特表2024-505886 | 知財ポータル「IP Force」

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特表2024-505886セクレトームを調製する方法及びその使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-08

(54)【発明の名称】セクレトームを調製する方法及びその使用

(51)【国際特許分類】

A61K 38/22 20060101AFI20240201BHJP

A61K 38/16 20060101ALI20240201BHJP

A61K 38/39 20060101ALI20240201BHJP

A61K 38/18 20060101ALI20240201BHJP

A61K 38/20 20060101ALI20240201BHJP

A61K 38/24 20060101ALI20240201BHJP

A61K 38/48 20060101ALI20240201BHJP

A61P 21/00 20060101ALI20240201BHJP

A61K 31/573 20060101ALI20240201BHJP

A61K 31/568 20060101ALI20240201BHJP

A61P 5/38 20060101ALI20240201BHJP

A61P 5/26 20060101ALI20240201BHJP

A61K 9/16 20060101ALI20240201BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20240201BHJP

A61K 47/26 20060101ALI20240201BHJP

C07K 14/47 20060101ALI20240201BHJP

C12N 15/12 20060101ALI20240201BHJP

C12P 21/02 20060101ALI20240201BHJP

C12N 5/0735 20100101ALN20240201BHJP

【ＦＩ】

A61K38/22 ZNA

A61K38/16

A61K38/39

A61K38/18

A61K38/20

A61K38/24

A61K38/48

A61P21/00

A61K31/573

A61K31/568

A61P5/38

A61P5/26

A61K9/16

A61P43/00 111

A61P43/00 105

A61K47/26

C07K14/47

C12N15/12

C12P21/02 A

C12N5/0735

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023545273

(86)(22)【出願日】2022-01-26

(85)【翻訳文提出日】2023-08-24

(86)【国際出願番号】 US2022013834

(87)【国際公開番号】W WO2022164854

(87)【国際公開日】2022-08-04

(31)【優先権主張番号】63/169,203

(32)【優先日】2021-03-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/142,456

(32)【優先日】2021-01-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/177,346

(32)【優先日】2021-04-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523281401

【氏名又は名称】イミュニス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本健策

(72)【発明者】

【氏名】ペインター，ジェシーシルバ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA10

4B064DA01

4B065AA93X

4B065AC14

4B065BA30

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA31

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076CC09

4C076CC26

4C076CC29

4C076CC30

4C076DD67R

4C076FF39

4C076FF61

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA44

4C084DA18

4C084DA25

4C084DB01

4C084DB49

4C084DB52

4C084DB54

4C084DB55

4C084DB58

4C084DB60

4C084DB61

4C084DB62

4C084DC09

4C084DC50

4C084MA02

4C084MA41

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA941

4C084ZB211

4C084ZC411

4C086AA01

4C086DA09

4C086DA11

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA17

4C086MA66

4C086NA05

4C086ZC08

4C086ZC10

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045EA20

4H045FA72

(57)【要約】

薬学的組成物及びそれらを生成する方法が、記載されている。薬学的組成物は、（Ａ）フォリスタチンタンパク質またはそのバリアント、及び（Ｂ）フェチュインＡタンパク質またはその断片もしくはバリアントを含み得、（Ｂ）が、ＴＧＦ－βに結合することが可能であり、（Ａ）及び（Ｂ）の総量が、組成物中の総タンパク質の１０％超である。セクレトーム組成物を調製する方法は、トレハロースを含むタンパク質不含培地中で幹細胞を培養することと、試料から上清を採取し、上清を、トレハロースを含む新鮮なタンパク質不含培地と置き換えることと、採取した上清を合わせてセクレトーム組成物を調製することと、を含み得る。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（Ａ）フォリスタチンタンパク質またはそのバリアント、及び（Ｂ）フェチュインＡタンパク質（アルファ－２－ＨＳ糖タンパク質）またはその断片もしくはバリアントを含む、薬学的組成物であって、（Ｂ）が、ＴＧＦ－βに結合することが可能であり、（Ａ）及び（Ｂ）の総量が、前記組成物中の総タンパク質の約１０％超である、前記薬学的組成物。

【請求項2】

前記フォリスタチンタンパク質が、配列番号１～１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項3】

前記フォリスタチンタンパク質の前記バリアントが、配列番号１～１３のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％の配列同一性を有する、請求項２に記載の薬学的組成物。

【請求項4】

前記フォリスタチンタンパク質の前記バリアントが、フォリスタチンＮ末端（ＦＯＬＮ）ドメインを含む、請求項３に記載の薬学的組成物。

【請求項5】

前記ＦＯＬＮドメインが、配列番号１４～１６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１４～１６のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の薬学的組成物。

【請求項6】

前記ＦＯＬＮドメインが、配列番号１４～１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の薬学的組成物。

【請求項7】

前記フェチュインＡタンパク質が、配列番号１７～２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項8】

前記フェチュインＡタンパク質の前記断片または前記バリアントが、配列番号２７のアミノ酸配列、または配列番号２７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の薬学的組成物。

【請求項9】

前記フェチュインＡタンパク質の前記断片または前記バリアントが、一本鎖または二本鎖タンパク質である、請求項７に記載の薬学的組成物。

【請求項10】

前記（Ａ）が、配列番号１～１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記（Ｂ）が、配列番号１７～２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２７の断片を含む配列番号１７～２０のうちのいずれか１つの断片である、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項11】

（Ａ）及び（Ｂ）の前記総量が、前記組成物中の総タンパク質の約２０％超である、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項12】

前記総タンパク質が、筋形成アンタゴニスト因子を約２０％を超えて含まず、前記筋形成アンタゴニスト因子が、ＩＧＦＢＰ－３（インスリン様成長因子結合タンパク質３）及びＤｋｋ－３（ｄｉｃｋｋｏｐｆＷＮＴシグナル伝達経路阻害剤３）を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項13】

前記筋形成アンタゴニスト因子が、ペリオスチン、ＴＧＦｂ１、ＩＬ－６、ＦＧＦ－２１、ＴＧＦｂ２、ＴＮＦｂ、ＴＧＦｂ３、アクチビンＡ、ＴＧＦｂ１、及びＴＧＦａをさらに含む、請求項１２に記載の薬学的組成物。

【請求項14】

１つ以上の筋形成誘発性因子をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項15】

前記筋形成誘発性因子が、ＯＰＮ、ＩＧＦＢＰ－４、ＭＭＰ－１、ＴＳＰ－１、ＧＲＯａ、ＭＭＰ－１０、ｂＩＧ－Ｈ３、ｈＣＧｂ、ＲＧＭ－Ｂ、ＶＥＧＦ、Ｃｒｉｐｔｏ－１、ＨＧＦ、ＢＭＰ－５、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ－２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＦＧＦ－１９、及びＷＩＳＰ－１のうちの１つ以上を含む、請求項１４に記載の薬学的組成物。

【請求項16】

前記筋形成誘発性因子の総量及び前記筋形成アンタゴニスト因子の総量が、３：１超の比を有する、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項17】

患者の筋肉量、筋力、または筋機能を改善するための方法であって、
（Ａ）フォリスタチンタンパク質またはそのバリアント、及び（Ｂ）フェチュインＡタンパク質（アルファ－２－ＨＳ糖タンパク質）またはその断片もしくはバリアントを含む、薬学的組成物を前記患者に投与するステップであって、（Ｂ）が、ＴＧＦ－βに結合することが可能であり、（Ａ）及び（Ｂ）の総量が、前記組成物中の総タンパク質の約１０％超である、前記ステップを含む、前記方法。

【請求項18】

前記投与が、筋肉内、静脈内、または皮下である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記患者が、筋損傷、筋萎縮、筋機能不全、または筋線維症に罹患している、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

セクレトーム組成物を調製する方法であって、
約５％～２５％ｗ／ｖの濃度でトレハロースを含むタンパク質不含培地中で幹細胞を培養するステップと、
前記試料から上清を採取し、前記上清を、約５％～２５％ｗ／ｖの濃度でトレハロースを含む新鮮なタンパク質不含培地と置き換えるステップと、
前記採取した上清を合わせて、前記セクレトーム組成物を調製するステップと、を含む、前記方法。

【請求項21】

タンジェンシャルフロー濾過を使用して、前記合わせた採取した上清の体積を低減するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記タンジェンシャルフロー濾過による前記体積低減が、５０：１～１００：１である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記タンジェンシャルフロー濾過が、１～５ｋＤａのカットオフ膜を利用する、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記採取した上清から生細胞を除去するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項25】

セクレトーム組成物を調製する方法であって、前記方法が、
ｂＦＧＦ及びアクチビンＡを含む培養培地中で、約３日間～約７日間、多能性幹細胞を増殖させるステップと、
トレハロースを含むタンパク質不含培地に前記多能性幹細胞を曝露させるステップであって、前記トレハロース濃度が、５％～２５％である、前記ステップと、
前記培養上清を毎日採取し、約１日間～約１０日間、トレハロースを含む追加のタンパク質不含培地と置き換えるステップと、
前記採取した培養上清を合わせて、合わせた培養上清のプールを形成するステップと、
前記合わせた培養上清のプールを均質化して、均質化された合わせた培養上清のプールを形成するステップと、
前記均質化された合わせた培養上清のプールを膜フィルターに通して濾過して、濾過された均質化された合わせたプールを形成するステップと、を含む、前記方法。

【請求項26】

タンジェンシャルフロー濾過を使用して、前記濾過された均質化された合わせたプールの体積を低減するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記タンジェンシャルフロー濾過による前記体積低減が、５０：１～１００：１である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記タンジェンシャルフロー濾過が、１～５ｋＤａのカットオフ膜を利用する、請求項２６に記載の方法。

【請求項29】

前記濾過された均質化された合わせたプールから生細胞を除去するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項30】

セクレトーム組成物であって、
フェチュインＡ、フォリスタチン、及びフォリスタチン様－１からなる群から選択される少なくとも２つの筋形成アゴニストを含み、
前記少なくとも２つの筋形成アゴニストの合わせた濃度が、約１～約２０ｐｍｏｌ／ｍＬである、前記セクレトーム組成物。

【請求項31】

前記少なくとも２つの筋形成アゴニストが、ＯＰＮ、ＩＧＦＢＰ－４、ＭＭＰ－１、ＴＳＰ－１、ＧＲＯａ（ＣＸＣＬ１）、ＭＭＰ－１０、ｂＩＧ－Ｈ３、ｈＣＧｂ、ＲＧＭ－Ｂ、ＶＥＧＦ、Ｃｒｉｐｔｏ－１、ＨＧＦ、ＢＭＰ－５、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ－２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＦＧＦ－１９、ＷＩＳＰ－１、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項３０に記載の組成物。

【請求項32】

前記組成物が、少なくとも２つの筋形成アンタゴニストをさらに含む、請求項３０に記載の組成物。

【請求項33】

前記組成物が、約１ｐｍｏｌ／ｍＬ未満の前記少なくとも２つの筋形成アンタゴニストの濃度を有する、請求項３２に記載の組成物。

【請求項34】

前記少なくとも２つの筋形成アンタゴニストが、アクチビンＡ及びＴＧＦｂ１を含む、請求項３２に記載の組成物。

【請求項35】

前記少なくとも２つの筋形成アゴニスト対前記少なくとも２つの筋形成アンタゴニストの濃度の比が、約４：１～約８：１である、請求項３２に記載の組成物。

【請求項36】

前記少なくとも２つの筋形成アゴニスト対前記少なくとも２つの筋形成アンタゴニストの濃度の比が、約５：１～約８：１である、請求項３２に記載の組成物。

【請求項37】

前記少なくとも２つの筋形成アゴニスト対前記少なくとも２つの筋形成アンタゴニストの濃度の比が、約５：１～約２００：１である、請求項３２に記載の組成物。

【請求項38】

薬学的組成物であって、
フェチュインＡ、フォリスタチン、及びフォリスタチン様－１からなる群から選択される少なくとも２つの筋形成アゴニストであって、前記少なくとも２つの筋形成アゴニストの合わせた濃度が、約１～約２０ｐｍｏｌ／ｍＬである、前記少なくとも２つの筋形成アゴニストと、
薬学的に許容される担体と、
薬学的に許容される防腐剤と、を含む、前記薬学的組成物。

【請求項39】

前記薬学的に許容される担体が、７．０～７．８のｐＨを有する生理学的緩衝液である、請求項３８に記載の組成物。

【請求項40】

前記薬学的に許容される防腐剤が、トレハロースである、請求項３８に記載の組成物。

【請求項41】

前記薬学的組成物が、凍結乾燥方法によって保存された粉末である、請求項３８に記載の組成物。

【請求項42】

前記薬学的組成物が、ガンマ線照射によって滅菌される、請求項３８に記載の組成物。

【請求項43】

前記薬学的組成物が、単回用量ガラス容器に充填されるか、または単回用量シリンジを使用する準備ができている、請求項３８に記載の組成物。

【請求項44】

前記薬学的組成物が、コルチコステロイドをさらに含む、請求項３８に記載の組成物。

【請求項45】

前記薬学的組成物が、アナボリックステロイドをさらに含む、請求項３８に記載の組成物。

【請求項46】

筋肉を治療するための方法であって、前記方法が、
フェチュインＡ、フォリスタチン、及びフォリスタチン様－１からなる群から選択される少なくとも２つの筋形成アゴニストであって、前記少なくとも２つの筋形成アゴニストの合わせた濃度が、約１～約２０ｐｍｏｌ／ｍＬである、前記少なくとも２つの筋形成アゴニストと、薬学的に許容される担体と、薬学的に許容される防腐剤と、を含む、組成物を対象に投与するステップを含む、前記方法。

【請求項47】

前記組成物が、注射によって投与される、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記注射が、筋肉内、静脈内、または皮下に投与される、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記組成物が、１回、毎日、毎週、または毎月投与される、請求項４７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）条の下、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる、２０２１年１月２７日出願の米国仮出願第６３／１４２，４５６号、２０２１年３月３１日出願の米国仮出願第６３／１６９，２０３号、及び２０２１年４月２０日出願の米国仮出願第６３／１７７，３４６号からの優先権の利益を主張する。

【0002】

本明細書に記載の主題は、概して、セクレトームを調製する方法、及び老化に関連する状態を含む様々な状態の治療のためのそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0003】

病気、損傷、または手術からの回復の結果として老化すると、多くの場合、筋肉廃用期間が生じる（１～３）。これらの廃用事象は、多くの場合、骨格筋筋肉量の急速な萎縮及び衰弱をもたらし、予後不良、及び再入院またはさらなる損傷のリスク増加に関連付けられる（４）。老化に関連する筋肉量及び筋力の損失（５）は、可動性及び生活の質の減少を生じながら、また、他の併存疾患のリスク及び死亡率も増加させる（６～８）。さらに、多くの場合、老化した筋肉では廃用性萎縮からの回復が弱まり、以前のベースラインの筋肉サイズ及び筋機能の品質を完全に達成することはない（９、１０）。したがって、老化中の骨格筋を標的とし、筋萎縮を緩和するのに十分に有効でありながら、廃用後の筋肉回復を改善する、新規の療法が必要とされている。

【0004】

老化中の筋機能不全に関連する一般的に研究されている機序は、骨格筋における線維化、すなわち細胞外マトリックス（特にコラーゲン）の蓄積である（１１、１２）。過度の筋肉コラーゲン沈着は、力を生成する機能的能力を損なう（６、７、９、１３）。最近のエビデンスは、老化したマウスの筋肉中のコラーゲンの存在量が、若いマウスのそれと比較してほぼ２倍であることを実証している（１４）が、これが、コラーゲン発現の増加またはターンオーバー不良と相関するかは明らかではない（１５）。げっ歯類における筋肉廃用性は、コラーゲンの蓄積にさらに寄与し（１６、１７）、したがって、過度の線維化が、老化中の筋肉回復が最適に至らないことに関与し得るという懸念を高めている。老化に関連する筋線維症に付随する現象は、筋肉が損傷から回復する能力に重要である、筋衛星細胞プールの低下である（１８、１９）。さらに、老化は、筋形成の継続に必要である損傷中の筋形成衛星細胞（ｍｙｏｇｅｎｉｃｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌ）の数及び活性の低下に関連付けられる（１９～２１）。したがって、衛星細胞機能の変化及びコラーゲン沈着は、廃用及び回復中の老化中の筋肉の質の低下に部分的に寄与する可能性が高いとみなすのが妥当である。

【0005】

多くの研究は、老化における筋線維症及び衛星細胞機能の機序を調べてきたが、この表現型に向かう筋肉の老化、ならびに廃用性萎縮及び回復状態中の悪化を促進するものについての理解には依然として大きなギャップが存在する。１つの可能性は、老化に関連付けられる機能不全の免疫系であり（２２、２３）、損傷または廃用性萎縮から回復中の骨格筋の再生または再成長は、衛星細胞の活性化及び増殖ならびに適切なＥＣＭリモデリングを確実にするために、厳密に制御された炎症誘発性及び抗炎症性局所環境を促進する免疫細胞（例えば、好中球、マクロファージ）の注意深くタイミングを合わせて調整された事象を必要とする（２４）。我々の研究室及び他の研究室は、廃用性萎縮の回復中に炎症誘発性マクロファージ応答を損なった、老化した骨格筋が存在することに注目している（２、２５）。損傷または廃用性萎縮から回復中のマクロファージ活性の枯渇（化学的または遺伝的アプローチ）は、筋線維症及び不完全な筋肉回復をもたらし（２６～３０）、したがって、筋肉の適切な再成長のためのマクロファージ機能の重要性を強調している。

【0006】

老化した骨格筋の廃用性萎縮及び回復中の介入を採用した研究はほとんどなく、その結果は両義的である（１３、３１～３３）。これらの研究は、筋肉サイズ及び筋機能に十分に有効ではないが、衛星細胞の活性化を含む、筋肉細胞成長に関与する様々な細胞経路を強調している（１３、３１、３２、３４～３６）。したがって、廃用及び回復中の老化した骨格筋の筋肉量及び筋機能を促進する療法に対する必要性が依然として存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

この問題に対処するために、廃用及び回復中の老化した骨格筋の筋肉量及び筋機能を促進するためのセクレトーム産生物（ＳＴＥＭと称される）の有効性を生じさせ、研究した。ＳＴＥＭは、廃用中の骨格筋萎縮を軽減し、回復中の再成長を改善することが見出された。ＳＴＥＭはまた、老化した筋肉マクロファージ及び衛星細胞表現型を向上させながら、また筋線維症を低減した。

【0008】

高齢者は、廃用性萎縮の期間を経験するリスクがあり、その結果、遅く、不完全な筋肉回復に直面する。廃用中の筋肉量損失を軽減し、回復を改善するためにいくつかの療法が採用されているが、両方に有効であることが証明されているものはほとんどない。したがって、この研究の目的は、廃用及び回復中の老化した骨格筋の筋肉量及び筋機能に対する、独自に開発されたセクレトーム産生物（ＳＴＥＭ）の有効性を調べることであった。老化した（２２ヵ月）の雄のＣ５７ＢＬ／６を、ＰＢＳまたはＳＴＥＭ治療（ｎ＝３０）に分割した。各治療内で、歩行可能な対照（１４日間の正常なケージ歩行）、１４日間の後肢免荷（ＨＵ）、または１４日間の後肢免荷、続いて７日間の回復のいずれかに、マウスを割り当てた。マウスに、それぞれの治療群の期間の間、１日おきに、ＰＢＳまたはＳＴＥＭのいずれかの後肢筋肉への筋肉内送達を与えた。ＳＴＥＭ治療は、対照及び回復（なぜ活用されたのか？）中にヒラメ筋筋肉量、線維ＣＳＡ（定義）、及び握力を増加させながら、ＨＵ中の萎縮及び衰弱を減弱させることが見出された。筋肉炎症誘発性（ＣＤ６８＋）及び抗炎症性（ＣＤ１６３＋）マクロファージは、歩行可能な対照マウスで増加したが、炎症誘発性のみは、ＳＴＥＭ投与を伴うＨＵ及び回復中に増加した。さらに、ＳＴＥＭは、全ての治療群にわたってコラーゲンターンオーバー及びＰａｘ７＋細胞を増加させた。筋肉に対するＳＴＥＭの細胞自律的な役割を調べるためのフォローアップとして、Ｃ２Ｃ１２筋管に４％のＳＴＥＭまたは４％のウマ血清培地を与えて、筋管融合／サイズ、及び筋肉遺伝子ネットワークに対する影響を調べた。ＳＴＥＭ治療Ｃ２Ｃ１２筋管は、より大きく、より高い融合指数を有し、細胞外マトリックスリモデリングに関連付けられる定義された経路に関連付けられる遺伝子の発現の上昇に関連していた。結果は、ＳＴＥＭが、様々な老化に関連する状態にわたって骨格筋を改善する翻訳可能性を有し得る、強力な同化、免疫調節、及び細胞骨格リモデリング特性を有する独自のカクテルであることを実証している。

【0009】

【0010】

前述の要約、ならびに本発明の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて閲読するとより良好に理解されるであろう。本発明は、図面に示される正確な実施形態に限定されないことに留意すべきである。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】様々な実験のタイムラインを示す。

【0012】

【図2A】１４日間の正常なケージ歩行中の、老化した骨格筋に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【図2B】１４日間の正常なケージ歩行中の、老化した骨格筋に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【図2C】１４日間の正常なケージ歩行中の、老化した骨格筋に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【図2D】１４日間の正常なケージ歩行中の、老化した骨格筋に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【図2E】１４日間の正常なケージ歩行中の、老化した骨格筋に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【図2F】１４日間の正常なケージ歩行中の、老化した骨格筋に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【0013】

【図3A】１４日間の後肢免荷中の、老化した骨格筋に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【図3B】１４日間の後肢免荷中の、老化した骨格筋に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【図3C】１４日間の後肢免荷中の、老化した骨格筋に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【図3D】１４日間の後肢免荷中の、老化した骨格筋に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【図3E】１４日間の後肢免荷中の、老化した骨格筋に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【図3F】１４日間の後肢免荷中の、老化した骨格筋に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【0014】

【図4A】７日間の回復中の、老化した骨格筋に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【図4B】７日間の回復中の、老化した骨格筋に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【図4C】７日間の回復中の、老化した骨格筋に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【図4D】７日間の回復中の、老化した骨格筋に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【図4E】７日間の回復中の、老化した骨格筋に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【図4F】７日間の回復中の、老化した骨格筋に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【0015】

【図5A】Ｃ２Ｃ１２筋管融合、サイズ、及びＲＮＡ配列決定に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【図5B】Ｃ２Ｃ１２筋管融合、サイズ、及びＲＮＡ配列決定に対するセクレトームの実験からの結果を示す。

【0016】

【図6A】ＥＬＩＳＡによって同定されたセクレトームにおいて発現した因子を示す。

【図6B】ＥＬＩＳＡによって同定されたセクレトームにおいて発現した因子を示す。

【図6C】ＥＬＩＳＡによって同定されたセクレトームにおいて発現した因子を示す。

【0017】

【図7-1】フォリスタチンタンパク質及びそのバリアントの例示的な配列を示す。

【図7-2】フォリスタチンタンパク質及びそのバリアントの例示的な配列を示す。

【図7-3】フォリスタチンタンパク質及びそのバリアントの例示的な配列を示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本明細書で言及される全ての参考文献及び刊行物は、全ての目的のために、それらの全体が参照により明示的に組み込まれる。

【0019】

別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別段文脈が明らかに指定しない限り、複数の指示対象を含むことに留意する必要がある。したがって、例えば、「ペプチド」への言及は、複数のペプチドを含む。

【0020】

数値表記、例えば、範囲を含む温度、時間、量、及び濃度の前で使用される場合、「約」という用語は、（＋）または（－）１０％、５％、または１％変動し得る近似値を示す。

【0021】

図１。実験設計。３つの実験の日数単位での各々の長さ。黒丸は、ＳＴＥＭ／ＰＢＳの筋肉内注射及び筋力測定が行われた時点を示す。

【0022】

図２Ａ～２Ｆ。１４日間の正常なケージ歩行中の老化した骨格筋に対するＳＴＥＭ。パネルは、ベースライン時（治療の前日）、ならびに通常のケージ歩行の１３日目（組織採取の前日）に繰り返した、ＰＢＳ及びＳＴＥＭ治療マウスの握力（図２Ａ）を表す。正常なケージ歩行の１４ｄ後のＳＴＥＭ及びＰＢＳ治療マウスの、ヒラメ筋筋肉量（ｍｇ）（図２Ｂ）及びヒラメ筋断面積（ＣＳＡ；ｕｍ２）（図２Ｃ）。正常なケージ歩行の１４ｄ後のＳＴＥＭ及びＰＢＳ治療マウスの、ヒラメ筋ＢＣＨＰ／ＣＯＬＩＶ比（図２Ｄ）、ならびにＣＤ６８＋及びＣＤ１６３＋存在量（図２Ｅ）、ならびにＰＡＸ７＋存在量（図２Ｆ）。代表的な免疫組織化学画像を、各パネルの隣に示す。ＡＣは、歩行可能な対照を示す。Ｎ＝各群に５匹のマウス。結果は、（図２Ａ）で使用した平均２元配置分散分析繰り返し測定値の標準誤差を伴う平均である。ＰＢＳとＳＴＥＭとの間のＴ検定。†＝全ての群とは異なる。＊＝ＰＢＳとは異なる。

【0023】

図３Ａ～３Ｆ。１４日間の後肢免荷中の老化した骨格筋に対するＳＴＥＭ効果。パネルは、ベースライン時（治療の前日）、ＨＵ（後肢免荷）の７日目及びＨＵの１３日目（組織採取の前日）に繰り返した、ＰＢＳ及びＳＴＥＭ治療マウスの握力（図３Ａ）を表す。ＨＵの１４ｄ後の、ＳＴＥＭ及びＰＢＳ治療マウスにおけるヒラメ筋筋肉量（ｍｇ）（図３Ｂ）、ならびにＰＢＳ及びＳＴＥＭ治療マウスにおけるヒラメ筋断面積（ＣＳＡ；ｕｍ２）（図３Ｃ）。ＨＵの１４ｄ後のＳＴＥＭ及びＰＢＳ治療マウスの、ヒラメ筋ＢＣＨＰ／ＣＯＬＩＶ比（図３Ｄ）、ならびにＣＤ６８＋及びＣＤ１６３＋存在量（図３Ｅ）、ならびにＰＡＸ７＋存在量（図３Ｆ）。Ｎ＝各群に５匹のマウス。結果は、平均値の標準誤差を伴う平均である。ＰＢＳとＳＴＥＭとの間のＴ検定。＊＊＊＝全てのＰＢＳ群は互いに異なる。＊＝ＰＢＳとは異なる。

【0024】

図４Ａ～４Ｆ。７日間の回復中の老化した骨格筋に対するＳＴＥＭの効果。パネルは、ベースライン時（治療の前日）、ＨＵ（後肢免荷）の１４日目、及びＲＬの６日目（再荷重、組織採取の前日）に繰り返した、ＰＢＳ及びＳＴＥＭ治療マウスの握力（図４Ａ）を表す。回復の７ｄ後のＰＢＳ及びＳＴＥＭ治療マウスにおける、ヒラメ筋筋肉量（ｍｇ）（図４Ｂ）及びヒラメ筋断面積（ＣＳＡ；ｕｍ２）（図４Ｃ）。回復の７ｄ後のＰＢＳ及びＳＴＥＭ治療した歩行可能な対照マウスにおける、ヒラメ筋ＢＣＨＰ／ＣＯＬＩＶ（図４Ｄ）、ならびにＣＤ６８＋及びＣＤ１６３＋存在量（図４Ｅ）、ならびにＰＡＸ７＋存在量（図４Ｆ）。Ｎ＝各群に５匹のマウス。結果は、（図４Ａ）で使用した平均２元配置分散分析繰り返し測定値の標準誤差を伴う平均である。ＰＢＳとＳＴＥＭとの間のＴ検定。＊＊＊＝全てのＰＢＳ群は互いに異なる。†＝全ての群とは異なる。＊＝ＰＢＳとは異なる。

【0025】

図５Ａ～５Ｂ。ＳＴＥＭは、Ｃ２Ｃ１２筋管融合、サイズ、及びＲＮＡ配列決定に影響を及ぼす。パネルは、対照（２％及び４％のウマ血清）及び２～２４％のＳＴＥＭ治療Ｃ２Ｃ１２筋管の、筋核融合（％）及び筋管サイズの定量を表す（図５Ａ）（方法を参照されたい）。筋核融合及び筋管面積パーセントについての４％のウマ血清及びＳＴＥＭの代表的な画像。（図５Ｂ）４％のウマ血清（対照）と比較した４％のＳＴＥＭ治療筋管における、遺伝子が有意に増加及び減少した火山プロット及び表の上段。結果は、平均１元配置分散分析の標準誤差を伴う平均である。＊＝実線の下にない全ての群とは異なる。

【0026】

図６Ａ～６Ｃ。ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＥＬＩＳＡによって同定されたＳＴＥＭにおける上位発現因子。上位に同定された成長因子（図６Ａ）、免疫調節因子（図６Ｂ）、及び細胞骨格因子（図６Ｃ）。全ての値は、平均値の標準誤差を伴う平均である。値は、３つの別々の試料からＭｕｌｔｉｐｌｅｘＥＬＩＳＡを介して得、ｐｇ／ｍｌで報告した。分類は、Ｒｅａｃｔｏｍｅを使用して支援した。

【0027】

図７は、フォリスタチンタンパク質及びそのバリアントの例示的な配列である。

【0028】

材料及び方法
動物
ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｎＡｇｉｎｇｍｏｕｓｅｃｏｌｏｎｙによって寛大にも提供された２２ヵ月齢の３０匹の老化した雄Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）を、ＰＢＳまたはＳＴＥＭ治療群（ｎ＝１５／群）に分割した。次いで、各治療内のマウスを、３つの実験群：ａ）歩行可能な対照（１４日間の正常なケージ歩行）（ＣＯＮ；ｎ＝５）、ｂ）１４日間の後肢免荷として定義される廃用（ＨＵ；ｎ＝５）、またはｃ）１４日間の後肢免荷、続いて７日間の回復として定義される廃用からの回復（回復；ｎ＝５）のうちの１つに割り当てた（図１）。自由に餌及び水へアクセスさせて動物を収容し、１２時間の明／暗サイクルで維持した。全ての実験手順は、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＵｔａｈのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって設定されたガイドラインに従って行った。

【0029】

歩行可能な対照及び後肢免荷及び回復実験
ケージ歩行可能な対照を１４ｄ間追跡し、２～３匹のマウス／ケージの群に収容した。廃用実験のために、いくつかの追加の改変を伴う、げっ歯類における廃用性萎縮を研究するための従来のＭｏｒｅｙ－Ｈｏｌｔｏｎ設計に基づく改変した免荷方法（３７）を使用して、尾懸垂を介して、動物に後肢免荷を施した（２匹の動物／ケージ）。１４日間の後肢免荷に続いて、動物を５時間絶食させ、次いで組織分析のために安楽死させた。廃用からの回復実験では、動物に１４ｄの後肢免荷を施し、その後、懸垂装置から取り外し、次いで、７日間の歩行可能性回復のために個々のケージに収容した。マウスが栄養失調または脱水症に起因する過度の体重損失を経験していないことを確実にするために、各実験の間、隔日に体重を監視した。各治療群の完了時に、左右の後肢からの下肢三頭筋群（ヒラメ筋、足底筋、腓腹筋）を慎重に解剖し、秤量し、免疫組織化学の準備をし、液体窒素冷却イソペンタン中で瞬間凍結させた。

【0030】

ＳＴＥＭの特徴評価及び投与
ＳＴＥＭは、免疫調節、細胞骨格リモデリング、及び成長因子媒介性同化シグナル伝達に関与する多数の因子で構成される部分分化胚性幹細胞に由来するセクレトームバイオロジクスである。部分分化多能性幹細胞によって分泌される因子を含有する、ＵＳＰグレードのタンパク質、アミノ酸、ビタミン、及びミネラルの滅菌及び非発熱性水溶液である。溶液は、生細胞、または任意の細胞断片を含有せず、細胞の可溶性分泌物のみを含有する。因子は、ＱｕａｎｔｉｂｏｄｙＭｕｌｔｉｐｌｅｘＥＬＩＳＡプラットフォーム（ヒトサイトカインアレイＱ４４０）を使用して、第三者（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）によって３つの独立した試料において決定した。各群における標的の測定量をピコモル（ｐｍｏｌ／ｍＬ）に変換し、各群について平均化した。図６は、セクレトームにおいて高度に発現された、測定された因子を列挙する。因子は、Ｒｅａｃｔｏｍｅを使用して分類した。

【0031】

多能性幹細胞は、ＡＢＳＴＥＭ（ＦＵＪＩＦＩＬＭＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、動物性物質を含まない試薬及び組換え成長因子（ｂＦＧＦ及びアクチビンＡ）を使用するＧＭＰ条件で増殖させる。増殖の後、成長因子を除去し、２日後に、培養物を、４．７％のトレハローゼ、及びＵＳＰグレードの塩、アミノ酸、ビタミン、及び緩衝液を含有する、あつらえたタンパク質不含培地に曝露させる。培養上清を毎日収集し、新鮮な培地と置き換える。７日間にわたって収集した生成物をプールして均質化し、次いで、０．２２ｕｍ滅菌膜フィルターに通して濾過する。濾過した生成物に、１ｋＤａのカットオフ膜を用いてタンジェンシャルフロー濾過を施し、体積を１００倍低減する。次いで、ＢＣＡアッセイ及び定量的ＥＬＩＳＡを使用して、タンパク質濃度を５０ｕｇ／ｍＬのフォリスタチンに対して標準化する。フォリスタチンは、ミオスタチンの周知のアンタゴニストであり、筋肉成長の促進因子である。フォリスタチンタンパク質及びそのバリアントの配列を、図７に列挙する。フォリスタチン及びフォリスタチンバリアント配列を、以下の表１に列挙する。シグナル配列は除外しており、フォリスタチン－Ｎ末端ドメインには下線を引いている。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0032】

フェチュインＡを多量に添加した組成物の分析は、ＴＧＦｂ／ＢＭＰ結合ドメインを有する多機能分子（ｈｔｔｐｓ：／／ｅｓｃｈｏｌａｒｓｈｉｐ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｑｔ５９ｒ４３９ｑ２／ｑｔ５９ｒ４３９ｑ２＿ｎｏＳｐｌａｓｈ＿ａ６ｆ１８ｂｆｅ３２ｃ６７０ｅ６３５ｃｅｅ８ｅ２２９ｂａ７ｃｄ２．ｐｄｆ）が、ＴＧＦｂ１及びＢＭＰ２活性を阻害し、Ｃａに対して特定の親和性を有するミネラル結合ドメインを有することを明らかにし、したがって、Ｃａリザーバまたは石灰化防止構造とみなされる。ＴＧＦｂ及びＢＭＰ２を阻害することによって、フェチュインＡは、骨格筋分化を促進することができる（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓｄｅｖ．ｃｓｈｌｐ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１５／２２／２９５０．ａｂｓｔｒａｃｔ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｍｃｄｅｖｂｉｏｌ．ｂｉｏｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／１０．１１８６／１４７１－２１３Ｘ－１１－４４）。フェチュインＡタンパク質アイソフォームを、以下の表２に列挙する。シグナル配列は除外しており、ＴＧＦ－ベータ結合ドメインには下線を引いている。

【表2-1】

【表2-2】

【0033】

ＳＴＥＭ組成物中に見出される他の筋形成アゴニスト及びアンタゴニストは、以下の表３及び表４に含まれる：

【表3】

【表4】

【0034】

筋肉の成長及び分化についてのアゴニストとアンタゴニストとのモル比は、３つの異なる製造ロットで平均６．６５：１であった。筋肉再生のためにＳＴＥＭを使用するための理論的な指標に対して行った、筋形成誘発性因子の優位性。

【0035】

ＤｕｍｏｎｔａｎｄＦｒｅｎｅｔｔｅによって報告されたのと同様の注射戦略（３８）を使用して、ＰＢＳまたはＳＴＥＭのいずれか（２μＬのＳＴＥＭ／１００μＬのＰＢＳ）の１００μｌの筋肉内注射を、各治療群に１日おきにマウスの右下肢三頭筋群に投与した。歩行可能な対照及び後肢免荷マウスは、それぞれの１４日間の治療群期間にわたって合計６回の注射を受けた。筋肉の回復／再成長に対するＳＴＥＭの効果を効果的に調べるために、後肢免荷及び回復を施したが、治療の７日間の回復フェーズ中にのみ送達された動物に、合計３回の注射を与えた。安楽死させる前日に、全てのマウスに最終治療注射を施して、急な治療効果を回避した。

【0036】

後肢免荷及び回復
後肢免荷及び再荷重群には、いくつかの追加の改変を伴う、げっ歯類における廃用性萎縮を研究するための従来のＭｏｒｅｙ－Ｈｏｌｔｏｎ設計に基づく改変した免荷方法（３８）を使用して、尾懸垂を介して、動物に後肢免荷を施した（２匹の動物／ケージ）。マウスが栄養失調または脱水症に起因する過度の体重損失を経験していないことを確実にするために、隔日に体重を監視した。１４日間の後肢免荷に続いて、動物を５時間絶食させ、次いで組織分析のために安楽死させた。マウスの別々の群では、動物に１４ｄの後肢免荷を施し、その後、懸垂装置から取り外し、次いで、７日間の歩行可能性回復のために個々のケージに収容した。ケージ歩行可能な対照を１４ｄ間追跡し、２～３匹のマウス／ケージの群に収容した。各治療群の完了時に、左右の後肢からの下肢三頭筋群（ヒラメ筋、足底筋、腓腹筋）を慎重に解剖し、秤量し、免疫組織化学の準備をし、液体窒素冷却イソペンタン中で瞬間凍結させた。

【0037】

握力
全身筋力を評価するために、げっ歯類握力計（ＣｏｌｕｍｂｕｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＣｏｌｕｍｂｕｓＯＨ）での握力分析をマウスに施した。マウスに、前肢及び後肢で力変換器グリッドを握らせ、同じ研究者によってグリッドを横切って尾を優しく引っ張った。５秒の休止期間を伴う５回の反復を平均して、各動物の握力を決定した。歩行可能な対照マウスでは、ＰＢＳまたはＳＴＥＭ治療を開始する前日、及び組織採取の前日の１３日目の２回、握力を決定した。廃用実験マウスを、治療の前日、７日目、及び再び組織採取の前日の１３日目の３回、試験した。廃用からの回復実験マウスも、後肢免荷の前日、後肢免荷の終了時、及び回復期間の６日目の３回、試験した（図１）。注射の交絡作用を回避するために、全ての測定は注射の前に行った。

【0038】

免疫蛍光
ＯＣＴに埋入させ、液体窒素冷却イソペンタン中で凍結することによって、右（治療済み）ヒラメ筋を組織学のために準備した。いくつかの冷凍切片を１０μｍの厚さで切断し、細胞膜（ラミニンまたはジストロフィン（１：１００；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ））を使用して、筋線維断面積（ＣＳＡ）を染色するために使用した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアとともにＭＡＴＬＡＢ（登録商標）アプリケーション（ＳＭＡＳＨ）である組織学的セグメンテーションを伴う半自動筋肉分析を使用して、筋線維ＣＳＡを測定した（２５、３９）。マクロファージ存在量を評価するために、一次抗体抗ラットＣＤ６８（炎症誘発性様、１：１００Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、及び抗ウサギＣＤ１６３（抗炎症性様、１：１００、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用した。抗ラット二次抗体（１：２５０、ＡＦ５５５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗マウス二次抗体（１：５００、Ａ４８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び抗ウサギ二次抗体（１：５００、ＡＦ６４７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を適用し、次いで、ＤＡＰＩ含有実装媒体（Ｖｅｃｔｏｒ）に実装した。Ｐａｘ７（１：１０００、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を使用して、筋衛星細胞を染色した。線維症を評価するために、ビオチンコラーゲンハイブリダイジングペプチド（１：１００、コラーゲン分解のためのＢＣＨＰ－マーカ、３Ｈｅｌｉｘ、ＳａｌｔＬａｋｅＣｉｔｙ，ＵＴ）及びコラーゲンＩＶ（１：１００、コラーゲン合成のためのＣＯＬＩＶ－マーカ、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して、凍結切片を染色した。これら２つの染色の比は、全体的なコラーゲンターンオーバー、したがって筋肉の線維化の指標である。全ての染色スライドは、１０倍または２０倍対物レンズを備えた全自動広視野光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で観察した。高感度ＣｌａｒａＣＣＤカメラ（Ｂｅｌｆａｓｔ，ＵＫ）を使用して、画像を撮影した。

【0039】

Ｃ２Ｃ１２筋形成指数、筋線維サイズ、及びＲＮＡ配列決定
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を６つのウェルプレートに配置し、約９５％のコンフルエンシーを達成したら、２％のウマ血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充した分化培地ＤＭＥＭを５日間使用して、筋芽細胞を筋管へと分化させた。５日間の完了時に、分化培地を除去し、２４時間の間、ウマ血清の代わりに様々なパーセンテージのＳＴＥＭ（２、４、８、１２、及び２４％）を含有する培地と置き換えた。対照ウェルは、２％のウマ血清または４％のウマ血清を含有する普通の分化培地のいずれかを含有した。血清を含まない対照も利用した。２４時間後、細胞を固定し、ＭＦ２０（ＤＳＨＢ、ＩｏｗａＣｉｔｙ，Ｉｏｗａ）及びＤＡＰＩを使用して染色した。次いで、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＵｔａｈＩｍａｇｉｎｇＣｏｒｅ施設のＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅＴｉ広視野走査顕微鏡で、細胞を撮像した。各ウェルについて１０×１０の視野画像を得、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を使用して分析した。筋核融合は、画像視野における、筋管内の核／全核として定義する。筋管面積パーセントは、筋管によって覆われた画像の面積パーセントとして定義した。

【0040】

対照として４％のウマ血清、及び４％のＳＴＥＭを利用した別々の細胞群を、ウェル当たり１ｍｌのキアゾールを使用して総ＲＮＡについて収集し、（ｍｉＲＮＡｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔを使用して）精製した。次いで、ＲＮＡをＴＵＲＢＯＤＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で処理し、ＲＮＡＣｌｅａｎａｎｄＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ５Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製した。ＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑＳｔｒａｎｄｅｄＴｏｔａｌＲＮＡＬｉｂｒａｒｙＰｒｅｐＲｉｂｏ－ＺｅｒｏＧｏｌｄ（ＧｅｎｏｍｅＢｕｉｌｄｓｍｍ１０、Ｍ＿ｍｕｓｃｕｌｕｓ＿Ｄｅｃ＿２０１１、ＧＲＣｍ３８）でライブラリを調製し、ＩｌｌｕｍｉｎａＮｏｖａＳｅｑＲｅａｇｅｎｔＫｉｔｖ１．５１５０×１５０ｂｐＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（１００Ｍ読み取り対）を使用してＲＮＡを配列決定した。

【0041】

統計分析及びバイオインフォマティクス分析。
結果は、平均±標準誤差として報告する。必要な場合、反復測定を伴うＴ検定、１元配置分散分析、または２元配置分散分析を採用した。適切な場合、ＴｕｋｅｙまたはＳｔｕｄｅｎｔ－Ｎｅｗｍａｎ－Ｋｅｕｌｓ方法で、事後分析を実施した。全ての分析では、許容される有意性のレベルをｐ＜０．０５に設定した。統計分析は、ＰｒｉｓｍＧｒａｐｈＰａｄ７（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．、ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して実施した。ＲＮＡ配列決定には、ＤＥＳｅｑ２バージョン１．２６．００で５％の偽発見率を使用して、差異的に発現された遺伝子を同定した。データは、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＯｍｎｉｂｕｓに見出すことができる。火山プロットは、Ｙ軸上に－Ｌｏｇ１０（調整済みＰ値）を取り、Ｘ軸上にＬｏｇ２倍率変化に対してプロットすることによって生成した。上位２０の有意に減少した遺伝子、及び上位２０の増加した遺伝子を、全ての有意に変化した転写物（調整済みＰ値≦０．０５）を採用し、次いでｌｏｇ２倍率変化によって選別することによって同定した。値は、表に提示するためにｌｏｇ２から変換した。

【0042】

結果
歩行可能な対照マウスにおけるヒラメ筋及び筋力に対するＳＴＥＭの効果
１つの目標は、老齢マウスにおける１４日間の正常なケージ歩行中の後肢の筋肉量及び筋力に対するＳＴＥＭの影響を決定することであった。廃用中の筋萎縮に対するその感受性、及び第２に、我々の実験の過程の間、ＳＴＥＭによって影響を最も受けた筋肉であったことに起因して、ヒラメ筋を調べた（例えば、足底筋のサイズはＳＴＥＭで増加した一方で、腓腹筋は影響を受けなかった）。驚くべきことに、１４日間の正常なケージ歩行の過程にわたって単一の肢へのＳＴＥＭ送達は、ベースラインレベルを上回って全身握力を増加させた（ｐ＝０．００８）（図２Ａ）。さらに、ＳＴＥＭは、ＰＢＳ治療マウスを上回ってヒラメ筋筋肉量を増加させた（ｐ＝０．０００１）（図２Ｂ）。ヒラメ筋筋肉量の増加と一致して、ＳＴＥＭはまた、線維断面積（ＣＳＡ）を増加させた（ｐ＝．０２）（図２Ｃ）。さらに、ＳＴＥＭは、ＢＣＨＰを増加させ、ＣＯＬＩＶを減少させ（データは示さず）、ＢＣＨＰ／ＣＯＬＩＶ比の増加を生じ（ｐ＝００４）（図２Ｄ）、全体的なヒラメ筋コラーゲン含有量の減少を示唆している。

【0043】

次に、ＳＴＥＭカクテル独自の免疫調節組成を考慮して、治療が、ヒラメ筋の炎症誘発性及び抗炎症性様マクロファージに影響を及ぼしたかどうかを決定した。凍結切片の免疫染色は、ＳＴＥＭが、ＣＤ６８＋／ＤＡＰＩ＋細胞（炎症誘発性Ｍ１様マクロファージ）（ｐ＝０．０００２）及びＣＤ１６３＋／ＤＡＰＩ＋（抗炎症性Ｍ２様マクロファージ）（ｐ＝０．０００２）マクロファージサブタイプを増加させたことを示した（図２Ｅ）。さらに、ＳＴＥＭは、ＰＢＳと比較して、歩行可能な対照マウスにおけるＰａｘ７＋細胞含有量を３倍にした（ｐ＝０．０００１）（図２Ｆ）。まとめると、これらの結果は、老化したマウスにおける１４日間のケージ歩行中に、ＳＴＥＭが、ヒラメ筋のサイズ、筋力を改善し、筋線維症を低減し、マクロファージ浸潤を増加させ、Ｐａｘ７＋細胞を増加させたことを示唆している。

【0044】

後肢免荷中のヒラメ筋及び筋力に対するＳＴＥＭの効果
第２の実験は、ＳＴＥＭ投与が、筋萎縮及び筋衰弱を軽減するかどうかを決定し、これを、１４日間の後肢免荷の結果としてモデル化する。後肢免荷の１４日後、ＰＢＳで治療したＨＵマウスと比較すると、ＳＴＥＭ治療は、７及び１４日ＨＵの握力の損失を完全に防止することが見出された（ｐ＝０．００４）（図３Ａ）。同様に、ＳＴＥＭ治療は、ＨＵ中のヒラメ筋萎縮を防止した（ｐ＝０．００６）（図３Ｂ）。筋肉量データと一致して、ＳＴＥＭは、ＰＢＳと比較して、ヒラメ筋における線維ＣＳＡ萎縮を減衰させた（ｐ＝０．００２）（図３Ｃ）。ＳＴＥＭはまた、ＢＣＨＰを増加させ、ＣＯＬＩＶを減少させ（データは示さず）、これは、ＨＵマウスのヒラメ筋におけるＢＣＨＰ対ＣＯＬＩＶの比の増加をもたらす（ｐ＝０．０４）（図３Ｄ）。最後に、実験マウスのＳＴＥＭ注射は、ＰＢＳ治療と比較すると、体重に影響を与えなかった（データは示さず）。これらの結果は、ＳＴＥＭが、廃用誘発性萎縮を軽減し、老化したヒラメ筋のコラーゲンターンオーバーを改善することが可能であることを実証している。

【0045】

次に、ＳＴＥＭが免荷筋肉におけるマクロファージ浸潤及びＰａｘ７細胞含有量を調節したかどうかを決定した。ＳＴＥＭは、ＰＢＳ治療ＨＵマウスと比較して、ヒラメ筋におけるＣＤ６８＋／ＤＡＰＩ＋細胞（炎症誘発性Ｍ１様マクロファージ）を増加させた（ｐ＝０．０００９）が、ＣＤ１６３＋／ＤＡＰＩ＋細胞（抗炎症性Ｍ２様マクロファージ）を増加させなかったことが見出された（図３Ｅ）。最後に、ＨＵ中のＰＢＳ対照と比較すると、ＳＴＥＭが、ヒラメ筋におけるＰａｘ７＋細胞含有量を２倍にした（ｐ＝０．０００４）ことが決定された（図３Ｆ）。まとめると、これらの結果は、ＳＴＥＭが、廃用性萎縮中の老化したヒラメ筋において炎症誘発性マクロファージを増加させながら、また、総衛星細胞（Ｐａｘ７＋）含有量を増加させることが可能であることを示唆している。

【0046】

廃用後のヒラメ筋及び筋力の回復に対するＳＴＥＭの効果
次に、ＳＴＥＭが、廃用性萎縮（１４日間のＨＵ）後の筋肉及び筋力の回復を向上するかどうかを決定した。７日間の回復過程にわたるＳＴＥＭのわずか３回の筋肉内注射で、握力が、ベースラインレベルまで完全に回復し（ｐ＝０．０００１）、ＰＢＳ治療群とは対照的であった（図４Ａ）。さらに、ＳＴＥＭは、ＰＢＳ治療マウスと比較して、ヒラメ筋筋肉量を回復させた（ｐ＝０．００１）（図４Ｂ）。筋肉量データと同様に、ＳＴＥＭは、ＰＢＳ治療マウスを上回ってヒラメ筋線維ＣＳＡ（ｐ＝０．００３）を増加させ（図４Ｃ）、第１の実験からの歩行可能な対照マウスの線維ＣＳＡと同様であった。ＳＴＥＭはまた、ＢＣＨＰ／ＣＯＬＩＶの比の増加（ｐ＝０．０００９）によって留意された、コラーゲンの蓄積を低減し（図４Ｄ）、これは、再びＢＣＨＰの増加及びＣＯＬＩＶの減少に起因した（データは示さず）。これらの結果は、ＳＴＥＭが、老化したヒラメ筋筋肉量を改善し、廃用性萎縮からの回復中に筋線維の成長を促進したことを実証している。追加的に、ＳＴＥＭは、コラーゲンターンオーバーを増加させ、コラーゲン含有量における全体的な正味を減少させたように思われた。

【0047】

最後に、廃用から回復中の筋肉マクロファージ及び衛星細胞に対するＳＴＥＭの効果を調べた。ＰＢＳ治療マウスと比較すると、ＳＴＥＭは、７日間の回復中のヒラメ筋ではＣＤ６８＋／ＤＡＰＩ＋細胞（炎症誘発性Ｍ１様マクロファージ）を増加させた（ｐ＝０．００５６）が、ＣＤ１６３＋／ＤＡＰＩ＋細胞（抗炎症性Ｍ２様マクロファージ）は増加させなかった（図４Ｅ）。ＳＴＥＭはまた、ＰＢＳ治療マウスと比較すると、７日間の回復中に、マウスのヒラメ筋におけるＰａｘ７＋細胞を２倍にした（ｐ＝０．０００５）（図４Ｆ）。まとめると、これらの結果は、ＳＴＥＭが、回復中の老化した筋肉において、マクロファージ浸潤を増加させ、衛星細胞プールを向上したことを実証している。

【0048】

Ｃ２Ｃ１２筋管融合及びサイズに対するＳＴＥＭの影響
骨格筋に対するＳＴＥＭの独立した効果をさらに評価するために、５日間の分化後のＣ２Ｃ１２筋管に、変動する濃度のＳＴＥＭを施した。対照（２％及び４％のウマ血清培地ならびに血清を含まない培地）と比較すると、２、４、８、及び１２％のＳＴＥＭでの、筋核融合（プレート当たりの筋管における核のパーセンテージ）（ｐ＝０．０００１）及び筋管面積パーセント（サイズ；ｐ＝０．０００２）の堅牢な誘発が留意された（図５Ａ）。これらの結果の代わりに、４％のウマ血清を対照として、４％のＳＴＥＭを治療群として使用した、Ｃ２Ｃ１２筋管の別々のコホートで実験を繰り返し、ＳＴＥＭが、分子レベルでＣ２Ｃ１２にどのように影響を与え得るかについての洞察を提供するためにＲＮＡ配列決定分析を実施した。ＳＴＥＭは、細胞成長及び細胞外マトリックスのリモデリングに関連する転写プログラムを誘発することが見出された（図５Ｂ）。制御された留意すべき遺伝子は、コラーゲン合成、分解、及び成長因子（ＩＧＦ結合タンパク質３、Ｃｏｌ２３ａ１、Ｃｏｌ１４ａ１、Ｍｔ２、Ｍｔ１、及びＦｍｏｄ）に関係していた。全体的に、これらの結果は、成長因子に関連する遺伝子の制御及び細胞外マトリックスリモデリングの促進を通じて、ＳＴＥＭが、Ｃ２Ｃ１２筋管における筋形成を改善したことを示唆している。

【0049】

考察
ＳＴＥＭは、老化したマウスにおいて、わずか７日の回復の後に、廃用中のヒラメ筋筋肉量及び線維断面積の損失を減弱させながら、また、量及び断面積を増加させることが見出された。さらに、これらの所見は、改善された握力及び筋肉コラーゲンターンオーバーによって裏付けられた。ＳＴＥＭの独自のセクレトーム組成物は、全ての治療群にわたる筋肉マクロファージの浸潤の増加及び衛星細胞の蓄積によって留意されるように、免疫調節が可能であることも見出された。最後に、筋細胞培養実験では、ＳＴＥＭは、筋管のサイズ及び融合に強力な効果を有しながら、また、堅牢な細胞外マトリックスリモデリングによって留意される転写シグネチャを促進することが示された。まとめると、これらの結果は、ＳＴＥＭが、老化したマウスにおいて、廃用及び回復中の筋肉サイズ及び筋力を向上し、線維症を低減することができる、新規の治療薬であることを示唆している。

【0050】

骨格筋は、荷重刺激の変化に応答して、そのサイズ及び機能的能力を調節することが可能な、高度に適応性のある組織である（４０）。後肢免荷によって誘発されるげっ歯類における筋肉廃用は、堅牢な萎縮及び衰弱を誘発し、ヒトにおける廃用性萎縮及び回復をモデル化するために頻繁に使用される（１、３、１０、４１）。老化は、廃用中の筋肉量損失を加速させない（４２、４３）が、老化は、そのような損傷後の回復を悪化させ（４３～４５）、特に、虚弱及びサルコペニアなどの、低い筋肉リザーブを有する老化した個人には懸念事項である。限定的な筋肉サイズ及び筋機能的リザーブは、生活の質の減少をもたらし得るので、これらの障害は、深刻な予想外の結果を有し得る（４５）。本明細書で論じられる主要な所見は、ＳＴＥＭ投与が、様々な老化に関連する状態のヒラメ筋筋肉量及び断面積を増加させること：歩行可能な対照の老化したマウスにおいて、２週間後にヒラメ筋サイズを増加させること、廃用性萎縮を鈍らせること、及び回復中に筋肉サイズを増幅させることが可能であることを実証しており、これらの全てが、サルコペニア、筋肉廃用、及び廃用からの回復後の老化に関連する障害に対する適用性を有する。興味深いことに、全身握力は、全ての治療群にわたって改善された。これは、ＳＴＥＭが単一の肢に筋肉内に投与されたにもかかわらず、循環器への拡散を通じて全身的効果が生じ得ることを示唆している。さらに、インビトロ分析は、ウマ血清対照と比較すると、ＳＴＥＭが、筋管肥大及び融合を誘発することによって、筋肉に直接影響を与えることができることを実証した。フォリスタチン、インスリン、ＩＧＦ結合タンパク質２、及びＩＧＦ結合タンパク質－６などの成長因子のＳＴＥＭの様々な組成（方法の表を参照）（４６～５０）を考慮すると、この化合物が肥大を促進することが可能であったことは論理的である。

【0051】

別の主要な所見は、３つ全ての実験において、ＳＴＥＭが、筋肉コラーゲンターンオーバーを増加させ（したがって線維症を低減し）、炎症誘発性様マクロファージ浸潤を増加させたことであった。老化した骨格筋の一般的な不具合は、コラーゲン含有量の上昇であり、これが、廃用性萎縮からの機能障害及び再成長に寄与すると広く考えられている（１１、１２、５１、５２）。最近のエビデンスは、老化した免疫系が、廃用及び回復中の両方の骨格筋の障害に寄与し得ることを示唆している（２２、２３、２５、５２）。常在する炎症誘発性の機能不全及び抗炎症性マクロファージの蓄積は、老化した骨格筋の不十分なリモデリングを強調し得る（２２、２３、２５）。炎症誘発性様マクロファージは、衛星細胞増殖を増加させ、筋芽細胞分化を阻害する特定のサイトカインプロファイルを分泌する（５３～５５）。他方では、抗炎症性マクロファージは、筋芽細胞分化を促進し、増殖を阻害しながら（５４、５６）、また、コラーゲン合成を増加させるサイトカイン及び成長因子を分泌する（５７）。さらに、抗炎症性マクロファージは、老化した筋肉において、衛星細胞がより線維化誘発性の表現型に移行することを促進する（１９、２１、２２）。この研究では、ＳＴＥＭが、全ての実験治療群にわたって、Ｃｄ６８＋炎症誘発性様マクロファージを増加させることが実証された。これは、健康な骨格筋及び老化した骨格筋における炎症誘発性マクロファージ浸潤を向上し、したがって、廃用及び損傷からの筋肉の再成長を向上するのに有効である、免疫療法の成功と言える（５８～６０）。これらの所見は、廃用及び回復中のＳＴＥＭ投与が、炎症誘発性マクロファージの浸潤を促進し、コラーゲンターンオーバーの増加及び全体的な線維化筋肉の低下に関連し得ることを示唆している。ＳＴＥＭで治療されたＣ２Ｃ１２筋管におけるトランスクリプトーム分析はまた、骨格筋リモデリング及びコラーゲン合成に関連する遺伝子ネットワークにおける明らかな変化を裏付けている。ＳＴＥＭの投与によるマクロファージの浸潤は、様々なサイトカイン及び免疫細胞調節分子がカクテル中に存在する証拠である。調べた唯一の免疫細胞はマクロファージであったが、カクテルは、筋肉再成長に重要な多数の免疫細胞（例えば、好中球、Ｔ細胞）を調節することによって、間接的に筋肉に影響を及ぼし得る。

【0052】

最後に、ＳＴＥＭ投与は、全ての治療群にわたって、老化した筋肉におけるＰａｘ７＋細胞の総量を堅牢に増加させることが見出された。衛星細胞は、損傷後の骨格筋の維持及び再生に不可欠であり、老化中の骨格筋では低減しているかまたは機能不全である（６１～６３）。最近の研究では、筋肉幹細胞環境の調節因子として、老化中の免疫系が強調されている（２２）。例えば、若いマウスへの古い骨髄細胞の移植は、骨格筋Ｐａｘ７＋細胞を減少させ、それらをより線維性の細胞系統に向かって偏らせた（２２）。したがって、マクロファージ観察と組み合わせると、これらの結果は、ＳＴＥＭが、老化した骨格筋免疫細胞を調節し、それによって、筋肉微小環境及び衛星細胞ニッチを改善し得ることを示唆している。

【0053】

要約すると、本明細書で論じられる結果は、セクレトームであるＳＴＥＭが、廃用性萎縮及び回復中の老化した骨格筋の筋肉量及び筋力を改善したことを示唆している。正確な作用機序を決定することは困難であるが、ＳＴＥＭの独自の同化及び筋形成誘発性成長因子特性、ならびにサイトカインプロファイルは、コラーゲンターンオーバーに影響を与える可能性があり得る、免疫細胞及び衛星細胞を調節し得る。ＳＴＥＭはまた、他の後肢筋肉群と比較して、ヒラメ筋において単離された利点を有することが見出された。ＳＴＥＭは、インスリン及び成長因子に対する筋肉の感受性（６４～６６）、ならびに高いマクロファージ含有量（６７）に起因して、優先的にヒラメ筋を標的とし得るが、歩行可能な対照マウス及び廃用性萎縮中の足底筋サイズ（腓腹筋ではない）において、ＳＴＥＭ治療によるいくつかの改善が留意された。これは、老化中の筋肉の将来の治療薬としてＳＴＥＭを前進させるために、投与及び送達アプローチのさらなる最適化が必要であろうことを示唆している。

【0054】

ＳＴＥＭ構成成分の定量的評価

【0055】

標準化された製造方法によって生成した３ロットのＳＴＥＭの試料を、ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＥＬＩＳＡアッセイのために第三者研究機関に送った。アッセイは、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅアレイを使用し、作業は、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈによるＧＬＰの下で実施した。成長因子、サイトカイン、ケモカイン、酵素、及び細胞外マトリックス構成成分を含む合計４００の標的を分析した。ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈによって実施されたＭｕｌｔｉｐｌｅｘＥＬＩＳＡの結果を、表５に含める。

【0056】

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【表5-4】

【表5-5】

【0057】

タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による濃縮を施した３つの追加のロットからの試料を、フォリスタチン、フェチュインＡ、及びアクチビンＡについて特定のＥＬＩＳＡキットを使用してさらに試験した。標準に対して２回の反復及び各試料に対して３回の反復を使用して、ＥＬＩＳＡ試験を実施した。結果を、表６に提示する。

【0058】

【表6】

【0059】

効力アッセイ
ＳＴＥＭの筋形成誘発性効果は、理論的には、フォリスタチンなどの筋形成誘発性因子におけるその含有量に起因し得る。これらの因子は、一般に、アクチビンＡのアンタゴニストであり、したがって、ＳＴＥＭバッチの効力を試験するための簡単なアッセイは、ＭＰＣ－１１細胞株などの感受性細胞株におけるアクチビンＡ中和を評価することである。アッセイ開発は、アッセイに最も応答した細胞密度を見出すことを含んだ。典型的なＳＴＥＭロットによって中和されたアクチビンＡ範囲を使用して、アクチビンＡＩＣ５０を決定し、これをさらに、ＳＴＥＭのアクチビンＡ中和単位に翻訳することができた。

【0060】

実行のために、アッセイは、代謝的に活性な細胞の存在をシグナル伝達するＡＴＰの存在の定量化に基づいて、培養物中の生存細胞の数を決定する、ＰｒｏｍｅｇａＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏの均質な方法を使用した。

【0061】

ＭＰＣ１１供給培地中１：１０のＳＴＥＭ（９ｍＬの供給培地及び１ｍＬのＳＴＥＭ）を使用して、完全な培地を作製した。主にＭＰＣ－１１培養物からの細胞懸濁液の試料を、ＮｅｘｃｅｌｏｍＡＯ／ＰＩ標準化アッセイを使用して計数を施した。主な培養物は、２．８２×１０^４個の生存細胞／ｍＬを含有し、１００万個の細胞を含有する体積（約３０ｍＬ）を抽出し、３００Ｇで５分間遠心分離した。ペレットを２．４ｍＬの培地に再懸濁させ、様々な濃度で細胞を試験プレートにプレーティングし、ＣＯ_２インキュベーター内で４日間成長させた。

【0062】

【表7】

【0063】

細胞の各濃度としては、４００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡストック溶液を使用し、１：３の希釈進行で連続希釈した、０．００１ｎｇ／ｍＬ～１２０ｎｇ／ｍＬの範囲のアクチビンＡを試験した。

【0064】

ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイは、製品指示に従って、及びＰｒｏｍｅｇａＧｌｏｍａｘＥｘｐｌｏｒｅｒマイクロプレートリーダーによって提供されるアッセイテンプレートを使用して、実施した。

【0065】

結果
最良のアッセイ感度（細胞生存率に比例する最大発光）を、ウェル当たり５，０００個の細胞を使用して見出した。他の２つの群（ウェル当たり１０，０００及び２０，０００個の細胞）は、細胞濃度に比例して発光が減少した。これは、細胞密度が高いことが、一般に、培養条件を限定する要因であったことを示唆している。

【0066】

【表8】

【0067】

アクチビンＡに対するフォリスタチンの中和モル比は２：１であることが知られている。アクチビンＡの分子量は２６．２ｋＤａであり、フォリスタチンの分子量は３１．７ｋＤａである。したがって、アッセイにおけるフォリスタチンの理論的な中和量を、表９に提示する。

【0068】

【表9】

【0069】

アッセイ結果をＥＬＩＳＡによる定量的フォリスタチン測定と比較すると、ＭＰＣ－１アッセイに示されるその生物学的活性とＥＬＩＳＡによるその定量的測定との間に大きな相違が存在した（表６を参照されたい）。

【0070】

重要な所見は、ＳＴＥＭと組み合わせたアクチビンＡが、約３．７ｎｇ／ｍＬの刺激誘発性ピーク、次いで約２０ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０を有する阻害効果の、二相効果を有することである。

【0071】

結論
決定された同等なフォリスタチン生体活性は、定量的ＥＬＩＳＡによって決定された量よりもはるかに大きい。

【0072】

ＳＴＥＭと低濃度のアクチビンＡとの組み合わせは、ＭＰＣ－１１細胞に予想外の刺激効果を有した。

【0073】

このデータは、フォリスタチンが、ＭＰＣ－１１細胞系に対するＳＴＥＭの生物学的効果を担う唯一の構成成分ではないことを示唆している。この所見は、個々の構成成分ではなく、全体としてのＳＴＥＭに基づく評価を裏付けている。

【0074】

この所見はまた、治療用量のＳＴＥＭが、インビボで存在する少量のアクチビンＡによって増強され得ることを示唆しており、これは、比較的低用量のＳＴＥＭが有意な生物学的効果を発揮した、以前の動物実験で観察された効果を説明し得る。

【0075】

本主題の様々な態様は、以下の実施形態の相互関係及び互換性に重点を置いて、これまでに記載された実施形態を検討し、及び／またはこれを補完するために以下に記載される。言い換えれば、実施形態の各特徴は、別段明示的に記載されない限り、または論理的に妥当である限り、各全ての他の特徴と組み合わせることができるという事実に重点が置かれている。本明細書に記載の実施形態は、図面を明示的に参照することなく、以下の段落で再び記述及び拡張されている。

【0076】

多くの方法では、セクレトームを調製する方法が記載されている。方法は、ｂＦＧＦ及びアクチビンＡを含む培養培地中で多能性幹細胞を増殖させるステップと、トレハロースを含むタンパク質不含培地に多能性幹細胞を曝露させるステップと、培養上清を毎日採取し、トレハロースを含む追加のタンパク質不含培地と置き換えるステップと、採取した培養上清を合わせて、合わせた培養上清のプールを形成するステップと、合わせた培養上清のプールを均質化して、均質化された合わせた培養上清のプールを形成するステップと、均質化された合わせた培養上清のプールを膜フィルターに通して濾過して、濾過された均質化された合わせたプールを形成するステップと、を含む。

【0077】

いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、約３日間～約７日間増殖され得る。

【0078】

いくつかの実施形態では、タンパク質不含培地中のトレハロースの濃度は、約５％～約２５％である。

【0079】

いくつかの実施形態では、培養上清は、毎日採取され、約１日間～約１０日間、トレハロースを含む追加のタンパク質不含培地と置き換えられる。

【0080】

いくつかの実施形態では、方法は、タンジェンシャルフロー濾過を使用して濾過された均質化された合わせたプールの体積を低減するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、タンジェンシャルフロー濾過による体積低減は、５０：１～１００：１である。いくつかの実施形態では、タンジェンシャルフロー濾過は、１～５ｋＤａのカットオフ膜を利用する。

【0081】

多くの実施形態では、本明細書に記載の方法によって得られるセクレトーム組成物が記載されている。

【0082】

いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも２つの筋形成アゴニストを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、フェチュインＡ、フォリスタチン、及びフォリスタチン様－１からなる群から選択される少なくとも２つの筋形成アゴニストを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの筋形成アゴニストは、フォリスタチン、フォリスタチンバリアント、またはフォリスタチンの断片を含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの筋形成アゴニストの合わせた濃度は、約１～約２０ｐｍｏｌ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの筋形成アゴニストは、ＯＰＮ、ＩＧＦＢＰ－４、ＭＭＰ－１、ＴＳＰ－１、ＧＲＯａ（ＣＸＣＬ１）、ＭＭＰ－１０、ｂＩＧ－Ｈ３、ｈＣＧｂ、ＲＧＭ－Ｂ、ＶＥＧＦ、Ｃｒｉｐｔｏ－１、ＨＧＦ、ＢＭＰ－５、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ－２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＦＧＦ－１９、ＷＩＳＰ－１のうちのいずれか１つ以上、またはそれらの組み合わせをさらに含む。

【0083】

いくつかの実施形態では、生細胞は、セクレトーム組成物から除去されている。

【0084】

いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも２つの筋形成アンタゴニストをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約１ｐｍｏｌ／ｍＬ未満の少なくとも２つの筋形成アンタゴニストの濃度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの筋形成アンタゴニストは、アクチビンＡ及びＴＧＦｂ１を含む。

【0085】

いくつかの実施形態では、少なくとも２つの筋形成アゴニスト対少なくとも２つの筋形成アンタゴニストの濃度の比は、約４：１～約８：１である。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの筋形成アゴニスト対少なくとも２つの筋形成アンタゴニストの濃度の比は、約５：１～約８：１である。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの筋形成アゴニスト対少なくとも２つの筋形成アンタゴニストの濃度の比は、約５：１～約２００：１である。

【0086】

多くの実施形態では、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかに記載のセクレトーム組成物と、薬学的に許容される担体と、薬学的に許容される防腐剤と、を含む、薬学的組成物が記載されている。

【0087】

いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、７．０～７．８のｐＨを有する生理学的緩衝液である。

【0088】

いくつかの実施形態では、薬学的に許容される防腐剤は、トレハロースである。

【0089】

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、凍結乾燥方法によって保存された粉末である。

【0090】

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ガンマ線照射によって滅菌される。

【0091】

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、単回用量ガラス容器に充填されるか、または単回用量シリンジを使用する準備ができている。

【0092】

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、コルチコステロイドをさらに含む。

【0093】

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、アナボリックステロイドをさらに含む。

【0094】

多くの実施形態では、筋肉を治療するための方法も記載されている。方法は、前述の特許請求の範囲のうちのいずれかまたは適用の他の箇所に記載の組成物を対象に投与することを含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、組成物は、注射によって投与される。いくつかの実施形態では、注射は、筋肉内、静脈内、または皮下に投与される。

【0096】

いくつかの実施形態では、組成物は、１回、毎日、毎週、または毎月投与される。

【0097】

多くの実施形態では、筋肉を治療するための方法が記載されている。方法は、部分分化胚性幹細胞由来の治療有効量のセクレトームであって、セクレトームが、少なくとも約５：１の比で筋形成アゴニスト及び筋形成アンタゴニストを含み、筋形成アゴニストが、フェチュインＡを含む、セクレトームと、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物を対象に投与するステップを含む。

【0098】

いくつかの実施形態では、セクレトームは、ｂＦＤＦ及びアクチビンＡを含む細胞培養培地中で部分分化胚性幹細胞を培養することによって得られる細胞条件培地の形態であり、生細胞が、除去されている。

【0099】

いくつかの実施形態では、セクレトームは、約５～約１５ｐｍｏｌ／ｍＬ、あるいは約１～約２０ｐｍｏｌ／ｍＬの濃度でフェチュインＡを含む。

【0100】

いくつかの実施形態では、筋形成アゴニスト対筋形成アンタゴニストの比は、約４：１～約８：１、あるいは約５：１～約７：１、あるいは約６：１～約７：１、あるいは約５：１～約５０：１、あるいは約５：１～約１００：１、あるいは約５：１～約１５０：１、あるいは約５：１～約２００：１である。

【0101】

いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、ＰＢＳである。

【0102】

いくつかの実施形態では、組成物は、約１ｐｍｏｌ／ｍＬ未満の筋形成アンタゴニストの濃度を有する。いくつかの実施形態では、筋形成アンタゴニストは、アクチビンＡを含む。いくつかの実施形態では、筋形成アンタゴニストは、ＴＧＦｂ１を含む。

【0103】

いくつかの実施形態では、筋形成アゴニストは、フォリスタチン、ＧＲＯａ、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ＩＧＦＢＰ－４、及び／またはＭＭＰタンパク質（ＭＭＰ－１０など）をさらに含む。

【0104】

多くの実施形態では、少なくとも５：１の比で筋形成アゴニストと筋形成アンタゴニストとの混合物を含む、胚性幹細胞に由来するセクレトームが記載されており、筋形成アゴニストが、フェチュインＡを含む。

【0105】

【0106】

いくつかの実施形態では、生細胞は、細胞条件培地から除去されている。

【0107】

いくつかの実施形態では、セクレトームは、約５～約１５ｐｍｏｌ／ｍＬ、あるいは約１～約２０ｐｍｏｌ／ｍＬの濃度でフェチュインＡを含む。

【0108】

【0109】

いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、ＰＢＳである。

【0110】

いくつかの実施形態では、筋形成アンタゴニストは、アクチビンＡを含む。いくつかの実施形態では、筋形成アンタゴニストは、ＴＧＦｂ１を含む。

【0111】

【0112】

多くの実施形態では、筋肉を治療するための方法が記載されている。方法は、部分分化胚性幹細胞由来の治療有効量のセクレトームであって、セクレトームが、フェチュインＡ、ＩＧＦＢＰ４、アクチビンＡ、及びフォリスタチンを含む、セクレトームと、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物を対象に投与するステップを含む。

【0113】

【0114】

いくつかの実施形態では、フェチュインＡの濃度は、約５～約１５ｐｍｏｌ／ｍＬ、あるいは約１～約２０ｐｍｏｌ／ｍＬである。

【0115】

いくつかの実施形態では、セクレトームは、ＧＲＯａ、オステオポンチン（ＯＰＮ）、及び／またはＭＭＰタンパク質（ＭＭＰ－１０など）をさらに含む。

【0116】

多くの実施形態では、少なくとも２つの筋形成アゴニスト及び少なくとも２つの筋形成アンタゴニストを含む、胚性幹細胞に由来するセクレトームが記載される。

【0117】

いくつかの実施形態では、セクレトームは、約１ｐｍｏｌ／ｍＬ未満の少なくとも２つの筋形成アンタゴニストの濃度を有する。

【0118】

いくつかの実施形態では、少なくとも２つの筋形成アンタゴニストは、アクチビンＡ及びＴＧＦｂ１を含む。

【0119】

いくつかの実施形態では、少なくとも２つの筋形成アゴニスト対少なくとも２つの筋形成アンタゴニストの比は、約４：１～約８：１、あるいは約５：１～約７：１、あるいは約６：１～約７：１、あるいは約５：１～約５０：１、あるいは約５：１～約１００：１、あるいは約５：１～約１５０：１、あるいは約５：１～約２００：１である。

【0120】

いくつかの実施形態では、少なくとも２つの筋形成アゴニストは、フェチュインＡを含み、フェチュインＡの濃度が、約５～約１５ｐｍｏｌ／ｍＬ、あるいは約１～約２０ｐｍｏｌ／ｍＬである。

【0121】

いくつかの実施形態では、少なくとも２つの筋形成アンタゴニストは、アクチビンＡを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの筋形成アンタゴニストは、ＴＧＦｂ１を含む。

【0122】

いくつかの実施形態では、少なくとも２つの筋形成アゴニストは、フォリスタチン、ＧＲＯａ、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ＩＧＦＢＰ－４、及び／またはＭＭＰタンパク質（ＭＭＰ－１０など）をさらに含む。

【0123】

多くの実施形態では、薬学的組成物は、少なくとも２つの筋形成アゴニスト及び少なくとも２つの筋形成アンタゴニストを含む、胚性幹細胞に由来するセクレトームと、薬学的に許容される担体と、薬学的に許容される防腐剤と、を含む。

【0124】

いくつかの実施形態では、セクレトームは、約１ｐｍｏｌ／ｍＬ未満の少なくとも２つの筋形成アンタゴニストの濃度を有する。

【0125】

いくつかの実施形態では、少なくとも２つの筋形成アンタゴニストは、アクチビンＡ及びＴＧＦｂ１を含む。

【0126】

【0127】

【0128】

【0129】

【0130】

いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、７．０～７．８のｐＨを有する生理学的緩衝液である。

【0131】

いくつかの実施形態では、薬学的に許容される防腐剤は、トレハロースである。

【0132】

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、凍結乾燥方法によって保存された粉末である。

【0133】

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ガンマ線照射によって滅菌される。

【0134】

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、単回用量ガラス容器に充填されるか、または単回用量シリンジを使用する準備ができている。

【0135】

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、コルチコステロイドをさらに含む。

【0136】

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、アナボリックステロイドをさらに含む。

【0137】

多くの実施形態では、薬学的組成物は、（Ａ）フォリスタチンタンパク質またはそのバリアント、及び（Ｂ）フェチュインＡタンパク質（アルファ－２－ＨＳ糖タンパク質）またはその断片もしくはバリアントを含み、（Ｂ）が、ＴＧＦ－βに結合することが可能であり、（Ａ）及び（Ｂ）の総量が、組成物中の総タンパク質の１０％超である。フォリスタチンタンパク質及びそのバリアントの配列を、図７に列挙する。

【0138】

いくつかの実施形態では、フォリスタチンタンパク質は、配列番号１～１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0139】

いくつかの実施形態では、フォリスタチンタンパク質のバリアントは、配列番号１～１３のうちのいずれか１つに対して、少なくとも７５％の配列同一性、または好ましくは、少なくとも８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有する。

【0140】

いくつかの実施形態では、フォリスタチンタンパク質のバリアントは、フォリスタチン－Ｎ末端（ＦＯＬＮ）ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦＯＬＮドメインは、配列番号１４～１６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１４～１６のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＯＬＮドメインは、配列番号１４～１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0141】

いくつかの実施形態では、フェチュインＡタンパク質は、配列番号１７～２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0142】

いくつかの実施形態では、フェチュインＡタンパク質の断片またはバリアントは、配列番号２７のアミノ酸配列、または配列番号２７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0143】

いくつかの実施形態では、フェチュインＡタンパク質の断片またはバリアントは、一本鎖または二本鎖タンパク質である。

【0144】

いくつかの実施形態では、（Ａ）は、配列番号１～１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、（Ｂ）は、配列番号１７～２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２７の断片を含む配列番号１７～２０のうちのいずれか１つの断片である。

【0145】

いくつかの実施形態では、（Ａ）及び（Ｂ）の総量は、組成物中の総タンパク質の２０％超、または好ましくは２５％、３０％、３５％、もしくは４０％超である。

【0146】

いくつかの実施形態では、総タンパク質は、筋形成アンタゴニスト因子を２０％を超えて含まず、筋形成アンタゴニスト因子が、ＩＧＦＢＰ－３（インスリン様成長因子結合タンパク質３）及びＤｋｋ－３（ｄｉｃｋｋｏｐｆＷＮＴシグナル伝達経路阻害剤３）を含む。いくつかの実施形態では、筋形成アンタゴニスト因子は、ペリオスチン、ＴＧＦｂ１、ＩＬ－６、ＦＧＦ－２１、ＴＧＦｂ２、ＴＮＦｂ、ＴＧＦｂ３、アクチビンＡ、ＴＧＦｂ１、及びＴＧＦａをさらに含む。

【0147】

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１つ以上の筋形成誘発性因子をさらに含む。いくつかの実施形態では、筋形成誘発性因子は、ＯＰＮ、ＩＧＦＢＰ－４、ＭＭＰ－１、ＴＳＰ－１、ＧＲＯａ、ＭＭＰ－１０、ｂＩＧ－Ｈ３、ｈＣＧｂ、ＲＧＭ－Ｂ、ＶＥＧＦ、Ｃｒｉｐｔｏ－１、ＨＧＦ、ＢＭＰ－５、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ－２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＦＧＦ－１９、及びＷＩＳＰ－１のうちの１つ以上を含む。

【0148】

いくつかの実施形態では、筋形成誘発性因子の総量及び筋形成アンタゴニスト因子の総量は、３：１超、または好ましくは４：１、５：１、６：１、７：１、もしくは８：１超の比を有する。

【0149】

多くの実施形態では、患者の筋肉量、筋力、または筋機能を改善するための方法は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの薬学的組成物を患者に投与するステップを含む。

【0150】

いくつかの実施形態では、投与は、筋肉内、静脈内、または皮下である。

【0151】

いくつかの実施形態では、患者は、筋損傷、筋萎縮、筋機能不全、または筋線維症に罹患している。

【0152】

多くの実施形態では、セクレトーム組成物を調製する方法は、５％～２５％ｗ／ｖの濃度でトレハロースを含むタンパク質不含培地中で幹細胞を培養するステップと、試料から上清を採取し、上清を、５％～２５％ｗ／ｖの濃度でトレハロースを含む新鮮なタンパク質不含培地と置き換えるステップと、採取した上清を合わせて、セクレトーム組成物を調製するステップと、を含む。

【0153】

【0154】

いくつかの実施形態では、フォリスタチンタンパク質は、配列番号１～１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、フォリスタチンタンパク質のバリアントは、配列番号１～１３のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、フォリスタチンタンパク質のバリアントは、フォリスタチン－Ｎ末端（ＦＯＬＮ）ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦＯＬＮドメインは、配列番号１４～１６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１４～１６のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＯＬＮドメインは、配列番号１４～１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0155】

いくつかの実施形態では、フェチュインＡタンパク質は、配列番号１７～２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、フェチュインＡタンパク質の断片またはバリアントは、配列番号２７のアミノ酸配列、または配列番号２７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、フェチュインＡタンパク質の断片またはバリアントは、一本鎖または二本鎖タンパク質である。

【0156】

【0157】

いくつかの実施形態では、（Ａ）及び（Ｂ）の総量は、組成物中の総タンパク質の２０％超である。

【0158】

【0159】

いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の筋形成誘発性因子をさらに含む。いくつかの実施形態では、筋形成誘発性因子は、ＯＰＮ、ＩＧＦＢＰ－４、ＭＭＰ－１、ＴＳＰ－１、ＧＲＯａ、ＭＭＰ－１０、ｂＩＧ－Ｈ３、ｈＣＧｂ、ＲＧＭ－Ｂ、ＶＥＧＦ、Ｃｒｉｐｔｏ－１、ＨＧＦ、ＢＭＰ－５、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ－２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＦＧＦ－１９、及びＷＩＳＰ－１のうちの１つ以上を含む。

【0160】

いくつかの実施形態では、筋形成誘発性因子の総量及び筋形成アンタゴニスト因子の総量は、３：１超の比を有する。

【0161】

多くの実施形態では、患者の筋肉量、筋力、または筋機能を改善するための方法は、（Ａ）フォリスタチンタンパク質またはそのバリアント、及び（Ｂ）フェチュインＡタンパク質（アルファ－２－ＨＳ糖タンパク質）またはその断片もしくはバリアント、を含む、薬学的組成物を患者に投与するステップを含み、（Ｂ）が、ＴＧＦ－βに結合することが可能であり、（Ａ）及び（Ｂ）の総量が、組成物中の総タンパク質の１０％超である。

【0162】

いくつかの実施形態では、投与は、筋肉内、静脈内、または皮下である。

【0163】

いくつかの実施形態では、患者は、筋損傷、筋萎縮、筋機能不全、または筋線維症に罹患している。

【0164】

【0165】

【0166】

いくつかの実施形態では、方法は、採取した上清から生細胞を除去するステップをさらに含む。

【0167】

多くの実施形態では、セクレトーム組成物を調製する方法であって、方法が、ｂＦＧＦ及びアクチビンＡを含む培養培地中で、約３日間～約７日間、多能性幹細胞を増殖させるステップと、トレハロースを含むタンパク質不含培地に多能性幹細胞を曝露させるステップであって、トレハロース濃度が、５％～２５％である、ステップと、培養上清を毎日採取し、約１日～約１０日間、トレハロースを含む追加のタンパク質不含培地と置き換えるステップと、採取した培養上清を合わせて、合わせた培養上清のプールを形成するステップと、合わせた培養上清のプールを均質化して、均質化された合わせた培養上清のプールを形成するステップと、均質化された合わせた培養上清のプールを膜フィルターに通して濾過して、濾過された均質化された合わせたプールを形成するステップと、を含む。

【0168】

【0169】

いくつかの実施形態では、濾過された均質化された合わせたプールから生細胞を除去するステップをさらに含む。

【0170】

いくつかの実施形態では、セクレトーム組成物は、フェチュインＡ、フォリスタチン、及びフォリスタチン様－１からなる群から選択される少なくとも２つの筋形成アゴニストを含み、少なくとも２つの筋形成アゴニストの合わせた濃度が、約１～約２０ｐｍｏｌ／ｍＬである。

【0171】

いくつかの実施形態では、少なくとも２つの筋形成アゴニストは、ＯＰＮ、ＩＧＦＢＰ－４、ＭＭＰ－１、ＴＳＰ－１、ＧＲＯａ（ＣＸＣＬ１）、ＭＭＰ－１０、ｂＩＧ－Ｈ３、ｈＣＧｂ、ＲＧＭ－Ｂ、ＶＥＧＦ、Ｃｒｉｐｔｏ－１、ＨＧＦ、ＢＭＰ－５、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ－２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＦＧＦ－１９、ＷＩＳＰ－１、またはそれらの組み合わせをさらに含む。

【0172】

【0173】

【0174】

多くの実施形態では、薬学的組成物は、フェチュインＡ、フォリスタチン、及びフォリスタチン様－１からなる群から選択される少なくとも２つの筋形成アゴニストであって、少なくとも２つの筋形成アゴニストの合わせた濃度が、約１～約２０ｐｍｏｌ／ｍＬである、少なくとも２つの筋形成アゴニストと、薬学的に許容される担体と、薬学的に許容される防腐剤と、を含む。

【0175】

いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、７．０～７．８のｐＨを有する生理学的緩衝液である。

【0176】

いくつかの実施形態では、薬学的に許容される防腐剤は、トレハロースである。

【0177】

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、凍結乾燥方法によって保存された粉末である。

【0178】

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ガンマ線照射によって滅菌される。

【0179】

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、単回用量ガラス容器に充填されるか、または単回用量シリンジを使用する準備ができている。

【0180】

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、コルチコステロイドをさらに含む。

【0181】

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、アナボリックステロイドをさらに含む。

【0182】

いくつかの実施形態では、筋肉を治療するための方法であって、方法が、フェチュインＡ、フォリスタチン、及びフォリスタチン様－１からなる群から選択される少なくとも２つの筋形成アゴニストであって、少なくとも２つの筋形成アゴニストの合わせた濃度が、約１～約２０ｐｍｏｌ／ｍＬである、少なくとも２つの筋形成アゴニストと、薬学的に許容される担体と、薬学的に許容される防腐剤と、を含む、組成物を対象に投与するステップを含む。

【0183】

いくつかの実施形態では、組成物は、注射によって投与される。

【0184】

いくつかの実施形態では、注射は、筋肉内、静脈内、または皮下に投与される。

【0185】

いくつかの実施形態では、組成物は、１回、毎日、毎週、または毎月投与される。

【0186】

上の実施形態のうちのいずれにおいても、組成物は、フォリスタチン、フォリスタチンバリアント、またはフォリスタチンの断片を含み得る。上の実施形態のうちのいずれにおいても、組成物は、フェチュインＡ、フェチュインＡバリアント、またはフェチュインＡの断片を含み得る。

【0187】

条項
例示的な実施形態は、以下の付番された条項に示される。
条項１．（Ａ）フォリスタチンタンパク質またはそのバリアント、及び（Ｂ）フェチュインＡタンパク質（アルファ－２－ＨＳ糖タンパク質）またはその断片もしくはバリアントを含む、薬学的組成物であって、（Ｂ）が、ＴＧＦ－βに結合することが可能であり、（Ａ）及び（Ｂ）の総量が、前記組成物中の総タンパク質の１０％超である、前記薬学的組成物。
条項２．前記フォリスタチンタンパク質が、配列番号１～１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、条項１に記載の薬学的組成物。
条項３．前記フォリスタチンタンパク質の前記バリアントが、配列番号１～１３のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％の配列同一性を有する、条項２に記載の薬学的組成物。
条項４．前記フォリスタチンタンパク質の前記バリアントが、フォリスタチンＮ末端（ＦＯＬＮ）ドメインを含む、条項３に記載の薬学的組成物。
条項５．前記ＦＯＬＮドメインが、配列番号１４～１６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１４～１６のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、条項４に記載の薬学的組成物。
条項６．前記ＦＯＬＮドメインが、配列番号１４～１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、条項４に記載の薬学的組成物。
条項７．前記フェチュインＡタンパク質が、配列番号１７～２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、条項１に記載の薬学的組成物。
条項８．前記フェチュインＡタンパク質の前記断片または前記バリアントが、配列番号２７のアミノ酸配列、または配列番号２７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、条項７に記載の薬学的組成物。
条項９．前記フェチュインＡタンパク質の前記断片または前記バリアントが、一本鎖または二本鎖タンパク質である、条項７に記載の薬学的組成物。
条項１０．前記（Ａ）が、配列番号１～１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記（Ｂ）が、配列番号１７～２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２７の断片を含む配列番号１７～２０のうちのいずれか１つの断片である、条項１に記載の薬学的組成物。
条項１１．前記（Ａ）及び前記（Ｂ）の前記総量が、前記組成物中の総タンパク質の２０％超である、条項１に記載の薬学的組成物。
条項１２．前記総タンパク質が、筋形成アンタゴニスト因子を２０％を超えて含まず、前記筋形成アンタゴニスト因子が、ＩＧＦＢＰ－３（インスリン様成長因子結合タンパク質３）及びＤｋｋ－３（ｄｉｃｋｋｏｐｆＷＮＴシグナル伝達経路阻害剤３）を含む、条項１に記載の薬学的組成物。
条項１３．前記筋形成アンタゴニスト因子が、ペリオスチン、ＴＧＦｂ１、ＩＬ－６、ＦＧＦ－２１、ＴＧＦｂ２、ＴＮＦｂ、ＴＧＦｂ３、アクチビンＡ、ＴＧＦｂ１、及びＴＧＦａをさらに含む、条項１２に記載の薬学的組成物。
条項１４．１つ以上の筋形成誘発性因子をさらに含む、条項１に記載の薬学的組成物。
条項１５．前記筋形成誘発性因子が、ＯＰＮ、ＩＧＦＢＰ－４、ＭＭＰ－１、ＴＳＰ－１、ＧＲＯａ、ＭＭＰ－１０、ｂＩＧ－Ｈ３、ｈＣＧｂ、ＲＧＭ－Ｂ、ＶＥＧＦ、Ｃｒｉｐｔｏ－１、ＨＧＦ、ＢＭＰ－５、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ－２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＦＧＦ－１９、及びＷＩＳＰ－１のうちの１つ以上を含む、条項１４に記載の薬学的組成物。
条項１６．前記筋形成誘発性因子の総量及び前記筋形成アンタゴニスト因子の総量が、３：１超の比を有する、条項１に記載の薬学的組成物。
条項１７．患者の筋肉量、筋力、または筋機能を改善するための方法であって、
（Ａ）フォリスタチンタンパク質またはそのバリアント、及び（Ｂ）フェチュインＡタンパク質（アルファ－２－ＨＳ糖タンパク質）またはその断片もしくはバリアントを含む、薬学的組成物を前記患者に投与するステップであって、（Ｂ）が、ＴＧＦ－βに結合することが可能であり、（Ａ）及び（Ｂ）の総量が、前記組成物中の総タンパク質の１０％超である、前記ステップを含む、前記方法。
条項１８．前記投与が、筋肉内、静脈内、または皮下である、条項１７に記載の方法。
条項１９．前記患者が、筋損傷、筋萎縮、筋機能不全、または筋線維症に罹患している、条項１７に記載の方法。
条項２０．セクレトーム組成物を調製する方法であって、
５％～２５％ｗ／ｖの濃度でトレハロースを含むタンパク質不含培地中で幹細胞を培養するステップと、
試料から上清を採取し、前記上清を、５％～２５％ｗ／ｖの濃度でトレハロースを含む新鮮なタンパク質不含培地と置き換えるステップと、
前記採取した上清を合わせて、前記セクレトーム組成物を調製するステップと、を含む、前記方法。
条項２１．タンジェンシャルフロー濾過を使用して、前記濾過された均質化された合わせたプールの体積を低減するステップをさらに含む、条項２０に記載の方法。
条項２２．前記タンジェンシャルフロー濾過による前記体積低減が、５０：１～１００：１である、条項２１に記載の方法。
条項２３．前記タンジェンシャルフロー濾過が、１～５ｋＤａのカットオフ膜を利用する、条項２２に記載の方法。
条項２４．前記採取した上清から生細胞を除去するステップをさらに含む、条項２０に記載の方法。
条項２５．セクレトーム組成物を調製する方法であって、前記方法が、
ｂＦＧＦ及びアクチビンＡを含む培養培地中で、約３日間～約７日間、多能性幹細胞を増殖させるステップと、
トレハロースを含むタンパク質不含培地に前記多能性幹細胞を曝露させるステップであって、前記トレハロース濃度が、５％～２５％である、前記ステップと、
前記培養上清を毎日採取し、約１日間～約１０日間、トレハロースを含む追加のタンパク質不含培地と置き換えるステップと、
前記採取した培養上清を合わせて、合わせた培養上清のプールを形成するステップと、
前記合わせた培養上清のプールを均質化して、均質化された合わせた培養上清のプールを形成するステップと、
前記均質化された合わせた培養上清のプールを膜フィルターに通して濾過して、濾過された均質化された合わせたプールを形成するステップと、を含む、前記方法。
条項２６．タンジェンシャルフロー濾過を使用して、前記濾過された均質化された合わせたプールの体積を低減するステップをさらに含む、条項２５に記載の方法。
条項２７．前記タンジェンシャルフロー濾過による前記体積低減が、５０：１～１００：１である、条項２６に記載の方法。
条項２８．前記タンジェンシャルフロー濾過が、１～５ｋＤａのカットオフ膜を利用する、条項２６に記載の方法。
条項２９．前記濾過された均質化された合わせたプールから生細胞を除去するステップをさらに含む、条項２５に記載の方法。
条項３０．セクレトーム組成物であって、
フェチュインＡ、フォリスタチン、及びフォリスタチン様－１からなる群から選択される少なくとも２つの筋形成アゴニストを含み、
前記少なくとも２つの筋形成アゴニストの合わせた濃度が、約１～約２０ｐｍｏｌ／ｍＬである、前記セクレトーム組成物。
条項３１．前記少なくとも２つの筋形成アゴニストが、ＯＰＮ、ＩＧＦＢＰ－４、ＭＭＰ－１、ＴＳＰ－１、ＧＲＯａ（ＣＸＣＬ１）、ＭＭＰ－１０、ｂＩＧ－Ｈ３、ｈＣＧｂ、ＲＧＭ－Ｂ、ＶＥＧＦ、Ｃｒｉｐｔｏ－１、ＨＧＦ、ＢＭＰ－５、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ－２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＦＧＦ－１９、ＷＩＳＰ－１、またはそれらの組み合わせをさらに含む、条項３０に記載の組成物。
条項３２．前記組成物が、少なくとも２つの筋形成アンタゴニストをさらに含む、条項３０に記載の組成物。
条項３３．前記組成物が、約１ｐｍｏｌ／ｍＬ未満の前記少なくとも２つの筋形成アンタゴニストの濃度を有する、条項３２に記載の組成物。
条項３４．前記少なくとも２つの筋形成アンタゴニストが、アクチビンＡ及びＴＧＦｂ１を含む、条項３２に記載の組成物。
条項３５．前記少なくとも２つの筋形成アゴニスト対前記少なくとも２つの筋形成アンタゴニストの濃度の比が、約４：１～約８：１である、条項３２に記載の組成物。
条項３６．前記少なくとも２つの筋形成アゴニスト対前記少なくとも２つの筋形成アンタゴニストの濃度の比が、約５：１～約８：１である、条項３２に記載の組成物。
条項３７．前記少なくとも２つの筋形成アゴニスト対前記少なくとも２つの筋形成アンタゴニストの濃度の比が、約５：１～約２００：１である、条項３２に記載の組成物。
条項３８．薬学的組成物であって、
フェチュインＡ、フォリスタチン、及びフォリスタチン様－１からなる群から選択される少なくとも２つの筋形成アゴニストであって、前記少なくとも２つの筋形成アゴニストの合わせた濃度が、約１～約２０ｐｍｏｌ／ｍＬである、前記少なくとも２つの筋形成アゴニストと、
薬学的に許容される担体と、
薬学的に許容される防腐剤と、を含む、前記薬学的組成物。
条項３９．前記薬学的に許容される担体が、７．０～７．８のｐＨを有する生理学的緩衝液である、条項３８に記載の組成物。
条項４０．前記薬学的に許容される防腐剤が、トレハロースである、条項３８に記載の組成物。
条項４１．前記薬学的組成物が、凍結乾燥方法によって保存された粉末である、条項３８に記載の組成物。
条項４２．前記薬学的組成物が、ガンマ線照射によって滅菌される、条項３８に記載の組成物。
条項４３．前記薬学的組成物が、単回用量ガラス容器に充填されるか、または単回用量シリンジを使用する準備ができている、条項３８に記載の組成物。
条項４４．前記薬学的組成物が、コルチコステロイドをさらに含む、条項３８に記載の組成物。
条項４５．前記薬学的組成物が、アナボリックステロイドをさらに含む、条項３８に記載の組成物。
条項４６．筋肉を治療するための方法であって、前記方法が、
フェチュインＡ、フォリスタチン、及びフォリスタチン様－１からなる群から選択される少なくとも２つの筋形成アゴニストであって、前記少なくとも２つの筋形成アゴニストの合わせた濃度が、約１～約２０ｐｍｏｌ／ｍＬである、前記少なくとも２つの筋形成アゴニストと、薬学的に許容される担体と、薬学的に許容される防腐剤と、を含む、組成物を対象に投与するステップを含む、前記方法。
条項４７．前記組成物が、注射によって投与される、条項４６に記載の方法。
条項４８．前記注射が、筋肉内、静脈内、または皮下に投与される、条項４７に記載の方法。
条項４９．前記組成物が、１回、毎日、毎週、または毎月投与される、条項４７に記載の方法。

参考文献
１．Ｄｅｇｅｎｓ，Ｈ．，ａｎｄＡｌｗａｙ，Ｓ．Ｅ．（２００６）Ｃｏｎｔｒｏｌｏｆｍｕｓｃｌｅｓｉｚｅｄｕｒｉｎｇｄｉｓｕｓｅ，ｄｉｓｅａｓｅ，ａｎｄａｇｉｎｇ．ＩｎｔＪＳｐｏｒｔｓＭｅｄ２７，９４－９９
２．Ｒｅｉｄｙ，Ｐ．Ｔ．，Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｃ．Ｃ．，ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ａ．Ｉ．，Ｆｒｙ，Ｃ．Ｓ．，Ｓｕｐｉａｎｏ，Ｍ．Ａ．，Ｍａｒｃｕｓ，Ｒ．Ｌ．，ＬａＳｔａｙｏ，Ｐ．Ｃ．，ａｎｄＤｒｕｍｍｏｎｄ，Ｍ．Ｊ．（２０１８）Ａｇｉｎｇ－ｒｅｌａｔｅｄｅｆｆｅｃｔｓｏｆｂｅｄｒｅｓｔｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｅｃｃｅｎｔｒｉｃｅｘｅｒｃｉｓｅｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎｏｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｎｄｉｎｓｕｌｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．ＥｘｐＧｅｒｏｎｔｏｌ１０７，３７－４９
３．Ｓｕｅｔｔａ，Ｃ．，Ｆｒａｎｄｓｅｎ，Ｕ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｊｅｓｐｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｈｖｉｄ，Ｌ．Ｇ．，Ｂａｙｅｒ，Ｍ．，Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｈ．Ｄ．，Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｈｅｉｎｅｍｅｉｅｒ，Ｋ．Ｍ．，Ａａｇａａｒｄ，Ｐ．，Ｓｃｈｊｅｒｌｉｎｇ，Ｐ．，ａｎｄＫｊａｅｒ，Ｍ．（２０１２）Ａｇｉｎｇａｆｆｅｃｔｓｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｄｉｓｕｓｅａｔｒｏｐｈｙ．ＰｌｏＳｏｎｅ７，ｅ５１２３８
４．Ｃａｎｇｅｌｏｓｉ，Ｄ．，Ｒｅｓａｚ，Ｒ．，Ｐｅｔｒｅｔｔｏ，Ａ．，Ｓｅｇａｌｅｒｂａ，Ｄ．，Ｏｇｎｉｂｅｎｅ，Ｍ．，Ｒａｇｇｉ，Ｆ．，Ｍａｓｔｒａｃｃｉ，Ｌ．，Ｇｒｉｌｌｏ，Ｆ．，Ｂｏｓｃｏ，Ｍ．Ｃ．，Ｖａｒｅｓｉｏ，Ｌ．，Ｓｉｃａ，Ａ．，Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｉ．，ａｎｄＥｖａ，Ａ．（２０１９）ＡＰｒｏｔｅｏｍｉｃＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＧＳＤ－１ａｉｎＭｏｕｓｅＬｉｖｅｒｓ：ＥｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒＭｅｔａｂｏｌｉｃＲｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄＭａｃｒｏｐｈａｇｅＰｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．ＪＰｒｏｔｅｏｍｅＲｅｓ１８，２９６５－２９７８
５．Ｌｉ，Ｃ．Ｉ．，Ｌｉ，Ｔ．Ｃ．，Ｌｉｎ，Ｗ．Ｙ．，Ｌｉｕ，Ｃ．Ｓ．，Ｈｓｕ，Ｃ．Ｃ．，Ｈｓｉｕｎｇ，Ｃ．Ａ．，Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｙ．，Ｈｕａｎｇ，Ｋ．Ｃ．，Ｗｕ，Ｃ．Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｃ．，Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ，ａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＡｇｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈｉｎＴａｉｗａｎ，Ｔ．（２０１５）ＣｏｍｂｉｎｅｄａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆｃｈｒｏｎｉｃｄｉｓｅａｓｅａｎｄｌｏｗｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｍａｓｓｗｉｔｈｐｈｙｓｉｃａｌｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｉｎｏｌｄｅｒａｄｕｌｔｓｉｎｔｈｅＳａｒｃｏｐｅｎｉａａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＡｇｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈｉｎＴａｉｗａｎ（ＳＴＡＲＴ）ｓｔｕｄｙ．ＢＭＣＧｅｒｉａｔｒ１５，１１
６．Ｅｖａｎｓ，Ｗ．Ｊ．（２０１０）Ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｌｏｓｓ：ｃａｃｈｅｘｉａ，ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ，ａｎｄｉｎａｃｔｉｖｉｔｙ．ＡｍＪＣｌｉｎＮｕｔｒ９１，１１２３Ｓ－１１２７Ｓ
７．Ｅｖａｎｓ，Ｗ．Ｊ．（２０１５）ＳａｒｃｏｐｅｎｉａＳｈｏｕｌｄＲｅｆｌｅｃｔｔｈｅＣｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＡｇｅ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＣｈａｎｇｅｓｉｎＳｋｅｌｅｔａｌＭｕｓｃｌｅｔｏＲｉｓｋｏｆＭｏｒｂｉｄｉｔｙａｎｄＭｏｒｔａｌｉｔｙｉｎＥｌｄｅｒｌｙＰｅｏｐｌｅ．ＪＡｍＭｅｄＤｉｒＡｓｓｏｃ１６，５４６－５４７
８．Ｋｉｒｉｙａ，Ｙ．，Ｔｏｓｈｉａｋｉ，Ｎ．，Ｓｈｉｂａｓａｋｉ，Ｉ．，Ｏｇａｔａ，Ｋ．，Ｏｇａｗａ，Ｈ．，Ｔａｋｅｉ，Ｙ．，Ｔｅｚｕｋａ，Ｍ．，Ｓｅｋｉ，Ｍ．，Ｋａｔｏ，Ｔ．，Ｌｅｆｏｒ，Ａ．Ｋ．，ａｎｄＦｕｋｕｄａ，Ｈ．（２０２０）Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａａｓｓｅｓｓｅｄｂｙｔｈｅｑｕａｎｔｉｔｙａｎｄｑｕａｌｉｔｙｏｆｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｉｓａｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｆａｃｔｏｒｆｏｒｐａｔｉｅｎｔｓｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇｃａｒｄｉａｃｓｕｒｇｅｒｙ．ＳｕｒｇＴｏｄａｙ５０，８９５－９０４
９．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｓ．，Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄＴｏｔｈ，Ｍ．Ｊ．（２０１４）Ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｍｙｏｆｉｌａｍｅｎｔａｄａｐｔａｔｉｏｎｓｔｏａｇｉｎｇ，ｄｉｓｅａｓｅ，ａｎｄｄｉｓｕｓｅａｎｄｔｈｅｉｒｅｆｆｅｃｔｓｏｎｗｈｏｌｅｍｕｓｃｌｅｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｉｎｏｌｄｅｒａｄｕｌｔｈｕｍａｎｓ．ＦｒｏｎｔＰｈｙｓｉｏｌ５，３６９
１０．Ｗａｌｌ，Ｂ．Ｔ．，Ｄｉｒｋｓ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄｖａｎＬｏｏｎ，Ｌ．Ｊ．（２０１３）Ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅａｔｒｏｐｈｙｄｕｒｉｎｇｓｈｏｒｔ－ｔｅｒｍｄｉｓｕｓｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｓａｒｃｏｐｅｎｉａ．Ａｇｅｉｎｇｒｅｓｅａｒｃｈｒｅｖｉｅｗｓ１２，８９８－９０６
１１．Ｈａｕｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ，Ｊ．Ａ．，Ｔｒａｐｐｅ，Ｓ．Ｗ．，ａｎｄＴｒａｐｐｅ，Ｔ．Ａ．（２００７）Ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ，ａｎｄａｄｖａｎｃｅｄｇｌｙｃａｔｉｏｎｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓｉｎａｇｉｎｇｈｕｍａｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ．ＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ（１９８５）１０３，２０６８－２０７６
１２．Ｋｏｖａｎｅｎ，Ｖ．，Ｓｕｏｍｉｎｅｎ，Ｈ．，ａｎｄＰｅｌｔｏｎｅｎ，Ｌ．（１９８７）Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｇｉｎｇａｎｄｌｉｆｅ－ｌｏｎｇｐｈｙｓｉｃａｌｔｒａｉｎｉｎｇｏｎｃｏｌｌａｇｅｎｉｎｓｌｏｗａｎｄｆａｓｔｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｉｎｒａｔｓ．Ａｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃａｎｄｉｍｍｕｎｏ－ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔｕｄｙ．ＣｅｌｌＴｉｓｓｕｅＲｅｓ２４８，２４７－２５５
１３．Ａｌｗａｙ，Ｓ．Ｅ．，Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｓ．Ｌ．，Ｅｄｅｎｓ，Ｎ．Ｋ．，Ｈａｏ，Ｙ．，ａｎｄＢｅｎｎｅｔｔ，Ｂ．Ｔ．（２０１３）ｂｅｔａ－Ｈｙｄｒｏｘｙ－ｂｅｔａ－ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ（ＨＭＢ）ｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌｓｉｎｆａｓｔｍｕｓｃｌｅｓｏｆａｇｅｄｒａｔｓｄｕｒｉｎｇｒｅｃｏｖｅｒｙｆｒｏｍｄｉｓｕｓｅａｔｒｏｐｈｙ．ＥｘｐＧｅｒｏｎｔｏｌ４８，９７３－９８４
１４．Ｌａｃｒａｚ，Ｇ．，Ｒｏｕｌｅａｕ，Ａ．Ｊ．，Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ｖ．，Ｓｏｌｌｒａｌｄ，Ｔ．，Ｄｒｏｕｉｎ，Ｇ．，Ｖｅｉｌｌｅｔｔｅ，Ｎ．，Ｇｒａｎｄｂｏｉｓ，Ｍ．，ａｎｄＧｒｅｎｉｅｒ，Ｇ．（２０１５）ＩｎｃｒｅａｓｅｄＳｔｉｆｆｎｅｓｓｉｎＡｇｅｄＳｋｅｌｅｔａｌＭｕｓｃｌｅＩｍｐａｉｒｓＭｕｓｃｌｅＰｒｏｇｅｎｉｔｏｒＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅＡｃｔｉｖｉｔｙ．ＰＬｏＳＯｎｅ１０，ｅ０１３６２１７
１５．Ｍａｈｄｙ，Ｍ．Ａ．Ａ．（２０１９）Ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｆｉｂｒｏｓｉｓ：ａｎｏｖｅｒｖｉｅｗ．ＣｅｌｌＴｉｓｓｕｅＲｅｓ３７５，５７５－５８８
１６．Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ａ．，Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｊ．，Ｈｏｎｄａ，Ｙ．，Ｋａｔａｏｋａ，Ｈ．，Ｎａｋａｎｏ，Ｊ．，ａｎｄＯｋｉｔａ，Ｍ．（２０１７）Ｃｙｃｌｉｃｍｕｓｃｌｅｔｗｉｔｃｈｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｓｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄｍｕｓｃｌｅｃｏｎｔｒａｃｔｕｒｅａｎｄｆｉｂｒｏｓｉｓｉｎｒａｔｓ．ＣｏｎｎｅｃｔＴｉｓｓｕｅＲｅｓ５８，４８７－４９５
１７．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｔ．Ａ．，Ｌｅｓｎｉｅｗｓｋｉ，Ｌ．Ａ．，Ｍｕｌｌｅｒ－Ｄｅｌｐ，Ｊ．Ｍ．，Ｍａｊｏｒｓ，Ａ．Ｋ．，Ｓｃａｌｉｓｅ，Ｄ．，ａｎｄＤｅｌｐ，Ｍ．Ｄ．（２００１）Ｈｉｎｄｌｉｍｂｕｎｌｏａｄｉｎｇｉｎｄｕｃｅｓａｃｏｌｌａｇｅｎｉｓｏｆｏｒｍｓｈｉｆｔｉｎｔｈｅｓｏｌｅｕｓｍｕｓｃｌｅｏｆｔｈｅｒａｔ．Ａｍｅｒｉｃａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ，ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅａｎｄｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ２８１，Ｒ１７１０－１７１７
１８．Ｅｔｉｅｎｎｅ，Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｃ．，Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｃｏｎｂｏｙ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄＣｏｎｂｏｙ，Ｉ．Ｍ．（２０２０）Ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅａｓａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｏｄｅｌｏｆｃｈｏｉｃｅｔｏｓｔｕｄｙｔｉｓｓｕｅａｇｉｎｇａｎｄｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ．ＳｋｅｌｅｔＭｕｓｃｌｅ１０
１９．Ｙａｍａｋａｗａ，Ｈ．，Ｋｕｓｕｍｏｔｏ，Ｄ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｈ．，ａｎｄＹｕａｓａ，Ｓ．（２０２０）ＳｔｅｍＣｅｌｌＡｇｉｎｇｉｎＳｋｅｌｅｔａｌＭｕｓｃｌｅＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄＤｉｓｅａｓｅ．ＩｎｔＪＭｏｌＳｃｉ２１
２０．Ｂｒａｃｋ，Ａ．Ｓ．，Ｃｏｎｂｏｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｒｏｙ，Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｍ．，Ｋｕｏ，Ｃ．Ｊ．，Ｋｅｌｌｅｒ，Ｃ．，ａｎｄＲａｎｄｏ，Ｔ．Ａ．（２００７）ＩｎｃｒｅａｓｅｄＷｎｔｓｉｇｎａｌｉｎｇｄｕｒｉｎｇａｇｉｎｇａｌｔｅｒｓｍｕｓｃｌｅｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｔｅａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｓｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３１７，８０７－８１０
２１．Ｃｈａｋｋａｌａｋａｌ，Ｊ．Ｖ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｋ．Ｍ．，Ｂａｓｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄＢｒａｃｋ，Ａ．Ｓ．（２０１２）Ｔｈｅａｇｅｄｎｉｃｈｅｄｉｓｒｕｐｔｓｍｕｓｃｌｅｓｔｅｍｃｅｌｌｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ４９０，３５５－３６０
２２．Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｗｅｈｌｉｎｇ－Ｈｅｎｒｉｃｋｓ，Ｍ．，Ｗｅｌｃ，Ｓ．Ｓ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ａ．Ｌ．，Ｚｕｏ，Ｑ．，ａｎｄＴｉｄｂａｌｌ，Ｊ．Ｇ．（２０１９）Ａｇｉｎｇｏｆｔｈｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍｃａｕｓｅｓｒｅｄｕｃｔｉｏｎｓｉｎｍｕｓｃｌｅｓｔｅｍｃｅｌｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ，ｐｒｏｍｏｔｅｓｔｈｅｉｒｓｈｉｆｔｔｏａｆｉｂｒｏｇｅｎｉｃｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，ａｎｄｍｏｄｕｌａｔｅｓｓａｒｃｏｐｅｎｉａ．ＦＡＳＥＢＪ３３，１４１５－１４２７
２３．Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｗｅｈｌｉｎｇ－Ｈｅｎｒｉｃｋｓ，Ｍ．，Ｓａｍｅｎｇｏ，Ｇ．，ａｎｄＴｉｄｂａｌｌ，Ｊ．Ｇ．（２０１５）ＩｎｃｒｅａｓｅｓｏｆＭ２ａｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｎｄｆｉｂｒｏｓｉｓｉｎａｇｉｎｇｍｕｓｃｌｅａｒｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄｂｙｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｇｉｎｇａｎｄｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｍｕｓｃｌｅ－ｄｅｒｉｖｅｄｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ．ＡｇｉｎｇＣｅｌｌ１４，６７８－６８８
２４．Ｔｉｄｂａｌｌ，Ｊ．Ｇ．（２０１７）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｍｕｓｃｌｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｂｙｔｈｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍ．ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ１７，１６５－１７８
２５．Ｒｅｉｄｙ，Ｐ．Ｔ．，ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ａ．Ｉ．，Ｍａｈｍａｓｓａｎｉ，Ｚ．Ｓ．，Ｐｅｔｒｏｃｅｌｌｉ，Ｊ．Ｊ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｃ．Ｃ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｏｒｒｏｗ，Ｖ．Ｒ．，Ｋｅｅｆｅ，Ａ．Ｃ．，Ｈｕｆｆａｋｅｒ，Ｔ．Ｂ．，Ｓｔｏｄｄａｒｄ，Ｇ．Ｊ．，Ｋａｒｄｏｎ，Ｇ．，Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄＤｒｕｍｍｏｎｄ，Ｍ．Ｊ（２０１９）Ａｇｉｎｇｉｍｐａｉｒｓｍｏｕｓｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｍｕｓｃｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｂｕｎｄａｎｃｅｄｕｒｉｎｇｒｅｃｏｖｅｒｙｆｒｏｍｄｉｓｕｓｅ．Ａｍｅｒｉｃａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ３１７，Ｅ８５－Ｅ９８
２６．Ｔｉｄｂａｌｌ，Ｊ．Ｇ．，ａｎｄＷｅｈｌｉｎｇ－Ｈｅｎｒｉｃｋｓ，Ｍ．（２００７）Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｐｒｏｍｏｔｅｍｕｓｃｌｅｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｐａｉｒａｎｄｍｕｓｃｌｅｆｉｂｒｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｍｏｄｉｆｉｅｄｍｕｓｃｌｅｌｏａｄｉｎｇｉｎｍｉｃｅｉｎｖｉｖｏ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ５７８，３２７－３３６
２７．Ｓｕｍｍａｎ，Ｍ．，Ｗａｒｒｅｎ，Ｇ．Ｌ．，Ｍｅｒｃｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｒ．，Ｈｕｌｄｅｒｍａｎ，Ｔ．，ＶａｎＲｏｏｉｊｅｎ，Ｎ．，ａｎｄＳｉｍｅｏｎｏｖａ，Ｐ．Ｐ．（２００６）Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｎｄｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ａｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｌｉｐｏｓｏｍｅｄｅｐｌｅｔｉｏｎｓｔｕｄｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ，ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅａｎｄｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ２９０，Ｒ１４８８－１４９５
２８．Ｏｈｉｒａ，Ｔ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．Ｄ．，Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｋａｗａｎｏ，Ｆ．，Ｇｏｔｏ，Ｋ．，Ｉｚａｗａ，Ｔ．，Ｏｈｎｏ，Ｈ．，Ｋｉｚａｋｉ，Ｔ．，ａｎｄＯｈｉｒａ，Ｙ．（２０１５）Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｉｎｏｓｔｅｏｐｅｔｒｏｔｉｃ（ｏｐ／ｏｐ）ｍｉｃｅｉｎｈｉｂｉｔｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌｓａｎｄｐｒｅｖｅｎｔｓｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙｉｎｓｉｎｇｌｅｓｏｌｅｕｓｆｉｂｅｒｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｃｅｌｌｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ３０８，Ｃ８４８－８５５
２９．Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｗ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｃ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｓａｒｗａｒ，Ｚ．，Ｗｅｔｚｅｌ，Ｍ．Ｄ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｔ．，Ｐｏｒｔｅｒ，Ｌ．，Ｂｅｒｔｏｎ，Ｍ．Ｔ．，ＭｃＭａｎｕｓ，Ｌ．Ｍ．，ａｎｄＳｈｉｒｅｍａｎ，Ｐ．Ｋ．（２０１６）ＡｂｓｅｎｃｅｏｆＣＣＲ２ｒｅｓｕｌｔｓｉｎａｎｉｎｆｌａｍｍａｇｉｎｇｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｉｎｙｏｕｎｇｍｉｃｅｗｉｔｈａｇｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｓｉｎｍｕｓｃｌｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｌｅｕｋｏｃｙｔｅｂｉｏｌｏｇｙ１００，１０１１－１０２５
３０．Ｓｅｇａｗａ，Ｍ．，Ｆｕｋａｄａ，Ｓ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｙａｈａｇｉ，Ｈ．，Ｋａｎｅｍａｔｓｕ，Ｍ．，Ｓａｔｏ，Ｍ．，Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｕｅｚｕｍｉ，Ａ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｓ．，Ｍｉｙａｇｏｅ－Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．，Ｔｓｕｊｉｋａｗａ，Ｋ．，ａｎｄＹａｍａｍｏｔｏ，Ｈ．（２００８）Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍａｃｒｏｐｈａｇｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｍｐａｉｒｓｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｗｉｔｈｓｅｖｅｒｅｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｅｌｌｒｅｓｅａｒｃｈ３１４，３２３２－３２４４
３１．Ａｌｗａｙ，Ｓ．Ｅ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｂ．Ｔ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｅｄｅｎｓ，Ｎ．Ｋ．，ａｎｄＰｅｒｅｉｒａ，Ｓ．Ｌ．（２０１４）Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ－３－ｇａｌｌａｔｅｉｍｐｒｏｖｅｓｐｌａｎｔａｒｉｓｍｕｓｃｌｅｒｅｃｏｖｅｒｙａｆｔｅｒｄｉｓｕｓｅｉｎａｇｅｄｒａｔｓ．ＥｘｐＧｅｒｏｎｔｏｌ５０，８２－９４
３２．Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｂ．Ｔ．，Ｍｏｈａｍｅｄ，Ｊ．Ｓ．，ａｎｄＡｌｗａｙ，Ｓ．Ｅ．（２０１３）Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌｏｎｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆｍｕｓｃｌｅｍａｓｓｆｏｌｌｏｗｉｎｇｄｉｓｕｓｅｉｎｔｈｅｐｌａｎｔａｒｉｓｍｕｓｃｌｅｏｆａｇｅｄｒａｔｓ．ＰｌｏＳｏｎｅ８，ｅ８３５１８
３３．Ｂｒｏｏｋｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｈａｊｉｒａ，Ａ．，Ｍｏｈａｍｅｄ，Ｊ．Ｓ．，ａｎｄＡｌｗａｙ，Ｓ．Ｅ．（２０１８）Ｖｏｌｕｎｔａｒｙｗｈｅｅｌｒｕｎｎｉｎｇｉｎｃｒｅａｓｅｓｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌａｂｕｎｄａｎｃｅａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｓｒｅｃｏｖｅｒｙｆｒｏｍｄｉｓｕｓｅｉｎｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｉｕｓｍｕｓｃｌｅｓｆｒｏｍｍｉｃｅ．ＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ（１９８５）１２４，１６１６－１６２８
３４．Ａｌｗａｙ，Ｓ．Ｅ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｂ．Ｔ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｐｅｒｒｉｎｇｅｒ，Ｊ．，Ｍｏｈａｍｅｄ，Ｊ．Ｓ．，Ｅｄｅｎｓ，Ｎ．Ｋ．，ａｎｄＰｅｒｅｉｒａ，Ｓ．Ｌ．（２０１５）Ｇｒｅｅｎｔｅａｅｘｔｒａｃｔａｔｔｅｎｕａｔｅｓｍｕｓｃｌｅｌｏｓｓａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｓｍｕｓｃｌｅｆｕｎｃｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｄｉｓｕｓｅ，ｂｕｔｆａｉｌｓｔｏｉｍｐｒｏｖｅｍｕｓｃｌｅｒｅｃｏｖｅｒｙｆｏｌｌｏｗｉｎｇｕｎｌｏａｄｉｎｇｉｎａｇｅｄｒａｔｓ．ＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ（１９８５）１１８，３１９－３３０
３５．Ｃｈｅｎ，Ｋ．Ｄ．，ａｎｄＡｌｗａｙ，Ｓ．Ｅ．（２００１）Ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌｒｅｄｕｃｅｓｓｏｌｅｕｓｍｕｓｃｌｅｆａｔｉｇｕｅｄｕｒｉｎｇｄｉｓｕｓｅｉｎａｇｅｄｒａｔｓ．ＭｕｓｃｌｅＮｅｒｖｅ２４，２１１－２２２
３６．Ａｒｅｎｔｓｏｎ－Ｌａｎｔｚ，Ｅ．Ｊ．，Ｆｉｅｂｉｇ，Ｋ．Ｎ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ－Ｃａｔａｎｉａ，Ｋ．Ｊ．，Ｄｅｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｗａｃｈｅｒ，Ａ．，Ｆｒｙ，Ｃ．Ｓ．，Ｌａｍｏｎ，Ｓ．，ａｎｄＰａｄｄｏｎ－Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．（２０２０）Ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｇｄｉｓｕｓｅａｔｒｏｐｈｙｉｎｏｌｄｅｒａｄｕｌｔｓｗｉｔｈｌｏｗ－ｖｏｌｕｍｅｌｅｕｃｉｎｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ．ＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ（１９８５）１２８，９６７－９７７
３７．Ｍｏｒｅｙ－Ｈｏｌｔｏｎ，Ｅ．Ｒ．，ａｎｄＧｌｏｂｕｓ，Ｒ．Ｋ．（２００２）Ｈｉｎｄｌｉｍｂｕｎｌｏａｄｉｎｇｒｏｄｅｎｔｍｏｄｅｌ：ｔｅｃｈｎｉｃａｌａｓｐｅｃｔｓ．ＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ（１９８５）９２，１３６７－１３７７．
３８．Ｄｕｍｏｎｔ，Ｎ．Ａ．，ａｎｄＦｒｅｎｅｔｔｅ，Ｊ．（２０１３）Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ－ｉｎｄｕｃｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｐｒｏｍｏｔｅｓｒｅｇｒｏｗｔｈｉｎａｔｒｏｐｈｉｅｄｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｓａｎｄＣ２Ｃ１２ｍｙｏｔｕｂｅｓ．ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆｐａｔｈｏｌｏｇｙ１８２，５０５－５１５
３９．Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｒ．，ａｎｄＢａｒｔｏｎ，Ｅ．Ｒ．（２０１４）ＳＭＡＳＨ－ｓｅｍｉ－ａｕｔｏｍａｔｉｃｍｕｓｃｌｅａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：ａＭＡＴＬＡＢａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ４，２１
４０．Ｋｒａｅｍｅｒ，Ｗ．Ｊ．，ａｎｄＳｐｉｅｒｉｎｇ，Ｂ．Ａ．（２００６）Ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙａｎｄｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｅｘｅｒｃｉｓｅ．ＨｏｒｍＲｅｓ６６，２－１６
４１．Ｂｅｌｌ，Ｋ．Ｅ．，ｖｏｎＡｌｌｍｅｎ，Ｍ．Ｔ．，Ｄｅｖｒｉｅｓ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄＰｈｉｌｌｉｐｓ，Ｓ．Ｍ．（２０１６）ＭｕｓｃｌｅＤｉｓｕｓｅａｓａＰｉｖｏｔａｌＰｒｏｂｌｅｍｉｎＳａｒｃｏｐｅｎｉａ－ＲｅｌａｔｅｄＭｕｓｃｌｅＬｏｓｓａｎｄＤｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＪＦｒａｌｉｔｙＡｇｉｎｇ５，３３－４１
４２．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂ．Ｆ．，Ｂａｅｈｒ，Ｌ．Ｍ．，Ｍｕｓｃｉ，Ｒ．Ｖ．，Ｒｅｉｄ，Ｊ．Ｊ．，Ｐｅｅｌｏｒ，Ｆ．Ｆ．，３ｒｄ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｋ．Ｌ．，ａｎｄＢｏｄｉｎｅ，Ｓ．Ｃ．（２０１９）Ｍｕｓｃｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｈａｎｇｅｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｗｉｔｈａｇｉｎｇａｎｄｒｅｌｏａｄｉｎｇａｆｔｅｒｄｉｓｕｓｅａｔｒｏｐｈｙ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃａｃｈｅｘｉａ，ｓａｒｃｏｐｅｎｉａａｎｄｍｕｓｃｌｅ１０，１１９５－１２０９
４３．Ｂａｅｈｒ，Ｌ．Ｍ．，Ｗｅｓｔ，Ｄ．Ｗ．，Ｍａｒｃｏｔｔｅ，Ｇ．，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ａ．Ｇ．，ＤｅＳｏｕｓａ，Ｌ．Ｇ．，Ｂａａｒ，Ｋ．，ａｎｄＢｏｄｉｎｅ，Ｓ．Ｃ．（２０１６）Ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｄｅｆｉｃｉｔｓｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｒｅｃｏｖｅｒｙｆｏｌｌｏｗｉｎｇｄｉｓｕｓｅａｒｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒｊｕｎｃｔｉｏｎｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄＥＲｓｔｒｅｓｓ，ｎｏｔｉｍｐａｉｒｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ａｇｉｎｇ（ＡｌｂａｎｙＮＹ）８，１２７－１４６
４４．Ｃｈｏｉ，Ｓ．Ｊ．，Ｈａｒｉｉ，Ｋ．，Ａｓａｔｏ，Ｈ．，ａｎｄＵｅｄａ，Ｋ．（１９９６）Ａｇｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｒｅｃｏｖｅｒｙａｆｔｅｒｒｅｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ．ＳｃａｎｄＪＰｌａｓｔＲｅｃｏｎｓｔｒＳｕｒｇＨａｎｄＳｕｒｇ３０，８９－９８
４５．Ｈｖｉｄ，Ｌ．Ｇ．，Ｓｕｅｔｔａ，Ｃ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｆｒａｎｄｓｅｎ，Ｕ．，Ｏｒｔｅｎｂｌａｄ，Ｎ．，Ｋｊａｅｒ，Ｍ．，ａｎｄＡａｇａａｒｄ，Ｐ．（２０１４）Ａｇｉｎｇｉｍｐａｉｒｓｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｙｉｎｍｅｃｈａｎｉｃａｌｍｕｓｃｌｅｆｕｎｃｔｉｏｎｆｏｌｌｏｗｉｎｇ４ｄａｙｓｏｆｄｉｓｕｓｅ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ５２，１－８
４６．Ｂａｒｂｅ，Ｃ．，Ｋａｌｉｓｔａ，Ｓ．，Ｌｏｕｍａｙｅ，Ａ．，Ｒｉｔｖｏｓ，Ｏ．，Ｌａｕｓｅ，Ｐ．，Ｆｅｒｒａｃｉｎ，Ｂ．，ａｎｄＴｈｉｓｓｅｎ，Ｊ．Ｐ．（２０１５）ＲｏｌｅｏｆＩＧＦ－Ｉｉｎｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ３０９，Ｅ５５７－５６７
４７．Ｚｈｕ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｌｕ，Ａ．，Ｇｈａｒａｉｂｅｈ，Ｂ．，Ｍａ，Ｊ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ｑｕｉｎｔｅｒｏ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄＨｕａｒｄ，Ｊ（２０１１）Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎｉｍｐｒｏｖｅｓｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｈｅａｌｉｎｇａｆｔｅｒｉｎｊｕｒｙａｎｄｄｉｓｅａｓｅｔｈｒｏｕｇｈａｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｍｕｓｃｌｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄｆｉｂｒｏｓｉｓ．ＡｍＪＰａｔｈｏｌ１７９，９１５－９３０
４８．Ｊｅｎｎｉｓｃｈｅ，Ｅ．，ａｎｄＨａｌｌ，Ｃ．Ｍ．（２０００）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎｏｆＩＧＦ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｍＲＮＡｓｉｎｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇｒａｔｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ．ＡＰＭＩＳ１０８，７４７－７５５
４９．Ｓｃｈｅｒｔｚｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｇｅｈｒｉｇ，Ｓ．Ｍ．，Ｒｙａｌｌ，Ｊ．Ｇ．，ａｎｄＬｙｎｃｈ，Ｇ．Ｓ．（２００７）Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）－ＩａｎｄＩＧＦ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｅｎｈａｎｃｅｓｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓｔｈｅｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃｐａｔｈｏｌｏｇｙｉｎｍｄｘｍｉｃｅ．ＡｍＪＰａｔｈｏｌ１７１，１１８０－１１８８
５０．Ｓｗｉｄｅｒｓｋｉ，Ｋ．，Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｋ．Ｊ．，Ｃｈｅｅ，Ａ．，Ｔｒｉｅｕ，Ｊ．，Ｎａｉｍ，Ｔ．，Ｇｅｈｒｉｇ，Ｓ．Ｍ．，Ｂａｕｍ，Ｄ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｍｏｅｈｌ，Ｊ．，Ｃｈａｕ，Ｌ．，Ｋｏｏｐｍａｎ，Ｒ．，Ｇｒｅｇｏｒｅｖｉｃ，Ｐ．，Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｆ．，Ｈｏｅｆｌｉｃｈ，Ａ．，ａｎｄＬｙｎｃｈ，Ｇ．Ｓ．（２０１６）Ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＧＦＢＰ－２ｐｒｏｍｏｔｅｓａｓｌｏｗｅｒｍｕｓｃｌｅｐｈｅｎｏｔｙｐｅｉｎｈｅａｌｔｈｙｂｕｔｎｏｔｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃｍｄｘｍｉｃｅａｎｄｄｏｅｓｎｏｔａｆｆｅｃｔｔｈｅｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃｐａｔｈｏｌｏｇｙ．ＧｒｏｗｔｈＨｏｒｍＩＧＦＲｅｓ３０－３１，１－１０
５１．Ｃａｌａｂｒｅｓｉ，Ｃ．，Ａｒｏｓｉｏ，Ｂ．，Ｇａｌｉｍｂｅｒｔｉ，Ｌ．，Ｓｃａｎｚｉａｎｉ，Ｅ．，Ｂｅｒｇｏｔｔｉｎｉ，Ｒ．，Ａｎｎｏｎｉ，Ｇ．，ａｎｄＶｅｒｇａｎｉ，Ｃ．（２００７）Ｎａｔｕｒａｌａｇｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｆｉｂｒｏｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓａｎｄｃｏｌｌａｇｅｎｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｒａｔｌｕｎｇ．ＥｘｐＧｅｒｏｎｔｏｌ４２，１００３－１０１１
５２．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｃ．Ｊ．，ＲｏｄｒｉｇｕｅｓＪｕｎｉｏｒ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄＢｏｈｍ，Ｇ．Ｍ．（１９９６）Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｇｉｎｇｏｎｍｕｓｃｌｅｆｉｂｅｒｓａｎｄｃｏｌｌａｇｅｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｈｅｄｉａｐｈｒａｇｍ：ａｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｗｉｔｈｔｈｅｒｅｃｔｕｓａｂｄｏｍｉｎｉｓｍｕｓｃｌｅ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ４２，２１８－２２８
５３．Ｔｉｄｂａｌｌ，Ｊ．Ｇ．，Ｆｌｏｒｅｓ，Ｉ．，Ｗｅｌｃ，Ｓ．Ｓ．，Ｗｅｈｌｉｎｇ－Ｈｅｎｒｉｃｋｓ，Ｍ．，ａｎｄＯｃｈｉ，Ｅ．（２０２０）Ａｇｉｎｇｏｆｔｈｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍａｎｄｉｍｐａｉｒｅｄｍｕｓｃｌｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：Ａｆａｉｌｕｒｅｏｆｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆａｄｕｌｔｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ１４５，１１１２００
５４．Ｃａｎｔｉｎｉ，Ｍ．，Ｍａｓｓｉｍｉｎｏ，Ｍ．Ｌ．，Ｂｒｕｓｏｎ，Ａ．，Ｃａｔａｎｉ，Ｃ．，ＤａｌｌａＬｉｂｅｒａ，Ｌ．，ａｎｄＣａｒｒａｒｏ，Ｕ．（１９９４）Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｒｅｇｕｌａｔｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌｓ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ２０２，１６８８－１６９６
５５．Ｄｏｒｔ，Ｊ．，Ｆａｂｒｅ，Ｐ．，Ｍｏｌｉｎａ，Ｔ．，ａｎｄＤｕｍｏｎｔ，Ｎ．Ａ．（２０１９）ＭａｃｒｏｐｈａｇｅｓＡｒｅＫｅｙＲｅｇｕｌａｔｏｒｓｏｆＳｔｅｍＣｅｌｌｓｄｕｒｉｎｇＳｋｅｌｅｔａｌＭｕｓｃｌｅＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄＤｉｓｅａｓｅｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＩｎｔ２０１９，４７６１４２７
５６．Ｗｙｎｎ，Ｔ．Ａ．，ａｎｄＶａｎｎｅｌｌａ，Ｋ．Ｍ．（２０１６）ＭａｃｒｏｐｈａｇｅｓｉｎＴｉｓｓｕｅＲｅｐａｉｒ，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄＦｉｂｒｏｓｉｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ４４，４５０－４６２
５７．Ｔｏｎｋｉｎ，Ｊ．，Ｔｅｍｍｅｒｍａｎ，Ｌ．，Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｄ．，Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｃｏｌｏｎ，Ｅ．，Ｂａｒｂｅｒｉ，Ｌ．，Ｂｉｌｂａｏ，Ｄ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｍ．Ｄ．，Ｍｕｓａｒｏ，Ａ．，ａｎｄＲｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｎ．（２０１５）Ｍｏｎｏｃｙｔｅ／Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｄｅｒｉｖｅｄＩＧＦ－１ＯｒｃｈｅｓｔｒａｔｅｓＭｕｒｉｎｅＳｋｅｌｅｔａｌＭｕｓｃｌｅＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄＭｏｄｕｌａｔｅｓＡｕｔｏｃｒｉｎｅＰｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．ＭｏｌＴｈｅｒ２３，１１８９－１２００
５８．Ｃｕｉ，Ｃ．Ｙ．，Ｄｒｉｓｃｏｌｌ，Ｒ．Ｋ．，Ｐｉａｏ，Ｙ．，Ｃｈｉａ，Ｃ．Ｗ．，Ｇｏｒｏｓｐｅ，Ｍ．，ａｎｄＦｅｒｒｕｃｃｉ，Ｌ．（２０１９）Ｓｋｅｗｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎｉｎａｇｉｎｇｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ．ＡｇｉｎｇＣｅｌｌ１８，ｅ１３０３２
５９．Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｌ．，Ｇａｌｌｏ，Ｃ．Ｃ．，Ｈｏｎｄａ，Ｔ．Ｓ．Ｂ．，Ａｌｖｅｓ，Ｐ．Ｔ．，Ｓｔｉｌｈａｎｏ，Ｒ．Ｓ．，Ｒｏｓａ，Ｄ．Ｓ．，Ｋｏｈ，Ｔ．Ｊ．，ａｎｄＨａｎ，Ｓ．Ｗ．（２０２０）ＳｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｈｅａｌｉｎｇｂｙＭ１－ｌｉｋｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓＧＭ－ＣＳＦ．ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｓＴｈｅｒ１１，４７３
６０．Ｎｏｖａｋ，Ｍ．Ｌ．，Ｗｅｉｎｈｅｉｍｅｒ－Ｈａｕｓ，Ｅ．Ｍ．，ａｎｄＫｏｈ，Ｔ．Ｊ．（２０１４）Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｈｅａｌｉｎｇｆｏｌｌｏｗｉｎｇｔｒａｕｍａｔｉｃｉｎｊｕｒｙ．ＪＰａｔｈｏｌ２３２，３４４－３５５
６１．Ｈａｍｍｅｒｓ，Ｄ．Ｗ．，Ｒｙｂａｌｋｏ，Ｖ．，Ｍｅｒｓｃｈａｍ－Ｂａｎｄａ，Ｍ．，Ｈｓｉｅｈ，Ｐ．Ｌ．，Ｓｕｇｇｓ，Ｌ．Ｊ．，ａｎｄＦａｒｒａｒ，Ｒ．Ｐ．（２０１５）Ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｉｍｐｒｏｖｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｒｅｃｏｖｅｒｙｆｒｏｍｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．ＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ（１９８５），ｊａｐ００３１３０２０１４
６２．ＭｃＫｅｎｎａ，Ｃ．Ｆ．，ａｎｄＦｒｙ，Ｃ．Ｓ．（２０１７）Ａｌｔｅｒｅｄｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌｄｙｎａｍｉｃｓａｃｃｏｍｐａｎｙｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅａｔｒｏｐｈｙｄｕｒｉｎｇｃｈｒｏｎｉｃｉｌｌｎｅｓｓ，ｄｉｓｕｓｅ，ａｎｄａｇｉｎｇ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｌｉｎＮｕｔｒＭｅｔａｂＣａｒｅ２０，４４７－４５２
６３．Ｓｎｉｊｄｅｒｓ，Ｔ．，Ｖｅｒｄｉｊｋ，Ｌ．Ｂ．，ａｎｄｖａｎＬｏｏｎ，Ｌ．Ｊ．（２００９）Ｔｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｓａｒｃｏｐｅｎｉａａｎｄｅｘｅｒｃｉｓｅｔｒａｉｎｉｎｇｏｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌｓ．Ａｇｅｉｎｇｒｅｓｅａｒｃｈｒｅｖｉｅｗｓ８，３２８－３３８
６４．Ｋｅｅｆｅ，Ａ．Ｃ．，Ｌａｗｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｆｌｙｇａｒｅ，Ｓ．Ｄ．，Ｆｏｘ，Ｚ．Ｄ．，Ｃｏｌａｓａｎｔｏ，Ｍ．Ｐ．，Ｍａｔｈｅｗ，Ｓ．Ｊ．，Ｙａｎｄｅｌｌ，Ｍ．，ａｎｄＫａｒｄｏｎ，Ｇ．（２０１５）Ｍｕｓｃｌｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏｍｙｏｆｉｂｒｅｓｉｎｓｅｄｅｎｔａｒｙａｄｕｌｔｍｉｃｅ．ＮａｔＣｏｍｍｕｎ６，７０８７
６５．Ｂｏｎｅｎ，Ａ．，Ｔａｎ，Ｍ．Ｈ．，ａｎｄＷａｔｓｏｎ－Ｗｒｉｇｈｔ，Ｗ．Ｍ．（１９８１）Ｉｎｓｕｌｉｎｂｉｎｄｉｎｇａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｕｐｔａｋｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｒｏｄｅｎｔｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ３０，７０２－７０４
６６．Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ，Ｅ．Ｊ．，Ｂｏｕｒｅｙ，Ｒ．Ｅ．，Ｒｏｄｎｉｃｋ，ＫＪ．，Ｋｏｒａｎｙｉ，Ｌ．，Ｐｅｒｍｕｔｔ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄＨｏｌｌｏｓｚｙ，Ｊ．Ｏ．（１９９０）Ｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｃａｐａｃｉｔｙｉｎｒａｔｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｓ．ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌ２５９，Ｅ５９３－５９８
６７．Ｓｏｎｇ，Ｘ．Ｍ．，Ｒｙｄｅｒ，Ｊ．Ｗ．，Ｋａｗａｎｏ，Ｙ．，Ｃｈｉｂａｌｉｎ，Ａ．Ｖ．，Ｋｒｏｏｋ，Ａ．，ａｎｄＺｉｅｒａｔｈ，Ｊ．Ｒ．（１９９９）Ｍｕｓｃｌｅｆｉｂｅｒｔｙｐｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｉｎｉｎｓｕｌｉｎｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌ２７７，Ｒ１６９０－１６９６
６８．Ｒｅｉｄｙ，Ｐ．Ｔ．，ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ａ．Ｉ．，Ｍａｈｍａｓｓａｎｉ，Ｚ．Ｓ．，Ｐｅｔｒｏｃｅｌｌｉ，Ｊ．Ｊ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｃ．Ｃ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｏｒｒｏｗ，Ｖ．Ｒ．，Ｋｅｅｆｅ，Ａ．Ｃ．，Ｈｕｆｆａｋｅｒ，Ｔ．Ｂ．，Ｓｔｏｄｄａｒｄ，Ｇ．Ｊ．，Ｋａｒｄｏｎ，Ｇ．，Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄＤｒｕｍｍｏｎｄ，Ｍ．Ｊ（２０１９）Ａｇｉｎｇｉｍｐａｉｒｓｍｏｕｓｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｍｕｓｃｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｂｕｎｄａｎｃｅｄｕｒｉｎｇｒｅｃｏｖｅｒｙｆｒｏｍｄｉｓｕｓｅ．Ａｍｅｒｉｃａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ

【図1】