特表 2024-505587 腎臓疾患の予防または治療用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-06

(54)【発明の名称】腎臓疾患の予防または治療用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/22 20150101AFI20240130BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20240130BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240130BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240130BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240130BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20240130BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240130BHJP

【ＦＩ】

A61K35/22

C12N5/071 ZNA

C12N5/10

C12N15/11 Z

C12N15/113 Z

C12Q1/68

A61P13/12

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023547483

(86)(22)【出願日】2022-02-04

(85)【翻訳文提出日】2023-08-04

(86)【国際出願番号】 KR2022001727

(87)【国際公開番号】W WO2022169279

(87)【国際公開日】2022-08-11

(31)【優先権主張番号】10-2021-0016870

(32)【優先日】2021-02-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507175175

【氏名又は名称】インダストリー－アカデミック コーポレーション ファウンデーション，ヨンセイ ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】キ・テク・ナム

(72)【発明者】

【氏名】ユラ・イ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ02

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QX02

4B065AA91X

4B065AB01

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4B065BB19

4B065BC46

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB41

4C087BB63

4C087NA14

4C087ZA81

(57)【要約】

本発明による腎臓組織由来幹細胞；またはオルガノイドは、治療のための施術が容易であり、高い自己増殖能で大量供給が可能であり、腎臓細胞への分化能に優れ、腫瘍形成の可能性が低いだけでなく、病変に直接注入される場合、損傷した組織を再生する能力が非常に卓越する。したがって、このような幹細胞のうち、特に成体幹細胞ベースの再生治療に非常に好適に使用できる。また、本発明による組成物は、腎臓細胞のうち、特に腎臓幹細胞のみを特異的に選別することができる。さらに、Ｌｒｉｇ１タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を発現する腎臓幹細胞は、再生能力および多能性に非常に優れ、ネフロンに分裂可能な能力を有しているので、腎臓疾患の予防または治療に非常に効果的に使用できる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｌｒｉｇ１（Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔｓ Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｌｉｋｅ Ｄｏｍａｉｎｓ １）タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を発現する腎臓組織由来幹細胞を有効成分として含む腎臓疾患の予防または治療用薬学組成物。

【請求項2】

前記腎臓組織由来幹細胞は、Ｋｌｆ６（Ｋｒｕｅｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ６）タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を追加的にさらに発現する、請求項１に記載の薬学組成物。

【請求項3】

前記腎臓疾患は、急性腎損傷（Ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ；ＡＫＩ）または慢性腎損傷（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ；ＣＫＤ）である、請求項１に記載の薬学組成物。

【請求項4】

Ｌｒｉｇ１タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を発現する腎臓組織由来幹細胞を含む腎臓オルガノイド。

【請求項5】

前記腎臓組織由来幹細胞は、Ｋｌｆ６（Ｋｒｕｅｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ６）タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を追加的にさらに発現する、請求項４に記載の腎臓オルガノイド。

【請求項6】

請求項４または５に記載の腎臓オルガノイドを有効成分として含む、腎臓疾患の予防または治療用薬学組成物。

【請求項7】

（ａ）目的とする個体から分離された腎臓上皮細胞から、Ｌｒｉｇ１（Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔｓ Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｌｉｋｅ Ｄｏｍａｉｎｓ １）タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子が発現した細胞を分離するステップと、
（ｂ）前記Ｌｒｉｇ１タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子が発現した細胞を培養するステップと、
（ｃ）前記培養された細胞をマトリゲルに入れてオルガノイドを形成するステップと、を含む腎臓オルガノイドの製造方法。

【請求項8】

前記（ａ）ステップで分離された細胞は、Ｋｌｆ６（Ｋｒｕｅｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ６）タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を追加的にさらに発現するものである、請求項７に記載の製造方法。

【請求項9】

前記（ｂ）ステップにおいて、前記遺伝子が発現した細胞を培養するステップは、ウシ胎児血清、成長因子および抗生剤が含まれている細胞培養培地を用いるものである、請求項７に記載の製造方法。

【請求項10】

前記（ｃ）ステップにおいて、前記オルガノイドを形成するステップは、Ｂ２７補充剤、条件培地、成長因子、Ｎ－アセチルシステインおよびＡＬＫ５（ＴＧＦβ ｋｉｎａｓｅ／ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ）抑制剤が含まれている細胞培養培地を用いるものである、請求項７に記載の製造方法。

【請求項11】

前記条件培地は、Ｗｎｔ３ａ条件培地、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）条件培地およびＲｓｐｏ１条件培地からなる群より選択される少なくとも１つ以上である、請求項１０に記載の製造方法。

【請求項12】

前記マトリゲルは、成長因子減少マトリゲルである、請求項７に記載の製造方法。

【請求項13】

Ｌｒｉｇ１（Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔｓ Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｌｉｋｅ Ｄｏｍａｉｎｓ １）タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の発現レベルを測定する製剤を含む腎臓組織由来幹細胞検出用組成物。

【請求項14】

前記検出用組成物は、Ｋｌｆ６（Ｋｒｕｅｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ６）タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の発現レベルを測定する製剤をさらに含む、請求項１３に記載の検出用組成物。

【請求項15】

前記遺伝子の発現レベルを測定する製剤は、前記遺伝子に特異的に結合するプライマー、プローブおよびアンチセンスヌクレオチドからなる群より選択される少なくともいずれか１つである、請求項１３に記載の検出用組成物。

【請求項16】

前記タンパク質の発現レベルを測定する製剤は、前記タンパク質に特異的に結合する抗体、オリゴペプチド、リガンド、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）およびアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）からなる群より選択される少なくともいずれか１つである、請求項１３に記載の検出用組成物。

【請求項17】

請求項１３～１６のいずれか１項に記載の検出用組成物を含む腎臓組織由来幹細胞検出用キット。

【請求項18】

目的とする個体から分離された生物学的試料からＬｒｉｇ１（Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔｓ Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｌｉｋｅ Ｄｏｍａｉｎｓ １）タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の発現レベルを測定するステップ、を含む腎臓組織由来幹細胞の検出方法。

【請求項19】

前記発現レベルを測定するステップの際、前記生物学的試料からＫｌｆ６（Ｋｒｕｅｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ６）タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の発現レベルを追加的に測定する、請求項１８に記載の検出方法。

【請求項20】

前記遺伝子の発現レベルは、前記遺伝子に特異的に結合するプライマー、プローブおよびアンチセンスヌクレオチドからなる群より選択される少なくともいずれか１つ以上により測定されるものである、請求項１８に記載の検出方法。

【請求項21】

前記タンパク質の発現レベルは、前記タンパク質に特異的に結合する抗体、オリゴペプチド、リガンド、ＰＮＡおよびアプタマーからなる群より選択される少なくとも１つ以上により測定されるものである、請求項１８に記載の検出方法。

【請求項22】

前記Ｌｒｉｇ１（Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔｓ Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｌｉｋｅ Ｄｏｍａｉｎｓ １）タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の発現レベルが対照群と比較して増加した場合、腎臓組織由来幹細胞として検出するステップをさらに含む、請求項１８に記載の検出方法。

【請求項23】

目的とする個体から分離された生物学的試料からＬｒｉｇ１（Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔｓ Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｌｉｋｅ Ｄｏｍａｉｎｓ １）タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子が発現する細胞を分離するステップ、を含む腎臓組織由来幹細胞の分離方法。

【請求項24】

前記分離される細胞は、Ｋｌｆ６（Ｋｒｕｅｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ６）タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を追加的にさらに発現するものである、請求項２３に記載の分離方法。

【請求項25】

前記分離するステップは、磁気活性細胞分類法（Ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ；ＭＡＣＳ）またはフローサイトメトリー分析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ）により行われるものである、請求項２３に記載の分離方法。

【請求項26】

Ｌｒｉｇ１（Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔｓ Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｌｉｋｅ Ｄｏｍａｉｎｓ １）タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を発現する腎臓組織由来幹細胞を分離するステップと、
前記分離された腎臓組織由来幹細胞を培養するステップと、を含む腎臓組織由来幹細胞を培養する方法。

【請求項27】

前記分離される細胞は、Ｋｌｆ６（Ｋｒｕｅｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ６）タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を追加的にさらに発現するものである、請求項２６に記載の培養する方法。

【請求項28】

腎臓疾患の予防または治療のための細胞治療剤スクリーニング用動物モデルの製造方法において，
Ｌｒｉｇ１（Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔｓ Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｌｉｋｅ Ｄｏｍａｉｎｓ １）を暗号化する遺伝子がＣｒｅＥＲＴ２－ＬｏｘＰシステムによって条件的に発現する動物に腎臓損傷を誘導するステップと、
前記動物にエストロゲン拮抗剤を処理して、目的とする遺伝子の発現を誘導するステップと、を含む、動物モデルの製造方法。

【請求項29】

前記腎臓損傷を誘導するステップは、葉酸の腹腔内投与；虚血／再灌流損傷を誘導；および片側性尿管閉塞誘導で構成された方法のいずれか１つを行うものである、請求項２８に記載の動物モデルの製造方法。

【請求項30】

請求項２８に記載の製造方法により製造された腎臓疾患の予防または治療のための細胞治療剤スクリーニング用動物モデル。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腎臓疾患の予防または治療用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

腎臓は生体の恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）を維持する重要な臓器であり、体内の体液量、血液中のイオン濃度とｐＨを調節し、代謝性老廃物、毒素、薬物などの老廃物を排泄し、血圧調節およびその他の代謝性、内分泌機能を行う。また、ビタミンＤを活性化させて小腸でカルシウムが吸収されるように補助し、様々なホルモンの合成にも関与する。前記腎臓が排泄、調節、代謝および内分泌的機能を正常に行えずに全体的に機能が低下したり異常がもたされた状態を、腎臓疾患という。腎臓の損傷による機能の低下は、腎臓および関連構造の増大、腎臓の萎縮、体液量の変化、電解質不均衡、代謝性アシドーシス、ガス交換障害、抗感染機能損傷、尿毒性毒素の蓄積などをもたらす。特に、急性腎不全は、様々な原因によって腎臓機能が低下して高い致死率を示す難治性疾患である。腎臓機能が回復しても損傷の原因と程度によって再発したり治療されない場合、慢性および末期腎不全（ｅｎｄ－ｓｔａｇｅ ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ）に進行したりする。

【0003】

現代医学の発展にもかかわらず、病院に入院する多くの患者が腎臓機能の低下によって多くの苦痛を強いられており、特に病気の重症度が高い患者は腎臓機能の低下によって腎代替療法が必要な場合が多い。急性腎損傷の有病率は入院患者の約５％で、重患者室に入院する患者の約３０～５０％まで報告されており、このような有病率は新しい治療法の開発にもかかわらず着実に増加する傾向にある。

【0004】

このような腎臓疾患を治療するために、幹細胞に対する前臨床報告書と臨床試験が現在活発に進められているのが現状である。具体的には、中間葉幹細胞、脂肪由来幹細胞、羊水幹細胞および腎臓前駆細胞などに至る多様なタイプの幹細胞が腎臓を復旧するのに多様に研究されている。このような幹細胞のうち、特に成人の腎臓に由来する成体幹細胞を用いた細胞治療剤は、向上した腎臓生着および分化の潜在的な利点があり、自己治療に非常に有用に活用できるなどの利点が存在する。

【0005】

このような脈絡で、腎臓の場合、近位細尿管末端、糸球体および腎乳頭（Ｒｅｎａｌ ｐａｐｉｉｌａ）に成体幹細胞が存在すると報告されており、このような幹細胞によって損傷した腎臓細胞の再生を誘導できる細胞治療剤に関する多様な研究が続いている。

【0006】

しかし、依然として、このような腎臓幹細胞を識別し治療剤として適用するための幹細胞を同定し、臨床に活用するための適用可能性などに関する研究は不備であるのが現状である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の一目的は、腎臓組織由来幹細胞を有効成分として含む腎臓疾患の予防または治療用薬学組成物を提供することである。

【0008】

本発明の他の目的は、腎臓オルガノイドの製造方法；これにより製造された腎臓オルガノイド；および腎臓オルガノイドを有効成分として含む腎臓疾患の予防または治療用薬学組成物を提供することである。

【0009】

本発明のさらに他の目的は、腎臓組織由来幹細胞検出用組成物；およびこれを含む腎臓幹細胞検出用キットを提供することである。

【0010】

本発明のさらに他の目的は、腎臓組織由来幹細胞の検出方法；および腎臓幹細胞を分離する方法を提供することである。

【0011】

本発明のさらに他の目的は、腎臓組織由来幹細胞を培養する方法を提供することである。

【0012】

しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は以上に言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は以下の記載から当業界における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。

【課題を解決するための手段】

【0013】

１．腎臓組織由来幹細胞を有効成分として含む薬学組成物
本発明の一実施形態では、腎臓組織由来幹細胞を有効成分として含む腎臓疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

【0014】

本発明の前記腎臓幹細胞は、Ｌｒｉｇ１（Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔｓ Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｌｉｋｅ Ｄｏｍａｉｎｓ １）タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を発現する。

【0015】

本発明の前記Ｌｒｉｇ１またはこれを暗号化する遺伝子を発現する腎臓上皮細胞は、他の細胞とは異なり、幹細胞能を有する腎臓組織由来幹細胞であって、特に腎臓の後期発達段階である尿細管形成（Ｔｕｂｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関与してネフロンに分裂可能な能力を有することができる。したがって、本発明の目的上、前記幹細胞能を有するＬｒｉｇ１またはこれを暗号化する遺伝子を発現する腎臓上皮細胞を用いる場合には、腎臓疾患を非常に効果的に予防または治療することができる。

【0016】

本発明の前記「Ｌｒｉｇ１」は、ＥＧＦＲ－系統、ＭＥＴおよびＲＥＴタンパク質などの受容体チロシンキナーゼと相互作用する膜通過タンパク質（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。前記Ｌｒｉｇ１は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などを含む哺乳類に由来するものであってもよいし、例えば、ヒトのＬｒｉｇ１（アクセス番号：ＮＭ＿０１５５４１によって暗号化されるポリペプチドまたはＮＰ＿０５６３５６、配列番号１で表されるポリペプチド）であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0017】

また、本発明において、前記腎臓組織由来幹細胞は、Ｋｌｆ６（Ｋｒｕｅｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ６）タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を追加的に発現することができる。

【0018】

本発明の前記「Ｋｌｆ６」は、腫瘍抑制遺伝子（ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ）に相当するＫＬＦ６遺伝子によって暗号化されるタンパク質である。前記Ｋｌｆ６は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などを含む哺乳類に由来するものであってもよいし、例えば、ヒトのＬｒｉｇ１（アクセス番号：ＮＰ＿００１１５３５９６．１によって暗号化されるポリペプチドまたはＮＭ＿００１１６０１２４．１；ＮＰ＿００１１５３５９７．１によって暗号化されるポリペプチドまたはＮＭ＿００１１６０１２５．１［Ｑ９９６１２－３］；ＮＰ＿００１２９１．３によって暗号化されるポリペプチドまたはＮＭ＿００１３００．５［Ｑ９９６１２－１］、配列番号２で表されるポリペプチド）であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0019】

本発明の前記「腎臓組織由来幹細胞」は、腎臓の組織内に存在する幹細胞であって、腎臓のすべての細胞タイプに分化できる自己再生性（Ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗｉｎｇ）および多能性幹細胞を意味する。このような幹細胞は、腎臓損傷の再生および恒常性に関与することができる。

【0020】

本発明の前記腎臓組織由来幹細胞は、細胞治療剤として使用されるものであってもよい。

【0021】

本発明の前記「細胞治療剤」は、患者に直接注入する治療方法に使用される生きている細胞であって、生きている自家細胞、同種細胞または異種細胞を体外で培養、増殖したり選別するなど、物理的、化学的または生物学的方法で操作して製造する医薬品を意味する。本発明の目的上、前記腎臓組織由来幹細胞は、患者の腎臓に存在するＬｒｉｇ１タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子が発現している幹細胞能に非常に優れているので、移植拒絶反応などのような副作用が非常に少ないという利点が存在する。

【0022】

本発明の前記「腎臓疾患」は、腎臓機能の弱化をもたらす疾患であって、腎臓機能の悪化が進行する速度によって急性腎損傷（Ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ；ＡＫＩ）および慢性腎損傷（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ；ＣＫＤ）が含まれ、例えば、急性腎損傷であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0023】

本発明の前記腎臓疾患は、例えば、糸球体腎炎、慢性腎不全、急性腎不全、腎症候群、腎盂炎、腎臓結石および腎臓癌からなる群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0024】

本発明の前記「予防」は、動物の病理学的細胞の発生または細胞の損傷、消失の程度の減少を意味する。予防は、完全であり、または部分的であってもよい。この場合には、個体内の病理学的細胞の発生または異常な免疫作用などが前記腎臓疾患の予防および治療用組成物を使用しない場合と比較して減少する現象を意味することができる。

【0025】

本発明の前記「治療」は、治療しようとする対象または細胞の天然過程を変更させるために臨床的に介入するすべての行為を意味し、臨床病理状態が進行する間、またはこれを予防するために行うことができる。目的とする治療効果は、疾病の発生または再発を予防したり、症状を緩和させたり、疾病によるすべての直接または間接的な病理学的結果を低下させたり、転移を予防したり、疾病の進行速度を減少させたり、疾病状態を軽減または一時的緩和させたり、予後を改善させることを含むことができる。すなわち、前記治療は、前記組成物によって腎臓疾患の症状が好転したり完治するすべての行為を包括すると解釈される。

【0026】

本発明の前記腎臓組織由来幹細胞は、１×１０^７～１×１０^８、１×１０^８～２×１０^８、２×１０^８～４×１０^８、４×１０^８～６×１０^８、６×１０^８～８×１０^８、８×１０^８～１×１０^９、１×１０^９～２×１０^９、２×１０^９～４×１０^９、４×１０^９～１×１０^１０、２×１０^８～６×１０^８、６×１０^８～１×１０^９、１×１０^８～２×１０^８、２×１０^８～２×１０^９、１×１０^７～１×１０^８、１×１０^８～１×１０^９、１×１０^９～１×１０^１０または１×１０^７～１×１０^９個のいずれか１つの細胞／ｋｇの投与量で投与できるが、これに限定されるものではない。

【0027】

本発明の前記薬学組成物は、カプセル、錠剤、顆粒、注射剤、軟膏剤、粉末または飲料形態であることを特徴とし、前記薬学組成物は、ヒトを対象にすることを特徴とする。

【0028】

本発明の前記薬学組成物はこれらに限定されるものではないが、それぞれ通常の方法により、散剤、顆粒剤、カプセル、錠剤、水性懸濁液などの経口型剤形、外用剤、坐剤および滅菌注射溶液の形態に剤形化されて使用できる。本発明の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。薬学的に許容される担体は、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などが使用可能であり、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などが混合されて使用可能であり、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などが使用可能である。本発明の薬学組成物の剤形は、上述のような薬学的に許容される担体と混合して多様に製造できる。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、サスペンション、シロップ、ウエハなどの形態に製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐放型製剤などに剤形化することができる。

【0029】

一方、製剤化に適した担体、賦形剤および希釈剤の例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油などが使用できる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などを追加的に含むことができる。

【0030】

本発明の前記薬学組成物の投与経路はこれらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれ、例えば、経口または非経口投与であってもよい。

【0031】

本発明の前記「非経口」とは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明の目的上、前記薬学組成物は、腎臓に直接注射される方式で投与できるが、これに限定されるものではない。

【0032】

本発明の前記薬学組成物は、使用された特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合および予防または治療される特定疾患の重症を含む様々な要因によって多様に変化可能であり、前記薬学組成物の投与量は、患者の状態、体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者によって適宜選択可能であり、１日０．０００１～５０ｍｇ／ｋｇまたは０．００１～５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。投与は、１日１回投与してもよく、数回分けて投与してもよい。前記投与量はいかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。本発明による医薬組成物は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤に剤形化される。

【0033】

２．オルガノイド
本発明において、後述する腎臓オルガノイドは、治療のための施術が容易であり、高い自己増殖能で大量供給が可能であり、腎臓細胞への分化能に優れ、腫瘍形成の可能性が低いだけでなく、病変に直接注入される場合、損傷した組織を再生する能力が非常に卓越する。したがって、成体幹細胞ベースの再生治療に非常に好適に使用できる。特に、このような腎臓オルガノイドは、既存の中間葉幹細胞、胚幹細胞または逆分化万能幹細胞を用いる細胞治療剤と比較して直接再生効果に非常に優れているというメリットが存在する。

【0034】

以下、腎臓オルガノイド、腎臓オルガノイドの製造方法およびその用途について詳しく説明する。

【0035】

（１）腎臓オルガノイド
本発明の他の実施形態では、腎臓オルガノイドを提供する。

【0036】

本発明の前記腎臓オルガノイドは、Ｌｒｉｇ１タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を発現する腎臓組織由来幹細胞を含む。

【0037】

本発明の前記Ｌｒｉｇ１またはこれを暗号化する遺伝子を発現する腎臓上皮細胞は、他の細胞とは異なり、幹細胞能を有する腎臓組織由来幹細胞であって、特に腎臓の後期発達段階である尿細管形成（Ｔｕｂｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関与してネフロンに分裂可能な能力を有することができる。したがって、本発明の目的上、前記幹細胞能を有するＬｒｉｇ１またはこれを暗号化する遺伝子を発現する腎臓上皮細胞は、非常に効果的にオルガノイドを形成することができる。

【0038】

また、本発明において、前記腎臓組織由来幹細胞は、Ｋｌｆ６タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を追加的に発現することができる。

【0039】

本発明の前記腎臓オルガノイドにおいて、Ｌｒｉｇ１またはＫｌｆ６タンパク質またはこれによって暗号化される遺伝子、腎臓組織由来幹細胞などに関する内容は、上記の「１．腎臓組織由来幹細胞を有効成分として含む薬学組成物」に記載されたものと同一であるので、記載を省略する。

【0040】

本発明の前記「オルガノイド」は、３Ｄ立体構造を有する細胞を意味し、動物などから収集、取得していない人工的な培養過程により製造した組織と類似のモデルを意味する。２Ｄ培養とは異なり、３Ｄ細胞培養は、体外で細胞がすべての方向に成長することができる。

【0041】

（２）腎臓オルガノイドの製造方法
本発明のさらに他の実施形態では、腎臓オルガノイドの製造方法を提供する。

【0042】

本発明の前記製造方法は、（ａ）目的とする個体から分離された腎臓上皮細胞から、Ｌｒｉｇ１（Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔｓ Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｌｉｋｅ Ｄｏｍａｉｎｓ １）タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子が発現した細胞を分離するステップと、（ｂ）前記Ｌｒｉｇ１タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子が発現した細胞を培養するステップと、（ｃ）前記培養された細胞をマトリゲルに入れてオルガノイドを形成するステップと、を含む。

【0043】

本発明の前記Ｌｒｉｇ１またはこれを暗号化する遺伝子を発現する腎臓上皮細胞は、他の細胞とは異なり、幹細胞能を有する腎臓組織由来幹細胞であって、特に腎臓の後期発達段階である尿細管形成（Ｔｕｂｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関与してネフロンに分裂可能な能力を有することができる。したがって、本発明の目的上、前記幹細胞能を有するＬｒｉｇ１またはこれを暗号化する遺伝子を発現する腎臓組織由来幹細胞を用いる場合には、腎臓オルガノイドを非常に高い収率で製造することができる。

【0044】

また、本発明の前記（ａ）ステップで分離される細胞は、Ｋｌｆ６（Ｋｒｕｅｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ６）タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子が発現するものであってもよい。

【0045】

本発明の前記腎臓オルガノイドの製造方法において、Ｌｒｉｇ１またはＫｌｆ６タンパク質またはこれによって暗号化される遺伝子、腎臓組織由来幹細胞、オルガノイドなどに関する内容は、上記の「１．腎臓幹細胞を有効成分として含む薬学組成物」および「（１）腎臓オルガノイド」に記載されたものと同一であるので、記載を省略する。

【0046】

本発明の前記（ａ）ステップにおいて、細胞を分離するステップは、目的とする個体から分離されたサンプルを解離させた後、通常の方法により磁気活性細胞分類法（Ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ；ＭＡＣＳ）またはフローサイトメトリー分析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ）により行われるが、これに限定されるものではない。

【0047】

本発明の前記サンプルを解離させるステップは、コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）を用いるものであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0048】

本発明の前記（ｂ）ステップにおいて、前記遺伝子が発現した細胞を培養するステップは、ウシ胎児血清、成長因子および抗生剤が含まれている細胞培養培地を用いるものであってもよい。

【0049】

本発明の前記（ｃ）ステップにおいて、前記オルガノイドを形成するステップは、Ｂ２７補充剤、条件培地、成長因子、Ｎ－アセチルシステインおよびＡＬＫ５（ＴＧＦβ ｋｉｎａｓｅ／ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ）抑制剤が含まれている細胞培養培地を用いるものであってもよい。

【0050】

本発明の前記「成長因子」は、細胞の成長に必要な物質であって、例えば、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＩＧＦ（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）などであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0051】

本発明の前記「条件培地」は、Ｗｎｔ３ａ条件培地、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）条件培地およびＲｓｐｏｌ条件培地からなる群より選択される少なくとも１つ以上であってもよく、例えば、Ｗｎｔ３ａ条件培地、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）条件培地およびＲｓｐｏ１条件培地を含むものであってもよいし、例えば、４０％Ｗｎｔ３ａ条件培地、１０％ノギン条件培地、１０％Ｒｓｐｏ１条件培地を含むものであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0052】

本発明の前記「細胞培養培地」は、生体外（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で細胞株の成長および維持のための基本的な成分が含まれているものであって、例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ－１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＡＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）などであってもよく、前記（ｂ）ステップの細胞培養培地は、ＲＰＭＩ－１６４０であってもよく、前記（ｃ）ステップの細胞培養培地は、ＡＤＭＥＭ／Ｆ１２であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0053】

本発明の一具体例において、前記（ｂ）ステップにおいて、前記細胞培養培地には、１０％ウシ胎児血清、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシンが含まれるものであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0054】

本発明の一具体例において、前記（ｃ）ステップにおいて、前記細胞培養培地には、１．５％Ｂ２７補充剤、４０％Ｗｎｔ３ａ条件培地、１０％ノギン条件培地、１０％Ｒｓｐｏ１条件培地、５０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ－１０、１．２５ｍＭのＮ－アセチルシステインおよび５μＭのＡ８３０１（ＣＡＳ ｎｏ．ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ９０９９１０－４３－６）が含まれているものであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0055】

本発明の前記マトリゲルは、成長因子減少マトリゲルであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0056】

（３）腎臓オルガノイド
本発明の他の実施形態では、本発明による前記腎臓オルガノイドの製造方法により製造された腎臓オルガノイドを提供する。

【0057】

本発明の前記腎臓オルガノイドは、非常に優れた幹細胞能を有するＬｒｉｇ１またはこれを暗号化する遺伝子、好ましくは、Ｌｒｉｇ１およびＫｌｆ６タンパク質またはこれらを暗号化する遺伝子を発現する腎臓組織由来幹細胞を用いて製造されたものであって、腎臓を非常に効果的に実現して腎臓損傷治療剤を効果的にスクリーニングできるだけでなく、直接腎臓損傷に使用される細胞治療剤として使用できる。

【0058】

本発明の前記腎臓オルガノイドにおいて、Ｌｒｉｇ１またはＫｌｆ６タンパク質またはこれによって暗号化される遺伝子、腎臓オルガノイドおよび製造方法などに関する内容は、上記の「１．腎臓幹細胞を有効成分として含む薬学組成物」および「（１）腎臓オルガノイド」に記載されたものと同一であるので、記載を省略する。

【0059】

（４）腎臓疾患の予防または治療用薬学組成物
本発明のさらに他の実施形態では、腎臓オルガノイドを有効成分として含む腎臓疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

【0060】

本発明の前記腎臓オルガノイドは、細胞治療剤として使用されるものであってもよい。

【0061】

本発明の前記腎臓疾患の予防または治療用薬学組成物において、Ｌｒｉｇ１タンパク質またはこれによって暗号化される遺伝子、薬学組成物、予防、治療、腎臓オルガノイドおよび製造方法などに関する内容は、上記の「１．腎臓組織由来幹細胞を有効成分として含む薬学組成物」および「（１）腎臓オルガノイド」に記載されたものと同一であるので、記載を省略する。

【0062】

本発明の前記腎臓オルガノイドは、１×１０^７～１×１０^８、１×１０^８～２×１０^８、２×１０^８～４×１０^８、４×１０^８～６×１０^８、６×１０^８～８×１０^８、８×１０^８～１×１０^９、１×１０^９～２×１０^９、２×１０^９～４×１０^９、４×１０^９～１×１０^１０、２×１０^８～６×１０^８、６×１０^８～１×１０^９、１×１０^８～２×１０^８、２×１０^８～２×１０^９、１×１０^７～１×１０^８、１×１０^８～１×１０^９、１×１０^９～１×１０^１０または１×１０^７～１×１０^９個のいずれか１つの細胞／ｋｇの投与量で投与できるが、これに限定されるものではない。

【0063】

４．検出用組成物、キットおよび検出方法
（１）腎臓組織由来幹細胞の検出用組成物
本発明の他の実施形態では、腎臓組織由来幹細胞検出用組成物を提供する。

【0064】

本発明の前記検出用組成物は、Ｌｒｉｇ１タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の発現レベルを測定する製剤を含む。

【0065】

また、本発明の前記検出用組成物は、Ｋｌｆ６タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の発現レベルを測定する製剤をさらに含むことができる。

【0066】

本発明の前記検出用組成物において、Ｌｒｉｇ１またはＫｌｆ６タンパク質および腎臓組織由来幹細胞などに関する内容は、上記の「１．腎臓組織由来幹細胞を有効成分として含む薬学組成物」に記載されたものと同一であるので、記載を省略する。

【0067】

本発明の前記遺伝子の発現レベルを測定する製剤は、生物学的試料中に存在するＤＮＡまたはこれによって転写されるｍＲＮＡの発現レベルを測定できるものであればすべて含まれてもよく、例えば、前記遺伝子に特異的に結合するプライマー、プローブおよびアンチセンスヌクレオチドからなる群より選択される少なくともいずれか１つであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0068】

本発明の前記「プライマー」とは、標的遺伝子配列を認知する断片であって、正方向および逆方向のプライマー対を含むが、好ましくは、特異性および敏感性を有する分析結果を提供するプライマー対である。プライマーの核酸配列が試料中に存在する非－標的配列と不一致の配列であるので、相補的なプライマー結合部位を含む標的遺伝子配列のみ増幅し、非特異的増幅を誘発しないプライマーの時、高い特異性が付与できる。

【0069】

本発明の前記「プローブ」とは、試料中の検出しようとする標的物質と特異的に結合できる物質を意味し、前記結合により特異的に試料中の標的物質の存在を確認できる物質を意味する。プローブの種類は当業界にて通常使用される物質として制限はないが、好ましくは、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよいし、最も好ましくは、ＰＮＡである。より具体的には、前記プローブは、バイオ物質として生物に由来するか、これに類似のもの、または生体外で製造されたものを含むものであり、例えば、酵素、タンパク質、抗体、微生物、動植物細胞および器官、神経細胞、ＤＮＡ、およびＲＮＡであってもよいし、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを含み、ＲＮＡは、ゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドを含み、タンパク質の例には、抗体、抗原、酵素、ペプチドなどを含むことができる。

【0070】

本発明の前記「ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）」とは、２’－Ｏ、４’－Ｃメチレンブリッジを含む核酸アナログを意味する。ＬＮＡヌクレオシドは、ＤＮＡとＲＮＡの一般的な核酸塩基を含み、ワトソン・クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対規則によって塩基対を形成することができる。しかし、メチレンブリッジによる分子の「ｌｏｃｋｉｎｇ」によって、ＬＮＡは、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ結合で理想的形状を形成できなくなる。ＬＮＡがＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドに含まれると、ＬＮＡは、より速く相補的ヌクレオチド鎖と対をなして二重螺旋の安定性を高めることができる。

【0071】

本発明の前記「アンチセンス」は、アンチセンスオリゴマーがワトソン・クリック塩基対の形成によってＲＮＡ内の標的配列と混成化されて、標的配列内で典型的にｍＲＮＡとＲＮＡ：オリゴマーヘテロ二重体の形成を許容する、ヌクレオチド塩基の配列およびサブユニット間のバックボーンを有するオリゴマーを意味する。オリゴマーは、標的配列に対する正確な配列相補性または近似相補性を有することができる。

【0072】

本発明の前記遺伝子の情報は、前記ＮＣＢＩアクセス番号により確認可能なサイトによって通常の技術者が容易に確認できるので、通常の技術者が導出された遺伝子配列に基づいて前記遺伝子に特異的に結合するプライマー、プローブまたはアンチセンスヌクレオチドを容易に作製することができる。

【0073】

本発明の前記タンパク質の発現レベルを測定する製剤は、生物学的試料中に存在するタンパク質の量を測定できるものであればすべて含まれてもよく、例えば、前記タンパク質に特異的に結合する抗体、オリゴペプチド、リガンド、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）およびアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）からなる群より選択される少なくともいずれか１つであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0074】

本発明の前記「タンパク質」は、そのタンパク質自体のみならず、スプライシングおよび可変プロモーターによって生成されるか、突然変異または多形成のような遺伝的変化によって生成できるタンパク質異性体（Ｉｓｏｆｏｒｍ）またはタンパク質変異体（Ｖａｒｉａｎｔ）を含む。

【0075】

本発明の前記「抗体」は、抗原と特異的に結合して抗原－抗体反応を起こす物質を指す。本発明の目的上、抗体は、前記バイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する抗体を意味する。本発明の抗体は、多クローン抗体、単クローン抗体および組換え抗体をすべて含む。前記抗体は、当業界にて広く公知の技術を利用して容易に製造できる。例えば、多クローン抗体は、前記タンパク質の抗原を動物に注射し、動物から採血して抗体を含む血清を得る過程を含む当業界にて広く公知の方法によって生産できる。このような多クローン抗体は、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、サル、ウマ、ブタ、ウシ、イヌなどの任意の動物から製造できる。また、単クローン抗体は、当業界にて広く公知のハイブリドーマ方法、またはファージ抗体ライブラリー技術を用いて製造できる。前記方法で製造された抗体は、ゲル電気泳動、透析、塩沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどの方法を用いて分離、精製される。また、本発明の抗体は、２個の全長の軽鎖および２個の全長の重鎖を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどをすべて含むものを意味する。

【0076】

本発明の前記「ＰＮＡ」とは、人工的に合成されたＤＮＡまたはＲＮＡに類似の重合体を指し、１９９１年、デンマークのコペンハーゲン大学のＮｉｅｌｓｅｎ、Ｅｇｈｏｌｍ、ＢｅｒｇとＢｕｃｈａｒｄｔ教授によって初めて紹介された。ＤＮＡはリン酸－リボース糖骨格を有するのに対し、ＰＮＡはペプチド結合によって連結された繰り返しのＮ－（２－アミノエチル）－グリシン骨格を有し、これによってＤＮＡまたはＲＮＡに対する結合力と安定性が大きく増加して、分子生物学、診断分析およびアンチセンス治療法に使用されている。前記ＰＮＡは、本発明の技術分野にて広く知られた背景技術を参照してさらに具体化することができる。

【0077】

本発明の前記「アプタマー」とは、オリゴ核酸またはペプチド分子であり、アプタマーの一般的な内容は、文献［Ｂｏｃｋ ＬＣ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５５（６３６０）：５６４６（１９９２）；Ｈｏｐｐｅ－Ｓｅｙｌｅｒ Ｆ，Ｂｕｔｚ Ｋ“Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｐｔａｍｅｒｓ：ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ”．Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．７８（８）：４２６３０（２０００）；Ｃｏｈｅｎ ＢＡ，Ｃｏｌａｓ Ｐ，Ｂｒｅｎｔ Ｒ．“Ａｎａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｅｌｌ－ｃｙｃｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ”．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５（２４）：１４２７２７（１９９８）］を参照して具体化することができる。

【0078】

本発明の前記抗体、オリゴペプチド、リガンド、ＰＮＡおよびアプタマーなどは、前記ＮＣＢＩアクセス番号により確認可能なサイトによって確認可能なアミノ酸配列に基づいて通常の技術者によって容易に作製することができる。

【0079】

（２）腎臓組織由来幹細胞の検出用キット
本発明のさらに他の実施形態では、本発明による前記検出用組成物を含む腎臓組織由来幹細胞の検出用キットを提供する。

【0080】

本発明の前記キットにおいて、Ｌｒｉｇ１タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子、腎臓組織由来幹細胞、タンパク質の発現レベルを測定する製剤、遺伝子の発現レベルを測定する製剤などに関する内容は、上記の「１．腎臓組織由来幹細胞を有効成分として含む薬学組成物」および「（１）腎臓幹細胞の検出用組成物」に記載されたものと同一であるので、記載を省略する。

【0081】

本発明の前記キットは、ＲＴ－ＰＣＲキット、ＤＮＡチップキット、ＥＬＩＳＡキット、タンパク質チップキット、ラピッド（ｒａｐｉｄ）キットまたはＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）キットであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0082】

本発明の前記キットは、分析方法に適した１種類またはそれ以上の他の構成成分組成物、溶液または装置をさらに含むことができる。

【0083】

本発明の一具体例において、前記キットは、逆転写重合酵素反応を行うために必要な必須要素をさらに含むことができる。逆転写重合酵素反応キットは、前記遺伝子に対して特異的なプライマー対を含む。プライマーは、前記遺伝子の核酸配列に特異的な配列を有するヌクレオチドであって、約７ｂｐ～５０ｂｐの長さ、より好ましくは、約１０ｂｐ～３０ｂｐの長さを有することができる。また、対照群遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）の核酸配列に特異的なプライマーを含むことができる。その他の逆転写重合酵素反応キットは、テストチューブまたは他の適切な容器、反応緩衝液（ｐＨおよびマグネシウム濃度は多様）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ－ポリメラーゼおよび逆転写酵素のような酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ抑制剤ＤＥＰＣ－水（ＤＥＰＣ－ｗａｔｅｒ）、滅菌水などを含むことができるが、これに限定されるものではない。

【0084】

本発明の他の具体例において、本発明の診断用キットは、ＤＮＡチップを行うために必要な必須要素を含むことができる。ＤＮＡチップキットは、遺伝子またはその断片に相当するｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）が付着している基板、および蛍光標識プローブを作製するための試薬、製剤、酵素などを含むことができる。また、基板は、対照群遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）またはその断片に相当するｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを含むことができるが、これに限定されるものではない。

【0085】

本発明のさらに他の具体例において、本発明の診断用キットは、ＥＬＩＳＡを行うために必要な必須要素を含むことができる。ＥＬＩＳＡキットは、前記タンパク質に対して特異的な抗体を含む。抗体は、マーカータンパク質に対する特異性および親和性が高く、他のタンパク質に対する交差反応性がほとんどない抗体で、単クローン抗体、多クローン抗体または組換え抗体である。さらに、前記ＥＬＩＳＡキットは、対照群（例えば、ハウスキーピングタンパク質）タンパク質に特異的な抗体を含むことができる。その他のＥＬＩＳＡキットは、結合した抗体を検出可能な試薬、例えば、標識された二次抗体、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ）、酵素（例：抗体とコンジュゲートされる）およびその基質または抗体と結合可能な他の物質などを含むことができる。

【0086】

（３）腎臓組織由来幹細胞の検出方法
本発明のさらに他の実施形態では、腎臓組織由来幹細胞の検出方法を提供する。

【0087】

本発明の前記検出方法は、目的とする個体から分離された生物学的試料からＬｒｉｇ１タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の発現レベルを測定するステップ、を含む。

【0088】

また、本発明の前記発現レベルを測定するステップの際、前記生物学的試料からＫｌｆ６タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の発現レベルを追加的に測定することができる。

【0089】

本発明の前記検出方法において、腎臓組織由来幹細胞、Ｌｒｉｇ１またはＫｌｆ６タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子などに関する内容は、上記の「１．腎臓組織由来幹細胞を有効成分として含む薬学組成物」および「（１）腎臓幹細胞の検出用組成物」に記載されたものと同一であるので、記載を省略する。

【0090】

本発明の前記「生物学的試料」は、個体から得られるか、個体に由来する任意の物質、生物学的体液、組織または細胞を意味するものであり、例えば、全血（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）、末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）、白血球軟膜（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）、血漿（ｐｌａｓｍａ）および血清（ｓｅｒｕｍ）を含む血液、尿（ｕｒｉｎｅ）、精液（ｓｅｍｅｎ）、器官分泌物（ｏｒｇａｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ）、細胞（ｃｅｌｌ）または細胞抽出物（ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔ）を含むことができ、例えば、腎臓組織または腎臓細胞であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0091】

本発明の前記遺伝子の発現レベルを測定するステップは、前記遺伝子に特異的に結合するプライマー、プローブおよびアンチセンスヌクレオチドからなる群より選択される少なくともいずれか１つである遺伝子の発現レベルを測定する製剤を用いて、逆転写重合酵素反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競争的逆転写重合酵素反応（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写重合酵素反応（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）またはＤＮＡチップなどにより行われるが、これに限定されるものではない。

【0092】

本発明の前記タンパク質の発現レベルを測定するステップは、前記タンパク質に特異的に結合する抗体、オリゴペプチド、リガンド、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）およびアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）からなる群より選択される少なくともいずれか１つであるタンパク質の発現レベルを測定する製剤を用いて、タンパク質チップ分析、免疫測定法、リガンドバインディングアッセイ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ（Ｓｕｌｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、補体固定分析法、２次元電気泳動分析、液体クロマトグラフィー－質量分析（ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＬＣ－ＭＳ）、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、ウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）などにより行われるが、これに限定されるものではない。

【0093】

本発明の前記検出方法において、前記Ｌｒｉｇ１タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の発現レベルが対照群と比較して増加した場合、腎臓組織由来幹細胞として検出するステップをさらに含むことができる。

【0094】

５．腎臓組織由来幹細胞の分離方法
本発明のさらに他の実施形態では、腎臓組織由来幹細胞の分離方法を提供する。

【0095】

本発明の前記分離方法は、目的とする個体から分離された生物学的試料からＬｒｉｇ１タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子が発現する細胞を分離するステップ、を含む。

【0096】

本発明の細胞を分離するステップの際、前記細胞は、Ｋｌｆ６タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子が追加的に発現するものであってもよい。

【0097】

本発明の前記分離方法において、Ｌｒｉｇ１またはＫｌｆ６タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子、腎臓組織由来幹細胞、生物学的試料などに関する内容は、上記の「１．腎臓幹細胞を有効成分として含む薬学組成物」、「（１）腎臓幹細胞の検出用組成物」および「（３）腎臓組織由来幹細胞の検出方法」に記載されたものと同一であるので、記載を省略する。

【0098】

本発明の前記分離するステップは、磁気活性細胞分類法（Ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ；ＭＡＣＳ）またはフローサイトメトリー分析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ）により行われる。

【0099】

６．腎臓組織由来幹細胞を培養する方法
本発明のさらに他の実施形態では、腎臓組織由来幹細胞を培養する方法を提供する。

【0100】

本発明の前記培養する方法は、Ｌｒｉｇ１タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を発現する腎臓組織由来幹細胞を分離するステップと、前記分離された腎臓組織由来幹細胞を培養するステップと、を含む。

【0101】

本発明の前記分離するステップの際、前記腎臓組織由来幹細胞は、Ｋｌｆ６タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子が追加的に発現するものであってもよい。

【0102】

本発明の前記分離方法において、Ｌｒｉｇ１またはＫｌｆ６タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子、腎臓組織由来幹細胞などに関する内容は、上記の「１．腎臓幹細胞を有効成分として含む薬学組成物」に記載されたものと同一であるので、記載を省略する。

【0103】

本発明の前記培養する方法は、本発明の前記５．腎臓組織由来幹細胞を分離する方法に記載された方法により、腎臓組織由来幹細胞を分離した後に、これを培養、例えば、試験管内（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で培養するものであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0104】

本発明の前記培養するステップにおいて、「培養」とは、細胞の任意の試験管内の培養を意味する。本発明の培養は、細胞培養培地を用いることができ、細胞培養培地は、細胞を培養する環境で使用するすべての種類の培地を意味し、例えば、アミノ酸、エネルギー源として少なくとも１つの炭水化物、微量元素、ビタミン、塩および可能な追加成分（例：細胞の成長、生産性、または生産物の品質に影響を及ぼすため）を含むことができるが、これに限定されるものではない。

【0105】

７．動物モデルの製造方法
本発明のさらに他の実施形態では、腎臓疾患の予防または治療のための細胞治療剤のスクリーニング用動物モデルの製造方法を提供する。

【0106】

本発明の前記動物モデルの製造方法は、目的とする遺伝子がＣｒｅＥＲＴ２－ＬｏｘＰシステムによって条件的に発現する動物に腎臓損傷を誘導するステップと、前記動物にエストロゲン拮抗剤を処理して、目的とする遺伝子の発現を誘導するステップと、を含む。

【0107】

本発明の前記動物モデルの製造方法において、腎臓組織由来幹細胞、腎臓疾患、細胞治療剤に関する内容は、上記の「１．腎臓組織由来幹細胞を有効成分として含む薬学組成物」に記載されたものと同一であるので、記載を省略する。

【0108】

本発明の前記「ＣｒｅＥＲＴ２－ＬｏｘＰシステム」は、プロモーター特異的に発現したＣｒｅ－ＥＲＴ２ポリペプチドが２つのＬｏｘＰヌクレオチド配列を認識し、２つのＬｏｘＰヌクレオチド配列の間を部位特異的組換えを触媒して、前記ＬｏｘＰヌクレオチドの下流の遺伝子を特異的に発現させるシステムをいう。このようなシステムの構築方法は、Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｒｅｓ．２０１８Ｄｅｃ；３４（４）：１４７－１５９．などに記載された内容によって通常の技術者が容易に構築することができる。

【0109】

本発明の前記「目的とする遺伝子」は、細胞治療剤として使用できる可能性がある細胞で特異的に発現するか、または発現すると予想される遺伝子であって、本発明の目的上、Ｌｒｉｇ１を暗号化する遺伝子、好ましくは、Ｌｒｉｇ１を暗号化する遺伝子およびＫｌｆ６を暗号化する遺伝子であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0110】

本発明の前記「動物モデル」は、ヒトの疾病などと非常に類似の形態を示すことができる動物を意味する。このような動物モデルを用いる場合には、多様な疾病の原因と発病過程などを研究することができ、治療剤選別、毒性検査などのような可能性の有無を判断する基礎資料を得ることができる。

【0111】

本発明の前記動物は、ヒトを除いた任意の哺乳類動物を意味し、胚、胎児、新生児、成人を含むすべての年齢の動物を含む。このような動物は、ウサギ、齧歯類（マウス、ネズミ、ハムスター、アレチネズミまたはモルモット）、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥（ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ）および霊長類（チンパンジー、サル、アカゲザル）からなる群より選択されるいずれか１つであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0112】

本発明の前記腎臓損傷を誘導するステップは、葉酸の腹腔内投与；虚血／再灌流損傷を誘導；および片側性尿管閉塞誘導で構成された方法のいずれか１つを行うものであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0113】

本発明の前記葉酸は、１００ｍｇ／ｋｇ～３００ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与されるものであってもよく、例えば、１５０ｍｇ／ｋｇまたは２５０ｍｇ／ｋｇで投与されるものであってもよいが、これに限定されるものではない。前記葉酸の投与用量が１００ｍｇ／ｋｇ未満の場合には、腎臓に急性腎臓損傷が誘導されないことがあり、３００ｍｇ／ｋｇ超過の場合には、動物モデルに毒性が存在して、目的とする実験結果の解析に影響を及ぼしたり、または動物モデルが死亡することがある。

【0114】

本発明の前記エストロゲン拮抗剤は、タモキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、クロミフェン（Ｃｌｏｍｉｆｅｎｅ）、ラロキシフェン（Ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、またはこれらの組み合わせであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0115】

８．動物モデル
本発明のさらに他の実施形態では、本発明の前記製造方法により製造された腎臓疾患の予防または治療のための細胞治療剤スクリーニング用動物モデルを提供する。

【0116】

本発明の前記動物モデルにおいて、製造方法、細胞治療剤、腎臓疾患などに関する内容は、上記の「１．腎臓組織由来幹細胞を有効成分として含む薬学組成物」および「６．動物モデルの製造方法」に記載されたものと同一であるので、記載を省略する。

【発明の効果】

【0117】

本発明による腎臓組織由来幹細胞；またはオルガノイドは、治療のための施術が容易であり、高い自己増殖能で大量供給が可能であり、腎臓細胞への分化能に優れ、腫瘍形成の可能性が低いだけでなく、病変に直接注入される場合、損傷した組織を再生する能力が非常に卓越する。したがって、このような幹細胞のうち、特に成体幹細胞ベースの再生治療に非常に好適に使用できる。

【0118】

また、本発明による組成物は、腎臓細胞のうち、特に腎臓幹細胞のみを特異的に選別することができる。さらに、Ｌｒｉｇ１タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を発現する腎臓幹細胞は、再生能力および多能性に非常に優れ、ネフロンに分裂可能な能力を有しているので、腎臓疾患の予防または治療に非常に効果的に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【0119】

【図1】本発明の一実施例による生体内系統追跡研究で使用されるマウス動物モデルを用いた実験プロセスの模式図を示す図である。

【図2】本発明の一実施例による生体内系統追跡研究で使用される胚状態のマウス動物モデルを用いた実験プロセスの模式図を示す図である。

【図3】本発明の一実施例による高用量（２５０ｍｇ／ｋｇ）葉酸誘導急性腎臓損傷動物モデルの製造方法に関する模式図を示す図である。

【図4】本発明の一実施例による高用量（１５０ｍｇ／ｋｇ）葉酸誘導急性腎臓損傷動物モデルに本発明による腎臓オルガノイドを移植した後、分析過程に関する模式図を示す図である。

【図5】本発明の一実施例による虚血／再灌流損傷誘導急性腎臓損傷動物モデルの製造方法に関する模式図を示す図である。

【図6】本発明の一実施例による片側性尿管閉塞誘導急性腎臓損傷動物モデルの製造方法に関する模式図を示す図である。

【図7】本発明の一実施例によるマウスの腎臓においてｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞（Ｌｒｉｇ１ｔｄＴ＋）の存在の有無を組織染色結果により確認した結果を示す図である。

【図8】本発明の一実施例によるマウスの腎臓においてｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞（Ｌｒｉｇ１ｔｄＴ＋）の数を定量化した結果を示す図である。

【図9】本発明の一実施例による発生段階のマウスにおいてｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞（Ｌｒｉｇ１ｔｄＴ＋）の存在の有無を組織染色結果により確認した結果を示す図である。

【図10】本発明の一実施例による発生段階のマウスにおいてｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞（Ｌｒｉｇ１ｔｄＴ＋）の数を定量化した結果を示す図である。

【図11】本発明の一実施例による腎臓オルガノイドを蛍光顕微鏡を用いて確認した結果を示す図である。

【図12】本発明の一実施例による腎臓オルガノイドで発現する遺伝子の発現レベルをリアルタイム重合酵素連鎖反応により確認した結果を示す図である。

【図13】本発明の一実施例による腎臓オルガノイドを１日から１９日まで長期間培養した時、腎臓オルガノイド数が増加することを確認した結果を示す図である。

【図14】本発明の一実施例による高用量（１５０ｍｇ／ｋｒ）葉酸誘導急性腎臓損傷動物モデルにＰＢＳまたは本発明による腎臓オルガノイドを移植し、腎臓復旧の存在の有無を確認するために、組織染色およびＫＩＭ１の発現レベルを確認した結果を示す図である。

【図15】本発明の一実施例による高用量（１５０ｍｇ／ｋｒ）葉酸誘導急性腎臓損傷動物モデルにＰＢＳまたは本発明による腎臓オルガノイドを移植し、腎臓復旧の存在の有無を確認するために、血中ＢＵＮおよびクレアチン濃度を確認した結果を示す図である。

【図16】本発明の一実施例による腎臓オルガノイドにおいてＫｉ－６７の発現を蛍光顕微鏡で確認した結果を示す図である。

【図17】本発明の一実施例による腎臓オルガノイドにおいて近位細尿管（ＰＴ）クラスターをＰＴＳ１、ＰＴＳ２、ＰＴＳ３およびＰＴＱＰｓの４個のサブ－クラスターに分類したことを示した。

【図18】本発明の一実施例による腎臓オルガノイドにおいてＰＴＳ１、ＰＴＳ２、ＰＴＳ３およびＰＴＱＰｓのクラスター別遺伝子の発現レベルを確認した結果をバブル－プロットで示す図である。

【図19】本発明の一実施例による腎臓オルガノイドにおいてＰＴＳ１、ＰＴＳ２、ＰＴＳ３およびＰＴＱＰｓのクラスター別遺伝子の発現レベルを確認した結果をバブル－プロットで示す図である。

【図20】本発明の一実施例による腎臓オルガノイドを移植した後、Ｃｒｅ－ｌｏｘｐ誘導後１日目と３６５日目にＰＴＳ１、ＰＴＳ２、ＰＴＳ３およびＰＴＱＰｓクラスター細胞の比率を測定した結果を示す図である。

【図21】本発明の一実施例による腎臓オルガノイドを移植した後、Ｃｒｅ－ｌｏｘｐ誘導後１日目対比の３６５日目にＰＴＳ１、ＰＴＳ２、ＰＴＳ３およびＰＴＱＰｓクラスター細胞数の変化を測定した結果を示す図である。

【図22】本発明の一実施例による腎臓オルガノイドにおいてＰＴＳ１、ＰＴＳ２、ＰＴＳ３およびＰＴＱＰｓの各クラスター別自己－再生関連遺伝子、静止（ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ）関連遺伝子、および多能性／未成熟細胞関連遺伝子の発現レベルを確認した結果をバイオリン－プロットで示す図である。

【図23】本発明の一実施例による腎臓オルガノイドにおいてＰＴＳ３およびＰＴＱＰｓクラスターで高く発現する上位１０個の遺伝子を示す図である。

【図24】本発明の一実施例による腎臓オルガノイドを移植した後、Ｃｒｅ－ｌｏｘｐ誘導後１日目と３６５日目の腎臓切片でＬＴＬ（ＰＴマーカー）およびＫＬＦ６を染色した免疫蛍光染色写真を示す図である。

【図25】本発明の一実施例による腎臓オルガノイドを移植した後、Ｃｒｅ－ｌｏｘｐ誘導後１日目と３６５日目の腎臓切片で２０Ｘフィールド（ｆｉｅｌｄ）あたりＬＴＬ＋ＫＬＦ６＋細胞を定量化した結果を示す図である（Ｎ＝３、２４個のイメージ）。

【図26】本発明の一実施例による腎臓オルガノイドを移植した後、Ｃｒｅ－ｌｏｘｐ誘導後１日目と３６５日目に各クラスター別ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の比率を示す図である。

【図27】本発明の一実施例による腎臓オルガノイドの近位細尿管（ＰＴ）で擬時間（ｐｓｅｕｄｏｔｉｍｅ）系統を３つの異なる状態に区分したものであり、ＰＴＳ１、ＰＴＳ３およびＰＴＱＰｓクラスターはそれぞれ異なる色で示した。黒い矢印は擬時間の方向を示した。

【図28】本発明の一実施例による腎臓オルガノイドを移植した後、Ｃｒｅ－ｌｏｘｐ誘導後１日目と３６５日目にｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞を系統グラフにプロットし、発現レベルを色で区分した結果を示す図である。ここで、低発現は灰色、高発現は赤色で示した。

【図29】本発明の一実施例による腎臓オルガノイドを移植した後、Ｃｒｅ－ｌｏｘｐ誘導後１日目と３６５日目の腎臓切片をＬｒｉｇ１ｔｄＴｏｍａｔｏ＋およびＫＬＦ６染色した免疫蛍光染色写真を示す図である。

【図30】本発明の一実施例による腎臓オルガノイドを移植した後、Ｃｒｅ－ｌｏｘｐ誘導後１日目と３６５日目の腎臓切片で２０Ｘフィールド（ｆｉｅｌｄ）あたりＬｒｉｇ１ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＫＬＦ６＋細胞を定量化した結果を示す図である（Ｎ＝５、４２個のイメージ）。

【発明を実施するための形態】

【0120】

本発明は、従来の急性腎不全のような腎臓疾患治療の限界点を克服し、より効果的な治療剤を開発するためのものである。本発明は、腎臓組織由来幹細胞またはオルガノイドを用いて効果的な腎臓疾患治療剤を開発するためのものである。高濃度葉酸（ＦＡ）のみを処理した場合、および高濃度葉酸を処理しＰＢＳを注入した場合（ＦＡ＋ＰＢＳ）には、血中ＢＵＮおよびクレアチン（Ｃｒｅａｔｉｎｅ）が存在するレベルが非常に高いのに対し、腎臓オルガノイドを注入した場合には、ＢＵＮおよびクレアチンが存在するレベルが正常（Ｎｏｒｍａｌ）と類似程度に減少した。このような結果により、Ｌｒｉｇ１陽性腎臓オルガノイドは、損傷した腎臓の治療に非常に効果的に使用できることが直接的に分かる。

【実施例】

【0121】

［実験方法］
［実験方法１］実験動物
本明細書で行われたすべての生体内（Ｉｎ ｖｉｖｏ）実験は韓国の延世大学動物倫理審議委員会（ＩＡＣＵＣ２０１７－０３２５）の承認を受けて行われた。

【0122】

明暗周期１２時間交代下、特定の病原体がない（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ；ＳＰＦ）バリア施設に実験動物を収容し、ピコラボのラボ齧歯類ダイエット２０（ＰｉｃｏＬａｂ Ｌａｂ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ２０，ＬａｂＤｉｅｔ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）飼料を供給する方式で実験動物を飼育した。

【0123】

生体内（Ｉｎ ｖｉｖｏ）実験で使用された実験動物の場合、１）Ｌｒｉｇ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋はヴァンダービルト大学のロバートＪ．コフィー（Ｒｏｂｅｒｔ Ｊ．Ｃｏｆｆｅｙ）から提供され、２）Ｂ６．Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１４（ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）／Ｈｚｅ／Ｊ（Ｒ２６Ｒ－ＬＳＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、００７９１４）は延世大学のポク・ジンウン教授から提供され、３）Ｂ６．１２９（Ｃｇ）－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ４（ＡＣＴＢ－ｔｄＴｏａｍｔｏ－ＥＧＦＰ）Ｌｕｏ／Ｊ（ＡＣＴＢ－ｍＴ／ｍＧ；Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、００７６７６）は延世大学のキ・ヒョンウン教授から提供された。

【0124】

［実験方法２］生体内系統追跡研究方法
図１に示されるように、前記実験方法１の同型のレポーターマウスであるＬｒｉｇ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスおよびＲ２６Ｒ－ＬＳＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスを交配させて異型のマウスを生産した。前記マウスにトウモロコシオイルに含まれているタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）２ｍｇを３日連続で腹腔内に注入してＣｒｅ－ｌｏｘｐ組換え誘導した後、１日、３日、１０日、３０日、６０日、９０日、１８０日または３６５日目に分析を行った。

【0125】

また、図２に示されるように、同型のレポーターマウスであるＬｒｉｇ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスおよびＲ２６Ｒ－ＬＳＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスを交配させて発生したＥ９．５、Ｅ１０．５、Ｅ１３．５およびＥ１８．５胚に、トウモロコシオイルに含まれている４－ヒドロキシタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）２ｍｇを１回注入し、産後６週目に分析を行った。

【0126】

［実験方法３］生体外（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）２Ｄおよびオルガノイド培養方法
２Ｄおよびオルガノイド培養のために、Ｌｒｉｇ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスおよびＲ２６Ｒ－ＡＣＴＢ－ｍＴ／ｍＧマウスを交配させて生産された同型のレポーターマウスを６週～１０週飼育した後、一次腎臓上皮細胞を採取した。前記採取された一次腎臓上皮細胞に２ｍｇ／ｍｌの１型コラゲナーゼを入れて、３７℃で３０分間スムーズに撹拌しながら培養した。その後、フィルタを用いて前記一次腎臓上皮細胞を濾過した後に分離された単一細胞を培養した。以後、Ｌｒｉｇ１タンパク質が発現した細胞をＲＰＭＩ１６４０（１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含む）培地に入れて、５％ＣＯ_２および３７℃の条件でコンフルエンス（Ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が８０％になる程度である７日～８日間培養した。以後、成長因子減少マトリゲルおよび培養培地が含まれているウェルに１×１０^３の数の前記培養された細胞を分注し培養した。ここで、前記培養培地は１％ペニシリン－ストレプトマイシン、ヘプス（ＨＥＰＳ）およびグルタマックスが含まれているＡＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地をベースとして、１．５％Ｂ２７補充剤、４０％Ｗｎｔ３ａ条件培地（ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｕｓｉｎｇ ｓｔａｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ Ｌ ｃｅｌｌｓ）、１０％ｎｏｇｇｉｎ条件培地、１０％Ｒｓｐｏ１条件培地、５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－１０、１．２５ｍＭのＮ－アセチルシステイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）および５μＭのＡ８３０１（ＣＡＳ ｎｏ．ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ９０９９１０－４３－６）が含まれているものを使用した。

【0127】

マトリゲルで前記細胞が十分にポリメライゼーション（Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｉｏｎ）されるようにした後、オルガノイド培養培地を追加し、オルガノイド培養培地は３日ごとに入れ替えた。

【0128】

［実験方法４］急性腎臓損傷動物モデルの作製
［４－１］高用量葉酸誘導急性腎臓損傷動物モデルの作製
図３に示されるように、成人（８～１０週齢）Ｌｒｉｇ１－ＣｒｅＥＲＴ２；ＬＳＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスに、前記実験方法２に記載されたように、タモキシフェンを注入する過程によりＬｒｉｇ１タンパク質が発現できるようにした。以後、急性腎臓損傷誘導のために、２５０ｍｇ／ｋｇの葉酸（Ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ；ＦＡ）を腹腔内に注入した。

【0129】

また、図４に示されるように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１５０ｍｇ／ｋｇの葉酸を腹腔内に注入して急性腎臓損傷を誘導し、葉酸を注入後３日目に前記実験方法３で作製した腎臓オルガノイドを直立性移植する方式で移植した。具体的には、イソフルランを用いて前記急性腎臓損傷が誘導されたＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）を痲酔し、脇腹を切開して腎臓を外部に露出させた。その後、対照群であるＰＢＳまたは前記実験方法３で作製された腎臓オルガノイド約４０個を前記腎臓の皮質部位に最小１５回以上直接注入した。以後、分析のために、１１日間マウスを飼育した。以後、１４日目にマウスから血漿クレアチニン（Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）およびＢＵＮの数値を測定するために血液サンプルを採取した。

【0130】

［４－２］虚血／再灌流損傷誘導急性腎臓損傷動物モデルの作製
図５に示されるように、成人（８～１０週齢）Ｌｒｉｇ１－ＣｒｅＥＲＴ２；ＬＳＬ－ｔｄＴＯｍａｔｏマウスに、前記実験方法２に記載されたように、タモキシフェンを注入する過程によりＬｒｉｇ１タンパク質が発現できるようにした。以後、前記マウスの腎動脈を鉗子で２０分間閉塞する過程により急性腎臓損傷を誘導した。３日後、前記マウスの腎臓組織を採取して確認した結果、急性腎臓損傷が誘導されたことを確認することができた。

【0131】

［４－３］片側性尿管閉塞誘導急性腎臓損傷動物モデルの作製
図６に示されるように、成人（８～１０週齢）Ｌｒｉｇ１－ＣｒｅＥＲＴ２；ＬＳＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスに、前記実験方法２に記載されたように、タモキシフェンを注入する過程によりＬｒｉｇ１タンパク質が発現できるようにした。以後、尿管を鉗子で７日間閉塞する過程により急性腎臓損傷を誘導した。７日後、前記マウスの腎臓組織を採取して確認した結果、急性腎臓損傷が誘導されたことを確認することができた。

【0132】

［実験結果］
［実験結果１］マウスの腎臓におけるＬｒｉｇ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ子孫のタモキシフェン誘導による血統分析
腎臓においてＬｒｉｇ１を発現する細胞とそれらの子孫の行動様式を分析するために、Ｒ２６Ｒ－ＬＳＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスモデルを用いて系統追跡分析を行った。

【0133】

図７に示すように、初日にはコルテックス（Ｃｏｒｔｅｘ）で非常に少ないレベルのｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞が観察されたのに対し、３６５日目にはＬｒｉｇ１を発現する細胞によって誘導された子孫細胞は全体腎臓で管構造の１２（±２．４）％を生成することが確認された。

【0134】

図８に示すように、日付によってＬｒｉｇ１を発現する細胞の数（Ｌｒｉｇ１ｔｄＴ＋）を定量化した時、このような細胞クローンは時期が続くにつれて順次に一緒に増加し、このような増加はＬｒｉｇ１発現後３６５日まで続いた。

【0135】

図９および図１０に示すように、尿管芽分岐段階（Ｕｒｅｔｅｒｉｃ ｂｕｄ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｓｔａｇｅ）であるＥ９．５およびＥ１０．５ではｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞（Ｌｒｉｇ１ｔｄＴ＋）が観察されなかった。しかし、腎形成段階（Ｎｅｐｈｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｓｔａｇｅ）であるＥ１３．５ではｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞が観察され、大部分の細胞はチューブ構造を形成するように拡張されていた。

【0136】

このような結果により、Ｌｒｉｇ１が初期に成熟した腎臓に発達した後、ネフロン分裂を生成するのに関与する幹細胞集団であることが分かる。

【0137】

［実験結果２］高濃度葉酸によって誘導された急性腎臓損傷動物モデルにおける腎臓オルガノイド直交移植による治療効果の確認
図１１に示すように、前記実験方法３に記載された方法により作製された腎臓オルガノイドを蛍光顕微鏡を用いて分析した結果、腎臓オルガノイドを培養して７日目および９日目に緑色のＬｒｉｇ１細胞が多数観察された。

【0138】

また、図１２に示すように、腎臓オルガノイドを培養して１７日目に、遺伝子発現レベルを通常の方法により下記表１のプライマーを用いてリアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を行って確認した時、Ｌｒｉｇ１の発現レベルだけでなく、Ｓａｌｌ１、Ｓｉｘ２、Ｆｏｘｏ１、Ｃｉｔｅｄ、Ｏｓｒ１、Ｈｏｘｐ７、Ｊａｇｇｅｄ１およびＧａｔａ３のような腎臓幹細胞の遺伝子の発現レベルも一緒に増加していることを確認した。さらに、図１３に示すように、Ｌｒｉｇ１陽性である腎臓オルガノイドの場合には、生成されるオルガノイド数が９日目から１９日目まで約４０個以上の数に増加した。

【0139】

【表1】

【0140】

図１４に示すように、前記実験方法４の［４－１］に記載された高濃度葉酸によって誘導された急性腎臓損傷動物モデルにＰＢＳ（ＦＡ＋ＰＢＳ）または腎臓オルガノイド（ＦＡ＋Ｏｒｇａｎｏｉｄ）を実験方法4によって腎臓に直接注入し、１４日後に通常の方法によりＨ＆Ｅ染色を行った。その結果、ＰＢＳのみを注入した場合（ＦＡ＋ＰＢＳ）には、高濃度葉酸によって損傷した腎臓が復旧されず、ＫＩＭ１の発現レベルが高いのに対し、腎臓オルガノイドを注入した場合には、高濃度葉酸によって損傷した腎臓が復旧され、ＫＩＭ１の発現レベルが減少した。このような結果により、腎臓オルガノイドの注入は損傷した腎臓を非常に効果的に復旧させることができることが分かる。

【0141】

また、図１５に示すように、高濃度葉酸（ＦＡ）のみを処理した場合、および高濃度葉酸を処理しＰＢＳを注入した場合（ＦＡ＋ＰＢＳ）には、血中ＢＵＮおよびクレアチン（Ｃｒｅａｔｉｎｅ）が存在するレベルが非常に高いのに対し、腎臓オルガノイドを注入した場合には、ＢＵＮおよびクレアチンが存在するレベルが正常（Ｎｏｒｍａｌ）と類似程度に減少した。このような結果により、Ｌｒｉｇ１陽性腎臓オルガノイドは損傷した腎臓の治療に非常に効果的に使用できることが直接的に分かる。

【0142】

また、図１６に示すように、蛍光顕微鏡により確認した結果、免疫蛍光染色により腎臓内に注入されたオルガノイドを確認し、Ｋｉ－６７のような増殖マーカーが発現することが分かったので、腎臓内に注入されたオルガノイドは増殖性があることが確認された。

【0143】

［実験結果３］Ｌｒｉｇ１およびその子孫細胞の成人腎臓における幹細胞ニッチ形成効果
上記の実験結果により、Ｌｒｉｇ１陽性細胞は近位細尿管（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌｅ；ＰＴ）で長期間生存し、潜在的な腎臓幹／前駆細胞に相当し、前記Ｌｒｉｇ１陽性細胞由来の子孫細胞（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔｓ）がＰＴ恒常性を維持するのに実質的に貢献することが分かった。ＰＴでＬｒｉｇ１＋細胞とその由来細胞の細胞的異質性を確認するために、図１７に示すように、ＰＴクラスターをＰＴＳ１、ＰＴＳ２、ＰＴＳ３およびＰＴＱＰｓの４個のサブ－クラスターに分類した。この時、ＰＴＳ１の分類のためにＳｌｃ５ａ１２およびＳｌｃ５ａ２マーカー、ＰＴＳ２分類のためにＳｌｃ１３ａ３およびＤｄａｈ１マーカー、ＰＴＳ３分類のためにＳｌｃ１６ａ９およびＳｌｃ７ａ１３マーカーを用いた。そして、図１８に示すように、急性腎臓損傷状態で上方調節されるピルベートデヒドロゲナーゼ腎臓４（Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｋｉｄｎｅｙ ４；Ｐｄｋ４）およびシステイン－リッチタンパク質（Ｃｙｓｔｅｉｎ－ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ６１；Ｃｙｒ６１）が豊富に発現するサブ－クラスターであるＰＴＱＰｓを見つけた。より具体的に定義すべく、ＰＴＱＰｓを他のＰＴサブ－クラスターと比較した。ＰＴＱＰｓで発現する上位５０個の遺伝子の発現レベルを確認した結果、図１９に示すように、ＰＴＱＰｓでは腎臓損傷および回復関連遺伝子が高く発現することを確認することができ、２ネフロン前駆体遺伝子（２ｎｅｐｈｒｏｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｇｅｎｅｓ）も発現することを確認することができた。各ＰＴサブ－クラスターで細胞数を測定した結果、図２０に示すように、Ｃｒｅ－ｌｏｘｐ組換え後３６５日目にはＰＴＳ２およびＰＴＱＰｓ細胞数が増加した。また、図２１に示すように、Ｃｒｅ－ｌｏｘｐ組換え後３６５日目の腎臓でＰＴＱＰｓクラスター細胞数が１日目の腎臓と比較して５倍増加したことを確認することができた。これから、ＰＴ細胞は時間経過とともに増加し、特に、ＰＴＱＰｓおよびＰＴＳ２クラスター細胞数が増加することが分かった。次に、成人幹細胞遺伝子モジュールを用いて腎臓のＰＴＱＰｓクラスターを定義した。その結果、ＤＥＧｓで計６５０個の遺伝子を検出した。図２２に示すように、ＰＴＱＰｓクラスターで幹－関連遺伝子が高く発現し、自己－再生関連遺伝子（Ｋｌｆ５は除いて、Ｐｔｂｐ１、Ｎｃｌ、Ｃｔｒ９およびＣｉｔｅｄ２）、静止（ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ）関連遺伝子（Ｈｉｆ１ａ、Ｍｙｃ、およびＦｏｘｏ３）、そして多能性または未成熟細胞関連遺伝子（Ｉｄ２、Ｂｔｇ２、Ｔｕｂｂ６、およびＫｌｆ２）が上方調節されたことを確認することができた。これにより、ＰＴＱＰｓクラスターは、腎臓損傷－回復関連遺伝子と成熟ＰＴ細胞のマーカーを含めて幹能関連遺伝子が発現することが分かり、このような結果から当該クラスターを「ＰＴ静止前駆体（ＰＴ ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ；ＰＴＱＰｓ）」と名付けたのである。

【0144】

次に、ＰＴＳ３と区別されるＰＴＱＰｓマーカーを確認した結果、図２３に示すように、ＤＥＧｓで高く発現する幹細胞ニッチとして知られた遺伝子を確認することができた。ＰＴＳ３クラスターではＰＴセグメント３（ＰＴ ｓｅｇｍｅｎｔ ３）特異的遺伝子が高く発現したのに対し、ＰＴＱＰｓでは高く発現しなかった。ＰＴＱＰｓマーカーを検証するために、Ｊｕｎ、Ｋｌｆ６およびＣｙｒ６１を用いて腎臓切片をＩＦ染色した。ＪｕｎおよびＣｙｒ６１はＰＴだけでなく多様なネフロン切片で高く発現して、これらを除いた。次に、ＰＴで発現するかを確認するために、１日目および３６５日目の腎臓切片でＫＬＦ６およびＬＴＬを染色した。図２４に示すように、１日目の腎臓切片でＫｌｆ６＋ＬＴＬ＋ＰＴ尿細管が弱く発現したのに対し、３６５日目の腎臓切片ではＫｌｆ６＋ＬＴＬ＋ＰＴ尿細管が強く発現した。定量化の結果、図２５に示すように、ＫＬＦ６＋発現ＰＴ尿細管は３６５日目の腎臓で著しく増加したことを確認することができた。これから、３６５日目の腎臓でＰＴＱＰｓ分布の増加はＫｌｆ６を用いて確認できることが分かった。

【0145】

Ｌｒｉｇ１陽性細胞に由来する子孫細胞がＰＴＱＰｓ集団をなすかを確認するために、１日目および３６５日目の腎臓切片でｔｄＴｏｍａｔｏ発現細胞を確認した。その結果、図２６に示すように、１日目の腎臓切片ではｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞はＰＴＳ１細胞の５４％、ＰＴＳ３の２７％をなしたが、３６５日目の腎臓切片ではそれぞれ５０％および１１％に減少した。これに対し、１日目の腎臓切片でＰＴＳ２細胞の１２％、ＰＴＱＰｓ細胞の１７．８％をなしたが、３６５日目にはそれぞれ２０％および１８％に増加した。これから、Ｌｒｉｇ１陽性細胞に由来する子孫細胞がＰＴＱＰｓ細胞集団をなすことが分かった。また、単一細胞での情報により分化への進行を示す細胞の軌跡（ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ）を分析した。軌跡の初期段階ではＰＴ幹細胞ニッチとして知られたＰＴＳ３と新しい幹細胞ニッチとして究明されたＰＴＱＰｓに相当した。このような細胞群集団はＰＴＳ１への２個の区分される軌跡に分けられるが（図２７）、１日目の腎臓ではＰＴＳ３が優勢になってからＰＴＳ１クラスターに分化する様相を示し、３６５日目にはＰＴＱＰｓクラスターが主にＰＴＳ１クラスター細胞の恒常性を行うことが分かった。１日目および３６５日目にＰＴＳ３およびＰＴＱＰｓとｔｄＴｏｍａｔｏ－発現細胞をアラインした結果、図２８に示すように、１日目にはＰＴＳ３クラスターでｔｄＴｏｍａｔｏ発現細胞はＰＴＳ１に分化されることを確認することができ、３６５日目にはＰＴＱＰｓクラスターでｔｄＴｏｍａｔｏ発現細胞は主にＰＴＳ１を維持させることが分かった。Ｋｌｆ６およびｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞を染色すれば、図２９および３０に示すように、１日目と比較して３６５日目にＫｌｆ６＋ｔｄＴｏｍａｔｏ＋尿細管が著しく増加したことを確認することができた。これにより、Ｌｒｉｇ１陽性細胞およびこれに由来する子孫細胞がＰＴＱＰｓクラスターをなすことが分かった。実験条件でも１日目の腎臓は６週齢マウスから取ったが、３６５日目の腎臓は１３ヶ月齢のマウスから取った。上記の実験結果から腎臓の恒常性は若い腎臓（１日目の腎臓）ではＰＴＳ３によって調節され、そして、老化した腎臓（３６５日目の腎臓）ではＰＴＱＰｓが新しい幹細胞ニッチを示すことが分かった。

【0146】

以上、本発明について詳細に説明したが、本発明の権利範囲はこれに限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で多様な修正および変形が可能であることは当技術分野における通常の知識を有する者には自明であろう。

【産業上の利用可能性】

【0147】

本発明は、従来の急性腎不全のような腎臓疾患治療の限界点を克服し、より効果的な治療剤を開発するためのものである。現在、腎臓幹細胞を識別し治療剤として適用するための幹細胞を同定し、臨床に活用するための適用可能性などに関する研究は不備であるのが現状であるが、開発の必要性が要求されている。本発明は、腎臓組織由来幹細胞；またはオルガノイドは、治療のための施術が容易であり、腎臓細胞への分化能に優れ、腫瘍形成の可能性が低いだけでなく、病変に直接注入される場合、損傷した組織を再生する能力が非常に卓越するので、腎臓疾患の予防または治療に非常に効果的に用いられると期待される。
［配列リストのフリーテキスト］
配列番号1:
MARPVRGGLG APRRSPCLLL LWLVLVRLEP VTAAAGPRAP CAAACTCAGD SLDCGGRGLA
ALPGDLPSWT RSLNLSYNKL SEIDPAGFED LPNLQEVNLS YNKLSEIDPA GFEDLPNLQE
VYLNNNELTA VPSLGAASSH VVSLFLQHNK IRSVEGSQLK AYLSLEVLDL SLNNITEVRN
TCFPHGPPIK ELNLAGNRIG TLELGAFDGL SRSLLTLRLS KNRITQLPVR AFKLPRLTQL
DLNRNRIRLI EGLTFQGLNS LEVLKLQRNN ISKLTDGAFW GLSKMHVLHL EYNSLVEVNS
GSLYGLTALH QLHLSNNSIA RIHRKGWSFC QKLHELVLSF NNLTRLDEES LAELSSLSVL
RLSHNSISHI AEGAFKGLRS LRVLDLDHNE ISGTIEDTSG AFSGLDSLSK LNLGGNAIRS
VQFDAFVKMK NLKELHISSD SFLCDCQLKW LPPWLIGRML QAFVTATCAH PESLKGQSIF
SVPPESFVCD DFLKPQIITQ PETTMAMVGK DIRFTCSAAS SSSSPMTFAW KKDNEVLTNA
DMENFVHVHA QDGEVMEYTT ILHLRQVTFG HEGRYQCVIT NHFGSTYSHK ARLTVNVLPS
FTKTPHDITI RTTTVARLEC AATGHPNPQI AWQKDGGTDF PAARERRMHV MPDDDVFFIT
DVKIDDAGVY SCTAQNSAGS ISANATLTVL ETPSLVVPLE DRVVSVGETV ALQCKATGNP
PPRITWFKGD RPLSLTERHH LTPDNQLLVV QNVVAEDAGR YTCEMSNTLG TERAHSQLSV
LPAAGCRKDG TTVGIFTIAV VSSIVLTSLV WVCIIYQTRK KSEEYSVTNT DETVVPPDVP
SYLSSQGTLS DRQETVVRTE GGPQANGHIE SNGVCPRDAS HFPEPDTHSV ACRQPKLCAG
SAYHKEPWKA MEKAEGTPGP HKMEHGGRVV CSDCNTEVDC YSRGQAFHPQ PVSRDSAQPS
APNGPEPGGS DQEHSPHHQC SRTAAGSCPE CQGSLYPSNH DRMLTAVKKK PMASLDGKGD
SSWTLARLYH PDSTELQPAS SLTSGSPERA EAQYLLVSNG HLPKACDASP ESTPLTGQLP
GKQRVPLLLA PKS
配列番号2:
MDVLPMCSIF QELQIVHETG YFSALPSLEE YWQQTCLELE RYLQSEPCYV SASEIKFDSQ
EDLWTKIILA REKKEESELK ISSSPPEDTL ISPSFCYNLE TNSLNSDVSS ESSDSSEELS
PTAKFTSDPI GEVLVSSGKL SSSVTSTPPS SPELSREPSQ LWGCVPGELP SPGKVRSGTS
GKPGDKGNGD ASPDGRRRVH RCHFNGCRKV YTKSSHLKAH QRTHTGEKPY RCSWEGCEWR
FARSDELTRH FRKHTGAKPF KCSHCDRCFS RSDHLALHMK RHL
配列番号3: GGTGAGCCTGGCCTTATGTGAATA
配列番号4: CACCACCATCCTGCACCTCC
配列番号5: TACTCTTTCCTTCAGGCAGTGA
配列番号6: GATCGAGGCAAGTGCATGG
配列番号7: CACCTCCACAAGAATGAAAGCG
配列番号8: CTCCGCCTCGATGTAGTGC
配列番号9: AACCTTGGAGTGAAGGATCGC
配列番号10: GTAGGAGAGCCTATTGGAGATGT
配列番号11: CTCAACATTTCCAATCCGACCC
配列番号12: GGCATCCTTGCTCTTAGTGGG
配列番号13: GAGAGCCAGCCTACCATCC
配列番号14: GGGTCCTCGTGTTTGAAGGAA
配列番号15: AAGTTCGGTTTTCGCTCCAGG
配列番号16: ACACCCCGGAGAGGTTCTG
配列番号17: CTCGGCCATTCGTACATGGAA
配列番号18: GGATACCTCTGCACCGTAGC
配列番号19: GCGTCAGGGAGATGGTAAAG
配列番号20: CATCAGGGAAACAGTTGCAG
配列番号21: CGCTAAGAATCCGCTGGTGAAG
配列番号22: GGATCTTGACGAAGCAGTCGTT
配列番号23: CCTCGGGTCAGTTTGAGCTG
配列番号24: CCTTGAGGCACACTTTGAAGTA

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【配列表】

2024505587000001.app

【国際調査報告】