▶ ドンペ ファーマスーチシ ソシエタ ペル アチオニの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-08
(54)【発明の名称】眼の病態の治療に使用するためのＮＧＦアイソフォーム
(51)【国際特許分類】
A61K 38/18 20060101AFI20240201BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240201BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240201BHJP
A61P 27/06 20060101ALI20240201BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240201BHJP
C07K 14/48 20060101ALN20240201BHJP
【ＦＩ】
A61K38/18
A61P27/02
A61P37/06
A61P27/06
A61K9/08
C07K14/48 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023547342
(86)(22)【出願日】2022-02-04
(85)【翻訳文提出日】2023-10-04
(86)【国際出願番号】 EP2022052761
(87)【国際公開番号】W WO2022167607
(87)【国際公開日】2022-08-11
(31)【優先権主張番号】21155393.8
(32)【優先日】2021-02-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516388388
【氏名又は名称】ドンペ ファーマスーチシ ソシエタ ペル アチオニ
(74)【代理人】
【識別番号】110001243
【氏名又は名称】弁理士法人谷・阿部特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】アンドレア アラミニ
(72)【発明者】
【氏名】ピエール ジョルジオ アメンドラ
(72)【発明者】
【氏名】アンナ シリコ
(72)【発明者】
【氏名】ガエターノ ダニーバル
(72)【発明者】
【氏名】フランカ カッターニ
(72)【発明者】
【氏名】マルチェロ アレグレッティ
(72)【発明者】
【氏名】フラビオ マンテルリ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076BB24
4C076CC07
4C076CC10
4C076DD23
4C076DD67
4C084AA02
4C084BA21
4C084CA53
4C084DB59
4C084MA05
4C084MA17
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA33
4C084ZB08
4H045AA30
4H045BA09
4H045DA21
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ＮＧＦの投与による眼の病態の治療の分野に関し、ＮＧＦは配列番号１のＮＧＦアイソフォームを５０重量％超含む。前記ＮＧＦは、ＮＧＦの増殖および生存効果が所望され、ｐ７５ＮＴＲのプロアポトーシス効果が有害である眼の病態の治療に特に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
網膜症、角膜の病態、視神経症、結膜の病態、角縁幹細胞欠乏から選択される眼の病態の治療、および角膜移植における同種移植片拒絶反応の予防に使用するためのＮＧＦであって、前記ＮＧＦが、前記ＮＧＦに含まれる全てのＮＧＦアイソフォームの総重量に対して５０重量％超の配列番号１のＮＧＦを含む、ＮＧＦ。
【請求項2】
前記ＮＧＦが、前記ＮＧＦに含まれる全てのＮＧＦアイソフォームの総重量に対して、少なくとも６０重量％、より好ましくは少なくとも７０重量％、さらにより好ましくは少なくとも８０重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、さらにより好ましくは少なくとも９５重量％、さらにより好ましくは少なくとも９８重量％、さらにより好ましくは少なくとも９９重量％、さらにより好ましくは１００重量％の配列番号１のＮＧＦアイソフォームを含む、請求項１に記載の使用のためのＮＧＦ。
【請求項3】
前記ＮＧＦに含まれる前記ＮＧＦアイソフォームが、配列番号１、２、３もしくは４のＮＧＦアイソフォームもしくはそれらの混合物を含むか、またはそれらから選択される、請求項１または２に記載の使用のためのＮＧＦ。
【請求項4】
前記ＮＧＦが、前記ＮＧＦに含まれるすべてのＮＧＦアイソフォームの総重量に対して、２０重量％未満、より好ましくは１０重量％未満、さらにより好ましくは５重量％未満の総重量で、配列番号２、３もしくは４のＮＧＦアイソフォームまたはそれらの混合物を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のためのＮＧＦ。
【請求項5】
前記ＮＧＦが、前記ＮＧＦに含まれる全てのＮＧＦの総重量に対して、２重量％未満、好ましくは１重量％未満の量で、配列番号２、３もしくは４のＮＧＦアイソフォームまたはそれらの混合物を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のためのＮＧＦ。
【請求項6】
前記配列番号１のＮＧＦアイソフォームが、いかなる翻訳後修飾も含まない、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のためのＮＧＦ。
【請求項7】
前記網膜症が、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、光毒性網膜症、網膜剥離、加齢黄斑変性、黄斑変性、黄斑萎縮、黄斑円孔、黄斑浮腫、および網膜上膜から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のためのＮＧＦ。
【請求項8】
前記角膜の病態が、円すい角膜、光毒性角膜症、遷延性上皮欠損、角膜潰瘍、角膜ジストロフィーおよび変性、並びに乾性角結膜炎から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のためのＮＧＦ。
【請求項9】
前記視神経症が、緑内障並びに虚血性、変性性、外傷性、遺伝性および先天性視神経症から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のためのＮＧＦ。
【請求項10】
治療上有効な量の請求項１～９のいずれか一項に記載の使用のためのＮＧＦと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項11】
眼科用途用医薬組成物である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
液体眼科用組成物、好ましくは眼科用水性液体組成物である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
前眼部への局所投与用の水性点眼剤組成物である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記ＮＧＦを、前記水性組成物の約０．０００１％～０．５％ｗ／ｖの範囲、より好ましくは約０．００１％～約０．１％ｗ／ｖの範囲、より好ましくは約０．００２％ｗ／ｖの濃度で含む、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項15】
後眼部への投与のための請求項１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、眼の病態の治療、特にＮＧＦの特定のアイソフォームの投与による眼の病態の治療の分野に関する。
【背景技術】
【0002】
神経成長因子（ＮＧＦ）は、進化的に十分に保存されたニューロトロフィン成長因子のファミリーのメンバーであり、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経栄養素－３（ＮＴ３）およびＮＴ４／５も包含する。
【0003】
それは、２つの構造的に無関係な細胞表面受容体、高親和性受容体チロシンキナーゼＡ（ＴｒＫＡ）および低親和性ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）と相互作用することによってその活性を発揮する。
【0004】
これらの２つの受容体が、細胞に対して複雑かつしばしば反対のＮＧＦの効果を仲介することが示されている。
【0005】
ＴｒＫＡは、ＮＧＦに対して選択的であり、ＰＩ３キナーゼ、Ｒａｓ／細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）、Ａｋｔ１およびプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）などの細胞の生存、増殖および分化を促進する異なるシグナル伝達経路を誘発する（非特許文献１、非特許文献２）。さらに、ＴｒＫＡの活性化は、例えば、カプサーゼ３を阻害することにより、細胞内のアポトーシスシグナル伝達を阻害する(非特許文献３)。
【0006】
ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーに属し、非特異的にすべてのニューロトロフィンに結合する。ＴｒＫＡ受容体に結合したときに観察されたものとは対照的に、ｐ７５ＮＴＲへのＮＧＦ結合は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）および、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）、核カッパＢ（ＮＦｋＢ）、カプサーゼおよびｐ５３を含むＦａｓ受容体などの、細胞死受容体によって活性化されるものと同様の多数の細胞内メディエーターの活性化によってアポトーシスを誘導する(非特許文献４、非特許文献５)。
【0007】
したがって、細胞へのＮＧＦの最終的な作用は、発現レベルおよび上記の２つの受容体の活性化に著しく依存する。したがって、２つの受容体の比率の変化は、ＴｒＫＡによって仲介される増殖、成長促進および生存効果のいずれか、またはｐ７５ＮＲＴによって仲介されるアポトーシス応答の支配により、ＮＧＦによって誘導される保護効果および有害な効果の間でバランスを変化させることができ、したがって、細胞へのＮＧＦの最終的な作用を変化させる（非特許文献６、非特許文献７)。
【0008】
ＮＧＦのｐ７５ＮＴＲに対する親和性はＴｒＫＡに対してよりも低いが、その細胞型分布はＴｒＫＡのものよりも広い。
【0009】
両方のＮＧＦ受容体は、角膜、結膜、角膜縁上皮（ｌｉｍｂａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）、網膜および視神経を含む眼の前部および後部の両方で広く発現し、ＮＧＦは、眼の生理学および病理学の両方において、細胞生存、増殖、分化およびアポトーシスなどのプロセスを調節する重要な役割を有することが実証されている（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。いくつかの実証研究は、ＴｒＫＡ刺激が虚血性損傷、視神経切断、および高眼圧症後のＲＧＣの生存を促進することを実証した(非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献４、非特許文献１５)。
【0010】
上記にかかわらず、視覚系におけるＮＧＦの効果は複雑であり、細胞状況並びに各ＮＧＦ受容体の細胞分布および発現レベルに応じて、一義的ではない。例えば、網膜において、ＲＧＣはＴｒＫＡを発現し、グリア細胞はｐ７５ＮＴＲを発現する。緑内障の動物モデルにおける研究では、生存促進性ＴｒＫＡ受容体の選択的アゴニストがＲＧＣの死を予防するのに有効であるが、ＮＧＦもアポトーシス促進性ｐ７５受容体のアンタゴニストもＲＧＣを保護しないことが示された(非特許文献１６)。
【0011】
その後の研究は、ｐ７５ＮＴＲの薬理学的阻害において、またはｐ７５ＮＴＲノックアウトマウスにおいて、軸索切断されたＲＧＣの生存率の向上を示した。加えて、ＮＧＦまたはＴｒＫＡアゴニストと、ｐ７５ＮＴＲアンタゴニストとの組み合わせは、インビボでのＲＧＣ神経保護をさらに増強した(非特許文献１７）。
【0012】
要約すると、いくつかのデータは、ＮＧＦがＲＧＣのＴｒＫＡ受容体に結合すると神経保護効果を発揮し、グリア細胞に作用するとｐ７５ＮＴＲがこの効果に拮抗するという仮説を裏付けている（非特許文献１８)。
【0013】
これらの論争の的になっている発見は、ＮＧＦが、異なる状況での網膜におけるＴｒＫＡおよびｐ７５ＮＴＲの相対的な発現が異なるために、ＲＧＣに対して異なる作用を有するという観察結果によって説明することができ、したがって、ＮＧＦ栄養支持体の不具合は、ＴｒＫＡに関連するｐ７５ＮＴＲの進行性の上方制御に関連し得る（非特許文献１５、非特許文献１９）。
【0014】
この証拠は、ｐ７５ＮＴＲの選択的活性化が正常な網膜におけるＲＧＣ死を誘導し、疾患眼におけるＲＧＣ死を加速させる一方で、選択的ＴｒＫＡアゴニストが慢性および急性神経変性においてＲＧＣを保護することを示す研究によって裏付けられる（非特許文献２０、非特許文献２１）。
【0015】
いくつかの研究は、網膜において、ＴｒＫＡは主に網膜神経節細胞（ＲＧＣ）に発現する一方で、ミュラー細胞およびグリア細胞ではｐ７５ＮＲＴが発現すること（非特許文献４）、およびグリアにおけるｐ７５ＮＲＴの活性化は、ＲＧＣに対するＴｒＫＡ活性化の保護効果を相殺する神経毒性経路を誘発することができることを実証している。
【0016】
得られたデータの不整合のさらなる理由はまた、タンパク質投与の異なる経路またはレジメンの使用に起因し得る。実際、タンパク質が投与される濃度は、ＮＧＦに対する応答に影響を及ぼすようであり、より高い濃度は、ｐ７５ＮＴＲのより高い活性化をもたらす。したがって、高濃度のＮＧＦを必要とする投与経路またはレジメンは、低濃度よりもＮＧＦの生存活性を誘導するのに効果が低い場合がある。
【0017】
眼の他の状態におけるＮＧＦの他の潜在的な治療用途は、このニューロトロフィンの生存促進性効果および栄養効果に基づいており、したがって、その有効性は、ＴｒＫＡとｐ７５ＮＴＲ活性化との間のバランスに大きく依存する。
【0018】
特に、証拠は、ＮＧＦの抗アプトトーシス（ａｎｔｉａｐｔｏｔｏｔｉｃ）効果および栄養効果が以下に有用であり得ることを示す：
－角膜移植における角膜移植片拒絶反応の予防（非特許文献２２）
－角膜縁上皮前駆細胞の保存および増殖（非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５）、
－光毒性角膜症（ｐｈｏｔｏｔｏｘｉｃ ｋｅｒａｔｏｐａｔｈｙ）（非特許文献２６)、角膜ジストロフィーおよび角膜変性（ｃｏｒｎｅａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ）並びに角膜潰瘍（非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０、非特許文献３１、非特許文献３２、非特許文献９）、乾性角結膜炎（非特許文献１５）、網膜剥離を含む網膜疾患（非特許文献３３）、糖尿病性網膜症（非特許文献３４）、網膜神経変性および／または虚血（非特許文献３５）、光毒性網膜症（非特許文献２６、非特許文献３６）、網膜上膜（非特許文献３７）、黄斑円孔（非特許文献３８）、黄斑変性（非特許文献３９）および視神経症（非特許文献４０、非特許文献４１）を含む、角膜および結膜疾患の治療。
－角膜移植における角膜移植片拒絶反応の予防（非特許文献２２）
－角膜縁上皮前駆細胞の保存および増殖（非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５）、
－光毒性角膜症（ｐｈｏｔｏｔｏｘｉｃ ｋｅｒａｔｏｐａｔｈｙ）（非特許文献２６)、角膜ジストロフィーおよび角膜変性（ｃｏｒｎｅａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ）並びに角膜潰瘍（非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０、非特許文献３１、非特許文献３２、非特許文献９）、乾性角結膜炎（非特許文献１５）、網膜剥離を含む網膜疾患（非特許文献３３）、糖尿病性網膜症（非特許文献３４）、網膜神経変性および／または虚血（非特許文献３５）、光毒性網膜症（非特許文献２６、非特許文献３６）、網膜上膜（非特許文献３７）、黄斑円孔（非特許文献３８）、黄斑変性（非特許文献３９）および視神経症（非特許文献４０、非特許文献４１）を含む、角膜および結膜疾患の治療。
【0019】
しかし、ＮＧＦによるｐ７５ＮＴＲ受容体の活性化は、上記の病態におけるＮＧＦのインビボ効果を予測することを困難にする。
【0020】
チャイニーズハムスター卵巣細胞においてタンパク質が１２０アミノ酸配列として発現されるとき、トリプシンおよび／またはカルボキシペプチダーゼによる部分的な酵素消化により、１１７および１１８アミノ酸の多数の異なるｒｈＮＧＦ変異が同定されている。これらの変異型は分析され、ニワトリ後根神経節細胞生存アッセイおよびラット褐色細胞腫軸索伸長アッセイの両方において等能である（ｅｑｕｉｐｏｔｅｎｔ）ことが見出されている（非特許文献４２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0021】
【非特許文献1】Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １９９４，２５（１１）：１４０４－１７
【非特許文献2】Ｃｌｅｗｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００８，１０７：１１２４－１１３５
【非特許文献3】Ｎｇｕｙｅｎ Ｔ ＬＸ，Ｅｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１０，４２（８）：５８３－５９５
【非特許文献4】Ｈａｒａｄａ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００６，２９０：５７－６５
【非特許文献5】Ａｌｏｙｚ Ｒ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９８，（１４３）６：１６９１－１７０３
【非特許文献6】Ｆｒａｄｅ ａｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９６；３８３：１６６－１６８
【非特許文献7】Ｙｏｏｎ Ｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９９８；１８：３２７３－３２８１
【非特許文献8】Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ＆Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１７，３４：４３－５７
【非特許文献9】Ｓｏｒｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ ２０１０；１６：１４３９－１４４７
【非特許文献10】Ｄｉ Ｇｉｒｏｌａｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ ２００８，１２（６Ｂ）：２７９９－２８１１
【非特許文献11】Ｃａｒｍｉｇｎｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９８９，９（４）：１２６３－１２７２．
【非特許文献12】Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９０；５２３：１１－１５
【非特許文献13】Ｓｉｌｉｐｒａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ １９９３，３４（１２）：３２３２－３２４５
【非特許文献14】Ｈａａｍｅｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００１，４３１：３９７－４０４
【非特許文献15】Ｃｏａｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒａｅｆｅｓ Ａｒｃｈ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００８，２４６：１７４３－１７４９
【非特許文献16】Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００７，６７（７）：８８４－９４
【非特許文献17】Ｌｅｂｒｕｎ－Ｊｕｌｉｅｎ Ｆ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００９，４０（４）：４１０－４２０
【非特許文献18】Wａｎｇ Ｈ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２０１４，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ７５９４７３
【非特許文献19】Ｍｏｈａｍｅｄ Ｒ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１５；６（５）；ｄｏｉ：１０．４１７２／２１５５－９５７０．１０００４８３
【非特許文献20】Ｂａｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１０，２８５（５０）：３９３９２－３９４００
【非特許文献21】ＺｈｉＨｕａ Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００７），６７（７）：８８４－８９４
【非特許文献22】Ｇｏｎｇ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ，２００７，４８（３）：１０４３－１０５２
【非特許文献23】Ｌａｍｂｉａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ２０１２，５３（１３）：８２８０－８２８７
【非特許文献24】Ｍａｓｏｎ ＳＬ， ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１６；５７：３７０８－３７１３
【非特許文献25】Ｔｏｕｈａｍｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００２，４３：９８７－９９４
【非特許文献26】Ｒｏｃｃｏ ＭＬ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒａｅｆｅｓ Ａｒｃｈｉｖｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ２０１８，２５６：７２９－７３８
【非特許文献27】Ｌａｍｂｉａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ １９９８，３９：１２７２－１２７５
【非特許文献28】Ｌａｍｂｉａｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９８，３３８：１１７４－１１８０
【非特許文献29】Ｂｏｎｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ２０００，１０７：１３４７－１３５１
【非特許文献30】Ｌａｍｂｉａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ２０００，４１：１０６３－１０６９
【非特許文献31】Ｂｌａｎｃｏ－Ｍｅｚｑｕｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１３，５４（６）：３８８０－９０
【非特許文献32】Ｙｏｕ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０００；４１（３）：６９２－７０２
【非特許文献33】Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ ２００８，２２２：５８－６１
【非特許文献34】Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００８，５７：８８９－８９８
【非特許文献35】Ｘｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ２０１４，１２５：１５６－６３
【非特許文献36】Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ２０１４，１３１（３）：３０３－１３
【非特許文献37】Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ ２００８，２８（４）：６２８－３７
【非特許文献38】Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１９，１９（１）：１３０
【非特許文献39】Ｌａｍｂｉａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｉｓｔ Ｓｕｐｅｒ Ｓａｎｉｔａ ２００９，４５（４）：４３９－４４２
【非特許文献40】Ｍｅｓｅｎｔｉｅｒ－Ｌｏｕｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２０１９，５６（２）：１０５６－１０６９
【非特許文献41】Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０２０，１０：３３７５
【非特許文献42】Ｓｈｍｅｌｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ １９９２，５９（５）：１６７５－８３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0022】
出願人は、眼におけるＮＧＦ活性に関する文献における多少議論の的になっているデータを明らかにすることを目的とした研究を実施している。
【0023】
これらの研究は、市販のＮＧＦが、単独または混合物のいずれかで、長さが異なるだけのアミノ酸配列によって特徴付けられる、異なるＮＧＦのアイソフォームを含むことを示している。
【0024】
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、これらのＮＧＦのアイソフォームが、ＴｒＫＡまたはｐ７５ＮＴＲ受容体によって誘導される経路を活性化する異なる能力を有し、異なる活性パターンをもたらすことを見出した。
【0025】
特に、本発明者らは、配列番号１の１１８アミノ酸配列を有するＮＧＦアイソフォームが、主に、ＴｒＫＡ仲介経路を活性化し、ｐ７５ＮＴＲによって仲介されるアポトーシス経路を阻害する一方で、配列番号２、３および４のそれぞれ１２０、１１７または１１９アミノ酸配列を有するアイソフォームが、ｐ７５ＮＴＲ依存性アポトーシス経路を活性化するより高い能力を有することを見出した。ＮＧＦアイソフォームの異なる受容体選択性に関連するこれらの知見は、ＮＧＦの治療用途に関する文献に見られる矛盾を理解するのに役立ち得る。
【0026】
上記を考慮すると、配列番号１のＮＧＦアイソフォームは、増殖および生存に対するＮＧＦの効果が所望され、ｐ７５ＮＴＲのアポトーシス促進効果が有害である病態の治療に特に有用である。
【課題を解決するための手段】
【0027】
したがって、本発明の第１の対象は、好ましくは糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、光毒性網膜症、網膜剥離、加齢黄斑変性、黄斑変性、黄斑萎縮（ｍａｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、黄斑円孔、黄斑浮腫および網膜上膜から選択される網膜症；角縁幹細胞欠乏（ｌｉｍｂａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）；好ましくは円すい角膜、光毒性角膜症、遷延性上皮欠損（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ）、角膜潰瘍、角膜ジストロフィーおよび角膜変性、並びに乾性角結膜炎から選択される角膜の病態；結膜の病態；好ましくは緑内障、虚血性、外傷性、変性性、遺伝性および先天性の視神経症から選択される視神経症、から選択される眼の病態の予防および／または治療に使用するための、並びに角膜移植における同種移植片拒絶反応の予防に使用するためのＮＧＦであり、前記ＮＧＦは、前記ＮＧＦに含まれる全てのＮＧＦアイソフォームの総重量に対して、５０重量％超の配列番号１のＮＧＦを含む。
【0028】
本発明の第２の対象は、好ましくは糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、光毒性網膜症、網膜剥離、加齢黄斑変性、黄斑変性、黄斑萎縮、黄斑円孔、黄斑浮腫および網膜上膜から選択される網膜症；角縁幹細胞欠乏；好ましくは円すい角膜、光毒性角膜症、遷延性上皮欠損、角膜潰瘍、角膜ジストロフィーおよび角膜変性、並びに乾性角結膜炎から選択される角膜の病態；結膜の病態；好ましくは緑内障、虚血性、変性性、外傷性、遺伝性および先天性の視神経症から選択される視神経症、から選択される眼の病態の治療に使用するための、並びに角膜移植における同種移植片拒絶反応の予防に使用するための、ＮＧＦを治療上有効な量で含む医薬組成物に関し、前記ＮＧＦは、前記ＮＧＦに含まれる全てのＮＧＦアイソフォームの総重量に対して、５０重量％超の配列番号１のＮＧＦアイソフォームと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。
【0029】
本発明の第３の対象は、好ましくは糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、光毒性網膜症、網膜剥離、加齢黄斑変性、黄斑変性、黄斑萎縮、黄斑円孔、黄斑浮腫および網膜上膜から選択される網膜症；角縁幹細胞欠乏；好ましくは円すい角膜、光毒性角膜症、遷延性上皮欠損、角膜潰瘍、角膜ジストロフィーおよび角膜変性、並びに乾性角結膜炎から選択される角膜の病態；結膜の病態；好ましくは緑内障、虚血性、変性性、外傷性、遺伝性および先天性の視神経症から選択される視神経症、から選択される眼の病態の治療、並びに角膜移植における同種移植片拒絶反応の予防の方法に関し、ＮＧＦを治療上有効な量で対象に投与することを含み、前記ＮＧＦは、前記ＮＧＦに含まれる全てのＮＧＦアイソフォームの総量に対して、５０重量％超の配列番号１のＮＧＦを含む。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】実施例２に記載のように測定した、ＰＣ１２、Ｉ－ＨＣＥＣ、並びにｈＴＥＲＴ－ＲＰＥ－１およびＡＲＰＥ－１９細胞の細胞膜上のＮＧＦ受容体ＴｒＫＡおよびｐ７５ＮＴＲの発現を示す。データは、フローサイトメトリーによって測定した、関連する受容体を発現する陽性細胞の割合として表される。
【図2】実施例２に記載のように測定し、ベン図として表される、各ＮＧＦによる処理によって各細胞株において上方制御および下方制御されたタンパク質の総数を示す。詳細には、図２Ａ）は、ＲＰＥ細胞のベン図を示し、図２Ｂ）は、ＨＣＥＣ細胞のベン図を示し、図２Ｃ）は、ＰＣ１２細胞のベン図を示す。
【図3】実施例３ａに記載のように、未処理（ＮＴ）のＨＣＥＣ細胞、ＰＢＳ（ＰＢＳ）、製剤緩衝液（ＦＢ）、ｒｈＮＧＦ－１１８（ｒｈＮＧＦ－１１８）またはｒｈＮＧＦ－１（ｒｈＮＧＦ－１）で処理されたＨＣＥＣ細胞における早期（３０分、図３Ａ）およびその後（２４時間、図３Ｂ）のカスパーゼ３／７活性を示す。結果は、７つの独立した実験の緑色領域（カスパーゼ活性）と位相領域（細胞コンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ））との間の比として表される。スチューデントのＴ検定を計算した。＊ｐ値＜０．０５、ｎｓ＝有意差なし。
【図4】実施例３ａに記載のように、未処理（ＮＴ）のＲＰＥ細胞、ＰＢＳ（ＰＢＳ １Ｘ）、製剤緩衝液（ＦＢ）、ｒｈＮＧＦ－１１８（ｒｈＮＧＦ－１１８）またはｒｈＮＧＦ－１（ｒｈＮＧＦ－１）で処理されたＲＰＥ細胞における早期（３０分、図４Ａ）およびその後（２４時間、図４Ｂ）のカスパーゼ３／７活性を示す。結果は、５つの独立した実験の緑色領域と位相領域との間の比の、未処理（ＮＴ）に対する変化の倍数として表される。スチューデントのＴ検定を計算した。＊ｐ値＜０．０５。
【図5】実施例３ｂ．ｉ）に記載のように、未処理（ＮＴ）のＲＰＥ細胞、または製剤緩衝液（ＦＢ＋ｔＢＨＰ）、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＮＧＦ１１８（ｒｈＮＧＦ－１１８＋ｔＢＨＰ）、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＮＧＦ－２（ｒｈＮＧＦ－２＋ｔＢＨＰ）または５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＮＧＦ－３（ｒｈＮＧＦ－３＋ｔＢＨＰ）の存在下で１０μＭのｔＢＨＰで２４時間処理したＲＰＥ細胞におけるカスパーゼ３／７の活性を示す。データは、３つの独立した実験の緑色領域コンフルエンス（カスパーゼ活性化）の割合として提示される。スチューデントのＴ検定を計算した。＊ｐ値＜０．０５、＊＊ｐ値＜０．００５、＊＊＊ｐ値＜０．０００５。さらに、一元配置ＡＮＯＶＡ、ボンフェローニ検定は、ｔＢＨＰ対ＮＴ、ｒｈＮＧＦ－１１８対ｔＢＨＰ、およびｒｈＮＧＦ－２対ｒｈＮＧＦ－１１８の統計的有意性を示した（図示せず）。
【図6】実施例３ｂ．ｉｉ）に記載のように、未処理（ＮＴ）のＲＰＥ細胞、またはＰＢＳ（ＰＢＳ １Ｘ）、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＮＧＦ－１１８（ｒｈＮＧＦ－１１８）、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＮＧＦ－１（ｒｈＮＧＦ－１）、１００μＭの単独（Ｈ２Ｏ２）で処理した、または５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＮＧＦ－１１８（ｒｈＮＧＦ－１８＋Ｈ２Ｏ２）もしくは５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＮＧＦ－１（ｒｈＮＧＦ－１＋Ｈ２Ｏ２）の存在下の、ＲＰＥ細胞における、早期（３０分、図６Ａ）およびその後（２４時間、図６Ｂ）のカスパーゼ３／７の活性を示す。データは、４つの独立した実験の全緑色蛍光（カスパーゼ活性化）の未処理細胞（ＮＴ）に対する増加の倍率として提示される。スチューデントのＴ検定を計算した。＊ｐ値＜０．０５、＊＊ｐ値＜０．００５、＊＊＊ｐ値＜０．０００５。さらに、３０分後、一元配置ＡＮＯＶＡ、ボンフェローニ検定は、ｒｈＮＧＦ－１の存在下のＨ２Ｏ２対ＮＴ、対Ｈ２Ｏ２単独、および対ｒｈＮＧＦ－１１８の存在下のＨ２Ｏ２の統計的有意性を示した。一方、２４時間後、ｒｈＮＧＦ－１の存在下のＨ２Ｏ２対ＮＴの統計的有意性が観察された（図示せず）。
【図7】実施例４に記載のように測定した、２つの異なる濃度のｒｈＮＧＦ－１１８またはｒｈＮＧＦ－１によって誘導される神経突起の成長を示す。
【図8】ｒｈＮＧＦ－１１８の拡大した逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図9】ｒｈＮＧＦ－１の拡大した逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図10】ｒｈＮＧＦ－２の拡大した逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図11】ｒｈＮＧＦ－３の拡大した逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図12】ｒｈＮＧＦ－４の拡大した逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図13】実施例４に記載のように測定した、２つの異なる濃度のｒｈＮＧＦ－１１８またはｒｈＮＧＦ－１２０（ｒｈＮＧＦ－４）によって誘導される神経突起の成長を示す。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本発明の第１の対象は、網膜症、角膜の病態、視神経症、結膜の病態、角縁幹細胞欠乏から選択される病態の治療および／または予防、並びに角膜移植における同種移植片拒絶反応の予防に使用するためのＮＧＦであり、前記ＮＧＦは、前記ＮＧＦに含まれる全てのＮＧＦアイソフォームの総重量に対して、５０重量％超の配列番号１のＮＧＦアイソフォームを含む。
【0032】
本発明による「ＮＧＦ」という用語は、機能的に活性なＮＧＦアイソフォームまたは機能的に活性なＮＧＦアイソフォームの混合物を指す。好ましくは、前記ＮＧＦアイソフォームは、ヒトＮＧＦのアイソフォームである。
【0033】
本文脈において、「ＮＧＦアイソフォーム」とは、異なるアミノ酸配列を有する２つ以上の機能的に活性なＮＧＦタンパク質のうちのいずれかを意味し、そのような配列は、それらの長さにおいてのみ異なる。好ましくは、前記ＮＧＦアイソフォームは、配列番号２のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、または配列番号２とは長さが異なる配列、すなわち、追加のアミノ酸の存在、またはＮ末端もしくはＣ末端、好ましくはＣ末端におけるアミノ酸の欠失を有する。好ましくは、前記ＮＧＦアイソフォームは、配列番号１、２、３、４のアミノ酸配列を有するＮＧＦタンパク質である。
【0034】
特定のＮＧＦアイソフォームを指す場合、酸化、糖化、またはグリコシル化などの翻訳後修飾の存在とは独立して、そのようなアイソフォームのアミノ酸配列を有するすべての形態のＮＧＦが含まれる。
【0035】
好ましい実施形態において、前記ＮＧＦに含まれる前記ＮＧＦアイソフォームは、配列番号１、２、３または４のＮＧＦアイソフォームまたはそれらの混合物から選択される。
【0036】
好ましくは、前記網膜症は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、光毒性網膜症、網膜剥離、加齢黄斑変性、黄斑変性、黄斑萎縮、黄斑円孔、黄斑浮腫、および網膜上膜から選択される。
【0037】
好ましくは、前記角膜の病態は、円すい角膜、光毒性角膜症、遷延性上皮欠損、角膜潰瘍、角膜ジストロフィーおよび変性、並びに乾性角結膜炎から選択される。
【0038】
好ましくは、前記視神経症は、緑内障並びに虚血性、変性性、外傷性、遺伝性および先天性視神経症から選択される。
【0039】
特に好ましい実施形態によれば、上記の病態は、緑内障、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、光毒性網膜症、網膜剥離、加齢黄斑変性、黄斑変性、黄斑萎縮、黄斑円孔、黄斑浮腫および網膜上膜から選択され、より好ましくは、上記の病態は、緑内障である。
【0040】
本発明による使用のためのＮＧＦは、好ましくは、配列番号１の高純度ＮＧＦアイソフォームからなる。
【0041】
好ましくは、本発明による使用のためのＮＧＦは、前記ＮＧＦに含まれる全てのＮＧＦアイソフォームの総重量に対して、少なくとも６０重量％、より好ましくは少なくとも７０重量％、さらにより好ましくは少なくとも８０重量％、さらに好ましくは少なくとも９０重量％、さらにより好ましくは少なくとも９５重量％、さらにより好ましくは少なくとも９８重量％、さらにより好ましくは少なくとも９９重量％、さらにより好ましくは１００重量％の配列番号１のＮＧＦアイソフォームを含む。
【0042】
好ましくは、本発明による使用のためのＮＧＦは、前記ＮＧＦに含まれる全てのＮＧＦアイソフォームの総重量に対して、少なくとも６０重量％、より好ましくは少なくとも７０重量％、さらにより好ましくは少なくとも８０重量％、さらにより好ましくは少なくとも９０重量％、さらにより好ましくは少なくとも９５重量％、さらにより好ましくは少なくとも９８重量％、さらにより好ましくは少なくとも９９重量％、さらにより好ましくは１００重量％の配列番号１のＮＧＦアイソフォームを含み、前記ＮＧＦに含まれる前記ＮＧＦアイソフォームは、配列番号１、２、３もしくは４のＮＧＦアイソフォームもしくはそれらの混合物を含むか、またはそれらから選択される。
【0043】
好ましくは、本発明による使用のためのＮＧＦは、前記ＮＧＦに含まれる全てのＮＧＦアイソフォームの総重量に対して、配列番号２、３もしくは４のＮＧＦアイソフォームまたはそれらの混合物を、２０重量％未満、より好ましくは１０重量％未満、さらにより好ましくは５重量％未満、さらにより好ましくは２重量％未満、さらにより好ましくは１重量％未満の総重量で含む。
【0044】
好ましくは、前記配列番号１のＮＧＦアイソフォームは、ＮＧＦの他のアイソフォームとの組み合わせで使用されない。
【0045】
好ましくは、前記配列番号１のＮＧＦアイソフォームは、配列番号２、３または４を有するＮＧＦのアイソフォームとの組み合わせで使用されない。
【0046】
好ましくは、本発明による使用のためのＮＧＦは、ＮＧＦの１つのアイソフォームのみを含み、前記アイソフォームは、配列番号１の配列を有する。
【0047】
好ましくは、前記配列番号１のＮＧＦアイソフォームは、翻訳後修飾の合計において、１５重量％を超えず、好ましくは１０重量％を超えず、または５重量％を超えない。
【0048】
より好ましくは、前記配列番号１のＮＧＦアイソフォームは、いかなる翻訳後修飾も含まず、すなわち、非修飾アミノ酸のみからなる。
【0049】
本発明による使用のためのＮＧＦは、ＮＧＦの総重量に対して、好ましくは２０重量％未満、より好ましくは１０重量％未満、さらにより好ましくは５重量％未満の総量で、他の不純物を含み得る。
【0050】
用語「他の不純物」は、ＮＧＦアイソフォームおよびそれらの翻訳後修飾とは異なる化合物を指す。
【0051】
好ましくは、上記の配列番号１のＮＧＦアイソフォームは、組換えヒトＮＧＦである。これは、例えば、ｐｒｏＮＧＦ変異体ＳＰ１７４－１０１（国際公開第２０１３／０９２７７６号の配列番号５）の配列を組み込んだ発現ベクターを使用して、国際公開第２０００／０２２１１９号および国際公開第２０１３／０９２７７６号に記載のプロセスに従って、Ｅ．Ｃｏｌｉで製造されてもよい。
【0052】
好ましくは、本発明の第１の態様による使用のための上記ＮＧＦは、眼科用途用医薬組成物の形態で投与される。
【0053】
したがって、本発明のさらなる対象は、治療上有効な量の上記のような使用のためのＮＧＦと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物である。
【0054】
上記の病態の治療または予防における本ＮＧＦの投与の正しい用量およびレジメンは、例えば、投与経路および治療を受ける個人の疾患の重症度など、多くの要因に依存する。
【0055】
好ましくは、前記医薬組成物は、眼科用途用医薬組成物である。
【0056】
好ましくは、前記医薬組成物は、上記ＮＧＦおよび１つ以上の眼科的に許容可能な賦形剤を含む。
【0057】
「眼科的に許容可能な賦形剤」は、眼に有害な影響を及ぼすことなく眼の疾患または状態を治療するために、薬剤を眼および／またはまぶたに送達することを可能にする不活性賦形剤である。
【0058】
好ましくは、前記眼科用組成物は、液体眼科用組成物、好ましくは水性液体眼科用組成物、好ましくは水性点眼剤組成物である。この組成物は、前眼部への局所投与に特に適する。
【0059】
前記液体組成物は、溶液、エマルション、または懸濁液の形態であってもよい。前記液体組成物は、ミセルを含んでもよい。
【0060】
好ましくは、前記液体組成物は、眼科的に許容可能な粘度増強剤、浸透促進剤、緩衝剤、浸透圧調節剤、防腐剤および界面活性剤から選択される眼科的に許容可能な賦形剤を含む。
【0061】
粘度増強剤は、組成物の粘度を増加させ、結膜嚢におけるその保持を改善する機能を有し、好ましくは、セルロース誘導体、好ましくはヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース；ポリビニルピロリドン、並びにゲル化剤、好ましくはジェランガム、キサンタンガム、およびカーボポール－９７４から選択される。
【0062】
浸透促進剤は、眼膜を越える薬物透過性を増強する機能を有し、好ましくは、シクロデキストリン、キレート剤、クラウンエーテル、胆汁酸および胆汁塩から選択される。
【0063】
緩衝剤は、眼での使用に適合するように、好ましくは６～８のｐＨで、製剤の正しいｐＨを提供し、維持する機能を有する。好ましい緩衝液は、リン酸緩衝液であるが、ｐＨを所望の範囲内に維持することができる他の緩衝液、特に眼科用途に適した緩衝液も含まれる。
【0064】
浸透圧調節剤は、眼液で液体組成物を等張にすることができる塩である。好ましい塩は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）であるが、例えば、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）並びにそれらの混合物など、他の生物学的に許容可能な塩を使用してもよい。
【0065】
防腐剤は微生物活動を阻害する。好適な防腐剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、および塩化セチルピリジニウムなどの第四級アンモニウム化合物が挙げられる。
【0066】
界面活性剤は、組成物を安定させ、容器の様々な表面へのＮＧＦ吸着を低減または防止する機能を有し、好ましくは、Ｔｗｅｅｅｎｙ ８０などのポリソルベート、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ６８などのポロキサマー、または血清アルブミンなどのタンパク質から選択される。
【0067】
前記液体、点眼剤組成物は、組成物を含むキット、組成物を保持するための容器、および点眼剤ディスペンサーの一部であり得る。
【0068】
ＮＧＦ水性組成物は、正しい流体張力を提供し、ＮＧＦを溶液中に維持するのに十分な量の生物学的に許容可能な塩を含んでもよい。
【0069】
医薬水性組成物に一般的に使用され、技術者に知られている他の添加剤、例えば糖、糖アルコール、アミノ酸、セルロース誘導体、ポリエチレングリコールなどが、ＮＧＦ水性組成物中に存在してもよい。
【0070】
ＮＧＦ水性組成物は、組成物成分の適切な濃度を達成するのに十分な量の水を含む。
【0071】
液体組成物は、ＮＧＦを治療上有効な濃度で含む。
【0072】
好ましくは、液体組成物中に、上記ＮＧＦは、水性組成物の約０．０００１％～約０．５％ｗ／ｖ、より好ましくは約０．００１％～約０．１％ｗ／ｖ、最も好ましくは約０．００２％ｗ／ｖの範囲の濃度で存在する。
【0073】
一実施形態によれば、本組成物は、好ましくは硝子体内注射または外科的移植によって、眼の後眼部への投与に適した組成物である。本発明による使用のためのＮＧＦは、上記のように、ｐ７５ＮＴＲのより高い活性化に関連するより高い濃度のＮＧＦの使用を必要とするため、このタイプの投与にとって特に有利である。したがって、これらの濃度では、配列番号１のＮＧＦアイソフォームとは異なるアイソフォームの存在は、ｐ７５ＮＴＲ活性化の顕著な増加、および結果として、より関連のある副作用の顕著な増加をもたらし得る。
【0074】
したがって、本出願では、ＮＧＦは、好ましくは、配列番号２、３もしくは４のＮＧＦアイソフォームまたはそれらの混合物を、前記ＮＧＦに含まれるすべてのＮＧＦアイソフォームの総重量に対して、５重量％未満、より好ましくは２重量％未満、さらにより好ましくは１重量％未満の総重量で含む。
【0075】
好ましくは、この実施形態によれば、本発明による使用のための組成物は、硝子体内注射または移植によって、眼の網膜、強膜、後眼房、硝子体腔、網膜下腔、脈絡膜上部（ｓｕｐｒａｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｓｅｇｍｅｎｔ）に投与される。
【0076】
好ましくは、この実施形態によれば、ＮＧＦは、組成物中に、約０．０１％～約０．１％ｗ／ｖ、より好ましくは約０．０２％ｗ／ｖ～約０．０５％ｗ／ｖ、最も好ましくは約０．０３％～約０．０４％ｗ／ｖの範囲の濃度で存在する。
【0077】
特に好ましい実施形態によれば、前記眼科用組成物は、眼への硝子体内投与のための制御放出組成物である。
【0078】
この実施形態によれば、本組成物は、ポリマー微粒子の形態でもよく、前記ポリマーは、好ましくは、生分解性または水溶性ポリマーであり、上記ＮＧＦを眼に徐々に放出する特性を有する。
【0079】
本発明は、以下の実施例でさらに説明されるが、これらは、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【0080】
実施例１－さまざまなｒｈＮＧＦの評価
ａ）材料
国際公開第２０００／０２２１１９号および国際公開第２０１３／０９２７７６号に記載のプロセスに従い、ＰｒｏＮＧＦ変異体ＳＰ１７４－１０１（国際公開第２０１３／０９２７７６号の配列番号５）の配列を組み込んだ発現ベクターを使用して、１１８個のアミノ酸のアミノ酸配列を有する組換えヒトＮＧＦ（ｒｈＮＧＦ）（配列番号１、以下、ｒｈＮＧＦ－１１８）を大腸菌で製造した。
ａ）材料
国際公開第２０００／０２２１１９号および国際公開第２０１３／０９２７７６号に記載のプロセスに従い、ＰｒｏＮＧＦ変異体ＳＰ１７４－１０１（国際公開第２０１３／０９２７７６号の配列番号５）の配列を組み込んだ発現ベクターを使用して、１１８個のアミノ酸のアミノ酸配列を有する組換えヒトＮＧＦ（ｒｈＮＧＦ）（配列番号１、以下、ｒｈＮＧＦ－１１８）を大腸菌で製造した。
【0081】
４つの異なる市販のｒｈＮＧＦを購入した：
－ｒｈＮＧＦ－１：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃから購入した組換えヒトＮＧＦ（製品コード：２５６－ＧＦ／ＣＦ）、マウス骨髄腫細胞株で製造される。
－ｒｈＮＧＦ２：Ａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した組換えヒトＮＧＦ（製品コード １７４５．９５５）、ＣＨＯ細胞で製造される。
－ｒｈＮＧＦ３：Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した組換えヒトＮＧＦ（製品コード：１１０５０－ＨＮＡＣ）、ＣＨＯ細胞で製造される。
－ｒｈＮＧＦ４：Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入した組換えヒトＮＧＦ（製品コード：４５０－０１）、大腸菌で製造される。
－ｒｈＮＧＦ－１：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃから購入した組換えヒトＮＧＦ（製品コード：２５６－ＧＦ／ＣＦ）、マウス骨髄腫細胞株で製造される。
－ｒｈＮＧＦ２：Ａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した組換えヒトＮＧＦ（製品コード １７４５．９５５）、ＣＨＯ細胞で製造される。
－ｒｈＮＧＦ３：Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した組換えヒトＮＧＦ（製品コード：１１０５０－ＨＮＡＣ）、ＣＨＯ細胞で製造される。
－ｒｈＮＧＦ４：Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入した組換えヒトＮＧＦ（製品コード：４５０－０１）、大腸菌で製造される。
【0082】
ｂ）さまざまなｒｈＮＧＦのＨＰＬＣ分析
異なる起源からの上記ｒｈＮＧＦの試料を、逆相ＨＰＬＣ－ＵＶ、分子量を決定するための逆相ＵＨＰＬＣ－ＭＳ、およびペプチドマッピングのための逆相ＨＰＬＣ－ＭＳによって分析した。ＨＰＬＣ分析の結果を図８～１１に示し、以下の表１～５に報告する。
異なる起源からの上記ｒｈＮＧＦの試料を、逆相ＨＰＬＣ－ＵＶ、分子量を決定するための逆相ＵＨＰＬＣ－ＭＳ、およびペプチドマッピングのための逆相ＨＰＬＣ－ＭＳによって分析した。ＨＰＬＣ分析の結果を図８～１１に示し、以下の表１～５に報告する。
【0083】
逆相ＨＰＬＣ－ＵＶ分析
体積ポンプ勾配システム、冷却サンプル注入デバイス、およびＵＶ検出器を備えるＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムをこの分析に使用した。分析分離は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラム、モデルＪｕｐｉｔｅｒ Ｃ４、３００Ａ、２５０×４．６ｍｍ（５μｍ粒径）を使用して行った。
体積ポンプ勾配システム、冷却サンプル注入デバイス、およびＵＶ検出器を備えるＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムをこの分析に使用した。分析分離は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラム、モデルＪｕｐｉｔｅｒ Ｃ４、３００Ａ、２５０×４．６ｍｍ（５μｍ粒径）を使用して行った。
【0084】
勾配溶出を、どちらも０．０５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する、水およびアセトニトリルからなる移動相で行った。流速は１ｍＬ／分であり、カラム温度は３７℃に維持し、波長は２２０ｎｍに設定した。
【0085】
この手順を、ｒｈＮＧＦ－１１８および上記の市販のｒｈＮＧＦに並行して適用した。
【0086】
詳細には、供給業者によって提供される指示に従って、試験されるｒｈＮＧＦ試料を室温で解凍し、処理した。
【0087】
ＨＰＬＣシステムに注入する前に、すべての試料を製剤緩衝液（リン酸緩衝液５０ｍＭ、ＮａＣｌ １００ｍＭ、ｐＨ７．２）で、０．３～０．１ｍｇ／ｍＬの範囲の最終濃度まで希釈した。
【0088】
ＵＨＰＬＣ－ＭＳ分析
加熱エレクトロスプレーイオン化源（ＨＥＳＩ）を備えたＯｒｂｉｔｒａｐ ＱＥｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と結合したＵＨＰＬＣシステムをこの分析に使用した。
加熱エレクトロスプレーイオン化源（ＨＥＳＩ）を備えたＯｒｂｉｔｒａｐ ＱＥｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と結合したＵＨＰＬＣシステムをこの分析に使用した。
【0089】
分析分離は、Ｗａｔｅｒｓカラム、モデルＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣタンパク質ＢＥＨ Ｃ４ ３００Ａ、１００×２．１ｍｍ（１．７μｍ粒径）を使用して行った。勾配溶出を、どちらも０．０５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する、水およびアセトニトリルからなる移動相で行った。流速は０．３ｍＬ／分であり、カラム温度は３３℃に維持した。無傷なタンパク質の特性評価は、Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して質量分析データに行った。
【0090】
この手順を、ｒｈＮＧＦ－１１８および上記の市販のｒｈＮＧＦに並行して適用した。
【0091】
詳細には、供給業者によって提供される指示に従って、ｒｈＮＧＦ試料を室温で解凍し、処理した。ＵＨＰＬＣシステムに注入する前に、すべての試料を製剤緩衝液で０．３～０．１ｍｇ／ｍＬの範囲の最終濃度に希釈した。
【0092】
異なる起源のｒｈＮＧＦのペプチドマッピングのための逆相ＨＰＬＣ－ＭＳ
加熱エレクトロスプレーイオン化源（ＨＥＳＩ）を備えたＯｒｂｉｔｒａｐ ＱＥｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と結合したＵＨＰＬＣシステムをこの分析に使用した。
加熱エレクトロスプレーイオン化源（ＨＥＳＩ）を備えたＯｒｂｉｔｒａｐ ＱＥｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と結合したＵＨＰＬＣシステムをこの分析に使用した。
【0093】
分析分離は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラム、モデルＪｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ ３００Ａ、２５０×２．１ｍｍ（５μｍ粒径）を使用して行った。勾配溶出を、どちらも０．１％のトリフルオロ酢酸を含有する、水およびアセトニトリルからなる移動相で行った。流速は０．２ｍＬ／分であり、カラム温度は５３℃に維持した。
【0094】
この手順を、ｒｈＮＧＦ－１１８および上記の市販のｒｈＮＧＦに並行して適用した。
【0095】
詳細には、供給業者によって提供される指示に従って、ＮＧＦ試料を室温で解凍し、処理した。
【0096】
各ＮＧＦ試料の合計３００μｇをトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈殿させ、４℃で２０分間遠心分離した。試料を再懸濁し、グアニジン－ＨＣｌ ５．９２Ｍおよび炭酸水素アンモニウム１００ｍＭ（ｐＨ７．８）で変性させた。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）５０ｍＭを添加し、続いて５６℃で９０分間インキュベートすることによって、還元を達成した。ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）７５ｍＭを添加し、続いて暗闇の中で３０分間室温でインキュベートすることによってアルキル化を行った。過剰のＩＡＡのクエンチは、５０ｍＭのＤＤＴの溶液を試料に添加し、続いて３７℃で３０分間インキュベートすることによって行った。トリプシン（質量比１／１７．５ ｗ／ｗのトリプシン／タンパク質）を添加し、３７℃で一晩（約１８時間）インキュベートして、酵素消化を行った。インキュベート後、試料を遠心分離して分析した。ペプチド同定は、Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してＭＳ／ＭＳデータに行った。
【0097】
逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを図８～１２に示し、対応するＨＰＬＣ表の主なピークを表２～６に報告する。
【0098】
見て分かるように、ｒｈＮＧＦ－１１８の拡大クロマトグラム（図８）および表２は、２１．８６０分の保持時間（ＲＴ）における主ピークおよび他の副ピークを示す。
【0099】
ＲｈＮＧＦ－１１８の質量分析から、すべてのピークが１１８個のアミノ酸の同じ配列を有することが確認され、主ピークは翻訳後修飾のないｒｈＮＧＦ－１１８に対応し、副ピークは翻訳後修飾を有するｒｈＮＧＦ－１１８に対応する。主ピークの分子量（ＭＷ）は１３２５２．５Ｄａである（表１）。
【0100】
図９に、ｒｈＮＧＦ－１のクロマトグラムを報告する。２１．６３５、２１．８１５および２２．０３４分にＲＴを有する３つの主ピークを検出した（表３を参照）。質量分析から、ｒｈＮＧＦ－１の３つの主ピークは、１１７、１１８、１１９、および１２０個のアミノ酸で構成される異なる長さの配列を示した（詳細は表１および表３を参照）。
【0101】
ｒｈＮＧＦ－２およびｒｈＮＧＦ－３（図１０～１１、表４および５）に関して、それらは、それぞれ２２．０９１および２２．０５０分のＲＴにおいて、主ピークを特徴とし、どちらも（質量分析によって確認される）１１７個のアミノ酸の配列に対応する。
【0102】
それらの関連する翻訳後修飾形態を含む各アイソフォームに対応する保持時間および組成パーセンテージを、以下の表１（第２および第３の列）に要約する。
【0103】
これらの結果を合わせると、市販製品のｒｈＮＧＦ－１、ｒｈＮＧＦ－２、およびｒｈＮＧＦ－３は、均質な組成を有さないこと、および／またはｒｈＮＧＦのより短いアイソフォームを含有することが実証される。
【0104】
【表1】
【0105】
【表2】
【0106】
【表3】
【0107】
【表4】
【0108】
【表5】
【0109】
【表6】
【0110】
表１および表２～６に見られるように、ｒｈＮＧＦ－１１８は、配列番号１のＮＧＦの分子量に対応する分子量を有するが、分析された市販製品は、異なる分子量のアイソフォームまたはそれらの混合物を含む。
【0111】
ＲｈＮＧＦ－１１８は、配列番号１の１１８アミノ酸配列を有するＮＧＦアイソフォーム１００％からなり、場合によっては、翻訳後修飾を少量の割合で有するが、市販製品は、配列番号１の１１８アミノ酸の長さとは異なるアミノ酸長を有するＮＧＦアイソフォームの存在を特徴とする。
【0112】
特に、ｒｈＮＧＦ－１は、１１７個（配列番号３）、１１８個（配列番号１）、１１９個（配列番号４）および１２０個（配列番号２）のアミノ酸を有し、大きな割合の１１９個および１２０個のアミノ酸のアイソフォームを有する、ＮＧＦの異なるアイソフォームの混合物を含む。
【0113】
ｒｈＮＧＦ－２およびｒｈＮＧＦ－３は、１１７個のアミノ酸（配列番号３）の配列を有するＮＧＦのアイソフォームからなる。
【0114】
ｒｈＮＧＦ－４は、１２０個のアミノ酸（配列番号２）の配列を有するＮＧＦのアイソフォームからなる。
【0115】
また、１１７個（配列番号３）、１１８個（配列番号１）、１１９個（配列番号４）および１２０個（配列番号２）のアミノ酸を有する上記アイソフォームは、わずかな割合の翻訳後修飾タンパク質、例えば、酸化タンパク質または糖化タンパク質を含む。
【0116】
実施例２－プロテオミクス分析
ＮＧＦ応答性細胞内シグナル伝達経路を調節する能力を調べるために、ｒｈＮＧＦ－１１８およびｒｈＮＧＦ－１についてプロテオミクス解析を行った。
ＮＧＦ応答性細胞内シグナル伝達経路を調節する能力を調べるために、ｒｈＮＧＦ－１１８およびｒｈＮＧＦ－１についてプロテオミクス解析を行った。
【0117】
この目的のために、眼の異なる領域に由来する２つのヒト細胞株、ヒト網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ、ｈＴＥＲＴ－ＲＰＥ－１、ＡＴＣＣ ＣＬＲ－４００）、ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥＣ、Ｐ１０８７１－ＩＭ ＩｎｎｏＰｒｏｔ）、およびラット副腎髄質の褐色細胞腫に由来する一細胞株（ＰＣ－１２、Ｃｅｉｎｇｅ、ｃｏｄ．Ａｒｔ．ＣＦ０１７．０４）を使用した。
【0118】
ＮＧＦシグナル伝達は、２つの主要な受容体、ＴｒＫＡおよびｐ７５によって仲介され、したがって、分析を開始する前に、使用されるすべての細胞株におけるこれらの受容体の発現をＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）によって評価した。
【0119】
図１に見られるように、両方の受容体は、異なる量であっても、すべての細胞株で発現される。
【0120】
細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＮＧＦ－１１８またはｒｈＮＧＦ－１（主にｒｈＮＧＦ－１１９およびｒｈＮＧＦ－１２０によって構成される）で５、１０または２０分間処理し、次いで溶解させて一緒にプールした。
【0121】
各試料からの２５～５０μｇのプールされた溶解タンパク質を、ビオチンで共有結合標識した。次いで、ゲル濾過によって標識の完了時の遊離ビオチン分子を除去した。アレイ上の非特異的結合部位をブロックした後、インキュベーションチャンバーをマイクロアレイに取り付けて、２つの試料（通常、１つの対照および１つのマッチング処理された試料）を同じチップ上に並べてロードすることを可能にし、試料の混合を防止した。試料のインキュベーション後、非結合タンパク質を洗い流し、アレイを、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｒｅａｄｅｒレーザーアレイスキャナで捕捉した独自の蛍光色素の組み合わせで標識された抗ビオチン抗体でプローブした。
【0122】
シグナル定量化は、スポットセグメンテーションおよびバックグラウンド補正のための所定の設定を用いて、ＩｍａＧｅｎｅ９．０（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いて行った。シグナルの強度は、重複測定で得られた、細胞内に見出される標的タンパク質の発現レベルまたはリン酸化状態の指標であった。
【0123】
各ｒｈＮＧＦによる処理後の３つの細胞株間のタンパク質変化、次いで、各個々の細胞株における異なるｒｈＮＧＦ処理間のタンパク質変化を分析した。
【0124】
そのようにして得られたデータは、３つの細胞株における２つの主なＮＧＦ受容体（ＴｒＫＡおよびｐ７５）について同定された異なる発現レベルに従って、試験されたＮＧＦの両方が細胞依存的にタンパク質を調節することを示す（図２）。さらに、いくつかのタンパク質は、さまざまな試験されたｒｈＮＧＦによって同一に調節されるが、他のタンパク質は、各ｒｈＮＧＦに特異的な調節パターンを示す（図２）。
【0125】
調節されたタンパク質に基づいて、ＮＧＦによって調節される３つの主な細胞内経路、すなわちアポトーシス、生存／増殖、および分化を同定することができた。
【0126】
解析の結果は、以下の表７に示される所見に沿って、細胞増殖および生存に関連する経路を促進し、アポトーシスに関連する経路の活性化を阻害するｒｈＮＧＦ－１１８の能力を示すが、ｒｈＮＧＦ－１の能力は示さない：
【0127】
【表7】
【0128】
表７から、ｒｈＮＧＦ－１とは異なり、ｒｈＮＧＦ－１１８がｐ５３を下方制御し、ｐ５３発現を低下させ（ＲＰＥを参照）、ｐ５３の重要な負の調節因子であるＭＤＭ２発現を誘導する（ＨＣＥＣおよびＰＣ１２を参照）ことが明らかに示される。加えて、ｒｈＮＧＦ－１１８は、全体的に、ＢＡＤを非活性化する抗アポトーシス効果を示すＰｉｍ２およびＰｉｍ３タンパク質を上方制御することができた。一方、ｒｈＮＧＦ－１処理は、ｐ５３の直接的な上方調節（ＨＣＥＣおよびＰＣ１２を参照）およびＪｕｎの上方調節をもたらし、アポトーシス効果に寄与し得る。得られた結果は、２つの試験されたＮＧＦが同じ細胞内の異なる下流経路を活性化することを示唆している。全体として、ｒｈＮＧＦ－１１８による細胞の処理は、アポトーシスの減少および細胞増殖の促進に向かうタンパク質の調節をもたらす。それに対して、ｒｈＮＧＦ－１による細胞の処理は、潜在的に増加したアポトーシスに従うタンパク質の変化をもたらす。これらのデータは、以下の要約表８に示すように、ｒｈＮＧＦ－１１８がＴｒＫＡ仲介経路に対してより強い活性を発揮する一方で、ｒｈＮＧＦ－１がｐ７５ＮＴＲによって仲介される経路を活性化することを示唆する。
【0129】
【表8】
【0130】
表８から分かるように、ＲＰＥ、ＨＣＥＣおよびＰＣ１２細胞において、ｒｈＮＧＦ－１１８による処理は、アポトーシスを阻害し、増殖を促進するが、ｒｈＮＧＦ－１による処理は、アポトーシスを活性化し、増殖を変化または促進しない。２つのＮＧＦはまた、ＰＣ１２細胞分化に反対の効果を有する。
【0131】
ｐ５３依存性アポトーシスを阻害するｒｈＮＧＦ－１１８の傾向は、網膜および角膜の眼の病理学的状態に対するこの分子の極めて重要な保護的な役割を支援する。
【0132】
網膜、角膜および結膜細胞において、ｐ５３は、アポトーシスを促進し、いくつかの眼の病理学的状態と関連しているが、その発現および活性の低下は、網膜および角膜細胞を死から保護する。以前の研究では、Ａ２Ｅ（主要なＲＰＥリポフスシンフルオロフォアおよびＲＰＥ細胞への光損傷の媒介物）とのインキュベーションおよび高エネルギー可視（ＨＥＶ）光への曝露後のヒトＲＰＥ細胞株ＡＲＰＥ－１９において、ｐ５３の上方制御が見出された。代わりに、ＨＥＶ光に曝露する前のＴＰ５３に対するｓｉＲＮＡでのトランスフェクションは、細胞を保護し、アポトーシスを減少させ、明るい光媒介性損傷におけるｐ５３の重要な役割を実証した。さらに、高齢者の失明の主な原因である加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、しばしばＲＰＥ細胞におけるリポフスシンの蓄積およびＲＰＥ細胞死と関連している。したがって、インビトロでのリポフスシン関連細胞死におけるｐ５３の役割、およびｐ５３阻害剤Ｍｄｍ２の阻害がヒトＲＰＥ細胞をアポトーシスに感作させることが示されているという事実を考慮すると、ＡＭＤにおけるＲＰＥ細胞死はｐ５３経路を伴うと仮定するのが妥当である（Ｖｕｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ２０１２，．５３，１３６２－１３７１)。
【0133】
実施例３－アポトーシスに対する効果の分析
ａ）正常状態におけるアポトーシスへの影響
プロテオミクスデータによって示唆されるように、アポトーシスを阻害するｒｈＮＧＦアイソフォームの異なる能力を確認するために、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｓｓａｙを使用して、ＨＣＥＣおよびＲＰＥ細胞において、アポトーシスの一般的に使用されるマーカーであるカスパーゼ３／７を誘導するＮＧＦの能力を分析した。
ａ）正常状態におけるアポトーシスへの影響
プロテオミクスデータによって示唆されるように、アポトーシスを阻害するｒｈＮＧＦアイソフォームの異なる能力を確認するために、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｓｓａｙを使用して、ＨＣＥＣおよびＲＰＥ細胞において、アポトーシスの一般的に使用されるマーカーであるカスパーゼ３／７を誘導するＮＧＦの能力を分析した。
【0134】
Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）カスパーゼ－３／７試薬は、細胞の細胞膜を自由に通過する。アポトーシス細胞において、それらは活性化カスパーゼ－３／７によって切断されてＤＮＡ結合蛍光標識を放出し、したがって、これらの細胞を蛍光核として可視化することを可能にする。
【0135】
上記のＨＣＥＣおよびＲＰＥ細胞は、処理なし（ＮＴ）、またはＰＢＳ（ＰＢＳ）、製剤緩衝液（ＦＢ）、ｒｈＮＧＦ－１１８（５０ｎｇ／ｍｌ）またはｒｈＮＧＦ－１（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理し、３０分後および２４時間後に各試料においてカスパーゼ３／７の誘導を評価した。
【0136】
図３および４に見られるように、ｒｈＮＧＦ－１１８による細胞の処理は、カスパーゼ３／７の有意な誘導をもたらさなかったが、ｒｈＮＧＦ－１は、未処理の対照と比較して、このアポトーシスマーカーの上方調節を引き起こし、特に処理後２４時間で明らかであった。
【0137】
ｂ）酸化ストレス条件下でのアポトーシスへの影響
ｉ）ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド（ｔＢＨＰ）により誘導されるアポトーシス
ＲＰＥ細胞を、製剤緩衝液（ＦＢ）、ｒｈＮＧＦ－１１８（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＮＧＦ－２（５０ｎｇ／ｍｌ）またはｒｈＮＧＦ－３（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、細胞内でアポトーシスを誘導するために一般的に使用されるストレスであるｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド（ｔＢＨＰ）１０μＭと２４時間インキュベートし、カスパーゼ－３／７の活性を評価した。
ｉ）ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド（ｔＢＨＰ）により誘導されるアポトーシス
ＲＰＥ細胞を、製剤緩衝液（ＦＢ）、ｒｈＮＧＦ－１１８（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＮＧＦ－２（５０ｎｇ／ｍｌ）またはｒｈＮＧＦ－３（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、細胞内でアポトーシスを誘導するために一般的に使用されるストレスであるｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド（ｔＢＨＰ）１０μＭと２４時間インキュベートし、カスパーゼ－３／７の活性を評価した。
【0138】
ｔＢＨＰ曝露２４時間後、ｒｈＮＧＦ－１１８で処理した細胞は、ＦＢで処理した対照と比較して、アポトーシスの有意な減少を示した。反対に、ｒｈＮＧＦ－２およびｒｈＮＧＦ－３の両方での処理は、ｒｈＮＧＦ－１１８と比較して、代わりに有意な増加をもたらしたｔＢＨＰ誘導アポトーシスを減少させなかった（図５）。
【0139】
ｉｉ）Ｈ
２
Ｏ
２
により誘導されるアポトーシス
ｒｈＮＧＦ－１１８の抗アポトーシス活性をさらに評価するために、細胞内でアポトーシスを誘導するために一般的に使用されるストレス誘導剤である１００μＭのＨ２Ｏ２を、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＮＧＦ－１１８またはｒｈＮＧＦ－１の非存在下または存在下で、ＲＰＥ細胞の培地に添加した。該当する場合、試験したＮＧＦをＨ２Ｏ２に同時に添加した。対照として、未処理またはＰＢＳ、Ｈ２Ｏ２、ｒｈＮＧＦ－１１８もしくはｒｈＮＧＦ－１のみで処理した細胞を使用した。各試料におけるアポトーシスシグナルを、インキュベーションの３０分後（図６Ａ）および２４時間後（図６Ｂ）に測定し、未処理試料と比較したアポトーシスの倍率増加を計算した。
ｒｈＮＧＦ－１１８の抗アポトーシス活性をさらに評価するために、細胞内でアポトーシスを誘導するために一般的に使用されるストレス誘導剤である１００μＭのＨ２Ｏ２を、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＮＧＦ－１１８またはｒｈＮＧＦ－１の非存在下または存在下で、ＲＰＥ細胞の培地に添加した。該当する場合、試験したＮＧＦをＨ２Ｏ２に同時に添加した。対照として、未処理またはＰＢＳ、Ｈ２Ｏ２、ｒｈＮＧＦ－１１８もしくはｒｈＮＧＦ－１のみで処理した細胞を使用した。各試料におけるアポトーシスシグナルを、インキュベーションの３０分後（図６Ａ）および２４時間後（図６Ｂ）に測定し、未処理試料と比較したアポトーシスの倍率増加を計算した。
【0140】
予想通り、Ｈ２Ｏ２処理は、アポトーシスレベルの増加をもたらした。驚くべきことに、この増加は、細胞をｒｈＮＧＦ－１１８とインキュベートしたときは防がれたが、ｒｈＮＧＦ－１では防がれなかった（図６Ａおよび６Ｂ）。反対に、ｒｈＮＧＦ－１が細胞内に存在した場合、Ｈ２Ｏ２のみで処理した対照細胞と比較して、より高いレベルのアポトーシスが観察された。
【0141】
これらのデータを合わせると、プロテオミクス解析結果が確認され、ｒｈＮＧＦ－１１８が角膜および網膜上皮細胞におけるアポトーシスを防止することが示されている。さらに重要なことに、これらの結果はまた、Ｈ２Ｏ２によって誘導されるようなストレスに対するｒｈＮＧＦ－１１８の保護的役割を示している。
【0142】
実施例４
神経分化への影響
次に、ＰＣ１２細胞を用いた神経分化のインビトロ機能アッセイにおいて、ｒｈＮＧＦ－１２０、ｒｈＮＧＦ－１１８およびｒｈＮＧＦ－１を比較した。ＰＣ１２細胞は神経成長因子（ＮＧＦ）に応答し、神経突起を出す神経細胞の典型的な表現型を示すため、これはインビトロで神経分化を研究するための高度に検証されたモデルである。
神経分化への影響
次に、ＰＣ１２細胞を用いた神経分化のインビトロ機能アッセイにおいて、ｒｈＮＧＦ－１２０、ｒｈＮＧＦ－１１８およびｒｈＮＧＦ－１を比較した。ＰＣ１２細胞は神経成長因子（ＮＧＦ）に応答し、神経突起を出す神経細胞の典型的な表現型を示すため、これはインビトロで神経分化を研究するための高度に検証されたモデルである。
【0143】
ＰＣ１２細胞は、高レベルのＴｒＫＡおよびｐ７５受容体の両方を発現する（図１）。
【0144】
ＰＣ１２細胞を、未処理または各ｒｈＮＧＦで、異なる濃度（２５ｎｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌ）で、６日間処理した。処理されていない細胞と比較して、処理された細胞において、より大きな細胞体および神経突起の広範なネットワークの精緻化が観察され、これは用量依存的に増加した。ＮＧＦの非存在下では、細胞は比較的小さく丸みを帯びており、目に見える神経突起を有していなかった。
【0145】
神経突起長は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｌｉｖｅ－Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓを使用して取得した位相コントラスト画像を分析するＮｅｕｒｏＴｒａｃｋソフトウェアを使用して測定した。細胞体は、テクスチャおよび／または明るさに基づいて背景からセグメント化され、神経突起（線形特徴）は、幅および明るさに基づいてセグメント化された。全神経突起長さを画像面積（ｍｍ／ｍｍ２）に正規化した。
【0146】
図７から分かるように、ｒｈＮＧＦ－１１８による処理は、ｒｈ－ＮＧＦ－１と比較して、特に２５ｎｇ／ｍｌで、神経突起生成の増加をもたらした。
【0147】
図１３から分かるように、ｒｈＮＧＦ－１１８による処理は、ｒｈＮＧＦ－４と比較して、神経突起生成の増加をもたらした。
【0148】
実施例５
ＴｒＫＡおよびｐ７５受容体への結合
試験したｒｈＮＧＦアイソフォームの異なる生物学的特性について１つの考えられる理由は、受容体ＴｒＫＡおよびｐ７５ＮＴＲに対する異なる結合親和性であり得る。
ＴｒＫＡおよびｐ７５受容体への結合
試験したｒｈＮＧＦアイソフォームの異なる生物学的特性について１つの考えられる理由は、受容体ＴｒＫＡおよびｐ７５ＮＴＲに対する異なる結合親和性であり得る。
【0149】
したがって、我々は、センサー表面上のＴｒＫＡまたはｐ７５ＮＴＲ受容体を固定化し、次いでさまざまなｒｈＮＧＦアイソフォームを注入することによって、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を行った。親和性値は、定常状態結合レベルの測定から得た。定常状態１：１のモデルは、分析物濃度に対する定常状態結合レベルのプロットから、１：１の相互作用の平衡解離定数Ｋｄを計算する。
【0150】
そのようにして得られた結果を以下の表９に示す。
【0151】
【表9】
【0152】
データから分かるように、ｒｈＮＧＦ－２およびｒｈＮＧＦ－３は、ｐ７５ＮＴＲに対してはるかに高い親和性を示すが、ｒｈＮＧＦ－１１８およびｒｈＮＧＦ－１は、ＴｒＫＡおよびｐ７５ＮＴＲ受容体に対して非常に類似した親和性を示す。
【0153】
ｒｈＮＧＦ－１１８とｒｈＮＧＦ－１の結合親和性の違いを観察できなかったため、これら２つのＮＧＦの受容体への結合の動態に焦点を当てた。センサグラムの解析から、ＢＩＡ評価ソフトウェアにより、速度論的パラメータ（Ｋｏｎ＝結合速度定数、Ｋｏｆｆ＝解離速度定数）および結合（Ｋｄ）値を運動速度定数の比（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）として評価した。
【0154】
得られた結果を以下の表１０に示す。
【0155】
【表10】
【0156】
上記のデータから分かるように、２つのＮＧＦは、２つの受容体への結合の異なる動態を示す。
【0157】
特に、ｒｈＮＧＦ－１１８はｐ７５ＮＴＲに非常に速く結合および解離するが、ｒｈＮＧＦ－１はｐ７５ＮＴＲから解離するのがはるかに遅い。
【0158】
これらのデータに基づいて、我々は、ｒｈＮＧＦ－１１８がｐ７５ＮＴＲから迅速に解離し、したがって、ＴｒＫＡに結合し、その下流シグナル伝達を活性化するためにより利用可能であると結論付ける。
【0159】
一方、ｐ７５ＮＴＲからのｒｈＮＧＦ－１のゆっくりとした解離は、長期化した下流のｐ７５ＮＴＲ仲介作用を説明することができる。
【0160】
実施例６
ヒトＴＦ－１細胞株における増殖誘導活性
ｒｈＮＧＦ生物学的活性は、ＮＧＦなどの成長因子に応答して増殖するＴＦ－１細胞株上で実施した。簡潔に言えば、細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン５０Ｕ／５０μｇ／ｍＬ、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）５ｎｇ／ｍＬを追加した適切な培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０）上で培養し、３×１０４／ｍＬ～５×１０５／ｍＬの範囲の密度で維持した。細胞がおよそ３×１０５／ｍＬ～５×１０５／ｍＬの範囲内にあったときに、継代培養した。
ヒトＴＦ－１細胞株における増殖誘導活性
ｒｈＮＧＦ生物学的活性は、ＮＧＦなどの成長因子に応答して増殖するＴＦ－１細胞株上で実施した。簡潔に言えば、細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン５０Ｕ／５０μｇ／ｍＬ、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）５ｎｇ／ｍＬを追加した適切な培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０）上で培養し、３×１０４／ｍＬ～５×１０５／ｍＬの範囲の密度で維持した。細胞がおよそ３×１０５／ｍＬ～５×１０５／ｍＬの範囲内にあったときに、継代培養した。
【0161】
アッセイは、解凍後（Ｐ＃０）の継代２（Ｐ＃２）、継代３（Ｐ＃３）または継代４（Ｐ＃４）を使用して実施した。試験で細胞を使用する前日に、新鮮な培地を使用して１：２で分割した。
【0162】
ｒｈＮＧＦ－４およびｒｈＮＧＦ－１１８の増殖効果は、ＧＭ－ＣＳＦを追加していない培養培地で、細胞を１５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種することによって、０．３ｐＭ～６．７６ｎＭの濃度範囲で評価した。細胞を、ｒｈＮＧＦ－４またはｒｈＮＧＦ－１１８の存在下で、３７°±２℃、５±２％ＣＯ２で４８±１時間インキュベートした。インキュベート後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、４９０ｎｍで吸光度を読み取ることによって、生細胞を測定した。
【0163】
細胞の５０％の増殖を誘導するために必要なｒｈＮＧＦの濃度として、ＥＣ５０を計算した。ｒｈＮＧＦ－４の効力は、ｒｈＮＧＦ－１１８のＥＣ５０をｒｈＮＧＦ－４のＥＣ５０で割った比率に１００を掛けることによって計算した。
【0164】
各試験を、ｒｈＮＧＦの種類ごとに３つの濃度応答曲線を並行して含む４つの異なるプレートで繰り返した。効力は、３～４回の反復の平均として計算した。
【0165】
得られた結果を以下の表１１に示す。
【0166】
【表11】
【0167】
得られた結果に基づいて、ｒｈＮＧＦ－４は、ｒｈＮＧＦ－１１８に関して、ＴＦ－１細胞株の増殖を刺激する活性が約１０倍低いと結論付けることができる。
【0168】
実施例７
細胞生存率アッセイ
ｔＢＨＰによって誘導される細胞アポトーシスを阻害するｒｈＮＧＦ－１１８またはｒｈＮＧＦ－４の能力を、ヒト網膜色素上皮細胞ＡＲＰＥ－１９で評価した。細胞を最初に染色し、実施例２に記載のように、フローサイトメトリーによってＴｒｋＡおよびｐ７５ＮＴＲの発現を評価した（図１参照）。
細胞生存率アッセイ
ｔＢＨＰによって誘導される細胞アポトーシスを阻害するｒｈＮＧＦ－１１８またはｒｈＮＧＦ－４の能力を、ヒト網膜色素上皮細胞ＡＲＰＥ－１９で評価した。細胞を最初に染色し、実施例２に記載のように、フローサイトメトリーによってＴｒｋＡおよびｐ７５ＮＴＲの発現を評価した（図１参照）。
【0169】
細胞を、ビヒクル、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＮＧＦ－１１８または１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＮＧＦ－４で１時間前処理し、次いで、使用した前処理に従って、ビヒクル、またはビヒクルと組み合わせた５０μＭのｔＢＨＰ、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＮＧＦ－１１８または１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＮＧＦ－４で４８時間処理した。細胞生存率は、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８によって評価した。結果は、ｔＢＨＰによる処理は、ビヒクルのみと比較して細胞生存率を有意に低下させることを示し、ｒｈＮＧＦ－４による処理は、細胞生存率を完全に回復することはできない一方で、ｒｈＮＧＦ－１１８は、ビヒクル試料に非常に近い細胞生存率を示す。これらの結果は、ＮＧＦ－４ではなくＮＧＦ－１１８が、酸化ストレス後に細胞生存率を回復することができることを実証する。
【0170】
配列番号１
ＳＳＳＨＰＩＦＨＲＧＥＦＳＶＣＤＳＶＳＶＷＶＧＤＫＴＴＡＴＤＩＫＧＫＥＶＭＶＬＧＥＶＮＩＮＮＳＶＦＫＱＹＦＦＥＴＫＣＲＤＰＮＰＶＤＳＧＣＲＧＩＤＳＫＨＷＮＳＹＣＴＴＴＨＴＦＶＫＡＬＴＭＤＧＫＱＡＡＷＲＦＩＲＩＤＴＡＣＶＣＶＬＳＲＫＡＶＲ
配列番号２
ＳＳＳＨＰＩＦＨＲＧＥＦＳＶＣＤＳＶＳＶＷＶＧＤＫＴＴＡＴＤＩＫＧＫＥＶＭＶＬＧＥＶＮＩＮＮＳＶＦＫＱＹＦＦＥＴＫＣＲＤＰＮＰＶＤＳＧＣＲＧＩＤＳＫＨＷＮＳＹＣＴＴＴＨＴＦＶＫＡＬＴＭＤＧＫＱＡＡＷＲＦＩＲＩＤＴＡＣＶＣＶＬＳＲＫＡＶＲＲＡ
配列番号３
ＳＳＳＨＰＩＦＨＲＧＥＦＳＶＣＤＳＶＳＶＷＶＧＤＫＴＴＡＴＤＩＫＧＫＥＶＭＶＬＧＥＶＮＩＮＮＳＶＦＫＱＹＦＦＥＴＫＣＲＤＰＮＰＶＤＳＧＣＲＧＩＤＳＫＨＷＮＳＹＣＴＴＴＨＴＦＶＫＡＬＴＭＤＧＫＱＡＡＷＲＦＩＲＩＤＴＡＣＶＣＶＬＳＲＫＡＶ
配列番号４
ＳＳＳＨＰＩＦＨＲＧＥＦＳＶＣＤＳＶＳＶＷＶＧＤＫＴＴＡＴＤＩＫＧＫＥＶＭＶＬＧＥＶＮＩＮＮＳＶＦＫＱＹＦＦＥＴＫＣＲＤＰＮＰＶＤＳＧＣＲＧＩＤＳＫＨＷＮＳＹＣＴＴＴＨＴＦＶＫＡＬＴＭＤＧＫＱＡＡＷＲＦＩＲＩＤＴＡＣＶＣＶＬＳＲＫＡＶＲＲ
ＳＳＳＨＰＩＦＨＲＧＥＦＳＶＣＤＳＶＳＶＷＶＧＤＫＴＴＡＴＤＩＫＧＫＥＶＭＶＬＧＥＶＮＩＮＮＳＶＦＫＱＹＦＦＥＴＫＣＲＤＰＮＰＶＤＳＧＣＲＧＩＤＳＫＨＷＮＳＹＣＴＴＴＨＴＦＶＫＡＬＴＭＤＧＫＱＡＡＷＲＦＩＲＩＤＴＡＣＶＣＶＬＳＲＫＡＶＲ
配列番号２
ＳＳＳＨＰＩＦＨＲＧＥＦＳＶＣＤＳＶＳＶＷＶＧＤＫＴＴＡＴＤＩＫＧＫＥＶＭＶＬＧＥＶＮＩＮＮＳＶＦＫＱＹＦＦＥＴＫＣＲＤＰＮＰＶＤＳＧＣＲＧＩＤＳＫＨＷＮＳＹＣＴＴＴＨＴＦＶＫＡＬＴＭＤＧＫＱＡＡＷＲＦＩＲＩＤＴＡＣＶＣＶＬＳＲＫＡＶＲＲＡ
配列番号３
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配列番号４
ＳＳＳＨＰＩＦＨＲＧＥＦＳＶＣＤＳＶＳＶＷＶＧＤＫＴＴＡＴＤＩＫＧＫＥＶＭＶＬＧＥＶＮＩＮＮＳＶＦＫＱＹＦＦＥＴＫＣＲＤＰＮＰＶＤＳＧＣＲＧＩＤＳＫＨＷＮＳＹＣＴＴＴＨＴＦＶＫＡＬＴＭＤＧＫＱＡＡＷＲＦＩＲＩＤＴＡＣＶＣＶＬＳＲＫＡＶＲＲ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-11-10
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
網膜症、角膜の病態、視神経症、結膜の病態、角縁幹細胞欠乏から選択される眼の病態の治療、および角膜移植における同種移植片拒絶反応の予防に使用するための、ＮＧＦを含む医薬組成物であって、前記ＮＧＦが、前記ＮＧＦに含まれる全てのＮＧＦアイソフォームの総重量に対して５０重量％超の配列番号１のＮＧＦを含む、医薬組成物。
【請求項2】
前記ＮＧＦが、前記ＮＧＦに含まれる全てのＮＧＦアイソフォームの総重量に対して、少なくとも６０重量％、より好ましくは少なくとも７０重量％、さらにより好ましくは少なくとも８０重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、さらにより好ましくは少なくとも９５重量％、さらにより好ましくは少なくとも９８重量％、さらにより好ましくは少なくとも９９重量％、さらにより好ましくは１００重量％の配列番号１のＮＧＦアイソフォームを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記ＮＧＦに含まれる前記ＮＧＦアイソフォームが、配列番号１、２、３もしくは４のＮＧＦアイソフォームもしくはそれらの混合物を含むか、またはそれらから選択される、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記ＮＧＦが、前記ＮＧＦに含まれるすべてのＮＧＦアイソフォームの総重量に対して、２０重量％未満、より好ましくは１０重量％未満、さらにより好ましくは５重量％未満の総重量で、配列番号２、３もしくは４のＮＧＦアイソフォームまたはそれらの混合物を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記ＮＧＦが、前記ＮＧＦに含まれる全てのＮＧＦの総重量に対して、２重量％未満、好ましくは１重量％未満の量で、配列番号２、３もしくは４のＮＧＦアイソフォームまたはそれらの混合物を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記配列番号１のＮＧＦアイソフォームが、いかなる翻訳後修飾も含まない、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記網膜症が、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、光毒性網膜症、網膜剥離、加齢黄斑変性、黄斑変性、黄斑萎縮、黄斑円孔、黄斑浮腫、および網膜上膜から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記角膜の病態が、円すい角膜、光毒性角膜症、遷延性上皮欠損、角膜潰瘍、角膜ジストロフィーおよび変性、並びに乾性角結膜炎から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記視神経症が、緑内障並びに虚血性、変性性、外傷性、遺伝性および先天性視神経症から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項10】
少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項11】
眼科用途用医薬組成物である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
液体眼科用組成物、好ましくは眼科用水性液体組成物である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前眼部への局所投与用の水性点眼剤組成物である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記ＮＧＦを、前記水性組成物の約０．０００１％～０．５％ｗ／ｖの範囲、より好ましくは約０．００１％～約０．１％ｗ／ｖの範囲、より好ましくは約０．００２％ｗ／ｖの濃度で含む、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
【請求項15】
後眼部への投与のための請求項１１に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】