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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-07
(54)【発明の名称】チロソール及びサリドロシドの微生物産生
(51)【国際特許分類】
C12P 7/22 20060101AFI20240131BHJP
C12P 19/00 20060101ALI20240131BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240131BHJP
C12N 15/52 20060101ALN20240131BHJP
【ＦＩ】
C12P7/22 ZNA
C12P19/00
C12N1/21
C12N15/52 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023547635
(86)(22)【出願日】2022-02-08
(85)【翻訳文提出日】2023-09-29
(86)【国際出願番号】 EP2022053036
(87)【国際公開番号】W WO2022167692
(87)【国際公開日】2022-08-11
(31)【優先権主張番号】21155780.6
(32)【優先日】2021-02-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】117340K
(32)【優先日】2021-07-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】PT
(31)【優先権主張番号】21196276.6
(32)【優先日】2021-09-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523297550
【氏名又は名称】シリコライフ エルディーエー
(74)【代理人】
【識別番号】100149032
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 敏明
(74)【代理人】
【識別番号】100181906
【弁理士】
【氏名又は名称】河村 一乃
(72)【発明者】
【氏名】デ ピンホ ソアレス，シマン ペドロ
(72)【発明者】
【氏名】シルバ ゴメス，ジョアナ マルガリダ
(72)【発明者】
【氏名】ダ シルバ ファリア，クリスティアーナ
(72)【発明者】
【氏名】デ アルメイダ ペレイラ ダ ロシャ，イザベル クリスティーナ
(72)【発明者】
【氏名】カルバルホ ヴィラサ，パウロ リカルド
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AC16
4B064AC17
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064CD09
4B064CD13
4B064DA01
4B064DA16
4B065AA01X
4B065AA26X
4B065AA80Y
4B065AA88Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB15
4B065BD33
4B065CA05
4B065CA20
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、チロソールを製造する方法であって、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼを異種発現し、かつホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現し、ｐｈｅＡＬ及びｆｅａＢがともに不活性化又は除去されている、トランスジェニック細菌細胞を、ホスホエノールピルビン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ：ＰＥＰ）及びエリスロース４－リン酸（ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ ４－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：Ｅ４Ｐ）の代謝前駆体、特にグルコース、及び任意にフェニルアラニンを補助剤として含む培地中で増殖し；かつ前記培地からチロソールを抽出する、前記方法に関する。本発明はまた、サリドロシドを製造する方法であって、前記トランスジェニック細胞は、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ８５Ａ１、ＥＣ：２．４．１．）をさらに異種発現する、前記方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
チロソールを製造する方法であって：ａ． フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０）
を異種発現し、かつ：
ｂ． ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ）
ｃ． プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ）
の各々を過剰発現し、かつ以下の各々の遺伝子：
ｉ． ｐｈｅＡＬ（二機能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ）
ｉｉ． ｆｅａＢ（フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ）
を発現しない、トランスジェニック細菌細胞を：
・ ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びエリスロース４－リン酸（Ｅ４Ｐ）の代謝前駆体、特にグルコースである前記代謝前駆体、及び
・ 任意に、補助剤としてのフェニルアラニン
を含む培地で増殖し、そして、
前記培地からチロソールを抽出する、
前記方法。
【請求項2】
前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属であり、特に前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ種であり、より特に前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、酵母由来であり、特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
サリドロシドを製造する方法であって、－ 請求項１～３のいずれか一項で特定されるとおりのトランスジェニック細菌細胞は、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ８５Ａ１）をさらに異種発現し、かつ
－ 前記細胞を：
・ ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びエリスロース４－リン酸（Ｅ４Ｐ）の代謝前駆体、特にグルコース、及び
・ 任意に、補助剤としてフェニルアラニン、
を含む培地で増殖し、かつ
－ 前記培地からサリドロシドを抽出する、
前記方法。
【請求項5】
前記ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、植物由来であり、特にＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来であり、より特にＡ．ｔｈａｌｉａｎａ由来である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記トランスジェニック細菌細胞は、以下のタンパク質：－ アルコールデヒドロゲナーゼ、
－ ＤＮＡ結合性転写調節タンパク質（ｔｙｒＲ）、
及び
－ チロシンアミノトランスフェラーゼ
のいずれも過剰発現しない、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記トランスジェニック細菌細胞の唯一異種発現される遺伝子は：ｉ）前記方法がチロソールの製造を対象としている場合、前記細胞内で唯一異種発現される遺伝子は、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼであり；
ｉｉ）前記方法がサリドロシドの製造を対象としている場合、前記細胞内で唯一異種発現される遺伝子は、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ及びウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼである、
請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記過剰発現される遺伝子及び導入遺伝子は、１つ又は複数のプラスミドベクターを介して前記トランスジェニック細菌細胞に導入され、特に、－ フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ、及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼが、中コピープラスミドベクターによってコードされ、及び／又は
－ ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼが、低コピープラスミドベクターによってコードされる、
請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記トランスジェニック細菌細胞は、前記細胞内で作動可能なプロモーター配列の制御下で前記異種発現又は過剰発現される酵素をコードする１つ又は複数のプラスミドを含み、特にＴ７プロモーター（配列番号３１）、ｌａｃプロモーター（配列番号３２）、ｔａｃプロモーター（配列番号３３）、又はｔｒｃプロモーター（配列番号３４）の制御下で前記異種発現又は過剰発現される酵素をコードする１つ又は複数のプラスミドを含み、より特に：－ ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が、ｔｒｃプロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が、Ｔ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼをコードする遺伝子が、Ｔ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、Ｔ７プロモーターの制御下にある、
請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記異種発現及び／又は過剰発現される遺伝子の発現は、イソプロピル－β－ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって誘導され、特に約０．１ｍＭの濃度のＩＰＴＧを９６時間添加することによって誘導される、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記培地は、１０～５０ｇ／Ｌのグルコースを含み、特に１５～３０ｇ／Ｌのグルコースを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記導入遺伝子は、前記トランスジェニック細菌細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記培地は：－ ５～１０ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、
－ ２～４ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、
－ ０．２５～１ｇ／ＬのＮａＣｌ、
－ ０．５～１．５ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、
－ １～３％（ｗ／ｖ）のグルコース、
－ ０．０１～０．０５％（ｗ／ｖ）の酵母エキス、
－ ３～７ｍＭのＭｇＳＯ４、
－ ０．００５～０．０２ｇ／ＬのＣａＣｌ２、
及び
－ 抗生物質、
を含み、
－ 特に前記抗生物質は、５０～２００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１０～５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、及び２５～４５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールである、
請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ａ． 前記フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼは、配列番号１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％の配列同一性を有し、特に８５％、より特に９０％、さらにより特に９５％、又はなおさらにより特に９５％超過の配列同一性を有し、かつ前記フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼは、配列番号１の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有し、及び／又はｂ． 前記ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼは、配列番号２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％の配列同一性を有し、特に８５％、より特に９０％、さらにより特に９５％、又はなおさらにより特に９５％超過の配列同一性を有し、かつ前記ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼは、配列番号２の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有し、及び／又は
ｃ． 前記プレフェン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％の配列同一性を有し、特に８５％、より特に９０％、さらにより特に９５％、又はなおさらにより特に９５％超過の配列同一性を有し、かつ前記プレフェン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号３の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有し、及び／又は
ｄ． 前記ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼは、配列番号４と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％の配列同一性を有し、特に８５％、より特に９０％、さらにより特に９５％、又はなおさらにより特に９５％超過の配列同一性を有し、かつ前記ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼは、配列番号４の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有する、
請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２１年２月０８日に出願された欧州特許出願（ＥＰ）第２１１５５７８０．６号、及び２０２１年９月１３日に出願された欧州特許出願（ＥＰ）第２１１９６２７６．６号、並びに２０２１年７月１３日に出願されたポルトガル特許出願第２０２１１００００２７２２２号の利益を主張するものであり、これらはすべて参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【0002】
本発明は、チロソール（ｔｙｒｏｓｏｌ）を製造する方法であって、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）を異種発現し、かつホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸（ｐｈｏｓｐｈｏ－２－ｄｅｈｙｄｒｏ－３－ｄｅｏｘｙｈｅｐｔｏｎａｔｅ）及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を過剰発現し、ｐｈｅＡＬ及びｆｅａＢがともに不活性化又は除去されているトランスジェニック細菌細胞を、ホスホエノールピルビン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ：ＰＥＰ）及びエリスロース４－リン酸（ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ ４－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：Ｅ４Ｐ）の代謝前駆体、特にグルコース、及び任意に補助剤としてのフェニルアラニンを含む培地で増殖し；そして前記培地からチロソールを抽出する前記方法に関する。本発明はまた、サリドロシド（ｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ）を製造する方法であって、前記トランスジェニック細胞は、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ８５Ａ１、ＥＣ：２．４．１．）をさらに異種発現する前記方法に関する。
【0003】
説明
チロソールは工業的価値の高いフェノール化合物であり、精製化学製品として販売されている。
チロソールは工業的価値の高いフェノール化合物であり、精製化学製品として販売されている。
【0004】
サリドロシドはチロソールのグルコシドであり、推定抗うつ作用及び抗不安作用をもたらす可能性のある化合物の一つとして研究されてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
通常、植物中のチロソール濃度は低く、そのため商業製品の収量が低くなり、製造コストが高くなる。さらに、植物から高純度のチロソールを得るための天然抽出プロセスは複雑であり、そのため収率も比較的低い。天然に豊富に存在するにもかかわらず、天然資源からの抽出コストが非常に高いため、チロソールは工業的な目的のために化学合成法でも製造されているが、これらの方法は商業的な観点から改善の余地が大きい。
【課題を解決するための手段】
【0006】
定義
本明細書の文脈で参照される「トランスジェニック細胞」とは、宿主細胞とは異なる生物に由来する少なくとも１つの遺伝子（本明細書では導入遺伝子と呼ぶ）を含む細胞を意味する。この遺伝子は、分子生物学的手法によってトランスジェニック宿主細胞に導入される。
本明細書の文脈で参照される「トランスジェニック細胞」とは、宿主細胞とは異なる生物に由来する少なくとも１つの遺伝子（本明細書では導入遺伝子と呼ぶ）を含む細胞を意味する。この遺伝子は、分子生物学的手法によってトランスジェニック宿主細胞に導入される。
【0007】
本明細書で参照される特定の遺伝子に関する「異種発現」とは、その遺伝子が異種発現するとされる宿主種以外の供給源にその遺伝子が由来することを意味する。
【0008】
本明細書で参照される特定の遺伝子に関する「過剰発現」とは、前記遺伝子の機能的（導入遺伝子又は自己の）バージョンの付加、及び／又は前記遺伝子の自己（天然）バージョンを制御するプロモーター配列の付加であり、これにより野生型（細菌）細胞に対して遺伝子の生物学的活性の有意に高い発現をもたらすことを意味する。遺伝子の生物学的活性の有意に高い発現とは、野生型細菌細胞と比較して、細菌細胞内に少なくとも１．５倍、特に少なくとも２倍の数のｍＲＮＡ分子が存在することを意味する。過剰発現される遺伝子はまた、野生型の核酸及びアミノ酸配列と比較して、変異（置換、欠失及び／又は挿入）を含んでいることもある。変異は、酵素の効力を高めたり、発現速度を最適化したり、又は酵素特異性を変えたりする。
【0009】
本明細書で参照される特定の遺伝子に関する「不活性化」又は「ノックアウト」とは、その遺伝子の発現が野生型細菌細胞と比較して有意に減少し、特に少なくとも３０倍、より特に少なくとも１００倍減少しているか、又はその遺伝子の発現がないことを意味する。
【0010】
本明細書で参照される特定の遺伝子に関する「組換え遺伝子発現」とは、以下を意味する：組換え遺伝子は、分子生物学的手法によって宿主細胞に挿入される。組換え遺伝子は、宿主細胞と同じ生物に由来してもよいし、又は異なる生物に由来してもよい。
【0011】
「補助剤（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）」とは、細菌細胞にとって主要な炭素源ではないが、細胞の代謝が化合物の栄養要求を補うことができる十分な量である化合物の量を指す。フェニルアラニンは、ｐｈｅＡＬ欠失株の栄養要求をカバーするために必要である。本発明者らは、フェニルアラニンの供給源として酵母エキスを有するようなＭ９Ｙを使用した。酵母エキス、又は純粋なフェニルアラニンのいずれかのサプリメンテーション（補充）が必要である。
【0012】
発明の詳細な説明
本発明の第１の態様は、以下の酵素：
ａ． フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０、ＥＣ：４．１．１．８０）
を異種発現し、以下の各々の酵素：
ｂ． ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ、ＥＣ：２．５．１．５４）
ｃ． プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ、ＥＣ：５．４．９９．５及びＥＣ：１．３．１．１２）
を過剰発現し、以下の各々の遺伝子：
ｉ． ｐｈｅＡＬ（二機能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ（Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ ｍｕｔａｓｅ／ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０Ａ９Ｊ８；ＥＣ：５．４．９９．５）
ｉｉ． ｆｅａＢ（フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ８０６６８；ＥＣ：１．２．１．３９）
が不活性化又は除去されている（存在しない、発現しない）、
トランスジェニック細菌細胞を、
・ ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びエリスロース４－リン酸（Ｅ４Ｐ）の代謝前駆体、特にグルコース、及び
・ 任意に、補助剤としてのフェニルアラニン
を含む培地で増殖し、
そして、前記培地からチロソールを抽出する、
チロソールを製造する方法に関する。
本発明の第１の態様は、以下の酵素：
ａ． フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０、ＥＣ：４．１．１．８０）
を異種発現し、以下の各々の酵素：
ｂ． ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ、ＥＣ：２．５．１．５４）
ｃ． プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ、ＥＣ：５．４．９９．５及びＥＣ：１．３．１．１２）
を過剰発現し、以下の各々の遺伝子：
ｉ． ｐｈｅＡＬ（二機能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ（Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ ｍｕｔａｓｅ／ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０Ａ９Ｊ８；ＥＣ：５．４．９９．５）
ｉｉ． ｆｅａＢ（フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ８０６６８；ＥＣ：１．２．１．３９）
が不活性化又は除去されている（存在しない、発現しない）、
トランスジェニック細菌細胞を、
・ ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びエリスロース４－リン酸（Ｅ４Ｐ）の代謝前駆体、特にグルコース、及び
・ 任意に、補助剤としてのフェニルアラニン
を含む培地で増殖し、
そして、前記培地からチロソールを抽出する、
チロソールを製造する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図１は、グルコースを炭素源として使用するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるチロソール及びサリドロシドの生合成を示す。チロソールを製造（産生）するために、遺伝子ａｒｏＦｆｂｒ、ｔｙｒＡｆｂｒ及びＳｃＡＲＯ１０＊をプラスミドにクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換してチロソール産生株を得た。サリドロシドを産生するために、遺伝子ＡｔＵＧＴ８５Ａ１を異なるプラスミドにクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、チロソール産生株からサリドロシド産生株を得た。サリドロシド産生については、三角と丸の記号で示すとおり、関連する生合成遺伝子に対して動的制御が存在した：塗りつぶした三角はＴ７プロモーターの使用を示し、空の三角はｔｒｃプロモーターの使用を示す；１つの丸は低コピー数プラスミドの使用を示し、２つの丸は中コピー数プラスミドの使用を示し、３つの丸は高コピー数プラスミドの使用を示す。略号：ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）；エリスロース４－リン酸（Ｅ４Ｐ）；ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦｆｂｒ）；３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソン酸７－リン酸（ＤＡＨＰ）；プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡｆｂｒ）；４－ヒドロキシフェニルピルビン酸（４－ＨＰＰ）；Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＳｃＡＲＯ１０＊）；４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（４－ＨＰＡＡ）；アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｐｓ）；シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）由来のウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＡｔＵＧＴ８５Ａ１）。
【図2】図２は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるグルコースからのチロソール産生に最適なフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＳｃＡＲＯ１０＊、ＥｉｐｄＣ、及びＫｐＰＤＣ）の選択を示す。ａ）グルコースからのチロソール生成経路の概略図。ｂ）Ｍ９Ｙ培地中の０．１ｍＭのｉＰＴＧで誘導されたＳＴ９３株、ＳＴ１３５株、及びＳＴ１３６株のチロソール力価（ｇ／Ｌ）。チロソールの検出のため、培養液は増殖の７２時間後にサンプリングした。統計解析はスチューデントのｔ検定を用いて行った（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。すべてのデータはｎ＝３の生物学的に独立した試料の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。
【図3】図３は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるグルコースからのチロソール産生に対するａｄｈＰ＊の過剰発現の影響を示す。ａ）グルコースからのチロソール産生の経路の概略図。ｂ）Ｍ９Ｙ培地中の０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導したＳＴ９３株、ＳＴ８１株、ＳＴ１１４株のチロソール力価（ｇ／Ｌ）。チロソールの検出のため、培養液は培養の４８時間後にサンプリングした。ＳＴ８１株を２２℃と３０℃とで培養し、チロソール力価への影響を評価した。統計解析はスチューデントのｔ検定を用いて行った（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。すべてのデータはｎ＝３の生物学的に独立した試料の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。
【図4】図４は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるグルコースからのチロソール産生を改善するための芳香族アミノ酸経路の操作を示す。ａ）グルコースからのチロソール産生の経路の概略図。ｂ）フェニルアラニンのサプリメンテーションの有又は無で、Ｍ９Ｙ培地中の０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導されたｆｅａＢ遺伝子及びｐｈｅＡＬ遺伝子のノックアウトを有するＳＴ１７０株及び１９１株のチロソール力価（ｇ／Ｌ）。チロソールの検出のために培養液は増殖の９６時間後にサンプリングした。統計解析はスチューデントのｔ検定を用いて行った（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。すべてのデータはｎ＝３の生物学的に独立した試料の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。ＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒはプラスミドｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒに対応し、ａｄｈＰ＊はｐＥＴ－２８ａ（＋）＿ａｄｈＰ＊に対応する。
【図5】図５は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるグルコースからのサリドロシド産生に対するＡｔＵＧＴ８５Ａ１の発現レベルの違いによる影響を示す。ａ）グルコースからのサリドロシド産生の経路の概略図、ｂ）Ｍ９Ｙ培地中で０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導したＳＴ９２株、ＳＴ１１６株、ＳＴ１３１株、及びＳＴ１７６株のサリドロシド及びチロソールの力価（ｇ／Ｌ）。サリドロシド及びチロソールの検出のため、培養液を増殖の４８時間後に採取した。統計解析はスチューデントのｔ検定を用いて行った（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。すべてのデータはｎ＝３の生物学的に独立した試料の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。
【図6】図６は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるグルコースからのサリドロシド産生を改善するための芳香族アミノ酸経路の操作を示す。ａ）グルコースからのサリドロシド産生の経路の概略図。ｂ）フェニルアラニンのサプリメンテーションの有又は無でのＭ９Ｙ培地中の０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導したＳＴ１７２株とＳＴ１７８株とのサリドロシド力価（ｇ／Ｌ）。サリドロシド検出のため、増殖の９６時間後に培養液をサンプリングした。統計解析はスチューデントのｔ検定を用いて行った（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。すべてのデータはｎ＝３の生物学的に独立した試料の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。
【図7】図７は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるグルコースからのヒドロキシチロソール産生に対するｈｐａＢＣ＊の発現レベルの違いによる影響を示す。ａ）グルコースからのヒドロキシチロソール産生経路の概略図。ｂ）１ｇ／Ｌのアスコルビン酸を補充したＭ９Ｙ培地中、０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導したＳＴ７６、ＳＴ１１９及びＳＴ１３２株のヒドロキシチロソール力価（ｇ／Ｌ）。ヒドロキシチロソールの検出のため、培養液を４８時間増殖後にサンプリングした。統計解析はスチューデントのｔ検定を用いて行った（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（すべてのデータはｎ＝３の生物学的に独立した試料の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。）
【図8】図８は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるグルコースからのヒドロキシチロソール産生に対するｈｐａＢＣ＊の発現レベルの違いによる影響を示す。ａ）グルコースからのヒドロキシチロソール産生経路の概略図。ｂ）２５％（ｖ／ｖ）の１－ドデカノールの添加の有又は無での１ｇ／Ｌのアスコルビン酸を補充したＭ９Ｙ培地中の０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導したＳＴ１１９株とＳＴ１３２株のヒドロキシチロソール力価（ｇ／Ｌ）。ヒドロキシチロソールの検出のため、培養液を４８時間増殖後にサンプリングした。統計解析はスチューデントのｔ検定を用いて行った。すべてのデータはｎ＝３の生物学的に独立した試料の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す（材料及び方法を参照）。
【発明を実施するための形態】
【0014】
特定の実施形態では、前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属であり、特定の実施形態では、前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ種である。特定の実施形態では、前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株である。
【0015】
特定の実施形態では、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は酵母由来である。特定の実施形態では、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来である。
【0016】
本発明の第２の態様は、サリドロシドを製造する方法に関し、
－ 前述の実施形態のいずれかで特定されるとおりのトランスジェニック細胞は、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ８５Ａ１、ＥＣ：２．４．１．）をさらに異種発現し、そして
－ 前記細胞を：
・ ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びエリスロース４－リン酸（Ｅ４Ｐ）の代謝前駆体、特にグルコース、及び
・ 任意に、補助剤としてのフェニルアラニン、
を含む培地で増殖し、かつ
－ 前記培地からサリドロシドを抽出する。
－ 前述の実施形態のいずれかで特定されるとおりのトランスジェニック細胞は、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ８５Ａ１、ＥＣ：２．４．１．）をさらに異種発現し、そして
－ 前記細胞を：
・ ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びエリスロース４－リン酸（Ｅ４Ｐ）の代謝前駆体、特にグルコース、及び
・ 任意に、補助剤としてのフェニルアラニン、
を含む培地で増殖し、かつ
－ 前記培地からサリドロシドを抽出する。
【0017】
本発明の第３の態様は、ヒドロキシチロソールを製造する方法に関し、以下の酵素：
ａ．フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０、ＥＣ：４．１．１．８０）
を異種発現し、以下の各々の酵素：
ｂ．ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ、ＥＣ：２．５．１．５４）
ｃ．プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ、ＥＣ：５．４．９９．５及びＥＣ：１．３．１．１２）
ｄ．４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼ（ｈｐａＢＣ＊、ＥＣ：１．１４．１４．９）
を過剰発現するトランスジェニック細菌細胞を、
・ ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びエリスロース４－リン酸（Ｅ４Ｐ）の代謝前駆体、特にグルコース、及び
・ 任意に、補助剤としてのフェニルアラニン、
を含む培地で増殖し、そして
前記培地からヒドロキシチロソールを抽出する。
ａ．フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０、ＥＣ：４．１．１．８０）
を異種発現し、以下の各々の酵素：
ｂ．ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ、ＥＣ：２．５．１．５４）
ｃ．プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ、ＥＣ：５．４．９９．５及びＥＣ：１．３．１．１２）
ｄ．４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼ（ｈｐａＢＣ＊、ＥＣ：１．１４．１４．９）
を過剰発現するトランスジェニック細菌細胞を、
・ ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びエリスロース４－リン酸（Ｅ４Ｐ）の代謝前駆体、特にグルコース、及び
・ 任意に、補助剤としてのフェニルアラニン、
を含む培地で増殖し、そして
前記培地からヒドロキシチロソールを抽出する。
【0018】
別の本発明の第３の態様は、ヒドロキシチロソールを製造する方法に関し、以下の各々の酵素：
ａ．フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０、ＥＣ：４．１．１．８０）
ｂ．ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ、ＥＣ：２．５．１．５４）
ｃ．プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ、ＥＣ：５．４．９９．５及びＥＣ：１．３．１．１２）
ｄ．４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼ（ｈｐａＢＣ＊、ＥＣ：１．１４．１４．９）
を組換え発現するトランスジェニック細菌細胞を：
・ ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びエリスロース４－リン酸（Ｅ４Ｐ）の代謝前駆体、特にグルコース、及び
・ 任意に、補助剤としてのフェニルアラニン、
を含む培地で増殖し、そして
前記培地からヒドロキシチロソールを抽出する。
ａ．フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０、ＥＣ：４．１．１．８０）
ｂ．ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ、ＥＣ：２．５．１．５４）
ｃ．プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ、ＥＣ：５．４．９９．５及びＥＣ：１．３．１．１２）
ｄ．４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼ（ｈｐａＢＣ＊、ＥＣ：１．１４．１４．９）
を組換え発現するトランスジェニック細菌細胞を：
・ ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びエリスロース４－リン酸（Ｅ４Ｐ）の代謝前駆体、特にグルコース、及び
・ 任意に、補助剤としてのフェニルアラニン、
を含む培地で増殖し、そして
前記培地からヒドロキシチロソールを抽出する。
【0019】
特定の実施形態では、４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ由来である。特定の実施形態では、４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来である。
【0020】
特定の実施形態では、４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、アミノ酸置換Ｓ２１０Ｔ、Ａ２１１Ｌ、及びＱ２１２Ｅを含む。
【0021】
第３の態様の特定の実施形態では、前記培地は、５～１０ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、２～４ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．２５～１ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．５～１．５ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、１～３％（ｗ／ｖ）のグルコース、０．０１～０．０５％（ｗ／ｖ）の酵母エキス、３～７ｍＭのＭｇＳＯ４、０．００５～０．０２ｇ／ＬのＣａＣｌ２、０．５～２．０ｇ／Ｌのアスコルビン酸、及び抗生物質を含む。
【0022】
第３の態様の特定の実施形態では、ドデカノールが培地に添加される。第３の態様の特定の実施形態では、約２５％のドデカノール（ｖ／ｖ）が培地に添加される。ドデカノールは水と混和しないため、培地の上に第２の層を作る。
【0023】
第３の態様の特定の実施形態では、前記細胞は２％（ｖ／ｖ）以上のＯ２で増殖される。第３の態様の特定の実施形態では、前記細胞は２～４％（ｖ／ｖ）のＯ２で増殖される。
【0024】
特定の実施形態では、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は植物に由来する。特定の実施形態では、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（シロイヌナズナ）に由来する。特定の実施形態では、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａに由来する。
【0025】
特定の実施形態では、トランスジェニック細菌細胞は、以下のタンパク質：
－ アルコールデヒドロゲナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３９４５１；ＥＣ：１．１．１．１）、
－ ＤＮＡ結合性転写調節タンパク質（ｔｙｒＲ ＮＣＢＩ ＧｅｎＰｅｐｔ：ＮＰ＿４１５８３９．１）、及び
－ チロシンアミノトランスフェラーゼ、（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４６９３、ＥＣ：２．６．１．５７）
のいずれも過剰発現しない。
－ アルコールデヒドロゲナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３９４５１；ＥＣ：１．１．１．１）、
－ ＤＮＡ結合性転写調節タンパク質（ｔｙｒＲ ＮＣＢＩ ＧｅｎＰｅｐｔ：ＮＰ＿４１５８３９．１）、及び
－ チロシンアミノトランスフェラーゼ、（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４６９３、ＥＣ：２．６．１．５７）
のいずれも過剰発現しない。
【0026】
特定の実施形態では、トランスジェニック細菌細胞の導入遺伝子は上記の導入遺伝子だけである。
【0027】
特定の実施形態では、過剰発現される遺伝子及び導入遺伝子は、１つ又は複数のプラスミドベクターを介してトランスジェニック細菌細胞に導入され、特に：
－ フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ、及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼが、中コピープラスミドベクターによってコードされ、及び／又は
－ ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼが低コピープラスミドベクターによってコードされ、及び／又は
－ ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼが低コピープラスミドベクターによってコードされる。
－ フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ、及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼが、中コピープラスミドベクターによってコードされ、及び／又は
－ ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼが低コピープラスミドベクターによってコードされ、及び／又は
－ ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼが低コピープラスミドベクターによってコードされる。
【0028】
特定の実施形態では、前記トランスジェニック細菌細胞は、前記細胞において作動可能なプロモーター配列、特にＴ７プロモーター（配列番号３１）、ｌａｃプロモーター（配列番号３２）、ｔａｃプロモーター（配列番号３３）又はｔｒｃプロモーター（配列番号３４）の制御下で、前記異種発現又は過剰発現される酵素をコードする１つ又は複数のプラスミドを含み、より特に：
－ ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がｔｒｃプロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にあり；及び／又は
－ ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にある。
－ ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がｔｒｃプロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にあり；及び／又は
－ ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にある。
【0029】
特定の実施形態では、前記異種及び／又は過剰発現される遺伝子の発現は、イソプロピル－β－ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ：ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加することにより、特に約０．１ｍＭの濃度のＩＰＴＧを９６時間添加することにより、誘導される。
【0030】
特定の実施形態では、前記培地は、１０～５０ｇ／Ｌのグルコース、特に１５～３０ｇ／Ｌのグルコースを含む。
【0031】
特定の実施形態では、前記導入遺伝子は、前記トランスジェニック細菌細胞における発現のためにコドン最適化されている。
【0032】
特定の実施形態では、前記培地は、５～１０ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、２～４ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．２５～１ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．５～１．５ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１～３％（ｗ／ｖ）グルコース、０．０１～０．０５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、３～７ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．００５～０．０２ｇ／ＬのＣａＣｌ２、及び抗生物質を含み、特に抗生物質は、５０～２００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１０～５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、及び２５～４５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールである。
【0033】
特定の実施形態では、前記細胞は２２℃～３０℃、特に約３０℃で増殖される。
【0034】
特定の実施形態では、タンパク質フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼは、配列番号１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号１の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有する。特定の実施形態では、タンパク質ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼは、配列番号２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号２の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有する。特定の実施形態では、タンパク質プレフェン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号３の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有する。特定の実施形態では、タンパク質ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼは、配列番号４と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号４の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有する。特定の実施形態では、タンパク質４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼは、配列番号０３５と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号０３５の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有する。
【0035】
本発明の第４の態様は、上述の実施形態のいずれか１つに規定されるとおりのトランスジェニック細胞に関する。
【0036】
別の第４の態様は、トランスジェニック細胞であって、以下の酵素：
ａ． フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０、ＥＣ：４．１．１．８０）
を異種発現し、かつ以下の各々の酵素：
ｂ． ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ、ＥＣ：２．５．１．５４）
ｃ． プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ、ＥＣ：５．４．９９．５及びＥＣ：１．３．１．１２）
を過剰発現し、かつ以下の各々の遺伝子：
ｉ． ｐｈｅＡＬ（二機能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０Ａ９Ｊ８；ＥＣ：５．４．９９．５）
ｉｉ． ｆｅａＢ（フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ８０６６８、ＥＣ：１．２．１．３９）
が不活化又は除去されている（存在しない、発現しない）、
前記トランスジェニック細胞に関する。
ａ． フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０、ＥＣ：４．１．１．８０）
を異種発現し、かつ以下の各々の酵素：
ｂ． ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ、ＥＣ：２．５．１．５４）
ｃ． プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ、ＥＣ：５．４．９９．５及びＥＣ：１．３．１．１２）
を過剰発現し、かつ以下の各々の遺伝子：
ｉ． ｐｈｅＡＬ（二機能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０Ａ９Ｊ８；ＥＣ：５．４．９９．５）
ｉｉ． ｆｅａＢ（フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ８０６６８、ＥＣ：１．２．１．３９）
が不活化又は除去されている（存在しない、発現しない）、
前記トランスジェニック細胞に関する。
【0037】
さらに別の第４の態様は、トランスジェニック細胞であって、以下の各々の酵素：
ａ． フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０、ＥＣ：４．１．１．８０）；
ｂ． ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ８５Ａ１、ＥＣ：２．４．１．）；
を異種発現し、以下の各々の酵素：
ｃ． ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ、ＥＣ：２．５．１．５４）
ｄ． プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ、ＥＣ：５．４．９９．５及びＥＣ：１．３．１．１２）
を過剰発現し、以下の各々の遺伝子：
ｉ． ｐｈｅＡＬ（二機能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０Ａ９Ｊ８；ＥＣ：５．４．９９．５）
ｉｉ． ｆｅａＢ（フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ８０６６８、ＥＣ：１．２．１．３９）
が不活化又は除去されている（存在しない、発現しない）、
前記トランスジェニック細胞に関する。
ａ． フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０、ＥＣ：４．１．１．８０）；
ｂ． ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ８５Ａ１、ＥＣ：２．４．１．）；
を異種発現し、以下の各々の酵素：
ｃ． ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ、ＥＣ：２．５．１．５４）
ｄ． プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ、ＥＣ：５．４．９９．５及びＥＣ：１．３．１．１２）
を過剰発現し、以下の各々の遺伝子：
ｉ． ｐｈｅＡＬ（二機能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０Ａ９Ｊ８；ＥＣ：５．４．９９．５）
ｉｉ． ｆｅａＢ（フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ８０６６８、ＥＣ：１．２．１．３９）
が不活化又は除去されている（存在しない、発現しない）、
前記トランスジェニック細胞に関する。
【0038】
さらに別の第４の態様は、トランスジェニック細胞であって、以下の酵素：
ａ． フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０、ＥＣ：４．１．１．８０）
を異種発現し、以下の各々の酵素：
ｂ． ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ、ＥＣ：２．５．１．５４）
ｃ． プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ、ＥＣ：５．４．９９．５及びＥＣ：１．３．１．１２）
ｄ． ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼ（ｈｐａＢＣ＊、ＥＣ：１．１４．１４．９）
を過剰発現する、
前記トランスジェニック細胞に関する。
ａ． フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０、ＥＣ：４．１．１．８０）
を異種発現し、以下の各々の酵素：
ｂ． ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ、ＥＣ：２．５．１．５４）
ｃ． プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ、ＥＣ：５．４．９９．５及びＥＣ：１．３．１．１２）
ｄ． ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼ（ｈｐａＢＣ＊、ＥＣ：１．１４．１４．９）
を過剰発現する、
前記トランスジェニック細胞に関する。
【0039】
第４の態様の特定の実施形態では、前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属であり、特に、前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ種であり、より特に、前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株である。
【0040】
第４の態様の特定の実施形態では、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、酵母由来、特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来である。
【0041】
第４の態様の特定の実施形態では、４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ由来、特にＥ．ｃｏｌｉ由来である。
【0042】
第４の態様の特定の実施形態では、４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、アミノ酸置換Ｓ２１０Ｔ、Ａ２１１Ｌ、及びＱ２１２Ｅを含む。
【0043】
第４の態様の特定の実施形態では、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、植物由来、特にＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来、より特にＡ．ｔｈａｌｉａｎａ由来である。
【0044】
第４の態様の特定の実施形態では、トランスジェニック細菌細胞は、以下のタンパク質：
－ アルコールデヒドロゲナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３９４５１；ＥＣ：１．１．１．１）、
－ ＤＮＡ結合性転写調節タンパク質（ｔｙｒＲ ＮＣＢＩ ＧｅｎＰｅｐｔ：ＮＰ＿４１５８３９．１）、及び
－ チロシンアミノトランスフェラーゼ、（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４６９３、ＥＣ：２．６．１．５７）
のいずれも過剰発現しない。
－ アルコールデヒドロゲナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３９４５１；ＥＣ：１．１．１．１）、
－ ＤＮＡ結合性転写調節タンパク質（ｔｙｒＲ ＮＣＢＩ ＧｅｎＰｅｐｔ：ＮＰ＿４１５８３９．１）、及び
－ チロシンアミノトランスフェラーゼ、（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４６９３、ＥＣ：２．６．１．５７）
のいずれも過剰発現しない。
【0045】
第４の態様の特定の実施形態では、トランスジェニック細菌細胞の導入遺伝子は上記の導入遺伝子だけである。
【0046】
第４の態様の特定の実施形態では、過剰発現される遺伝子及び導入遺伝子は、１つ又は複数のプラスミドベクターを介してトランスジェニック細菌細胞に導入され、特に：
－ フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ、及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼが、中コピープラスミドベクターによってコードされ、及び／又は
－ ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼが、低コピープラスミドベクターによってコードされ、及び／又は
－ ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼが、低コピープラスミドベクターによってコードされている。
－ フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ、及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼが、中コピープラスミドベクターによってコードされ、及び／又は
－ ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼが、低コピープラスミドベクターによってコードされ、及び／又は
－ ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼが、低コピープラスミドベクターによってコードされている。
【0047】
第４の態様の特定の実施形態では、前記トランスジェニック細菌細胞は、前記細胞において作動可能なプロモーター配列の制御下、特にＴ７プロモーター（配列番号３１）、ｌａｃプロモーター（配列番号３２）、ｔａｃプロモーター（配列番号３３）、又はｔｒｃプロモーター（配列番号３４）の制御下で、前記異種発現又は過剰発現される酵素をコードする１つ又は複数のプラスミドを含み、より特に：
－ ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、ｔｒｃプロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、Ｔ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼをコードする遺伝子は、Ｔ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、Ｔ７プロモーターの制御下にあり；及び／又は
－ ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、Ｔ７プロモーターの制御下にある。
－ ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、ｔｒｃプロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、Ｔ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼをコードする遺伝子は、Ｔ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、Ｔ７プロモーターの制御下にあり；及び／又は
－ ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、Ｔ７プロモーターの制御下にある。
【0048】
第４の態様の特定の実施形態では、タンパク質フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼは、配列番号１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号１の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有する。第４の態様の特定の実施形態では、タンパク質ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼは、配列番号２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号２の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有する。第４の態様の特定の実施形態では、タンパク質プレフェン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号３の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有する。第４の態様の特定の実施形態では、タンパク質ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼは、配列番号４と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号４の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有する。第４の態様の特定の実施形態では、タンパク質４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼは、配列番号０３５と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号０３５の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有する。
【0049】
本明細書はまた、以下の項目を備える。
項目
項目１．ヒドロキシチロソールを製造する方法であって、以下の酵素：
ａ． フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０）
を異種発現し、以下の各々の酵素：
ｂ． ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ）
ｃ． プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ）
ｄ． ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼ（ｈｐａＢＣ＊）
を過剰発現するトランスジェニック細菌細胞を：
・ ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びエリスロース４－リン酸（Ｅ４Ｐ）の代謝前駆体、特にグルコース、及び
・ 任意に、補助剤としてのフェニルアラニン
を含む培地で増殖し、そして
前記培地からヒドロキシチロソールを抽出する、前記方法。
項目２．前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属であり、特に前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ種であり、より特に前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株である、項目１に記載の方法。
項目３．前記フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、酵母由来であり、特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来である、項目１又は２に記載の方法。
項目４．前記４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ由来であり、特にＥ．ｃｏｌｉ由来である、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
項目５．前記４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、アミノ酸置換Ｓ２１０Ｔ、Ａ２１１Ｌ、及びＱ２１２Ｅを含む、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
項目６．前記トランスジェニック細菌細胞は、以下のタンパク質：
－ アルコールデヒドロゲナーゼ、
－ ＤＮＡ結合性転写調節タンパク質（ｔｙｒＲ）、及び
－ チロシンアミノトランスフェラーゼ
のいずれも過剰発現しない、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
項目７．前記トランスジェニック細菌細胞の唯一異種発現される遺伝子は、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼである、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
項目８．前記過剰発現される遺伝子及び導入遺伝子は、１つ又は複数のプラスミドベクターを介して前記トランスジェニック細菌細胞に導入され、特に：
－ フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ、及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼは、中コピープラスミドベクターによってコードされ、及び／又は
－ ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼは、低コピープラスミドベクターによってコードされている、
項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
項目９．前記トランスジェニック細菌細胞は、前記細胞内で作動可能なプロモーター配列の制御下で、特にＴ７プロモーター（配列番号３１）、ｌａｃプロモーター（配列番号３２）、ｔａｃプロモーター（配列番号３３）、又はｔｒｃプロモーター（配列番号３４）の制御下で、前記異種発現又は過剰発現される酵素をコードする１つ又は複数のプラスミドを含み、より特に：
－ ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にある、
項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
項目１０．前記異種発現及び／又は過剰発現される遺伝子の発現は、イソプロピル－β－ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって誘導され、特に約０．１ｍＭの濃度のＩＰＴＧを９６時間添加することによって誘導される、項目９に記載の方法。
項目１１．前記培地は、１０～５０ｇ／Ｌのグルコースを含み、特に１５～３０ｇ／Ｌのグルコースを含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
項目１２．前記導入遺伝子は、前記トランスジェニック細菌細胞における発現に対してコドン最適化されている、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
項目１３．前記培地は：
・ ５～１０ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、
・ ２～４ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、
・ ０．２５～１ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、
・ ０．５～１．５ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、
・ １～３％（ｗ／ｖ）グルコース、
・ ０．０１～０．０５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、
・ ３～７ｍＭ ＭｇＳＯ４、
・ ０．００５～０．０２ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２、
・ ０．５～２．０ｇ／Ｌ アスコルビン酸、及び
・ 抗生物質、特に５０～２００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１０～５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、及び２５～４５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールである前記抗生物質、
を含む、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
項目１４．ドデカノールが前記培地に添加され、特に約２５％ドデカノール（ｖ／ｖ）が前記培地に添加される、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
項目１５．前記細胞を、２％（ｖ／ｖ）以上のＯ２で増殖し、特に２～４％（ｖ／ｖ）のＯ２で増殖する、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
項目１６．
ａ．タンパク質フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼは、配列番号１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号１の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有し、及び／又は
ｂ．タンパク質ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼは、配列番号２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号２の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有し、及び／又は
ｃ．タンパク質プレフェン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号３の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有し、及び／又は
ｄ．タンパク質４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼは、配列番号０３５と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号０３５の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有する、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
項目１７．項目１～１６のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目１８．トランスジェニック細胞であって、以下の酵素：
ａ． フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０）
を異種発現し、かつ以下の各々の酵素：
ｂ． ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ）
ｃ． プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ）
を過剰発現し、かつ以下の各々の遺伝子：
ｉ． ｐｈｅＡＬ（二機能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ）
ｉｉ． ｆｅａＢ（フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ）
を発現しない、
前記トランスジェニック細胞。
項目１９．トランスジェニック細胞であって、以下の各々の酵素：
ａ． フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０）；
ｂ． ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ８５Ａ１）；
を異種発現し、かつ以下の各々の酵素：
ｃ． ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ）
ｄ． プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ）
を過剰発現し、かつ以下の各々の遺伝子：
ｉ． ｐｈｅＡＬ（二機能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ）
ｉｉ． ｆｅａＢ（フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ）、
を発現しない、
前記トランスジェニック細胞。
項目２０．トランスジェニック細胞であって、以下の酵素：
ａ． フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０）
を異種発現し、かつ以下の各々の酵素：
ｂ． ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ）、
ｃ． プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ）、
ｄ． ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼ（ｈｐａＢＣ＊）
を過剰発現する、前記トランスジェニック細胞。
項目２１．前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属であり、特に前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ種であり、より特に前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株である、項目１７～２０のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目２２．前記フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、酵母由来であり、特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来である、項目１７～２１のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目２３．前記４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ由来であり、特にＥ．ｃｏｌｉ由来である、項目１７又は２０～２２のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目２４．前記４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、アミノ酸置換Ｓ２１０Ｔ、Ａ２１１Ｌ、及びＱ２１２Ｅを含む、項目１７又は２０～２３のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目２５．ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、植物由来であり、特にＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来であり、より特にＡ．ｔｈａｌｉａｎａ由来である、項目１７若しくは１９、又は項目２１～２２のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目２６．前記トランスジェニック細菌細胞は、以下のタンパク質：
－ アルコールデヒドロゲナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３９４５１；ＥＣ：１．１．１．１）、
－ ＤＮＡ結合性転写調節タンパク質（ｔｙｒＲ ＮＣＢＩ ＧｅｎＰｅｐｔ：ＮＰ＿４１５８３９．１）、及び
－ チロシンアミノトランスフェラーゼ、（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４６９３、ＥＣ：２．６．１．５７）
のいずれも過剰発現しない、項目１７～２５のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目２７．前記トランスジェニック細胞の唯一異種発現される遺伝子は、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼである、項目１８又は２０～２６のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目２８．前記トランスジェニック細胞の唯一異種発現される遺伝子は、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ及びウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼである、項目１９又は２１～２６のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目２９．前記過剰発現される遺伝子及び導入遺伝子は、１つ又は複数のプラスミドベクターを介して前記トランスジェニック細菌細胞に導入され、特に：
－ フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼが、中コピープラスミドベクターによってコードされ、及び／又は
－ ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼが、低コピープラスミドベクターによってコードされ、及び／又は
－ ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼが、低コピープラスミドベクターによってコードされる、
項目１７～２７のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目３０．前記トランスジェニック細菌細胞は、前記細胞内で作動可能なプロモーター配列の制御下で、特にＴ７プロモーター（配列番号３１）、ｌａｃプロモーター（配列番号３２）、ｔａｃプロモーター（配列番号３３）、又はｔｒｃプロモーター（配列番号３４）の制御下で、前記異種発現又は過剰発現される酵素をコードする１つ又は複数のプラスミドを含み、より特に：
－ ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がｔｒｃプロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にあり；及び／又は
－ ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にある、
項目１７～２８のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目３１．
－ タンパク質フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼは、配列番号１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号１の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有し、及び／又は
－ タンパク質ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼは、配列番号２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号２の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有し、及び／又は
－ タンパク質プレフェン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号３の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有し、及び／又は
－ タンパク質ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼは、配列番号４と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号４の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有し、及び／又は
－ タンパク質４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼは、配列番号０３５と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号０３５の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有する、
項目１７～２９のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目
項目１．ヒドロキシチロソールを製造する方法であって、以下の酵素：
ａ． フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０）
を異種発現し、以下の各々の酵素：
ｂ． ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ）
ｃ． プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ）
ｄ． ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼ（ｈｐａＢＣ＊）
を過剰発現するトランスジェニック細菌細胞を：
・ ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びエリスロース４－リン酸（Ｅ４Ｐ）の代謝前駆体、特にグルコース、及び
・ 任意に、補助剤としてのフェニルアラニン
を含む培地で増殖し、そして
前記培地からヒドロキシチロソールを抽出する、前記方法。
項目２．前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属であり、特に前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ種であり、より特に前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株である、項目１に記載の方法。
項目３．前記フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、酵母由来であり、特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来である、項目１又は２に記載の方法。
項目４．前記４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ由来であり、特にＥ．ｃｏｌｉ由来である、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
項目５．前記４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、アミノ酸置換Ｓ２１０Ｔ、Ａ２１１Ｌ、及びＱ２１２Ｅを含む、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
項目６．前記トランスジェニック細菌細胞は、以下のタンパク質：
－ アルコールデヒドロゲナーゼ、
－ ＤＮＡ結合性転写調節タンパク質（ｔｙｒＲ）、及び
－ チロシンアミノトランスフェラーゼ
のいずれも過剰発現しない、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
項目７．前記トランスジェニック細菌細胞の唯一異種発現される遺伝子は、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼである、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
項目８．前記過剰発現される遺伝子及び導入遺伝子は、１つ又は複数のプラスミドベクターを介して前記トランスジェニック細菌細胞に導入され、特に：
－ フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ、及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼは、中コピープラスミドベクターによってコードされ、及び／又は
－ ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼは、低コピープラスミドベクターによってコードされている、
項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
項目９．前記トランスジェニック細菌細胞は、前記細胞内で作動可能なプロモーター配列の制御下で、特にＴ７プロモーター（配列番号３１）、ｌａｃプロモーター（配列番号３２）、ｔａｃプロモーター（配列番号３３）、又はｔｒｃプロモーター（配列番号３４）の制御下で、前記異種発現又は過剰発現される酵素をコードする１つ又は複数のプラスミドを含み、より特に：
－ ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にある、
項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
項目１０．前記異種発現及び／又は過剰発現される遺伝子の発現は、イソプロピル－β－ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって誘導され、特に約０．１ｍＭの濃度のＩＰＴＧを９６時間添加することによって誘導される、項目９に記載の方法。
項目１１．前記培地は、１０～５０ｇ／Ｌのグルコースを含み、特に１５～３０ｇ／Ｌのグルコースを含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
項目１２．前記導入遺伝子は、前記トランスジェニック細菌細胞における発現に対してコドン最適化されている、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
項目１３．前記培地は：
・ ５～１０ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、
・ ２～４ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、
・ ０．２５～１ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、
・ ０．５～１．５ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、
・ １～３％（ｗ／ｖ）グルコース、
・ ０．０１～０．０５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、
・ ３～７ｍＭ ＭｇＳＯ４、
・ ０．００５～０．０２ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２、
・ ０．５～２．０ｇ／Ｌ アスコルビン酸、及び
・ 抗生物質、特に５０～２００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１０～５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、及び２５～４５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールである前記抗生物質、
を含む、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
項目１４．ドデカノールが前記培地に添加され、特に約２５％ドデカノール（ｖ／ｖ）が前記培地に添加される、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
項目１５．前記細胞を、２％（ｖ／ｖ）以上のＯ２で増殖し、特に２～４％（ｖ／ｖ）のＯ２で増殖する、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
項目１６．
ａ．タンパク質フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼは、配列番号１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号１の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有し、及び／又は
ｂ．タンパク質ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼは、配列番号２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号２の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有し、及び／又は
ｃ．タンパク質プレフェン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号３の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有し、及び／又は
ｄ．タンパク質４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼは、配列番号０３５と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号０３５の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有する、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
項目１７．項目１～１６のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目１８．トランスジェニック細胞であって、以下の酵素：
ａ． フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０）
を異種発現し、かつ以下の各々の酵素：
ｂ． ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ）
ｃ． プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ）
を過剰発現し、かつ以下の各々の遺伝子：
ｉ． ｐｈｅＡＬ（二機能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ）
ｉｉ． ｆｅａＢ（フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ）
を発現しない、
前記トランスジェニック細胞。
項目１９．トランスジェニック細胞であって、以下の各々の酵素：
ａ． フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０）；
ｂ． ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ８５Ａ１）；
を異種発現し、かつ以下の各々の酵素：
ｃ． ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ）
ｄ． プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ）
を過剰発現し、かつ以下の各々の遺伝子：
ｉ． ｐｈｅＡＬ（二機能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ）
ｉｉ． ｆｅａＢ（フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ）、
を発現しない、
前記トランスジェニック細胞。
項目２０．トランスジェニック細胞であって、以下の酵素：
ａ． フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０）
を異種発現し、かつ以下の各々の酵素：
ｂ． ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ）、
ｃ． プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ）、
ｄ． ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼ（ｈｐａＢＣ＊）
を過剰発現する、前記トランスジェニック細胞。
項目２１．前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属であり、特に前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ種であり、より特に前記トランスジェニック細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株である、項目１７～２０のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目２２．前記フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、酵母由来であり、特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来である、項目１７～２１のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目２３．前記４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ由来であり、特にＥ．ｃｏｌｉ由来である、項目１７又は２０～２２のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目２４．前記４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、アミノ酸置換Ｓ２１０Ｔ、Ａ２１１Ｌ、及びＱ２１２Ｅを含む、項目１７又は２０～２３のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目２５．ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、植物由来であり、特にＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来であり、より特にＡ．ｔｈａｌｉａｎａ由来である、項目１７若しくは１９、又は項目２１～２２のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目２６．前記トランスジェニック細菌細胞は、以下のタンパク質：
－ アルコールデヒドロゲナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３９４５１；ＥＣ：１．１．１．１）、
－ ＤＮＡ結合性転写調節タンパク質（ｔｙｒＲ ＮＣＢＩ ＧｅｎＰｅｐｔ：ＮＰ＿４１５８３９．１）、及び
－ チロシンアミノトランスフェラーゼ、（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４６９３、ＥＣ：２．６．１．５７）
のいずれも過剰発現しない、項目１７～２５のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目２７．前記トランスジェニック細胞の唯一異種発現される遺伝子は、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼである、項目１８又は２０～２６のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目２８．前記トランスジェニック細胞の唯一異種発現される遺伝子は、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ及びウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼである、項目１９又は２１～２６のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目２９．前記過剰発現される遺伝子及び導入遺伝子は、１つ又は複数のプラスミドベクターを介して前記トランスジェニック細菌細胞に導入され、特に：
－ フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼが、中コピープラスミドベクターによってコードされ、及び／又は
－ ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼが、低コピープラスミドベクターによってコードされ、及び／又は
－ ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼが、低コピープラスミドベクターによってコードされる、
項目１７～２７のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目３０．前記トランスジェニック細菌細胞は、前記細胞内で作動可能なプロモーター配列の制御下で、特にＴ７プロモーター（配列番号３１）、ｌａｃプロモーター（配列番号３２）、ｔａｃプロモーター（配列番号３３）、又はｔｒｃプロモーター（配列番号３４）の制御下で、前記異種発現又は過剰発現される酵素をコードする１つ又は複数のプラスミドを含み、より特に：
－ ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がｔｒｃプロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にあり、及び／又は
－ プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にあり；及び／又は
－ ４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下にある、
項目１７～２８のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
項目３１．
－ タンパク質フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼは、配列番号１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号１の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有し、及び／又は
－ タンパク質ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼは、配列番号２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号２の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有し、及び／又は
－ タンパク質プレフェン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号３の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有し、及び／又は
－ タンパク質ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼは、配列番号４と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号４の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有し、及び／又は
－ タンパク質４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼは、配列番号０３５と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超過の配列同一性を有し、かつ配列番号０３５の触媒活性の少なくとも７５％の触媒活性を有する、
項目１７～２９のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞。
【0050】
材料及び方法
クローニング戦略
遺伝子クローニング及びベクター増殖にはＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、マサチューセッツ州、米国）を用いた。この菌株は、適切な抗生物質濃度のルリア・ベルタニ（ＬＢ）培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）で培養した。この培地の固形バージョンには、２０ｇ／Ｌの寒天を含んだ。培養はすべて３７℃で行い、液体培養の場合は振盪条件下（２００ｒｐｍ）で行った。長期保存のため、選択培地の一晩培養液にグリセロールを最終濃度３０％（ｖ／ｖ）まで加え、－８０℃の冷凍庫で保存した。
クローニング戦略
遺伝子クローニング及びベクター増殖にはＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、マサチューセッツ州、米国）を用いた。この菌株は、適切な抗生物質濃度のルリア・ベルタニ（ＬＢ）培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）で培養した。この培地の固形バージョンには、２０ｇ／Ｌの寒天を含んだ。培養はすべて３７℃で行い、液体培養の場合は振盪条件下（２００ｒｐｍ）で行った。長期保存のため、選択培地の一晩培養液にグリセロールを最終濃度３０％（ｖ／ｖ）まで加え、－８０℃の冷凍庫で保存した。
【0051】
この研究で使用した遺伝子は、ＬｉｆｅＥＣＯ Ｔｈｅｒｍａｌ ＣｙｃｌｅｒでＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、米国）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。プライマーはすべてＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（コーラルビル、米国）から購入した。ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ ＤＮＡキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、アーバイン、米国）を用いてＤＮＡ断片を精製した。
【0052】
プラスミドはＰｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて抽出した。すべての消化は、適切なＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ（登録商標）制限エンドヌクレアーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。ライゲーションはＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行い、Ｍｉｘ ＆ Ｇｏ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ＆Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞及びＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。ライゲーションの成功は、ＤｒｅａｍＴａｑ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたコロニーＰＣＲによって確認し、さらにシーケンシング（ＳｔａｂＶｉｄａ、リスボン、ポルトガル）によって確認した。手順は製造元の指示に従って実施した。
【0053】
ｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子及びコドン最適化遺伝子ＳｃＡＲＯ１０＊、ＫｐＰＤＣ、ＥｉｐｄＣ、及びＡｔＵＧＴ８５Ａ１を、ＩＤＴ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（コーラルビル、米国）から購入し、ｔｙｒＡｆｂｒ及びＳｃＡＲＯ１０＊の場合はｐＥＴ－２１ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ダルムシュタット、ドイツ）にクローニングし、ＫｐＰＤＣ及びＥｉｐｄＣの場合はｐＪＥＴ１．２ベクター（ＣｌｏｎｅＪＥＴ ＰＣＲクローニングキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングし、ＵＧＴ遺伝子の場合はｐＥＴ－２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ダルムシュタット、ドイツ）にクローニングした。ａｒｏＦｆｂｒ及びｈｐａＢＣ＊遺伝子は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（マサチューセッツ州、米国）のＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムＤＮＡから増幅した。ｈｐａＢＣ＊遺伝子は、チロソールに対する活性を向上させるために、ＨｐａＢサブユニットのＳ２１０Ｔ、Ａ２１１Ｌ及びＱ２１２Ｅで変異させた（Ｃｈｅｎ、２０１９）。ａｄｈＰ＊は、Ｉｓａｂｅｌ Ｒｏｃｈａ氏のグループ（ミーニョ大学、ポルトガル）の厚意により提供された。
【0054】
プラスミドの構築及び菌株
プラスミドｐＥＴ－２１ａ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ、及びｐＲＳＦＤｕｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ダルムシュタット、ドイツ）を用いて、Ｔ７ｌａｃプロモーター及びリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の制御下で各タンパク質を個別に発現させた。すべてのプラスミドを従来の分子生物学的手法によって構築し、プラスミド構築の成功はコロニーＰＣＲと適切なプライマーを用いた目的の領域のシーケンシングによって確認した。
プラスミドｐＥＴ－２１ａ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ、及びｐＲＳＦＤｕｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ダルムシュタット、ドイツ）を用いて、Ｔ７ｌａｃプロモーター及びリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の制御下で各タンパク質を個別に発現させた。すべてのプラスミドを従来の分子生物学的手法によって構築し、プラスミド構築の成功はコロニーＰＣＲと適切なプライマーを用いた目的の領域のシーケンシングによって確認した。
【0055】
遺伝子クローニング及びプラスミド増殖の宿主としてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを用い、一方で親株であるＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）はチロソール、サリドロシド、ヒドロキシチロソールを製造（産生）するように操作した。すべての菌株について、適切な抗生物質濃度（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、３０μｇ／ｍＬのカナマイシン、及び３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）を含むＬＢ寒天プレートで陽性形質転換体を単離し、３７℃で一晩培養した。形質転換の成功を確認するため、数個の形質転換コロニーを、適切な抗生物質を加えたＬＢ培地で一晩培養した。その後、プラスミドを抽出し、適切な制限酵素で消化し、１％（ｗ／ｖ）のアガロースゲルで消化を実行することにより、正しい断片の長さを確認した。
【0056】
チロソールプラスミド及び菌株の構築
アンピシリン耐性マーカーを持つプラスミドｐＥＴ－２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、遺伝子ａｄｈＰ＊、ａｒｏＦｆｂｒ、ｔｙｒＡｆｂｒ及びコドン最適化遺伝子ＳｃＡＲＯ１０＊をクローニングした。最適化されたフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子ＳｃＡＲＯ１０＊を、プライマー対ＡＲＯ１０＊＿ｐｅｔ＿ｆｗ／ＡＲＯ１０＊＿ＲＢＳ＿ｒｅｖ（プライマーは表１に示す）を用いてＰＣＲによって増幅し、プラスミドｐＥＴ－２１ａ（＋）を、プライマー対ｐｅｔ２１ａ＿ｆｗ／ｐｅｔ２１ａ＿ｒｅｖを用いてＰＣＲによって増幅した。これらの２つの断片を、環状ポリメラーゼ伸長クローニング（ＣＰＥＣ）を用いて融合した（Ｑｕａｎ，Ｊ．ら，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ６，２４２－２５１（２０１１））。次に、このＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで制限したプライマーＡＲＯ１０＊＿ｐｅｔ＿ｆｗ及びＡＲＯ１０＿ｈｉｎｄｉｉｉ＿ｒｅｖを用いてＰＣＲで増幅し、またこれらの酵素で制限したプラスミドｐＥＴ－２１ａ（＋）にクローニングし、ｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊を生成した。Ｄ１４７Ｎ変異を持つａｒｏＦｆｂｒのＰＣＲ産物を、プライマー対ａｒｏＦ＿ｆｂｒ＿ＲＢＳ＿ｆｗ／ａｒｏＦ＿Ｄ１４７Ｎ＿ｒｅｖ、及びａｒｏＦ＿Ｄ１４７Ｎ＿ｆｗ／ａｒｏＦ＿ｆｂｒ＿ＲＢＳ＿ｒｅｖを用いて、ＰＣＲで２つの断片に増幅した。これらの２つの断片をプライマー対ａｒｏＦ＿ｆｂｒ＿ＲＢＳ＿ｆｗ／ａｒｏＦ＿ｆｂｒ＿ＲＢＳ＿ｒｅｖを用いてＰＣＲ法で融合し、かつ前の構築物のＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩ制限部位に制限及びライゲーションし、ｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒを生成した。Ｍ５３Ｉ及びＡ３５４Ｖの変異を持つコリスミ酸ムターゼ又はプレフェン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子ｔｙｒＡｆｂｒは、ＩＤＴ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国）から取り寄せ、前の構築物にクローニングするためにＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで制限して、ｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒを生成した。アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ａｄｈＰ＊は、Ｉｓａｂｅｌ Ｒｏｃｈａ教授のグループ（ミーニョ大学、ポルトガル）の厚意により提供されたプラスミドｐＥＴ－２８ａ（＋）＿ａｄｈＰ＊から、プライマーＴｙｒ２＿ａｄｈｐ＿ＪＯ＿ｆｗ、及びＴｙｒ２＿ａｄｈｐ＿ＪＯ＿ｒｅｖを用いてＰＣＲ法により増幅し、プラスミドｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒをＮｏｔＩで制限した後、該増幅断片及び該プラスミドを次いでＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｌｕｓキット（ＴａＫａＲａ、フランス）を用いてライゲーションし、ｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ａｄｈＰ＊＿ｔｙｒＡｆｂｒを形成した。
アンピシリン耐性マーカーを持つプラスミドｐＥＴ－２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、遺伝子ａｄｈＰ＊、ａｒｏＦｆｂｒ、ｔｙｒＡｆｂｒ及びコドン最適化遺伝子ＳｃＡＲＯ１０＊をクローニングした。最適化されたフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子ＳｃＡＲＯ１０＊を、プライマー対ＡＲＯ１０＊＿ｐｅｔ＿ｆｗ／ＡＲＯ１０＊＿ＲＢＳ＿ｒｅｖ（プライマーは表１に示す）を用いてＰＣＲによって増幅し、プラスミドｐＥＴ－２１ａ（＋）を、プライマー対ｐｅｔ２１ａ＿ｆｗ／ｐｅｔ２１ａ＿ｒｅｖを用いてＰＣＲによって増幅した。これらの２つの断片を、環状ポリメラーゼ伸長クローニング（ＣＰＥＣ）を用いて融合した（Ｑｕａｎ，Ｊ．ら，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ６，２４２－２５１（２０１１））。次に、このＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで制限したプライマーＡＲＯ１０＊＿ｐｅｔ＿ｆｗ及びＡＲＯ１０＿ｈｉｎｄｉｉｉ＿ｒｅｖを用いてＰＣＲで増幅し、またこれらの酵素で制限したプラスミドｐＥＴ－２１ａ（＋）にクローニングし、ｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊を生成した。Ｄ１４７Ｎ変異を持つａｒｏＦｆｂｒのＰＣＲ産物を、プライマー対ａｒｏＦ＿ｆｂｒ＿ＲＢＳ＿ｆｗ／ａｒｏＦ＿Ｄ１４７Ｎ＿ｒｅｖ、及びａｒｏＦ＿Ｄ１４７Ｎ＿ｆｗ／ａｒｏＦ＿ｆｂｒ＿ＲＢＳ＿ｒｅｖを用いて、ＰＣＲで２つの断片に増幅した。これらの２つの断片をプライマー対ａｒｏＦ＿ｆｂｒ＿ＲＢＳ＿ｆｗ／ａｒｏＦ＿ｆｂｒ＿ＲＢＳ＿ｒｅｖを用いてＰＣＲ法で融合し、かつ前の構築物のＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩ制限部位に制限及びライゲーションし、ｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒを生成した。Ｍ５３Ｉ及びＡ３５４Ｖの変異を持つコリスミ酸ムターゼ又はプレフェン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子ｔｙｒＡｆｂｒは、ＩＤＴ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国）から取り寄せ、前の構築物にクローニングするためにＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで制限して、ｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒを生成した。アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ａｄｈＰ＊は、Ｉｓａｂｅｌ Ｒｏｃｈａ教授のグループ（ミーニョ大学、ポルトガル）の厚意により提供されたプラスミドｐＥＴ－２８ａ（＋）＿ａｄｈＰ＊から、プライマーＴｙｒ２＿ａｄｈｐ＿ＪＯ＿ｆｗ、及びＴｙｒ２＿ａｄｈｐ＿ＪＯ＿ｒｅｖを用いてＰＣＲ法により増幅し、プラスミドｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒをＮｏｔＩで制限した後、該増幅断片及び該プラスミドを次いでＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｌｕｓキット（ＴａＫａＲａ、フランス）を用いてライゲーションし、ｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ａｄｈＰ＊＿ｔｙｒＡｆｂｒを形成した。
【0057】
【表1】
【0058】
あるいは、カナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドｐＥＴ－２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）も、ａｒｏＦｆｂｒ及びｔｙｒＡｆｂｒの遺伝子のクローニングに使用した。そのために、ｐＥＴ－２８ａ（＋）プラスミドをｐｅｔ２１ａ＿ｆｗ及びｐｅｔ２８ａ＿ＲＢＳ＿ｒｅｖのプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、そしてａｒｏＦｆｂｒ遺伝子を、ＲＲＢＳ＿ｌｉｎｋｅｒ＿ｓｔ７＿ｆｗ及びａｒｏＦ＿ｆｂｒ＿ＲＢＳ＿ｒｅｖのプライマーを用いて、ｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒプラスミドから増幅した。その後、環状ポリメラーゼ伸長クローニング（ＣＰＥＣ）を用いて両断片を結合し、ｐＥＴ－２８ａ（＋）＿ａｒｏＦｆｂｒを生成した。その後、このプラスミドをプライマーｐｅｔ２１ａ＿ｆｗとａｒｏＦ＿ｆｂｒ＿ＲＢＳ＿ｒｅｖとを用いてＰＣＲで増幅し、ｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子はｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒプラスミドからプライマーＲＢＳ＿ｌｉｎｋｅｒ＿ｓｔ７＿ｆｗとｔｙｒＡ＿ｆｂｒ＿ｐｅｔ＿ｒｅｖとを用いて増幅した。最後に、これら２つの断片をＣＰＥＣ戦略で融合し、ｐＥＴ－２８ａ（＋）＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒを形成した。
【0059】
さらに、ＳｃＡＲＯ１０＊の代わりに、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．由来のＥｉｐｄＣ遺伝子とＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ由来のＫｐＰＤＣ遺伝子によりそれぞれコードされる２つの別のデカルボキシラーゼを試験した。そのために、事前にｐＪＥＴ１．２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングした合成遺伝子をＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで制限し、またこれらの酵素で制限したｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒにクローニングし、それぞれ、ｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＥｉｐｄＣ＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒ及びｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＫｐＰＤＣ＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒを生成した。
【0060】
本研究で構築及び使用したプラスミド及びチロソール産生株を表２に示す。
【0061】
【表2】
【0062】
サリドロシドプラスミド及び菌株の構築
プラスミドｐＥＴ－２８ａ（＋）を用いて、チロソールからサリドロシドへの変換で構成される提示の経路の最終段階に対応するコドン最適化遺伝子ＡｔＵＧＴ８５Ａ１をクローニングした。ＡｔＵＧＴ８５Ａ１遺伝子を、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩに制限部位を有するプライマーＵＧＴ８５ａ１＿ｎｃｏｉ＿ｆｗ及びＵＧＴ８５Ａ１＿ｂａｍｈｉ＿ｒｅｖ（プライマーを表３に示す）を用いてＰＣＲにより増幅し、ｐＥＴ－２８ａ（＋）にクローニングし、ｐＥＴ－２８ａ（＋）＿ＡｔＵＧＴ８５Ａ１を生成した。
プラスミドｐＥＴ－２８ａ（＋）を用いて、チロソールからサリドロシドへの変換で構成される提示の経路の最終段階に対応するコドン最適化遺伝子ＡｔＵＧＴ８５Ａ１をクローニングした。ＡｔＵＧＴ８５Ａ１遺伝子を、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩに制限部位を有するプライマーＵＧＴ８５ａ１＿ｎｃｏｉ＿ｆｗ及びＵＧＴ８５Ａ１＿ｂａｍｈｉ＿ｒｅｖ（プライマーを表３に示す）を用いてＰＣＲにより増幅し、ｐＥＴ－２８ａ（＋）にクローニングし、ｐＥＴ－２８ａ（＋）＿ＡｔＵＧＴ８５Ａ１を生成した。
【0063】
さらに、異なるプラスミドのコピー数を試験するために、ＡｔＵＧＴ８５Ａ１遺伝子を、それぞれクロラムフェニコール及びカナマイシンの耐性マーカーを有するプラスミドｐＡＣＹＣＤｕｅｔ及びｐＲＳＦＤｕｅｔにクローニングした。ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ＿ＡｔＵＧＴ８５Ａ１プラスミド及びｐＲＳＦＤｕｅｔ＿ＡｔＵＧＴ８５Ａ１プラスミドを構築するために、ＡｔＵＧＴ８５Ａ１遺伝子をｐＥＴ２８ａ（＋）＿ＡｔＵＧＴ８５Ａ１プラスミドからＮｄｅＩ及びＸｈｏＩを用いて抽出し、またこれらの酵素で消化したｐＡＣＹＣＤｕｅｔ及びｐＲＳＦＤｕｅｔにそれぞれクローニングした。
【0064】
さらに、サリドロシド産生を増加させるために、プライマーｐａｃｙｃ＿ｔｒｃ＿ｍｃ２＿ｆｗ及びｐａｃｙｃ＿ｔｒｃ＿ｍｃ２＿ｒｅｖを用いてＰＣＲ法を使用して、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ＿ＡｔＵＧＴ８５Ａ１内のＴ７ｌａｃプロモーターをｔｒｃプロモーターに置き換え、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ＿ｔｒｃ－プロモーター＿ＡｔＵＧＴ８５Ａ１を生成した。
【0065】
【表3】
【0066】
本研究で構築及び使用したプラスミド及びサリドロシド産生株を表４に示す。
【表4】
【0067】
ヒドロキシチロソールプラスミド及び菌株の構築
プラスミドｐＥＴ－２８ａ（＋）を用いて、チロソールをヒドロキシチロソールに変換する役割の酵素であるＨｐａＢサブユニットのＳ２１０Ｔ、Ａ２１１Ｌ、及びＱ２１２Ｅに変異を持つｈｐａＢＣ＊遺伝子をクローニングした。Ｃｈｅｎらによって同定されたこれらの変異は、チロソールに対するＨｐａＢの活性及び特異性を向上させる。ｈｐａＢＣ＊遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）のゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、プライマー対ｈｐａＢ＿ｒｂｓ＿ｘｂａｉ／ｈｐａｂ＿２１０＿２＿ｒｅｖ及びｈｐａｂ＿２１０＿２＿ｆｗ／ｈｐａｃ＿ｂａｍｈｉ＿ｒｅｖを用いて、所定の変異を挿入するために２つの断片にＰＣＲにより増幅した（プライマーを表５に示す）。これらの２つの断片をプライマー対ｈｐａＢ＿ｒｂｓ＿ｘｂａｉ／ｈｐａｃ＿ｂａｍｈｉ＿ｒｅｖを用いてＰＣＲ法を用いて融合し、プラスミドｐＥＴ－２８ａ（＋）のＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ制限部位に制限及びライゲーションし、ｐＥＴ－２８ａ（＋）＿ｈｐａＢＣ＊を形成した。
プラスミドｐＥＴ－２８ａ（＋）を用いて、チロソールをヒドロキシチロソールに変換する役割の酵素であるＨｐａＢサブユニットのＳ２１０Ｔ、Ａ２１１Ｌ、及びＱ２１２Ｅに変異を持つｈｐａＢＣ＊遺伝子をクローニングした。Ｃｈｅｎらによって同定されたこれらの変異は、チロソールに対するＨｐａＢの活性及び特異性を向上させる。ｈｐａＢＣ＊遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）のゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、プライマー対ｈｐａＢ＿ｒｂｓ＿ｘｂａｉ／ｈｐａｂ＿２１０＿２＿ｒｅｖ及びｈｐａｂ＿２１０＿２＿ｆｗ／ｈｐａｃ＿ｂａｍｈｉ＿ｒｅｖを用いて、所定の変異を挿入するために２つの断片にＰＣＲにより増幅した（プライマーを表５に示す）。これらの２つの断片をプライマー対ｈｐａＢ＿ｒｂｓ＿ｘｂａｉ／ｈｐａｃ＿ｂａｍｈｉ＿ｒｅｖを用いてＰＣＲ法を用いて融合し、プラスミドｐＥＴ－２８ａ（＋）のＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ制限部位に制限及びライゲーションし、ｐＥＴ－２８ａ（＋）＿ｈｐａＢＣ＊を形成した。
【0068】
さらに、プラスミドコピー数の違いによる影響を試験するため、ｈｐａＢＣ＊遺伝子を、それぞれクロラムフェニコールとカナマイシンとの耐性マーカーを持つプラスミドｐＡＣＹＣＤｕｅｔとｐＲＳＦＤｕｅｔとにクローニングした。いずれの場合も、ｈｐａＢＣ＊遺伝子をｐＥＴ－２８ａ（＋）＿ｈｐａＢＣ＊プラスミドから抽出し、各プラスミドのＮｄｅＩ及びＸｈｏＩの制限部位に制限及びライゲーションし、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ＿ｈｐａＢＣ＊及びｐＲＳＦＤｕｅｔ＿ｈｐａＢＣ＊を生成した。
【0069】
【表5】
【0070】
本研究で構築及び使用したプラスミド及びヒドロキシチロソール産生株を表６に示す。
【0071】
【表6】
【0072】
菌株の維持及び培養培地
全菌株をＬＢブロス培地（１０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）及びＭ９Ｙ培地で培養した。Ｍ９Ｙ培地は、１×Ｍ９最小塩類（Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、８．５ｇ／Ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、３．０ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ、０．５ｇ／Ｌ；ＮＨ４Ｃｌ、１．０ｇ／Ｌ）及び２％（ｗ／ｖ）グルコースを含有し、かつ０．０２５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、５ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．０１１ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２、及び適切な濃度の抗生物質（１００μｇ／ｍＬ アンピシリン、３０μｇ／ｍＬ カナマイシン、及び３４μｇ／ｍＬ クロラムフェニコール）を補充したものであった。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｐｈｅＡＬΔｆｅａＢをバックグラウンドとする株には、２０ｍｇ／Ｌのフェニルアラニンを補充した。
全菌株をＬＢブロス培地（１０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）及びＭ９Ｙ培地で培養した。Ｍ９Ｙ培地は、１×Ｍ９最小塩類（Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、８．５ｇ／Ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、３．０ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ、０．５ｇ／Ｌ；ＮＨ４Ｃｌ、１．０ｇ／Ｌ）及び２％（ｗ／ｖ）グルコースを含有し、かつ０．０２５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、５ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．０１１ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２、及び適切な濃度の抗生物質（１００μｇ／ｍＬ アンピシリン、３０μｇ／ｍＬ カナマイシン、及び３４μｇ／ｍＬ クロラムフェニコール）を補充したものであった。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｐｈｅＡＬΔｆｅａＢをバックグラウンドとする株には、２０ｍｇ／Ｌのフェニルアラニンを補充した。
【0073】
操作したＥ．ｃｏｌｉ株の単一コロニーを、適切な抗生物質を含む１０ｍｌの液体ＬＢ培地に植菌するのに使用し、３７℃で一晩、２００ｒｐｍで撹拌して増殖させた。次いで、前培養液を、初期光学密度（ＯＤ６００）０．１で、適切な抗生物質を含む５０ｍＬのＬＢ培地を含有する２５０ｍＬ振盪フラスコに移した。最初に、細胞密度（ＯＤ６００）が０．６～０．８になるまで、２００ｒｐｍ、３７℃のロータリーシェーカーで培養した。この時点で、チロソール及びサリドロシドの場合、細胞を遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間）により回収し、適切な抗生物質を加えた５０ｍｌのＭ９Ｙ培地に再懸濁し、最終濃度０．１ｍＭ又は１ｍＭのイソプロピル１－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で遺伝子発現を誘導した。誘導後、培養液は２２℃又は３０℃で、２００ｒｐｍで撹拌しながらインキュベートした。ＨＰＬＣ分析及び細胞密度測定のため、０時間、誘導時間２４、４８、７２、９６、及び１２１時間に培養液の試料を採取した。ヒドロキシチロソールの場合、以下の複数の変更を加えて上記のように細胞を培養した：ａ）１ｇ／Ｌのアスコルビン酸の添加、ｂ）誘導１６時間での増殖培地への１２．５ｍｌの１－ドデカノールの添加又は非添加。これらの配合は、ヒドロキシチロソールの回収率を向上させることを目的とした。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析及び細胞密度測定のため、０時間、誘導時間２４時間、４８時間に培養液試料を採取した。実験はすべて３重で行い、試料はＨＰＬＣ及び核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）により分析した。
【0074】
分析方法
発酵培地のチロソール、サリドロシド、ヒドロキシチロソール、グルコース、及び有機酸の含有量を、ＨＰＬＣを使用して分析した。ＮＭＲ法を使用して、培地試料中のチロソール、サリドロシド、及びヒドロキシチロソールの存在を確認し、二相性増殖の１－ドデカノール画分中のヒドロキシチロソールを定量した。
発酵培地のチロソール、サリドロシド、ヒドロキシチロソール、グルコース、及び有機酸の含有量を、ＨＰＬＣを使用して分析した。ＮＭＲ法を使用して、培地試料中のチロソール、サリドロシド、及びヒドロキシチロソールの存在を確認し、二相性増殖の１－ドデカノール画分中のヒドロキシチロソールを定量した。
【0075】
各サンプリングでは、この培養液から１ｍＬの培養液を取り出し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、培地から細胞を分離した。次に、上清を孔径０．２２μｍのメンブレンフィルターでＨＰＬＣバイアル中に濾過して、さらなる分析まで－２０°Ｃで保存した。
【0076】
チロソール、サリドロシド、及びヒドロキシチロソールの濃度は、ＳＨＩＭＡＤＺＵのＤＡＤ ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ検出器を搭載したＳＨＩＭＡＤＺＵ（京都、日本）のＨＰＬＣ装置のモデルＮｅｘｅｒａ Ｘ２により定量した。試料は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（カリフォルニア州、米国）のＫｉｎｅｔｅｘ（登録商標）Ｃ１８カラム（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ；粒子径１．７μｍ）を用いて分析した。チロソール及びサリドロシドの分析については、発酵上清試料５μｌを、溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ中０．１％のギ酸）及び溶媒Ｂ（０．１％のギ酸含有アセトニトリル）を含む移動相とともにカラムに適用した。各試料は３０℃、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、及び以下のＨＰＬＣ条件で溶出した：溶媒Ｂ濃度は５％に１分間維持され、その後４分間かけて５％から９％に増加させ、５分間かけて９％から３０％に増加させた後、６分間３０％に維持され、最後に２分間かけて３０％から５％に減少させた。化合物は２８０ｎｍで検出した。この条件では、チロソール及びサリドロシドの保持時間はそれぞれ７分及び５分であった。培養液中のチロソール及びサリドロシドを定量するため、一連の既知濃度のチロソール標準物質（Ｆｉｓｈｅｒ、米国）及びサリドロシド標準物質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を水に溶解して検量線を作成した。検量線のＲ２係数は０．９９超過であった。ヒドロキシチロソールの分析には、発酵上清試料１０μｌを、溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ中０．５％の酢酸）及び溶媒Ｂ（１００％のアセトニトリル）を含む移動相とともにカラムに適用した。各試料を３０℃、流速０．３ｍＬ／ｍｉｎ、及び以下のＨＰＬＣ条件で溶出した：溶媒Ｂ濃度は５％で２分間維持させ、その後２分間かけて５％から９％に増加させ、その後６分間かけて９％から３０％に増加させ、その後４分間３０％に維持させ、最後に２分間かけて３０％から５％に減少させた。ヒドロキシチロソールを８分の保持時間で２８０ｎｍにて検出した。培養液中のヒドロキシチロソールを定量するために、水に溶解した一連の既知濃度のヒドロキシチロソール標準物質（ＴＣＩ、日本）を用いて検量線を作成した。検量線のＲ２係数は０．９９超過であった。
【0077】
グルコース及び発酵産物の定量分析は、ＪａｓｃｏのＵＶ－２０７５ Ｐｌｕｓ検出器及びＲＩ－４０３０ Ｐｌｕｓ検出器を搭載した同じくＪａｓｃｏ（日本）のモデルＬＣ－ＮｅｔＩＩ／ＡＤＣのＨＰＬＣ装置を用いて実施した。試料は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ（米国）のＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈカラム（３００ｍｍ×７．７ｍｍ）を用いて分析し、６０°Ｃに保ち、０．５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４を移動相として流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで使用した。グルコース及びエタノールを屈折率（ＲＩ）検出器（４０３０、Ｊａｓｃｏ）で検出し、有機酸（酢酸、ギ酸、乳酸、コハク酸、及びピルビン酸）をＵＶ検出器を用いて２１０ｎｍで検出した。各代謝物の既知濃度の標準物質を注入することにより検量線を得た。試料中の代謝物濃度は、検量線と試料のピーク面積を比較することにより算出した。検量線のＲ２係数は０．９９超過であった。
【0078】
二相性増殖の１－ドデカノール画分中のヒドロキシチロソールは、ＢＲＵＫＥＲ（米国）のＮＭＲ装置モデルＡｖａｎｃｅ ＩＩ ４００ＭＨｚ分光計を使用して、プロトン磁気共鳴分光法（１Ｈ）により定量した。そのために、３００μｌの１－ドデカノール画分を３００μｌの重水素化クロロホルムと５μｌの２５０ｍＭのギ酸溶液（内部標準）で希釈した。チロソール、ヒドロキシチロソール、及びサリドロシドの生成を確認するために、ＨＰＬＣで分析した陽性試料は、速やかに１０％（ｖ／ｖ）のＤ２Ｏを入れたＮＭＲ管に移し、上記の分光計で読み取った。
【0079】
すべての細胞の光学密度（ＯＤ６００）の測定は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（米国）のＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ分光光度計を用いて行った。
【0080】
統計分析
実験はすべて独立して３回行った。実験データは平均値±標準偏差で表される。スチューデントのｔ検定を使用して統計分析を実施した。Ｐ値が０．０５未満の場合、操作した株間の差異は有意であるとみなした。
実験はすべて独立して３回行った。実験データは平均値±標準偏差で表される。スチューデントのｔ検定を使用して統計分析を実施した。Ｐ値が０．０５未満の場合、操作した株間の差異は有意であるとみなした。
【0081】
配列
タンパク質配列：
タンパク質配列：
【表7】
【0082】
遺伝子配列：
【表8】
【0083】
プロモーター配列
【表9】
【実施例】
【0084】
この研究の主な目標は、１リットルあたりグラムの力価までＥ．ｃｏｌｉ内でのチロソール及びその誘導体の製造のバイオプロセスを最適化することであった。これは、これらの化合物には付加価値が高く、重要な生物学的活性及び有用性があるためである。そのために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を操作して、図１に示した経路でチロソール及びサリドロシドを産生した。
【0085】
実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるチロソール生合成経路の実装
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に実装されたチロソール生合成経路（図１）は、グルコースから始まり、これはいくつかの工程を経て４－ヒドロキシフェニルピルビン酸に変換され、最後にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０＊）及び内因性アルコールデヒドロゲナーゼによって４－ヒドロキシフェニルピルビン酸がチロソールに変換されて終了する。最初に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の遺伝子ＡＲＯ１０＊を選択してｐＥＴ－２１ａ（＋）に挿入し、得られたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）にクローニングしてＳＴ５３株を形成した。ＳＴ５３株は、Ｍ９Ｙ培地中、１ｍＭのｉＰＴＧで４８時間誘導した後、０．０５±０．００ｇ／Ｌのチロソールを生成した。この結果は、ＳｃＡＲＯ１０と内因性ＡＤＨとを組み合わせて過剰発現させると、グルコースを基質として使用して４－ヒドロキシフェニルピルビン酸をチロソールに変換できることを裏付けるものであった。チロソールの産生を改善するために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦｆｂｒ）及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡｆｂｒ）をｐＥＴ－２１ａ（＋）又はｐＥＴ－２８ａ（＋）に挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）で過剰発現させて、それぞれＳＴ９３株とＳＴ９６株とを得た。これら２つの株は、これら３つの遺伝子がオペロン様システムでよりよく働くのか、或いはプロモーター－遺伝子組織でよりよく働くのかを理解するために構築した。ＳＴ９３株及び９６株を用いて、Ｍ９Ｙ培地中１ｍＭのＩＰＴＧで４８時間誘導した後、チロソール産生が有意に促進され（ｐ＜０．００１）、ＳＴ９３株では０．２１±０．０１ｇ／Ｌ、ＳＴ９６株では０．１４±０．００ｇ／Ｌを達成した。さらに、チロソールの産生が細胞密度（ＯＤ６００ｎｍ）と逆相関することを確認することができ、これによりチロソールの産生が細胞増殖に影響することが示された。これらの結果はまた、同一ベクターでのＳｃＡＲＯ１０＊の異種発現、及びａｒｏＦｆｂｒ及びｔｙｒＡｆｂｒの過剰発現によって、チロソール産生が促進されたことを示している。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に実装されたチロソール生合成経路（図１）は、グルコースから始まり、これはいくつかの工程を経て４－ヒドロキシフェニルピルビン酸に変換され、最後にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０＊）及び内因性アルコールデヒドロゲナーゼによって４－ヒドロキシフェニルピルビン酸がチロソールに変換されて終了する。最初に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の遺伝子ＡＲＯ１０＊を選択してｐＥＴ－２１ａ（＋）に挿入し、得られたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）にクローニングしてＳＴ５３株を形成した。ＳＴ５３株は、Ｍ９Ｙ培地中、１ｍＭのｉＰＴＧで４８時間誘導した後、０．０５±０．００ｇ／Ｌのチロソールを生成した。この結果は、ＳｃＡＲＯ１０と内因性ＡＤＨとを組み合わせて過剰発現させると、グルコースを基質として使用して４－ヒドロキシフェニルピルビン酸をチロソールに変換できることを裏付けるものであった。チロソールの産生を改善するために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦｆｂｒ）及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡｆｂｒ）をｐＥＴ－２１ａ（＋）又はｐＥＴ－２８ａ（＋）に挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）で過剰発現させて、それぞれＳＴ９３株とＳＴ９６株とを得た。これら２つの株は、これら３つの遺伝子がオペロン様システムでよりよく働くのか、或いはプロモーター－遺伝子組織でよりよく働くのかを理解するために構築した。ＳＴ９３株及び９６株を用いて、Ｍ９Ｙ培地中１ｍＭのＩＰＴＧで４８時間誘導した後、チロソール産生が有意に促進され（ｐ＜０．００１）、ＳＴ９３株では０．２１±０．０１ｇ／Ｌ、ＳＴ９６株では０．１４±０．００ｇ／Ｌを達成した。さらに、チロソールの産生が細胞密度（ＯＤ６００ｎｍ）と逆相関することを確認することができ、これによりチロソールの産生が細胞増殖に影響することが示された。これらの結果はまた、同一ベクターでのＳｃＡＲＯ１０＊の異種発現、及びａｒｏＦｆｂｒ及びｔｙｒＡｆｂｒの過剰発現によって、チロソール産生が促進されたことを示している。
【0086】
実施例２：ＩＰＴＧ濃度の最適化
イソプロピル－β－ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は、強力なＴ７プロモーター及びｔｒｃプロモーターの効果的な誘導剤であり、クローニング手順で一般的に使用される。チロソール産生株の誘導に最適なＩＰＴＧ濃度を選択するため、Ｍ９Ｙ培地中で、０．１ｍＭ及び１ｍＭのＩＰＴＧで４８時間誘導した。この条件下で、ＳＴ９３株は０．１ｍＭ及び１ｍＭのＩＰＴＧでの誘導後、それぞれ０．６５±０．０７ｇ／Ｌ及び０．２１±０．０１ｇ／Ｌのチロソールを得た（表１０）。このようにして、０．１ｍＭのＩＰＴＧがチロソール産生株を誘導するのに最適な濃度であることが判明した。
イソプロピル－β－ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は、強力なＴ７プロモーター及びｔｒｃプロモーターの効果的な誘導剤であり、クローニング手順で一般的に使用される。チロソール産生株の誘導に最適なＩＰＴＧ濃度を選択するため、Ｍ９Ｙ培地中で、０．１ｍＭ及び１ｍＭのＩＰＴＧで４８時間誘導した。この条件下で、ＳＴ９３株は０．１ｍＭ及び１ｍＭのＩＰＴＧでの誘導後、それぞれ０．６５±０．０７ｇ／Ｌ及び０．２１±０．０１ｇ／Ｌのチロソールを得た（表１０）。このようにして、０．１ｍＭのＩＰＴＧがチロソール産生株を誘導するのに最適な濃度であることが判明した。
【0087】
【表10】
【0088】
実施例３：最適なフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼの選択
フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼはエールリッヒ経路に関与する酵素であり、フェニルピルビン酸からフェニルアセトアルデヒドへの脱炭酸を触媒する（図２ａ）。本研究では、どのデカルボキシラーゼがチロソール産生に最適な酵素であるかを評価するために、それぞれ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．及びＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ由来のＳｃＡＲＯ１０＊、ＥｉｐｄＣ及びＫｐＰＤＣをｐＥＴ－２１ａ（＋）にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。このようにして、それぞれＳｃＡＲＯ１０＊、ＫｐＰＤＣ、及びＥｉｐｄＣを保有するＳＴ９３株、ＳＴ１３５株、及びＳＴ１３６株を構築した。これらの株をグルコース２％のＭ９Ｙで増殖し、０．１ｍＭのＩＰＴＧで７２時間誘導した。結果は、Ｍ９Ｙ培地において０．１ｍＭのｉＰＴＧでの誘導の７２時間後に、ＳＴ９３株は０．７３±０．０４ｇ／Ｌのチロソールを産生し、ＳＴ１３５株は０．３１±０．０５ｇ／Ｌのチロソールを産生でき、ＳＴ１３６株は０．０９±０．０１ｇ／Ｌのチロソールしか産生しないことを示している（図２ｂ）。これを考慮すると、ＳＴ９３株はＳＴ１３５株よりも２倍多くの量のチロソールを産生し、ＳＴ１３６株と比較して８倍多くの量のチロソールを産生したため、チロソール産生に最適なデカルボキシラーゼはＡＲＯ１０＊であった。さらにまたしても、チロソールの量が多いほど（ＳＴ９３）、細胞密度（ＯＤ６００ｎｍ）が低い（図２ｂ）。
フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼはエールリッヒ経路に関与する酵素であり、フェニルピルビン酸からフェニルアセトアルデヒドへの脱炭酸を触媒する（図２ａ）。本研究では、どのデカルボキシラーゼがチロソール産生に最適な酵素であるかを評価するために、それぞれ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．及びＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ由来のＳｃＡＲＯ１０＊、ＥｉｐｄＣ及びＫｐＰＤＣをｐＥＴ－２１ａ（＋）にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。このようにして、それぞれＳｃＡＲＯ１０＊、ＫｐＰＤＣ、及びＥｉｐｄＣを保有するＳＴ９３株、ＳＴ１３５株、及びＳＴ１３６株を構築した。これらの株をグルコース２％のＭ９Ｙで増殖し、０．１ｍＭのＩＰＴＧで７２時間誘導した。結果は、Ｍ９Ｙ培地において０．１ｍＭのｉＰＴＧでの誘導の７２時間後に、ＳＴ９３株は０．７３±０．０４ｇ／Ｌのチロソールを産生し、ＳＴ１３５株は０．３１±０．０５ｇ／Ｌのチロソールを産生でき、ＳＴ１３６株は０．０９±０．０１ｇ／Ｌのチロソールしか産生しないことを示している（図２ｂ）。これを考慮すると、ＳＴ９３株はＳＴ１３５株よりも２倍多くの量のチロソールを産生し、ＳＴ１３６株と比較して８倍多くの量のチロソールを産生したため、チロソール産生に最適なデカルボキシラーゼはＡＲＯ１０＊であった。さらにまたしても、チロソールの量が多いほど（ＳＴ９３）、細胞密度（ＯＤ６００ｎｍ）が低い（図２ｂ）。
【0089】
実施例４：ａｄｈＰ＊過剰発現の影響
Ｉｓａｂｅｌ Ｒｏｃｈａ教授のグループの厚意により提供されたアルコールデヒドロゲナーゼＡｄｈＰ＊は、４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドをチロソールに還元することができ、大きな基質に対してより優れた性能を発揮するように改良された（図３ａ）。ａｄｈＰ＊遺伝子をｐＥＴ－２８ａ（＋）又はｐＥＴ－２１ａ（＋）にクローニングし、それぞれＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して、ＳＴ８１株及びＳＴ１１４株を生成し、ａｄｈＰ＊の過剰発現がチロソール産生に及ぼす影響を評価した。Ｍ９Ｙ培地中０．１ｍＭのｉＰＴＧで４８時間誘導した後に、ＳＴ８１株は０．６０±０．１８ｇ／Ｌのチロソールを産生でき、ＳＴ１１４株は０．５１±０．０１ｇ／Ｌのチロソールを産生できた（図３ｂ）。これらの結果を、図３ｂに示した同じ条件下でＳＴ９３株が得た力価（０．６５±０．０７ｇ／Ｌ）と比較すると、ＳＴ９３株とＳＴ８１株が得た力価に有意差はないが（ｐ＞０．０５）、ＳＴ１１４株はＳＴ９３株と比較して有意にチロソール生成量が少ない（ｐ＜０．０１）ことから、ａｄｈＰ＊の過剰発現はチロソール産生を改善しなかったことが検証できた（データは示さず）。
Ｉｓａｂｅｌ Ｒｏｃｈａ教授のグループの厚意により提供されたアルコールデヒドロゲナーゼＡｄｈＰ＊は、４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドをチロソールに還元することができ、大きな基質に対してより優れた性能を発揮するように改良された（図３ａ）。ａｄｈＰ＊遺伝子をｐＥＴ－２８ａ（＋）又はｐＥＴ－２１ａ（＋）にクローニングし、それぞれＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して、ＳＴ８１株及びＳＴ１１４株を生成し、ａｄｈＰ＊の過剰発現がチロソール産生に及ぼす影響を評価した。Ｍ９Ｙ培地中０．１ｍＭのｉＰＴＧで４８時間誘導した後に、ＳＴ８１株は０．６０±０．１８ｇ／Ｌのチロソールを産生でき、ＳＴ１１４株は０．５１±０．０１ｇ／Ｌのチロソールを産生できた（図３ｂ）。これらの結果を、図３ｂに示した同じ条件下でＳＴ９３株が得た力価（０．６５±０．０７ｇ／Ｌ）と比較すると、ＳＴ９３株とＳＴ８１株が得た力価に有意差はないが（ｐ＞０．０５）、ＳＴ１１４株はＳＴ９３株と比較して有意にチロソール生成量が少ない（ｐ＜０．０１）ことから、ａｄｈＰ＊の過剰発現はチロソール産生を改善しなかったことが検証できた（データは示さず）。
【0090】
さらに、ＡｄｈＰ＊触媒に最適な条件を調べるため、ＳＴ８１株を２２℃のＭ９Ｙ培地中で、０．１ｍＭのｉＰＴＧで４８時間誘導した。この条件下で、ＳＴ８１株は０．２９±０．０２ｇ／Ｌのチロソールを産生できたが（図３ｂ）、これはこの株を３０℃で誘導した場合に得られた力価よりもさらに低かった。すべての結果を考慮すると、チロソールを産生する最良の株及び条件は、３０℃にてＭ９Ｙ中で０．１ｍＭのｉＰＴＧにより７２時間誘導した後のＳＴ９３であった（０．７３±０．０４ｇ／Ｌ）。
【0091】
実施例５：芳香族アミノ酸経路の操作
前述のとおり、Ｅ．ｃｏｌｉの内因性ＡＤＨは４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドをチロソールに還元することが可能であるが、この中間体化合物は、ＦｅａＢと名付けられた内因性フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼによっても４－ヒドロキシフェニルアセテートに酸化され得る（図４ａ）。一方、二機能性酵素のコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ（ＰｈｅＡ）は、フェニルアラニン及びチロシンの生合成における非常に重要なノードを担当しており、炭素フラックスをコリスミ酸からフェニルアラニンに転換する役割を担っている（図４ａ）。その結果、これら２つの遺伝子の破壊は、炭素フラックスをチロソール産生に向かわせることが知られている。チロソールの産生を改善するために、ｆｅａＢ遺伝子とｐｈｅＡＬ遺伝子とのノックアウトを保有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ＳｉｌｉｃｏＬｉｆｅの研究室で入手可能）を、ＳｃＡＲＯ１０＊、ａｒｏＦｆｂｒ、及びｔｙｒＡｆｂｒの遺伝子を持つｐＥＴ－２１ａ（＋）に宿主として使用し、ＳＴ１９１株を生成した。さらに、本発明者らはまた、ＳｃＡＲＯ１０＊、ａｒｏＦｆｂｒ及びｔｙｒＡｆｂｒの遺伝子をｐＥＴ－２１ａ（＋）に、ａｄｈＰ＊遺伝子をｐＥＴ－２８ａ（＋）に形質転換することにより、ＳＴ１７０株を得て、ｆｅａＢ及びｐｈｅＡＬの欠失株におけるａｄｈＰ＊の過剰発現も評価した。これらの２株を増殖した結果、本発明者らは、Ｍ９Ｙ培地中０．１ｍＭのＩＰＴＧで９６時間誘導した後、ＳＴ１９１は０．７８±０．０２ｇ／Ｌのチロソールを産生し、一方でＳＴ１７０は１．０３±０．０７ｇ／Ｌのチロソールを産生すると結論づけた（図４ｂ）。チロソールの産生は増殖７２時間でもまだ増加していたため、増殖は９６時間まで延長したことに注意されたい。細胞密度（ＯＤ６００ｎｍ）については、ノックアウト株の場合、ノックアウトしていないそれぞれの株（ＳＴ９３及びＳＴ８１）に比べて増殖が低下していることが確認できた。チロソールへの炭素の偏りだけでなく、この減少は、フェニルアラニン栄養要求を引き起こすｐｈｅＡＬのノックアウトによるフェニルアラニン不足によっても部分的に説明できる。したがって、酵母エキス０．０２５％を含有するＭ９Ｙ培地のフェニルアラニン量では、この栄養要求をカバーしきれないのではないかと本発明者らは考えた。この仮説を検証するため、ＳＴ１７０株とＳＴ１９１株とを、２０ｍｇ／Ｌのフェニルアラニンを補充したＭ９Ｙ培地中で、０．１ｍＭのＩＰＴＧで９６時間誘導した。この条件下で、ＳＴ１７０株とＳＴ１９１株とは、それぞれ０．８０±０．０７ｇ／Ｌと１．４１±０．０２ｇ／Ｌのチロソールを生成した（図４ｂ）。
前述のとおり、Ｅ．ｃｏｌｉの内因性ＡＤＨは４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドをチロソールに還元することが可能であるが、この中間体化合物は、ＦｅａＢと名付けられた内因性フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼによっても４－ヒドロキシフェニルアセテートに酸化され得る（図４ａ）。一方、二機能性酵素のコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ（ＰｈｅＡ）は、フェニルアラニン及びチロシンの生合成における非常に重要なノードを担当しており、炭素フラックスをコリスミ酸からフェニルアラニンに転換する役割を担っている（図４ａ）。その結果、これら２つの遺伝子の破壊は、炭素フラックスをチロソール産生に向かわせることが知られている。チロソールの産生を改善するために、ｆｅａＢ遺伝子とｐｈｅＡＬ遺伝子とのノックアウトを保有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ＳｉｌｉｃｏＬｉｆｅの研究室で入手可能）を、ＳｃＡＲＯ１０＊、ａｒｏＦｆｂｒ、及びｔｙｒＡｆｂｒの遺伝子を持つｐＥＴ－２１ａ（＋）に宿主として使用し、ＳＴ１９１株を生成した。さらに、本発明者らはまた、ＳｃＡＲＯ１０＊、ａｒｏＦｆｂｒ及びｔｙｒＡｆｂｒの遺伝子をｐＥＴ－２１ａ（＋）に、ａｄｈＰ＊遺伝子をｐＥＴ－２８ａ（＋）に形質転換することにより、ＳＴ１７０株を得て、ｆｅａＢ及びｐｈｅＡＬの欠失株におけるａｄｈＰ＊の過剰発現も評価した。これらの２株を増殖した結果、本発明者らは、Ｍ９Ｙ培地中０．１ｍＭのＩＰＴＧで９６時間誘導した後、ＳＴ１９１は０．７８±０．０２ｇ／Ｌのチロソールを産生し、一方でＳＴ１７０は１．０３±０．０７ｇ／Ｌのチロソールを産生すると結論づけた（図４ｂ）。チロソールの産生は増殖７２時間でもまだ増加していたため、増殖は９６時間まで延長したことに注意されたい。細胞密度（ＯＤ６００ｎｍ）については、ノックアウト株の場合、ノックアウトしていないそれぞれの株（ＳＴ９３及びＳＴ８１）に比べて増殖が低下していることが確認できた。チロソールへの炭素の偏りだけでなく、この減少は、フェニルアラニン栄養要求を引き起こすｐｈｅＡＬのノックアウトによるフェニルアラニン不足によっても部分的に説明できる。したがって、酵母エキス０．０２５％を含有するＭ９Ｙ培地のフェニルアラニン量では、この栄養要求をカバーしきれないのではないかと本発明者らは考えた。この仮説を検証するため、ＳＴ１７０株とＳＴ１９１株とを、２０ｍｇ／Ｌのフェニルアラニンを補充したＭ９Ｙ培地中で、０．１ｍＭのＩＰＴＧで９６時間誘導した。この条件下で、ＳＴ１７０株とＳＴ１９１株とは、それぞれ０．８０±０．０７ｇ／Ｌと１．４１±０．０２ｇ／Ｌのチロソールを生成した（図４ｂ）。
【0092】
これらの結果を分析すると、フェニルアラニンの添加はＳＴ１９１でのチロソール産生を有意に改善し（ｐ＜０．００１）、ＳＴ１７０では減少することが確認できる。さらに、これらの菌株の増殖はフェニルアラニンの添加によって異なる挙動を示し、フェニルアラニンを添加しない場合の増殖と比較して、ＳＴ１７０ではパラメータが改善され、ＳＴ１９１では応答がなかった。結論として、本研究で達成されたグルコースからの最高のチロソール力価は、１０ｍＭに相当するＳＴ１９１株で１．４１±０．０２ｇ／Ｌであり、Ｍ９Ｙ培地で０．１ｍＭのＩＰＴＧと２０ｍｇ／Ｌのフェニルアラニンの添加とにより９６時間誘導した後に達成された。この結果は、Ｙａｎｇらによる力価を裏付けるものであり、Ｙａｎｇらは、ＳｃＡＲＯ１０＊を異種発現させ、かつｆｅａＢ、ｐｈｅＡ、ｔｙｒＢ、及びｔｙｒＲの遺伝子をノックアウトしたＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５を操作することにより、Ｍ９Ｙ培地中０．６ｍＭのＩＰＴＧで４８時間誘導した後、グルコースから１．３２ｇ／Ｌのチロソールを産生した（Ｙａｎｇら、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２６，２６１５－２６２１）。しかしながら、この研究では、ＳｃＡＲＯ１０＊遺伝子、ａｒｏＦｆｂｒ遺伝子、及びｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子を保有し、かつｆｅａＢ遺伝子及びｐｈｅＡＬ遺伝子を欠失させた株により、本発明者らはＹａｎｇらよりも６％多くチロソールを産生している。さらに、本発明者らは、ｐＥＴシステムにクローニングされたオペロン様システムにおけるａｒｏＦｆｂｒ及びｔｙｒＡｆｂｒの過剰発現を伴うＳｃＡＲＯ１０＊の異種発現が、最初に構築された株（ＳＴ５３）と比較して、チロソール産生を約９２％改善することを確認している。さらに、ｆｅａＢ遺伝子とｐｈｅＡＬ遺伝子とをノックアウトした株は、ノックアウトしていない株に比べ、チロソールの産生が約５０％増加した。一方、ＡｄｈＰ＊の過剰発現では、チロソール産生は改善されず、それどころか、上述のとおり、この酵素を持たない株と比較して７％減少した。
【0093】
サリドロシドの産生
サリドロシドはフェニルエタノイド配糖体であり、植物界に広く分布し、近年アダプトゲン作用における重要な役割のために注目されてきた。過去１０年間に、Ｅ．ｃｏｌｉでの新しい代謝遺伝子操作的アプローチが実施されたが、より効果的な戦略が求められている。
サリドロシドはフェニルエタノイド配糖体であり、植物界に広く分布し、近年アダプトゲン作用における重要な役割のために注目されてきた。過去１０年間に、Ｅ．ｃｏｌｉでの新しい代謝遺伝子操作的アプローチが実施されたが、より効果的な戦略が求められている。
【0094】
実施例６：Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるサリドロシド生合成経路の操作
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）で作成されるサリドロシド生合成経路を、さまざまなプラスミドでのＳｃＡＲＯ１０＊遺伝子及びＡｔＵＧＴ８５Ａ１遺伝子の異種発現、及びａｒｏＦｆｂｒ遺伝子及びｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子の過剰発現によって達成した。この経路の重要な工程は、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ８５Ａ１）によって媒介されるチロソールのサリドロシドへのグリコシル化である。この遺伝子をｐＥＴ－２８ａ（＋）に挿入し、ｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊を保有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に、及びｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒを保有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、それぞれＳＴ９５株及びＳＴ９２株を得た。両方の株をグルコースを含むＭ９Ｙ培地で好気的に増殖させ、ＳＴ９５株に対してＭ９Ｙ培地中１ｍＭのＩＰＴＧによる誘導、及びａｒｏＦｆｂｒ及びｔｙｒＡｆｂｒの過剰発現の４８時間後に、サリドロシド及びチロソールが最大０．０２±０．０１ｇ／Ｌを示し、一方ＳＴ９２株は、同じ条件で、ＳＴ９５株よりも１０倍高い力価のサリドロシドを生成することができた（サリドロシド０．２４±０．０５ｇ／Ｌ及びチロソール０．１３±０．０３ｇ／Ｌ）。この結果は、ＳＴ９３株によるチロソール産生で得られた結果を支持するものであり、ＳｃＡＲＯ１０＊の異種発現を伴うａｒｏＦｆｂｒ及びｔｙｒＡｆｂｒの過剰発現が、ＵＧＴ８５Ａ１によるチロソール産生、ひいてはサリドロシド産生を増強したことを示すものである。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）で作成されるサリドロシド生合成経路を、さまざまなプラスミドでのＳｃＡＲＯ１０＊遺伝子及びＡｔＵＧＴ８５Ａ１遺伝子の異種発現、及びａｒｏＦｆｂｒ遺伝子及びｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子の過剰発現によって達成した。この経路の重要な工程は、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ８５Ａ１）によって媒介されるチロソールのサリドロシドへのグリコシル化である。この遺伝子をｐＥＴ－２８ａ（＋）に挿入し、ｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊を保有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に、及びｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒを保有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、それぞれＳＴ９５株及びＳＴ９２株を得た。両方の株をグルコースを含むＭ９Ｙ培地で好気的に増殖させ、ＳＴ９５株に対してＭ９Ｙ培地中１ｍＭのＩＰＴＧによる誘導、及びａｒｏＦｆｂｒ及びｔｙｒＡｆｂｒの過剰発現の４８時間後に、サリドロシド及びチロソールが最大０．０２±０．０１ｇ／Ｌを示し、一方ＳＴ９２株は、同じ条件で、ＳＴ９５株よりも１０倍高い力価のサリドロシドを生成することができた（サリドロシド０．２４±０．０５ｇ／Ｌ及びチロソール０．１３±０．０３ｇ／Ｌ）。この結果は、ＳＴ９３株によるチロソール産生で得られた結果を支持するものであり、ＳｃＡＲＯ１０＊の異種発現を伴うａｒｏＦｆｂｒ及びｔｙｒＡｆｂｒの過剰発現が、ＵＧＴ８５Ａ１によるチロソール産生、ひいてはサリドロシド産生を増強したことを示すものである。
【0095】
実施例７：サリドロシドのＩＰＴＧ試験及び培地の最適化
０．１ｍＭのＩＰＴＧによる誘導がまた、サリドロシド産生に最適な濃度かどうかを検証する目的で、ＳＴ９２株をＭ９Ｙ培地で０．１ｍＭのＩＰＴＧで４８時間誘導した。この条件下で、ＳＴ９２株はＭ９Ｙ培地で４８時間の誘導後、０．４１±０．０７ｇ／Ｌのサリドロシドと０．１５±０．０４ｇ／Ｌのチロソールとを生成した（表１１）。この結果から、チロソール産生と同様に、サリドロシド産生も１ｍＭのＩＰＴＧの代わりに０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導することで有意に増強されることが示された（ｐ＜０．００１）。
０．１ｍＭのＩＰＴＧによる誘導がまた、サリドロシド産生に最適な濃度かどうかを検証する目的で、ＳＴ９２株をＭ９Ｙ培地で０．１ｍＭのＩＰＴＧで４８時間誘導した。この条件下で、ＳＴ９２株はＭ９Ｙ培地で４８時間の誘導後、０．４１±０．０７ｇ／Ｌのサリドロシドと０．１５±０．０４ｇ／Ｌのチロソールとを生成した（表１１）。この結果から、チロソール産生と同様に、サリドロシド産生も１ｍＭのＩＰＴＧの代わりに０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導することで有意に増強されることが示された（ｐ＜０．００１）。
【0096】
【表11】
【0097】
しかしながら、ＳＴ９２株の代謝は、試験したＩＰＴＧの両方の濃度でチロソールが蓄積されるため、サリドロシド産生においてボトルネックを示した。この蓄積は、次のようなさまざまなシナリオで説明することが可能である：低ｐＨによる増殖停止、ＵＤＰグルコース又は培地から枯渇した他の重要な栄養素の発酵代謝の欠乏の帰結、又は不適切な酵素の生成／フォールディング。それ故、サリドロシド産生におけるグルコース及びｐＨの影響をみるために異なるＭ９Ｙ培地の組成を試験した。そのために、ＳＴ９２株を、２倍量の塩類（２×Ｍ９Ｙ）を含むＭ９Ｙにおいて０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、５、１０又は２０ｇ／Ｌのグルコースを４８時間かけて補完した。これらの条件下で、ＳＴ９２株は、５ｇ／Ｌのグルコースから０．１０±０．００ｇ／Ｌのサリドロシド及び０．０８±０．００ｇ／Ｌのチロソール、１０ｇ／Ｌのグルコースから０．２６±０．００ｇ／Ｌのサリドロシド及び０．１２±０．０２ｇ／Ｌのチロソール、並びに２０ｇ／Ｌのグルコースから０．３４±０．０１ｇ／Ｌのサリドロシド及び０．１９±０．００ｇ／Ｌのチロソールを生成可能であった（表１２）。グルコースの供給に関しては、２×Ｍ９Ｙ培地に２０ｇ／Ｌのグルコースを添加することでサリドロシド産生が促進されたが、２０ｇ／Ｌのグルコースで補完したＭ９Ｙ培地では最良のサリドロシド力価を達成した（０．４１±０．０７ｇ／Ｌ）。この結果は、２倍量の塩類を添加してＭ９Ｙ培地を緩衝化しても、サリドロシドの産生は改善されないことを示している。
【0098】
【表12】
【0099】
一方、培地のｐＨの変動は、２０ｇ／Ｌのグルコースで補完した２×Ｍ９Ｙ培地では、５ｇ／Ｌ及び１０ｇ／Ｌのグルコースを補充した２×Ｍ９Ｙ培地よりも有意に大きかった（ｐ＜０．０１）。このｐＨ変動は酢酸産生に起因するもので、２×Ｍ９Ｙ培地を２０ｇ／Ｌのグルコースで補完すると、酢酸産生はより高くなった。さらに、２０ｇ／Ｌのグルコースで補完した２×Ｍ９Ｙ培地及びＭ９Ｙ培地のｐＨの変動は、あまり有意ではなかった（ｐ＜０．０５）。これらすべてを考慮すると、サリドロシド産生に最適な条件は、２０ｇ／Ｌのグルコースで補完したＭ９Ｙ培地中で、０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導することであった。
【0100】
実施例８：ＡｔＵＧＴ８５Ａ１遺伝子に対する動的制御
培地最適化のあらゆる試みにもかかわらず、サリドロシド産生のボトルネックは克服されていない。そこで、ＵＧＴ８５Ａ１の発現レベルを異なるコピー数のプラスミドにクローニングすることで変化させることがサリドロシド産生に効果があるかどうかを理解するために新たな戦略を実施した（図５ａ）。このように、ＡｔＵＧＴ８５Ａ１をｐＡＣＹＣＤｕｅｔ（低コピー）又はｐＲＳＦＤｕｅｔ（高コピー）のプラスミドにクローニングし、ｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒを保有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、それぞれＳＴ１１６株及びＳＴ１３１株を得た。これらの菌株の増殖は、ＳＴ１１６では０．４９±０．１０ｇ／Ｌのサリドロシド、及び０．３９±０．０６ｇ／Ｌのチロソール、並びにＳＴ１３１では０．３５±０．０６ｇ／Ｌのサリドロシド、及び０．０３±０．００ｇ／Ｌのチロソールの産生値を示した。試料は０．１ｍＭのＩＰＴＧ及びＭ９Ｙ培地での誘導後４８時に採取した（図５ｂ）。
培地最適化のあらゆる試みにもかかわらず、サリドロシド産生のボトルネックは克服されていない。そこで、ＵＧＴ８５Ａ１の発現レベルを異なるコピー数のプラスミドにクローニングすることで変化させることがサリドロシド産生に効果があるかどうかを理解するために新たな戦略を実施した（図５ａ）。このように、ＡｔＵＧＴ８５Ａ１をｐＡＣＹＣＤｕｅｔ（低コピー）又はｐＲＳＦＤｕｅｔ（高コピー）のプラスミドにクローニングし、ｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒを保有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、それぞれＳＴ１１６株及びＳＴ１３１株を得た。これらの菌株の増殖は、ＳＴ１１６では０．４９±０．１０ｇ／Ｌのサリドロシド、及び０．３９±０．０６ｇ／Ｌのチロソール、並びにＳＴ１３１では０．３５±０．０６ｇ／Ｌのサリドロシド、及び０．０３±０．００ｇ／Ｌのチロソールの産生値を示した。試料は０．１ｍＭのＩＰＴＧ及びＭ９Ｙ培地での誘導後４８時に採取した（図５ｂ）。
【0101】
これらの結果をＳＴ９２株で得られたもの（サリドロシド０．４１±０．０７ｇ／Ｌ、チロソール０．１５±０．０４ｇ／Ｌ）と比較すると、ＳＴ９２株と１１６株とではサリドロシドの産生量に有意差はなかったが（ｐ＞０．０５）、ＳＴ１１６株は、絶対値においてより多くのサリドロシドを蓄積したと結論づけることができた。また、ＳＴ１１６ではＳＴ９２に比べてチロソールの蓄積量がより多い。一方、ＳＴ１３１株に対応する高コピープラスミドｐＲＳＦＤｕｅｔは、サリドロシドの産生の値が最も低かった（図５ｂ）。
【0102】
さらに、プラスミドコピー数を増加させると（ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ＜ｐＥＴ－２８ａ（＋）＜ｐＲＳＦＤｕｅｔ）、チロソールのサリドロシドへの変換はほぼ完全に達成されたが、サリドロシドの力価は増強されず、これはおそらくＵＧＴ８５Ａ１が不溶性である可能性があることを示している。このことを考慮して、チロソール変換とサリドロシド力価とを最適化するために、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ＿ＡｔＵＧＴ８５Ａ１のＴ７プロモーターをｔｒｃプロモーターに置き換えてＳＴ１７６株を生成した。この株は、Ｍ９Ｙ培地中、０．１ｍＭのｉＰＴＧで４８時間誘導した後、１．６４±０．０７ｇ／Ｌのサリドロシドを産生可能であり、０．１０±０．０６ｇ／Ｌのチロソールしか産生できなかった（図５ｂ）。したがって、これらの結果から、ＡｔＵＧＴ８５Ａ１を低コピー数のプラスミド（ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ）で、かつそれほど強くないプロモーター（ｔｒｃプロモーター）の影響下で異種発現させることにより、チロソールのサリドロシドへの変換がほぼ完全に行われ、サリドロシドの力価が向上したことが明らかになった。
【0103】
実施例９：ｆｅａＢ及びｐｈｅＡＬ遺伝子のノックアウトの影響
サリドロシドへの代謝の流れを改善するために、本発明者らは、最良の２つの遺伝子組織をクローニングし、その産生を改善することを試み、この最良の遺伝子組織を、ｆｅａＢ遺伝子及びｐｈｅＡＬ遺伝子ノックアウトを保有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）にクローニングし（図６ａ）、ｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ＿ＡｔＵＧＴ８５Ａ１を有するＳＴ１７２株、並びにｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ＿ｔｒｃ－ｐｍ＿ＡｔＵＧＴ８５Ａ１を有するＳＴ１７８株を生成した。Ｍ９Ｙ培地で０．１ｍＭのＩＰＴＧで９６時間の誘導後、ＳＴ１７２株は０．５９±０．０９ｇ／Ｌのサリドロシド及び０．８０±０．０８ｇ／Ｌのチロソールを産生でき、ＳＴ１７８株は２．７０±０．０６ｇ／Ｌのサリドロシド及び０．０９±０．０２ｇ／Ｌのチロソールを産生できた（図６ｂ）。
サリドロシドへの代謝の流れを改善するために、本発明者らは、最良の２つの遺伝子組織をクローニングし、その産生を改善することを試み、この最良の遺伝子組織を、ｆｅａＢ遺伝子及びｐｈｅＡＬ遺伝子ノックアウトを保有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）にクローニングし（図６ａ）、ｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ＿ＡｔＵＧＴ８５Ａ１を有するＳＴ１７２株、並びにｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ＿ｔｒｃ－ｐｍ＿ＡｔＵＧＴ８５Ａ１を有するＳＴ１７８株を生成した。Ｍ９Ｙ培地で０．１ｍＭのＩＰＴＧで９６時間の誘導後、ＳＴ１７２株は０．５９±０．０９ｇ／Ｌのサリドロシド及び０．８０±０．０８ｇ／Ｌのチロソールを産生でき、ＳＴ１７８株は２．７０±０．０６ｇ／Ｌのサリドロシド及び０．０９±０．０２ｇ／Ｌのチロソールを産生できた（図６ｂ）。
【0104】
ここでも、ＳＴ１７８では、大部分のチロソールがサリドロシドに変換され、以前に観察されたように、ＳＴ１７２は、かなりの量のチロソールとともにサリドロシドを蓄積した。結論として、ＡｔＵＧＴ８５Ａ１を低コピープラスミドにクローニングすること、及びより弱いプロモーターの影響下であることで、タンパク質の産生をバランスさせ、サリドロシド力価を有意に改善した。さらに、ノックアウトにより、ノックアウトしていない菌株と比較して、両菌株でサリドロシド産生が向上していることも確認できた。
【0105】
それに加えて、フェニルアラニンのサプリメンテーションがサリドロシド生成に及ぼす影響も評価した。そのために、ＳＴ１７２株とＳＴ１７８株とを、２０ｍｇ／Ｌのフェニルアラニンを補充したＭ９Ｙ培地中で、０．１ｍＭのＩＰＴＧで９６時間誘導した。この条件下で、ＳＴ１７２株は０．４３±０．０１ｇ／Ｌのサリドロシド及び０．９０±０．０３ｇ／Ｌのチロソールを産生でき、ＳＴ１７８株は１．２５±０．４２ｇ／Ｌのサリドロシド及び０．４０±０．１２ｇ／Ｌのチロソールを産生できた（図６ｂ）。これらの結果から、フェニルアラニンの添加は、チロソールの場合とは逆に、サリドロシドの産生を減少させることが示された（データは示さず）。したがって、本研究で達成されたグルコースからの最良のサリドロシド力価は、２０ｇ／Ｌのグルコースで補完されたＭ９Ｙ培地中、０．１ｍＭのＩＰＴＧで１２１時間誘導後に、ＳＴ１７８株（３．１１±０．１９ｇ／Ｌのサリドロシド）によってもたらされた。この結果は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を、ＰｃＡＡＳ及びＡｔＵＧＴ８５Ａ１の異種発現、並びにｔｙｒＲ、ｐｈｅＡ、及びｆｅａＢの遺伝子のノックアウトにより操作することにより、２５℃のＭ９Ｙ培地中、１ｍＭのＩＰＴＧで４８時間誘導した後、グルコースから０．２８ｇ／Ｌのサリドロシドしか産生しなかったＣｈｕｎｇらの結果よりも約１０倍多いサリドロシド量に相当する（Ｃｈｕｎｇ，ら，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，７，１－８，（２０１７））。
【0106】
ヒドロキシチロソールの産生
ヒドロキシチロソールは、オリーブに最も豊富なフェノール性アルコールの１つであり、栄養補助食品、農薬、化粧品、及び食品産業への応用に理想的な複数の特別な特性を持っている。しかし、すべてのすでに行われた研究の他に費用対効果の高いアプローチはまだ見つかっていない。
ヒドロキシチロソールは、オリーブに最も豊富なフェノール性アルコールの１つであり、栄養補助食品、農薬、化粧品、及び食品産業への応用に理想的な複数の特別な特性を持っている。しかし、すべてのすでに行われた研究の他に費用対効果の高いアプローチはまだ見つかっていない。
【0107】
実施例１０：Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるｈｐａＢＣ＊の過剰発現
ヒドロキシチロソールの生合成における基本的な工程は、チロソールからヒドロキシチロソールへの変換である。この工程を媒介するために、文献には複数の可能な候補となる酵素が挙げられている。Ｅｓｐiｎらはキノコのチロシナーゼを使用したが、この酵素は不安定で、フェノール及びアスコルビン酸によってこの活性が阻害される。Ｌｉｅｂｇｏｔｔらが行った別の研究では、異なる細菌由来の４－ヒドロキシフェニル酢酸３－ヒドロキシラーゼが、チロソールをヒドロキシチロソールに変換する役割を担っていることが示された。さらに、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダＦ６（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｆ６）及びハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）のＨＴＢ２４株など、いくつかの芳香族化合物分解微生物の他の天然の加水分解酵素がチロソールをヒドロキシチロソールに変換することを同定した。より最近では、チロソールに対する活性及び特異性を向上させるために、４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼ（ＨｐａＢＣ＊）がＥ．ｃｏｌｉから遺伝子操作された。この操作した酵素により、彼らはチロソールに対する高い活性を達成し、チロソールに対するドッキングエネルギーが野生型ＨｐａＢＣよりもはるかに低いことを発見した。そこで、本研究では、ＨｐａＢＣ＊がＥ．ｃｏｌｉの内因性酵素であり、基質としてのチロソールからのより優れた性能について操作されているため、いずれの酵素からＨｐａＢＣ＊を選択した。このようにして、ヒドロキシチロソールの生合成経路を、ＳｃＡＲＯ１０＊遺伝子の異種発現及びａｒｏＦｆｂｒ遺伝子、ｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子及びｈｐａＢＣ＊遺伝子の過剰発現によって、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に実装した（図７ａ）。この考え方に基づき、ｈｐａＢＣ＊過剰発現、ひいてはヒドロキシチロソール産生におけるプラスミドコピー数の影響を評価するために３つの株を構築した。３株ともｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒを保有しているが、ｈｐａＢＣ＊を、ＳＴ７６株についてはｐＥＴ－２８ａ（＋）に、ＳＴ１１９株についてはｐＡＣＹＣＤｕｅｔに、ＳＴ１３２株についてはｐＲＳＦＤｕｅｔに、クローニングした。その後、すべての株を、ヒドロキシチロソールの酸化を避けるため、１ｇ／Ｌのアスコルビン酸を補充したＭ９Ｙ培地中で、０．１ｍＭのＩＰＴＧで４８時間誘導した。この条件下で、ＳＴ７６株は０．０８±０．０２ｇ／Ｌのヒドロキシチロソールを産生し、ＳＴ１１９株は０．５７±０．０６ｇ／Ｌのヒドロキシチロソールを産生し、ＳＴ１３２株は０．４８±０．１２ｇ／Ｌのヒドロキシチロソールを産生した（図７ｂ）。すべての菌株で、残留のチロソール量が蓄積された（８０ｍｇ／Ｌ未満）。ＳＴ１１９とＳＴ１３２とは、それぞれ低コピープラスミドと高コピープラスミドとを有し、有意に異なる量のヒドロキシチロソールを産生しなかったため（ｐ＞０．０５）、これらの結果は一致しなかった。しかしながら、ＳＴ１３２でのヒドロキシチロソールの産生はＳＴ１１９株及びＳＴ７６株よりも一様でないことに注意することが重要であり、これはプラスミドの不安定性を示している。一方、中コピープラスミドを持つＳＴ７６株は、他の２株よりもヒドロキシチロソールの産生量が少ない株である。さらに、細胞密度（ＯＤ６００ｎｍ）が低かったのはＳＴ１１９株であり、これはチロソール及びサリドロシドで観察されたとおり、ヒドロキシチロソールを多く産生する株であった。また、ヒドロキシチロソールに対する毒性は、ヒドロキシチロソールの濃度が１ｇ／Ｌ未満では報告されていない。一方、この菌株の増殖中に、本発明者らは、培地が濃い色に変化することに気づいた。これは、ヒドロキシチロソールを含む培地成分の酸化を示している。
ヒドロキシチロソールの生合成における基本的な工程は、チロソールからヒドロキシチロソールへの変換である。この工程を媒介するために、文献には複数の可能な候補となる酵素が挙げられている。Ｅｓｐiｎらはキノコのチロシナーゼを使用したが、この酵素は不安定で、フェノール及びアスコルビン酸によってこの活性が阻害される。Ｌｉｅｂｇｏｔｔらが行った別の研究では、異なる細菌由来の４－ヒドロキシフェニル酢酸３－ヒドロキシラーゼが、チロソールをヒドロキシチロソールに変換する役割を担っていることが示された。さらに、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダＦ６（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｆ６）及びハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）のＨＴＢ２４株など、いくつかの芳香族化合物分解微生物の他の天然の加水分解酵素がチロソールをヒドロキシチロソールに変換することを同定した。より最近では、チロソールに対する活性及び特異性を向上させるために、４－ヒドロキシフェニル酢酸３－モノオキシゲナーゼ（ＨｐａＢＣ＊）がＥ．ｃｏｌｉから遺伝子操作された。この操作した酵素により、彼らはチロソールに対する高い活性を達成し、チロソールに対するドッキングエネルギーが野生型ＨｐａＢＣよりもはるかに低いことを発見した。そこで、本研究では、ＨｐａＢＣ＊がＥ．ｃｏｌｉの内因性酵素であり、基質としてのチロソールからのより優れた性能について操作されているため、いずれの酵素からＨｐａＢＣ＊を選択した。このようにして、ヒドロキシチロソールの生合成経路を、ＳｃＡＲＯ１０＊遺伝子の異種発現及びａｒｏＦｆｂｒ遺伝子、ｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子及びｈｐａＢＣ＊遺伝子の過剰発現によって、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に実装した（図７ａ）。この考え方に基づき、ｈｐａＢＣ＊過剰発現、ひいてはヒドロキシチロソール産生におけるプラスミドコピー数の影響を評価するために３つの株を構築した。３株ともｐＥＴ－２１ａ（＋）＿ＳｃＡＲＯ１０＊＿ａｒｏＦｆｂｒ＿ｔｙｒＡｆｂｒを保有しているが、ｈｐａＢＣ＊を、ＳＴ７６株についてはｐＥＴ－２８ａ（＋）に、ＳＴ１１９株についてはｐＡＣＹＣＤｕｅｔに、ＳＴ１３２株についてはｐＲＳＦＤｕｅｔに、クローニングした。その後、すべての株を、ヒドロキシチロソールの酸化を避けるため、１ｇ／Ｌのアスコルビン酸を補充したＭ９Ｙ培地中で、０．１ｍＭのＩＰＴＧで４８時間誘導した。この条件下で、ＳＴ７６株は０．０８±０．０２ｇ／Ｌのヒドロキシチロソールを産生し、ＳＴ１１９株は０．５７±０．０６ｇ／Ｌのヒドロキシチロソールを産生し、ＳＴ１３２株は０．４８±０．１２ｇ／Ｌのヒドロキシチロソールを産生した（図７ｂ）。すべての菌株で、残留のチロソール量が蓄積された（８０ｍｇ／Ｌ未満）。ＳＴ１１９とＳＴ１３２とは、それぞれ低コピープラスミドと高コピープラスミドとを有し、有意に異なる量のヒドロキシチロソールを産生しなかったため（ｐ＞０．０５）、これらの結果は一致しなかった。しかしながら、ＳＴ１３２でのヒドロキシチロソールの産生はＳＴ１１９株及びＳＴ７６株よりも一様でないことに注意することが重要であり、これはプラスミドの不安定性を示している。一方、中コピープラスミドを持つＳＴ７６株は、他の２株よりもヒドロキシチロソールの産生量が少ない株である。さらに、細胞密度（ＯＤ６００ｎｍ）が低かったのはＳＴ１１９株であり、これはチロソール及びサリドロシドで観察されたとおり、ヒドロキシチロソールを多く産生する株であった。また、ヒドロキシチロソールに対する毒性は、ヒドロキシチロソールの濃度が１ｇ／Ｌ未満では報告されていない。一方、この菌株の増殖中に、本発明者らは、培地が濃い色に変化することに気づいた。これは、ヒドロキシチロソールを含む培地成分の酸化を示している。
【0108】
実施例１１：二相性増殖の影響
前述したとおり、ヒドロキシチロソールは抗酸化物質であり、製造過程で酸化されやすく、チロソール又はサリドロシドよりも不安定である。そのほか、ヒドロキシチロソールは１ｇ／Ｌ超過で細胞増殖に対する抑制効果を示すことが報告されている。これを考慮して、本発明者らは、ヒドロキシチロソールを隔離し、その酸化及び細胞毒性を回避できる１－ドデカノールを用いた二相性増殖（ｂｉｐｈａｓｉｃ ｇｒｏｗｔｈ）を設計した。そうするために、本発明者らは、増殖がもはや観察されなくなったとき（タンパク質誘導後１６時間に起こる）、２５％（ｖ／ｖ）の１－ドデカノールを培地に添加した。最大産生は、１ｇ／Ｌのアスコルビン酸を補充し、かつ１２．５ｍｌの１－ドデカノールを添加したＭ９Ｙ培地中で０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いた誘導の４８時間にて検出した（図８ｂ）。結果は、ＳＴ１１９株及びＳＴ１３２株がそれぞれ０．９２±０．１５ｇ／Ｌ及び０．６３±０．０６ｇ／Ｌ、並びに微量のチロソールを産生できたことを示している。１－ドデカノールの添加の有無にかかわらず、ＳＴ１１９株及びＳＴ１３２株によって得られたヒドロキシチロソール力価を比較すると、二相系においてＳＴ１１９株及びＳＴ１３２株では産生がそれぞれ３０％超過及び２０％超過増加したことが確認できる。しかし、細胞密度は改善されず、これは増殖停止がヒドロキシチロソールの蓄積と関連していないことを示している。これらの結果から、二相系がヒドロキシチロソールの産生を安定化することが確認され、ｈｐａＢＣ＊を低コピープラスミド（ＳＴ１１９）にクローニングする場合、ＳＴ１３２株の高コピープラスミドに比べてヒドロキシチロソールの力価が向上することが明らかになった。
前述したとおり、ヒドロキシチロソールは抗酸化物質であり、製造過程で酸化されやすく、チロソール又はサリドロシドよりも不安定である。そのほか、ヒドロキシチロソールは１ｇ／Ｌ超過で細胞増殖に対する抑制効果を示すことが報告されている。これを考慮して、本発明者らは、ヒドロキシチロソールを隔離し、その酸化及び細胞毒性を回避できる１－ドデカノールを用いた二相性増殖（ｂｉｐｈａｓｉｃ ｇｒｏｗｔｈ）を設計した。そうするために、本発明者らは、増殖がもはや観察されなくなったとき（タンパク質誘導後１６時間に起こる）、２５％（ｖ／ｖ）の１－ドデカノールを培地に添加した。最大産生は、１ｇ／Ｌのアスコルビン酸を補充し、かつ１２．５ｍｌの１－ドデカノールを添加したＭ９Ｙ培地中で０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いた誘導の４８時間にて検出した（図８ｂ）。結果は、ＳＴ１１９株及びＳＴ１３２株がそれぞれ０．９２±０．１５ｇ／Ｌ及び０．６３±０．０６ｇ／Ｌ、並びに微量のチロソールを産生できたことを示している。１－ドデカノールの添加の有無にかかわらず、ＳＴ１１９株及びＳＴ１３２株によって得られたヒドロキシチロソール力価を比較すると、二相系においてＳＴ１１９株及びＳＴ１３２株では産生がそれぞれ３０％超過及び２０％超過増加したことが確認できる。しかし、細胞密度は改善されず、これは増殖停止がヒドロキシチロソールの蓄積と関連していないことを示している。これらの結果から、二相系がヒドロキシチロソールの産生を安定化することが確認され、ｈｐａＢＣ＊を低コピープラスミド（ＳＴ１１９）にクローニングする場合、ＳＴ１３２株の高コピープラスミドに比べてヒドロキシチロソールの力価が向上することが明らかになった。
【0109】
実施例：１２ ＩＰＴＧの最適化
チロソール及びサリドロシドのように、ヒドロキシチロソールの産生に最適な誘導条件を評価するために、異なるＩＰＴＧ濃度を試験した。この場合、ＳＴ１１９株を、１ｇ／Ｌのアスコルビン酸を補充し、かつ１２．５ｍＬの１－ドデカノールを添加したＭ９Ｙ培地中で、０．１ｍＭ及び０．２ｍＭのＩＰＴＧで４８時間誘導した。ＳＴ１１９株は、０．２ｍＭのＩＰＴＧによる誘導後に０．５６±０．０９ｇ／Ｌのヒドロキシチロソール及び微量のチロソールを生成したが、これはＳＴ１１９株を０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した場合に得られるヒドロキシチロソール力価（ヒドロキシチロソール０．９２±０．１５ｇ／Ｌ）よりも有意に低かった（表１３）。さらに、ヒドロキシチロソールの蓄積量が異なるにもかかわらず、０．１ｍＭ又は０．２ｍＭのＩＰＴＧで誘導した場合、細胞密度（ＯＤ６００ｎｍ）に影響はなかった。この結果から、ヒドロキシチロソールの産生に最適な条件は、１ｇ／Ｌのアスコルビン酸を補充し、かつ１２．５ｍｌの１－ドデカノールを添加したＭ９Ｙ培地中で、０．１ｍＭのＩＰＴＧで４８時間誘導することであると理解することができた。遺伝子がｐＥＴシステムで過剰発現したＡＲＯ１０＊、ａｒｏＦｆｂｒ、ｔｙｒＡｆｂｒ及びＨｐａＢＣ＊タンパク質の溶解性を評価するため、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを行ったところ、過剰産生されたタンパク質は主に可溶性であることが実証された。
チロソール及びサリドロシドのように、ヒドロキシチロソールの産生に最適な誘導条件を評価するために、異なるＩＰＴＧ濃度を試験した。この場合、ＳＴ１１９株を、１ｇ／Ｌのアスコルビン酸を補充し、かつ１２．５ｍＬの１－ドデカノールを添加したＭ９Ｙ培地中で、０．１ｍＭ及び０．２ｍＭのＩＰＴＧで４８時間誘導した。ＳＴ１１９株は、０．２ｍＭのＩＰＴＧによる誘導後に０．５６±０．０９ｇ／Ｌのヒドロキシチロソール及び微量のチロソールを生成したが、これはＳＴ１１９株を０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した場合に得られるヒドロキシチロソール力価（ヒドロキシチロソール０．９２±０．１５ｇ／Ｌ）よりも有意に低かった（表１３）。さらに、ヒドロキシチロソールの蓄積量が異なるにもかかわらず、０．１ｍＭ又は０．２ｍＭのＩＰＴＧで誘導した場合、細胞密度（ＯＤ６００ｎｍ）に影響はなかった。この結果から、ヒドロキシチロソールの産生に最適な条件は、１ｇ／Ｌのアスコルビン酸を補充し、かつ１２．５ｍｌの１－ドデカノールを添加したＭ９Ｙ培地中で、０．１ｍＭのＩＰＴＧで４８時間誘導することであると理解することができた。遺伝子がｐＥＴシステムで過剰発現したＡＲＯ１０＊、ａｒｏＦｆｂｒ、ｔｙｒＡｆｂｒ及びＨｐａＢＣ＊タンパク質の溶解性を評価するため、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを行ったところ、過剰産生されたタンパク質は主に可溶性であることが実証された。
【0110】
【表13】
【0111】
結論として、ヒドロキシチロソール産生のための最良の条件は６ｍＭであり、ＳＴ１１９株を用いて、１ｇ／Ｌのアスコルビン酸及び２０ｇ／Ｌのグルコースを補充し、かつ１２．５ｍｌの１－ドデカノールを添加したＭ９Ｙ培地中の０．１ｍＭのＩＰＴＧによる誘導後４８時間に得られた。この条件下で、０．９２±０．１５ｇ／Ｌのヒドロキシチロソールを蓄積することができ、これは、１－ドデカノールを添加しない産生と比較して約４０％の増加に相当し、本発明者らの知る限り、報告されている中で最高のヒドロキシチロソール力価である。しかしながら、チロソールのヒドロキシチロソールへの変換は、チロソール株ＳＴ１９１と比較して６０％しか変換されないため、あまり効率的ではなかった。グルコースからのＥ．ｃｏｌｉにおけるヒドロキシチロソールの産生は、ＳｃＡＲＯ１０遺伝子の異種発現、ＡＤＨ６、ｔｙｒＡ、ｐｐｓＡ、ｔｋｔＡ、及びａｒｏＧの遺伝子の過剰発現、及びｆｅａＢ遺伝子のノックアウトによりＥ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３を操作することによることが以前に報告されている（ヒドロキシチロソール０．６５ｇ／Ｌ）。彼らは、３７℃のＭ９Ｙ培地中で０．５ｍＭのＩＰＴＧで細胞を誘導することにより、この産生を達成した。この結果を本研究で得られたものと比較すると、Ｌｉらは約３０％少ないヒドロキシチロソールを産生し、このことは、０．１ｍＭのＩＰＴＧの代わりに０．５ｍＭのＩＰＴＧを使用すること、本研究者らよりも多くの遺伝子を過剰発現させること、及びｆｅａＢ遺伝子のみをノックアウトすることによって説明することができる。
【0112】
実施例１３：ＨＴ１経路を用いたＥ．ｃｏｌｉでのヒドロキシチロソールの産生
【表14】
【0113】
【表15】
【0114】
細胞をＬＢ培地で２時間増殖させ、３０℃でＭ９Ｙ＋２％グルコース＋０．１ｍＭのＩＰＴＧ（通常培地）に洗浄及び再懸濁し、７２時間インキュベートした。ｈｐａＢＣの低コピー数は、ヒドロキシチロソールの蓄積に有利である。ドデカノールの添加により、ヒドロキシチロソールの産生量は約４０％増加した。二相系はヒドロキシチロソールの産生を安定させた。ｐｈｅａＬ遺伝子及びｆｅａＢ遺伝子のノックアウト及び酸素制限により、ヒドロキシチロソールの蓄積は減少した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】