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特表2024-505806遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５を改造してＬ－グルタミン酸を生産する組換え菌株及びその構築方法と応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-08
(54)【発明の名称】遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５を改造してＬ－グルタミン酸を生産する組換え菌株及びその構築方法と応用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20240201BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240201BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240201BHJP
C12P 13/14 20060101ALI20240201BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240201BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240201BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240201BHJP
C07K 14/195 20060101ALI20240201BHJP
C07K 14/34 20060101ALN20240201BHJP
C07K 14/345 20060101ALN20240201BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31
C12N1/21 ZNA
C12N15/63 Z
C12P13/14
C12N1/15
C12N1/19
C12N5/10
C07K14/195
C07K14/34
C07K14/345
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023540088
(86)(22)【出願日】2021-12-28
(85)【翻訳文提出日】2023-08-28
(86)【国際出願番号】 CN2021141993
(87)【国際公開番号】W WO2022143639
(87)【国際公開日】2022-07-07
(31)【優先権主張番号】202011631250.7
(32)【優先日】2020-12-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515213652
【氏名又は名称】ニンシャー エッペン バイオテック カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(72)【発明者】
【氏名】ウェイ，アイイン
(72)【発明者】
【氏名】モン，ガン
(72)【発明者】
【氏名】ヂャオ，チュングァン
(72)【発明者】
【氏名】ジャ，フゥイピン
(72)【発明者】
【氏名】スー，ホウブォ
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，リーポン
(72)【発明者】
【氏名】グオ，シァオウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ティエン，ビン
(72)【発明者】
【氏名】マー，フォンヨン
(72)【発明者】
【氏名】ヂョウ，シァオチュン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AE19
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA10
4B065AA22X
4B065AA22Y
4B065AA24X
4B065AA24Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BA25
4B065BC01
4B065CA17
4B065CA41
4B065CA44
4H045AA20
4H045BA10
4H045CA11
4H045EA01
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５を改造してＬ－グルタミン酸を生産する組換え菌株及びその構築方法と応用を開示する。この組換え菌株は、Ｌ－グルタミン酸を生産する細菌であり、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドの発現が改善されることを有する。この改善された発現は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有し且つ発現が増強されていることであってもよい。本発明では、ＢＢＤ２９＿１１２６６５遺伝子配列の７０番目の塩基がグアニンからアデニンに変異し、コードされた対応するアミノ酸配列の２４番目のアラニンがトレオニンで置換される遺伝子工学菌、及びＢＢＤ２９＿１１２６６５遺伝子またはＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を過剰発現させる工学菌を構築する。この細菌はＬ－グルタミン酸の生産量と転化率を高めるのに役立つ。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｌ－グルタミン酸生産細菌であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドの発現が改善されており、好ましくは、前記改善された発現は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドの発現が増強されていること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有していること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有し且つ発現が増強されていることである、ことを特徴とするＬ－グルタミン酸生産細菌。
【請求項2】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの点変異により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列の２４番目のアラニンは、異なるアミノ酸で置換され、好ましくは、２４番目のアラニンは、トレオニンで置換される、ことを特徴とする請求項１に記載の細菌。
【請求項3】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項4】
前記点変異を有するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の７０番目の塩基の変異により形成され、好ましくは、前記変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の７０番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異を含み、
好ましくは、点変異を有するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項5】
前記細菌は、コリネバクテリウム属細菌であり、好ましくは、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ペキネンシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｋｉｎｅｎｓｅ）、ブレビバクテリウム・サッカロリチカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・チオゲニタイス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ）であり、さらに好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０又はＡＴＣＣ １３８６９である、ことを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項6】
ポリヌクレオチド配列であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドをコードすることを含み、ここで、２４番目のアラニンは、異なるアミノ酸で置換され、好ましくは、２４番目のアラニンは、トレオニンで置換され、好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：４に示されるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドをコードすることを含み、
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の７０番目の塩基の変異により形成され、好ましくは、前記変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の７０番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異であり、
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とするポリヌクレオチド配列。
【請求項7】
前記配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：４に示される、ことを特徴とするアミノ酸配列。
【請求項8】
請求項６に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする組換えベクター。
【請求項9】
請求項６に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする組換え菌株。
【請求項10】
請求項１～５のいずれか１項に記載の細菌を培養し、前記培養物からＬ－グルタミン酸を回収することを含む、Ｌ－グルタミン酸の生産方法。
【請求項11】
前記タンパク質は、Ａ１）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４であるタンパク質と、
Ａ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示されるアミノ酸配列を、アミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られた、Ａ１）に示されるタンパク質と８０％以上の同一性を有し且つ同じ機能を有するタンパク質と、
Ａ３）Ａ１）又はＡ２）のＮ端及び／又はＣ端にタグを連結して得られた、同じ機能を有する融合タンパク質とのうちのいずれか一つである、ことを特徴とするタンパク質。
【請求項12】
前記核酸分子は、Ｂ１）請求項１１に記載のタンパク質をコードする核酸分子と、
Ｂ２）コード配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子と、
Ｂ３）ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子とのうちのいずれか一つである、ことを特徴とする核酸分子。
【請求項13】
前記生体材料は、Ｃ１）請求項１２に記載の核酸分子を含む発現カセットと、
Ｃ２）請求項１２に記載の核酸分子を含む組換えベクター、又はＣ１）に記載の発現カセットを含む組換えベクターと、
Ｃ３）請求項１２に記載の核酸分子を含む組換え微生物、又はＣ１）に記載の発現カセットを含む組換え微生物、又はＣ２）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物とのうちのいずれか一つである、ことを特徴とする生物材料。
【請求項14】
Ｆ１）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの微生物のＬ－グルタミン酸の生産量の制御における応用と、Ｆ２）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つのＬ－グルタミン酸生産の遺伝子工学的菌の構築における応用と、
Ｆ３）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つのＬ－グルタミン酸の製造における応用とのうちのいずれか一つにおけるＤ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの応用であって、
ここで、前記Ｄ１）～Ｄ８）は、
Ｄ１）請求項１１に記載のタンパク質、
Ｄ２）請求項１２に記載の核酸分子、
Ｄ３）請求項１３に記載の生物材料、
Ｄ４）ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるＤＮＡ分子、
Ｄ５）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるヌクレオチド配列を、修飾及び／又は一つ又は複数のヌクレオチドの置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られた、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子と９０％以上の同一性を有し、且つ同じ機能を有するＤＮＡ分子、
Ｄ６）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む発現カセット、
Ｄ７）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む組換えベクター、又はＤ６）に記載の発現カセットを含む組換えベクター、
Ｄ８）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む組換え微生物、又はＤ６）に記載の発現カセットを含む組換え微生物、又はＤ７）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物である、Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの応用。
【請求項15】
微生物におけるＬ－グルタミン酸の生産量を向上させる方法であって、Ｅ１）目的微生物における請求項１２に記載の核酸分子の発現量又は、含有量を向上させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることと、
Ｅ２）目的微生物における請求項１４におけるＤ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子の発現量又は、含有量を向上させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることと、
Ｅ３）前記目的微生物におけるヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるＤＮＡ分子を変異させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることとのうちのいずれか一つを含む、ことを特徴とする微生物におけるＬ－グルタミン酸の生産量を向上させる方法。
【請求項16】
前記変異は、点変異である、ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記点変異は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子がコードするアミノ酸配列の２４番目のアラニン残基を別のアミノ酸残基に変異することである、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記点変異は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子がコードするアミノ酸配列の２４番目のアラニンをトレオニンに変異させ、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４である変異タンパク質を得ることである、ことを特徴とする請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項19】
請求項１３又は１４に記載の組換え微生物を構築する方法であって、Ｆ１）請求項１２に記載の核酸分子を目的微生物に導入し、前記組換え微生物を得ることと、
Ｆ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子を目的微生物に導入し、前記組換え微生物を得ることと、
Ｆ３）遺伝子編集手段を用いてＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子を編集し、目的微生物にＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子を含ませることとのうちの少なくともいずれか一つを含む、ことを特徴とする請求項１３又は１４に記載の組換え微生物を構築する方法。
【請求項20】
請求項１３又は１４に記載の組換え微生物を用いてＬ－グルタミン酸を生産することを含む、ことを特徴とするＬ－グルタミン酸の製造方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子工学と微生物技術分野に属し、具体的にＬ－グルタミン酸を生産する組換え菌株及びその構築方法と応用に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｌ－グルタミン酸は、重要なアミノ酸であり、食品、臨床薬物及びその他の方面に応用されている。従来、Ｌ－グルタミン酸は、主として発酵によりブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属等の菌属に属するＬ－グルタミン酸を生産する細菌又はその変異体を用いて生産した。
【0003】
Ｌ－グルタミン酸は、微生物細胞内クエン酸循環の中間生成物であるα－ケトグルタル酸から生物合成される。α－ケトグルタル酸からアンモニウムイオンの同化作用によりＬ－グルタミン酸を形成する生物合成経路は、２つある。そのうちの１つの経路は、高濃度のアンモニウムイオンが存在する場合、グルタミン酸脱水素酵素（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＧＤＨ）の触媒によりＬ－グルタミン酸を合成することである。もう１つの経路（ＧＳ／ＧＯＧＡＴ経路）は、グルタミン合成酵素及びグルタミン－ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼによりＬ－グルタミン酸を合成することである。グルタミン合成酵素（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳ）は、Ｌ－グルタミン酸とアンモニウムイオンをグルタミンに形質転換する反応を触媒し、グルタミン－ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ－ｏｘｏｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄ ａｍｉｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、「グルタミン酸合成酵素」（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＧＯＧＡＴ）とも呼ばれ、Ｌ－グルタミン酸合成反応を触媒し、該反応において、既にＧＳにより合成された１分子のグルタミンと１分子のα－ケトグルタル酸分子から２分子のＬ－グルタミン酸を合成する。
【0004】
発酵法によるＬ－アミノ酸生産の改良は、発酵技術、例えば攪拌と酸素供給などに関してもよく、又は栄養培地の組成、例えば発酵中の糖濃度に関し、又は発酵液を適切な製品形態に加工することに関し、例えば乾燥と造粒発酵液又はイオン交換クロマトグラフィーにより、又は関連する微生物自体の固有性能特性に関してもよい。
【0005】
これらの微生物の性能特性を改善するための方法は、変異誘導、変異体の選択とスクリーニングを含む。このようにして得られた菌株は、代謝物に対して耐性を有するか、または調節的に重要な代謝物に対して栄養欠損型であり、Ｌ－アミノ酸等を産生する。
【0006】
Ｌ－グルタミン酸の生産能力を向上させる方法は、すでに大量にあるが、日増しに増加する需要を満たすために、Ｌ－グルタミン酸の生産方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【0007】
本発明の目的は、細菌のＬ－グルタミン酸生産能力を改善するための新技術を開発することにより、有効なＬ－グルタミン酸の生産方法を提供することである。
【0008】
上記目的を実現するために、本発明の発明者らは、細菌における遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５又はその相同遺伝子を、前記遺伝子を修飾するか又はその発現を改善することにより、細菌のＬ－グルタミン酸生産能力を改善できることを研究によって発見した。これらの発見に基づいて、本発明を完了した。
【0009】
本発明は、Ｌ－グルタミン酸生産細菌を提供し、ここで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（配列表における配列３）のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドの発現が改善されている。本発明は、前記微生物を用いたＬ－グルタミン酸の生産方法をさらに提供した。
【0010】
本発明の第一の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸生産細菌を提供し、この細菌は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドの発現が改善されている。本発明によれば、前記改善された発現は、前記ポリヌクレオチド発現が増強されていること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有していること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有し且つ発現が増強されていることである。
【0011】
前記ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：３のアミノ酸配列又はその相同配列は、遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５又はその相同遺伝子がコードするタンパクである。
【0012】
前記細菌は、未修飾菌株と比べて増強されたＬ－グルタミン酸生産能力を有する。
【0013】
本発明において、用語である「Ｌ－グルタミン酸生産能力を有する細菌」とは、細菌が培地で培養される時にＬ－グルタミン酸を収集できるように、培地及び／又は細菌の細胞において以下の程度で目的Ｌ－グルタミン酸を生産、蓄積能力を有する細菌を指す。Ｌ－グルタミン酸生産能力を有する細菌は、未修飾菌株の取得可能な量よりも多い量で培地及び／又は細菌の細胞において目的Ｌ－グルタミン酸を蓄積できる細菌であってもよい。
【0014】
用語である「未修飾菌株」とは、特定の特徴を有するように修飾されていない対照菌株を指す。即ち、未修飾菌株の例は、野生型菌株と親株を含む。
【0015】
Ｌ－グルタミン酸生産能力を有する細菌は、培地において好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは１．Ｏｇ／Ｌ以上の量で目的Ｌ－グルタミン酸を蓄積できる細菌であってもよい。
【0016】
本発明において、別段の説明がない限り、用語である「Ｌ－グルタミン酸」とは、遊離形態のＬ－グルタミン酸、その塩又はその混合物を指す。
【0017】
前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列と約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、又は約９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードすることができる。本明細書で使用されるように、用語である「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチドモジュール間のパーセンテージ同一性を指す。当分野で既知の方法であるモジュールと別のモジュールとの間の配列相同性を測定することができる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによってこのような配列相同性を測定することができる。
【0018】
ポリヌクレオチドの発現は、置換又は変異（Ｍｕｔａｔｉｏｎ）による発現調節配列、ポリヌクレオチド配列への変異導入、染色体挿入又はベクターを介して導入されるポリヌクレオチドコピー数の増加、又はその組み合わせなどによって増強されることができる。
【0019】
ポリヌクレオチドの発現調節配列を修飾してもよい。発現調節配列は、それに操作可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を制御し、且つ例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、サイレンサーなどを含んでもよい。ポリヌクレオチドは、開始コドンの変化を有してもよい。ポリヌクレオチドを染色体の特定の部位に配合することによって、コピー数を増加させてもよい。本明細書において、特定の部位は、例えばトランスポゾン部位又は遺伝子間部位を含んでもよい。また、ポリヌクレオチドを発現ベクターに配合し、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、コピー数を増加させてもよい。
【0020】
本発明の一つの実施の形態において、ポリヌクレオチド又は点変異を有するポリヌクレオチドを微生物染色体の特定の部位に配合することによって、コピー数を増加させる。
【0021】
本発明の一つの実施の形態において、プロモーター配列付きポリヌクレオチド又は点変異を有するプロモーター配列付きポリヌクレオチドを微生物染色体の特定の部位に配合することによって、前記アミノ酸配列を過剰発現させる。
【0022】
本発明の一つの実施の形態において、ポリヌクレオチド又は点変異を有するポリヌクレオチドを発現ベクターに配合し、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、コピー数を増加させる。
【0023】
本発明の一つの実施の形態において、プロモーター配列付きポリヌクレオチド又は点変異を有するプロモーター配列付きポリヌクレオチドを発現ベクターに配合し、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、前記アミノ酸配列を過剰発現させる。
【0024】
本発明の一つの具体的な実施の形態において、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列を含んでもよい。
【0025】
本発明の一つの実施の形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有していることによって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列の２４番目のアラニンは、異なるアミノ酸で置換される。
【0026】
本発明によれば、好ましくは、２４番目のアラニンは、トレオニンで置換される。
【0027】
本発明によれば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：３に示されるアミノ酸配列であって、２４番目のアラニンは、トレオニンで置換された後のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。
【0028】
本発明の一つの実施の形態において、前記点変異を有するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の７０番目の塩基の変異により形成される。
【0029】
本発明によれば、前記変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の７０番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異を含む。
【0030】
本発明の一つの実施の形態において、前記点変異を有するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を含む。
【0031】
本明細書で使用されるように、用語である「操作可能な連結」とは、調節配列とポリヌクレオチド配列との間の機能的連結を指し、それによって調節配列は、ポリヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御する。調節配列は、ポリヌクレオチドの発現レベルを向上させることができる強力なプロモーターであってもよい。調節配列は、コリネバクテリウム属に属する微生物由来のプロモーターであってもよく、又は他の微生物由来のプロモーターであってもよい。例えば、プロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター又はｃｊ７プロモーターであってもよい。
【0032】
本発明の一つの具体的な実施の形態において、前記プロモーターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子）のプロモーターである。
【0033】
本明細書で使用されるように、用語である「ベクター」とは、遺伝子の調節配列と遺伝子配列を含み且つ適切な宿主細胞において標的遺伝子を発現するように構成されたポリヌクレオチド構築体を指す。又は、ベクターは、相同組換えに利用可能な配列を含むポリヌクレオチド構築体をさらに指してもよく、それによって宿主細胞に導入されたベクターにより、宿主細胞のゲノムにおける内因性遺伝子の調節配列を変更することができ、又は発現可能な標的遺伝子を宿主のゲノムの特定の部位に挿入することができる。この点では、本発明で使用されるベクターは、ベクターの宿主細胞への導入又はベクターの宿主細胞の染色体への挿入を決定する選択マーカーをさらに含んでもよい。選択マーカーは、選択可能な表現型、例えば薬物耐性、栄養欠損型、細胞毒剤に対する耐性、又は表面タンパクの発現を与えるマーカーを含んでもよい。このような選択剤で処理された環境では、選択マーカーを発現させた細胞のみが生存できるか又は異なる表現型性状を示すため、形質転換された細胞を選択してもよい。本明細書に記載のベクターは、当業者に公知のものであり、プラスミド、ファージ（例えば、λファージ又はＭ１３糸状ファージなど）、コスミド（即ちＣｏｓｍｉｄ）又はウィルスベクターを含むが、それらに限定されない。
【0034】
本発明のいくつかの具体的な実施の形態において、使用されるベクターは、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド、ｐＸＭＪ１９プラスミドである。
【0035】
本明細書で使用されるように、用語である「形質転換」とは、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することによって、ポリヌクレオチドがゲノム外素子とするか又は宿主細胞に挿入されたゲノムで複製できることを指す。本発明で使用されるベクターを形質転換する方法は、核酸を細胞に導入する方法を含んでもよい。また、関連技術に開示されるように、宿主細胞に応じて電気パルス法を実施することができる。
【0036】
本明細書において、前記微生物は、酵母、細菌、藻又は真菌であってもよい。
【0037】
本発明によれば、前記細菌は、コリネバクテリウム属に属する微生物、例えばコリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ペキネンシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｋｉｎｅｎｓｅ）、ブレビバクテリウム・サッカロリチカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）ブレビバクテリウム・チオゲニタイス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ）などであってもよい。
【0038】
本発明の一実施形態において、前記コリネバクテリウム属に属する微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９である。
【0039】
本発明の一実施形態において、前記コリネバクテリウム属に属する微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＹＰＧＬＵ００１であり、該菌は、多収型グルタミン酸であり、保存情報は、以下のとおりである。菌種名：コリネバクテリウム・グルタミクム、ラテン名：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、菌株番号：ＹＰＧＬＵ００１、保存機構：中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センター、保存機構略称：ＣＧＭＣＣ、住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号、保存日：２０２０年１１月２３日、保存センター登録簿番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０。
【0040】
本発明によれば、前記細菌は、Ｌ－グルタミン酸の生産量の向上に関連する他の改良、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンセターゼ、グルタミン－ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼなどの酵素の活性又は遺伝子の増強又は低下の発現をさらに有してもよく、又は遺伝子を外来遺伝子に置換させてもよい。
【0041】
本発明の第二の態様によれば、ポリヌクレオチド配列、該ポリヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列、前記ポリヌクレオチド配列を含む組換えベクター、前記ポリヌクレオチド配列を含む組換え菌株を提供する。
【0042】
本発明によれば、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記配列の２４番目のアラニンは、異なるアミノ酸で置換される。
【0043】
本発明によれば、好ましくは、２４番目のアラニンは、トレオニンで置換される。
【0044】
本発明によれば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：３に示されるアミノ酸配列であって、２４番目のアラニンがトレオニンで置換された後のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。
【0045】
本発明によれば、好ましくは、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列を含む。
【0046】
本発明の一つの実施の形態において、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の７０番目の塩基の変異により形成される。
【0047】
本発明によれば、前記変異とは、前記部位の塩基／ヌクレオチドが変化することを指し、前記変異方法は、変異誘導、ＰＣＲ固定点変異法、及び／又は相同組換えなどの方法から少なくとも一つを選択してもよい。本発明において、好ましくは、ＰＣＲ固定点変異法及び／又は相同組換えを採用する。
【0048】
本発明によれば、前記変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の７０番目のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異を含む。
【0049】
本発明の一つの実施の形態において、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を含む。
【0050】
本発明によれば、前記アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を含む。
【0051】
本発明によれば、前記組換えベクターは、前記ポリヌクレオチド配列をプラスミドに導入して構築される。
【0052】
本発明の一つの実施の形態において、前記プラスミドは、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドである。
【0053】
本発明の別の実施の形態において、前記プラスミドは、ＰＸＭＪ１９プラスミドである。
【0054】
具体的には、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を介して前記ポリヌクレオチド配列と前記プラスミドを組換えベクターとして構築してもよい。
【0055】
本発明によれば、前記組換え菌株は、前記ポリヌクレオチド配列を含む。
【0056】
本発明の一実施形態として、前記組換え菌株の出発菌は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０である。
【0057】
本発明の一実施形態として、前記組換え菌株の出発菌は、ＡＴＣＣ １３８６９である。
本発明の第三の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸を生成する組換え菌株の構築方法をさらに提供する。
本発明の第三の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸を生成する組換え菌株の構築方法をさらに提供する。
【0058】
本発明によれば、前記構築方法は、
宿主菌株におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子のポリヌクレオチド配列を改造し、その７０番目の塩基に変異を生じさせ、変異ＢＢＤ２９＿１１２６５コード遺伝子を含む組換え菌株を得るステップを含む。
宿主菌株におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子のポリヌクレオチド配列を改造し、その７０番目の塩基に変異を生じさせ、変異ＢＢＤ２９＿１１２６５コード遺伝子を含む組換え菌株を得るステップを含む。
【0059】
本発明の構築方法によれば、前記改造は、変異誘導、ＰＣＲ固定点変異法、及び／又は相同組換えなどの方法のうちの少なくとも一つを含む。
【0060】
本発明の構築方法によれば、前記変異とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における７０番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異を指し、具体的には、前含変異ＢＢＤ２９＿１１２６５コード遺伝子を含むポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される。
【0061】
さらに、前記構築方法は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子のヌクレオチド配列を改造し、その７０番目の塩基に変異を生じさせ、変異ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子ポリヌクレオチド配列を得るステップ（１）と、
前記変異多核酸配列とプラスミドとを連結して、組換えベクターを構築するステップ（２）と、
前記組換えベクターを宿主菌株に導入し、前記変異ＢＢＤ２９＿１１２６５コード遺伝子を含む組換え菌株を得るステップ（３）とを含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子のヌクレオチド配列を改造し、その７０番目の塩基に変異を生じさせ、変異ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子ポリヌクレオチド配列を得るステップ（１）と、
前記変異多核酸配列とプラスミドとを連結して、組換えベクターを構築するステップ（２）と、
前記組換えベクターを宿主菌株に導入し、前記変異ＢＢＤ２９＿１１２６５コード遺伝子を含む組換え菌株を得るステップ（３）とを含む。
【0062】
本発明の構築方法によれば、前記ステップ（１）は、点変異のＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子の構築を含み、即ち、未修飾菌株のゲノム配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子断片を増幅するプライマーＰ１とＰ２及びＰ３とＰ４を２組合成し、ＰＣＲ固定点変異法によって野生型ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に点変異を導入し、点変異ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：２を得、ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａとする。
【0063】
本発明の一つの実施の形態において、前記未修飾菌株ゲノムは、ＡＴＣＣ １３８６９菌株に由来してもよく、そのゲノム配列は、ＮＣＢＩサイトから取得されてもよい。
【0064】
本発明の一実施形態において、前記ステップ（１）において、前記プライマーは、以下のとおりである。
Ｐ１： ５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＣＧＧＴＧＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＴＣＡＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
Ｐ２： ５’ ＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡ ＴＣＧＴＴＧＣＧＡＴ ＣＣＣＧＣＣＣＡＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３： ５’ ＣＡＴＧＧＧＣＧＧＧ ＡＴＣＧＣＡＡＣＧＡ ＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４： ５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣ ＣＧＴＣＡＧＣＣＣＣ ＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
本発明の一実施形態において、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、及び７２℃で４５秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
Ｐ１： ５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＣＧＧＴＧＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＴＣＡＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
Ｐ２： ５’ ＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡ ＴＣＧＴＴＧＣＧＡＴ ＣＣＣＧＣＣＣＡＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３： ５’ ＣＡＴＧＧＧＣＧＧＧ ＡＴＣＧＣＡＡＣＧＡ ＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４： ５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣ ＣＧＴＣＡＧＣＣＣＣ ＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
本発明の一実施形態において、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、及び７２℃で４５秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
【0065】
本発明の一実施形態において、前記オーバーラップＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、及び７２℃で９０秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
【0066】
本発明の構築方法によれば、前記ステップ（２）は、組換えプラスミドの構築を含み、分離精製されたＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０ＡとｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドを、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系により組み立て、組換えプラスミドを得ることを含む。
【0067】
本発明の構築方法によれば、前記ステップ（３）は、組換え菌株の構築を含み、即ち組換えプラスミドを宿主菌株に形質転換し、組換え菌株を得る。
【0068】
本発明の一実施形態において、前記ステップ（３）の形質転換は、電気変換法である。
【0069】
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＡＴＣＣ １３８６９である。
【0070】
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０である。
【0071】
本発明の一つの実施の形態において、前記組換えは、相同組換えによって実現される。
【0072】
本発明の第四の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸を生成する組換え菌株の構築方法をさらに提供する。
【0073】
本発明によれば、前記構築方法は、
ＢＢＤ２９＿１１２６５の上下流相同アーム断片、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅し、相同組換えの方式で宿主菌株のゲノムにＢＢＤ２９＿１１２６５又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を導入し、前記菌株がＢＢＤ２９＿１１２６５又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を過剰発現させることを実現するステップを含む。
ＢＢＤ２９＿１１２６５の上下流相同アーム断片、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅し、相同組換えの方式で宿主菌株のゲノムにＢＢＤ２９＿１１２６５又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を導入し、前記菌株がＢＢＤ２９＿１１２６５又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を過剰発現させることを実現するステップを含む。
【0074】
本発明の一つの実施の形態において、上流相同アーム断片を増幅するプライマーは、以下のとおりである。
Ｐ７： ５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧ ＧＡＣＣＣＧＣＴＴＧ ＣＣＡＴＡＣＧＡＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
Ｐ８： ５’ ＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣ ＧＡＣＡＡＡＡＧＧＴ ＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴ ＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
本発明の一つの実施の形態において、下流相同アーム断片を増幅するプライマーは、以下のとおりである。
Ｐ１１： ５’ ＡＣＴＧＧＣＣＴＣＣ ＴＡＣＧＣＡＡＴＡＡ ＴＴＣＧＴＧＧＧＣＡ ＣＴＣＴＧＧＴＴＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
Ｐ１２： ５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＡＡＧＡＡＡＣ ＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
本発明の一つの実施の形態において、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅するプライマーは、以下のとおりである。
Ｐ９： ５’ ＧＡＴＴＣＴＴＣＡＧ ＡＴＧＡＧＴＡＧＡＴ ＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣ ＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
Ｐ１０： ５’ ＣＡＡＡＣＣＡＧＡＧ ＴＧＣＣＣＡＣＧＡＡ ＴＴＡＴＴＧＣＧＴＡ ＧＧＡＧＧＣＣＡＧＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
本発明の一つの実施の形態において、さらに前記Ｐ７／Ｐ１２をプライマーとし、増幅された上流相同アーム断片、下流相同アーム断片、遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列断片の三つの断片混合物をテンプレートとして増幅し、統合相同アーム断片を得る。
Ｐ７： ５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧ ＧＡＣＣＣＧＣＴＴＧ ＣＣＡＴＡＣＧＡＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
Ｐ８： ５’ ＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣ ＧＡＣＡＡＡＡＧＧＴ ＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴ ＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
本発明の一つの実施の形態において、下流相同アーム断片を増幅するプライマーは、以下のとおりである。
Ｐ１１： ５’ ＡＣＴＧＧＣＣＴＣＣ ＴＡＣＧＣＡＡＴＡＡ ＴＴＣＧＴＧＧＧＣＡ ＣＴＣＴＧＧＴＴＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
Ｐ１２： ５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＡＡＧＡＡＡＣ ＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
本発明の一つの実施の形態において、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅するプライマーは、以下のとおりである。
Ｐ９： ５’ ＧＡＴＴＣＴＴＣＡＧ ＡＴＧＡＧＴＡＧＡＴ ＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣ ＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
Ｐ１０： ５’ ＣＡＡＡＣＣＡＧＡＧ ＴＧＣＣＣＡＣＧＡＡ ＴＴＡＴＴＧＣＧＴＡ ＧＧＡＧＧＣＣＡＧＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
本発明の一つの実施の形態において、さらに前記Ｐ７／Ｐ１２をプライマーとし、増幅された上流相同アーム断片、下流相同アーム断片、遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列断片の三つの断片混合物をテンプレートとして増幅し、統合相同アーム断片を得る。
【0075】
本発明の一つの実施の形態において、採用されたＰＣＲ系は、ｌ０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（ｌＯｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総容積５０μＬであり、ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で１２０秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
【0076】
本発明の一つの実施の形態において、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用し、シャトルプラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢと統合相同アーム断片を組み立て、統合プラスミドを得る。
【0077】
本発明の一つの実施の形態において、統合プラスミドを宿主菌株にトランスフェクトし、相同組換えの方式で宿主菌株のゲノムにＢＢＤ２９＿１１２６５又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を導入する。
【0078】
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０である。
【0079】
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＡＴＣＣ １３８６９である。
【0080】
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：２に示されるポリヌクレオチド配列を有する菌株である。
【0081】
本発明の第五の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸を生産する組換え菌株の構築方法をさらに提供する。
【0082】
本発明によれば、前記構築方法は、
ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列、又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅し、過剰発現プラスミドベクターを構築し、前記ベクターを宿主菌株に導入し、前記菌株がＢＢＤ２９＿１１２６５又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を過剰発現させることを実現するステップを含む。
ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列、又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅し、過剰発現プラスミドベクターを構築し、前記ベクターを宿主菌株に導入し、前記菌株がＢＢＤ２９＿１１２６５又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を過剰発現させることを実現するステップを含む。
【0083】
本発明の一つの実施の形態において、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅するプライマーは、以下のとおりである。
Ｐ１７：５’ ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣ ＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：２１）
Ｐ１８：５’ ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣ ＴＴＡＴＴＧＣＧＴＡ ＧＧＡＧＧＣＣＡＧＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
本発明の一つの実施の形態において、前記ＰＣＲ系は、ｌＯ×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（ｌ０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総容積５０μＬであり、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で４５秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
Ｐ１７：５’ ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣ ＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：２１）
Ｐ１８：５’ ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣ ＴＴＡＴＴＧＣＧＴＡ ＧＧＡＧＧＣＣＡＧＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
本発明の一つの実施の形態において、前記ＰＣＲ系は、ｌＯ×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（ｌ０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総容積５０μＬであり、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で４５秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
【0084】
本発明の一つの実施の形態において、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用し、シャトルプラスミドｐＸＭＪ１９と自己プロモーターを持つＢＢＤ２９＿１１２６５又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ断片を組み立て、過剰発現プラスミドを得る。
【0085】
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０である。
【0086】
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＡＴＣＣ １３８６９である。
【0087】
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：２に示されるポリヌクレオチド配列を有する菌株である。
【0088】
本発明で得られた組換え菌株は、単独でＬ－グルタミン酸の発酵生産に応用されてもよく、Ｌ－グルタミン酸を生産する他の細菌と混合してＬ－グルタミン酸を発酵生産してもよい。
【0089】
本発明の別の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸の生産方法を提供し、該方法は、前記細菌を培養し、且つ培養物からＬ－グルタミン酸を得ることを含む。
【0090】
当分野の既知の培養条件で適切な培地において細菌の培養を行うことができる。培地は、炭素源、窒素源、微量元素、及びその組み合わせを含んでもよい。培養において、培養物のｐＨを調整してもよい。また、培養の際に、気泡の発生を防止することを含んでもよく、例えば消泡剤を用いて気泡の発生を防止する。また、培養の際に、培養物にガスを注入することを含んでもよい。ガスは、培養物の好気条件を維持できる任意のガスを含んでもよい。培養において、培養物の温度は、２０～４５℃であってもよい。生成されたＬ－グルタミン酸を培養物から回収し、即ち硫酸又は塩酸などで培養物を処理し、そして例えばアニオン交換クロマトグラフィー、濃縮、晶析と等電点沈殿の方法を組み合わせて行ってもよい。
【0091】
本発明において、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：ＢＢＤ２９＿１１２６５野生型ＯＲＦ配列
ＡＴＧＧＣＴＴＴＡＧ ＧＣＧＧＣＧＣＡＧＡ ＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴ ＣＴＴＴＴＴＡＴＣＣ ＴＧＴＴＴＡＴＴＣＴ ＧＴＴＣＡＴＧＧＧＣ ＧＧＧＡＴＣＧＣＡＧ ＣＧＡＴＴＧＴＣＡＴ ＣＧＴＴＡＴＣＧＴＴ ＡＡＧＴＴＧＡＣＣＣ ＡＧＣＧＧＴＣＴＡＡ ＣＡＧＴＣＧＴＧＧＴ ＧＣＣＴＣＡＡＣＴＡ ＣＧＴＣＣＡＣＡＡＴ ＴＡＡＣＡＴＴＧＡＴ ＣＣＧＡＧＴＡＴＴＣ ＡＴＧＣＴＧＣＡＴＴ ＧＡＣＡＧＡＧＡＴＣ ＧＣＡＧＣＴＡＧＧＧ ＡＣＧＧＧＧＴＡＣＣ ＧＧＣＧＴＣＴＡＧＣ ＧＴＧＧＴＴＡＡＣＧ ＧＴＣＴＴＣＴＧＡＡ ＣＧＡＴＴＡＣＡＴＣ ＡＡＴＡＡＧＣＧＣＡ ＧＧＴＡＣＴＧＧＣＣ ＴＣＣＴＡＣＧＣＡＡ ＴＡＡ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：２：ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ ＯＲＦ配列
ＡＴＧＧＣＴＴＴＡＧ ＧＣＧＧＣＧＣＡＧＡ ＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴ ＣＴＴＴＴＴＡＴＣＣ ＴＧＴＴＴＡＴＴＣＴ ＧＴＴＣＡＴＧＧＧＣ ＧＧＧＡＴＣＧＣＡＡ ＣＧＡＴＴＧＴＣＡＴ ＣＧＴＴＡＴＣＧＴＴ ＡＡＧＴＴＧＡＣＣＣ ＡＧＣＧＧＴＣＴＡＡ ＣＡＧＴＣＧＴＧＧＴ ＧＣＣＴＣＡＡＣＴＡ ＣＧＴＣＣＡＣＡＡＴ ＴＡＡＣＡＴＴＧＡＴ ＣＣＧＡＧＴＡＴＴＣ ＡＴＧＣＴＧＣＡＴＴ ＧＡＣＡＧＡＧＡＴＣ ＧＣＡＧＣＴＡＧＧＧ ＡＣＧＧＧＧＴＡＣＣ ＧＧＣＧＴＣＴＡＧＣ ＧＴＧＧＴＴＡＡＣＧ ＧＴＣＴＴＣＴＧＡＡ ＣＧＡＴＴＡＣＡＴＣ ＡＡＴＡＡＧＣＧＣＡ ＧＧＴＡＣＴＧＧＣＣ ＴＣＣＴＡＣＧＣＡＡ ＴＡＡ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：３：ＢＢＤ２９＿１１２６５野生型コードタンパクアミノ酸配列
ＭＡＬＧＧＡＥＬＬＩ ＬＦＩＬＦＩＬＦＭＧ ＧＩＡＡＩＶＩＶＩＶ ＫＬＴＱＲＳＮＳＲＧ ＡＳＴＴＳＴＩＮＩＤ ＰＳＩＨＡＡＬＴＥＩ ＡＡＲＤＧＶＰＡＳＳ ＶＶＮＧＬＬＮＤＹＩ ＮＫＲＲＹＷＰＰＴＱ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：４：ＢＢＤ２９＿１１２６５Ａ２４Ｔコードタンパクアミノ酸配列
ＭＡＬＧＧＡＥＬＬＩ ＬＦＩＬＦＩＬＦＭＧ ＧＩＡＴＩＶＩＶＩＶ ＫＬＴＱＲＳＮＳＲＧ ＡＳＴＴＳＴＩＮＩＤ ＰＳＩＨＡＡＬＴＥＩ ＡＡＲＤＧＶＰＡＳＳ ＶＶＮＧＬＬＮＤＹＩ ＮＫＲＲＹＷＰＰＴＱ
ＢＢＤ２９＿１１２６５Ａ２４Ｔ は、ＢＢＤ２９＿１１２６５Ａ２４Ｔである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：ＢＢＤ２９＿１１２６５野生型ＯＲＦ配列
ＡＴＧＧＣＴＴＴＡＧ ＧＣＧＧＣＧＣＡＧＡ ＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴ ＣＴＴＴＴＴＡＴＣＣ ＴＧＴＴＴＡＴＴＣＴ ＧＴＴＣＡＴＧＧＧＣ ＧＧＧＡＴＣＧＣＡＧ ＣＧＡＴＴＧＴＣＡＴ ＣＧＴＴＡＴＣＧＴＴ ＡＡＧＴＴＧＡＣＣＣ ＡＧＣＧＧＴＣＴＡＡ ＣＡＧＴＣＧＴＧＧＴ ＧＣＣＴＣＡＡＣＴＡ ＣＧＴＣＣＡＣＡＡＴ ＴＡＡＣＡＴＴＧＡＴ ＣＣＧＡＧＴＡＴＴＣ ＡＴＧＣＴＧＣＡＴＴ ＧＡＣＡＧＡＧＡＴＣ ＧＣＡＧＣＴＡＧＧＧ ＡＣＧＧＧＧＴＡＣＣ ＧＧＣＧＴＣＴＡＧＣ ＧＴＧＧＴＴＡＡＣＧ ＧＴＣＴＴＣＴＧＡＡ ＣＧＡＴＴＡＣＡＴＣ ＡＡＴＡＡＧＣＧＣＡ ＧＧＴＡＣＴＧＧＣＣ ＴＣＣＴＡＣＧＣＡＡ ＴＡＡ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：２：ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ ＯＲＦ配列
ＡＴＧＧＣＴＴＴＡＧ ＧＣＧＧＣＧＣＡＧＡ ＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴ ＣＴＴＴＴＴＡＴＣＣ ＴＧＴＴＴＡＴＴＣＴ ＧＴＴＣＡＴＧＧＧＣ ＧＧＧＡＴＣＧＣＡＡ ＣＧＡＴＴＧＴＣＡＴ ＣＧＴＴＡＴＣＧＴＴ ＡＡＧＴＴＧＡＣＣＣ ＡＧＣＧＧＴＣＴＡＡ ＣＡＧＴＣＧＴＧＧＴ ＧＣＣＴＣＡＡＣＴＡ ＣＧＴＣＣＡＣＡＡＴ ＴＡＡＣＡＴＴＧＡＴ ＣＣＧＡＧＴＡＴＴＣ ＡＴＧＣＴＧＣＡＴＴ ＧＡＣＡＧＡＧＡＴＣ ＧＣＡＧＣＴＡＧＧＧ ＡＣＧＧＧＧＴＡＣＣ ＧＧＣＧＴＣＴＡＧＣ ＧＴＧＧＴＴＡＡＣＧ ＧＴＣＴＴＣＴＧＡＡ ＣＧＡＴＴＡＣＡＴＣ ＡＡＴＡＡＧＣＧＣＡ ＧＧＴＡＣＴＧＧＣＣ ＴＣＣＴＡＣＧＣＡＡ ＴＡＡ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：３：ＢＢＤ２９＿１１２６５野生型コードタンパクアミノ酸配列
ＭＡＬＧＧＡＥＬＬＩ ＬＦＩＬＦＩＬＦＭＧ ＧＩＡＡＩＶＩＶＩＶ ＫＬＴＱＲＳＮＳＲＧ ＡＳＴＴＳＴＩＮＩＤ ＰＳＩＨＡＡＬＴＥＩ ＡＡＲＤＧＶＰＡＳＳ ＶＶＮＧＬＬＮＤＹＩ ＮＫＲＲＹＷＰＰＴＱ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：４：ＢＢＤ２９＿１１２６５Ａ２４Ｔコードタンパクアミノ酸配列
ＭＡＬＧＧＡＥＬＬＩ ＬＦＩＬＦＩＬＦＭＧ ＧＩＡＴＩＶＩＶＩＶ ＫＬＴＱＲＳＮＳＲＧ ＡＳＴＴＳＴＩＮＩＤ ＰＳＩＨＡＡＬＴＥＩ ＡＡＲＤＧＶＰＡＳＳ ＶＶＮＧＬＬＮＤＹＩ ＮＫＲＲＹＷＰＰＴＱ
ＢＢＤ２９＿１１２６５Ａ２４Ｔ は、ＢＢＤ２９＿１１２６５Ａ２４Ｔである。
【0092】
本発明は、タンパク質をさらに提供し、名称がタンパク質ＢＢＤ２９＿１１２６５Ａ２４Ｔであり、前記タンパク質は、
Ａ１）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４であるタンパク質と、
Ａ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示されるアミノ酸配列を、アミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られた、Ａ１）に示されるタンパク質と８０％以上の同一性を有し且つ同じ機能を有するタンパク質と、
Ａ３）Ａ１）又はＡ２）のＮ端及び／又はＣ端にタグを連結して得られた、同じ機能を有する融合タンパク質とのうちのいずれか一つであってもよい。
Ａ１）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４であるタンパク質と、
Ａ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示されるアミノ酸配列を、アミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られた、Ａ１）に示されるタンパク質と８０％以上の同一性を有し且つ同じ機能を有するタンパク質と、
Ａ３）Ａ１）又はＡ２）のＮ端及び／又はＣ端にタグを連結して得られた、同じ機能を有する融合タンパク質とのうちのいずれか一つであってもよい。
【0093】
本発明は、核酸分子をさらに提供し、名称がＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａであり、前記核酸分子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａは、
Ｂ１）コード前記タンパク質ＢＢＤ２９＿１１２６５Ａ２４Ｔの核酸分子と、
Ｂ２）コード配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子と、
Ｂ３）ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子とのうちのいずれか一つであってもよい。
Ｂ１）コード前記タンパク質ＢＢＤ２９＿１１２６５Ａ２４Ｔの核酸分子と、
Ｂ２）コード配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子と、
Ｂ３）ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子とのうちのいずれか一つであってもよい。
【0094】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子は、本発明に記載のＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子である。
【0095】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子（ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子）は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示されるタンパク質ＢＢＤ２９＿１１２６５Ａ２４Ｔをコードする。
【0096】
前記タンパク質ＢＢＤ２９＿１１２６５Ａ２４Ｔのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）における２４番目のトレオニン（Ｔ）は、アラニン（Ａ）を変異させたものである。
本発明は、生物材料をさらに提供し、前記生物材料は、
Ｃ１）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを含む発現カセットと、
Ｃ２）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを含む組換えベクター、又はＣ１）に記載の発現カセットを含む組換えベクターと、
Ｃ３）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを含む組換え微生物、又はＣ１）に記載の発現カセットを含む組換え微生物、又はＣ２）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物とのうちのいずれか一つであってもよい。
本発明は、生物材料をさらに提供し、前記生物材料は、
Ｃ１）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを含む発現カセットと、
Ｃ２）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを含む組換えベクター、又はＣ１）に記載の発現カセットを含む組換えベクターと、
Ｃ３）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを含む組換え微生物、又はＣ１）に記載の発現カセットを含む組換え微生物、又はＣ２）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物とのうちのいずれか一つであってもよい。
【0097】
本発明は、
Ｆ１）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの微生物のＬ－グルタミン酸の生産量の制御における応用と、
Ｆ２）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つのＬ－グルタミン酸生産の遺伝子工学的菌の構築における応用と、
Ｆ３）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つのＬ－グルタミン酸の製造における応用とのうちのいずれか一つにおけるＤ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの応用をさらに提供し、
ここで、前記Ｄ１）～Ｄ８）は、
Ｄ１）前記タンパク質ＢＢＤ２９＿１１２６５Ａ２４Ｔ、
Ｄ２）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ、
Ｄ３）前記生物材料、
Ｄ４）ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるＤＮＡ分子、
Ｄ５）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるヌクレオチド配列を、修飾及び／又は一つ又は複数のヌクレオチドの置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られた、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子と９０％以上の同一性を有し、且つ同じ機能を有するＤＮＡ分子、
Ｄ６）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む発現カセット、
Ｄ７）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む組換えベクター、又はＤ６）に記載の発現カセットを含む組換えベクター、
Ｄ８）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む組換え微生物、又はＤ６）に記載の発現カセットを含む組換え微生物、又はＤ７）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物である。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子は、本発明に記載のＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子である。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子（ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子）は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３に示されるタンパク質をコードする。
Ｆ１）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの微生物のＬ－グルタミン酸の生産量の制御における応用と、
Ｆ２）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つのＬ－グルタミン酸生産の遺伝子工学的菌の構築における応用と、
Ｆ３）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つのＬ－グルタミン酸の製造における応用とのうちのいずれか一つにおけるＤ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの応用をさらに提供し、
ここで、前記Ｄ１）～Ｄ８）は、
Ｄ１）前記タンパク質ＢＢＤ２９＿１１２６５Ａ２４Ｔ、
Ｄ２）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ、
Ｄ３）前記生物材料、
Ｄ４）ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるＤＮＡ分子、
Ｄ５）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるヌクレオチド配列を、修飾及び／又は一つ又は複数のヌクレオチドの置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られた、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子と９０％以上の同一性を有し、且つ同じ機能を有するＤＮＡ分子、
Ｄ６）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む発現カセット、
Ｄ７）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む組換えベクター、又はＤ６）に記載の発現カセットを含む組換えベクター、
Ｄ８）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む組換え微生物、又はＤ６）に記載の発現カセットを含む組換え微生物、又はＤ７）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物である。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子は、本発明に記載のＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子である。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子（ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子）は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３に示されるタンパク質をコードする。
【0098】
本明細書において、同一性とは、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性を指す。国際インターネット上の相同性検索サイト、例えばＮＣＢＩホームページサイトのＢＬＡＳＴページを用いて、アミノ酸配列の同一性を測定することができる。例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＢＬＡＳＴ２．１では、ｂｌａｓｔｐをプログラムとして使用し、Ｅｘｐｅｃｔ値を１０に設定し、すべてのＦｉｌｔｅｒをＯＦＦに設定し、ＢＬ０ＳＵＭ６２をＭａｔｒｉｘとして使用し、Ｇａｐ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｃｏｓｔ、Ｐｅｒ ｒｅｓｉｄｕｅ ｇａｐ ｃｏｓｔとＬａｍｂｄａ ｒａｔｉｏをそれぞれ１１、１と０．８５（デフォルト値）に設定して１組のアミノ酸配列の同一性を検索して計算することにより、同一性の値（％）を得ることができる。
【0099】
本明細書において、前記８０％以上の同一性は、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性であってもよい。
【0100】
本明細書において、前記９０％以上の同一性は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性であってもよい。
【0101】
本明細書に記載の微生物のＬ－グルタミン酸の生産量の制御は、微生物におけるＬ－グルタミン酸の蓄積量（即ちＬ－グルタミン酸の生物合成を促進又は抑制する）を向上又は低下させることであってもよい。
【0102】
本発明は、微生物におけるＬ－グルタミン酸の生産量を向上させる方法をさらに提供し、前記方法は、
Ｅ１）目的微生物における前記核酸分子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａの発現量又は含有量を向上させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることと、
Ｅ２）目的微生物におけるＤ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子の発現量又は、含有量を向上させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることと、
Ｅ３）前記目的微生物におけるヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるＤＮＡ分子を変異させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることとのうちのいずれか一つを含む。
Ｅ１）目的微生物における前記核酸分子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａの発現量又は含有量を向上させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることと、
Ｅ２）目的微生物におけるＤ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子の発現量又は、含有量を向上させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることと、
Ｅ３）前記目的微生物におけるヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるＤＮＡ分子を変異させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることとのうちのいずれか一つを含む。
【0103】
上記方法において、前記変異は、点変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、即ち単一ヌクレオチドの変異であってもよい。
【0104】
上記方法において、前記点変異は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子がコードするアミノ酸配列の２４番目のアラニン残基を別のアミノ酸残基に変異させるものであってもよい。
【0105】
上記方法において、前記点変異は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子がコードするアミノ酸配列の２４番目のアラニンをトレオニンに変異させ、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４である変異タンパク質ＢＢＤ２９＿１１２６５Ａ２４Ｔを得るものであってもよい。
【0106】
前記変異とは、固定点変異により遺伝子におけるいずれか一つ又は複数の塩基を変化させることにより、対応するタンパク質アミノ酸組が変化し、新たなタンパク質を生産し又は元のタンパク質に新たな機能を発生させ、即ち遺伝子固定点変異を指す。遺伝子の固定点変異技術、例えばオリゴヌクレオチドプライマーを介した固定点変異、ＰＣＲを介した固定点変異又はカセット変異などは、当業者には周知である。
【0107】
本明細書に記載の点変異は、一塩基置換、一塩基挿入または一塩基欠失であってもよく、具体的には一塩基置換であってもよい。前記一塩基置換は、対立遺伝子置換であってもよい。
【0108】
前記点変異は、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）の７０番目のグアニン（Ｇ）の核酸改造であってもよい。
【0109】
具体的には、前記点変異は、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）の７０番目のグアニン（Ｇ）をアデニン（Ａ）に変異させ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子を得るものであってもよい。
【0110】
本明細書において、前記組換えベクターは、具体的に組換えベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ、ＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１１２６５、ＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ、ｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１１２６５又はｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａであってもよい。
【0111】
前記組換えベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａは、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターのＸｂａ Ｉと／ＢａｍＨ Ｉ認識部位間の断片（小断片）を配列表におけるＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９の３７－１４９５番目に示されるＤＮＡ断片に置換し、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターの他の配列をそのまま維持し、得られた組換えベクターである。前記組換えベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示される変異の遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａの１～２７３番目に示されるＤＮＡ分子を含む。
【0112】
前記組換えベクターＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１１２６５は、外来遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５を宿主染色体に統合し、菌生産中に野生型ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子を過剰発現させるために用いられる。前記組換えベクターＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１１２６５は、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターのＸｂａ Ｉと／ＢａｍＨ Ｉ認識部位間の断片（小断片）を配列表におけるＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０の３７～１９６６番目に示されるＤＮＡ 断片に置換し、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターの他の配列をそのまま維持し、得られた組換えベクターである。
【0113】
前記組換えベクターＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａは、外来遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを宿主染色体に統合し、菌生産中に変異型遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを過剰発現させるために用いられる。前記組換えベクターＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａは、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターのＸｂａ Ｉと／ＢａｍＨ Ｉ認識部位間の断片（小断片）を配列表におけるＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１の３７－１９６６番目に示されるＤＮＡ断片に置換し、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターの他の配列をそのまま維持し、得られた組換えベクターである。
【0114】
前記組換えベクターｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１１２６５は、プラスミドを介して外来遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５を染色体外に発現させ、さらに菌生産中に野生型ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子を過剰発現させるために用いられる。前記組換えベクターｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１１２６５は、ｐＸＭＪ１９ベクターのＥｃｏＲ ＩとＫｐｎ Ｉ認識部位間の断片（小断片）を配列表におけるＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２の３７～４８６番目に示されるＤＮＡ断片に置換し、ｐＸＭＪ１９ベクターの他の配列をそのまま維持し、得られた組換えベクターである。
【0115】
前記組換えベクターｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａは、プラスミドを介して外来遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを染色体外に発現させ、さらに菌生産中に変異型遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを過剰発現させるために用いられる。前記組換えベクターｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａは、ｐＸＭＪ１９ベクターのＥｃｏＲ ＩとＫｐｎ Ｉ認識部位間の断片（小断片）を配列表におけるＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３３の３７～４８６番目に示されるＤＮＡ断片に置換し、ｐＸＭＪ１９ベクターの他の配列をそのまま維持し、得られた組換えベクターである。
【0116】
前記組換えベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ、ＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１１２６５、ＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ、ｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿ｌ１２６５とｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａは、いずれも本発明の保護範囲内にある。
【0117】
本明細書において、前記組換え微生物は、具体的に組換え菌ＹＰＧ－０１３、ＹＰＧ－０１４、ＹＰＧ－０１５、ＹＰＧ－０１６又はＹＰＧ－０１７であってもよい。
【0118】
前記組換え菌ＹＰＧ－０１３は、前記組換えベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａをコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｉｎ ｇｌｕｔａｉｎｉｃｕｍ）ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０に形質転換して得られた組換え菌であり、前記組換え菌ＹＰＧ－０１３は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示される変異の遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを含む。
【0119】
前記組換え菌ＹＰＧ－０１４は、２コピーのＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子を含み、２コピーＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子を含む組換え菌は、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子の発現量を顕著かつ安定的に増加させることができる。組換え菌ＹＰＧ－０１４は、ゲノム上の野生型ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子を過剰発現させる工学的菌である。
【0120】
前記組換え菌ＹＰＧ－０１５は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示される変異のＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を含み、組換え菌ＹＰＧ－０１５は、ゲノム上の変異型ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌である。
【0121】
前記組換え菌ＹＰＧ－０１６は、２コピーＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子を含み、組換え菌ＹＰＧ－０１６は、プラスミド上の野生型ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子を過剰発現させる工学的菌であり、即ちプラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１１２６５が染色体外に過剰発現を行う。
【0122】
前記組換え菌ＹＰＧ－０１７は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示される変異のＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を含み、組換え菌ＹＰＧ－０１７は、プラスミド上の変異型ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌であり、即ちプラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａが染色体外に過剰発現を行う。
【0123】
前記組換え菌 ＹＰＧ－０１３、ＹＰＧ－０１４、ＹＰＧ－０１５、ＹＰＧ－０１６とＹＰＧ－０１７は、いずれも本発明の保護範囲内にある。
【0124】
本発明は、前記組換え微生物を構築する方法をさらに提供し、前記方法は、
Ｆ１）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを目的微生物に導入し、前記組換え微生物を得ることと、
Ｆ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子を目的微生物に導入し、前記組換え微生物を得ることと、
Ｆ３）遺伝子編集手段（例えば一塩基の遺伝子編集）を用いてＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子を編集し、目的微生物にＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子を含ませることとのうちの少なくともいずれか一つを含む。
Ｆ１）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを目的微生物に導入し、前記組換え微生物を得ることと、
Ｆ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子を目的微生物に導入し、前記組換え微生物を得ることと、
Ｆ３）遺伝子編集手段（例えば一塩基の遺伝子編集）を用いてＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子を編集し、目的微生物にＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子を含ませることとのうちの少なくともいずれか一つを含む。
【0125】
前記導入は、化学形質転換法又は電気ショック形質転換法などの既知の形質転換方法により本発明ＤＮＡ分子を担持したベクターを宿主菌に形質転換することであってもよい。導入されたＤＮＡ分子は、シングルコピーであってもよくマルチコピーであってもよい。前記導入は、外来遺伝子を宿主染色体に統合してもよく、プラスミドが染色体外に発現してもよい。
【0126】
本発明は、Ｌ－グルタミン酸の製造方法をさらに提供し、前記方法は、本明細書におけるいずれか一つの前記組換え微生物を用いてＬ－グルタミン酸を生産することを含む。
【0127】
上記方法において、前記方法は、発酵法によるＬ－グルタミン酸の製造であってもよく、前記組換え微生物は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｉｎ）であってもよく、具体的にコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）及びその変異体であってもよい。
【0128】
保存情報：菌種名：コリネバクテリウム・グルタミクム、ラテン名：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、菌株番号：ＹＰＧＬＵ００１、保存機構：中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センター、保存機構略称：ＣＧＭＣＣ、住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号、保存日：２０２０年１１月２３日、保存センター登録簿番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０。
【発明を実施するための形態】
【0129】
以下では、具体的な実施形態を結び付けながら本発明についてさらに詳細に記述するが、これらの実施例は、ただ本発明を記述するにすぎず、本発明の範囲を制限するものではない。以下に提供される実施例は、当業者によるさらなる改良のためのガイドラインとすることができ、いかなる方式でも本発明の制限を構成するものではない。
【0130】
下記の実施例における実験方法は、別段の説明がない限り、通常の方法であり、本分野内の文献に記述された技術又は条件又は製品説明書に従って行われる。下記の実施例で使用される材料、試薬などは、別段の説明がない限り、いずれも商業的に入手することができる。
【0131】
以下の実施例において前記菌株を培養するために使用される基礎培地の組成が同じであり、この上に培地組成に必要のある該当するショ糖、カナマイシン又はクロラムフェニコールなどを添加し、基礎培地の組成を表１に示す。
下記の実施例におけるコリネバクテリウム・グルタミッカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＹＰＧＬＵ００１ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０は、２０２０年１１月２３日に中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センター（ＣＧＭＣＣと略称され、住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所）に保存されており、保存登録番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０である。コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＹＰＧＬＵ００１は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０とも呼ばれる。
【表1】
【0132】
実施例１ 点変異のＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域を含む形質転換ベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａの構築
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域配列を増幅するプライマーを２組設計して合成し、アレル置換の方式で菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０（シークエンスにより該菌株染色体上のＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域とＡＴＣＣ １３８６９とが一致していることが確認された）に点変異を導入し、対応するコードタンパクのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：３であり、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子のヌクレオチド配列の７０番目のグアニン（Ｇ）は、アデニン（Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ）に変化し、対応するコードタンパクのアミノ酸配列の２４番目のアラニン（Ａ）は、トレオニン（Ｔ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：４：ＢＢＤ２９＿１１２６５Ａ２４Ｔ）に変化した。
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域配列を増幅するプライマーを２組設計して合成し、アレル置換の方式で菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０（シークエンスにより該菌株染色体上のＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域とＡＴＣＣ １３８６９とが一致していることが確認された）に点変異を導入し、対応するコードタンパクのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：３であり、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子のヌクレオチド配列の７０番目のグアニン（Ｇ）は、アデニン（Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ）に変化し、対応するコードタンパクのアミノ酸配列の２４番目のアラニン（Ａ）は、トレオニン（Ｔ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：４：ＢＢＤ２９＿１１２６５Ａ２４Ｔ）に変化した。
【0133】
前記点変異は、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）における７０番目のグアニン（Ｇ）をアデニン（Ａ）に変異させ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子（変異ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子、名称がＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａである）を得るものである。
【0134】
ここで、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子コードアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３のタンパク質である（前記タンパク質名は、タンパク質ＢＢＤ２９＿１１２６５である）。
【0135】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子コードアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４の変異タンパク質である（前記変異タンパク質名は、ＢＢＤ２９＿１１２６５Ａ２４Ｔである）。前記変異タンパク質ＢＢＤ２９＿１１２６５Ａ２４Ｔアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）における２４番目のトレオニン（Ｔ）は、アラニン（Ａ）が変異したものである。
【0136】
オーバーラップＰＣＲ（Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ）技術を用いて遺伝子固定点変異を行い、プライマー設計は、以下のとおりであり（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）、太字フォントの塩基は、変異位置である。
Ｐ１：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＣＧＧＴＧＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＴＣＡＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
Ｐ２：５’ ＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡ ＴＣＧＴＴＧＣＧＡＴ ＣＣＣＧＣＣＣＡＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３：５’ ＣＡＴＧＧＧＣＧＧＧ ＡＴＣＧＣＡＡＣＧＡ ＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣ ＣＧＴＣＡＧＣＣＣＣ ＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
構築方法：以コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９をテンプレートとし、それぞれプライマーＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４で、ＰＣＲ増幅を行い、大きさがそれぞれ７７５ｂｐと７８８ｂｐである、それぞれ変異塩基付きの２つのＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域のＤＮＡ断片（ＢＢＤ２９＿１１２６５ ＵｐとＢＢＤ２９＿１１２６５ Ｄｏｗｎ）を取得した。
Ｐ１：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＣＧＧＴＧＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＴＣＡＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
Ｐ２：５’ ＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡ ＴＣＧＴＴＧＣＧＡＴ ＣＣＣＧＣＣＣＡＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３：５’ ＣＡＴＧＧＧＣＧＧＧ ＡＴＣＧＣＡＡＣＧＡ ＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣ ＣＧＴＣＡＧＣＣＣＣ ＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
構築方法：以コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９をテンプレートとし、それぞれプライマーＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４で、ＰＣＲ増幅を行い、大きさがそれぞれ７７５ｂｐと７８８ｂｐである、それぞれ変異塩基付きの２つのＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域のＤＮＡ断片（ＢＢＤ２９＿１１２６５ ＵｐとＢＢＤ２９＿１１２６５ Ｄｏｗｎ）を取得した。
【0137】
ＰＣＲ系：ｌ０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（ｌ０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総容積５０μＬ。
【0138】
前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で４５秒間の伸長、３０サイクル、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われ、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域を含む、大きさがそれぞれ７７５ｂｐと７８８ｂｐである２つのＤＮＡ断片（ＢＢＤ２９＿１１２６５ ＵｐとＢＢＤ２９＿１１２６５ Ｄｏｗｎ）を取得した。
【0139】
上記２つのＤＮＡ断片（ＢＢＤ２９＿１１２６５ ＵｐとＢＢＤ２９＿１１２６５ Ｄｏｗｎ）をアガロースゲル電気泳動により分離精製した後、目的ストリップを回収し、さらに上記２つのＤＮＡ断片をテンプレートとし、Ｐ１とＰ４をプライマーとし、オーバーラップＰＣＲ増幅により長さ１５３３ｂｐの断片を得、名称がＢＢＤ２９＿１１２６５ Ｕｐ－Ｄｏｗｎである（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９に示される）。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９に示されるＤＮＡ断片のうち、６９３～９６５番目は、変異部位を含むＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子断片（即ちＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の１～２７３番目）である。
【0140】
オーバーラップＰＣＲ系：ｌＯ×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（ｌＯ ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総容積５０μＬ。
【0141】
前記オーバーラップＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で９０秒間の伸長、３０サイクル、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われた。
【0142】
このＤＮＡ断片ＢＢＤ２９＿１１２６５ Ｕｐ－Ｄｏｗｎ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９）は、変異部位を含み、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０中ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域の７０番目に核酸改造を導入するために用いられ、具体的には菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０におけるＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域の７０番目のグアニン（Ｇ）をアデニン（Ａ）に変化させ、最終的にコードタンパクの２４番目のアミノ酸をアラニン（Ａ）からトレオニン（Ｔ）に変化させた。ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入）をＸｂａ Ｉ／ＢａｍＨ Ｉ酵素で切断した後、アガロースゲル電気泳動でＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａと線形化したｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドを分離精製し、さらにＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系で組立、ベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを得、該プラスミドには、カナマイシン抵抗性マーカーが含まれる。そしてベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａをシーケンシング会社に送ってシーケンシング鑑定し、正しい点変異（Ｇ－Ａ）を含むベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを保存して予備した。
【0143】
具体的には、前記ＤＮＡ断片（ＢＢＤ２９＿１１２６５ Ｕｐ－Ｄｏｗｎ）をアガロースゲル電気泳動により分離した後に精製し、酵素切断（Ｘｂａ Ｉ／ＢａｍＨ Ｉ）を経て精製されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入され、Ｘｂａ Ｉ／ＢａｍＨ Ｉ酵素で切断する）とＮＥＢｕｉｌｄｅｒ酵素（ＮＥＢ社から購入）により５０℃で３０分間連結し、連結産物をＤＨ５ａ（ＴＡＫＡＲＡ社から購入）に形質転換した後に成長したモノクローナルをＰＣＲ鑑定して陽性組換えベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを得、該組換えベクターにはカナマイシン抵抗性（Ｋａｎｒ）マーカー、が含まれる。酵素切断の正しい組換えベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａをシーケンシング会社に送ってシーケンシング鑑定し、正しい点変異（Ｇ－Ａ）を含む組換えベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを保存して予備した。
【0144】
前記組換えベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａは、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターのＸｂａ Ｉと／ＢａｍＨ Ｉ認識部位間の断片（小断片）を配列表におけるＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９の３７～１４９５番目に示されるＤＮＡ断片に置換し、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターの他の配列をそのまま維持し、得られた組換えベクターである。
【0145】
前記組換えベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示される変異を含む遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａの第１～２７３位に示されるＤＮＡ分子である。
【0146】
実施例２ 点変異を含むＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａの工学的菌株の構築
構築方法：実施例１におけるアイソサイト置換プラスミドｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを電気転換によりコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０に導入し、培地で培養し、培地成分と培養条件は表１を参照し、培養により生じた単一コロニーは、それぞれプライマーＰ１と汎用プライマーＭ１３Ｒにより鑑定され、大きさ約１５６０ｂｐバンドを増幅できた菌株は、陽性菌株である。陽性菌株は、１５％のショ糖を含む培地板上で培養され、培養により生じた単一コロニーは、それぞれカナマイシンを含む培地板とカナマイシンを含まない培地板上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長するが、カナマイシンを含む培地上で成長しない菌株を選択してさらに以下のプライマー（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成され）を採用してＰＣＲ鑑定され、
Ｐ５：５’ ＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴ ＧＣＴＣＴＧＡＡＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
Ｐ６：５’ ＧＡＣＣＧＴＴＡＡＣ ＣＡＣＧＣＴＡＧＡＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
上記ＰＣＲ増幅産物は、高温変性、氷浴後にＳＳＣＰ電気泳動（プラスミドｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａの増幅断片を陽性対照とし、ＡＴＣＣ １３８６９の増幅断片を陰性対照、水を空白対照とする）を行い、ＳＳＣＰ電気泳動のＰＡＧＥの製造及び電気泳動条件は、表２を参照し、断片構造が異なり、電気泳動位置が異なるため、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず且つ陽性対照断片の位置と一致する菌株を、アイソサイト置換に成功した菌株とする。アイソサイト置換に成功した菌株の目的断片を、さらにプライマーＰ５とＰ６でＰＣＲ増幅を行い、ＰＭＤ１９－Ｔベクターに連結してシークエンスを行い、配列比較により、塩基配列に変異を生じさせた配列検証菌株のアイソサイト置換に成功し、ＹＰＧ－０１３と命名された。
組換え菌ＹＰＧ－０１３は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示される変異を含む遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａである。
実施例３ ゲノムにおいてＢＢＤ２９＿１１２６５又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌株の構築
菌生産中に野生型ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子又はその変異遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを過剰発現させることでＬ－グルタミン酸の生産量を増加させることができることをさらに研究検証するために、外来遺伝子を宿主染色体に統合し、ゲノムにおいてＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌株を構築した。
構築方法：実施例１におけるアイソサイト置換プラスミドｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを電気転換によりコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０に導入し、培地で培養し、培地成分と培養条件は表１を参照し、培養により生じた単一コロニーは、それぞれプライマーＰ１と汎用プライマーＭ１３Ｒにより鑑定され、大きさ約１５６０ｂｐバンドを増幅できた菌株は、陽性菌株である。陽性菌株は、１５％のショ糖を含む培地板上で培養され、培養により生じた単一コロニーは、それぞれカナマイシンを含む培地板とカナマイシンを含まない培地板上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長するが、カナマイシンを含む培地上で成長しない菌株を選択してさらに以下のプライマー（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成され）を採用してＰＣＲ鑑定され、
Ｐ５：５’ ＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴ ＧＣＴＣＴＧＡＡＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
Ｐ６：５’ ＧＡＣＣＧＴＴＡＡＣ ＣＡＣＧＣＴＡＧＡＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
上記ＰＣＲ増幅産物は、高温変性、氷浴後にＳＳＣＰ電気泳動（プラスミドｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａの増幅断片を陽性対照とし、ＡＴＣＣ １３８６９の増幅断片を陰性対照、水を空白対照とする）を行い、ＳＳＣＰ電気泳動のＰＡＧＥの製造及び電気泳動条件は、表２を参照し、断片構造が異なり、電気泳動位置が異なるため、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず且つ陽性対照断片の位置と一致する菌株を、アイソサイト置換に成功した菌株とする。アイソサイト置換に成功した菌株の目的断片を、さらにプライマーＰ５とＰ６でＰＣＲ増幅を行い、ＰＭＤ１９－Ｔベクターに連結してシークエンスを行い、配列比較により、塩基配列に変異を生じさせた配列検証菌株のアイソサイト置換に成功し、ＹＰＧ－０１３と命名された。
組換え菌ＹＰＧ－０１３は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示される変異を含む遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａである。
【表2】
菌生産中に野生型ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子又はその変異遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを過剰発現させることでＬ－グルタミン酸の生産量を増加させることができることをさらに研究検証するために、外来遺伝子を宿主染色体に統合し、ゲノムにおいてＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌株を構築した。
【0147】
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム配列に基づいて、上下流相同アーム断片及びＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅するプライマーを３組設計して合成し、相同組換えの方式で菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０にＢＢＤ２９＿１１２６５又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を導入した。
【0148】
プライマー設計は、以下のとおりである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成され）、
Ｐ７：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧ ＧＡＣＣＣＧＣＴＴＧ ＣＣＡＴＡＣＧＡＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
Ｐ８：５’ ＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣ ＧＡＣＡＡＡＡＧＧＴ ＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴ ＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
Ｐ９：５’ ＧＡＴＴＣＴＴＣＡＧ ＡＴＧＡＧＴＡＧＡＴ ＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣ ＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
Ｐ１０：５’ ＣＡＡＡＣＣＡＧＡＧ ＴＧＣＣＣＡＣＧＡＡ ＴＴＡＴＴＧＣＧＴＡ ＧＧＡＧＧＣＣＡＧＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
Ｐ１１：５’ ＡＣＴＧＧＣＣＴＣＣ ＴＡＣＧＣＡＡＴＡＡ ＴＴＣＧＴＧＧＧＣＡ ＣＴＣＴＧＧＴＴＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
Ｐ１２：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＡＡＧＡＡＡＣ ＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
構築方法：それぞれ以コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９又はＹＰＧ－０１３をテンプレートとし、それぞれプライマーＰ７／Ｐ８、Ｐ９／Ｐ１０、Ｐ１１／Ｐ１２でＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片約８０６ｂｐ、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域及びプロモーター領域断片４９０ｂｐ又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子コード領域及びプロモーター領域断片約４９０ｂｐ及び下流相同アーム断片約７８８ｂｐを得た。さらにＰ７／Ｐ１２をプライマーとし、以上の増幅した３つの断片をテンプレートとして混合して増幅し、統合相同アーム断片１と２（統合相同アーム断片１の大きさは、２００４ｂｐであり、配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０に示され、統合相同アーム断片２の大きさは、２００４ｂｐであり、配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１に示される）を得た。ＰＣＲ反応終了後、増幅産物を電気泳動により回収し、カラム型ＤＮＡゲル回収キットを用いて（ＴＩＡＮＧＥＮ）必要な約２００４ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用してＸｂａ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドＰｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢと連結し、統合プラスミド（即ち組換えベクター）ＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１１２６５又はＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを得、プラスミドには、カナマイシン抵抗性マーカーが含まれ、カナマイシンスクリーニングによりプラスミドがゲノムに統合された組換え子を得ることができる。
Ｐ７：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧ ＧＡＣＣＣＧＣＴＴＧ ＣＣＡＴＡＣＧＡＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
Ｐ８：５’ ＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣ ＧＡＣＡＡＡＡＧＧＴ ＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴ ＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
Ｐ９：５’ ＧＡＴＴＣＴＴＣＡＧ ＡＴＧＡＧＴＡＧＡＴ ＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣ ＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
Ｐ１０：５’ ＣＡＡＡＣＣＡＧＡＧ ＴＧＣＣＣＡＣＧＡＡ ＴＴＡＴＴＧＣＧＴＡ ＧＧＡＧＧＣＣＡＧＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
Ｐ１１：５’ ＡＣＴＧＧＣＣＴＣＣ ＴＡＣＧＣＡＡＴＡＡ ＴＴＣＧＴＧＧＧＣＡ ＣＴＣＴＧＧＴＴＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
Ｐ１２：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＡＡＧＡＡＡＣ ＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
構築方法：それぞれ以コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９又はＹＰＧ－０１３をテンプレートとし、それぞれプライマーＰ７／Ｐ８、Ｐ９／Ｐ１０、Ｐ１１／Ｐ１２でＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片約８０６ｂｐ、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域及びプロモーター領域断片４９０ｂｐ又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子コード領域及びプロモーター領域断片約４９０ｂｐ及び下流相同アーム断片約７８８ｂｐを得た。さらにＰ７／Ｐ１２をプライマーとし、以上の増幅した３つの断片をテンプレートとして混合して増幅し、統合相同アーム断片１と２（統合相同アーム断片１の大きさは、２００４ｂｐであり、配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０に示され、統合相同アーム断片２の大きさは、２００４ｂｐであり、配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１に示される）を得た。ＰＣＲ反応終了後、増幅産物を電気泳動により回収し、カラム型ＤＮＡゲル回収キットを用いて（ＴＩＡＮＧＥＮ）必要な約２００４ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用してＸｂａ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドＰｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢと連結し、統合プラスミド（即ち組換えベクター）ＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１１２６５又はＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを得、プラスミドには、カナマイシン抵抗性マーカーが含まれ、カナマイシンスクリーニングによりプラスミドがゲノムに統合された組換え子を得ることができる。
【0149】
前記組換えベクターＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１１２６５は、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターのＸｂａ Ｉと／ＢａｍＨ Ｉ認識部位間の断片（小断片）を配列表におけるＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０の３７～１９６６番目に示されるＤＮＡ断片に置換し、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターの他の配列をそのまま維持し、得られた組換えベクターである。
【0150】
前記組換えベクターＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａは、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターのＸｂａ Ｉと／ＢａｍＨ Ｉ認識部位間の断片（小断片）を配列表におけるＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１の３７～１９６６番目に示されるＤＮＡ断片に置換し、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターの他の配列をそのまま維持し、得られた組換えベクターである。
【0151】
ＰＣＲ系：ｌ０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４ μＬ、プライマー（ｌ０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総容積５０μＬ。
【0152】
前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で１２０秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われた。
【0153】
２つの統合プラスミド（ＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１１２６５とＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ）をそれぞれ電気転換により菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０に導入し、培養により生じた単一コロニーは、Ｐ１３／Ｐ１４プライマーＰＣＲで鑑定され、ＰＣＲが増幅できた大きさ約１１９０ｂｐの断片を含むのは、陽性菌株であり、断片を増幅できなかったのは、原菌である。陽性菌株は、１５％のショ糖スクリーニングを経てた後に、それぞれカナマイシンを含む培地板とカナマイシンを含まない培地板上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長するが、カナマイシンを含む培地上で成長しない菌株は、さらにＰ１５／Ｐ１６プライマーを採用してＰＣＲ鑑定され、増幅できた大きさ約１２００ｂｐの菌は、ＢＢＤ２９＿１１２６５又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子をコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０ゲノムに統合した菌株であり、ＹＰＧ－０１４（変異点を除く）とＹＰＧ－０１５（変異点を含む）と命名された。
【0154】
組換え菌ＹＰＧ－０１４は、２コピーのＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子を含み、２コピーＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子を含む組換え菌は、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子の発現量を顕著かつ安定的に増加させることができる。組換え菌ＹＰＧ－０１４は、ゲノム上の野生型ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子を過剰発現させる工学的菌である。
【0155】
組換え菌ＹＰＧ－０１５は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示される変異のＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を含み、組換え菌ＹＰＧ－０１５は、ゲノム上の変異型ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌である。
【0156】
ＰＣＲ鑑定プライマーは、以下に示される、
Ｐ１３：５’ ＧＴＣＣＡＡＧＧＴＧ ＡＣＧＧＣＣＧＣＡＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）
Ｐ１４：５’ ＴＧＣＧＡＴＣＴＣＴ ＧＴＣＡＡＴＧＣＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
Ｐ１５：５’ ＣＴＧＧＧＡＴＡＧＴ ＴＴＣＡＡＧＣＣＴＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
Ｐ１６：５’ ＡＴＡＴＴＣＧＧＣＣ ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）
実施例４ プラスミドにおいてＢＢＤ２９＿１１２６５又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌株の構築
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅するプライマーを１組設計して合成し、プライマー設計は、以下のとおりである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）。
Ｐ１７：５’ ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣ ＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：２１）
Ｐ１８：５’ ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣ ＴＴＡＴＴＧＣＧＴＡ ＧＧＡＧＧＣＣＡＧＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
構築方法：それぞれＹＰＧ－００１４又はＹＰＧ－００１３をテンプレートとし、プライマーＰ１７／Ｐ１８でＰＣＲ増幅を行い、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子及びそのプロモーター断片５２０ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２）又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子及びそのプロモーター断片５２０ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３３）を得、増幅産物を電気泳動により回収し、カラム型ＤＮＡゲル回収キットを用いて必要な５２０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用してＥｃｏＲ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドｐＸＭＪ１９と連結し、過剰発現プラスミド（即ち組換えベクター）ｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１１２６５又はｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを得た。プラスミドには、クロラムフェニコール耐性マーカーが含まれ、クロラムフェニコールスクリーニングにより得られたプラスミドを菌株に形質転換することができる。
Ｐ１３：５’ ＧＴＣＣＡＡＧＧＴＧ ＡＣＧＧＣＣＧＣＡＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）
Ｐ１４：５’ ＴＧＣＧＡＴＣＴＣＴ ＧＴＣＡＡＴＧＣＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
Ｐ１５：５’ ＣＴＧＧＧＡＴＡＧＴ ＴＴＣＡＡＧＣＣＴＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
Ｐ１６：５’ ＡＴＡＴＴＣＧＧＣＣ ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）
実施例４ プラスミドにおいてＢＢＤ２９＿１１２６５又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌株の構築
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅するプライマーを１組設計して合成し、プライマー設計は、以下のとおりである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）。
Ｐ１７：５’ ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣ ＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：２１）
Ｐ１８：５’ ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣ ＴＴＡＴＴＧＣＧＴＡ ＧＧＡＧＧＣＣＡＧＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
構築方法：それぞれＹＰＧ－００１４又はＹＰＧ－００１３をテンプレートとし、プライマーＰ１７／Ｐ１８でＰＣＲ増幅を行い、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子及びそのプロモーター断片５２０ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２）又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子及びそのプロモーター断片５２０ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３３）を得、増幅産物を電気泳動により回収し、カラム型ＤＮＡゲル回収キットを用いて必要な５２０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用してＥｃｏＲ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドｐＸＭＪ１９と連結し、過剰発現プラスミド（即ち組換えベクター）ｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１１２６５又はｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを得た。プラスミドには、クロラムフェニコール耐性マーカーが含まれ、クロラムフェニコールスクリーニングにより得られたプラスミドを菌株に形質転換することができる。
【0157】
前記組換えベクターｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１１２６５は、ｐＸＭＪ１９ベクターのＥｃｏＲ ＩとＫｐｎ Ｉ認識部位間の断片（小断片）を配列表におけるＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２の３７～４８６番目に示されるＤＮＡ断片に置換し、ｐＸＭＪ１９ベクターの他の配列をそのまま維持し、得られた組換えベクターである。
【0158】
前記組換えベクターｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａは、ｐＸＭＪ１９ベクターのＥｃｏＲ ＩとＫｐｎ Ｉ 認識部位間の断片（小断片）を配列表におけるＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３３の３７～４８６番目に示されるＤＮＡ断片に置換し、ｐＸＭＪ１９ベクターの他の配列をそのまま維持し、得られた組換えベクターである。
【0159】
ＰＣＲ系：ｌ０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（ｌ０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総容積５０μＬ。
【0160】
前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で４５秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われた。
【0161】
２つのプラスミド（ｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１１２６５とｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ）をそれぞれ電気転換により菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０に導入し、培養により生じた単一コロニーは、Ｍ１３Ｒ（－４８）とＰ１８プライマーでＰＣＲ鑑定され、ＰＣＲが増幅できた大きさ約５６９ｂｐの断片を含むのは、転入菌株であり、ＹＰＧ－０１６（点変異を除く）とＹＰＧ－０１７（点変異を含む）と命名された。
【0162】
組換え菌ＹＰＧ－０１６は、２コピーＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子を含み、組換え菌ＹＰＧ－０１６は、プラスミド上の野生型ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子を過剰発現させる工学的菌であり、即ちプラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１１２６５が染色体外に過剰発現を行う。
【0163】
組換え菌ＹＰＧ－０１７は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示される変異のＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を含み、組換え菌ＹＰＧ－０１７は、プラスミド上の変異型ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌であり、即ちプラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａが染色体外に過剰発現を行う。
【0164】
実施例５ ゲノムにおいてＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子を欠失させた工学的菌株の構築
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９のゲノム配列に基づき、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域両端の断片を増幅するプライマーを２組合成し、上下流相同アーム断片とする。プライマー設計は、以下のとおりである（上海英俊公司により合成された）。
Ｐ１９：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧ ＧＡＴＴＴＣＧＣＣＡ ＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）
Ｐ２０：５’ ＡＧＣＣＣＣＴＴＴＴＡＧＡＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＡＡＡＴＡＡＣＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）
Ｐ２１：５’ ＣＣＧＴＴＡＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＣＣＣＣＡＴＣＴＡＡＡＡＧＧＧＧＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
Ｐ２２：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＡＧ ＣＣＧＧＧＴＧＣＡＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）
構築方法：コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９をテンプレートとし、それぞれプライマーＰ１９／Ｐ２０とＰ２１／Ｐ２２でＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片７７３ｂｐ及び下流相同アーム断片７７８ｂｐを得た。さらにプライマーＰ１９／Ｐ２２でＰＣＲをオーバーラップして相同アーム断片１５１１ｂｐ全体を得た。ＰＣＲ反応終了後、増幅産物を電気泳動により回収し、カラム型ＤＮＡゲル回収キットを用いて必要な１５１１ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系によってＸｂａ Ｉ／ＢａｍＨ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドｐｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドと連結し、ノックアウトプラスミドを得た。該プラスミドには、カナマイシン抵抗性マーカーが含まれた。
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９のゲノム配列に基づき、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域両端の断片を増幅するプライマーを２組合成し、上下流相同アーム断片とする。プライマー設計は、以下のとおりである（上海英俊公司により合成された）。
Ｐ１９：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧ ＧＡＴＴＴＣＧＣＣＡ ＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）
Ｐ２０：５’ ＡＧＣＣＣＣＴＴＴＴＡＧＡＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＡＡＡＴＡＡＣＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）
Ｐ２１：５’ ＣＣＧＴＴＡＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＣＣＣＣＡＴＣＴＡＡＡＡＧＧＧＧＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
Ｐ２２：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＡＧ ＣＣＧＧＧＴＧＣＡＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）
構築方法：コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９をテンプレートとし、それぞれプライマーＰ１９／Ｐ２０とＰ２１／Ｐ２２でＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片７７３ｂｐ及び下流相同アーム断片７７８ｂｐを得た。さらにプライマーＰ１９／Ｐ２２でＰＣＲをオーバーラップして相同アーム断片１５１１ｂｐ全体を得た。ＰＣＲ反応終了後、増幅産物を電気泳動により回収し、カラム型ＤＮＡゲル回収キットを用いて必要な１５１１ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系によってＸｂａ Ｉ／ＢａｍＨ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドｐｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドと連結し、ノックアウトプラスミドを得た。該プラスミドには、カナマイシン抵抗性マーカーが含まれた。
【0165】
ノックアウトプラスミドを電気変換により菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０において、培養により生じた単一コロニーは、それぞれ以下のプライマー（上海英俊公司により合成された）でＰＣＲ鑑定され、
Ｐ２３：５’ ＧＡＴＴＴＣＧＣＣＡ ＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：２７）
Ｐ２４：５’ ＣＧＡＧＧＧＴＧＡＧ ＣＣＧＧＧＴＧＣＡＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：２８）
上記ＰＣＲ増幅できた大きさ１４３７ｂｐ及び１７１０ｂｐのバンドの菌株は、陽性菌株であり、１７１０ｂｐバンドのみを増幅できた菌株は、原菌である。陽性菌株は、１５％のショ糖培地上でスクリーニングした後に、それぞれカナマイシンを含む培地板とカナマイシンを含まない培地板上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長するが、カナマイシンを含む培地上で成長しない菌株は、さらにＰ２３／Ｐ２４プライマーを採用してＰＣＲ鑑定され、増幅できた大きさ１４３７ｂｐバンドの菌株は、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域がノックアウトされた遺伝子工学的菌株であり、ＹＰＧ－０１８（コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０上のゲノムにおけるＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子がノックアウトされた）と命名された。
Ｐ２３：５’ ＧＡＴＴＴＣＧＣＣＡ ＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：２７）
Ｐ２４：５’ ＣＧＡＧＧＧＴＧＡＧ ＣＣＧＧＧＴＧＣＡＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：２８）
上記ＰＣＲ増幅できた大きさ１４３７ｂｐ及び１７１０ｂｐのバンドの菌株は、陽性菌株であり、１７１０ｂｐバンドのみを増幅できた菌株は、原菌である。陽性菌株は、１５％のショ糖培地上でスクリーニングした後に、それぞれカナマイシンを含む培地板とカナマイシンを含まない培地板上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長するが、カナマイシンを含む培地上で成長しない菌株は、さらにＰ２３／Ｐ２４プライマーを採用してＰＣＲ鑑定され、増幅できた大きさ１４３７ｂｐバンドの菌株は、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域がノックアウトされた遺伝子工学的菌株であり、ＹＰＧ－０１８（コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０上のゲノムにおけるＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子がノックアウトされた）と命名された。
【0166】
実施例６ Ｌ－グルタミン酸発酵実験
上記実施例２～５で構築された菌株（ＹＰＧ－０１３、ＹＰＧ－０１４、ＹＰＧ－０１５、ＹＰＧ－０１６、ＹＰＧ－０１７、ＹＰＧ－０１８）とオリジナル菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０をＢＬＢＩ０－５ＧＣ－４－Ｈ型番の発酵槽（上海百崙生物科技有限公司から購入された）で、表３に示される培地と表４に示される発酵制御プロセスに従って発酵実験を行った。各菌株は３回繰り返し、結果を表５に示す。
結果は、表５に示すように、コリネバクテリウム・グルタミクムにおいてＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子を過剰発現させ、又はＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域に対して点変異ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ及び／又はＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子又はその変異遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを過剰発現させることにより、Ｌ－グルタミン酸生産量の向上に有利であるが、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子を弱化又はノックアウトすることにより、Ｌ－グルタミン酸の蓄積に不利である。
上記実施例２～５で構築された菌株（ＹＰＧ－０１３、ＹＰＧ－０１４、ＹＰＧ－０１５、ＹＰＧ－０１６、ＹＰＧ－０１７、ＹＰＧ－０１８）とオリジナル菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０をＢＬＢＩ０－５ＧＣ－４－Ｈ型番の発酵槽（上海百崙生物科技有限公司から購入された）で、表３に示される培地と表４に示される発酵制御プロセスに従って発酵実験を行った。各菌株は３回繰り返し、結果を表５に示す。
【表3】
【表4】
【表5】
【0167】
以上、本発明について詳細に記述した。当業者にとって、本発明の主旨と範囲を逸脱することなく、及び不必要な実験を行うことなく、同等のパラメータ、濃度と条件で、より広範囲内で本発明を実施することができる。本発明は、特別な実施例を与えるが、本発明をさらに改良できると理解されるべきである。要すると、本発明の原理によれば、本出願は、任意の変更、用途又は本発明の改良を含むことが望ましく、本出願において開示された範囲から逸脱し、本分野で既知の従来技術を用いた変更を含む。以下に付随する請求項の範囲によれば、いくつかの基本的特徴の応用を行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【0168】
本発明は、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子の弱化又はノックアウトにより、該遺伝子のコードする産物がＬ－グルタミン酸生産能力に影響を与え、コード配列に点変異を導入し、又は該遺伝子のコピー数を増加又は過剰発現させて組換え菌株を得ることにより、得られた菌株が未改造の菌株と比べて、高濃度のグルタミン酸を生産するのに有利であることを発見した。
具体的には、本発明は、まずアレル置換の方式でコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０のＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）に点変異を導入し、点変異（Ｇ－Ａ）を含む遺伝子工学的菌ＹＰＧ－０１３を構築した。菌生産中に野生型ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子又はその変異遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを過剰発現させることでＬ－グルタミン酸の生産量を向上させることができることをさらに研究検証するために、それぞれ外来遺伝子を宿主染色体に統合し又はプラスミド染色が体外に発現させ、ゲノム上とプラスミド上においてＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌ＹＰＧ－０１４、ＹＰＧ－０１５、ＹＰＧ－０１６とＹＰＧ－０１７を構築した。実験によると、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子及びその変異体は、Ｌ－グルタミン酸の生物合成に関与しており、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子の過剰発現又はノックアウト、又は固定点変異（例えば点変異）を行うことにより、Ｌ－グルタミン酸の微生物における蓄積量を制御することができる。ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域に対して点変異又は菌生産中にＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子又はその変異遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを過剰発現させることにより、Ｌ－グルタミン酸生産量及び形質転換率の向上に有利であるが、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子に対してノックアウト又は弱化を行うことは、Ｌ－グルタミン酸の蓄積に不利である。ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子及びその変異体（例えばＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子）を利用してＬ－グルタミン酸を生産する遺伝子工学的菌種を構築し、Ｌ－グルタミン酸生産量の向上を促進することができ、工業化生産に適合する高生産、高品質の菌種を育成し、Ｌ－グルタミン酸の工業化生産に対して広範な応用価値と重要な経済意義を持つ。
具体的には、本発明は、まずアレル置換の方式でコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０のＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）に点変異を導入し、点変異（Ｇ－Ａ）を含む遺伝子工学的菌ＹＰＧ－０１３を構築した。菌生産中に野生型ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子又はその変異遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを過剰発現させることでＬ－グルタミン酸の生産量を向上させることができることをさらに研究検証するために、それぞれ外来遺伝子を宿主染色体に統合し又はプラスミド染色が体外に発現させ、ゲノム上とプラスミド上においてＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子又はＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌ＹＰＧ－０１４、ＹＰＧ－０１５、ＹＰＧ－０１６とＹＰＧ－０１７を構築した。実験によると、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子及びその変異体は、Ｌ－グルタミン酸の生物合成に関与しており、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子の過剰発現又はノックアウト、又は固定点変異（例えば点変異）を行うことにより、Ｌ－グルタミン酸の微生物における蓄積量を制御することができる。ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子コード領域に対して点変異又は菌生産中にＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子又はその変異遺伝子ＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａを過剰発現させることにより、Ｌ－グルタミン酸生産量及び形質転換率の向上に有利であるが、ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子に対してノックアウト又は弱化を行うことは、Ｌ－グルタミン酸の蓄積に不利である。ＢＢＤ２９＿１１２６５遺伝子及びその変異体（例えばＢＢＤ２９＿１１２６５Ｇ７０Ａ遺伝子）を利用してＬ－グルタミン酸を生産する遺伝子工学的菌種を構築し、Ｌ－グルタミン酸生産量の向上を促進することができ、工業化生産に適合する高生産、高品質の菌種を育成し、Ｌ－グルタミン酸の工業化生産に対して広範な応用価値と重要な経済意義を持つ。
【受託番号】
【0169】
菌種名：コリネバクテリウム・グルタミクム：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、菌株番号：ＹＰＧＬＵ００１、受託番号：ＣＧＭＣＣ ２１２２０
【配列表】
【国際調査報告】