特表 2024-505924 核酸送達

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-08

(54)【発明の名称】核酸送達

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20240201BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20240201BHJP

   A61K 47/44 20170101ALI20240201BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20240201BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240201BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240201BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20240201BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240201BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240201BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240201BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240201BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20240201BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20240201BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20240201BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240201BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20240201BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240201BHJP

   C12N 15/87 20060101ALI20240201BHJP

   C07K 7/00 20060101ALI20240201BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240201BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61K47/42

A61K47/44

A61K31/711

A61K31/7105

A61K31/713

A61K39/00 H

A61P35/00

A61P35/02

A61P37/06

A61P21/00

A61P21/04

A61P9/10

A61K47/24

A61K9/08

A61K47/12

C12N15/11 Z

C12N15/87 Z

C07K7/00

C12N15/09 200

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2023546009

(86)(22)【出願日】2022-01-28

(85)【翻訳文提出日】2023-09-21

(86)【国際出願番号】 EP2022052145

(87)【国際公開番号】W WO2022162200

(87)【国際公開日】2022-08-04

(31)【優先権主張番号】2101301.6

(32)【優先日】2021-01-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】2103551.4

(32)【優先日】2021-03-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523285546

【氏名又は名称】ヌンティウス セラピューティクス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100083806

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 秀和

(74)【代理人】

【識別番号】100111235

【弁理士】

【氏名又は名称】原 裕子

(74)【代理人】

【識別番号】100195257

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕 一志

(72)【発明者】

【氏名】クウォク、 アルバート

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

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4H045EA31

4H045FA10

(57)【要約】

本発明は、核酸などの治療用分子を哺乳動物細胞、並びにヒト及び動物の身体に送達することができる脂質／デンドリマー系を提供する。例えば、本発明は、リンパ系器官、骨格筋、脳、及び脂肪組織、並びに腫瘍組織、肝臓、及び肺への核酸の有効な送達を可能にする系を提供する。ＤＮＡ及びＲＮＡの送達が、提供される。特に、本発明の系は、ｍＲＮＡを送達することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

医薬における使用のための、ペプチドデンドリマーと、核酸と、脂質と、を含む、組成物であって、
前記ペプチドデンドリマーが、少なくとも、コアペプチド配列と、第１の分岐残基と、２つの第１のペプチドモチーフと、を含み、前記分岐残基が、リジン、２，４－ジアミノ酪酸、オルニチン、又はジアミノプロピオン酸であり、
前記核酸が、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、又は少なくとも５０ヌクレオチドの核酸を含む、組成物。

【請求項2】

前記核酸が、ＲＮＡである、請求項１に記載の使用のための組成物。

【請求項3】

前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、及び／又は自己増幅ＲＮＡから選択される、請求項２に記載の使用のための組成物。

【請求項4】

前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、請求項３に記載の使用のための組成物。

【請求項5】

前記核酸が、ＤＮＡである、請求項１に記載の使用のための組成物。

【請求項6】

前記ＤＮＡが、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、プラスミド、及び／又はｃＤＮＡを含む、請求項５に記載の使用のための組成物。

【請求項7】

前記組成物が、ＲＮＡ核酸及びＤＮＡ核酸を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項8】

前記ＲＮＡ核酸及びＤＮＡ核酸が、単一核酸分子の一部である、請求項７に記載の使用のための組成物。

【請求項9】

前記核酸が、修飾核酸を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項10】

前記核酸が、導入遺伝子をコードし、標的細胞において前記導入遺伝子を発現することができる、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項11】

前記使用が、内因性遺伝子の発現又は活性を調節することによる対象における疾患の治療を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項12】

前記調節が、前記遺伝子の前記発現及び／又は前記遺伝子の更なるコピーの外因性発現の増加である、請求項１１に記載の使用のための組成物。

【請求項13】

前記調節が、前記遺伝子の前記発現の減少である、請求項１１に記載の使用のための組成物。

【請求項14】

前記内因性遺伝子が、タンパク質又はペプチドに翻訳される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項15】

前記タンパク質又はペプチドが、抗原、ホルモン、受容体、キメラ抗原受容体、転写因子、並びに／又はサイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及び／若しくはインターフェロンを含む、請求項１４に記載の使用のための組成物。

【請求項16】

前記導入遺伝子が、腫瘍抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、又は哺乳動物に寄生する微生物のタンパク質を含む、請求項１０に記載の使用のための組成物。

【請求項17】

前記組成物が、ワクチンである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項18】

前記核酸が、自己増幅ＲＮＡを含むか又はコードする、請求項１７に記載の使用のための組成物。

【請求項19】

前記使用が、前記対象における遺伝性障害の治療を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項20】

前記核酸が、前記対象において非機能的であるか、下方制御されているか、不活性であるか、又は損なわれている遺伝子の機能的バージョンを発現する、請求項１９に記載の使用のための組成物。

【請求項21】

前記核酸が、ゲノムを編集するための系又は遺伝子発現を変化させるための系の１つ以上の成分をコードする、かつ／又は含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項22】

前記ゲノムを編集するための系又は遺伝子発現を変化させるための系が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系である、請求項２１に記載の使用のための組成物。

【請求項23】

前記核酸が、Ｃａｓタンパク質若しくはペプチドをコードし、かつ／又はｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、及び／若しくはｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項２１又は２２に記載の使用のための組成物。

【請求項24】

前記核酸が、Ｃａｓタンパク質又はペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びｓｇＲＮＡを含むＲＮＡ配列を含む、請求項２３に記載の使用のための組成物。

【請求項25】

前記Ｃａｓタンパク質又はペプチドをコードするｍＲＮＡ、及び前記ｓｇＲＮＡを含むＲＮＡ配列が、別個の分子である、請求項２４に記載の使用のための組成物。

【請求項26】

前記ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＣａｓタンパク質をコードする核酸のうちの１つ以上が、存在する場合、単一核酸の一部である、請求項２３又は２４に記載の使用のための組成物。

【請求項27】

前記ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＣａｓタンパク質をコードする核酸のうちの１つ以上が、存在する場合、２つ以上の核酸上に存在する、請求項２３又は２４に記載の使用のための組成物。

【請求項28】

前記組成物が、脾臓、リンパ組織、肺、骨、胸腺、肝臓、腫瘍組織、心臓組織、骨格筋、腎臓、脂肪組織、及び／又は脳を標的とする、請求項１～２７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項29】

前記組成物が、脾臓、リンパ組織、肺、及び／又は骨を標的とする、請求項２８に記載の使用のための組成物。

【請求項30】

前記核酸が、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡである、請求項２９に記載の使用のための組成物。

【請求項31】

前記使用が、前記核酸が、白血球、例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、単球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、若しくは単球；リンパ節組織細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、筋細胞、骨格筋細胞、内皮細胞、肝細胞、星細胞、ニューロン、アストロサイト、脾細胞、肺細胞、心筋細胞、腎細胞、脂肪細胞、幹細胞、及び／又は腫瘍細胞である細胞に送達されるように、前記組成物を対象に投与することを含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項32】

前記使用が、前記核酸が免疫細胞に送達されるように、前記組成物を対象に投与することを含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項33】

前記核酸が、前記細胞において免疫分子又は転写因子を発現する、請求項３１又は３２に記載の使用のための組成物。

【請求項34】

前記免疫分子が、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体、サイトカイン、デコイ受容体、抗体、共刺激受容体、共刺激リガンド、チェックポイント阻害剤、免疫コンジュゲート、又は腫瘍抗原である、請求項３３に記載の使用のための組成物。

【請求項35】

前記細胞が、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、単球、骨髄由来サプレッサ細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ、又は腫瘍関連好中球である、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項36】

前記核酸が、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡである、請求項３５に記載の使用のための組成物。

【請求項37】

前記組成物が、前記対象におけるがんを治療する方法における使用のためのものである、請求項１～３６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項38】

前記がんが、血液がん、例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫、骨髄異形成症候群；又は肺がん、噴門がん、肉腫、若しくは肝臓がんである、請求項３７に記載の使用のための組成物。

【請求項39】

前記方法が、抗がん剤の投与を含む、請求項３７又は３８に記載の使用のための組成物。

【請求項40】

前記組成物が、前記対象における肺疾患又は自己免疫疾患を治療する方法における使用のためのものである、請求項１～３９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項41】

前記方法が、前記対象におけるポンペ病、筋肉消耗性疾患、ミオパチー、又は筋ジストロフィー、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療である、請求項１９～２８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項42】

前記核酸が、ＤＮＡである、請求項４１に記載の使用のための組成物。

【請求項43】

前記方法が、前記対象における糖尿病性四肢虚血などの四肢虚血のための治療であり、前記導入遺伝子が、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び／又は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）である、請求項１～３１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項44】

前記２つの第１のペプチドモチーフが、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる、請求項１～４３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項45】

前記ペプチドデンドリマーが、２つの第２の分岐残基（例えば、リジン）及び４つの第２のペプチドモチーフを更に含み、
前記第２の分岐残基のうちの一方が、前記第１のペプチドモチーフのうちの一方と共有結合し、他方の前記第２の分岐残基が、他方の前記第１のペプチドモチーフと共有結合し、各第２の分岐残基が、２つの第２のペプチドモチーフと共有結合する、請求項１～４４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項46】

前記４つの第２のペプチドモチーフが、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる、請求項４５に記載の使用のための組成物。

【請求項47】

前記ペプチドデンドリマーが、４つの第３の分岐残基（例えば、リジン）及び８つの第３のペプチドモチーフを更に含み、
各第２のペプチドモチーフが、各第３の分岐残基が１つの第２のペプチドモチーフと共有結合するように、前記第３の分岐残基のうちの１つとそれぞれ共有結合し、各第３の分岐残基が、２つの第３のペプチドモチーフと共有結合する、請求項４５又は４６に記載の使用のための組成物。

【請求項48】

前記８つの第３のペプチドモチーフが、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる、請求項４７に記載の使用のための組成物。

【請求項49】

前記第１、第２、及び／又は第３のペプチドモチーフが、塩基性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項４４～４８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項50】

前記第１、第２、及び／又は第３のペプチドモチーフが、非極性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項４４～４９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項51】

前記第１、第２、及び／又は第３のペプチドモチーフが、酸性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項４４～５０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項52】

前記第１、第２、及び／又は第３のペプチドモチーフが、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項４４～５１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項53】

前記第１、第２、及び／又は第３のペプチドモチーフが、ロイシン（Ｌ）及び／又はアルギニン（Ｒ）残基を含む、請求項４４～５２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項54】

前記コア配列が、少なくとも２つのアミノ酸を含む、請求項４４～５３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項55】

前記コア配列が、３０個までのアミノ酸を含む、請求項４４～５４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項56】

前記コア配列が、ヒスチジンなどのイオン化可能なアミノ酸を含む、請求項４４～５４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項57】

前記ペプチドデンドリマーが、表２に示される構造を含む、請求項１～５６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項58】

前記ペプチドデンドリマーが、組織及び／又は細胞標的化モチーフを更に含む、請求項１～５７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項59】

前記組織又は細胞標的化モチーフが、筋標的化モチーフ、例えば、ＧＡＡＳＳＬＮＩＡ（配列番号１）、インテグリン標的化モチーフ、例えば、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸、又は化学修飾、例えば、マンノース糖鎖付加を含む化学修飾を含む、請求項５８に記載の使用のための組成物。

【請求項60】

前記ペプチドデンドリマーが、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を更に含む、請求項１～５９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項61】

前記細胞透過性ペプチドが、ペプチド配列ＸＲＸＲＲＢＲＲＸＲＲＢＲＸＢ（配列番号２）（式中、Ｘは６－アミノヘキサン酸であり、Ｂはベータ－アラニンである）を含む、請求項６０に記載の使用のための組成物。

【請求項62】

前記細胞透過性ペプチドが、ＴＡＴ由来配列を含む、請求項６０に記載の使用のための組成物。

【請求項63】

前記ペプチドデンドリマーが、アルキル鎖、アルケニル鎖、抗体若しくはその断片、標的化ペプチド、糖、細胞透過性ペプチド、エンドソームエスケープペプチド、核局在化モチーフ、及び／又は脂肪酸を更に含む、請求項１～６２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項64】

前記アルキル鎖又はアルケニル鎖が、前記コアペプチド配列にコンジュゲートしている、請求項６３に記載の使用のための組成物。

【請求項65】

前記アルキル鎖若しくはアルケニル鎖、抗体若しくはその断片、前記標的化ペプチド、糖、標的化ペプチド、細胞透過性ペプチド、エンドソームエスケープペプチド、核局在化モチーフ、及び／又は脂肪酸が、前記ペプチドデンドリマーのＣ末端にコンジュゲートしている、請求項６３又は６４に記載の使用のための組成物。

【請求項66】

前記アルキル鎖若しくはアルケニル鎖、抗体若しくは前記その断片、標的化ペプチド、糖、標的化ペプチド、細胞透過性ペプチド、エンドソームエスケープペプチド、核局在化モチーフ、及び／又は脂肪酸が、前記ペプチドデンドリマーのＮ末端にコンジュゲートしている、請求項６３～６５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項67】

前記アルキル鎖又はアルケニル鎖が、約５個の炭素～約５０個の炭素、好ましくは約１２個～約３０個の炭素を含む、請求項６３～６６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項68】

前記脂質が、カチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質、及び／又はイオン化可能な脂質を含む、請求項１～６７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項69】

前記脂質が、飽和脂肪酸を含む、請求項１～６８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項70】

前記脂質が、不飽和脂肪酸を含む、請求項１～６９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項71】

前記脂質が、１、２、３、４、５、又は６個の脂肪酸鎖を含む、請求項６９又は７０に記載の使用のための組成物。

【請求項72】

前記脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及び／又はＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を含む、請求項１～７１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項73】

前記脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及びジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）を含む、請求項１～７２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項74】

Ｎ／Ｐ比が、約０．０１：１～１００：１である、請求項１～７３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項75】

前記Ｎ／Ｐ比が、１：１～５０：１である、請求項７４に記載の使用のための組成物。

【請求項76】

対象への投与後に、肝臓よりも脾臓及び／又はリンパ節において、より高い割合の前記組成物が観察される、請求項７５に記載の使用のための組成物。

【請求項77】

前記Ｎ／Ｐ比が、０．０１：１～１：１である、請求項７５に記載の使用のための組成物。

【請求項78】

対象への投与後に、肝臓よりも肺、脾臓、及び／又はリンパ節において、より高い割合の前記組成物が観察される、請求項７７に記載の使用のための組成物。

【請求項79】

前記ペプチドデンドリマー、核酸、及び脂質が、正に荷電した粒子を形成する、請求項１～７８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項80】

前記ペプチドデンドリマー、核酸、及び脂質が、負に荷電した粒子又は中性電荷を有する粒子を形成する、請求項１～７９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項81】

標的組織又は細胞への前記核酸の送達が、脂質ベースの核酸送達系を使用した同じ組織又は細胞型への同じ核酸の送達と比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、１００％増加する、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項82】

前記標的組織が、脾臓、リンパ節、肺、肝臓、又は骨である、請求項８１に記載の使用のための組成物。

【請求項83】

前記脂質ベースの核酸送達系が、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥである、請求項８１又は８２に記載の使用のための組成物。

【請求項84】

前記投与が、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮下、皮内、又は腹腔内である、請求項１～８３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項85】

前記組成物が、液体内に含まれる、請求項１～８４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項86】

ペプチドデンドリマーと、核酸と、脂質と、を含む組成物であって、前記ペプチドデンドリマーが、少なくとも、コアペプチド配列と、第１の分岐残基と、２つの第１のペプチドモチーフと、を含み、前記分岐残基が、リジン、２，４－ジアミノ酪酸、オルニチン、又はジアミノプロピオン酸であり、
前記核酸が、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、又は少なくとも５０ヌクレオチドの一本鎖核酸を含む、組成物。

【請求項87】

前記一本鎖核酸が、ＲＮＡである、請求項８６に記載の組成物。

【請求項88】

前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及び／又は自己増幅ＲＮＡから選択される、請求項８７に記載の組成物。

【請求項89】

前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、請求項８８に記載の組成物。

【請求項90】

前記組成物が、２つ以上のＲＮＡを含む、請求項８６～８９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項91】

前記一本鎖核酸が、ｓｓＤＮＡである、請求項８６に記載の組成物。

【請求項92】

前記組成物が、ＲＮＡ核酸及びＤＮＡ核酸を含む、請求項８６～９１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項93】

前記ＲＮＡ核酸及びＤＮＡ核酸が、単一核酸分子の一部である、請求項９２に記載の組成物。

【請求項94】

前記一本鎖核酸が、修飾核酸を含む、請求項８６～９３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項95】

前記一本鎖核酸が導入遺伝子をコードし、標的細胞において前記導入遺伝子を発現することができる、請求項８６～９４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項96】

前記一本鎖核酸が、内因性遺伝子の発現又は活性を調節することができる、請求項８６～９５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項97】

前記調節が、前記遺伝子の前記発現及び／又は前記遺伝子の更なるコピーの外因性発現の増加である、請求項９６に記載の組成物。

【請求項98】

前記調節が、前記遺伝子の前記発現の減少である、請求項９６に記載の組成物。

【請求項99】

前記内因性遺伝子が、タンパク質又はペプチドに翻訳される、請求項９６～９８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項100】

前記タンパク質又はペプチドが、抗原、ホルモン、受容体、キメラ抗原受容体、転写因子、並びに／又はサイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及び／若しくはインターフェロンを含む、請求項９９に記載の組成物。

【請求項101】

前記導入遺伝子が、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、及び／又は哺乳動物に寄生する微生物のタンパク質を含む、請求項９５に記載の組成物。

【請求項102】

前記組成物が、ワクチンである、請求項８６～１０１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項103】

前記一本鎖核酸が、自己活性化ＲＮＡを含むか又はコードする、請求項１０８に記載の組成物。

【請求項104】

使用が、対象における遺伝性障害の治療を含む、請求項８６～１００のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項105】

前記核酸が、前記対象において非機能的であるか、下方制御されているか、不活性であるか、又は損なわれている遺伝子の機能的バージョンを発現する、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項106】

前記一本鎖核酸が、ゲノムを編集するための系又は遺伝子発現を変化させるための系の１つ以上の成分をコードする、かつ／又は含む、請求項８６～１０５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項107】

前記ゲノムを編集するための系又は遺伝子発現を変化させるための系が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系である、請求項１０６に記載の組成物。

【請求項108】

前記一本鎖核酸が、Ｃａｓタンパク質若しくはペプチドをコードし、かつ／又はｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、及び／若しくはｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１０６又は１０７に記載の組成物。

【請求項109】

前記一本鎖核酸が、Ｃａｓタンパク質又はペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びｓｇＲＮＡを含む、請求項１０８に記載の組成物。

【請求項110】

前記ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＣａｓタンパク質をコードする核酸のうちの１つ以上が、存在する場合、単一核酸の一部である、請求項１０８又は１０９に記載の組成物。

【請求項111】

前記ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＣａｓタンパク質をコードする核酸のうちの１つ以上が、存在する場合、２つ以上の核酸上に存在する、請求項１０８又は１０９に記載の組成物。

【請求項112】

前記組成物が、前記核酸を脾臓、リンパ組織、肺、骨、肝臓、心臓組織、腫瘍組織、骨格筋、腎臓、脂肪組織、及び／又は脳に標的化するのに適している、請求項８６～１１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項113】

前記組成物が、前記核酸を脾臓、リンパ組織、肺、及び／又は骨に標的化するのに適している、請求項１１２に記載の組成物。

【請求項114】

前記核酸が、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡである、請求項１１３に記載の組成物。

【請求項115】

対象におけるがんを治療する方法における使用のための、請求項８６～１１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項116】

前記がんが、血液がん、例えば、白血病、リンパ種若しくは骨髄腫、噴門がん、肉腫、又は肝臓がんである、請求項１１５に記載の使用のための組成物。

【請求項117】

前記方法が、抗がん剤の投与を含む、請求項１１５又は１１６に記載の使用のための組成物。

【請求項118】

対象における肺疾患又は自己免疫疾患を治療する方法における使用のための、請求項８６～１１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項119】

対象におけるポンペ病、筋肉消耗性疾患、ミオパチー、又は筋ジストロフィー、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療における使用のための、請求項８６～１１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項120】

前記核酸が、ＤＮＡである、請求項１１９に記載の使用のための組成物。

【請求項121】

前記組成物が、前記核酸を前記対象における白血球、例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、単球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、若しくは単球；リンパ節組織細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、筋細胞、骨格筋細胞、肝細胞、星細胞、ニューロン、アストロサイト、脾細胞、肺細胞、心筋細胞、腎細胞、脂肪細胞、又は腫瘍細胞に送達する、請求項８６～１２０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項122】

前記使用が、前記核酸が免疫細胞に送達されるように、前記組成物を対象に投与することを含む、請求項８６～１２１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項123】

前記核酸が、前記細胞において免疫分子又は転写因子を発現する、請求項１２１又は１２２に記載の使用のための組成物。

【請求項124】

前記免疫分子が、Ｔ細胞受容体、サイトカイン、デコイ受容体、抗体、共刺激受容体、共刺激リガンド、チェックポイント阻害剤、免疫コンジュゲート、又は腫瘍抗原である、請求項１２３に記載の使用のための組成物。

【請求項125】

前記細胞が、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、単球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、又は単球である、請求項１２１～１２４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項126】

前記核酸が、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡである、請求項１２５に記載の使用のための組成物。

【請求項127】

前記２つの第１のペプチドモチーフが、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる、請求項８６～９７のいずれか一項に記載の組成物又は請求項１１５～１２６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項128】

前記ペプチドデンドリマーが、２つの第２の分岐残基（例えば、リジン）及び４つの第２のペプチドモチーフを更に含み、前記第２の分岐残基のうちの一方が、前記第１のペプチドモチーフのうちの一方と共有結合し、他方の前記第２の分岐残基が、他方の前記第１のペプチドモチーフと共有結合し、各第２の分岐残基が、２つの第２のペプチドモチーフと共有結合する、請求項１２７に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項129】

前記４つの第２のペプチドモチーフが、独立して、モノペプチド、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる、請求項１２８に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項130】

前記ペプチドデンドリマーが、４つの第３の分岐残基（例えば、リジン）及び８つの第３のペプチドモチーフを更に含み、
各第２のペプチドモチーフが、各第３の分岐残基が１つの第２のペプチドモチーフと共有結合するように、前記第３の分岐残基のうちの１つとそれぞれ共有結合し、各第３の分岐残基が、２つの第３のペプチドモチーフと共有結合する、請求項１２７又は１２８に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項131】

前記８つの第３のペプチドモチーフが、独立して、モノペプチド、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる、請求項１３０に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項132】

前記第１、第２、及び／又は第３のペプチドモチーフが、塩基性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項１２７～１３１のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項133】

前記第１、第２、及び／又は第３のペプチドモチーフが、非極性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項１２７～１３２のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項134】

前記第１、第２、及び／又は第３のペプチドモチーフが、酸性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項１２７～１３３のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項135】

前記第１、第２、及び／又は第３のペプチドモチーフが、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項１２７～１３４のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項136】

前記第１、第２、及び／又は第３のペプチドモチーフが、ロイシン（Ｌ）及び／又はアルギニン（Ｒ）残基を含む、請求項１２７～１３５のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項137】

前記ペプチドデンドリマーが、表２に示される構造を含む、請求項８６～１３６のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項138】

前記ペプチドデンドリマーが、組織及び／又は細胞標的化モチーフを含む、請求項８６～１３７のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項139】

前記組織標的化モチーフが、筋標的化モチーフ、例えば、ＧＡＡＳＳＬＮＩＡ（配列番号１）、インテグリン標的化モチーフ、例えば、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸、又は化学修飾、例えば、マンノース糖鎖付加を含む化学修飾を含む、請求項１３８に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項140】

前記ペプチドデンドリマーが、細胞透過性ペプチドを含む、請求項８６～１３９のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項141】

前記細胞透過性ペプチドが、ＴＡＴ由来配列を含む、請求項１４０に記載の使用のための組成物。

【請求項142】

前記細胞透過性ペプチドが、ペプチド配列ＸＲＸＲＲＢＲＲＸＲＲＢＲＸＢ（配列番号２）（式中、Ｘは６－アミノヘキサン酸であり、Ｂはベータ－アラニンである）を含む、請求項１４０に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項143】

前記ペプチドデンドリマーが、アルキル鎖、アルケニル鎖、抗体若しくはその断片、糖、及び／又は脂肪酸を含む、請求項８６～１４２のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項144】

前記アルキル鎖又はアルケニル鎖が、前記コアペプチド配列にコンジュゲートしている、請求項１４３に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項145】

前記アルキル鎖又はアルケニル鎖が、前記ペプチドデンドリマーのＣ末端にコンジュゲートしている、請求項１４４に記載の使用のための組成物。

【請求項146】

前記アルキル鎖又はアルケニル鎖が、前記ペプチドデンドリマーのＮ末端にコンジュゲートしている、請求項１４４に記載の使用のための組成物。

【請求項147】

前記アルキル鎖又はアルケニル鎖が、約５個の炭素～約５０個の炭素、好ましくは約１２個～約３０個の炭素を含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項148】

前記ペプチドデンドリマーが、前記ペプチドデンドリマーのＣ末端にコンジュゲートされた脂肪酸を含む、請求項１４３に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項149】

前記ペプチドデンドリマーが、前記ペプチドデンドリマーのＮ末端にコンジュゲートされた脂肪酸を含む、請求項１４３に記載の使用のための組成物。

【請求項150】

前記脂質が、カチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質、及び／又はイオン化可能な脂質を含む、請求項８６～１４９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項151】

前記脂質が、飽和脂肪酸を含む、請求項８６～１５０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項152】

前記脂質が、不飽和脂肪酸を含む、請求項８６～１５１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項153】

前記脂質が、１、２、３、４、５、又は６個の脂肪酸鎖を含む、請求項１５１又は１５２に記載の使用のための組成物。

【請求項154】

前記脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及び／又はＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を含む、請求項８６～１５３のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項155】

前記脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及びジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）を含む、請求項８６～１５４のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項156】

Ｎ／Ｐ比が、約０．０１：１～１００：１である、請求項８６～１５５のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項157】

前記Ｎ／Ｐ比が、１：１～５０：１である、請求項１５６に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項158】

対象への投与後に、肝臓よりも脾臓及び／又はリンパ節において、より高い割合の前記組成物が観察される、請求項１５７に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項159】

前記Ｎ／Ｐ比が、０．０１：１～１：１である、請求項１５６に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項160】

対象への投与後に、肝臓よりも肺、脾臓、及び／又はリンパ節において、より高い割合の前記組成物が観察される、請求項１５９に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項161】

標的細胞を前記組成物とインビトロで接触させた後、前記標的細胞への前記核酸の送達が、脂質ベースの核酸送達系を使用した同じ細胞型への同じ核酸の送達と比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、１００％増加する、請求項８６～１６０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項162】

前記標的細胞が、がん細胞又は免疫細胞である、請求項１６１に記載の使用のための組成物。

【請求項163】

前記脂質ベースの核酸送達系が、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００である、請求項１６１又は１６２に記載の使用のための組成物。

【請求項164】

前記ペプチドデンドリマー、核酸、及び脂質が、正に荷電した粒子を形成する、請求項８６～１６３のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項165】

前記組成物が、液体内に含まれる、請求項８６～１６４のいずれか一項に記載の組成物又は使用のための組成物。

【請求項166】

前記組成物が、粉末組成物である、請求項８６～１６５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項167】

核酸の送達を必要とする対象の細胞内へ核酸を送達する方法であって、薬学的有効量の請求項１～１６５のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、核酸などの治療用分子を哺乳動物細胞、並びにヒト及び動物の身体に送達することができる組成物に関する。特定の細胞型への送達、例えば、リンパ組織及び循環中の白血球への送達が示されている。特定の器官及び組織への送達も示されている。例えば、本発明は、脾臓、リンパ系器官、骨格筋、脳、及び脂肪組織、並びに肺、腫瘍組織、心臓、骨格筋、脂肪組織、脳、肝臓、及び腎臓への核酸の有効な送達を可能にする組成物を提供する。ＤＮＡ及びＲＮＡの送達が、提供される。特に、ｍＲＮＡの送達が示されている。

【背景技術】

【0002】

ヘルスケアを変えるための次世代の精密医薬品としての核酸療法の完全な可能性を実現するために、薬物送達の重要な課題に対処する必要がある。現在のウイルス及び非ウイルスベクタープラットフォームの限界は、開発を著しく妨げており、多くの療法は、オフターゲット効果、免疫系の活性化、及び大規模製造の困難に起因して、臨床転換段階で失敗している。

【0003】

核酸のインビボ送達の状況において、ウイルス由来の薬剤は、最も強力なベクターであり、臨床において非常に進歩しているものもある（Ｓｈｅｒｉｄａｎ ｅｔ ａｌ，２０１１）。特に、アデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus、ＡＡＶ）は、インビボ送達のための有効な系である（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１９）。しかしながら、このような系の適用は、５ｋｂ未満のＤＮＡを輸送することができるのみであり、ＲＮＡ又はより大きなＤＮＡを輸送することができないので、限定される。更に、ウイルスベクターの進歩にもかかわらず、潜在的なランダム挿入及び免疫毒性のような問題が、この種の核酸送達ベクターの使用に関連している。例えば、ＡＡＶ送達は、特に高用量が肝臓以外の標的組織に必要とされる場合、高度に免疫原性であり得る。ＡＡＶ送達系はまた、反復投与について制限されている。患者は、典型的には、ＡＡＶ送達系に対する免疫を獲得し、反復投与が不可能となる。最後に、ＡＡＶ送達系の製造は高価であり、大規模かつ適正製造規範（Good Manufacturing Practice、ＧＭＰ）グレードで製造することが困難である。

【0004】

ウイルス系の欠点を考慮して、インビボで細胞及び組織に核酸を送達するための非ウイルスベクターが調査されている。ｓｉＲＮＡ及びアンチセンスオリゴヌクレオチド（antisense oligonucleotide、ＡＳＯ）などのより小さな核酸の送達のために、様々な送達技術が開発されている。これらには、ｓｉＲＮＡ又はＡＳＯが抗体又はリガンドにコンジュゲートしているバイオコンジュゲートオリゴヌクレオチド送達系が含まれる（Ｂｅｎｉｚｒｉ ｅｔ ａｌ，２０１９）。しかしながら、ｓｉＲＮＡ及びＡＳＯ療法は、遺伝子発現ではなく、遺伝子サイレンシング又はエクソンスキッピングのみを達成することができる。多くの疾患について、ＤＮＡ又はｍＲＮＡを有する機能的遺伝子を発現することは有利である。プラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡなどの大きな遺伝子ペイロードの有効な送達のためにコンジュゲート系を適用することは困難である。プラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡは、負に荷電した大きな分子であり、負に荷電した細胞膜を容易に通過することができない。送達ビヒクルがそれらをカプセル化し、有効な送達のために電荷を中和する場合に有用である。

【0005】

非ウイルス送達ビヒクルを封入するものとしての脂質ナノ粒子（lipid nanoparticle、ＬＮＰ）は、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンにおけるｍＲＮＡ送達に使用されている（Ｑｕｉ ｅｔ ａｌ，２０２１）。ウイルスと戦うための免疫系を育てるには、比較的少数の免疫細胞及び筋肉細胞を注射部位に局所的にトランスフェクトすれば十分である。したがって、ＲＮＡベースのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンが筋肉内投与される。しかしながら、広範な疾患は、特定の型の多くの細胞がトランスフェクトされる場合にのみ効果的に治療することができ、静脈内注射が必要となり得る。臨床で現在使用されているＬＮＰの表面特性は、静脈内投与された場合に肝臓を標的とするのにそれらを良好に適合させる。しかしながら、現在臨床で使用されているＬＮＰは、多くの他の組織を標的とするのにはあまり適していない。

【0006】

例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（dioleoylphosphatidylethanolamine、ＤＯＰＥ）などの非荷電脂質及び／又は１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパンクロリド（1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride、ＤＯＴＡＰ）及びＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride、ＤＯＴＭＡ）などのカチオン性脂質を含む、様々なリポソームベースの系も同様に調査されている（Ｂｒａｕｍ，２０１９、Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ，２０００）。同様のリポソームが核酸送達のために臨床で使用されており、中程度の有効性を示している。

【0007】

脂質ベースのベクターへのペプチドの付加が調査されている。ペプチド／脂質ハイブリッド系では、ペプチド及び脂質が核酸と会合して、細胞によって内在化され得るナノ粒子を形成する。ペプチド要素は、直鎖状（Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ，２０１６）であってもよく、ペプチドデンドリマー（Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ，２０１３）などの分岐状であってもよい。しかしながら、ペプチド／脂質ハイブリッド系に対するこの以前の研究は、インビボ条件とは実質的に異なる無血清インビトロ条件において、二本鎖プラスミドＤＮＡ（plasmid DNA、ｐＤＮＡ）及び短鎖干渉ＲＮＡ（short interfering RNA、ｓｉＲＮＡ）に対してのみ実施された。この系がインビボでの核酸送達のために使用され得るかどうかは明らかではなかった。ペプチドデンドリマー／脂質ナノ粒子を使用する短い一本鎖オリゴヌクレオチドの送達のみが、インビボで報告されており（Ｓａｈｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１８、Ｓａｈｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１９）、ＡＳＯ単独と比較して、ＡＳＯ肝臓送達における２０～３０％の低い増加が観察されている。このデータから、ペプチドデンドリマー系は、ｍＲＮＡなどの更に大きな核酸をインビボで組織に送達することができない可能性があると結論付けることができる。ｍＲＮＡなどの長い核酸の送達は、ペプチドデンドリマー／脂質ハイブリッド系を用いて以前にインビボで実証されたことがない。

【0008】

本発明は、上記の考慮事項に鑑みてなされたものである。

【発明の概要】

【0009】

核酸療法の開発は、効率的な核酸送達に依存する。本発明者らは、ペプチドデンドリマーを使用して、核酸送達のためのフレームワークを開発した。これらのデンドリマーは、デンドリマー分子内で分岐単位として作用する「分岐残基」の間に１、２、３、又は４個のアミノ酸残基を示す分岐ペプチドである。本発明は、驚くべきことに、より大きな核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＳＯよりも大きい）を送達するのに有効である。ＡＳＯなどの一部のより小さな核酸は、ベクター系がなくても細胞に容易に取り込まれるが、本発明の組成物は、ｍＲＮＡなどのより大きな核酸の効果的な送達を可能にする。これは、ウイルス送達ベクターを必要とすることなく、ＣＲＩＳＰＲ媒介性遺伝子編集及び関連技術などの分野を臨床応用に開放する。

【0010】

肝臓をバイパスする臨床ｍＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲカセット（すなわち、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡ）送達系が依然として欠如しているので、組織特異的ｍＲＮＡ送達系を特異的に開発することは、著しい進歩を意味する。本発明は、細胞中のＣＲＩＳＰＲカセット及びｍＲＮＡを様々な組織、特に肺及び免疫細胞に富む組織（脾臓、リンパ節、及び骨髄を含む）に効果的に送達することができる。これにより、肝外組織に対するｍＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ療法の開発が可能になる。免疫細胞、更には、単球、マクロファージ、好中球、及び樹状細胞を含む骨髄細胞にｍＲＮＡを送達することができることにより、この技術は、全てのがん型（固形腫瘍、及び骨髄異形成症候群（Myelodysplastic Syndrome、ＭＤＳ）及び慢性骨髄単球性白血病（Chronic Myelomonocytic Leukemia、ＣＭＭＬ）などの血液がん、自己免疫疾患（例えば、リウマチ性関節炎、クローン病、ブドウ膜炎、炎症性大腸炎）、並びにゴーシェ病などの他の免疫細胞関連障害を含む、を治療するために開発されることが可能になる。本発明はまた、ｍＲＮＡが肺及び／又は免疫細胞に送達されることを可能にし、肺関連疾患（例えば、嚢胞性線維症及び慢性閉塞性肺疾患）の治療を可能にする。

【0011】

本発明者らはまた、それらのデンドリマーベースの系が驚くほど汎用性であることを見出した。ＤＮＡ及びＲＮＡ分子は、ある範囲の第１世代、第２世代、及び第３世代デンドリマーを使用して送達することができる。一例では、脂質と会合したＧ１，２，３－ＫＬデンドリマー（「第３世代」デンドリマー）などのデンドリマーに基づくベクター系は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００などのいくつかの主要な市販試薬と比較して、ＤＮＡの細胞トランスフェクションを６～１０倍改善することができる。別の例では、脂質と会合したＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲデンドリマー（「第３世代」デンドリマー）などのデンドリマーに基づくベクター系は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００などのいくつかの主要な市販試薬と比較して、ｍＲＮＡなどの細胞トランスフェクション核酸を１０倍改善することができる。更に、特定の器官及び組織を標的とすることができる。以下により詳細に記載されるように、本発明者らは、デンドリマーベースの系が、驚くほど頑強かつ汎用性であり、血清の存在下、インビトロで高い活性を示し、インビボで予想外の組織標的化特性を示すことを見出した。ＤＮＡ及びＲＮＡの効果的な送達を、以下で考察する。

【0012】

本発明者らは、ＤＮＡ送達のために、Ｇ１，２，３－ＫＬ及びＧ１，２，３－ＲＬ（「第３世代」デンドリマー）並びにある程度までＧ１，２－ＫＬ、Ｇ１，２－ＲＬ（両方とも「第２世代」デンドリマー）が、血清の存在下でＨｅＬａ及びＮｅｕｒｏ２Ａ細胞をトランスフェクトすることができることを見出した。（血清成分は、アルブミンなどの成分がカチオン性製剤に干渉し得るので、インビボＤＮＡ送達、特に全身送達に関する課題を示す）。この予想外の発見により、本発明者らは、細胞侵入の根底にある機構を調査し、このベクター系の能力をインビボで評価するに至った。驚くべきことに、Ｇ１，２，３－ＲＬベースのベクターは、全身送達後の特定の組織への機能的核酸の有効な送達を媒介することが見出された。肝臓及び骨格筋は、高度に標的となる。エンドサイトーシス経路分析により、Ｇ１，２，３－ＲＬ ＤＮＡ複合体がクラスリン、カベオラ媒介性エンドサイトーシス、及びマクロピノサイトーシスの両方を介してＤＮＡを送達することが示される。

【0013】

本発明者らは、ｍＲＮＡ送達のために、第１又は第２世代デンドリマー（例えば、ＲＨＣＧ１－Ｒ、ＲＨＣＧ１，２－Ｒ、ＲＨＣＧ１－ＬＲ、ＲＨＣＧ１－ＲＬ、２－ＬＲ）が、細胞を効果的にトランスフェクトし得、第３世代デンドリマーと同様のトランスフェクション効率を媒介し得ることを見出した（血清を含む完全成長培地条件下でのＨｅＬａ細胞のトランスフェクションの有効性を示す図２８Ａを参照されたい）。これは、ＲＮＡ送達のためのハイブリッド系の特定の汎用性を示す。

【0014】

本発明において使用されるデンドリマーは、第１、第２、又は第３世代ペプチドデンドリマーであり、これは、そのペプチドデンドリマーが、リジンなどの「分岐」残基間に散在するペプチドモチーフ（典型的にはジペプチドモチーフである）の最大３つの「層」を有することを意味する。第１世代デンドリマーは、Ｎ末端からＣ末端への配向で示され、Ｌｙｓを分岐単位とする以下の構造を有する。
（Ｎ末端－Ｐｅｐ１）_２－Ｌｙｓ－（コア）－（Ｃ末端）

【0015】

第２世代デンドリマーは、Ｎ末端からＣ末端への配向で示され、Ｌｙｓを分岐単位とする以下の構造を有する。
（Ｎ末端－Ｐｅｐ２）_４－Ｌｙｓ_２－（Ｐｅｐ１）_２－Ｌｙｓ－（コア）－（Ｃ末端）

【0016】

第３世代デンドリマーは、Ｎ末端からＣ末端への配向で示され、Ｌｙｓを分岐単位とする以下の構造を有する。
（Ｎ末端－Ｐｅｐ３）_８－Ｌｙｓ_４－（Ｐｅｐ２）_４－Ｌｙｓ_２－（Ｐｅｐ１）_２－Ｌｙｓ－（コア）－（Ｃ末端）

【0017】

第３世代デンドリマーは、図３１において図式的に表される（左側にＮ末端及び右側にＣ末端を有する）。

【0018】

丸は、コア配列を表す。各三角は、リジンなどの分岐残基を表す。各長方形は、ペプチドモチーフを表す。第３世代デンドリマーの第１の層には２つのペプチドモチーフがあり、第２の層には４つのペプチドモチーフがあり、第３の層には８つのペプチドモチーフがある。Ｎ末端及びＣ末端は、本明細書で考察されるように、更なる化学モチーフで誘導体化されてもよい。例えば、誘導体化されていない実施形態では、Ｃ末端はカルボン酸であるが、他の実施形態では、デンドリマーを合成するために使用される化学経路の結果として、Ｃ末端は、例えば、一級アミド基であるＣＯＮＨ_２を（ＣＯＯＨの代わりに）含むように誘導体化される。標的化部分（例えば、抗体、ペプチド基、糖基、及び／又は脂質鎖）などの機能的に重要な誘導体化も想定され、これらの部分は、Ｎ末端及び／若しくはＣ末端に、又はデンドリマーに沿った他の位置に結合することができる。

【0019】

本明細書に記載されているように、デンドリマーは、第１、第２、又は第３世代であり得る。これは、構造的に次のように定義することができる。第１世代デンドリマーは、コアペプチド配列と、第１の分岐残基と、２つの第１のペプチドモチーフと、を含む。２つの第１のペプチドモチーフは、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる。第２世代デンドリマーは、２つの第２の分岐残基（例えば、リジン）及び４つの第２のペプチドモチーフを更に含み、第２の分岐残基のうちの一方は、第１のペプチドモチーフのうちの一方と共有結合し、他方の第２の分岐残基は、他方の第１のペプチドモチーフと共有結合し、各第２の分岐残基は、２つの第２のペプチドモチーフと共有結合する。４つの第２のペプチドモチーフは、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる。第３世代デンドリマーは、４つの第３の分岐残基（例えば、リジン）及び８つの第３のペプチドモチーフを更に含み、各第２のペプチドモチーフは、各第３の分岐残基が１つの第２のペプチドモチーフと共有結合するように、第３の分岐残基のうちの１つとそれぞれ共有結合し、各第３の分岐残基は、２つの第３のペプチドモチーフと共有結合する。８つの第３のペプチドモチーフは、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる。第１、第２、及び第３のペプチドモチーフの各々は、存在する場合、（１）塩基性側鎖を有するアミノ酸、例えば、限定されないが、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）、（２）酸性側鎖を有するアミノ酸、例えば、限定されないが、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）、（３）非極性側鎖を有するアミノ酸、例えば、限定されないが、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ベータ－アラニン（Ｂ）、トリプトファン（Ｗ）、プロリン（Ｐ）、アミノヘキサン酸（Ｘ）、及びシステイン（Ｃ）、並びに（４）非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えば、限定されないが、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及びチロシン（Ｙ）を含み得る。

【0020】

好ましいデンドリマーを以下の表２に示す。特定の例を特に説明する。例えば、各ペプチドモチーフがＡｒｇ－Ｌｅｕ（ＲＬ）ジペプチドであるデンドリマーでは、この構造は、Ｇ１－ＲＬ、Ｇ１，２－ＲＬ、及びＧ１，２，３－ＲＬと表すことができる。各ペプチドモチーフがＬｙｓ－Ｌｅｕ（ＫＬ）ジペプチドであるデンドリマーでは、この構造は、Ｇ１－ＫＬ、Ｇ１，２－ＫＬ、及びＧ１，２，３－ＫＬと表される。各ペプチドモチーフがＬｅｕ－Ａｒｇ（ＬＲ）ジペプチドであるデンドリマーでは、この構造は、Ｇ１－ＬＲ、Ｇ１，２－ＬＲ、及びＧ１，２，３－ＬＲと表される。

【0021】

（「Ｇ１」、「Ｇ２」、及び「Ｇ３」は、それぞれ、第１、第２、及び第３の層の「世代１」、「世代２」、及び「世代３」ペプチドモチーフを指す。各アミノ酸残基は、Ｌ－アミノ酸又はＤ－アミノ酸であり得る。Ｄ－アミノ酸は、一文字コードの小文字を使用して示され得る。あるいは、各アミノ酸がＤ－アイソフォームであるデンドリマーは、デンドリマーの短縮形表記の前に「Ｄ－」を先行させて書くことができる。）

【0022】

したがって、第１の態様では、本発明は、医薬における使用のための組成物であって、第１、第２、又は第３世代ペプチドデンドリマーと、核酸と、脂質と、を含む、組成物を提供する。組成物は、核酸及び脂質を更に含む。ペプチドデンドリマーは、少なくとも、コアペプチド配列と、第１の分岐残基と、２つの第１のペプチドモチーフと、を含む。分岐残基は、リジン、２，４－ジアミノ酪酸、オルニチン、又はジアミノプロピオン酸であってもよい。核酸は、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、又は少なくとも１００ヌクレオチドの核酸を含む。

【0023】

第２の態様では、本発明は、ペプチドデンドリマーと、核酸と、脂質と、を含む組成物であって、ペプチドデンドリマーが、少なくとも、コアペプチド配列と、第１の分岐残基と、２つの第１のペプチドモチーフと、を含む、組成物を提供する。分岐残基は、リジン、２，４－ジアミノ酪酸、オルニチン、又はジアミノプロピオン酸であってもよい。核酸は、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、又は少なくとも１００ヌクレオチドの一本鎖核酸を含む。

【0024】

第３の態様では、本発明は、核酸の送達を必要とする対象の細胞内へ核酸を送達する方法であって、薬学的有効量の組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。組成物は、ペプチドデンドリマーと、核酸と、脂質と、を含み、ペプチドデンドリマーは、少なくとも、コアペプチド配列と、第１の分岐残基と、２つの第１のペプチドモチーフと、を含む。分岐残基は、リジン、２，４－ジアミノ酪酸、オルニチン、又はジアミノプロピオン酸であってもよい。核酸は、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、又は少なくとも１００ヌクレオチドの核酸を含む。核酸は、一本鎖であってもよい。

【0025】

いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡである。例えば、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、及び／又は自己増幅ＲＮＡから選択され得る。好ましくは、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。

【0026】

いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡである。例えば、ＤＮＡは、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、プラスミド、及び／又はｃＤＮＡを含んでもよい。

【0027】

疑義を避けるために、組成物は、２つ以上の核酸（例えば、２つ以上のタイプのＲＮＡ分子）を含んでもよい。同様に、組成物は、２つ以上の脂質を含んでもよい。組成物は、２つ以上のペプチドデンドリマーを含んでもよい。

【0028】

いくつかの実施形態では、組成物は、ＲＮＡ核酸及びＤＮＡ核酸を含む。ＲＮＡ核酸及びＤＮＡ核酸は、単一核酸分子の一部であってもよい。

【0029】

いくつかの実施形態では、核酸は、修飾核酸を含む。例示的な核酸修飾が、本明細書に記載される。

【0030】

好ましくは、核酸は、導入遺伝子をコードし、標的細胞において導入遺伝子を発現することができる。導入遺伝子は、タンパク質又はペプチドであってもよい。更に又はあるいは、核酸は、内因性遺伝子の発現又は活性を調節することができる。調節は、遺伝子の発現及び／若しくは遺伝子の更なるコピーの外因性発現の増加であり得るか、又は調節は、遺伝子の発現の減少であり得る。

【0031】

いくつかの実施形態では、調節された内因性遺伝子は、タンパク質又はペプチドを発現する遺伝子である。

【0032】

いくつかの実施形態では、タンパク質又はペプチドは、抗原、ホルモン、受容体、キメラ抗原受容体、転写因子、及び／又はサイトカインを含む。

【0033】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、腫瘍抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、又は哺乳動物に寄生する微生物のタンパク質を含む。

【0034】

いくつかの実施形態では、組成物は、ワクチンとして使用することができる。

【0035】

いくつかの実施形態では、核酸は、自己増幅ＲＮＡを含むか又はコードする。

【0036】

いくつかの実施形態では、使用は、対象における遺伝性障害の治療を含む。

【0037】

いくつかの実施形態では、核酸は、対象において非機能的であるか、下方制御されているか、不活性であるか、又は損なわれている遺伝子の機能的バージョンを発現する。

【0038】

いくつかの実施形態では、核酸は、ゲノムを編集するための系又は遺伝子発現を変化させるための系の１つ以上の成分をコードする、かつ／又は含む。例えば、ゲノムを編集するための系又は遺伝子発現を変化させるための系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であってもよい。核酸は、Ｃａｓタンパク質若しくはペプチドをコードしてもよく、かつ／又はｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、及び／若しくはｔｒａｃｒＲＮＡを含む。核酸は、Ｃａｓタンパク質又はペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びｓｇＲＮＡを含むＲＮＡ配列を含んでもよい。組成物は、Ｃａｓタンパク質又はペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びｓｇＲＮＡを含む別のＲＮＡを（別々の分子として）含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＣａｓタンパク質をコードする核酸のうちの１つ以上が、存在する場合、単一核酸の一部である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＣａｓタンパク質をコードする核酸のうちの１つ以上が、存在する場合、２つ以上の核酸上に存在する。

【0039】

いくつかの実施形態では、組成物は、脾臓、リンパ組織、骨格筋、脳、及び脂肪組織、並びに肺、腫瘍組織、心臓、骨格筋、脂肪組織、脳、肝臓、及び腎臓を標的とする。

【0040】

いくつかの実施形態では、組成物は、脾臓、リンパ組織、肺、及び／又は骨を標的とする。これらの実施形態では、核酸は、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡであってもよい。

【0041】

いくつかの実施形態では、核酸は、白血球、例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、単球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、若しくは単球；リンパ節組織細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、筋細胞、骨格筋細胞、内皮細胞、肝細胞、星細胞、ニューロン、アストロサイト、脾細胞、肺細胞、心筋細胞、腎細胞、脂肪細胞、幹細胞、及び／又は腫瘍細胞である細胞に送達される。

【0042】

いくつかの実施形態では、組成物は、核酸が免疫細胞に送達されるように、対象に投与される。

【0043】

いくつかの実施形態では、核酸は、標的細胞において免疫分子又は転写因子を発現する。免疫分子は、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体、サイトカイン、デコイ受容体、抗体、共刺激受容体、共刺激リガンド、チェックポイント阻害剤、免疫コンジュゲート、又は腫瘍抗原であってもよい。

【0044】

いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、単球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、単球、骨髄由来サプレッサ細胞（myeloid derived suppressor cell、ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ、又は腫瘍関連好中球である。

【0045】

いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡである。

【0046】

いくつかの実施形態では、組成物は、対象におけるがんを治療する方法における使用のためのものである。がんは、血液がん、例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫、若しくは骨髄異形成症候群；又は肺がん、噴門がん、肉腫、若しくは肝臓がんであってもよい。治療はまた、抗がん剤の投与を含んでもよい。がんは、非小細胞肺がん、進行性黒色腫、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、胆管がん（Bile duct cancer）（胆管がん（Cholangiocarcinoma））、胆のうがん、神経内分泌腫瘍、肝細胞がん、結腸直腸がん、膵臓がん、及び固形腫瘍であってもよい。

【0047】

いくつかの実施形態では、組成物は、肺疾患を治療する方法における使用のためのものである。例えば、組成物は、慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease、ＣＯＰＤ）又は嚢胞性線維症（cystic fibrosis、ＣＦ）の治療における使用のためのものであってもよい。

【0048】

いくつかの実施形態では、組成物は、対象における自己免疫疾患を治療する方法における使用のためのものである。

【0049】

いくつかの実施形態では、組成物は、対象におけるポンペ病、筋肉消耗性疾患、ミオパチー、又は筋ジストロフィー、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療における使用のためのものである。これらの実施形態では、核酸は、ＤＮＡであってもよい。

【0050】

いくつかの実施形態では、組成物は、対象における糖尿病性四肢虚血などの四肢虚血のための治療における使用のためのものであり、導入遺伝子が、肝細胞増殖因子（hepatocyte growth factor、ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor、ＶＥＧＦ）及び／又は線維芽細胞増殖因子（Fibroblast growth factor、ＦＧＦ）である。

【0051】

いくつかの実施形態では、２つの第１のペプチドモチーフは、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる。

【0052】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、２つの第２の分岐残基（例えば、リジン）及び４つの第２のペプチドモチーフを更に含み、第２の分岐残基のうちの一方は、第１のペプチドモチーフのうちの一方と共有結合し、他方の第２の分岐残基は、他方の第１のペプチドモチーフと共有結合し、各第２の分岐残基は、２つの第２のペプチドモチーフと共有結合する。

【0053】

いくつかの実施形態では、４つの第２のペプチドモチーフは、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる。

【0054】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、４つの第３の分岐残基（例えば、リジン）及び８つの第３のペプチドモチーフを更に含み、各第２のペプチドモチーフは、各第３の分岐残基が１つの第２のペプチドモチーフと共有結合するように、第３の分岐残基のうちの１つとそれぞれ共有結合し、各第３の分岐残基は、２つの第３のペプチドモチーフと共有結合する。

【0055】

いくつかの実施形態では、８つの第３のペプチドモチーフは、独立して、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフからなる。

【0056】

各ペプチドモチーフは、独立して、天然に存在するＬ－若しくはＤ－アミノ酸及び／又は天然に存在しないＬ－若しくはＤ－アミノ酸、例えば、ベータ－アラニン（Ｂ）又はアミノヘキサン酸（Ｘ）を含む。

【0057】

いくつかの実施形態では、第１、第２、及び／又は第３のペプチドモチーフは、塩基性側鎖を有するアミノ酸を含む。

【0058】

いくつかの実施形態では、コア配列は、ヒスチジンなどのイオン化可能な基を有するアミノ酸残基を含む。

【0059】

いくつかの実施形態では、第１、第２、及び／又は第３のペプチドモチーフは、非極性側鎖を有するアミノ酸を含む。

【0060】

いくつかの実施形態では、第１、第２、及び／又は第３のペプチドモチーフは、酸性側鎖を有するアミノ酸を含む。

【0061】

いくつかの実施形態では、第１、第２、及び／又は第３のペプチドモチーフは、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸を含む。

【0062】

いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のペプチドモチーフ（存在する場合）は、ａ）アルギニン（Ｒ）若しくはリジン（Ｋ）；及び／又はｂ）ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、ヒスチジン（Ｈ）、若しくはイソロイシン（Ｉ）を含む。

【0063】

いくつかの実施形態では、第１、第２、及び／又は第３のペプチドモチーフは、ロイシン（Ｌ）及び／又はアルギニン（Ｒ）残基を含む。

【0064】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、表２に記載される構造を含む。

【0065】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、組織及び／又は細胞標的化モチーフを更に含む。組織又は細胞標的化モチーフは、筋標的化モチーフ、例えば、ＧＡＡＳＳＬＮＩＡ（配列番号１）、インテグリン標的化モチーフ、例えば、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）、又は化学修飾、例えば、マンノース糖鎖付加を含む化学修飾を含み得る。

【0066】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、細胞透過性ペプチドを更に含む。細胞透過性ペプチドは、ＴＡＴ由来配列を含んでもよい。細胞透過性ペプチドは、ペプチド配列ＸＲＸＲＲＢＲＲＸＲＲＢＲＸＢ（配列番号２）（式中、Ｘは６－アミノヘキサン酸であり、Ｂはベータ－アラニンである）を含んでもよい。

【0067】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、アルキル鎖、アルケニル鎖、抗体若しくはその断片、糖、及び／又は脂肪酸を更に含む。アルキル鎖又はアルケニル鎖は、例えば、ペプチドデンドリマーのＣ末端で、コアペプチド配列にコンジュゲートしていてもよい。あるいは、アルキル鎖又はアルケニル鎖は、ペプチドデンドリマーのＮ末端にコンジュゲートしていてもよい。

【0068】

いくつかの実施形態では、アルキル鎖又はアルケニル鎖は、約５個の炭素～約５０個の炭素、好ましくは約１２個～約３０個の炭素を含む。

【0069】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、ペプチドデンドリマーのＣ末端にコンジュゲートされた脂肪酸を含む。他の実施形態では、ペプチドデンドリマーは、ペプチドデンドリマーのＮ末端にコンジュゲートされた脂肪酸を含む。

【0070】

いくつかの実施形態では、組成物の脂質は、カチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質、及び／又はイオン化可能な脂質を含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、組成物の脂質は、飽和脂肪酸を含む。更に又はあるいは、組成物の脂質は、不飽和脂肪酸を含んでもよい。

【0072】

いくつかの実施形態では、脂質は、１、２、３、４、５、又は６個の脂肪酸鎖を含む。好ましくは、脂質は、２、３、４、又は６個の脂肪酸鎖を含む。

【0073】

いくつかの実施形態では、脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及び／又はＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を含む。いくつかの実施形態では、脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及びジオレオイルホスファチジルグリセロール（dioleoylphosphatidylglycerol、ＤＯＰＧ）を含む。

【0074】

いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、約０．０１：１～１００：１である。例えば、Ｎ／Ｐ比は、約０．０５：１～５０：１又は約０．１：１～３０：１であってもよい。０．２：１～２５：１及び０．５：１～２０：１などのより狭い範囲も想定される。

【0075】

いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、１：１～５０：１である。いくつかの実施形態では、対象への投与後に、肝臓よりも脾臓及び／又はリンパ節において、より高い割合の組成物が観察される。

【0076】

いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、０．０１：１～１：１である。いくつかの実施形態では、対象への投与後に、肝臓よりも肺、脾臓、及び／又はリンパ節において、より高い割合の組成物が観察される。

【0077】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマー、核酸、及び脂質は、正に荷電した粒子を形成する。

【0078】

他の実施形態では、ペプチドデンドリマー、核酸、及び脂質は、負に荷電した粒子又は中性電荷を有する粒子を形成する。

【0079】

いくつかの実施形態では、標的組織又は標的細胞への核酸の送達は、脂質ベースの核酸送達系を使用した同じ組織又は細胞型への同じ核酸の送達と比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、１００％増加する。標的細胞又は標的組織は、本明細書で定義される細胞型又は臓器／組織である。例えば、標的組織は、脾臓、リンパ系器官、骨格筋、脳、及び脂肪組織、並びに肺、腫瘍組織、心臓、骨格筋、脂肪組織、脳、肝臓、及び腎臓であってもよい。脂質ベースの核酸送達系は、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥであってもよい。

【0080】

組成物は、対象に静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮下、皮内、又は腹腔内に投与することができる。

【0081】

いくつかの実施形態では、組成物は、液体内に含まれる。他の実施形態では、組成物は、乾燥組成物、例えば、乾燥粉末として提供される。乾燥組成物は、凍結乾燥及び／又はフリーズドライ技術を使用して調製され得る。

【0082】

特定の実施形態では、第３世代ペプチドデンドリマーは、第１のリジン残基及び２つの第１のペプチドモチーフと、２つの第２のリジン残基及び４つの第２のペプチドモチーフと、４つの第３のリジン残基及び８つの第３のペプチドモチーフと、第１のリジン残基と共有結合したコアペプチド配列と、を含み、
（ｉ）第１のリジン残基は、２つの第１のペプチドモチーフと共有結合し、２つの第１のペプチドモチーフは、それぞれ２つの第２のリジン残基と共有結合し、
（ｉｉ）各第２のリジン残基は、２つの第２のペプチドモチーフと共有結合し、各第２のペプチドモチーフは、それぞれ、第３のリジン残基のうちの１つと共有結合し、
（ｉｉｉ）各第３のリジン残基は、第３のペプチドモチーフのうちの２つと共有結合し、第１、第２、及び第３のペプチドモチーフは、独立して、モノペプチド、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフである。第１、第２、及び第３のペプチドモチーフの各々は、アルギニン（Ｒ）若しくはリジン（Ｋ）；及び／又はｂ）ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、ヒスチジン（Ｈ）、若しくはイソロイシン（Ｉ）を含んでもよい。（「共有結合した」という用語は、いかなる介在原子も持たない、記載された部分間の直接共有結合を意味する。したがって、モノ－、ジ－、トリ－、又はテトラ－ペプチドモチーフのみが、第１のリジン残基と各第２のリジン残基との間に存在し、モノ－、ジ－、トリ－、又はテトラ－ペプチドモチーフのみが、各第２のリジン残基と各第３のリジン残基との間に存在する）。

【0083】

いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のペプチドモチーフの各々は、存在する場合、（１）塩基性側鎖を有するアミノ酸、例えば、限定されないが、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）、（２）酸性側鎖を有するアミノ酸、例えば、限定されないが、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）、（３）非極性側鎖を有するアミノ酸、例えば、限定されないが、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ベータ－アラニン（Ｂ）、トリプトファン（Ｗ）、プロリン（Ｐ）、アミノヘキサン酸（Ｘ）、及びシステイン（Ｃ）、並びに（４）非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えば、限定されないが、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及びチロシン（Ｙ）を含み得る。

【0084】

好ましくは、第１、第２、及び第３のペプチドモチーフのうちの少なくとも１つは、アルギニン（Ｒ）を含む。第１、第２、及び第３のペプチドモチーフのうちの少なくとも２つは、アルギニン（Ｒ）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のペプチドモチーフの全てが、アルギニン（Ｒ）を含む。

【0085】

好ましくは、第１、第２、及び第３のペプチドモチーフのうちの少なくとも１つは、ロイシン（Ｌ）を含む。第１、第２、及び第３のペプチドモチーフのうちの少なくとも２つは、ロイシン（Ｌ）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のペプチドモチーフの全てが、ロイシン（Ｌ）を含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のペプチドモチーフの各々は、ジペプチドモチーフである。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のペプチドモチーフの各々は、トリペプチドモチーフである。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のペプチドモチーフの各々は、テトラペプチドモチーフである。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のペプチドモチーフの各々は、独立して、モノ－、ジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドモチーフである。好ましくは、第１、第２、及び第３のペプチドモチーフのうちの少なくとも１つは、ロイシン（Ｌ）及びアルギニン（Ｒ）の両方を含むジペプチドモチーフである。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のペプチドモチーフのうちの少なくとも２つは、ロイシン（Ｌ）及びアルギニン（Ｒ）の両方を含むジペプチドモチーフである。特に好ましい実施形態では、各ペプチドモチーフは、ロイシン（Ｌ）及びアルギニン（Ｒ）の両方を含むジペプチドモチーフである。各アミノ酸残基は、独立して、Ｌ－アイソフォーム又はＤ－アイソフォームから選択される。

【0087】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、表２に列挙されるペプチドデンドリマーのうちのいずれか１つから選択される。

【0088】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、Ｇ１，２，３－ＲＬであり、（ＲＬ）_８（ＫＲＬ）_４（ＫＲＬ）_２Ｋ－コアを含む。

【0089】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、Ｇ１－ＬＲ，Ｇ２，３－ＲＬであり、（ＲＬ）_８（ＫＲＬ）_４（ＫＬＲ）_２Ｋ－コアを含む。

【0090】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、Ｇ１，２，３－ｒｌであり、（ｒｌ）_８（ｋｒｌ）_４（ｋｒｌ）_２ｋ－コア（式中、「ｒ」はＤ－アルギニンであり、ＴはＤ－ロイシンであり、「ｋ」はＤ－リジンである）を含む。

【0091】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、Ｇ１，２－ＲＬ，Ｇ３－ＬＲであり、（ＬＲ）_８（ＫＲＬ）_４（ＫＲＬ）_２Ｋ－コアを含む。

【0092】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、Ｇ１，２－ＬＲ，Ｇ３－ＲＬであり、（ＲＬ）_８（ＫＬＲ）_４（ＫＬＲ）_２Ｋ－コアを含む。

【0093】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、Ｇ１，２，３－ＬＲであり、（ＬＲ）_８（ＫＬＲ）_４（ＫＬＲ）_２Ｋ－コアを含む。

【0094】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、ＲＨＣＧ１－Ｒであり、（Ｒ）２ＫＲＨＣ－ＮＨ２を含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、ＲＨＣＧ１，２－Ｒであり、（Ｒ）４（ＫＲ）２ＫＲＨＣ－ＮＨ２を含む。

【0096】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、ＲＨＣＧ１－ＬＲであり、（ＬＲ）２ＫＲＨＣ－ＮＨ２を含む。

【0097】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、ＲＨＣＧ１－ＲＬ，２－ＬＲであり、（ＬＲ）４（ＫＲＬ）２ＫＲＨＣ－ＮＨ２を含む。

【0098】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲであり、（ＬＲ）_８（ＫＲＬ）_４（ＫＲＬ）_２ＫＧＳＣ－ＮＨ_２を含む。

【0099】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、ＲＨＣＧ１－ＲＬＲであり、（ＲＬＲ）２ＫＲＨＣ－ＮＨ２を含む。

【0100】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、ＲＨＣＧ１，２－ＲＬＲであり、（ＲＬＲ）４（ＫＲＬＲ）２ＫＲＨＣ－ＮＨ２を含む。

【0101】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、Ｇ１－ＬＲＬＲであり、（ＬＲＬＲ）２ＫＧＳＣ－ＮＨ２を含む。

【0102】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、ＲＨＣＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲであり、（ＬＲ）８（ＫＲＬ）４（ＫＲＬ）２ＫＲＨＣ－ＮＨ２を含む。

【0103】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、Ｇ１，２，３－ＲＬであり、（ＲＬ）ｓ（ＫＲＬ）４（ＫＲＬ）_２ＫＧＳＣ－ＮＨ_２を含む。

【0104】

いくつかの実施形態では、ペプチドデンドリマーは、ＮＴＸ１であり、（ＬＲ）８（ＫＲＬ）４（ＫＲＬ）２ＫＧＳＣＧＡＡＳＳＬＮＩＡＸＲＸＲＲＢＲＲＸＲＲＢＲＸＢ－ＮＨ２（式中、Ｘ＝６－アミノヘキサン酸及びＢ＝ベータ－アラニン）を含む。

【0105】

（「Ｇ１」は、第１の層の「世代１」ペプチドモチーフを指す。「Ｇ２」は、第２の層の「世代２」ペプチドモチーフを指す。「Ｇ３」は、第３の層の「世代３」ペプチドモチーフを指す。）

【0106】

したがって、本発明は、医薬における使用のための、本明細書に記載される核酸と、脂質と、デンドリマーと、を含む、組成物を提供する。デンドリマーは、第１世代デンドリマー、又は第２世代デンドリマー、又は第３世代デンドリマーであってもよい。好ましくは、核酸の量（骨格中の１－荷電リン酸基の数Ｐによって測定される）に対するペプチドの量（ペプチド上の１＋荷電窒素原子の数Ｎによって測定される）であるＮ／Ｐ比は、０．０５：１より大きく、例えば、０．１：１より大きい。（用語Ｎ／Ｐ比は、「Ｎ／Ｐ」、「Ｎ：Ｐ」、又は「ＮＰ」）と表すことができる。）いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、０．１５：１、又は約０．１５：１、又は少なくとも０．１５：１である。いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、０．１６：１、又は約０．１６：１、又は少なくとも０．１６：１である。いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、少なくとも１：１以上、例えば、約２：１以上、約２．５：１以上、約３：１以上、約４：１以上、約５：１以上、約１０：１、又は最大２０：１である。いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、約５：１、約８：１、約１０：１、又は約２０：１である。いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、約２：１～約２０：１、又は約２．５：１～約１０：１の範囲内である。

【0107】

組成物の脂質成分は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ、及び／又はＤＯＰＧを含んでもよい。

【0108】

脂質成分の量は、組成物中の核酸の量に対する重量：重量比（「ｗ／ｗ」又は「ｗ：ｗ」）で表すことができ、１：５０～５０：１の範囲内であり得る。より好ましくは、脂質の量（重量）は、核酸の量（重量）に対して１：１～５０：１、又は２：１～２０：１である。脂質：核酸比は、少なくとも２：１であり得る。最も好ましくは、脂質：核酸の重量：重量比は、約１０：１である。これらの比は、総脂質の重量を指す。本明細書に記載されるように、組成物は、２つ以上の脂質成分、例えば、２つ、３つ、又は４つの脂質の混合物を含む脂質を含んでもよい。脂質成分の重量は、これらの脂質成分の合計（合わせた）重量である。好ましくは、各脂質成分は、ほぼ等しい割合で混合される。

【0109】

関連して、本発明は、本明細書に記載される核酸、脂質、及び第１、第２、又は第３世代デンドリマー、並びに薬学的に許容される賦形剤、を含む、薬学的組成物を提供する。

【0110】

本発明の組成物の一部を形成する核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（antisense oligonucleotide、ＡＳＯ）であってもよい。好ましくは、ＡＳＯは、少なくとも２０ヌクレオチド長、少なくとも２５ヌクレオチド長、少なくとも３０ヌクレオチド長、少なくとも３５ヌクレオチド長であるか、又は本明細書の他の箇所に開示される核酸に関連して特定される長さ、例えば、少なくとも４０ヌクレオチド長を有する。

【0111】

本発明の組成物の一部を形成する核酸は、ｍＲＮＡ分子であってもよい。本発明の組成物の一部を形成する核酸は、ｌｎｃＲＮＡ分子であってもよい。本発明の組成物の一部を形成する核酸は、ＣＲＩＳＰＲ配列を含んでもよい。本発明の組成物の一部を形成する核酸は、二本鎖領域を含んでもよい。核酸は、ｓｉＲＮＡ分子であってもよい。核酸は、小活性化ＲＮＡ（small activating RNA、ｓａＲＮＡ）分子であってもよい。核酸は、自己増幅ＲＮＡ分子であってもよい。核酸は、標的細胞においてｓｉＲＮＡ又はｓａＲＮＡ分子を発現することができるＤＮＡプラスミドであってもよい。核酸は、ＤＮＡプラスミド（直鎖状又は環状）、例えば、標的細胞において導入遺伝子を発現することができるプラスミドであってもよい。

【0112】

導入遺伝子は、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、又は哺乳動物に寄生する微生物のタンパク質であってもよい。ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、又は寄生微生物タンパク質を発現する組成物は、ワクチンとして使用され得る。例えば、有効量の組成物を対象に全身的に（例えば、静脈内に）送達して、対象の骨格筋におけるウイルスタンパク質、細菌タンパク質、又は寄生微生物タンパク質の発現を達成し、そのウイルスタンパク質、細菌タンパク質、又は寄生タンパク質に対する免疫応答をプライミングしてもよい。したがって、本発明は、対象にワクチン接種する方法、及び対象のワクチン接種における使用のための組成物を提供する。そのような例において、導入遺伝子は、本明細書に記載される免疫細胞、例えば、白血球、例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、単球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、又は単球；リンパ節組織細胞において発現され得る。

【0113】

導入遺伝子は、遺伝子療法における使用のための治療用タンパク質を発現し得る。遺伝子療法は、患者における遺伝性障害を治療するためのものであってもよい。遺伝性障害は、患者における単一遺伝子障害、例えば、筋ジストロフィーであってもよい。単一遺伝子障害が筋ジストロフィーである実施形態では、導入遺伝子は、ジストロフィンであってもよい。障害が虚血である実施形態では、導入遺伝子は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）であってもよい。障害が筋肉消耗性である実施形態では、導入遺伝子は、フォリスタチンであってもよい。障害が神経筋疾患である実施形態では、導入遺伝子は、酸性α－グルコシダーゼ（α-glucosidase、ＧＡＡ）であってもよい。導入遺伝子は、本明細書に開示される組織のうちの１つ以上において発現され得るが、発現されたタンパク質は、組織から循環中に分泌され得る。

【0114】

本発明は、ミオパチーを治療するための核酸療法を送達するために使用できることが想定される。また、本発明は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー、遺伝性筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、及び遠位型ミオパチーなどの筋ジストロフィーを治療するための核酸療法を送達するために使用できることも想定される。

【0115】

核酸療法は、悪液質などの筋肉消耗状態を治療するためのものであってもよい。核酸療法は、遺伝性筋障害、例えば、先天性筋緊張症、又は家族性周期性四肢麻痺などの他の筋障害を治療するためのものであってもよい。核酸療法は、運動ニューロン疾患、例えば、ＡＬＳ（amyotrophic lateral sclerosis、筋萎縮性側索硬化症）、球脊髄性筋萎縮症（spinal-bulbar muscular atrophy、ＳＢＭＡ）、又は脊髄性筋萎縮症（spinal muscular atrophy、ＳＭＡ）を治療するためのものであってもよい。核酸療法は、フリードライヒ運動失調症（Friedreich’s ataxia、ＦＡ）などのミトコンドリア病、又はカーンズ・セイヤー症候群（Kearns-Sayre syndrome、ＫＳＳ）、リー脳症（亜急性壊死性脳筋症）、ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス及び卒中様発作（mitochondrial encephalomyopathy,lactic acidosis and stroke-like episode、ＭＥＬＡＳ）、ミトコンドリア神経胃腸管脳筋症（mitochondrial neurogastrointestinal encephalomyopathy、ＭＮＧＩＥ）、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌス脳筋症（myoclonus epilepsy with ragged red fibers、ＭＥＲＲＦ）、神経障害、運動失調及び網膜色素変性（neuropathy, ataxia and retinitis pigmentosa、ＮＡＲＰ）、ピアソン症候群、若しくは進行性外眼筋麻痺（progressive external opthalmoplegia、ＰＥＯ）などのミトコンドリアミオパチーを治療するためのものであってもよい。核酸療法は、先天性ミオパチー、例えば、ｃａｐミオパチー、中心核ミオパチー、筋線維タイプ不均等症を伴う先天性ミオパチー、コアミオパチー、セントラルコア病、マルチミニコアミオパチー、ミオシン蓄積ミオパチー、ミオチュブラーミオパチー、又はネマリンミオパチーを治療するためのものであってもよい。核酸療法は、ＧＮＥミオパチー／野中ミオパチー／遺伝性封入体ミオパチー（hereditary inclusion-body myopathy、ＨＩＢＭ）、Ｌａｉｎｇ型遠位型ミオパチー、Ｍａｒｋｅｓｂｅｒｙ－Ｇｒｉｇｇｓ遅発性遠位型ミオパチー、三好ミオパチー、Ｕｄｄミオパチー／頸骨筋ジストロフィー、ＶＣＰミオパチー／ＩＢＭＰＦＤ、声帯及び咽頭遠位型ミオパチー、又はＷｅｌａｎｄｅｒ遠位型ミオパチーなどの遠位型ミオパチーを治療するためのものであってもよい。核酸療法は、甲状腺機能亢進性ミオパチー又は甲状腺機能低下性ミオパチーなどの内分泌性ミオパチーを治療するためのものであってもよい。核酸療法は、皮膚筋炎、封入体筋炎、又は多発性筋炎などの炎症性ミオパチーを治療するためのものであってもよい。核酸療法は、酸性マルターゼ欠損症（Acid maltase deficiency、ＡＭＤ、ポンペ病）、カルニチン欠損症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠損症、脱分枝酵素欠損症（debrancher enzyme deficiency）（コリ病、フォーブス病）、乳酸デヒドロゲナーゼ欠損症、ミオアデニレートデアミナーゼ欠損症、ホスホフルクトキナーゼ欠損症（垂井病）、ホスホグリセレートキナーゼ欠損症、ホスホグリセレートムターゼ欠損症、又はホスホリラーゼ欠損症（ＭｃＡｒｄｌｅ病）などの代謝性ミオパチーを治療するためのものであってもよい。核酸療法は、筋原線維性ミオパチー又は肩甲腓骨型ミオパチーを治療するためのものであってもよい。核酸療法は、先天性筋無力症候群（congenital myasthenic syndrome、ＣＭＳ）、ランバート・イートン筋無力症候群（Lambert-Eaton myasthenic syndrome、ＬＥＭＳ）、又は重症筋無力症（myasthenia gravis、ＭＧ）などの神経筋接合部疾患を治療するためのものであってもよい。核酸療法は、シャルコー・マリー・トゥース病（Charcot-Marie-Tooth disease、ＣＭＴ）又は巨大軸索神経障害（giant axonal neuropathy、ＧＡＮ）などの末梢神経疾患を治療するためのものであってもよい。核酸療法は、閉塞性血栓性血管炎／バージャー病、糖尿病性末梢神経障害（ＡＬＳ、重症下肢虚血、及び足部潰瘍においても試験される）、末梢動脈疾患、下肢虚血、重症下肢虚血（包括的高度慢性下肢虚血及び糖尿病性下肢虚血としても知られる）、重症末梢動脈閉塞性疾患（peripheral artery occlusive disease、ＰＡＯＤ）、又は間欠性跛行／動脈硬化などの心臓血管疾患を治療するためのものであってもよい。核酸療法は、ＣＯＶＩＤ－１９、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、エボラ及びマールブルグウイルス、ウエストナイル熱、ＳＡＲＳ、鳥インフルエンザ、ＨＰＶ、サイトメガロウィルス、又はマラリアなどの感染疾患を治療するためのものであってもよい。核酸療法は、肉腫、黒色腫、乳がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、肝臓がん、急性骨髄性白血病、又はＢ細胞リンパ腫などのがんを治療するためのものであってもよい。核酸療法は、落花生アレルギーなどのアレルギーを治療するためのものであってもよい。核酸療法は、多発性硬化症（multiple sclerosis、ＭＳ）を治療するためのものであってもよい。核酸療法は、骨髄異形成症候群（myelodysplastic syndrome、ＭＤＳ）を治療するためのものであってもよい。

【0116】

ポンペ病は、グリコーゲンから末端α１－４及びα１－６グルコースを切断するリソソーム酵素であるヒト酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）の欠損に起因する。本発明の組成物は、ポンペ病を治療するために使用され得る。ＧＡＡをコードする核酸を含む本発明の組成物は、対象の標的組織に核酸を送達し、本明細書に記載される標的組織、特に肝臓及び骨格筋においてＧＡＡを発現させるために、ポンペ病に罹患している対象に投与され得る。酵素は、組織から循環中に分泌され得る。

【0117】

フォリスタチンは、骨格筋成長を抑制し、筋肉消耗を促進するＴＧＦ－βスーパーファミリーリガンドの阻害剤である。フォリスタチンをコードする核酸を含む本発明の組成物は、核酸を対象の標的組織に送達し、本明細書に記載される標的組織、特に肝臓及び骨格筋においてフォリスタチンを発現させるために、筋肉消耗障害に罹患している対象に投与され得る。タンパク質は、組織から循環中に分泌され得る。

【0118】

したがって、本発明は、このような障害を治療するための方法、及びこのような治療における使用のための組成物を提供する。

【0119】

デンドリマーのコアペプチドモチーフは、単一のアミノ酸残基又はジペプチド若しくはトリペプチドモチーフなどの短いペプチドモチーフである。コア配列は、任意のアミノ酸（Ｌ－及び／若しくはＤ－異性体）、例えば、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、プロリン（Ｐ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アルギニン（Ｒ）、並びに／又はヒスチジン（Ｈ）を含んでもよい。コア配列はまた、天然に存在しないアミノ酸（Ｌ－及び／若しくはＤ－異性体）、例えば、ベータ－アラニン（Ｂ）及び／又はアミノヘキサン酸（Ｘ）を含んでもよい。コアがトリペプチドモチーフである場合、コアは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、及びシステイン（Ｃ）又はアラニン（Ａ）のいずれかを含んでもよい。好ましくは、コアは、ヒスチジン（Ｈ）などのイオン化可能な残基を含む。コア配列は、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びシステイン（Ｃ）を含んでもよい。コア配列は、アルギニン（Ｒ）又はグリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）又はセリン（Ｓ）、及びシステイン（Ｃ）又はアラニン（Ａ）を含んでもよい。例えば、コア配列は、ＧＳＣ又はＲＨＣであってもよい。トリペプチドモチーフは、アラニン（Ａ）、リジン（Ｋ）、及びロイシン（Ｌ）を含んでもよい。例えば、コア配列は、ＫＬＡであってもよい。コアペプチドは、更なる部分、例えば、細胞特異的標的化ペプチドと共有結合してもよく、又は脂質分子で誘導体化されてもよい。デンドリマー、例えば、コアペプチドモチーフのアミノ酸のうちの１つ、いくつか、又は全ては、更なる部分、例えば、抗体、細胞特異的標的化ペプチド、糖リガンド、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、及びＧａｌＮＡｃ（若しくはそれらを含むグリカン）、並びに／又は脂質置換基と共有結合してもよい。当業者は、溶解性又は核酸結合特徴に悪影響を及ぼさない更なる部分を容易に選択することができる。

【0120】

組成物の脂質成分は、カチオン性脂質を含む脂質の混合物を含んでもよい。例えば、脂質成分は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及びＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を含んでもよい。ＤＯＰＥ：ＤＯＴＭＡ比は、所定の用途に最適な特性について容易に決定できるが、通常、１：５～５：１の範囲であろう。

【0121】

好ましくは、その範囲は、３：１～１：３又は２：１～１：２である。最も好ましくは、ＤＯＰＥ：ＤＯＴＭＡ比は、１：１である。他の実施形態では、脂質は、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）を、例えば、単独の脂質として、又はＤＯＰＥと組み合わせて含む。

【0122】

他の実施形態では、組成物の脂質成分は、ＤＯＰＥ及びＤＯＴＭＡに加えて（又はその代わりに）他の脂質を含んでもよい。例示的な脂質成分を、以下に示す。

【0123】

カチオン性脂質：
Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）
１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパンクロリド（1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride、ＤＯＴＡＰ）
２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－（２［スペルミン－カルボキサミド］エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパナミニウムトリフルオロアセテート（2,3-dioleyloxy-N-(2[spermine-carboxamido]ethyl)-N,N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate、ＤＯＳＰＡ）
３ｐ－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール塩酸塩（3p-[N-(N’,N’-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride、ＤＣ－ｃｈｏｌ）

【0124】

中性脂質：
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、ＤＯＰＣ）
コレステロール

【0125】

陰イオン性脂質：
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）

【0126】

イオン化可能な脂質：
ＤＬｉｎ－ＤＭＡ
ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ
ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ

【0127】

他の可能性のある脂質としては、４－（２－アミノエチル）－モルホリノ－コレステロール－ヘミスクシネート、（4-(2-aminoethyl)-morpholino-cholesterol-hemisuccinate、ＭｏＣｈｏｌ）コレステロールヘミスクシネート（cholesterolhemisuccinate、ＣＨＥＭＳ）、ホスファチジルコリン（phosphatidylcholine、ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（phosphatidylethanolamine、ＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（dimyristoylphosphatidylcholine、ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（dipalmitoylphosphatidylcholine、ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（distearoylphosphatidylcholine、ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（dimyristoylphosphatidylethanolamine、ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（dipalmitoylphosphatidylethanolamine、ＤＰＰＥ）、コレステロール－（３－イミダゾール－１－イルプロピル）カルバメート（cholesterol-(3-imidazol-1-yl propyl)carbamate、ＣＨＩＭ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（dimethyldioctadecylammonium bromide、ＤＤＡＢ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（dioleoylphosphatidylserine、ＤＯＰＳ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、コレステロールスルフェート（cholesterol sulfate、ｃｈｏｌ－ＳＯ_４）が挙げられる。

【0128】

前述の脂質のいずれも、本発明の組成物において単独で、又は互いに組み合わせて使用することができることが想定される。更に、脂質は、ＰＥＧ２０００などのＰＥＧ基への連結を介して誘導体化することができる。

【0129】

本発明は、核酸を標的細胞内へ送達する方法であって、標的細胞を本発明の組成物と接触させることを含む、方法を提供する。標的細胞は、筋細胞、肝細胞、星細胞、ニューロン、アストロサイト、脾細胞、肺細胞、心筋細胞、腎細胞、脂肪細胞、骨髄由来サプレッサ細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ若しくは腫瘍関連好中球、幹細胞、又は腫瘍細胞であってもよい。この方法は、インビトロで実施してもよい。細胞は、患者から得られたものであってもよく、細胞は、方法が実施された後に患者に投与されてもよく、すなわち、方法は、エクスビボであってもよい。あるいは、この方法は、医学的使用又は処理の一部としてインビボで実施してもよい。この方法は、クラスリン媒介性エンドサイトーシス、カベオラ媒介性エンドサイトーシス、及び／又はミクロピノサイトーシスを介する細胞侵入を含む。このようなインビボ処理は、特定の標的組織（複数可）、例えば、対象の筋肉及び／又は肝臓へ核酸を送達するために、対象に組成物を投与することを包含し得る。組成物は、単回用量として、又は２回以上の用量として投与することができる。

【0130】

本発明はまた、表２に示されるものなどの新規なデンドリマーを提供する。いくつかの実施形態では、デンドリマーは、第３世代デンドリマー、例えば、Ｇ１，２，３－ＬＲデンドリマー、Ｇ１，２，３－ｒｌデンドリマー、Ｇ１－ＬＲ，Ｇ２，３－ＲＬデンドリマー、Ｇ１，２－ＲＬ，Ｇ３－ＬＲデンドリマー、及びＧ１，２－ＬＲ，Ｇ３－ＲＬデンドリマーであり、これらは、集合的に、第１のリジン残基及び２つの第１のジペプチドモチーフと、２つの第２のリジン残基及び４つの第２のジペプチドモチーフと、４つの第３のリジン残基及び８つの第３のジペプチドモチーフと、第１のリジン残基と共有結合したコアペプチド配列と、を含むペプチドデンドリマーであって、（ｉ）第１のリジン残基が、２つの第１のジペプチドモチーフと共有結合し、２つの第１のジペプチドモチーフがそれぞれ、２つの第２のリジン残基と共有結合し、（ｉｉ）各第２のリジン残基が、２つの第２のジペプチドモチーフと共有結合し、各第２のペプチドモチーフがそれぞれ、第３のリジン残基のうちの１つと共有結合し、（ｉｉｉ）各第３のリジン残基が、第３のジペプチドモチーフのうちの２つと共有結合し、第１、第２、及び第３のジペプチドモチーフが各々、ロイシン（Ｌ）及びアルギニン（Ｒ）を含み、第１、第２、及び第３のジペプチドモチーフのうちの少なくとも１つが、ロイシン－アルギニン（ＬＲ）ジペプチドモチーフからなる（「ＬＲ」モチーフは標準的なＮ末端からＣ末端への慣例に従って記載される）、ペプチドデンドリマーとして定義され得る。各アミノ酸残基は、独立して、Ｌ－アイソフォーム又はＤ－アイソフォームから選択される。これらの新規デンドリマーは、本発明の組成物の一部を形成することができ、本明細書に開示される本発明の他の態様において使用することができる。

【0131】

本発明は、記載された態様及び好ましい特質の組み合わせを、そのような組み合わせが明らかに許容されないか又は明示的に回避される場合を除いて含む。

【図面の簡単な説明】

【0132】

次に、本発明の原理を示す実施形態及び実験について、添付の図面を参照しながら説明する。

【図1】ＤＮＡ送達のための異なるリジン及びロイシン配置を有するデンドリマーのトランスフェクション効率の比較。世代内のリジン及びロイシンの位置の変更は、（Ａ）ＨｅＬａ又は（Ｂ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるトランスフェクション効率を有意に変化させない。デンドリマーＧ１，２，３－ＫＬのそのバリアント、例えば、Ｇ１，２，３－Ｋ（全てのロイシンが除去されたＧ１，２，３－ＫＬのバージョン）への構造的修飾、及び全てのＬ型アミノ酸のＤ型への置換は、（Ｃ）ＨｅＬａ又は（Ｄ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるトランスフェクション効率を有意に変化させない。（Ｅ）ＨｅＬａ又は（Ｆ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞において、Ｇ０，１，２，３－ＫＬ（ＫＬモチーフを有する第０世代のＧ１，２，３－ＫＬのバージョン）の場合、有意差はない。条件：１×１０^４個の細胞に０．２５μｇのｐＣＩ－Ｌｕｃをトランスフェクトした。エラーバーは、三回行われた実験についての平均±ＳＥＭを指す。Ｄ／Ｄは、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥである。

【図2】ＤＮＡ送達についての、異なる世代（Ｇ１、Ｇ２、及びＧ３）並びにカチオン性残基（例えば、ＫＬ対ＲＬ）を有するデンドリマーのトランスフェクション効率の比較。（Ａ）ＨｅＬａ細胞におけるトランスフェクション効率、（Ｂ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるトランスフェクション効率。Ｄ／Ｄを有するペプチドデンドリマーの存在下でルシフェラーゼ発現プラスミド（ｐＣＩ－Ｌｕｃ）をトランスフェクトされた細胞（トランスフェクションの２４時間後に測定）。発光値を、Ｄ／Ｄ ＤＮＡ複合体（ｗ／ｗ １：１、０．２５μｇ）で処理した細胞についての類似値で割ることによって正規化して、トランスフェクションの％を得た。条件：１×１０^４個の細胞に０．２５μｇのｐＣＩ－Ｌｕｃをトランスフェクトした。エラーバーは、三回行われた実験についての平均±ＳＥＭを指す。^＊は、ｐ＜０．０５を示す。Ｄ／Ｄは、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥである。

【図3】ＤＮＡ送達のための、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ、ポリエチレンイミン、及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を含む他の市販のトランスフェクション試薬を用いたＧ１，２，３－ＲＬのトランスフェクション効率の比較。（Ａ）血清の非存在下でのＨｅＬａ細胞におけるトランスフェクション、（Ｂ）血清の存在下でのＨｅＬａ細胞におけるトランスフェクション、（Ｃ）血清の非存在下でのＮｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるトランスフェクション、及び（Ｄ）血清の存在下でのＮｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるトランスフェクション。Ｄ／Ｄを有するＧ１，２，３－ＲＬの存在下でルシフェラーゼ発現プラスミド（ｐＣＩ－Ｌｕｃ）をトランスフェクトされた細胞（トランスフェクションの２４時間後に測定）。発光値を、Ｄ／Ｄ ＤＮＡ複合体で処理した細胞についての類似値で割ることによって正規化して、トランスフェクションの％を得た。条件：１×１０^４個の細胞に、０．２５μｇのｐＣＩ－Ｌｕｃを４時間、無血清又は１０％血清中でトランスフェクトした。エラーバーは、三回行われた実験についての平均±ＳＥＭを指す。Ｇ１，２，３－ＲＬは、ＨｅＬａ及びＮｅｕｒｏ２Ａ細胞において他の試薬よりも有意に強力なトランスフェクションを媒介する。^＊は、ｐ＜０．０５を示し、^＊＊＊は、ｐ＜０．００１を示し、^＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を示す。Ｄ／Ｄは、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥである。

【図4】血清条件でのＤＮＡ送達についての、異なる世代（Ｇ１、Ｇ２、及びＧ３）並びにカチオン性残基（例えば、ＫＬ対ＲＬ）を有するデンドリマーのトランスフェクション効率の比較。（Ａ）ＨｅＬａ細胞におけるトランスフェクション効率、（Ｂ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるトランスフェクション効率。Ｄ／Ｄを有するペプチドデンドリマーの存在下でルシフェラーゼ発現プラスミド（ｐＣＩ－Ｌｕｃ）をトランスフェクトされた細胞（トランスフェクションの２４時間後に測定）。発光値を、Ｄ／Ｄ ＤＮＡ複合体（ｗ／ｗ １：１、０．２５μｇ）で処理した細胞についての類似値で割ることによって正規化して、トランスフェクションの％を得た。条件：１×１０^４個の細胞に、０．２５μｇのｐＣＩ－Ｌｕｃを４時間、１０％血清中でトランスフェクトした。エラーバーは、三回行われた実験についての平均±ＳＥＭを指す。Ｇ１，２，３－ＲＬ（Ｎ／Ｐ：５～２０）は、ＨｅＬａ及びＮｅｕｒｏ２Ａ細胞の両方において、他の群よりも有意に強力なトランスフェクションを媒介する。^＊は、ｐ＜０．０５を示す。Ｇ１，２，３－ＲＬ（Ｎ／Ｐ：１０、２０）は、他の群よりも有意に強力なトランスフェクションを媒介する。^＊＊＊は、ｐ＜０．００１を示す。Ｄ／Ｄは、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥである。

【図5】Ｇ１，２，３－ＲＬ－Ｄ／Ｄ－ＤＮＡナノ粒子の細胞取り込み経路。クロルプロマジンは、クラスリン媒介性エンドサイトーシスを阻害する。ゲニステイン及びロットレリンは、カベオラ媒介性エンドサイトーシス及びミクロピノサイトーシスをそれぞれ阻害する。

【図6】Ｄ／Ｄ及びフォリスタチンを発現するプラスミドＤＮＡとともにＧ１，２，３－ＲＬを含む組成物の静脈内投与後の骨格筋におけるフォリスタチン発現。マウスにＧ１，２，３－ＲＬ複合体を２回注射し、組織を採取して、フォリスタチンのｍＲＮＡ発現レベルをｑＰＣＲによってアッセイした。

【図7】開示された組成物の静脈内投与後のマウスの体重。

【図8】ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ＤＮＡに対してｗ／ｗ＝１：１）及びルシフェラーゼを発現するミニサークルＤＮＡとともにＧ１，２，３－ＲＬ又はＧ１，２，３－ＬＲを含む組成物の静脈内投与後のマウス組織におけるルシフェラーゼ発現。組成物を、２０：１のＮＰ比で注射した。マウスに組成物を注射し、２４時間後に組織を採取して、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓、及び骨格筋におけるルシフェラーゼシグナルを測定した。

【図9】ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ＤＮＡに対してｗ／ｗ＝１：１）及びルシフェラーゼを発現するミニサークルＤＮＡとともにＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲを含む組成物の筋肉内投与後のマウス骨格筋におけるルシフェラーゼ発現。組成物を、２０：１のＮＰ比で注射した。マウスに組成物を注射し、４８時間後に骨格筋組織を採取してルシフェラーゼシグナルを測定した。

【図10】ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）及びルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡとともにＧ１，２，３－ＲＬ（上パネル）又はＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（下パネル）を含む組成物の静脈内投与後のマウス組織におけるルシフェラーゼ発現。各デンドリマー組成物を、８：１及び０．１５：１のＮＰ比で注射した。マウスに組成物を注射し、６時間後に組織を採取して、筋肉（腓腹筋）、肝臓、肺、心臓、脾臓、腎臓、脂肪組織、脳、頸部リンパ節、及び鼠径リンパ節におけるルシフェラーゼシグナルを測定した。Ｇ１，２，３－ＲＬ及びＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲを含む組成物は、０．１５：１のＮＰ比で注射された場合、肺、脾臓、及びリンパ節を含む免疫細胞に富む組織にｍＲＮＡを送達することができる。ＮＰ８：１で注射されたＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲは、脾臓へのｍＲＮＡの送達を標的とすることができる。

【図11】ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）及びルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡとともにＧ１，２，３－ＲＬ（上パネル）又はＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（下パネル）を含む組成物の静脈内投与後のマウス組織におけるルシフェラーゼ発現。各デンドリマー組成物を、８：１及び０．１５：１のＮＰ比で注射した。マウスに組成物を注射し、６時間後に組織を採取して、筋肉（腓腹筋）、肝臓、心臓、腎臓、脂肪組織、及び脳におけるルシフェラーゼシグナルを測定した。

【図12】ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）及びルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡとともにＧ１，２，３－ＲＬ又はＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲを含む組成物のＮＰ比８：１での静脈内投与後のマウス組織におけるルシフェラーゼ発現の比較。マウスに組成物を注射し、６時間後に組織を採取して、筋肉（腓腹筋）、肝臓、肺、心臓、脾臓、腎臓、脂肪組織、脳、頸部リンパ節、及び鼠径リンパ節におけるルシフェラーゼシグナルを測定した（図１２Ａ、上パネル）。同じデータが、肺、頸部リンパ節、及び鼠径リンパ節（図１２Ａ、下パネル）と、筋肉（腓腹筋）、肝臓、心臓、腎臓、脂肪組織、及び脳（図１２Ｂ）との間の比較を可能にするために提示される。ＮＰ比８：１で注射されたＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲを含む組成物は、ＮＰ比８：１で注射されたＧ１，２，３－ＲＬと比較してより高い効率で免疫細胞に富む組織にｍＲＮＡを送達することができる。

【図13】ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）及びルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡとともにＧ１，２，３－ＲＬを含む２用量の組成物の静脈内投与後のマウス組織におけるルシフェラーゼ発現。デンドリマー組成物を、ＮＰ比＝０．１５：１で注射した。マウスに組成物を注射し、６時間後に組織を採取して、筋肉（腓腹筋）、肝臓、肺、心臓、脾臓、腎臓、脂肪組織、脳、頸部リンパ節、及び鼠径リンパ節におけるルシフェラーゼシグナルを測定した。

【図14】ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）及びルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡとともにＧ１，２，３－ＲＬ、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ、又はＮＴＸ１を含む組成物の静脈内投与後のマウス組織におけるルシフェラーゼ発現。各デンドリマー組成物を、０．１５：１のＮＰ比で注射した。マウスに組成物を注射し、６時間後に組織を採取して、筋肉（腓腹筋）、肝臓、肺、心臓、脾臓、腎臓、脂肪組織、脳、頸部リンパ節、及び鼠径リンパ節におけるルシフェラーゼシグナルを測定した。骨格筋標的化ドメイン及び細胞透過性ペプチドドメインを含むＮＴＸ１を含む組成物は、Ｇ１，２，３－ＲＬ及びＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲを含む組成物と比較してより高い効率で免疫細胞に富む組織にｍＲＮＡを送達することができる。

【図15】ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）及びルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡとともにＧ１，２，３－ＲＬ、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ、又はＮＴＸ１を含む組成物の静脈内投与後の、デンドリマーを含まない、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）及びルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡを含む組成物を注射したマウスと比較した、マウス組織におけるルシフェラーゼ発現。各デンドリマー組成物を、０．１５：１のＮＰ比で注射した。マウスに組成物を注射し、６時間後に組織を採取して、筋肉（腓腹筋）、肝臓、肺、心臓、脾臓、腎臓、脂肪組織、脳、頸部リンパ節、及び鼠径リンパ節におけるルシフェラーゼシグナルを測定した。

【図16】ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）及びルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡとともにＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲを含む組成物の静脈内投与後の、デンドリマーを含まない、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）及びルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡを含む組成物を注射したマウスと比較した、マウス組織におけるルシフェラーゼ発現。デンドリマー組成物を、ＮＰ比＝８：１で注射した。マウスに組成物を注射し、６時間後に組織を採取して、筋肉（腓腹筋）、肝臓、肺、心臓、脾臓、腎臓、脂肪組織、脳、頸部リンパ節、及び鼠径リンパ節におけるルシフェラーゼシグナルを測定した。ＮＴＸ１、Ｇ１，２，３－ＲＬ、及びＧ１，２－ＲＬ、３ＬＲを含む組成物は各々、ｍＲＮＡ単独を含む組成物又はＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ及びｍＲＮＡを含む組成物と比較して、全ての組織へのｍＲＮＡの送達の増加を示す。

【図17】デンドリマー組成物又は市販のトランスフェクション試薬をトランスフェクトした後のＨｅＬａ又はＣ２Ｃ１２細胞におけるルシフェラーゼ及びｅＧＦＰ発現。１）ルシフェラーゼｍＲＮＡ単独、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（ＮＰ＝０．１６：１）、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）、及びルシフェラーゼｍＲＮＡを含む組成物、若しくはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）及びルシフェラーゼｍＲＮＡを含む組成物（左上パネル）、又は２）ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ単独、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（ＮＰ＝０．１６：１）、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）、及びｅＧＦＰ ｍＲＮＡを含む組成物、若しくはＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＤＭＧ－ＰＥＧ脂質ナノ粒子及びｅＧＦＰ ｍＲＮＡを含む組成物（右上パネル）を、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。ルシフェラーゼｍＲＮＡ単独、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（ＮＰ＝８：１）、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）、及びルシフェラーゼｍＲＮＡを含む組成物、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）及びルシフェラーゼｍＲＮＡ又はポリエチレンイミン及びルシフェラーゼｍＲＮＡを含む組成物（下パネル）を、Ｃ２Ｃ１２細胞にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ及びｅＧＦＰ発現をトランスフェクションの２４時間後に測定した。本発明のペプチドデンドリマーは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００及びＬＮＰなどの市販のトランスフェクション試薬と比較して、インビトロでＨｅＬａ細胞をトランスフェクトする際により効率的である。

【図18】ＮＰ比０．１５：１又は８：１で蛍光標識されたｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡを、又はＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲを蛍光標識されたｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡとともに、トランスフェクトした後のＨｅＬａ細胞におけるＲＮＡトランスフェクション効率。ｓｇＲＮＡをＴＭ－ローダミンで標識し、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをＣｙ５フルオロフォアで標識した。細胞を２時間トランスフェクトし、フローサイトメトリーによってアッセイした。Ｇ１，２－ＲＬ、３ＬＲを含む組成物に曝露されたＨｅＬａ細胞の１００％が、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡについて二重陽性であり、これは、極めて高いトランスフェクション効率を実証している。

【図19】ＮＰ比０．１５：１又は８：１で、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）、ｃｒＲＮＡ、及びＣａｓ９ ｍＲＮＡを、又はＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲをｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、及びＣａｓ９ ｍＲＮＡとともに、トランスフェクトした後のＨｅＬａ細胞におけるＲＮＡトランスフェクション効率。ｔｒａｃｒＲＮＡをＡＴＴＯ ５５フルオロフォアで標識した。ｃｒＲＮＡをフルオレセインで標識し、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをＣｙ５フルオロフォアで標識した。細胞を２時間トランスフェクトし、フローサイトメトリーによってアッセイした。

【図20】ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）、ｃｒＲＮＡ、又はＣａｓ９ ｍＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした後のＨｅＬａ細胞におけるＲＮＡトランスフェクション効率。細胞には、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲをトランスフェクトした、又はトランスフェクトしなかった。ｔｒａｃｒＲＮＡをＡＴＴＯ ５５フルオロフォアで標識した。ｃｒＲＮＡをフルオレセインで標識し、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをＣｙ５フルオロフォアで標識した。細胞を２時間トランスフェクトし、フローサイトメトリーによってアッセイした。

【図21】脾臓内の免疫細胞へのｍＲＮＡ送達。マウスに、ｍＲＮＡ単独、又はｍＲＮＡとＮＴＸ１（ＮＰ＝０．１５：１）、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（ＮＰ＝０．１５：１）、若しくはＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（ＮＰ＝８：１）のいずれかとを静脈内注射した。ｍＲＮＡをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で標識した。脾臓を、処理のために注射の２時間後にマウスから採取した。脾臓に存在する広範囲の免疫細胞へのｍＲＮＡの送達は、ＮＴＸ１、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（ＮＰ８：１）、又はＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（ＮＰ０．１５：１）を含む組成物を使用して可能である。

【図22】骨髄内の免疫細胞へのｍＲＮＡ送達。マウスに、ｍＲＮＡ単独、又はｍＲＮＡとＮＴＸ１（ＮＰ＝０．１５：１）、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（ＮＰ＝０．１５：１）、若しくはＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（ＮＰ＝８：１）のいずれかとを静脈内注射した。ｍＲＮＡをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で標識した。骨髄を、処理のために注射の２時間後にマウスから採取した。

【図23】血液内の免疫細胞へのｍＲＮＡ送達。マウスに、ｍＲＮＡ単独、又はｍＲＮＡとＮＴＸ１（ＮＰ＝０．１５：１）、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（ＮＰ＝０．１５：１）、若しくはＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（ＮＰ＝８：１）のいずれかとを静脈内注射した。ｍＲＮＡをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で標識した。血液を、処理のために注射の２時間後にマウスから採取した。血液中に存在する広範囲の免疫細胞へのｍＲＮＡの送達は、ＮＴＸ１、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（ＮＰ８：１）、又はＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（ＮＰ０．１５：１）を含む組成物を使用して可能である。

【図24】リンパ節内の免疫細胞へのｍＲＮＡ送達。マウスに、ｍＲＮＡ単独、又はｍＲＮＡとＮＴＸ１（ＮＰ＝０．１５：１）、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（ＮＰ＝０．１５：１）、若しくはＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（ＮＰ＝８：１）のいずれかとを静脈内注射した。ｍＲＮＡをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で標識した。リンパ節を、処理のために注射の２時間後にマウスから採取した。

【図25】ＨｅＬａ及びＣ２Ｃ１２細胞へのインビトロＤＮＡ送達。ＤＮＡ単独、Ｇ１，２，３－ＲＬ（Ｎ：Ｐ＝５：１）及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ＤＮＡに対してｗ／ｗ＝１：１）とＤＮＡ、並びにＧ１，２，３－ＲＬ（Ｎ：Ｐ＝５：１）及びＤＯＰＧ／ＤＯＰＥ（ＤＮＡに対してｗ／ｗ＝１：１）とＤＮＡ（上のパネル）、のいずれかをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。ＤＮＡ単独、ポリエチレンイミンとＤＮＡ、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（Ｎ：Ｐ＝８：１）及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ＤＮＡに対してｗ／ｗ＝１：１で）とＤＮＡ、並びにＮＴＸ２（Ｎ：Ｐ＝８：１）及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ＤＮＡに対してｗ／ｗ＝１：１）とＤＮＡ（下のパネル）、のいずれかを、Ｃ２Ｃ１２細胞（筋肉由来細胞株）にトランスフェクトした。両方の実験で使用したＤＮＡは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする。ＮＴＸ２は、筋標的化ペプチドＡＳＳＬＩＮＡ（（ＬＲ）８（ＫＲＬ）４（ＫＲＬ）２ＫＧＳＣＧＡＡＳＳＬＮＩＡ（Ａｃｐ）－ＮＨ２）にコンジュゲートされたＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲデンドリマーである。

【図26】ｍＲＮＡ製剤投与後のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（Aspartate transaminase、ＡＳＴ、２６Ａ、上パネル）、ＴＮＦ－α（２６Ａ、下パネル）、ＩＬ－６（２６Ｂ、上パネル）、及びＩＬ－１β（２６Ｂ、下パネル）のレベル。マウスを、ｍＲＮＡ単独、又はｍＲＮＡ、デンドリマー、及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）のいずれかで処理した。ｍＲＮＡに対するデンドリマーのＮ：Ｐ比を、Ｘ軸に示す。２回投与されたＧ１，２，３－ＲＬ及びＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲとは別に、全ての製剤を１回投与した。２用量を注射したマウスについては、１回目の用量を、２回目の用量の２４時間前に注射した。ＡＳＴ又はサイトカインレベルの測定のために、２回目の投与の６時間後にマウスの血漿を採取した。１回投与したマウスについては、ＡＳＴ及びサイトカインレベルの測定のために、投与の６時間後に血漿を採取した。インビボでｍＲＮＡを送達するための本発明のデンドリマーの使用は、有意な肝臓毒性又は有意な免疫反応を引き起こさない。

【図27】ＤＮＡ製剤投与後のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（左上パネル）、ＴＮＦ－α（右上パネル）、ＩＬ－６（左下パネル）、及びＩＬ－１β（右下パネル）のレベル。マウスを、ＤＮＡ単独、又はＧ１，２，３－ＲＬ及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ＤＮＡに対してｗ／ｗ＝１：１）のいずれかで処理した。全ての製剤を２回投与した後、血漿試料を採取し、ＡＳＴ又はサイトカインレベルを測定した。インビボでＤＮＡを送達するための本発明のデンドリマーの使用は、有意な肝臓毒性又は有意な免疫反応を引き起こさない。

【図28】インビトロでの脂質系によるペプチドデンドリマーのｍＲＮＡトランスフェクション。ｍＲＮＡ単独、又はｍＲＮＡとペプチドデンドリマー（Ｎ：Ｐ＝０．１６：１）及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）を、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。使用したｍＲＮＡは、ｅＧＦＰレポーター遺伝子を発現した。２４時間のトランスフェクション後、細胞を採取して、ｅＧＦＰ発現をアッセイした。ｅＧＦＰ発現を、各トランスフェクションのタンパク質の総量で正規化した。遺伝子発現レベルは、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ、及びｍＲＮＡ処理細胞のトランスフェクション値を正規化することによって計算した。様々なコアと、第１、第２、及び第３世代ペプチドモチーフと、を有する第１、第２、及び第３世代デンドリマーは、試験した条件下で細胞にｍＲＮＡを効果的にトランスフェクトすることができる。

【図29】インビトロでの脂質系によるペプチドデンドリマーのｍＲＮＡトランスフェクション。ｍＲＮＡ単独、又はｍＲＮＡとペプチドデンドリマー及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）を、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲのＮ：Ｐ比は０．１６：１であったが、他の全てのデンドリマーのＮ：Ｐ比は８：１であった。使用したｍＲＮＡは、ｅＧＦＰレポーター遺伝子を発現した。２４時間のトランスフェクション後、細胞を採取して、ｅＧＦＰ発現をアッセイした。ｅＧＦＰ発現を、各トランスフェクションのタンパク質の総量で正規化した。遺伝子発現レベルは、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ、及びｍＲＮＡ処理細胞のトランスフェクション値を正規化することによって計算した。様々なコアと、第１、第２、及び第３世代ペプチドモチーフと、を有する第１、第２、及び第３世代デンドリマーは、試験した条件下で細胞にｍＲＮＡを効果的にトランスフェクトすることができる。

【図30】ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）及びルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡとともにＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ又はＲＨＣＧ１－ＲＬ，２－ＬＲを含む組成物の静脈内投与後のマウス組織におけるルシフェラーゼ発現。デンドリマー組成物を、Ｎ：Ｐ比０．１５：１又は８：１のいずれかで注射した。マウスに組成物を注射し、６時間後に組織を採取して、筋肉（腓腹筋）、肝臓、肺、心臓、脾臓、腎臓、脂肪組織、脳、及びリンパ節におけるルシフェラーゼシグナルを測定した。世代２デンドリマーは、第３世代デンドリマーＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲよりも高い効率で脾臓及び肺へのｍＲＮＡ送達を標的とすることができる。

【図31】第３世代デンドリマーは、図式的に表される（左側にＮ末端及び右側にＣ末端を有する）。

【発明を実施するための形態】

【0133】

本発明の態様及び実施形態について、上で特定した図面及び以下に続く技術的定義を参照して説明する。更なる態様及び実施形態は、当業者には明らかであろう。本明細書で言及される全ての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0134】

現在の免疫療法応答率は約１５～２０％であり、治療転帰を改善する緊急の必要性が存在する。１つの戦略は、ｍＲＮＡを送達してタンパク質（ＣＥＢＰＡ、ＩＲＦ８、ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ、ＳＯＣＳ１、及び／又はＳＯＣＳ３など）を発現させて、腫瘍微小環境における骨髄細胞の免疫抑制表現型を元に戻すことであり、これは、免疫療法が応答性であるためのより好ましい環境を提供する。別の戦略は、ｍＲＮＡを腫瘍内の免疫細胞内に移入して、サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及び／又はインターフェロンなど）を発現させ、免疫細胞を活性化させてがん細胞と戦うことであり得る。マクロファージが活性化されて腫瘍細胞を殺傷することができるように、ｍＲＮＡをマクロファージに送達して、キメラ抗原受容体を発現させることも可能である。抗原提示細胞において腫瘍抗原を発現させるためにｍＲＮＡを送達することは、免疫系を活性化させてがん細胞を攻撃するのを助ける。これらの戦略は、全ての腫瘍、特に非小細胞肺がん、進行性黒色腫、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、胆管がん（Bile duct cancer）（胆管がん（Cholangiocarcinoma））、胆のうがん、神経内分泌腫瘍、肝細胞がん、結腸直腸がん、膵臓がん、及び固形腫瘍を治療するために適用することができる。

【0135】

核酸の送達
本発明の組成物は、本明細書中に記載される核酸をヒト又は動物の身体の特定の組織に送達するために使用できる。例えば、以下の組織に送達する。
１．骨格筋
２．肝臓
３．肺
４．心臓
５．白色脂肪組織
６．褐色脂肪組織
７．脳
８．脾臓
９．骨髄
１０．関節
１１．腎臓
１２．消化管
１３．腫瘍
１４．眼
１５．胸腺
１６．皮膚
１７．リンパ節
１８．膵臓
１９．副腎
２０．精巣
２１．前立腺
２２．卵巣
２３．子宮
２４．膀胱
２５．横隔膜

【0136】

ｍＲＮＡトランスフェクション
ｍＲＮＡ送達におけるデンドリマーの世代数に対する影響を、完全成長培地条件においてＨｅＬａ細胞をトランスフェクトすることによって研究した。本発明者らは、第１又は第２世代デンドリマー（例えば、ＲＨＣＧ１－Ｒ、ＲＨＣＧ１，２－Ｒ、ＲＨＣＧ１－ＬＲ、ＲＨＣＧ１－ＲＬ、２－ＬＲ）が細胞を効果的にトランスフェクトし、第３世代デンドリマーと同様のトランスフェクション効率を媒介することができることを示した（図２８Ａ）。第１又は第２世代デンドリマーは、完全成長培地中で第３世代デンドリマーと同様に細胞をトランスフェクトしないので、これは実際にＤＮＡトランスフェクションとは非常に異なる（図４）。興味深いことに、世代１又は世代２デンドリマーのＮ：Ｐ比を０．１６から８に増加させると、トランスフェクション効率が更に増加する（図２９Ａ）。

【0137】

本発明者らは、トランスフェクションに対するデンドリマーのコア配列の影響を研究し、ＧＳＣ（例えば、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ由来）などのトリペプチド配列が有効であることを示した。ＫＡ及びＹＭなどのジペプチドコア配列も有効である。コアペプチド長のこの変化はｍＲＮＡトランスフェクションに影響せず、コア中に２つのアミノ酸を有するデンドリマーが、コア中に３つのアミノ酸を有するデンドリマーと同様にトランスフェクトすることを示唆している（図２８Ａ）。ＲＦＷ、ＲＹＭなどの異なるトリペプチドコア配列は、ＧＳＣと同等に機能する。カチオン性基を含有するアルギニンがコアに付加されるが、このアルギニンがトランスフェクションを改善又は減少させることはない。興味深いことに、３つのアミノ酸がコアにおいてＧＣＳからＲＨＣに変化すると、トランスフェクションは５０％改善することができる。これは、デンドリマーのコアにおけるヒスチジンなどのイオン化可能な基がトランスフェクションを改善し得ることを示唆する（図２８Ａ）。

【0138】

１２個のアミノ酸のコア配列（例えば、デンドリマー「線状ＧＩ，２－ＲＬ，３－ＬＲ」）の使用は、トランスフェクション効果がコア配列の長さの増加によって影響を受けないことを実証している（図２８Ａ）。この結果は、トランスフェクション効率に影響を与えることなく、より長いアミノ酸鎖及び／又はより長い構造をコアに導入することが可能であることを示した。実際、コアに２７個のアミノ酸を含むＮＴＸ１は、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＲＬよりも効果的にトランスフェクトする。これは、より長いコア配列が、実際にトランスフェクションを増強し得ることを実証する。ＮＴＸ１からのトランスフェクションの増強は、コア配列内の細胞透過性ペプチドの存在による可能性が高い。

【0139】

本発明者らは、トランスフェクションにおける世代内のアミノ酸の数に対する影響を調査した。したがって、本発明者らは、１つのアミノ酸（Ｒ）、２つのアミノ酸（ＲＬ又はＬＲ）、３つのアミノ酸（ＲＬＲ）、及び４つのアミノ酸（ＬＲＬＲ）のみを有するデンドリマーを試験した。これらの研究は、各世代において１、２、３又は４つのアミノ酸を有するデンドリマーが、依然としてｍＲＮＡを細胞に十分にトランスフェクトすることができることを示した（図２８Ａ）。各世代において異なる数のアミノ酸を有するデンドリマーを使用しても、トランスフェクション効率は影響を受けないことが示された。

【0140】

Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ構造に基づいて、本発明者らは、塩基性アミノ酸ＲをＫに置換し、かつ／又は疎水性アミノ酸Ｌを、Ｅなどの酸性アミノ酸、並びに／若しくはＭ、Ｆ、ベータ－アラニン（Ｂ）、アミノヘキサン酸（Ｘ）、及びＷなどの非極性側鎖を有するアミノ酸、並びに／又はＱ、Ｔ及びＹなどの極性側鎖を有するアミノ酸に変化させた３世代デンドリマーのライブラリーを設計した。

【0141】

デンドリマー内でＲをＫに置換すると、ｍＲＮＡトランスフェクション効率が低下する（図２８Ａ）。しかしながら、疎水性アミノ酸を他の疎水性アミノ酸及び／又は極性若しくは非極性側鎖を有するアミノ酸に変更することは、トランスフェクションに影響を及ぼさない可能性があるか、又はＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲと比較してトランスフェクションを３０～４０％低下させる可能性がある。しかしながら、これらのデンドリマーは全て、ｍＲＮＡ単独対照よりも有意に高いｍＲＮＡトランスフェクションを誘導することができる。

【0142】

本発明者らはまた、ｍＲＮＡトランスフェクションに対するデンドリマー内のＬ又はＤ型アミノ酸の影響を調査した。Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲデンドリマーに基づいて、本発明者らは、デンドリマーの各世代においてアミノ酸の一部又は全部をＬ型からＤ型に変化させてもトランスフェクション効率に影響を与えないことを見出した。デンドリマー内でリジンをジアミノ酪酸に置換することは、トランスフェクションを低下させるが、このデンドリマーのトランスフェクションは、ｍＲＮＡ単独対照よりも依然として有意に高い。

【0143】

本発明者らは、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｗ／ｗ １０：１）とともにＧ１－ＬＬ，２－ＲＲをＮ：Ｐ比０．１６：１で使用した本発明者らの製剤プロトコルを用いてｍＲＮＡを送達するためにＧ１－ＬＬ，２－ＲＲを使用できることを実証した。興味深いことに、このデンドリマーは、インビトロ及びインビボで異なる製剤にＡＳＯを送達するために使用された（Ｓａｈｅｒ ２０１８）。使用した製剤は、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ＡＳＯに対してｗ／ｗ＝２：１）及びＮ：Ｐ＝２０：１、Ｇ１－ＬＬ，２－ＲＲ対ＡＳＯであった。本発明者らは、これをトランスフェクト細胞（すなわち、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝２：１）及びＮ：Ｐ＝２０：１、Ｇ１－ＬＬ，２－ＲＲ対ｍＲＮＡ）に対して試みたが、トランスフェクション効率は低い。この製剤（ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝２：１）及びＮ：Ｐ＝２０：１、Ｇ１－ＬＬ，２－ＲＲ対ｍＲＮＡ）のｍＲＮＡトランスフェクション効率は、本発明者らの改良製剤（ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）及びＮ：Ｐ＝０．１６：１、Ｇ１－ＬＬ，２－ＲＲ対ｍＲＮＡ）のｍＲＮＡトランスフェクション効率の１０％にしかならない。

【0144】

本発明者らは、ｍＲＮＡ送達のために、異なる世代においてＲＬ又はＬＲ又はｒｌのいずれかを有する３世代デンドリマーを調査した。本発明者らは、これらのデンドリマーのほとんどが同様に細胞をトランスフェクトし、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲがｍＲＮＡトランスフェクションにおいて最も有効であることを見出した。全体として、本発明者らのデータは、各世代において疎水性アミノ酸及びカチオン性アミノ酸を有するデンドリマーが、細胞への有効なｍＲＮＡ送達をもたらすことを示唆した。

【0145】

Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲよりも効果的に細胞をトランスフェクトする第１世代及び第２世代デンドリマーが存在するので、本発明者らは、トランスフェクションに関する更なる試験のためにこれらのデンドリマーを選択した。これらのデンドリマーは、一般に、様々なＮ：Ｐ比でＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲよりも良好にトランスフェクトすることができる。特に、Ｎ：Ｐ＝４：１のＲＨＣＧ１－Ｒ、ＲＨＣＧ１，２－Ｒ、ＲＨＣＧ１－ＬＲ、ＲＨＣＧ１－ＲＬ，２－ＬＲ、ＲＨＣＧ１－ＲＬＲ、及びＧ１－ＬＲＬＲは、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲよりも７００％～１８１５％良好にトランスフェクトすることができる。これらのデータは、ＤＮＡ及びｍＲＮＡ送達の要件が非常に異なることを実証した。ｍＲＮＡについては、第１又は第２世代デンドリマーが、完全成長培地条件において第３世代デンドリマーよりも良好に細胞をトランスフェクトする傾向がある。しかしながら、世代３のデンドリマーは、完全成長培地条件において、世代１又は世代２のデンドリマーよりも良好に細胞をＤＮＡでトランスフェクトする（図４）。

【0146】

ｍＲＮＡ送達に特に好ましい本発明の特定のデンドリマーとしては、ＲＨＣＧ１－Ｒ、ＲＨＣＧ１，２－Ｒ、ＲＨＣＧ１－ＬＲ、ＲＨＣＧ１－ＲＬ，２－ＬＲ、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ、ＲＨＣＧ１－ＲＬＲ、ＲＨＣＧ１，２－ＲＬＲ、Ｇ１－ＬＲＬ、ＲＨＣＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ、及びＧ１，２，３－ＲＬが挙げられる。

【0147】

ＲＮＡ干渉
本発明は、核酸の送達によって標的遺伝子発現の治療的下方制御を促進する。これらには、ＲＮＡ干渉（RNA interference、ＲＮＡｉ）が含まれる。小ＲＮＡ分子を用いて、遺伝子発現を制御してもよい。

【0148】

これらには、低分子干渉ＲＮＡ（small interfering RNA、ｓｉＲＮＡ）によるｍＲＮＡの標的分解、転写後遺伝子サイレンシング（post transcriptional gene silencing、ＰＴＧｓ）、マイクロＲＮＡ（micro-RNA、ｍｉＲＮＡ）によるｍＲＮＡの発生的に制御された配列特異的翻訳抑制、及び標的転写遺伝子サイレンシングが含まれる。

【0149】

ヘテロクロマチン複合体の標的化及び特定の染色体遺伝子座でのエピジェネティック遺伝子サイレンシングにおけるＲＮＡｉ機構及び小ＲＮＡの役割も実証されている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）としても知られる二本鎖ＲＮＡ（double-stranded RNA、ｄｓＲＮＡ）依存性転写後サイレンシングは、ｄｓＲＮＡ複合体が短期間でサイレンシングのために相同性の特定の遺伝子を標的とすることができる現象である。これは、配列同一性を有するｍＲＮＡの分解を促進するシグナルとして作用する。２１－ｎｔのｓｉＲＮＡは、一般に、遺伝子特異的サイレンシングを誘導するのに十分な長さであるが、宿主応答を回避するのに十分な短さである。標的遺伝子産物の発現の減少は、ｓｉＲＮＡの数個の分子によって誘導される９０％サイレンシングを伴って広範囲であり得る。

【0150】

当技術分野では、これらのＲＮＡ配列は、それらの起源に応じて、「短鎖若しくは低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）又は「マイクロＲＮＡ」（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる。両方のタイプの配列を使用して、相補的ＲＮＡに結合し、ｍＲＮＡ排除（ＲＮＡｉ）を誘発するか、又はｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を停止することによって、遺伝子発現を下方制御することができる。ｓｉＲＮＡは、長い二本鎖ＲＮＡのプロセシングによって誘導され、天然に見出される場合、典型的には外因性起源である。マイクロ干渉ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、短ヘアピンのプロセシングによって誘導される、内因的にコードされた小分子非コードＲＮＡである。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは両方とも、ＲＮＡ切断なしに部分的に相補的な標的配列を有するｍＲＮＡの翻訳を阻害し、完全に相補的な配列を有するｍＲＮＡを分解することができる。

【0151】

したがって、本発明は、標的遺伝子の発現を下方制御するための、本発明の組成物におけるこれらの配列の使用を提供する。

【0152】

標的遺伝子の機能のＲＮＡ媒介下方制御の有効性を最適化するために、ｓｉＲＮＡリガンドは、典型的には二本鎖であり、ｓｉＲＮＡ分子の長さは、ｍＲＮＡ標的のｓｉＲＮＡによる認識を媒介するＲＩＳＣ複合体によるｓｉＲＮＡの正確な認識を確実にするように、かつｓｉＲＮＡが宿主応答を低下させるのに十分短くなるように選択されることが好ましい。

【0153】

ｍｉＲＮＡリガンドは、典型的には一本鎖であり、リガンドがヘアピンを形成することを可能にする部分的に相補的な領域を有する。ｍｉＲＮＡは、ＤＮＡから転写されるが、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ遺伝子である。ｍｉＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、ｍｉＲＮＡよりも長い。このＤＮＡ配列は、ｍｉＲＮＡ配列及び近似逆相補体を含む。このＤＮＡ配列が一本鎖ＲＮＡ分子に転写される場合、ｍｉＲＮＡ配列及びその逆相補塩基対は、部分的に二本鎖のＲＮＡセグメントを形成する。マイクロＲＮＡ配列の設計は、Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ，２００４で考察されている。

【0154】

典型的には、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの効果を模倣することが意図されるＲＮＡリガンドは、１０～４０リボヌクレオチド（又はその合成類似体）、より好ましくは１７～３０リボヌクレオチド、より好ましくは１９～２５リボヌクレオチド、及び最も好ましくは２１～２３リボヌクレオチドを有する。二本鎖ｓｉＲＮＡを使用する本発明のいくつかの実施形態では、分子は、例えば、１つ又は２つの（リボ）ヌクレオチドの対称３’オーバーハング、典型的にはｄＴｄＴ ３’オーバーハングのＵＵを有し得る。本明細書に提供される開示に基づいて、当業者は、例えば、ＡｍｂｉｏｎのオンラインｓｉＲＮＡファインダーなどのリソースを使用して、適切なｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ配列を容易に設計することができる。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ配列は、合成的に産生され、遺伝子下方制御を引き起こすために外因的に添加され得るか、又は発現系（例えば、ベクター）を使用して産生され得る。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、合成的に合成される。

【0155】

より長い二本鎖ＲＮＡを細胞内でプロセシングして、ｓｉＲＮＡを産生してもよい（例えば、Ｍｙｅｒｓｅｔ ａｌ（２００３）を参照されたい）。より長いｄｓＲＮＡ分子は、例えば、１つ又は２つの（リボ）ヌクレオチドの対称３’若しくは５’オーバーハングを有してもよく、又は平滑末端を有してもよい。より長いｄｓＲＮＡ分子は、２５ヌクレオチド以上であり得る。好ましくは、より長いｄｓＲＮＡ分子は、２５～３０ヌクレオチド長である。より好ましくは、より長いｄｓＲＮＡ分子は、２５～２７ヌクレオチド長である。最も好ましくは、より長いｄｓＲＮＡ分子は、２７ヌクレオチド長である。

【0156】

一実施形態では、ｓｉＲＮＡ、より長いｄｓＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡは、ベクターからの転写によって内因的に（細胞内で）産生される。ベクターは、当技術分野で公知の任意の方法で細胞に導入してもよい。必要に応じて、ＲＮＡ配列の発現は、組織特異的プロモーターを使用して制御できる。更なる実施形態では、ｓｉＲＮＡ、より長いｄｓＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡは、ベクターからの転写によって外因的に（インビトロで）産生される。

【0157】

あるいは、ｓｉＲＮＡ分子は、当該分野で公知の標準的な固相合成技術又は液相合成技術を使用して合成され得る。ヌクレオチド間の連結は、ホスホジエステル結合又は代替物であってもよく、例えば、式Ｐ（Ｏ）Ｓ、（チオエート）；Ｐ（Ｓ）Ｓ、（ジチオエート）；Ｐ（Ｏ）ＮＲ’２；Ｐ（Ｏ）Ｒ’；Ｐ（Ｏ）ＯＲ６；ＣＯ；又はＣＯＮＲ’２（式中、ＲはＨ（又は塩）又はアルキル（１～１２Ｃ）であり、Ｒ６はアルキル（１～９Ｃ）である）の連結基は、－Ｏ－又は－Ｓ－を介して隣接するヌクレオチドに接合している。

【0158】

長鎖型非コードＲＮＡ
哺乳動物ゲノムは広範に転写され、何千もの長鎖型非コードＲＮＡ分子（ｌｎｃＲＮＡ）を含む膨大な数の転写物を産生する。ｌｎｃＲＮＡは、クロマチン状態、転写、ＲＮＡ安定性、及び特定の遺伝子の翻訳を制御することができることが示されている。

【0159】

ＲＮＡ活性化（ＲＮＡ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、ＲＮＡａ）
ＲＮＡ活性化（ＲＮＡａ）は、高度に制御され、進化的に保存された経路を介して遺伝子発現を増強するためにＲＮＡによって媒介されるプロセスである。ＲＮＡａは、両末端に２ヌクレオチドオーバーハングを有する２１ヌクレオチドｄｓＲＮＡからなる非コードＲＮＡのクラスである小活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）によって誘導することができる。ｓａＲＮＡが配列特異的に遺伝子活性化を媒介するという事実にもかかわらず、ｓａＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同一の構造及び化学成分を有する。遺伝子発現を活性化するために、ｓａＲＮＡのガイド鎖をＡＧＯ２にロードし、次いで複合体を核に輸送する。核内に入ると、ガイド鎖－ＡＧＯ２複合体は、遺伝子プロモーター又は関連する転写物に直接結合し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを含む重要な成分を動員して、遺伝子活性化を開始する（Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．２０１９）。

【0160】

アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、標的配列に相補的なＤＮＡ又はＲＮＡの一本鎖である。ＡＳＯは、標的核酸とハイブリダイズする。例えば、ＡＳＯは、細胞内のコード又は非コードＲＮＡ分子を標的とするために使用され得る。標的結合の後、ＡＳＯ／標的複合体は、例えば、ＲＮａｓｅ Ｈによって酵素的に分解され得る。

【0161】

メッセンジャーＲＮＡ（Messenger RNA、ｍＲＮＡ）
当業者は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が、リボソームによって対応するアミノ酸配列に翻訳される遺伝子のコード配列をとるＲＮＡの一本鎖分子であることを承知している。ｍＲＮＡは、酵素（ＲＮＡポリメラーゼ）が遺伝子を一次転写ｍＲＮＡ（プレｍＲＮＡとしても知られる）に変換する転写プロセス中に生成される。このプレｍＲＮＡは通常、最終的なアミノ酸配列をコードしない領域であるイントロンを依然として含む。これらはＲＮＡスプライシングの過程で除去され、タンパク質をコードする領域であるエキソンのみが残る。このエキソン配列は、成熟ｍＲＮＡを構成する。次いで、成熟ｍＲＮＡがリボソームによって読み取られ、それによってコードされたタンパク質が産生される。本発明は、所望のタンパク質又はペプチドの発現を誘導する手段として、ｍＲＮＡ分子を標的細胞及び組織に送達するために使用され得る。ｍＲＮＡ送達によるペプチド／タンパク質発現の誘導は、一過性発現が所望される場合に特に有用である。

【0162】

ｍＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡは、典型的に、負に荷電した側及び疎水性側を有する大きな分子である。したがって、ｍＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡは、カプセル化され、かつ標的組織及び細胞に送達されるために、疎水性相互作用と親水性相互作用との間のバランスを必要とする。疎水性相互作用と親水性相互作用との間のこのバランスは、例えば、両側に電荷を有するｐＤＮＡ及びｓｉＲＮＡなどの二本鎖核酸とは異なる。ｍＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡは、例えば、ＡＳＯよりも有意に大きいので、カプセル化及び送達のための要件も異なる可能性が高い。したがって、ｍＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡ送達のためのデンドリマーの最適なＮＰ比及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥのｗ／ｗ比は、ＡＳＯ送達と比較して異なる。

【0163】

修飾核酸
修飾ヌクレオチド塩基は、天然に存在する塩基に加えて使用することができ、それらを含有する核酸に有利な特性を付与することができる。

【0164】

例えば、修飾塩基は、核酸分子の安定性を増加させ、それによって、必要とされる量を低下させ得る。修飾塩基の提供はまた、非修飾核酸よりも多かれ少なかれ安定である核酸分子を提供し得る。

【0165】

「修飾ヌクレオチド塩基」という用語は、共有結合的に修飾された塩基及び／又は糖を有するヌクレオチドを包含する。例えば、修飾ヌクレオチドには、３’位のヒドロキシル基以外及び５’位のリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合した糖を有するヌクレオチドが含まれる。したがって、修飾ヌクレオチドはまた、２’置換糖、例えば、２’－Ｏ－メチル－；２’－Ｏ－アルキル；２’－Ｏ－アリル；２’－Ｓ－アルキル；２’－Ｓ－アリル；２’－フルオロ－；２’－ハロ又はアジド－リボース、炭素環式糖類似体、α－アノマー糖；エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロース又はリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、及びセドヘプツロースを含み得る。

【0166】

修飾ヌクレオチドは、当技術分野で公知であり、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリン及びピリミジン、並びに他の複素環を含む。これらのクラスのピリミジン及びプリンは、当該分野で公知であり、プソイドイソシトシン、Ｎ４，Ｎ４－エタノシトシン、８－ヒドロキシ－Ｎ６－メチルアデニン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６－イソペンチル－アデニン、１－メチルアデニン、１－メチルプソイドウラシル、１－メチルグアニン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、－Ｄ－マンノシルクエオシン、５－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、プソオラシル（psueouracil）、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、クエオシン、２－チオシトシン、５－プロピルウラシル、５－プロピルシトシン、５－エチルウラシル、５－エチルシトシン、５－ブチルウラシル、５－ペンチルウラシル、５－ペンチルシトシン、及び２，６，ジアミノプリン、メチルプソイドウラシル、１－メチルグアニン、１－メチルシトシンが挙げられる。

【0167】

核酸ベースのワクチン
世界保健機関（World Health Organisation、ＷＨＯ）によって定義されるＤＮＡワクチン、及びＲＮＡワクチンは、免疫応答が求められる抗原をコードするＤＮＡ配列又はＲＮＡを含有するプラスミドを（ワクチン接種される対象の）適切な組織に直接導入することを伴い、標的抗原のインサイチュ産生に依存する。これらのアプローチは、両方のＢ細胞及びＴ細胞応答の刺激、改善されたワクチン安定性、任意の感染因子の非存在、並びに大規模製造の相対的な容易さを含む、伝統的なアプローチを超える多くの潜在的な利点を提供する。ＤＮＡワクチン接種の原理の証明として、動物における免疫応答は、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、狂犬病ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、マラリア原虫、及びマイコプラズマを含む種々の感染因子由来の遺伝子を使用して得られている。場合によっては、動物における疾患からの保護も得られている。しかしながら、ＤＮＡワクチンの価値及び利点は、ケースバイケースで評価されなければならず、それらの適用性は、それに対して免疫化される薬剤の性質、抗原の性質、及び防御に必要な免疫応答のタイプに依存する。

【0168】

ＤＮＡ及びＲＮＡワクチン接種の分野は、急速に発展している。現在開発されているワクチンは、ＤＮＡを使用するだけでなく、ＤＮＡが細胞に入るのを補助し、それを特定の細胞に標的化するか、又は免疫応答を刺激若しくは指向するアジュバントとして作用し得るアジャンクトも含む。２０２０年の時点で、ＷＨＯは、市販のために認可された最初の核酸ワクチンが細菌細胞由来のプラスミドＤＮＡを使用する可能性が高いが、将来、他のワクチンがＲＮＡを使用し得るか、又は核酸分子及び他の実体の複合体を使用し得ることに注目した。しかしながら、２０２０年のＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの開始とともに、最初のＲＮＡベースのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを市場に出すために協奏的な努力がなされ、これらは２０２０年半ば～後半に使用が承認された。承認されて以来、これらのＲＮＡベースのワクチンは、ＣＯＶＩＤ－１９に対して集団を免疫化するために世界中で成功裏に展開されてきた。

【0169】

ＤＮＡワクチンの筋肉内送達は、他のワクチン技術と共通して、一般的なアプローチである（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ，２０２０）。安定な発現がゲノム組み込みに依存しないので、これは、骨格筋における筋細胞（筋肉細胞）の低い複製速度に起因して、ＤＮＡワクチン接種の魅力的な標的となる。

【0170】

現在市販されているＲＮＡワクチンは、ペイロードとして抗原をコードするｍＲＮＡを使用している。ＲＮＡワクチンの有効性を増加させるために現在調査されている領域は、自己増幅ＲＮＡの使用である。自己増幅ＲＮＡは、ｍＲＮＡの構造的特質の多くを共有し、５’キャップ、３’ポリＡテール、並びに５’及び３’非翻訳領域（untranslated region、ＵＴＲ）を含み得る。目的の抗原をコードすることに加えて、自己増幅ＲＮＡはまた、自己増幅のための系を含む。例えば、自己増幅ＲＮＡはまた、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＡ）、プロモーター、及び目的の抗原をコードし得る。

【0171】

対象翻訳機構によるＲＤＲＡの翻訳時に、ＲＤＲＡは、自己増幅ＲＮＡに関与し、ＲＮＡを複製することができる。自己増幅のための系を含むことは、ワクチンにおいて必要とされる最小ＲＮＡを低下させ、結果として、対象が副作用を経験する可能性を低下させる。

【0172】

医学療法：遺伝子療法
本発明は、遺伝子療法レジメンにおける使用を企図する。核酸は、標的細胞に導入された場合、治療用遺伝子産物、例えば、導入遺伝子の発現をもたらす組成物中に存在し得る。標的細胞としては、筋細胞、肝細胞、星細胞、脳細胞（ニューロン、アストロサイト）、脾細胞、肺細胞、心筋細胞、腎細胞、脂肪細胞、幹細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄由来サプレッサ細胞、腫瘍関連マクロファージ、腫瘍関連好中球、又は腫瘍細胞が挙げられる。

【0173】

遺伝子療法が実用的であるためには、（１）治療用配列を標的細胞に指向させ、（２）治療用核酸の標的細胞集団の一部への取り込みを媒介し、かつ（３）治療用途のためのインビボでの使用に適しているＤＮＡ／ＲＮＡ転移系を用いることが望ましい。

【0174】

本発明の核酸含有組成物は、無菌の薬学的に許容される担体中で保存及び投与することができる。水、ＰＢＳ、エタノール、脂質などを含む様々な滅菌溶液を使用することができる。ＤＮＡ／ＲＮＡの濃度は、治療用量を提供するのに十分であり、これは細胞への輸送効率に依存する。

【0175】

上記のように製剤化された遺伝子配列の実際の送達は、直接注入、肺及び他の上皮表面の点滴注入、又は静脈内注射を含む種々の技術によって行われ得る。投与は、ボーラス、複数回投与、又は持続注入などとして、注射針、トロカール、カニューレ、カテーテルなどによるものであり得る。

【0176】

遺伝子編集
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）、ＴＡＬＥＮＳ及びジンクフィンガーヌクレアーゼなどの当技術分野で周知の技術を使用する遺伝子編集療法を含む、遺伝子編集療法における使用を企図する。

【0177】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓヌクレアーゼ、ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（crispr RNA、ｃｒＲＮＡ）、及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（trans-activating crRNA、ｔｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。この系では、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡに相補的な配列を含み、Ｃａｓヌクレアーゼをゲノム内の標的部位に指向させる働きをし、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ活性に必要とされるＣａｓヌクレアーゼの結合足場として働く。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓヌクレアーゼと、Ｃａｓヌクレアーゼを標的遺伝子中の標的部位に指向させるための単一ガイドＲＮＡ（single-guide RNA、ｓｇＲＮＡ）とを含む。ｓｇＲＮＡは、単一核酸中に足場ｔｒａｃｒＲＮＡに融合された標的特異的ｃｒＲＮＡを含む。

【0178】

いくつかの実施形態では、核酸は、Ｃａｓタンパク質又はペプチド、例えば、Ｃａｓ９タンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ｃｒＲＮＡ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、Ｃａｓタンパク質又はペプチド、ｃｒＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、Ｃａｓタンパク質又はペプチド及びｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡを含む。

【0179】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、標的遺伝子の修復又は修飾を指示することもできる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＤＮＡ修復を促進するための、又は例えば、相同組換え修復を促進することによって外因性核酸配列を標的遺伝子に導入するための核酸鋳型を含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はまた、例えば、塩基編集技術を使用して、標的ゲノムＤＮＡに標的化修飾を導入するために使用されてもよい。これは、例えば、国際公開第２０１７／０７０６３３（Ａ２）号（参照により組み込まれる）に開示されるように、シチジンデアミナーゼなどの塩基エディターに融合されたＣａｓタンパク質を使用して達成することができる。別の例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ゲノム中の核酸配列を「書き換える」ために使用されてもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、プライム編集系であり得る。このようなプライム編集系では、融合タンパク質が使用され得る。例えば、融合タンパク質は、触媒的に損なわれたＣａｓドメイン（例えば、「ニッカーゼ」）及び逆転写酵素を含み得る。触媒的に損なわれたＣａｓドメインは、ＤＮＡの一本鎖を切断して、ニックの入ったＤＮＡ二重鎖を生成することが可能であり得る。プライム編集系は、プライマー結合部位及び逆転写酵素鋳型配列を含む拡張ｓｇＲＮＡを含むプライム編集ガイドＲＮＡ（prime editing guide RNA、ｐｅｇＲＮＡ）を含み得る。触媒的に損なわれたＣａｓによるＤＮＡ二本鎖のニッキングの際に、プライマー結合部位は、ニッキングされたＤＮＡ鎖の３’末端がｐｅｇＲＮＡにハイブリダイズすることを可能にし、一方、ＲＴ鋳型は、編集された遺伝子情報の合成のための鋳型として役立つ。

【0180】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系は、目的の標的遺伝子の修復を指示する核酸鋳型を含み得る。他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質又はペプチドは、塩基エディターを含み得る。なお更なる実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、プライム編集系であってもよい。

【0181】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子サイレンシング及び遺伝子活性化
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、遺伝子サイレンシング及び活性化における使用に適合されている。そのような系は、本発明で使用するために想定される。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、転写リプレッサ又はアクチベータに融合したＣａｓタンパク質又はペプチドを含む融合タンパク質をコードしてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、触媒活性がない。融合タンパク質は、ｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡのいずれかによってゲノム中の目的の部位に指向され得る。目的の部位への融合タンパク質の結合に際して、転写リプレッサ又はアクチベータは、目的の遺伝子の発現を制御し得る。

【0182】

併用療法
本発明の化合物又は本発明の方法によって同定される化合物は、腫瘍及びがんの治療を必要とする対象における腫瘍及びがんの治療に使用することができる。化合物は、単独で又は他の抗がん剤と組み合わせて投与してもよい。

【0183】

「抗がん剤」は、新生物状態の治療に有用な任意の薬剤を指す。抗がん剤の１つのクラスは、化学療法剤を含む。「化学療法」は、静脈内、経口、筋肉内、腹腔内、膀胱内、皮下、経皮、頬側、若しくは吸入を含む様々な方法によるか、又は坐剤の形態での、がん患者への１つ以上の化学療法薬及び／又は他の薬剤の投与を意味する。いくつかの化学療法剤は、細胞毒性である。

【0184】

細胞毒性化学療法剤は、受容体媒介性ではない機構又は手段を介して細胞死を誘発する。細胞毒性化学療法剤は、細胞分裂、代謝又は細胞生存に必要な機能を妨害することによって細胞死を誘発する。この作用機序のために、急速に成長している（増殖又は分裂していることを意味する）細胞又は代謝的に活性な細胞は、そうでない細胞よりも優先的に死滅する。分裂又はエネルギー使用（これは細胞の機能を支持する代謝活性である）としての体内の異なる細胞の状態は、細胞死を引き起こす化学療法剤の用量を決定する。細胞毒性化学療法剤は、非排他的に、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物性アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、抗腫瘍薬及び三酸化ヒ素、カルムスチン、フルダラビン、ＩＤＡ ａｒａ－Ｃ、ｍｙａｌｏｔａｎｇ、ＧＯ、ｍｕｓｔａｒｇｅｎ、シクロホスファミド、ゲムシタビン、ベンダムスチン、放射線全身照射、シタラビン、エトポシド、メルファラン、ペントスタチン、及び放射線に関する。

【0185】

抗がん剤はまた、血液及び肺がんを含む多様な範囲のがんの治療に使用することができるプロテインキナーゼ阻害剤を含む。プロテインキナーゼは、典型的には、細胞増殖、生存、及び移動を促進し、がんにおいて構成的に過剰発現されるか又は活性であることが多い。したがって、プロテインキナーゼの阻害剤は、がんの治療における一般的な薬物標的である。臨床で使用するためのキナーゼ阻害剤の例としては、クリゾチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、ブリガチニブ、ボスチニブ、ダサチニブ、イマチニブ、ニロチニブ、ポナチニブ、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、イブルチニブ、パルボシクリブ、ソラフェニブ、及びリボシクリブが挙げられる。

【0186】

抗がん剤はまた、抗体を含む、免疫療法における使用のための薬剤を含む。免疫療法は、特定の疾患状況に応じて免疫応答を誘発、増幅、低下、又は抑制することができる。例えば、ＰＤＬ１リガンドを発現する腫瘍細胞は、Ｔ細胞上に発現されるＰＤ－１受容体に結合することによって、対象における正常な免疫応答を抑制する。このようにして、腫瘍細胞は、免疫誘導性アポトーシスに抵抗し、腫瘍進行を促進する。抗ＰＤ－１及び抗ＰＤＬ１抗体は、この免疫チェックポイントを阻害し、かつ腫瘍細胞の免疫細胞媒介性死滅を促進するために、臨床において成功裏に使用されている。免疫療法の他の例としては、腫瘍溶解性ウイルス療法、Ｔ細胞療法、及びがんワクチンが挙げられる。

【0187】

薬学的組成物
本明細書で提供される薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、例えば、溶媒、溶解促進剤、懸濁化剤、緩衝剤、等張化剤、抗酸化剤、又は抗菌保存剤を含んでもよい。「薬学的に許容される」とは、「一般に安全であるとみなされる」分子実体及び組成物、例えば、ヒトに投与された場合に、生理学的に忍容性があり、典型的にはアレルギー性又は同様の有害反応、例えば、胃の不調などを生じない分子実体及び組成物を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、連邦食品医薬品化粧品法（Federal Food, Drug and Cosmetic Act）のセクション２０４（ｓ）及び４０９に基づくＧＲＡＳリストとして、米国連邦政府又は州政府の規制当局によって承認された分子実体及び組成物を指し、これは、ＦＤＡ若しくは同様のリスト、米国薬局方、又は動物、より具体的にはヒトにおける使用のための別の一般的に認識された薬局方によるプレマーケットレビュー及び承認を受ける。使用される場合、組成物の賦形剤は、活性成分の安定性、生物学的利用能、安全性、及び／又は有効性に悪影響を及ぼさない。したがって、当業者は、剤形の成分のうちのいずれかの間に不適合性がない組成物が提供されることを理解するであろう。賦形剤は、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、抗酸化剤、抗菌剤、及び保存剤からなる群から選択され得る。

【0188】

治療用産物の発現
本発明の組成物によって送達される核酸は、治療作用（例えば、標的遺伝子を直接下方制御又は上方制御するように作用することによって）を示し得るか、又はプロモーターに作動可能に連結されたコード配列を含む発現カセットを介して遺伝子産物（治療用タンパク質又は治療用核酸であり得る）を発現し得る。本明細書において、「作動可能に連結された」という用語は、選択されたヌクレオチド配列及び制御ヌクレオチド配列が、コード配列の発現を制御配列の影響下又は制御下に置くような様式で共有結合している状況を含み得る。したがって、制御配列が、選択されたヌクレオチド配列の一部又は全てを形成するコード配列の転写を達成し得る場合、制御配列は、選択されたヌクレオチド配列に作動可能に連結される。適切な場合、次いで、得られた転写物は、所望のタンパク質又はポリペプチドに翻訳され得る。

【0189】

投与経路
本発明の態様による組成物は、静脈内、非経口、動脈内、筋肉内、腫瘍内、皮下、経口、及び経鼻を含むがこれらに限定されないいくつかの経路による投与のために製剤化することができる。組成物は、ヒト又は動物対象への注入によって、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腫瘍内注入によって投与することができる。

【0190】

対象
処理される対象は、任意の動物又はヒトであり得る。対象は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。対象は、非ヒト哺乳動物であってもよいが、より好ましくはヒトである。対象は、男性であっても女性であってもよい。対象は、患者であってもよい。治療的使用は、ヒト又は動物（獣医学的使用）におけるものであってもよい。
^＊＊＊

【0191】

特定の形態で、又は開示された機能を実施するための手段、又は開示された結果を得るための方法若しくはプロセスに関して表現された、前述の説明、以下の特許請求の範囲、又は添付の図面に開示された特質は、必要に応じて、別々に、又はそのような特質の任意の組み合わせで、本発明をその多様な形態で実現するために利用することができる。

【0192】

本発明は、上述の例示的な実施形態に関連して説明されてきたが、多くの等価な修正形態及び変形形態が、本開示を与えられたときに当業者には明らかになるであろう。したがって、上述した本発明の例示的な実施形態は、例示的なものであり、限定的なものではないと考えられる。説明された実施形態に対する様々な変更が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく行われ得る。

【0193】

疑義を回避するために、本明細書で提供される任意の理論的説明は、読者の理解を向上させる目的で提供される。本発明者らは、これらの理論的説明のうちのいずれにも束縛されることを望まない。

【0194】

本明細書で使用される任意のセクション見出しは、構成上の目的のみのためであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0195】

特許請求の範囲を含む本明細書全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（comprise）」及び「含む（include）」という用語、並びに「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」、及び「含んでいる（including）」などの変形は、述べられた整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群の包含を意味するが、任意の他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群の排除を意味しないことが理解されるであろう。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、文脈が明らかに他を指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。範囲は、本明細書において、「約」１つの特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までとして表現され得る。そのような範囲が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、及び／又は他の特定の値までを含む。同様に、値が先行詞「約」の使用によって近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。数値に関する「約」という用語は任意選択であり、例えば、＋／－１０％を意味する。

【実施例】

【0196】

実施例１－脂質と組み合わせてカチオン性残基及び疎水性残基を提示するペプチドデンドリマーを用いた遺伝子送達
序論
カチオン性脂質に基づく核酸送達系は、現在までに記載されている最も研究された効率的な非ウイルスベクタープラットフォームのうちの１つであり、天然アミノ酸を有するペプチドベクターの合理的な設計及び開発は、アミノ酸の非毒性の性質に起因して、治療用途のために特に魅力的である。本発明者らは、ペプチドデンドリマーを使用して、核酸送達のための構造フレームワークを開発した。構造フレームワークは、リジン残基に結合した３層のペプチド（又はジペプチド）モチーフを含む。本発明者らは、各世代（層）におけるカチオン性アミノ酸残基（Ｌｙｓ又はＡｒｇ）の分布により、表面上のみに局在する電荷を有するデンドリマーよりも効率的にトランスフェクトするペプチドデンドリマーが得られることを見出した（Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ，２０１３）。固相ペプチドデンドリマー合成手順を使用して、本発明者らは、樹状足場内に組み込まれた全てのアミノ酸残基の位置を正確に操作することができる。これは、デンドリマーの構造及び機能のより大きな制御を可能にし、これは、修飾が主に分子の表面上で行われたポリマー又は他のデンドリマーなどの以前に研究された系では通常不可能であった。ペプチドデンドリマー／脂質ベクターは、高いトランスフェクション効率、結果の良好な再現性、及び低い毒性を示した。

【0197】

本発明者らは、（１）樹状骨格、（２）デンドリマーの緻密性、（３）樹状サイズ、（４）デンドリマービルディングブロックキラリティ、及び（５）デンドリマー内のアミノ酸組成が、遺伝子導入を改善するための重要なパラメータであり得ると仮定した。本発明者らは、交互のＬｙｓＬｅｕモチーフを有する有効なＧ１，２，３－ＫＬに基づく新しいデンドリマーライブラリーを生成することによって構造的特質を調査し、トランスフェクション活性が世代依存性であり、３世代がトランスフェクションに最適であることを見出した。各世代において均一な電荷分布を達成することは重要であるが、各世代内の電荷の正確な位置は重要ではない。キラリティが異なるデンドリマー及び各世代内でのアミノ酸の数が異なるデンドリマーを使用した場合に、いくらかの活性が観察された。しかしながら、デンドリマー内で陽イオンアミノ酸をＬｙｓからＡｒｇに（すなわち、ＬｙｓＬｅｕからＡｒｇＬｅｕモチーフに）変化させると、血清条件におけるトランスフェクションが改善された。これは、全身送達を介したインビボ遺伝子導入を可能にし、デンドリマー－ＤＮＡ複合体の改善された安定性と相関する。Ｇ１，２，３－ＲＬ複合体は、組織パネルへの遺伝子送達において有効である。

【0198】

結果
核酸送達の有効性を決定する際の分子認識単位の役割
疎水性及びカチオン性特性のバランスを一定に保ちながら、ＤＮＡパッケージング及び送達に対するデンドリマーの分子認識単位の微調整に対する効果を評価するために、本発明者らは、Ｇ１，２，３－ＫＬの誘導体に基づいて、異なる（１）骨格、（２）緻密性、（３）サイズ、（４）ビルディングブロックにおけるキラリティ、及び（５）アミノ酸組成を有するデンドリマーを調査した。デンドリマー－ＤＮＡは、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（Ｄ／Ｄ）と複合体を形成する。広く使用されているヒト子宮頸がんＨｅＬａ細胞及びマウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞でのトランスフェクション効率を、以下の表からの特定のデンドリマーを使用して評価した。

【0199】

【表1】

表１．例示的なデンドリマー。Ｇ１，２，３－ＫＬ、Ｇ１，２－ＫＬ、Ｇ１－ＫＬ、Ｇ１，２，３－ＬＲ、Ｇ１－ＬＲ，Ｇ２．３－ＲＬ、Ｇ１，２，３－ｒｌ、Ｇ１，２－ＲＬ，Ｇ３－ＬＲ、Ｇ１，２－ＬＲ，Ｇ３－ＲＬ、Ｇ１，２，３－ＲＬ、Ｇ１，２，－ＲＬ、Ｇ１－ＲＬ、Ｇ１，２－ＬＫ，Ｇ３－ＫＬ、Ｇ１，２，３－ＬＫ、Ａｌａ－Ｇ１，２，３－ＫＬ、Ｇ１，２，３－Ｋ、Ｇ０，１，２，３－ＫＬ、及びＤ－Ｇ１，２．３－ＫＬ（「Ｇ１，２，３－ｋｌ」とも示される）は、デンドリマー全体にわたって交互の電荷（Ｌｙｓ又はＡｒｇ）及び疎水性（Ｌｅｕ）残基分布を有する。Ｇ１，２，３－Ｋは、各世代のペプチドモチーフ中にただ１つのアミノ酸を有する。コア配列のＣ末端に存在するＮＨ_２基は、ペプチド合成法の結果である。分子量（molecular weight、ＭＷ）は、対イオン（トリフルオロアセテート）を含まない。

【0200】

ｍＲＮＡ及びＤＮＡ送達についてのインビボ及びインビトロトランスフェクション効率もまた、以下の表からの特定のデンドリマーを使用して評価し、以下の実施例において考察した。

【0201】

【表2】

表２．更なる例示的なデンドリマー。コア配列のＣ末端に存在するＮＨ２基は、ペプチド合成法の結果である。Ｘ＝６－アミノヘキサン酸、Ｂ＝ベータ－アラニン、Ｄａｂ＝２，４－ジアミノ酪酸。小文字はＤ型アミノ酸を意味し、大文字はＬ型アミノ酸を意味する。Ｉは、Ｄ型ロイシンである。グリシンにはＤ型もＬ型も存在しない。

【0202】

流体力学的サイズ、多分散性指数、及びゼータ電位を、表１及び２に開示されるデンドリマーのセットについて決定した。

【0203】

【表3】

表３．ペプチドデンドリマー、脂質、及びｍＲＮＡ複合体の流体力学的サイズ及びゼータ電位。デンドリマーは、Ｎ：Ｐ比が０．１６：１であり、脂質ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥは、ｍＲＮＡに対するｗ／ｗ比が１０：１であった。コア配列のＣ末端に存在するＮＨ２基は、ペプチド合成法の結果である。Ｘ＝６－アミノヘキサン酸、Ｂ＝ベータ－アラニン、Ｄａｂ＝２，４－ジアミノ酪酸。小文字はＤ型アミノ酸を意味し、大文字はＬ型アミノ酸を意味する。ｌは、Ｄ型ロイシンである。グリシンにはＤ型もＬ型も存在しない。

【0204】

【表4】

表４．ペプチドデンドリマー、脂質、及びｍＲＮＡ複合体の流体力学的サイズ及びゼータ電位。デンドリマーは、Ｎ：Ｐ比が８：１であり、脂質ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥは、ｍＲＮＡに対するｗ／ｗ比が１０：１であった。コア配列のＣ末端に存在するＮＨ基は、ペプチド合成法の結果である。Ｘ＝６－アミノヘキサン酸、Ｂ＝ベータ－アラニン、Ｄａｂ＝２，４－ジアミノ酪酸。小文字はＤ型アミノ酸を意味し、大文字はＬ型アミノ酸を意味する。ｌは、Ｄ型ロイシンである。グリシンにはＤ型もＬ型も存在しない。

【0205】

樹状構造、対称性、トポロジー、及びキラリティの変動
種々の樹状構造は、足場内の異なるアミノ酸分布及び分岐点間のアミノ酸の数を提供して、多様な緻密性及びサイズを示す構造を与える（例えば、上記の表１を参照されたい）。

【0206】

トポロジー変動の影響を調査するために、一部又は全てのＫＬの位置が逆転したデンドリマー（Ｇ１，２－ＬＫ，３－ＫＬ及びＧ１，２，３－ＬＫ）をＧ１，２，３－ＫＬと比較する。Ｇ１，２，３－ＬＫは、Ｇ１，２，３－ＫＬと比較して、ＤＮＡ結合及びトランスフェクションに対して有意差を有しなかった（図１Ａ、Ｂ）。総電荷はＧ１，２，３－ＫＬと同じであるが、サイズ及び分子量が低下している（Ｇ１，２，３－Ｋの電荷当たりのＭＷはＧ１，２，３－ＫＬよりも１．５倍低い）Ｇ１，２，３－Ｋについては、トランスフェクション効率がいくらか低下し、Ｇ１，２，３－ＫＬほど有効ではない（図１Ｃ、Ｄ）。Ｇ１，２，３－Ｋは、２．５のより低いＮ／Ｐ比でより良好にトランスフェクトされたが、Ｎ／Ｐ比を増加させると、Ｇ１，２，３－ＫＬと比較した場合、効果がより低くなる傾向がある。

【0207】

キラリティの影響を調査するために、Ｄ型アミノ酸を有するＧ１，２，３－ＫＬデンドリマーを合成した（Ｄ－Ｇ１，２，３ＫＬと示す）。デンドリマーのＬ型アミノ酸をＤ型に置換することは、トランスフェクションに有意な影響を及ぼさなかった（図１Ｃ、Ｄ）。

【0208】

トランスフェクションにおける焦点でのアミノ酸配列の重要性を、Ｇ０，１，２，３－ＫＬ及びＡｌａ－Ｇ１，２，３－ＫＬを試験することによって研究した。焦点におけるＧｌｙＳｅｒＣｙｓ配列は、以前に研究された全てのデンドリマーにおいて一定であり、更なる荷電した残基を有するＬｙｓＬｅｕＡｌａによって置換された。変化はトランスフェクションの結果に影響を及ぼさなかった（図１Ｅ、Ｆ）。

【0209】

全体として、上記の結果は、デンドリマーの各世代における電荷分布がトランスフェクション効率の決定因子であることを示す。最適な構造に関する更なる変動は、トランスフェクション活性をわずかに変化させ得るが、全体的な効果は、電荷分布それ自体が変化しない限り、重要ではない。この観察は、電荷が外側世代（outer generation）に集中しているだけであり、各世代にわたって均一に分布していないという本発明者らの以前の観察と一致しており、トランスフェクション効率は大幅に減少した。

【0210】

異なる世代のＫＬ及びＲＬデンドリマーのトランスフェクション効率の比較
送達効率におけるＫＬ反復単位に基づくＧ１からＧ２、Ｇ３への世代数を調査した。また、ＫＬ単位をＲＬ反復単位で置換して、ｐＫａが異なるプロトン化塩基性基の影響を比較した。興味深いことに、本発明者らは、細胞における世代とトランスフェクションとの関係を観察した（図２）。トランスフェクションに対する世代依存性は、第１世代デンドリマーＧ１－ＫＬ又はＧ１－ＲＬが、荷電残基としてリジン又はアルギニンを用いてＨｅＬａ又はＮｅｕｒｏ２Ａ細胞をトランスフェクトしないことを明らかにする。これは、複合体安定性アッセイによって示されるように（データは示さず）、Ｇ１ペプチドが、プラスミドＤＮＡを完全にカプセル化して安定なナノ粒子を形成するのに十分なほど物理的に大きくないという事実に起因し得る。

【0211】

しかしながら、第２世代については、アルギニン含有Ｇ１，２－ＲＬは、Ｇ１，２－ＫＬと比較してより高いトランスフェクション効率を示す（ＨｅＬａ細胞では１０又は２０のＮ／Ｐ比で、及びＮｅｕｒｏ２Ａ細胞では２０のＮ／Ｐ比で）（図２）。Ｇ１，２－ＫＬに対するＧ１，２－ＲＬのこのようなトランスフェクションの優位性は、Ｇ１，２－ＫＬよりも安定なトランスフェクション複合体をＤＮＡと形成するＧ１，２－ＲＬの能力と一致する（データは示さず）。Ｇ２デンドリマーの最適Ｎ／Ｐ比は、それぞれの最良の活性について、Ｇ３デンドリマーの最適Ｎ／Ｐ比よりも有意に高い。本発明者らの結果はまた、Ｇ１，２－ＫＬがＮｅｕｒｏ２Ａ細胞よりも高い効率でＨｅＬａ細胞をトランスフェクトしたことを示した。これは、ある種の形質転換体の活性が、プロテオグリカンなどの異なる成分、及びトランスフェクション複合体結合及び最終的に細胞への遺伝子送達に影響を及ぼし得る細胞表面上のそれらの濃度に起因して、細胞依存性であり得るという事実を強調する。

【0212】

全体として、Ｇ３デンドリマーは、ＨｅＬａ及びＮｅｕｒｏ２Ａ細胞の両方において効率的にトランスフェクトする。本発明者らの第３世代デンドリマーは、ＨｅＬａ及びＮｅｕｒｏ２Ａ細胞において、ポリエチレンイミン（Polyethylenimine、ＰＥＩ）、リポフェクチン（ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥとしても知られる）、及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００などの広く使用されている一部の市販試薬よりも２～６００倍良好にトランスフェクトした（図３）。

【0213】

血清の存在下では、Ｇ１，２，３－ＲＬ－デンドリマー／ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ製剤は、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ単独よりも最大８００倍効率的であった（Ｄ／Ｄ単独を使用したトランスフェクションを１００％と定義する）。Ｇ１，２，３－ＫＬは、ＨｅＬａ細胞において、Ｄ／Ｄ単独と比較してトランスフェクション効率を２００倍改善した（図４Ａ）。Ｎｅｕｒｏ ２Ａ細胞において、Ｇ１，２，３－ＫＬ及びＧ１，２，３－ＲＬの活性は、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ単独よりもそれぞれ３４０倍及び１５００倍高かった（図４Ｂ）。この観察は、ＲＬデンドリマーがＫＬデンドリマーよりも強くＤＮＡに結合し、したがってそれらがより安定であり、血清中の荷電成分からの攻撃に対して耐性があるという事実によって説明することができる。

【0214】

トランスフェクション試薬によって媒介される細胞毒性は、インビボ用途のための重要なパラメータである。デンドリマー含有製剤の毒性を対照の毒性と比較した。デンドリマーの修飾のほとんどは、ＨｅＬａ細胞に対してより高い毒性を誘導せず、細胞生存率は、Ｇ１，２，３－ＫＬ（約４０％以上）及び市販の試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（約２０％）に匹敵し、補充脂質（Ｄ／Ｄ、約４０％）と同様であった。世代数を１から３に増加させても、毒性は増加しなかった。デンドリマー製剤によって引き起こされる毒性の実際の機構はよく知られていないが、製剤からの毒性の一部は、以前に示されたようにＤ／Ｄの添加によるものであり、Ｄ／Ｄ単独対照からも生じた。実際、脂質－デンドリマー－ＤＮＡ複合体の大部分は、Ｄ／Ｄ対照と比較してより高い毒性を媒介しなかったが、デンドリマー複合体の大部分は、広く使用されているＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００と比較してより高い細胞生存率をもたらした。無効なＧ１－ＫＬ又はＲＬ製剤も４０％の細胞死を誘導したので、デンドリマー複合体の毒性は、トランスフェクション効率に直接関連しなかった。Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞において、ほとんどのデンドリマー－ＤＮＡ複合体は、ＨｅＬａ細胞におけるほど毒性ではなかった（８０％以上の細胞生存率）。全体として、トランスフェクション後の細胞生存率は、参照試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（約４５％）よりも有意に高かった。

【0215】

取り込み機構
本発明の組成物の取り込み機構を調査した。クラスリン媒介性エンドサイトーシスを阻害するために、クロルプロマジンを用いた。ゲニステイン及びロットレリンも使用した。これらの薬剤は、カベオラ媒介性エンドサイトーシス及びミクロピノサイトーシスをそれぞれ阻害することが報告されている。

【0216】

本発明者らは、クロルプロマジンの添加がトランスフェクションを８０％有意に阻害することを観察し（図５Ｂ）、クラスリン媒介性エンドサイトーシスがデンドリマー系によるＤＮＡ送達において重要な役割を果たすことを示唆した。ゲニステイン及びロットレリンは、トランスフェクションを約５０％阻害した（図５Ｄ、Ｆ）。これは、ペプチドデンドリマー系が、少なくとも３つの異なる経路を介して細胞取り込みを媒介し、クラスリン媒介性エンドサイトーシスが内在化のための重要な経路であることを示唆した。異なる細胞内在化経路を誘発する能力は、異なる細胞型によるナノ粒子の取り込みを可能にし、したがって、このデンドリマー系がインビボでＤＮＡカーゴを送達するという事実を説明するであろう。

【0217】

考察
本発明者らは、トランスフェクションに対するＲＬ及びＫＬ（すなわち、疎水性基とカチオン性基との組み合わせ）ベースの第３世代デンドリマーの電荷分布の影響を以前に報告している（Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ，２０１３）。３つの世代にわたって均一な分布を提供することにより、効率的なトランスフェクション試薬（ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥと組み合わせて）が得られたが、表面上（第３世代）のみに電荷が集中することで、ＤＮＡトランスフェクションが有意に低下した。本明細書（例えば、上記表１）に開示される第３世代デンドリマーバリアントに関する本調査により、効率的なトランスフェクションのためには、樹状構造における電荷分布が、足場内のアミノ酸のトポロジー及びキラリティよりも重要であることが分かる。

【0218】

本発明者らは、世代数がトランスフェクションに重要であり、世代数の増加がトランスフェクション効率を増強する傾向があることを実証する。改善されたトランスフェクション効率は、改善された複合体安定性と一致する。例えば、Ｇ１，２，３－ＲＬは、血清条件でのトランスフェクション及びインビボ遺伝子送達に非常に有効なデンドリマーである（データは示さず）。

【0219】

全身投与により、Ｇ１，２，３－ＲＬ－ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ複合体は、アッセイされる全ての組織における機能的遺伝子発現のためのＤＮＡを送達する。遺伝子発現は、肝臓及び骨格筋において特に高く、毒性は観察されなかった。全ての異なる組織へのＤＮＡの送達は、Ｇ１，２，３－ＲＬ及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ複合体が、全ての細胞型において異なるレベルで発現されるカーゴ取り込みプロセスであるクラスリン媒介性エンドサイトーシス、カベオラ媒介性エンドサイトーシス、及びマクロピノサイトーシスを介して細胞内在化を媒介し得るという観察と一致する（データは示さず）。

【0220】

Ｇ１，２，３－ＲＬ、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ、ＤＮＡ組成物の生体分布は、当該分野で記載されている他の系とは異なる。例えば、脂質ベース、ペプチドベースの系、及びデンドリマーＰＡＭＡＭ足場は、主にＩＶ投与後に肺及び脾臓にＤＮＡを送達することが観察された。ＰＥＩ及び両親媒性ペプチドは、ＤＮＡを肺及び肝臓に効果的に送達したが、ＰＥＩの使用で毒性が観察された。対照的に、本発明は、毒性なしに筋肉に送達する有効な手段を提供する。腎臓及び脾臓における比較的低い遺伝子発現は、本発明の組成物が腎臓及び細網内皮系によるクリアランスに供されないことを意味する。したがって、肝臓における高い遺伝子発現は、主に肝細胞及び星細胞への送達を示唆する（データは示さず）。

【0221】

本発明の組成物は、核酸を脳に機能的に送達することもできる。血液脳関門（blood brain barrier、ＢＢＢ）を通る又はその周囲の経路は確かではないが、内皮細胞がカーゴを障壁の一端でエンドサイトーシスし、他端でエキソサイトーシスするプロセスであるトランスサイトーシスが可能である。トランスサイトーシスは、ボラ型両親媒性物質系などの他の合成系によってＢＢＢを迂回してカーゴを送達することが報告されている。

【0222】

驚くべきことに、本発明の組成物は、ほとんどの非ウイルス遺伝子送達系がこの標的への効果的でない送達を示すという事実にもかかわらず（データは示さず）、ＤＮＡを骨格筋に効果的に送達する。骨格筋は、カベオリン３（caveolin 3、Ｃａｖ３）のみを発現し、これは、本発明の送達系がＣａｖ３成分と相互作用して有効な細胞内在化を媒介することを示唆し得る。

【0223】

本発明のペプチドデンドリマーは、アミノ酸組成、デンドリマーのトポロジー、並びにＣ末端及びＮ末端上の可能な修飾に関して利用可能である大きな化学的空間を有する、効率的かつ潜在的に標的に合わせたトランスフェクション試薬を提供する、汎用性のプラットフォームを表す。ペプチドデンドリマー／ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ系は、生物学的障壁を迂回して、他のアジュバントなしでＤＮＡプラスミドを細胞核にインビボで送達することができる。エンドソーム脱出及び／又は核局在化を助ける細胞特異的標的化ドメイン、ペプチド、又は他の分子をデンドリマーにコンジュゲートして、細胞／組織標的化送達及び遺伝子発現を更に改善することができることが想定される。

【0224】

材料及び方法
分取ＲＰ－ＨＰＬＣ後に、Ｇ１，２，３－ＫＬ（（ＫＬ）_８（ＫＫＬ）_４（ＫＫＬ）_２ＫＧＳＣ－ＮＨ_２）を泡状無色固体として得た（７２．３ｍｇ、１０．３μｍｏｌ、９％）。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝１．４７分（２．２分でＡ／Ｄ １００／０～０／１００、λ＝２１４ｎｍ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ_２１８Ｈ_４２２Ｎ_６０Ｏ_３９Ｓ計算値／実測値：４５４０．１／４５３９．０［Ｍ］^＋。

【0225】

分取ＲＰ－ＨＰＬＣ後に、Ｇ１，２－ＫＬ（（ＫＬ）_４（ＫＫＬ）_２ＫＧＳＣ－ＮＨ_２）を泡状無色固体として得た（９０．５ｍｇ、２７．９μｍｏｌ、４１％）。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝１．３６分（２．２分でＡ／Ｄ １００／０～０／１００、λ＝２１４ｎｍ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ_９６Ｈ_１８２Ｎ_２８Ｏ_１９Ｓ計算値／実測値：２０９６．８／２０９６．０［Ｍ］^＋。

【0226】

分取ＲＰ－ＨＰＬＣ後に、Ｇ１－ＫＬ（（ＫＬ）_２ＫＧＳＣ－ＮＨ_２）を泡状無色固体として得た（４６．０ｍｇ、４１．７μｍｏｌ、６０％）。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝１．２３分（２．２分でＡ／Ｄ １００／０～０／１００、λ＝２１４ｎｍ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ_３８Ｈ_７４Ｎ_１２Ｏ_９Ｓ計算値／実測値：８７５．１／８７５．４［Ｍ］^＋。

【0227】

分取ＲＰ－ＨＰＬＣ後に、Ｇ１，２，３－ＲＬ（（ＲＬ）_８（ＫＲＬ）_４（ＫＲＬ）_２ＫＧＳＣ－ＮＨ_２）を泡状無色固体として得た（１４．６ｍｇ、２．０μｍｏｌ、２％）。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝１．５０分（２．２分でＡ／Ｄ １００／０～０／１００、λ＝２１４ｎｍ）。ＨＲＭＳ（ＮＳＩ＋）：Ｃ_２１８Ｈ_４２２Ｎ_８８Ｏ_３９Ｓ計算値／実測値：４９３２．３／４９３１．４［Ｍ］^＋；５１０６．３／５１０５．７［Ｍ＋ＴＦＡ＋Ｎａ＋Ｋ］^＋；５２２０．３／５２１９．９［Ｍ＋２ＴＦＡ＋Ｎａ＋Ｋ］^＋；５６１６．４／５６１６．３［Ｍ＋６ＴＦＡ］^＋；５７３０．４／５７３０．３［Ｍ＋７ＴＦＡ］^＋；５８４４．５／５８４４．３［Ｍ＋８ＴＦＡ］^＋；５９５８．５／５９５８．３［Ｍ＋９ＴＦＡ］^＋；６０７２．５／６０７２．３［Ｍ＋１０ＴＦＡ］^＋。

【0228】

分取ＲＰ－ＨＰＬＣ後に、Ｇ１，２－ＲＬ（（ＲＬ）_４（ＫＲＬ）_２ＫＧＳＣ－ＮＨ_２）を泡状無色固体として得た（１４３．２ｍｇ、４２．１μｍｏｌ、３８％）。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝１．４５分（２．２分でＡ／Ｄ １００／０～０／１００、λ＝２１４ｎｍ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ_９６Ｈ_１９０Ｎ_４０Ｏ_１９Ｓ計算値／実測値：２２６４．９／２２６４．０［Ｍ］^＋。

【0229】

分取ＲＰ－ＨＰＬＣ後に、Ｇ１－ＲＬ（（ＲＬ）_２ＫＧＳＣ－ＮＨ_２）を泡状無色固体として得た（７８．５ｍｇ、５６．６μｍｏｌ、５１％）。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝１．３７分（２．２分でＡ／Ｄ １００／０～０／１００、λ＝２１４ｎｍ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ_３８Ｈ_７４Ｎ_１６Ｏ_９Ｓ計算値／実測値：９３１．２／９３１．２［Ｍ］^＋；１０４５．２／１０４５．４［Ｍ＋１ＴＦＡ］^＋。

【0230】

分取ＲＰ－ＨＰＬＣ後に、Ｇ１，２－ＬＫ，３－ＫＬ（（ＫＬ）_８（ＫＬＫ）_４（ＫＬＫ）_２ＫＣＧＳＣ－ＮＨ_２）を泡状無色固体として得た（５６．７ｍｇ、８．１μｍｏｌ、７％）。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝１．４７分（２．２分でＡ／Ｄ １００／０～０／１００、λ＝２１４ｎｍ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ_２１８Ｈ_４２２Ｎ_６０Ｏ_３９Ｓ計算値／実測値：４５４０．１／４５３９．０［Ｍ］^＋。

【0231】

分取ＲＰ－ＨＰＬＣ後に、Ｇ１，２，３－ＬＫ，（（ＬＫ）_８（ＫＬＫ）_４（ＫＬＫ）_２ＫＧＳＣ－ＮＨ_２）を泡状無色固体として得た（３２．４ｍｇ、４．６μｍｏｌ、４％）。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝１．４１分（２．２分でＡ／Ｄ １００／０～０／１００、λ＝２１４ｎｍ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ_２１８Ｈ_４２２Ｎ_６０Ｏ_３９Ｓ計算値／実測値：４５４０．１／４５３９．０［Ｍ］^＋。

【0232】

Ａｌａ－Ｇ１，２，３－ＫＬ（（ＬｙｓＬｅｕ）_８（ＬｙｓＬｙｓＬｅｕ）_４（ＬｙｓＬｙｓＬｅｕ）_２ＬｙｓＧｌｙＳｅｒＡｌａ－ＮＨ_２を、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ（登録商標）樹脂（５００ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ ｇ－１）から得、Ａｌａ－Ｇ１，２，３－ＫＬを、分取ＲＰ－ＨＰＬＣ後に泡状無色固体として得た（３６．６ｍｇ、５．２μｍｏｌ、５％）。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ：ｔＲ＝１．４６分（２．２分かけて１００％Ａ：１００％Ｄ、λ＝２１４ｎｍ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ_２１８Ｈ_４２２Ｎ_６０Ｏ_３９実測値／計算値：４５０８．０／４５０８．１［Ｍ］^＋。

【0233】

分取ＲＰ－ＨＰＬＣ後に、Ｇ１，２，３－Ｋ（（Ｋ）_８（ＫＫ）_４（ＫＫ）_２ＫＧＳＣ－ＮＨ_２）を泡状無色固体として得た（７９．９ｍｇ、１４．６μｍｏｌ、１２％）。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝１．１７分（２．２分でＡ／Ｄ １００／０～０／１００、λ＝２１４ｎｍ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ_１３４Ｈ_２６８Ｎ_４６Ｏ_２５Ｓ計算値／実測値：２９５５．９／２９５６．０［Ｍ］^＋。

【0234】

分取ＲＰ－ＨＰＬＣ後に、Ｇ０，１，２，３－ＫＬ（（ＫＬ）_８（ＫＫＬ）_４（ＫＫＬ）_２ＫＫＬＣ－ＮＨ_２）を泡状無色固体として得た（５４．２ｍｇ、７．５μｍｏｌ、６％）。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝１．４７分（２．２分でＡ／Ｄ １００／０～０／１００、λ＝２１４ｎｍ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ_２２５Ｈ_４３７Ｎ_６１Ｏ_３８Ｓ計算値／実測値：４６３７．３／４６３８．０［Ｍ］^＋。

【0235】

分取ＲＰ－ＨＰＬＣ後に、Ｄ－Ｇ１，２，３－ＫＬ（（ｋｌ）_８（ｋｋｌ）_４（ｋｋｌ）_２ｋｇｓｃ－ＮＨ_２）を泡状無色固体として得た（２８．３ｍｇ、４．０μｍｏｌ、５％）。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ：ｔ_Ｒ＝１．４４分（２．２分でＡ／Ｄ １００／０～０／１００、λ＝２１４ｎｍ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ_２１８Ｈ_４２２Ｎ_６０Ｏ_３９Ｓ計算値／実測値：４５４０．１／４５４０．０［Ｍ］^＋、少量の不純物を含有

【0236】

ＤＮＡトランスフェクション
細胞株、トランスフェクション試薬、及びプラスミド。ＨｅＬａ細胞を、５％ＣＯ_２及び３７℃の加湿雰囲気中で、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ及び１％（ｖ／ｖ）Ｐ／Ｓを含むＲＰＭＩ培地中で維持した。プラスミドｐＣＩ－Ｌｕｃは、ルシフェラーゼ遺伝子が挿入されたプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）から誘導された。分岐ＰＥＩ（２５ｋＤａ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌ２０００）及びリポフェクチン（ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ（１：１（ｗ／ｗ））は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。ＰＥＩ、Ｌ２０００、及びリポフェクチンを製造者の指示に従って陽性対照トランスフェクション剤として使用した。

【0237】

トランスフェクション手順。トランスフェクションの２４時間前に、ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートに播種して（１００μＬ／ウェル中１０，０００細胞）、７０％コンフルエンスに到達させた。プラスミドトランスフェクション複合体は、デンドリマー（１００μＬ、Ｎ／Ｐ比に応じて６０μｇ～１０５μｇ）をリポフェクチン（４μｇ；１００μＬ）と混合することによって形成した。これらの混合物を、ｐＣＩ－Ｌｕｃ（４μｇ；１００μＬ）とともに、２５℃で３０分間、ＯｐｔｉＭＥＭ中において異なるＮ／Ｐ比でインキュベートした。トランスフェクション対照複合体（ＰＥＩ、リポフェクチン又はＬ２０００）（ＯｐｔｉＭＥＭ中合計１００μＬ）を、それぞれの製造業者の推奨濃度でｐＣＩ－Ｌｕｃ（４μｇ；１００μＬ）と混合した。無血清培地中でのトランスフェクションのために、ＤＮＡ複合体を細胞上に重層する前に、ＯｐｔｉＭＥＭを添加して複合体を希釈し、各複合体が９６ウェルプレートの１つのウェル中に１００μＬの総容量中に０．２５μｇのＤＮＡを含有するようにした。血清培地中でのトランスフェクションのために、ＤＮＡ複合体を細胞上に重層する前に、完全成長培地を添加して複合体を希釈し、各複合体が９６ウェルプレートの１つのウェル中に１００μＬの総容量中に０．２５μｇのＤＮＡを含有するようにした。細胞から完全培地を除去した後、複合体をプレートに加えた。プレートを３７℃で４時間インキュベートした。次いで、トランスフェクション溶液を完全成長培地で２４時間置換してから、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。

【0238】

導入遺伝子発現アッセイ。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、レポーター溶解緩衝液（２０μＬ、Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに４℃で２０分間、次いで－８０℃で一晩インキュベートした。細胞を室温で解凍した後、ルシフェラーゼアッセイ緩衝液（１００μＬ、Ｐｒｏｍｅｇａ；製造者のプロトコルに従って調製した）を各ウェルに加えた。発光生成物を、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａルミノメーター（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）において相対光単位（Relative Light Unit、ＲＬＵ）によって測定した。

【0239】

タンパク質含量決定。溶解物（２０μＬ）をＢｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（１８０μＬ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫ）と混合することによって、各細胞溶解物のタンパク質含量を決定した。１０分間のインキュベーション後、５９０ｎｍでの吸光度を測定し、ＢＳＡ標準曲線を使用してタンパク質濃度に変換した。タンパク質１ｍｇ当たりのＲＬＵは、ルシフェラーゼ活性を表した。これら２つの値の比が、タンパク質単位当たりの活性（ＲＬＵ／ｍｇ）である。トランスフェクション図に示された値は、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥを用いた対照トランスフェクション実験に対して正規化した後に表され、パーセンテージとして示されている。

【0240】

細胞生存率。細胞を「トランスフェクション手順」に記載したようにトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。その後、細胞を室温で１時間乾燥させた（核染色剤を浸透させるため）。クリスタルバイオレット溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈによって供給されたストック溶液５０μＬ）を細胞に添加した。それらを室温で１５分間インキュベートした。蒸留水（５回）で洗浄した後、細胞を室温で３０分間乾燥させた。次いで、ＭｅＯＨ（２００μＬ）を添加し、懸濁液を室温で１時間インキュベートした。生細胞によって保持されたクリスタルバイオレット染色剤の相対量を、５５０ｎｍでのメタノール溶液の吸光度によって決定した。

【0241】

蛍光消光アッセイ
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＮＡに添加し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加して、最終ＤＮＡ濃度０．００２μｇ／μＬとした。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎをＤＮＡに１：１５０（ｖ／ｖ）の比で添加し、１００μＬの溶液ごとに０．２μｇのＤＮＡを含有させた。混合物を室温で１０分間インキュベートした。インキュベーションの間、異なる量のトランスフェクション試薬をＴＥ緩衝液で希釈した。次いで、５０μＬのリポフェクチン（０．２μｇ）及び５０μＬのデンドリマー（量は、０．６２５：１から４０：１まで変化させた選択されたＮ／Ｐ比に依存する）を、平底９６ウェルプレートのウェルごとに添加した。その後、１００μＬのＤＮＡ－ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ溶液（０．２μｇ ＤＮＡ）をウェルごとに添加した。対照として、１００μＬのＤＮＡ－ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ溶液（０．２μｇ ＤＮＡ）を１００μＬのＴＥ緩衝液に添加した。室温で３０分間インキュベートした後、１００μＬのＴＥ緩衝液を各ウェルに添加した。次いで、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎシグナルを、蛍光プレートリーダー（ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ，ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて、４８５ｎｍでの励起及び５２０ｎｍでの発光で検出した。複合体からのＰｉｃｏＧｒｅｅｎシグナルをＤＮＡ対照に対して正規化して、検出されたＰｉｃｏＧｒｅｅｎシグナルのパーセンテージを得た。

【0242】

複合体解離アッセイ
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＮＡに添加し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１ｍＭ ＥＤＴＡ）で０．００２μｇ／μＬの最終ＤＮＡ濃度まで希釈した（１００μＬごとの溶液が０．２μｇのＤＮＡを含有するように、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎを１：１５０（ｖ／ｖ）の比でＤＮＡに添加した）。混合物を室温で１０分間インキュベートした。インキュベーションの間、異なる量のトランスフェクション試薬をＴＥ緩衝液で希釈した。次いで、５０μＬのリポフェクチン（０．２μｇ）及び５０μＬのデンドリマー（量は、０．６２５：１から４０：１まで変化させた選択されたＮ／Ｐ比に依存する）を、平底９６ウェルプレートのウェルごとに添加した。その後、１００μＬのＤＮＡ－ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ溶液（０．２μｇ ＤＮＡ）をウェルごとに添加した。対照として、１００μＬのＤＮＡ－ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ溶液（０．２μｇ ＤＮＡ）を１００μＬのＴＥ緩衝液に添加した。室温で３０分間インキュベートした後、１００μＬのＴＥ緩衝液で希釈した異なる濃度のヘパリン（０．２～１．４Ｕ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ＤＮＡ複合体又はＤＮＡ単独（０．２μｇ、総体積２００μＬ）に添加した。室温で３０分間インキュベートした後、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎからの蛍光シグナルを、マイクロプレートリーダー（ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ，ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して、励起４８５ｎｍ及び発光５２０ｎｍで記録した。ＤＮＡ対照を用いてシグナルを正規化した。

【0243】

インビボルシフェラーゼＤＮＡ発現アッセイ
デンドリマー、脂質、及びＤＮＡ製剤をマウスに注射し、組織を単離し、静脈内及び筋肉内注射のそれぞれ２４時間後及び４８時間後にルシフェラーゼ発現分析のために急速凍結した。

【0244】

組織を、プロテアーゼ阻害剤を補充した１×レポーター溶解緩衝液でホモジナイズした。組織に応じて、１．５～３倍の溶解緩衝液を組織のホモジナイズに使用した。ホモジナイズ後、溶解物を遠心分離し、上清をルシフェラーゼ発現及びタンパク質含量のアッセイに使用した。ルシフェラーゼ発現レベルを、製造業者の指示に従って、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ルミノメーターで測定した。Ｂｉｏｒａｄタンパク質アッセイキットを使用して、製造業者の指示に従って５９５ｎｍの吸光度でタンパク質含量を測定した。

【0245】

インビボルシフェラーゼｍＲＮＡ発現アッセイ
ペプチドデンドリマー－脂質－ｍＲＮＡ粒子
ペプチドデンドリマーをそれぞれの濃度に希釈し、ＮＰ＝０．１５：１又は８：１などの所望のＮＰ比のためにｍＲＮＡと混合した。溶液を室温で１０分間インキュベートした。ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥなどの脂質をそれぞれの濃度に希釈し、ＮＰ＝４．７：１などの所望のＮＰ比のためにデンドリマー－ｍＲＮＡ複合体と混合した。溶液を室温で２０分間インキュベートした。必要に応じて、注射前に溶液を更に希釈する。

【0246】

脂質－ｍＲＮＡ粒子制御
ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥをそれぞれの濃度に希釈し、デンドリマー－ｍＲＮＡ複合体と混合した。溶液を室温で２０分間インキュベートした。必要に応じて、注射前に溶液を更に希釈する。

【0247】

マウス及び送達経路
本発明者らの研究において行われた全ての動物手順は、ＵＫ法に従っており、倫理承認を含んでいた。６～８週齢の雌ＣＤ－１マウス（ｎ＝３９）を、到着時に１週間馴化させた。全てのマウスを秤量し、製剤を、３０Ｇインスリンシリンジ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して尾静脈を介して静脈内に送達した（１００μｌ）。

【0248】

生物発光イメージング（Bioluminescence imaging、ＢＬＩ）
全てのマウスを注射の６時間後に撮像した。ＢＬＩは、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）イメージングシステムを使用して実施した。マウスにＤ－ルシフェリン（３０ｍｇ／ｍＬ、ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を１５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。マウスを、５％イソフルランを含むチャンバー内でＤ－ルシフェリンを投与した６分後に麻酔し、次いで、２．５％イソフルランで維持しながら、加熱したイメージングプラットフォーム上に置いた。得られたシグナルが有効な検出範囲（オープンフィルター、ビニング８、ｆ－ストップ１）内にあることを確実にするように設定された曝露時間で、Ｄ－ルシフェリン投与の１０分後にマウスを撮像した。生物発光シグナルを、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、規定された関心領域（region of interest、ＲＯＩ）における光子束（光子／秒）を測定することによって定量した。インビボ全身イメージングの後、マウスを安楽死させ、心臓血液を採取し、エクスビボイメージングのために組織を抽出した。ここで、各組織を、ＰＢＳ中に０．３ｍｇ／ｍＬのＤ－ルシフェリンを含有する２４ウェルイメージングプレート（黒色面、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）の個々のウェルに入れた。イメージングプレートをイメージングプラットフォーム（Ｌｕｍｉｎａ ＩＩシステム）の中心に置き、上で詳述した取得設定を使用してシグナルを測定した。最後に、組織を保存バイアルに入れ、液体窒素中で急速冷凍した。

【0249】

エンドサイトーシス実験
細胞を各阻害剤（クロルプロマジン、ゲンステイン（genstein）、及びロットレリン）とともに３７℃で３０分間プレインキュベートした。続いて、トランスフェクションのセクションに記載したように、阻害剤の存在下、３７℃で更に４時間、トランスフェクションを実施した。

【0250】

インビボ研究
ＤＮＡを含む組成物を使用したＦＳＴ発現の誘導
１日目及び３日目に、フォリスタチンを発現するＤＮＡを単独で、又はフォリスタチンを発現するＤＮＡをＧ１，２，３－ＲＬ及びＤ／Ｄ脂質とともにマウスに注射した。５日目に、ＲＮＡ抽出のために組織を採取した。次いで、ｑＰＣＲのためにｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。マウスの骨格筋におけるフォリスタチン（follistatin、ＦＳＴ）の相対的発現レベルを図６に示す。

【0251】

免疫原性／忍容性
体重を、上記で議論したＤＮＡ送達のためのタイプのＩＶプロトコルの間にモニタした。重量損失は観察されなかった（図７を参照されたい）。

【0252】

１日目及び３日目に、注射を受けなかったマウス、又はＤＮＡのみ若しくはＤＮＡ、Ｇ１，２，３－ＲＬ及びＤ／Ｄ製剤を静脈内注射したマウスについて、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（Aspartate aminotransferase、ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（Alanine aminotransferase、ＡＬＴ）レベルもモニタした。全ての群について、ＡＳＴレベルは実質的に２００Ｕ／Ｌ未満のままであり、ＡＬＴレベルは１００Ｕ／Ｌ未満のままであった。（ＡＳＴ及びＡＬＴのこれらのレベルは、肝臓損傷（四塩化炭素によって誘導される）の疾患モデルにおける７０００Ｕ／Ｌを超える閾値レベルよりもはるかに低い（Ｂｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ ２００８））。

【0253】

免疫原性をチェックするために、マウスにおいてサイトカインレベルも測定した。ＡＳＴ及びＡＬＴレベルの測定のために５日目に血清を採取した。実質的な上昇は観察されなかった。ＩＦＮ－ガンマについて、レベルは２ｐｇ／ｍＬ未満のままであり、有意な増加はなかった（他の非ウイルス系はＩＦＮ－ガンマを６０，０００ｐｇ／ｍＬまで上昇させることができた（Ｂｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ ２００８））。ＴＮＦ－アルファについては、レベルは２０ｐｇ／ｍＬ未満のままであり、有意な増加はなかった（リポ多糖類はＴＮＦ－アルファを５０００ｐｇ／ｍＬまで増加させることができた（Ｂｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ ２００８））。ＩＬ－６については、本発明の組成物を投与したマウス群のレベルは、２０ｐｇ／ｍＬ未満のままであり、有意な増加はなかった（他の非ウイルス系は、ＩＬ－６レベルを１５０００ｐｇ／ｍＬまで増加させることができた（Ｂｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ ２００８））。ＩＬ－１ベータ及びＩＬ－１０についても、レベルは非常に低いままであり、有意な増加はなかった。

【0254】

ＤＮＡを含む組成物を使用したルシフェラーゼ発現の誘導
注射後のルシフェラーゼ発現を検出するために調製したデンドリマー、脂質、及びＤＮＡ製剤をマウスに注射した。静脈内及び筋肉内注射のそれぞれ２４時間後及び４８時間後に、組織を単離し、ルシフェラーゼ発現分析のために急速凍結した。

【0255】

静脈内注射されたＧ１，２，３－ＲＬ及びＧ１，２，３－ＬＲの両方を含む組成物は、ルシフェラーゼ発現によって決定されるような、骨格筋へのＤＮＡの標的化送達を標的とし、Ｇ１，２，３－ＬＲは、骨格筋への最も有効な送達を示した（図８）。

【0256】

筋肉内注射されたＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲを含む組成物はまた、ルシフェラーゼ発現によって決定されるように、骨格筋にＤＮＡを送達することができる（図９）。

【0257】

ｍＲＮＡを含む組成物を使用したルシフェラーゼ発現の誘導
ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥと、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡと、Ｇ１，２，３－ＲＬ（図１０、上パネル；「Ｇ１，２，３－ＲＬ、脂質、及びｍＲＮＡ製剤」）又はＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（図１０、下パネル；（「Ｇ１，２，３－ＲＬ、脂質、及びｍＲＮＡ製剤」）のいずれかと、を含む組成物をマウスに注射した。各製剤を調製し、８：１及び０．１５：１のＮＰ比で注射した。注射後のルシフェラーゼ発現を検出するためにマウスを準備した。

【0258】

Ｇ１，２，３－ＲＬ又はＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ製剤のいずれかのＮＰ比を変化させると、マウス組織におけるｍＲＮＡの生体内分布が変化する。０．１５：１のＮＰ比は、脾臓及びより低い程度でリンパ節を特異的に標的とするＮＰ＝８：１と比較して、肺、脾臓、及びリンパ節を含む広範囲の免疫細胞組織を標的とする（図１０）。これは、組成物のＮＰ比を変化させることによって、組成物の組織分布が変化し得ることを実証する。例えば、ＮＰ比の増加は、リンパ系器官への標的化を改善することができる。

【0259】

Ｇ１，２，３－ＲＬ及びＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ、脂質、並びにｍＲＮＡ製剤はまた、筋肉、肝臓、心臓、腎臓、及び脂肪組織を含む組織にｍＲＮＡを首尾よく送達することができる（図１１）。特に、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ、脂質、及びｍＲＮＡ製剤は、８：１又は０．１５：１のいずれかのＮＰ比で、腓腹筋及び大腿四頭筋組織、肝臓、心臓、腎臓、及び脂肪組織において有意な発現を誘導することができた。

【0260】

ルシフェラーゼ発現の比較を、Ｇ１，２，３－ＲＬと、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥと、ｍＲＮＡと、を含む組成物を注射したマウスと、Ｇ１，２－ＲＬ．３－ＬＲと、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥと、ｍＲＮＡと、を含む組成物を注射したマウスとの間で実施した。試験した全ての組織への送達の増加が、Ｇ１，２，３－ＲＬと比較してＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲについて観察された（図１２）。これは、デンドリマー配列の選択が、特定の組織を標的とするために使用され得ることを実証する。

【0261】

反復投与実験
組成物を繰り返し投与し、組織への送達を維持することができるかどうかを決定するために、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ、ｍＲＮＡ及びペプチドデンドリマーの単回投与又は反復投与（２４時間間隔で２回投与）のいずれかを受けたマウス間の比較を実施した。いずれかの組成物を２回投与されたマウスは、ｍＲＮＡ単独と比較してルシフェラーゼ発現の増加を示した。典型的には、２回投与を受けたマウスにおけるルシフェラーゼ発現は、単回投与を受けたマウスと比較して、ほぼ同程度のルシフェラーゼ発現又は増加したルシフェラーゼ発現のいずれかを示した。ルシフェラーゼ発現を処理の６時間後にアッセイした。

【0262】

組織／細胞標的化ペプチド－デンドリマー融合タンパク質
ルシフェラーゼ発現の比較を、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥと、ｍＲＮＡと、Ｇ１，２，３－ＲＬ、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ、又はＮＸＴ１のうちの１つと、を含む組成物間で実施した（図１４）。ＮＸＴＩデンドリマーは、筋肉標的化ペプチド及び細胞透過性ペプチドを含むコアペプチド配列を有するＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲデンドリマーを含む。ＮＸＴ１は、筋肉を含む多くの組織へのｍＲＮＡ送達を媒介する上で、Ｇ１，２，３－ＲＬ及びＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲよりも有効である。驚くべきことに、ＮＸＴ１はまた、Ｇ１，２，３－ＲＬ及びＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲと比較して、脾臓及びリンパ節へのｍＲＮＡの送達においてより有効である。ＮＸＴ１及びＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲは、肺へのｍＲＮＡの送達において同様の効率を示す。

【0263】

デンドリマーは、脂質単独と比較して、組織へのｍＲＮＡ送達を増加させる
デンドリマーの存在が組織へのｍＲＮＡの送達を改善するかどうかを決定するために、：ｉ）ｍＲＮＡ単独；ｉｉ）ｍＲＮＡ及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ；ｉｉｉ）Ｇ１，２，３－ＲＬ、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ、及びｍＲＮＡ；ｉｖ）Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ、及びｍＲＮＡ、又はｖ）ＮＴＸ１、ｍＲＮＡ、及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ、のいずれかを含む組成物をマウスに注射して、注射後のルシフェラーゼ発現の検出のために準備した。各デンドリマー組成物中のＮＰ比は、０．１５：１であった。図１５に実証されるように、Ｇ１，２，３－ＲＬ、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ、及びＮＴＸ１のいずれかの存在は、ｍＲＮＡ単独又はｍＲＮＡ及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ単独と比較して、肺、脾臓、及びリンパ節へのｍＲＮＡ送達の効率を改善する。

【0264】

ｉ）ｍＲＮＡ単独、ｉｉ）ｍＲＮＡ、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ、及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ、又はｉｉｉ）ｍＲＮＡ及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ、のいずれかを含む組成物を注射したマウス間でも比較を実施した。この実験におけるＮＰ比は、８：１であった。これは、脾臓へのｍＲＮＡ送達が、ｍＲＮＡ単独又はｍＲＮＡ及び脂質と比較して、デンドリマーの存在下で有意に増強されることを実証する。更に、肺、及びリンパ節におけるルシフェラーゼの発現は、脂質単独と比較して、デンドリマーを含む組成物において減少する。このデータは更に、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲが、ＤＯＴＡ／ＤＯＰＥ単独と比較して、脾臓へのｍＲＮＡ送達の特異性を改善することを実証する。

【0265】

市販の脂質送達系に対するデンドリマー：脂質送達系の比較
Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ＮＰ＝０．１６：１）を含む組成物又は市販のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００のいずれかを使用して、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。図１７の左上のパネルに示すように、ＮＰ比＝０．１６：１のＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥを含む組成物は、市販のトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００と比較して、インビトロでのトランスフェクション効率を約１桁増加させる。同様に、ＮＰ比＝０．１６：１のＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥを使用してｅＧＦＰをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＤＭＧ－ＰＥＧ脂質ナノ粒子送達系を使用してトランスフェクトしたｍＲＮＡと比較して、ｅＧＦＰ発現を約４倍増加させた（図１７、右上パネル）。

【0266】

ｍＲＮＡ単独、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（Ｎ：Ｐ＝８：１）及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）とｍＲＮＡ、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）とｍＲＮＡ、ポリエチレンイミンとｍＲＮＡ、及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００とｍＲＮＡ、のいずれかをＣ２Ｃ１２細胞に２４時間トランスフェクトした。図１７の下パネルに示されるように、デンドリマー製剤は、市販の脂質ベースのトランスフェクション試薬と比較して、Ｃ２Ｃ１２細胞へのｍＲＮＡの送達を改善する。

【0267】

インビトロＣＲＩＳＰＲ実験
Ｌａｂｅｌ ＩＴ（登録商標）核酸標識キット（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ）を製造説明書に従って使用してＲＮＡを標識した。簡潔に述べると、ｔｒａｃｅｒＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）と融合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）からなる単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をＴＭ－ローダミンフルオロフォアで標識し、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをＣｙ５フルオロフォアで標識した。ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡを、それぞれフルオレセイン及びＡＴＴＯ ５５０フルオロフォアでタグ化した。

【0268】

ＨｅＬａ細胞に、（１）ＮＰ比＝０．１５：１のＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ、又は（２）ＮＰ比＝８：１のＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥのいずれかの製剤と標識ＲＮＡの異なる組み合わせをトランスフェクトした。全ての組成物における脂質対ＲＮＡ比は１０：１ ｗ／ｗであり、ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥは１：１の重量比であった。細胞を各製剤とともに２時間インキュベートし、続いてトリプシン処理し、固定した。細胞におけるＲＮＡ取り込みのパーセンテージを、フローサイトメトリーによってアッセイした。製剤を含まないＲＮＡのみを対照として使用した。

【0269】

ｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ製剤に曝露されたＨｅＬａ細胞のおよそ１００％が、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡに対して二重陽性であることが分かり、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲデンドリマーが非常に有効なトランスフェクション試薬であることを実証した（図１８）。

【0270】

ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡを含むデンドリマー及び脂質製剤において、デンドリマー製剤は、細胞の約４％において３つ全ての成分の送達を媒介することができる（図１９）。ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、又はＣａｓ９ ｍＲＮＡのうちの１つのみを含むデンドリマー及び脂質製剤では、陽性細胞のパーセンテージが変動する。ｔｒＲＮＡ又はＣａｓ９ ｍＲＮＡのいずれかを含む組成物では、細胞の約１００％が核酸について陽性である。対照的に、ｃｒＲＮＡのみを含む組成物に曝露された場合、細胞の４％のみがｃｒＲＮＡに対して陽性である（図２０）。まとめると、このデータは、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲデンドリマーが、細胞への比較的短いＲＮＡ（例えば、本研究において使用されるｃｒＲＮＡは、３６ヌクレオチド長であった）の送達を首尾よく媒介することができる一方で、トランスフェクトされるＲＮＡの長さが増加するにつれて、ＲＮＡの送達の成功が増加することを実証する（本研究において使用されるｔｒＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡは、それぞれ、６７及び５４２１ヌクレオチド長であった）。

【0271】

免疫細胞標的化
１５匹の５～７週齢の雌ＣＤ－１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＵＫ）に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８のみで標識されたｍＲＮＡ、又はＮＴＸ１及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥを有するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識されたｍＲＮＡ、又はＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥを有するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識されたｍＲＮＡ、又はＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥを有するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識されたｍＲＮＡのいずれか１ｍｇ／ｋｇを、それぞれ、５ｍｌ／ｋｇの用量体積を使用する静脈内注射によって投与した。群１にはビヒクルを与え、群５には対照としてｍＲＮＡのみを与えた。全ての群のマウスを、ＩＶ投与の２時間後に殺処分した。安楽死の時点で、全血、脾臓、鼠径リンパ節、及び大腿骨を全てのマウスから収集した。フローサイトメトリー分析のために、ＥＤＴＡ処理した全血、脾臓、鼠径リンパ節、及び骨髄から白血球（White Blood Cell、ＷＢＣ）を得た。要約すると、骨髄（bone marrow、ＢＭ）を大腿骨から洗い流し、脾臓及びリンパ節を７０μｍフィルターに通すことによって単一細胞懸濁液に処理した。血液、ＢＭ及び脾臓中の赤血球を溶解した後、全ての組織から単離したＷＢＣを異なる抗体パネルで染色して、免疫細胞の特定の亜集団を同定した。９６ウェルプレートフォーマットで染色を実施した後、ＡＣＥＡ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ ３００５フローサイトメーターを使用して試料を分析した。

【0272】

ＮＴＸ１及びＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲは、脾臓に存在する免疫細胞におけるｍＲＮＡの取り込みを媒介した（図２１）。デンドリマー及び脂質とともに製剤化されたｍＲＮＡは、（Ａ）Ｂ細胞、（Ｂ）Ｔ細胞、（Ｃ）単球及びマクロファージ、（Ｄ）好中球、並びに（Ｅ）樹状細胞によって取り込まれた。特に、デンドリマー及び脂質製剤は、注射から比較的短い時間内（注射後２時間）に単球及びマクロファージ、好中球、並びに樹状細胞にｍＲＮＡを送達することができる。ＮＴＸ１（ＮＰ＝０．１５：１）及びＧ１，２－ＲＬ，３ＬＲ（ＮＰ＝０．１５：１及び８：１）は、単球／マクロファージ、好中球、及び樹状細胞の約５％以上へのｍＲＮＡの送達を媒介する。注射から組織採取までの期間が短いことを考慮すると、分析される免疫細胞型のそれぞれへのｍＲＮＡの送達が経時的に増加すると仮定することは妥当である。

【0273】

ＮＴＸ１及びＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲは、骨髄に存在する免疫細胞におけるｍＲＮＡの取り込みを媒介した（図２２）。デンドリマー及び脂質とともに製剤化されたｍＲＮＡは、（Ａ）単球及びマクロファージ、（Ｂ）樹状細胞、（Ｃ）ＣＤ３８＋細胞、（Ｄ）Ｂ細胞、並びに（Ｅ）好中球によって取り込まれた。特に、デンドリマー及び脂質製剤は、注射から比較的短い時間内（注射後２時間）に単球及びマクロファージ、好中球、並びに樹状細胞にｍＲＮＡを送達することができる。注射から組織採取までの期間が短いことを考慮すると、分析される免疫細胞型のそれぞれへのｍＲＮＡの送達が経時的に増加すると仮定することは妥当である。

【0274】

インビトロＤＮＡ送達
図２５の上のパネルは、ＤＮＡ単独、Ｇ１，２，３－ＲＬ（Ｎ：Ｐ＝５：１）及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ＤＮＡに対してｗ／ｗ＝１：１）とＤＮＡ、並びにＧ１，２，３－ＲＬ（Ｎ：Ｐ＝５：１）及びＤＯＰＧ／ＤＯＰＥ（ＤＮＡに対してｗ／ｗ＝１：１）とＤＮＡ、のいずれかをトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞におけるルシフェラーゼ発現を示す。Ｇ１，２，３－ＲＬ及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ又はＤＯＰＧ／ＤＯＰＥのいずれかを含む組成物は、インビトロでＨｅＬａ細胞を首尾よくトランスフェクトすることができる。

【0275】

同様に、図２５の下パネルは、ＤＮＡ単独、ポリエチレンイミンとＤＮＡ、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ（Ｎ：Ｐ＝８：１）及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ＤＮＡに対してｗ／ｗ＝１：１で）とＤＮＡ、並びにＮＴＸ２（Ｎ：Ｐ＝８：１）及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ＤＮＡに対してｗ／ｗ＝１：１）とＤＮＡ、のいずれかをトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞（筋肉由来細胞株）におけるルシフェラーゼ発現を示す。ＮＴＸ２は、筋標的化ペプチドＡＳＳＬＩＮＡ（（ＬＲ）８（ＫＲＬ）４（ＫＲＬ）２ＫＧＳＣＧＡＡＳＳＬＮＩＡ（Ａｃｐ）－ＮＨ２）にコンジュゲートされたＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲデンドリマーである。両方のデンドリマーは、インビトロでＣ２Ｃ１２細胞を首尾よくトランスフェクトすることができる。筋肉標的化ドメインを含むデンドリマーは、筋肉標的化ドメインを含まないデンドリマーと比較してトランスフェクション効率を更に増加させる。

【0276】

インビボ毒性アッセイ
マウスにｍＲＮＡ製剤を１回又は２回注射した。２回のＩＶ注射では、２回目の注射の２４時間前にマウスに注射した。２回目のＩＶ注射の６時間後、マウスの血漿を採取し、ＡＳＴレベル及び他のサイトカインレベルを測定した。１回注射したマウスについては、ＡＳＴレベル及び他のサイトカインレベル測定のために、注射の６時間後に血漿を採取した。

【0277】

アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）は、肝臓の健康の尺度として使用することができ、薬剤の肝臓毒性を決定するためのマーカーとしても使用することができるバイオマーカーである。試験した全てのデンドリマー－脂質－ｍＲＮＡ組成物は、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ単独を含む組成物と比較してＡＳＴレベルの有意な増加を示さず、実際には、ｍＲＮＡ単独と比較してＡＳＴレベルの減少を示した（図２６Ａ、上パネル）。これらの結果は、試験したデンドリマー組成物が有意な肝臓毒性を示さないことを示している。

【0278】

種々のデンドリマー－脂質－ｍＲＮＡ製剤の注射を受けたマウスにおいても、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６及びＩＬ－１βを測定した。図２６Ａの下パネル、並びに図２６Ｂの上及び下パネルに示すように、試験したデンドリマー組成物はいずれも、ｍＲＮＡ単独又はＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ及びｍＲＮＡ組成物と比較して、それぞれＴＮＦ－α、ＩＬ－６又はＩＬ－１βの血漿レベルを有意に増加させなかった。これらのデータは、デンドリマー組成物が、前記組成物に曝露されたマウスにおいて有意な免疫反応を引き起こさないことを実証する。これは更に、インビボでｍＲＮＡを組織に送達する際に使用するためのデンドリマー組成物の安全性を実証する。

【0279】

マウスにはまた、ＤＮＡ又はＧ１，２，３－ＲＬ、ＤＮＡ及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ組成物を含む製剤のいずれかを注射し、２４時間後にＡＳＴ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６及びＩＬ－１βの血漿レベルを測定した。図２７に示すように、デンドリマーを含む製剤の注射は、ＡＳＴ（左上）、ＴＮＦ－α（右上）、ＩＬ－６（左下）、又はＩＬ－１β（右下）のいずれの血漿レベルにおいても有意な増加を引き起こさなかった。これらのデータは、本発明のデンドリマーを使用するＤＮＡの送達が安全であり、肝臓損傷又はその間の有害な免疫反応を引き起こさないことを示す。

【0280】

ペプチドデンドリマートランスフェクション効率の比較
ｍＲＮＡ送達におけるデンドリマーの世代数に対する影響を、完全成長培地条件においてＨｅＬａ細胞をトランスフェクトすることによって研究した。本発明者らは、第１又は第２世代デンドリマー（例えば、ＲＨＣＧ１－Ｒ、ＲＨＣＧ１，２－Ｒ、ＲＨＣＧ１－ＬＲ、ＲＨＣＧ１－ＲＬ、２－ＬＲ）が細胞を効果的にトランスフェクトし、第３世代デンドリマーと同様のトランスフェクション効率を媒介することができることを示した（図２８）。第１又は第２世代デンドリマーは、完全成長培地中で第３世代デンドリマーと同様に細胞をトランスフェクトしないので、これは実際にＤＮＡトランスフェクションとは非常に異なる（図４）。興味深いことに、世代１又は世代２デンドリマーのＮ：Ｐ比を０．１６から８に増加させると、トランスフェクション効率が更に増加する（図２９）。

【0281】

本発明者らは、トランスフェクションに対するデンドリマーのコア配列の影響を研究した。本発明者らは、３つのアミノ酸のコア配列ＧＳＣを、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲから、ＫＡ及びＹＭなどの２つのアミノ酸のみに変えた。この変化はｍＲＮＡトランスフェクションに影響せず、コアに２つのアミノ酸を有するデンドリマーが、コアに３つのアミノ酸を有するデンドリマーと同様にトランスフェクトすることを示唆している。次に、本発明者らは、３つのアミノ酸のコア配列を、ＧＳＣと比較して、ＲＦＷ、ＲＹＭなどの異なるアミノ酸に置換する。カチオン性基を含有するアルギニンがコアに付加されるが、このアルギニンがトランスフェクションを改善又は減少させることはない。興味深いことに、３つのアミノ酸がコアにおいてＧＣＳからＲＨＣに変化すると、トランスフェクションは５０％改善する。これは、デンドリマーのコアにおけるヒスチジンなどのイオン化可能な基がトランスフェクションを改善し得ることを示唆する（図２８Ａ）。

【0282】

本発明者らは、デンドリマー（線状Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ）のコアに１２個のアミノ酸を導入したが、トランスフェクション効果は影響を受けなかった（図２８Ａ）。この結果は、トランスフェクション効率に影響を与えることなく、より長いアミノ酸鎖及び／又はより長い構造をコアに導入することが可能であることを示す。実際、コアに２７個のアミノ酸を含むＮＴＸ１は、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＲＬよりも効果的にトランスフェクトする。これは、より長いコア配列が、実際にトランスフェクションを増強し得ることを実証する。ＮＴＸ１からのトランスフェクションの増強は、コア配列内の細胞透過性ペプチドの存在による可能性が高い。

【0283】

本発明者らはまた、トランスフェクションにおける世代内のアミノ酸の数に対する影響を調査する。したがって、本発明者らは、１つのアミノ酸（Ｒ）、２つのアミノ酸（ＲＬ又はＬＲ）、３つのアミノ酸（ＲＬＲ）、及び４つのアミノ酸（ＬＲＬＲ）のみを有するデンドリマーを試験した。本発明者らのトランスフェクション研究は、各世代において１、２、３又は４個のアミノ酸を有するデンドリマーが、依然としてｍＲＮＡを細胞内に十分にトランスフェクトすることができることを示す（図２８Ａ）。本発明者らは更に、各世代において異なる数のアミノ酸を有するデンドリマーを試験し、トランスフェクション効率が影響を受けないことを示した。

【0284】

Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ構造に基づいて、本発明者らは、塩基性アミノ酸ＲをＫに置換し、かつ／又は疎水性アミノ酸Ｌを、Ｅなどの酸性アミノ酸、並びに／若しくはＭ、Ｆ、ベータ－アラニン（Ｂ）、アミノヘキサン酸（Ｘ）、及びＷなどの非極性側鎖を有するアミノ酸、並びに／又はＱ、Ｔ及びＹなどの極性側鎖を有するアミノ酸に変化させた３世代デンドリマーのライブラリーを設計した。

【0285】

デンドリマー内でＲをＫに置換すると、ｍＲＮＡトランスフェクション効率が低下する（図２８Ａ）。しかしながら、疎水性アミノ酸を他の疎水性アミノ酸及び／又は極性若しくは非極性側鎖を有するアミノ酸に変更することは、トランスフェクションに影響を及ぼさない可能性があるか、又はＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲと比較してトランスフェクションを３０～４０％低下させる可能性がある。下線パターンははっきりせず、更なる調査が実施される。しかしながら、これらのデンドリマーは全て、ｍＲＮＡ単独対照よりも有意に高いｍＲＮＡトランスフェクションを誘導することができる。

【0286】

本発明者らはまた、ｍＲＮＡトランスフェクションに対するデンドリマー内のＬ又はＤ型アミノ酸の影響を調査した。Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲデンドリマーに基づいて、本発明者らは、デンドリマーの各世代においてアミノ酸の一部又は全部をＬ型からＤ型に変化させてもトランスフェクション効率に影響を与えないことを見出した。デンドリマー内でリジンをジアミノ酪酸に置換することは、トランスフェクションを低下させるが、このデンドリマーのトランスフェクションは、ｍＲＮＡ単独対照よりも依然として有意に高い。

【0287】

本発明者らは、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｗ／ｗ １０：１）とともにＧ１－ＬＬ，２－ＲＲをＮ：Ｐ比０．１６：１で使用した本発明者らの製剤プロトコルを用いてｍＲＮＡを送達するためにＧ１－ＬＬ，２－ＲＲを使用できることを実証した。興味深いことに、このデンドリマーは、インビトロ及びインビボで異なる製剤にＡＳＯを送達するために使用された（Ｓａｈｅｒ ２０１８）。使用した製剤は、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ＡＳＯに対してｗ／ｗ＝２：１）及びＮ：Ｐ＝２０：１、Ｇ１－ＬＬ，２－ＲＲ対ＡＳＯであった。本発明者らは、これをトランスフェクト細胞（すなわち、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝２：１）及びＮ：Ｐ＝２０：１、Ｇ１－ＬＬ，２－ＲＲ対ｍＲＮＡ）に対して試みたが、トランスフェクション効率は低い。この製剤（ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝２：１）及びＮ：Ｐ＝２０：１、Ｇ１－ＬＬ，２－ＲＲ対ｍＲＮＡ）のｍＲＮＡトランスフェクション効率は、本発明者らの改良製剤（ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ｍＲＮＡに対してｗ／ｗ＝１０：１）及びＮ：Ｐ＝０．１６：１、Ｇ１－ＬＬ，２－ＲＲ対ｍＲＮＡ）のｍＲＮＡトランスフェクション効率の１０％にしかならない。

【0288】

本発明者らは、ｍＲＮＡ送達のために、異なる世代においてＲＬ又はＬＲ又はｒｌのいずれかを有する第３世代デンドリマーを調査した。本発明者らは、これらのデンドリマーのほとんどが同様に細胞をトランスフェクトし、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲがｍＲＮＡトランスフェクションにおいて最も有効であることを見出した。全体として、本発明者らのデータは、各世代において疎水性アミノ酸及びカチオン性アミノ酸を有するデンドリマーが、細胞への有効なｍＲＮＡ送達をもたらすことを示唆した。

【0289】

Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲよりも効果的に細胞をトランスフェクトする第１世代及び第２世代デンドリマーが存在するので、本発明者らは、トランスフェクションに関する更なる試験のためにこれらのデンドリマーを選択した。本発明者らは、これらのデンドリマーが一般に、様々なＮ：Ｐ比でＧ１，２－ＲＬ，３－ＬＲよりも良好にトランスフェクトできることを示した。特に、Ｎ：Ｐ＝４：１のＲＨＣＧ１－Ｒ、ＲＨＣＧ１，２－Ｒ、ＲＨＣＧ１－ＬＲ、ＲＨＣＧ１－ＲＬ，２－ＬＲ、ＲＨＣＧ１－ＲＬＲ、及びＧ１－ＬＲＬＲは、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲよりも７００％～１８１５％良好にトランスフェクトすることができる。これらのデータは、ＤＮＡ及びｍＲＮＡ送達の要件が非常に異なることを実証した。ｍＲＮＡについては、第１又は第２世代デンドリマーが、完全成長培地条件において第３世代デンドリマーよりも良好に細胞をトランスフェクトする傾向がある。しかしながら、世代３のデンドリマーは、完全成長培地条件において、世代１又は世代２のデンドリマーよりも良好に細胞をＤＮＡでトランスフェクトする（図４）。

【0290】

図３０は、８：１のＮＰ比で送達されたＲＨＣペプチドコアを含む世代２デンドリマーが、主に脾臓（上パネル）及びより低い程度で肺（下パネル）へのｍＲＮＡ送達を標的とすることを示す。ＮＰ比０．１５：１では、肺へのｍＲＮＡ送達は、ＮＰ比８：１と比較して増加する。

【0291】

ｍＲＮＡ発現の調節
ｍＲＮＡ発現は、ＰＥＧ２０００脂質を含む組成物をマウスに注射することによって調節することができる。Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ／ＰＥＧ２０００、及びｍＲＮＡを含む組成物を注射したマウスは、Ｇ１，２－ＲＬ，３－ＬＲ、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ、及びｍＲＮＡを含む組成物を注射したマウスと比較して、ルシフェラーゼ発現が減弱していた。

【0292】

番号付けされた項
以下の番号付けされた項は、本発明の特定の特質及び特質の組み合わせを示す。
１．医薬における使用のための組成物であって、当該組成物が、ペプチドデンドリマーと、核酸と、脂質と、を含み、ペプチドデンドリマーが、第１のリジン残基及び２つの第１のペプチドモチーフと、２つの第２のリジン残基及び４つの第２のペプチドモチーフと、４つの第３のリジン残基及び８つの第３のペプチドモチーフと、第１のリジン残基と共有結合したコアペプチド配列と、を含み、
（ｉ）第１のリジン残基が、２つの第１のペプチドモチーフと共有結合し、２つの第１のペプチドモチーフは、それぞれ２つの第２のリジン残基と共有結合し、
（ｉｉ）各第２のリジン残基が、２つの第２のペプチドモチーフと共有結合し、各第２のペプチドモチーフは、それぞれ、第３のリジン残基のうちの１つと共有結合し、
（ｉｉｉ）各第３のリジン残基が、第３のペプチドモチーフのうちの２つと共有結合し、第１、第２、及び第３のペプチドモチーフが、独立して、モノペプチド又はジペプチドモチーフからなり、第１、第２、及び第３のペプチドモチーフの各々が、ａ）アルギニン（Ｒ）若しくはリジン（Ｋ）、及び／又はｂ）ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、ヒスチジン（Ｈ）、若しくはイソロイシン（Ｉ）を含み、各アミノ酸残基が、独立して、Ｌ－アイソフォーム又はＤ－アイソフォームから選択される、組成物。
２．第１、第２、及び第３のペプチドモチーフのうちの少なくとも２つが、アルギニン（Ｒ）を含む、項１に記載の使用のための組成物。
３．第１、第２、及び第３のペプチドモチーフのうちの少なくとも２つが、ロイシン（Ｌ）を含む、項１又は２に記載の使用のための組成物。
４．第１、第２、及び第３のペプチドモチーフの各々が、ジペプチドモチーフである、項１～３のいずれか１つに記載の使用のための組成物。
５．第１、第２、及び第３のペプチドモチーフの各々が、ロイシン（Ｌ）及びアルギニン（Ｒ）を含む、項４に記載の使用のための組成物。
６．核酸が、二本鎖領域を含む、項１～５のいずれか１つに記載の使用のための組成物。
７．核酸が、ＤＮＡプラスミドである、項６に記載の使用のための組成物。
８．核酸が、ｍＲＮＡ分子又はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であるか、又はそれをコードする、項１～７のいずれか１つに記載の使用のための組成物。
９．核酸が、ＣＲＩＳＰＲ配列を含む、項１～８のいずれか１つに記載の使用のための組成物。
１０．核酸が、ｓｉＲＮＡ又はｓａＲＮＡ分子である、項６に記載の使用のための組成物。
１１．ＤＮＡプラスミドが、標的細胞においてｓｉＲＮＡ又はｓａＲＮＡ分子を発現することができる、項７に記載の使用のための組成物。
１２．核酸が、標的細胞において導入遺伝子を発現することができる、項７又は８に記載の使用のための組成物。
１３．導入遺伝子が、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、又は哺乳動物に寄生する微生物のタンパク質である、項１２に記載の使用のための組成物。
１４．ワクチンとしての使用のための、項１３に記載の使用のための組成物。
１５．患者における遺伝性障害のための遺伝子療法における使用のための、項１２に記載の使用のための組成物。
１６．遺伝性障害が、患者において筋ジストロフィーを引き起こす、項１５に記載の使用のための組成物。
１７．遺伝性障害が、患者においてミオパチーを引き起こす、項１５に記載の使用のための組成物。
１８．導入遺伝子が、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、及び／又は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）である、糖尿病性下肢虚血を治療する方法における使用のための、項１２に記載の組成物。
１９．コアペプチド配列が、トリペプチドモチーフからなる、項１～１８のいずれか１つに記載の使用のための組成物。
２０．トリペプチドモチーフが、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、及びシステイン（Ｃ）、及び／又はアラニン（Ａ）を含む、項１８に記載の組成物。
１９．脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及び／又はＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を含む、項１～１８のいずれか１つに記載の使用のための組成物。
２０．脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及びジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）を含む、項１～１９のいずれか１つに記載の使用のための組成物。
２１．使用が、患者の筋肉への核酸の送達を含む、項１～２０のいずれか１つに記載の使用のための組成物。
２２．項１～２１のいずれか１つに記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
２３．核酸を標的細胞内に送達する方法であって、標的細胞を項１～２０のいずれか１つに記載の組成物と接触させることを含み、標的細胞が、筋細胞、肝細胞、星細胞、ニューロン、アストロサイト、脾細胞、肺細胞、心筋細胞、腎細胞、脂肪細胞、又は腫瘍細胞である、方法。
２４．第１のリジン残基及び２つの第１のペプチドモチーフと、２つの第２のリジン残基及び４つの第２のペプチドモチーフと、４つの第３のリジン残基及び８つの第３のペプチドモチーフと、第１のリジン残基と共有結合したコアペプチド配列と、を含む、ペプチドデンドリマーであって、
（ｉ）第１のリジン残基が、２つの第１のペプチドモチーフと共有結合し、２つの第１のペプチドモチーフは、それぞれ２つの第２のリジン残基と共有結合し、
（ｉｉ）各第２のリジン残基が、２つの第２のペプチドモチーフと共有結合し、各第２のペプチドモチーフは、それぞれ、第３のリジン残基のうちの１つと共有結合し、
（ｉｉｉ）各第３のリジン残基が、第３のペプチドモチーフのうちの２つと共有結合し、第１、第２、及び第３のペプチドモチーフが各々、（ｉ）ロイシン－アルギニン（ＬＲ）ジペプチドモチーフ、又は（ｉｉ）アルギニン－ロイシン（ＲＬ）モチーフのいずれかからなり、第１、第２、及び第３のペプチドモチーフのうちの少なくとも１つが、（ｉ）ロイシン－アルギニン（ＬＲ）であり、各アミノ酸残基が、独立して、Ｌ－アイソフォーム又はＤ－アイソフォームから選択される、ペプチドデンドリマー。
２５．核酸と、脂質と、項２４に記載のペプチドデンドリマーと、を含む、組成物。
２６．医薬における使用のための、項２５に記載の組成物。
２７．核酸を細胞にインビトロで又はエクスビボで送達するための、項２５に記載の組成物の使用。
２８．ポンペ病、筋肉消耗性疾患、又は筋ジストロフィー、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療における使用のための、項１～２２又は２４～２６のいずれか１つに記載の組成物又はペプチドデンドリマー。

【0293】

参考文献
本発明及び本発明が属する技術分野の状況をより完全に記載及び開示するために、多くの刊行物が上で引用されている。これらの参考文献についての完全な引用を以下に示す。これらの参考文献の各々の全体は、本明細書中に組み込まれる。

【0294】

Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｎｄ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ；Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７；２１０－２１９（２０１１）。

【0295】

Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ／Ｌｉｐｉｄ Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｒｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ Ｈｉｇｈｌｉｇｈｔ ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｃｈａｒｇｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｃｒｏｓｓ Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ；ＡＣＳ Ｎａｎｏ ７；５４６６８－４６８２（２０１３）。

【0296】

Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｆ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｌｉｎｅａｒ Ｏｌｉｇｏｌｙｓｉｎｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｓｉＲＮＡ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ；Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ ８７：７４７－７６３（２０１６）。

【0297】

Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｓｍａｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＲＮＡ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｉｓｅｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ １０（３）：１５１－１６４（２０１９）

【0298】

Ｓａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ／ｌｉｐｉｄ／ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｅｒｎａｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｌｉｃｅ－ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ；Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １３２：２９－４０（２０１８）。

【0299】

Ｓａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｕｇａｒ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ Ｓｐｌｉｃｅ－Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ／Ｌｉｐｉｄ／Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．１１（１２）：６６６（２０１９）

【0300】

Ｓｈｅｒｉｄａｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｉｎｄｓ ｉｔｓ ｎｉｃｈｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９（２），１２１－８（２０１１）。

【0301】

Ｂｒａｕｍ．Ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｍｕｓｃｌｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ；Ｃｈａｐｔｅｒ ９ Ｍｕｓｃｌｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎａｔｕｒｅ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ ＡＧ Ｄ．Ｄｕａｎ，Ｊ．Ｒ．Ｍｅｎｄｅｌｌ（ｅｄｓ．）１５７－１７８（２０１９）。

【0302】

Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ＤＯＴＭＡ ｆｏｒ ｉｔｓ ｈｉｇｈ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｏｕｓｅ；Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７，７６４－７６８（２０００）。

【0303】

Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔｓ；ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１（２），１８６２－１８７９（２００４）。

【0304】

Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｄｉｃｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｃｏｎｖｅｒｔｓ ｌａｒｇｅ ｄｓＲＮＡｓ ｉｎｔｏ ｓｉＲＮＡｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：３２４－３２８（２００３）。

【0305】

Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎａｎｏｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １２（１）３０（２０２０）。

【0306】

Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．Ａｒｇｉｎｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３３，４９１７－４９２７（２０１２）。

【0307】

Ｂｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒ ｓｉＲＮＡ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ｌｉｎｅａｒ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（Ｌ－ＰＥＩ）Ｄｏｅｓ Ｎｏｔ Ｉｎｄｕｃｅ ａｎ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓ．２５，２９７２（２００８）。

【0308】

Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ａｓ ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１８（５）：３５８－３７８（２０１９）。

【0309】

Ｐｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ．Ｆｏｕｒｔｈ Ｂｏｙ Ｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ ｏｆ Ａｓｔｅｌｌａｓ’ ＡＴ１３２．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．３２，１９－２０（２０２１）．Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．５４（２１），４００１－４０１１（２０２１）。

【0310】

Ｂｅｎｉｚｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．３０（２）：３６６－３８３．（２０１９）。

【0311】

Ｊａｓｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｓｉｚｅ ａｎｄ Ｓｈａｐｅ ｏｆ ＲＮＡ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｏｎ Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２６（３），７８４－７９２（２０１８）。

【0312】

Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍＲＮＡ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＨｕＲ Ｕｓｉｎｇ ３ＤＮＡ Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｏｖａｒｉａｎ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．７６（６），１５４９－１５５９（２０１６）。

【0313】

Ｆｏｒ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｓｅｅ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．３ ｅｄ．２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【図27】

【図28A】

【図28B】

【図29】

【図30】

【図31】

【配列表】

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【国際調査報告】