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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-07
(54)【発明の名称】部分的早老症の治療に対する化合物
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20240131BHJP
C07K 5/10 20060101ALI20240131BHJP
C07K 5/08 20060101ALI20240131BHJP
A61K 38/06 20060101ALI20240131BHJP
A61K 38/07 20060101ALI20240131BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240131BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240131BHJP
A61P 19/00 20060101ALI20240131BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06
C07K5/10
C07K5/08
A61K38/06
A61K38/07
A61P43/00 111
A61P43/00 105
A61P17/00
A61P19/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023532582
(86)(22)【出願日】2021-11-24
(85)【翻訳文提出日】2023-07-21
(86)【国際出願番号】 EP2021082873
(87)【国際公開番号】W WO2022112357
(87)【国際公開日】2022-06-02
(31)【優先権主張番号】20306430.8
(32)【優先日】2020-11-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】20306431.6
(32)【優先日】2020-11-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523195050
【氏名又は名称】プロジュライフ
(71)【出願人】
【識別番号】515121759
【氏名又は名称】ユニベルシテ ドゥ モンペリエ
(71)【出願人】
【識別番号】501089863
【氏名又は名称】サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェ サイアンティフィク
(71)【出願人】
【識別番号】523193089
【氏名又は名称】エコール ナショナル スーペリウール ドゥ シミ ドゥ モンペリエ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】ピエール コー
(72)【発明者】
【氏名】エリック デソー
(72)【発明者】
【氏名】ミュリエル アンブラール－コーシル
(72)【発明者】
【氏名】パスカル ベルディ
(72)【発明者】
【氏名】ジル シュブラ
(72)【発明者】
【氏名】アレクサンドル ドゥフー
(72)【発明者】
【氏名】クレール ナバーロ
(72)【発明者】
【氏名】ソフィ ペラン
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA23
4C084CA59
4C084NA14
4C084ZA89
4C084ZA96
4C084ZB21
4C084ZC01
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA12
4H045BA13
4H045BA14
4H045BA15
4H045EA20
4H045FA20
(57)【要約】
本発明は、以下の式（Ｉ）の化合物に関し：
特に、個人の疾患を予防又は治療する方法における使用のための化合物、
より詳しくは、プロジェリン又はプレラミンＡと関連している疾患を予防又は治療するための化合物に関する。
より詳しくは、プロジェリン又はプレラミンＡと関連している疾患を予防又は治療するための化合物に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の式（Ｉ）の化合物であって、【化1】
Ｒ０は、アルデヒド基又は保護されたアルデヒド基を表し；
Ｒ２、Ｒ４及びＲ６は、同一又は異なって、ｎ＝２の時、当該２つのＲ４基が同一又は異なってもよいという条件で、
Ｈ；
任意に、１又は複数のアミノ基又はカルボン酸基で置換されている、１～６の炭素原子を有するアルキル基；
又は、任意に１又は複数のアミノ基、ヒドロキシル基又はカルボン酸基で置換されている、５～１０の炭素原子を有するアルカリル基又はアリール基を表し；
Ｒ１、Ｒ３及びＲ５は、同一又は異なって、ｎ＝２の時、当該２つのＲ３基が同一又は異なってもよいという条件で、Ｈ、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）官能基、ロイシン（Ｌｅｕ， Ｌ）官能基、ノルロイシン（Ｎｌｅ）官能基、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）官能基、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）官能基、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）官能基、ノルバリン（Ｎｖａ）官能基、又はチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）官能基を表し；そして、
Ｒ７は以下を表す：
保護基又は
以下の式（ＩＩ）の基であって：
【化2】
Ｒ９、Ｒ１１ 及びＲ１３は、同一又は異なって、ｎ＝２の時、当該２つのＲ１１基が同一又は異なってもよいという条件で、
Ｈ；任意に、１又は複数のアミノ基又はカルボン酸基で置換されている、１～６の炭素原子を有するアルキル基；又は、任意に１又は複数のアミノ基、ヒドロキシル基又はカルボン酸基で置換されている、５～１０の炭素原子を有するアルカリル基又はアリール基を表し；
Ｒ１０、Ｒ１２及びＲ１４は、同一又は異なって、ｎ＝２の時、当該２つのＲ１２基が同一又は異なってもよいという条件で、Ｈ、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）官能基、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）官能基、ノルロイシン（Ｎｌｅ）官能基、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）官能基、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）官能基、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）官能基、ノルバリン（Ｎｖａ）官能基、又はチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）官能基を表し；
Ｒ８は、結合部分を表し：そして、
Ｒ１５は、アルデヒド基又は保護されたアルデヒド基を表し、ｎ＝１である場合は、Ｒ０は、アルデヒド基、Ｒ２、Ｒ４及びＲ６はすべてＨを表し、Ｒ７は、Ｚ保護基であり、そして、Ｒ３及びＲ５の両方は、ロイシン官能基を表し、その時、Ｒ１は、ロイシン官能基、ノルバリン官能基、フェニルアラニン官能基を表さない、式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項2】
以下の群：【化3】
【化4】
【化5】
【化6】
【請求項3】
疾患、特に、プロジェリン又はプレラミンＡに関連する疾患を予防又は治療する方法に使用するための請求項１又は請求項２に記載の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容されるその塩。
【請求項4】
前記方法は、プロジェリン又はプレラミンＡの個人の細胞濃度を低下する、請求項３に記載の使用のための、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容されるその塩。
【請求項5】
前記疾患が、部分的早老症である、請求項３又は請求項４に記載の使用のための、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容されるその塩。
【請求項6】
前記疾患が、早老症、特にハッチンソン・ギルフォード・早老性症候群（ＨＧＰＳ）、ＨＧＰＳ様症候群、拘束性皮膚障害、下顎骨端異形成症Ｂ型（ｍａｎｄｉｂｕｌｏａｃｒａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ ｔｙｐｅ Ｂ）、異常早老性症候群（ａｎ ａｔｙｐｉｃａｌ ｐｒｏｇｅｒｏｉｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、異常ウェルナー症候群、及び
Ｎeｓｔｏｒ－Ｇｕｉｌｌｅｒｍｏ早老性症候群からなる群より選択される、請求項３～請求項５のいずれか１項に記載の使用のための、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容されるその塩。
【請求項7】
前記疾患が、早老症又はハッチンソン・ギルフォード・早老性症候群（ＨＧＰＳ）である、請求項３～請求項６のいずれか１項に記載の使用のための、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容されるその塩。
【請求項8】
請求項１又は２に記載の式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含み、任意に、薬学的に許容されるキャリア又は賦形剤を伴う、医薬品組成物。
【請求項9】
疾患の予防又は治療のための方法における使用のための、請求項８に記載の医薬品組成物。
【請求項10】
前記疾患が、プロジェリン又はプレラミンＡに関連する、請求項９に記載の使用のための医薬品組成物。
【請求項11】
前記方法は、プロジェリン又はプレラミンＡの個人の細胞濃度を低下する、請求項９又は請求項１０に記載の使用のための医薬品組成物。
【請求項12】
前記疾患が、部分的早老症である、請求項９～請求項１１のいずれか１項に記載の使用のための医薬品組成物。
【請求項13】
前記疾患が、早老症、特にハッチンソン・ギルフォード・早老性症候群（ＨＧＰＳ）、ＨＧＰＳ様症候群、拘束性皮膚障害、下顎骨端異形成症Ｂ型（ｍａｎｄｉｂｕｌｏａｃｒａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ ｔｙｐｅ Ｂ）、異常早老性症候群（ａｎ ａｔｙｐｉｃａｌ ｐｒｏｇｅｒｏｉｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、異常ウェルナー症候群、及び
Ｎeｓｔｏｒ－Ｇｕｉｌｌｅｒｍｏ早老性症候群からなる群より選択される、請求項９～請求項１２のいずれか１項記載の使用のための医薬品組成物。
【請求項14】
前記疾患が、早老症又はハッチンソン・ギルフォード・早老性症候群（ＨＧＰＳ）である、請求項９～請求項１３のいずれか１項に使用のための医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、部分的早老症の治療に有用な新規化合物及びそのような疾患の治療に対するそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
部分的早老性症候群は、核膜の組織化、並びに核質内の核マトリックスの組織化及び機能を制御するタンパク質の変異と関連する。部分的早老性症候群において変異が生じたタンパク質は、ラミンＡ／Ｃがコード化されたＬＭＮＡ、核膜内のそれらのタンパク質パートナー、及びＬＭＮＡ遺伝子産物の翻訳後処理に関与するタンパク質である。
【0003】
部分的早老性症候群の中で、早老症又はハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群（ＨＧＰＳ； ＯＭＩＭ ＃１７６６７０）は、４～８００万人に１人の子どもに生じる希少な遺伝的障害であり、成長障害、極めて薄い肌、皮下脂肪の減少、脱毛症、骨粗鬆症、心臓病及びアテローム性動脈硬化症を含む、通常の大人の老化に似た症状を伴い、短縮された寿命及び約１３．５歳での死をもたらす。
【0004】
この症候群は、ラミンＡをコードするＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１１内のｄｅ ｎｏｖｏミスセンス点突然変異ｃ．１８２４ Ｃ＞Ｔによって引き起こされる。この変異は、カルボキシ末端の球状ドメインで５０アミノ酸の欠損をもたらすエクソン１１内の潜在的なドナースプライス部位（ｃｒｙｐｔｉｃ ｄｏｎｏｒ ｓｐｌｉｃｅ ｓｉｔｅ）を活性化し、プロジェリンと呼ばれるプレラミンＡの６０７－６５６残基を欠損した切り詰めされたタンパク質をもたらす。しかし、プロジェリンはファルネシル化の標的であるＣ－末端のＣＡＡＸボックスを保持している。ＺＭＰＴＥ２４のエンドタンパク質分解の切断部位が失われているため、切り詰め型ラミン／プロジェリンは永久にファルネシル化される。
【0005】
ラミンＡ／Ｃは、Ｂ型ラミンとともに、核内膜の基礎にある繊維状のネットワークである核ラミナの主要構成要素である。このように、細胞レベルでは、ＨＧＰＳ早老症は、核膜構造の劇的な欠陥、核形状の大規模な変化、小疱形成、「ヘルニア」、核の一方の極からいくつかの内部核膜（ＩＮＭ）タンパク質の喪失、及び根底にあるヘテロクロマチンの破壊によって特徴づけられる。ラミンＡは核内マトリックスの構成要素でもあることから、ＨＧＰＳ患者細胞におけるその変化は、核小体、スペックル、及び核内構造体などの核機能領域の分布及び／又は構造構成に影響を及ぼすかもしれない。核マトリックス組成の異常は、ＤＮＡ修復からＲＮＡの転写やスプライシングに至るまで、ゲノムの不安定化をもたらすＤＮＡやＲＮＡの代謝段階における欠損をももたらす。核の代謝異常、並びに細胞周期、代謝経路、細胞コンパートメント機能へのその影響は、細胞の老化につながる。
【0006】
プレラミンＡの成熟に影響を与える他のＬＭＮＡ変異は、ＨＧＰＳ様早老性症候群をもたらし、その重症度は生成されたプロジェリン／プレラミンＡアイソフォーム量に本質的に依存する（Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙら（２０１５）．Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２３（８）： １０５１－１０６１）．また、周産期致死性の遺伝性皮膚症である拘束性皮膚障害（ＲＤ）と、比較的軽度の早老性症候群であるＢ型下顎骨端異形成症（ｔｙｐｅ Ｂ ｍａｎｄｉｂｕｌｏａｃｒａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）の２つの他の症候群は、プレラミンＡの病理的蓄積に関連しており、主にＺＭＰＳＴＥ２４の変異に起因する。さらに、ＨＧＰＳや他のプレラミンＡ関連疾患と臨床的特徴が重なるいくつかの異常早老性症候群（ａｔｙｐｉｃａｌ ｐｒｏｇｅｒｏｉｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ＡＰＳ）又は異常ウェルナー症候群（ａｔｙｐｉｃａｌ Ｗｅｒｎｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ＡＷＳ）は、ＬＭＮＡ遺伝子のミスセンス変異と関連している（Ｇｒｅｌｅｔ ｅｔ ａｌ． （２０１９）．そのほか、Ｎｅｓｔｏｒ－Ｇｕｉｌｌｅｒｍｏ早老性症候群は、ラミンＡやエメリンの核内タンパク質パートナーで、そして、クロマチンと核膜をつなぐ、ＢＡＦをコードするＢＡＮＦ１の変異によって起こる他の早老性疾患である（Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ａ １５５Ａ： ２６１７－２６２５）。
【0007】
近年、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）であるロナファルニブが、ハッチンソン－ギルフォード早老性症候群による死亡リスクの低減、および特定の処理不全早老性ラミノパチー（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｇｅｒｏｉｄ ｌａｍｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）の治療に対して、米国連邦医薬品局（ＦＤＡ）に承認された。実際、ロナファルニブ治療は、プロジェリア患者の死亡率低下と関連することが示されている（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ． （２０１８） ＪＡＭＡ ３１９： １６８７－１６９５）。しかしながら、インスリン抵抗性、脂肪異栄養症、関節拘縮、皮膚など、本疾患のいくつかの側面は、本治療によって改善されない（Ｇｏｒｄｏｎら（２０１２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０９：１６６６６－１６６７１）。
【0008】
そのため、部分的早老性症候群の代替治療のニーズが依然として存在する。
【発明の概要】
【0009】
本発明者らは、最近、ＨＰＧＳ個人の細胞中のプロジェリンレベルを低下させるのに有効である新規化合物を合成した。
【0010】
従って、本発明は、下記式（Ｉ）の化合物：
ｎは、０、１、又は２を表し；
Ｒ０は、アルデヒド基又は保護されたアルデヒド基を表し；
Ｒ２、Ｒ４及びＲ６は、同一又は異なって、ｎ＝２の時、当該２つＲ４基が同一又は異なってもよいという条件で、
Ｈ（水素原子）；
任意に、１又は複数のアミノ基又はカルボン酸基で置換されている、１～６の炭素原子を有するアルキル基；
又は、任意に１又は複数のアミノ基、ヒドロキシル基又はカルボン酸基で置換されている、５～１０の炭素原子を有するアルカリル基又はアリール基を表し；
特に、イソブチル基、イソペンチル基、フェニルエチル基またはヒドロキシフェニルエチル基を表し；
Ｒ１、Ｒ３ 及びＲ５は、同一又は異なって、ｎ＝２の時、当該２つのＲ３基が同一又は異なってもよいという条件で、
Ｈ（水素原子）、アルギニン（Ａｒｇ， Ｒ）官能基、ロイシン（Ｌｅｕ， Ｌ）官能基、ノルロイシン（Ｎｌｅ）官能基、 メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）官能基、 フェニルアラニン（Ｐｈｅ， Ｆ）官能基、 バリン（Ｖａｌ、Ｖ）官能基、 ノルバリン（Ｎｖａ）官能基、又はチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）官能基を表し；そして、
Ｒ７は以下を表す：
保護基又は
以下の式（ＩＩ）の基であって：
ここで、ｍは、０、１、又は２を表し；
Ｒ９、Ｒ１１ 及びＲ１３は、同一又は異なって、ｎ＝２の時、当該２つのＲ１１基が同一又は異なってもよいという条件で、
Ｈ（水素原子）；
任意に、１又は複数のアミノ基又はカルボン酸基で置換されている、１～６の炭素原子を有するアルキル基；
又は、任意に１又は複数のアミノ基、ヒドロキシル基又はカルボン酸基で置換されている、５～１０の炭素原子を有するアルカリル基又はアリール基；
特に、イソブチル基、イソペンチル基、フェニルエチル基またはヒドロキシフェニルエチル基を表し；
Ｒ１０、Ｒ１２ 及びＲ１４は、同一又は異なって、ｎ＝２の時、当該２つのＲ１２基が同一又は異なってもよいという条件で、
Ｈ（水素原子）、アルギニン（Ａｒｇ， Ｒ）官能基、ロイシン（Ｌｅｕ， Ｌ）官能基、ノルロイシン（Ｎｌｅ）官能基、 メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）官能基、 フェニルアラニン（Ｐｈｅ， Ｆ）官能基、 バリン（Ｖａｌ、Ｖ）官能基、 ノルバリン（Ｎｖａ）官能基、又はチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）官能基を表し；
Ｒ８は、リンカー部分を表し：そして、
Ｒ１５は、アルデヒド基又は保護されたアルデヒド基を表し：
又はその薬学的に許容される塩に関する。
【化1】
Ｒ０は、アルデヒド基又は保護されたアルデヒド基を表し；
Ｒ２、Ｒ４及びＲ６は、同一又は異なって、ｎ＝２の時、当該２つＲ４基が同一又は異なってもよいという条件で、
Ｈ（水素原子）；
任意に、１又は複数のアミノ基又はカルボン酸基で置換されている、１～６の炭素原子を有するアルキル基；
又は、任意に１又は複数のアミノ基、ヒドロキシル基又はカルボン酸基で置換されている、５～１０の炭素原子を有するアルカリル基又はアリール基を表し；
特に、イソブチル基、イソペンチル基、フェニルエチル基またはヒドロキシフェニルエチル基を表し；
Ｒ１、Ｒ３ 及びＲ５は、同一又は異なって、ｎ＝２の時、当該２つのＲ３基が同一又は異なってもよいという条件で、
Ｈ（水素原子）、アルギニン（Ａｒｇ， Ｒ）官能基、ロイシン（Ｌｅｕ， Ｌ）官能基、ノルロイシン（Ｎｌｅ）官能基、 メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）官能基、 フェニルアラニン（Ｐｈｅ， Ｆ）官能基、 バリン（Ｖａｌ、Ｖ）官能基、 ノルバリン（Ｎｖａ）官能基、又はチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）官能基を表し；そして、
Ｒ７は以下を表す：
保護基又は
以下の式（ＩＩ）の基であって：
【化2】
Ｒ９、Ｒ１１ 及びＲ１３は、同一又は異なって、ｎ＝２の時、当該２つのＲ１１基が同一又は異なってもよいという条件で、
Ｈ（水素原子）；
任意に、１又は複数のアミノ基又はカルボン酸基で置換されている、１～６の炭素原子を有するアルキル基；
又は、任意に１又は複数のアミノ基、ヒドロキシル基又はカルボン酸基で置換されている、５～１０の炭素原子を有するアルカリル基又はアリール基；
特に、イソブチル基、イソペンチル基、フェニルエチル基またはヒドロキシフェニルエチル基を表し；
Ｒ１０、Ｒ１２ 及びＲ１４は、同一又は異なって、ｎ＝２の時、当該２つのＲ１２基が同一又は異なってもよいという条件で、
Ｈ（水素原子）、アルギニン（Ａｒｇ， Ｒ）官能基、ロイシン（Ｌｅｕ， Ｌ）官能基、ノルロイシン（Ｎｌｅ）官能基、 メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）官能基、 フェニルアラニン（Ｐｈｅ， Ｆ）官能基、 バリン（Ｖａｌ、Ｖ）官能基、 ノルバリン（Ｎｖａ）官能基、又はチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）官能基を表し；
Ｒ８は、リンカー部分を表し：そして、
Ｒ１５は、アルデヒド基又は保護されたアルデヒド基を表し：
又はその薬学的に許容される塩に関する。
【0011】
好ましい実施形態において、本発明は、ｎ＝１である場合は、Ｒ０は、アルデヒド基、Ｒ２， Ｒ４及びＲ６はすべてＨ（水素原子）を表し、Ｒ７は、Ｚ保護基であり、そして、Ｒ３及びＲ５の両方は、ロイシン官能基を表し、その時、Ｒ１は、ロイシン官能基、ノルバリン官能基、フェニルアラニン官能基を表さない、上記で定義された式（Ｉ）の化合物に関する。
【0012】
他の好ましい実施形態において、本発明は、上記の式（I）の化合物に関するが、ただし以下のものとは異なる：
【化3】
【0013】
本発明はまた、医薬品としての使用、または疾患、特に個体におけるプロジェリンまたはプレラミンＡに関連する疾患を予防または治療するための方法における使用のための、上で定義された式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩に関する。
【0014】
本発明はまた、疾患、特に個人におけるプロジェリンまたはプレラミンＡに関連する疾患の予防または治療を意図した医薬品の製造のための、上記で定義された式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容できる塩の使用に関する。
【0015】
本発明はまた、任意に少なくとも１つの薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を伴って、好ましくは、疾患、特に個人におけるプロジェリンまたはプレラミンＡに関連する疾患の予防または治療方法における使用のための、有効成分として、上記で定義された式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む医薬品組成物に関する。
【0016】
本発明はまた、疾患、特に固体におけるプロジェリンまたはプレラミンＡに関連する疾患の予防または治療のための方法であって、上記で定義した式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、または上記で定義した医薬組成物の有効量を当該個体に投与することを含む方法に関する。
【0017】
（発明の詳細な説明）
本明細書で意図されるように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」又は「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」と同義である。主題物が１つ又はいくつかの特徴を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）と言われる場合、言及された特徴以外の特徴も主題物に含まれ得ることを意味する。逆に、「から構成される（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｏｆ）」という表現は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」と同義である。ある主題が１つまたはいくつかの特徴からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）と言われる場合、言及された特徴以外の特徴がその主題に含まれないことを意味するものである。
本明細書で意図されるように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」又は「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」と同義である。主題物が１つ又はいくつかの特徴を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）と言われる場合、言及された特徴以外の特徴も主題物に含まれ得ることを意味する。逆に、「から構成される（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｏｆ）」という表現は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」と同義である。ある主題が１つまたはいくつかの特徴からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）と言われる場合、言及された特徴以外の特徴がその主題に含まれないことを意味するものである。
【0018】
化合物
式（Ｉ）の化合物は、当業者によって、特に固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって容易に合成することができる。
式（Ｉ）の化合物は、当業者によって、特に固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって容易に合成することができる。
【0019】
ペプチドのＮ末端を保護するための保護基は当業者によく知られており、そして、任意のそのような保護基を本発明に従って使用されてもよい。しかしながら、本発明による保護基は、カルボキシベンジル（ＺまたはＣｂｚ）、アセチル（Ａｃ）、ジクロロベンジル、ピラジニルカルボニル、ジフルオロフェニルからなる群から選択されることが好ましい。
【0020】
本明細書で意図されるように、アルデヒド基は、以下の式：
の基である。
【化4】
【0021】
保護されたアルデヒド基は、当業者によく知られており、そして、任意のそのような保護されたアルデヒド基を本発明に従って使用されてもよい。しかしながら、本発明による保護されたアルデヒド基は、アミド、カルボン酸、セミカルバゾン、イミン、オキシム、ヒドラゾン、重亜硫酸ナトリウムおよびチアゾリジンからなる群から選択されることが好ましい。
より好ましくは、本発明による前記保護されたアルデヒド基は、以下の式で表される基から選択される：
ここで、Ｒ’０はＨ（水素原子）又は１～１００の炭素原子、好ましくは、１～５０の炭素原子であり、そして、より好ましくは、１～２０の炭素原子を含む基を表す。
Ｒ’０が１～２０、５０または１００個の炭素原子を含む基を表す場合、それは好ましくは極性基またはポリマーライゲーション基である。最も好ましくは、本発明による保護されたアルデヒド基は、以下の式で表される：
より好ましくは、本発明による前記保護されたアルデヒド基は、以下の式で表される基から選択される：
【化5】
Ｒ’０が１～２０、５０または１００個の炭素原子を含む基を表す場合、それは好ましくは極性基またはポリマーライゲーション基である。最も好ましくは、本発明による保護されたアルデヒド基は、以下の式で表される：
【化6】
【0022】
本明細書で意図されるように、リンカー部分は、２つのアミン基を架橋することができる任意の基を意味する。好ましくは、当該リンカー部分は、３～２０の炭素原子を有し、そして、少なくとも２のカルボン酸基を含む。当業者にとって明らかであるとおり、前記好ましいリンカー部分の２つのカルボン酸基は、２つのアミン基と、アミド結合を形成し、当該リンカー部分は架橋をしている。より好ましくは、前記リンカー部分は、前記２つのアミン基を架橋している時は、以下の式を持っている基から選択される：
【化7】
【0023】
当業者にとって明らかである通り、Ｒ７が式（ＩＩ）の基を表すとき、前記式（Ｉ）の化合物は、以下の式（ＩＩＩ）で表せられ得る：
【化8】
【0024】
好ましくは、本発明による式(I)の化合物は、以下の群からなる基から選択される：
【化9】
【化10】
【化11】
【化12】
【0025】
疾患
本明細書で意図されるように、プレラミンＡまたはプロジェリンに関連する疾患は、プレラミンＡまたはプロジェリン、すなわちプレラミンＡのファルネシル化切り詰め型、特に残基６０７－６５６を欠く形態の細胞蓄積によって引き起こされる疾患に関する。
本明細書で意図されるように、プレラミンＡまたはプロジェリンに関連する疾患は、プレラミンＡまたはプロジェリン、すなわちプレラミンＡのファルネシル化切り詰め型、特に残基６０７－６５６を欠く形態の細胞蓄積によって引き起こされる疾患に関する。
【0026】
好ましくは、本発明による疾患は、部分的早老症、特にラミンＡ／ＣをコードするＬＭＮＡに関連し、より好ましくは、早老症、ハッチンソン・ギルフォード・早老性症候群（ＨＧＰＳ）、ＨＧＰＳ様症候群、拘束性皮膚障害、下顎骨端異形成症Ｂ型（ｍａｎｄｉｂｕｌｏａｃｒａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ ｔｙｐｅ Ｂ）、異常早老性症候群（ａｎ ａｔｙｐｉｃａｌ ｐｒｏｇｅｒｏｉｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、異常ウェルナー症候群、及びＮeｓｔｏｒ－Ｇｕｉｌｌｅｒｍｏ早老性症候群からなる群より選択される。より好ましくは、本発明に関する前記疾患は、早老症又はハッチンソン・ギルフォード・早老性症候群（ＨＧＰＳ）である。
【0027】
治療
好ましくは、本発明による方法は、プロジェリンまたはプレラミンＡの個人の細胞内濃度を減少させる。
好ましくは、本発明による方法は、プロジェリンまたはプレラミンＡの個人の細胞内濃度を減少させる。
【0028】
「減少」は、本発明による方法が個人に適用される前の状況を基準として定義される。タンパク質の細胞内濃度を決定するための多数の方法は、当業者に知られている。例として、個人から得られた生検材料の細胞抽出物に対してＥＬＩＳＡアッセイを実施することができる。間接的には、定量的ＲＴ－ＰＣＲによって、タンパク質をコードするｍＲＮＡの濃度を決定することも可能である。
【0029】
個人
好ましくは、上記で定義された個人は、ヒトである。好ましくは、上記で定義された個人は、プロジェリンまたはプレラミンＡに関連する疾患、特に早老症またはＨＧＰＳに罹患するリスクがあるか、または罹患している。
好ましくは、上記で定義された個人は、ヒトである。好ましくは、上記で定義された個人は、プロジェリンまたはプレラミンＡに関連する疾患、特に早老症またはＨＧＰＳに罹患するリスクがあるか、または罹患している。
【0030】
医薬品組成物
本発明による式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩は、少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルまたは賦形剤を含むことができる医薬組成物中に含まれ得る。薬学的に許容されるビヒクルまたは賦形剤は、分散剤、可溶化剤、ネブライザー、安定剤、防腐剤などから選択することができる。その上、製剤、特に液体及び／又は注射剤に使用されることができる薬学的に許容されるビヒクル又は賦形剤は、好ましくは、スクロース、ラクトース、デンプン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、クロスカルメロースナトリウム、ラクトース一水和物、マグネシウムステアレート、微結晶セルロース、ポビドン、ラウリル硫酸ナトリウム、マンニトール、ゼラチン、ラクトース、植物油、アカシアガム、リポソーム等から選択される。
本発明による式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩は、少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルまたは賦形剤を含むことができる医薬組成物中に含まれ得る。薬学的に許容されるビヒクルまたは賦形剤は、分散剤、可溶化剤、ネブライザー、安定剤、防腐剤などから選択することができる。その上、製剤、特に液体及び／又は注射剤に使用されることができる薬学的に許容されるビヒクル又は賦形剤は、好ましくは、スクロース、ラクトース、デンプン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、クロスカルメロースナトリウム、ラクトース一水和物、マグネシウムステアレート、微結晶セルロース、ポビドン、ラウリル硫酸ナトリウム、マンニトール、ゼラチン、ラクトース、植物油、アカシアガム、リポソーム等から選択される。
【0031】
投与
式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩又は上記で定義される医薬組成物は、経口、非経口、粘膜性または皮膚性で投与されてもよい。非経口経路は、好ましくは、皮下、静脈内、筋肉内または腹腔内投与を含むが、後者はむしろ動物に留保される。粘膜経路は、好ましくは、鼻腔内投与、口腔咽頭投与、肺内投与又は直腸粘膜を介した投与を含む。皮膚経路は、有利には、経皮経路、特に経皮デバイス、典型的にはパッチを介した経路を含む。
式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩又は上記で定義される医薬組成物は、経口、非経口、粘膜性または皮膚性で投与されてもよい。非経口経路は、好ましくは、皮下、静脈内、筋肉内または腹腔内投与を含むが、後者はむしろ動物に留保される。粘膜経路は、好ましくは、鼻腔内投与、口腔咽頭投与、肺内投与又は直腸粘膜を介した投与を含む。皮膚経路は、有利には、経皮経路、特に経皮デバイス、典型的にはパッチを介した経路を含む。
【0032】
本発明による式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩又は上記で定義された医薬組成物は、注射液または懸濁液、ゲル、オイル、錠剤、座薬、粉末、ゲルカプセル、カプセル、エアゾールなどの形態で、任意にガレノス製剤または徐放性および／または遅延放出をもたらすデバイスによって処方されてもよい。このタイプの製剤には、セルロース、炭酸塩、デンプン、または承認されたバイオポリマー（例えばＰＥＧ、キトサン、ヒアルロン酸ポリマー）のような薬剤が有利に使用される。バイオポリマーと薬物のコンジュゲートで構成されたガレノス形態は、封入後にさらに静脈注射される患者の赤血球に封入することができ、それにより薬物放出の徐放及び／又は遅延が可能となる。
【0033】
本発明による式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩または上記で定義された医薬組成物は、上記で定義された個人に、上記で定義された式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の０．１ｍｇ～１０００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ～１００ｍｇ、より好ましくは１ｍｇ～１００ｍｇを投与されてもよい。もちろん、当業者は、治療される個人の体重または体表面積に応じて、上記で定義された式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の用量を調整してもよい。好ましくは、本発明による式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の用量範囲は、０．１ｍｇ／日～１０００ｍｇ／日、好ましくは０．１ｍｇ／日～１００ｍｇ／日、より好ましくは１ｍｇ／日～１００ｍｇ／日の間である。
【0034】
本発明は、以下の非制限的な実施例によりさらに明確に述べられる。
【実施例】
【0035】
実施例１―４
以下の化合物を合成した：
代表的な化合物の合成は以下で詳述する。
以下の化合物を合成した：
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0036】
一般的な方法
すべてのペプチジルアルデヒドは、Ｗｅｉｎｒｅｂ ａｍｉｄｅ結合リンカー（Ｎ－Ｆｍｏｃ－Ｎ－メトキシ－３－アミノプロピオン酸）を用いて固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により調製した。リチウムアルミニウムによるこのアミドの還元は、ペプチジルアルデヒドをもたらす（Ｆｅｈｒｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔ． ３６， １４３， ７８７１－７８７４ （１９９５））。２の異なるレジンを使用している：ＳＰＰＳ工程の前に合成したＦｍｏｃ－Ｎ－メトキシ－３－アミノプロピオン酸で機能化した、メルク社で購入した市販のワインレブＡＭレジンと、アジレント・テクノロジー社で購入したＲＡＭ ａｍｐｈｉｓｐｈｅｒｅレジン。異なるＮ－保護基およびアミノ酸を有するペプチジルアルデヒドを、実施例１および２で定義したとおりに調製した。ペプチド－ペプトイドハイブリッドを実施例３で示した手順に従って調製し、そして、ペプチジルアルデヒドのダイマーを実施例４に従って調製した。すべての化合物をプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ １Ｈ）によって特徴付け、そして、それらの純度は質量分析（ＭＳ）に結合した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定した。
すべてのペプチジルアルデヒドは、Ｗｅｉｎｒｅｂ ａｍｉｄｅ結合リンカー（Ｎ－Ｆｍｏｃ－Ｎ－メトキシ－３－アミノプロピオン酸）を用いて固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により調製した。リチウムアルミニウムによるこのアミドの還元は、ペプチジルアルデヒドをもたらす（Ｆｅｈｒｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔ． ３６， １４３， ７８７１－７８７４ （１９９５））。２の異なるレジンを使用している：ＳＰＰＳ工程の前に合成したＦｍｏｃ－Ｎ－メトキシ－３－アミノプロピオン酸で機能化した、メルク社で購入した市販のワインレブＡＭレジンと、アジレント・テクノロジー社で購入したＲＡＭ ａｍｐｈｉｓｐｈｅｒｅレジン。異なるＮ－保護基およびアミノ酸を有するペプチジルアルデヒドを、実施例１および２で定義したとおりに調製した。ペプチド－ペプトイドハイブリッドを実施例３で示した手順に従って調製し、そして、ペプチジルアルデヒドのダイマーを実施例４に従って調製した。すべての化合物をプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ １Ｈ）によって特徴付け、そして、それらの純度は質量分析（ＭＳ）に結合した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定した。
【0037】
すべてのＦｍｏｃ－アミノ酸誘導体および（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシド ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）はＩｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨから購入した。ピペリジン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリルおよび１，２－ジクロロエタン（ＤＣＥ）はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈより提供された。Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＡｍｐｈｉＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）４０ ＲＡＭ ０．３９ｍｍｏｌ／ｇ ７５－１５０μｍレジンは、アジレント・テクノロジー社から購入した。ＨＰＬＣおよびＬＣＭＳに使用したすべての溶媒は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから勾配グレードまたは試薬の品質で購入した。すべての最終化合物は逆相ＨＰＬＣで精製し、そして、ＬＣ－ＭＳで当該純度を評価した。
【0038】
ＬＣ－ＭＳ分析用のサンプルは、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル／水混合液（５０：５０、ｖ／ｖ）で調製した。当該ＬＣ－ＭＳシステムは、Ｗａｔｅｒ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ分光計（エレクトロスプレーイオン化モード、ＥＳＩ＋）と結合したＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５ ＨＰＬＣで構成されていた。すべての分析は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｏｎｙｘ逆相カラム（２５ｘ４．６ｍｍ）を使用して実施した。流速３ｍＬ／分、２．５分かけてＢを０％から１００％まで勾配を使用した。溶離液Ａ：水／０．１％ギ酸；溶離液Ｂ：アセトニトリル／０．１％ギ酸。ＵＶ検出は２１４ｎｍで行った。正イオンエレクトロスプレーマススペクトルは、溶媒流速１００～５００μＬ／分で取得した。窒素をネブライジングガス及び乾燥ガスの両方に使用した。当該データは０．１秒間隔のスキャンモードで取得し、１０のスキャンを合計して最終スペクトルを得た。
【0039】
Ｆｍｏｃ－Ｎ－メトキシ－３－アミノプロピオン酸の合成
ベンジル３－アミノ－Ｎ－メトキシプロパノエイトの調製
３．３４ｇ（４０ｍｍｏｌ）メトキシルアミン塩酸塩を１００ｍＬのアセトニトリル及び１３ｍＬのＤＩＥＡ（８０ｍｍｏｌ）に溶解した。その後、３．０４ｍＬのベンジルアクリレート（２０ｍｍｏｌ）を添加した。前記混合物を還流で２０時間攪拌した。その後、当該溶媒を減圧下で濃縮して乾燥させ、そして、酢酸エチルを添加した。得られた有機溶液を水で２回、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の飽和溶液で１回洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、そして、減圧下で濃縮して、粗収率７６％のわずかに茶色の油状物３．２ｇを得た。
ベンジル３－アミノ－Ｎ－メトキシプロパノエイトの調製
３．３４ｇ（４０ｍｍｏｌ）メトキシルアミン塩酸塩を１００ｍＬのアセトニトリル及び１３ｍＬのＤＩＥＡ（８０ｍｍｏｌ）に溶解した。その後、３．０４ｍＬのベンジルアクリレート（２０ｍｍｏｌ）を添加した。前記混合物を還流で２０時間攪拌した。その後、当該溶媒を減圧下で濃縮して乾燥させ、そして、酢酸エチルを添加した。得られた有機溶液を水で２回、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の飽和溶液で１回洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、そして、減圧下で濃縮して、粗収率７６％のわずかに茶色の油状物３．２ｇを得た。
【0040】
ベンジル３－アミノ－Ｎ－Ｆｍｏｃ－Ｎ－メトキシ－プロパノエイトの調製
水（２０ｍＬ）中の３．２ｇの３－アミノ－Ｎ－メトキシプロパノエイト（１５ｍｍｏｌ）に、２．０８５ｍＬのトリエチルアミン（１５ｍｍｏｌ， １ｅｑ．）と１５ｍＬのジオキサンに可溶なｌ３．４８ｇのＦｍｏｃ－Ｃ（１３．５ｍｍｏｌ，０．９ｅｑ．）を加えた。室温で２時間撹拌した後、酢酸エチル（１００ｍＬ）を加え、そして、得られた溶液を０．１ＭのＨＣｌ、飽和ＫＨＳＯ４および飽和ＮａＣｌの溶液で２回洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、そして真空下で濃縮した。４．８８ｇ（１１．３ｍｍｏｌ）がわずかに茶色のオイルとして得られ（粗収率：７５％）、そして、次の化合物の調製にさらに処理せずに使用した。
水（２０ｍＬ）中の３．２ｇの３－アミノ－Ｎ－メトキシプロパノエイト（１５ｍｍｏｌ）に、２．０８５ｍＬのトリエチルアミン（１５ｍｍｏｌ， １ｅｑ．）と１５ｍＬのジオキサンに可溶なｌ３．４８ｇのＦｍｏｃ－Ｃ（１３．５ｍｍｏｌ，０．９ｅｑ．）を加えた。室温で２時間撹拌した後、酢酸エチル（１００ｍＬ）を加え、そして、得られた溶液を０．１ＭのＨＣｌ、飽和ＫＨＳＯ４および飽和ＮａＣｌの溶液で２回洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、そして真空下で濃縮した。４．８８ｇ（１１．３ｍｍｏｌ）がわずかに茶色のオイルとして得られ（粗収率：７５％）、そして、次の化合物の調製にさらに処理せずに使用した。
【0041】
３－アミノ－Ｎ－Ｆｍｏｃ－メトキシ－プロパン酸の調製
４．８８ｇの３－アミノ－Ｎ－Ｆｍｏｃ－Ｎ－メトキシ－プロパノエイト（１１．３ｍｍｏｌ）を、１０％Ｐｄ／Ｃ触媒の存在下、ＥｔＯＨ（５０ｍＬ）中で室温で２８時間水素添加した。その後、触媒をセライト上での濾過により除去し、そして、得られた溶液を真空下で濃縮して、３．６２ｇ（１０．６１ｍｍｏｌ、粗収率：９４％）のわずかに茶色のオイルを得た。次に、この生成物をフラッシュクロマトグラフィー（移動相としてジクロロメタンおよびメタノール）で精製して、１．８グラム（５．３ｍｍｏｌ）の純粋な３－アミノ－Ｎ－Ｆｍｏｃ－Ｎ－メトキシプロピオン酸（最終収率：２５％）を得た。
４．８８ｇの３－アミノ－Ｎ－Ｆｍｏｃ－Ｎ－メトキシ－プロパノエイト（１１．３ｍｍｏｌ）を、１０％Ｐｄ／Ｃ触媒の存在下、ＥｔＯＨ（５０ｍＬ）中で室温で２８時間水素添加した。その後、触媒をセライト上での濾過により除去し、そして、得られた溶液を真空下で濃縮して、３．６２ｇ（１０．６１ｍｍｏｌ、粗収率：９４％）のわずかに茶色のオイルを得た。次に、この生成物をフラッシュクロマトグラフィー（移動相としてジクロロメタンおよびメタノール）で精製して、１．８グラム（５．３ｍｍｏｌ）の純粋な３－アミノ－Ｎ－Ｆｍｏｃ－Ｎ－メトキシプロピオン酸（最終収率：２５％）を得た。
【0042】
実施例１：Ｗｅｉｎｒｅｂ Ｌｉｎｋｅｒで機能を持たせたＡｍｐｈｉｓｐｈｅｒｅ ＲＡＭレジン上での化合物６（Ｚ－ロイシン－フェニルアラニン－ロイシナール）の調製
２５６ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）のＡｍｐｈｉｓｐｈｅｒｅ ＲＡＭレジン（０．３９ｍｍｏｌ／ｇ．７５－１５０μｍ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）中で１５分間膨潤した。次に、レジンのアミンをＰｉｐ／ＤＭＦ２０％混合液中でそのＦｍｏｃ基から脱保護した（２×５分）。当該レジンをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびＤＣＭで洗浄した。
【化13】
【0043】
１６０ｍｇの３－アミノ－Ｎ－Ｆｍｏｃ－Ｎ－メトキシ－プロパン酸（０．５ｍｍｏｌ、５ｅｑ．）を２ｍＬのＤＭＦに溶解させ、そして、レジンを含むシリンジに添加した。１７０μＬのＤＩＰＥＡ（１０ｅｑ．）と１ｍＬの０．５ＭのＨＡＴＵ（０．５ｍｍｏｌ， ５ｅｑ．）を添加した。当該反応を室温で１時間撹拌した。カイザーテスト（一級アミンの検出）でモニターした反応の完了後、当該レジンをＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。次に、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンでのレジンの処理（２×２．５分）によりＦｍｏｃ保護基を除去し、そして、当該レジンをＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。
【0044】
その後、ＨＡＴＵ／ＤＩＰＥＡをカップリング試薬として用い、Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳによりペプチドをレジン上に伸長させた。アミノ酸カップリングは、アミノ酸溶液（０．５Ｍ）、ＤＩＰＥＡ及びＨＡＴＵ溶液（０．５Ｍ）を用いて行った。１ｍＬのアミノ酸溶液（０．５ｍｍｏｌ、５ｅｑ．）を最初に導入し、次に１８０μＬのＤＩＰＥＡ（１ｍｍｏｌ、１０ｅｑ．）と１ｍＬの０．５ＭのＨＡＴＵ溶液（０．５ｍｍｏｌ，５ｅｑ．）を加えた。前記カップリング反応を２回行い、その後、２０％Ｐｉｐ／ＤＭＦ混合液でＦｍｏｃ基を脱保護した。
その後、当該レジンをDMF及びDCMにより洗浄し、そして乾燥させた。
【表2】
【0045】
次に、レジンを２０ｍＬの無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で適度な攪拌とアルゴンバブリング下、０℃で１５分間膨潤させた。無水ＴＨＦ中の市販の８００μＬの１Ｍ（８ｅｑ．）ＬｉＡｌＨ４をゆっくりと導入し、そして、当該反応を０℃で４５分間撹拌した後、３０ｍＬの５％ＫＨＳＯ４水溶液でクエンチし、そして、１５分間撹拌下に放置した。その後、懸濁液を濾過し、そして、ＤＣＭで洗浄した。次いで、ペプチドアルデヒドを水溶液からＤＣＭで抽出した（４回）。次に、合わせた有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液で１回洗浄し、そして、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。当該溶液を濾過し、そして、前記有機溶媒を減圧下で蒸発させた。４５ｍｇの生成物を得た。Ｚ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－ロイシナールペプチドを、移動相としてアセトニトリル／水０．１％トリフルオロ酢酸を用いる分取逆相液体クロマトグラフィーにより精製した。純度１００％の２５．５ｍｇのＺ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－ロイシナールを得た（収率：５０％）
【0046】
実施例２：市販のＷｅｉｎｒｅｂ Ｒｅｓｉｎ上での化合物４（Ｚ－フェニルアラニン－ロイシン－ロイシナール）の調製。
３７０ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）の市販のＷｅｉｎｒｅｂ Ｒｅｓｉｎ（０．５４ｍｍｏｌ／ｇ、１００～２００μｍ）をＤＣＭ中で１５分間膨潤した。ＤＭＦ中２０％ピペリジンでレジンを処理することによりＦｍｏｃ保護基を除去し（２×２．５分）、そして、レジンをＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。
３７０ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）の市販のＷｅｉｎｒｅｂ Ｒｅｓｉｎ（０．５４ｍｍｏｌ／ｇ、１００～２００μｍ）をＤＣＭ中で１５分間膨潤した。ＤＭＦ中２０％ピペリジンでレジンを処理することによりＦｍｏｃ保護基を除去し（２×２．５分）、そして、レジンをＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。
【0047】
当該ペプチドの伸長は、上述の通り実行した。
【表3】
【0048】
次に、レジンを１５ｍＬの無水ＴＨＦで、適度な攪拌とアルゴンバブリング下、０℃で１５分間膨潤した。無水ＴＨＦ中の市販の１ｍＬ（５ｅｑ）の１ＭのＬｉＡｌＨ４をゆっくりと導入し、そして、当該反応を０℃で３０分間撹拌下に放置した後、１ＭのＫＨＳＯ４水溶液の数滴でクエンチし、そして、１５分間撹拌した。その後、懸濁液を濾過し、ＴＨＦおよび酢酸エチルで洗浄した。当該溶液を酢酸エチルで希釈し、５％ＫＨＳＯ４、１ＭのＮａＨＣＯ３および飽和ＮａＣｌの水溶液で洗浄した後、ＭｇＳＯ４上で乾燥した。当該溶液を濾過し、そして、前記有機溶媒を減圧下で蒸発させた。粗化合物６１ｍｇを得て、そして、アセトニトリル／水０．１％トリフルオロ酢酸を移動相とする分取逆相液体クロマトグラフィーで精製し、純度１００％の表題アルデヒドＺ－Ｆｅ－Ｌｅｕ－ロイシナール（収率：１８％）１８．１６ｍｇを得た。
【0049】
実施例３：市販のＷｅｉｎｒｅｂ Ｒｅｓｉｎ上での化合物１１（Ｚ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｎ（イソペンチルアミン）グリシナール）の調製
２５２ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）の市販のＷｅｉｎｒｅｂ Ｒｅｓｉｎ（０．６２ｍｍｏｌ／ｇ， ７５－１５０μｍ）をＤＣＭ中で１５分間膨潤した。ＤＭＦ中２０％ピペリジンでレジンを処理（２ｘ２．５分）することによりＦｍｏｃ保護基を除去し、そして、当該レジンをＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。前記反応はクロラニルテストでモニターした。
２５２ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）の市販のＷｅｉｎｒｅｂ Ｒｅｓｉｎ（０．６２ｍｍｏｌ／ｇ， ７５－１５０μｍ）をＤＣＭ中で１５分間膨潤した。ＤＭＦ中２０％ピペリジンでレジンを処理（２ｘ２．５分）することによりＦｍｏｃ保護基を除去し、そして、当該レジンをＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。前記反応はクロラニルテストでモニターした。
【0050】
２７８ｍｇ（２ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）のブロモ酢酸を２ｍＬのＤＭＦに可溶化し、そして、レジンを入れたシリンジに導入した。２０８μＬのＮ，Ｎ′－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（２ｍｍｏｌ，１０ ｅｑ．）と１ｍＬの０．２Ｍ（１ｅｑ．）４－ジメチルアミノピリジン （ＤＭＡＰ）を加え、そして、当該懸濁液を１時間撹拌下に放置した。前記反応を、同条件で２回目を繰り返した。前記レジンをＤＭＳＯ、ＤＭＦ、及びＤＣＭで洗浄し、その後、クロラニルテストで２級メトキシルアミンがアシル化されたかどうかを確認した。
【0051】
ＤＭＳＯ中の２ｍＬの１．５Ｍ（１．０ｍｍｏｌ，５ｅｑ．）イソペンチルアミンを前記レジンに加え、そして、前記反応を室温で一晩攪拌した。その後、前記レジンをＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄し、そして、クロラニルテストで２級アミンの存在をモニターした。
【0052】
１ｍＬのＤＭＦ中の１Ｍ（１．０ｍｍｏｌ，５ｅｑ．）Ｂｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ．Ｈ２Ｏをシリンジに加えて、続いて３２０μＬのＤＩＰＥＡ（１０ｅｑ．）と２ｍＬの０．５Ｍ（１．０ｍｍｏｌ，５ｅｑ．）ＨＡＴＵを加えた。前記反応は１時間３０分撹拌した。前記カップリングを、同条件で２回目を繰り返した。当該レジンをＤＭＦとＤＣＭで洗浄し、そして、カイザーテストを実施して反応の完了をモニターした。
【0053】
当該レジンを４ｍＬのＴＦＡ／ＤＣＭ（１／１）で９０分間処理することにより、Ｂｏｃ保護を除去した。その後、当該レジンをイソプロパノール、ＤＭＦ、及びＤＣＭで洗浄した。
【0054】
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の０．５Ｍ（５ｅｑ．）Ｚ－Ｌｅｕ－ＯＨを２０８μＬのＤＩＣ と１５分間反応させた。次に、２ｍＬの０．５Ｍのｏｘｙｍａ ｐｕｒｅ溶液を加え、そして、前記反応混合物をさらに１５分間撹拌して、対応する活性エステルを生成させた。次に、予め活性化したＺ－Ｌｅｕ－ＯＨをレジンに添加し、そして、前記反応を一晩放置した。その後、当該レジンをＤＭＦとＤＣＭで洗浄し、そして、カイザーテストで遊離アミノ基のアシル化をモニターした。
【0055】
Ｗｅｉｎｒｅｂ ａｍｉｄｅ還元は、５ｅｑ．のＬｉＡｌＨ４を用いて前述と同様に実施した。処理後、オイルとして５９ｍｇの粗化合物を得た。
【0056】
分取ＨＰＬＣによる精製の後、１．８ｍｇの純粋Ｚ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｎ（イソペンチルアミン）グリシナールを得た。（収率：２％）
【0057】
実施例４：化合物１４（ダイマー）の調製
当該ペプチジルＦｍｏｃ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－レジンは、実施例１に記載されたように、従来のＳＰＰＳによってＷｅｉｎｒｅｂ Ｌｉｎｋｅｒで機能を持たせたＲＡＭ ａｍｐｈｉｓｐｈｅｒｅ上で調製した。
当該ペプチジルＦｍｏｃ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－レジンは、実施例１に記載されたように、従来のＳＰＰＳによってＷｅｉｎｒｅｂ Ｌｉｎｋｅｒで機能を持たせたＲＡＭ ａｍｐｈｉｓｐｈｅｒｅ上で調製した。
【0058】
次に、０．８ｇのペプチジルレジン（０．２ｍｍｏｌペプチド当量）を、Ｆｍｏｃ除去のためにＰｉｐ／ＤＭＦ ２０：８０混合液２×５分により処理した。次に、レジンをＴＦＡ／ＤＣＭ ５０：５０混合物（６ｍＬ）によって１時間３０分処理した。前記懸濁液を濾過し、そして、ＤＣＭで３回洗浄した。前記有機溶液を減圧下で蒸発させ、そして、当該残留物をエーテル中で沈殿させ、そして、遠心分離した。エーテルを除去し、そして、８６ｍｇの粗化合物を回収した（０．１８ｍｍｏｌ）。当該０．１８ｍｍｏｌのＨ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｗｅｉｎｒｅｂ ａｍｉｄｅを２ｍＬのＤＭＦに溶解した。次に、ｍ－フェニル１６ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ， ０．４５ｅｑ．）酢酸，１６０μＬ（５ｅｑ．）ＤＩＥＰＡおよびＤＭＦ（２．５ｅｑ．）中の０．９ｍＬの０．５ＭのＨＡＴＵを加え、そして、当該溶液を２４時間撹拌した。
【0059】
その後、当該溶液を水で希釈し、そして、当該生成物をＤＣＭで抽出した。有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。次に、当該生成物を分取ＨＰＬＣで精製し、そして、凍結乾燥して、２２ｍｇのタイトルのダイマーを得た。
【0060】
２２ｍｇ（０．００２ｍｍｏｌ）の前記精製物をアルゴンバブリング下で１０ｍＬ無水ＴＨＦに溶解し、そして、１５分間攪拌した。無水ＴＨＦ中の市販の０．６４ｍＬ（１６ｅｑ．）の１MのＬｉＡｌＨ４をゆっくりと導入し、そして、前記反応を０℃で１時間撹拌下に放置した後、１ＭのＫＨＳＯ４水溶液の数滴でクエンチし、１５分間撹拌下に放置し、その後、１ＭのＫＨＳＯ４水溶液の数滴でクエンチし、１５分間攪拌した。当該溶液をＤＣＭで希釈し、そして、有機相を５％のＫＨＳＯ４、飽和ＮａＨＣＯ３および飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、そして、減圧下で蒸発した。４３ｍｇの生成物が得られ、そして、分取ＨＰＬＣで精製して、純度９０％の所望のダイマーペプチド４．１３ｍｇ（収率＝５％）を得た。
【0061】
実施例５：プロジェリンー減少効果
材料と方法
繊維芽細胞培養と処置
継代１８～２４までのＨＧＰＳドナーからの線維芽細胞を、１５％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＤＭＥＭ低グルコース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ， Ｆｒａｎｃｅ）において、５％ＣＯ２を含む湿潤環境下で３７℃において培養した。
材料と方法
繊維芽細胞培養と処置
継代１８～２４までのＨＧＰＳドナーからの線維芽細胞を、１５％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＤＭＥＭ低グルコース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ， Ｆｒａｎｃｅ）において、５％ＣＯ２を含む湿潤環境下で３７℃において培養した。
【0062】
線維芽細胞を、本発明による化合物３、４、６、７、８、１２、１３、１４および１６の存在下で７２時間培養し、４８時間後に更新した。比較化合物１（Ｚ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－ロイシナール）をコントロールとして添加した。すべての分子をＤＭＳＯで１０ｍＭに希釈した。１００μＭ～０．０００１ｎＭの濃度を用いて、９６ウェルプレートで細胞生存率を試験した。薬物効率は６ウェルプレートで評価した。
【0063】
細胞生存率及び毒性の評価
アッセイは９６ウェルマイクロプレートで実施した。処理から７２時間後、当該細胞を１００μＬのＤＰＢＳ（カルシウムなし、マグネシウムなし）で１回洗浄した。その後、ＤＰＢＳで１０％に希釈した１００μｌ ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各ウェルに添加した。プレートは３７℃で３０分間インキュベートした。蛍光強度は、マルチウェルプレートリーダー（Ｇｌｏｍａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ， Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｅｓ ｌｅｓ Ｂａｉｎｓ， Ｆｒａｎｃｅ）で、グリーンフィルター（励起５２５ｎｍ／放出５８０－６４０ｎｍ）を用いて測定した。蛍光強度の値は、Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）にペーストし、用量反応解析を実施した。ＣＶ２５は、ＨＧＰＳ線維芽細胞の生存率が２５％である薬物濃度に相当する。ＣＶ７５は、ＨＧＰＳ線維芽細胞の生存率が７５％である薬物濃度に対応する。
アッセイは９６ウェルマイクロプレートで実施した。処理から７２時間後、当該細胞を１００μＬのＤＰＢＳ（カルシウムなし、マグネシウムなし）で１回洗浄した。その後、ＤＰＢＳで１０％に希釈した１００μｌ ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各ウェルに添加した。プレートは３７℃で３０分間インキュベートした。蛍光強度は、マルチウェルプレートリーダー（Ｇｌｏｍａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ， Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｅｓ ｌｅｓ Ｂａｉｎｓ， Ｆｒａｎｃｅ）で、グリーンフィルター（励起５２５ｎｍ／放出５８０－６４０ｎｍ）を用いて測定した。蛍光強度の値は、Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）にペーストし、用量反応解析を実施した。ＣＶ２５は、ＨＧＰＳ線維芽細胞の生存率が２５％である薬物濃度に相当する。ＣＶ７５は、ＨＧＰＳ線維芽細胞の生存率が７５％である薬物濃度に対応する。
【0064】
タンパク質抽出
全繊維芽細胞タンパク質は、１Ｘプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む１００μＬのＮＰ４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での７２時間処理後に抽出した。ライセートを、１０分間隔でボルテックスしながら、３０分間氷上でインキュベートした。最後に、それらを４回超音波処理（各２０秒）し、そして、その後、１３０００ｒｐｍで４℃、１０分間遠心分離した。
全繊維芽細胞タンパク質は、１Ｘプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む１００μＬのＮＰ４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での７２時間処理後に抽出した。ライセートを、１０分間隔でボルテックスしながら、３０分間氷上でインキュベートした。最後に、それらを４回超音波処理（各２０秒）し、そして、その後、１３０００ｒｐｍで４℃、１０分間遠心分離した。
【0065】
タンパク質濃度を、ＢＣＡ（登録商標）タンパク質アッセイ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて決定した。
【0066】
ウェスタンブロット
タンパク質ライセートをＮｕｐａｇｅ Ｎｏｖｅｘ ４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｍｉｄｉ ｐｒｅｃａｓｔ ｇｅｌｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分離し、そして、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＦＬ ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｍｏｌｓｈｅｉｍ， Ｆｒａｎｃｅ）に移した。膜を近赤外蛍光ウェスタンブロッティング用の１：１希釈ブロッキングバッファー（Ｒｏｃｋｌａｎｄ， Ｌｅ Ｐｅｒｒａｙ， Ｆｒａｎｃｅ）で１時間ブロッキングした。ブロックした膜を一次抗体と４℃で一晩インキュベートし、その後それらを洗浄し、そして、ＩＲ－Ｄｙｅコンジュゲート二次抗体とＲＴで一時間インキュベートした。結合した抗体は、Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステム（Ｌｉ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂａｄ Ｈｏｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、メーカーの説明書に従って検出及び解析した。Ｒｅｖｅｒｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ （Ｌｉ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、２つの従来のタンパク質ローディングコントロールＧＡＰＤＨとアクチンに加えて、総タンパク質ローディングコントロールとして使用した。プロジェリンおよびＳＲＳＦ１レベルは、Ｌｉ－ＣＯＲが開発したＩｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅ（登録商標）ソフトウェアを使用して、Ｒｅｖｅｒｔ染色により定量化および正規化した。
タンパク質ライセートをＮｕｐａｇｅ Ｎｏｖｅｘ ４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｍｉｄｉ ｐｒｅｃａｓｔ ｇｅｌｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分離し、そして、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＦＬ ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｍｏｌｓｈｅｉｍ， Ｆｒａｎｃｅ）に移した。膜を近赤外蛍光ウェスタンブロッティング用の１：１希釈ブロッキングバッファー（Ｒｏｃｋｌａｎｄ， Ｌｅ Ｐｅｒｒａｙ， Ｆｒａｎｃｅ）で１時間ブロッキングした。ブロックした膜を一次抗体と４℃で一晩インキュベートし、その後それらを洗浄し、そして、ＩＲ－Ｄｙｅコンジュゲート二次抗体とＲＴで一時間インキュベートした。結合した抗体は、Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステム（Ｌｉ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂａｄ Ｈｏｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、メーカーの説明書に従って検出及び解析した。Ｒｅｖｅｒｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ （Ｌｉ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、２つの従来のタンパク質ローディングコントロールＧＡＰＤＨとアクチンに加えて、総タンパク質ローディングコントロールとして使用した。プロジェリンおよびＳＲＳＦ１レベルは、Ｌｉ－ＣＯＲが開発したＩｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅ（登録商標）ソフトウェアを使用して、Ｒｅｖｅｒｔ染色により定量化および正規化した。
【0067】
抗体
本研究では以下の抗体を使用した：ウサギモノクローナル抗ラミンＡ／Ｃ（ａｂ１０８９２２， １／１０００， Ａｂｃａｍ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ウサギモノクローナル抗ＳＲＳＦ１（ＳＦ２）（ａｂ１２９１０８，１／１０００，Ａｂｃａｍ）、マウスモノクローナル抗ＧＡＰＤＨ（ＭＡＢ３７４，１／４００００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｏｌｓｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ）およびマウスモノクローナル抗アクチン（ＭＡＢ１５０１Ｒ，１／１００００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。ＩＲ－Ｄｙｅ ８００ＣＷまたは６８０とコンジュゲートした二次抗体は、メーカーの説明書に従って使用した（９２６－３２２１３および９２６－６８０７２，１／５０００，Ｌｉ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
本研究では以下の抗体を使用した：ウサギモノクローナル抗ラミンＡ／Ｃ（ａｂ１０８９２２， １／１０００， Ａｂｃａｍ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ウサギモノクローナル抗ＳＲＳＦ１（ＳＦ２）（ａｂ１２９１０８，１／１０００，Ａｂｃａｍ）、マウスモノクローナル抗ＧＡＰＤＨ（ＭＡＢ３７４，１／４００００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｏｌｓｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ）およびマウスモノクローナル抗アクチン（ＭＡＢ１５０１Ｒ，１／１００００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。ＩＲ－Ｄｙｅ ８００ＣＷまたは６８０とコンジュゲートした二次抗体は、メーカーの説明書に従って使用した（９２６－３２２１３および９２６－６８０７２，１／５０００，Ｌｉ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【0068】
結果
ＣＶ２５で試験した化合物による、Ｔ＝７２時間のＨＧＰＳ細胞でのプロジェリン発現の平均減少（ＤＭＳＯコントロールで測定した濃度のパーセンテージで表示）を、ウェスタンブロット分析で決定し、そして、タンパク質の総量（Ｒｅｖｅｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｉｎ）に対して正規化（ｎ＝３（範囲）の平均）したものを、次の表に示した：
ＣＶ２５で試験した化合物による、Ｔ＝７２時間のＨＧＰＳ細胞でのプロジェリン発現の平均減少（ＤＭＳＯコントロールで測定した濃度のパーセンテージで表示）を、ウェスタンブロット分析で決定し、そして、タンパク質の総量（Ｒｅｖｅｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｉｎ）に対して正規化（ｎ＝３（範囲）の平均）したものを、次の表に示した：
【表4】
【0069】
ＣＶ７５で試験した化合物による、Ｔ＝７２時間のＨＧＰＳ細胞でのプロジェリン発現（ＤＭＳＯコントロールで測定した濃度のパーセンテージで表示）の平均変化（減少（－）または増加）を、ウェスタンブロット分析で決定し、そして、タンパク質の総量（Ｒｅｖｅｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｉｎ）に対して正規化（ｎ＝３（範囲）の平均）したものを、次の表に示した：
【表5】
【0070】
本発明による化合物は、早老症の治療効果を示す強力な抗プロジェリン活性を有することが示されうる。
【国際調査報告】