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特表2024-505966ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体、及びその作製方法並びにその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-08
(54)【発明の名称】ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体、及びその作製方法並びにその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240201BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240201BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240201BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240201BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240201BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240201BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240201BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240201BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240201BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240201BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240201BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240201BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240201BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240201BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240201BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240201BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20240201BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N15/13 ZNA
C12N1/21
C12N15/63 Z
C07K16/28
C07K16/46
C12N1/15
C12N1/19
C12N5/10
C12P21/02 C
A61P37/06
A61P35/00
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61K39/395 G
A61K39/395 U
A61K47/68
A61P43/00 107
G01N33/53 D
G01N33/531 A
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023546445
(86)(22)【出願日】2022-05-05
(85)【翻訳文提出日】2023-08-01
(86)【国際出願番号】 CN2022090931
(87)【国際公開番号】W WO2022267702
(87)【国際公開日】2022-12-29
(31)【優先権主張番号】202110704255.6
(32)【優先日】2021-06-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521183028
【氏名又は名称】益科思特（北京）医葯科技▲發▼展有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(72)【発明者】
【氏名】ユェン チンアン
(72)【発明者】
【氏名】バイ リーリー
(72)【発明者】
【氏名】モン チンウー
(72)【発明者】
【氏名】ヂャオ リークン
(72)【発明者】
【氏名】リー イージャ
(72)【発明者】
【氏名】リー イェンフー
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG20
4B064CA10
4B064DA01
4B065AB04
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA46
4C076AA95
4C076CC03
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB01
4C085BB11
4C085CC05
4C085CC31
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045BA01
4H045BA40
4H045BA72
4H045CA11
4H045DA75
4H045DA83
(57)【要約】
本発明は、遺伝子
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抗体の技術分野に関するものであり、具体的には、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体、及びその作製方法並びにその使用に関するものである。本発明は、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に同時に結合でき、特異的な標的作用を有し、指向性免疫反応を効率的に誘発できる二重特異性抗体を提供する。当該二重特異性抗体は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＢＣＭＡ抗体の生物学的機能を十分に保持しており、一つの二重特異性抗体分子がＢＣＭＡとＣＤ３の標的結合の優れた生物学的機能を同時に有することを実現しており、腫瘍細胞と免疫エフェクター細胞との架け橋となり、免疫エフェクター細胞及び指向性免疫反応を効果的に誘起でき、免疫細胞の腫瘍細胞に対する殺傷効果を有意に向上し、高い標的細胞への殺傷効率を有するとともに、ＡＤＣＣ効果を最小限に抑え、高い安全性を有し、腫瘍の免疫治療において良好な使用見通しがある。
【選択図】図１
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抗体の技術分野に関するものであり、具体的には、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体、及びその作製方法並びにその使用に関するものである。本発明は、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に同時に結合でき、特異的な標的作用を有し、指向性免疫反応を効率的に誘発できる二重特異性抗体を提供する。当該二重特異性抗体は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＢＣＭＡ抗体の生物学的機能を十分に保持しており、一つの二重特異性抗体分子がＢＣＭＡとＣＤ３の標的結合の優れた生物学的機能を同時に有することを実現しており、腫瘍細胞と免疫エフェクター細胞との架け橋となり、免疫エフェクター細胞及び指向性免疫反応を効果的に誘起でき、免疫細胞の腫瘍細胞に対する殺傷効果を有意に向上し、高い標的細胞への殺傷効率を有するとともに、ＡＤＣＣ効果を最小限に抑え、高い安全性を有し、腫瘍の免疫治療において良好な使用見通しがある。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、Ｂ細胞成熟抗原ＢＣＭＡに結合する第１のドメインと、Ｔ細胞表面抗原ＣＤ３に結合する第２のドメインとを含み、
前記第１のドメインと前記第２のドメインとがリンカーペプチドを介して連結され、
前記第１のドメインは、
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列を有し、或いは、それぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列を参照配列とした、下記の突然変異から選ばれる１種の突然変異、又は多種の突然変異の組み合わせを含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
（１）配列番号４で示されるアミノ酸配列の１番目のＳからＰ又はＫへの突然変異、
（２）配列番号４で示されるアミノ酸配列の２番目のＹからＨ、Ｄ、Ｇ、Ｍ又はＳへの突然変異、
（３）配列番号４で示されるアミノ酸配列の３番目のＡからＮへの突然変異、
（４）配列番号４で示されるアミノ酸配列の５番目のＳからＨ、Ｎ、Ａ又はＭへの突然変異、
（５）配列番号５で示されるアミノ酸配列の１番目のＧからＶ又はＴへの突然変異、
（６）配列番号５で示されるアミノ酸配列の３番目のＩからＨへの突然変異、
（７）配列番号５で示されるアミノ酸配列の４番目のＩからＤ又はＡへの突然変異、
（８）配列番号５で示されるアミノ酸配列の５番目のＦからＨへの突然変異、
（９）配列番号５で示されるアミノ酸配列の７番目のＴからＫへの突然変異、及び
（１０）配列番号６で示されるアミノ酸配列の４番目のＦからＬへの突然変異、
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列を有し、或いは、それぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列を参照配列とした、下記の突然変異から選ばれる１種の突然変異、又は多種の突然変異の組み合わせを含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の５番目のＳからＮ、Ｒ又はＴへの突然変異、
（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列の７番目のＬからＱ、Ｖ又はＡへの突然変異、
（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列の８番目のＩからＳ、Ａ、Ｒ又はＰへの突然変異、
（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列の１０番目のＹからＭ、Ｌ、Ｗ又はＴへの突然変異、及び
（５）配列番号３で示されるアミノ酸配列の１１番目のＶからＬ又はＱへの突然変異、
を含む、ことを特徴とするＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体。
【請求項2】
ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、Ｂ細胞成熟抗原ＢＣＭＡに結合する第１のドメインと、Ｔ細胞表面抗原ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含み、
前記第１のドメインと前記第２のドメインとがリンカーペプチドを介して連結され、
前記第１のドメインは、
ＣＤＲ１が配列番号４、７、８、９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号５、１０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号６、１１のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
ＣＤＲ１が配列番号１、１２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号３、１３、１４、１５、１６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含み、
好ましくは、前記第１のドメインの重鎖可変領域のＣＤＲは、
（１）ＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（２）ＣＤＲ１が配列番号７で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（３）ＣＤＲ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するもの、及び
（４）ＣＤＲ１が配列番号９で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するものからのいずれか１種であり、
前記第１のドメインの軽鎖可変領域のＣＤＲは、
（１）ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（２）ＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（３）ＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（４）ＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するもの、及び
（５）ＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するものからのいずれか１種であり、
より好ましくは、前記第１のドメインの重鎖可変領域のＣＤＲ及び軽鎖可変領域のＣＤＲは、
（１）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（２）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（３）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号９で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するもの、及び
（４）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するものからのいずれか１種である、ことを特徴とするＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体。
【請求項3】
前記第１のドメインの重鎖可変領域が配列番号１７、及び１９～２１のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号１８、及び２２～２７のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有し、或いは、前記の配列と比べて、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、以下の２つの特徴の少なくとも１つを有し、ａ）同じ抗原決定基に結合すること、及びｂ）配列の同一性が７０％、８０％、８５％、９０％、９７％、９８％又は９９％より大きいというアミノ酸配列を有すること、
好ましくは、前記第１のドメインの重鎖可変領域が配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有し、
或いは、前記第１のドメインの重鎖可変領域が配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有し、
或いは、前記第１のドメインの重鎖可変領域が配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有し、
或いは、前記第１のドメインの重鎖可変領域が配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有し、
或いは、前記第１のドメインの重鎖可変領域が配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項２に記載のＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体。
【請求項4】
前記第１のドメインは、ジスルフィド結合を介して連結された２つの完全な重鎖－軽鎖ペアであり、好ましくは、前記重鎖のＦｃ断片は、ヒト又はヒト化抗体のＦｃ断片であり、前記ヒト又はヒト化抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ４又はＩｇＤである、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体。
【請求項5】
前記第１のドメインの重鎖が配列番号３２で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号３３で示されるアミノ酸配列を有し、或いは、前記第１のドメインの重鎖が配列番号４９で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４２で示されるアミノ酸配列を有し、
或いは、前記第１のドメインの重鎖が配列番号５０で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４４で示されるアミノ酸配列を有し、
或いは、前記第１のドメインの重鎖が配列番号５１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４６で示されるアミノ酸配列を有し、
或いは、前記第１のドメインの重鎖が配列番号５２で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４８で示されるアミノ酸配列を有し、
或いは、前記配列と比べて、前記重鎖、軽鎖が、以下の２つの特徴の少なくとも１つを有し、ａ）同じ抗原決定基に結合すること、及びｂ）配列の同一性が７０％、８０％、８５％、９０％、９７％、９８％又は９９％より大きいというアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体。
【請求項6】
前記第２のドメインの重鎖可変領域が配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有し、好ましくは、第２のドメインの軽鎖可変領域と重鎖可変領域とがリンカーペプチドを介して一本鎖抗体となるように連結され、前記一本鎖抗体が配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体。
【請求項7】
前記第２のドメインは２つの一本鎖抗体を含み、前記二重特異性抗体は、
（１）前記第２のドメインの２つの一本鎖抗体のＣ端が、それぞれ、リンカーペプチドを介して前記第１のドメインの２本の重鎖のＮ端に連結すること、及び
（２）前記第２のドメインの２つの一本鎖抗体のＮ端が、それぞれ、リンカーペプチドを介して前記第１のドメインの２本の重鎖のＣ端に連結することのいずれか１種によって連結された対称構造であり、
好ましくは、前記リンカーペプチドのアミノ酸配列は（ＧＧＧＧＸ）ｎ（ここで、ＸがＧｌｙ又はＳｅｒであり、ｎが１～４の自然数である）であり、
より好ましくは、前記リンカーペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３０で示されるものである、ことを特徴とする請求項１～６のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体。
【請求項8】
前記第１のドメインの重鎖は、リンカーペプチドを介して第２のドメインと連結した後、配列番号３４または３５で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖は、配列番号３３で示されるアミノ酸配列を有し、或いは、前記第１のドメインの重鎖は、リンカーペプチドを介して第２のドメインと連結した後、配列番号４１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖は、配列番号４２で示されるアミノ酸配列を有し、
或いは、前記第１のドメインの重鎖は、リンカーペプチドを介して第２のドメインと連結した後、配列番号４３で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖は、配列番号４４で示されるアミノ酸配列を有し、
或いは、前記第１のドメインの重鎖は、リンカーペプチドを介して第２のドメインと連結した後、配列番号４５で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖は、配列番号４６で示されるアミノ酸配列を有し、
或いは、前記第１のドメインの重鎖は、リンカーペプチドを介して第２のドメインと連結した後、配列番号４７で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖は、配列番号４８で示されるアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項１～７のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体をコードする核酸。
【請求項10】
請求項９に記載の核酸を含有する生体材料であって、組換えＤＮＡ、発現カセット、ベクター、宿主細胞、組換え菌又は細胞株を含む前記生体材料。
【請求項11】
前記第１のドメイン及び前記第２のドメインのコード遺伝子を含む発現ベクターを構築すること、前記発現ベクターを宿主細胞に導入し、前記二重特異性抗体を発現する宿主細胞を得ること、及び宿主細胞を培養し、分離精製によって前記二重特異性抗体を得ること、を含むことを特徴とする請求項１～８のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体の作製方法。
【請求項12】
請求項１～８のいずれか１項に記載のＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体、請求項９に記載の核酸、又は請求項１０に記載の生体材料の使用であって、（１）ＢＣＭＡが発現するＢ細胞関連疾患を診断、予防又は治療するための医薬品の製造における使用、
（２）ＢＣＭＡを標的とした疾患を診断、予防又は治療するための医薬品の製造における使用、
（３）ＢＣＭＡが発現する細胞を殺傷するための医薬品の製造における使用、
（４）ＢＣＭＡ及び／又はＣＤ３の検出試薬の製造における使用、及び
（５）ＣＡＲ－Ｔ療法に適用される関連試薬の製造における使用
のいずれか１種であり、
好ましくは、前記ＢＣＭＡが発現するＢ細胞関連疾患がＢ細胞関連腫瘍、Ｂ細胞による自己免疫疾患を含むことを特徴とする前記使用。
【請求項13】
請求項１～８のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体を含む多重特異性抗体、融合タンパク質、免疫毒素、医薬品又は検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【相互参照】
【0001】
本願は、２０２１年６月２４日に出願された発明の名称が「ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体、及びその作製方法並びにその使用」である中国特許出願第２０２１１０７０４２５５．６号に基づき優先権を主張し、引用によりその全内容を本願に援用する。
【技術分野】
【0002】
本願は、遺伝子組換え抗体の技術分野に関するものであり、具体的には、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体、及びその作製方法並びにその使用に関するものである。
【背景技術】
【0003】
モノクローナル抗体は、臨床で腫瘍治療、免疫疾患治療及び抗感染治療に用いられるものである。その中で、腫瘍の治療は現在モノクローナル抗体が最も広く使用されている分野であり、モノクローナル抗体による腫瘍の治療は、疾患細胞の特異的ターゲットに対して免疫系を刺激して標的細胞を殺傷する免疫療法である。モノクローナル抗体に基づいて、さらに薬効を向上させ、毒性や副作用を低減させるために、モノクローナル抗体に基づく新たな抗体医薬品、例えば抗体薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ， ＡＤＣ）、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ、 ｂｓＡｂ）及びＣＡＲ－Ｔ （ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ）等の新規なタンパク質医薬品や細胞医薬品が急速に発展されている。その中で、二重特異性に基づいて構築された細胞架橋（ｃｅｌｌ－ｂｒｉｄｇｉｎｇ）二重特異性抗体は、その免疫Ｔ細胞及び標的のがん細胞に連結する能力のため、殺傷活性及び特異性が著しく向上し、画期的な臨床的価値があるものとなり、特に注目されている。多発性骨髄腫について、ＢＣＭＡを標的とする上記の特性を有する細胞架橋二重特異性抗体は、抗体の治療効果を改善するための開発対象の一つであり、抗体工学の研究分野のホットスポットになっている。
【0004】
Ｔ細胞表面のＣＤ３分子は、δ、ε、γ、ζの４つのサブユニットから構成されたものであり、その分子量が、それぞれ、１８．９ｋＤａ、２３．１ｋＤａ、２０．５ｋＤａ及び１８．７ｋＤａであり、その長さが、それぞれ、１７１、２０７、１８２、１６４個のアミノ酸残基である。それらは、６本のペプチド鎖を形成し、常にＴ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）と密接に結合して８本のペプチド鎖を含むＴＣＲ－ＣＤ３複合体を形成し、その構造模式図を図１Ａに示す。この複合体は、Ｔ細胞の活性化、シグナル伝達、及びＴＣＲ構造の安定化といった機能を有する。ＣＤ３細胞質ドメインには、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ、ＩＴＡＭ）が含まれ、ＴＣＲがＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏ－ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）分子によって提示されたペプチド抗原を認識して結合するため、ＣＤ３におけるＩＴＡＭの保守的な配列内のチロシン残基がＴ細胞内のチロシンプロテインキナーゼｐ５６ｌｃｋによりりん酸化され、その後、ＳＨ２（Ｓｃｒ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ２）ドメインを含有する他のチロシンプロテインキナーゼ（例えばＺＡＰ－７０）を動員する。ＩＴＡＭのリン酸化及びＺＡＰ－７０との結合は、Ｔ細胞の活性化シグナル伝達プロセスの初期段階での重要な生化学反応の１つである。このため、ＣＤ３分子の機能は、ＴＣＲを介した抗原認識による活性化シグナルを伝達することである。
【0005】
ＢＣＭＡ（即ち、Ｂ－細胞成熟抗原、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＣＤ２６９）は、分化した形質細胞で優先的に発現する腫瘍壊死（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーに属する非グリコシル化Ｉ型膜貫通型蛋白質であり、Ｂ細胞の成熟、成長、及び生存に関与するものである。ＢＣＭＡは最初、ヒト成熟Ｂリンパ球のゴルジ体内の内在性膜タンパク質、即ち細胞内タンパク質として報告され、ＢＣＭＡがＢ細胞の発育やホメオスタシスに重要な役割を果たしているように思われることが示されている。
【0006】
ＢＣＭＡの発現はＢ細胞系統に限られ、そして主に形質細胞や形質芽細胞（図１のＢ）に存在し、ある程度でメモリーＢ細胞に存在するが、実際には末梢のＢ細胞に存在しない。ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞にも発現する。ＢＣＭＡは、そのファミリーメンバーである膜貫通活性化剤及びサイクロフィリンリガンドインタラクタ（ＴＡＣＩ）及びＴＮＦファミリー受容体（ＢＡＦＦ－Ｒ）のＢ細胞活性化因子とともに、体液性免疫、Ｂ細胞の発育、及びホメオスタシスのさまざまな側面といったものを調節する。ＢＣＭＡは、ＢＣＭＡの高親和性リガンドであるＡＰＲＩＬ（増殖誘導リガンド、ＣＤ２５６、ＴＮＦＳＦ１３）と、ＢＣＭＡの低親和性リガンドであるＢ細胞活性化因子ＢＡＦＦ（ＴＨＡＮＫ、ＢｌｙＳ、Ｂリンパ球刺激因子、ＴＡＬＬ－１、及びｚＴＮＦ４）との２つのＴＮＦスーパーファミリーのリガンド（図１Ｃ）の受容体である。ＡＰＲＩＬとＢＡＦＦは、構造的類似性、並びに重複するが異なる受容体結合特異性を示している。負の制御因子ＴＡＣＩもＢＡＦＦとＡＰＲＩＬの両方に結合する。ＡＰＲＩＬとＢＡＦＦは、ＢＣＭＡ及び／又はＴＡＣＩの配位に結合して転写因子ＮＦ－κＢを活性化させ、さらに生存促進Ｂｃｌ－２ファミリーメンバー（例えば、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘＬ、Ｂｃｌ－ｗ、Ｍｃｌ－１、Ａ１）の発現を増加させ、アポトーシス促進因子（例えば、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍなど）の発現を減少させることによって、細胞のアポトーシスを阻害して生存を促進する。この組み合わせが奏する作用は、Ｂ細胞の分化、増殖、生存、及び抗体の産生を促進する。ＢＣＭＡの発現は、Ｂ細胞分化の後期段階で現れ、形質芽細胞及び形質細胞が骨髄で長期的に生存することに有利である。
【0007】
ＢＣＭＡは、非常に重要なＢ細胞バイオマーカーであり、ＭＭ細胞の表面に広く存在し、ＭＭ及びその他の血液悪性腫瘍の人気な免疫療法の標的である。連続の３期ＡＳＣＯ年次総会で、ＢＣＭＡは業界で注目されている焦点である。米国がん研究所（ＣＲＩ）の最新の分析によれば、ＢＣＭＡはＣＤ１９に次いで２番目の人気な抗がん細胞療法の標的になっている。ＭＭは、異質性疾患の１種であり、ｔ（１１；１４）、ｔ（４；１４）、ｔ（８；１４）、ｄｅｌ（１３）、ｄｅｌ（１７）（その他を除く）染色体転座によって引き起こされることが多い。ＭＭ患者は、骨髄浸潤、骨破壊、腎不全、免疫不全、及び癌診断による心理的負担などの、疾患に関連するさまざまな症状を経る可能性がある。
【0008】
ＭＭでは、化学療法や幹細胞移植の治療方法は生存率を向上させることができるが、しばしば有害な副作用を伴うため、ＭＭは依然として治療が困難である。化学療法、プロテアーゼ阻害剤、免疫調節剤サリドマイド誘導体、及びＣＤ３８標的抗体において大きな進展があるが、ほとんど全ての患者が最終的に再発することとなる。従って、この分野では新薬に対する需要は依然として緊急である。今まで、多発性骨髄腫の患者にとって最も一般的な２つの治療選択肢は、ステロイド、サリドマイド、レナリドマイド、ボルテゾミブ、または多種の細胞毒性試薬の組み合わせ、及びより若年患者向けの高用量化学療法を採用するとともに自家幹細胞移植を併用することである。多くの移植は自家型であり、即ち、患者自身の細胞を使用することである。このような移植は、治癒的ではないが、選択された患者の寿命を延ばすことが示されている。新たに診断された患者に対する初期療法として使用し、または再発の場合に使用することができる。適切的に疾患を管理するために、患者に一種以上の移植を採用することを勧めることがある。この疾患の治療に用いられる化学療法剤は、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びメルファランであり、それが例えばサリドマイド、レナリドマイド、ボルテゾミブなどの免疫調節剤、及び皮質ステロイド（例えば、デキサメタゾン）との併用療法は、すでに、新たに診断された患者、及び化学療法または移植が失敗した疾患進行末期の患者に対する、骨髄腫を治療するための重要な選択肢となっている。
【0009】
現在、ＭＭの治療に用いられる治療法は、通常、非治癒的である。高齢、その他の重い病気もあること、またはその他の身体的制約により、幹細胞移植は、ほとんどの患者に適用しない選択肢である。化学療法は多発性骨髄腫を部分的に制御することしかできず、完全な緩和を達成することは殆どない。従って、新たな革新的治療法が強く望まれている。
拮抗型ＢＣＭＡ特異的抗体は、正常及び悪性のＢ細胞における強力な生存促進シグナル伝達経路に関連するＮＦ－κＢ活性化を阻害できる。
拮抗型ＢＣＭＡ特異的抗体は、正常及び悪性のＢ細胞における強力な生存促進シグナル伝達経路に関連するＮＦ－κＢ活性化を阻害できる。
【0010】
血液由来の腫瘍または自己免疫疾患を対抗するための他の方法は、ＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ（即ちＴＮＦリガンドスーパーファミリーのリガンド）と、ＢＡＦＦ及び／またはＡＰＲＩＬによって活性化される受容体ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ－Ｒ及びＢＣＭＡとの間の相互作用に着目するものである。例えば、ヒト免疫グロブリンのＦｃ－ドメインをＺｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ社のＴＡＣＩと融合させてアタシセプト（ＴＡＣＩ－Ｉｇ）を産生することにより、これらの２つのリガンドを中和して受容体の活性化を阻害する。アタシセプトは、現在、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ、第ＩＩＩ期）、多発性硬化症（ＭＳ、第ＩＩ期）及び関節リウマチ（ＲＡ、第ＩＩ期）を治療するための臨床試験段階にあり、ならびにＢ細胞悪性腫瘍である慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、及びＭＭを治療するための第Ｉ期臨床試験段階にある。前臨床研究では、アタシセプトは体外及び体内でナイーブＭＭ細胞及びＭＭ細胞株の増殖及び生存を減少させた。これは、ＴＡＣＩリガンドのＭＭ細胞に対する関連性を示している。ほとんどのＭＭ細胞及びその派生細胞株は、いずれもＢＣＭＡやＴＡＣＩを発現するため、両方の受容体は、リガンドによって媒介された増殖及び生存を促進する可能性がある。これらのデータは、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩに対する拮抗作用が形質細胞障害の治療に有益である可能性があることを示している。また、ＴＡＣＩと交差反応するＢＣＭＡ特異的抗体が報告された（ＷＯ０２／０６６５１６）。
【0011】
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社とＧｌaｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社は、ＢＡＦＦを標的とするベリムマブと呼ばれる抗体を開発した。ベリムマブは、可溶性ＢＡＦＦ及びその受容体ＢＡＦＦ－Ｒ、ＢＣＭＡやＴＡＣＩのＢ細胞への結合を阻害することができる。ベリムマブはＢ細胞に直接的に結合しないが、ＢＡＦＦに結合することにより、自己反応性Ｂ細胞を含めたＢ細胞の生存を阻害し、Ｂ細胞から免疫グロブリンを産生する形質細胞へ分化することを減少させることができる。
【0012】
しかし、ＢＣＭＡ、ＢＡＦＦ－Ｒ、及びＴＡＣＩ（即ち、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属するＢ細胞受容体）及びそれらのリガンドであるＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬが、癌及び／または自己免疫疾患を対抗する治療案に適用する事実が存在しても、この病状を治療するための他の利用可能な選択肢が必要である。
【発明の概要】
【0013】
本発明は、第一、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体及びその活性断片を提供することを目的とする。
本発明は、第二、上記抗体又はその活性断片をコードする核酸を提供することを目的とする。
本発明は、第二、上記抗体又はその活性断片をコードする核酸を提供することを目的とする。
【0014】
本発明は、第三、上記抗体又はその活性断片の使用を提供することを目的とする。
具体的には、本発明は以下の技術案を提供する。
具体的には、本発明は以下の技術案を提供する。
【0015】
まず、本発明は、
ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、
Ｂ細胞成熟抗原ＢＣＭＡに結合する第１のドメインと、Ｔ細胞表面抗原ＣＤ３に結合する第２のドメインとを含み、
第１のドメインと第２のドメインとがリンカーペプチドを介して連結され、
第１のドメインは、
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列を有し、或いは、それぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列を参照配列とした、下記の突然変異から選ばれる１種の突然変異、又は多種の突然変異の組み合わせを含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
（１）配列番号４で示されるアミノ酸配列の１番目のＳからＰ又はＫへの突然変異
（２）配列番号４で示されるアミノ酸配列の２番目のＹからＨ、Ｄ、Ｇ、Ｍ又はＳへの突然変異
（３）配列番号４で示されるアミノ酸配列の３番目のＡからＮへの突然変異
（４）配列番号４で示されるアミノ酸配列の５番目のＳからＨ、Ｎ、Ａ又はＭへの突然変異
（５）配列番号５で示されるアミノ酸配列の１番目ＧからＶ又はＴへの突然変異
（６）配列番号５で示されるアミノ酸配列の３番目のＩからＨへの突然変異
（７）配列番号５で示されるアミノ酸配列の４番目のＩからＤ又はＡへの突然変異
（８）配列番号５で示されるアミノ酸配列の５番目のＦからＨへの突然変異
（９）配列番号５で示されるアミノ酸配列の７番目のＴからＫへの突然変異
（１０）配列番号６で示されるアミノ酸配列の４番目のＦからＬへの突然変異
ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、
Ｂ細胞成熟抗原ＢＣＭＡに結合する第１のドメインと、Ｔ細胞表面抗原ＣＤ３に結合する第２のドメインとを含み、
第１のドメインと第２のドメインとがリンカーペプチドを介して連結され、
第１のドメインは、
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列を有し、或いは、それぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列を参照配列とした、下記の突然変異から選ばれる１種の突然変異、又は多種の突然変異の組み合わせを含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
（１）配列番号４で示されるアミノ酸配列の１番目のＳからＰ又はＫへの突然変異
（２）配列番号４で示されるアミノ酸配列の２番目のＹからＨ、Ｄ、Ｇ、Ｍ又はＳへの突然変異
（３）配列番号４で示されるアミノ酸配列の３番目のＡからＮへの突然変異
（４）配列番号４で示されるアミノ酸配列の５番目のＳからＨ、Ｎ、Ａ又はＭへの突然変異
（５）配列番号５で示されるアミノ酸配列の１番目ＧからＶ又はＴへの突然変異
（６）配列番号５で示されるアミノ酸配列の３番目のＩからＨへの突然変異
（７）配列番号５で示されるアミノ酸配列の４番目のＩからＤ又はＡへの突然変異
（８）配列番号５で示されるアミノ酸配列の５番目のＦからＨへの突然変異
（９）配列番号５で示されるアミノ酸配列の７番目のＴからＫへの突然変異
（１０）配列番号６で示されるアミノ酸配列の４番目のＦからＬへの突然変異
【0016】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列を有し、或いは、それぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列を参照配列とした、下記の突然変異から選ばれる１種の突然変異、又は多種の突然変異の組み合わせを含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の５番目のＳからＮ、Ｒ又はＴへの突然変異
（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列の７番目のＬからＱ、Ｖ又はＡへの突然変異
（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列の８番目のＩからＳ、Ａ、Ｒ又はＰへの突然変異
（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列の１０番目のＹからＭ、Ｌ、Ｗ又はＴへの突然変異
（５）配列番号３で示されるアミノ酸配列の１１番目のＶからＬ又はＱへの突然変異
を含む、ことを特徴とするＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体を提供する。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の５番目のＳからＮ、Ｒ又はＴへの突然変異
（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列の７番目のＬからＱ、Ｖ又はＡへの突然変異
（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列の８番目のＩからＳ、Ａ、Ｒ又はＰへの突然変異
（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列の１０番目のＹからＭ、Ｌ、Ｗ又はＴへの突然変異
（５）配列番号３で示されるアミノ酸配列の１１番目のＶからＬ又はＱへの突然変異
を含む、ことを特徴とするＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体を提供する。
【0017】
本発明は、完全合成一本鎖ヒト抗体ライブラリーから抗ＢＣＭＡの遺伝子組換え一本鎖抗体をスクリーニングし、その抗体の可変領域遺伝子の配列を取得し、点突然変異キットにより突然変異体ライブラリーを構築し、親和性の高いクローンを得て、これらのクローンのＤＮＡを混合し、組換えによって一本鎖抗体のコンビナトリアルライブラリーを組み立て、それをスクリーニングした後、ヒトＢＣＭＡと結合する親和性が高いＢＣＭＡ抗体を得る。
【0018】
本発明により提供される抗体可変領域のアミノ酸配列パターンは、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。本願では、ＦＲ及びＣＤＲの領域分画は、Ｋａｂａｔ命名システムに基づくものである。ここで、ＦＲ１～４は４つのフレームワーク領域を表し、ＣＤＲ１～３は３つの超可変領域を表す。ＦＲ１～４は、定常領域配列から分離されたもの（例えば、ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖、サブクラスまたはサブファミリーに最も一般的に使用されるアミノ酸など）であってもよく、単独のヒト抗体フレームワーク領域から分離されたもの、又は異なるフレームワーク領域の遺伝子を組み合わせたものであってもよい。
【0019】
更なるスクリーニングにより、本発明は、
ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、
Ｂ細胞成熟抗原ＢＣＭＡに結合する第１のドメインと、Ｔ細胞表面抗原ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含み、
第１のドメインと第２のドメインとがリンカーペプチドを介して連結され、
第１のドメインは、
ＣＤＲ１が配列番号４、７、８、９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号５、１０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号６、１１のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
ＣＤＲ１が配列番号１、１２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号３、１３、１４、１５、１６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含むＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体を提供し、その第１のドメインはＢＣＭＡに対してより高い親和性を示す。
ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、
Ｂ細胞成熟抗原ＢＣＭＡに結合する第１のドメインと、Ｔ細胞表面抗原ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含み、
第１のドメインと第２のドメインとがリンカーペプチドを介して連結され、
第１のドメインは、
ＣＤＲ１が配列番号４、７、８、９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号５、１０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号６、１１のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
ＣＤＲ１が配列番号１、１２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号３、１３、１４、１５、１６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含むＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体を提供し、その第１のドメインはＢＣＭＡに対してより高い親和性を示す。
【0020】
さらに、上記のＢＣＭＡに結合する抗体において、以下の抗体はＢＣＭＡに対してより高い親和性を示す：
重鎖可変領域のＣＤＲ領域配列が、
（１）ＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（２）ＣＤＲ１が配列番号７で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（３）ＣＤＲ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するもの、及び
（４）ＣＤＲ１が配列番号９で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するものからのいずれか１種であり、
軽鎖可変領域のＣＤＲ領域配列が、
（１）ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（２）ＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（３）ＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（４）ＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するもの、及び
（５）ＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するものからのいずれか１種である抗体。
重鎖可変領域のＣＤＲ領域配列が、
（１）ＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（２）ＣＤＲ１が配列番号７で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（３）ＣＤＲ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するもの、及び
（４）ＣＤＲ１が配列番号９で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するものからのいずれか１種であり、
軽鎖可変領域のＣＤＲ領域配列が、
（１）ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（２）ＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（３）ＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（４）ＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するもの、及び
（５）ＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するものからのいずれか１種である抗体。
【0021】
さらに、上記のＢＣＭＡに結合する抗体において、以下の抗体はＢＣＭＡに対してより高い親和性を示す：
重鎖可変領域のＣＤＲ及び軽鎖可変領域のＣＤＲが、
（１）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（２）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（３）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号９で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するもの、及び
（４）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するものからのいずれかの１種である抗体。
重鎖可変領域のＣＤＲ及び軽鎖可変領域のＣＤＲが、
（１）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（２）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するもの、
（３）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号９で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するもの、及び
（４）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３が配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するものからのいずれかの１種である抗体。
【0022】
上記ＣＤＲの配列に基づいて、下記の可変領域配列を有する抗体（第１のドメイン）は、ＢＣＭＡに対して高い親和性を示す：
重鎖可変領域が配列番号１７、１９～２１のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号１８、２２～２７のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有するもの。
重鎖可変領域が配列番号１７、１９～２１のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号１８、２２～２７のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有するもの。
【0023】
上記重鎖可変領域、軽鎖可変領域に基づいて、その配列に比べて、ａ）同じ抗原決定基に結合すること、及びｂ）配列の同一性が７０％、８０％、８５％、９０％、９７％、９８％又は９９％より大きいことという両者の少なくとも一者を満たすアミノ酸配列も本発明の保護範囲にある。
【0024】
更には、下記の可変領域配列を有する抗体（第１のドメイン）は、ＢＣＭＡに対してより優れた親和性を示す：
重鎖可変領域が配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するもの、
或いは、重鎖可変領域が配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有するもの、
或いは、重鎖可変領域が配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有するもの、
或いは、重鎖可変領域が配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有するもの、
或いは、重鎖可変領域が配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有するもの。
重鎖可変領域が配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するもの、
或いは、重鎖可変領域が配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有するもの、
或いは、重鎖可変領域が配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有するもの、
或いは、重鎖可変領域が配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有するもの、
或いは、重鎖可変領域が配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有するもの。
【0025】
本発明の二重特異性抗体において、第１のドメインは、ＢＣＭＡに結合可能な抗体であり、軽鎖と重鎖とがジスルフィド結合を介して結合された、２つの完全な重鎖－軽鎖ペアを含む。
【0026】
第１のドメインの重鎖のＦｃ断片は、ヒト又はヒト化抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ４又はＩｇＤ）のＦｃ断片であっても良い。
【0027】
本発明の実施形態の１つでは、第１のドメインの重鎖のＦｃ断片がヒト又はヒト化抗体ＩｇＧ４のＦｃ断片である。
【0028】
本発明の好ましい実施形態として、
第１のドメインの重鎖が配列番号３２で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号３３で示されるアミノ酸配列を有し、
或いは、第１のドメインの重鎖が配列番号４９で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４２で示されるアミノ酸配列を有し、
或いは、第１のドメインの重鎖が配列番号５０で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４４で示されるアミノ酸配列を有し、
或いは、第１のドメインの重鎖が配列番号５１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４６で示されるアミノ酸配列を有し、
或いは、第１のドメインの重鎖が配列番号５２で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４８で示されるアミノ酸配列有する。
第１のドメインの重鎖が配列番号３２で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号３３で示されるアミノ酸配列を有し、
或いは、第１のドメインの重鎖が配列番号４９で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４２で示されるアミノ酸配列を有し、
或いは、第１のドメインの重鎖が配列番号５０で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４４で示されるアミノ酸配列を有し、
或いは、第１のドメインの重鎖が配列番号５１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４６で示されるアミノ酸配列を有し、
或いは、第１のドメインの重鎖が配列番号５２で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４８で示されるアミノ酸配列有する。
【0029】
これらのＢＣＭＡに結合する抗体は、ＢＣＭＡに対して高い親和性を有するとともに、ＣＤ３に結合する抗体と二重特異性抗体を形成する時に両者の機能が十分に発揮されることを確保することができる。
【0030】
上記重鎖配列、軽鎖配列に基づいて、当該配列に比べて、ａ）同じ抗原決定基に結合すること、ｂ）配列の同一性が７０％、８０％、８５％、９０％、９７％、９８％又は９９％より大きいことという両者からの少なくとも一者を満たすアミノ酸配列も本発明の保護範囲にある。
【0031】
本発明により提供される上記のヒト源の抗ヒトＢＣＭＡ抗体は、０．２ｎＭ～１０ｎＭの親和性でヒトＢＣＭＡに結合する。この抗体は、ＢＣＭＡリガンドがヒトＢＣＭＡに結合することを阻害する。この抗体はＢＣＭＡを発現する細胞に結合し、前記細胞はヒト多発性骨髄腫細胞又はリンパ腫細胞であってもよい。
【0032】
ＣＤ３抗原に結合する第２のドメインにおいて、その重鎖可変領域が配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する。
【0033】
第２のドメインの軽鎖可変領域と重鎖可変領域とがリンカーペプチドを介して一本鎖抗体のように連結され、且つ当該一本鎖抗体が配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有することが好ましい。
【0034】
本発明の二重特異性抗体は、下記の構造となるように設計されることが好ましい：第１のドメインが２つの完全な重鎖－軽鎖ペアを含み、第２のドメインが２つの一本鎖抗体を含み、前記二重特異性抗体は、
（１）第２のドメインの２つの一本鎖抗体のＣ端が、それぞれ、リンカーペプチドを介して第１のドメインの２本の重鎖のＮ端に連結すること、及び
（２）第２のドメインの２つの一本鎖抗体のＮ端が、それぞれ、リンカーペプチドを介して第１のドメインの２本の重鎖のＣ端に連結することのいずれか１種によって連結された対称構造である。
（１）第２のドメインの２つの一本鎖抗体のＣ端が、それぞれ、リンカーペプチドを介して第１のドメインの２本の重鎖のＮ端に連結すること、及び
（２）第２のドメインの２つの一本鎖抗体のＮ端が、それぞれ、リンカーペプチドを介して第１のドメインの２本の重鎖のＣ端に連結することのいずれか１種によって連結された対称構造である。
【0035】
本発明は、上記の第１のドメイン及び第２のドメインの配列について、上記の対称構造の二重特異性抗体は、他の構造の二重特異性抗体に比べて、第１のドメイン及び第２のドメインにおける一次抗体の特異的抗原結合能をより良好に保持することができるとともに、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する優れた生物学的機能を有し、製造プロセス及び薬効等において明らかな優勢を有することを見出した。本発明は、特異的な標的作用を有し、指向性免疫反応を効率的に誘発し、腫瘍細胞を殺傷することができる、上記の抗体分子構造を有するＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体を開発した。
【0036】
第１のドメインと第２のドメインとを連結するためのリンカーペプチドのアミノ酸配列は（ＧＧＧＧＸ）ｎ（ここで、ＸがＧｌｙ又はＳｅｒであり、ｎが１～４の自然数である）であることが好ましい。
本発明の好ましい実施態様として、リンカーペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３０で示されるものである。
本発明の好ましい実施態様として、リンカーペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３０で示されるものである。
【0037】
上記の構造を有する二重特異性抗体の例として、本発明は、ヒトに対するＣＤ３×ＢＣＭＡ二重特異性抗体を提供し、上記の一本鎖抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域及びモノクローナル抗体の重鎖と軽鎖を有する構造及び配列において、本発明は、ＣＤ３とＢＭＣＡに同時に結合することができる２つの二重特異性抗体を構築した。その構造及び配列が下記の通りである。
【0038】
（１）第１のドメインの重鎖が第２のドメインと連結して、配列番号３４で示されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を形成し、第１のドメインの軽鎖が配列番号３３で示されるアミノ酸配列を有するもの
（２）第１のドメインの重鎖が第２のドメインと連結して、配列番号３５で示されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を形成し、第１のドメインの軽鎖が配列番号３３で示されるアミノ酸配列を有するもの
（３）第１のドメインの重鎖がリンカーペプチドを介して第２のドメインに連結した後、配列番号４１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４２で示されるアミノ酸配列を有するもの
（４）第１のドメインの重鎖がリンカーペプチドを介して第２のドメインに連結した後、配列番号４３で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４４で示されるアミノ酸配列を有するもの
（５）第１のドメインの重鎖がリンカーペプチドを介して第２のドメインに連結した後、配列番号４５で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４６で示されるアミノ酸配列を有するもの
（６）第１のドメインの重鎖がリンカーペプチドを介して第２のドメインに連結した後、配列番号４７で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４８で示されるアミノ酸配列を有するもの
上記の開示または保護しようとする配列番号１～５２で示される配列には、「保守的な配列修飾」、即ち、前記抗体または前記アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響及び改変しないヌクレオチド及びアミノ酸配列修飾が含まれる。前記保守的な配列修飾には、ヌクレオチド又はアミノ酸の置換、付加又は欠失が含まれる。部位特異的変異導入及びＰＣＲに媒介される突然変異誘発などの当分野の標準的な技術によって修飾を配列番号１～５２に導入することができ、保守的なアミノ酸置換として、アミノ酸残基が、類似な側鎖を有するアミノ酸残基または他のアミノ酸残基に置換されることが含まれている。当分野では、類似な側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが定義されている。これらのファミリーとして、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。従って、ヒト抗ＢＣＭＡ抗体における非必須アミノ酸残基を同一側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換することが好ましい。
（２）第１のドメインの重鎖が第２のドメインと連結して、配列番号３５で示されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を形成し、第１のドメインの軽鎖が配列番号３３で示されるアミノ酸配列を有するもの
（３）第１のドメインの重鎖がリンカーペプチドを介して第２のドメインに連結した後、配列番号４１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４２で示されるアミノ酸配列を有するもの
（４）第１のドメインの重鎖がリンカーペプチドを介して第２のドメインに連結した後、配列番号４３で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４４で示されるアミノ酸配列を有するもの
（５）第１のドメインの重鎖がリンカーペプチドを介して第２のドメインに連結した後、配列番号４５で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４６で示されるアミノ酸配列を有するもの
（６）第１のドメインの重鎖がリンカーペプチドを介して第２のドメインに連結した後、配列番号４７で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４８で示されるアミノ酸配列を有するもの
上記の開示または保護しようとする配列番号１～５２で示される配列には、「保守的な配列修飾」、即ち、前記抗体または前記アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響及び改変しないヌクレオチド及びアミノ酸配列修飾が含まれる。前記保守的な配列修飾には、ヌクレオチド又はアミノ酸の置換、付加又は欠失が含まれる。部位特異的変異導入及びＰＣＲに媒介される突然変異誘発などの当分野の標準的な技術によって修飾を配列番号１～５２に導入することができ、保守的なアミノ酸置換として、アミノ酸残基が、類似な側鎖を有するアミノ酸残基または他のアミノ酸残基に置換されることが含まれている。当分野では、類似な側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが定義されている。これらのファミリーとして、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。従って、ヒト抗ＢＣＭＡ抗体における非必須アミノ酸残基を同一側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換することが好ましい。
【0039】
従って、上記で開示された前記アミノ酸配列を有する抗体及び／又は上記で開示されたアミノ酸配列を含む抗体には、実質的に保守的な配列により修飾された類似な配列によってコードされた抗体、又は保守的な配列により修飾された類似な配列を含む抗体も含まれており、いずれも本発明の範囲内のものと見なされるべきである。
また、本発明は、前記ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体をコードする核酸を提供する。
また、本発明は、前記ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体をコードする核酸を提供する。
【0040】
コドンの縮退を考慮すると、本発明の前記抗体をコードする遺伝子は、そのコード領域において、アミノ酸配列を改変しない条件で、上記の抗体をコードする遺伝子配列を改変し、同じ抗体をコードする遺伝子を得ることができる。当業者は、抗体を発現する宿主のコドン偏位に応じて、遺伝子を人工的に合成・改造することにより、抗体の発現効率を向上させることができる。
【0041】
さらに、本発明は、前記ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体をコードする核酸を含有する生体材料であって、組換えＤＮＡ、発現カセット、ベクター、宿主細胞、組換え菌又は細胞株を含む生体材料を提供する。
【0042】
ここで、前記ベクターは、クローンベクター、発現ベクターを含むが、これらに限定されるものではなく、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾン等のベクターであってもよい。
【0043】
前記宿主細胞または細胞株は、微生物または動物の細胞または細胞株に由来するものであってもよい。
【0044】
また、本発明は、前記第１のドメイン及び前記第２のドメインのコード遺伝子を含む発現ベクターを構築すること、前記発現ベクターを宿主細胞に導入し、前記二重特異性抗体を発現する宿主細胞を得ること、及び宿主細胞を培養し、分離精製によって前記二重特異性抗体を得ること、を含むＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体の作製方法を提供する。
【0045】
前記二重特異性抗体を作製する時、当業者は、必要に応じて、当分野の通常の宿主細胞、発現ベクター、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、及び抗体の分離精製方法を選択することができる。
【0046】
本発明により提供されるＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体の機能に基づいて、本発明は、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体、それをコードする核酸、または当該核酸を含有する生体材料の、下記のいずれか１種の使用を提供する。
【0047】
（１）ＢＣＭＡが発現するＢ細胞関連疾患を診断、予防又は治療するための医薬品の製造における使用（ここで、前記ＢＣＭＡが発現するＢ細胞関連疾患がＢ細胞関連腫瘍（多発性骨髄腫またはリンパ腫を含むがこれらに限定されない）、Ｂ細胞による自己免疫疾患を含むことが好ましい）
（２）ＢＣＭＡを標的とした疾患を診断、予防又は治療するための医薬品の製造における使用（ここで、前記の医薬品が抗悪性腫瘍薬または自己免疫疾患を治療するための医薬品であることが好ましい）
（３）ＢＣＭＡが発現する細胞を殺傷するための医薬品の製造における使用
（４）ＢＣＭＡ及び／又はＣＤ３の検出試薬の製造における使用
（５）ＣＡＲ－Ｔ療法に適用される関連試薬の製造における使用
（２）ＢＣＭＡを標的とした疾患を診断、予防又は治療するための医薬品の製造における使用（ここで、前記の医薬品が抗悪性腫瘍薬または自己免疫疾患を治療するための医薬品であることが好ましい）
（３）ＢＣＭＡが発現する細胞を殺傷するための医薬品の製造における使用
（４）ＢＣＭＡ及び／又はＣＤ３の検出試薬の製造における使用
（５）ＣＡＲ－Ｔ療法に適用される関連試薬の製造における使用
【0048】
上記のＢＣＭＡが発現するＢ細胞関連疾患は、ＢＣＭＡを高度又は過剰に発現する悪性腫瘍及び自己免疫疾患であることが好ましい。
【0049】
本発明により提供される二重特異性抗体は、その自体が治療及び診断に用いられることができる。抗体は、標識、架橋、またはカップリングされること、又は他のタンパク質またはペプチド分子と融合発現することにより、複合体（例えば、細胞毒性物質、放射性毒素及び／または化学分子など）を形成し、診断及び治療に用いられることができる。
【0050】
また、本発明は、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体が含まれる多重特異性抗体、融合タンパク質、免疫毒素、医薬品又は検出試薬を提供する。
【0051】
上記の免疫毒素は、様々な形態で細胞毒性剤に結合する二重特異性抗体を含む。
【0052】
前記結合の様々な形態は、抗体の標識、体外での架橋、または分子カップリングである。前記細胞毒性剤には、化学分子、放射性同位元素、ペプチド、毒素、及び細胞殺傷性、または細胞死誘導特性を有する他の物質が含まれる。
【0053】
上記の融合タンパク質は、本発明が提供する二重特異性抗体と、特定の機能を有する他のタンパク質またはペプチド分子との複合体を含む。
【0054】
具体的には、前記融合タンパク質は、抗体遺伝子を免疫毒素またはサイトカイン遺伝子に連結させて組換え発現ベクターを構築し、哺乳動物細胞または他の発現系によって組換え融合タンパク質分子を得るものであってもよい。
【0055】
上記の医薬品、検出試薬は、さらに、薬学の分野及び検出試薬の分野で許容される他の有効成分または
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（例えば、抗体の成分及び薬理学的に許容される送達分子または溶液）を含んでもよい。ここで、治療に用いられる成分は無菌であり、低温凍結乾燥のものであってもよい）。
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（例えば、抗体の成分及び薬理学的に許容される送達分子または溶液）を含んでもよい。ここで、治療に用いられる成分は無菌であり、低温凍結乾燥のものであってもよい）。
【0056】
本発明の二重特異性抗体は、ＢＣＭＡにより誘導される生物学的活性の１種以上を阻害することができる。ＢＣＭＡとそのリガンドとの結合を遮断することによってその機能を発揮することができるが、ＢＣＭＡを高度に発現する細胞を殺傷することによってその機能を発揮することもでき、或いはＢＣＭＡに結合した複合体が内在化されて細胞表面のＢＣＭＡが消費されることによってその機能を発揮することもできる。ＢＣＭＡ拮抗剤が有する全ての干渉機能を本発明の目的と同等に扱うべきである。
【発明の効果】
【0057】
本発明は、遺伝子組換え及びファージ表面ディスプレイライブラリー技術によって天然の完全ヒト配列の一本鎖抗体ライブラリーから抗ヒトＢ細胞表面抗原ＢＣＭＡの特異的抗体をスクリーニングする。親和性の成熟を改進することによって、結合能が顕著的に向上された複数のクローンを得て、それらのヒトＢＣＭＡに対する親和性は０．２６ｎＭ～０．３１ｎＭである。フローサイトメトリーによって測定された見かけ親和性が、親抗体より６１～９７倍向上された。これは、本発明の抗ヒトＢＣＭＡ抗体及び最適化された突然変異体がいずれも良好なＢＣＭＡに結合する能力を有することを検証した。
【0058】
これに基づいて、本発明は、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に同時に結合することができ、特異的な標的作用を有し、指向性免疫反応を効率的に誘起することができる二重特異性抗体を提供する。当該二重特異性抗体は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＢＣＭＡ抗体の生物学的機能を十分に保持しており、一つの二重特異性抗体分子がＢＣＭＡとＣＤ３に同時に結合する優れた生物学的機能を有することを実現し、腫瘍細胞と免疫エフェクター細胞の架け橋となり、免疫エフェクター細胞及び指向性免疫反応を効率的に誘起でき、免疫細胞の腫瘍細胞に対する殺傷効果を有意に向上させるとともに、ＡＤＣＣ効果を最小限に抑え、高い安全性を有する。
【0059】
本発明により提供される二重特異性抗体は、治療応用において良好な見通しがあり、主にヒトＢＣＭＡ及びＣＤ３に特異的に結合する活性を有することとして表現されている。ＥＬＩＳＡ検出及びフローサイトメトリー検出によると、この抗体は、Ｈ９２９及びＲＰＭＩ８２２６細胞の表面のＢＣＭＡ及びＴ細胞に特異的に結合できるため、標的特異性が良好であったことが示されている。体外細胞への殺傷効率の検出によると、当該二重特異性抗体は高い標的細胞殺傷効率を有する。
【0060】
また、本発明により提供される二重特異性抗体は、構造が完全に対称的であるという特徴を有するため、宿主で発現する時、他の構造のタンパク質のアイソフォームを産生することがなく、抽出・精製プロセスの難易度を大幅に下げることができ、製造が簡単で、収率が高い優勢を有し、腫瘍免疫療法において広い使用見通しがある。
【0061】
本発明は、ＢＣＭＡを標的とする抗腫瘍抗体薬の開発、ＣＡＲ－Ｔ試薬の開発、ならびにＢ細胞関連炎症及び自己免疫疾患などの他の疾患の予防及び治療のために、二重特異性抗体の候補分子を提供した。本発明の二重特異性抗体は、免疫細胞と腫瘍細胞に同時に結合することができ、指向性Ｔ細胞免疫反応を誘起し、腫瘍細胞を特異的且つ効果的に殺傷することができ、多発性骨髄腫の抗体医薬品として開発することができる。
【図面の簡単な説明】
【0062】
【図1】図１は本発明の背景技術に記載のＢＣＭＡの発現及びＴＣＲ構造模式図であり、その中で、ＡがＢＣＭＡ抗原のＢ細胞の発生期間における発現を示すものであり、ＢがＢＣＭＡ抗原のリガンド作用シグナル伝達チャンネルを示すものであり（出典：ｆｉｍｍｕ－０９－０１８２１－ｇ００１．ｊｐｇ（１０５０×７６２）（ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎ．ｏｒｇ））、ＣがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の構造及びそのＣＤ３の組成を示すものである（出典：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｅｓｅａｒｃｈｇａｔｅ．ｎｅｔ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／２９９５４９３７６）。
【図2】図２は本発明の実施例２においてフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いてＢＣＭＡとリードクローン（ｌｅａｄ ｃｌｏｎｅ）Ｂ１０との結合を分析した結果を示すものであり、その中で、上の２つの写真が陰性対照（ＮＣ）の分析結果であり、真ん中の２つの写真が陽性対照（ＰＣ）の分析結果であり、下の２つの写真が候補クローンＢ１０（Ｂ１０）の分析結果である。
【図3】図３は本発明の実施例３においてフローサイトメーターを用いてＢ１０及びその親和性成熟の突然変異体の結合を分析した結果を示すものであり、その中で、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥがそれぞれＢ１０、Ｂ１０．３、Ｂ１０．４、Ｂ１０．５、Ｂ１０．９のＨ９２９細胞への結合の分析結果であり、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、ＪがそれぞれＢ１０、Ｂ１０．３、Ｂ１０．４、Ｂ１０．５、Ｂ１０．９のＲＰＭＩ８２２６細胞への結合の分析結果である。
【図4】図４は、本発明の実施例３において、それぞれ、ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメーターを用いて、Ｊ６、Ｂ１０及びそれらの突然変異体の結合を分析、比較した結果を示すものであり、その中で、ＡがＥＬＩＳＡを用いた場合の結果、ＢがＦＡＣＳを用いた場合の結果である。
【図5】図５は、本発明の実施例４においてＦＩＳＴプラットフォームに基づいて構築された抗ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の構造模式図であり、その中で、ＡがＮ末端融合（ｎＦＩＳＴ）で構築された二重抗体（抗ＣＤ３一本鎖抗体が抗ＢＣＭＡ抗体ＶＨのＮ末端に融合したもの）の構造模式図であり、ＢがＣ末端融合（ｃＦＩＳＴ）で構築された二重抗体（抗ＣＤ３一本鎖抗体が抗ＢＣＭＡ抗体ＦｃのＣ末端に融合したもの）の構造模式図である。
【図6】図６は本発明の実施例５における二重特異性抗体Ｋ３Ｂ１０．３及びＢ１０．３Ｋ３のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動図であり、その中で、Ａ及びＣが還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動図であり、Ｂ及びＤが非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動図であり、Ａ及びＢがＫ３Ｂ１０．３二重特異性抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動結果であり、Ｃ及びＤがＢ１０．３Ｋ３二重特異性抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動結果であり、レーンＭがタンパク質分子量標準を表し、レーン１が目標タンパク質である。
【図7】図７は本発明の実施例５で精製された二重特異性抗体Ｋ３Ｂ１０．３及びＢ１０．３Ｋ３の、ＨＰＬＣ－ＳＥＣによる純度分析で得られたピークグラフであり、その中で、Ａが二重特異性抗体Ｋ３Ｂ１０．３のピークグラフであり、Ｂが二重特異性抗体Ｂ１０．３Ｋ３のピークグラフである。
【図8】図８は本発明の実施例６においてフローサイトメーターを用いて、Ｋ３Ｂ１０．３及びＢ１０．３Ｋ３のヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞への結合、ＲＰＭＩ細胞への結合を分析した結果を示すものであり、その中で、Ａが二次抗体対照の分析結果であり、ＢがＫ３Ｂ１０．３、ＣがＢ１０．３Ｋ３のＣＤ３への結合の分析結果であり、Ｄが二次抗体対照の分析結果であり、ＥがＫ３Ｂ１０．３、ＦがＢ１０．３Ｋ３のＢＣＭＡへの結合の分析結果である。
【図9】図９は本発明の実施例７のｃＦＩＳＴ二重抗体のＢＣＭＡ抗原への結合、及びそれらにより媒介されたＴ細胞のＢＣＭＡ発現細胞ＲＰＭＩ８２２６に対する殺傷を示すものであり、その中で、ＡはＢ１０の親和性が向上された突然変異型二重抗体のＢＣＭＡ抗原への結合のＥＬＩＳＡ測定結果を示すものであり（ここで、抗体は２００ｎｇ／ｗｅｌｌでコーティングし、ビオチン－ＢＣＭＡは２５０ｎｇ／ｍｌから半希釈され）、Ｂは、Ｂ１０の親和性が向された突然変異型二重抗体の当該突然変異型二重抗体により媒介されたＢＣＭＡ発現細胞に対する殺傷を示すものである（ここで、Ｂ１０Ｋ３に対してそれぞれ高濃度及び低濃度で実験し、低濃度（Ｂ１０Ｋ３）では標準Ｓ曲線が得られず、高濃度（Ｂ１０（ｈｉｇｈ）Ｋ３）では標準Ｓ曲線が得られ、当該曲線によってＥＣ５０値を計算した。）。
【発明を実施するための形態】
【0063】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【0064】
実施例１ 天然ヒト抗体ファージ表面ディスプレイライブラリーから抗ヒトＢＣＭＡ抗体をスクリーニングする
抗体ライブラリー技術は、ある動物（ヒトを含む）のすべての抗体可変領域遺伝子をプラスミドまたはファージにクローングし、後者を大腸菌に感染させた後、抗体断片をファージ粒子の表面、または大腸菌のペリプラズムや
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に発現させ、その後、標的抗原によって抗体ライブラリーから特異的抗体遺伝子を持つクローンをスクリーニングして、相応の特異的抗体を得る技術である。抗体ライブラリーには、腫瘍に関連する膜タンパク質抗原、自己免疫疾患に関連する自己抗原、ウイルス性疾患に対するウイルス抗原のような多くの基礎研究や臨床開発に必要な抗体がスクリーニングされている。これは、抗体ライブラリー技術が基礎研究や抗体医薬品の開発において大きな応用可能性があることを示している。特に、ヒト抗体ライブラリーから得られた完全ヒトモノクローナル抗体は、マウスハイブリドーマ技術によってヒトモノクローナル抗体を得ることが困難であるという障害を克服した。ヒト抗体配列の高度な保守性のため、これらの抗体のヒト自己免疫系に対する免疫原性は、動物由来の抗体より遥かに低く、より安全である。
抗体ライブラリー技術は、ある動物（ヒトを含む）のすべての抗体可変領域遺伝子をプラスミドまたはファージにクローングし、後者を大腸菌に感染させた後、抗体断片をファージ粒子の表面、または大腸菌のペリプラズムや
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に発現させ、その後、標的抗原によって抗体ライブラリーから特異的抗体遺伝子を持つクローンをスクリーニングして、相応の特異的抗体を得る技術である。抗体ライブラリーには、腫瘍に関連する膜タンパク質抗原、自己免疫疾患に関連する自己抗原、ウイルス性疾患に対するウイルス抗原のような多くの基礎研究や臨床開発に必要な抗体がスクリーニングされている。これは、抗体ライブラリー技術が基礎研究や抗体医薬品の開発において大きな応用可能性があることを示している。特に、ヒト抗体ライブラリーから得られた完全ヒトモノクローナル抗体は、マウスハイブリドーマ技術によってヒトモノクローナル抗体を得ることが困難であるという障害を克服した。ヒト抗体配列の高度な保守性のため、これらの抗体のヒト自己免疫系に対する免疫原性は、動物由来の抗体より遥かに低く、より安全である。
【0065】
非免疫ヒト天然抗体ライブラリーは、健康な人を抗体遺伝子の供給源とし、これらの人がドナーと呼ばれる。天然の完全ヒト抗体配列を使用しているため、得られた抗体はヒト免疫系に対する免疫原性が極めて低い。分子生物学及びＤＮＡ操作技術によって、ＲＮＡ抽出キット（例えば、ＱＩＡＧＥＮのＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、カタログ番号：７４１０４）にてドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からすべてのＲＮＡを抽出した後、各ＲＮＡサンプルから等量のものを採取して合わせ、逆転写キット（例えば、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のｃＤＮＡ合成キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ））にて軽鎖及び重鎖の遺伝子ｃＤＮＡを合成した。これらの抗体ｃＤＮＡをテンプレートとし、増幅の第１ラウンドでは、各サブグループ特異的な上流プライマー及び定常領域プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、各サブグループの全てのメンバーの遺伝子を得た。ＰＣＲの第２ラウンドでは、架橋付き重鎖可変領域（ＶＨ）３“末端プライマーセットと架橋付き軽鎖可変領域（ＶＬ）５’末端プライマーセットは、得られるＶＨとＶＬがリンカーを介して連結できるように、それぞれ、各自の他の末端プライマー（特異的な制限酵素部位を含む）と組み合わせて、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）遺伝子を形成した。これらの一本鎖抗体の遺伝子の５’末端及び３’末端の特異的酵素切断部位を利用してこれらのｓｃＦｖ遺伝子を溶原性ファージミド（ｐｈaｇｅｍｉｄ、例えば、Ｍ１３ファージミド）ベクターにクローンし、抗体ライブラリーを構築した。当該ライブラリーの大きさは５０億コロニーフォーミングユニット（ｃｆｕ）に達した。
【0066】
バイオパニングとは、特異的な標的によって抗体から特異的なクローンをスクリーニングすることを指す。ヒトＢＣＭＡ抗原特異的なヒト抗体を得るために、液相スクリーニングによってパニングを行う。液相パニング法の一般的な手順としては、まず、市販のＢＣＭＡ抗原（ＢＣＭＡ－Ｆｃ融合タンパク質、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＣ７－Ｈ５２５４）をビオチンで修飾し、各分子に３～５個のビオチン分子を架橋させ、遊離ビオチンを除去する。適量のビオチンにマークされたＢＣＭＡ抗原を、ストレプトアビジンがカップリングされた磁性ビーズに結合させた（例えば、ＤｙｎaｂｅaｄｓＴＭＭ－２８０ストレプトアビジン、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、カタログ番号１１２０５Ｄ）。異なる抗体を発現する１００億個のファージ粒子を含むヒト抗体ライブラリーを1部解凍した。磁性ビーズ及び抗体ライブラリは、非特異的な作用部位を除去するために、いずれも４％脱脂粉乳溶液（４％ＭＰＢＳ）で遮断された。磁性ビーズ上にアビジンに結合されていないストレプトアビジンが存在する可能性があり、そしてＢＣＭＡ抗原分子がヒトＦｃで構成される融合タンパク質であるため、それらに結合する抗体クローンを除去するために、解凍された抗体ライブラリーにストレプトアビジン及びヒト抗体Ｆｃを十分な量（使用する標的タンパク質に対して５０～１００倍の過剰量）で添加する必要がある。遮断された抗体ライブラリー溶液を磁性ビーズとともに（合計体積＜１ｍｌ）１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、ＢＣＭＡ特異的ファージと抗体とが結合するように室温で２時間回転混合しながらインキュベートした。インキュベートが完了した後、エッペンドルフチューブを磁性ラックに１分間置き、磁性ビーズと溶液を分離させた。ピペットガンで溶液をできるだけ完全に除去し、新しいチップ（ｔｉｐ）に置換し、洗浄液ＰＢＳＴ（リン酸緩衝液（ＰＢＳ）溶液中に最終濃度が０．０５％となるようにＴｗｅｅｎ ２０を添加したもの）１ｍｌをエッペンドルフチューブに加え、磁性ラックから離し、ピペットガンで磁性ビーズを緩やかに浮遊させ、磁性ラック上に改めて配置して磁性ビーズと溶液とを分離させた。溶液を除去し、このように３回繰り返した。次に、洗浄液をＰＢＳに変更し、磁性ビーズを３回洗浄した。洗浄により、非特異的で低親和性のファージ抗体はほとんど除去され、特異的なファージ抗体が磁性ビーズ上に残留した。磁性ビーズに溶出液（１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．０）を加え、磁性ビーズを再度浮遊させ、室温で１０分間放置し、磁性ビーズと溶液を磁性ラックで分離させ、溶液をきれいなエッペンドルフチューブに吸い込み、１／１０ １Ｍ トリス溶液（Ｔｒｉｓ溶液）（ｐＨ８．０）を加えて溶液を中和したものが、ＢＣＭＡ抗原に結合する数千の異なるファージ抗体が含まれている溶出液であり、これにより第１ラウンドのパニングが完了した。
【0067】
親和性が高い特異的抗体クローンをさらに得るために、より多くのパニングが必要である。このために、第１ラウンドのパニングにより溶離されたファージ抗体溶液を、Ｍ１３ファージを感染可能な大腸菌（例えば、ＴＧ１株）に対数期で感染させ、感染液を得た。少量な感染液を取り、一連の１０倍勾配希釈（通常、原液の１００万分の１までに希釈し、最後の３つの勾配希釈のものを取り、コーティングする）を行って、第１ラウンドで生産した溶出液（ｏｕｔｐｕｔ）の力価（ｔｉｔｅｒ）を測定した。この力価は、第１ラウンドの最大ダイバーシティとも呼ばれ、第１ラウンドにパニングされた溶出液の力価は通常１０Ｅ６ ｃｆｕ以下である。残りの感染液を、すべて相応の抗生物質を含む細菌培養プレート上にコーティングし、終夜培養して、コロニーを得た。コロニーを掻き取り、培地で再懸濁し、第１ラウンドの溶出液（ｏｕｔｐｕｔ）の多様性を含む十分な量の再懸濁液を、十分な量の液体培地（２ＹＴ培地に最終濃度がそれぞれ１００μｇ／ｍｌ及び２％となるようにカルベニシリンと及びグルコースがを入れた２ＹＴ－ＣＧ）を含む振とうフラスコに入れ、再懸濁液を０．１ ＯＤ６００以下までに希釈し、対数期、即ちＯＤ６００が約０．５に達するまで培養した。これらの第１ラウンドのパニングによって得られた抗体をファージ粒子の表面に再びディスプレイさせるために、１０ｍｌの細菌溶液を取り、補助ファージＭ１３Ｋ０７を加え、感染多重度が２０：１となるように３７℃で３０分間静置した（この段階はファージレスキューと呼ばれる）。遠心分離し、菌体を５０ ｍｌの発現培地（２ＹＴ培地に最終濃度がそれぞれ１００ μｇ／ｍｌ及び３０ μｇ／ｍｌとなるようにカルベニシリン及びカナマイシンを入れた２ＹＴ－ＡＫ）で再懸濁させ、３０℃で２００ ｒｐｍ／分で終夜培養した。翌日、遠心分離により上清を回収し、１／５体積のＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ（ＰＥＧ－８０００ ２０％、ＮａＣｌ ２．５ Ｍ）を加え、十分に混合させ、氷上で１時間インキュベートした。３０分間高速遠心分離（１１，５００×ｇ）して、ファージ抗体粒子を得た。沈殿を１ｍｌのＰＢＳ溶液に再懸濁させ、再び高速遠心分離機に置き、細菌の破片を除去した。上清は、第１ラウンドのパニング後の増幅液であり、それに含まれる各抗体クローンはいずれも数万倍以上に増幅されている。この増幅液は、第２ラウンドのパニング実験に使用できる。第２ラウンドのパニング操作は、ＰＢＳＴ／ＰＢＳによる洗浄をそれぞれ６回（６／６）までに増やすこと以外、第１ラウンドの操作方法とまったく同じである。第３ラウンドでは、洗浄回数をさらに１０／１０までに増やすことができる。複数ラウンドのパニングは、通常、特異的なクローンを効果的に濃縮し、多様性が大幅に減少したが、それらの親和性が高く、その後のモノクローナルのスクリーニングに便利である。
【0068】
特異的なモノクローナル抗体を得るためには、モノクローナルファージ酵素結合アッセイ（モノファージＥＬＩＳＡ）が必要である。このために、第２ラウンド及び／または第３ラウンドの勾配希釈で十分に分離できる単一コロニーを、２ＹＴ－ＡＧを含む９６ウェルプレートに個別に接種し（各プレートあたりコロニーを９３個接種し、陰性対照として三個のウェルを保留する）、終夜培養した。これはマスタープレート（ｍａｓｔｅｒ ｐｌａｔｅ）である。マスタープレート内の各ウェルの細菌溶液を新たな培養プレートに接種し、対数期までに増殖させ、各クローンの抗体がファージ表面にディスプレイするように上記のファージレスキューを行った。通常の９６ウェル酵素結合プレートにＢＣＭＡ抗原（１ μｇ／ｍｌ）をコーティングするとともに、同じ濃度でヒトＦｃで他の酵素結合プレートをコーティングした。各モノクローナルファージ抗体を個別に発現する細菌溶液をそれぞれＢＣＭＡプレート及びＦｃプレートの対応のウェルに添加し後、適切な二次抗体及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）がカップリングされた三次抗体を添加し、基質を発色させ、吸光度（４５０ｎＭ）を読み取った。ＢＣＭＡ陽性クローンの判断方法では、Ｆｃプレート上で陰性（吸光度がそのプレートの陰性ウェルの１．５倍以下）であるが、ＢＣＭＡプレート上で陽性（吸光度がそのプレートの陰性ウェルの３倍超え）でかつそのウェルの吸光度がＦｃプレート上の対応のウェルの吸光度より高いクローンを、ＢＣＭＡ陽性クローンと判断する。分析したところ、１０個のウェルに対応するクローンは、ＢＣＭＡ抗原のみに対して陽性であるが、Ｆｃに対して陰性であることが示され、これらのクローンをヒット（ｈｉｔ）と総称した。
【0069】
これらのヒット細菌溶液を、それぞれマスタープレートの対応のウェルから３ ｍｌの２ＹＴ－ＣＧに接種し、３７℃で置き、２００ｒｐｍ／分で終夜培養した。翌日、ファージミドＤＮＡを抽出し、特異的プライマーで各ヒットを含む一本鎖抗体領域の配列を測定した。コード領域のＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳し、それらに対して複数配列を比較して（ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ウェブサイトへのリンク ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ－ｂｉｎ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）、クローンの特異性を判断した。分析したところ、これらの１０個のヒットは、配列上で２つの異なるクローンに属し、その中の１つはＢ１０と命名され、これにより抗ヒトＢＣＭＡ抗原の完全ヒト抗体の可変領域配列を得た。Ｂ１０の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４～６で示されるものであり、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１～３で示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１７で示されるものであり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１８で示されるものである。Ｂ１０の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域からなる一本鎖抗体のアミノ酸配列は、配列番号３６で示されるものである。
【0070】
実施例２ 抗体機能の検証
得られたＢＣＭＡ抗体クローンが、精製されたＢＣＭＡ抗原及び細胞膜表面に発現されているＢＣＭＡに結合したかどうかを検証するために、Ｂ１０一本鎖抗体の遺伝子を真核生物発現ベクターｐＦＨ（Ｅｘｃｙｔｅ社製）にクローンし、プラスミドｐＦＨ－Ｂ１０を得た。このベクターでは、ｓｃＦｖ遺伝子がヒトＩｇＧ４のＦｃ遺伝子と融合してｓｃＦｖ－Ｆｃ形態のタンパク質を発現している。それは、プロテインＡ（Ｐｏｔｅｉｎ Ａ）によって親和性精製することができ、（ＨＲＰまたはフルオレセイン）標識抗ヒトＦｃ抗体によって検出することもできる。
得られたＢＣＭＡ抗体クローンが、精製されたＢＣＭＡ抗原及び細胞膜表面に発現されているＢＣＭＡに結合したかどうかを検証するために、Ｂ１０一本鎖抗体の遺伝子を真核生物発現ベクターｐＦＨ（Ｅｘｃｙｔｅ社製）にクローンし、プラスミドｐＦＨ－Ｂ１０を得た。このベクターでは、ｓｃＦｖ遺伝子がヒトＩｇＧ４のＦｃ遺伝子と融合してｓｃＦｖ－Ｆｃ形態のタンパク質を発現している。それは、プロテインＡ（Ｐｏｔｅｉｎ Ａ）によって親和性精製することができ、（ＨＲＰまたはフルオレセイン）標識抗ヒトＦｃ抗体によって検出することもできる。
【0071】
Ｂ１０のｓｃＦｖ－Ｆｃタンパク質を得た後、オクテットＲＥＤ（Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ）によって当該抗体のＢＣＭＡへの結合を検測したところ、Ｂ１０のＢＣＭＡへの特異的結合が確認された。
【0072】
フローサイトメーターを用いてＢ１０のＢＣＭＡ発現細胞株Ｈ９２９（ＮＣＩ―Ｈ９２９、ＡＴＣＣＲＣＲＴ―９０６８ＴＭ）への結合を検測したところ、Ｂ１０が細胞膜表面のＢＣＭＡ抗原に特異的に結合したことが示された（図２を参照）。このＦＡＣＳ分析では、４区画の左上隅の百分率（陽性百分率）は、各一本鎖抗体の細胞表面抗原への結合の強さを表す。クローンＢ１０の陽性百分率は４８．９６％であることから、当該抗ヒトＢＣＭＡ抗原の抗体結合能が検証された。
【0073】
実施例３ 抗体の親和性成熟
体外での親和性成熟は、ＤＮＡレベルで突然変異を導入し、タンパク質結合のレベルでスクリーニングする、急速的に分子進化を指向する操作である。Ｂ１０抗体の場合、免疫原性を高める可能性のある突然変異を導入すること、又は抗体の構造を顕著的に改変することを回避するために、突然変異部位がＣＤＲ領域の配列に制限され、かつ各位置がいずれもそれぞれ飽和突然変異を行い、各突然変異がそれぞれに発現してそれぞれに検測される。
体外での親和性成熟は、ＤＮＡレベルで突然変異を導入し、タンパク質結合のレベルでスクリーニングする、急速的に分子進化を指向する操作である。Ｂ１０抗体の場合、免疫原性を高める可能性のある突然変異を導入すること、又は抗体の構造を顕著的に改変することを回避するために、突然変異部位がＣＤＲ領域の配列に制限され、かつ各位置がいずれもそれぞれ飽和突然変異を行い、各突然変異がそれぞれに発現してそれぞれに検測される。
【0074】
親和性成熟の操作プロセスは、下記の通りである。まず、Ｂ１０の軽鎖可変領域遺伝子及び重鎖可変領域遺伝子をそれぞれｐＵＦＬベクター上（ｐＵＦＬは、大腸菌で抗体Ｆａｂを発現できるプラスミドであり、Ｅｘｃｙｔｅ社製のものである）にクローンし、Ｂ１０のＦａｂ型を得た。ＣＤＲ領域の単一サイトランダム突然変異プライマーの全セットを設計し、点突然変異キット（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ カタログ番号 ２１０５１５ ）を使用して、それぞれに各ＣＤＲ部位をＰＣＲ突然変異させ、それぞれにＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換し、それぞれにモノクローナルコロニープレートを調製し、これらの突然変異体はまとめて単一サイト突然変異体ライブラリーと呼ばれる。同時に、親抗体Ｂ１０のＦａｂベクターも形質転換した。３０個超えのコロニーを選別してＤＮＡを調製し、突然変異領域を配列解析し、突然変異率を評価した。突然変異率が適切（８０％超え）である場合、各ＣＤＲ位置の突然変異に応じて９２個のコロニーを選別し、対応の培地（２ＹＴ中に１００ μｇ／ｍｌのカルベニシリン＋０．１％のグルコースを含むもの）を含む９６ウェルプレートに入れ、別途に３個の親コロニーを選別し、ブランク対照として３個のウェルを保留した。プレートを３７℃で置き、３００ｒｐｍ／分で６時間培養し、ＩＰＴＧを終濃度が１ｍＭとなるように添加し、３０℃に移し、３００ｒｐｍ／分で終夜培養し、Ｆａｂ断片が発現し、さらに培地中に分泌した。
【0075】
予備実験により、Ｂ１０親抗体Ｆａｂの抗原ＢＣＭＡ－Ｆｃへの結合のＡ４５０吸光度がバックグラウンドシグナルの約３倍よりわずかに高くなるように酵素結合の反応条件を最適化した。一日先に酵素結合プレート上に０．２５μｇ／ｍｌでＢＣＭＡ－Ｆｃ抗原をコーティングし、翌日に、ウェルごとに分泌発現した突然変異型Ｆａｂを添加し、ＨＲＰによってカップリングされた抗ヒトＦａｂを二次抗体とし、基質を発色させ、Ａ４５０を読み取り、シグナルが親のウェルの最高値の１．５倍より高いウェルに対応するクローンを得て、これらのクローンはヒットと呼ばれる。軽鎖可変領域及び重鎖可変領域におけるすべてのヒットを収集し、誘導発現及び酵素結合実験を改めて行うことにより、それらが確かに親抗体よりも高い親和性を有することを確認した。反復陽性のクローンのプラスミドに対して突然変異領域の配列を解析し、ＣＤＲアミノ酸の突然変異情報を得た。このプロセスは、一次スクリーニングと呼ばれる。これにより、ＣＤＲ領域の全ての親和性の向上に有益な突然変異情報を得た。重鎖可変領域ＣＤＲにおける親和性を与える突然変異部位を表１に示し、軽鎖可変領域ＣＤＲにおける親和性を与える突然変異部位を表２に示す。
【0076】
【表1】
【0077】
【表2】
【0078】
一次ライブラリーから酵素結合実験によるスクリーニングによってＣＤＲ領域全体の親和性向上に有益な全ての単一突然変異情報を得た後、主要な有益的突然変異を含むように新たな多重点突然変異のプライマーを再設計し、再度に点突然変異キットによって突然変異体ライブラリーを構築した。このライブラリーは、コンビナトリアルライブラリーと呼ばれる。できるだけ軽鎖可変領域及び重鎖可変領域における全ての突然変異の組み合わせをスクリーニングするために、それぞれの複数の突然変異を含む軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の組み合わせライブラリーをそれぞれに構築及びスクリーニングした。軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２２～２６で示されるような５つの突然変異配列を含む、軽鎖可変領域の組み合わせライブラリーにおいて親和性が最も高い上位５つのクローンを得た。それらの軽鎖可変領域のＣＤＲ１は配列番号１、１２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号３、１３、１４、１５、１６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有する。
【0079】
重鎖可変領域の組み合わせライブラリーにおいて酵素結合スクリーニングを実施することによって、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１９～２１で示されるような３つの突然変異配列を含む、重鎖可変領域の組み合わせライブラリーにおいて親和性が最も高い上位３つのクローンを得た。それらの重鎖可変領域のＣＤＲ１は配列番号７、８、９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する。
【0080】
上記の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の中で最も親和性の高い上位５つのクローンのＤＮＡを混合し、酵素切断や連結の組換え方法によって最終的な一本鎖抗体のコンビナトリアルライブラリーに組み立てた。このライブラリーをスクリーニングし、シグナルが最も高い上位１０位を選別し、それらのＤＮＡ配列を解析したところ、相応のアミノ酸配列が配列番号３７～４０で示されるものである４つの異なる一本鎖抗体クローンを得た。
【0081】
得られた突然変異体の親和性が向上したかどうかを検証するために、Ｂ１０親抗体及び最後に得られた４つの突然変異体Ｂ１０．３、Ｂ１０．４、Ｂ１０．５、Ｂ１０．９（アミノ酸配列はそれぞれ配列番号３７～４０で示されるものである）とＦｃとの融合タンパク質（即ち、ｓｃＦｖ－Ｆｃ）をそれぞれ発現させ、精製した。精製された生成物を、２つの発現レベルの異なるＢＣＭＡ陽性細胞株Ｈ９２９及びＲＰＭＩ８２２６上でフローサイトメーターによって検測した。それらのＨ９２９細胞への結合の百分率は、それぞれ、親抗体Ｂ１０が７５．３１％であり、突然変異体Ｂ１０．３が９７．９６％までに向上し、突然変異体Ｂ１０．４が９７．８９％までに向上し、突然変異体Ｂ１０．５が９７．１７％までに向上し、突然変異体Ｂ１０．９が９１．６１％までに向上した。ＲＰＭＩ８２２６細胞への結合の百分率は、それぞれ、親抗体Ｂ１０が５．５４％であり、突然変異型Ｂ１０．３が５４．８９％までに向上し、突然変異型Ｂ１０．４が５７．５１％までに向上し、突然変異型Ｂ１０．５が５８．１８％までに向上し、突然変異型Ｂ１０．９が４２．８９％までに向上した。これらの結果は、４つの突然変異体は、Ｂ１０に比べて、いずれもＢＣＭＡへの結合を有意に向上したことを示した（図３を参照）。
【0082】
得られたＢ１０及びその誘導体化抗体の親和性を知るために、ＥＬＩＳＡによってＢ１０親抗体及び最後に得られた４つの突然変異体を、親和性既知のＢＣＭＡ抗体Ｊ６（即ちクローンＪ６Ｍ０であり、特許［ＷＯ２０１２１６３８０５Ａ１］の記載によれば、その親和性が約０．２ｎＭである）とそれぞれ比較する実験を行った。異なる濃度の抗体で酵素結合プレートをコーティングした後、生物素化ＢＣＭＡ抗原、ストレプトアビジンがカップリングされた西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、及び発色基質を順に添加した。得られたシグナル－抗体勾配曲線を図４Ａに示し、相対親和性変化倍数を表３に示す。
【0083】
【表3】
【0084】
上記の結果により、固有の親和性では、親抗体Ｂ１０のヒトＢＣＭＡへの結合はＪ６より有意に弱いため、Ｓ行曲線が得られず、その親和性の数値を生成できなかったことが示された。また、Ｂ１０．３の親和性は約０．２６ｎＭ、Ｂ１０．４の親和性は約０．３１ｎＭ、Ｂ１０．５の親和性は約０．２７ｎＭ、Ｂ１０．９の親和性は約０．２９ｎＭであった。
【0085】
これらの抗体の細胞表面のＢＣＭＡに対する見かけ親和性を知るために、Ｂ１０親抗体及び最後に得られた４つの突然変異体と、Ｊ６とを、それぞれＢＣＭＡを発現する細胞株ＲＰＭＩ８２２６と結合するフローサイトメトリーによって比較実験を行った（図４Ｂ、表４を参照）。その結果、細胞レベルでは、親Ｂ１０のＥＣ５０は、Ｊ６（ＥＣ５０が２．７４１μｇ／ｍｌである）より約１．５倍で向上され、１．５７５μｇ／ｍｌであった。Ｂ１０．３、Ｂ１０．４、Ｂ１０．５及びＢ１０．９のＥＣ５０は、それぞれ、０．０２８２２μｇ／ｍｌ、０．０３４２９μｇ／ｍｌ、０．０４０６３μｇ／ｍｌ及び０．０４５１４μｇ／ｍｌであった。Ｊ６に比べて、これらの親和性が向上された突然変異体のＥＣ５０の向上倍数は、それぞれ９７．１３、７９．９４、６７．４６、及び６０．７２であった。
【0086】
【表4】
【0087】
実施例４ ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の設計
本実施例は、腫瘍細胞表面抗原ＢＣＭＡ及び免疫細胞表面抗原ＣＤ３を標的とし、二重特異性抗体を設計した。
本実施例は、腫瘍細胞表面抗原ＢＣＭＡ及び免疫細胞表面抗原ＣＤ３を標的とし、二重特異性抗体を設計した。
【0088】
本発明は、タンパク質構造設計ソフトウェアと大量の人工的実験によるスクリーニングとを組み合わせて、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する複数種の二重特異性抗体構造から、一本鎖抗体単位及びモノクローナル抗体単位を含む、対称構造を有する二重特異性抗体の構造をスクリーニングして決定した。本発明では、このような技術プラットフォームはＦＩＳＴ（ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ ａｎｄ ｓｃＦｖ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と呼ばれている。例えば、抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体単位は、ＩｇＧ抗体として、２つの完全な軽鎖－重鎖ペア（即ち、完全なＦａｂ及びＦｃドメインを含み、軽鎖と重鎖とがジスルフィド結合を介して連結されているもの）を含み、抗-ＣＤ３は、一本鎖抗体単位として２つの一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）を含むことができる。一本鎖抗体とモノクローナル抗体とがリンカーペプチド（配列番号３０で示されるもの）により連結されており、一本鎖抗体とモノクローナル抗体との連結方式として、以下のような連結方式を設計し、対称構造を有する二重特異性抗体を得た（図５）。
【0089】
一本鎖抗体のＣ末端をモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のＮ末端に連結し、ｎＦＩＳＴを得た（図５のＡ）。一本鎖抗体は、リンカーペプチドを介してＩｇＧ－ＦｃのＣ末端に融合して、ｃＦＩＳＴを得ることもできる（図５のＢ）。
【0090】
本実施例では、抗-ＣＤ３一本鎖抗体ＵＣＨＴ１の可変領域配列は、文献（Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，Ｐ．Ｃ．＆Ｃａｌｌａｒｄ，Ｒ．Ｅ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ “Ｔ” ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ Ｅ ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ ｏｒ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ－Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （１９８１） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１，３２９～３３４）に由来するものであった、ヒト化改造された（Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ．ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ＨＥＲ２ ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ．（１９９２） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．Ｊａｎ １；１７５（１）：２１７～２５）ものである。このように構築された一本鎖抗体は、Ｋ３（配列番号３１で）と命名され、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域にそれぞれ挿入された２つのシステイン（Ｃｙｓ）を含み、折り畳まれた後に鎖間ジスルフィド結合を一対形成し、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２８で示されるものであり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２９で示されるものである。
【0091】
実施例５ ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の作製
実施例４で設計されたｎＦＩＳＴ及びｃＦＩＳＴ形式の二重特異性抗体に従って遺伝子をコードして、発現ベクターｐＧ４ＨＫにクローンすることによって、２つの二重特異性抗体Ｋ３Ｂ１０．３及びＢ１０．３Ｋ３を得た。それらの重鎖アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３４及び３５（モノクローナル抗体の重鎖と一本鎖抗体とがリンカーペプチドを介して連結された融合ペプチドである）で示されるものであり、軽鎖アミノ酸配列は配列番号３３で示されるものである。Ｋ３Ｂ１０．３及びＢ１０．３Ｋ３に対応する発現プラスミドを、それぞれＣＨＯ－Ｋ１に安定的にトランスフェクションし、二重特異性抗体タンパク質を作製した。
実施例４で設計されたｎＦＩＳＴ及びｃＦＩＳＴ形式の二重特異性抗体に従って遺伝子をコードして、発現ベクターｐＧ４ＨＫにクローンすることによって、２つの二重特異性抗体Ｋ３Ｂ１０．３及びＢ１０．３Ｋ３を得た。それらの重鎖アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３４及び３５（モノクローナル抗体の重鎖と一本鎖抗体とがリンカーペプチドを介して連結された融合ペプチドである）で示されるものであり、軽鎖アミノ酸配列は配列番号３３で示されるものである。Ｋ３Ｂ１０．３及びＢ１０．３Ｋ３に対応する発現プラスミドを、それぞれＣＨＯ－Ｋ１に安定的にトランスフェクションし、二重特異性抗体タンパク質を作製した。
【0092】
ｃＦＩＳＴ形式によってより多くの抗ＢＣＭＡ×ＣＤ３の二重特異性抗体を構築した。この中、ＢＣＭＡに結合するＩｇＧ単位の重鎖可変領域は配列番号１７～２１で示されるものに由来し、ＢＣＭＡに結合するＩｇＧ単位の軽鎖可変領域は配列番号１８、２２、２５～２７で示されるものに由来した。これらの抗体のプラスミドを２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、一過性発現及びプロテインＡによってそれらをさらに精製し、Ｂ１０Ｋ３（重鎖アミノ酸配列が配列番号４１で示されるものであり、軽鎖アミノ酸配列が配列番号４２で示されるものである）、Ｂ１０．３Ｋ３、Ｂ１０．４Ｋ３（重鎖アミノ酸配列が配列番号４３で示されるものであり、軽鎖アミノ酸配列が配列番号４４で示されるものである）、Ｂ１０．５Ｋ３（重鎖アミノ酸配列が配列番号４５で示されるものであり、軽鎖アミノ酸配列が配列番号４６で示されるものである）、Ｂ１０．９Ｋ３（重鎖アミノ酸配列が配列番号４７で示されるものであり、軽鎖アミノ酸配列が配列番号４８で示されるものである）二重抗体を得た。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度分析を行ったところ、モノマーが９０％以上であったことが示された。それらのＢＣＭＡ抗原への結合の検測結果を図９Ａに示す。
【0093】
上記の二重特異性抗体について、高純度の二重特異性抗体を得るために、以下の手順に従って実施した。（１）試料液の前処理：発酵培養された上清を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、０．２２μＭのメンブレーンフィルターで濾過処理した。（２）アフィニティークロマトグラフィー：Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ社から購入、商品番号１８－５４３８－０２）を用い、前処理された発酵液における抗体を捕捉した。緩衝液（１０ｍＭ ＰＢＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）でクロマトグラフィーカラムの平衡化を十分に行い、試料液をアフィニティークロマトグラフィーカラムに流し、溶離液（０．１Ｍ クエン酸、ｐＨ３．０）で溶出した。（３）陽イオン交換クロマトグラフィー：アフィニティークロマトグラフィーで作製されたサンプルを、分子篩交換クロマトグラフィーでさらに精製し、緩衝液（５０ ｍＭ ＰＢＳ、０．２ Ｍａｎ Ｎａ２ＳＯ４、ｐＨ６．７）で溶出した。
【0094】
Ｋ３Ｂ１０．３及びＢ１０．３Ｋ３に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ－ＳＥＣの検測を行い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図６に示す。このうち、Ｋ３Ｂ１０．３の還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の検測結果を図６Ａに示し、非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の検測結果を図６Ｂに示し、Ｂ１０．３Ｋ３の還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の検測結果を図６Ｃに示し、非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の検測結果を図６Ｄに示す。ＨＰＬＣ－ＳＥＣの検測結果を図７に示す。その中、Ｋ３Ｂ１０．３のＳＥＣの検測結果を図７Ａに示し、Ｂ１０．３Ｋ３のＳＥＣの検測結果を図７Ｂに示す。その検測結果によると、発現及び精製によって二重特異性抗体Ｋ３Ｂ１０．３及びＢ１０．３Ｋ３を作製することに成功した。精製された二重特異性抗体のモノマーの純度は９５％以上である。
【0095】
実施例６ フローサイトメトリー法による二重特異性抗体とＴ細胞との結合活性の検測
健康なヒトドナーのＰＢＭＣ細胞を収集してＴ細胞を精製し、１×１０６ｃｅｌｌ／チューブでＰＢＳに再懸濁し、結合緩衝液（０．５％ｗ／ｖ ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）１ ｍｌで細胞を１回洗浄し、遠心分離（３５０×ｇ、４℃、５分間）した後、結合緩衝液２００μｌで細胞を再懸濁した。５μｇ／ｍｌとなるように二重特異性抗体Ｋ３Ｂ１０．３及びＢ１０．３Ｋ３をそれぞれ添加し、氷上で４５分間インキュベートした。上記のように細胞を一回洗浄した後、結合緩衝液１００μｌで細胞を再懸濁した。サンプルチューブに蛍光標識二次抗体（ＰＥ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０９３０４）５μｌを加え、アイソタイプコントロールチューブにアイソタイプコントロール（ＰＥ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ、κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ（ＦＣ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４００２１３ ）を加え、氷上で１５ｍｉｎ遮光してインキュベートした。上記のように細胞を一回洗浄した。細胞をＰＢＳ２００μｌで再懸濁した後、機械（Ｂｅｃｋｍａｎ）にかけて測定した。
健康なヒトドナーのＰＢＭＣ細胞を収集してＴ細胞を精製し、１×１０６ｃｅｌｌ／チューブでＰＢＳに再懸濁し、結合緩衝液（０．５％ｗ／ｖ ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）１ ｍｌで細胞を１回洗浄し、遠心分離（３５０×ｇ、４℃、５分間）した後、結合緩衝液２００μｌで細胞を再懸濁した。５μｇ／ｍｌとなるように二重特異性抗体Ｋ３Ｂ１０．３及びＢ１０．３Ｋ３をそれぞれ添加し、氷上で４５分間インキュベートした。上記のように細胞を一回洗浄した後、結合緩衝液１００μｌで細胞を再懸濁した。サンプルチューブに蛍光標識二次抗体（ＰＥ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０９３０４）５μｌを加え、アイソタイプコントロールチューブにアイソタイプコントロール（ＰＥ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ、κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ（ＦＣ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４００２１３ ）を加え、氷上で１５ｍｉｎ遮光してインキュベートした。上記のように細胞を一回洗浄した。細胞をＰＢＳ２００μｌで再懸濁した後、機械（Ｂｅｃｋｍａｎ）にかけて測定した。
【0096】
フローサイトメトリーによるＫ３Ｂ１０．３及びＢ１０．３Ｋ３のヒトＴ細胞への結合の検測結果を図８に示し、その中、対照の検測結果を図８Ａに示し、Ｋ３Ｂ１０．３のＴ細胞への結合の検測結果を図８Ｂに示し、Ｂ１０．３Ｋ３のＴ細胞への結合の検測結果を図８Ｃに示す。その結果によると、二重特異性抗体Ｋ３Ｂ１０．３及びＢ１０．３Ｋ３は、いずれもＴ細胞に特異的に結合でき、即ち二重特異性抗体融合タンパク質は一本鎖抗体抗ＣＤ３の結合機能を保持している。
【0097】
抗ＢＣＭＡ単位のＢＣＭＡへの結合を検測するために、当該実験のＴ細胞をＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣ(R)ＣＣＬ－１５５）に変更し、類似なＦＡＣＳ実験を実施した。対照の検測結果を図８Ｄに示し、Ｋ３Ｂ１０．３及びＢ１０．３Ｋ３の検測結果を図８Ｅ及びＦに示す。
【0098】
実施例７ 二重特異性抗体により媒介された体外での細胞殺傷の効率の検測
本実施例は、それぞれＨ９２９－ｌｕｃ及びＲＰＭＩ８２２６－Ｌｕｃを標的細胞とし、ＰＢＭＣを免疫エフェクター細胞として、二重特異性抗体Ｂ１０Ｋ３、Ｂ１０．３Ｋ３、Ｂ１０．４Ｋ３、Ｂ１０．５Ｋ３、Ｂ１０．９Ｋ３及びＫ３Ｂ１０．３により媒介された標的細胞の殺傷効果を検測した。具体的な実験手順は次の通りである。
本実施例は、それぞれＨ９２９－ｌｕｃ及びＲＰＭＩ８２２６－Ｌｕｃを標的細胞とし、ＰＢＭＣを免疫エフェクター細胞として、二重特異性抗体Ｂ１０Ｋ３、Ｂ１０．３Ｋ３、Ｂ１０．４Ｋ３、Ｂ１０．５Ｋ３、Ｂ１０．９Ｋ３及びＫ３Ｂ１０．３により媒介された標的細胞の殺傷効果を検測した。具体的な実験手順は次の通りである。
【0099】
１）標的細胞の用意：Ｈ９２９－ｌｕｃ及びＲＰＭＩ８２２６－Ｌｕｃ（ルシフェラーゼで標識されたＨ９２９及びＲＰＭＩ８２２６細胞、Ｅｘｃｙｔｅ社のラボで製造したもの）細胞を培養し、上下にピペッティングして標的細胞を均一に混合させてから計数し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳで１回洗浄した。標的細胞を遠心分離して洗浄した後、ＧＴ－Ｔ５５１培地で密度が０．２×１０６／ｍｌとなるように調整し、１ウェルあたり５０μｌを加え、つまり１ウェルにおける細胞数が１０，０００個であった。
２）ＰＢＭＣの用意：ＰＢＭＣをエフェクター細胞とした。液体窒素タンク内に凍結保存されたＰＢＭＣを取り出して解凍し（細胞の凍結保存及び再培養を参考）、ＰＢＳまたはＧＴ－Ｔ５５１培地を含む１５ｍｌの遠心チューブに加え、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳまたはＧＴ－Ｔ５５１培地で２回洗浄し、細胞数、生存率及び密度を計測し、生細胞の密度が２×１０６／ｍｌとなるように調整し、１ウェルあたり５０μｌを加え、つまり１ウェルにおける細胞数が１００，０００個であった。
３）抗体の希釈：ＧＴ－Ｔ５５１培地で二重特異性Ｂ１０Ｋ３、Ｂ１０．３Ｋ３、Ｂ１０．４Ｋ３、Ｂ１０．５Ｋ３、Ｂ１０．９Ｋ３、Ｋ３Ｂ１０．３及びＢ１０．３Ｋ３をそれぞれ希釈し、抗体の初期濃度が１０ｎＭとなるように調整した。１：５の比率で順次希釈した。希釈された抗体１００μｌを上記で用意した細胞に加え、均一に混合し、９６ウェルプレートをインキュベーターに置き、１８時間後に殺傷効果を検測した。
４）検測：Ｈ９２９またはＲＰＭＩ８２２６の標的細胞がＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を持っているため、ＬＵＭＩＮＥＸ法によって標的細胞への殺傷効率を検測した。
Ｓｔｅａｄｙ－ＧＬＯ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を基質として、キット内の緩衝液を解凍して融化させた後、基質粉末に添加して均一に混合し、１本あたり５ｍｌまたは１０ｍｌ分注し、Ｓｔｅａｄｙ－ＧＬＯ基質の再構築を完了した。共培養された細胞を上下にピペッティングして均一に混合させてから、１００μｌを取って不透明な白プレートに移し、再構築のＳｔｅａｄｙ－ＧＬＯ基質１００μｌを加え、均一に混合するように軽くたたき、５分間放置した後プレートを読み取った。検測装置はＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴであった。
５）データ処理：標的細胞の殺傷率の計算式は次の通りである。
標的細胞の殺傷率（百分率）＝１００×（標的細胞のみ含むウェルの数値－検測ウェルの数値）／標的細胞のみ含むウェルの数値
２）ＰＢＭＣの用意：ＰＢＭＣをエフェクター細胞とした。液体窒素タンク内に凍結保存されたＰＢＭＣを取り出して解凍し（細胞の凍結保存及び再培養を参考）、ＰＢＳまたはＧＴ－Ｔ５５１培地を含む１５ｍｌの遠心チューブに加え、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳまたはＧＴ－Ｔ５５１培地で２回洗浄し、細胞数、生存率及び密度を計測し、生細胞の密度が２×１０６／ｍｌとなるように調整し、１ウェルあたり５０μｌを加え、つまり１ウェルにおける細胞数が１００，０００個であった。
３）抗体の希釈：ＧＴ－Ｔ５５１培地で二重特異性Ｂ１０Ｋ３、Ｂ１０．３Ｋ３、Ｂ１０．４Ｋ３、Ｂ１０．５Ｋ３、Ｂ１０．９Ｋ３、Ｋ３Ｂ１０．３及びＢ１０．３Ｋ３をそれぞれ希釈し、抗体の初期濃度が１０ｎＭとなるように調整した。１：５の比率で順次希釈した。希釈された抗体１００μｌを上記で用意した細胞に加え、均一に混合し、９６ウェルプレートをインキュベーターに置き、１８時間後に殺傷効果を検測した。
４）検測：Ｈ９２９またはＲＰＭＩ８２２６の標的細胞がＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を持っているため、ＬＵＭＩＮＥＸ法によって標的細胞への殺傷効率を検測した。
Ｓｔｅａｄｙ－ＧＬＯ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を基質として、キット内の緩衝液を解凍して融化させた後、基質粉末に添加して均一に混合し、１本あたり５ｍｌまたは１０ｍｌ分注し、Ｓｔｅａｄｙ－ＧＬＯ基質の再構築を完了した。共培養された細胞を上下にピペッティングして均一に混合させてから、１００μｌを取って不透明な白プレートに移し、再構築のＳｔｅａｄｙ－ＧＬＯ基質１００μｌを加え、均一に混合するように軽くたたき、５分間放置した後プレートを読み取った。検測装置はＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴであった。
５）データ処理：標的細胞の殺傷率の計算式は次の通りである。
標的細胞の殺傷率（百分率）＝１００×（標的細胞のみ含むウェルの数値－検測ウェルの数値）／標的細胞のみ含むウェルの数値
【0100】
全ての検測ウェルの標的細胞の殺傷率に対応する抗体濃度をｌｏｇ１０に変換し、これを横軸とし、殺傷率を縦軸としてグラフを作成した。ｃＦＩＳＴ形式の二次抗体Ｂ１０Ｋ３、Ｂ１０．３Ｋ３、Ｂ１０．４Ｋ３、Ｂ１０．５Ｋ３、及びＢ１０．９Ｋ３の感受性細胞株ＲＰＭＩ８２２６に対する殺傷濃度－勾配曲線を図９Ｂに示し、各勾配の殺傷百分率を表５に示す。
【0101】
Ｋ３Ｂ１０．３及びＢ１０．３Ｋ３の結果を図１０に示し、それらのＲＰＭＩ８２２６に対する殺傷百分率を表６に示し、それらのＨ９２９に対する殺傷百分率を表７に示す。その結果によると、二重特異性抗体Ｂ１０．３Ｋ３は、いずれもＰＢＭＣが腫瘍細胞株Ｈ９２９またはＲＰＭＩ８２２６を殺傷することを効率的に媒介することができ、
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のＢ１０．３Ｋ３の分子は、いずれも抗ＢＣＭＡの生物学的機能及び抗ＣＤ３モノクローナル抗体の生物学的機能を同時に有する。Ｋ３Ｂ１０．３により媒介された標的細胞ＲＰＭＩ８２２６を殺傷する効力は、Ｂ１０．３Ｋ３より顕著に弱く、特にＨ９２９細胞に対する殺傷効果がほとんどない。Ｂ１０．９Ｋ３、Ｂ１０．５Ｋ３、Ｂ１０．４Ｋ３、Ｂ１０．３Ｋ３、及びＢ１０Ｋ３により媒介された標的細胞の殺傷のＥＣ５０は、それぞれ８．７５９ｐＭ、１２．８７ｐＭ、７．８３９ｐＭ、５．８３３ｐＭ、及び２８１．７ｐＭであった。
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のＢ１０．３Ｋ３の分子は、いずれも抗ＢＣＭＡの生物学的機能及び抗ＣＤ３モノクローナル抗体の生物学的機能を同時に有する。Ｋ３Ｂ１０．３により媒介された標的細胞ＲＰＭＩ８２２６を殺傷する効力は、Ｂ１０．３Ｋ３より顕著に弱く、特にＨ９２９細胞に対する殺傷効果がほとんどない。Ｂ１０．９Ｋ３、Ｂ１０．５Ｋ３、Ｂ１０．４Ｋ３、Ｂ１０．３Ｋ３、及びＢ１０Ｋ３により媒介された標的細胞の殺傷のＥＣ５０は、それぞれ８．７５９ｐＭ、１２．８７ｐＭ、７．８３９ｐＭ、５．８３３ｐＭ、及び２８１．７ｐＭであった。
【0102】
【表5】
【0103】
【表6】
【0104】
【表7】
【0105】
上記の表５、表６及び表７において、各二重特異性抗体の二つの縦欄の数値は、２回の繰り返し実験の結果（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）である。
【0106】
上記において、一般的な説明及び具体的な実施形態で本発明を詳しく説明したが、本発明に基づき、いくつかの修正や改善を行い得ることは、当業者にとって自明である。従って、本発明の趣旨から逸脱しない範疇で行われるこれらの修正や改善は、いずれも本発明の保護しようとする範囲に属する。
【産業上の利用可能性】
【0107】
本発明は、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体及びその作製方法並び使用に関するものである。本発明は、ＢＣＭＡ及びＣＤ３を同時に結合し、特異的な標的作用を有し、指向性免疫反応を効率的に誘発できる二重特異性抗体を提供する。当該二重特異性抗体は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＢＣＭＡ抗体の生物学的機能を十分に保持しており、一つの二重特異性抗体分子がＢＣＭＡとＣＤ３の標的結合の優れた生物学的機能を同時に有することを実現しており、腫瘍細胞と免疫エフェクター細胞との架け橋となり、免疫エフェクター細胞及び指向性免疫反応を効果的に誘起でき、免疫細胞の腫瘍細胞に対する殺傷効果を有意に向上させ、高い標的細胞への殺傷効率を有するとともに、ＡＤＣＣ効果を最小限に抑え、高い安全性を有し、腫瘍の免疫治療において良好な使用見通しがある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】