、６Ｄ１、６Ｄ２、６Ｅ１、６Ｆ１、６Ｇ１、６Ｈ１、６Ｉ１、６Ｊ１、６Ｌ１ ６Ｌ２に示される化合物、及びそれらの混合物、例えば６Ａ１及び６Ａ２；６Ｂ１及び６Ｂ２、６Ｃ１及び６Ｃ２又は６Ｄ１及び６Ｄ２の立体異性体混合物から選択され、より好ましくは化合物（Ｉ）は、６Ｄ１及び６Ｄ２に示される化合物及びそれらの混合物から選択され、より好ましくは化合物（Ｉ）は、化合物６Ｄ１及び６Ｄ２の混合物であり、好ましくはＡは、表６に示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択され、好ましくはＡは、図１Ａ、２Ａ ３Ａ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ及び８Ａに示される残基から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド残基であり、Ｌは２～１０個のヌクレオシド、例えば２～５個のヌクレオシド、例えば２個のヌクレオシドを含むか又はそれらからなるリンカーであり、任意に、ヌクレオシドはホスホジエステル結合ヌクレオシドであり、より好ましくは、Ｌは以下である。

【化29】

【0090】

更なる態様では、Ｒは、構造（Ｉ）を有する残基であり、

【化30】

【0091】

Ｌは、本明細書で定義されるリンカーであり、好ましくは、Ｌは、２～１０個のヌクレオシド、例えば２～５個のヌクレオシド、例えば２個のヌクレオシドを含むか、又はそれらからなるリンカーであり、任意に、ヌクレオシドはホスホジエステル結合ヌクレオシドであり、より好ましくは、Ｌは以下である。

【化31】

及び
Ａは、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば表６に示すアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

【0092】

本発明の一態様によれば、Ａは、図１Ａ、図２Ａ、図３Ａ及び図４Ａに示される残基から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド残基であり、
例えば、Ａは、以下の式のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

【化32】

【0093】

本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートと、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩、及び／又はアジュバントとを含む、医薬組成物を提供する。

【0094】

本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容され得る塩は、ナトリウム塩、カリウム塩及びアンモニウム塩からなる群から選択される。

【0095】

本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートと、生理食塩水等の薬学的に許容され得る溶媒とを含む、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの薬学的溶液を提供する。

【0096】

本発明は、凍結乾燥粉末の形態等の固体粉末形態の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートを提供する。

【0097】

本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩を提供する。

【0098】

本発明は、薬学的に許容され得る塩がナトリウム塩又はカリウム塩である、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容され得る塩又は本発明のコンジュゲートを提供する。

【0099】

本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲート又は本発明の塩と、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又はアジュバントとを含む、医薬組成物を提供する。

【0100】

本発明は、ＲＴＥＬ１を発現している標的細胞におけるＲＴＥＬ１発現を阻害するための方法であって、該細胞に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の塩、又は本発明の組成物を有効量で投与することを含む、方法を提供する。本方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ法又はｉｎ ｖｉｔｒｏ法であり得る。

【0101】

本発明は、ヒト等の対象におけるＨＢＶ感染症を処置及び／又は予防するための方法であって、治療有効量又は予防有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の塩、又は本発明の組成物を投与して、ＨＢＶ感染症、例えば慢性ＨＢＶ感染症を、例えば処置及び／又は予防することを含む、方法を提供する。

【0102】

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の塩、又は本発明の医薬組成物は、ＨＢＶ感染、例えば慢性ＨＢＶ感染症の処置及び／又は予防に使用するためのものである。

【0103】

本発明は、薬に使用するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の医薬組成物、又は本発明の塩を提供する。

【0104】

更なる態様では、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲートを有効量で細胞に投与することによって、ＲＴＥＬ１を発現している標的細胞におけるＲＴＥＬ１発現を阻害する方法を提供する。更なる態様では、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートを有効量で細胞に投与することによって、ＲＴＥＬ１を発現している標的細胞におけるＲＴＥＬ１発現を阻害するためのｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの方法のための方法を提供する。細胞は、ヒト細胞、例えば肝臓細胞、例えば肝細胞であってよい。

【0105】

更なる態様では、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲートを有効量で細胞に投与することによって、ＨＢＶ感染細胞におけるｃｃｃＤＮＡを減少させる方法を提供する。更なる態様では、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲートを有効量で細胞に投与することによって、ＨＢＶ感染細胞におけるｃｃｃＤＮＡを減少させるためのｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの方法のための方法を提供する。

【0106】

更なる態様では、本発明は、慢性ＨＢＶ感染症等のＨＢＶ感染症を処置及び／又は予防する方法を提供する。

【0107】

更なる態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の医薬組成物は、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ等のウイルス性肝感染症、又はマラリア、トキソプラズマ症、リーシュマニア症及びトリパノソーマ症等の寄生虫感染症、又は肝臓癌若しくは肝臓における転移の処置及び／又は予防に使用される。

【0108】

更なる態様では、本発明は、ＨＢＶ感染症、例えば慢性ＨＢＶ感染症を処置及び／又は予防するための医薬品の製造に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の医薬組成物を提供する。

【0109】

更なる態様では、本発明は、抗ウイルス薬の製造に使用するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはコンジュゲート、又は本発明の医薬組成物を提供する。

【0110】

本発明は、ＨＢＶ感染症、例えば慢性ＨＢＶ感染症の処置に使用するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の医薬組成物を提供する。
配列表

【0111】

本出願と共に提出された配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。配列表と明細書又は図面との間に不一致がある場合、明細書（図面を含む）に開示された情報は正しいと見なされる。

【図面の簡単な説明】

【0112】

【図1-1】ホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを介して三価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートした化合物３＿１（配列番号３）

【図1-2】図１Ａ 化合物３＿１の残基Ａ（配列番号３）

【図2-1】ホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを介して三価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートした化合物４＿１（配列番号４）

【図2-2】図２Ａ 化合物４＿１の残基Ａ（配列番号４）

【図3-1】ホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを介して三価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートした化合物６＿１（配列番号６）

【図3-2】図３Ａ 化合物６＿１の残基Ａ（配列番号６）

【図4-1】ホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを介して三価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートした化合物５＿１（配列番号５）

【図4-2】図４Ａ 化合物５＿１の残基Ａ（配列番号５）

【図5-1】図５は、例示的なＧａｌＮＡｃ部分を示す。図５Ｌの化合物は、合成の一部として依然として固体支持体上にある間にオリゴヌクレオチドに添加された単量体ＧａｌＮＡｃホスホラミダイトから構成され、ＸはＳ又はＯであり、ＹはＳ又はＯであり、ｎ＝１～３である（国際公開第２０１７／１７８６５６号を参照）。図５Ｂと図５Ｄは、本明細書ではＧａｌＮＡｃ２又はＧＮ２とも呼ばれ、それぞれ、Ｃ６リンカーを有さないものと、有するものである。

【図5-2】図５は、例示的なＧａｌＮＡｃ部分を示す。図５Ｌの化合物は、合成の一部として依然として固体支持体上にある間にオリゴヌクレオチドに添加された単量体ＧａｌＮＡｃホスホラミダイトから構成され、ＸはＳ又はＯであり、ＹはＳ又はＯであり、ｎ＝１～３である（国際公開第２０１７／１７８６５６号を参照）。図５Ｂと図５Ｄは、本明細書ではＧａｌＮＡｃ２又はＧＮ２とも呼ばれ、それぞれ、Ｃ６リンカーを有さないものと、有するものである。

【図5-3】図５は、例示的なＧａｌＮＡｃ部分を示す。図５Ｌの化合物は、合成の一部として依然として固体支持体上にある間にオリゴヌクレオチドに添加された単量体ＧａｌＮＡｃホスホラミダイトから構成され、ＸはＳ又はＯであり、ＹはＳ又はＯであり、ｎ＝１～３である（国際公開第２０１７／１７８６５６号を参照）。図５Ｂと図５Ｄは、本明細書ではＧａｌＮＡｃ２又はＧＮ２とも呼ばれ、それぞれ、Ｃ６リンカーを有さないものと、有するものである。

【図5-4】図５は、例示的なＧａｌＮＡｃ部分を示す。図５Ｌの化合物は、合成の一部として依然として固体支持体上にある間にオリゴヌクレオチドに添加された単量体ＧａｌＮＡｃホスホラミダイトから構成され、ＸはＳ又はＯであり、ＹはＳ又はＯであり、ｎ＝１～３である（国際公開第２０１７／１７８６５６号を参照）。図５Ｂと図５Ｄは、本明細書ではＧａｌＮＡｃ２又はＧＮ２とも呼ばれ、それぞれ、Ｃ６リンカーを有さないものと、有するものである。

【図5-5】図５は、例示的なＧａｌＮＡｃ部分を示す。図５Ｌの化合物は、合成の一部として依然として固体支持体上にある間にオリゴヌクレオチドに添加された単量体ＧａｌＮＡｃホスホラミダイトから構成され、ＸはＳ又はＯであり、ＹはＳ又はＯであり、ｎ＝１～３である（国際公開第２０１７／１７８６５６号を参照）。図５Ｂと図５Ｄは、本明細書ではＧａｌＮＡｃ２又はＧＮ２とも呼ばれ、それぞれ、Ｃ６リンカーを有さないものと、有するものである。

【図5-6】図５は、例示的なＧａｌＮＡｃ部分を示す。図５Ｌの化合物は、合成の一部として依然として固体支持体上にある間にオリゴヌクレオチドに添加された単量体ＧａｌＮＡｃホスホラミダイトから構成され、ＸはＳ又はＯであり、ＹはＳ又はＯであり、ｎ＝１～３である（国際公開第２０１７／１７８６５６号を参照）。図５Ｂと図５Ｄは、本明細書ではＧａｌＮＡｃ２又はＧＮ２とも呼ばれ、それぞれ、Ｃ６リンカーを有さないものと、有するものである。

【図5-7】図５は、例示的なＧａｌＮＡｃ部分を示す。図５Ｌの化合物は、合成の一部として依然として固体支持体上にある間にオリゴヌクレオチドに添加された単量体ＧａｌＮＡｃホスホラミダイトから構成され、ＸはＳ又はＯであり、ＹはＳ又はＯであり、ｎ＝１～３である（国際公開第２０１７／１７８６５６号を参照）。図５Ｂと図５Ｄは、本明細書ではＧａｌＮＡｃ２又はＧＮ２とも呼ばれ、それぞれ、Ｃ６リンカーを有さないものと、有するものである。

【図5-8】図５は、例示的なＧａｌＮＡｃ部分を示す。図５Ｌの化合物は、合成の一部として依然として固体支持体上にある間にオリゴヌクレオチドに添加された単量体ＧａｌＮＡｃホスホラミダイトから構成され、ＸはＳ又はＯであり、ＹはＳ又はＯであり、ｎ＝１～３である（国際公開第２０１７／１７８６５６号を参照）。図５Ｂと図５Ｄは、本明細書ではＧａｌＮＡｃ２又はＧＮ２とも呼ばれ、それぞれ、Ｃ６リンカーを有さないものと、有するものである。

【図6-1】図６Ａ～図６Ｌ：オリゴヌクレオチドが上記の「Ａ」という用語で表される、例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを示す。図６Ａ～Ｄにおける化合物は、ジリジンブランチャー（ｂｒａｎｃｈｅｒ）分子、ＰＥＧ３スペーサー、及び３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図６Ａ（図６Ａ－１及び図６Ａ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）及び図６Ｂ（図６Ｂ－１及び図６Ｂ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）の化合物では、オリゴヌクレオチドはアルキルリンカーなしでアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に直接結合している。図６Ｃ（図６Ｃ－１及び図６Ｃ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）及び図６Ｄ（図６Ｄ－１及び図６Ｄ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）の化合物では、オリゴヌクレオチドはＣ６リンカーを介してアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に結合している。図６Ｅ～Ｊの化合物は、種々の長さ及び構造の市販のトレブラー（ｔｒｅｂｌｅｒ）ブランチャー分子及びスペーサー、並びに３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図６Ｌ１及び６Ｌ２の化合物は、合成の一部として依然として固体支持体上にある間にオリゴヌクレオチドに添加された単量体ＧａｌＮＡｃホスホラミダイトから構成され、Ｘ＝Ｓ又はＯであり、独立してＹ＝Ｓ又はＯであり、ｎ＝１～３である（国際公開第２０１７／１７８６５６号を参照）。

【図6-2】図６Ａ～図６Ｌ：オリゴヌクレオチドが上記の「Ａ」という用語で表される、例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを示す。図６Ａ～Ｄにおける化合物は、ジリジンブランチャー（ｂｒａｎｃｈｅｒ）分子、ＰＥＧ３スペーサー、及び３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図６Ａ（図６Ａ－１及び図６Ａ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）及び図６Ｂ（図６Ｂ－１及び図６Ｂ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）の化合物では、オリゴヌクレオチドはアルキルリンカーなしでアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に直接結合している。図６Ｃ（図６Ｃ－１及び図６Ｃ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）及び図６Ｄ（図６Ｄ－１及び図６Ｄ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）の化合物では、オリゴヌクレオチドはＣ６リンカーを介してアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に結合している。図６Ｅ～Ｊの化合物は、種々の長さ及び構造の市販のトレブラー（ｔｒｅｂｌｅｒ）ブランチャー分子及びスペーサー、並びに３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図６Ｌ１及び６Ｌ２の化合物は、合成の一部として依然として固体支持体上にある間にオリゴヌクレオチドに添加された単量体ＧａｌＮＡｃホスホラミダイトから構成され、Ｘ＝Ｓ又はＯであり、独立してＹ＝Ｓ又はＯであり、ｎ＝１～３である（国際公開第２０１７／１７８６５６号を参照）。

【図6-3】図６Ａ～図６Ｌ：オリゴヌクレオチドが上記の「Ａ」という用語で表される、例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを示す。図６Ａ～Ｄにおける化合物は、ジリジンブランチャー（ｂｒａｎｃｈｅｒ）分子、ＰＥＧ３スペーサー、及び３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図６Ａ（図６Ａ－１及び図６Ａ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）及び図６Ｂ（図６Ｂ－１及び図６Ｂ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）の化合物では、オリゴヌクレオチドはアルキルリンカーなしでアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に直接結合している。図６Ｃ（図６Ｃ－１及び図６Ｃ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）及び図６Ｄ（図６Ｄ－１及び図６Ｄ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）の化合物では、オリゴヌクレオチドはＣ６リンカーを介してアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に結合している。図６Ｅ～Ｊの化合物は、種々の長さ及び構造の市販のトレブラー（ｔｒｅｂｌｅｒ）ブランチャー分子及びスペーサー、並びに３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図６Ｌ１及び６Ｌ２の化合物は、合成の一部として依然として固体支持体上にある間にオリゴヌクレオチドに添加された単量体ＧａｌＮＡｃホスホラミダイトから構成され、Ｘ＝Ｓ又はＯであり、独立してＹ＝Ｓ又はＯであり、ｎ＝１～３である（国際公開第２０１７／１７８６５６号を参照）。

【図6-4】図６Ａ～図６Ｌ：オリゴヌクレオチドが上記の「Ａ」という用語で表される、例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを示す。図６Ａ～Ｄにおける化合物は、ジリジンブランチャー（ｂｒａｎｃｈｅｒ）分子、ＰＥＧ３スペーサー、及び３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図６Ａ（図６Ａ－１及び図６Ａ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）及び図６Ｂ（図６Ｂ－１及び図６Ｂ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）の化合物では、オリゴヌクレオチドはアルキルリンカーなしでアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に直接結合している。図６Ｃ（図６Ｃ－１及び図６Ｃ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）及び図６Ｄ（図６Ｄ－１及び図６Ｄ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）の化合物では、オリゴヌクレオチドはＣ６リンカーを介してアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に結合している。図６Ｅ～Ｊの化合物は、種々の長さ及び構造の市販のトレブラー（ｔｒｅｂｌｅｒ）ブランチャー分子及びスペーサー、並びに３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図６Ｌ１及び６Ｌ２の化合物は、合成の一部として依然として固体支持体上にある間にオリゴヌクレオチドに添加された単量体ＧａｌＮＡｃホスホラミダイトから構成され、Ｘ＝Ｓ又はＯであり、独立してＹ＝Ｓ又はＯであり、ｎ＝１～３である（国際公開第２０１７／１７８６５６号を参照）。

【図6-5】図６Ａ～図６Ｌ：オリゴヌクレオチドが上記の「Ａ」という用語で表される、例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを示す。図６Ａ～Ｄにおける化合物は、ジリジンブランチャー（ｂｒａｎｃｈｅｒ）分子、ＰＥＧ３スペーサー、及び３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図６Ａ（図６Ａ－１及び図６Ａ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）及び図６Ｂ（図６Ｂ－１及び図６Ｂ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）の化合物では、オリゴヌクレオチドはアルキルリンカーなしでアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に直接結合している。図６Ｃ（図６Ｃ－１及び図６Ｃ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）及び図６Ｄ（図６Ｄ－１及び図６Ｄ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）の化合物では、オリゴヌクレオチドはＣ６リンカーを介してアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に結合している。図６Ｅ～Ｊの化合物は、種々の長さ及び構造の市販のトレブラー（ｔｒｅｂｌｅｒ）ブランチャー分子及びスペーサー、並びに３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図６Ｌ１及び６Ｌ２の化合物は、合成の一部として依然として固体支持体上にある間にオリゴヌクレオチドに添加された単量体ＧａｌＮＡｃホスホラミダイトから構成され、Ｘ＝Ｓ又はＯであり、独立してＹ＝Ｓ又はＯであり、ｎ＝１～３である（国際公開第２０１７／１７８６５６号を参照）。

【図6-6】図６Ａ～図６Ｌ：オリゴヌクレオチドが上記の「Ａ」という用語で表される、例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを示す。図６Ａ～Ｄにおける化合物は、ジリジンブランチャー（ｂｒａｎｃｈｅｒ）分子、ＰＥＧ３スペーサー、及び３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図６Ａ（図６Ａ－１及び図６Ａ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）及び図６Ｂ（図６Ｂ－１及び図６Ｂ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）の化合物では、オリゴヌクレオチドはアルキルリンカーなしでアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に直接結合している。図６Ｃ（図６Ｃ－１及び図６Ｃ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）及び図６Ｄ（図６Ｄ－１及び図６Ｄ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）の化合物では、オリゴヌクレオチドはＣ６リンカーを介してアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に結合している。図６Ｅ～Ｊの化合物は、種々の長さ及び構造の市販のトレブラー（ｔｒｅｂｌｅｒ）ブランチャー分子及びスペーサー、並びに３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図６Ｌ１及び６Ｌ２の化合物は、合成の一部として依然として固体支持体上にある間にオリゴヌクレオチドに添加された単量体ＧａｌＮＡｃホスホラミダイトから構成され、Ｘ＝Ｓ又はＯであり、独立してＹ＝Ｓ又はＯであり、ｎ＝１～３である（国際公開第２０１７／１７８６５６号を参照）。

【図6-7】図６Ａ～図６Ｌ：オリゴヌクレオチドが上記の「Ａ」という用語で表される、例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを示す。図６Ａ～Ｄにおける化合物は、ジリジンブランチャー（ｂｒａｎｃｈｅｒ）分子、ＰＥＧ３スペーサー、及び３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図６Ａ（図６Ａ－１及び図６Ａ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）及び図６Ｂ（図６Ｂ－１及び図６Ｂ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）の化合物では、オリゴヌクレオチドはアルキルリンカーなしでアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に直接結合している。図６Ｃ（図６Ｃ－１及び図６Ｃ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）及び図６Ｄ（図６Ｄ－１及び図６Ｄ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）の化合物では、オリゴヌクレオチドはＣ６リンカーを介してアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に結合している。図６Ｅ～Ｊの化合物は、種々の長さ及び構造の市販のトレブラー（ｔｒｅｂｌｅｒ）ブランチャー分子及びスペーサー、並びに３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図６Ｌ１及び６Ｌ２の化合物は、合成の一部として依然として固体支持体上にある間にオリゴヌクレオチドに添加された単量体ＧａｌＮＡｃホスホラミダイトから構成され、Ｘ＝Ｓ又はＯであり、独立してＹ＝Ｓ又はＯであり、ｎ＝１～３である（国際公開第２０１７／１７８６５６号を参照）。

【図6-8】図６Ａ～図６Ｌ：オリゴヌクレオチドが上記の「Ａ」という用語で表される、例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを示す。図６Ａ～Ｄにおける化合物は、ジリジンブランチャー（ｂｒａｎｃｈｅｒ）分子、ＰＥＧ３スペーサー、及び３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図６Ａ（図６Ａ－１及び図６Ａ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）及び図６Ｂ（図６Ｂ－１及び図６Ｂ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）の化合物では、オリゴヌクレオチドはアルキルリンカーなしでアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に直接結合している。図６Ｃ（図６Ｃ－１及び図６Ｃ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）及び図６Ｄ（図６Ｄ－１及び図６Ｄ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）の化合物では、オリゴヌクレオチドはＣ６リンカーを介してアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に結合している。図６Ｅ～Ｊの化合物は、種々の長さ及び構造の市販のトレブラー（ｔｒｅｂｌｅｒ）ブランチャー分子及びスペーサー、並びに３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図６Ｌ１及び６Ｌ２の化合物は、合成の一部として依然として固体支持体上にある間にオリゴヌクレオチドに添加された単量体ＧａｌＮＡｃホスホラミダイトから構成され、Ｘ＝Ｓ又はＯであり、独立してＹ＝Ｓ又はＯであり、ｎ＝１～３である（国際公開第２０１７／１７８６５６号を参照）。

【図7】ヒト細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１における濃度依存的な効力及び有効性について、オリゴヌクレオチドＣＭＰ ＩＤ番号３＿１、４＿１、５＿１及び６＿１をｉｎ ｖｉｔｒｏ で試験する。

【図8】ヒト細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１における濃度依存的な効力及び有効性について、オリゴヌクレオチドＣＭＰ ＩＤ番号３＿１、４＿１、５＿１及び６＿１並びに先行技術の化合物（ＣＭＰ ＩＤ番号７＿１～２３＿１）をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験する。

【図9-1】ヒト細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１における濃度依存的な効力及び有効性について、オリゴヌクレオチドアンチセンス分子及びそのより短い代謝産物をｉｎ ｖｉｔｒｏ で試験する。Ａ）ＣＭＰ ＩＤ ５＿１、Ｂ）ＣＭＰ ＩＤ ７＿１、Ｃ）ＣＭＰ ＩＤ ８＿１、Ｄ）ＣＭＰ ＩＤ ９＿１、Ｅ）ＣＭＰ ＩＤ １０＿１。

【図9-2】ヒト細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１における濃度依存的な効力及び有効性について、オリゴヌクレオチドアンチセンス分子及びそのより短い代謝産物をｉｎ ｖｉｔｒｏ で試験する。Ａ）ＣＭＰ ＩＤ ５＿１、Ｂ）ＣＭＰ ＩＤ ７＿１、Ｃ）ＣＭＰ ＩＤ ８＿１、Ｄ）ＣＭＰ ＩＤ ９＿１、Ｅ）ＣＭＰ ＩＤ １０＿１。

【図9-3】ヒト細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１における濃度依存的な効力及び有効性について、オリゴヌクレオチドアンチセンス分子及びそのより短い代謝産物をｉｎ ｖｉｔｒｏ で試験する。Ａ）ＣＭＰ ＩＤ ５＿１、Ｂ）ＣＭＰ ＩＤ ７＿１、Ｃ）ＣＭＰ ＩＤ ８＿１、Ｄ）ＣＭＰ ＩＤ ９＿１、Ｅ）ＣＭＰ ＩＤ １０＿１。

【図10】ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＣＭＰ ＩＤ ５＿１で処置したマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ分析のための研究プロトコル

【図11】ＧａｌＮＡｃコンジュゲートオリゴヌクレオチドアンチセンスＣＭＰ ＩＤ番号３＿１及び５＿１で処置したＰＸＢマウスの肝臓組織におけるＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡのレベル

【図12】ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＣＭＰ ＩＤ ５＿１で処置したＨＢＶ感染ＰＸＢマウスのｉｎ ｖｉｖｏ分析のための研究プロトコル。

【図13】ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＣＭＰ ＩＤ ５＿１及び対照で処置したＨＢＶ感染ＰＸＢマウスの肝臓組織におけるＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡレベル及びＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡレベル：Ａ）１０５日目、Ｂ）５６日目。

【発明を実施するための形態】

【0113】

定義
ＨＢＶ感染症
「Ｂ型肝炎ウイルス感染症」又は「ＨＢＶ感染症」という用語は、当該技術分野では一般的に知られており、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされ、かつ肝臓に影響を及ぼす感染性疾患を指す。ＨＢＶ感染症は急性感染症又は慢性感染症であり得る。慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ：ＣＨＢ）感染症は、世界中で２億４８００万人に影響する世界的な疾病負荷である。年間およそ６８６，０００人の死亡は、ＨＢＶ関連末期肝疾患及び肝細胞癌腫（ＨＣＣ）に起因する（ＧＢＤ ２０１３；Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＷＨＯは、更なる介入がなければ、ＣＨＢ感染者の数は今後４０～５０年間にわたり現在の高い水準を維持し、累積２０００万人が２０１５～２０３０年の間に死亡すると予測した（ＷＨＯ、２０１６年）。ＣＨＢ感染症は特異な臨床症状を呈する同種疾患ではない。感染した個体は、生涯でＣＨＢ関連肝疾患のいくつかの段階を経て進行している。これらの病期もまた標準治療（ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ ｃａｒｅ：ＳＯＣ）による処置の基礎となる。現在のガイドラインでは、血清ＡＬＴレベル、ＨＢＶ ＤＮＡレベル、及び肝疾患の重症度の３つの基準に基づいて、ＣＨＢに感染した特定の個人のみを処置することを推奨している（ＥＡＳＬ、２０１７年）。この推奨は、ＳＯＣ、すなわちヌクレオシ（チ）ド類似体（ＮＡ）及びペグ化インターフェロン－α（ＰＥＧ－ＩＦＮ）が治癒的ではなく、かつ長期間投与しなければならず、それによって安全性リスクが増加するという事実による。ＮＡはＨＢＶ ＤＮＡ複製を効果的に抑制する。しかしながら、他のウイルスマーカには非常に限られた影響しか及ぼさない／一切影響を及ぼさない。ＨＢＶ感染症の２つの特徴である、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）及び共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）は、ＨＢＶ治癒を目的とする新薬の主な標的である。ＣＨＢ患者の血漿中において、ＨＢｓＡｇサブウイルス（中空）粒子は、ＨＢＶビリオンを数で１０^３～１０^５倍上回る（Ｇａｎｅｍ＆Ｐｒｉｎｃｅ、２０１４年）。その過剰は、急性ＨＢＶ感染症の消散後に観察された血清学的マーカーである中和抗ＨＢｓ抗体を発現できない個体を含む、該疾患の免疫病理発生に寄与すると考えられている。

【0114】

ｃｃｃＤＮＡ（共有結合的に閉じた環状ＤＮＡ）
ｃｃｃＤＮＡは感染した肝細胞の核に存在するウイルスの遺伝的鋳型であり、増殖性感染に必要な全てのＨＢＶ ＲＮＡ転写物を生じ、慢性ＨＢＶ感染症の自然経過中のウイルス持続に関与する（Ｌｏｃａｒｎｉｎｉ＆Ｚｏｕｌｉｍ，２０１０ Ａｎｔｉｖｉｒ Ｔｈｅｒ．１５ Ｓｕｐｐｌ ３：３－１４．ｄｏｉ：１０．３８５１／ＩＭＰ１６１９）。ｃｃｃＤＮＡはウイルスのリザーバとして作用し、処置中止後のウイルスリバウンド源であって、長期の、時として生涯の処置を必要とする。ＰＥＧ－ＩＦＮは、その種々の副作用に起因して、ＣＨＢの小サブセットにしか投与できない。

【0115】

したがって、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの分解又は除去により定義される完全治癒をＣＨＢ患者の大部分にもたらすことができる新規の治療法が、強く必要とされている。

【0116】

化合物
本明細書では、「化合物」という用語は、ＲＴＥＬ１の発現又は活性を阻害することができる任意の分子を意味する。本発明の特定の化合物は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はそのような核酸分子を含む任意のコンジュゲートである。例えば、本明細書において、化合物は、ＲＴＥＬ１を標的とする核酸分子、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。

【0117】

オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者によって一般的に理解されるように定義される。このような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子又はオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製及び単離によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合には、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列又は順序、若しくはその修飾が言及される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工のものであり、化学的に合成され、典型的には精製又は単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオシド等の１つ以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオシド間結合等の、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。

【0118】

アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡでもｓｈＲＮＡでもない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部又は相互の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間二本鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二本鎖）を形成することができることが理解される。

【0119】

いくつかの実施形態では、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオシドを含まなくてもよい。

【0120】

有利には、本発明のオリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオシド等の１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む。さらに、修飾されていないヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドであることは有利である。

【0121】

連続ヌクレオチド配列
「連続ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で「連続核酸塩基配列」という用語及び「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」という用語と互換的に用いられる。いくつかの実施形態では、ヌクレオシドの全てのヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｆ－Ｇ－Ｆ’ギャップマー領域等の連続ヌクレオチド配列を含み、任意に、更なるヌクレオチド（複数可）、例えば、官能基（例えば、コンジュゲート基）を連続ヌクレオチド配列に結合するために使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含み得る。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に対して相補的であっても相補的でなくてもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、連続ヌクレオチド配列を構成である。

【0122】

ヌクレオチド及びヌクレオシド
ヌクレオチド及びヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシドと、天然に存在しないヌクレオチド及びヌクレオシドとの両方を含む。本来、ＤＮＡヌクレオチド及びＲＮＡヌクレオチド等のヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、「単位」又は「モノマー」と互換的に称されてもよい。

【0123】

修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」という用語は、糖部分又は（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって、同等のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。有利には、１つ以上の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む。「修飾ヌクレオシド」という用語はまた、「ヌクレオシド類似体」又は修飾「単位」又は修飾「モノマー」という用語と互換的に使用されてもよい。非修飾ＤＮＡ又はＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、それらがワトソン・クリック塩基対合可能な場合には、依然として一般的にＤＮＡ又はＲＮＡと称される。

【0124】

修飾ヌクレオシド間結合
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者に一般的に理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合又は１つ以上のホスホロジチオエートのヌクレオシド間結合のような、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％又は例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てが、ホスホロチオエートである。

【0125】

いくつかの有利な実施形態では、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列の全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであるか、又はオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。

【0126】

欧州特許第２７４２１３５号に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステル、ホスホロチオエート及びホスホロジチオエート以外）、例えばアルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間結合を含んでもよいことが認識され、これは欧州特許第２７４２１３５号によれば、例えば、別のＤＮＡホスホロチオエートのギャップ領域内で耐性であり得る。

【0127】

核酸塩基
核酸塩基という用語は、ヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えばウラシル、チミン及びシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーションの際に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」とは、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチン等の天然に存在する核酸塩基と、天然に存在しないバリアントとの両方を指す。このようなバリアントは、例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５ ａｎｄ Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１に記載されている。

【0128】

いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリン又はピリミジンを修飾プリン又はピリミジン、例えば置換プリン又は置換ピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チアゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン及び２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅｄ）に変えることにより修飾される。

【0129】

核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基についての文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵにより示されてもよく、各文字は、任意に等価機能の修飾核酸塩基を含んでもよい。例えば、例示したオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５－メチルシトシンから選択される。任意に、ＬＮＡギャップマーでは、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが用いられ得る。

【0130】

修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを表す。「キメラ」オリゴヌクレオチドという用語は、糖修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、有利にはキメラオリゴヌクレオチドである。

【0131】

相補性
「相補性」という用語は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成の能力を表す。Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば５－メチルシトシンは度々シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を包含することが理解されよう（例えばＨｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１を参照）。

【0132】

本明細書で使用される場合、「％相補的」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、標的配列又は配列モチーフ）に相補的である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセント）を指す。したがって、相補性のパーセンテージは、２つの配列間（標的配列５’－３’と３’－５’からのオリゴヌクレオチド配列とを整列させた場合）で相補的である（ワトソン・クリック塩基対から）整列した核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることによって計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。相補性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。

【0133】

「完全に相補的な」という用語は、１００％の相補性を指す。

【0134】

同一性
本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）と同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性のパーセンテージは、２つの配列（本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列及び参照配列における）の間で同一の（一致する）整列された核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることによって計算される。したがって、同一性のパーセンテージ＝（一致数×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。

【0135】

ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズ」又は「ハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）が対向する鎖上の塩基対間に水素結合を形成することにより二本鎖を形成することと理解されるべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される、融解温度（Ｔ_ｍ）によって説明されることが多い。生理学的条件では、Ｔ_ｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ及びＬａｃｒｏｉｘ、２００３、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１３：５１５～５３７）。標準状態でのギブスの自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表しており、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋ_ｄ）（式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である）によって反応の解離定数（Ｋ_ｄ）と関連付けられている。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水溶液濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃である反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合のΔＧ°は、ゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９６５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６－３８及びＨｏｌｄｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載される等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）により、実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°はまた、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６及びＭｃＴｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５によって記載された適切に導出された熱力学パラメータを使用して、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０－１４６５によって記載された最近傍モデルを使用することによって数値的に推定することができる。その意図した核酸標的をハイブリダイゼーションによって調節する可能性を確保するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態でのギブスの自由エネルギーΔＧ°によって測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、及び例えば－２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば－１２～－４０、例えば－１５～－３０ｋｃａｌ、又は－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば－１８～－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で、標的核酸にハイブリダイズする。

【0136】

標的
本明細書で使用される場合、「標的」という用語は、「ＫＩＡＡ１０８８」又は「Ｃ２０ＯＲＦ４１」又は「テロメア長の調節因子」又は「テロメア長調節因子」又は「第２０染色体オープンリーディングフレーム４１」としても知られる哺乳動物タンパク質ＲＴＥＬ１（「テロメア伸長ヘリカーゼ１の調節因子」）を指す。ホモサピエンス（ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＲＴＥＬ１遺伝子は、２０番染色体の６３、６５７、８１０～６３、６９６、２５３相補体（ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）更新アノテーション、リリース１０９．２０２００２２８、ＧＲＣｈ３８．ｐ１３）に位置する。ＲＴＥＬ１タンパク質は、テロメア長調節、ＤＮＡ修復及びゲノム安定性の維持に関与するＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼである。ヒトＲＴＥＬ１のアミノ酸配列は当技術分野で公知であり、ＵｎｉＰｒｏｔによって評価することができ、ヒトＲＴＥＬ１についてはＵｎｉＰｒｏｔエントリーＱ９ＮＺ７１を参照されたい（参照により本明細書に組み込まれる）。

【0137】

標的核酸
本発明によれば、標的核酸は、哺乳動物ＲＴＥＬ１をコードする核酸であり、例えば遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列であり得る。したがって、標的は、ＲＴＥＬ１標的核酸と呼ばれ得る。

【0138】

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、哺乳動物ＲＴＥＬ１の標的エクソン領域を標的とし得るか、又は例えばＲＴＥＬ１プレｍＲＮＡのイントロン領域を標的とし得る。ヒトＲＴＥＬ１遺伝子は、タンパク質をコードするこれらの７つの転写物のうち１５の転写物をコードし、したがって、潜在的な核酸標的である。表３は、配列番号１のヒトＲＴＥＬ１プレｍＲＮＡ上に位置する７つの転写物の予測されるエクソン及びイントロン領域を列挙する。

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【表3-5】

【0139】

好適には、標的核酸は、ＲＴＥＬ１タンパク質、特に哺乳動物ＲＴＥＬ１、例えばヒトＲＴＥＬ１をコードする（例えば、表３及び表４を参照）。これは、ヒト及びサルＲＴＥＬ１についてのプレｍＲＮＡ配列を提供する。

【0140】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１及び／若しくは２、又はその天然に存在するバリアント（例えば、哺乳動物ＲＴＥＬ１タンパク質をコードする配列）から選択される。

【0141】

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のコンジュゲートを研究又は診断に使用する場合、標的核酸は、ｃＤＮＡ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡに由来する合成核酸であり得る。

【0142】

ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの適用のために、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、ＲＴＥＬ１標的核酸を発現している細胞内のＲＴＥＬ１標的核酸の発現を阻害することができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さにわたって測定して、任意に１つ又は２つのミスマッチを除いて、また場合により、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコンジュゲート等の任意の官能基に連結し得るヌクレオチドベースのリンカー領域、又は他の非相補的末端ヌクレオチド（例えば、領域Ｄ’又はＤ”）を除いて、ＲＴＥＬ１標的核酸に相補的である。標的核酸は、いくつかの実施形態では、ヒトＲＴＥＬ１等のプレｍＲＮＡ、例えば配列番号１として開示されているもの等のヒトＲＴＥＬ１プレ－ｍＲＮＡ配列、又は配列番号２として開示されているもの等のカニクイザルＲＴＥＬ１プレ－ｍＲＮＡ配列等のメッセンジャーＲＮＡ等のＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。配列番号１及び２はＤＮＡ配列である。標的ＲＮＡ配列は、チミジン塩基（Ｔ）の代わりに、ウラシル（Ｕ）塩基を有することが理解されよう。

【0143】

例示的な標的核酸に関する更なる情報は、表４及び５に提供される。

【表4】

Ｆｗｄ＝フォワード鎖。ゲノム座標は、プレｍＲＮＡ配列（ゲノム配列）を提供する。ＮＣＢＩ参照は、ｍＲＮＡ配列（ｃＤＮＡ配列）を提供する。

【表5】

注：配列番号２は、配列決定が配列を正確に精製することができず、したがって縮重配列が含まれる、複数のＮＮＮＮの領域を含む。疑いを避けるため、本発明の化合物は実際の標的配列に対して相補的であり、したがって、縮重化合物ではない。

【0144】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１である。

【0145】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号２である。

【0146】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１及び２である。

【0147】

標的配列
本明細書で使用される場合、「標的配列」という用語は、本発明のオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む、標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。いくつかの実施形態では、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列、又は標的領域と称され得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、単一のオリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば、本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドにより標的とされ得る標的核酸の好ましい領域を表し得る。

【0148】

本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸、例えば本明細書に記載される標的配列に相補的及びハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含む。

【0149】

オリゴヌクレオチドが相補的である標的配列は、一般に、少なくとも１０ヌクレオチドの連続核酸塩基配列を含む。連続ヌクレオチド配列は、１０～３０ヌクレオチド長、例えば１２～３０、例えば１４～２０、例えば１５～１８連続ヌクレオチド長、例えば１５、１６、１７連続ヌクレオチド長である。

【0150】

標的配列領域
本発明者らは、本発明のオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートによって標的化され得るＲＴＥＬ１標的核酸の特に有効な配列を同定した。

【0151】

いくつかの実施形態では、標的配列は配列番号７である。

【0152】

いくつかの実施形態では、標的配列は配列番号８である。

【0153】

いくつかの実施形態では、標的配列は配列番号９である。

【0154】

いくつかの実施形態では、標的配列は配列番号１０である。

【0155】

いくつかの実施形態では、標的配列は配列番号１１である。

【0156】

配列番号７：ＴＴＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＡＴＧＴＡＡＡＡＴＴ
配列番号８：ＡＣＣＡＧＡＧＴＡＴＧＴＡＡＡＡＴＴ
配列番号９：ＧＡＣＣＡＧＡＧＴＡＴＧＴＡＡＡＡＴＴ
配列番号１０：ＴＴＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＡＴＧＴＡＡ
配列番号１１：ＧＡＧＡＴＴＣＡＡＧＴＴＡＴＡＡＴＡＡＡＧ
配列番号７～１１はＤＮＡ配列である。標的ＲＮＡ配列は、チミジン塩基（Ｔ）の代わりに、ウラシル（Ｕ）塩基を有することが理解されよう。

【0157】

配列番号７～１０に示される標的配列は、ヒトＲＴＥＬ１のイントロン８に見出すことができる。配列番号１１に示される標的配列は、ヒトＲＴＥＬ１のイントロン７に見出すことができる。

【0158】

いくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１のヌクレオチド１１７５３～１１７７４の領域である。

【0159】

いくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１のヌクレオチド１１７５７～１１７７４の領域である。

【0160】

いくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１のヌクレオチド１１７５６～１１７７４の領域である。

【0161】

いくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１のヌクレオチド１１７５３～１１７７０の領域である。

【0162】

いくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１のヌクレオチド８６８１～８７０１の領域である。

【0163】

標的細胞
本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ 又はｉｎ ｖｉｔｒｏであり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えば、げっ歯類細胞、例えば、マウス細胞若しくはラット細胞、又は霊長類細胞、例えば、サル細胞若しくはヒト細胞である。

【0164】

典型的には、標的細胞は、ＲＴＥＬ１プレｍＲＮＡ又はＲＴＥＬ１成熟ｍＲＮＡ等のＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡを発現する。実験評価のために、ヒトＲＴＥＬ１プレｍＲＮＡ、例えば配列番号１等の標的配列を含む核酸を発現する標的細胞を使用してもよい。

【0165】

ＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡのポリＡテールは、典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化では無視される。

【0166】

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、例えばｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで、ＲＴＥＬ１標的核酸を発現している細胞（標的細胞）におけるＲＴＥＬ１標的核酸の発現を阻害することができる。

【0167】

さらに、標的細胞は肝細胞であってもよい。一実施形態では、標的細胞は、ＨＢＶに感染した初代ヒト肝細胞であり、ＨＢＶ感染個体に由来するか、又はヒト化肝臓を有するＨＢＶに感染したマウス（ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ、ＰＸＢマウス）に由来するかのいずれかである。

【0168】

本発明によれば、標的細胞は、ＨＢＶに感染していてもよい。さらに、標的細胞は、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを含み得る。したがって、標的細胞は、ＲＴＥＬ１プレｍＲＮＡ又はＲＴＥＬ１成熟ｍＲＮＡ等のＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡ及びＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを含むことが好ましい。

【0169】

天然に存在するバリアント
「天然に存在するバリアント」という用語は、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、例えば、同じアミノ酸をコードする多数のコドンを引き起こす遺伝コードの縮重のために、又はプレｍＲＮＡの選択的スプライシング、又は多型、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在に起因して異なり得るＲＴＥＬ１遺伝子又は転写産物のバリアント、及び対立遺伝子バリアントを指す。オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的な配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、したがって、標的核酸及びその天然に存在するバリアントを標的とし得る。

【0170】

いくつかの実施形態では、天然に存在するバリアントは、哺乳動物ＲＴＥＬ１標的核酸、例えば配列番号１の標的核酸に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％又は少なくとも９９％相同性を有する。いくつかの実施形態では、天然に存在するバリアントは、配列番号１のヒトＲＴＥＬ１標的核酸に対して少なくとも９９％相同性を有する。

【0171】

発現の阻害
本明細書で使用される場合、「発現の阻害」という用語は、標的細胞におけるＲＴＥＬ１の量又は活性を阻害するオリゴヌクレオチドの能力の全体的な用語として理解されるべきである。活性の阻害は、ＲＴＥＬ１プレｍＲＮＡ若しくはＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡのレベルを測定することによって、又は細胞中のＲＴＥＬ１若しくはＲＴＥＬ１活性のレベルを測定することによって決定され得る。したがって、発現の阻害はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで決定され得る。

【0172】

典型的には、発現の阻害は、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的細胞に投与することによる活性の阻害を比較する、及びそのレベルをアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与しない標的細胞から得られた参照レベル（対照実験）、又は既知の参照レベル（例えば、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与前の発現レベル、又は所定の若しくは他の既知の発現レベル）と比較することによって決定される。

【0173】

例えば、対照実験は、生理食塩水組成物又は参照オリゴヌクレオチド（多くの場合、スクランブル対照）で処置した動物若しくはヒト、又は標的細胞であり得る。

【0174】

「阻害」又は「阻害する」という用語は、ＲＴＥＬ１、例えばＲＴＥＬ１プレｍＲＮＡの発現を下方調節する、減少させる、抑制する、減らす、低下させるとも呼ばれ得る。

【0175】

発現の阻害は、例えばプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの分解（例えば、ＲＮアーゼＨ動員オリゴヌクレオチド、例えばギャップマーを使用する）によって起こり得る。

【0176】

高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド中に組み込まれた場合に、例えば、融解温度（Ｔｍ）によって測定された、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める修飾ヌクレオチドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５～＋１２℃、より好ましくは＋１．５～＋１０℃、最も好ましくは＋３～＋８℃の融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野において知られており、例えば、多くの２’置換ヌクレオシド及びロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９９７、２５、４４２９～４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０００、３（２）、２９３～２１３を参照）。

【0177】

糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較して、糖部分が修飾された１つ以上のヌクレオシドを含みうる。
リボース糖部分の修飾を有する数多くのヌクレオシドは、親和性及び／又はヌクレアー

【0178】

ゼ耐性等のオリゴヌクレオチドのある特定の性質を改善することを主な目的として作製されてきた。

【0179】

このような修飾には、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）、又は典型的にはリボース環上のＣ２炭素とＣ４炭素との間にビラジカル架橋を有する二環式環（ＬＮＡ）、又は典型的にはＣ２炭素とＣ３炭素との間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）又は三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドにはまた、糖部分が例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）又はモルホリノ核酸の場合には非糖部分で置き換えられているヌクレオシドが含まれる。

【0180】

糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を、水素以外の基、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシド中に天然に存在する２’－ＯＨ基に変更することによってなされる修飾も含まれる。置換基は、例えば２’、３’、４’、又は５’位で導入され得る。

【0181】

２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ又は－ＯＨ以外の置換基を有するか（２’置換ヌクレオシド）、又は２’炭素とリボース環上の第２の炭素との間に架橋を形成することができる２’結合ビラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドである。

【0182】

実際、２’糖置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、数多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾ヌクレオシドは、結合親和性の向上、及び／又はヌクレアーゼ耐性の増大をオリゴヌクレオチドに提供することができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。更なる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９９７、２５、４４２９～４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０００、３（２）、２９３～２１３、並びにＤｅｌｅａｖｅｙ及びＤａｍｈａ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２、１９、９３７を参照されたい。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの例示である。

【化33】

【0183】

本発明に関して、２’置換糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡのような２’架橋ヌクレオシドを含まない。

【0184】

ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡヌクレオシド）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、該ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを連結するビラジカル（「２’－４’架橋」とも呼ばれる）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限又は固定する。これらのヌクレオシドはまた、文献において、架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースのコンホメーションの固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖安定化）に関連している。これは、オリゴヌクレオチド／相補二重鎖の融解温度を測定することによって、日常的に決定され得る。

【0185】

非限定的で例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号、国際公開第２００８／１５０７２９号、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３－７６、Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ ７５（５）ｐｐ．１５６９－８１、及びＭｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５－１２３８、及びＷａｎ ａｎｄ Ｓｅｔｈ，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，５９，９６４５－９６６７を参照されたい。

【0186】

更なる非限定的な例示的ＬＮＡヌクレオシドを、スキーム１に開示する。

【化34】

【0187】

特定のＬＮＡヌクレオシドは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）－６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）及びＥＮＡである。特定の有利なＬＮＡは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである。

【0188】

ヌクレアーゼ媒介分解
ヌクレアーゼ媒介分解は、相補的なヌクレオチド配列と二重鎖を形成するときに、そのような配列の分解を媒介することができるオリゴヌクレオチドを指す。

【0189】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレアーゼ媒介分解を介して機能することができ、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、好ましくはＲＮアーゼＨ等のエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）を動員することができる。ヌクレアーゼ媒介機構を介して作用するオリゴヌクレオチド設計の例は、典型的には少なくとも５個又は６個の連続するＤＮＡヌクレオシドの領域を含み、親和性増強ヌクレオシド、例えばギャップマーによって片側又は両側に隣接するオリゴヌクレオチドである。

【0190】

ＲＮａｓｅ Ｈの活性及び動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性とは、相補的ＲＮＡ分子との二重鎖にあるときにＲＮａｓｅ Ｈを動員する能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅ Ｈを動員する能力を決定するために使用され得る、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。典型的には、オリゴヌクレオチドが、相補的標的核酸配列が提供された場合に、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオエート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するオリゴヌクレオチドを使用し、国際公開第０１／２３６１３号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１～９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期速度の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％又は２０％超のｐｍｏｌ／ｌ／分で測定された初期速度を有する場合に、このオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅ Ｈを動員し得ると見なされる。ＲＮａｓｅ Ｈ活性の決定での使用について、組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ（登録商標）（大腸菌で発現したＨｉｓタグと融合した組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１）から入手できる。

【0191】

ギャップマー
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列はギャップマーであってもよく、また、ギャップマーオリゴヌクレオチド又はギャップマー設計とも称され得る。アンチセンスギャップマーは、通常、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介分解を介した標的核酸の阻害に用いられる。ギャップマー型オリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの別個の構造領域、５’－フランク、ギャップ及び３’－フランク、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を５’→３’方向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈを動員することを可能にする一続きの連続するＤＮＡヌクレオチドを含む。ギャップ領域には、１種以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’隣接領域（Ｆ）と、１種以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’隣接領域（Ｆ’）が隣接する。領域Ｆ及びＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を向上させる（すなわち、親和性向上糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、例えばＬＮＡ及び２’－ＭＯＥから独立して選択される、例えば高親和性の２’糖修飾等、２’糖修飾ヌクレオシドである。

【0192】

ギャップマー設計において、ギャップ領域の最も５’及び３’のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、それぞれ、５’（Ｆ）又は３’（Ｆ’）領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置されている。フランクは更に、ギャップ領域から最も遠い端、すなわち５’フランクの５’末端及び３’フランクの３’末端に少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することによって定義され得る。いくつかの実施形態では、式Ｆ－Ｇ－Ｆ’のギャップマー領域のヌクレオシド間の全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0193】

領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’は、連続ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列は、式Ｆ－Ｇ－Ｆ’のギャップマー領域を含み得る。

【0194】

ギャップマー設計Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、例えば１２～３２ヌクレオシド、例えば１３～２４、例えば１４～２２ヌクレオシド、例えば１５～２０、例えば１６～１８ヌクレオシドであり得る。

【0195】

例として、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式によって表すことができる：
Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_１－８、例えば
Ｆ_１－８－Ｇ_７－１６－Ｆ’_２－８、又は
Ｆ_１－８－Ｇ_{１１－１６}－Ｆ’_２－８、
ただし、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。

【0196】

本発明の一態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマー（式中、領域Ｆ及びＦ’は独立して１～８個のヌクレオシドを含むか又はそれらからなり、そのうち１～４個は２’糖修飾され、Ｆ及びＦ’領域の５’及び３’末端を規定し、ＧはＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる６～１６個のヌクレオシドの領域である）からなるか又はそれを含む。

【0197】

領域Ｆ、Ｇ、及びＦ’は、更に以下に定義され、Ｆ－Ｇ－Ｆ’式に組み込むことができる。

【0198】

ギャップマー－領域Ｇ
ギャップマーの領域Ｇ（ギャップ領域）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨ、例えばヒトＲＮａｓｅＨ１を動員することを可能にするヌクレオシド、典型的にはＤＮＡヌクレオシドの領域である。ＲＮａｓｅ Ｈは、ＤＮＡとＲＮＡとの間の二重鎖を認識し、ＲＮＡ分子を酵素的に切断する細胞性酵素である。好適には、ギャップマーは、少なくとも５又は６連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば５～１６連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば６～１５連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば７～１４連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば８～１２連続ＤＮＡヌクレオチド、例えば８～１２連続ＤＮＡヌクレオチド長のギャップ領域（Ｇ）を有し得る。ギャップ領域Ｇは、いくつかの実施形態では、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６連続するＤＮＡヌクレオシドからなっていてもよい。さらに、領域Ｇは、１１～１６個の連続するＤＮＡヌクレオチドの長さを有し得る。

【0199】

ギャップ領域内の１つ以上のシトシン（Ｃ）ＤＮＡは、いくつかの場合、メチル化（例えば、ＤＮＡ ｃにＤＮＡ ｇが続く場合）されてもよく、このような残基は、５－メチル－シトシン（^ｍｅＣ）と注釈が付けられる。いくつかの実施形態では、ギャップ領域Ｇは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６個の連続するホスホロチオエート結合ＤＮＡヌクレオシドからなっていてもよい。

【0200】

いくつかの実施形態では、ギャップ内の全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

【0201】

ギャップマー－隣接領域、Ｆ及びＦ’
領域Ｆ’は、領域Ｇの５’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、又はＬＮＡヌクレオシドである。

【0202】

領域Ｆ’は、領域Ｇの３’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、又はＬＮＡヌクレオシドである。

【0203】

領域Ｆは、１～８連続ヌクレオチド長、例えば２～６、例えば２～４連続ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、領域Ｆの長さは２個の連続ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の長さは３個の連続ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの長さは４個の連続ヌクレオチドである。

【0204】

有利には、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。

【0205】

領域Ｆ’は、１～８個の連続したヌクレオチド長、例えば２～６個の連続したヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の長さは２個の連続ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の長さは４個の連続ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの長さは５個の連続ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの長さは６個の連続ヌクレオチドである。

【0206】

有利には、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。

【0207】

領域Ｆの長さが１である場合、それは有利なことには、ＬＮＡヌクレオシドであることに留意するべきである。さらに、領域Ｆ及び／又はＦ’の長さが２である場合、領域Ｆ及び／又はＦ’の両方のヌクレオシドは、有利にはＬＮＡヌクレオシドであることに留意されたい。

【0208】

いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’における糖修飾ヌクレオシドは、１タイプのみの糖修飾ヌクレオシド、例えばＭＯＥのみ、又はβ－Ｄ－オキシＬＮＡのみ、又はＳｃＥＴのみからなる。このような設計は、均一フランク又は均一ギャップマー設計とも称される。

【0209】

いくつかの実施形態では、領域Ｆ若しくはＦ’、又はＦ及びＦ’の全ヌクレオシドは、例えばベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシド等のＬＮＡヌクレオシドである。代替的な実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の全ての糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えばベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、領域Ｆ若しくはＦ’、又は領域Ｆ及びＦ’の両方は、ＤＮＡヌクレオシド（交互フランク、詳細についてはこれらの定義を参照されたい）を含み得る。

【0210】

いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の最５’及び最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えばベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドヌクレオシドである。

【0211】

いくつかの実施形態では、領域Ｆと領域Ｇとの間のヌクレオシド間結合及び／又は領域Ｆ’と領域Ｇとの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ又はＦ’、Ｆ及びＦ’のヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0212】

ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方に、ＬＮＡヌクレオシドを含むか、若しくはそれからなるギャップマーである。ベータ－Ｄ－オキシギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方に、ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか、若しくはそれからなるギャップマーである。

【0213】

いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、式：［ＬＮＡ］_１～５－［領域Ｇ］－［ＬＮＡ］_１～５（式中、領域Ｇは、ＲＮａｓｅＨを動員することができる連続ＤＮＡヌクレオシドの領域であるか又はそれを含む）のものである。

【0214】

ＭＯＥギャップマー
ＭＯＥギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施形態では、ＭＯＥギャップマーは、設計［ＭＯＥ］_１～８－［領域Ｇ］_５～１６－［ＭＯＥ］_１～８、例えば［ＭＯＥ］_２～７－［領域Ｇ］_６～１４－［ＭＯＥ］_２～７、例えば［ＭＯＥ］_３～６－［領域Ｇ］_８～１２－［ＭＯＥ］_３～６（式中、領域Ｇはギャップマーの定義において定義される通りである）のものである。５－１０－５設計（ＭＯＥ－ＤＮＡ－ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマーは、当技術分野で広く使用されている。

【0215】

混合ウィングギャップマー
混合ウィングギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方が、２’置換ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位及び２’－フルオロ－ＡＮＡ単位からなる群から独立して選択される２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドを含むＬＮＡギャップマーである。領域Ｆ及びＦ’の少なくとも一方、又は領域ＦとＦ’の両方が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の残りのヌクレオシドが、ＭＯＥ及びＬＮＡからなる群から独立して選択される。領域Ｆ及びＦ’の少なくとも一方、又は領域ＦとＦ’の両方が少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の残りのヌクレオシドが、ＭＯＥ及びＬＮＡからなる群から独立して選択される。いくつかの混合ウイング実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方が、１つ以上のＤＮＡヌクレオシドを更に含んでもよい。

【0216】

交互フランクギャップマー
フランキング領域は、ＬＮＡヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの両方を含んでよく、それらはＬＮＡ－ＤＮＡ－ＬＮＡヌクレオシドの交互のモチーフを含むことから、「交互フランク」と呼ばれる。少なくとも１つの交互フランクを含むギャップマーは、「交互フランクギャップマー」と称される。したがって、「交互フランクギャップマー」は、少なくとも１つのフランク（Ｆ又はＦ’）がＬＮＡヌクレオシド（複数可）に加えてＤＮＡを含む、ＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ若しくはＦ’の少なくとも一方、又は領域ＦとＦ’の両方が、ＬＮＡヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。このような実施形態では、隣接領域Ｆ又はＦ’、若しくはＦ及びＦ’の両方が少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆ及び／又はＦ’領域の最も５’及び３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。交互フランクＬＮＡギャップマーは、国際公開第２０１６／１２７００２号に開示されている。

【0217】

交互フランク領域は、１～２つ、又は１つ、又は２つ、又は３つの連続するＤＮＡヌクレオシド等の最大３つの連続するＤＮＡヌクレオシドを含み得る。
交互のフレーク領域は、一連の整数として注釈を付けることができ、これは、いくつかのＬＮＡヌクレオシド（Ｌ）とそれに続くいくつかのＤＮＡヌクレオシド（Ｄ）、例えば［Ｌ］１－３－［Ｄ］１－３－［Ｌ］１－３又は［Ｌ］１－２－［Ｄ］１－２－［Ｌ］１－２－［Ｄ］１－２－［Ｌ］１－２を表す。オリゴヌクレオチド設計では、これらは、２－２－１が５’［Ｌ］２－［Ｄ］２－［Ｌ］３’を表し、１－１－１－１－１が５’［Ｌ］－［Ｄ］－［Ｌ］－［Ｄ］－［Ｌ］３’を表すような数として表されることが多い。交互フランクを有するオリゴヌクレオチド内のフランク（領域Ｆ及びＦ’）の長さは、これらの領域について本明細書で上述したように、例えば４～８、例えば５～６個のヌクレオシド、例えば４、５、６又は７個の修飾ヌクレオシドであり得る。追加のエキソヌクレアーゼ耐性を付与するために、３’フランク（Ｆ’）の３’末端に少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを有することが有利であり得る。
オリゴヌクレオチドにおける領域Ｄ’又はＤ”
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に対して相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’、並びに更に５’及び／又は３’ヌクレオシドを含むか、又はそれからなり得る。更なる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、標的核酸に対して完全に相補的であっても、完全に相補的でなくてもよい。このような更なる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、本明細書では領域Ｄ’及びＤ”と称され得る。

【0218】

領域Ｄ’又はＤ”の付加は、連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーをコンジュゲート部分又は別の官能基に連結する目的のために使用され得る。連結に用いられる場合、コンジュゲート部分を有する連続ヌクレオチド配列は、生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る。あるいは、それはエキソヌクレアーゼ保護を提供するために、又は合成若しくは製造を容易にするために使用され得る。

【0219】

領域Ｄ’及びＤ”は、それぞれ、領域Ｆの５’末端又は領域Ｆ’の３’末端に結合されて、以下の式Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”、又はＤ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”の設計を生成することができる。この場合、Ｆ－Ｇ－Ｆ’はオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域Ｄ’又はＤ”は、オリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。

【0220】

領域Ｄ’又はＤ”は、独立して、１、２、３、４、又は５の追加のヌクレオチドを含むか、又はそれからなり、これは、標的核酸に相補的であっても、相補的でなくてもよい。Ｆ又はＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の糖修飾ヌクレオチドではなく、若しくはこれらの塩基修飾バージョンでもない。Ｄ’又はＤ”領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る（リンカーの定義を参照）。いくつかの実施形態では、追加の５’及び／又は３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で連結されており、ＤＮＡ又はＲＮＡである。領域Ｄ’又はＤ”としての使用に好適なヌクレオチドベースの生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号に開示されており、これには例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドが含まれる。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能なリンカーの使用は国際公開第２０１５／１１３９２２号に開示されており、それらは複数のアンチセンス構築物（例えば、ギャップマー領域）を単一のオリゴヌクレオチド内で結合するのに使用されている。

【0221】

一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’及び／又はＤ”を含む。

【0222】

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式によって表すことができる：
Ｆ－Ｇ－Ｆ’；特にＦ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特にＤ’_１－３－Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８
Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”、特にＦ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８－Ｄ”_１－３
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”、特にＤ’_１－３－Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８－Ｄ”_１－３
いくつかの実施形態では、領域Ｄ’と領域Ｆとの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｄ”の間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。

【0223】

コンジュゲート
本明細書で用いられるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分又は領域Ｃ又は第３の領域）に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す。コンジュゲート部分は、任意に領域Ｄ’又はＤ”等のリンカー基を介して、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合していてもよい。

【0224】

オリゴヌクレオチドコンジュゲート及びそれらの合成についてはまた、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，ｅｄ．，Ｃｈ．１６，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２００１、及びＭａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００２，１２，１０３による包括的な概説において報告されている。

【0225】

いくつかの実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）、又はそれらの組合せからなる群より選択される。

【0226】

例示的なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合することができるものを含む。特に、三価Ｎ－アセチルガラクトサミンのコンジュゲート部分は、ＡＳＧＰＲへの結合に適しており、例えば、国際公開第２０１４／０７６１９６号、国際公開第２０１４／２０７２３２号、及び国際公開第２０１４／１７９６２０号を参照されたい。このようなコンジュゲートは、肝臓へのオリゴヌクレオチドの取り込みを増強するのに役立つ。

【0227】

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／１４３３７９号に開示されているような、トランスフェリン受容体に対して特異的親和性を有する抗体又は抗体断片である。いくつかの実施形態では、非ヌクレオチド部分は、抗体又は抗体断片、例えば血液脳関門を通る送達を促進する抗体又は抗体断片、特にトランスフェリン受容体を標的とする抗体又は抗体断片である。

【0228】

リンカー
結合又はリンカーは、１つ以上の共有結合を介して目的の１つの化学基又はセグメントを目的の別の化学基又はセグメントに連結する、２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接又は連結部分（例えば、リンカー又はテザー）を介してオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えば、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ）に共有結合する役割を果たす。

【0229】

本発明のいくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲート又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、任意に、標的核酸に対して相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ又は第１の領域）と、コンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）との間に位置するリンカー領域（第２の領域又は領域Ｂ及び／又は領域Ｙ）を含み得る。

【0230】

生体切断可能なリンカー（領域Ｂ）は、哺乳動物の体内で通常遭遇する又は遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むか、又はそれからなる。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化又は還元条件、若しくは薬剤等の化学条件、並びに哺乳動物の細胞で見られる又は遭遇するものに類似した塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素又は加水分解酵素又はヌクレアーゼ等の哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態では、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。いくつかの実施形態では、生理学的に不安定なリンカー（生物切断性）は、１個～１０個の連結されたヌクレオシド、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個の連結されたヌクレオシド、例えば２個～６個の連結されたヌクレオシド、例えば２個～５個の連結されたヌクレオシド、例えば２個～４個の連結されたヌクレオシドを含み、少なくとも２個の連続する連結は生体切断可能であり、例えばホスホジエステル連結、例えば少なくとも３個又は４個又は５個の連続するホスホジエステル連結である。好ましくは、ヌクレオシドは、ＤＮＡ又はＲＮＡである。

【0231】

一実施形態では、オリゴヌクレオチドとコンジュゲート部分との間のリンカーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列の５’又は３’末端に少なくとも２個の連続するホスホジエステル結合を含む２～５個の連続するホスホジエステル結合ヌクレオシドで構成される生理学的に不安定なリンカーである。

【0232】

いくつかの実施形態では、生理学的に不安定なリンカーは、ＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＴＡ、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ又はＧＧからなる群から選択される配列を有するＤＮＡジヌクレオチドを含むか又はそれからなり、２つのＤＮＡヌクレオシドの間にホスホジエステル結合が存在し、少なくとも１つの更なるホスホジエステルが、核酸分子のオリゴヌクレオチドをジヌクレオチドに連結するか又はコンジュゲート部分をジヌクレオチドに連結するジヌクレオチドの５’又は３’末端に存在する。例えば、リンカーはＣＡジヌクレオチドによるものであり得る。いくつかの実施形態では、生理学的に不安定なリンカーは、配列ＡＡＡ、ＡＡＴ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＡＴＡ、ＡＴＴ、ＡＴＣ、ＡＴＧ、ＡＣＡ、ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＧＡ、ＡＧＴ、ＡＧＣ、ＡＧＧ、ＴＡＡ、ＴＡＴ、ＴＡＣ、ＴＡＧ、ＴＴＡ、ＴＴＴ、ＴＴＣ、ＴＡＧ、ＴＣＡ、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＧＡ、ＴＧＴ、ＴＧＣ、ＴＧＧ、ＣＡＡ、ＣＡＴ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＣＴＣ、ＣＴＴ、ＣＣＡ、ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＧＡ、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＧＡＡ、ＧＡＴ、ＧＡＣ、ＣＡＧ、ＧＴＡ、ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＧ、ＧＣＡ、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＧＡ、ＧＧＴ、ＧＧＣ、又はＧＧＧを含むか又はそれからなり、ＤＮＡヌクレオシドの間にホスホジエステル結合が存在し、トリヌクレオチドの５’又は３’末端に更なるホスホジエステルが潜在的に存在する。ホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号（参照により本明細書に組み込まれる）においてより詳細に記載されている。生体切断可能なリンカーを有するコンジュゲート化合物では、標準と比較した場合、コンジュゲート部分の少なくとも約５０％がオリゴヌクレオチドから切断され、例えば、少なくとも約６０％が切断され、例えば、少なくとも約７０％が切断され、例えば、少なくとも約８０％が切断され、例えば、少なくとも約８５％が切断され、例えば、少なくとも約９０％が切断され、例えば、コンジュゲート部分の少なくとも約９５％がオリゴヌクレオチドから切断される。

【0233】

領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａ又は第１の領域）に共有結合させるのに役立つリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位又はアミノアルキル基等の反復単位の鎖構造又はオリゴマーを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを、以下の領域要素Ａ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｙ－Ｃ、Ａ－Ｙ－Ｂ－Ｃ又はＡ－Ｙ－Ｃから構築することができる。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、アミノアルキル、例えばＣ６～Ｃ１２アミノアルキル基を含むＣ２～Ｃ３６アミノアルキル基である。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。

【0234】

好ましくは、切断可能なリンカーは、本発明のコンジュゲートをその標的細胞に送達した後に切断される。例えば、標的細胞（例えば、肝臓細胞）へのコンジュゲートのＧａｌＮＡｃ媒介送達後にリンカーが切断され、裸の化合物が活性薬物として残る。例えば、実施例の節で試験したコンジュゲートは、ＣＡジヌクレオチドリンカーを含有する。

【0235】

薬学的に許容され得る塩
「薬学的に許容され得る塩」という用語は、生物学的に又は別様に望ましくないものではない、遊離塩基又は遊離酸の生物学的有効性及び特性を保持する塩を指す。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、特に塩酸、並びに、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ－アセチルシステイン等の有機酸と共に形成される。加えて、これらの塩は、無機塩基又は有機塩基を遊離酸に加えることにより調製され得る。無機塩基から誘導される塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウムの塩が含まれるがこれらに限定されない。有機塩基から誘導される塩には、第一級、第二級、及び第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環式アミン及び塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニン、Ｎ－エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂の塩が含まれるが、これらに限定されない。本発明の化合物は、双性イオンの形態で存在することもあり得る。特に好ましくは、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容され得る塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、及びメタンスルホン酸の塩である。

【0236】

処置
本明細書で使用される場合、「処置」という用語は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患又は障害）の処置、又は疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される処置は、いくつかの実施形態では、予防的であり得ることが認識されよう。予防とは、ＨＢＶ感染症が慢性ＨＢＶ感染症に転化するのを防ぐこと、又は慢性ＨＢＶ感染症による肝硬変及び肝細胞癌腫等の重篤な肝疾患を予防することと理解することができる。

【0237】

予防
本明細書において、「予防すること」、「予防」、又は「予防する」という用語は、予防的処置、すなわち、その目的が疾患を治癒することよりむしろ予防することである、測定又は手段に関する。予防とは、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果が、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防するという観点から、予防的に得られることを意味する。したがって、本明細書における「ＨＢＶ感染症を予防する」とは、対象におけるＨＢＶ感染症の発生を予防すること、及びＨＢＶ感染症の症状の発生を予防することを含む。本発明では、特に、ＨＢＶに感染した母親からの小児におけるＨＢＶ感染症の予防が企図される。また、急性ＨＢＶ感染症が慢性ＨＢＶ感染症に変化することを防ぐことも企図される。

【0238】

患者
本発明の目的について、「対象」又は「患者」は、脊椎動物であり得る。本発明に関連して、「対象」という用語は、ヒト及び他の動物、特に哺乳動物と、他の生物との両方を含む。したがって、本明細書に提供される手段及び方法は、ヒト治療及び獣医学的用途の両方に適用可能である。したがって、本明細書では、対象は、マウス、ラット、ハムスタ、ウサギ、モルモット、フェレット、ネコ、イヌ、ニワトリ、ヒツジ、ウシ種、ウマ、ラクダ、又は霊長類等の動物であり得る。好ましくは、対象は、哺乳動物である。より好ましくは、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、患者は、ＨＢＶ感染症等の本明細書で言及される疾患に罹患している。いくつかの実施形態では、患者は当該疾患にかかりやすい。
［発明を実施するための形態］

【0239】

感染肝細胞におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の共有結合的に閉じた環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）は持続的な慢性感染症及び再活性化に関与し、全てのウイルスサブゲノム転写物及びプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）の鋳型であって、新たに合成されたウイルス子孫と細胞内ヌクレオカプシド再循環を介したｃｃｃＤＮＡプール補充との両方を確実にする。ＲＴＥＬ１はｃｃｃＤＮＡ安定性に関連する。ＲＴＥＬ１の阻害は、ＨＢＶ感染対象におけるｃｃｃＤＮＡの不安定化をもたらし、これは次に、慢性感染ＨＢＶ患者の完全治癒の機会を開く。

【0240】

本発明の一態様は、ＨＢＶ感染症、特に慢性ＨＢＶ感染症の処置及び／又は予防に使用するための、ＲＴＥＬ１を標的とする増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はそのコンジュゲートである。

【0241】

一実施形態では、ＲＴＥＬ１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、例えば、ＲＴＥＬ１タンパク質の発現、ＲＴＥＬ１タンパク質のｃｃｃＤＮＡへの結合を減少させ、それによって感染細胞、例えばＨＢＶ感染細胞においてｃｃｃＤＮＡ及び／又はｐｇＲＮＡを減少させることができる。

【0242】

一実施形態では、ＲＴＥＬ１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、ＨＢＶ感染個体においてｉｎ ｖｉｖｏでＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇを減少させることができる。

【0243】

一実施形態では、ＲＴＥＬ１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、ＨＢＶ感染個体においてｉｎ ｖｉｖｏでｃｃｃＤＮＡを減少させることができる。

【0244】

一実施形態では、ＲＴＥＬ１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、ＨＢＶ感染個体においてｉｎ ｖｉｖｏでｐｇＤＮＡを減少させることができる。

【0245】

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明の増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、ＲＴＥＬ１転写物を標的とすることができ、ＲＮａｓｅ Ｈ切断を介してその分解を促進するため、潜在的に優れたＲＴＥＬ１阻害剤である。

【0246】

本発明の一態様は、ＨＢＶ感染症の処置及び／又は予防に使用するための増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートである。

【0247】

本発明のセクションは、ＨＢＶ感染症の処置及び／又は予防に好適な新規のオリゴヌクレオチドを解説する。

【0248】

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＲＴＥＬ１の発現を阻害することができる。阻害は、ＲＴＥＬ１をコードする又はＲＴＥＬ１の調節に関与する標的核酸に、オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより達成される。標的核酸は、配列番号１及び／又は２の配列といった哺乳動物ＲＴＥＬ１配列であり得る。

【0249】

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、標的の発現を阻害又はダウンレギュレートすることにより調節することができる。好ましくは、そのような調節は、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも２０％、より好ましくは、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の阻害をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、ＰＸＢ－ＰＨＨ細胞において１０μＭを使用して、ＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡの発現レベルをｉｎ ｖｉｔｒｏで少なくとも６０％又は７０％阻害することができる場合がある。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、ＰＸＢ－ＰＨＨ細胞において１０μＭを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで少なくとも５０％のＲＴＥＬ１タンパク質の発現レベルを阻害することができ、この範囲の標的減少は、ｃｃｃＤＮＡ減少との良好な相関を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択する点で有利である。適切には、実施例は、ＲＴＥＬ１ ＲＮＡ阻害を測定するために使用され得るアッセイを提供する（例えば、実施例１）。標的阻害は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間のミスマッチを含む。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、ＲＴＥＬ１発現の所望の阻害を示すのに尚充分であり得る。ミスマッチから生じる結合親和性の低下は、オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド数の増加、及び／又は、標的への結合親和性を増加させることができる修飾ヌクレオシド、例えばオリゴヌクレオチド配列内に存在する、ＬＮＡを含む２’糖修飾ヌクレオシドの数の増加により有利に補償され得る。

【0250】

本発明の一態様は、１２～６０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば少なくとも１２～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、哺乳動物ＲＴＥＬ１標的核酸、特にヒトＲＴＥＬ１核酸に対して少なくとも９５％相補的、例えば完全に相補的である、増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＴＥＬ１の発現を阻害することができる。

【0251】

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号７の標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性、例えば完全な相補性を有する、１２～２２ヌクレオチド、例えば１５～２０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。

【0252】

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号８の標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性、例えば完全な相補性を有する、１５～１８ヌクレオチド、例えば１７又は１８ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。

【0253】

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号９の標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性、例えば完全な相補性を有する、１５～１９ヌクレオチド、例えば１８又は１９ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。

【0254】

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性、例えば完全な相補性を有する、１５～１８ヌクレオチド、例えば１７又は１８ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。

【0255】

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性、例えば完全な相補性を有する、１２～２２ヌクレオチド、例えば１７～２２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。

【0256】

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１の以下の領域：配列番号１の８６８１～８７０１；配列番号１の１１７５３～１１７７４；例えば、配列番号１のヌクレオチド１１７５７－１１７７４、１１７５６～１１７７４、又は１１７５３～１１７７０から選択される標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性、例えば完全な相補性を有する、１５～２２ヌクレオチド、例えば１５～１８ヌクレオチド、例えば１７又は１８ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。

【0257】

本発明の一態様は、１２～３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、哺乳動物ＲＴＥＬ１に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

【0258】

本発明の更なる態様は、配列番号１の標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性を有する、例えば完全に相補的である、１２～２０、例えば１５～２２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

【0259】

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長の連続配列を含み、これは、標的核酸又は標的配列の領域と、少なくとも９０％相補的、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、又は１００％相補的である。

【0260】

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域に完全に相補的（１００％相補的）である場合、又はいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に１つ又は２つのミスマッチを含み得る場合に有利である。

【0261】

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、配列番号１の対応する標的核酸領域に対して１００％相補的である。

【0262】

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１及び配列番号２の標的核酸に対して少なくとも９５％相補性、例えば完全に（又は１００％）相補的である。

【0263】

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、配列番号３、４、５、及び６からなる群から選択される核酸塩基の配列、又はその少なくとも１４個の連続ヌクレオチドを含む。

【0264】

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、１０～３０ヌクレオチド長、例えば１２～２５、例えば１１～２２、例えば１２～２０、例えば１４～１８又は１４～１６連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれからなる。

【0265】

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、２２以下のヌクレオチド、例えば２０以下のヌクレオチド、例えば１８以下のヌクレオチド、例えば１４、１５、１６又は１７ヌクレオチドを含むか、又はそれからなる。本明細書で提供されるいずれの範囲も、範囲の終点を含むことを理解するべきである。したがって、オリゴヌクレオチドが１０～３０ヌクレオチドを含むと記される場合、１０ヌクレオチド及び３０ヌクレオチドの両方が含まれる。

【0266】

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる。

【0267】

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号３、４、５、及び６ら選択される配列を含むか、又はそれからなる。

【0268】

本発明は、長さが１２～２４ヌクレオチド長、例えば１２～１８ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号７に存在する、少なくとも１２個、例えば少なくとも１３個、例えば少なくとも１４個、例えば少なくとも１５個、又は少なくとも１６個の連続ヌクレオチドを含む、連続ヌクレオチド配列を含む。

【0269】

本発明は、長さが１２～２４ヌクレオチド長、例えば１２～１８ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号８に存在する、少なくとも１２個、例えば少なくとも１３個、例えば少なくとも１４個、例えば少なくとも１５個、又は少なくとも１６個の連続ヌクレオチドを含む、連続ヌクレオチド配列を含む。

【0270】

本発明は、長さが１２～２４ヌクレオチド長、例えば１２～１８ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号９に存在する、少なくとも１２個、例えば少なくとも１３個、例えば少なくとも１４個、例えば少なくとも１５個、又は少なくとも１６個の連続ヌクレオチドを含む、連続ヌクレオチド配列を含む。

【0271】

本発明は、長さが１２～２４ヌクレオチド長、例えば１２～１８ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０に存在する、少なくとも１２個、例えば少なくとも１３個、例えば少なくとも１４個、例えば少なくとも１５個、又は少なくとも１６個の連続ヌクレオチドを含む、連続ヌクレオチド配列を含む。

【0272】

本発明は、長さが１２～２４ヌクレオチド長、例えば１２～１８ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１１に存在する、少なくとも１２個、例えば少なくとも１３個、例えば少なくとも１４個、例えば少なくとも１５個、又は少なくとも１６個の連続ヌクレオチドを含む、連続ヌクレオチド配列を含む。

【0273】

有利な実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、例えば１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含む。修飾ヌクレオシド（複数可）の１つ以上がロックド核酸（ＬＮＡ）である場合、有利である。

【0274】

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡヌクレオシドを含む。

【0275】

本発明のオリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態では、全てのＬＮＡヌクレオシドは、β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドである。

【0276】

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含む。

【0277】

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む。

【0278】

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含む。

【0279】

有利には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列の最も３’側のヌクレオシドは、２’糖修飾ヌクレオシドである。

【0280】

有利には、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエート等の少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。

【0281】

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0282】

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ホスホロジチオエートヌクレオシド間結合である。

【0283】

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合である。

【0284】

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列内の全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0285】

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列内の少なくとも７５％のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0286】

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列内の全てのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0287】

本発明の有利な実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ Ｈ、例えばＲＮａｓｅ Ｈ１を動員することができる。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、ギャップマーである。

【0288】

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーからなるか又はそれを含む。

【0289】

いくつかの実施形態では、領域Ｇは、６～１６個のＤＮＡヌクレオシド、例えば１１～１６個のＤＮＡヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態では、領域Ｆは２～４個のＤＮＡヌクレオシドを含み、及び／又は、領域Ｆ’は２～６個のＤＮＡヌクレオシドを含む。

【0290】

いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’はそれぞれ、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む。

【0291】

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、均一フランクを有するＬＮＡギャップマーである。例えば、均一なフランクを有するＬＮＡギャップマーは、以下の設計から選択される設計を有し得る：４－１２－２、２－１３－４及び２－１２－５。表６は、各モチーフ配列の好ましい設計を列挙している。

【0292】

本発明のいくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、交互フランクＬＮＡギャップマーである。いくつかの実施形態では、交互フランクＬＮＡギャップマーは、少なくとも１つの交互フランク（フランクＦ’等）を含む。いくつかの実施形態では、交互フランクＬＮＡギャップマーは、１つの交互フランク（フランクＦ’等）及び１つの均一フランク（フランクＦ等）を含む。例えば、１つの交互のＦ’フランクを有するＬＮＡギャップマーは、以下の設計を有し得る：２－１１－１－２－１－３。

【0293】

本発明は、以下のオリゴヌクレオチド化合物を提供する（表６）：

【表6】

表中の見出し「オリゴヌクレオチド化合物」とは、モチーフ配列の特定の設計を表す。大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。「設計」という見出しは、ギャップマー設計、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を指す。古典的なギャップマー設計、すなわち均一なフランク（例えば４－１２－２）を有するギャップマーでは、フランク（Ｆ及びＦ’）中の全てのヌクレオチドは、同じタイプの２’糖修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡ、ｃＥＴ又はＭＯＥ、及びギャップ（Ｇ）を形成する中央のＤＮＡのストレッチで構成される。交互のフランク設計を有するギャップマーでは、オリゴヌクレオチドのフランクは一連の整数として注釈が付けられ、いくつかのβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシド（Ｌ）とそれに続くいくつかのＤＮＡヌクレオシド（Ｄ）を表す。例えば、１－２－１－１－３モチーフを有するフランクＦ’は、ＬＤＤＬＤＬＬＬを表す（ＣＭＰ ＩＤ番号６＿１を参照）。両方のフランクは５’末端及び３’末端にβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを有する。ギャップ領域（Ｇ）は、フランクの間に位置するいくつかのＤＮＡヌクレオシドで構成されている。

【0294】

本発明のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ－ＩＤ番号３＿１、４＿１、５＿１及び６＿１からなるオリゴヌクレオチド化合物の群から選択される（表６を参照）。

【0295】

全ての場合において、Ｆ－Ｇ－Ｆ’設計は、「オリゴヌクレオチド中の領域Ｄ’又はＤ”」の「定義」セクションに記載されるように、領域Ｄ’及び／又はＤ”を更に含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマー領域の５’末端又は３’末端、例えば５’末端に、１、２、又は３個のホスホジエステル結合ヌクレオシド単位、例えばＤＮＡ単位を有する。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、２つの５’ホスホジエステル結合ＤＮＡヌクレオシドと、続いて上記に定義したＦ－Ｇ－Ｆ’ギャップマー領域と、からなる。５’末端又は３’末端にホスホジエステル結合ＤＮＡ単位を含むオリゴヌクレオチドは、コンジュゲーションに好適であり、本明細書に記載されるようなコンジュゲート部分を更に含み得る。肝臓への送達では、ＡＳＧＰＲ標的化部分は、コンジュゲート部分として特に有利である。更なる詳細についてはコンジュゲート部分を参照されたい。
コンジュゲート

【0296】

ＨＢＶ感染症は主に肝臓内の肝細胞に影響を及ぼすので、本発明の増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、非コンジュゲートアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して肝臓へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達を増加させるコンジュゲート部分にコンジュゲートすることが有利である。一実施形態では、肝臓標的化部分は、コレステロール若しくは他の脂質を含む部分、又はアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合することができるコンジュゲート部分から選択される。

【0297】

いくつかの実施形態では、本発明は、コンジュゲート部分に共有結合した本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートを提供する。

【0298】

アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）コンジュゲート部分は、ガラクトースと同等以上の親和性でアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＰＧＲ標的化部分）に結合することができる、１つ以上の炭水化物部分を含む。アシアロ糖タンパク質受容体に対する多数のガラクトース誘導体の親和性が研究されており（例えば、Ｊｏｂｓｔ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｋ．ＪＢ．Ｃ．１９９６，２７１，６６８６を参照）、又は当技術分野で典型的な方法を用いて容易に決定される。

【0299】

一実施形態では、コンジュゲート部分は、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－ホルミル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブタノイル－ガラクトサミン、及びＮ－イソブタノイルガラクサミンからなる群より選択される、少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分を含む。有利には、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。

【0300】

ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分を生成するために、ＡＳＰＧＲ標的化部分（好ましくは、ＧａｌＮＡｃ）をコンジュゲート足場に付着させることができる。一般に、ＡＳＰＧＲ標的化部分は、足場の同じ末端にあり得る。一実施形態では、コンジュゲート部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ得るブランチャー分子に各ＧａｌＮＡｃ部分を連結するスペーサーに連結された、２～４個の末端ＧａｌＮＡｃ部分からなる。

【0301】

更なる実施形態では、コンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分に関して、一価、二価、三価、又は四価である。有利には、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む。

【0302】

ＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分としては、例えば、国際公開第２０１４／１７９６２０号及び同第２０１６／０５５６０１号及び国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５９０８０号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているもの、並びに、Ｔｙｒ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－（アミノヘキシルＧａｌＮＡｃ）３（ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３等のＧａｌＮＡｃ部分が結合した小さなペプチド；肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に結合するグリコトリペプチド、例えば、Ｄｕｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２０００，３１３，２９７；リシン系ガラクトースクラスター（例えば、Ｌ３Ｇ４；Ｂｉｅｓｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｄｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，１９９９，２１４）；及びコラン系ガラクトースクラスター（例えば、アシアロ糖タンパク質受容体に対する炭水化物認識モチーフ）を挙げることができる。

【0303】

ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分、特に三価ＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分は、当該技術分野で公知の方法を用いてオリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端に結合することができる。一実施形態では、ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの５’末端に連結される。

【0304】

一実施形態では、コンジュゲート部分は、図５に示すような三価のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。一実施形態では、コンジュゲート部分は、図５Ａ－１若しくは図５Ａ－２の三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、又はその両方の混合物である。一実施形態では、コンジュゲート部分は、図５Ｂ－１若しくは図５Ｂ－２の三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、又はその両方の混合物である。一実施形態では、コンジュゲート部分は、図５Ｃ－１若しくは図５Ｃ－２の三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、又はその両方の混合物である。一実施形態では、コンジュゲート部分は、図５Ｄ－１若しくは図５Ｄ－２の三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、又はその両方の混合物である。

【0305】

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、以下からなる群から選択される。
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏＡ_ｓＡ_ｓＴ_ｓＴ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｃ_ｓａ_ｓｔ_ｓａ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｇ_ｓＧ_ｓＴ_ｓ，
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏＡ_ｓＡ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｃ_ｓａ_ｓｔ_ｓａ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｃ_ｓｔ_ｓＧ_ｓＧ_ｓＴ_ｓ ^ｍＣ_ｓ，
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ ^ｍＣ_ｓＴ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓａ_ｓａ_ｓｃ_ｓｔ_ｓＴ_ｓｇ_ｓａ_ｓＡ_ｓｔ_ｓ ^ｍＣ_ｓＴ_ｓ ^ｍＣ_ｓ、及び
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ Ｔ_ｓＴ_ｓａ_ｓｃ_ｓａ_ｓｔ_ｓａ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｇ_ｓｇ_ｓｔ_ｓ ^ｍＣ_ｓＡ_ｓＡ_ｓＡ_ｓ

【0306】

大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５－メチルシトシンであり、下付き文字ｓはホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し、下付き文字ｏはホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し、ＧＮ２－Ｃ６は、三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、例えば図５Ｄ－１又は図５Ｄ－２の三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）等の図５に示すもの、又は両方の混合物である。

【0307】

いくつかの分子を表す化学図を図１～図４に示す。

【0308】

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、図１に示されるコンジュゲートである。

【0309】

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、図２に示されるコンジュゲートである。

【0310】

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、図３に示されるコンジュゲートである。

【0311】

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、図４に示されるコンジュゲートである。

【0312】

図１～４に示す化合物は、プロトン化形態で示される。ホスホロチオエート結合上のＳ原子がプロトン化されている。プロトンの存在は分子の環境の酸性度、及び、（例えば、オリゴヌクレオチドが塩形態でであるときの）代替のカチオンの存在によって変化することが理解されよう。プロトン化ホスホロチオエートは互変異性形態で存在する。
薬学的に許容され得る塩

【0313】

本発明による化合物は、その薬学的に許容され得る塩の形態で存在してもよい。「薬学的に許容され得る塩」という用語は、本発明の化合物の生物学的有効性及び特性を保持し、適切な非毒性の有機若しくは無機酸又は有機若しくは無機塩基から形成される従来の酸付加塩又は塩基付加塩を指す。酸付加塩には、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸及び硝酸等の無機酸に由来するもの、並びにｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸等の有機酸に由来するもの等が含まれる。塩基付加塩としては、アンモニウム、カリウム、ナトリウム及び第四級アンモニウムヒドロキシド、例えば、テトラメチルアンモニウムヒドロキシドに由来するものが挙げられる。薬学的化合物の塩への化学修飾は、化合物の改善された物理的及び化学的安定性、吸湿性、流動性並びに溶解性を得るために、薬学者に周知の技術である。これは例えば、Ｂａｓｔｉｎ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０００，４，４２７－４３５ ｏｒ ｉｎ Ａｎｓｅｌ，Ｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，６ｔｈ ｅｄ．（１９９５），ｐｐ．１９６ ａｎｄ １４５６－１４５７に記載されている。例えば、本明細書で提供される化合物の薬学的に許容され得る塩は、ナトリウム塩であり得る。

【0314】

更なる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩、例えば、薬学的に許容され得るナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩を提供する。

【0315】

製造方法
更なる態様では、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチドからなる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供する。好ましくは、この方法は、ホスホロアミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１５４，ｐａｇｅｓ ２８７－３１３を参照）。更なる実施形態では、この方法は、連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることを更に含む。更なる態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又はアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物を製造するための方法が提供される。

【0316】

医薬組成物
更なる態様では、本発明は、前述のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドコンジュゲート又はその塩のいずれかと、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む、医薬組成物を提供する。薬学的に許容され得る希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容され得る塩には、限定するものではないが、ナトリウム塩及びカリウム塩が含まれる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容され得る希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、薬学的に許容され得る希釈剤中５０～３００μＭ溶液の濃度で使用される。

【0317】

本発明での使用に適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５に見られる。薬物送達の方法の簡単な概説については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３，１９９０）を参照されたい。国際公開第２００７／０３１０９１号は、薬学的に許容され得る希釈剤、担体及びアジュバントの適切で好ましい更なる例を提供する（参照により本明細書に組み込まれる）。適切な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組合せ、プロドラッグ製剤もまた、国際公開第２００７／０３１０９１号に提供されている。

【0318】

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはそのコンジュゲート、又はその薬学的に許容され得る塩は、固体形態、例えば粉末、例えば凍結乾燥粉末である。

【0319】

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、医薬組成物又は製剤の調製の調整のために、薬学的に許容され得る活性物質又は不活性物質と混合され得る。医薬組成物の調製のための組成及び方法は、限定されるものではないが、投与経路、疾患の程度、又は投与される用量を含む多くの基準に依存する。

【0320】

これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌されても、又は滅菌フィルタにかけられてもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装するか、又は凍結乾燥することができ、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には３～１１、より好ましくは５～９又は６～８、最も好ましくは７～８、例えば７～７．５であろう。得られた固体形態の組成物は、錠剤又はカプセルの密封パッケージ等のように、各々が上記の薬剤又は薬剤群の固定量を含む複数の単回用量単位で包装することができる。固体形態の組成物はまた、局所適用可能なクリーム又は軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブ等の柔軟な量の容器に包装することもできる。

【0321】

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートはプロドラッグである。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞に送達されると、コンジュゲート部分はオリゴヌクレオチドから切断される。

【0322】

用途
本発明の増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療及び予防法のための研究試薬として利用され得る。

【0323】

研究では、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物）及び実験動物におけるＲＴＥＬ１タンパク質の合成を特異的に調節し、それによって標的の機能分析又は治療的介入の標的としてのその有用性の評価を促進することができる。典型的には、標的調節は、タンパク質を生成するｍＲＮＡを分解又は阻害し、それによってタンパク質形成を防止することによって、又はタンパク質を生成する遺伝子若しくはｍＲＮＡのモジュレータを分解若しくは阻害することによって達成される。

【0324】

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを研究又は診断に使用する場合、標的核酸は、ｃＤＮＡ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡに由来する合成核酸であり得る。

【0325】

本発明はまた、ＲＴＥＬ１を発現している標的細胞においてＲＴＥＬ１発現を調節するためのｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物を該細胞に投与することを含む、方法も包含する。

【0326】

いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。標的細胞は、哺乳動物の組織の一部を形成するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物又はｉｎ ｖｉｖｏ細胞であってよい。好ましい実施形態では、標的細胞は、肝臓中に存在する。標的細胞は肝細胞であってもよい。

【0327】

本発明の一態様は、医薬として使用する本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物に関する。

【0328】

本発明の一態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物は、感染細胞中のｃｃｃＤＮＡレベルを低下させることができ、したがってＨＢＶ感染症を阻害することができる。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、感染細胞中における以下のパラメータ（ｉ）ｃｃｃＤＮＡの減少、及び／又は（ｉｉ）ｐｇＲＮＡの減少、及び／又は（ｉｉｉ）ＨＢＶ ＤＮＡの減少、及び／又は（ｉｖ）ＨＢＶウイルス抗原の減少のうちの１つ以上に影響を及ぼすことができる。

【0329】

例えば、ＨＢＶ感染症を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、（ｉ）感染細胞中のｃｃｃＤＮＡレベルを、対照と比較して、少なくとも４０％、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％減少、又は（ｉｉ）ｐｇＲＮＡレベルを、少なくとも４０％、対照と比較して、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％減少させることができる。対照は、未処置の細胞若しくは動物、又は適切な対照で処理された細胞若しくは動物であり得る。

【0330】

ＨＢＶ感染症の阻害は、ＨＢＶに感染した初代ヒト肝細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで、又はヒト化肝細胞ＰＸＢマウスモデル（ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏから入手可能、また、Ｋａｋｕｎｉ ｅｔ ａｌ ２０１４ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．１５：５８－７４も参照されたい）を用いてｉｎ ｖｉｖｏで測定することができる。ＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇの分泌阻害は、製造業者の指示に従って、例えばＣＬＩＡ ＥＬＩＳＡキット（Ａｕｔｏｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）を用いてＥＬＩＳＡにより測定することができる。細胞内ｃｃｃＤＮＡ又はＨＢＶ ｍＲＮＡ及びｐｇＲＮＡの減少は、例えば、材料及び方法セクションに記載されるように、ｑＰＣＲによって測定することができる。試験化合物がＨＢＶ感染症を阻害するかどうかを評価するための更なる方法は、例えば国際公開第２０１５／１７３２０８号に記載されている通りｑＰＣＲにより、又はノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、又は免疫蛍光を用いて、ＨＢＶ ＤＮＡの分泌を測定することである。

【0331】

ＲＴＥＬ１レベルの低下により、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物を使用して、ＨＢＶ感染症の発症又は処置を阻害することができる。特に、本発明のｃｃｃＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物の不安定化及び低減は、ＨＢｓＡｇの分泌のみを減少させる化合物と比較して、慢性ＨＢＶ感染症の発症をより効率的に阻害又は処置する。

【0332】

したがって、本発明の一態様は、ＨＢＶ感染個体におけるｃｃｃＤＮＡ及び／又はｐｇＲＮＡを減少させるための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物の使用に関する。

【0333】

本発明の更なる態様は、慢性ＨＢＶ感染症の発症を阻害又は処置するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物の使用に関する。

【0334】

本発明の更なる態様は、ＨＢＶ感染者の感染性を低下させるための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物の使用に関する。本発明の特定の態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物は、慢性ＨＢＶ感染症の発症を阻害する。

【0335】

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物（又は本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、若しくは医薬組成物を予防的に受容するもの）で処置される対象は、好ましくはヒトであり、より好ましくはＨＢｓＡｇ陽性及び／又はＨＢｅＡｇ陽性のヒト患者であり、より好ましくはＨＢｓＡｇ陽性及びＨＢｅＡｇ陽性のヒト患者である。

【0336】

したがって、本発明は、有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物を投与することを含む、ＨＢＶ感染症を処置する方法に関する。本発明は更に、慢性ＨＢＶ感染症に起因する肝硬変及び肝細胞癌腫を予防する方法に関する。

【0337】

本発明はまた、医薬、特にＨＢＶ感染症若しくは慢性ＨＢＶ感染症の処置、又はＨＢＶ感染者の感染性の低減に使用する医薬の製造のための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物の使用を提供する。好ましい実施形態では、医薬は、皮下投与のための剤形で製造される。

【0338】

本発明はまた、医薬を製造するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、医薬組成物の使用を提供し、該医薬は静脈内投与のための剤形である。

【0339】

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート又は医薬組成物は、併用療法において使用され得る。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物は、ＨＢＶの処置及び／又は予防のために、インターフェロンα－２ｂ、インターフェロンα－２ａ、及びインターフェロンアルファコン－１（ペグ化及び非ペグ化）、リバビリン、ラミブジン（３ＴＣ）、エンテカビル、テノホビル、テルビブジン（ＬｄＴ）、アデホビル等の他の抗ＨＢＶ剤、又はＨＢＶ ＲＮＡ複製阻害剤、ＨＢｓＡｇ分泌阻害剤、ＨＢＶカプシド阻害剤、アンチセンスオリゴマー（例えば、国際公開第２０１２／１４５６９７号、同第２０１４／１７９６２９号、及び同第２０１７／２１６３９０号に記載）、ｓｉＲＮＡ（例えば、国際公開第２００５／０１４８０６号、同第２０１２／０２４１７０号、同第２０１２／２０５５３６２号、同第２０１３／００３５２０号、同第２０１３／１５９１０９号、同第２０１７／０２７３５０号、及び同第２０１７／０１５１７５号に記載）、ＨＢＶ治療ワクチン、ＨＢＶ予防ワクチン、ＨＢＶ抗体療法（単クローン性又は多クローン性）、又はＴＬＲ２、３、７、８、若しくは９アゴニスト等の他の抗ＨＢＶ剤と組み合わせてもよい。

【0340】

併用療法
いくつかの実施形態では、本発明の増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物は、別の治療薬との併用処置で使用するためのものである。治療剤は、例えば、上記の疾患又は障害の標準ケアであり得る。

【0341】

例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物は、アンチセンス（他のＬＮＡオリゴマーを含む）、ｓｉＲＮＡ（ＡＲＣ５２０等）、アプタマ、モルホリノ、又は任意の他の抗ウイルス、ヌクレオチド配列依存性作用様式のいずれかを介して作用する、オリゴヌクレオチド系抗ウイルス剤、例えば配列特異的オリゴヌクレオチド系抗ウイルス剤等の他の活性剤と組み合わせて使用することができる。

【0342】

更なる例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物は、インターフェロン（例えば、ペグ化インターフェロンα）、ＴＬＲ７アゴニスト（例えば、ＧＳ－９６２０）、又は治療ワクチン等の免疫刺激抗ウイルス化合物といった他の活性物質と組み合わせて使用することができる。

【0343】

更なる例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物は、抗ウイルス活性を有する他の活性物質、例えば小分子と組み合わせて使用することができる。これらの他の活性物質は、例えば、ヌクレオシド／ヌクレオチド阻害剤（例えば、エンテカビル又はテノホビル・ジソプロキシルフマル酸塩）、封入阻害剤、侵入阻害剤（例えば、Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ Ｂ）であり得る。

【0344】

特定の実施形態では、追加の治療剤は、ＨＢＶ薬、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）薬、化学療法薬、抗生物質、鎮痛薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、抗真菌薬、抗寄生虫薬、制吐薬、下痢止め薬、又は免疫抑制薬であり得る。

【0345】

特に、関連する実施形態では、追加のＨＢＶ剤は、インターフェロンα－２ｂ、インターフェロンα－２ａ、及びインターフェロンアルファコン－１（ペグ化及び非ペグ化）、リバビリン；ＨＢＶ ＲＮＡ複製阻害薬；第２のアンチセンスオリゴマー；ＨＢＶ治療ワクチン；ＨＢＶ予防ワクチン；ラミブジン（３ＴＣ）；エンテカビル（ＥＴＶ）；フマル酸テノホビルジイソプロキシル（ＴＤＦ）；テルビブジン（ＬｄＴ）；アデホビル；又はＨＢＶ抗体療法（単クローン性又は多クローン性）であり得る。

【0346】

他の特定の関連する実施形態では、更なるＨＣＶ剤は、インターフェロンα－２ｂ、インターフェロンα－２ａ、及びインターフェロンアルファコン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｌｐｈａｃｏｎ）－１（ペグ化及び非ペグ化）；リバビリン；ペガシス；ＨＣＶ ＲＮＡ複製阻害剤（例えば、ＶｉｒｏＰｈａｒｍａ社製ＶＰ５０４０６シリーズ）；ＨＣＶアンチセンス剤；ＨＣＶ治療ワクチン；ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤；ＨＣＶヘリカーゼ阻害剤；又はＨＣＶモノクローナル抗体療法若しくはＨＣＶポリクローナル抗体療法であり得る。

【0347】

投与
本発明の増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート又は医薬組成物は、局所（例えば、皮膚に対して、吸入、眼又は耳等）又は経腸（例えば、経口的に、又は消化管を通して）又は非経口（例えば、静脈内、皮下、又は筋肉内）で投与され得る。

【0348】

好ましい実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート又は医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内投与を含む非経口経路によって投与される。一実施形態では、活性アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは静脈内投与される。別の実施形態では、活性アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは皮下投与される。

【0349】

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート又は医薬組成物は、０．１～１５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２～１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２５～５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与は、週に１回、２週に１回、３週に１回、又は月に１回であり得る。

【0350】

本発明はまた、医薬の製造のために記載された本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの使用も提供し、該医薬は皮下投与のための剤形である。
本発明の実施形態

【0351】

本発明の以下の実施形態は、本明細書に記載される任意の他の実施形態と組み合わせて使用することができる。上記の、特に「発明の概要」、「定義」及び「発明の詳細な説明」の項で提供される定義及び説明は、以下に準用される。

【0352】

１．ＲＴＥＬ１核酸に対する少なくとも９０％の相補性、例えば１００％の相補性を有する連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、細胞におけるヒトＲＴＥＬ１等のＲＴＥＬ１の発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0353】

２．前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号１に示されるヒトＲＴＥＬ１プレｍＲＮＡのヌクレオチド１１７５３～１１７７４からの領域、例えば配列番号１のヌクレオチド１１７５７～１１７７４、ヌクレオチド１１７５６～１１７７４又はヌクレオチド１１７５３～１１７７０からの領域に完全に相補的である、実施形態１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0354】

３．前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号７、８、９及び／又は１０と完全に相補的である、実施形態１及び２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0355】

４．前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号１に示されるヒトＲＴＥＬ１プレｍＲＮＡのヌクレオチド８６８１～８７０１からの領域に完全に相補的である、実施形態１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0356】

５．前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号１１と完全に相補的である、実施形態１及び４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0357】

６．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１２～３０ヌクレオチド長、例えば１２～２２ヌクレオチド長、例えば１６～２０ヌクレオチド長である、実施形態１～５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0358】

７．連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１２ヌクレオチド、例えば１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチドの連続配列である、実施形態１～６のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0359】

８．連続ヌクレオチド配列が１８又は１９ヌクレオチドの連続配列である、実施形態７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0360】

９．連続ヌクレオチド配列が、配列番号３、４、５及び６からなる群から選択される配列、又はそれらの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドと１００％同一である、実施形態１～８のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0361】

１０．前記連続ヌクレオチド配列中に１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0362】

１１．前記連続ヌクレオチド配列中の１つ以上の修飾ヌクレオシドが２’糖修飾ヌクレオシドである、実施形態１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0363】

１２．前記１つ以上の２’－糖修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される、実施形態１１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0364】

１３．前記１つ以上の修飾ヌクレオシドが、以下の２’－４’架橋－Ｏ－ＣＨ_２－を有するオキシ－ＬＮＡ等のＬＮＡヌクレオシドである、実施形態１０～１２のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0365】

１４．前記１つ以上の修飾ヌクレオシドがβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである、実施形態１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0366】

１５．前記連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態１～１４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0367】

１６．前記連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロジチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0368】

１７前記連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホジエステルヌクレオシド間結合である、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0369】

１８．前記連続ヌクレオチド配列中の全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態１７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0370】

１９．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＲＮアーゼＨ１等のＲＮアーゼＨを動員することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態１～１８のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0371】

２０．前記アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列が、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーからなる、又はそれを含む、実施形態１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0372】

２１．領域Ｇが、６～１６個のＤＮＡヌクレオシド、例えば１１～１６個のＤＮＡヌクレオシドの長さを有する、実施形態２０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0373】

２２．領域Ｆ及びＦ’がそれぞれ少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含み、例えば、領域Ｆ及びＦ’がそれぞれ少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む、実施形態１９～２１のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0374】

２３．領域Ｆが、１～８個のＤＮＡヌクレオシド、例えば２～４個のＤＮＡヌクレオシドの長さを有する、実施形態１９～２２のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0375】

２４．領域Ｆが、１～８個のＤＮＡヌクレオシド、例えば２～６個のＤＮＡヌクレオシドの長さを有する、実施形態１９～２３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0376】

２５．前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、式Ｆ_２－４－Ｇ_{１１－１６}－Ｆ’_２－６のギャップマーからなるか、又はそれを含む、実施形態１９～２４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0377】

２６．前記ギャップマーが少なくとも一つの交互のフランクを含む、実施形態１９～２５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0378】

２７．前記ギャップマーが２つの均一なフランクを含む、実施形態１９～２５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0379】

２８．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、以下
ＡＡＴＴｔｔａｃａｔａｃｔｃｔｇＧＴ（配列番号３、化合物ＩＤ番号３＿１）、
ＡＡｔｔｔｔａｃａｔａｃｔｃｔＧＧＴＣ（配列番号４、化合物ＩＤ番号４＿１）、
ＴＴａｃａｔａｃｔｃｔｇｇｔＣＡＡＡ（配列番号５、化合物ＩＤ番号５＿１）、及び
ＣＴｔｔａｔｔａｔａａｃｔＴｇａＡｔＣＴＣ（配列番号６、化合物ＩＤ番号６＿１）からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの群から選択され、
大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態１～２７のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【0380】

２９．実施形態１～２８のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート。

【0381】

３０．前記コンジュゲート部分が、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－ホルミル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブタノイル－ガラクトサミン、及びＮ－イソブタノイルガラクサミンからなる群から選択される、少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分を含む、実施形態２９に記載のコンジュゲート。

【0382】

３１．前記アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分が、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である、実施形態３０に記載のコンジュゲート。

【0383】

３２．前記コンジュゲート部分が、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分に関して、一価、二価、三価、又は四価である、実施形態３０又は３１に記載の化合物。

【0384】

３３．前記コンジュゲート部分が、２～４個の末端ＧａｌＮＡｃ部分と、アンチセンス化合物にコンジュゲートされ得るブランチャー分子に各ＧａｌＮＡｃ部分を連結するスペーサーと、からなる、実施形態３２に記載の化合物。

【0385】

３４．前記スペーサーが、ＰＥＧスペーサーである、実施形態３３に記載のコンジュゲート。

【0386】

３５．前記コンジュゲート部分が、三価のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分である、実施形態３０～３４のいずれか１つに記載のコンジュゲート。

【0387】

３６．前記コンジュゲート部分が、図５の三価ＧａｌＮＡｃ部分のうち１つから選択される、実施形態３０～３５のいずれか１つに記載の化合物。

【0388】

３７．前記コンジュゲート部分が、図５の三価ＧａｌＮＡｃ部分、例えば図５Ｄ－１若しくは図５Ｄ－２の三価ＧａｌＮＡｃ部分、又は両方の混合物である、実施系チア３６に記載のコンジュゲート。

【0389】

３８．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドと前記コンジュゲート部分との間に配置されたリンカーを含む、実施形態２９～３７のいずれか１つに記載のコンジュゲート。

【0390】

３９．前記生理学的に不安定なリンカーが、２～５個の連続したホスホジエステル結合ヌクレオシド、例えば２個の連続したホスホジエステル結合ヌクレオシドを含むか、又はそれからなる、実施形態３８に記載のコンジュゲート。

【0391】

４０．前記コンジュゲートが、以下
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏＡ_ｓＡ_ｓＴ_ｓＴ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｃ_ｓａ_ｓｔ_ｓａ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｇ_ｓＧ_ｓＴ，
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏＡ_ｓＡ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｃ_ｓａ_ｓｔ_ｓａ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｃ_ｓｔ_ｓＧ_ｓＧ_ｓＴ_ｓ ^ｍＣ，
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ ^ｍＣ_ｓＴ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓａ_ｓａ_ｓｃ_ｓｔ_ｓＴ_ｓｇ_ｓａ_ｓＡ_ｓｔ_ｓ ^ｍＣ_ｓＴ_ｓ ^ｍＣ，ａｎｄ
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ Ｔ_ｓＴ_ｓａ_ｓｃ_ｓａ_ｓｔ_ｓａ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｇ_ｓｇ_ｓｔ_ｓ ^ｍＣ_ｓＡ_ｓＡ_ｓＡからなる群から選択され、
大文字はベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５－メチルシトシンであり、^ｍｃは５－メチルシトシンＤＮＡであり、下付き文字ｓはホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し、下付き文字ｏはホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し、ＧＮ２－Ｃ６は下記式の残基であり：

【化35】

残基ＧＮ２－Ｃ６は、オリゴヌクレオチドの５’末端にホスホジエステル結合を介して結合しており、及び／又はＧＮ２－Ｃ６は、図５Ｄ１若しくは図５Ｄ２の三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、又は両方の混合物であり、より好ましくは、ＧＮ２－Ｃ６は、図５Ｄ１若しくは図５Ｄ２に示される三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基の混合物である、実施形態２９～３９のいずれか１つに記載のコンジュゲート。

【0392】

４１．図１に示すコンジュゲート。

【0393】

４２．図２に示すコンジュゲート。

【0394】

４３．図３に示すコンジュゲート。

【0395】

４４．図４に示すコンジュゲート。

【0396】

４５．実施形態１～２８のいずれか１つのオリゴヌクレオチド又は実施形態２９～４４のいずれか１つに記載のコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩。

【0397】

４６．実施形態１～２８のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態２９～４４のいずれか１つに記載のコンジュゲート、又は実施形態４５に記載の薬学的に許容され得る塩と、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む、医薬組成物。

【0398】

４７．ＲＴＥＬ１を発現している標的細胞においてＲＴＥＬ１発現を調節するためのｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、前記細胞に、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態２９～４４のいずれか１つに記載のコンジュゲート、実施形態４５に記載の薬学的に許容され得る塩、又は実施形態４６に記載の医薬組成物を有効量で投与することを含む、方法。

【0399】

４８．疾患を処置又は予防するための方法であって、疾患に罹患しているか、又は罹患しやすい対象に、治療有効量又は予防有効量の実施形態１～２８のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態２９～４４のいずれか１つに記載のコンジュゲート、実施形態４５に記載の薬学的に許容され得る塩、又は実施形態４６に記載の医薬組成物を投与することを含み、前記疾患が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症、例えば慢性ＨＢＶ感染症である、方法。

【0400】

４９．薬に使用するための、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態２９～４４のいずれか１つに記載のコンジュゲート、実施形態４５に記載の薬学的に許容され得る塩、又は実施形態４６に記載の医薬組成物。

【0401】

５０．Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症、例えば慢性ＨＢＶ感染症の処置又は予防に使用するための、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態２９～４４のいずれか１つに記載のコンジュゲート、実施形態４５に記載の薬学的に許容され得る塩、又は実施形態４６に記載の医薬組成物。

【0402】

５１．Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症、例えば慢性ＨＢＶ感染症の処置又は予防のための医薬の調整のための、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態２９～４４のいずれか１つに記載のコンジュゲート、実施形態４５に記載の薬学的に許容され得る塩、又は実施形態４６に記載の医薬組成物。

【実施例】

【0403】

材料及び方法
オリゴヌクレオチド合成

【0404】

オリゴヌクレオチド合成は当該技術分野で一般に知られている。以下は、適用できるプロトコルである。本発明のオリゴヌクレオチドは、使用される装置、支持体、及び濃度に関してわずかに異なる方法によって、生成されている場合がある。

【0405】

オリゴヌクレオチドは、Ｏｌｉｇｏｍａｋｅｒ ４８のホスホロアミダイトアプローチを１μｍｏｌスケールで用いて、ウリジンユニバーサル支持体上で合成される。合成の終わりに、オリゴヌクレオチドを、アンモニア水を用いて６０℃で５～１６時間、固体支持体から切断する。オリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）又は固相抽出によって精製し、ＵＰＬＣによって特徴付け、分子量を更にＥＳＩ－ＭＳによって確認する。

【0406】

β－シアノエチル－ホスホロアミダイトのカップリング（ＤＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ－Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｔ、ＬＮＡ－５－メチル－Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ｇ（ｄｍｆ）、又はＬＮＡ－Ｔ）は、アセトニトリル中の０．１Ｍの５’－Ｏ－ＤＭＴ保護アミダイト及びアセトニトリル（０．２５Ｍ）中のＤＣＩ（４，５－ジシアノイミダゾール）の溶液を活性剤として用いて行われる。最終サイクルでは、所望の修飾を有するホスホロアミダイト、例えばコンジュゲート基を結合するためのＣ６リンカー、又はそのようなコンジュゲート基を使用できる。ホスホルチオエート結合を導入するためのチオール化は、水素化キサンタン（アセトニトリル／ピリジン９：１中０．０１Ｍ）を用いることにより行われる。ホスホジエステル結合は、ＴＨＦ／ピリジン／水７：２：１中の０．０２Ｍヨウ素を用いて導入できる。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成に通常使用される試薬である。

【0407】

固相合成後のコンジュゲーションでは、固相合成の最後のサイクルで市販のＣ６アミノリンカーホルフォラミダイトを使用でき、脱保護及び固相支持体からの切断後、アミノ結合脱保護オリゴヌクレオチドが単離される。コンジュゲートは、標準的な合成方法を使用した官能基の活性化によって導入される。

【0408】

粗化合物は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ（登録商標）Ｃ１８ １０μ １５０ｘ１０ｍｍカラムでの取ＲＰ－ＨＰＬＣにより精製される。０．１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ８及びアセトニトリルを５ｍＬ／分の流速で緩衝液として使用する。収集された画分を凍結乾燥して、精製された化合物を典型的には白色固体として得る。

【0409】

略語：
ＤＣＩ：４，５－ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４’－ジメトキシトリチル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル
ＲＰ－ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィ
初代ヒト肝細胞（ＰＸＢ－ＰＨＨ）

【0410】

ヒト化マウス（ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウス）（本明細書ではＰＨＨと呼ばれる）から採取した新鮮な初代ヒト肝細胞（ＰＸＢ－ＰＨＨ）を、ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ（日本）から９６ウェル形式で入手し、改変肝細胞クローン増殖培地（ｄＨＣＧＭ）中で培養した。ｄＨＣＧＭは、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、４４ｍＭのＮａＨＣＯ_３、１５μｇ／ｍｌのＬ－プロリン、０．２５μｇ／ｍｌのインスリン、５０ｎＭのデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、０．１ｍＭのＡｓｃ－２Ｐ、２％のＤＭＳＯ及び１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地である（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

【0411】

細胞を、５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気下において３７℃で培養した。培養培地を、週末を除いて、採取まで２日毎に交換した。

【0412】

ＨＢＶ感染及びオリゴヌクレオチド処置
ＰＨＨを、４％ＰＥＧと共に４０の感染多重度（ＭＯＩ）でＨＢＶ（慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）個体から精製）と２４時間インキュベートした。翌日、ウイルス接種材料を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、新鮮な培地を添加した。

【0413】

ＰＨＨにおけるｃｃｃＤＮＡ確立化合物処置を、ＨＢＶ感染後３日目に開始した。細胞を、１０μＭで開始する１：１０希釈段階用量応答様式で投与した。ＨＢＶ感染後３日目、５日目及び７日目に、細胞に、１００μＩ／ウェルのｄＨＣＧＭ培地の最終容量でオリゴヌクレオチド化合物を投与した。感染後５日目に１０ｎＭのエンテカビル（ＥＴＶ）処置を開始し、ｑＰＣＲによる実際のｃｃｃＤＮＡ測定を確実にし、ＨＢＶ感染後１６日目に細胞が採取されるまで、１０ｎＭのＥＴＶを含む培地を（週末を除いて）２日ごとに交換した。実験を生物学的に三連で行った。

【0414】

細胞内ＲＴＥＬ１ ＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ
製造業者のプロトコルに従って、Ｑｉａｇｅｎ ＢｉｏＲｏｂｏｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｙｓｔｅｍ、及び
ＲＮｅａｓｙ ９６ウェル抽出プレート（ＲＮｅａｓｙ ９６ ＢｉｏＲｏｂｏｔ ８０００ Ｋｉｔ（１２）／カタログ番号ＩＩ Ｄ：９６７１５２）
を使用して細胞から全ｍＲＮＡを抽出した。ＡＢＩ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）１２ｋ ＦｌｅｘでリアルタイムＰＣＲを使用してｍＲＮＡ発現レベルを分析した。β－アクチン（ＡＣＴ Ｂ）を、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４４４４５５８）を用いてｑＰＣＲによって技術的複製で定量した。Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４３８５６１２）を用いて、ＲＴＥＬ１遺伝子に対するｑＰＣＲを行った。結果はヒトＡＣＴ Ｂ内因性対照で正規化した。ｍＲＮＡ発現は、参照遺伝子ＡＣＴ Ｂ及び未処置細胞に対して正規化した比較サイクル閾値２－ΔΔＣｔ法を用いて分析した。ＡＣＴＢ ＲＮＡ及びＲＴＥＬ１ ＲＮＡの定量に用いられるプライマーを表７に列挙する。

【表7】

【0415】

ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの定量
ＤＮＡを、ＳＤＳ溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）を使用してＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞から抽出した。細胞を８０μｌのＳＤＳ溶解緩衝液で溶解した後、試料を－８０℃で最低２時間凍結した。試料を３７℃で解凍し、１μｌのプロテイナーゼＫ（Ａｍｂｉｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのカタログ番号ＡＭ２５４４８、２０ｍｇ／ｍＬストック）を９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、試料を５６℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｄ４０６７）からの３容量のＣｈＩＰ ＤＮＡ結合緩衝液を添加し、製造業者のプロトコルに従ってＤＮＡを精製した。ＤＮＡを２０μｌのＤＮＡ溶出緩衝液で溶出し、２μｌのＤＮＡを用いてｑＰＣＲを行った。

【0416】

ｃｃｃＤＮＡ発現レベルを、比較サイクル閾値２－ΔΔＣｔ法を使用して技術的複製で定量した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ Ｆｌｅｘ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応測定を行った。Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４３８５６１２）を使用して、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｉｔｏＤＮＡ）及び内因性対照として未処置細胞に対して正規化を行った。サイクラー設定を、９５℃で５分間、次いで４５サイクルの９５℃で１秒間、及び６０℃で３５秒間のインキュベーションに調整した。使用したプライマーを以下の表８に列挙する（表中の全てのプローブはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎである）：

【表8】

【0417】

実施例１：ＨＢＶ感染ＰＨＨ細胞におけるＲＴＥＬ１ ＲＮＡ及びｃｃｃＤＮＡに対するＲＴＥＬ１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果。
ＲＴＥＬ１ ＲＮＡ及びｃｃｃＤＮＡに対するＲＴＥＬ１ノックダウンの効果を、表６のオリゴヌクレオチド化合物を用いて試験した。ＰＨＨは、材料及び方法のセクションに記載されている通りに培養した。ＨＢＶ感染ＰＨＨ細胞を、上記の表６の化合物で処置した。１６日間の処置後、ＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡ及びｃｃｃＤＮＡを上記のようにｑＰＣＲによって測定した。結果を、平均薬物なし対照（ＮＤＣ）試料の％として表９に示す（すなわち、値が低いほど、阻害／減少は大きくなる）。

【表9】

化合物について：大文字はＬＮＡヌクレオシドを表し（β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを使用した）、全てのＬＮＡシトシンは５－メチルシトシンであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表す。全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0418】

実施例２：濃度応答曲線のための異なる濃度でのヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株におけるＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性の試験。

【0419】

ヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株はＡＴＣＣから購入し、供給業者による推奨のとおりに、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベーター内で維持した。アッセイでは、３５００細胞／ウェルを培地中の９６マルチウェルプレートに播種した。細胞を２４時間インキュベートした後、ＰＢＳに溶解したオリゴヌクレオチドを添加した。オリゴヌクレオチドの最高スクリーニング濃度：５０μＭ及びその後の８段階の１：１希釈。オリゴヌクレオチドの添加の３日後に、細胞を採取した。ＲＮＡは、製造元の指示に従ってＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｐｒｏ ９６ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、５０μｌの水で溶出した。その後、ＲＮＡをＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリーの水（Ｇｉｂｃｏ）で１０倍希釈し、９０℃に１分間加熱した。

【0420】

遺伝子発現解析では、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを、二重鎖セットアップで、ｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ ＲＯＸ（商標）（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用して実施した。ｑＰＣＲには、以下のＴａｑＭａｎプライマーアッセイを使用した：ＲＴＥＬ１＿Ｈｓ００２４９６６８＿ｍ１ ［ＦＡＭ－ＭＧＢ］及び内因性対照ＧＵＳＢ＿ Ｈｓ９９９９９９０８＿ｍ１ ［ＶＩＣ－ＭＧＢ］。全てのプライマーセットは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＩＣ ５０決定を、ｎ＝２の生物学的複製物からのＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０４において行った。５０μＭオリゴヌクレオチドで処置したときの相対的なＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡレベルを対照（ＰＢＳ処置試料）のパーセントとして表１０に示す。

【表10】

【0421】

化合物は、図７に提供されるヒト細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１における濃度応答曲線が示すように、ヒトＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡのノックダウンに対する非常に良好な有効性及び効力を示す。

【0422】

実施例３：本発明の化合物と従来技術の化合物のｉｎ ｖｉｖｏ有効性の直接比較
この実験では、本発明の化合物（ＣＭＰ ＩＤ番号：３＿１、４＿１、５＿１及び６＿１、例えば表６を参照）を国際公開第２０２０／０１１９０２号Ａ１に開示されている化合物と比較した。試験した先行技術の化合物を表１１（ＣＭＰ ＩＤ番号：７＿１～２３＿１）に示す。具体的には、ヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡレベルに対する効果を試験した。

【0423】

ヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株をＡＴＣＣから購入し、供給業者による推奨のとおりに、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベーター内で維持した。アッセイでは、３５００細胞／ウェルを培地中の９６マルチウェルプレートに播種した。細胞を２４時間インキュベートした後、ＰＢＳに溶解したオリゴヌクレオチドを添加した。オリゴヌクレオチドの最高スクリーニング濃度：５０μＭ及びその後の８段階の１：１希釈。オリゴヌクレオチドの添加の３日後に、細胞を採取した。ＲＮＡは、製造元の指示に従ってＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｐｒｏ ９６ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、５０μｌの水で溶出した。その後、ＲＮＡをＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリーの水（Ｇｉｂｃｏ）で１０倍希釈し、９０℃に１分間加熱した。

【0424】

遺伝子発現解析では、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを、二重鎖セットアップで、ｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ ＲＯＸ（商標）（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用して実施した。ｑＰＣＲには、以下のＴａｑＭａｎプライマーアッセイを使用した：ＲＴＥＬ１＿Ｈｓ００２４９６６８＿ｍ１ ［ＦＡＭ－ＭＧＢ］及び内因性対照ＧＵＳＢ＿ Ｈｓ９９９９９９０８＿ｍ１ ［ＶＩＣ－ＭＧＢ］。全てのプライマーセットは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＩＣ ５０決定を、ｎ＝２の生物学的複製物からのＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０４において行った。５０μＭオリゴヌクレオチドで処置したときの相対的なＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡレベルを対照（ＰＢＳ処置試料）のパーセントとして表１１に示す。結果を図８にも示す。

【表11】

【0425】

実施例４：アンチセンスオリゴヌクレオチドカスパーゼを、ＨｅｐＧ２及び３Ｔ３細胞において１００ｎＭ濃度で２４時間スクリーニングする。

【0426】

この実験では、本発明の化合物（ＣＭＰ ＩＤ番号３＿１、４＿１、５＿１及び６＿１、例えば表６を参照）の毒性を、ＨｅｐＧ２細胞におけるカスパーゼスクリーニングによって評価した。実施例３で試験した従来技術の化合物をこの研究に含めた。さらに、全長ＣＭＰ ＩＤ番号３＿１及び５＿１のより短い代謝産物を分析した（更なる詳細については、実施例６を参照）。

【0427】

ＨｅｐＧ２又は３Ｔ３細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清を補充し、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（３Ｔ３）で完了した、ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ番号４１０９０；ＨｅｐＧ２）を含むＭＥＭ培地又はＧｌｕｔａｍａｘを含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ３１９６６号）中でおよそ７０％コンフルエンスで培養した。細胞を０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ番号２５２０００５６）で剥離し、１×１０^４細胞／ウェル（ＨｅｐＧ２）又は０．２５×１０^４細胞／ウェル（３Ｔ３）の密度で黒色の透明な９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ番号３９０４、米国ニューヨーク州）に播種した。播種の２４時間後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ番号３１９８５）に溶解した１００ｎＭオリゴヌクレオチドを使用して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ番号１１６６８０１９）で細胞を一過性にトランスフェクトした。カスパーゼ－３／７活性を、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用して決定した。再構成カスパーゼ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７試薬をトランスフェクションの２４時間後に細胞に添加し、６０分間インキュベートし、細胞溶解物を不透明な９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ番号３６００、米国ニューヨーク州）に移した後、製造者の指示に従ってＥｎｓｐｉｒｅマルチモードプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で発光を決定した。

【0428】

結果を表１２に示す。

【表12】

【0429】

６０％ＡＷを超える値を有する化合物を毒性（Ｔ）とみなした。４０～６０％ＡＷの値を有する化合物を中程度の毒性（ＭＴ）とみなした。２０～４０％ＡＷの値を有する化合物を軽度の毒性（Ｍ）とみなした。２０％ＡＷ未満の値を有する化合物を非毒性（ＮＴ）とみなした。

【0430】

表１２から導き出すことができるように、ＣＭＰ ＩＤ番号１１＿１（ＭＴ）、ＣＭＰ ＩＤ番号１２＿１（Ｔ）、ＣＭＰ ＩＤ番号１３＿１（ＭＴ）、ＣＭＰ ＩＤ番号１４＿１（ＭＴ）、ＣＭＰ ＩＤ番号１５＿１（Ｔ）、ＣＭＰ ＩＤ番号１６＿１（Ｔ）、ＣＭＰ ＩＤ番号１７＿１（Ｔ）、ＣＭＰ ＩＤ番号１８＿１（Ｔ）、ＣＭＰ ＩＤ番号１９＿１（Ｔ）、ＣＭＰ ＩＤ番号２０＿１（ＭＴ）、ＣＭＰ ＩＤ番号２１＿１、ＣＭＰ ＩＤ番号２２＿１、及びＣＭＰ ＩＤ番号２３＿１を有する化合物は、更なるプロファイリングのために化合物を選択解除する中程度の毒性（ＭＴ）又は毒性（Ｔ）を示した。

【0431】

実施例５：濃度応答曲線のための異なる濃度でのヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株におけるＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡを標的化する完全長アンチセンスオリゴヌクレオチド及びその代謝産物のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性の試験。

【0432】

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内で代謝されることが知られている。この実験では、３’末端からの完全長オリゴヌクレオチド及びそれらの代謝産物（すなわち、ｎ－１、ｎ－２、ｎ－３、ｎ－４、ｎ－５、及びｎ－６）を、ＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡ標的を減少させるそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏ効力について試験する。

【0433】

ヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株をＡＴＣＣから購入し、供給業者による推奨のとおりに、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベーター内で維持した。アッセイでは、３５００細胞／ウェルを培地中の９６マルチウェルプレートに播種した。細胞を２４時間インキュベートした後、ＰＢＳに溶解したオリゴヌクレオチドを添加した。オリゴヌクレオチドの最高スクリーニング濃度：５０μＭ及びその後の８段階の希釈。オリゴヌクレオチドの添加の３日後に、細胞を採取した。ＲＮＡは、製造元の指示に従ってＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｐｒｏ ９６ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、５０μｌの水で溶出した。その後、ＲＮＡをＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリーの水（Ｇｉｂｃｏ）で１０倍希釈し、９０℃に１分間加熱した。

【0434】

遺伝子発現解析では、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを、二重鎖セットアップで、ｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ ＲＯＸ（商標）（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用して実施した。ｑＰＣＲには、以下のＴａｑＭａｎプライマーアッセイを使用した：ＲＴＥＬ１＿ Ｈｓ０１５４８０５６＿ｍ１［ＦＡＭ－ＭＧＢ］及び内因性対照ＧＵＳＢ＿ Ｈｓ９９９９９９０８＿ｍ１ ［ＶＩＣ－ＭＧＢ］。全てのプライマーセットは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。相対ＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡレベルを、対照（ＰＢＳ処置試料）のパーセントとして示し、ＩＣ_５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０４を使用して決定した。

【0435】

結果を図９及び表１３に示す。

【表13】

【0436】

表１３及び図９ａから導き出すことができるように、全長オリゴヌクレオチドＣＭＰ ５＿１は０．６μＭのＩＣ_５０を有する。有利には、第１及び第２の代謝産物（ＣＭＰ ５＿１－１及びＣＭＰ ５＿１－２）は、同様の標的ノックダウン活性を保持し、ＩＣ_５０はそれぞれ０．４μＭ及び０．７μＭであり、その後、更なる代謝産物（ｎ－３～ｎ－６）は最大効力及び効力の低下を示す。他の全ての化合物について、既にｎ－１及びｎ－２代謝産物は、それらのそれぞれの完全長配列化合物と比較して、効力及び／又は最大効力の有意な喪失を示す。

【0437】

実施例６：ＣＭＰ ５＿１－ＧａｌＮＡｃアンチセンスオリゴヌクレオチドのＩｎ ｖｉｖｏ研究
研究スケジュール
この研究を、安定したヒト肝細胞生着を伴うキメラマウスモデル（ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ）であるＨＢＶ感染ＰＸＢマウス（登録商標）において、それぞれ２０匹の動物からなる３つの群（ビヒクル、ＣＭＰＤ ３＿１＿ＧａｌＮＡｃ、ＣＭＰＤ ５＿１＿ＧａｌＮＡｃ）で合計７７日間行う。動物に、１０ｍｇ／ｋｇの化合物又は当量のビヒクルを用いて毎週投薬する。各群の５匹の動物をそれぞれ２８日目及び５６日目に屠殺した。７７日目において残りの動物について、その後、動物の肝臓について生物分析を行った。研究プロトコルを図１０に示す。

【0438】

方法及び材料
ＣＭＰ ３＿１及びＣＭＰ ５＿１のためのＧａｌＮＡｃコンジュゲートを、当技術分野で公知の方法（例えば、Ｊａｖａｎｂａｋｈ ｅｔ ａｌ．Ｌｉｖｅｒ－Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ａｎｔｉ－ＨＢＶ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｏｔｅｎｔｌｙ Ｒｅｄｕｃｅ ＨＢＶ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｎ Ｖｉｖｏ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１８ Ｊｕｎ １；１１：４４１－４５４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｏｍｔｎ．２０１８．０２．００５．Ｅｐｕｂ ２０１８ Ｆｅｂ ２３．ＰＭＩＤ：２９８５８０７９；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ５９９２３４５）によって生成した。生成したコンジュゲートをそれぞれ図１及び図４に示す。

【0439】

動物及び取り扱い
ＨＢＶ遺伝子型Ｃ感染ヒト肝キメラｕＰＡ／ＳＣＩＤマウス（ＰＸＢマウス；ドナー肝細胞ＢＤ１９５（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ））を、ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。動物の取り扱いは、日本国、東広島にあるＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって現地で行われた。投薬開始時（０日目）に少なくとも２０週齢であり、投薬開始前日（－１日目）に決定された１８ｇ以上の体重を有する雄マウスを研究のために選択した。マウスは、投薬開始の少なくとも６週間前にＨＢＶ遺伝子型Ｃ（コード番号：ＰＢＢ００４、ロット：１８０１１８、ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に感染しており、－７日目にｑＰＣＲによって判定して＞１ｘ１０^６コピー／ｍｌの血清ＨＢＶ－ＤＮＡレベルを示した。研究開始時の群ランダム化を、体重の算術平均値、並びに血中ｈ－Ａｌｂ濃度及び血清ＨＢＶ－ＤＮＡ濃度の幾何平均値に基づいて－１日目に決定した。

【0440】

１０ｍｇ／ｋｇの全ての用量を、投薬日において、投与前に摂取されたマウスの個々の体重に基づいて計算した。全ての対象マウスは、０、７、１４、２８、３５、４２、４９、５６、６３及び７０日目に、取り外せないように針が取り付けられた使い捨ての１．０ｍＬシリンジ（Ｔｅｒｕｍｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、背中上部の頸部皮下組織に用量製剤の注射を受けた。

【0441】

各屠殺日に、標的動物をイソフルラン麻酔で麻酔し、心臓穿刺及び失血によって屠殺した。肝臓を摘出し、外側左葉をおよそ１００ｍｇの小片に分割した。正確な重量を記録し、肝臓試料を液体窒素中で急速凍結し、更に処理するまで－８０℃で保存した。

【0442】

瀕死又は初期体重の２０％超の体重減少の兆候を有する動物を必要に応じて屠殺した。全ての早期終了／死亡した動物、並びに屠殺時に胸腺腫／リンパ腫を有するマウスを分析から除外した。

【0443】

ＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡ発現の定量
肝臓組織試料を、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ＬＣ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（製品番号０３６０４７２１００１、Ｒｏｃｈｅ）に溶解するまで凍結したままにし、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）上で、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ Ｌａｒｇｅ Ｖｏｌｕｍｅ Ｋｉｔ（製品番号０５４６７５３５００１、Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ユーザのマニュアルに従ってＲＮＡ抽出を続け、ＲＮＡ濃度を水で調整した。

【0444】

遺伝子発現解析では、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを、ｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ ＲＯＸ（商標）（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用して実施した。ｑＰＣＲには、以下のＴａｑＭａｎプライマーアッセイを使用した：Ｈｓ０１５４８０５６＿ｍ１；Ｈｓ００２４９６８０＿ｍ１；Ｈｓ００２４９６６８＿ｍ１及び参照遺伝子ＧＡＰＤＨ＿Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１；ＰＧＫ１＿Ｈｓ９９９９９９０６＿ｍ１及びＧＵＳＢ＿Ｈｓ９９９９９９０８＿ｍ１。全てのプライマーセットは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。相対的なｍＲＮＡ発現レベルを、生理食塩水で処置した対照群に対するパーセントとして示す。

【0445】

結果を図１１に示す。この分析は、１０ｍｇ／ｋｇの毎週のＣＭＰ３＿１＿ＧａｌＮＡｃの投薬でおよそ８０％のノックダウン有効性を示し、１０ｍｇ／ｋｇの毎週のＣＭＰ５＿１＿ＧａｌＮＡｃの投薬でおよそ９５％ノックダウン有効性を示す。

【0446】

実施例７：初代ヒト肝細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ研究
方法及び材料
細胞培養
ヒト化肝臓を有するキメラウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子／重症複合免疫不全症（ｕＰＡ／ＳＣＩＤ）マウスからコラゲナーゼ灌流法によって単離された初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を、ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ（日本国広島）から入手した。ＰＨＨを、改変肝細胞クローン増殖培地（ｄＨＣＧＭ）中７×１０^４細胞／ウェルの濃度でＩ型コラーゲン被覆９６ウェルプレートに播種した。ｄＨＣＧＭは、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、４４ ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、１５μｇ／ｍｌ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍｌインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２％ ＤＭＳＯ及び１０％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）である。

【0447】

細胞を、５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気下において３７℃で培養した。培養培地を、週末を除いて、採取まで２日毎に交換した。

【0448】

次いで、感染多重度（ＭＯＩ）４０のＨＢＶ遺伝子型Ｃを、４％ＰＥＧ ８０００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の最終濃度で９６ウェルプレート内の細胞に添加した。感染細胞を３７℃で２０時間インキュベートし、次いでＰＢＳで２回洗浄してＨＢＶ接種物を除去し、完全培地を再充填した。感染後４日目に、細胞を異なる濃度のＬＮＡで処置した。感染後６日目及び８日目に培地を新しいＬＮＡで交換した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を「薬物なし」対照（ＮＤＣ）として使用した。上清及び細胞を採取し、感染後１９日目にＨＢＶマーカー及び標的ノックダウン分析に使用した。

【0449】

ＬＮＡの細胞傷害性を、製造業者のプロトコルに従ってＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ ８（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して評価し、ＮＤＣに対する％細胞傷害性として表した。

【0450】

ＲＮＡ抽出及びリアルタイム定量ＰＣＲ
製造業者のプロトコルに従って、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ロボット及びＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ Ｌａｒｇｅ Ｖｏｌｕｍｅ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて細胞内ｍＲＮＡを細胞から抽出した。相対的な総ＨＢＶ、ＲＴＥＬ１、ｐｇＲＮＡ、及びβ－グルクロニダーゼ（ＧｕｓＢ）内因性対照ｍＲＮＡの定量化を、ＴａｑＭａｎ ＲＮＡ－ｔｏ－Ｃｔ １－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、番号４３９２９３８）を使用してＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２ Ｋ Ｆｌｅｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して技術的複製で行った。ｍＲＮＡ発現は、参照遺伝子ＧｕｓＢ及び薬物なし対照に対して正規化した比較サイクル閾値２－ΔΔＣｔ法を用いて分析した。ＴａｑＭａｎプライマー及びアッセイＩＤは以下の通りであった：ＲＴＥＬ１，Ｈｓ０２５６８６２３＿ｓ１；Ｔｏｔａｌ ＨＢＶ ＲＮＡ Ｐａ０３４５３４０６＿ｓ１；ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ ＡＩＬＪＫＸ５．参照遺伝子ＧｕｓＢとして、Ｈｓ００９３９６２７＿ｍ１を用いた。全てのプライマー及びプローブセットは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから入手した。

【0451】

２５μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドについての結果を表１４に示し、これはとりわけ、細胞の細胞傷害性及びＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡノックダウンに関する情報を含む。ＣＭＰ １０＿１は、ＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡの標的化において高い細胞傷害性及び低い有効性を示す。さらに、ＣＭＰ９＿１は、５７％の残存ＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡでＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡの２番目に低いノックダウンを示す。

【表14】

【0452】

５μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドについての結果を表１５に示す。ＣＭＰ１０＿１は、ＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡの標的化において低い有効性を示す。さらに、ＣＭＰ９＿１は、７９％の残存ＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡでＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡの２番目に低いノックダウンを再び示す。

【表15】

【0453】

実施例８：ＣＭＰ５＿１－ＧａｌＮＡｃのＩｎ ｖｉｖｏ概念実証
研究スケジュール
研究を、ヒト肝細胞が安定して生着しているキメラマウスモデル（ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ）であるＨＢＶ感染ＰＸＢマウス（登録商標）を５６日目及び１０５日目に屠殺して行う。ＣＭＰ５＿１－ＧａｌＮａｃを、５、１０、及び２０ｍｇ／ｋｇ（５６日目、図１２を参照）の８回の毎週の投薬後に評価する。さらに、ＣＭＰ５＿１－ＧａｌＮａｃを、１０ｍｇ／ｋｇの１５回の毎週の投薬後（１０５日目）にも評価する。各群について、処置動物と同じ体積のビヒクルを投与する別個のビヒクル対照アームがあった。全ての群は、研究開始時に６匹のマウスのサイズであった。生物学的分析を動物の肝臓に対して行った。

【0454】

方法及び材料
動物及び取り扱い
ＨＢＶ遺伝子型Ｃ感染ヒト肝キメラｕＰＡ／ＳＣＩＤマウス（ＰＸＢマウス；ドナー肝細胞ＢＤ １９５（Ｃｏｒｎｉｎｇ社））を、ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。動物の取り扱いを、日本、宇土のＬＳＩＭ Ｓａｆｅｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって行った。投薬開始時（０日目）に少なくとも２５週齢であり、投薬開始前日（－１日目）に決定された１８ｇ以上の体重を有する雄マウスを研究のために選択した。マウスは、投薬開始の少なくとも６週間前にＨＢＶ遺伝子型Ｃ（コード番号：ＰＢＢ００４、ロット：１８０１１８、ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に感染しており、－７日目にｑＰＣＲによって判定して＞１ｘ１０^６コピー／ｍｌの血清ＨＢＶ－ＤＮＡレベルを示した。体重及び血中ｈ－Ａｌｂ濃度並びに血清ＨＢＶ－ＤＮＡ濃度に基づいて、－１日目の研究開始時に層別ランダム化を行った。

【0455】

全ての用量は、投薬日において、投与前に摂取されたマウスの個々の体重に基づいて計算した。全ての対象マウスは、背中上部の頸部皮下組織への用量製剤又は対応するビヒクルの注射を受けた。５６日目に屠殺した動物には、０、７、１４、２１、２８、３５、４２及び４９日目に注射した（図１２を参照）。キメラ肝臓におけるＡＳＧＰＲの過負荷を回避するために、２０ｍｇ／ｋｇ／週の用量を１０ｍｇ／ｋｇの２回の連続注射で与えた。したがって、これらのマウスに、０、１、７、８、１４、１５、２１、２２、２８、２９、３５、３６、４２、４３、４９及び５０日目に投薬した。１０５日目に屠殺した動物には、０、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、８４、９１及び９８日目に１０ｍｇ／ｋｇを投与し（図１２を参照）、取り外せないように針が取り付けられた使い捨ての１．０ｍＬシリンジを使用した（Ｔｅｒｕｍｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。

【0456】

各屠殺日に、標的動物をイソフルラン麻酔で麻酔し、心臓穿刺及び失血によって屠殺した。肝臓を摘出し、外側左葉をおよそ１００ｍｇの小片に分割した。正確な重量を記録し、肝臓試料を液体窒素中で急速凍結し、更に処理するまで－８０℃で保存した。

【0457】

瀕死又は初期体重の２０％超の体重減少の兆候を有する動物を必要に応じて屠殺した。全ての早期終了／死亡した動物、並びに屠殺時に胸腺腫／リンパ腫を有するマウスを分析から除外した。

【0458】

サザンブロット分析によるｃｃｃＤＮＡの決定
肝臓組織をＤＮＡ抽出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ）中でホモジナイズするまで凍結したままにした。まず、抽出物をＲＮａｓｅカクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で周囲温度にて３０分間消化し、続いてプロテイナーゼＫ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で軽く撹拌しながら、５６℃にて２時間消化した。遠心分離によってデブリをペレット化し、１体積のＵｌｔｒａＰｕｒｅ緩衝液飽和フェノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で３回振盪し、続いて１体積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で抽出することによって上清からＤＮＡを抽出した。次いで、１体積の１００％エタノール及び６０ｍＭ（最終）ＮａＡｃ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を－２０℃で一晩添加することによってＤＮＡを沈殿させた。次いで、ＤＮＡを遠心分離によってペレット化し、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、風乾した後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に再懸濁する。

【0459】

ＤＮＡ含有量を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して定量し、濃度を１．５μｇ／μｌに正規化する。次いで、３０μｇのＤＮＡを、３７℃で２時間、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中の７０ Ｕ Ｔ５エキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化する。各試料について、等体積をＢｌｕｅ Ｊｕｉｃｅローディングバッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と混合し、０．９５％アガロース－ＴＡＥゲル（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）にローディングする。試料の全ての（生物学的）群の間で、ＤＮＡ分子量マーカーＶＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）をロードした１レーンを追加する（各レーンで同じ量）。分離後、ゲルを新鮮な０．２Ｍ ＨＣｌ（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）に１０分間移し、次いで水で３回すすぐ。続いて、ゲルを変性緩衝液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に３０分間入れ、水で１回すすぐ。次に、ゲルを中和緩衝液（０．５ＭトリスｐＨ７．５、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に３０分間移す。最後に、ゲルを２０×ＳＳＣ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で３０分間平衡化する。次いで、ＤＮＡを、一晩の転写のために２０×ＳＳＣ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ＴｕｒｂｏＢｌｏｔｔｅｒキット（Ｃｙｔｉｖａ）を製造者の指示に従って使用してＨｙｂｏｎｄ－ＸＬ膜（Ｃｙｔｉｖａ）に転写する。転写後、ＤＮＡを１８００ ＪのＵＶ放射線の照射によって膜に架橋し、膜を乾燥させる。

【0460】

ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの特異的検出のため、ＤＩＧ核酸検出キットを、ＤＩＧ ＥａｓｙＨｙｂ緩衝液及びＤＩＧ洗浄及びブロッキング緩衝液セット（全てＲｏｃｈｅ）と共に製造業者の説明書に従って使用する。プローブを、製造元の指示に従ってＤＩＧ ＰＣＲプローブキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＰＣＲによって生成する。ＨＢＶ遺伝子型Ｃゲノムを含むプラスミドを、以下のプライマーを用いて鋳型として使用する：フォワード、ＧＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＣＣＴＡＡＴＣＡＴＣ（配列番号７０）；リバース、ＧＣＡＡＡＡＡＧＴＴＧＣＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴ（配列番号７１）。

【0461】

１００℃で５分間変性させ、次いで３７℃で一晩４℃に急速に冷却したプローブを用いて、ハイブリダイゼーションを行う。洗浄及び検出を、製造業者の指示に従って行う。画像を、ビヒクル対照試料中のｃｃｃＤＮＡを検出するための適切な曝露時間を設定するＦＵＳＩＯＮ ＦＸシステム（Ｖｉｌｂｅｒ）を使用して取得する。分析のため、ＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｌｉｃｏｒ）を使用してｃｃｃＤＮＡバンド（２．１ｋＢサイズ）を定量する。不均一な転写を説明するため、ＤＮＡ分子量マーカーＶＩＩの２．８ｋＢバンドも定量し、ｃｃｃＤＮＡバンド強度を、群を構成する二つのバンドの平均強度に対して正規化する。次いで、個々の値をビヒクル対照群の平均バンド強度に対して正規化する。

【0462】

ＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡ分析
肝臓組織試料を、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ＬＣ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（製品番号０３６０４７２１００１、Ｒｏｃｈｅ）に溶解するまで凍結したままにし、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）上で、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ Ｌａｒｇｅ Ｖｏｌｕｍｅ Ｋｉｔ（製品番号０５４６７５３５００１、Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ユーザのマニュアルに従ってＲＮＡ抽出を続け、ＲＮＡ濃度を水で調整した。

【0463】

遺伝子発現解析では、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを、ｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ ＲＯＸ（商標）（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用して実施した。ｑＰＣＲには、以下のＴａｑＭａｎプライマーアッセイを使用した：Ｈｓ０１５４８０５６＿ｍ１；Ｈｓ００２４９６８０＿ｍ１；Ｈｓ００２４９６６８＿ｍ１及び参照遺伝子ＧＡＰＤＨ＿Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１；ＰＧＫ１＿Ｈｓ９９９９９９０６＿ｍ１及びＧＵＳＢ＿Ｈｓ９９９９９９０８＿ｍ１。全てのプライマーセットは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。相対的なｍＲＮＡ発現レベルを、生理食塩水で処置した対照群に対するパーセントとして示す。

【0464】

図１３Ａは、ＣＭＰ５＿１－ＧａｌＮＡｃを１０５日間毎週投薬すると、ＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡが約１５％に、ｃｃｃＤＮＡが約２０％に減少する例を示す。

【0465】

図１３Ｂは、５６日目に５、１０及び２０ｍｇ／ｋｇのＣＭＰ５＿１－ＧａｌＮａｃをそれぞれ毎週投薬した後の、８７％、９１％及び９７％のＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡのノックダウンを示す。ｃｃｃＤＮＡは、１０及び２０ｍｇ／ｋｇのＣＭＰ５＿１－ＧａｌＮａｃに対してそれぞれ５９％及び７３％減少した。

【0466】

結論：上記の実施例から、ＣＭＰ ＩＤ ５＿１は、ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方でＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡを標的とするための安全かつ有効な化合物を示すことになる。本発明者らは、ここでＣＭＰ ＩＤ＿５＿１の好ましいｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物特性プロファイルを示し、本発明者らは、ＲＴＥＬ１の標的をｉｎ ｖｉｖｏで非常に効率的に関与させ、その後ウイルスｃｃｃＤＮＡを減少させることができることを示した。加えて、本発明者らは、ＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡを下方制御することによって、Ｂ型肝炎感染ヒト化マウスモデルを使用したウイルスｃｃｃＤＮＡに対する有意な用量依存的効果が誘発され得ることを示した。また、化合物５＿１は、３’末端から分解後も活性を保持する特性を有する。これは、３’末端からのｎ－１及びｎ－２が、完全長ＣＭＰ ＩＤ＿５＿１と比較して同等のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力を有することを意味する。ｎ－３分解はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ効力は低いが、ＲＴＥＬ１に対する活性を依然として保持している。親分子の代謝産物が依然としてＲＴＥＬ１ ｍＲＮＡに対して所望の効果を誘発するため、このプロファイルは分子に明確な利益を与える。

【図1-1】

【図1-2】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図5-5】

【図5-6】

【図5-7】

【図5-8】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図6-5】

【図6-6】

【図6-7】

【図6-8】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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【国際調査報告】