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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-07
(54)【発明の名称】遺伝子改変酵母細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 1/19 20060101AFI20240131BHJP
C12N 15/81 20060101ALI20240131BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20240131BHJP
C07K 14/395 20060101ALI20240131BHJP
C07K 14/805 20060101ALI20240131BHJP
【ＦＩ】
C12N1/19
C12N15/81 Z ZNA
C12N15/31
C07K14/395
C07K14/805
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023528070
(86)(22)【出願日】2021-11-11
(85)【翻訳文提出日】2023-07-05
(86)【国際出願番号】 SE2021051128
(87)【国際公開番号】W WO2022103318
(87)【国際公開日】2022-05-19
(31)【優先権主張番号】2051317-2
(32)【優先日】2020-11-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520011050
【氏名又は名称】クリシア リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】イシシュク、オレナ
(72)【発明者】
【氏名】ペトラノヴィッチ ニールセン、ディナ
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA76X
4B065AA77X
4B065AA80X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA60
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA11
4H045EA60
(57)【要約】
ポルフォビリノーゲン脱アミナーゼ（ＨＥＭ３）をコードする酵母遺伝子の過剰発現を含む遺伝子改変を含み、ＨＥＭ３遺伝子が配列番号７と少なくとも８０％の同一性を有する、遺伝子改変酵母細胞。改変酵母細胞のゲノムは、低酸素遺伝子のヘム依存性リプレッサ（ＲＯＸ１）をコードする遺伝子、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＭＸ１）をコードする遺伝子、液胞プロテアーゼの受容体（ＶＰＳ１０）をコードする遺伝子、及び液胞プロテイナーゼ（ＰＥＰ４）をコードする遺伝子から選択される１つ又は複数の遺伝子における１つ又は複数の遺伝子改変をさらに含み、１つ又は複数の遺伝子改変は、そのような遺伝子からのポリペプチドの発現が低減若しくは破壊されるか、又は発現されるポリペプチドが非機能的であるような遺伝子改変である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポルフォビリノーゲン脱アミナーゼ（ＨＥＭ３）をコードする酵母遺伝子の過剰発現を含む遺伝子改変を含む遺伝子改変酵母細胞であって、ＨＥＭ３遺伝子が配列番号７と少なくとも８０％の同一性を有し、改変酵母細胞のゲノムが、低酸素遺伝子のヘム依存性リプレッサ（ＲＯＸ１）をコードする遺伝子、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＭＸ１）をコードする遺伝子、液胞プロテアーゼの受容体（ＶＰＳ１０）をコードする遺伝子、及び液胞プロテイナーゼ（ＰＥＰ４）をコードする遺伝子から選択される１つ又は複数の遺伝子における１つ又は複数の遺伝子改変をさらに含み、１つ又は複数の遺伝子改変が、そのような遺伝子からのポリペプチドの発現が低減若しくは破壊されるか、又は発現されるポリペプチドが非機能的であるような遺伝子改変であることを特徴とする、遺伝子改変酵母細胞。
【請求項2】
改変酵母細胞の酵母ゲノムが、低酸素遺伝子のヘム依存性リプレッサ（ＲＯＸ１）をコードする遺伝子における１つ又は複数の遺伝子改変を含む、請求項１に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項3】
改変酵母細胞の酵母ゲノムが、液胞プロテアーゼの受容体（ＶＰＳ１０）をコードする遺伝子における１つ又は複数の遺伝子改変を含む、請求項１又は２に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項4】
改変酵母細胞の酵母ゲノムが、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＭＸ１）をコードする遺伝子における１つ又は複数の遺伝子改変を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項5】
改変酵母細胞の酵母ゲノムが、液胞プロテイナーゼＡ（ＰＥＰ４）をコードする遺伝子における１つ又は複数の遺伝子改変を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項6】
赤血球分子シャペロン（ＡＨＳＰ）をコードするヒト遺伝子を含み、該ＡＨＳＰ遺伝子が配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有し、該ＡＨＳＰ遺伝子が過剰発現される、請求項１から５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項7】
ヒトヘモグロビンをコードする遺伝子又は非ヒトヘモグロビンをコードする遺伝子を含み、該非ヒトヘモグロビンが補因子としてのヘム及びガス状リガンドに可逆的に結合するグロビン部分を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項8】
ヘモグロビン系酸素運搬体（ＨＢＯＣ）、ミオグロビン又はＰ４５０酵素をコードする遺伝子を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項9】
酵母細胞が、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）及びヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を含む群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母細胞。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒト及び非ヒトヘモグロビンの産生に使用され得る遺伝子改変酵母細胞に関する。
【背景技術】
【0002】
ヘモグロビン（Ｈｂ）は、血液循環中の赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）（赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）、ＲＢＣ）中の主要な血液タンパク質であり、その主な機能は酸素を肺から組織に運ぶことである。ＲＢＣは、総可溶性タンパク質含有量に対して９８％ものＨｂを含有する。ヘモグロビンは、四量体の補因子含有タンパク質であり、成人では、遺伝子ＨＢＡ及びＨＢＢによってそれぞれコードされる２つのα－及び２つのβ－グロビンサブユニット（α２β２）から構成される。各ヘモグロビンサブユニットは、ポルフィリン環の中心にある４つの窒素によって第一鉄原子が配位された１つの非共有結合ヘムｂ（プロトポルフィリンＩＸ）基を有する。鉄原子は酸素結合の活性部位であるが、タンパク質の有機成分は調節に寄与し、例えば酸素結合の可逆性を確実にする。
【0003】
輸血のための酸素運搬体の必要性が高まるにつれて、持続可能な供給源からのヒトヘモグロビン（Ｈｂ）の生産がますます求められている。微生物産生は、このタンパク質の安価で安全で信頼性の高い供給源を提供し得るので、魅力的な選択肢の１つである。しかしながら、補因子の喪失は通常、活性の喪失に関連するので、Ｈｂを含む補因子含有タンパク質の産生は困難である。ヘモグロビンの組換え産生に関する研究は、細菌界、酵母界、動物界、及び植物界のほとんどすべてをカバーする異なる産生宿主を使用することによって、過去４０年間進行中であった。
【0004】
Ｈｂフォールディングに重要なα－及びβ－グロビンの化学量論量を得るために、ヒトグロビン遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で単一オペロンで発現させた（Ｈｏｆｆｍａｎ ＳＪ，Ｌｏｏｋｅｒ ＤＬ，Ｒｏｅｈｒｉｃｈ ＪＭ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９０．８７（２１）：８５２１－８５２５．）。部位特異的突然変異誘発を使用して、細菌での発現時にＨｂの溶解度を改善した（Ｗｅｉｃｋｅｒｔ ＭＪ，Ｐａｇｒａｔｉｓ Ｍ，Ｇｌａｓｃｏｃｋ ＣＢ ｅｔ ａｌ．Ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎ ｈｅｍｅ ｅｘｃｅｓｓ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９．６５（２）：６４０－６４７．）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、赤血球系ヒトα－ヘモグロビン安定化タンパク質（ＡＨＳＰ）の同時発現が、Ｈｂ収量を増加させるのに成功したことが証明された（Ｖａｓｓｅｕｒ－Ｇｏｄｂｉｌｌｏｎ Ｃ，Ｈａｍｄａｎｅ Ｄ，Ｍａｒｄｅｎ ＭＣ ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ－ｙｉｅｌｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ－ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ ｉｔｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２００６．１９（３）：９１－９７．）。
【0005】
酵母は、数千年にわたり食品及び飲料に使用されてきており、一般に安全と見なされている。酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、学術的及び産業的な研究及び用途のための伝統的なモデル生物である。遺伝子操作、ゲノミクス、システム及び合成生物学の方法及びツールの進歩により、幅広い化学物質、燃料、香味料、工業用酵素及び医薬品にとって好ましい細胞工場の１つになった。ヘム含有タンパク質の製造は、血液及び肉代替物の開発に求められている。これらの市場の主な標的タンパク質はヘモグロビンであるため、生産はヘムの利用可能性に依存する。研究されたウシ及びヒトヘモグロビンの血液代替物については、食品用途は、植物起源のヘモグロビン、例えばマメ科植物のヘモグロビンに関心が寄せられている（Ｆｒａｓｅｒ ＲＺ，Ｓｈｉｔｕｔ Ｍ，Ａｇｒａｗａｌ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｙ Ｌｅｇｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｆｒｏｍ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｉｎｔｅｎｄｅｄ ｆｏｒ Ｕｓｅ ａｓ ａ Ｆｌａｖｏｒ Ｃａｔａｌｙｓｔ ｉｎ Ｐｌａｎｔ－Ｂａｓｅｄ Ｍｅａｔ．Ｉｎｔ Ｊ Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０１８；３７（３）：２４１－２６２；及びＦｒａｓｅｒ Ｒ，Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ Ｂｒｏｗｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｆｌａｖｏｒ ａｎｄ ａｒｏｍａ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｃｏｎｓｕｍａｂｌｅｓ．ＵＳ ２０１５／０３５１４３５ Ａ１．Ｄｅｃ．１０．２０１５．Ｉｍｐｏｓｓｉｂｌｅ Ｆｏｏｄｓ Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，ＣＡ（ＵＳ）．）。
【0006】
出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、サイトゾル区画及びミトコンドリア区画を含む複雑な経路において内因的にヘムを産生し、このプロセスは、炭素源、酸素及びヘムの利用可能性によって厳密に調節される（Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｈａｃｈ Ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｈｅｍｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｙｅａｓｔ：ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｈａｐ１ ｓｅｒｖｅｓ ａｓ ｔｈｅ ｋｅｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．１９９９．５６（５－６）：４１５－４２６；及びＨｏｆｆｍａｎ Ｍ，Ｇｏｒａ Ｍ，Ｒｙｔｋａ Ｊ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔｅ－ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｓｔｅｐｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｈｅｍｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００３．３１０（４）：１２４７－１２５３．）。ヘム生合成は、２つの前駆体、スクシニル－ＣｏＡ及びグリシンの縮合によってミトコンドリア内で開始する。次いで、この反応の生成物である５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）がサイトゾルに輸送され、そこで次の一連の酵素反応によってコプロポルフィリノーゲンＩＩＩに変換される。ミトコンドリアにおけるさらなる酸化的脱炭酸及び酸化工程により、プロトポルフィリンＩＸが得られる。ミトコンドリアのフェロケラターゼによる鉄の挿入は、プロセスを完了させる。
【0007】
酵母における組換えヘモグロビンの発現は、内因性ヘム生合成の増強、α－及びβ－グロビン遺伝子発現のバランス、並びに細胞酸素検知の操作に基づく戦略によって有意に改善されている（Ｌｉｕ Ｌ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．Ｂａｌａｎｃｅｄ ｇｌｏｂｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｈｅｍｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ．２０１４．２１：９－１６；及びＭａｒｔｉｎｅｚ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｌ，Ｐｅｔｒａｎｏｖｉｃ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１５．１１２（１）：１８１－１８８．）。ヘム生合成能力は、経路の律速酵素の過剰発現によって増加した（Ｈｏｆｆｍａｎ Ｍ，Ｇｏｒａ Ｍ，Ｒｙｔｋａ Ｊ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔｅ－ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｓｔｅｐｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｈｅｍｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００３．３１０（４）：１２４７－１２５３；及びＬｉｕ Ｌ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．Ｂａｌａｎｃｅｄ ｇｌｏｂｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｈｅｍｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ．２０１４．２１：９－１６．）。一例として、マルチコピープラスミド上でのＨＥＭ３遺伝子（ポルフォビリノーゲン脱アミナーゼをコードする）の過剰発現は、細胞内遊離ヘムの最大４倍の増加をもたらす（Ｌｉｕ Ｌ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．Ｂａｌａｎｃｅｄ ｇｌｏｂｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｈｅｍｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ．２０１４．２１：９－１６．）。環境酸素のレベルがヘムの細胞内レベルを調節するので、細胞呼吸の調節に関与する転写因子をコードするＨＡＰ１遺伝子の欠失による酸素検知の操作は、全細胞可溶性タンパク質含有量の最大７％まで、ヘモグロビン産生をさらに改善することに成功した（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｌ，Ｐｅｔｒａｎｏｖｉｃ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１５．１１２（１）：１８１－１８８．）。
【0008】
したがって、最新技術を考慮すると、例えばグルコースを含む安価な基質からの収量がより高い、改良されたヘモグロビン製造方法が必要とされている。
【発明の概要】
【0009】
本開示の目的は、遺伝子改変酵母細胞を提供することである。ヒトヘモグロビン及び非ヒトヘモグロビンの産生に適している遺伝子改変酵母細胞。改変酵母細胞は、最先端の方法と比較して改善されたヘモグロビン収量を提供する。
【0010】
本発明は、添付の独立請求項によって定義される。非限定的な実施形態は、従属請求項、添付の図面、及び以下の説明から明らかになる。
【0011】
第１の態様によれば、ポルフォビリノーゲン脱アミナーゼ（ＨＥＭ３）をコードする酵母遺伝子の過剰発現を含む遺伝子改変を含み、ＨＥＭ３遺伝子が配列番号７と少なくとも８０％の同一性を有する、遺伝子改変酵母細胞が提供される。改変酵母細胞のゲノムは、低酸素遺伝子のヘム依存性リプレッサ（ＲＯＸ１）をコードする遺伝子、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＭＸ１）をコードする遺伝子、液胞プロテアーゼの受容体（ＶＰＳ１０）をコードする遺伝子、及び液胞プロテイナーゼ（ＰＥＰ４）をコードする遺伝子から選択される１つ又は複数の遺伝子における１つ又は複数の遺伝子改変をさらに含み、１つ又は複数の遺伝子改変は、そのような遺伝子からのポリペプチドの発現が低減若しくは破壊されるか、又はポリペプチドが非機能的に発現されるような遺伝子改変である。
【0012】
酵母細胞は、１つ又は複数の遺伝子、例えばＲＯＸ１及び／又はＨＭＸ１遺伝子に１つ又は複数の遺伝子改変を含み、１つ又は複数の遺伝子改変は、そのような遺伝子からのポリペプチドの発現が低減又は破壊されるか、又は発現されるポリペプチドが非機能的であるような遺伝子改変である。これは、遺伝子のコード領域全体の排除（欠失）によって達成され得るか、又は遺伝子が部分的若しくは完全に機能的なポリペプチドをもはや産生しないように、例えばタンパク質の活性が低減若しくは排除されるように、遺伝子又はそのプロモーター及び／若しくはターミネーター領域が改変される（欠失、挿入、又は突然変異などによる）。改変は、遺伝子操作方法、強制進化若しくは突然変異誘発、及び／又は選択若しくはスクリーニングによって達成することができる。
【0013】
酵母細胞は、ポルフォビリノーゲン脱アミナーゼ（ＨＥＭ３）をコードする酵母遺伝子の過剰発現を含む遺伝子改変を含み、ＨＥＭ３遺伝子は、配列番号７と少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は１００％の同一性を有する。ＨＥＭ３である遺伝子は、酵母プラスミド（ｐＩＹＣ０４など）上に位置し得る。
【0014】
過剰発現の方法は、以下のいずれか：ポルフォビリノーゲン脱アミナーゼ（ＨＥＭ３）をコードする遺伝子の１、２、３、４又はそれよりも多くのコピーを酵母ゲノムに導入することによって、又はプラスミドの多重コピーによって；又は、強力な構成的プロモーター（遺伝子ＴＥＦ１又はＰＧＫ１のプロモーターなど）によってＨＥＭ３遺伝子の天然プロモーターを置換することによって；又はＨＥＭ３遺伝子の転写を増加させるようにＨＥＭ３遺伝子の天然プロモーターを改変することによって、又はＨＥＭ３遺伝子転写物の半減期を増加させるようにＨＥＭ３遺伝子の天然ターミネーターを改変することによって；又はＨｅｍ３ポリペプチドのレベルを増加させるようにＨＥＭ３遺伝子翻訳の調節に関与するタンパク質（リプレッサ又はアクチベータのいずれか）を改変することによって、達成することができる。Ｈｅｍ３ポリペプチドは、配列番号８と少なくとも９５％同一であり得るか、又は酵母においてＨｅｍ３活性を有し得る。
【0015】
この遺伝子改変酵母細胞は、例えば、そのようなヘモグロビンをコードする遺伝子が改変酵母細胞のゲノムに導入されており、おそらくまた、そのようなヘモグロビン遺伝子を過剰発現している場合、ヒトヘモグロビン又は非ヒトヘモグロビンの産生に適している。改変酵母細胞は、最先端の方法と比較して改善されたヘモグロビン収量を提供する。
【0016】
改変酵母細胞の酵母ゲノムは、低酸素遺伝子のヘム依存性リプレッサ（ＲＯＸ１）をコードする遺伝子における１つ又は複数の遺伝子改変を含んでもよい。
【0017】
ＲＯＸ１遺伝子は、配列番号１の位置６７９６４３～６８０８６２の酵母ゲノムの染色体ＸＶＩ上に位置する。ＲＯＸ１をコードする遺伝子における１つ又は複数の遺伝子改変によって、ヘム依存性リプレッサＲｏｘ１によるＨＥＭ１３遺伝子（コプロポルフィリノーゲンＩＩＩオキシダーゼをコードする）の阻害を排除することができる。
【0018】
遺伝子改変は、ＲＯＸ１遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の欠失を含んでもよい。代替的な突然変異として、ＲＯＸ１ ＯＲＦの部分的欠失を行うことができ、これは、Ｒｏｘ１活性を有しない切断型Ｒｏｘ１ポリペプチドの産生をもたらし得るか、又はＲｏｘ１ポリペプチドの翻訳を終結させ得る。非機能的なＲｏｘ１をもたらす任意の遺伝子改変、例えば、ＲＯＸ１オープンリーディングフレームを破壊する部分的な遺伝子欠失又は挿入が可能である。
【0019】
改変酵母細胞の酵母ゲノムは、液胞プロテアーゼの受容体（ＶＰＳ１０）をコードする遺伝子における１つ又は複数の遺伝子改変を含んでもよい。
【0020】
ＶＰＳ１０遺伝子は、配列番号２の位置１９１５３３～１８６８６４の酵母ゲノムの染色体ＩＩ上に位置する。ＶＰＳ１０遺伝子の１つ又は複数の遺伝子改変によって、ヘモグロビン産生のために遺伝子改変酵母細胞を使用する場合、ポルフィリン及びヘモグロビン産生が改善され得、ヘモグロビンの分解産物（ビリルビン）の形成も減少し得る。タンパク質分解のためのヘモグロビンの液胞へのターゲティングは、ＶＰＳ１０遺伝子（液胞加水分解酵素の選別受容体）を遺伝子改変することによって抑制され得る。
【0021】
改変は、ＶＰＳ１０ ＯＲＦの欠失を含み得る。代替的な突然変異は、Ｖｐｓ１０ポリペプチドの翻訳をもたらさない改変を含んでもよい。代替的な突然変異として、ＶＰＳ１０ ＯＲＦの部分的欠失が行われ得、これにより、Ｖｐｓ１０活性を有しない切断型Ｖｐｓ１０ポリペプチドの産生がもたらされる。ＶＰＳ１０オープンリーディングフレームの破壊を引き起こす、又はＶｐｓ１０ポリペプチドが産生されないか、若しくは不活性Ｖｐｓ１０ポリペプチドを引き起こす、任意の種類の突然変異：挿入、欠失、ヌクレオチド置換が可能である。
【0022】
改変酵母細胞の酵母ゲノムは、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＭＸ１）をコードする遺伝子における１つ又は複数の遺伝子改変を含んでもよい。
【0023】
ＨＭＸ１遺伝子は、配列番号３の位置５５３７２５～５５２６３１のゲノムの染色体ＸＩＩ上に位置する。
【0024】
ＨＭＸ１遺伝子の１つ又は複数の遺伝子改変によって、ヘモグロビン産生のために遺伝子改変酵母細胞を使用する場合、ポルフィリン及びヘモグロビン産生が改善され得、ヘモグロビンの分解産物（ビリルビン）の形成も減少し得る。ＨＭＸ１遺伝子は、特定のヘム切断を担うヘムオキシゲナーゼをコードする。
【0025】
改変は、ＨＭＸ１ ＯＲＦの欠失を含み得る。代替的な突然変異は、ＨＭＸ１ ＯＲＦの部分的欠失を含んでもよく、これは、Ｈｍｘ１活性を有しない切断型Ｈｍｘ１ポリペプチドの産生をもたらす。代替的な突然変異は、ＨＭＸ１オープンリーディングフレームの破壊を引き起こし、Ｈｍｘ１ポリペプチドが産生されないか、又は不活性Ｈｍｘ１ポリペプチドの産生をもたらす、任意の種類の突然変異：挿入、欠失、ヌクレオチド置換であり得る。
【0026】
改変酵母細胞は、液胞プロテイナーゼＡ（ＰＥＰ４）をコードする遺伝子における１つ又は複数の遺伝子改変を含んでもよい。
【0027】
ＰＥＰ４遺伝子は、配列番号４の２６０８８３～２５９７０３のゲノムの染色体ＸＶＩ上に位置する。
【0028】
ＰＥＰ４遺伝子の１つ又は複数の遺伝子改変によって、ヘモグロビン産生のために遺伝子改変酵母細胞を使用する場合、ポルフィリン及びヘモグロビン産生が改善され得る。タンパク質分解のためのヘモグロビンの液胞へのターゲティングは、ＰＥＰ４（液胞プロテイナーゼＡ）遺伝子を欠失させることによって抑制され得る。
【0029】
改変は、ＰＥＰ４ ＯＲＦの欠失を含み得る。代替的な突然変異は、ＰＥＰ４ ＯＲＦの部分的欠失を含んでもよく、これは、Ｐｅｐ４活性を有しない切断型Ｐｅｐ４ポリペプチドの産生をもたらし得る。代替的な突然変異は、ＰＥＰ４オープンリーディングフレームの破壊を引き起こし、Ｐｅｐ４ポリペプチドが産生されないか、又は不活性Ｐｅｐ４ポリペプチドの産生をもたらす、任意の種類の突然変異：挿入、欠失、ヌクレオチド置換であり得る。
【0030】
ＲＯＸ１遺伝子、ＨＭＸ１遺伝子、ＶＰＳ１０遺伝子及びＰＥＰ４遺伝子から選択される遺伝子改変のいくつか又はすべてを含む遺伝子改変酵母細胞は、ヘモグロビン産生のために使用される場合、これらの遺伝子改変がより少ない遺伝子改変酵母細胞と比較して、改善されたヘモグロビン収量を示す。ＲＯＸ１遺伝子、ＨＭＸ１遺伝子、ＶＰＳ１０遺伝子及びＰＥＰ４遺伝子から選択される遺伝子改変の少なくとも１つを含む遺伝子改変酵母細胞は、ヘモグロビン産生に使用された場合、これらの遺伝子改変を含まない酵母細胞と比較して、改善されたヘモグロビン収量を示す。
【0031】
遺伝子改変酵母細胞は、赤血球分子シャペロン（ＡＨＳＰ）をコードするヒト遺伝子を含んでもよく、ＡＨＳＰ遺伝子は、配列番号５と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも１００％の同一性を有し、ＡＨＳＰ遺伝子は、過剰発現される。産生されたＡＨＳＰは、配列番号６と少なくとも９５％同一であるか、又は、産生されたポリペプチドは、酵母においてＡＨＳＰ活性を有する。
【0032】
ＡＨＳＰ遺伝子は、酵母プラスミド（ｐＩＹＣ０４など）上に位置し得る。
【0033】
α－ヘモグロビン安定化タンパク質（ＡＨＳＰ）の過剰発現は、改変細胞がヘモグロビン産生のために使用される場合、そのようなＡＳＨＰ過剰発現のない遺伝子改変酵母細胞株Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４（すなわち、ＲＯＸ１遺伝子、ＨＭＸ１遺伝子、ＶＰＳ１０遺伝子及びＰＥＰ４遺伝子における遺伝子改変を含む）と比較して、ヘモグロビン産生の５８％もの増加をもたらし得る。
【0034】
過剰発現の方法は、以下のいずれか：赤血球分子シャペロン（ＡＨＳＰ）をコードする遺伝子の１、２、３、４又はそれよりも多くのコピーを酵母ゲノムに導入することによって、又はプラスミドの多重コピーによって；又は、強力な構成的プロモーター（遺伝子ＴＥＦ１又はＰＧＫ１のプロモーターなど）によってＡＨＳＰ遺伝子の天然プロモーターを置換することによって；又はＡＨＳＰ遺伝子の転写を増加させるようにＡＨＳＰ遺伝子の天然プロモーターを改変することによって、又はＡＨＳＰ遺伝子転写物の半減期を増加させるようにＡＨＳＰ遺伝子の天然ターミネーターを改変することによって；又はＡＨＳＰポリペプチドのレベルを増加させるようにＡＨＳＰ遺伝子翻訳の調節に関与するタンパク質（リプレッサ又はアクチベータのいずれか）を改変することによって、達成することができる。
【0035】
１つの実験では、ＲＯＸ１遺伝子、ＨＭＸ１遺伝子、ＶＰＳ１０遺伝子及びＰＥＰ４遺伝子のすべてにおける改変、並びにＡＨＳＰの過剰発現を含み、ヘモグロビン産生のために使用される上記のような遺伝子改変酵母細胞は、ヒトヘモグロビンを発現するが記載された改変（ＲＯＸ１、ＨＭＸ１、ＶＰＳ１０、ＰＥＰ４の欠失及びＡＨＳＰの過剰発現）を有さない酵母細胞（ＷＴ／Ｈ３／ααβ株など）と比較して、ヒトヘモグロビンを含む総ポルフィリンの産生が１．９倍多いことを示した。
【0036】
上記の遺伝子改変酵母細胞は、ヒトヘモグロビンをコードする遺伝子又は非ヒトヘモグロビンをコードする遺伝子を含み、非ヒトヘモグロビンが補因子としてのヘム及びガス状リガンドに可逆的に結合するグロビン部分を含んでもよい。
【0037】
ヒトヘモグロビンサブユニットα、ＨＢＡ、配列番号９及びヘモグロビンサブユニットβ、ＨＢＢ、配列番号１０をコードする遺伝子、又は非ヒトヘモグロビンをコードする遺伝子は、酵母プラスミド（ｐＳＰ－ＧＭ１など）上に位置し得る。ヘモグロビン遺伝子は過剰発現され得る。
【0038】
過剰発現の方法は、ヘモグロビンをコードする遺伝子の１、２、３、４又はそれよりも多くのコピーを酵母ゲノムに導入することによって、又はプラスミドの多重コピーによって；又は、強力な構成的プロモーター（遺伝子ＴＥＦ１又はＰＧＫ１のプロモーターなど）により ヘモグロビン遺伝子の天然プロモーターを置換することによって；又はヘモグロビン遺伝子の転写を増加させるようにヘモグロビン遺伝子の天然プロモーターを改変することによって、又はヘモグロビン遺伝子転写物の半減期を増加させるようにヘモグロビン遺伝子の天然ターミネーターを改変することによって；又はヘモグロビンのレベルを増加させるようにヘモグロビン遺伝子翻訳の調節に関与するタンパク質（リプレッサ又はアクチベータのいずれか）を改変することによって、達成することができる。
【0039】
一例では、ヒトＨＢＡ遺伝子の１つのコピーを強力なプロモーターＰＧＫ１の下にクローニングし、ヒトＨＢＡ遺伝子の第２のコピーを強力なプロモーターＴＥＦ１の下にクローニングし、ヒトＨＢＢ遺伝子を強力なプロモーターＰＧＫ１の下にクローニングすることができる。
【0040】
補因子としてのヘム及びガス状リガンドに可逆的に結合するグロビン部分を含有する非ヒトヘモグロビンは、例えば、ウシヘモグロビン又は他の脊椎動物由来のヘモグロビン、植物ヘモグロビン（例えば、ダイズ、エンドウ豆、イネ又はオオムギなど由来）であり得る。ここで、ガス状リガンドとは、酸素、二酸化炭素、一酸化炭素、及び一酸化窒素を意味する。非ヒトヘムタンパク質は、補因子としてのヘムを有するなど、ヒトヘモグロビンと同様の特性を有するため、活性のためにヘムを必要とし、したがって上述の改変酵母細胞において産生することが可能である。植物ヘモグロビン（例えばダイズ、エンドウ豆、イネ又はオオムギ由来の非共生植物ヘモグロビン）は、本明細書に記載の酵母株で発現させることができる。
【0041】
ヒトヘモグロビン遺伝子の過剰発現、ＨＥＭ３遺伝子の過剰発現、ＡＨＳＰ遺伝子の過剰発現、ＲＯＸ１遺伝子の欠失、ＨＭＸ１遺伝子の欠失、ＶＰＳ１０遺伝子の欠失、及びＰＥＰ４遺伝子の欠失を含む遺伝子改変を含む遺伝子改変酵母細胞は、グルコース発酵中に産生される全酵母タンパク質に対する細胞内ヒトヘモグロビンの収量が１８％もの高さであることを示す。これは、これまでに知られているように、グルコースを基質として使用する酵母において報告されたヒトヘモグロビンの最高の産生である。このヘモグロビン産生は、酸素消費速度の増加及びより高いグリセロール収量を伴い、これは、高タンパク質産生条件下又は酸素制限下でＮＡＤＨレベルをバランスさせる酵母細胞の応答であると仮定される。
【0042】
そのような遺伝子改変酵母細胞は、配列番号１１と少なくとも９５％同一であるヘモグロビンα活性を有するポリペプチド、及び配列番号１２と少なくとも９５％同一であるヘモグロビンβ活性を有するポリペプチドを提供するために使用され得る。
【0043】
代替の一実施形態では、遺伝子改変酵母細胞は、ヘモグロビン系酸素運搬体（ＨＢＯＣ）、ミオグロビン又はＰ４５０酵素をコードする遺伝子を含んでもよい。
【0044】
ミオグロビンは、ＭＢ遺伝子によってコードされるヘム含有タンパク質である。ヒトＰ４５０ ２Ｓ１は、ＣＹＰ２Ｓ１遺伝子によってコードされるヘム含有タンパク質である。ＨＢＯＣ、ミオグロビン又はＰ４５０酵素をコードする遺伝子は、酵母プラスミド（ｐＥＳＣ－ＵＲＡ又はｐＳＰ－ＧＭ１など）上に位置し得る。
【0045】
第２の態様によれば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）及びヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を含む群から選択される、上記の遺伝子改変酵母細胞が提供される。
【0046】
好ましい実施形態では、酵母細胞はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【0047】
そのような改変されたサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母細胞は、上述の遺伝子改変、すなわち遺伝子ＲＯＸ１、ＶＰＳ１０、ＨＭＸ１、及びＰＥＰ４の欠失、並びにＨＥＭ３遺伝子、ＡＨＳＰ遺伝子、及びヒトヘモグロビン遺伝子の過剰発現（２コピーのＨＢＡ（ヘモグロビンサブユニットアルファ、αをコードする）、１コピーのＨＢＢ（ヘモグロビンサブユニットベータ、βをコードする））を有するΔｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ＡＨＳＰ／ααβであってもよく、細胞内ヒトヘモグロビン産生に使用され得る。
【0048】
第３の態様によれば、上記の遺伝子改変酵母細胞を用いて産生された産物が提供される。
【0049】
そのような産物は、ヒトヘモグロビン遺伝子をそのゲノムに有する上記の改変酵母細胞によって産生されたヒト又は非ヒトヘモグロビンであってもよく、ヘモグロビンは培地に分泌される。あるいは、産物は、そのゲノム中にそのようなタンパク質をコードする遺伝子を有する上記の改変酵母細胞によって産生されるヘモグロビン系酸素運搬体（ＨＢＯＣ）、ミオグロビン又はＰ４５０酵素であり得る。産物は、例えば、血液代替物又は食品添加物若しくは代替物であり得る。
【0050】
本発明は、添付の図面に示される実施形態を参照して、以下でより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【0051】
【図1】ヘム及びヘモグロビンの分解が低減された酵母株（すなわち、本開示による遺伝子改変酵母細胞）の構築の概略図を示す。
【0052】
【図2】構築された酵母株の全ポルフィリンを示す。 株：１－ＷＴ／空ベクター、対照；２－ＷＴ／ＨＥＭ３／ααβ；３－Δｒｏｘ１／ＨＥＭ３／ααβ，４－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０／ＨＥＭ３／ααβ，５－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１／ＨＥＭ３／ααβ，６－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３／ααβ，７－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ＡＨＳＰ／ααβ。
【0053】
【図3】ウェスタンブロッティングによって研究された構築株におけるヘモグロビン発現を示す。Ａ）ヒトヘモグロビンＨｂＡを発現する酵母株のＴＣＡタンパク質抽出物のタンパク質ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル。Ｂ）抗アルファヘモグロビン抗体を使用したウェスタンブロッティング。株：１－ＷＴ／空ベクター、対照；２－ＷＴ／ＨＥＭ３／ααβ；３－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３／ααβ，４－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ＡＨＳＰ／ααβ。
【0054】
【図4】発酵の６時間での構築された株によるＲＯＳ産生を示す。株：１－ＷＴ／空ベクター、対照；２－ＷＴ／ＨＥＭ３／ααβ；３－Δｒｏｘ１／ＨＥＭ３／ααβ，４－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０／ＨＥＭ３／ααβ，５－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１／ＨＥＭ３／ααβ，６－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３／ααβ，７－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ＡＨＳＰ／ααβ。
【0055】
【図5】発酵の２４時間での構築された株によるＲＯＳ蓄積を示す。グルコース発酵の２４時間で試料を収集し、ジヒドロローダミン１２３染色によってＲＯＳを検出した。各株の５０００個の細胞をフローサイトメトリーによって分析した。株：１－ＷＴ／空ベクター、対照；２－ＷＴ／ＨＥＭ３／ααβ；３－Δｒｏｘ１／ＨＥＭ３／ααβ，４－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０／ＨＥＭ３／ααβ，５－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１／ＨＥＭ３／ααβ，６－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３／ααβ，７－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ＡＨＳＰ／ααβ。
【0056】
【図6】構築された株の増殖速度を示す。株：１－ＷＴ／空ベクター、対照；２－ＷＴ／ＨＥＭ３／ααβ；３－Δｒｏｘ１／ＨＥＭ３／ααβ，４－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０／ＨＥＭ３／ααβ，５－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１／ＨＥＭ３／ααβ，６－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３／ααβ，７－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ＡＨＳＰ／ααβ。
【0057】
【図7】抗ヘモグロビンα抗体を使用したＴＣＡタンパク質抽出物のウェスタンブロッティングを示す。株：１－ＷＴ／空ベクター、対照；２－ＷＴ／ＨＥＭ３／ααβ；３－Δｒｏｘ１／ＨＥＭ３／ααβ，４－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１／ＨＥＭ３／ααβ，５－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３／ααβ，６－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ＡＨＳＰ／ααβ。
【0058】
【図8】酵母で発現されたヘモグロビンが一酸化炭素に結合することを示す。ＣＯ放出化合物ＣＯＲＭ－３で処理した酵母粗抽出物の上清の吸収スペクトル。株：１－ＷＴ／ ＨＥＭ３／ααβ；２－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ＡＨＳＰ／ααβ。
【0059】
【図9】酵母で発現されたビリルビンバイオセンサを示す。 Ａ）ヘム／ヘモグロビン分解産物ビリルビンの蓄積を研究するために、プロモーターＰＧＫ１下の酵母でｍＣｈｅｒｒｙ－ＵｎａＧ構築物を発現させた。 Ｂ）ＨｂＡを発現する異なる株におけるｍＣｈｅｒｒｙ－ＵｎａＧ緑色蛍光収量：Ｂ１）及びＢ２）野生型（ＷＴ）；Ｂ３）Δｒｏｘ１；Ｂ４）Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０；Ｂ５）Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１；Ｂ６）Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｐｅｐ４。２つの生物学的レプリケートを分析に使用した。
【0060】
【0061】
【図11】ＡＨＳＰ株の細胞サイズが増加したことを示す。ＣＡＳＹモデルＴＴ細胞株によって推定された細胞体積：１－ＷＴ／ＨＥＭ３／ααβ；２－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ＡＨＳＰ／ααβ。
【0062】
【図12】ヘモグロビン産生株の細胞サイズを示す。グルコース発酵の異なる時点でＣＡＳＹ Ｍｏｄｅｌ ＴＴ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒによって推定された異なる酵母株の細胞体積。
【0063】
【0064】
【図14】培地中の鉄補足の増加がヘモグロビン産生を改善し、ヘモグロビン分解を減少させることを示す。 Ａ１、Ａ２）１００及び２００μＭのＦｅ３＋を含むＳＤ培地におけるポルフィリン合成。 Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４）抗Ｈｂアルファ及び抗Ｇａｐｄｈ抗体を使用したＷＴ株及びＡＨＳＰ株のＴＣＡ抽出物のタンパク質ＳＤＳゲル及びウェスタンブロッティング。 Ｃ１、Ｃ２）ビリルビンバイオセンサの蛍光は、Ｆｅ３＋の量がより多い培地ではより低い
【0065】
【図15】１５Ａ：ＷＴ／ＨＥＭ３／ααβ及び１５Ｂ：Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ＡＨＳＰ／ααβ株の増殖、グルコース消費、及び代謝産物収量を示す。
【0066】
【図16】ヘモグロビンの発現及びヘモグロビン株の総タンパク質含有量を示す。 Ａ１、Ａ２）抗ヘモグロビンα抗体を用いたウェスタンブロッティングによるヘモグロビン産生の推定。 Ｂ）２４時間及び４８時間でのバイオリアクタ培養中の細胞の相対タンパク質含有量。
【0067】
【図17】バイオリアクタにおける発酵中の２７時間及び４８時間での異なる株におけるヘモグロビン産生を示す。 Ａ）抗ヘモグロビンα抗体を用いたウェスタンブロッティング。株：１，２－ＷＴ／ＨＥＭ３／ααβ；３，４－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ＡＨＳＰ／ααβ；５，６－Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３／ααβ。 Ｂ）総タンパク質含有量に対するＨｂ含有量。
【0068】
【図18】ウェスタンブロッティングによって決定されたＷＴ株及びΔｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４株における異なるヘムタンパク質の発現を示す。両方の株において、ヘムタンパク質遺伝子を出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＨＥＭ３遺伝子と共発現させた。Ａ）ＭＹＧ－ＢＯＶ：ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）のＭＢ（ミオグロビン）遺伝子によってコードされるウシミオグロビンの発現；Ｂ）ＨＢＬ－ＨＯＲ：オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）のＧＬＢ１遺伝子によってコードされる非共生ヘモグロビンの発現；Ｃ）ＣＹＰ２Ｓ１－Ｈｓ：ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）のＣＹＰ２Ｓ１によってコードされるシトクロムＰ４５０ ２Ｓ１の発現。Ｇａｐｄｈ（グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ）シグナルを使用してデータを正規化した。
【0069】
【図19】３つの異なる酵母株における分泌経路を介したヘモグロビン融合の発現を示す。 Ａ）ヘモグロビンは、ＣＥＮＰＫ１１３－１１ｃ ｒｏｘ１ ｖｐｓ１０ ｈｍｘ１ ｐｅｐ４、１８４Ｍ、及びＩＮＶＳｃ１株において、融合ペプチドとして発現した（出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の天然のα－因子リーダー配列とのαγ－グロビン融合物により、分泌経路に誘導される）。 Ｂ）γグロビン鎖に対するポリクローナル抗体を使用したＳＤＳタンパク質ゲル及びウェスタンブロッティングの結果。
【発明を実施するための形態】
【0070】
以下に記載されるさらなる発展を伴う本発明の実施形態は、例としてのみ見なされるべきであり、特許請求の範囲によって提供される保護の範囲を限定することを決して意図するものではない。（なお、本明細書において「本研究」とは、本特許出願に開示された研究をいう。）
【実施例】
【0071】
実験
【0072】
転写リプレッサＲＯＸ１の欠失は、細胞内ヘモグロビンレベルを増加させる
【0073】
低酸素遺伝子のアクチベータである転写因子Ｒｏｘ１は、ヘム生合成経路のリプレッサでもある。Ｒｏｘ１は、ＨＥＭ１３遺伝子の転写を阻害する。以前の研究は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＲＯＸ１遺伝子の欠失又はその発現の変化が、α－アミラーゼ及びインスリン前駆体などの異種タンパク質の産生の改善をもたらすことを見出した（Ｌｉｕ Ｌ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｌｉｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｔ ａｅｒｏｂｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．２０１５．１５（７）．ｐｉｉ：ｆｏｖ０７０；及びＨｕａｎｇ Ｍ，Ｂａｏ Ｊ，Ｈａｌｌｓｔｒｏｍ ＢＭ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｙｅａｓｔ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｇｌｏｂａｌ ｔｕｎｉｎｇ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７．８（１）：１１３１．）。ＲＯＸ１遺伝子の欠失はまた、ヘムの細胞内レベルの増加をもたらした（Ｚｈａｎｇ Ｔ，Ｂｕ Ｐ，Ｚｅｎｇ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｈｅｍｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ａ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｗｉｔｃｈ ｆｒｏｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｏ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｅｖｅｎ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１７．２９２（４１）：１６９４２－１６９５４．）。ヘモグロビンサブユニットα（２コピーのＨＢＡ、α）及びサブユニットβ（１コピーのＨＢＢ、β）をコードするＨＥＭ３遺伝子ヒト遺伝子を保有する組換えヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）発現のためのプラスミド（ｐＩＹＣ０４＋ＨＥＭ３及びｐＳＰ－ＧＭ１＋ααβ、図１及び下記の表１を参照）で形質転換した場合、Δｒｏｘ１株は、ヘム前駆体５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）を含む培地上のヘモグロビン発現プラスミドを保有するＷＴ（野生型）と比較して、より高いポルフィリン蓄積の結果であるより暗い赤色の色素沈着を示した。Δｒｏｘ１株は、ヘモグロビン発現プラスミドを担持するＷＴと比較して、１．２倍多い量の総ポルフィリンを蓄積することが分かった（図２）。ポルフィリン産生におけるその優れた特徴のために、Δｒｏｘ１株をさらなる操作戦略のためのバックグラウンド株として選択した。この試験で使用した酵母株は、以下の表２を参照されたい。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【0074】
ヘム及びヘモグロビンの分解に関与する遺伝子の欠失は、単独で、及びＡＨＳＰの過剰発現と組み合わせて、Ｈｂレベルの増加をもたらす。
【0075】
ヘモグロビンの産生を改善するために、本発明者らは、ヘモグロビンとヘムの両方の細胞内分解を減少させる戦略に従った（図１）。本発明者らは、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてＶＰＳ１０（複数の液胞加水分解酵素に対するＩ型膜貫通選別受容体をコードする）、ＰＥＰ４（液胞アスパルチルプロテアーゼ［プロテイナーゼＡ］をコードする）及びＨＭＸ１（ＥＲ局在化ヘムオキシゲナーゼをコードする）遺伝子を欠失させ、ＡＨＳＰ遺伝子によってコードされるヒトα－ヘモグロビン安定化タンパク質を過剰発現させた（図１）。３つの欠失をＣｒｅ－ｌｏｘシステム及び選択マーカーとしてのｋａｎＭＸ（Δｖｐｓ１０、Δｈｍｘ１、及びΔｐｅｐ４）によってΔｒｏｘ１株バックグラウンドに導入した。各欠失の後、（本明細書の「材料及び方法」の章に記載されるように）Ｃｒｅリコンビナーゼ発現の誘導によってｋａｎＭＸマーカーを除去した。ＶＰＳ１０及びＰＥＰ４遺伝子は、液胞へのミスフォールドタンパク質のターゲティング及びそれらの液胞分解に影響を及ぼすことが知られているが、ＨＭＸ１遺伝子はヘム分解経路の一部である（Ｈｏｎｇ Ｅ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ ＡＲ，Ｋａｉｓｅｒ ＣＡ．Ａ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｏｌｕｂｌｅ ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｖａｃｕｏｌｅ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９６．１３５（３）：６２３－６３３；Ｐｒｏｔｃｈｅｎｋｏ Ｏ，Ｐｈｉｌｐｏｔｔ ＣＣ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｅｍｅ ｌｅｖｅｌｓ ｂｙ ＨＭＸ１，ａ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｏｆ ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３．２７８（３８）：３６５８２－７；及びＭａｒｑｕｅｓ Ｍ，Ｍｏｊｚｉｔａ Ｄ，Ａｍｏｒｉｍ ＭＡ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｐｅｐ４ｐ ｖａｃｕｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｏｆ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｕｔ ＰＥＰ４ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｎｏｔ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｉｆｅｓｐａｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００６．１５２（Ｐｔ １２）：３５９５－３６０５．）。Ｐｅｐ４ｐ液胞プロテイナーゼは、酸化されたタンパク質のターンオーバーに寄与する。
【0076】
ＡＨＳＰ遺伝子をクローニングし、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主における発現のためにそのコドンが最適化された合成ペプチドとしてｐＩＹＣ０４＋ＨＥＭ３プラスミド（表１）上に発現させた。すべての欠失株を成体ヘモグロビン（ＨｂＡ）発現プラスミド（ｐＩＹＣ０４＋ＨＥＭ３及びｐＳＰ－ＧＭ１＋ααβ又はｐＩＹＣ０４＋ＨＥＭ３＋ＡＨＳＰ及びｐＳＰ－ＧＭ１＋ααβ[表１]）で形質転換した。
【0077】
ポルフィリン及びヘモグロビンの両方の産生は段階的に増加し、ＡＨＳＰ過剰発現株において最高レベルに達した（図２）。赤血球及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、ＡＨＳＰは、遊離α－グロビンサブユニットと安定な複合体を形成することにより、α－グロビンの分解を防ぐ（Ｋｉｈｍ ＡＪ，Ｋｏｎｇ Ｙ，Ｈｏｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．Ａｎ ａｂｕｎｄａｎｔ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ ｆｒｅｅ ａｌｐｈａ－ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ．２００２．４１７（６８９０）：７５８－７６３；Ｖａｓｓｅｕｒ－Ｇｏｄｂｉｌｌｏｎ Ｃ，Ｈａｍｄａｎｅ Ｄ，Ｍａｒｄｅｎ ＭＣ ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ－ｙｉｅｌｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ－ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ ｉｔｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２００６．１９（３）：９１－９７．）。本発明者らの酵母モデルでは、ＡＨＳＰ遺伝子の過剰発現はヘモグロビン産生を５８％増加させた（図３）。Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ＡＨＳＰ／ααβ株における２４時間での総ポルフィリンレベルは、ＷＴ／ＨＥＭ３／ααβ株と比較して２．６倍高かった（図２）。Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ＡＨＳＰ／ααβ株は、グルコース発酵の初期段階でＲＯＳレベルのわずかな低下を示したが、６時間では（図４）、抗酸化剤ＡＨＳＰ活性に起因する可能性があり（Ｙｕ Ｘ，Ｋｏｎｇ Ｙ，Ｄｏｒｅ ＬＣ ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｔｈａｔ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ａｌｐｈａ－ｇｌｏｂｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｆｏｒ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００７．１１７（７）：１８５６－１８６５；及びＫｉｇｅｒ Ｌ，Ｖａｓｓｅｕｒ Ｃ，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ－Ｈａｍｄｉ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ α－Ｈｂ ｃｈａｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｉｔｓ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ＡＨＳＰ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｈｅｍｅ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｄｏｘ ｓｔａｔｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２０１４．）、本発明者らは、２４時間で、ヘモグロビン産生の増加が、他のタンパク質産生酵母で起こるように（Ｓｈｉｍｉｚｕ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｆｏｌｄｉｎｇ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｄｅａｌｉｎｇ Ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｒｅｓｕｌｔａｎｔ Ｅｑｕｉｍｏｌａｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．２００９．１１（９）：２３１７－３１；Ｔｙｏ ＫＥ，Ｌｉｕ Ｚ，Ｐｅｔｒａｎｏｖｉｃ Ｄ，Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｊ．Ｉｍｂａｌａｎｃｅ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｙｉｅｌｄｓ ｒｕｎａｗａｙ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ．ＢＭＣ Ｂｉｏｌ．２０１２．１０：１６．）、ＲＯＳ産生の増加と正に相関することを観察した（図２、図５）。ヘモグロビン産生の増加は、おそらく細胞内のより高いタンパク質産生又は／及び酵母に対するヘモグロビンの毒性のために、酵母の増殖速度の低下も伴っていた（図６）。ｐｅｐ４欠失の導入後、ヘモグロビンのα－グロビンバンドは、タンパク質ＳＤＳゲル及びウェスタンブロッティングの両方によって容易に検出可能であった（図３、図７）。
【0078】
酵母のヘモグロビン活性は、一酸化炭素生成化合物（ＣＯＲＭ－３）で細胞抽出物を処理した後に形成されたカルボキシヘモグロビン（Ｈｂ－ＣＯ）の吸収スペクトルによって検出された（図８）。ＣＯ生成化合物（ＣＯＲＭ－３）で処理したΔｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ＡＨＳＰ／ααβ株の無細胞抽出物は、ＷＴ／ＨＥＭ３／ααβ株と比較して、４１９ｎｍ（Ｈｂ－ＣＯに対応）で３倍高い吸収ピークを有していた（図８）。
【0079】
操作株では、ヘモグロビン分解産物ビリルビンの生成量が低下する
【0080】
以前に記載された操作株を、ヘモグロビン分解産物ビリルビンの蓄積について分析した。これは、以前に開発されたウナギ筋肉由来のビリルビン結合バイオセンサＵｎａＧタンパク質を使用することによって行った（Ｋｕｍａｇａｉ Ａ，Ａｎｄｏ Ｒ，Ｍｉｙａｔａｋｅ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ａ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｅｅｌ ｍｕｓｃｌｅ．Ｃｅｌｌ．２０１３．１５３（７）：１６０２－１１．）。ビリルビンの赤色及び緑色蛍光アッセイのために開発されたプラスミドｍＣｈｅｒｒｙ－ＦＤＤからのｍＣｈｅｒｒｙ－ＵｎａＧ融合物（Ｎａｖａｒｒｏ Ｒ，Ｃｈｅｎ ＬＣ，Ｒａｋｈｉｔ Ｒ ｅｔ ａｌ．Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ Ｓｍａｌｌ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１６．１１（８）：２１０１－４．）を、酵母で使用するためにベクターｐＩＹＣ０４＋ＨＥＭ３上の酵母プロモーターＰＧＫ１下にクローニングした（表１）。構築したプラスミドｐＩＹＣ０４＋ＨＥＭ３＋ｍＣｈｅｒｒｙ－ＵｎａＧ（表１）を異なる欠失株に形質転換して、ビリルビン形成に対する導入突然変異の影響を検証した（図９Ａ）。ヘモグロビンＡ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＵｎａＧ発現プラスミドの両方を保有する野生型株は最も高い蛍光収量を有し、ｒｏｘ１欠失の導入は蛍光収量を約３０％低下させた（図９Ｂ３）。ｒｏｘ１株はより嫌気性であり、より低いビリルビン形成はヘム分解酵素のより低い発現に起因し得る。その後のｖｐｓ１０欠失は、蛍光をさらに約４０％減少させた（図９Ｂ４）。ｒｏｘ１ｖｐｓ１０バックグラウンドにおけるヘムオキシゲナーゼをコードする遺伝子（ビリルビンの前駆体であるビリベルジン形成に関与するＨＭＸ１）の欠失は蛍光を約１０％減少させたが、一方、同じ株バックグラウンドにおけるＰＥＰ４遺伝子の欠失は発酵終了時にビリルビンの１６％増加をもたらした（対応する図９Ｂ５及び図９Ｂ６）。ビリルビンバイオセンサの蛍光は、Ｈｂ融合構築物の発現時に低く、ＨｂＡと比較して四量体形態でより安定であった（図１０）。
【0081】
より高いヘモグロビン産生を有する株は、より大きなサイズ及び細胞密度を示す
【0082】
ヘモグロビン産生が増加したＡＨＳＰ株（Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ＡＨＳＰ／ααβ）は、その細胞サイズを約２倍増加させた（図１１）。より大きな細胞は、通常、より多くのタンパク質を含有する。強制的な高タンパク質産生下では、リボソーム活性に制約があり、したがって酵母は、増殖速度を遅くし、細胞サイズを増加させることによって適応する（Ｋａｆｒｉ Ｍ，Ｍｅｔｚｌ－Ｒａｚ Ｅ，Ｊｏｎａ Ｇ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｃｏｓｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１６．１４（１）：２２－３１．）。興味深いことに、ＡＨＳＰ株は最大の細胞体積を有していたが（図１１；図１２）、中間株Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３／ααβの細胞体積（それはＡＨＳＰよりも５８％低いＨｂ量を産生した（図３））は、対照株ＷＴ／ＨＥＭ３／ααβよりもわずか１０％～３６％高かった（図１２）。
【0083】
ヘモグロビン－ＧＦＰ構築物は細胞質に局在する
【0084】
構築された株におけるヘモグロビンの発現及び局在化を監視するために、本発明者らは、Ｎ末端ＧＦＰ－Ｈｂ融合（αγ）構築物からなるレポーター構築物を導入した（「材料及び方法」）。ＧＦＰ蛍光収量（バイオマスによって正規化）は、野生型と比較して、Δｒｏｘ１、Δｖｐｓ１０、及びΔｈｍｘ１突然変異の導入により実質的に増加した（図１３）。ｐｅｐ４突然変異は、ＧＦＰ蛍光収量をわずかにさらに増加させた（図１３）。
【0085】
培地への鉄の補足は、組換えヘモグロビン産生を増加させ、ビリルビン形成を減少させる。
【0086】
出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるヘム生合成の最終工程は、ＨＥＭ１５遺伝子によってコードされるフェロキレート酵素によるポルフィリン環への鉄の取り込みである（Ｌａｂｂｅ－Ｂｏｉｓ Ｒ．Ｔｈｅ ｆｅｒｒｏｃｈｅｌａｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｇｅｎｅ ＨＥＭ１５．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９０．２６５（１３）：７２７８－７２８３．）。鉄原子はヘム分子に安定性を付与し、ヘム分解は、ヘムオキシゲナーゼによる鉄、ＣＯ、及びビリベルジンの放出を介して起こる。
【0087】
本発明者らは、培地中の鉄の量が増加すると、ポルフィリン合成及びヘモグロビンタンパク質産生レベルが上昇することを見出した（図１４Ａ１、図１４Ａ２）。さらに、培地中のＦｅ３＋濃度の増加は、ビリルビン形成量の低下をもたらす（図１４Ｃ１、図１４Ｃ２）。
【0088】
バイオリアクタにおけるヘモグロビン産生
【0089】
構築した株のヘモグロビン産生を、通気及びｐＨを制御したバッチバイオリアクタで研究した（「材料及び方法」）。これらの条件下で、ＡＨＳＰ株の最大比増殖速度は対照株ＷＴ／ＨＥＭ３／ααβより２０％低かった（表３）。ＡＨＳＰ株は、より高い収量のグリセロール（２倍高い）及びアセタート（３０％高い）を産生し、酸素消費速度が増加した（図１５；表３）。一方、ＣＯ２収量は６％低下した（図１５；表３）。グリセロール、アセタート産生、及び酸素消費速度の増加は、細胞が細胞内のレドックス不均衡に対処していることを示す。これらの条件下で、ＡＨＳＰ株は、ウェスタンブロット（図１６Ａ１、図１６Ａ２）によって推定されるように、４８時間の培養後にその総タンパク質含有量の１８％までのヘモグロビンを産生することが見出され、このレベルは対照株ＷＴ／ＨＥＭ３／ααβのレベルよりも６倍高かった。ＡＨＳＰ株のヘモグロビン産生レベルは、発酵の４８時間での総細胞タンパク質増加と正の相関を有し（図１６Ｂ）、これはおそらく液胞タンパク質分解の減少の操作によるものであった。ＡＨＳＰタンパク質を欠く中間株Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４は、その総タンパク質含有量の約８％のＨｂしか産生しなかったが（図１７）、対照株ＷＴ／ＨＥＭ３／ααβは、以前に報告されたように（Ｌｉｕ Ｌ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．Ｂａｌａｎｃｅｄ ｇｌｏｂｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｈｅｍｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ．２０１４．２１：９－１６．）、細胞内ヘモグロビンの最大約３～４％を蓄積した。ヘモグロビンに加えて、Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４株は、ヒトチトクロムＰ４５０ ２Ｓ１、ウシミオグロビン及びオオムギ由来の非共生ヘモグロビンなどのより多くの他のヘム含有タンパク質を産生することも見出された（図１８）。
【表3】
【0090】
ヘモグロビン分解の低減は、その分泌にとって有益である
【0091】
α因子リーダー－ヘモグロビン融合構築物は、３つの異なる株バックグラウンドで発現した：ＩＮＶＳｃ１（タンパク質発現のために開発された２倍体株、Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ（商標））、１８４Ｍ（Ｈｕａｎｇ Ｍ，Ｂａｉ Ｙ，Ｓｊｏｓｔｒｏｍ ＳＬ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ｙｅａｓｔ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１５．１１２（３４）：Ｅ４６８９－９６．）、及びこの研究で構築したＣＥＮＰＫ１１３－１１ｃ Δｒｏｘ１ Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４（図１９Ａ）。培地濃縮前の培地ではヘモグロビンは検出されなかった。しかし、Ａｍｉｃｏｎ １０ｋＤａ遠心分離フィルタ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって培地を濃縮した後、１８４Ｍ及びＣＥＮＰＫ１１３－１１ｃ Δｒｏｘ１ Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４の２つの株でウェスタンブロッティングによってヘモグロビンを検出することができた（図１９Ｂ）。ＩＮＶＳｃ１ではヘモグロビンは検出されなかった（図１９Ｂ）。約３０ｋＤａのタンパク質バンドが両方の株で検出されたが、１８４Ｍ株は、より小さなサイズのバンドがほとんど検出されなかった（図１９Ｂ）。これは、１８４Ｍ株におけるヘモグロビンの部分的な分解を示し得る。１８４Ｍ株は、ＲＯＸ１遺伝子及びＶＰＳ１０遺伝子の両方のダウンレギュレーションを引き起こすものを含むいくつかの突然変異を保有しているが、ＰＥＰ４遺伝子発現は変化しなかった（Ｈｕａｎｇ Ｍ，Ｂａｏ Ｊ，Ｈａｌｌｓｔｒｏｍ ＢＭ ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｙｅａｓｔ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｇｌｏｂａｌ ｔｕｎｉｎｇ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７．８（１）：１１３１．）。
【0092】
改変酵母細胞遺伝子型は、例えば、上述の遺伝子改変、遺伝子の欠失（ＲＯＸ１、ＶＰＳ１０、ＨＭＸ１、ＰＥＰ４）及び遺伝子の過剰発現（ＨＥＭ ３、ヘモグロビンを分泌経路に導き、細胞の外側で分泌培地に導くための、接合フェロモンα因子（ＭＦ（ＡＬＰＨＡ）１）のアルファリーダー配列を有するサブユニットアルファ（α）及びサブユニットガンマ（γ）を含むヘモグロビン融合タンパク質（Ｈｂｆｕｓｉｏｎ））を有するΔｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ａｌｐｈａ ｌｅａｄｅｒ－Ｈｂｆｕｓｉｏｎであり得る。分泌型ヘモグロビンのヌクレオチド配列は、配列番号１３と少なくとも９５％同一であり得る。分泌型ヘモグロビンのポリペプチド配列は、配列番号１４と少なくとも９５％同一であるか、又はポリペプチドは、酵母分泌経路においてヘモグロビン活性を有する。
【0093】
考察
【0094】
ヒトヘモグロビン（Ｈｂ）は、どの発達段階で合成されるかに応じて、異なるサブユニットのヘテロ四量体である。すべてのヘモグロビンは補欠分子族（ヘムｂ）を持ち、これがグロビン鎖に共同して組み込まれ、ポリペプチドのフォールディングに影響を与える。ヘムレスヘモグロビンは酸素と結合することができないため、ヘムの利用可能性は、ヘモグロビン合成にとってだけでなく、その主要な機能にとっても重要である。代謝操作は、酵母におけるヘム産生を実質的に増加させることができる。ポルフォビリノーゲン脱アミナーゼをコードするＨＥＭ３などのヘム生合成の制限遺伝子（Ｈｏｆｆｍａｎ Ｍ，Ｇｏｒａ Ｍ，Ｒｙｔｋａ Ｊ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔｅ－ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｓｔｅｐｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｈｅｍｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００３．３１０（４）：１２４７－１２５３．）の過剰発現は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてヘム産生とヘモグロビン産生の両方を有意に増加させた（Ｌｉｕ Ｌ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．Ｂａｌａｎｃｅｄ ｇｌｏｂｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｈｅｍｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ．２０１４．２１：９－１６．）。
【0095】
本発明者らの株設計、すなわち本発明による遺伝子改変酵母細胞の本発明者らの設計では、本発明者らはＨＥＭ３遺伝子過剰発現戦略も使用した。酵母では、ヘムの細胞内レベルは、転写因子Ｈａｐ１によって酸素利用可能性に応答して転写レベルで厳密に調節される。Ｈａｐ１は、ＨＥＭ１３遺伝子のリプレッサであるＲｏｘ１を活性化する（Ｋｅｎｇ Ｔ．ＨＡＰ１ ａｎｄ ＲＯＸ１ ｆｏｒｍ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＥＭ１３ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９２．１２（６）：２６１６－２６２３；Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｌ，Ｐｅｔｒａｎｏｖｉｃ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１５．１１２（１）：１８１－１８８．）。ＲＯＸ１遺伝子の欠失はまた、低酸素誘導遺伝子を活性化し（Ｔｅｒ Ｌｉｎｄｅ ＪＪ，Ｓｔｅｅｎｓｍａ ＨＹ．Ａ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｈａｐ１ ａｎｄ Ｒｏｘ１ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｙｅａｓｔ．２００２．１９（１０）：８２５－８４０．）、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における他の異種タンパク質、例えばα－アミラーゼ、インスリン及びインベルターゼの産生を改善することが以前に示された（Ｌｉｕ Ｌ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｌｉｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｔ ａｅｒｏｂｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．２０１５．１５（７）．ｐｉｉ：ｆｏｖ０７０．）。Ｒｏｘ１によるＨＥＭ１３遺伝子阻害を排除するために、ヘモグロビン発現のバックグラウンド株としてΔｒｏｘ１を使用した。Δｒｏｘ１株は、ＨＥＭ３遺伝子過剰発現下でより高いポルフィリン量を産生することが証明された。異種タンパク質合成は、宿主における相同タンパク質分解機構によって悪影響を受け、タンパク質産生の成功は、これらのプロセスの抑制に大きく依存する。これに対処するために、本発明者らは、ヘムの分解が減少し、グロビンペプチドの分解が減少した、ヘモグロビン産生出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株、すなわち本発明による遺伝子改変酵母細胞を操作した。ヘムの細胞内レベルは、ヘム分解によって調節される。ＨＭＸ１遺伝子によってコードされるヘムオキシゲナーゼは、鉄飢餓及び酸化ストレス時にヘムを分解する（Ｐｒｏｔｃｈｅｎｋｏ Ｏ，Ｐｈｉｌｐｏｔｔ ＣＣ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｅｍｅ ｌｅｖｅｌｓ ｂｙ ＨＭＸ１，ａ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｏｆ ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３．２７８（３８）：３６５８２－７．）。高タンパク質産生条件下では、ミスフォールドタンパク質は液胞分解を標的とする。複数の液胞加水分解酵素のためのＩ型膜貫通選別受容体をコードするＶＰＳ１０遺伝子は、折り畳まれていないタンパク質の液胞ターゲティングに関与する（Ｍａｒｃｕｓｓｏｎ ＥＧ，Ｈｏｒａｚｄｏｖｓｋｙ ＢＦ，Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ＪＬ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｓｏｒｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｙｅａｓｔ ｖａｃｕｏｌａｒ ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｙ ｉｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＶＰＳ１０ ｇｅｎｅ．Ｃｅｌｌ．１９９４．７７（４）：５７９－５８６．）。ＶＰＳ１０遺伝子の欠失及びその活性低下は、他の異種タンパク質の産生を改善することが示された（Ｈｏｎｇ Ｅ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ ＡＲ，Ｋａｉｓｅｒ ＣＡ．Ａ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｏｌｕｂｌｅ ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｖａｃｕｏｌｅ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９６．１３５（３）：６２３－６３３；Ｈｕａｎｇ Ｍ，Ｂａｏ Ｊ，Ｈａｌｌｓｔｒｏｍ ＢＭ ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｙｅａｓｔ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｇｌｏｂａｌ ｔｕｎｉｎｇ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７．８（１）：１１３１．）。ＰＥＰ４遺伝子は、酸化ストレスによる損傷タンパク質のリサイクルに重要な液胞アスパルチルプロテアーゼをコードする。ＰＥＰ４遺伝子の突然変異は、異なる酵母株における異なる異種タンパク質の産生に有益であった（Ｍａｒｑｕｅｓ Ｍ，Ｍｏｊｚｉｔａ Ｄ，Ａｍｏｒｉｍ ＭＡ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｐｅｐ４ｐ ｖａｃｕｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｏｆ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｕｔ ＰＥＰ４ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｎｏｔ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｉｆｅｓｐａｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００６．１５２（Ｐｔ １２）：３５９５－３６０５；及びＷａｎｇ ＺＹ，Ｈｅ ＸＰ，Ｚｈａｎｇ ＢＲ．Ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＳＨ１ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ＰＥＰ４ ｇｅｎｅ ｉｎ ｓｅｌｆ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｂｒｅｗｅｒ’ｓ ｙｅａｓｔ．Ｉｎｔ Ｊ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７．１１９（３）：１９２－１９９．）。
【0096】
本発明者らが、ＲＯＸ１、ＶＰＳ１０、ＨＭＸ１及びＰＥＰ４遺伝子欠失を組み合わせたとき、すなわち、本発明に従った遺伝子改変酵母細胞において、本発明者らは、ウェスタンブロッティングなしでもタンパク質ゲルにおいてヘモグロビンを検出することができた。ビリルビン結合蛍光バイオセンサを使用することによって、本発明者らは、この変異体、すなわち本発明に従った遺伝子改変酵母細胞が、はるかに少ない量のヘモグロビン分解産物、ビリルビン、したがってより多くの産物を産生することを確認した。鉄の補充はまた、本発明者らの株におけるヘモグロビン産生を改善し、ビリルビン形成を減少させた。ヘムオキシゲナーゼ発現は鉄酸化ストレスによって調節されるため（Ｐｒｏｔｃｈｅｎｋｏ Ｏ，Ｐｈｉｌｐｏｔｔ ＣＣ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｅｍｅ ｌｅｖｅｌｓ ｂｙ ＨＭＸ１，ａ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｏｆ ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３．２７８（３８）：３６５８２－７；及びＣｏｌｌｉｎｓｏｎ ＥＪ，Ｗｉｍｍｅｒ－Ｋｌｅｉｋａｍｐ Ｓ，Ｇｅｒｅｇａ ＳＫ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｈｏｍｏｌｏｇ ｏｆ ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－１ ａｆｆｏｒｄｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｋｎｏｗｎ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｇｅｎｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１１．２８６（３）：２２０５－２２１４．）、鉄量が多い培地及びΔｒｏｘ１株ではその発現が低下する。ヘモグロビン分子を安定化し、赤血球におけるその分解及び酸化を防止するヒトＡＨＳＰ遺伝子（α－ヘモグロビン安定化タンパク質）の過剰発現（Ｋｉｈｍ ＡＪ，Ｋｏｎｇ Ｙ，Ｈｏｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．Ａｎ ａｂｕｎｄａｎｔ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ ｆｒｅｅ ａｌｐｈａ－ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ．２００２．４１７（６８９０）：７５８－７６３；Ｆｅｎｇ Ｌ，Ｇｅｌｌ ＤＡ，Ｚｈｏｕ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＡＨＳＰ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ－ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ．Ｃｅｌｌ．２００４．１１９（５）：６２９－６４０；Ｙｕ Ｘ，Ｋｏｎｇ Ｙ，Ｄｏｒｅ ＬＣ ｅｔ ａｌ．Ａｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ Ｔｈａｔ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ Ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ Ａｌｐｈａ－Ｇｌｏｂｉｎ Ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｆｏｒ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００７．１１７（７）：１８５６－１８６５；Ｍｏｌｌａｎ ＴＬ，Ｙｕ Ｘ，Ｗｅｉｓｓ ＭＪ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｌｐｈａ－ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｒｅｄｏｘ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．２０１０．１２（２）：２１９－２３１．）は、Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４酵母株におけるヘモグロビン産生の５８％の増加をもたらした。ＡＨＳＰ発現は、発酵の初期段階（６時間）でＲＯＳ形成を減少させたが、発酵の２４時間でＡＨＳＰ株は最大量のＲＯＳを蓄積し、これはヘモグロビン及び細胞ポルフィリンの量と正の相関を有していた。バイオリアクタでは、ＡＨＳＰ株ヘモグロビンレベルは、総細胞内タンパク質含有量に対して１８％であった。これは、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｌ，Ｐｅｔｒａｎｏｖｉｃ Ｄ ｅｔ ａｌ．（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１５．１１２（１）：１８１－１８８）によって以前に報告されたものよりも２．６倍高かった。タンパク質分解の減少を操作することによって達成された高タンパク質産生は、細胞の総タンパク質含有量の増加（約２０％）に伴って細胞の体積を増加させ、ＡＨＳＰ株において増殖速度を３１３％低下させた。これらは、高いタンパク質合成負荷に適応する細胞の特徴であり、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるレポーター構築物の使用について以前に報告された（Ｋａｆｒｉ Ｍ，Ｍｅｔｚｌ－Ｒａｚ Ｅ，Ｊｏｎａ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｃｏｓｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１６．１４（１）：２２－３１．）。
【0097】
高レベルの細胞内ヘモグロビン産生は、ＡＨＳＰ株の発酵プロファイルの変化を引き起こした。酸素消費量の増加、この株による副生成物であるグリセロール及びアセタートの産生は、レドックス不均衡を示す。ｒｏｘ１（低酸素遺伝子発現をもたらす）、ｈｍｘ１（鉄枯渇をもたらす）突然変異及びヘモグロビン産生（鉄枯渇）の組み合わせとして構築された株の複雑な表現型は、細胞内の全体的な酸素制限を引き起こした。グリセロール及びアセタートは、嫌気性条件下でＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨバランスを満たすように産生される（Ｖｉｌｌａｄｓｅｎ Ｊ，Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｊ，Ｌｉｄｅｎ Ｇ．Ｂｉｏｒｅａｃｔｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ＵＳ．２０１１．）。細胞が鉄を欠乏すると、その呼吸鎖がうまく機能せず、ＮＡＤＨを蓄積し、ＧＰＤ２遺伝子の発現を誘導してグリセロールを産生することによって応答する（Ａｎｓｅｌｌ Ｒ，Ａｄｌｅｒ Ｌ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｒｏｎ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｏｎ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ＮＡＤ（＋）－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９９．４６１（３）：１７３－１７７．）。代謝操作によってこの株の補因子不均衡に対処する戦略は、ヘモグロビン産生をさらに改善するために使用することができる。
【0098】
結論として、本発明者らは、全細胞タンパク質に対して（全細胞タンパク質の）最大１８％のヒトヘモグロビン（ＨｂＡ）を産生することができる出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株、すなわち本発明に従った遺伝子改変酵母細胞を操作した。この株、すなわち本発明に従った遺伝子改変酵母細胞は、ヘモグロビン系酸素運搬体（ＨＢＯＣ）、又は他のヘム含有タンパク質（例えば、持続可能な食品又は飼料生産）、又はヘム酵素（例えばＰ４５０）の開発のためのヘモグロビンの持続可能かつ安全な供給源として使用することができる。本明細書に記載の株は、グルコースからヘモグロビン及び他のヘムタンパク質をＰ４５０として高収率で産生することができるので、ＨＢＯＣ又は食品を開発する産業のためのヘモグロビン又は他のヘムタンパク質産生体として使用することができる。
【0099】
材料及び方法
【0100】
培地及び株の増殖条件
【0101】
本発明の実施形態の実験で使用される培地及び株を以下に提供する。この試験で使用した株を上記の表２に列挙する。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ １１３－１１Ｃ（ＭＡＴａ ｈｉｓ３Δ１ ｕｒａ ３－５２ ＭＡＬ２－８ｃ ＳＵＣ２）（Ｅｎｔｉａｎ ａｎｄ Ｋｏｔｔｅｒ，１９９８．）及びそのΔｒｏｘ１変異体（Ｌｉｕ Ｌ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｌｉｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｔ ａｅｒｏｂｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．２０１５．１５（７）．ｐｉｉ：ｆｏｖ０７０．）をヒトヘモグロビン産生の宿主として使用した。酵母株を完全富栄養培地ＹＰＤ（５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌペプトン、２０ｇ／Ｌグルコース）中３０℃で維持した。ヘモグロビンＡ発現プラスミドｐＩＹＣ０４＋ＨＥＭ３及びｐＳＰ－ＧＭ１＋ααβ（Ｌｉｕ Ｌ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．Ｂａｌａｎｃｅｄ ｇｌｏｂｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｈｅｍｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ．２０１４．２１：９－１６．）を有する形質転換体を、炭素源として２０ｇ／Ｌグルコースを含む、ウラシル及びヒスチジンの両方を含まない合成完全培地ＳＤ（アミノ酸を含まない硫酸アンモニウムを含む６．９ｇ／Ｌ酵母窒素塩基（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ（商標））、ヒスチジン及びウラシルを含まない０．７５ｇ／Ｌ合成完全ドロップアウト混合物（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ（商標））、ｐＨ６．０）で選択した。追加の鉄をＳＤ培地（Ｆｅ３＋を含むＳＤ）に添加した（１００μＭクエン酸第二鉄、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。欠失変異体を、０．２ｇ／Ｌの濃度のＧ４１８を含むＹＰＤ培地で選択した。Ｃｒｅリコンビナーゼ誘導によるｋａｎＭＸマーカー除去のために、形質転換体をＹＰＧ培地（５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌガラクトース）上で一晩増殖させた。Δｒｏｘ１株におけるポルフィリン産生の評価のために、５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）をＳＤ培地に１ｍＭの濃度で添加した。
【0102】
遺伝子ノックアウト株の作製
【0103】
この研究で使用したオリゴヌクレオチドプライマー及びプラスミドを表１に列挙する。Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ ＴＥＦ１（Ｓｔｅｉｎｅｒ Ｓ，Ｐｈｉｌｉｐｐｓｅｎ Ｐ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ＴＥＦ ｇｅｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｕｓ Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ．Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１９９４．２４２（３）：２６３－２７１．）の制御下で発現される優性選択マーカーｋａｎＭＸを有する欠失カセットを遺伝子ノックアウトに使用した。その後のマーカー除去をＣｒｅ－ｌｏｘシステム（Ｃｒｅリコンビナーゼは、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のプロモーターＧＡＬ１下で発現された）によって行った（Ｗｅｎｎｉｎｇ Ｌ，Ｙｕ Ｔ，Ｄａｖｉｄ Ｆ ｅｔ ａｌ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｖｅｒｙ ｌｏｎｇ－ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｌｃｏｈｏｌ ａｎｄ ｗａｘ ｅｓｔｅｒ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１７．１１４（５）：１０２５－１０３５．）。欠失カセットは、ＬｏｘＰに隣接するｋａｎＭＸ及びＣｒｅリコンビナーゼ、並びに出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＨＭＸ１、ＶＰＳ１０及びＰＥＰ４標的遺伝子に相同な約５０ｂｐのヌクレオチド配列を担持していた。形質転換後に酵母においてインビボで修復されるｋａｎＭＸ遺伝子の３３５ｂｐの重複領域を含む鋳型プラスミドｐＤｅｌ１及びｐＤｅｌ２（表１（Ｗｅｎｎｉｎｇ Ｌ，Ｙｕ Ｔ，Ｄａｖｉｄ Ｆ ｅｔ ａｌ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｖｅｒｙ ｌｏｎｇ－ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｌｃｏｈｏｌ ａｎｄ ｗａｘ ｅｓｔｅｒ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１７．１１４（５）：１０２５－１０３５．））からの２つの断片において、各欠失カセットを増幅し（断片１：標的遺伝子５’配列－ｌｏｘＰ－ｈａｌｆ ｋａｎＭＸ遺伝子；断片２：ｋａｎＭＸ遺伝子（重複部分を有する後半）－ＧＡＬ－プロモーター－Ｃｒｅリコンビナーゼ－ＬｏｘＰ－標的遺伝子３’配列、次いでΔｒｏｘ１変異体に共形質転換した。ＨＭＸ１遺伝子欠失カセットを、Ｄｅｌ－ＨＭＸ１－１及びＤｅｌ１－ｒｅｖプライマー対（ＰＣＲ断片１）、Ｄｅｌ２－ｆｏｒ及びＤｅｌ２－ＨＭＸ１－２（ＰＣＲ断片２）によって増幅した。ＶＰＳ１０遺伝子欠失カセットを、ＶＰＳ１０－１及びＤｅｌ１－ｒｅｖ（ＰＣＲ断片１）、Ｄｅｌ２－ｆｏｒ及びＶＰＳ１０－２（ＰＣＲ断片２）によって増幅した。ＰＥＰ４遺伝子欠失カセットを、ＰＥＰ４－４及びＤｅｌ１－ｒｅｖ（ＰＣＲ断片１）、Ｄｅｌ２－ｆｏｒ及びＰＥＰ４－２（ＰＣＲ断片２）によって増幅した（表１）。欠失カセットを有する形質転換体を、０．２ｇ／Ｌの濃度のＧ４１８を含むＹＰＤ培地で選択した。遺伝子欠失をＰＣＲ分析によって検証し、得られた変異体をさらなる研究のために選択した。Ｃｒｅリコンビナーゼ発現を誘導するために、ガラクトース（ＹＰＧ）を含む富栄養培地で形質転換体を一晩増殖させ、次いでＹＰＤに播種した。この処理後にＧ４１８を含むＹＰＤ上で成長する能力を失った形質転換体を、さらなる研究のために選択した。
【0104】
プラスミド及び合成ＤＮＡ
【0105】
この研究で構築したプラスミド及び使用したオリゴヌクレオチドを表１に列挙する。ヒトアルファヘモグロビン安定化タンパク質（ＡＨＳＰ）遺伝子の配列を、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対してコドン最適化し（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝４９３２）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから合成ＤＮＡとして得た。次いで、コドン最適化断片をＡＨＳＰ－１及びＡＨＳＰ－２プライマーで増幅し、プロモーターＰＧＫ１下でプラスミドｐＩＹＣ０４＋ＨＥＭ３にクローニングして、プラスミドｐＩＹＣ０４＋ＨＥＭ３＋ＡＨＳＰを得た。細菌Ｅ．ｃｏｌｉのためのヘモグロビン融合（αγサブユニット融合）構築物（Ｃｈａｋａｎｅ Ｓ．（２０１７）．Ｔｏｗａｒｄｓ Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ－Ｂａｓｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｌｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を、酵母における使用に適合させるために、本発明者らはまず、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）発現のためにコドン最適化した（Ｈｂｆｕｓｉｏｎと命名）。ＧＦＰ ＯＲＦを、プラスミドｐ４１６ＴＥＦＧＦＰ（Ｊｅｎｓｅｎ ＥＤ，Ｆｅｒｒｅｉｒａ Ｒ，Ｊａｋｏｃｉｕｎａｓ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｕｓｉｎｇ ｄＣａｓ９ ａｎｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｇＲＮＡ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．２０１７．１６（１）：４６．）からプライマーＨｂＦ－ＧＦＰ－１及びＨｂＦ－ＧＦＰ－２を用いて増幅し、プライマーＨｂＦ－ＧＦＰ－３及びＨ３ＡＦＨｂ－２で増幅したＨｂｆｕｓｉｏｎ構築物と融合させ、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢ）を使用して強力な構成的プロモーターＰＧＫ１の下でｐＩＹＣ０４＋ＨＥＭ３プラスミドにクローニングし、プラスミドｐＩＹＣ０４＋ＨＥＭ３＋ＧＦＰ－Ｈｂｆｕｓｉｏｎを得た。ｐＩＹＣ０４＋ＨＥＭ３＋ｍＣｈｅｒｒｙ－ＵｎａＧをｐＩＹＣ０４＋ＨＥＭ３（Ｌｉｕ Ｌ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．Ｂａｌａｎｃｅｄ ｇｌｏｂｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｈｅｍｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ．２０１４．２１：９－１６．）のベース上に構築した。ｍＣｈｅｒｒｙ－ＵｎａＧ融合物を、プライマーＦＤＤ－Ｂ／ＦＤＤ－Ｘ（表１）を用いてｍＣｈｅｒｒｙ－ＦＤＤベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃８０６２９（Ｎａｖａｒｒｏ Ｒ，Ｃｈｅｎ ＬＣ，Ｒａｋｈｉｔ Ｒ ｅｔ ａｌ．Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ Ｓｍａｌｌ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１６．１１（８）：２１０１－４．））から増幅し、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化したｐＩＹＣ０４＋ＨＥＭ３とライゲーションした。ＣＰＯＴ＋α－ｌｅａｄｅｒ－Ｈｂｆｕｓｉｏｎ＋ＨＥＭ３をＣＰＯＴｕｄ（Ｌｉｕ Ｚ，Ｔｙｏ ＫＥ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＪＬ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１２．１０９（５）：１２５９－６８．）のベース上に構築した。αリーダー配列を有する断片を、プライマー対Ａｌｐｈａ－１及びＡｌｐｈａ－２で増幅した。ヘモグロビンαγ融合（Ｈｂｆｕｓｉｏｎ）を有する断片を、ｐＩＹＣ０４＋ＨＥＭ３＋ＧＦＰ－ＨｂｆｕｓｉｏｎからプライマーＦｕｓｉｏｎ－１及びＦｕｓｉｏｎ－２で増幅した。得られた断片をＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ登録商標（）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢ）によってＫｐｎＩ及びＮｈｅＩ消化ＣＰＯＴプラスミドにクローニングし、プラスミドＣＰＯＴ＋α－ｌｅａｄｅｒ－Ｈｂｆｕｓｉｏｎを得た。プロモーターＴＥＦ１の制御下のＨＥＭ３遺伝子をプライマー対ＨＥＭ３ＣＰＯＴ－１及びＨＥＭ３ＣＰＯＴ－２で増幅し、ＣＰＯＴ＋α－ｌｅａｄｅｒ－ＨｂｆｕｓｉｏｎのＢａｍＨＩ部位にクローニングした。ｐＩＹＣ０４＋ＨＥＭ３＋α－ｌｅａｄｅｒ－ＨｂｆｕｓｉｏｎをｐＩＹＣ０４＋ＨＥＭ３（Ｌｉｕ Ｌ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．Ｂａｌａｎｃｅｄ ｇｌｏｂｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｈｅｍｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ．２０１４．２１：９－１６．）に基づいて構築した。α－ｌｅａｄｅｒ－Ｈｂｆｕｓｉｏｎ構築物を担持する断片を、プライマーＨ３ＡＦＨｂ－１及びＨ３ＡＦＨｂ－２を用いてＣＰＯＴ＋α－ｌｅａｄｅｒ－Ｈｂｆｕｓｉｏｎ＋ＨＥＭ３から増幅し、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ消化ｐＩＹＣ０４＋ＨＥＭ３にクローニングした。ＣＹＰ２Ｓ１ ＯＲＦをプロモーターＧＡＬ１０下でｐＥＳＣ－ＵＲＡのＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにクローニングしたｐＥＳＣ－ＵＲＡ＋ＣＹＰ２Ｓ１を、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）発現のためのコドン適合を有する合成ＤＮＡとしてＧｅｎＳｃｒｉｐｔから入手し、Ｈｉｓ６タグを保有した。ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）のＭＢ遺伝子のＯＲＦをプロモーターＧＡＬ１０下でｐＥＳＣ－ＵＲＡのＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにクローニングしたｐＥＳＣ－ＵＲＡ＋ＭＹＧ－ＢＯＶを、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）発現のためのコドン適合を有する合成ＤＮＡとしてＧｅｎＳｃｒｉｐｔから入手し、Ｈｉｓ６タグを保有した。オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）のＧＬＢ１遺伝子のＯＲＦをプロモーターＧＡＬ１０下でｐＥＳＣ－ＵＲＡのＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにクローニングしたｐＥＳＣ－ＵＲＡ＋ＨＢＬ－ＨＯＲを、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）発現のためのコドン適合を有する合成ＤＮＡとしてＧｅｎＳｃｒｉｐｔから入手し、Ｈｉｓ６タグを保有した。
【0106】
グルコース発酵及び代謝産物分析
【0107】
バッチグルコース発酵を、フラスコ内で、バイオリアクタ内で厳密に制御された条件下で行った。振盪フラスコ発酵を、２００ｒｐｍで２５ｍｌの液体培地中、３０℃で行い、前培養物から０．２の初期ＯＤ６００で接種した。バッチ発酵を、５００ｍｌの作業容量を有する１．０Ｌ Ｂｉｏｓｔａｔ Ｑｐｌｕｓ（Ｃ）バイオリアクタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）で行った。温度を３０℃及びｐＨ６．０に維持した。前培養物から０．１の初期ＯＤ６００でバイオリアクタに接種した。溶存酸素量は酸素センサで測定し、３０％超を維持した。体積流量（通気）を６０Ｌ／ｈ（２ｖｖｍ）に設定し、撹拌機の速度を６００ｒｐｍで一定にした。乾燥重量は、バイオマスをメンブレンフィルタ（０．４５μｍ、ＭｏｎｔａＭｉｌ（登録商標）ＭＣＥ、Ｆｒｉｓｅｎｅｔｔｅ、デンマーク）上に収集し、その後乾燥させることによって測定した。培養培地中の代謝産物を、ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣ（モデル１１００－１２００ Ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ）、ＨＰＸ－８７Ｈカラム（ＢＩＯ－ＲＡＤ、米国）を備える）によって培養培地中で測定した。バイオリアクタからのオフガスをフォームトラップに通し、質量分析計（Ｍｏｄｅｌ Ｐｒｉｍａ ＰＲＯ Ｐｒｏｃｅｓｓ ＭＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、英国）によって分析した。
【0108】
ＲＯＳ検出
【0109】
活性酸素種（ＲＯＳ）レベルを、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ Ｍ，Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｍｉｌａｎｏｖａ Ｓ ｅｔ ａｌ．ＰＵＦＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ｙｃａ１ｐ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙｓ，ａｎｄ ｉｓ ｒｅｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｉｎ ｙｅａｓｔ．ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．２０１６．１６（２）：ｆｏｗ００７によって記載されたプロトコルによってジヒドロローダミン１２３色素を使用してインビボで測定した。この目的のために、６時間の発酵、細胞を遠心分離によって回収し、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。細胞を、５０μＭジヒドロローダミン１２３を補充した５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液と共に暗所で３０分間さらにインキュベートした。染色後、細胞をスピンダウンし、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダー（励起４８５ｎｍ及び発光５２０ｎｍフィルタを有する）及びＧｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴフローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して蛍光によって、ローダミン（ジヒドロローダミン１２３の酸化形態）の形成を検出した。
【0110】
ポルフィリン含有量分析
【0111】
細胞のヘム及びポルフィリン含有量は、前述のように決定した（Ｌｉｕ Ｌ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．Ｂａｌａｎｃｅｄ ｇｌｏｂｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｈｅｍｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ．２０１４．２１：９－１６．）。遊離細胞ヘム及び総ポルフィリン含量を、シュウ酸処理後、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダー分光光度計でλ＝４００ｎｍでの励起及びλ＝６００ｎｍでの発光によるそれらの蛍光によって決定した。
【0112】
吸収スペクトルによるカルボキシヘモグロビンの検出
【0113】
酵母細胞粗抽出物を以前記載されたように調製した（Ｉｓｈｃｈｕｋ ＯＰ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＪＬ，Ｐｅｔｒａｎｏｖｉｃ Ｄ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ．Ｉｎ：Ｇａｓｓｅｒ Ｂ ａｎｄ Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ Ｄ（ｅｄｓ）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｙｅａｓｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１９２３．２０１９．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．）。細胞粗抽出物用の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液は、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．６ｍｇ／ｍｌのＣＯ放出化合物ＣＯＲＭ－３（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含有した。細胞残屑除去後、カルボキシヘモグロビン量を、同じ濃度（１３ｍｇ／ｍｌ）を有する試料のタンパク質抽出物のスペクトル分析によって決定した。
【0114】
細胞体積の決定
【0115】
酵母細胞体積は、ＣＡＳＹ Ｍｏｄｅｌ ＴＴ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ ａｎｄ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ．）を用いて決定した。細胞を２４、４８、７２及び９６時間の培養でバイオリアクタから回収し、ＣＡＳＹトン緩衝液に再懸濁し、６０μｍの毛細管を使用して分析した。
【0116】
タンパク質抽出及びウェスタンブロッティング。
【0117】
Ｂａｅｒｅｎｄｓ ＲＪ，Ｆａｂｅｒ ＫＮ，Ｋｒａｍ ＡＭ ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｔｒｅｔｃｈ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｔ ｔｈｅ Ｎ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｏｆ Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ Ｐｅｘ３ｐ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０００．２７５（１４）：９９８６－９９９５に記載されているように、ＴＣＡ処理によって総タンパク質を抽出し、タンパク質をプレキャストＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（４～２０％勾配、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌｓ、ＢＩＯ－ＲＡＤ）上での電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉ ＰＶＤＦ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐａｃｋｓ，ＢＩＯ－ＲＡＤ）に電気泳動転写し、抗ヘモグロビン抗体（ヘモグロビンα抗体（Ｄ－１６）：ｓｃ－３１１１０、ヤギポリクローナル、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とハイブリダイズさせた。ヘモグロビンシグナル検出のために、二次抗体をアルカリホスファターゼ（抗ヤギＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）又はホースラディッシュペルオキシダーゼ（抗ヤギＩｇＧ、Ｆｉｓｈｅｒ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかとコンジュゲートさせて使用した。シグナル強度をＩｍａｇｅ Ｌａｂ（商標）（ＢＩＯ－ＲＡＤ）で分析した。
【0118】
全細胞中のタンパク質濃度
【0119】
Ｖｅｒｄｕｙｎ Ｃ，Ｐｏｓｔｍａ Ｅ，Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓ ＷＡ ｅｔ ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｉｎ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｇｌｕｃｏｓｅ－ｌｉｍｉｔｅｄ ｃｈｅｍｏｓｔａｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９０．１３６（３）：３９５－４０３に記載されているように、タンパク質含有量を決定した。各株を分析する場合、等量の酵母乾燥重量を使用した。
【0120】
統計解析
【0121】
ソフトウェアパッケージＭｉｎｉｔａｂ（登録商標）１８．１を使用して、得られたデータを分析した。
【配列表フリーテキスト】
【0122】
配列表１ ＜２２３＞ゲノムから欠失した酵母細胞ＲＯＸ１遺伝子配列
配列表２ ＜２２３＞ゲノムから欠失した酵母細胞ＶＰＳ１０遺伝子配列
配列表３ ＜２２３＞ゲノムから欠失した酵母細胞ＨＭＸ１遺伝子配列
配列表４ ＜２２３＞ゲノムから欠失した酵母細胞ＰＥＰ４遺伝子配列
配列表５ ＜２２３＞酵母細胞ＡＨＳＰ遺伝子配列
配列表６ ＜２２３＞酵母細胞ＡＨＳＰポリペプチド配列
配列表７ ＜２２３＞酵母細胞ＨＥＭ３遺伝子
配列表８ ＜２２３＞酵母細胞Ｈｅｍ３ポリペプチド配列
配列表９ ＜２２３＞ヒトヘモグロビンサブユニットαをコードする配列
配列表１０ ＜２２３＞ヒトヘモグロビンサブユニットβをコードする配列
配列表１１ ＜２２３＞ヒトヘモグロビンサブユニットα
配列表１２ ＜２２３＞ヒトヘモグロビンサブユニットβ
配列表１３ ＜２２３＞改変酵母細胞、Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ａｌｐｈａ ｌｅａｄｅｒ－Ｈｂｆｕｓｉｏｎから分泌されたヘモグロビンをコードする配列
配列表１４ ＜２２３＞改変酵母細胞、Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ａｌｐｈａ ｌｅａｄｅｒ－Ｈｂｆｕｓｉｏｎ
から分泌されたヘモグロビンのポリペプチド配列
配列表２ ＜２２３＞ゲノムから欠失した酵母細胞ＶＰＳ１０遺伝子配列
配列表３ ＜２２３＞ゲノムから欠失した酵母細胞ＨＭＸ１遺伝子配列
配列表４ ＜２２３＞ゲノムから欠失した酵母細胞ＰＥＰ４遺伝子配列
配列表５ ＜２２３＞酵母細胞ＡＨＳＰ遺伝子配列
配列表６ ＜２２３＞酵母細胞ＡＨＳＰポリペプチド配列
配列表７ ＜２２３＞酵母細胞ＨＥＭ３遺伝子
配列表８ ＜２２３＞酵母細胞Ｈｅｍ３ポリペプチド配列
配列表９ ＜２２３＞ヒトヘモグロビンサブユニットαをコードする配列
配列表１０ ＜２２３＞ヒトヘモグロビンサブユニットβをコードする配列
配列表１１ ＜２２３＞ヒトヘモグロビンサブユニットα
配列表１２ ＜２２３＞ヒトヘモグロビンサブユニットβ
配列表１３ ＜２２３＞改変酵母細胞、Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ａｌｐｈａ ｌｅａｄｅｒ－Ｈｂｆｕｓｉｏｎから分泌されたヘモグロビンをコードする配列
配列表１４ ＜２２３＞改変酵母細胞、Δｒｏｘ１Δｖｐｓ１０Δｈｍｘ１Δｐｅｐ４／ＨＥＭ３＋ａｌｐｈａ ｌｅａｄｅｒ－Ｈｂｆｕｓｉｏｎ
から分泌されたヘモグロビンのポリペプチド配列
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図13E】
【図13F】
【図13G】
【図14-1】
【図14-2】
【図14-3】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18-1】
【図18-2】
【図19-1】
【図19-2】
【配列表】
【国際調査報告】