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特表2024-505723ポリオキサゾリン－脂質コンジュゲート並びにそれらを含む脂質ナノ粒子及び医薬組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-07
(54)【発明の名称】ポリオキサゾリン－脂質コンジュゲート並びにそれらを含む脂質ナノ粒子及び医薬組成物
(51)【国際特許分類】
C08G 73/02 20060101AFI20240131BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20240131BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20240131BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240131BHJP
【ＦＩ】
C08G73/02
A61K47/34
A61K9/51
A61K39/00 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023547812
(86)(22)【出願日】2022-02-04
(85)【翻訳文提出日】2023-10-05
(86)【国際出願番号】 US2022015314
(87)【国際公開番号】W WO2022173667
(87)【国際公開日】2022-08-18
(31)【優先権主張番号】17/665,190
(32)【優先日】2022-02-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/147,470
(32)【優先日】2021-02-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509241915
【氏名又は名称】セリナ・セラピユーテイツクス・インコーポレーテツド
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ハリス，ジェイ・ミルトン
(72)【発明者】
【氏名】ベントレー，マイケル
(72)【発明者】
【氏名】ビエガス，タシー
(72)【発明者】
【氏名】モレディス，ランドル
(72)【発明者】
【氏名】シャープ，ロバート・ジェイ
(72)【発明者】
【氏名】ユン，クンサン
(72)【発明者】
【氏名】ファン，ジーハオ
(72)【発明者】
【氏名】ウェイマー，レベッカ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4J043
【Ｆターム（参考）】
4C076AA65
4C076BB11
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB25
4C076CC06
4C076EE13A
4C076EE16
4C076FF31
4C085AA03
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG10
4J043PA04
4J043PB05
4J043PB07
4J043PB11
4J043PB14
4J043PB17
4J043PB21
4J043QA08
4J043RA08
4J043SA36
4J043SB01
4J043UA511
4J043XA18
4J043XB06
4J043XB09
4J043YB08
4J043YB32
4J043YB35
4J043ZB60
(57)【要約】
カプセル化されたペイロードの送達を促進するために使用されるＰＯＺ－脂質コンジュゲート及びＰＯＺ－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）。ＰＯＺ－脂質コンジュゲート及び核酸ペイロード、例えば限定される物ではないがｍＲＮＡ又は修飾ｍＲＮＡを含むＬＮＰが開示される。そのようなＬＮＰは、免疫原性を有しないか、又はＰＥＧ－脂質を含む対応するＬＮＰと比較して低減された免疫原性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉの化合物：Ｒ－ＰＯＺ－Ｌ－脂質 Ｉ
であって、式中、
Ｒは、開始基を含み、
ＰＯＺは、ポリオキサゾリンポリマーを含み、
Ｌは、生理的媒体中で制御可能な分解性を有する連結基を含み、
脂質は、少なくとも１つの疎水性部分を含む非荷電脂質を含む、前記化合物。
【請求項2】
ＰＯＺが、－｛［Ｎ（ＣＯＸ）ＣＨ２ＣＨ２］ｏ－［Ｎ（ＣＯＲ２）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ｝ａ－
であって、ここで、Ｘは、アルキン基、結合したカルボン酸を有するトリアゾール、又はそれらの組合せを含む官能基を含み、ｏは、０～１０の範囲内であり、ｎは、１～１０００の範囲内であり、Ｒ２は、水素、置換若しくは非置換アルキル、アルキン置換アルキル、又は置換若しくは非置換アラルキル基を含み、ａは、ランダムコポリマーを表すｒａｎ、又はブロックコポリマーを表すｂｌｏｃｋである、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
ＰＯＺが、約１．０１～約１．２０の多分散指数を有する、請求項２に記載の化合物。
【請求項4】
ＰＯＺが、５００ダルトン～５，０００ダルトンの分子量を有する、請求項２に記載の化合物。
【請求項5】
Ｒが、水素、置換若しくは非置換アルキル、アルキン置換アルキル、結合したカルボン酸を有するトリアゾール、又は置換若しくは非置換アラルキル基を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項6】
Ｌが、エーテル、エステル、カルボン酸エステル、炭酸エステル、カルバメート、アミン、アミド、ジスルフィド、及びそれらの組合せを含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項7】
脂質が、２つの疎水性部分を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項8】
脂質が、リン脂質、グリセロ脂質、ジアルキルアミン、又はそれらの組合せを含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項9】
脂質が、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロール、又はそれらの組合せを含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項10】
式Ｉが、以下：【化1】
【請求項11】
Ｌによって少なくとも部分的に決定される加水分解速度を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項12】
５０％ヒト血漿中における加水分解の半減期が約１０分以下である、請求項１に記載の化合物。
【請求項13】
５０％ヒト血漿中における加水分解の半減期が約１２０時間以上である、請求項１に記載の化合物。
【請求項14】
式ＩＩの化合物：脂質－Ｌ１－（ＰＯＺ）ｎ ａ－Ｔ ＩＩ
であって、式中、
脂質は、少なくとも１つの疎水性部分を含む非荷電脂質を含み、
Ｌ１は、生理的媒体中で制御可能な分解性を有する連結基を含み、
ＰＯＺは、構造［Ｎ（ＣＯＲ２）ＣＨ２ＣＨ２］のポリオキサゾリンポリマーを含み、ここで、Ｒ２は、ポリオキサゾリンポリマーの各繰り返し単位について非置換若しくは置換アルキル、アルケニル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキン置換アルキル、又は活性官能基から独立に選択され、
ｎは、１～１，０００の範囲内であり、
ａは、ランダムコポリマーを表すｒａｎ、又はブロックコポリマーを表すｂｌｏｃｋであり、
Ｔは、停止末端の基を含む、前記化合物。
【請求項15】
Ｌ１が、エーテル、エステル、カルボン酸エステル、炭酸エステル、カルバメート、アミン、アミド、ジスルフィド、及びそれらの組合せを含む、請求項１４に記載の化合物。
【請求項16】
Ｌ１が、トリアゾールを含む、請求項１４に記載の化合物。
【請求項17】
Ｔが、Ｚ－Ｂ－Ｑを含み、ここで、Ｚが、Ｓ、Ｏ、又はＮを含み、Ｂは、任意選択の連結基であり、Ｑは、停止求核体の一部分である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項18】
脂質が、２つの疎水性部分を含む、請求項１４に記載の化合物。
【請求項19】
脂質が、リン脂質、グリセロ脂質、ジアルキルアミン、又はそれらの組合せを含む、請求項１４に記載の化合物。
【請求項20】
脂質が、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロール、又はそれらの組合せを含む、請求項１４に記載の化合物。
【請求項21】
式ＩＩが、以下：【化2】
【請求項22】
Ｌによって少なくとも部分的に決定される加水分解速度を有する、請求項１４に記載の化合物。
【請求項23】
５０％ヒト血漿中における加水分解の半減期が約１０分以下である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項24】
５０％ヒト血漿中における加水分解の半減期が約１２０時間以上である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項25】
式ＩＩＩの化合物：Ｒ－（ＰＯＺ）ｎ ａ－Ｚ－Ｌ２－脂質 ＩＩＩ
であって、式中、
Ｒは、開始基を含み、
ＰＯＺは、構造［Ｎ（ＣＯＲ２）ＣＨ２ＣＨ２］のポリオキサゾリンポリマーを含み、ここで、Ｒ２は、ポリオキサゾリンポリマーの各繰り返し単位について非置換若しくは置換アルキル、アルケニル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｙｌａｌｋｙｌ）基、アルキン置換アルキル、又は活性官能基から独立に選択され、
ｎは、１～１，０００の範囲内であり、
ａは、ランダムコポリマーを表すｒａｎ、又はブロックコポリマーを表すｂｌｏｃｋであり、
Ｚが、Ｓ、Ｏ、又はＮを含み、
Ｌ２は、生理的媒体中で制御可能な分解性を有する連結基を含み、
脂質は、少なくとも１つの疎水基を含む非荷電脂質を含む、前記化合物。
【請求項26】
Ｌ２が、エーテル、エステル、カルボン酸エステル、炭酸エステル、カルバメート、アミン、アミド、ジスルフィド、及びそれらの組合せを含む、請求項２５に記載の化合物。
【請求項27】
脂質が、２つの疎水性部分を含む、請求項２５に記載の化合物。
【請求項28】
脂質が、リン脂質、グリセロ脂質、ジアルキルアミン、又はそれらの組合せを含む、請求項２５に記載の化合物。
【請求項29】
脂質が、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロール、又はそれらの組合せを含む、請求項２５に記載の化合物。
【請求項30】
Ｒが、水素、又は置換若しくは非置換アルキルを含み、ｎが、１５～３５の範囲内である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項31】
Ｌによって少なくとも部分的に決定される加水分解速度を有する、請求項２５に記載の化合物。
【請求項32】
５０％ヒト血漿中における加水分解の半減期が約１０分以下である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項33】
５０％ヒト血漿中における加水分解の半減期が約１２０時間以上である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項34】
式ＩＶの化合物：【化3】
Ｒは、開始基を含み、
Ｌ３は、生理的媒体中で制御可能な分解性を有する連結基を含み、
脂質は、少なくとも１つの疎水性部分を含む非荷電脂質を含み、
ｎは、１～５の範囲内であり、
Ｒ２は、各繰り返し単位について非置換若しくは置換アルキル、アルケニル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキン置換アルキル、又は活性官能基から独立に選択され、
ｍは、１～１００の範囲内であり、
ａは、ランダムコポリマーを表すｒａｎ、又はブロックコポリマーを表すｂｌｏｃｋであり、
Ｔは、停止末端の基を含む、前記化合物。
【請求項35】
Ｌ３が、エーテル、エステル、カルボン酸エステル、炭酸エステル、カルバメート、アミン、アミド、ジスルフィド、及びそれらの組合せを含む、請求項３４に記載の化合物。
【請求項36】
Ｌ３が、トリアゾールを含む、請求項３４に記載の化合物。
【請求項37】
Ｔが、Ｚ－Ｂ－Ｑを含み、ここで、Ｚが、Ｓ、Ｏ、又はＮを含み、Ｂは、任意選択の連結基であり、Ｑは、停止求核体の一部分である、請求項３４に記載の化合物。
【請求項38】
脂質が、２つの疎水性部分を含む、請求項３４に記載の化合物。
【請求項39】
脂質が、リン脂質、グリセロ脂質、ジアルキルアミン、又はそれらの組合せを含む、請求項３４に記載の化合物。
【請求項40】
脂質が、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロール、又はそれらの組合せを含む、請求項３４に記載の化合物。
【請求項41】
Ｌによって少なくとも部分的に決定される加水分解速度を有する、請求項３４に記載の化合物。
【請求項42】
５０％ヒト血漿中における加水分解の半減期が約１０分以下である、請求項３４に記載の化合物。
【請求項43】
５０％ヒト血漿中における加水分解の半減期が約１２０時間以上である、請求項３４に記載の化合物。
【請求項44】
請求項１に記載の化合物を含む組成物。
【請求項45】
カチオン性又はイオン化脂質をさらに含む、請求項４４に記載の組成物。
【請求項46】
動物における防御免疫応答を惹起する方法であって、動物に有効量の請求項４５に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項47】
前記投与するステップが、前記組成物を動物に皮下、静脈内、筋肉内、皮内又はエアロゾル経路を介して送達するステップを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
動物における障害又は疾患を治療する方法であって、動物に有効量の請求項４５に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項49】
請求項１４に記載の化合物を含む組成物。
【請求項50】
カチオン性又はイオン化脂質をさらに含む、請求項４９に記載の組成物。
【請求項51】
動物における防御免疫応答を惹起する方法であって、動物に有効量の請求項５０に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項52】
前記投与するステップが、脂質ナノ粒子組成物を動物に皮下、静脈内、筋肉内、皮内又はエアロゾル経路を介して送達するステップを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
動物における障害又は疾患を治療する方法であって、動物に有効量の請求項５０に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項54】
請求項２５に記載の化合物を含む組成物。
【請求項55】
カチオン性又はイオン化脂質をさらに含む、請求項５４に記載の組成物。
【請求項56】
動物における防御免疫応答を惹起する方法であって、動物に有効量の請求項５５に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項57】
前記投与するステップが、脂質ナノ粒子組成物を動物に皮下、静脈内、筋肉内、皮内又はエアロゾル経路を介して送達するステップを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
動物における障害又は疾患を治療する方法であって、動物に有効量の請求項５５に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項59】
請求項３４に記載の化合物を含む組成物。
【請求項60】
カチオン性又はイオン化脂質をさらに含む、請求項５９に記載の組成物。
【請求項61】
動物における防御免疫応答を惹起する方法であって、動物に有効量の請求項６０に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項62】
前記投与するステップが、脂質ナノ粒子組成物を動物に皮下、静脈内、筋肉内、皮内又はエアロゾル経路を介して送達するステップを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項63】
動物における障害又は疾患を治療する方法であって、動物に有効量の請求項６０に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ポリオキサゾリン－脂質コンジュゲート、これらのコンジュゲートの合成方法並びに脂質ナノ粒子及び医薬組成物における使用に関する。生細胞への送達のための、ｍＲＮＡやＤＮＡ、ｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドを組み込んでいる脂質ナノ粒子も企図される。
【背景技術】
【0002】
核酸（特にｍＲＮＡ）をベースとしたワクチンは、他のワクチン技術より有利な点をいくつかもたらす。例えば、核酸をベースとしたワクチンは、オリゴヌクレオチドペイロードに関係なくよく見られる製造プラットフォーム及び精製方法を使用することによって、開発時間及びコストを削減して、迅速に生成することができる。さらに、ｍＲＮＡをベースとしたワクチンは、コードされるタンパク質を翻訳することができる細胞によって取り込まれると、ポリペプチドを抗原として提示することができることがある。これらの細胞には、マクロファージや樹状細胞などの抗原提示細胞が含まれる。
【0003】
しかし、現在の核酸をベースとしたワクチンは、いくつかの欠点をもつ。例えば、ｍＲＮＡは、体内においてヌクレアーゼによって急速に分解され、プロタミンなどのポリアミンに複合体化しているだけである場合、大部分の細胞型には容易に取り込まれない。さらに、ＤＮＡとｍＲＮＡの両ワクチンの開発を妨害する主要因は、重篤な有害事象なく反復投与できる強力で忍容性が良好な非免疫原性送達システムの欠如である。
【0004】
これらの欠点に対処する試みでは、ｍＲＮＡペイロード（及び他のオリゴヌクレオチドペイロード）を脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル化し、それによって、ｍＲＮＡを酵素的分解から保護し、細胞取込み及び発現をポリアミンに複合体化しているｍＲＮＡと比べて最大で１０００倍増強させる。そのようなＬＮＰは、典型的にイオン化可能な脂質（オリゴヌクレオチドと複合体化する）、コレステロール（柔軟性をもたらす）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む脂質（脂質ナノ粒子を安定化し、他のナノ粒子との融合を防止する）、及びジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）などのヘルパー脂質（構造的統合性をもたらす）から構成される。例えば、米国特許出願公開第２０２０／０２３００５８号明細書には、目的の免疫原をコードするＲＮＡがカプセル化されているリポソームであって、リポソームが少なくとも１つのＰＥＧ－脂質を含み、ＰＥＧがリポソームの外部に存在し、１ｋＤａ～３ｋＤａの平均分子質量を有する、リポソームが開示される。
【0005】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を扱う早期の研究は、イオン化可能な脂質を効力に必須である主要成分の１つとして同定した。イオン化可能な脂質は、ＬＮＰが細胞においてエンドソームコンパートメントを通ってトラフィッキングするようになったなら、エンドソーム脱出にとって極めて重要である。
【0006】
ＬＮＰは、一般的にオリゴヌクレオチドペイロードを運ぶのに許容される安全性プロファイル及び能力を有する生体適合性ナノ担体であると考えられる。それにもかかわらず、上に簡潔に述べられたように、動物及びヒトに投与されるときいくつかのＬＮＰの免疫原性に関する問題が認められてきた。特に、ＬＮＰにおいてよく使用されるＰＥＧ－脂質は、抗ＰＥＧ免疫応答の影響のためにワクチン安全性を損なう可能性がある。実際は、ＰＥＧ－脂質を含めてＰＥＧ化成分で患者を治療することによって、ＰＥＧを特異的に認識し、ＰＥＧに結合する抗体（すなわち、抗ＰＥＧ抗体）の形成を招く可能性があることがますます認識される。その上、抗ＰＥＧ抗体は、ＰＥＧ化薬物で治療されたことはないが、ＰＥＧを含む製品（例えば、化粧品及び食品）に暴露された患者に見られる。
【0007】
したがって、予め形成された抗ＰＥＧ抗体を有する患者を、ＰＥＧ－脂質を含むＬＮＰで治療することによって、ＰＥＧ－脂質を含むＬＮＰの血液クリアランスを加速し、有効性を低減し／損ない、ＰＥＧに対して過敏反応、場合によっては重度アレルギー反応を生じる可能性がある。ＰＥＧのこの免疫原性は、対象がＰＥＧ－脂質を含むＬＮＰによる反復ワクチン接種をある程度の時間にわたって受けると、又は対象がＰＥＧを含む製品に以前に暴露されていた場合に、重篤な有害事象を引き起こすおそれがある。実際、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（「ＣＯＶＩＤ－１９」）に対して世界規模で行われたＰｆｉｚｅｒ／ＢｉｏＮＴｅｃｈ社及びＭｏｄｅｒｎａ社からのｍＲＮＡワクチン接種の初期の高まりにおいて、介護者が、アナフィラキシーを含めて生命を脅かすような副反応の異常に高い罹患率を報告した。アナフィラキシーの大部分は、女性において起こり（約９０％）、ＰＥＧに対する抗体が原因であることが示された。アナフィラキシーを媒介する正確な機構はまだ知られていないが、生命を脅かすような免疫応答は、ＰＥＧを含む化粧品、食品、又は医薬品への曝露によりＰＥＧに以前に感作された患者における好塩基球脱顆粒が原因である可能性が高い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】米国特許出願公開第２０２０／０２３００５８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
したがって、現在のＬＮＰ技術の欠点に取り組み、核酸ワクチンを送達する方法を改善する必要が残っている。特に、免疫原性が著しく低減された又は欠如しているＬＮＰ製剤を特定することは有利なはずである。ＬＮＰの初期投与後及びその後の投与後に許容される反応源性プロファイルを有するＬＮＰ製剤を特定することも有利なはずである。さらに、ＬＮＰ製剤におけるポリマー－脂質の細胞内安定性の役割はまだ十分に探求されておらず、オリゴヌクレオチドの細胞への細胞取り込み及びその後の放出の詳細はまだ不十分にしか理解されていないが、ＬＮＰにおけるポリマー－脂質は、ペイロードが細胞へ放出されるためにＬＮＰから脱落する必要があると一般的に考えられる（とはいえ、この点は議論の余地がある。）。このような理由などで、ＬＮＰ技術の分野では、低減された免疫原性又は非免疫原性のポリマー脂質を、さまざまなインビボ安定性をもたらすのに利用できることが不可欠である。本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲートは、現在のＬＮＰ製剤において使用されるＰＥＧ－脂質に対する低減された免疫原性又は非免疫原性の代替物を与え、したがってワクチン送達システムにおいて使用するための改善された非免疫原性ＬＮＰも与える。さらに、本開示に従って作製されたＬＮＰは、限定されるものではないが粒子サイズ、多分散性、凍結／解凍安定性、オリゴヌクレオチドカプセル化効率、オリゴヌクレオチドの完全性の維持、エンドソーム脱出、トランスフェクション効率などを含めて、当技術分野にとって潜在的に有益な複数の特性を有する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
（発明の要旨）
本開示は、脂質に結合しているポリオキサゾリン（ＰＯＺ）を含み、生体系において当該ポリマーと当該脂質の間で可変安定度を有する新規ポリマー脂質に関する。この態様において、ポリオキサゾリン－脂質（ＰＯＺ－脂質）コンジュゲートは、ＰＯＺと脂質の間のリンケージを介して制御可能な分解性を有する。ＰＯＺ－脂質コンジュゲートは、脂質ナノ粒子に組み込まれ、そうする際に、独自の特性を脂質ナノ粒子に付与することができる。
本開示は、脂質に結合しているポリオキサゾリン（ＰＯＺ）を含み、生体系において当該ポリマーと当該脂質の間で可変安定度を有する新規ポリマー脂質に関する。この態様において、ポリオキサゾリン－脂質（ＰＯＺ－脂質）コンジュゲートは、ＰＯＺと脂質の間のリンケージを介して制御可能な分解性を有する。ＰＯＺ－脂質コンジュゲートは、脂質ナノ粒子に組み込まれ、そうする際に、独自の特性を脂質ナノ粒子に付与することができる。
【0011】
一実施形態において、本開示の脂質ナノ粒子組成物は、本明細書に記載されたＰＯＺ－脂質を含むことができる。別の実施形態において、本開示の組成物は、本明細書に記載されたＰＯＺ－脂質、カチオン性又はイオン化可能な脂質、及び任意選択の追加の脂質を含む。さらに別の実施形態において、本開示の組成物は、本明細書に記載されたＰＯＺ－脂質、追加の脂質、例えばリン脂質や構造的脂質、コレステロール、オリゴヌクレオチドペイロード、及びそれらの組合せを含む。オリゴヌクレオチドペイロードをカプセルに入れる脂質ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子を取り入れる好適な細胞型においてペイロードの発現をもたらすことができ、したがってペイロードに対する治療的応答をもたらす。一実施形態において、オリゴヌクレオチドペイロードには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、狂犬病、インフルエンザなどの感染症に対するｍＲＮＡワクチンが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、脂質ナノ粒子組成物は、限定されるものではないががん免疫療法、遺伝子療法、酵素補充、及びそれらの組合せを含めて、さまざまな治療手段においても使用されうる。
【0012】
本開示はまた、式Ｉの化合物：
Ｒ－ＰＯＺ－Ｌ－脂質 Ｉ
にも関し、式中、
Ｒは、開始基を含み、
ＰＯＺは、ポリオキサゾリンポリマーを含み、
Ｌは、生理的媒体中で制御可能な分解性を有する連結基を含み、
脂質は、少なくとも１つの疎水性部分を含む非荷電脂質を含む。
Ｒ－ＰＯＺ－Ｌ－脂質 Ｉ
にも関し、式中、
Ｒは、開始基を含み、
ＰＯＺは、ポリオキサゾリンポリマーを含み、
Ｌは、生理的媒体中で制御可能な分解性を有する連結基を含み、
脂質は、少なくとも１つの疎水性部分を含む非荷電脂質を含む。
【0013】
一実施形態において、式Ｉ中のＰＯＺは、
－｛［Ｎ（ＣＯＸ）ＣＨ２ＣＨ２］ｏ－［Ｎ（ＣＯＲ２）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ｝ａ－
であり、
ここで、Ｘは、アルキン基、結合したカルボン酸を有するトリアゾール、又はそれらの組合せを含めて、官能基を含み、ｏは、０～１０の範囲内であり、ｎは、１～１０００の範囲内であり、Ｒ２は、水素、置換若しくは非置換アルキル、アルキン置換アルキル、又は置換若しくは非置換アラルキル基を含み、ａは、ランダムコポリマーを表すｒａｎ、又はブロックコポリマーを表すｂｌｏｃｋである。
－｛［Ｎ（ＣＯＸ）ＣＨ２ＣＨ２］ｏ－［Ｎ（ＣＯＲ２）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ｝ａ－
であり、
ここで、Ｘは、アルキン基、結合したカルボン酸を有するトリアゾール、又はそれらの組合せを含めて、官能基を含み、ｏは、０～１０の範囲内であり、ｎは、１～１０００の範囲内であり、Ｒ２は、水素、置換若しくは非置換アルキル、アルキン置換アルキル、又は置換若しくは非置換アラルキル基を含み、ａは、ランダムコポリマーを表すｒａｎ、又はブロックコポリマーを表すｂｌｏｃｋである。
【0014】
別の実施形態において、ＰＯＺは、約１．０１～約１．２０の多分散指数を有する。さらに別の実施形態において、ＰＯＺは、５００ダルトン～５，０００ダルトンの分子量を有する。さらに別の実施形態において、Ｒには、水素、置換若しくは非置換アルキル、アルキン置換アルキル、結合したカルボン酸を有するトリアゾール、又は置換若しくは非置換アラルキル基が含まれる。Ｌには、エーテル、エステル、カルボン酸エステル、炭酸エステル、（限定されるものではないがカルバミン酸エチル（ウレタン）を含めて）カルバメート、アミン、アミド、ジスルフィド、及びそれらの組合せが含まれうる。別の実施形態において、脂質は、２つの疎水性部分を含むことができる。例えば、脂質には、リン脂質、グリセロ脂質、ジアルキルアミン、又はそれらの組合せが含まれうる。一実施形態において、脂質は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロール、又はそれらの組合せを含む。
【0015】
本開示のこの態様において、式Ｉは、以下のうちの１つとすることができる：
【0016】
【化1】
本開示はまた、式ＩＩの化合物
脂質－Ｌ１－（ＰＯＺ）ｎ ａ－Ｔ ＩＩ
にも関し、式中、
脂質は、少なくとも１つの疎水性部分を含む非荷電脂質を含み、
Ｌ１は、生理的媒体中で制御可能な分解性を有する連結基を含み、
ＰＯＺは、構造［Ｎ（ＣＯＲ２）ＣＨ２ＣＨ２］のポリオキサゾリンポリマーを含み、ここで、Ｒ２は、ポリオキサゾリンポリマーの各繰り返し単位について非置換若しくは置換アルキル、アルケニル、アルキン置換アルキル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキル、又は活性官能基から独立に選択され、
ｎは、１～１，０００の範囲内であり、
ａは、ランダムコポリマーを表すｒａｎ、又はブロックコポリマーを表すｂｌｏｃｋであり、
Ｔは、停止末端の基を含む。
【0017】
この態様において、Ｌ１には、エーテル、エステル、カルボン酸エステル、炭酸エステル、（限定されるものではないがカルバミン酸エチル（ウレタン）を含めて）カルバメート、アミン、アミド、ジスルフィド、及びそれらの組合せが含まれうる。一実施形態において、Ｌ１は、トリアゾールである。別の実施形態において、Ｔは、Ｚ－Ｂ－Ｑを含み、ここで、Ｚは、Ｓ、Ｏ、又はＮを含み、Ｂは、任意選択の連結基であり、Ｑは、停止求核体又はその一部分である。
【0018】
この態様において、脂質は、２つの疎水性部分を含むことができる。例えば、脂質には、リン脂質、グリセロ脂質、ジアルキルアミン、又はそれらの組合せが含まれうる。一実施形態において、脂質には、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロール、又はそれらの組合せが含まれる。
【0019】
一実施形態において、式ＩＩは、以下のうちの１つである：
【0020】
【化2】
【0021】
本開示はまた、式ＩＩＩの化合物
Ｒ－（ＰＯＺ）ｎ ａ－Ｚ－Ｌ２－脂質 ＩＩＩ
にも関し、式中、
Ｒは、開始基を含み、
ＰＯＺは、構造［Ｎ（ＣＯＲ２）ＣＨ２ＣＨ２］のポリオキサゾリンポリマーを含み、ここで、Ｒ２は、ポリオキサゾリンポリマーの各繰り返し単位について非置換若しくは置換アルキル、アルケニル、アルキン置換アルキル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｙｌａｌｋｙｌ）基、又は活性官能基から独立に選択され、
ｎは、１～１，０００の範囲内であり、
ａは、ランダムコポリマーを表すｒａｎ、又はブロックコポリマーを表すｂｌｏｃｋであり、
Ｚは、Ｓ、Ｏ、又はＮを含み、
Ｌ２は、生理的媒体中で制御可能な分解性を有する連結基を含み、
脂質は、少なくとも１個の疎水基を含む非荷電脂質を含む。
Ｒ－（ＰＯＺ）ｎ ａ－Ｚ－Ｌ２－脂質 ＩＩＩ
にも関し、式中、
Ｒは、開始基を含み、
ＰＯＺは、構造［Ｎ（ＣＯＲ２）ＣＨ２ＣＨ２］のポリオキサゾリンポリマーを含み、ここで、Ｒ２は、ポリオキサゾリンポリマーの各繰り返し単位について非置換若しくは置換アルキル、アルケニル、アルキン置換アルキル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｙｌａｌｋｙｌ）基、又は活性官能基から独立に選択され、
ｎは、１～１，０００の範囲内であり、
ａは、ランダムコポリマーを表すｒａｎ、又はブロックコポリマーを表すｂｌｏｃｋであり、
Ｚは、Ｓ、Ｏ、又はＮを含み、
Ｌ２は、生理的媒体中で制御可能な分解性を有する連結基を含み、
脂質は、少なくとも１個の疎水基を含む非荷電脂質を含む。
【0022】
この態様において、Ｌ２には、エーテル、エステル、カルボン酸エステル、炭酸エステル、（限定されるものではないがカルバミン酸エチル（ウレタン）を含めて）カルバメート、アミン、アミド、ジスルフィド、及びそれらの組合せが含まれうる。一実施形態において、脂質は、２つの疎水性部分を含む。例えば、脂質には、リン脂質、グリセロ脂質、ジアルキルアミン、又はそれらの組合せが含まれうる。一実施形態において、脂質には、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロール、又はそれらの組合せが含まれる。
【0023】
一実施形態において、Ｒには、水素、又は置換若しくは非置換アルキルが含まれ、ｎは、１５～３５の範囲内である。
【0024】
本開示はまた、式ＩＶの化合物
【0025】
【化3】
Ｒは、開始基を含み、
Ｌ３は、生理的媒体中で制御可能な分解性を有する連結基を含み、
脂質は、少なくとも１つの疎水性部分を含む非荷電脂質を含み、
ｎは、１～５の範囲内であり、
Ｒ２は、各繰り返し単位について非置換若しくは置換アルキル、アルケニル、アルキン置換アルキル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキル、又は活性官能基から独立に選択され、
ｍは、１～１００の範囲内であり、
ａは、ランダムコポリマーを表すｒａｎ、又はブロックコポリマーを表すｂｌｏｃｋであり、
Ｔは、停止末端の基を含む。
【0026】
この態様において、Ｌ３には、エーテル、エステル、カルボン酸エステル、炭酸エステル、カルバメート、アミン、アミド、ジスルフィド、及びそれらの組合せが含まれうる。一実施形態において、Ｌ３は、トリアゾールを含む。別の実施形態において、Ｔは、Ｚ－Ｂ－Ｑを含み、ここで、Ｚは、Ｓ、Ｏ、又はＮを含み、Ｂは、任意選択の連結基であり、Ｑは、停止求核体又はその一部分である。
【0027】
脂質は、２つの疎水性部分を含むことができる。例えば、脂質には、リン脂質、グリセロ脂質、ジアルキルアミン、又はそれらの組合せが含まれうる。一実施形態において、脂質には、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロール、又はそれらの組合せが含まれうる。
【0028】
一実施形態において、上記の式Ｉ～ＩＶの化合物のいずれも、Ｌ、Ｌ１、Ｌ２、又はＬ３（適用できる場合）によって少なくとも部分的に決定される加水分解速度を有する。別の実施形態において、上記の式Ｉ～ＩＶの化合物のいずれも、５０％ヒト血漿中における加水分解の半減期が約１０分以下である。さらに別の実施形態において、上記の式Ｉ～ＩＶの化合物のいずれも、５０％ヒト血漿中における加水分解の半減期が約１２０時間以上である。
【0029】
上記の式Ｉ～ＩＶの化合物のいずれかを含む組成物が形成されうる。一実施形態において、そのような組成物は、カチオン性又はイオン化可能な脂質をさらに含むことができる。別の実施形態において、本開示は、動物における障害又は疾患を治療する方法であって、動物に有効量のそのような組成物を投与するステップを含む方法に関する。さらに別の実施形態において、本開示は、動物における防御免疫応答を惹起する方法であって、動物に有効量のそのような組成物を投与するステップを含む方法に関する。どちらの場合についても、投与するステップは、そのような組成物を動物に皮下、静脈内、筋肉内、皮内又はエアロゾル経路を介して送達するステップを含むことができる。
【0030】
本発明の別の特徴及び効果は、以下に記載される図面と関連させて提示された以下の詳細な説明から確認されうる。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】本開示の実施形態による脂質ナノ粒子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0032】
本開示は、本開示のさまざまな新規ＰＯＺ－脂質コンジュゲート及びＰＯＺ－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を提供する。ＬＮＰは、生物活性治療分子の細胞内送達を促進するために使用されうる。一実施形態において、ＬＮＰは、カプセル化ペイロード、例えば限定するものではないがｍＲＮＡ又は修飾ｍＲＮＡを含めて核酸ペイロードを送達するために使用されうる。本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲートを含むＬＮＰは、免疫原性を有しないか、又はＰＥＧ－脂質を含む対応するＬＮＰと比較して低減された免疫原性を有するので、そのようなＬＮＰは、核酸ワクチンを送達する、より安全な方法を提供する。さらに、特定の理論に拘束されないが、新規ＰＯＺ－脂質はＬＮＰの成分として、ＰＥＧ－脂質と比べると独自の特性を付与することもでき、得られたＬＮＰは治療薬として投与されると、独自の取り込み、分布及び有効性を示すことができると予想される。さらに、本開示のＰＯＺ－脂質は、さまざまな安定度を有し、ＰＯＺ－脂質を含むＬＮＰを「設計する」際に追加の柔軟性をもたらすことが有利でありうる。本開示はまた、そのようなＬＮＰを含み、治療有効量の生物活性分子を患者の細胞に送達するのに有用である医薬組成物にも関する。
【0033】
ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）は生体適合性ポリマーであり、多くの親水性及び疎水性溶媒に対して良好な溶解度を保持する。ＰＯＺは酸化的分解反応に抵抗性でもあり、生物蓄積を受けない。ＰＯＺは、シリカ粒子、金粒子、ＺｎＯナノ結晶、及び磁性粒子にグラフト化されたとき、ステルス能力及び良好な粘膜組織透過を付与する。
【0034】
ＬＮＰは、水性コアを包む１つ以上の脂質層によって形成された、約２０ｎｍ～数ミクロンの範囲内であるサイズの両親媒性球状ベシクルである。先行技術のＬＮＰは、一般的にカチオン性又はイオン化可能な脂質を（ｉ）二重層構造を支え、飲食作用を促進するヘルパー脂質；（ｉｉ）ＬＮＰの脂質二重層を安定化するためのステロール脂質（すなわち、コレステロール）；及び（ｉｉｉ）水和性層を有するＬＮＰを提供するためのＰＥＧ－脂質と組み合わせて含むことで、コロイド安定性を改善し、新生粒子の融着を妨げ、タンパク質吸着及び非特異的取り込みを低減し、網内系クリアランスを妨げる。しかし、上に記載されたように、これらのＬＮＰ中のＰＥＧ－脂質は、抗ＰＥＧ免疫応答の可能性のために患者の安全を損なうことがある。ＬＮＰ、特に核酸送達のためのＬＮＰにおいて使用されたことがない本開示のＰＯＺ－脂質を使用することは、ＰＥＧ化ＬＮＰの免疫原性の問題に対して解決策をもたらし、治療薬として投与されたとき（ＰＥＧ化ＬＮＰと比較して）独自の取り込み、分布、及び有効性を有するＬＮＰも提供する。
【0035】
定義
本明細書に引用されたすべての特許出願、特許、及び印刷刊行物は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。ただし、いずれかの定義、主題の放棄又は否定、及び組み込まれた資料が本明細書における明確な開示と一致しない範囲を除いては、この限りでなく、その場合には本開示における文言が優先する。
本明細書に引用されたすべての特許出願、特許、及び印刷刊行物は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。ただし、いずれかの定義、主題の放棄又は否定、及び組み込まれた資料が本明細書における明確な開示と一致しない範囲を除いては、この限りでなく、その場合には本開示における文言が優先する。
【0036】
冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、本明細書では当該冠詞の文法的目的語の１つ又は１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素又は１つより多くの要素を意味する。
【0037】
用語「約」及び「およそ」は、一般的に測定の性質又は精度を考慮して、測定された量の誤差又は変動の許容される範囲を意味するものとする。本明細書に記載された数量は別段の記載がない限り近似であり、用語「約」又は「およそ」は、明記されていないとき推測されうるということを意味する。
【0038】
本明細書では用語「活性の」又は「活性化された」は特定の官能基に関連して使用されたとき、別の分子の求電子体又は求核体と容易に反応する官能基を指す。これは、反応するために触媒又は非現実的な反応条件を必要とする基（すなわち、「非反応性」又は「不活性」基）とは対照的である。
【0039】
本明細書では用語「生理学的に分解可能な」又は「生理学的に放出可能な」は、切断可能な部分を含むリンケージを指す。分解可能な及び放出可能なという用語は、リンカーが切断される特定の機構をいずれも含意しない。
【0040】
本明細書では用語「連結する」、「転結された」、「リンケージ」又は「リンカー」はＰＯＺポリマー、ＰＯＺコンジュゲート、作用剤、若しくは本明細書に記載された化合物、又はそれらの成分に対して使用されたとき、通常は化学反応の結果として形成される結合を指し、典型的には共有結合である。
【0041】
本明細書では用語「脂質ナノ粒子」又は「ＬＮＰ」は、身体に放出されるべき分子を含むコアを取り囲んでいる脂質層によって形成された、リポソームを含めて多くのタイプのナノ粒子のいずれも包含するために使用される。リポソームは、一般的に水性コアをカプセル化している近接した１つ以上の脂質二重層を有する。リポソーム様ナノ担体の他の形は、脂質単層又は近接していない二重層を有することがあり、水性コアを有することもあれば有しないこともある。
【0042】
本明細書では用語「親水性の」は例えば親水基に関して、水との相互作用が油又は他の疎水性溶媒との相互作用より熱力学的に有利である化合物若しくは分子、又はそれらの一部分を指す。親水性化合物は、水に溶解することができ、又は分散されうる。
【0043】
本明細書では用語「疎水性の」は例えば疎水性部分に関して、水との相互作用が油又は他の疎水性溶媒との相互作用より熱力学的に有利でない化合物若しくは分子、又はそれらの一部分を指す。疎水性化合物は、油若しくは他の疎水性溶媒に溶解することができ、又は分散されうる。
【0044】
本明細書では用語「不活性な」又は「非反応性の」は特定の官能基に関連して使用されたとき、別の分子の求電子体又は求核体と容易に反応せず、反応するために触媒又は非現実的な反応条件を必要とする官能基を指す。
【0045】
本明細書では用語「ペンデント基」は、ＰＯＺポリマーに結合しているＰＯＺポリマーの部分を指す。
【0046】
本明細書では用語「ペンデント部分」は、ＰＯＺポリマー部分に連結基を介して連結している置換基を指す。ペンデント部分は、本明細書に記載された式ＩＶのＲ２により例示される。
【0047】
本明細書では用語「薬学的に許容される」は、組成物の他の成分と相溶性がある化合物であって、当該化合物又は組成物を受けている対象に有害でない化合物を指す。いくつかの実施形態において、用語「薬学的に許容される」は、米国連邦若しくは州政府の規制当局により認可され、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に動物、さらに特にヒトにおける使用で列挙されていることを意味する。
【0048】
本明細書では用語「薬学的に許容される形」は、限定されるものではないが化合物の溶媒和物、水和物、プロドラッグ、同形体、多形体、偽形体、中性の形、及び塩の形を含めて、対象に投与されうる化合物又はＰＯＺコンジュゲートの公知の形を含むことになっている。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される形は、プロドラッグ、同形体及び／又は偽形体を除外する。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される形は、薬学的に許容される塩、中性の形、溶媒和物及び水和物に限定される。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される形は、薬学的に許容される塩及び中性の形に限定される。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される形は、薬学的に許容される塩に限定される。
【0049】
本明細書では用語「アルキル」は単独で使用されようと置換基の部分として使用されようと、専門用語であり、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル基、アルキル置換シクロアルキル基、及びシクロアルキル置換アルキル基を含めて、任意選択的に置換されていてよい１個以上のヘテロ原子（Ｏ、Ｓ又はＮなど）を任意選択的に含む飽和脂肪族基を指す。いくつかの実施形態において、直鎖又は分枝鎖アルキルは、その主鎖中に約３０個以下の炭素原子（例えば、直鎖ではＣ１～Ｃ３０、分枝鎖ではＣ３～Ｃ３０）、あるいは約２０個以下又は１０個以下の炭素原子を有する。いくつかの実施形態において、用語「アルキル」は、Ｃ１～Ｃ１０直鎖アルキル基又はＣ１～Ｃ３直鎖アルキル基を指す。いくつかの実施形態において、用語「アルキル」は、Ｃ３～Ｃ１２分枝鎖アルキル基を指す。いくつかの実施形態において、用語「アルキル」は、Ｃ３～Ｃ８分枝鎖アルキル基を指す。アルキルの代表例には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、及びｎ－ヘキシルが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、用語「アルキル」は、炭素原子の代わりに、任意選択的に置換されていてよい１個以上のヘテロ原子（Ｏ、Ｓ又はＮなど）を含むＣ１～Ｃ１０直鎖アルキル基を指す。いくつかの実施形態において、用語「アルキル」は、ＯＨ、ＮＨ２及び＝Ｏからなる群から選択される基で５個まで置換されているＣ１～Ｃ１０直鎖アルキル基を指す。
【0050】
本明細書では用語「アルケニル」は単独で使用されようと置換基の部分として使用されようと、専門用語であり、２～３０個の炭素を含み、水素２個を除去することによって形成された少なくとも１個の炭素－炭素二重結合を含む直鎖又は分枝鎖炭化水素基を含めて、任意選択的に置換されていてよい１個以上のヘテロ原子（Ｏ、Ｓ又はＮなど）を任意選択的に含む不飽和脂肪族基を指す。アルケニルの代表例には、エテニル、２－プロペニル、２－メチル－２－プロペニル、３－ブチニル、４－ペンチニル、５－ヘキセニル、２－ヘプテニル、２－メチル－１－ヘプテニル、及び３－デセニルが含まれるが、これらに限定されない。アルケニル基の不飽和結合は、部分のどこに位置していてもよく、二重結合について（Ｚ）又は（Ｅ）立体配置を有することができる。
【0051】
本明細書では用語「アルキニル」は単独で使用されようと置換基の部分として使用されようと、専門用語であり、２～３０個の炭素原子を含み、少なくとも１個の炭素－炭素三重結合を含む直鎖又は分枝鎖炭化水素基を含めて、任意選択的に置換されていてよい１個以上のヘテロ原子（Ｏ、Ｓ又はＮなど）を任意選択的に含む不飽和脂肪族基を指す。アルキニルの代表例には、アセチレニル、１－プロピニル、２－プロピニル、３－ブチニル、２－ペンチニル、４－ペンチニル、及び１－ブチニルが含まれるが、これらに限定されない。
【0052】
本明細書では用語「置換アルキル」、「置換アルケニル」、及び「置換アルキニル」は、炭素又は水素への１個以上の結合が、非水素又は非炭素原子への結合、例えば限定されるものではないがＦやＣｌ、Ｂｒ、Ｉなどのハリド中のハロゲン原子；カルボニルやカルボキシル、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ヘテロシクリルオキシ基、エステル基などの基中の酸素原子；チオール基やアルキル及びアリールスルフィド基、スルホン基、スルホニル基、スルホキシド基などの基中の硫黄原子；アミンやアミド、アルキルアミン、ジアルキルアミン、アリールアミン、アルキルアリールアミン、ジアリールアミン、Ｎ－オキシド、イミド、エナミン、イミン、オキシム、ヒドラゾン、ヘテロシクリルアミン、（アルキル）（ヘテロシクリル）－アミン、（アリール）（ヘテロシクリル）アミン、ジヘテロシクリルアミン、トリアゾール、ニトリルなどの基中の窒素原子；トリアルキルシリル基やジアルキルアリールシリル基、アルキルジアリールシリル基、トリアリールシリル基などの基中のケイ素原子；並びにさまざまな他の基中の他のヘテロ原子への結合によって置き換えられている、上に定義されたようなアルキル、アルケニル及びアルキニル基を指す。具体的実施形態において、「極性アルキル」、「極性アルケニル」、及び「極性アルキニル」は、極性共有結合を生じる原子で置換されているアルキル、アルケニル、及びアルキニル基を指す。別の具体的実施形態において、「極性アルキル」、「極性アルケニル」、及び「極性アルキニル」は、極性共有結合を生じる原子で置換されているＣ１～Ｃ５アルキル、アルケニル、及びアルキニル基を指す。具体的実施形態において、「極性アルキル」、「極性アルケニル」、及び「極性アルキニル」は、－ＯＨ基及び／又は－Ｃ（Ｏ）－ＯＨ基で置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル基、例えばＣ１～Ｃ５アルキルやアルケニル、アルキニル基を指す。
【0053】
本明細書では用語「ハロ」又は「ハロゲン」は単独で使用されようと置換基の部分として使用されようと、専門用語であり、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、又は－Ｉを指す。
【0054】
本明細書では用語「アルコキシ」は単独で使用されようと置換基の部分として使用されようと、専門用語であり、酸素原子を通して親分子部分に付加されている、本明細書に定義されたアルキル基を指す。アルコキシの代表例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２－プロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、及びヘキシルオキシが含まれるが、これらに限定されない。
【0055】
本明細書では用語「アラルキル」又は「アリールアルキル」は単独で使用されようと置換基の部分として使用されようと、専門用語であり、アリール基で置換されているアルキル基を指し、当該部分は、アルキル基を通して親分子に付加されている。アリールアルキル基は、任意選択的に置換されていてよい。「置換アラルキル」は、非置換アラルキル基に対して、置換アリール基が非置換アリール基に対して有したのと同じ意味を有する。しかし、置換アラルキル基は、アルキル部分の炭素又は水素結合が非炭素又は非水素原子への結合によって置き換えられている基も含む。
【0056】
本明細書では用語「ヘテロアラルキル」又は「ヘテロアリールアルキル」は単独で使用されようと置換基の部分として使用されようと、専門用語であり、ヘテロアリール基で置換されているアルキル基を指し、当該部分は、アルキル基を通して親分子部分に付加されている。ヘテロアリールアルキルは、任意選択的に置換されていてよい。用語「置換ヘテロアリールアルキル」は、非置換ヘテロアリールアルキル基に対して、置換アリール基が非置換アリール基に対して有したのと同じ意味を有する。
【0057】
本明細書では用語「ヘテロシクリルアルキル」は単独で使用されようと置換基の部分として使用されようと、専門用語であり、非置換又は置換アルキル、アルケニル又はアルキニル基の水素又は炭素結合がヘテロシクリル基への結合で置き換えられている非置換又は置換アルキル、アルケニル又はアルキニル基を指す。ヘテロシクリルアルキルは、任意選択的に置換されていてよい。用語「置換ヘテロシクリルアルキル」は、非置換ヘテロシクリルアルキル基に対して、置換アリール基が非置換アリール基に対して有したのと同じ意味を有する。しかし、置換ヘテロシクリルアルキル基は、非水素原子が、ヘテロシクリルアルキル基のヘテロシクリル基中のヘテロ原子、例えば限定されるものではないがピペリジニルアルキル基のピペリジン環中の窒素原子に結合している基も含む。
【0058】
本明細書では用語「アリール」は単独で使用されようと置換基の部分として使用されようと、専門用語であり、単環式、二環式及び多環式芳香族炭化水素基、例えばベンゼン、ナフタレン、アントラセン、及びピレンを指す。芳香族環は、環の１つ以上の位置において１個以上の置換基、例えばハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又はヘテロ芳香族部分、フルオロアルキル（トリフルオロメチル（ｔｒｉｆｌｕｒｏｍｅｔｈｙｌ）など）、シアノで置換されていてよい。用語「アリール」は、２つの隣接環に２個以上の炭素が共有されている（環は「縮合環」である）２つ以上の環式環を有する多環式環系も含み、環の少なくとも１つが芳香族炭化水素であり、例えば他の環式環が、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、及び／又はヘテロシクリルであってよい。いくつかの実施形態において、用語「アリール」はフェニル基を指す。アリール基は、任意選択的に置換されていてよい。
【0059】
本明細書では用語「シクロアルキル」は単独で使用されようと置換基の部分として使用されようと、専門用語であり、３～６個の環炭素原子を含む飽和炭素環式基を指し、そのような環は、置換若しくは非置換アルキル基又は置換アルキル基のために記載された置換基で任意選択的に置換されていてよい。例示的なシクロアルキル基には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、２－メチルシクロブチル及び４－エチルシクロヘキシルが含まれるが、これらに限定されない。
【0060】
本明細書では用語「ヘテロアリール」は単独で使用されようと置換基の部分として使用されようと、専門用語であり、環構造中に１個以上のヘテロ原子、例えば窒素、酸素又は硫黄を含めて合計３～３０個の原子を有する単環式、二環式、及び多環式芳香族基を指す。例示的なヘテロアリール基には、アザインドリル、ベンゾ（ｂ）チエニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、フラニル、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、インドリル、インドリニル、インダゾリル、イソインドリニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、イソキノリニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジニル、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジニル、キノリニル、キナゾリニル、トリアゾリル、チアゾリル、チオフェニル、テトラヒドロインドリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、チエニル、チオモルホリニル、トリアゾリル又はトロパニルなどが含まれる。「ヘテロアリール」は、環の１つ以上の位置において１個以上の置換基、例えばハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又はヘテロ芳香族部分、フルオロアルキル（トリフルオロメチルなど）、シアノなどで置換されていてよい。用語「ヘテロアリール」は、２つの隣接環に２個以上の炭素が共有されている（環は「縮合環」である）２つ以上の環式環を有する多環式環系も含み、環の少なくとも１つが環構造中に１個以上のヘテロ原子を有する芳香族基であり、例えば他の環式環が、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、及び／又はヘテロシクリルであってよい。
【0061】
本明細書では用語「ヘテロシクリル」は単独で使用されようと置換基の部分として使用されようと、専門用語であり、完全に飽和されていてよく、又は１つ若しくは複数の不飽和単位を含んでよいが、誤解を避けるために、不飽和度は芳香族環系を生じず、少なくとも１個のヘテロ原子、例えば窒素、酸素又は硫黄を含めて３～１５個の原子を有する、限定されるものではないが単環式、二環式、及び三環式環を含めて、非芳香族環系の基を指す。本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでなく、例示を目的として、以下のアジリジニル、アジリニル、オキシラニル、チイラニル、チイレニル、ジオキシラニル、ジアジリニル、ジアゼパニル、１，３－ジオキサニル、１，３－ジオキソラニル、１，３－ジチオラニル、１，３－ジチアニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、アゼチル、オキセタニル、オキセチル、チエタニル、チエチル、ジアゼチジニル、ジオキセタニル、ジオキセテニル、ジチエタニル、ジチエチル、ジオキサラニル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアジニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、アゼピン、アゼチジニル、モルホリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、オキソピペリジニル、オキソピロリジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリニル、ピロリジニル、キヌクリジニル、チオモルホリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、チアジアゾリニル、チアジアゾリジニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、チオモルホリニル、１，１－ジオキシドチオモルホリニル（チオモルホリンスルホン）、チオピラニル、及びトリチアニルは、ヘテロ環式環の例である。ヘテロシクリル基は、環の１つ以上の位置において１個以上の置換基、例えばハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又はヘテロ芳香族部分、フルオロアルキル（トリフルオロメチルなど）、シアノなどで置換されていてよい。
【0062】
本明細書では用語「治療」、「治療する」、及び「治療すること」は、疾患又は病態の症状、様相又は特徴を予防、除去、又は低減するように一連の行動（本明細書に記載されたコンジュゲート又は本明細書に記載されたコンジュゲートを含む医薬組成物を投与することなど）を指す。そのような治療は、有用であるために絶対的である必要はない。一実施形態において、治療は、疾患又は病態の症状、様相、又は特徴の発生と同時に又はその後に開始された一連の行動を含む。一実施形態において、治療は、疾患又は病態の症状、様相、又は特徴の発生前に開始された一連の行動を含む。
【0063】
本明細書では用語「治療を必要とする」は、介護者によって下された、患者が治療を必要とし、又はそれから恩恵を被るという判断を指す。この判断は、介護者の専門知識の領域であるさまざまな要因に基づいて下されるが、本開示の方法又は化合物によって治療可能な疾患又は病態の結果として、患者が病気であり、又は病気であろうという知識を含む。
【0064】
本明細書では用語「個体」、「対象」、又は「患者」は、哺乳類、例えばマウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、又は霊長類、及びヒトを含めていずれの動物でも指す。用語は、雄性若しくは雌性又は両方を指定することができ、あるいは雄性又は雌性を除外することができる。好ましい実施形態において、用語「個体」、「対象」、又は「患者」は、ヒトを指す。
【0065】
本明細書では用語「治療有効量」は、疾患又は病態のいずれかの症状、様相、又は特徴にいずれかの検出可能なプラス効果をもつことができるコンジュゲート単独又は医薬組成物の部分としてのコンジュゲートの量を指す。そのような効果は、有益であるために絶対的である必要がない。
【0066】
「置換」又は「で置換されている」は、そのような置換が置換原子及び置換基の許容原子価に従い、置換が、安定な化合物、例えば転位、断片化、分解、環化、脱離、又は他の反応などによる転換を自発的に受けない化合物をもたらすという暗黙の条件を含むことが理解されよう。
【0067】
基が化合物の部分として指定されているとき、基の置換は、特定の結合を収容するように調整されうることが理解されよう。例えば、アルキル基が他の２個の基に連結されているとき、アルキル基はアルキレン基と考えられる。
【0068】
用語「置換された」は、有機化合物の許容されるすべての置換基を包むことも企図される。広範な態様において、許容される置換基は、有機化合物の非環式及び環式、分枝状及び非分枝状の置換基、炭素環式及びヘテロシクリル、芳香族及び非芳香族の置換基を含む。例示的な置換基には、例えば本明細書で上に記載されたものが含まれる。本開示では、酸素又は窒素などのヘテロ原子は、ヘテロ原子の原子価を満たす本明細書に記載された有機化合物の水素置換基及び／又はいずれか許容される置換基を有することができる。例示的な置換には、ヒドロキシ、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又はヘテロ芳香族部分、フルオロアルキル（トリフルオロメチルなど）、シアノなどが含まれるが、これらに限定されない。本発明は、いかなる形でも有機化合物の許容される置換基によって限定されることを意図したものではない。
【0069】
本明細書における他の化学用語は、参照により本明細書に組み込まれるＴｈｅ ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ， Ｓ．編、１９８５、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）によって例示されるように、当技術分野における通常の用法に従って使用される。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0070】
本明細書では用語「薬学的に許容される塩」は、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、ギ酸、酢酸、乳酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、グリコール酸、サリチル酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、マロン酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ナフタレン－２－スルホン酸、及び他の酸を含めて無機酸又は有機酸に由来する塩を含む。薬学的に許容される塩の形は、塩を含む分子の比が１：１でない形を含むことができる。例えば、塩は、塩基１分子当たり無機酸又は有機酸を１分子超、例えばコンジュゲート１分子当たり塩酸２分子を含むことができる。別の例として、塩は、塩基１分子当たり無機酸又は有機酸１分子未満、例えば無機酸又は有機酸１分子当たりコンジュゲート２分子を含むことができる。
【0071】
本明細書では用語「担体」及び「薬学的に許容される担体」は、化合物が一緒に投与され、又は投与のために一緒に製剤化される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのような薬学的に許容される担体の非限定例には、水や生理食塩水、油などの液体、及びアラビアゴムやゼラチン、デンプンのり、タルク、ケラチン、コロイダルシリカ、尿素などの固形物が含まれる。さらに、補助剤、安定化剤、粘稠化剤、等浸透剤、凍結保存剤、滑沢剤、矯味剤、及び着色剤が使用されうる。好適な医薬用担体の他の例については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （第２３版、ＩＳＢＮ ９７８０１２８２０００７０）及びＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（第８版、９７８－０－８５－７１１２７１－２）に記載されており、それぞれ参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0072】
本明細書では用語「ターゲット分子」は、治療的若しくは診断的適用又はターゲティング機能を有する任意の分子、あるいは化合物が一緒に投与され、又は投与のために一緒に製剤化されるビヒクルを指し、限定されるものではないが治療剤（例えば、限定されるものではないが薬物）、診断剤、ターゲティング剤、有機低分子、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、抗体フラグメント、タンパク質、ヘパリン若しくはヒアルロン酸などの炭水化物、又はグリセロ脂質、糖脂質、若しくはリン脂質などの脂質を含めて、ターゲット分子は、本開示のＰＯＺポリマー又はＰＯＺ誘導体の活性官能基とリンケージを形成することができる。
【0073】
本明細書では「脂質」又は「脂質部分」は、（ｉ）脂肪酸のエステル又はその誘導体を含み、水に不溶であるが、多くの有機溶媒に可溶であることによって特徴づけられ、脂肪や油、ロウなどの単純脂質、リン脂質や糖脂質、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質などの複合脂質、及びステロイドなどの誘導脂質が含まれるがこれらに限定されない有機化合物、並びに（ｉｉ）脂肪酸のエステルを含まないが、そのような有機化合物をその両親媒性により模倣する有機化合物を意味し、すなわち、疎水性部分と親水性部分を両方所有し、したがって水性環境において特異的な形で凝集して、層、ベシクル及びＬＮＰを形成することができる。
【0074】
本明細書では「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」は、特異的遺伝子の発現に干渉するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与する、１６～４０個のヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ分子のクラスを意味する。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路における役割に加えて、ＲＮＡｉ関連経路においても働く。
【0075】
本明細書では「ＲＮＡ」は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、及び多価ＲＮＡを含めて少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－ｒｉｂｏ－フラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離ＲＮＡ、例えば部分精製ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え産生ＲＮＡ、並びに１種以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は改変により天然ＲＮＡと異なる改変ＲＮＡを含む。
【0076】
ＰＯＺ－脂質コンジュゲート
本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲートは、ポリオキサゾリンポリマーに連結している脂質部分を含む。ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの成分については、以下にさらに詳述される。
本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲートは、ポリオキサゾリンポリマーに連結している脂質部分を含む。ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの成分については、以下にさらに詳述される。
【0077】
ＰＯＺ部分
さまざまなＰＯＺポリマーが、本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおいて使用されてよく、以下にさらに詳述される。しかし、一般的には、ＰＯＺポリマーは、単一のタイプ又はクラスの官能基を含むことができ、あるいは一つより多いタイプ又はクラスの官能基を含むことができる。ＰＯＺは、線状ＰＯＺポリマー、分枝状ＰＯＺポリマー、ペンデントＰＯＺポリマー又はマルチアーム型ＰＯＺポリマーとすることができる。代表的なＰＯＺポリマーについては、米国特許第７，９４３，１４１号、同第８，０８８，８８４号、同第８，１１０，６５１号、同第８，１０１，７０６号、同第８，８８３，２１１号、同第９，２８４，４１１号、及び米国特許出願第１３／００３，３０６号、同第１３／５４９，３１２号、同第１３／５２４，９９４号に記載されており、これらはそれぞれ、そのような教示のために参照によりその全体が組み込まれる。ポリオキサゾリンポリマーは、ホモポリマーとすることができる。同様に、ポリオキサゾリンポリマーは、１単位以上の第２のポリオキサゾリンポリマーによって分離されている１単位以上の第１のポリオキサゾリンポリマーを含むランダム又はブロックコポリマーとすることができる。同様に、ＰＯＺは、かなり親水性であるポリ（メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＺ）、又はあまり親水性でないポリ（エチルオキサゾリン）（ＰＥＯＺ）とすることができる。
さまざまなＰＯＺポリマーが、本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおいて使用されてよく、以下にさらに詳述される。しかし、一般的には、ＰＯＺポリマーは、単一のタイプ又はクラスの官能基を含むことができ、あるいは一つより多いタイプ又はクラスの官能基を含むことができる。ＰＯＺは、線状ＰＯＺポリマー、分枝状ＰＯＺポリマー、ペンデントＰＯＺポリマー又はマルチアーム型ＰＯＺポリマーとすることができる。代表的なＰＯＺポリマーについては、米国特許第７，９４３，１４１号、同第８，０８８，８８４号、同第８，１１０，６５１号、同第８，１０１，７０６号、同第８，８８３，２１１号、同第９，２８４，４１１号、及び米国特許出願第１３／００３，３０６号、同第１３／５４９，３１２号、同第１３／５２４，９９４号に記載されており、これらはそれぞれ、そのような教示のために参照によりその全体が組み込まれる。ポリオキサゾリンポリマーは、ホモポリマーとすることができる。同様に、ポリオキサゾリンポリマーは、１単位以上の第２のポリオキサゾリンポリマーによって分離されている１単位以上の第１のポリオキサゾリンポリマーを含むランダム又はブロックコポリマーとすることができる。同様に、ＰＯＺは、かなり親水性であるポリ（メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＺ）、又はあまり親水性でないポリ（エチルオキサゾリン）（ＰＥＯＺ）とすることができる。
【0078】
一実施形態において、ＰＯＺポリマーは、リビングカチオン重合によって調製される。当技術分野において公知である他の方法を使用して、ＰＯＺポリマーを調製することもできる。以下にさらに詳述するように、ＰＯＺを脂質に直接コンジュゲートすることができ、又はリンカー部分を介して脂質に連結することができる。限定されるものではないがエステルを含まないリンカー部分及びエステルを含むリンカー部分を含めて、ＰＯＺを脂質にカップリングさせるのに適したいずれのリンカー部分も使用することができる。また、以下にさらに詳述するように、ＰＯＺポリマーを、開始剤若しくはポリマーの停止末端の適切な化学基を介して、又はポリマーのペンダント位置における適切な化学基を介して脂質部分にコンジュゲートすることができる。
【0079】
本開示では、ポリオキサゾリン誘導体又はポリオキサゾリンポリマーが記載されているときは常に、ポリオキサゾリンポリマーは、低多分散（ＰＤ）値及び／又は純度上昇で特徴づけられたものとすることができ、したがってポリマーは、医薬品適用において有用である。特定の実施形態において、本開示の方法は、増加した分子量（ＭＷ）値において低ＰＤ値を有するポリオキサゾリン誘導体を提供する。例えば、一実施形態において、ＰＯＺ部分は、約５００～約１００００ダルトンの分子量を有する。別の実施形態において、ＰＯＺ部分は、約５００～約５０００ダルトンの分子量を有する。さらに別の実施形態において、ＰＯＺ部分は、約１，０００ダルトン～約２，５００ダルトンの分子量を有する。さらに別の実施形態において、ＰＯＺ部分は、約２，０００ダルトン～約５，０００ダルトンの分子量を有する。さらに別の実施形態において、ＰＯＺ部分は、約５，０００ダルトン～約１０，０００ダルトンの分子量を有する。そのような実施形態において、少なくとも１つのポリオキサゾリンポリマー鎖は、１．２以下、１．１以下、又は１．０５以下の多分散値を有する。低ＰＤ値を有するポリオキサゾリンポリマー及びそれらの誘導体を合成する方法については、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００２６２６号及び同ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７８１５９号に述べられており、それらは、そのような教示のために参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【0080】
脂質部分
一実施形態において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの脂質部分は、少なくとも１つの疎水性部分を含む。別の実施形態において、脂質部分は、２つの疎水性部分を含む。この態様において、疎水性部分は、アシル鎖、アルキル鎖、又はそれらの組合せとすることができる。アシル及びアルキル鎖は、長さがさまざまであってよい。さらに、アシル及びアルキル鎖は、飽和であってよく、又は１つ以上の不飽和領域（１個以上の二重結合など）を含むことができる。
一実施形態において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの脂質部分は、少なくとも１つの疎水性部分を含む。別の実施形態において、脂質部分は、２つの疎水性部分を含む。この態様において、疎水性部分は、アシル鎖、アルキル鎖、又はそれらの組合せとすることができる。アシル及びアルキル鎖は、長さがさまざまであってよい。さらに、アシル及びアルキル鎖は、飽和であってよく、又は１つ以上の不飽和領域（１個以上の二重結合など）を含むことができる。
【0081】
疎水性部分の数にかかわらず、脂質部分は、ＰＯＺポリマーの化学基とリンケージを形成することができる化学基も含む。この態様において、化学基は、アミン基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、カルボン酸基、及びそれらの組合せとすることができるが、他の化学基を除外しない。一実施形態において、脂質部分は、ＰＯＺポリマーとリンケージを形成するために使用することができる反応性アミノ基を含むことができる。
【0082】
いくつかの実施形態において、脂質の化学基は、親水性ヘッド基の位置に配置されていることがある。また、上に記載されたように、ＰＯＺポリマーを、開始剤若しくはポリマーの停止末端の適切な化学基を介して、又はポリマーのペンダント位置における適切な化学基を介して脂質にコンジュゲートすることができる。
【0083】
以下にさらに詳述されるように、リンケージの性質は、ＰＯＺポリマーに存在する化学基及び脂質部分に存在する化学基によって決まる。いくつかの実施形態において、リンケージは、いくつかの酵素の存在下で分解可能である。他の実施形態において、リンケージは、同じこれらの酵素の存在下で安定である。
【0084】
一実施形態において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの脂質部分は非荷電脂質である。例えば、層、ベシクル及び／又はＬＮＰ組成物を単独で又は他の脂質成分と組み合わせて形成することができるいずれの非荷電脂質も、本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲートを形成する際における使用に適している。別の実施形態において、脂質部分は、合成でも、天然でもよい。
【0085】
ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの脂質部分は、本明細書に記載されたＬＮＰに所望の特徴を付与するように選択されうる。例えば、脂質の不飽和度は、本明細書に記載されたＬＮＰに所望の特性をもたらすように選択されうる。例えば、脂質部分の不飽和度を上げることによって、ＬＮＰ組成物に流動性を付与することができる。さらに、不飽和領域の周囲のｃｉｓ立体配置が、ＬＮＰ組成物に増大した流動性を付与することもできる。同様に、飽和脂質部分が、ＬＮＰ組成物に硬さを付与することができる。流動性及び／又は硬さは、ＬＮＰ組成物の安定性及び／又はＬＮＰ組成物からのＰＯＺ－脂質コンジュゲートの放出率を少なくとも部分的に制御するように選択されうる。
【0086】
一実施形態において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの脂質部分はリン脂質である。例えば、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの脂質部分は、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、又はそれらの組合せとすることができる。
【0087】
別の実施形態において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの脂質部分はグリセロ脂質である。例えば、脂質部分は、αβ－ジアシルグリセロールとすることができる。
【0088】
別の実施形態において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの脂質部分はジアルキルアミンである。例えば、脂質部分は、ジミリスチルアミンとすることができる。
【0089】
ある態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質部分の２つのアシル又はアルキル鎖の少なくとも１つは飽和である。ある態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質の２つのアシル又はアルキル鎖はそれぞれ飽和である。さらに別の態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質の２つのアシル又はアルキル鎖の一方は飽和であり、他方のアシル又はアルキル鎖は不飽和である。さらに別の態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質の２つのアシル又はアルキル鎖はそれぞれ不飽和である。ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質の１つ以上のアシル又はアルキル鎖が不飽和であるとき、アシル又はアルキル鎖は、１～６つ、１～４つ、１～３つ、又は１～２つの不飽和領域を含むことができる。二重結合が存在する場合、ｃｉｓ若しくはｔｒａｎｓ立体配置、又はｃｉｓ及びｔｒａｎｓ立体配置の混合物とすることができる。
【0090】
一態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質の２つのアシル又はアルキル鎖の少なくとも１つは、１～５個の炭素の長さ、６～１０個の炭素の長さ、１１～１６個の炭素の長さ、又は１７～２１個の炭素の長さである。別の態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質の２つのアシル又はアルキル鎖のそれぞれは、１～５個の炭素の長さ、６～１０個の炭素の長さ、１１～１６個の炭素の長さ、又は１７～２１個の炭素の長さである。そのようなアシル又はアルキル鎖は長さにかかわらず、偶数と奇数両方の鎖長を含み、上に記載されたように飽和でも、不飽和でもよい。
【0091】
特定の一態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質部分の２つのアシル又はアルキル鎖の少なくとも１つは、６～１０個の炭素の長さである。別の態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質の２つのアシル又はアルキル鎖のそれぞれは、６～１０個の炭素の長さである。そのようなアシル又はアルキル鎖は長さにかかわらず、偶数と奇数両方の鎖長を含み、上に記載されたように飽和でも、不飽和でもよい。
【0092】
別の態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質部分の２つのアシル又はアルキル鎖の少なくとも１つは、１１～１６個の炭素の長さである。別の態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質の２つのアシル又はアルキル鎖のそれぞれは、１１～１６個の炭素の長さである。そのようなアシル又はアルキル鎖は長さにかかわらず、偶数と奇数両方の鎖長を含み、上に記載されたように飽和でも、不飽和でもよい。
【0093】
さらに別の態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質の２つのアシル又はアルキル鎖の少なくとも１つは、１７～２１個の炭素の長さである。さらに別の態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質の２つのアシル又はアルキル鎖のそれぞれは、１７～２１個の炭素の長さである。そのようなアシル又はアルキル鎖は長さにかかわらず、偶数と奇数両方の鎖長を含み、上に記載されたように飽和でも、不飽和でもよい。
【0094】
一態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質の２つのアシル又はアルキル鎖のそれぞれは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１個の炭素の長さであり、それらのアシル又はアルキル鎖は、飽和又は不飽和である。別の態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質の２つのアルキル又はアシル鎖のそれぞれは、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個の炭素の長さのアシル鎖であり、それらのアシル鎖は、飽和又は不飽和である。さらなる態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質の２つのアシル又はアルキル鎖のそれぞれは、１２、１３、１４、又は１５個の炭素の長さのアシル鎖であり、それらのアシル鎖は、飽和又は不飽和である。さらにさらなる態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質の２つのアシル又はアルキル鎖のそれぞれは、１３又は１４個の炭素の長さのアシル鎖であり、それらのアシル鎖は、飽和又は不飽和である。さらに別の態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質の２つのアルキル又はアシル鎖のそれぞれは、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個の炭素の長さのアルキル鎖であり、それらのアルキル鎖は、飽和又は不飽和である。さらなる態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質の２つのアシル又はアルキル鎖のそれぞれは、１２、１３、１４又は１５個の炭素の長さのアルキル鎖であり、それらのアルキル鎖は、飽和又は不飽和である。さらにさらなる態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質の２つのアシル又はアルキル鎖のそれぞれは、１３又は１４個の炭素の長さのアルキル鎖であり、それらのアルキル鎖は、飽和又は不飽和である。
【0095】
さらに別の態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質部分のそれぞれのアシル又はアルキル鎖は、同じ長さを有し、不飽和である。例えば、アシル又はアルキル鎖は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、若しくは２１個の炭素の長さ、１１、１２、１３、１４、１５、若しくは１６個の炭素の長さ、１２、１３、１４、若しくは１５個の炭素の長さ、又は１３若しくは１４個の炭素の長さであり、不飽和であってよい。
【0096】
別の態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質部分は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール又は１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロールである。さらに別の態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質部分は、ジ（テトラデシル）アセトアミド又はジ（ドデシル）アセトアミドである。さらに別の態様において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートにおける脂質部分は、Ｎ，Ｎ－ジ（テトラデシル）アセトアミド又はＮ，Ｎ－ジ（ドデシル）アセトアミドである。さらに別の態様において、脂質部分は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ）とすることができる。
【0097】
ＰＯＺ－脂質コンジュゲート
一般に、ＰＯＺの脂質への共有結合は、ＰＯＺポリマーの活性化学基と脂質の相補的化学基の反応によって行われる。ＰＯＺポリマー及び／又は脂質の化学基は、反応（例えば限定されるものではないが、保護基が存在するならばその除去）より前に活性化されうる。ヒドロキシル、アミン又はカルボキシル基は、とりわけＮ－ヒドロキシスクシンイミドやエチルクロロホルメート、ＤＣＣＤ、ウッドワード試薬Ｋ、シアヌル酸、トリフルオロメタンスルホニルクロリドなど単官能性の活性化剤によるカップリングのために活性化されうる。いくつかのジイソシアネートなどさまざまな反応性を有する基を含むいくつかの二官能性の架橋試薬も使用されうる。
一般に、ＰＯＺの脂質への共有結合は、ＰＯＺポリマーの活性化学基と脂質の相補的化学基の反応によって行われる。ＰＯＺポリマー及び／又は脂質の化学基は、反応（例えば限定されるものではないが、保護基が存在するならばその除去）より前に活性化されうる。ヒドロキシル、アミン又はカルボキシル基は、とりわけＮ－ヒドロキシスクシンイミドやエチルクロロホルメート、ＤＣＣＤ、ウッドワード試薬Ｋ、シアヌル酸、トリフルオロメタンスルホニルクロリドなど単官能性の活性化剤によるカップリングのために活性化されうる。いくつかのジイソシアネートなどさまざまな反応性を有する基を含むいくつかの二官能性の架橋試薬も使用されうる。
【0098】
ＰＯＺ－脂質コンジュゲートに含めるための特異的脂質は、以上及び本明細書に記載される。
【0099】
一実施形態において、本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲート、又はその薬学的に許容される形、例えば限定されるものではないが薬学的に許容される塩は、脂質がポリマー鎖に停止末端において結合している一般式Ｉ：
Ｒ－ＰＯＺｎ－Ｌ－脂質 Ｉ
によって表すことができ、式中、
Ｒは、開始基であり、
ＰＯＺは、ポリオキサゾリンポリマーであり、
ｎは、１～１，０００であり、ポリオキサゾリンポリマーを含むモノマー単位の数を表し、
Ｌは、切断速度が制御される切断可能な部分を任意選択的に含む連結基であり、脂質の反応性基とポリマーの反応性基を通じた直接リンケージを表し、直接リンケージが、切断速度が極めて不安定から安定まで制御されうる切断可能な部分を形成することができ、
脂質は、本明細書に記載された脂質部分を表す。
Ｒ－ＰＯＺｎ－Ｌ－脂質 Ｉ
によって表すことができ、式中、
Ｒは、開始基であり、
ＰＯＺは、ポリオキサゾリンポリマーであり、
ｎは、１～１，０００であり、ポリオキサゾリンポリマーを含むモノマー単位の数を表し、
Ｌは、切断速度が制御される切断可能な部分を任意選択的に含む連結基であり、脂質の反応性基とポリマーの反応性基を通じた直接リンケージを表し、直接リンケージが、切断速度が極めて不安定から安定まで制御されうる切断可能な部分を形成することができ、
脂質は、本明細書に記載された脂質部分を表す。
【0100】
構造Ｉの一実施形態において、ＰＯＺポリマーは、脂質又は連結基とリンケージを形成することができる少なくとも１個の反応性基を含む。（直接リンケージであろうと連結基を利用しているリンケージであろうと）ポリマーと脂質の間のリンケージは、末端位置又は（末端における）ペンデント位置における反応性基を含めてポリマー主鎖のいずれかの反応性基と脂質の反応性基の間に形成されうる。一態様において、連結基とポリマーの間のリンケージは、ポリマーの停止末端において形成されうる。別の態様において、連結基とポリマーの間のリンケージは、ポリマーのペンデント位置において形成されうる。さらに、リンケージ（直接リンケージであろうと連結基を利用しているリンケージであろうと）は、ポリマー又は脂質に元々存在していた反応性基の成分を含むことができる。リンケージ（直接リンケージであろうと連結基を利用しているリンケージであろうと）は、生理学的に分解可能でありうる。この態様において、リンケージは、切断可能な部分を含むことができる。好適な連結基には、エーテル、エステル、アミン、アミド、及びそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【0101】
この実施形態の一態様において、Ｌは、安定なリンケージである。この実施形態の別の態様において、Ｌは、生理学的に分解可能であり、切断可能な部分を含む。例えば、一実施形態において、Ｌは、エステル、カルボン酸エステル（－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－）、炭酸エステル（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－）、カルバメート（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－）及びアミド（－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－）から選択されうる。この実施形態のさらに別の態様において、Ｌは、切断可能な部分を含まないリンケージである。
【0102】
例示的なＲ基には、水素、アルキル及び置換アルキルが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、開始基は、アルキル基、例えばＣ１～Ｃ４アルキル基である。上記の具体的実施形態において、開始基はメチル基である。別の実施形態において、開始基はＨである。いくつかの態様において、開始基は、活性官能基を欠いているように選択されうる。他の態様において、開始基は、活性官能基を含むように選択されうる。追加の好適な開始基は、米国特許第７，９４３，１４１号、同第８，０８８，８８４号、同第８，１１０，６５１号、同第８，１０１，７０６号、同第８，８８３，２１１号、同第９，２８４，４１１号、及び米国特許出願第１３／００３，３０６号、同第１３／５４９，３１２号、同第１３／５２４，９９４号に開示されており、これらはそれぞれ、そのような教示のために参照によりその全体が組み込まれる。
【0103】
いくつかの実施形態において、Ｒは、Ｈ又はＣＨ３である。
【0104】
一態様において、構造ＩにおけるＰＯＺポリマーは、［Ｎ（ＣＯＲ２）ＣＨ２ＣＨ２］ｎによって表されるポリマーとすることができ、ここで、Ｒ２は、ＰＯＺポリマーの各繰り返し単位について非置換若しくは置換アルキル、アルケニル、アラルキル及びヘテロシクリルアルキル基から独立に選択され、Ｒは、Ｈ又はＣＨ３であり、重合度「ｎ」は、１５～３５、２０～３０の範囲内であり、又は２５でありうる。
【0105】
別の態様において、構造ＩにおけるＰＯＺポリマーは、［Ｎ（ＣＯＲ２）ＣＨ２ＣＨ２］ｎによって表されるポリマーとすることができ、ここで、Ｒ２は、ＰＯＺポリマーの各繰り返し単位について非置換及び置換アルキルから独立に選択され、Ｒは、Ｈ又はＣＨ３であり、ｎは、１５～３５、２０～３０の範囲内であり、又は２５でありうる。
【0106】
さらに別の態様において、構造ＩにおけるＰＯＺポリマーは、［Ｎ（ＣＯＲ２）ＣＨ２ＣＨ２］ｎによって表されるポリマーであり、ここで、Ｒ２は、ＰＯＺポリマーの各繰り返し単位について－ＣＨ３及び－ＣＨ２－ＣＨ３から独立に選択され、任意選択的にＲは、Ｈ又はＣＨ３であり、ｎは、１５～３５、２０～３０の範囲内であり、又は２５でありうる。
【0107】
ＰＯＺポリマーが［Ｎ（ＣＯＲ２）ＣＨ２ＣＨ２］ｎによって表されるポリマーであるとき、コンジュゲートのＰＯＺポリマーは、水性環境において可溶である。ペンデント基（Ｒ２）の性質は、溶解度をある程度変えることができる。例えば、（ＰＭＯＺのように）Ｒ２がメチルであるとき、ポリマーは高水溶性であり、（ＰＥＯＺのように）Ｒ２がエチルであるとき、ポリマーは水溶性のままであるが、その程度はＰＭＯＺより低い。ＰＯＺポリマーの溶解度は、ＰＯＺポリマーがリポソーム表面を超えてリポソーム外の環境に広がることを可能にする。そのような形で、ＰＯＺポリマーは、リポソーム表面を効果的に遮蔽することができる。
【0108】
上記の構造Ｉの具体的実施形態には、以下にＩ（ａ）（１）及びＩ（ａ）（２）で示されたアミダーゼで切断可能なアミドであるＬが含まれるが、これに限定されない。
【0109】
【化4】
【0110】
構造Ｉの代替実施形態において、同じ脂質基が、以下にＩ（ｂ）で示された（アミドではなく）安定なアミンとして組み込まれうる。
【0111】
【化5】
【0112】
構造Ｉのさらに別の実施形態において、同様の脂質が、以下にＩ（ｃ）及びＩ（ｄ）で示された比較的不安定なエステルリンケージを介してカップリングされうる。
【0113】
【化6】
【0114】
構造Ｉのさらに別の実施形態において、脂質が、以下にＩ（ｅ）及びＩ（ｆ）で示された比較的不安定なエーテルリンケージを介してカップリングされうる。
【0115】
【化7】
【0116】
一実施形態において、構造Ｉ（ａ）～Ｉ（ｆ）について（適用できる場合）、ｍは、１又は２であり、ｎは、１～１０００の範囲内であり、ｏは、１～５の範囲内であり、ｐは、１～１０の範囲内である。
【0117】
以下に実施例の項で明示されるように、構造Ｉ（Ｉ（ａ）～Ｉ（ｆ））の上記の実施形態は、血漿中さまざまな速度で加水分解し、したがって本開示の新規ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの重要な要素の１つを例示する。
【0118】
上記の構造Ｉの他の具体的実施形態には、以下にＩ（ｇ）及びＩ（ｈ）で示されたものが含まれるが、これらに限定されない。
【0119】
【化8】
【0120】
一実施形態において、構造Ｉ（ｇ）～Ｉ（ｈ）について、ｍは、１又は２であり、ｎは、１～１０００の範囲内である。
【0121】
本発明の別の実施形態において、本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲート、又はその薬学的に許容される形、例えば限定されるものではないが薬学的に許容される塩は、脂質がポリマー鎖に式Ｉのように停止末端ではなく開始剤末端において結合している一般式ＩＩ：
脂質－Ｌ１－（ＰＯＺ）ｎ ａ－Ｔ ＩＩ
によって表すことができ、式中、
ＰＯＺは、構造［Ｎ（ＣＯＲ２）ＣＨ２ＣＨ２］のポリオキサゾリンポリマーであり、
Ｌ１は、切断速度が制御されうる切断可能な部分を任意選択的に含む連結基であり、又は脂質の反応性基とポリマーの反応性基を通じた直接リンケージを表し、直接リンケージが、切断速度が制御されうる切断可能な部分を形成することができ、
Ｒ２は、ポリオキサゾリンポリマーの各繰り返し単位について非置換若しくは置換アルキル、アルケニル、アルキン置換アルキル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキル、又は活性官能基から独立に選択され、
Ｔは、停止末端の基であり、
ａは、ランダムコポリマーを表すｒａｎ、又はブロックコポリマーを表すｂｌｏｃｋであり、
ｎは、１～１，０００の整数である。
脂質－Ｌ１－（ＰＯＺ）ｎ ａ－Ｔ ＩＩ
によって表すことができ、式中、
ＰＯＺは、構造［Ｎ（ＣＯＲ２）ＣＨ２ＣＨ２］のポリオキサゾリンポリマーであり、
Ｌ１は、切断速度が制御されうる切断可能な部分を任意選択的に含む連結基であり、又は脂質の反応性基とポリマーの反応性基を通じた直接リンケージを表し、直接リンケージが、切断速度が制御されうる切断可能な部分を形成することができ、
Ｒ２は、ポリオキサゾリンポリマーの各繰り返し単位について非置換若しくは置換アルキル、アルケニル、アルキン置換アルキル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキル、又は活性官能基から独立に選択され、
Ｔは、停止末端の基であり、
ａは、ランダムコポリマーを表すｒａｎ、又はブロックコポリマーを表すｂｌｏｃｋであり、
ｎは、１～１，０００の整数である。
【0122】
ペンデント基（Ｒ２）の性質は、溶解度をある程度変えることができる。ＰＯＺポリマーの溶解度は、ＰＯＺポリマーがリポソーム表面を超えてリポソーム外の環境に広がることを可能にする。そのような形で、ＰＯＺポリマーは、リポソーム表面を効果的に遮蔽し、ＬＮＰ形成時において凝集を防止することができる。さらに、いかなる特定の理論にも拘束されることなく、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートは、核酸ペイロードを効率的に送達するために投与後にＬＮＰ表面から「脱落」されなければならないと思われる。いくつかの態様において、高親水基のＰＯＺ－脂質コンジュゲートへのＲ２位における付加は、ＬＮＰ形成及び／若しくは投与時における追加の遮蔽並びに／又はＰＯＺ－脂質コンジュゲートのＬＮＰからの脱落の増強を可能にして、ペイロードの送達を促進する。一実施形態において、Ｒ２は、少なくとも１個の親水基を含む。別の実施形態において、Ｒ２は、複数の親水基を含む。
【0123】
Ｌ１（直接リンケージであろうと連結基であろうと）は、ポリマー又は脂質に元々存在していた反応性基の成分を含むことができる。好適な連結基が本明細書に記載されている。Ｌ１は、切断可能な部分、例えば限定されるものではないがエステルやカルボン酸エステル（－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－）、炭酸エステル（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－）、カルバメート（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－）、アミド（－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－）を任意選択的に含むことができる。
【0124】
例示的な活性官能基には、アルキン、アルケン、アミン、オキシアミン、アルデヒド、ケトン、アセタール、チオール、ケタール、マレイミド、エステル、カルボン酸、活性化カルボン酸（例えば限定されるものではないがＮ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）や１－ベンゾトリアジン活性エステル）、活性カーボネート、クロロホルメート、アルコール、アジド、ビニルスルホン、又はオルトピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、活性官能基は親水基である。いくつかの実施形態において、活性官能基は、例えばアルキン又はアジド活性官能基を使用するクリックケミストリーなどにより、親水基をＰＯＺ－脂質コンジュゲートに付加するために使用される。
【0125】
この実施形態の一態様において、Ｌ１は、安定なリンケージである。この実施形態の別の態様において、Ｌ１は、生理学的に分解可能であり、切断可能な部分を含む。この実施形態の代替態様において、Ｌ１は、切断可能な部分を含まないリンケージである。好適なリンケージＬ１が、本明細書に記載されている。
【0126】
この実施形態の一態様において、Ｌ１は、以下にさらに詳述されるトリアゾール連結基である。
【0127】
この実施形態の別の態様において、Ｔは停止求核体である。例えば、Ｔは、Ｚ－Ｂ－Ｑとすることができ、ここで、Ｚは、Ｓ、Ｏ、又はＮであり、Ｂは、任意選択の連結基であり、Ｑは、停止求核体又は求核体の終端部分である。
【0128】
Ｂ基には、アルキレン基が含まれうるが、これに限定されない。特定の実施形態において、Ｂは、－（ＣＨ２）ｙ－であり、ここで、ｙは、１～１６から選択される整数である。
【0129】
特定の態様において、ＺはＳである。本明細書に記載された硫黄基を含むＰＯＺ－脂質コンジュゲートは、ＰＯＺカチオンをメルカプチド試薬、例えば限定されるものではないがメルカプト－エステル（例えば、－Ｓ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯ２ＣＨ３）又はメルカプト保護アミン（例えば、－Ｓ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ｔＢｏｃ）で終結させることによって調製されうる。そのようなＰＯＺコンジュゲートは、（第二級アミンを除去するのに）効果的で大規模なイオン交換クロマトグラフィー精製を行い、さらには多分散値の制御（多分散値１．１０以下）及びより高分子量のＰＯＺポリマーとのコンジュゲートの創造を可能にする。別の態様において、ＺはＮである。別の態様において、ＺはＯである。
【0130】
いくつかの態様において、Ｑは不活性である（すなわち、官能基を含まない）。Ｑが不活性基であるとき、限定されるものではないが－Ｃ６Ｈ５、アルキル、及びアリールメルカプチド基を含めて、いずれの不活性基でも使用されうる。代替態様において、Ｑは活性官能基であり、又はそれを含む。Ｑが活性官能基であり、又はそれを含むとき、好適な官能基には、アルキン、アルケン、アミン、オキシアミン、アルデヒド、ケトン、アセタール、チオール、ケタール、マレイミド、エステル、カルボン酸、活性化カルボン酸（例えば限定されるものではないがＮ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）や１－ベンゾトリアジン活性エステル）、活性カーボネート、クロロホルメート、アルコール、アジド、ビニルスルホン、又はオルトピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）が含まれるが、これらに限定されない。Ｑが活性官能基であり、又はそれを含むとき、ＱはＲ２と同じでもよく、Ｒ２と異なってもよい（すなわち、ＱとＲ２は、互いに化学的に直交することができる）。
【0131】
この実施形態の特定の一態様において、Ｒ２は、ポリオキサゾリンポリマーの各繰り返し単位について非置換又は置換アルキルから独立に選択され、任意選択的に、Ｒは、Ｈ又はＣＨ３であり、ｎは、１５～３５、２０～３０、２２～２８、又は２５である。この実施形態の別の態様において、Ｒ２は、ポリオキサゾリンポリマーの各繰り返し単位についてＣＨ３及びＣＨ２－ＣＨ３から独立に選択され、任意選択的に、Ｒは、Ｈ又はＣＨ３であり、ｎは、１５～３５、２０～３０、２２～２８、又は２５である。上記の態様のいずれにおいても、Ｔは、Ｚ－Ｂ－Ｑであり、ここで、ＺはＳであり、Ｂは－（ＣＨ２）ｙ－であり、Ｑは、不活性基、例えば限定されるものではないが－Ｃ６Ｈ５やアルキル、アリールメルカプチド基である。あるいは、上記の態様のいずれにおいても、Ｔは、Ｚ－Ｂ－Ｑであり、ここで、ＺはＳであり、Ｂは－（ＣＨ２）ｙ－であり、Ｑは、官能基、例えば限定されるものではないがアルキン、アルケン、アミン、オキシアミン、アルデヒド、ケトン、アセタール、チオール、ケタール、マレイミド、エステル、カルボン酸、活性化カルボン酸（例えば、限定するものではないがＮ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）や１－ベンゾトリアジン活性エステル）、活性カーボネート、クロロホルメート、アルコール、アジド、ビニルスルホン、又はオルトピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）であり、又はそれを含む。
【0132】
上記の構造ＩＩの具体的実施形態には、脂質が開始剤末端において結合されており、停止求核体が硫黄である、以下の構造ＩＩ（ａ）が含まれるが、これに限定されない。
【0133】
【化9】
【0134】
以下にＩＩ（ｂ）で示された構造ＩＩの代替実施形態において、脂質は、開始剤末端に結合しており、停止求核体は－ＯＨである。
【0135】
【化10】
【0136】
以下にＩＩ（ｃ）で示された構造ＩＩの代替実施形態において、脂質は、開始剤末端に結合しており、停止求核体は窒素であり、脂質は、２－プロピオン酸エステルを介して結合している。
【0137】
【化11】
【0138】
化合物ＩＩ（ａ）～ＩＩ（ｃ）は、以下に示されたようにアジドのペンデントアルキン基への「クリック」反応によって作製される。
【0139】
【化12】
【0140】
以下にＩＩ（ｄ）で示された構造ＩＩのさらに別の代替実施形態において、脂質は、開始剤末端に結合しており、停止求核体は硫黄であり、脂質は、酢酸エステルによって結合されている。
【0141】
【化13】
【0142】
ＩＩ（ｄ）は、以下に示されたようにアジドのアルキン開始基への「クリック」反応によって作製される。
【0143】
【化14】
【0144】
一実施形態において、構造ＩＩ（ａ）～ＩＩ（ｄ）について（適用できる場合）、ｍは、１～２であり、ｎは、１～１０００の範囲内であり、ｏは、１～５の範囲内である。
【0145】
別の実施形態において、本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲート、又はその薬学的に許容される形、例えば限定されるものではないが薬学的に許容される塩は、一般式ＩＩＩによって表されうる：
Ｒ－（ＰＯＺ）ｎ ａ－Ｚ－Ｌ２－脂質 ＩＩＩ
式中、
ＰＯＺは、構造［Ｎ（ＣＯＲ２）ＣＨ２ＣＨ２］のポリオキサゾリンポリマーであり、
Ｌ２は、切断速度が制御されうる切断可能な部分を任意選択的に含む連結基であり、又は脂質の反応性基とポリマーの反応性基を通じた直接リンケージを表し、直接リンケージが、切断速度が制御されうる切断可能な部分を形成することができ、
Ｒは、開始基であり、
Ｒ２は、ポリオキサゾリンポリマーの各繰り返し単位について非置換若しくは置換アルキル、アルケニル、アルキン置換アルキル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｙｌａｌｋｙｌ）基、又は活性官能基から独立に選択され、
Ｚは、Ｓ、Ｏ、又はＮであり、
ａは、ランダムコポリマーを表すｒａｎ、又はブロックコポリマーを表すｂｌｏｃｋであり、
ｎは、１～１，０００の整数である。
Ｒ－（ＰＯＺ）ｎ ａ－Ｚ－Ｌ２－脂質 ＩＩＩ
式中、
ＰＯＺは、構造［Ｎ（ＣＯＲ２）ＣＨ２ＣＨ２］のポリオキサゾリンポリマーであり、
Ｌ２は、切断速度が制御されうる切断可能な部分を任意選択的に含む連結基であり、又は脂質の反応性基とポリマーの反応性基を通じた直接リンケージを表し、直接リンケージが、切断速度が制御されうる切断可能な部分を形成することができ、
Ｒは、開始基であり、
Ｒ２は、ポリオキサゾリンポリマーの各繰り返し単位について非置換若しくは置換アルキル、アルケニル、アルキン置換アルキル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｙｌａｌｋｙｌ）基、又は活性官能基から独立に選択され、
Ｚは、Ｓ、Ｏ、又はＮであり、
ａは、ランダムコポリマーを表すｒａｎ、又はブロックコポリマーを表すｂｌｏｃｋであり、
ｎは、１～１，０００の整数である。
【0146】
構造ＩＩと同様に、ペンデント基（Ｒ２）の性質は、溶解度をある程度変えることができる。ポリオキサゾリンポリマーの溶解度は、ポリオキサゾリンポリマーがリポソーム表面を超えてリポソーム外の環境に広がることを可能にする。そのような形で、ポリオキサゾリンポリマーは、リポソーム表面を効果的に遮蔽することができる。さらに、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートは、核酸ペイロードを効率的に送達するために投与後にＬＮＰ表面から「脱落」されなければならない。いくつかの態様において、高親水基のＰＯＺ－脂質コンジュゲートへのＲ２位における付加は、ＬＮＰ形成及び／若しくは投与時における追加の遮蔽並びに／又はＰＯＺ－脂質コンジュゲートのＬＮＰからの脱落の増強を可能にして、ペイロードの送達を促進する。
【0147】
Ｌ２（直接リンケージであろうと連結基であろうと）は、ポリマー又は脂質に元々存在していた反応性基の成分を含むことができる。好適な連結基が本明細書に記載されている。Ｌ２は、切断可能な部分、例えば限定されるものではないがエステルやカルボン酸エステル（－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－）、炭酸エステル（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－）、カルバメート（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－）、アミド（－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－）を任意選択的に含むことができる。
【0148】
Ｒ基には、水素、アルキル及び置換アルキルが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、開始基は、アルキル基、例えばＣ１～Ｃ４アルキル基である。上記の具体的な実施形態において、開始基はメチル基である。別の実施形態において、開始基はＨである。開始基は、活性官能基を欠いているように選択されうる。あるいは、開始基は、活性官能基を含むように選択されうる。追加の例示的な開始基は、米国特許第７，９４３，１４１号、同第８，０８８，８８４号、同第８，１１０，６５１号、同第８，１０１，７０６号、同第８，８８３，２１１号、同第９，２８４，４１１号、及び米国特許出願第１３／００３，３０６号、同第１３／５４９，３１２号、同第１３／５２４，９９４号に開示されており、これらはそれぞれ、そのような教示のために参照によりその全体が組み込まれる。
【0149】
活性官能基には、アルキン、アルケン、アミン、オキシアミン、アルデヒド、ケトン、アセタール、チオール、ケタール、マレイミド、エステル、カルボン酸、活性化カルボン酸（例えば限定されるものではないがＮ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）や１－ベンゾトリアジン活性エステル）、活性カーボネート、クロロホルメート、アルコール、アジド、ビニルスルホン、又はオルトピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、活性官能基は親水基である。いくつかの実施形態において、活性官能基は、例えばアルキン又はアジド活性官能基を使用するクリックケミストリーなどにより、親水基をＰＯＺ－脂質コンジュゲートに付加するために使用される。
【0150】
この実施形態の一態様において、Ｌ２は、安定なリンケージである。この実施形態の別の態様において、Ｌ２は、生理学的に分解可能であり、切断可能な部分を含む。この実施形態の代替態様において、Ｌ２は、切断可能な部分を含まないリンケージである。好適なリンケージＬ２が本明細書に記載されている。
【0151】
特定の態様において、ＺはＳである。本明細書に記載された硫黄基を含むＰＯＺコンジュゲートは、ＰＯＺカチオンをメルカプチド試薬、例えば限定されるものではないがメルカプト－エステル（例えば、－Ｓ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯ２ＣＨ３）又はメルカプト保護アミン（例えば、－Ｓ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ｔＢｏｃ）で終結させることによって調製されうる。そのようなＰＯＺコンジュゲートは、（第二級アミンを除去するのに）効果的で大規模なイオン交換クロマトグラフィー精製を行い、さらには多分散値の制御（多分散値１．１０以下）及びより高分子量のＰＯＺポリマーとのコンジュゲートの創造を可能にする。別の態様において、ＺはＮである。別の態様において、ＺはＯである。
【0152】
この実施形態の態様において、Ｒ２は、ポリオキサゾリンポリマーの各繰り返し単位について非置換又は置換アルキルから独立に選択され、任意選択的に、Ｒは、Ｈ又はＣＨ３であり、ｎは、１５～３５、２０～３０、又は２５である。
【0153】
この実施形態の別の態様において、Ｒ２は、ポリオキサゾリンポリマーの各繰り返し単位についてＣＨ３及びＣＨ２－ＣＨ３から独立に選択され、任意選択的に、Ｒは、Ｈ又はＣＨ３であり、ｎは、１５～３５、２０～３０、又は２５である。
【0154】
別の実施形態において、本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲート、又はその薬学的に許容される形、例えば限定されるものではないが薬学的に許容される塩は、一般式ＩＶによって表されうる：
【0155】
【化15】
Ｒは、開始基であり、
Ｒ２は、ポリオキサゾリンポリマーの各繰り返し単位について非置換若しくは置換アルキル、アルケニル、アルキン置換アルキル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｙｌａｌｋｙｌ）基、又は活性官能基から独立に選択され、
Ｌ３は、切断速度が制御されうる切断可能な部分を任意選択的に含む連結基であり、又は脂質の反応性基とポリマーの反応性基を通じた直接リンケージを表し、直接リンケージが、切断速度が制御されうる切断可能な部分を形成することができ、
脂質は脂質であり、
Ｔは、停止末端の基であり、
ａは、ランダムコポリマーを表すｒａｎ、又はブロックコポリマーを表すｂｌｏｃｋであり、
ｍは、０～１００の整数であり、
ｎは、１～５の整数である。
【0156】
一態様において、ｎは１であり、このモノマー単位は、Ｒに隣接した初期単位である。
【0157】
ペンデント基（Ｒ２）の性質は、溶解度をある程度変えることができる。ポリオキサゾリンポリマーの溶解度は、ポリオキサゾリンポリマーがリポソーム表面を超えてリポソーム外の環境に広がることを可能にする。そのような形で、ポリオキサゾリンポリマーは、リポソーム表面を効果的に遮蔽することができる。さらに、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートは、核酸ペイロードを効率的に送達するために投与後にＬＮＰ表面から「脱落」されなければならない。いくつかの態様において、高親水基のＰＯＺ－脂質コンジュゲートへのＲ２位における付加は、ＬＮＰ形成及び／若しくは投与時における追加の遮蔽並びに／又はＰＯＺ－脂質コンジュゲートのＬＮＰからの脱落の増強を可能にして、ペイロードの送達を促進する。
【0158】
Ｌ３（直接リンケージであろうと連結基であろうと）は、ポリマー又は脂質に元々存在していた反応性基の成分を含むことができる。好適な連結基が本明細書に記載されている。Ｌ３は、切断可能な部分、例えば限定されるものではないがエステルやカルボン酸エステル（－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－）、炭酸エステル（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－）、カルバメート（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－）、アミド（－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－）を任意選択的に含むことができる。
【0159】
Ｒ基には、水素、アルキル及び置換アルキルが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、開始基は、アルキル基、例えばＣ１～Ｃ４アルキル基である。上記の具体的な実施形態において、開始基はメチル基である。別の実施形態において、開始基はＨである。開始基は、活性官能基を欠いているように選択されうる。あるいは、開始基は、活性官能基を含むように選択されうる。追加の例示的な開始基は、米国特許第７，９４３，１４１号、同第８，０８８，８８４号、同第８，１１０，６５１号、同第８，１０１，７０６号、同第８，８８３，２１１号、同第９，２８４，４１１号、及び米国特許出願第１３／００３，３０６号、同第１３／５４９，３１２号、同第１３／５２４，９９４号に開示されており、これらはそれぞれ、そのような教示のために参照によりその全体が組み込まれる。
【0160】
活性官能基には、アルキン、アルケン、アミン、オキシアミン、アルデヒド、ケトン、アセタール、チオール、ケタール、マレイミド、エステル、カルボン酸、活性化カルボン酸（例えば限定されるものではないがＮ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）や１－ベンゾトリアジン活性エステル）、活性カーボネート、クロロホルメート、アルコール、アジド、ビニルスルホン、又はオルトピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、活性官能基は親水基である。いくつかの実施形態において、活性官能基は、例えばアルキン又はアジド活性官能基を使用するクリックケミストリーなどにより、親水基をＰＯＺ－脂質コンジュゲートに付加するために使用される。
【0161】
この実施形態の一態様において、Ｌ３は、安定なリンケージである。この実施形態の別の態様において、Ｌ３は、生理学的に分解可能であり、切断可能な部分を含む。この実施形態の代替態様において、Ｌ３は、切断可能な部分を含まないリンケージである。好適なリンケージＬ３が本明細書に記載されている。
【0162】
この実施形態の一態様において、Ｔは停止求核体である。この実施形態の一態様において、Ｔは、Ｚ－Ｂ－Ｑであり、ここで、Ｚは、Ｓ、Ｏ、又はＮであり、Ｂは、任意選択の連結基であり、Ｑは、停止求核体又は求核体の終端部分である。
【0163】
Ｂ基には、アルキレン基が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、Ｂは、－（ＣＨ２）ｙ－であり、ここで、ｙは、１～１６から選択される整数である。
【0164】
特定の態様において、ＺはＳである。本明細書に記載された硫黄基を含むＰＯＺコンジュゲートは、ＰＯＺカチオンをメルカプチド試薬、例えば限定されるものではないがメルカプト－エステル（例えば、－Ｓ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯ２ＣＨ３）又はメルカプト保護アミン（例えば、－Ｓ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ｔＢｏｃ）で終結させることによって調製されうる。そのようなＰＯＺコンジュゲートは、（第二級アミンを除去するのに）効果的で大規模なイオン交換クロマトグラフィー精製を行い、さらには多分散値の制御（多分散値１．１０以下）及びより高分子量のＰＯＺポリマーとのコンジュゲートの創造を可能にする。別の態様において、ＺはＮである。別の態様において、ＺはＯである。
【0165】
いくつかの態様において、Ｑは不活性である（すなわち、官能基を含まない）。Ｑが不活性基であるとき、限定されるものではないが－Ｃ６Ｈ５、アルキル、及びアリールメルカプチド基を含めて、いずれの不活性基でも使用されうる。他の態様において、Ｑは活性官能基であり、又はそれを含む。Ｑが活性官能基であり、又はそれを含むとき、例示的な基には、アルキン、アルケン、アミン、オキシアミン、アルデヒド、ケトン、アセタール、チオール、ケタール、マレイミド、エステル、カルボン酸、活性化カルボン酸（例えば限定されるものではないがＮ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）や１－ベンゾトリアジン活性エステル）、活性カーボネート、クロロホルメート、アルコール、アジド、ビニルスルホン、又はオルトピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）が含まれるが、これらに限定されない。Ｑが活性官能基であり、又はそれを含むとき、ＱはＲ２と同じでもよく、Ｒ２と異なってもよい（すなわち、ＱとＲ２は、互いに化学的に直交する）。
【0166】
この実施形態の態様において、Ｒ２は、ポリオキサゾリンポリマーの各繰り返し単位について非置換又は置換アルキルから独立に選択され、任意選択的に、Ｒは、Ｈ又はＣＨ３であり、ｍは、１５～３５、２０～３０、又は２５であり、ｎは１である。この実施形態の別の態様において、Ｒ２は、ポリオキサゾリンポリマーの各繰り返し単位についてＣＨ３及びＣＨ２－ＣＨ３から独立に選択され、任意選択的に、Ｒは、Ｈ又はＣＨ３であり、ｍは、１５～３５、２０～３０、又は２５であり、ｎは１である。これらの態様のいずれにおいても、Ｔは、Ｚ－Ｂ－Ｑであり、ここで、ＺはＳであり、Ｂは－（ＣＨ２）ｙ－であり、Ｑは、不活性基、例えば限定されるものではないが－Ｃ６Ｈ５やアルキル、アリールメルカプチド基である。これらの態様のいずれにおいても、Ｔは、Ｚ－Ｂ－Ｑであり、ここで、ＺはＳであり、Ｂは－（ＣＨ２）ｙ－であり、Ｑは、官能基、例えば限定されるものではないがアルキン、アルケン、アミン、オキシアミン、アルデヒド、ケトン、アセタール、チオール、ケタール、マレイミド、エステル、カルボン酸、活性化カルボン酸（例えば限定されるものではないがＮ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）や１－ベンゾトリアジン活性エステル）、活性カーボネート、クロロホルメート、アルコール、アジド、ビニルスルホン、又はオルトピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）であり、又はそれを含む。
【0167】
一般式ＩＶの具体的な実施形態において、本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲートは、下記を含む。
【0168】
【化16】
【0169】
同様の化合物群が、以下に示されたようにアジドを開始アルキン基にカップリングさせることによって作製される。
【0170】
【化17】
【0171】
これらの化合物は、トリアゾール環を含む。このトリアゾール環は特権的足場であり、それに結合しているリガンドを細胞内におけるポリペプチドの切断を担う酵素である２６Ｓプロテアーゼを通して輸送することができるという証拠がある。これらのいわゆるタンパク質分解標的キメラ（ＰＲＯＴＡＣＳ）は、ＰＲＯＴＡＣの一端に結合し、切断のために２６Ｓプロテアーゼを通してシャトルするタンパク質のレベルを「ノックダウン」することが示されている有望な薬物群である。いかなる特定の理論にも拘束されることなく、トリアゾール環を組み込むＰＯＺポリマーは、ＰＯＺポリマーを２６Ｓプロテアーゼを通してシャトルさせることができ、したがってタンパク質切断を受けないＰＯＺポリマーの免疫提示を防止することが企図される。注目すべきことに、分解可能なエステルリンケージの加水分解によって、脂質を放出すると、ポリマーに結合しているペンデント酸基が残る。本発明者らは、これらの残留しているペンデント基がトリアゾール環を介して結合している可溶性ＰＯＺは、皮下コンパートメントにおける樹状細胞によって取り込まれるにもかかわらず非免疫原性であることを見い出した。さらに、ロチゴチンが結合しているＣ１４標識２０ｋＤ ＰＯＺポリマーの標識研究から、ポリマーコンジュゲートは、皮下注射部位のドレーン治療を行うリンパ管を介して取り込まれたことが示された。標識コンジュゲートは、結局脾臓に出現し、そこで赤脾髄（マクロファージコンパートメント）によってほぼ選択的に取り込まれる。いかなる特定の理論にも拘束されることなく、本開示のＰＯＺ－脂質ＬＮＰは、樹状細胞によっても選択的に取り込まれうることが企図される。この同じ文脈で、いかなる特定の理論にも拘束されることなく、本開示のＰＯＺ－脂質ＬＮＰは、マクロファージによって選択的に取り込まれうることが企図される。そうであれば、ＬＮＰ中のオリゴヌクレオチドペイロードは、樹状細胞／マクロファージコンパートメントにおいて優先的に発現される可能性があり、免疫提示のために意味を有することがある。一態様において、追加のトリアゾール－ペンデント酸が、上記の構造におけるＲ基として直接結合されうることを認識する価値はある。いかなる特定の理論にも拘束されることなく、これらの基は、ＬＮＰに含まれているＰＯＺ－脂質の免疫原性の低減にさらに寄与することができる。
【0172】
追加のＰＯＺ－脂質コンジュゲートは、以下に式Ｖ～ＶＩＩで表され、ＰＯＺポリマーが、Ｌ、Ｌ１、Ｌ２、又はＬ３によって脂質に連結されている：
【0173】
【化18】
アルキル１及びアルキル２は、それぞれ独立に５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、若しくは２１個の炭素の長さ、１１、１２、１３、１４、１５、１６個の炭素の長さ、１２、１３、１４、１５個の炭素の長さ、又は１３若しくは１４個の炭素の長さの飽和又は不飽和アルキル鎖であり、好ましくは、アルキル１及びアルキル２は、同数の炭素原子を有し、それぞれ不飽和であり、
アシル１及びアシル２は、それぞれ独立に５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２１個の炭素の長さ、１１、１２、１３、１４、１５、１６個の炭素の長さ、１２、１３、１４、１５個の炭素の長さ、又は１３又は１４個の炭素の長さの飽和又は不飽和アシル鎖であり、好ましくは、アシル１及びアシル２は、同数の炭素原子を有し、それぞれ不飽和であり、
ｊは、１～８の整数である。
【0174】
切断可能な連結基
上に述べられたように、上に記載された実施形態のいくつかにおいて、脂質は、切断可能なリンケージを介してＰＯＺポリマーに連結されうる。一態様において、連結基が、切断可能な部分を含むかたちで、ＰＯＺポリマーと脂質の間にもたらされる。言い換えれば、連結基は、特異的環境において切断されうるという点で生理学的に分解可能なリンケージを含む。例えば、リンケージは、本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲート又はＰＯＺ－脂質コンジュゲートを含むＬＮＰ組成物を対象に投与した後、対象においてインビボで切断されうる。
上に述べられたように、上に記載された実施形態のいくつかにおいて、脂質は、切断可能なリンケージを介してＰＯＺポリマーに連結されうる。一態様において、連結基が、切断可能な部分を含むかたちで、ＰＯＺポリマーと脂質の間にもたらされる。言い換えれば、連結基は、特異的環境において切断されうるという点で生理学的に分解可能なリンケージを含む。例えば、リンケージは、本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲート又はＰＯＺ－脂質コンジュゲートを含むＬＮＰ組成物を対象に投与した後、対象においてインビボで切断されうる。
【0175】
一実施形態において、切断可能な部分は、化学反応によって切断される。この実施形態の態様において、切断は、容易に還元される基、例えば限定されるものではないがジスルフィドの還元によって行われる。別の実施形態において、切断可能な部分は、対象に自然に存在し、又は対象に存在するように誘導される物質によって切断される。この実施形態の態様において、そのような物質は、酵素又はポリペプチドである。したがって、一実施形態において、切断可能な部分は、酵素反応によって切断される。さらに別の実施形態において、切断可能な部分は、上記の組合せによって切断される。連結基は、ＰＯＺポリマーの一部分及び／又は脂質の一部分を含むことができる。というのは、以下に述べられるように、そのような一部分が反応して、連結基を形成するからである。
【0176】
この態様において、好適な切断可能な部分には、エステル、カルボン酸エステ（－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－）、炭酸エステル（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－）、カルバメート（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－）及びアミド（－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、ペプチドにおけるアミド基を含める）が含まれるが、これらに限定されない。他の放出可能な部分が本明細書で述べられている。特定の実施形態において、切断可能な部分はエステルである。別の特定の実施形態において、切断可能な部分は、炭酸エステル又はカルボン酸エステルである。さらに、連結基は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、又は１種以上の天然及び／若しくは非天然アミノ酸を含むポリマーとすることができる。連結基は、ポリマー鎖及び／又は脂質に由来するいくつかの基を含むことができる。
【0177】
式Ｉ～ＩＶのＰＯＺ－脂質コンジュゲートのいくつかの態様において、Ｌ、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、生理学的に分解可能なリンケージであり、出現する毎に、エステル、カルボン酸エステル（－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－）、炭酸エステル（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－）、カルバメート（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－）、アミド（－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－）、及びそれらの組合せから独立に選択される切断可能な部分を含む。
【0178】
式Ｉ～ＩＶのＰＯＺ－脂質コンジュゲートの他のいくつかの態様において、Ｌ、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、出現する毎に、－（ＣＨ２）ｆ－（切断可能な部分）－（ＣＨ２）ｇ－から独立に選択され、ここで、ｆ及びｇは、それぞれ０～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、又は１～５から独立に選択される整数である。一態様において、ｆ及びｇは、それぞれ１～４から独立に選択される整数である。別の態様において、Ｌ、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３のいずれも、本明細書に記載された二置換トリアゾールとすることができる。
【0179】
式Ｉ～ＩＶのＰＯＺ－脂質コンジュゲートのいくつかの態様において、Ｌ、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、出現する毎に、－（ＣＨ２）ｆ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｇ－、－（ＣＨ２）ｆ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｈ－ＮＨＣ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｇ－、－（ＣＨ２）ｆ－ＮＨ（ＣＯ）－（ＣＨ２）ｈ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｇ－、－（ＣＨ２）ｆ－ＮＨＣ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｇ－、－（ＣＨ２）ｆ－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）ｇ－、－（ＣＨ２）ｆ－ＮＨＯＣ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｇ－、－（ＣＨ２）ｆ－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）ｇ－、－（ＣＨ２）ｆ－ＯＣ（Ｏ）ＯＮＨ－（ＣＨ２）ｇ－、－（ＣＨ２）ｆ－ＮＨＯＣ（Ｏ）Ｏ－（ＣＨ２）ｇ－、Ｏ－（ＣＨ２）ｈ、（ＣＨ２）ｈ－Ｏ又は（ＣＨ２）ｈから独立に選択され、ここで、ｆ、ｇ及びｈは、それぞれ０～１０、０～９、０～８、０～７、０～６、又は０～５から独立に選択される整数である。この特定の実施形態の一態様において、ｆ、ｇ、及びｈはそれぞれ、０～４とすることができる。
【0180】
式Ｉ～ＩＶのＰＯＺ－脂質コンジュゲートの別の態様において、Ｌ、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、出現する毎に、Ｒ３又はＲ４基の一方に切断可能な部分を含む二置換トリアゾールから独立に選択される。切断可能な部分は、好ましくはＲ４基に存在する。具体的な態様において、二置換トリアゾールは、以下の構造を有する：
【0181】
【化19】
Ｒ３は、トリアゾール部分をポリマー鎖に連結するリンカーである。Ｒ３は、ポリマー鎖の官能基によって部分的に規定されうる。言い換えれば、Ｒ３は、ポリマー鎖の官能基の部分を含むことがある。一態様において、Ｒ３は、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ５－であり、ここで、Ｒ５は存在しないか、又は１～１０個の炭素の長さの置換若しくは非置換アルキルである。
【0182】
Ｒ４は、トリアゾール部分を脂質に連結するリンカーである。Ｒ４は、この作用剤の官能基によって部分的に規定されうる。言い換えれば、Ｒ４は、脂質の官能基の部分を含むことがある。一態様において、Ｒ４は、－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－であり、ここで、Ｒ６は、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アラルキルであり、Ｒ７は、切断可能な部分又は切断可能な部分の一部分を含む基であり、Ｒ８は存在しないか、又はＯ、Ｓ、ＣＲｃ、若しくはＮＲｃであり、Ｒｃは、Ｈ又は置換若しくは非置換アルキルである。いくつかの態様において、Ｒ７及びＲ８を組み合わせて、切断可能な部分を形成することができる。一実施形態において、Ｒ７は、－Ｒａ－（Ｏ）－Ｒｂ－、－Ｒａ－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｒｂ－、－Ｒａ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－サイクリック－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｒｂ－（ここで、サイクリックは、置換又は非置換アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクル又はシクロアルキルを表す）、－Ｒａ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－（Ｃ６Ｈ４）－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｒｂ－、－Ｒａ－Ｃ（Ｏ）－Ｒｂ－、－Ｒａ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒｂ－、－Ｒａ－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒｂ－、－Ｒａ－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ１５－Ｒｂ－（ここで、Ｒ１５は、Ｈ又は置換若しくは非置換Ｃ１～Ｃ５アルキルである）、－Ｒａ－ＣＨ（ＯＨ）－Ｏ－Ｒｂ－、－Ｒａ－Ｓ－Ｓ－Ｒｂ－、－Ｒａ－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１１）－Ｏ－Ｒｂ－（ここで、Ｒ１１は、Ｈ又は置換若しくは非置換Ｃ１～Ｃ５アルキルである）、又は－Ｒａ－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ１５－Ｒｂ－（ここで、Ｒ１５は、Ｈ又は置換若しくは非置換Ｃ１～Ｃ５アルキルである）であり、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、存在しないか又は置換若しくは非置換アルキルである。別の実施形態において、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、存在しないか又はＣ２～Ｃ１６置換若しくは非置換アルキルである。上記の一実施形態において、Ｒ６は、直鎖置換若しくは非置換Ｃ１～Ｃ８アルキル又は分枝状置換若しくは非置換Ｃ１～Ｃ８アルキルであり、Ｒ７は、－Ｒａ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒｂ－であり、Ｒ８は存在しない。上記の別の実施形態において、Ｒ６は、直鎖置換若しくは非置換Ｃ１～Ｃ４アルキル又は分枝状置換若しくは非置換Ｃ１～Ｃ４アルキルであり、Ｒ７は、－Ｒａ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒｂ－であり、Ｒ８は存在しない。上記の一実施形態において、Ｒ６は、－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、又は－ＣＨ２（ＣＨ３）－であり、Ｒ７は、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－であり、Ｒ８は存在しない。
【0183】
特定の実施形態において、Ｒ３は、－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）３であり、Ｒ４は、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－又は－ＣＨ２（ＣＨ３）－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－である。
【0184】
特定の実施形態において、Ｒ３は、－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）３であり、Ｒ４は、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－Ｃ（Ｏ）、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－Ｃ（Ｏ）、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－（Ｃ６Ｈ４）－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－である。
【0185】
式Ｉ～ＩＶのＰＯＺ－脂質コンジュゲートのいくつかの態様において、Ｌ、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、出現する毎に、上に記載された切断可能な部分の１つ以上から独立に選択される。特定の態様において、１つより多いリンケージＬ、Ｌ１、Ｌ２、又はＬ３がＰＯＺ－脂質コンジュゲートに存在するとき、Ｌ、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、それぞれ同じである。別の特定の態様において、１つより多いリンケージＬ、Ｌ１、Ｌ２、又はＬ３がＰＯＺ－脂質コンジュゲートに存在するとき、少なくとも１つのＬ、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、残りのリンケージと異なる。
【0186】
以下の実施例３７及び３８から、本開示に従って作製されたいくつかのＰＯＺ－脂質は、血漿酵素及びアミダーゼに曝露されると分解することが明らかになる。特に、ＰＯＺを脂質に連結するエステルリンケージは、切断を減速又は加速して、血漿中においてＰＯＺ－脂質から脂質を放出するように制御されうる。他のＰＯＺ－脂質のいくつか、特にアミドリンケージを有するものは、血漿中では分解しないように見えるが、ある種の組織に存在するアミダーゼに曝露されたときには分解する。他のＰＯＺ－脂質、例えばアミンリンケージを有するものは、血漿に対してもアミダーゼに対しても安定であるように見える。
【0187】
したがって、本開示は、血漿中において安定なＰＯＺ－脂質（例えば、アミン、アミド）、血漿中において所望の速度で分解するように調整又は制御されうるＰＯＺ－脂質（例えば、エステル）、及び血漿中において安定であるが、特異的環境において分解するＰＯＺ－脂質を含む。実際、崩壊速度の実質的に正確な制御は、ＰＯＺと脂質の間のリンケージを慎重に選択することによって実現することができる。この態様において、本開示のＰＯＺ－脂質は、生理学的媒体において制御可能な分解性を有することができる。例えば、一実施形態において、連結基の制御可能な分解性によって、生理学的媒体において安定なＰＯＺ－脂質になる。この態様において、ＰＯＺ－脂質の加水分解速度、すなわち（通常その半減期によって測定される）ＰＯＺ－脂質を分解するのに要する時間は、ＰＯＺと脂質の間のリンケージの安定性／分解性の指標である。一態様において、ＰＯＺポリマーと脂質の間の連結基により、５０％ヒト血漿中における加水分解の半減期が少なくとも約１２０時間であるＰＯＺ－脂質が得られる。
【0188】
別の実施形態において、連結基の制御可能な分解性によって、生理学的媒体において経時的に分解するＰＯＺ－脂質になる。いくつかの態様において、ＰＯＺポリマーと脂質の間の連結基により、５０％ヒト血漿中における加水分解の半減期が約１０分以下であるＰＯＺ－脂質が得られる。例えば、ＰＯＺポリマーと脂質の間の連結基は、ＰＯＺ－脂質の５０％ヒト血漿中における加水分解の半減期が約３分～約７分であるように選択されうる。他の態様において、ＰＯＺポリマーと脂質の間の連結基は、ＰＯＺ－脂質の５０％ヒト血漿中における加水分解の半減期が約１０分超であるように選択される。例えば、ＰＯＺポリマーと脂質の間の連結基は、ＰＯＺ－脂質の５０％ヒト血漿中における加水分解の半減期が約１１分～約８時間であるように選択されうる。一実施形態において、ＰＯＺ－脂質は、５０％ヒト血漿中における加水分解の半減期が約２時間～約５時間である。
【0189】
ＰＯＺ－脂質を含む組成物
脂質は両親媒性であり、すなわち疎水性部分と親水性部分を両方含むので、これらの分子は、水性環境において特異的な形で凝集して、層、ベシクル及びＬＮＰを形成することができる。例えば、リン脂質は、そのような両親媒性を有するタイプの脂質であり、すなわち、リン脂質のヘッド基が親水性であり、テール基が疎水性である。親水性ヘッド基は、負に帯電したホスフェート基を含み、他の極性基を含むことができる。疎水性テール基は、一般的に長い脂肪酸炭化水素鎖を含む。リン脂質は水性環境に置かれると、リン脂質の特異的特性に応じてさまざまな構造を形成する。
脂質は両親媒性であり、すなわち疎水性部分と親水性部分を両方含むので、これらの分子は、水性環境において特異的な形で凝集して、層、ベシクル及びＬＮＰを形成することができる。例えば、リン脂質は、そのような両親媒性を有するタイプの脂質であり、すなわち、リン脂質のヘッド基が親水性であり、テール基が疎水性である。親水性ヘッド基は、負に帯電したホスフェート基を含み、他の極性基を含むことができる。疎水性テール基は、一般的に長い脂肪酸炭化水素鎖を含む。リン脂質は水性環境に置かれると、リン脂質の特異的特性に応じてさまざまな構造を形成する。
【0190】
したがって、本開示のＰＯＺ－脂質は、特にＬＮＰ組成物を形成するのによく適している。また、本明細書に記載されたＰＯＺ－脂質コンジュゲートを組み込んでいる本開示のＬＮＰ組成物は、本開示のＰＯＺ－脂質ポリマーを組み込まない同様のＬＮＰ組成物に対していくつかの利点を備える。例えば、本開示のＬＮＰ組成物は、実質的に非免疫原性である。一態様において、本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲートは本明細書に記載されたＬＮＰ組成物に組み込まれると、限定されるものではないがＰＯＺに特異的なＩｇＭ及び／又はＩｇＧ抗体の生成を含めて、著しい免疫応答を引き起こさない。別の態様において、本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲートは本明細書に記載されたＬＮＰ組成物に組み込まれると、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートを組み込んでいる対応するＬＮＰ組成物と比較して、限定されるものではないがポリマー部分に特異的なＩｇＭ及び／又はＩｇＧ抗体の生成を含めて、免疫応答を低減させる。別の態様において、本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲートを含むＬＮＰ組成物は、２回目の投与後に１回目の投与と比較して、対象の血液又は組織中に少なくとも７５％、例えば８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上の濃度で存在する。別の態様において、本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲートを含むＬＮＰ組成物は、加速的血液クリアランスの影響を受けない。
【0191】
本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲートのいずれもが、ＬＮＰ組成物を本開示に従って調製する際に使用されうる。一実施形態において、ＬＮＰ組成物は、本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲート及びカチオン性又はイオン化可能な脂質の少なくとも１つで形成されうる。例えば、組成物は、本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲート及びカチオン性脂質で形成されうる。別の実施形態において、組成物は、本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲート及びイオン化可能な脂質で形成されうる。さらに別の実施形態において、本開示による組成物は、本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲート、カチオン性又はイオン化可能な脂質、並びにベシクル及び／又はリポソームを形成することができる他の（ポリオキサゾリン成分を欠く）脂質成分（非誘導体化脂質）を含む。好適な非誘導体化脂質の例には、ヘルパー脂質、及び組成物を安定化する脂質が含まれるが、これらに限定されない。
【0192】
一態様において、本開示に従って形成されたＬＮＰは、本開示のＰＯＺ－脂質コンジュゲート、カチオン性又はイオン化可能な脂質、並びに（ｉ）構造支持を実現し、飲食作用を促進するヘルパー脂質及び／又は（ｉｉ）安定性のためのステロール脂質を含む。
【0193】
本開示に従って形成されたＬＮＰは、ペイロードも含むことができる。この態様において、ペイロードは、オリゴヌクレオチド、タンパク質、又はそれらの組合せとすることができる。例えば、図１で示された具体的な実施形態において、本開示のＬＮＰは、（ｉ）イオン化可能な脂質；（ｉｉ）ヘルパー脂質；（ｉｉｉ）ステロール脂質；（ｉｉｉ）本開示のＰＯＺ－脂質；及び（ｉｖ）オリゴヌクレオチドを含むことができる。別の具体的な実施形態（図示せず）において、本開示のＬＮＰは、カチオン性脂質、ヘルパー脂質、ステロール脂質、本開示のＰＯＺ－脂質、及びオリゴヌクレオチドを含むことができる。さらに別の具体的な実施形態（図示せず）において、本開示のＬＮＰは、カチオン性又はイオン化可能な脂質、ヘルパー脂質、ステロール脂質、本開示のＰＯＺ－脂質、及びタンパク質を含むことができる。
【0194】
一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、自己複製ｍＲＮＡ、修飾ヌクレオシドからなるｍＲＮＡ、及び天然ヌクレオシドからなるｍＲＮＡを含む。一態様において、オリゴヌクレオチドはＤＮＡである。別の態様において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。さらに別の態様において、オリゴヌクレオチドは、自己複製ｍＲＮＡ、修飾ヌクレオシドからなるｍＲＮＡ、又は天然ヌクレオシドからなるｍＲＮＡである。
【0195】
一実施形態において、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートはＬＮＰ組成物に組み込まれると、ＬＮＰ組成物の脂質層中に約０．２５～約５モル％のモル比、ＬＮＰ組成物の脂質層中に約０．５～約３モル％のモル比、ＬＮＰ組成物の脂質層中に約０．７５～約２モル％のモル比、又はＬＮＰ組成物の脂質層中に約０．８～約１．５モル％のモル比で存在する。
【0196】
本発明による使用に適したカチオン性脂質の非限定的な例には、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）がある。好適なイオン化可能な脂質には、ＭＣ３ ９８、Ｌｉｐｉｄ ３１９、Ｃ１２－２００、５Ａ２－ＳＣ８、３０６Ｏｉ１０、Ｍｏｄｅｒｎａ Ｌｉｐｉｄ ５、Ｍｏｄｅｒｎａ Ｌｉｐｉｄ Ｈ、ＳＭ－１０２、Ａｃｕｉｔａｓ Ａ９ ［５９］、Ａｒｃｔｕｒｕｓ Ｌｉｐｉｄ ２，２ （８，８） ４Ｃ ＣＨ３、Ｇｅｎｅｖａｎｔ ＣＬ１が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、カチオン性又はイオン化可能な脂質は、ＴＮＳ色素結合アッセイによって測定して、６～７の範囲のｐＫａを有する。
【0197】
ヘルパー脂質は、疎水性及び極性ヘッド基部分を有し、リン脂質によって例示されるように水中で自発的に二重層ベシクルに成ることができ、又は脂質二重層に安定に組み込まれ、疎水性部分が二重層膜の内側疎水性領域と接触しており、極性ヘッド基部分が膜の外側極性表面に向かって配向されている両親媒性脂質を指す。そのようなヘルパー脂質は、典型的に１つ又は２つの疎水性アシル炭化水素鎖又はステロイド基を含み、極性ヘッド基に化学的反応性基、例えばアミン、酸、エステル、アルデヒド又はアルコールを含むことができる。非限定的な例には、ホスファチジルコリン（ＰＣ）やホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）などのリン脂質が含まれ、２つの炭化水素鎖が典型的に約１４～２２個の炭素原子の長さであり、可変不飽和度を有する。他の好適なヘルパー脂質には、セレブロシドやガングリオシドなどの糖脂質が含まれるが、これらに限定されない。一態様において、ヘルパー脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、及び１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）の少なくとも１つである。
【0198】
本開示による使用に適したステロール脂質はコレステロールである。特定の一実施形態において、本開示によるＬＮＰは、カチオン性又はイオン化可能な脂質を（ｉ）ＤＳＰＣ；（ｉｉ）コレステロール；（ｉｉｉ）本開示のＰＯＺ－脂質；及び（ｉｖ）オリゴヌクレオチドと組み合わせて含む。
【0199】
本開示のＬＮＰ組成物への変更又は添加は（実にささいな変更又は添加でさえ）、ＬＮＰの構造だけでなく、カプセル化ペイロードの送達にも影響する可能性があることに留意することは重要である。例えば、コレステロールなどのステロール脂質がＬＮＰ組成物にイオン化可能な脂質及び本開示のＰＯＺ－脂質とともに含まれるとき、得られたＬＮＰは、単一二重層を有する。植物ステロールが添加される場合、ＬＮＰの構造はより複雑になり、したがってペイロードを異なるかたちで送達することができる。この文脈で、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートを含む本開示の組成物は、単層でも、非単層でもよい。
【0200】
本開示に従って作製されたＬＮＰの粒子サイズはさまざまでありうる。一実施形態において、本開示に従って形成されたＬＮＰは、水性コアを包む１つ以上の脂質二重層によって形成された、約１０ｎｍ～約１０ミクロンの範囲内であるサイズの両親媒性球状ベシクルである。別の実施形態において、本開示に従って形成されたＬＮＰは、約２５ｎｍ～約８ミクロンの粒子サイズを有する。さらに別の実施形態において、本開示に従って形成されたＬＮＰは、約３０ｎｍ～約５ミクロンの粒子サイズを有する。この態様において、ＬＮＰの粒子サイズは、約２０ｎｍ～約３ミクロンとすることができる。別の実施形態において、ＬＮＰは、約１０ｎｍ～約１０００ｎｍ、約２５ｎｍ～約５００ｎｍ、約３５ｎｍ～約２５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、又は約４５ｎｍ～約１００ｎｍとすることができる。サイズ分画方法が本明細書に開示されている。しかし、いくつかの態様において、サイズ分画は必要とされない。
【0201】
本開示のＬＮＰ組成物は、さまざまな方法によって調製されうる。一実施形態において、リポソームは、逆相蒸発法によって調製される（Ｓｚｏｋａら、ＰＮＡＳ １９７８、７５巻、４１９４－４１９８；Ｓｍｉｒｎｏｖら、Ｂｙｕｌｌｅｔｅｎ’ Ｅｋｓｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ’ｎｏｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｉ ｉ Ｍｅｄｉｔｓｉｎｙ、１９８４、９８巻、２４９～２５２頁；米国特許第４，２３５，８７１号）。この方法では、連結されたターゲット分子を有する又は有しないポリオキサゾリン－脂質コンジュゲートを含むことができる、リポソーム形成性脂質の有機溶液を、より小さい体積の水性媒体と混合し、混合物を分散させて、油中水型乳濁液を、好ましくはパイロジェンフリー成分を使用して形成する。送達対象のターゲット分子は、親油性ターゲット分子の場合には脂質溶液に、又は水溶性ターゲット分子の場合には水性媒体に添加される。脂質溶媒は蒸発除去され、得られたゲルは、リポソームに変換される。逆相蒸発ベシクル（ＲＥＶ）は、約０．２～０．４ミクロンの典型的な平均サイズを有し、圧倒的にオリゴラメラであり、すなわち１個又は数個の脂質二重層シェルを含む。ＲＥＶは、以下に述べられるように、好ましくは約０．０５～０．２ミクロンの選択されたサイズを有するオリゴ層ベシクルを得るために、押出によって容易にサイジングされうる。
【0202】
さらに、多層ベシクル（ＭＬＶ）が創造されうる。この方法では、本明細書に記載されたように、連結されたターゲット分子を有する又は有しないポリオキサゾリン－脂質コンジュゲートを含むことができる、リポソーム形成性脂質の混合物を、好適な溶媒に溶解し、容器中で溶媒を蒸発させて、薄膜を形成する。次いで、薄膜は水性媒体で覆われる。脂質フィルムは水和して、ＭＬＶを形成する。ＭＬＶは、一般的に約０．１～１０ミクロンのサイズを示す。ＭＬＶは、押出及び本明細書に記載された他の方法によって所望のサイズ範囲にまでサイジングされうる。
【0203】
ＲＥＶ及びＭＬＶに効果的な１つのサイジング方法は、リポソームの懸濁水溶液を、選択された均一な孔径、典型的に０．０５、０．０８、０．１、０．２、又は０．４ミクロンを有するポリカーボネート膜を通して押し出すものである（Ｓｚｏｋａら、ＰＮＡＳ １９７８、７５巻、４１９４－４１９８）。膜の孔径は、その膜を通して押出により生成されたリポソーム、特に調製物が２回以上同じ膜を通して押し出されたものである場合の最大サイズにおおむね合致する。より大きいサイズのＭＬＶをサイジングする方法が、Ｚｈｕらによって提供されている（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２００９；４（４）：ｅ５００９． Ｅｐｕｂ ２００９ Ａｐｒ ６）。
【0204】
小さい粒子サイズが望まれているとき、ＲＥＶ又はＭＬＶ調製物は、０．０４～０．０８ミクロン範囲のサイズによって特徴づけられる小さい単層ベシクル（ＳＵＶ）を生成するように処理されうる。そのような粒子は、粒子が毛細血管壁を通して吸収されうる場合、腫瘍組織又は肺組織をターゲティングする際に有用となることがある（０．１ミクロンより大きい粒子は吸収されない可能性がある）。
【0205】
さらに、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートは、上に記載された技法を使用してリポソームが形成された後、ＬＮＰ組成物に導入されうる。この手法では、予備成形されたリポソームは、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの存在下でインキュベートされる。ＰＯＺ－脂質コンジュゲートは、拡散によりリポソームに組み込まれる。溶液状態で自由に存在している又はリポソームによって取り込まれたＰＯＺ－脂質コンジュゲートの濃度をモニタリングすることができ、ＬＮＰ組成物中のＰＯＺ－脂質コンジュゲートが所望の濃度に到達すると、方法を終えることができる。インキュベーション溶液は、ＰＯＺ－脂質コンジュゲートのＬＮＰ組成物への拡散を促進するために界面活性剤又は他の作用剤を含むことができる。
【0206】
ＬＮＰ組成物は、使用前に外来成分を除去するように処理されうる。例えば、上に述べられたように界面活性剤が使用された場合、過剰な界面活性剤は、使用前に除去されうる。さらに、上に述べられたオリゴヌクレオチドなどのペイロードがＬＮＰ組成物に捕捉されている場合、過剰な又は捕捉されていないペイロードは、使用前に除去されうる。この作業を行う分離技法は、当技術分野において公知であり、特定の方法の選択は、除去される成分の性質に依存することができる。好適な方法には、遠心、透析及び分子ふるいクロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。組成物は、通常の０．２２ミクロンデプスフィルターを通す濾過により滅菌されうる。
【0207】
ＬＮＰは、ＰＯＺ－脂質コンジュゲート、イオン化可能な脂質、ヘルパー脂質、及びコレステロールを含む脂質フィルムを水和するものである伝統的な方法によって調製されうる。この方法は、これらの材料をクロロホルム又はジクロロメタンなどの有機溶媒に溶解し、次いで溶媒を蒸発させて、薄膜を生成するものである。次いで、薄膜を、薬物又は核酸を含む緩衝水溶液で水和して、ペイロードを受動的にカプセル化する。低カプセル化の不均一粒子であるＬＮＰが、通常は形成され、押出又は超音波処理によるサイズ減少を必要とする。
【0208】
別の好適な技法では、マイクロ流動化装置を用いた迅速混合を使用する。脂質ストック溶液は、脂質をエタノールなどの有機溶媒に溶解することによって調製される。ストック水溶液は、既知のｐＨ、イオン強度及び緩衝能を有する緩衝液に溶解した核酸を含む。２つのストック溶液をマイクロミキサーに所定の速度で通して、カチオン性脂質が負に帯電した核酸と相互作用することを可能にし、より高いカプセル化効率（すなわち、＞９０％）及び均一サイズ分布が得られる。混合プロセス中の水性溶媒対有機溶媒の比は重要である。有機溶媒は、透析、接線流濾過若しくは遠心、又は他の技法により除去される。規定サイズのＬＮＰが、マイクロ流体操作パラメータを制御することによって生成され、低多分散性及び均一な粒子サイズを有するＬＮＰを生じる。ＬＮＰの平均粒子直径（＜１００ｎｍ）、多分散性（＜０．４０及び、さらに詳細には＜０．２０）、及びゼータ電位は、調製物を特徴づけるために使用される３つの方法である。
【0209】
水和製剤の最適なサイズ、高ペイロード放出及びトランスフェクション、並びに改善された安定性を可能にするために、ＰＯＺ－脂質対イオン性脂質対コレステロールの比を変えることができる。一実施形態において、ＬＮＰ中のＰＯＺ－脂質のｍｏｌ％は、約０．５～６０％である。別の実施形態において、ＰＯＺ－脂質のｍｏｌ％は、約１～約４０％である。さらに別の実施形態において、ＰＯＺ－脂質は、ＬＮＰ中の脂質の全量の約１０％未満の量で存在する。この態様において、ＰＯＺ－脂質は、約０．５～約５％、約１～約４％、又は約１．５～約３．５％の量で存在することができる。この態様において、ＬＮＰ組成物の残部は、約３５～約５０％のステロール脂質、約３０％～約７０％のカチオン性脂質、及び約５％～約１５％のヘルパー脂質とすることができる。
【0210】
一実施形態において、ＬＮＰ組成物では、少なくとも１つのＰＯＺ－脂質コンジュゲートを含む脂質二重層が、オリゴヌクレオチドを含む水性コアをカプセル化し、ＰＯＺの平均分子量が約０．５～５ｋＤａである。別の実施形態において、ＬＮＰ組成物では、少なくとも１つのＰＯＺ－脂質コンジュゲートを含む脂質二重層が、オリゴヌクレオチドを含む水性コアをカプセル化し、ＰＯＺの平均分子量が約２～５ｋＤａである。
【0211】
オリゴヌクレオチドは、高効率でＬＮＰにカプセル化されうる。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも９０％の効率でＬＮＰにカプセル化される。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約９０～約９９％の効率でＬＮＰにカプセル化される。さらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約９０～約９５％の効率でＬＮＰにカプセル化される。さらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約９５％超の効率でＬＮＰにカプセル化される。
【0212】
投与
本開示のＬＮＰは、細胞に送達されうる。ＬＮＰをインビボで投与した後、オリゴヌクレオチドが放出される。この態様において、障害又は疾患に対する治療を誘発することができる医薬組成物に、本開示のＬＮＰを含めることができる。例えば、本開示に従って作製されたＬＮＰを含む医薬組成物を使用して、限定されるものではないがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、狂犬病、インフルエンザなどを含めて、感染症を予防又は治療することができる。さらに、本開示に従って作製されたＬＮＰを含む医薬組成物を、がん及び遺伝病の治療薬として使用することができる。そのような医薬組成物は、ＬＮＰに加えて薬学的に許容される担体も含むことができる。
本開示のＬＮＰは、細胞に送達されうる。ＬＮＰをインビボで投与した後、オリゴヌクレオチドが放出される。この態様において、障害又は疾患に対する治療を誘発することができる医薬組成物に、本開示のＬＮＰを含めることができる。例えば、本開示に従って作製されたＬＮＰを含む医薬組成物を使用して、限定されるものではないがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、狂犬病、インフルエンザなどを含めて、感染症を予防又は治療することができる。さらに、本開示に従って作製されたＬＮＰを含む医薬組成物を、がん及び遺伝病の治療薬として使用することができる。そのような医薬組成物は、ＬＮＰに加えて薬学的に許容される担体も含むことができる。
【0213】
一実施形態において、有効量の本開示のＬＮＰを含む医薬組成物は、動物に送達されうる。この態様において、有効量の本開示のＬＮＰの送達は、皮下、静脈内、筋肉内、皮内又はエアロゾル経路を介して行われうる。一実施形態において、動物はヒトである。
【実施例】
【0214】
以下の非限定的な例は、本発明の好ましい実施形態の例示にすぎず、本発明を限定するものと解釈されるべきでなく、その範囲は特許請求の範囲で定められる。
【0215】
材料
１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロール（ＤＭＧ）は、Ｂａｃｈｅｍ社から購入した。ＰＥＯＺ－プロパルギルアミド２Ｋ、３－アジドプロピオニルクロリド、３－（２－アミノエトキシ）プロパン－１，２－ジオールは、Ｓｅｒｉｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．によって合成された。ソルケタール（１，２－イソプロピリジングリセロール）、ミリスチン酸、ヨウ化銅（Ｉ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、及び無水ピリジンは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。無水硫酸ナトリウム、無水硫酸マグネシウム、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、及びジエチルエーテルは、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社から購入した。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は、Ｆｌｕｋａ社から購入した。Ａｍｂｅｒｓｅｐ Ｍ４１９５（又はＤｏｗｅｘ Ｍ４１９５）は、Ｓｕｐｅｌｃｏ社から購入した。カラム精製用のＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ ２５ｇカラム及びＩｓｏｌｅｒａ Ｓｙｓｔｅｍは、Ｂｉｏｔａｇｅ社から購入した。
１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロール（ＤＭＧ）は、Ｂａｃｈｅｍ社から購入した。ＰＥＯＺ－プロパルギルアミド２Ｋ、３－アジドプロピオニルクロリド、３－（２－アミノエトキシ）プロパン－１，２－ジオールは、Ｓｅｒｉｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．によって合成された。ソルケタール（１，２－イソプロピリジングリセロール）、ミリスチン酸、ヨウ化銅（Ｉ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、及び無水ピリジンは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。無水硫酸ナトリウム、無水硫酸マグネシウム、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、及びジエチルエーテルは、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社から購入した。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は、Ｆｌｕｋａ社から購入した。Ａｍｂｅｒｓｅｐ Ｍ４１９５（又はＤｏｗｅｘ Ｍ４１９５）は、Ｓｕｐｅｌｃｏ社から購入した。カラム精製用のＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ ２５ｇカラム及びＩｓｏｌｅｒａ Ｓｙｓｔｅｍは、Ｂｉｏｔａｇｅ社から購入した。
【0216】
実施例１． ＰＭＯＺ－ジミリスチルアミド（２．２ｋＤの化合物１５ａ）の合成
【0217】
【化20】
【0218】
炉乾燥した２５０ｍＬの丸底フラスコに、アルゴン雰囲気下でＰＭＯＺ－ＣＯＯＨ（１２．００グラム、５．４５ｍｍｏｌ、１．００当量）、次にＤＣＭ（５０ｍＬ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（１．２５グラム、１０．９ｍｍｏｌ、２．００当量）、最後にＤＭＡＰ（０．０３３グラム、０．２８ｍｍｏｌ、０．０５当量）を投入した。ＤＣＣ（２．２５ｇ、１０．９ｍｍｏｌ、２．００当量）を一度に添加し、得られた溶液を室温で少なくとも１２時間撹拌させておいた。この時間に続いて、反応混合物を粗焼結ガラスフリットで濾過し、次にフリットを追加のＤＣＭですすいだ。次いで、得られた溶液を、Ｅｔ２Ｏ（２０００ｍＬ）の撹拌溶液が入っているビーカーにゆっくり移した。沈殿物を真空濾過によって回収し、固形物を真空乾燥した。次いで、固形物を、アルゴン雰囲気下に撹拌子を装備した２５０ｍＬの乾燥した丸底フラスコ中のＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解した。次いで、反応混合物に、ジミリスチルアミン（４．４６ｇ、１０．９ｍｍｏｌ、２．００当量）、次にＮＥｔ３（１．５２ｍＬ、１０．９ｍｍｏｌ、２．００当量）を投入し、反応混合物を室温で少なくとも１２時間撹拌させておいた。この時間が経過した後、反応混合物を、２０００ｍＬのジエチルエーテルの撹拌溶液が入っているビーカー中に沈殿させた。固形物を真空濾過によって回収し、真空乾燥した。次いで、固形物を２００ｍＬの脱イオン水に溶解し、２００グラムのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ－６７及び２００グラムのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ－１２０Ｈが入っているアンバーライトカラムに通した。濾液は、水溶液がＰＡＡ試験で陰性を示すまで回収した。次いで、得られた溶液を１０００ｍＬのＤＥＡＥカラムに通し、脱イオン水で、ＰＡＡ試験が陰性の結果を示すまで溶離した。得られた水溶液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。残渣をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、硫酸ナトリウムで脱水し、２０００ｍＬのＥｔ２Ｏの撹拌溶液が入っているビーカー中に沈殿させた。固形物を真空濾過によって回収し、真空乾燥して、１０．９グラムの表題化合物を得た。
1H NMR分析はPMOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.92 (m, NH末端シグナル); 3.34 (CH2CH2骨格); 3.21 (N-CH2); 2.75-2.72 (S-CH2); 1.98 (-CH3); 1.80 (CH2-CO2R).脂質部分について追加のシグナルが、δ １．４９－１．４１（Ｎ－（ＣＨ２）２）；１．２４（ＣＨ２）；０．８５（ＣＨ３）に存在した。
1H NMR分析はPMOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.92 (m, NH末端シグナル); 3.34 (CH2CH2骨格); 3.21 (N-CH2); 2.75-2.72 (S-CH2); 1.98 (-CH3); 1.80 (CH2-CO2R).脂質部分について追加のシグナルが、δ １．４９－１．４１（Ｎ－（ＣＨ２）２）；１．２４（ＣＨ２）；０．８５（ＣＨ３）に存在した。
【0219】
実施例２． ＰＥＯＺ（２．２ｋＤ）－ジミリスチルアミド－２．２ｋＤ化合物２ｂ．
【0220】
【化21】
【0221】
化合物１５Ｂを調製するために使用された同じ手順を介して、化合物２Ｂを調製した。この反復で、１．３グラムの材料を単離した。
1H NMR. HNMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, CDCl3) δ 3.64 (CH2CH2骨格); 3.27 (N-CH2); 2.72 (S-CH2); 2.32-2.19 (C(O)-CH2); 1.12 (CH3).脂質部分について追加のシグナルが、δ １．４９－１．５４（Ｎ－（ＣＨ２）２）；１．２７（ＣＨ２）；０．８７（ＣＨ３）に存在した。ペンダント基のシグナルが、δ １．６５ｐｐｍ（ＣＨ２）に存在した。ペンダント基の数は、事前にポリマー出発物質から１．２１であると算出された。
1H NMR. HNMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, CDCl3) δ 3.64 (CH2CH2骨格); 3.27 (N-CH2); 2.72 (S-CH2); 2.32-2.19 (C(O)-CH2); 1.12 (CH3).脂質部分について追加のシグナルが、δ １．４９－１．５４（Ｎ－（ＣＨ２）２）；１．２７（ＣＨ２）；０．８７（ＣＨ３）に存在した。ペンダント基のシグナルが、δ １．６５ｐｐｍ（ＣＨ２）に存在した。ペンダント基の数は、事前にポリマー出発物質から１．２１であると算出された。
【0222】
実施例３－ ＰＭＯＺ－ジミリスチルアミド、化合物１６ａの合成、１．３ペンダント基、２．２ｋＤ．
【0223】
【化22】
【0224】
この化合物は、ＰＭＯＺ ２．２ｋＤ ジミリスチルアミド（ｄｙｍｙｒｉｓｔｙｌａｍｉｄｅ）について上に記載されたのと類似した形で調製した。７．７ｇを単離した。
1H NMR分析はPMOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.90 (m, NH末端シグナル); 3.33 (CH2CH2骨格); 3.21 (N-CH2); 2.75-2.72 (S-CH2); 1.98 (-CH3); 1.80 (CH2-CO2R).脂質部分について追加のシグナルが、δ １．４９－１．４１（Ｎ－（ＣＨ２）２）；１．２４（ＣＨ２）；０．８５（ＣＨ３）に存在した。ペンダント基のシグナルが、δ １．６５ｐｐｍ（ＣＨ２）に存在した。ペンダント基の数は、ポリマー主鎖の積分値とペンダント基のシグナルの比較を介して算出された。この場合、ペンダント基の数は、１．３５であると判断された。
1H NMR分析はPMOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.90 (m, NH末端シグナル); 3.33 (CH2CH2骨格); 3.21 (N-CH2); 2.75-2.72 (S-CH2); 1.98 (-CH3); 1.80 (CH2-CO2R).脂質部分について追加のシグナルが、δ １．４９－１．４１（Ｎ－（ＣＨ２）２）；１．２４（ＣＨ２）；０．８５（ＣＨ３）に存在した。ペンダント基のシグナルが、δ １．６５ｐｐｍ（ＣＨ２）に存在した。ペンダント基の数は、ポリマー主鎖の積分値とペンダント基のシグナルの比較を介して算出された。この場合、ペンダント基の数は、１．３５であると判断された。
【0225】
実施例４． ＰＥＯＺ－ジミリスチルアミド、化合物１６ｂの合成、１．５ペンダント基、２．２ｋＤ
【0226】
【化23】
【0227】
この化合物は、ＰＭＯＺ ２．２ｋＤ ジミリスチルアミド（ｄｙｍｙｒｉｓｔｙｌａｍｉｄｅ）について上に記載されたのと類似した形で調製した。７．０を単離した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, CDCl3) δ 3.64 (CH2CH2骨格); 3.27 (N-CH2); 2.72 (S-CH2); 2.32-2.19 (C(O)-CH2); 1.12 (CH3).脂質部分について追加のシグナルが、δ １．４９－１．５４（Ｎ－（ＣＨ２）２）；１．２７（ＣＨ２）；０．８７（ＣＨ３）に存在した。ペンダント基のシグナルが、δ １．６５ｐｐｍ（ＣＨ２）に存在した。ペンダント基の数は、ポリマー主鎖の積分値とペンダント基のシグナルの比較を介して算出された。この場合、ペンダント基の数は、１．５０であると判断された。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, CDCl3) δ 3.64 (CH2CH2骨格); 3.27 (N-CH2); 2.72 (S-CH2); 2.32-2.19 (C(O)-CH2); 1.12 (CH3).脂質部分について追加のシグナルが、δ １．４９－１．５４（Ｎ－（ＣＨ２）２）；１．２７（ＣＨ２）；０．８７（ＣＨ３）に存在した。ペンダント基のシグナルが、δ １．６５ｐｐｍ（ＣＨ２）に存在した。ペンダント基の数は、ポリマー主鎖の積分値とペンダント基のシグナルの比較を介して算出された。この場合、ペンダント基の数は、１．５０であると判断された。
【0228】
実施例５． ＰＥＯＺ－ジミリストイルグリセロールエーテル、化合物１７ｂの合成、５ｋＤ．
【0229】
【化24】
【0230】
ＮＨＳエステル（２．６グラム、０．４９ｍｍｏｌ、１．００当量、米国特許第７，９４３，１４１号と同様にして合成）を、アルゴン雰囲気下に撹拌子を装備した２５０ｍＬの乾燥丸底フラスコ中のＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解した。次いで、反応混合物に、３－（２－アミノエトキシ）プロパン－１，２－ジオール（０．２００グラム、１．４８ｍｍｏｌ、３．００当量）及びＮＥｔ３（０．６８ｍＬ、４．９ｍｍｏｌ、１０当量）の３ｍＬのＤＭＦ中の溶液を投入し、反応混合物を室温で少なくとも１２時間撹拌させておいた。この時間が経過した後、反応混合物を、２０００ｍＬのジエチルエーテルの撹拌溶液が入っているビーカー中に沈殿させた。固形物を真空濾過によって回収し、真空乾燥した。２．３グラムの材料を単離した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).ビス－ヒドロキシアミド部分について追加のシグナルが、δ ４．５９（ＯＨ）及び４．４６（ＯＨ）に存在した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).ビス－ヒドロキシアミド部分について追加のシグナルが、δ ４．５９（ＯＨ）及び４．４６（ＯＨ）に存在した。
【0231】
【化25】
【0232】
上に記載されたアミド（２．３グラム、０．４３ｍｍｏｌ、１．００当量）を、アルゴン雰囲気下で１００ｍＬの丸底フラスコに投入した。材料を３０ｍＬのＤＣＭに溶解した。ミリスチン酸（０．４９グラム、２．１２３ｍｍｏｌ、５．００当量）、次にＤＭＡＰ（０．０１ｇ、０．０９ｍｍｏｌ、０．２当量）、最後にＤＣＣ（０．４４グラム、２．１３ｍｍｏｌ、５．００当量）を添加し、反応混合物をアルゴン雰囲気下に終夜撹拌させておいた。翌朝、反応混合物を濾過し、１６００ｍＬのジエチルエーテルが入っているビーカー中に沈殿させた。固形物を真空濾過によって回収した。生成物を逆相Ｃ１８クロマトグラフィーでアセトニトリル及びメタノールを溶離液として使用して精製して、表題化合物（１．２グラム）を得た。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).脂質誘導体部分について追加のシグナルが、δ ５．１０（ＣＨ）；４．２５（ＣＨ２）；４．０８（ＣＨ２）；１．４８（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．２２（ＣＨ２）；０．８４（ＣＨ３）に存在した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).脂質誘導体部分について追加のシグナルが、δ ５．１０（ＣＨ）；４．２５（ＣＨ２）；４．０８（ＣＨ２）；１．４８（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．２２（ＣＨ２）；０．８４（ＣＨ３）に存在した。
【0233】
実施例６． 化合物１５ｂの合成
【0234】
【化26】
【0235】
炉乾燥した２５０ｍＬの丸底フラスコに、アルゴン雰囲気下でＰＥＯＺ－ＣＯＯＨ（７．００グラム、３．１８ｍｍｏｌ、１．００当量）、次にＤＣＭ（５０ｍＬ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（０．４８グラム、４．１４ｍｍｏｌ、１．３０当量）、最後にＤＭＡＰ（０．０４グラム、０．３１ｍｍｏｌ、０．１当量）を投入した。ＤＣＣ（０．８５４ｇ、４．１４ｍｍｏｌ、１．３０当量）を一度に添加し、得られた溶液を室温で少なくとも１２時間撹拌させておいた。この時間に続いて、反応混合物を粗焼結ガラスフリットで濾過し、次にフリットを追加のＤＣＭですすいだ。次いで、得られた溶液を、Ｅｔ２Ｏ（２０００ｍＬ）の撹拌溶液が入っているビーカーにゆっくり移した。沈殿物を真空濾過によって回収し、固形物を真空乾燥した。次いで、固形物を、アルゴン雰囲気下に撹拌子を装備した２５０ｍＬの乾燥した丸底フラスコ中のＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解した。次いで、反応混合物に、ジミリスチルアミン（２．６ｇ、６．３６ｍｍｏｌ、２．００当量）、次にＮＥｔ３（０．８９ｍＬ、６．３６ｍｍｏｌ、２．００当量）を投入し、反応混合物を室温で少なくとも１２時間撹拌させておいた。この時間が経過した後、反応混合物を、２０００ｍＬのヘキサンの撹拌溶液が入っているビーカー中に沈殿させた。固形物を真空濾過によって回収し、真空乾燥した。次いで、固形物を２００ｍＬの脱イオン水に溶解し、２００グラムのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ－６７及び２００グラムのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ－１２０Ｈが入っているアンバーライトカラムに通した。得られた水溶液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。残渣をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮して、４．５グラムの表題化合物を得た。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, CDCl3) δ 3.64 (CH2CH2骨格); 3.27 (N-CH2); 2.72 (S-CH2); 2.32-2.19 (C(O)-CH2); 1.12 (CH3).脂質部分について追加のシグナルが、δ １．４９－１．５４（Ｎ－（ＣＨ２）２）；１．２７（ＣＨ２）；０．８７（ＣＨ３）に存在した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, CDCl3) δ 3.64 (CH2CH2骨格); 3.27 (N-CH2); 2.72 (S-CH2); 2.32-2.19 (C(O)-CH2); 1.12 (CH3).脂質部分について追加のシグナルが、δ １．４９－１．５４（Ｎ－（ＣＨ２）２）；１．２７（ＣＨ２）；０．８７（ＣＨ３）に存在した。
【0236】
実施例７． 化合物１７ａの合成
【0237】
【化27】
【0238】
ＰＭＯＺ ５Ｋ ＮＨＳエステルは、ＰＥＯＺ ５Ｋ ＮＨＳについて上に記載されたのと類似した形で調製した。３．０グラムを単離した。
1H NMR分析はPMOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.92 (m, NH末端シグナル); 3.34 (CH2CH2骨格); 3.21 (N-CH2); 2.75-2.72 (S-CH2); 1.98 (-CH3); 1.80 (CH2-CO2R).ＮＨＳ部分について追加のシグナルが、δ ２．８１（ＣＨ２）に存在した。
1H NMR分析はPMOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.92 (m, NH末端シグナル); 3.34 (CH2CH2骨格); 3.21 (N-CH2); 2.75-2.72 (S-CH2); 1.98 (-CH3); 1.80 (CH2-CO2R).ＮＨＳ部分について追加のシグナルが、δ ２．８１（ＣＨ２）に存在した。
【0239】
【化28】
【0240】
ＰＭＯＺ ５Ｋアミドは、上に記載されたのと類似した形で調製した。ＨＮＭＲ分析から、生成物材料は、生成物と出発物ＮＨＳエステルの約５０：５０の分離不可能な混合物であることが明らかになった。この混合物をさらに精製することなく、次のステップに進めた。
1H NMR分析はPMOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.92 (m, NH末端シグナル); 3.34 (CH2CH2骨格); 3.21 (N-CH2); 2.75-2.72 (S-CH2); 1.98 (-CH3); 1.80 (CH2-CO2R).ジオール部分について追加のシグナルが、δ ４．６１（ＣＨ）及び４．４８（ＣＨ２）に存在した。
1H NMR分析はPMOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.92 (m, NH末端シグナル); 3.34 (CH2CH2骨格); 3.21 (N-CH2); 2.75-2.72 (S-CH2); 1.98 (-CH3); 1.80 (CH2-CO2R).ジオール部分について追加のシグナルが、δ ４．６１（ＣＨ）及び４．４８（ＣＨ２）に存在した。
【0241】
【化29】
【0242】
ＰＭＯＺ ５ｋジミリストイルグリセロールエーテルは、上に記載されたのと類似した形で調製した。７４０グラムを単離した。
1H NMR. HNMR分析はPMOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.92 (m, NH末端シグナル); 3.34 (CH2CH2骨格); 3.21 (N-CH2); 2.75-2.72 (S-CH2); 1.98 (-CH3); 1.80 (CH2-CO2R).脂質誘導体部分について追加のシグナルが、δ ５．１０（ＣＨ）；４．２６（ＣＨ２）；４．０８（ＣＨ２）；１．４９（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．２３（ＣＨ２）；０．８４（ＣＨ３）に存在した。
1H NMR. HNMR分析はPMOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.92 (m, NH末端シグナル); 3.34 (CH2CH2骨格); 3.21 (N-CH2); 2.75-2.72 (S-CH2); 1.98 (-CH3); 1.80 (CH2-CO2R).脂質誘導体部分について追加のシグナルが、δ ５．１０（ＣＨ）；４．２６（ＣＨ２）；４．０８（ＣＨ２）；１．４９（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．２３（ＣＨ２）；０．８４（ＣＨ３）に存在した。
【0243】
実施例８． 化合物１７ｃの合成
【0244】
【化30】
【0245】
ＰＥＯＺ ２Ｋジミリストイルグリセロールエーテルは、ＰＥＯＺ ５Ｋジミリストイルグリセロールエーテルについて記載されたのと同一の形で調製した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).脂質誘導体部分について追加のシグナルが、δ ５．１０（ＣＨ）；４．２５（ＣＨ２）；４．０８（ＣＨ２）；１．４８（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．２２（ＣＨ２）；０．８４（ＣＨ３）に存在した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).脂質誘導体部分について追加のシグナルが、δ ５．１０（ＣＨ）；４．２５（ＣＨ２）；４．０８（ＣＨ２）；１．４８（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．２２（ＣＨ２）；０．８４（ＣＨ３）に存在した。
【0246】
実施例９． 化合物１８ａの合成
【0247】
【化31】
【0248】
ＮＨＳエステル（前に記載された合成、１．４グラム、０．６７ｍｍｏｌ、１．００当量）を、アルゴン雰囲気下に撹拌子を装備した２５０ｍＬの乾燥丸底フラスコ中のＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解した。次いで、反応混合物に、エタノールアミン（０．１５ｍＬ、２．００ｍｍｏｌ、３．００当量）、次にトリエチルアミン（０．２８ｍＬ、２．００ｍｍｏｌ、３．００当量）を投入し、反応混合物を室温で少なくとも１２時間撹拌させておいた。この時間が経過した後、反応混合物を、１５００ｍＬのジエチルエーテルの撹拌溶液が入っているビーカー中に沈殿させた。固形物を真空濾過によって回収し、真空乾燥した。１．１グラムの材料を単離した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).エタノールアミンアミドについて追加のシグナルが、δ ４．６３（ＯＨ）；３．０８（Ｎ－ＣＨ２）；２．６９（ＨＯ－ＣＨ２）に存在した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).エタノールアミンアミドについて追加のシグナルが、δ ４．６３（ＯＨ）；３．０８（Ｎ－ＣＨ２）；２．６９（ＨＯ－ＣＨ２）に存在した。
【0249】
【化32】
【0250】
上に記載されたアミド（１グラム、０．４５ｍｍｏｌ、１．００当量）を、アルゴン雰囲気下で１００ｍＬの丸底フラスコに投入した。材料を３０ｍＬのＤＣＭに溶解した。ミリスチン酸（０．５２グラム、２．２７ｍｍｏｌ、５．００当量）、次にＤＭＡＰ（０．０１ｇ、０．０９ｍｍｏｌ、０．２当量）、最後にＤＣＣ（０．４７グラム、２．２７ｍｍｏｌ、５．００当量）を添加し、反応混合物をアルゴン雰囲気下に終夜撹拌させておいた。翌朝、反応混合物を濾過し、１６００ｍＬのジエチルエーテルが入っているビーカー中に沈殿させた。固形物を真空濾過によって回収した。生成物を逆相Ｃ１８クロマトグラフィーでアセトニトリル及びメタノールを溶離液として使用して精製して、表題化合物（０．７４０グラム）を得た。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, CDCl3) δ 3.45 (CH2CH2骨格); 2.74 (S-CH2); 2.40-2.30 (C(O)-CH2); 1.12 (CH3).脂質部分について追加のシグナルが、δ ４．１０（Ｏ－ＣＨ２）；２．８５（Ｎ－ＣＨ２）；１．９９（脂質ＣＨ２）；１．５８（脂質ＣＨ２）；１．２４（脂質ＣＨ２）；０．８７（脂質ＣＨ３）に存在した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, CDCl3) δ 3.45 (CH2CH2骨格); 2.74 (S-CH2); 2.40-2.30 (C(O)-CH2); 1.12 (CH3).脂質部分について追加のシグナルが、δ ４．１０（Ｏ－ＣＨ２）；２．８５（Ｎ－ＣＨ２）；１．９９（脂質ＣＨ２）；１．５８（脂質ＣＨ２）；１．２４（脂質ＣＨ２）；０．８７（脂質ＣＨ３）に存在した。
【0251】
実施例１０． 化合物１９ａの合成
【0252】
【化33】
【0253】
ＮＨＳエステル（前に記載された合成、６．００グラム、２．８６ｍｍｏｌ、１．００当量）を、アルゴン雰囲気下に撹拌子を装備した２５０ｍＬの乾燥丸底フラスコ中のＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解した。次いで、反応混合物に、プロパルギルアミン（０．５５ｍＬ、８．５７ｍｍｏｌ、３．００当量）、次にトリエチルアミン（１．１９ｍＬ、８．５７ｍｍｏｌ、３．００当量）を投入し、反応混合物を室温で少なくとも１２時間撹拌させておいた。この時間が経過した後、反応混合物を２５００ｍＬのジエチルエーテルの撹拌溶液が入っているビーカー中に沈殿させた。固形物を真空濾過によって回収し、真空乾燥した。１．８グラムの材料を単離した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).プロパルギルアミドについて追加のシグナルが、δ ３．８５（Ｎ－ＣＨ２）；３．７５（ＣＣＨ）に存在した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).プロパルギルアミドについて追加のシグナルが、δ ３．８５（Ｎ－ＣＨ２）；３．７５（ＣＣＨ）に存在した。
【0254】
【化34】
【0255】
１００ｍＬの丸底フラスコに、上に記載されたアミド（０．９２ｇ、０．４４ｍｍｏｌ、１．００当量）、次にアジドアセテート（０．３９ｇ、０．６６ｍｍｏｌ、１．５０当量）、ＴＨＦ（５０ｍＬ）、ＣｕＩ（０．３４ｇ、１．７６ｍｍｏｌ、４．００当量）、最後にトリエチルアミン（０．６２ｍＬ、４．４０ｍｍｏｌ、１０．０当量）を投入した。得られた混合物を５０℃に加熱し、終夜撹拌した。この時間に続いて、反応混合物を室温に冷却し、０．１Ｍ ＨＣｌ（３０ｍＬ）の添加によってクエンチして、１０分間撹拌した。得られた混合物を、予め調製された６０ｍＬのＤｏｗｅｘカラムに通した。得られた溶液をロータリーエバポレーターで３５℃にて濃縮し、続いて分液漏斗に移した。ブライン（２０ｍＬ）を添加し、混合物を１回２０ｍＬのＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機抽出液を硫酸ナトリウムで脱水し、真空中で濃縮した。生成物を逆相Ｃ１８クロマトグラフィーでアセトニトリル及びメタノールを溶離液として使用して精製して、表題化合物（０．５４０グラム）を得た。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, CDCl3) δ 7.71 (NH末端); 3.45 (CH2CH2骨格); 2.72 (S-CH2); 2.40-2.30 (C(O)-CH2); 1.12 (CH3).脂質部分について追加のシグナルが、δ ５．１６（ＣＨ）；４．４３（ＣＨ２）；４．１１（ＣＨ２）；２．２９（Ｎ－ＣＨ２）；１．６１（脂質ＣＨ２）；１．２５（脂質ＣＨ２）；０．８８（脂質ＣＨ３）に存在した。トリアゾール部分について追加のシグナルが、δ ５．２９（トリアゾールＣＨ）；４．５３（エステルＣＨ２）；４．２３（ＨＮ－ＣＨ２）に存在した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, CDCl3) δ 7.71 (NH末端); 3.45 (CH2CH2骨格); 2.72 (S-CH2); 2.40-2.30 (C(O)-CH2); 1.12 (CH3).脂質部分について追加のシグナルが、δ ５．１６（ＣＨ）；４．４３（ＣＨ２）；４．１１（ＣＨ２）；２．２９（Ｎ－ＣＨ２）；１．６１（脂質ＣＨ２）；１．２５（脂質ＣＨ２）；０．８８（脂質ＣＨ３）に存在した。トリアゾール部分について追加のシグナルが、δ ５．２９（トリアゾールＣＨ）；４．５３（エステルＣＨ２）；４．２３（ＨＮ－ＣＨ２）に存在した。
【0256】
実施例１１． 化合物１ｂの合成
【0257】
【化35】
【0258】
炉乾燥した５００ｍＬの丸底フラスコに、アルゴン雰囲気下でＰｈＣｌ（３００ｍＬ）、次に撹拌子及び２－（５－ペンチニル）－２－オキサゾリン（５．４０ｍＬ、３９．７９ｍｍｏｌ、１．２０当量）を投入した。ＴｆＯＨ（２．９４ｍＬ、３３．１６ｍｍｏｌ、１．００当量）を滴下して加え、混合物を室温で１０分間撹拌させておいた。この時間に続いて、２－エチル－２－オキサゾリン（６０．１５ｇ、６０５．３ｍｍｏｌ、１８．３０当量）を添加し、得られた混合物を室温で１０分間撹拌させておいた。次いで、反応を１１０℃に温め、３５分間撹拌した。別個の炉乾燥した１０００ｍＬの丸底フラスコに、ＰｈＣｌ（３００ｍＬ）、次にＮａＨ（３．９７ｇ、油中の６０％分散体、９９．２２ｍｍｏｌ、３．００当量）を投入した。次いで、メチル－３－メルカプトプロピオネート（２２．００ｍＬ、１９８．４２ｍｍｏｌ、６．００当量）を滴下して加え、混合物を使用前に少なくとも５時間撹拌させておいた。次いで、重合混合物を室温に冷却し、続いてアルゴン雰囲気下で１０分間かけて終結混合物に移した。反応混合物を室温で少なくとも１２時間撹拌させておいた。この時間に続いて、反応混合物を減圧下で濃縮した。０．１Ｍ ＮａＯＨ（水溶液）（１０００ｍＬ）を添加し、混合物を２時間撹拌した。得られた水溶液をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ－６７（２００ ｇ）とＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ１２０Ｈ（２００グラム）の混合カラムに通した。生成物の酸をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーを介して精製し、得られた水溶液をｐＨ＝３に酸性化し、ＣＨ２Ｃｌ２（２回×３００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出液を硫酸ナトリウムで脱水し、３００ｍＬの体積に濃縮した。次いで、溶液を３５００ｍＬのＥｔ２Ｏが入っている４Ｌのビーカー中に沈殿させ、固形物を真空濾過によって回収し、真空乾燥して、４６．２グラムの生成物を得た。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).ペンダント基のシグナルが、δ １．６５ｐｐｍ（ＣＨ２）に存在した。ペンダント基の数は、ポリマー主鎖の積分値とペンダント基のシグナルの比較を介して算出された。この場合、ペンダント基の数は、１．２１であると判断された。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).ペンダント基のシグナルが、δ １．６５ｐｐｍ（ＣＨ２）に存在した。ペンダント基の数は、ポリマー主鎖の積分値とペンダント基のシグナルの比較を介して算出された。この場合、ペンダント基の数は、１．２１であると判断された。
【0259】
実施例１２． 化合物１ａの合成
【0260】
【化36】
【0261】
炉乾燥した５００ｍＬの丸底フラスコに、アルゴン雰囲気下でＰｈＣｌ（３００ｍＬ）、次に撹拌子及び２－（５－ペンチニル）－２－オキサゾリン（２．７０ｍＬ、１９．８５ｍｍｏｌ、１．２０当量）を投入した。ＴｆＯＨ（１．４６ｍＬ、１６．５４ｍｍｏｌ、１．００当量）を滴下して加え、混合物を室温で１０分間撹拌させておいた。この時間に続いて、２－エチル－２－オキサゾリン（３０．０ｇ、３０２．６３ｍｍｏｌ、１８．３０当量）を添加し、得られた混合物を室温で１０分間撹拌させておいた。次いで、反応を１１０℃に温め、３５分間撹拌した。別個の炉乾燥した１０００ｍＬの丸底フラスコに、ＰｈＣｌ（１５０ｍＬ）、次にＮａＨ（１．９８ｇ、油中の６０％分散体、４９．６１ｍｍｏｌ、３．００当量）を投入した。次いで、メチルチオグリコレート（８．８６ｍＬ、９９．２４ｍｍｏｌ、６．００当量）を滴下して加え、混合物を使用前に少なくとも５時間撹拌させておいた。次いで、重合混合物を室温に冷却し、続いてアルゴン雰囲気下で１０分間かけて終結混合物に移した。反応混合物を室温で少なくとも１２時間撹拌させておいた。この時間に続いて、反応混合物を減圧下で濃縮した。０．１Ｍ ＮａＯＨ（水溶液）（１０００ｍＬ）を添加し、混合物を２時間撹拌した。得られた水溶液をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ－６７（２００ｇ）とＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ１２０Ｈ（２００グラム）の混合カラムに通した。生成物の酸をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーを介して精製し、得られた水溶液をｐＨ＝３に酸性化し、ＣＨ２Ｃｌ２（２回×３００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出液を硫酸ナトリウムで脱水し、３００ｍＬの体積に濃縮した。次いで、溶液を３５００ｍＬのＥｔ２Ｏが入っている４Ｌのビーカー中に沈殿させ、固形物を真空濾過によって回収し、真空乾燥して、２７．６グラムの生成物を得た。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).終端基のα－メチレンは、ポリマー主鎖のシグナルの下にあると結論づけられた。ペンダント基のシグナルが、δ １．６５ｐｐｍ（ＣＨ２）に存在した。ペンダント基の数は、ポリマー主鎖の積分値とペンダント基のシグナルの比較を介して算出された。この場合、ペンダント基の数は、１．３２であると判断された。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).終端基のα－メチレンは、ポリマー主鎖のシグナルの下にあると結論づけられた。ペンダント基のシグナルが、δ １．６５ｐｐｍ（ＣＨ２）に存在した。ペンダント基の数は、ポリマー主鎖の積分値とペンダント基のシグナルの比較を介して算出された。この場合、ペンダント基の数は、１．３２であると判断された。
【0262】
実施例１３． 化合物３ａの合成
【0263】
【化37】
【0264】
炉乾燥した５００ｍＬの丸底フラスコに、アルゴン雰囲気下で２－エチル－２－オキサゾリン（３２．１４ｇ、３２４．２２ｍｍｏｌ、１９．００当量）、次ＰｈＣｌ（１５０ｍＬ）及び撹拌子を投入した。ＴｆＯＨ（１．５１ｍＬ、１７．０６ｍｍｏｌ、１．００当量）を滴下して加え、混合物を室温で５分間撹拌させておいた。次いで、反応を１１０℃に温め、３５分間撹拌した。別個の炉乾燥した１０００ｍＬの丸底フラスコに、ＰｈＣｌ（１５０ｍＬ）、次にＮａＨ（１．９１ｇ、油中の６０％分散体、４７．８ｍｍｏｌ、３．００当量）を投入した。次いで、メチルチオグリコレート（８．５５ｍＬ、９５．６０ｍｍｏｌ、６．００当量）を滴下して加え、混合物を使用前に少なくとも５時間撹拌させておいた。次いで、重合混合物を室温に冷却し、続いてアルゴン雰囲気下で１０分間かけて終結混合物に移した。反応混合物を室温で少なくとも１２時間撹拌させておいた。この時間に続いて、反応混合物を減圧下で濃縮した。０．１Ｍ ＮａＯＨ（水溶液）（１０００ｍＬ）を添加し、混合物を２時間撹拌した。得られた水溶液をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ－６７（２００ｇ）とＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ１２０Ｈ（２００グラム）の混合カラムに通した。生成物の酸をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーを介して精製し、得られた水溶液をｐＨ＝３に酸性化し、ＣＨ２Ｃｌ２（２回×３００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出液を硫酸ナトリウムで脱水し、３００ｍＬの体積に濃縮した。次いで、溶液を３５００ｍＬのＥｔ２Ｏが入っている４Ｌのビーカー中に沈殿させ、固形物を真空濾過によって回収し、真空乾燥して、８．０グラムの生成物を得た。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).終端基のα－メチレンは、ポリマー主鎖のシグナルの下にあると結論づけられた。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).終端基のα－メチレンは、ポリマー主鎖のシグナルの下にあると結論づけられた。
【0265】
実施例１４． 化合物４の合成
【0266】
【化38】
【0267】
炉乾燥した５００ｍＬの丸底フラスコに、アルゴン雰囲気下でＰｈＣｌ（３００ｍＬ）、次に撹拌子及び２－（５－ペンチニル）－２－オキサゾリン（５．４７ｍＬ、４０．２７ｍｍｏｌ、１．２０当量）を投入した。ＴｆＯＨ（２．９７ｍＬ、３３．５６ｍｍｏｌ、１．００当量）を滴下して加え、混合物を室温で１０分間撹拌させておいた。この時間に続いて、２－エチル－２－オキサゾリン（６０．８８ｇ、６１４．１４ｍｍｏｌ、１８．３０当量）を添加し、得られた混合物を室温で１０分間撹拌させておいた。次いで、反応を１１０℃に温め、３５分間撹拌した。次いで、重合混合物を室温に冷却し、Ｎａ２ＣＯ３（２２．５ｇ、２１２．３ｍｍｏｌ、７．００当量）のＨ２Ｏ（４００ｍＬ）中の水溶液を添加した。反応混合物を少なくとも１２時間撹拌させておいた。この時間に続いて、反応混合物を分液漏斗に移し、ブライン（４００ｍＬ）で希釈した。得られた混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２回×３００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出液を３００ｍＬの体積に濃縮した。次いで、溶液を３５００ｍＬのＥｔ２Ｏが入っている４Ｌのビーカー中に沈殿させ、固形物を真空濾過によって回収し、真空乾燥して、５７グラムの生成物を得た。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 4.83-4.65 (CH2CH2OH末端); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).ペンダント基のシグナルが、δ １．６５ｐｐｍ（ＣＨ２）に存在した。ペンダント基の数は、事前にポリマー出発物質から１．１３であると算出された。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 4.83-4.65 (CH2CH2OH末端); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).ペンダント基のシグナルが、δ １．６５ｐｐｍ（ＣＨ２）に存在した。ペンダント基の数は、事前にポリマー出発物質から１．１３であると算出された。
【0268】
実施例１５． 化合物５の合成
【0269】
【化39】
【0270】
炉乾燥した５００ｍＬの丸底フラスコに、アルゴン雰囲気下で２－エチル－２－オキサゾリン（３０．４６ｇ、３０７．３ｍｍｏｌ、１９．００当量）、次にＰｈＣｌ（１５０ｍＬ）及び撹拌子を投入した。ＴｆＯＨ（１．４３ｍＬ、１６．１７ｍｍｏｌ、１．００当量）を滴下して加え、混合物を室温で５分間撹拌させておいた。次いで、反応を１１０℃に温め、３５分間撹拌した。次いで、重合混合物を室温に冷却し、イソニペコト酸エチル（４．９８ｍＬ、３２．３４ｍｍｏｌ、２．００当量）を添加した。反応混合物を室温で少なくとも１２時間撹拌させておいた。この時間に続いて、反応混合物を分液漏斗に移し、ブライン（４００ｍＬ）で希釈した。得られた混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２回×３００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出液を３００ｍＬの体積に濃縮した。次いで、溶液を３５００ｍＬのジエチルエーテルが入っている４Ｌのビーカー中に沈殿させ、固形物を真空濾過によって回収し、真空乾燥した。この反復で、２５グラムを単離した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 4.05 (エチルエステルCH2); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 2.81 (CH2-N); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 2.04 (末端ピペリジンのCH); 1.78 (末端ピペリジンのCH2); 1.50 (末端ピペリジンのCH2); 1.16 (エチルエステルCH3); 0.96(CH3).
以上で回収された材料から、６．００グラムのエチルエステルを２５０ｍＬの丸底フラスコに移し、１Ｍ ＮａＯＨ（水溶液）（３０ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌し、そこで混合物をｐＨ＝３に酸性化した。回転蒸発を介して□を除去し、残渣をＤＭＦに溶解し、濾過し、硫酸ナトリウムで脱水し、真空中で濃縮した。得られたゲルをＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、硫酸ナトリウムで脱水し、真空中で濃縮した。次いで、生成物を２０００ｍＬのジエチルエーテルが入っているビーカー中に沈殿させた。固形物を真空濾過によって回収し、真空乾燥した。５．８０グラムの材料を単離した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18(N-CH2); 2.96 (CH2-N); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 2.06 (末端ピペリジンのCH); 1.86 (末端ピペリジンのCH2); 0.96(CH3).
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 4.05 (エチルエステルCH2); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 2.81 (CH2-N); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 2.04 (末端ピペリジンのCH); 1.78 (末端ピペリジンのCH2); 1.50 (末端ピペリジンのCH2); 1.16 (エチルエステルCH3); 0.96(CH3).
以上で回収された材料から、６．００グラムのエチルエステルを２５０ｍＬの丸底フラスコに移し、１Ｍ ＮａＯＨ（水溶液）（３０ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌し、そこで混合物をｐＨ＝３に酸性化した。回転蒸発を介して□を除去し、残渣をＤＭＦに溶解し、濾過し、硫酸ナトリウムで脱水し、真空中で濃縮した。得られたゲルをＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、硫酸ナトリウムで脱水し、真空中で濃縮した。次いで、生成物を２０００ｍＬのジエチルエーテルが入っているビーカー中に沈殿させた。固形物を真空濾過によって回収し、真空乾燥した。５．８０グラムの材料を単離した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18(N-CH2); 2.96 (CH2-N); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 2.06 (末端ピペリジンのCH); 1.86 (末端ピペリジンのCH2); 0.96(CH3).
【0271】
実施例１６． 化合物７の合成
【0272】
【化40】
【0273】
炉乾燥した５００ｍＬの丸底フラスコに、アルゴン雰囲気下でＰｈＣｌ（１５０ｍＬ）、次に撹拌子及び２－（５－ペンチニル）－２－オキサゾリン（２．７ｍＬ、１９．８５ｍｍｏｌ、１．２０当量）を投入した。ＴｆＯＨ（１．４６ｍＬ、１６．５４ｍｍｏｌ、１．００当量）を滴下して加え、混合物を室温で１０分間撹拌させておいた。この時間に続いて、２－エチル－２－オキサゾリン（３０．００ｇ、３０２．６ｍｍｏｌ、１８．３０当量）を添加し、得られた混合物を室温で１０分間撹拌させておいた。次いで、反応を１１０℃に温め、３５分間撹拌した。次いで、重合混合物を室温に冷却した。次いで、イソニペコト酸エチル（４．９８ｍＬ、３３．０８ｍｍｏｌ、２．００当量）を添加した。反応混合物を室温で少なくとも１２時間撹拌させておいた。この時間に続いて、反応混合物を分液漏斗に移し、ブライン（４００ｍＬ）で希釈した。得られた混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２回×３００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出液を３００ｍＬの体積に濃縮した。次いで、溶液を３５００ｍＬのＥｔ２Ｏが入っている４Ｌのビーカー中に沈殿させ、固形物を真空濾過によって回収し、真空乾燥した。２５グラムの材料を単離した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 4.05 (エチルエステルCH2); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 2.81 (CH2-N); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 2.04 (末端ピペリジンのCH); 1.78 (末端ピペリジンのCH2); 1.50 (末端ピペリジンのCH2); 1.16 (エチルエステルCH3); 0.96(CH3).ペンダント基のシグナルが、δ １．６５ｐｐｍ（ＣＨ２）に存在した。ペンダント基の数は、事前にポリマー出発物質から０．９であると算出された。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 4.05 (エチルエステルCH2); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 2.81 (CH2-N); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 2.04 (末端ピペリジンのCH); 1.78 (末端ピペリジンのCH2); 1.50 (末端ピペリジンのCH2); 1.16 (エチルエステルCH3); 0.96(CH3).ペンダント基のシグナルが、δ １．６５ｐｐｍ（ＣＨ２）に存在した。ペンダント基の数は、事前にポリマー出発物質から０．９であると算出された。
【0274】
実施例１７． 化合物８の合成
【0275】
【化41】
【0276】
炉乾燥した５００ｍＬの丸底フラスコに、アルゴン雰囲気下でクロロベンゼン（１５０ｍＬ）、次に撹拌子及び２－エチル－２－オキサゾリン（３０ｇ、３０２．６３ｍｍｏｌ、１９．００当量）を投入した。プロパルギルトシレート（２．７６ｍＬ、１５．９３ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、反応混合物を１１０℃に温め、４０分間撹拌した。別個の炉乾燥した１０００ｍＬの丸底フラスコに、クロロベンゼン（１５０ｍＬ）、次にＮａＨ（１．９１ｇ、油中の６０％分散体、４７．７９ｍｍｏｌ、３．００当量）を投入した。次いで、メチル－３－メルカプトプロピオネート（１０．４８ｍＬ、９５．５８ｍｍｏｌ、６．００当量）を滴下して加え、混合物を５時間撹拌させておいた。次いで、重合混合物を室温に冷却し、４０分間保持した後、続いてアルゴン雰囲気下で１０分間かけて終結混合物に移した。反応混合物を室温で１２時間撹拌させておいた。この時間に続いて、反応混合物を減圧下で濃縮した。０．１Ｍ ＮａＯＨ（水溶液）（１０００ｍＬ）を添加し、混合物を２時間撹拌した。得られた水溶液をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ－６７（２００ｇ）とＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ１２０Ｈ（２００グラム）の混合カラムに通した。生成物の酸をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーを介して精製し、得られた水溶液をｐＨ ３に酸性化し、ＣＨ２Ｃｌ２（２回×３００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出液を硫酸ナトリウムで脱水し、３００ｍＬの体積に濃縮した。次いで、溶液を３５００ｍＬのＥｔ２Ｏが入っている４Ｌのビーカー中に沈殿させ、固形物を真空濾過によって回収し、真空乾燥して、１５．２グラムの生成物を得た。ＨＰＬＣ分析によって、分析純度９８％を決定した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02 (S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).アルキニル基のシグナルが、δ ４．２２－３．８２ｐｐｍ（ＣＨ２及びＣＨ）に存在した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02 (S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).アルキニル基のシグナルが、δ ４．２２－３．８２ｐｐｍ（ＣＨ２及びＣＨ）に存在した。
【0277】
実施例１８． 化合物９の合成
【0278】
【化42】
【0279】
炉乾燥した５００ｍＬの丸底フラスコに、アルゴン雰囲気下でＰｈＣｌ（７５ｍＬ）、次に撹拌子及び２－エチル－２－オキサゾリン（１５．４１ｇ、１５５．４７ｍｍｏｌ、２０．００当量）を投入した。プロパルギルトシレート（１．３４ｍＬ、７．７７ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、反応混合物を１１０℃に温め、１時間撹拌した。次いで、反応混合物を室温に冷却し、Ｎａ２ＣＯ３（６．００ｇ、５７．００ｍｍｏｌ、７．００当量）のＨ２Ｏ（１００ｍＬ）中の水溶液を添加した。反応混合物を少なくとも１２時間撹拌させておいた。この時間に続いて、反応混合物を分液漏斗に移し、ブライン（２００ｍＬ）で希釈した。得られた混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２回×２００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出液を１５０００ｍＬの体積に濃縮した。次いで、溶液を２０００ｍＬのＥｔ２Ｏが入っている４Ｌのビーカー中に沈殿させ、固形物を真空濾過によって回収し、真空乾燥して、６．０５グラムの生成物を得た。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 4.83-4.65 (CH2CH2OH末端); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96 (CH3).アルキニル基のシグナルが、δ ４．１７ｐｐｍ（ＣＨ２及びＣＨ）に存在した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 4.83-4.65 (CH2CH2OH末端); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96 (CH3).アルキニル基のシグナルが、δ ４．１７ｐｐｍ（ＣＨ２及びＣＨ）に存在した。
【0280】
実施例１９． 化合物１０の合成
【0281】
【化43】
【0282】
ポリ（エチルオキサゾリン）（ＯＨを末端基とする、０．５グラム、０．２７ｍｍｏｌ、１．００当量）を３０ｍＬのＴＨＦに溶解し、炉乾燥した２５０ｍＬの丸底フラスコに移した。カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（０．０９ｇ、０．８１ｍｍｏｌ、３．００当量）を添加し、反応混合物を室温で３０分間撹拌させておいた。この時間に続いて、ブロモ酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．２４ｍＬ、１．６２ｍｍｏｌ、６．００当量）を添加し、反応混合物を室温で少なくとも１２時間撹拌させておいた。この時間に続いて、反応混合物をブライン（５０ｍＬ）とともに分液漏斗に移した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２回×２５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出液を硫酸ナトリウムで脱水し、真空中で濃縮した。得られた固体を１Ｍ ＮａＯＨ水溶液（２０ｍＬ）に溶解し、室温で少なくとも１２時間撹拌した。次いで、溶液をｐＨ＝３に酸性化し、ＣＨ２Ｃｌ２（２回×３０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出液を硫酸ナトリウムで脱水し、真空中で濃縮して、０．４グラムの中間体カルボン酸を得た。それをさらに精製することなく、そのまま使用した。
【0283】
１００ｍＬの丸底フラスコに、上記のカルボン酸（１ｇ、０．４５ｍｍｏｌ、１．００当量）、次にＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）、ＤＭＡＰ（０．０１ｇ）、最後にＮＨＳ（０．０４グラム、０．３６ｍｍｏｌ、２．００当量）を投入した。次いで、ＤＣＣ（０．０８ｇ、０３６ｍｍｏｌ、２．００当量）を添加し、反応混合物を室温で少なくとも１２時間撹拌させておいた。次いで、得られた混合物を濾過し、濃縮して、中間体ＮＨＳエステルを得た。それをさらに精製することなく、そのまま使用した。次いで、ＮＨＳエステルを１００ｍＬの丸底フラスコに移し、ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）を添加した。ジミリスチルアミン（０．５６グラム、１．３６ｍｍｏｌ、３．００当量）を添加し、次にトリエチルアミン（０．２０ｍＬ、１．３６ｍｍｏｌ、３．００当量）を添加した。反応混合物を少なくとも１２時間撹拌し、そこで混合物をブライン（２０ｍＬ）で希釈し、分液漏斗に移した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２回×２０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出液を硫酸ナトリウムで脱水し、真空中で濃縮した。生成物を逆相クロマトグラフィー（Ｃ１８、アセトニトリル：メタノール）によって精製して、０．２７グラムの表題化合物を得た。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 4.27-3.93 (CH2O及びO-CH2-N) ; 3.35 (CH2CH2骨格); 2.96 (N-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).脂質部分について追加のシグナルが、δ １．４９－１．５４（Ｎ－（ＣＨ２）２）；１．２７（ＣＨ２）；０．８７（ＣＨ３）に存在した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 4.27-3.93 (CH2O及びO-CH2-N) ; 3.35 (CH2CH2骨格); 2.96 (N-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).脂質部分について追加のシグナルが、δ １．４９－１．５４（Ｎ－（ＣＨ２）２）；１．２７（ＣＨ２）；０．８７（ＣＨ３）に存在した。
【0284】
実施例２０． 化合物１１ａの合成
【0285】
【化44】
【0286】
１００ｍＬの丸底フラスコに、上に記載された酸（０．６８ｇ、０．３１ｍｍｏｌ、１．００当量）、次にアジドアセテート（０．２７ｇ、０．４６ｍｍｏｌ、１．５０当量）、ＴＨＦ（５０ｍＬ）、ＣｕＩ（０．２４ｇ、１．２４ｍｍｏｌ、４．００当量）、最後にトリエチルアミン（０．６４ｍＬ、４．６０ｍｍｏｌ、１０．０当量）を投入した。得られた混合物を５０℃に加熱し、終夜撹拌した。この時間に続いて、反応混合物を室温に冷却し、０．１Ｍ ＨＣｌ（３０ｍＬ）の添加によってクエンチして、１０分間撹拌した。得られた混合物を、予め調製された６０ｍＬのＤｏｗｅｘカラムに通した。得られた溶液をロータリーエバポレーターで３５℃にて濃縮し、続いて分液漏斗に移した。ブライン（２０ｍＬ）を添加し、混合物を１回２０ｍＬのＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機抽出液を硫酸ナトリウムで脱水し、真空中で濃縮した。生成物を逆相Ｃ１８クロマトグラフィーでアセトニトリル及びメタノールを溶離液として使用して精製して、表題化合物（０．１８グラム）を得た。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).脂質誘導体部分について追加のシグナルが、δ ５．１０（ＣＨ）；４．２６（ＣＨ２）；４．０８（ＣＨ２）；１．４９（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．２３（ＣＨ２）；０．８４（ＣＨ３）に存在した。トリアゾール部分について追加のシグナルが、δ ５．３４（トリアゾールＣＨ）；４．３５（エステル ＣＨ２）；４．１１（ＨＮ－ＣＨ２）に存在した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).脂質誘導体部分について追加のシグナルが、δ ５．１０（ＣＨ）；４．２６（ＣＨ２）；４．０８（ＣＨ２）；１．４９（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．２３（ＣＨ２）；０．８４（ＣＨ３）に存在した。トリアゾール部分について追加のシグナルが、δ ５．３４（トリアゾールＣＨ）；４．３５（エステル ＣＨ２）；４．１１（ＨＮ－ＣＨ２）に存在した。
【0287】
実施例２１． 化合物１１ｂの合成
【0288】
【化45】
【0289】
Ｐｔｙｎ－ＰＥＯＺ ２Ｋ酸（０．５００ｇ、０．２２７ｍｍｏｌ、１．０当量、Ｍｎ ２１９９Ｄａ）及びＤＭＧ－（２－アジドプロピオネート（０．１６６ｇ、０．２７３ｍｍｏｌ、１．２当量）のＴＨＦ（１０ｍＬ）中の溶液に、ＣｕＩ（０．０２１７ｇ、０．１１４ｍｍｏｌ、０．５当量）及びＴＥＡ（０．０６３４ｍＬ、０．４５５ｍｍｏｌ、２．０当量）を添加した。得られた混合物を室温で５分間撹拌し、次いで５０℃で１８時間撹拌させておき、曇った黄色溶液を得た。室温に冷却した後、０．１Ｎ ＨＣｌ水溶液（６ｍＬ）を添加し、次に５分間撹拌することによって反応混合物をクエンチした。混合物をＤｏｗｅｘ（登録商標） Ｍ４１９５カラムに通し、次いでロータリーエバポレーターを使用して、濾液からＴＨＦを除去した。得られた水溶液を２０ｍＬのジクロロメタンとともに、０．５ｇのＮａＣｌ（水体積の５ｗ／ｖ％）を使用して撹拌した。有機相を回収し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、濃縮した。残渣を５ｍＬのＤＣＭに溶解し、ジエチルエーテル（６０ｍＬ）に添加することによって沈殿させ、濾過し、真空中で乾燥した。得られた淡黄色結晶を、Ｂｉｏｔａｇｅ（ＳＮＡＰ ｕｌｔｒａ Ｃ－１８カラム、ＭｅＣＮ／ＭｅＯＨ）を使用してさらに精製して、ポリマー不純物を除去した。画分５～２１を回収し、濃縮して、所望の生成物（０．２０ｇ、純度９９．８％で収率３１．３％）を白色結晶として得た。
【0290】
ＤＭＧ－（２－アジドプロピオネート）の結合は、普通のポリマー主鎖ピークに加えて、ＤＭＧプロトンを０．８４ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、－（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、１．２３ｐｐｍ（ｍ、４０Ｈ、－（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、１．４９ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＨ２（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、１．８１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、トリアゾール－ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－）、２．２８ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、３．０７ｐｐｍ、４．２３ｐｐｍ及び４．３３ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＯＣＨ２ＣＨ（Ｏ－）ＣＨ２Ｏ－）、５．１８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＯＣＨ２ＣＨ（Ｏ－）ＣＨ２Ｏ－）、５．５９ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、トリアゾール－ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－）、及び８．０９ｐｐｍ（ｓ、１Ｈ、トリアゾール環、「クリック」反応に起因）に示す１Ｈ ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ、５００ＭＨｚ、１０ｍｇ／ｍＬ ＤＭＳＯ－ｄ６）スペクトルによって判明した。
【0291】
実施例２２． 化合物１１ｃの合成
【0292】
【化46】
【0293】
１００ｍＬの丸底フラスコに、上に記載された酸（１．４２ｇ、０．６５ｍｍｏｌ、１．００当量）、次にアジドプロピオネート（０．５９ｇ、０．９７ｍｍｏｌ、１．５０当量）、ＴＨＦ（５０ｍＬ）、ＣｕＩ（０．５ｇ、２．６ｍｍｏｌ、４．００当量）、最後にトリエチルアミン（０．９１ｍＬ、６．５０ｍｍｏｌ、１０．０当量）を投入した。得られた混合物を５０℃に加熱し、終夜撹拌した。この時間に続いて、反応混合物を室温に冷却し、０．１Ｍ ＨＣｌ（３０ｍＬ）の添加によってクエンチして、１０分間撹拌した。得られた混合物を、予め調製された６０ｍＬのＤｏｗｅｘカラムに通した。得られた溶液をロータリーエバポレーターで３５℃にて濃縮し、続いて分液漏斗に移した。ブライン（２０ｍＬ）を添加し、混合物を１回２０ｍＬのＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機抽出液を硫酸ナトリウムで脱水し、真空中で濃縮した。生成物を逆相Ｃ１８クロマトグラフィーでアセトニトリル及びメタノールを溶離液として使用して精製して、表題化合物（０．３４グラム）を得た。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).脂質誘導体部分について追加のシグナルが、δ ５．１０（ＣＨ）；４．５１（ＣＨ２）；４．２６（ＣＨ２）；４．０８（ＣＨ２）；１．４９（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．２３（ＣＨ２）；０．８４（ＣＨ３）に存在した。トリアゾール部分について追加のシグナルが、δ ４．３５（エステルＣＨ２）；４．１１（ＨＮ－ＣＨ２）に存在した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).脂質誘導体部分について追加のシグナルが、δ ５．１０（ＣＨ）；４．５１（ＣＨ２）；４．２６（ＣＨ２）；４．０８（ＣＨ２）；１．４９（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．２３（ＣＨ２）；０．８４（ＣＨ３）に存在した。トリアゾール部分について追加のシグナルが、δ ４．３５（エステルＣＨ２）；４．１１（ＨＮ－ＣＨ２）に存在した。
【0294】
実施例２３． 化合物１２ａの合成
【0295】
【化47】
【0296】
１００ｍＬの丸底フラスコに、上に記載された酸（０．８２ｇ、０．３７ｍｍｏｌ、１．００当量）、次にアジドアセテート（０．４０ｇ、０．６７ｍｍｏｌ、１．８０当量）、ＴＨＦ（５０ｍＬ）、ＣｕＩ（０．２８ｇ、１．４８ｍｍｏｌ、４．００当量）、最後にトリエチルアミン（０．５２ｍＬ、３．７０ｍｍｏｌ、１０．０当量）を投入した。得られた混合物を５０℃に加熱し、終夜撹拌した。この時間に続いて、反応混合物を室温に冷却し、０．１Ｍ ＨＣｌ（３０ｍＬ）の添加によってクエンチして、１０分間撹拌した。得られた混合物を、予め調製された６０ｍＬのＤｏｗｅｘカラムに通した。得られた溶液をロータリーエバポレーターで３５℃にて濃縮し、続いて分液漏斗に移した。ブライン（２０ｍＬ）を添加し、混合物を１回２０ｍＬのＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機抽出液を硫酸ナトリウムで脱水し、真空中で濃縮した。生成物を逆相Ｃ１８クロマトグラフィーでアセトニトリル及びメタノールを溶離液として使用して精製して、表題化合物（０．２２グラム）を得た。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).脂質誘導体部分について追加のシグナルが、δ ５．２０（ＣＨ）；４．２６（ＣＨ２）；１．４９（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．２３（ＣＨ２）；０．８４（ＣＨ３）に存在した。トリアゾール部分について追加のシグナルが、δ ５．３５（エステルＣＨ２）；４．１１（ＨＮ－ＣＨ２）に存在した。
1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).脂質誘導体部分について追加のシグナルが、δ ５．２０（ＣＨ）；４．２６（ＣＨ２）；１．４９（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．２３（ＣＨ２）；０．８４（ＣＨ３）に存在した。トリアゾール部分について追加のシグナルが、δ ５．３５（エステルＣＨ２）；４．１１（ＨＮ－ＣＨ２）に存在した。
【0297】
実施例２４． 化合物１９ｂの合成
Ａ． ＤＭＧ－（２－アジドプロピオネート）の合成
Ａ． ＤＭＧ－（２－アジドプロピオネート）の合成
【0298】
【化48】
【0299】
ＤＭＧ（１．０２ｇ、１．９００ｍｍｏｌ、１．０当量）のトルエン（２０ｍＬ）中の溶液に、２－アジドプロピオン酸（０．２８９ｇ、２．２８０ｍｍｏｌ、１．２当量、９０．８重量％）及びＤＭＡＰ（０．０２３２ｇ、０．０１９ｍｍｏｌ、０．１当量）を添加した。ＤＣＣ（０．４７０ｇ、２．２８０ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加した後、得られた混合物を室温で２時間撹拌させておいた。得られた混合物を、シリンジフィルターを使用して濾過し、ロータリーエバポレーターを使用して濃縮した。Ｂｉｏｔａｇｅ（ＳＮＡＰ ｕｌｔｒａ－シリカゲルカラム、ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）を使用して、残渣を精製して、所望の生成物（１．０９ｇ、収率９３．９％、純度９９．９％）を得た。
【0300】
２－アジドプロピオン酸の結合は、プロトンを０．８５ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、－（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、１．２３ｐｐｍ（ｍ、４０Ｈ、－（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、１．３２ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ、Ｎ３ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－）、１．５０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＨ２（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、２．２８ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、４．１５ｐｐｍ及び４．３５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＯＣＨ２ＣＨ（Ｏ－）ＣＨ２Ｏ－）、４．２９ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、Ｎ３ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－）、並びに５．２４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＯＣＨ２ＣＨ（Ｏ－）ＣＨ２Ｏ－）に示す１Ｈ ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ、５００ＭＨｚ、１０ｍｇ／ｍＬ ＤＭＳＯ－ｄ６）スペクトルによって判明した。
【0301】
Ｂ． ＰＥＯＺ ２Ｋ ＤＭＧ－（トリアゾール－２－プロピオネート）の合成
【0302】
【化49】
【0303】
ＰＥＯＺ ２Ｋアセチレン（１．０１ｇ、０．４５０ｍｍｏｌ、１．０当量、Ｍｎ ２２４９Ｄａ）及びＤＭＧ－（２－アジドプロピオネート（０．３０２ｇ、０．４９５ｍｍｏｌ、１．１当量）のＴＨＦ（１０ｍＬ）中の溶液に、ＣｕＩ（０．０４２９ｇ、０．２２５ｍｍｏｌ、０．５当量）及びＴＥＡ（０．１２５ｍＬ、０．９００ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。得られた混合物を室温で４分間撹拌し、次いで５０℃で１８時間撹拌させておいた。室温に冷却した後、０．１Ｎ ＨＣｌ水溶液（１２ｍＬ）を添加し、次に５分間撹拌することによって反応混合物をクエンチした。混合物をＤｏｗｅｘ（登録商標） Ｍ４１９５カラムに通し、ロータリーエバポレーターを使用して、濾液からＴＨＦを除去した。得られた水溶液を３０ｍＬのジクロロメタンとともに、２ｇのＮａＣｌ（水体積の１０ｗ／ｖ％）を使用して撹拌した。有機相を回収し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、濃縮した。残渣を６ｍＬのＤＣＭに溶解し、ジエチルエーテル（７０ｍＬ）に添加することによって沈殿させ、濾過し、真空中で乾燥した。得られた淡黄色結晶を、Ｂｉｏｔａｇｅ（ＳＮＡＰ ｕｌｔｒａ Ｃ－１８カラム、ＭｅＣＮ／ＭｅＯＨ）を使用してさらに精製して、ポリマー不純物を除去した後、凍結乾燥して、所望の生成物（０．５６０ｇ、純度９９．８％で収率４３．８％）を白色結晶として得た。
【0304】
ＤＭＧ－（２－アジドプロピオネート）の結合は、普通のポリマー主鎖ピークに加えて、ＤＭＧプロトンを０．８４ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、－（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、１．２３ｐｐｍ（ｍ、４０Ｈ、－（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、１．４９ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＨ２（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、１．７１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、トリアゾール－ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－）、２．２８ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、４．０６ｐｐｍ及び４．２８ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＯＣＨ２ＣＨ（Ｏ－）ＣＨ２Ｏ－）、５．１８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＯＣＨ２ＣＨ（Ｏ－）ＣＨ２Ｏ－）、５．６４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、トリアゾール－ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－）、及び８．００ｐｐｍ（ｓ、１Ｈ、トリアゾール環、「クリック」反応によって得られた）に示す１Ｈ ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ、５００ＭＨｚ、１０ｍｇ／ｍＬ ＤＭＳＯ－ｄ６）スペクトルによって判明した。
【0305】
実施例２５． 化合物１９ｃの合成
ステップ１－１，２－ジミリストイル－３－アジドプロピオニル－ｒａｃ－グリセロール（ＤＭＧ－３－アジドプロピオネート）の合成
ステップ１－１，２－ジミリストイル－３－アジドプロピオニル－ｒａｃ－グリセロール（ＤＭＧ－３－アジドプロピオネート）の合成
【0306】
【化50】
【0307】
１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロール（ＤＭＧ、１．００ｇｍ、１．９５ｍｍｏｌ、１．０当量）を無水ＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解した。アルゴン下に、無水ピリジン（６３２μＬ、７．８０ｍｍｏｌ、４．０当量）を添加し、次に３－アジドプロピオニルクロリド（５２１ｍｇ、３．９０ｍｍｏｌ、２．０当量）を添加した。反応混合物を室温でアルゴン下に撹拌させておいた。１時間反応した後、溶液を蒸発乾固した。残渣をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解し、それを０．０５Ｍ ＨＣｌ（２回×４０ｍＬ）で洗浄した。ＤＣＭ相を無水ＭｇＳＯ４（４ｇ）で脱水した。混合物を濾過した。清澄な濾液を蒸発乾固し、１．２２８ｇの粗生成物（黄色液体）を得た。粗生成物は、Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ ２５ｇカラム、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｉｓｏｌｅｒａ Ｓｙｓｔｅｍで、ヘキサン及び酢酸エチルを移動相として使用して、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。カラム精製した後、生成物画分の移動相を蒸発させ、残渣を終夜真空中でさらに乾燥し、０．７２ｇの無色液体／白ロウを得た。ＴＬＣ（シリカゲル６０）は１個のスポットを示す。
1H NMR (Varian, 500 MHZ, 4 mg/mL DMSO-d6, δ, ppm, TMS): 0.85 (t, 2 × 3H, -CH3), 1.23 (m, 不十分な分割, 2 × 20H, -(CH2)10-), 1.50 (m, 2 × 2H, -(C=O)CH2CH2-), 2.28 (t, 2 × 2H, -(C=O)CH2-), 2.61 (t, 2H, N3CH2CH2-), 3.54 (t, 2H, N3CH2-), 4.14, 4.20 (qq, 2H, -CH2O(C=O)C13H27), 4.28 (d, 2H, -CH2O(C=O)C2H4N3), 5.20 (m, 1H, -(OCH2)2CH-O-).
1H NMR (Varian, 500 MHZ, 4 mg/mL DMSO-d6, δ, ppm, TMS): 0.85 (t, 2 × 3H, -CH3), 1.23 (m, 不十分な分割, 2 × 20H, -(CH2)10-), 1.50 (m, 2 × 2H, -(C=O)CH2CH2-), 2.28 (t, 2 × 2H, -(C=O)CH2-), 2.61 (t, 2H, N3CH2CH2-), 3.54 (t, 2H, N3CH2-), 4.14, 4.20 (qq, 2H, -CH2O(C=O)C13H27), 4.28 (d, 2H, -CH2O(C=O)C2H4N3), 5.20 (m, 1H, -(OCH2)2CH-O-).
【0308】
ステップ２－ＰＥＯＺ－（トリアゾール－３－プロピオニル－ＤＭＧ） ２Ｋ、１９ｃのクリック反応による合成
【0309】
【化51】
【0310】
Ｈ－ＰＥＯＺ－プロパルギルアミド２Ｋ（１．０ｇｍ、０．６７ｍｍｏｌ、１当量）を、５０ｍＬの丸底フラスコ中の２５ｍＬのＴＨＦにＤＭＧ－３－アジドプロピオネート（０．４６４ｇｍ、０．７６ｍｍｏｌ、１．１当量）とともに溶解した。溶液を緩慢なアルゴン流下で撹拌した。次いで、ＣｕＩ（７２．４ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ、０．５当量）をフラスコに添加し、次にＴＥＡ（１８５．４μＬ、１．３３ｍｍｏｌ、１．９当量）を添加した。緑色がかった溶液を、アルゴン雰囲気下に油浴中５０℃で終夜撹拌させておいた。反応は、反応混合物の逆相ＨＰＬＣ分析で示されて完了した。溶液を２６．６ｍＬの５０ｍＭ ＨＣｌ（１．３３ｍｍｏｌｅ）及びＴＨＦ（２５ｍＬ）と混合した。溶液をガラスカラムに充填されたＡｍｂｅｒｓｅｐ Ｍ４１９５媒体に通すことによって、溶液中の銅を除去した。カラムをＴＨＦ－２ｍＭ ＨＣｌ（２：１（ｖ／ｖ））で溶離した。溶離液（１５０ｍＬ）を、ＴＨＦが除去されるまで蒸発させた。残留している白色の曇った水溶液にＮａＣｌ（５ｇ）を添加し、ＤＣＭ（４回×５０ｍＬ）で抽出した。ＤＣＭ相を無水硫酸マグネシウム（３ｇ）及び無水硫酸ナトリウム（２０ｇ）で脱水した。濾過して、硫酸マグネシウム及び硫酸ナトリウムを除去した後、濾液をほぼ乾固まで濃縮し、次いで４ｍＬのＤＣＭに再溶解し、次にジエチルエーテル（１６０ｍＬ）中に沈殿させた。濾過した後、沈殿物を回収し、真空中で乾燥し、０．８７ｇのコハク色粉末（ＰＥＯＺ－（トリアゾール－３－プロピオニル－ＤＭＧ）２Ｋ）を得た。逆相ＨＰＬＣによる純度は９９．７％である。
1H NMR (Varian, 500 MHZ, 10 mg/mL DMSO-d6, δ, ppm, TMS): 0.85 (t, 2 × 3H, -C13H24CH3), 1.23 (m, 不十分な分割, 2 × 20H, -(CH2)10-), 1.49 (m, 2 × 2H, -(C=O)CH2CH2-), 2.04 (t, 2 × 2H, -(C=O)CH2-), 2.97 (t, 2H, -トリアゾール-CH2CH2-), 4.10, 4.16 (mm, 2H, -CH2O(C=O)C13H27), 4.28 (d, 2H, -CH2O(C=O)C2H4-トリアゾール), 4.54 (t, 2H, -トリアゾール-CH2-), 5.17 (m, 1H, -(OCH2)2CH-O-), 7.90 (s, 1H, トリアゾール環上の-CH-), 8.51 (t, 不十分な分割, 1H, -(C=O)NH-CH2-トリアゾール-) PEOZ骨格ピークは、0.95(中) (s, 3nH, CH3CH2(C=O)NH-)、2.27 (小) (s, 2nH, -CH2(C=O)NH-)、及び3.35 (大) (s, 4nH, -NCH2CH2N-)にある。
1H NMR (Varian, 500 MHZ, 10 mg/mL DMSO-d6, δ, ppm, TMS): 0.85 (t, 2 × 3H, -C13H24CH3), 1.23 (m, 不十分な分割, 2 × 20H, -(CH2)10-), 1.49 (m, 2 × 2H, -(C=O)CH2CH2-), 2.04 (t, 2 × 2H, -(C=O)CH2-), 2.97 (t, 2H, -トリアゾール-CH2CH2-), 4.10, 4.16 (mm, 2H, -CH2O(C=O)C13H27), 4.28 (d, 2H, -CH2O(C=O)C2H4-トリアゾール), 4.54 (t, 2H, -トリアゾール-CH2-), 5.17 (m, 1H, -(OCH2)2CH-O-), 7.90 (s, 1H, トリアゾール環上の-CH-), 8.51 (t, 不十分な分割, 1H, -(C=O)NH-CH2-トリアゾール-) PEOZ骨格ピークは、0.95(中) (s, 3nH, CH3CH2(C=O)NH-)、2.27 (小) (s, 2nH, -CH2(C=O)NH-)、及び3.35 (大) (s, 4nH, -NCH2CH2N-)にある。
【0311】
実施例２６． 化合物２０ａの合成
【0312】
【化52】
ＰＭＯＺ ２Ｋ酸（１．０８ｇ、０．５００ｍｍｏｌ、１．０当量、Ｍｎ ２１６６Ｄａ）のＤＣＭ（１２ｍＬ）中の溶液に、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロール（０．２８３ｇ、０．５２５ｍｍｏｌ、１．０５当量、９５％）及びＤＭＡＰ（０．００６２ｇ、０．０５０ｍｍｏｌ、０．１当量）を添加した。４５℃で、ＤＣＣ（０．１０８ｇ、０．５２５ｍｍｏｌ、１．０５当量）を添加し、得られた混合物を１時間撹拌させておいた。混合物に追加のＤＭＧ（０．２８３ｇ、０．５２５ｍｍｏｌ、１．０５当量、９５％）及びＤＣＣ（０．１０８ｇ、０．５２５ｍｍｏｌ、１．０５当量）を新たに添加した。４５℃で１６時間撹拌した後、反応混合物を室温に冷却し、シリンジフィルターを使用して濾過し、ロータリーエバポレーターを使用して濃縮した。Ｂｉｏｔａｇｅ（ＳＮＡＰ ｕｌｔｒａ Ｃ１８カラム、ＭｅＣＮ／ＭｅＯＨ）を使用して、残渣を精製して、所望の生成物（０．４０ｇ、収率３０％、純度９９．８％）を得た。
【0313】
ＤＭＧの結合は、普通のポリマー主鎖ピークに加えて、ＤＭＧプロトンを０．８５ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、Ｊ＝６．５ Ｈｚ、－（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、１．２３ｐｐｍ（ｍ、４０Ｈ、－（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、１．５０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＨ２（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、２．７２ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、Ｊ＝６．５ Ｈｚ、－ ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、４．１５ｐｐｍ及び４．２７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ それぞれ、－ＯＣＨ２ＣＨ（Ｏ－）ＣＨ２Ｏ－）、並びに５．１９ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＯＣＨ２ＣＨ（Ｏ－）ＣＨ２Ｏ－）で示す１Ｈ ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ、５００ＭＨｚ、１０ｍｇ／ｍＬ ＤＭＳＯ－ｄ６）スペクトルによって判明した。
【0314】
実施例２７． 化合物２０ｂの合成
【0315】
【化53】
【0316】
ＰＥＯＺ ２Ｋ ＤＭＧエステルの合成
ＰＥＯＺ ２Ｋ酸（０．６６０ｇ、０．３００ｍｍｏｌ、１．０当量、Ｍｎ ２２００Ｄａ）のＤＣＭ（１２ｍＬ）中の溶液に、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロール（０．１７０ｇ、０．３１５ｍｍｏｌ、１．０５当量、９５％）及びＤＭＡＰ（０．００３７ｇ、０．０３０ｍｍｏｌ、０．１当量）を添加した。ＤＣＣ（０．０６５ｇ、０．３１５ｍｍｏｌ、１．０５当量）を添加した後、得られた混合物を１８時間撹拌させておいた。シリンジフィルターを使用して、混合物を濾過し、ロータリーエバポレーターを使用して濃縮した。Ｂｉｏｔａｇｅ（ＳＮＡＰ ｕｌｔｒａ Ｃ１８カラム、ＭｅＣＮ／ＭｅＯＨ）を使用して、残渣を精製して、所望の生成物（０．６２４ｇ、収率７８％、純度＞９９．９％）を得た。
ＰＥＯＺ ２Ｋ酸（０．６６０ｇ、０．３００ｍｍｏｌ、１．０当量、Ｍｎ ２２００Ｄａ）のＤＣＭ（１２ｍＬ）中の溶液に、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロール（０．１７０ｇ、０．３１５ｍｍｏｌ、１．０５当量、９５％）及びＤＭＡＰ（０．００３７ｇ、０．０３０ｍｍｏｌ、０．１当量）を添加した。ＤＣＣ（０．０６５ｇ、０．３１５ｍｍｏｌ、１．０５当量）を添加した後、得られた混合物を１８時間撹拌させておいた。シリンジフィルターを使用して、混合物を濾過し、ロータリーエバポレーターを使用して濃縮した。Ｂｉｏｔａｇｅ（ＳＮＡＰ ｕｌｔｒａ Ｃ１８カラム、ＭｅＣＮ／ＭｅＯＨ）を使用して、残渣を精製して、所望の生成物（０．６２４ｇ、収率７８％、純度＞９９．９％）を得た。
【0317】
ＤＭＧの結合は、普通のポリマー主鎖ピークに加えて、ＤＭＧプロトンを０．８５ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、Ｊ＝６．５ Ｈｚ、－（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、１．２３ｐｐｍ（ｍ、４０Ｈ、－（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、１．５０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＨ２（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、２．７０ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、－ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、４．１５ｐｐｍ及び４．２６ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ それぞれ、－ＯＣＨ２ＣＨ（Ｏ－）ＣＨ２Ｏ－）、及び５．１９ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＯＣＨ２ＣＨ（Ｏ－）ＣＨ２Ｏ－）に示す１Ｈ ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ、５００ＭＨｚ、１０ｍｇ／ｍＬ ＤＭＳＯ－ｄ６）スペクトルによって判明した。
【0318】
実施例２８． 化合物２１の合成
【0319】
【化54】
【0320】
Ｐｔｙｎ－ＰＥＯＺ ２Ｋイソニペコテート（化合物７、０．５００ｇ、０．２７４ｍｍｏｌ、１．０当量、Ｍｎ １８２３Ｄａ）及びＤＭＧ－（２－アジドプロピオネート（０．２７７ｇ、０．４５５ｍｍｏｌ、１．６当量）のＴＨＦ（１５ｍＬ）中の溶液に、ＣｕＩ（０．０４３３ｇ、０．２２７ｍｍｏｌ、０．８３当量）及びＴＥＡ（０．０９５ｍＬ、０．６８２ｍｍｏｌ、２．５当量）を添加した。得られた混合物を室温で５分間撹拌し、次いで５０℃で１８時間撹拌させておき、曇った黄色溶液を得た。室温に冷却した後、０．１Ｎ ＨＣｌ水溶液（８ｍＬ）を添加し、次に５分間撹拌することによって反応混合物をクエンチした。混合物をＤｏｗｅｘ（登録商標） Ｍ４１９５カラムに通し、次いでロータリーエバポレーターを使用して、濾液からＴＨＦを除去した。得られた水溶液を２０ｍＬのジクロロメタンとともに、０．５ｇのＮａＣｌ（水体積の５ｗ／ｖ％）を使用して撹拌した。有機相を回収し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、濃縮した。残渣を５ｍＬのＤＣＭに溶解し、ジエチルエーテル（６０ｍＬ）に添加することによって沈殿させ、濾過し、真空中で乾燥した。得られた淡黄色結晶を、Ｂｉｏｔａｇｅ（ＳＮＡＰ ｕｌｔｒａ Ｃ－１８カラム、アセトニトリル／メタノール）を使用してさらに精製して、ポリマー不純物を除去した。画分５～２１を回収し、濃縮して、所望の生成物（０．１４０ｇ、純度９９．８％で収率２１％）を黄色結晶固体として得た。
【0321】
ＤＭＧ－（２－アジドプロピオネート）の結合は、普通のポリマー主鎖ピークに加えて、ＤＭＧプロトンを０．８４ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、－（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、１．２３ｐｐｍ（ｍ、４０Ｈ、－（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、１．４９ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＨ２（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、１．７２ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、トリアゾール－ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－）、２．２８ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ２）１０ＣＨ３）、４．０８ｐｐｍ、４．２３ｐｐｍ及び４．３３ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＯＣＨ２ＣＨ（Ｏ－）ＣＨ２Ｏ－）、５．１８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＯＣＨ２ＣＨ（Ｏ－）ＣＨ２Ｏ－）、５．５９ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、トリアゾール－ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－）、及び８．００ｐｐｍ（ｓ、１Ｈ、トリアゾール環、「クリック」反応によって得られた）に示す１Ｈ ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ、５００ＭＨｚ、１０ｍｇ／ｍＬ ＤＭＳＯ－ｄ６）によって判明した。
【0322】
実施例２９． 化合物２２の合成
【0323】
【化55】
【0324】
炉乾燥した５００ｍＬの丸底フラスコに、アルゴン雰囲気下で２－エチル－２－オキサゾリン（３０ｇ、３０２．６３ｍｍｏｌ、１９．００当量）、次にＰｈＣｌ（１５０ｍＬ）及び撹拌子を投入した。ＴｆＯＨ（１．４１ｍＬ、１５．９３ｍｍｏｌ、１．００当量）を滴下して加え、混合物を室温で５分間撹拌させておいた。次いで、反応を１１０℃に温め、３５分間撹拌した。次いで、重合混合物を室温に冷却し、ジミリスチルアミン（１３．００グラム、３１．８６ｍｍｏｌ、２．００当量）を添加した。反応混合物を室温で少なくとも１２時間撹拌させておいた。この時間が完了すると、反応混合物をブライン（３００ｍＬ）で希釈し、分液漏斗に移した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２回×１５０ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで脱水し、真空中で濃縮して、２５．６グラムの粗製材料を得た。粗製材料の試料２グラムを、逆相Ｃ１８クロマトグラフィーでアセトニトリル及びメタノールを溶離液として使用して精製して、表題化合物（０．５５グラム）を得た。
1H NMR. 1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, CDCl3) δ 3.42 (CH2CH2骨格); 3.27 (N-CH2); 2.37-2.25 (C(O)-CH2); 1.11 (CH3).脂質部分について追加のシグナルが、δ ２．７４（Ｎ－（ＣＨ２）２）；２．５０（Ｎ－ＣＨ２）；１．６６（ＣＨ２）；１．３５（ＣＨ２）；１．２２（脂質アルキル鎖）；０．８５（ＣＨ３）に存在した。
1H NMR. 1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, CDCl3) δ 3.42 (CH2CH2骨格); 3.27 (N-CH2); 2.37-2.25 (C(O)-CH2); 1.11 (CH3).脂質部分について追加のシグナルが、δ ２．７４（Ｎ－（ＣＨ２）２）；２．５０（Ｎ－ＣＨ２）；１．６６（ＣＨ２）；１．３５（ＣＨ２）；１．２２（脂質アルキル鎖）；０．８５（ＣＨ３）に存在した。
【0325】
実施例３０． 化合物１３の合成
【0326】
【化56】
【0327】
化合物１３を化合物１５Ｂと類似した形で調製した。１．４グラムを単離した。
1H NMR. 1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, CDCl3) δ 3.43 (CH2CH2骨格); 3.24 (N-CH2); 2.8 (S-CH2); 2.32-2.19 (C(O)-CH2); 1.12 (CH3).脂質部分について追加のシグナルが、δ １．４９－１．６５（Ｎ－（ＣＨ２）２）；１．２７（ＣＨ２）；０．８７（ＣＨ３）に存在した。
1H NMR. 1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, CDCl3) δ 3.43 (CH2CH2骨格); 3.24 (N-CH2); 2.8 (S-CH2); 2.32-2.19 (C(O)-CH2); 1.12 (CH3).脂質部分について追加のシグナルが、δ １．４９－１．６５（Ｎ－（ＣＨ２）２）；１．２７（ＣＨ２）；０．８７（ＣＨ３）に存在した。
【0328】
実施例３１． 化合物１４の合成
【0329】
【化57】
【0330】
カルボン酸（２．００グラム、０．９１ｍｍｏｌ、１．００当量）を２５０ｍＬの丸底フラスコに移し、アセトニトリルと共沸させた。このプロセスを繰り返し、残渣を１時間真空乾燥した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）に溶解し、ＨＯＢＴ（０．０５ｇ、０．３６ｍｍｏｌ、０．４当量）、次にジミリスチルアミン（１．１２グラム、２．７３ｍｍｏｌ、３．００当量）、最後にＤＣＣ（０．６グラム、２．７３ｍｍｏｌ、３．００当量）を添加した。反応混合物を少なくとも１２時間撹拌させておき、そこで混合物を濾過し、１６００ｍＬのヘキサンが入っているビーカー中に沈殿させた。固形物を真空濾過によって回収し、真空乾燥した。生成物を逆相Ｃ１８クロマトグラフィーでアセトニトリル及びメタノールを溶離液として使用して精製して、表題化合物（０．４７グラム）を得た。
1H NMR. 1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, CDCl3) δ 3.42 (CH2CH2骨格); 2.93 (N-CH2); 2.39-2.27 (C(O)-CH2); 1.11 (CH3).ピペリジン部分について追加のシグナルが、δ ２．９２（Ｎ－ＣＨ）；１．８３（ＣＨ２）；１．７６（ＣＨ２）；１．７４（ＣＨ２）；１．６３（ＣＨ２）に存在した。脂質部分について追加のシグナルが、δ ３．２５（Ｎ－ＣＨ２）；３．１９（Ｎ－ＣＨ２）；２．０５（ＣＨ２）；１．５２－１．４６（ＣＨ２）；１．２５（脂質アルキル鎖）；０．８６（ＣＨ３）に存在した。
1H NMR. 1H NMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, CDCl3) δ 3.42 (CH2CH2骨格); 2.93 (N-CH2); 2.39-2.27 (C(O)-CH2); 1.11 (CH3).ピペリジン部分について追加のシグナルが、δ ２．９２（Ｎ－ＣＨ）；１．８３（ＣＨ２）；１．７６（ＣＨ２）；１．７４（ＣＨ２）；１．６３（ＣＨ２）に存在した。脂質部分について追加のシグナルが、δ ３．２５（Ｎ－ＣＨ２）；３．１９（Ｎ－ＣＨ２）；２．０５（ＣＨ２）；１．５２－１．４６（ＣＨ２）；１．２５（脂質アルキル鎖）；０．８６（ＣＨ３）に存在した。
【0331】
実施例３２． 化合物２３の合成
【0332】
【化58】
【0333】
化合物２３を化合物１２Ａと類似した形で調製した。この場合、０．１９ｇを単離した。ＨＰＬＣ分析によって、分析純度９３％を決定した。
1HNMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 3.35 (CH2CH2骨格); 2.71 (S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).脂質誘導体部分について追加のシグナルが、δ ５．１９（ＣＨ）；４．２６（ＣＨ２）；１．４９（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．２３（ＣＨ２）；０．８４（ＣＨ３）に存在した。トリアゾール部分について追加のシグナルが、δ ５．４６（エステルＣＨ２）；４．０７（ＨＮ－ＣＨ２）に存在した。
1HNMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 3.35 (CH2CH2骨格); 2.71 (S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).脂質誘導体部分について追加のシグナルが、δ ５．１９（ＣＨ）；４．２６（ＣＨ２）；１．４９（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．２３（ＣＨ２）；０．８４（ＣＨ３）に存在した。トリアゾール部分について追加のシグナルが、δ ５．４６（エステルＣＨ２）；４．０７（ＨＮ－ＣＨ２）に存在した。
【0334】
実施例３３－ Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラデシルアミン（ＤＭＡ）を含む脂質ナノ粒子の調製
１，２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン［ＤＯＴＡＰ］（Ｓｉｇｍａ Ｄ６１８２）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン［ＤＳＰＣ］（Ｂａｃｈｅｍ ４００５６１９）、コレステロールウルトラピュア（ＶＷＲ ０４３３）及び２Ｋポリマー（ＰＥＧ、ＰＭＯＺ又はＰＥＯＺ）コンジュゲートＤＭＡ（以上の実施例で記載）の新鮮な脂質ストック溶液をエタノール中でストック溶液として調製した。最終の脂質混合物ストックが１．３０ｍｇ／ｍＬのＤＯＴＡＰ、０．２８ｍｇ／ｍＬのＤＳＰＣ、０．５９ｍｇ／ｍＬのコレステロール及び０．１９ｍｇ／ｍＬのポリマーＤＭＡを含むように、ストック溶液を混合した。溶液は、２．３８ｍｇ／ｍＬの全脂質を含むものであった。次いで、７０μＬのストック溶液をピペットで１．５ｍＬのＬｏＢｉｎｄ遠心管（エッペンドルフ型０２２４３１０８１）に入れ、スピード真空システム（ＧｅｎｅＶａｃ ＥＺ－２）を使用して、エタノール溶液を蒸発させた。乾燥した試料を、ベントスノーケル下でさらに１０分間乾燥させておいた。乾燥した脂質ミックスを２５０μＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ ４．０）で水和させ、混合し、約１０分間音波処理して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を調製した。
１，２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン［ＤＯＴＡＰ］（Ｓｉｇｍａ Ｄ６１８２）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン［ＤＳＰＣ］（Ｂａｃｈｅｍ ４００５６１９）、コレステロールウルトラピュア（ＶＷＲ ０４３３）及び２Ｋポリマー（ＰＥＧ、ＰＭＯＺ又はＰＥＯＺ）コンジュゲートＤＭＡ（以上の実施例で記載）の新鮮な脂質ストック溶液をエタノール中でストック溶液として調製した。最終の脂質混合物ストックが１．３０ｍｇ／ｍＬのＤＯＴＡＰ、０．２８ｍｇ／ｍＬのＤＳＰＣ、０．５９ｍｇ／ｍＬのコレステロール及び０．１９ｍｇ／ｍＬのポリマーＤＭＡを含むように、ストック溶液を混合した。溶液は、２．３８ｍｇ／ｍＬの全脂質を含むものであった。次いで、７０μＬのストック溶液をピペットで１．５ｍＬのＬｏＢｉｎｄ遠心管（エッペンドルフ型０２２４３１０８１）に入れ、スピード真空システム（ＧｅｎｅＶａｃ ＥＺ－２）を使用して、エタノール溶液を蒸発させた。乾燥した試料を、ベントスノーケル下でさらに１０分間乾燥させておいた。乾燥した脂質ミックスを２５０μＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ ４．０）で水和させ、混合し、約１０分間音波処理して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を調製した。
【0335】
プラスミドＤＮＡ（ｐｈＭＧＦＰ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ６４２１）ストック溶液をクエン酸緩衝液（ｐＨ ４．０）と、１００μＬの濃度０．３４μｇ／μＬと６６．７μＬのクエン酸緩衝液の比で全体積が１６６．７μＬであるように混合した。１０μｇのＤＮＡを含むプラスミド溶液の一定分量５０μＬを、２５０μＬの脂質ナノ粒子混合物に添加し、ピペット混合し、１分未満音波処理して、半透明様懸濁液を得た。チューブを１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心した（エッペンドルフ型マイクロ遠心機）。上澄み約３００μＬをＬＮＰペレットから分け、１．２％アガロースゲル及びＱｕｂｉｔ定量を使用して、いずれか残留ＤＮＡについてアッセイした。結果は、上澄み中にＤＮＡが存在していないことを示し、完全なカプセル化が示唆された。
【0336】
ペレットを３００μＬの５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．４０）に再懸濁し、ピペットチップで２分間よく混合した。各ポリマーＤＭＡ製剤のＤＮＡカプセル化を検証するために、一定分量のＬＮＰ懸濁液をＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で溶解した。最初に、１０％ Ｔｒｉｔｏｎストック溶液をＨＥＰＥＳ緩衝液中で作製した。この溶液３μＬをＬＮＰ懸濁液２７μＬに、最終体積が３０μＬであり、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００界面活性剤の濃度が１％であるように添加した。懸濁液を２分間ボルテックスで混合し、４℃で終夜放置した。１．２％アガロースゲル及びＱｕｂｉｔ定量を使用して、混合物をいずれかの残留ＤＮＡについてアッセイした。結果は、混合物中のＤＮＡの濃度が高いことを示し、各ＬＮＰ製剤のカプセル化効率が＞９０％であることが示唆された。懸濁液は、０．２２及び０．１μｍのＰＶＤＦ低タンパク質結合３３ｍｍ－シリンジフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ－Ｗ及びＭｉｌｌｅｘ－ＧＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を通して容易に濾過される。
【0337】
実施例３４－ １，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール（ＤＭＧ）を含む脂質ナノ粒子の調製
１，２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン［ＤＯＴＡＰ］（Ｓｉｇｍａ Ｄ６１８２）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン［ＤＳＰＣ］（Ｂａｃｈｅｍ ４００５６１９）、コレステロールウルトラピュア（ＶＷＲ ０４３３）並びに２Ｋ及び５Ｋポリマー（ＰＥＧ、ＰＭＯＺ又はＰＥＯＺ）コンジュゲートＤＭＧ（以上の実施例で記載）の新鮮な脂質ストック溶液をエタノール中でストック溶液として調製した。最終の脂質混合物ストックが１．４８ｍｇ／ｍＬのＤＯＴＡＰ、０．２８ｍｇ／ｍＬのＤＳＰＣ、０．５７ｍｇ／ｍＬのコレステロール及び０．１５ｍｇ／ｍＬの２ＫポリマーＤＭＧを含むように、ストック溶液を混合した。溶液は、２．４９ｍｇ／ｍＬの全脂質を含むものであった。５ＫポリマーＤＭＧコンジュゲートが選択されたとき、濃度は０．３２ｍｇ／ｍＬであり、溶液は、２．６７ｍｇ／ｍＬの全脂質を含むものであった。次いで、６２μＬのストック溶液をピペットで１．５ｍＬのＬｏＢｉｎｄ遠心管（エッペンドルフ型 ０２２４３１０８１）に入れ、スピード真空システム（ＧｅｎｅＶａｃ ＥＺ－２）を使用して、エタノール溶液を蒸発させた。乾燥した試料をベントスノーケル下でさらに１０分間乾燥させておいた。乾燥した脂質ミックスを２７５μＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ ４．０）で水和させ、混合し、約１０分間音波処理して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を調製した。
１，２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン［ＤＯＴＡＰ］（Ｓｉｇｍａ Ｄ６１８２）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン［ＤＳＰＣ］（Ｂａｃｈｅｍ ４００５６１９）、コレステロールウルトラピュア（ＶＷＲ ０４３３）並びに２Ｋ及び５Ｋポリマー（ＰＥＧ、ＰＭＯＺ又はＰＥＯＺ）コンジュゲートＤＭＧ（以上の実施例で記載）の新鮮な脂質ストック溶液をエタノール中でストック溶液として調製した。最終の脂質混合物ストックが１．４８ｍｇ／ｍＬのＤＯＴＡＰ、０．２８ｍｇ／ｍＬのＤＳＰＣ、０．５７ｍｇ／ｍＬのコレステロール及び０．１５ｍｇ／ｍＬの２ＫポリマーＤＭＧを含むように、ストック溶液を混合した。溶液は、２．４９ｍｇ／ｍＬの全脂質を含むものであった。５ＫポリマーＤＭＧコンジュゲートが選択されたとき、濃度は０．３２ｍｇ／ｍＬであり、溶液は、２．６７ｍｇ／ｍＬの全脂質を含むものであった。次いで、６２μＬのストック溶液をピペットで１．５ｍＬのＬｏＢｉｎｄ遠心管（エッペンドルフ型 ０２２４３１０８１）に入れ、スピード真空システム（ＧｅｎｅＶａｃ ＥＺ－２）を使用して、エタノール溶液を蒸発させた。乾燥した試料をベントスノーケル下でさらに１０分間乾燥させておいた。乾燥した脂質ミックスを２７５μＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ ４．０）で水和させ、混合し、約１０分間音波処理して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を調製した。
【0338】
プラスミドＤＮＡ（ｐｈＭＧＦＰ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ６４２１）ストック溶液をクエン酸緩衝液（ｐＨ ４．０）と、８０μＬの濃度２．７μｇ／μＬと１９０μＬのクエン酸緩衝液の比で全体積が２７０μＬであるように混合した。２０μｇのＤＮＡを含むプラスミド溶液の一定分量２５μＬを、２７５μＬの脂質ナノ粒子混合物に添加し、ピペット混合し、１分未満音波処理して、半透明様懸濁液を得た。チューブを１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心した（エッペンドルフ型マイクロ遠心機）。上澄み約３００μＬをＬＮＰペレットから分け、１．２％アガロースゲル及びＱｕｂｉｔ定量を使用して、いずれか残留ＤＮＡについてアッセイした。結果は、上澄み中にＤＮＡが存在していないことを示し、完全なカプセル化が示唆された。
【0339】
ペレットを３００μＬの５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．４０）に再懸濁し、ピペットチップで２分間よく混合した。各ポリマーＤＭＡ製剤のＤＮＡカプセル化を検証するために、一定分量のＬＮＰ懸濁液をＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で溶解した。最初に、１０％ Ｔｒｉｔｏｎストック溶液をＨＥＰＥＳ緩衝液中で作製した。この溶液３μＬをＬＮＰ懸濁液２７μＬに、最終体積が３０μＬであり、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００界面活性剤の濃度が１％であるように添加した。懸濁液を２分間ボルテックスで混合し、４℃で終夜放置した。１．２％アガロースゲル及びＱｕｂｉｔ定量を使用して、混合物をいずれか残留ＤＮＡについてアッセイした。結果は、混合物中のＤＮＡの濃度が高いことを示し、各ＬＮＰ製剤のカプセル化効率が＞９０％であることが示唆された。懸濁液は、０．２２及び０．１μｍのＰＶＤＦ低タンパク質結合３３ｍｍ－シリンジフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ－Ｗ及びＭｉｌｌｅｘ－ＧＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を通して容易に濾過される。
【0340】
別の実験では、遠心されたペレットを、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム及びスクロースを含む緩衝液（ｐＨ ７．４）に再懸濁した。懸濁液を凍結乾燥して、均一で安定な乾燥ケークを得た。それを注射用水中で容易に復元した。
【0341】
実施例３５． ＬＮＰから、ＨＥＫ－２９３細胞でのＤＮＡのトランスフェクション
ＨＥＫ－２９３は、トランスフェクション研究の細胞生物学においてよく使用されるヒト胎児腎臓細胞系である。細胞は、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ－１５７３）から供給され、＞８５％のトランスフェクション効率を有することが実証された。研究プロトコルにおいて、低継代（＜５）細胞は、トランスフェクションより２４時間前に、アッセイプレートに１ウェル当たり１００μＬの抗生物質不含培地（ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中細胞２０，０００個という密度で播種される。トランスフェクションの直前に、完全培地交換が行われ、新鮮な１００μＬの抗生物質不含培地（ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を各ウェルに添加する。
ＨＥＫ－２９３は、トランスフェクション研究の細胞生物学においてよく使用されるヒト胎児腎臓細胞系である。細胞は、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ－１５７３）から供給され、＞８５％のトランスフェクション効率を有することが実証された。研究プロトコルにおいて、低継代（＜５）細胞は、トランスフェクションより２４時間前に、アッセイプレートに１ウェル当たり１００μＬの抗生物質不含培地（ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中細胞２０，０００個という密度で播種される。トランスフェクションの直前に、完全培地交換が行われ、新鮮な１００μＬの抗生物質不含培地（ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を各ウェルに添加する。
【0342】
ポリマーＤＭＡ脂質を含む調製されたＬＮＰ及びカプセル化されたプラスミドＤＮＡを各ウェルに２．６～２０．８μＬの体積で添加して、１ウェル当たり５０～４５０ｎｇのＤＮＡ ｐｈＭＧＦＰを送達する。
【0343】
陽性対照は、３：１の比のＦｕＧＥＮＥ－ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ３２１１）とＤＮＡである。ＤＮＡ溶液は、無血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ）に希釈する。９６ウェルのＰＣＲプレートで、両溶液を３：１の比（１ウェル当たり０．３μＬの試薬対１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ）で混合することを３回繰り返し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭを７．３３μＬの体積に添加する。プレートを室温で２５分間インキュベートする。７．３３μＬのＤＮＡ／トランスフェクション混合物を各ウェル中の細胞に添加する。
【0344】
供給された蓋でプレートを覆い、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ＲＨのインキュベータに入れる。それらを２４～４８時間インキュベートする。タイムポイントのそれぞれにおいて、プレートをＥｖｏｓ顕微鏡で読み取る。すべてのＧＦＰフィルター写真を４倍で読み取り、すべての透過光写真を１０倍で読み取る。ＧＦＰ蛍光を発した細胞の数を以下に表１で示す。透過光写真は、すべてのポリマーＤＭＡ脂質製剤について試験された最高濃度でいくつかの病的細胞を示した。特に、ＰＥＧ ＤＭＡ脂質については、ＧＦＰ蛍光を発した細胞が最多であった。
【0345】
【表1】
【0346】
４８時間のタイムポイントで、蛍光は高く、観察では、蛍光を発した細胞３０～３５％（陽性対照）；１０％（ＰＭＯＺ ＤＭＡ脂質では、４６６ｎｇ ＤＮＡ）；１０％（ＰＥＯＺ ＤＭＡ脂質では、３５０ｎｇ ＤＮＡ）；及び５％（ＰＥＧ ＤＭＡ脂質では、４５０ｎｇ ＤＮＡ）で、細胞死最多であった。
【0347】
実施例３６． ＬＮＰから、ＨｅｐＧ２細胞でのＤＮＡのトランスフェクション
ＨｅｐＧ２は、トランスフェクション研究においてよく使用されるヒト肝細胞癌細胞系である。細胞は、ＡＴＣＣ（ＨＢ－８０６５）から供給され、９５％という高いトランスフェクション効率を有することが実証された。研究プロトコルにおいて、低継代（＜５）細胞は、トランスフェクションより２４時間前に、アッセイプレートに１ウェル当たり１００μＬの抗生物質不含培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中細胞４０，０００個という密度で播種される。トランスフェクションの直前に、完全培地交換が行われ、新鮮な１００μＬの抗生物質不含培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を各ウェルに添加する。
ＨｅｐＧ２は、トランスフェクション研究においてよく使用されるヒト肝細胞癌細胞系である。細胞は、ＡＴＣＣ（ＨＢ－８０６５）から供給され、９５％という高いトランスフェクション効率を有することが実証された。研究プロトコルにおいて、低継代（＜５）細胞は、トランスフェクションより２４時間前に、アッセイプレートに１ウェル当たり１００μＬの抗生物質不含培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中細胞４０，０００個という密度で播種される。トランスフェクションの直前に、完全培地交換が行われ、新鮮な１００μＬの抗生物質不含培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を各ウェルに添加する。
【0348】
ポリマーＤＭＧ脂質を含む調製されたＬＮＰ及びカプセル化されたプラスミドＤＮＡを各ウェルに１．９～１１．７μＬの体積で添加して、１ウェル当たり１００～１０００ｎｇのＤＮＡ ｐｈＭＧＦＰを送達する。
【0349】
陽性対照は、３：１の比のＦｕＧＥＮＥ－ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ３２１１）とＤＮＡである。ＤＮＡ溶液は、無血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ）に希釈する。９６ウェルのＰＣＲプレートで、両溶液を３：１の比（１ウェル当たり０．３μＬの試薬対１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ）で混合することを３回繰り返し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭを７．３３μＬの体積に添加する。プレートを室温で２５分間インキュベートする。７．３３μＬのＤＮＡ／トランスフェクション混合物を各ウェル中の細胞に添加する。
【0350】
供給された蓋でプレートを覆い、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ＲＨのインキュベータに入れる。それらを、４８～７２時間インキュベートする。タイムポイントのそれぞれにおいて、プレートをＥｖｏｓ顕微鏡で読み取る。すべてのＧＦＰフィルター写真を４倍で読み取り、すべての透過光写真を１０倍で読み取る。ＧＦＰ蛍光を発した細胞の数を以下に表２で示す。透過光写真は、細胞毒性の徴候を示さなかった。
【0351】
【表2】
【0352】
実施例３７． ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの加水分解速度論
本開示のいくつかのＰＯＺ－脂質コンジュゲートの加水分解速度は、リン酸－生理食塩水緩衝液、ｐＨ ７．４（ＰＢＳ）並びにＰＢＳに希釈された１００％又は５０％のラット及びヒト血漿を含む生物学的培地において決定した。ＰＯＺ－脂質試料を正確に秤量し、ＰＢＳに溶解して、ストック溶液を調製した。これらの溶液をＰＢＳ又はラット若しくはヒト血漿の培地に加え、３７℃でインキュベートさせておいた。試料を加水分解培地からさまざまな時間間隔で除去し、冷却したメタノール中０．２％ギ酸を添加することによってクエンチした。試料を遠心し、上澄みを水中０．１％ギ酸に移し入れ、次いで高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で逆相カラム（３００ＳＢ Ｃ３）並びに移動相として水中０．１％ギ酸アンモニウム及びメタノール中０．１％ギ酸アンモニウムの勾配流を使用して、試料を分析した。ＰＯＺ－脂質コンジュゲートを、２１０ｎｍにおけるＵＶ吸収により検出し、その崩壊及び分解代謝物を検出し、次に質量分析を行った。５０％のＰＯＺ－脂質が分解するのにかかる時間は、濃度－時間曲線から外挿し、以下に表３で報告する。
本開示のいくつかのＰＯＺ－脂質コンジュゲートの加水分解速度は、リン酸－生理食塩水緩衝液、ｐＨ ７．４（ＰＢＳ）並びにＰＢＳに希釈された１００％又は５０％のラット及びヒト血漿を含む生物学的培地において決定した。ＰＯＺ－脂質試料を正確に秤量し、ＰＢＳに溶解して、ストック溶液を調製した。これらの溶液をＰＢＳ又はラット若しくはヒト血漿の培地に加え、３７℃でインキュベートさせておいた。試料を加水分解培地からさまざまな時間間隔で除去し、冷却したメタノール中０．２％ギ酸を添加することによってクエンチした。試料を遠心し、上澄みを水中０．１％ギ酸に移し入れ、次いで高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で逆相カラム（３００ＳＢ Ｃ３）並びに移動相として水中０．１％ギ酸アンモニウム及びメタノール中０．１％ギ酸アンモニウムの勾配流を使用して、試料を分析した。ＰＯＺ－脂質コンジュゲートを、２１０ｎｍにおけるＵＶ吸収により検出し、その崩壊及び分解代謝物を検出し、次に質量分析を行った。５０％のＰＯＺ－脂質が分解するのにかかる時間は、濃度－時間曲線から外挿し、以下に表３で報告する。
【0353】
【表3】
【0354】
結果は、エステルリンケージを有する化合物（化合物１９ａ、１９ｂ、１９ｃ、２０ａ及び２０ｂ）が、血漿中で、エーテルリンケージを有する化合物（化合物１７ａ、１７ｂ及び１７ｃ）より高速で加水分解したことを示す。
【0355】
実施例３８． ポリマー脂質コンジュゲートのアミダーゼ加水分解
この実験の目的は、ＰＢＳ、ラット血漿、又はヒト血漿（上記の実施例）中で明らかな反応（加水分解）を示さなかったさまざまなポリマー脂質コンジュゲートが、リポ－アミダーゼ酵素の存在下で反応するかどうかを決定することであった。化合物１３、１５ａ、及び１５ｂは、ＰＯＺと脂質の間にアミドリンケージを有する。化合物２２は、アミンリンケージを有する。ＰＯＺ－脂質試料を正確に秤量し、ＰＢＳに溶解して、ストック溶液を調製した。選択されたアミダーゼは、Ｂｉｏ－Ｖｉｓｉｏｎ社から供給された、≧９ｍＵ／ｍｇの比活性を有する「脂肪酸アミドヒドロラーゼ１、活性ヒト組換え（ＦＡＡＨ１）」であった。アミダーゼは、ＰＢＳ ｐＨ ８．０をアミダーゼの各バイアルに添加し、穏やかに混合し、３７℃の水浴に２時間入れることによって活性化した。アミダーゼ溶液の濃度は約２μｇ／μＬであった。一定分量のＰＯＺ－脂質ストック溶液を、活性化したリポ－アミダーゼ溶液に添加し、穏やかに混合し、３７℃で終夜インキュベートさせておいた。終夜加水分解した後、メタノールを添加し、試料を遠心し、上澄みをＨＰＬＣバイアルに移した。試料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で逆相カラム（３００ＳＢ Ｃ３）並びに移動相として水中０．１％ギ酸アンモニウム及びメタノール中０．１％ギ酸アンモニウムの勾配流を使用して分析した。ポリマー脂質コンジュゲートのピーク面積は、２１０ｎｍにおけるＵＶ吸収により測定した。初期及び終夜のアミダーゼインキュベーションにおけるピーク面積を比較し、その結果を以下に表４で示す。
この実験の目的は、ＰＢＳ、ラット血漿、又はヒト血漿（上記の実施例）中で明らかな反応（加水分解）を示さなかったさまざまなポリマー脂質コンジュゲートが、リポ－アミダーゼ酵素の存在下で反応するかどうかを決定することであった。化合物１３、１５ａ、及び１５ｂは、ＰＯＺと脂質の間にアミドリンケージを有する。化合物２２は、アミンリンケージを有する。ＰＯＺ－脂質試料を正確に秤量し、ＰＢＳに溶解して、ストック溶液を調製した。選択されたアミダーゼは、Ｂｉｏ－Ｖｉｓｉｏｎ社から供給された、≧９ｍＵ／ｍｇの比活性を有する「脂肪酸アミドヒドロラーゼ１、活性ヒト組換え（ＦＡＡＨ１）」であった。アミダーゼは、ＰＢＳ ｐＨ ８．０をアミダーゼの各バイアルに添加し、穏やかに混合し、３７℃の水浴に２時間入れることによって活性化した。アミダーゼ溶液の濃度は約２μｇ／μＬであった。一定分量のＰＯＺ－脂質ストック溶液を、活性化したリポ－アミダーゼ溶液に添加し、穏やかに混合し、３７℃で終夜インキュベートさせておいた。終夜加水分解した後、メタノールを添加し、試料を遠心し、上澄みをＨＰＬＣバイアルに移した。試料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で逆相カラム（３００ＳＢ Ｃ３）並びに移動相として水中０．１％ギ酸アンモニウム及びメタノール中０．１％ギ酸アンモニウムの勾配流を使用して分析した。ポリマー脂質コンジュゲートのピーク面積は、２１０ｎｍにおけるＵＶ吸収により測定した。初期及び終夜のアミダーゼインキュベーションにおけるピーク面積を比較し、その結果を以下に表４で示す。
【0356】
【表4】
【0357】
結果は、アミドリンケージを有する化合物（化合物１５ａ、１５ｂ、及び１３）が、終夜加水分解後のＰＯＺ－ＤＭＡピーク面積の低下、すなわち３０～５０％の変化で観察されたように、リポ－アミダーゼ酵素によって影響を受けたことを示す。対照的に、アミンリンケージを有する化合物２２は、ピーク面積のわずかな減少を示したが、それは有意ではなく、実験条件の誤差の範囲内、すなわち±１０％であった。
【0358】
実施例３９． 化合物２４の合成
ステップ１．
ステップ１．
【0359】
【化59】
【0360】
ＰＥＯＺ ２Ｋ（１．２１ｐ）ＮＨＳエステルは、前に記載されたのと類似した形で調製した。
1H NMR. HNMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02 (S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).ＮＨＳ部分について追加のシグナルが、δ ２．８１（（ＣＨ２）２）に存在した。アルキン部分のＣＨ２シグナルが、δ １．６３ｐｐｍに検出された。
1H NMR. HNMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02 (S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).ＮＨＳ部分について追加のシグナルが、δ ２．８１（（ＣＨ２）２）に存在した。アルキン部分のＣＨ２シグナルが、δ １．６３ｐｐｍに検出された。
【0361】
ステップ２．
【0362】
【化60】
【0363】
ＰＥＯＺ ２Ｋ（１．２１ｐ）エタノールアミングリセロールアミドは、前に記載されたのと類似した形で調製した。
1H NMR. HNMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96 (CH3).アルキン部分のＣＨ２シグナルが、δ １．６３ｐｐｍに検出された。ジオール部分について追加のシグナルが、δ ４．５６（ＣＨ２）；４．５３（ＣＨ）に存在した。
1H NMR. HNMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96 (CH3).アルキン部分のＣＨ２シグナルが、δ １．６３ｐｐｍに検出された。ジオール部分について追加のシグナルが、δ ４．５６（ＣＨ２）；４．５３（ＣＨ）に存在した。
【0364】
ステップ３．
【0365】
【化61】
【0366】
ＰＥＯＺ ２Ｋ（１．２１ｐ） ＤＭＧは、前に記載されたのと類似した形で調製した。
1H NMR. HNMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).脂質誘導体部分について追加のシグナルが、δ ５．２０（ＣＨ）；４．２６（ＣＨ２）；１．４９（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．２３（ＣＨ２）；０．８４（ＣＨ３）に存在した。アルキン部分のＣＨ２シグナルが、δ １．６３ｐｐｍに検出された。
1H NMR. HNMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).脂質誘導体部分について追加のシグナルが、δ ５．２０（ＣＨ）；４．２６（ＣＨ２）；１．４９（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．２３（ＣＨ２）；０．８４（ＣＨ３）に存在した。アルキン部分のＣＨ２シグナルが、δ １．６３ｐｐｍに検出された。
【0367】
ステップ４．
【0368】
【化62】
【0369】
ＰＥＯＺ ２Ｋ（１．２１ｐ）ＤＭＧ（３－アジドプロピオネート）、化合物２４は、前に記載されたのと類似した形で調製した。
1H NMR. HNMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).脂質誘導体部分について追加のシグナルが、δ ５．２０（ＣＨ）；４．２６（ＣＨ２）；１．４９（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．２３（ＣＨ２）；０．８４（ＣＨ３）に存在した。トリアゾール部分について追加のシグナルが、δ ７．７８（トリアゾールＣＨ）；４．５４（エステルＣＨ２）に存在した。
1H NMR. HNMR分析はPEOZの標準的骨格シグナルを示した (500 MHz, DMSO) δ 7.82 末端NH); 3.35 (CH2CH2骨格); 3.18 (N-CH2); 3.02(S-CH2); 2.32-2.27 (C(O)-CH2); 0.96(CH3).脂質誘導体部分について追加のシグナルが、δ ５．２０（ＣＨ）；４．２６（ＣＨ２）；１．４９（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．２３（ＣＨ２）；０．８４（ＣＨ３）に存在した。トリアゾール部分について追加のシグナルが、δ ７．７８（トリアゾールＣＨ）；４．５４（エステルＣＨ２）に存在した。
【0370】
本明細書に記載された及び特許請求されたＰＯＺ－脂質、ＬＮＰ、及び医薬組成物は、本明細書に開示されている具体的な実施形態によって範囲が限定されるべきでない。というのは、これらの実施形態は、本開示のいくつかの態様の例示として意図されているからである。いかなる均等な実施形態も、本開示の範囲内であるように意図される。実際、本明細書に示され、記載されたものに加えて、式及び構造のさまざまな修正形態が、上記の説明から当業者には明らかになるであろう。そのような修正形態も、添付の特許請求の範囲内に入るように意図される。上記の本文に引用される特許及び特許出願はすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込まれる。本明細書におけるいかなる項目見出しも、構造的序列を規定する３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． § １．７７又はその他の方法の示唆との一貫性のために記載されているにすぎない。これらの見出しは、本明細書に記載された本発明を限定も特徴付けもしてはならない。
【図1】
【国際調査報告】