特表 2024-506135 オリゴヌクレオチドを脱トリチル化するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-09

(54)【発明の名称】オリゴヌクレオチドを脱トリチル化するための方法

(51)【国際特許分類】

   C07H 21/00 20060101AFI20240202BHJP

   C07H 1/00 20060101ALI20240202BHJP

【ＦＩ】

C07H21/00

C07H1/00 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023542513

(86)(22)【出願日】2022-02-15

(85)【翻訳文提出日】2023-07-12

(86)【国際出願番号】 EP2022053556

(87)【国際公開番号】W WO2022175211

(87)【国際公開日】2022-08-25

(31)【優先権主張番号】21157508.9

(32)【優先日】2021-02-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(74)【代理人】

【識別番号】100221741

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 直子

(74)【代理人】

【識別番号】100114926

【弁理士】

【氏名又は名称】枝松 義恵

(72)【発明者】

【氏名】コミサルスキ マレク スタニスロー

(72)【発明者】

【氏名】ミューラー パスカル

(72)【発明者】

【氏名】オルブリッチ マーティン

【テーマコード（参考）】

4C057

【Ｆターム（参考）】

4C057AA03

4C057AA21

4C057BB02

4C057BB05

4C057DD03

4C057MM01

4C057MM02

4C057MM04

(57)【要約】

本発明は、アセトニトリルを含む脱トリチル化溶液を用いて、５’－Ｏオリゴヌクレオチドにおける酸不安定な５’ヒドロキシ保護基を除去することを含む、直鎖Ｐ結合オリゴヌクレオチドの製造のための新規な方法に関する。この方法は、低含有量の脱プリンおよびＮ－１不純物を伴うオリゴヌクレオチドを製造することを可能にする。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

トルエンとアセトニトリルとの溶媒混合物中のプロトン酸を含む脱トリチル化溶液を用いて、５’－Ｏオリゴヌクレオチドにおける酸不安定な５’ヒドロキシ保護基を除去することを含む、直鎖Ｐ結合オリゴヌクレオチドの製造のための方法。

【請求項2】

前記プロトン酸が、酢酸、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、またはトリクロロ酢酸から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記プロトン酸がジクロロ酢酸である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記酸不安定な５’ヒドロキシ保護基が、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、トリチル、９－フェニル－キサンテン－９－イル、９－（ｐ－トリル）－キサンテン－９－イルから、またはｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルから選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記酸不安定な５’ヒドロキシ保護基が、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、またはトリチルから選択される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

トルエンとの前記溶媒混合物中のアセトニトリル濃度が、０．１％（ｖ）～７０％（ｖ）、好ましくは１０％（ｖ）～２５％（ｖ）の範囲である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

トルエン中のプロトン酸濃度が、３％（ｖ）～２０％（ｖ）、好ましくは７％（ｖ）～１７％（ｖ）の範囲である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記酸不安定な５’ヒドロキシ保護基の除去が、０．１ＣＶ／分～２．０ＣＶ／分の流量を適用する前記脱トリチル化溶液を用いて行われる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

５’－Ｏオリゴヌクレオチド中間体が、前記５’－Ｏオリゴヌクレオチドにおける前記酸不安定な５’ヒドロキシ保護基の除去の前または後に、アセトニトリルとトルエンとの混合物で洗浄される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

「脱プリン関連不純物の合計」として表される脱プリンのレベルが８．０％未満である条件下で行われる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

「Ｎ－１不純物の合計」として表されるＮ－１不純物のレベルが３．０％未満である条件下で行われる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記脱プリンのレベルおよび前記Ｎ－１不純物のレベルが、切断および脱保護の後かつ任意の下流処理が適用される前に得られた粗オリゴヌクレオチドについて測定される、請求項１０または１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、トルエンとアセトニトリルとの溶媒混合物中のプロトン酸を含む脱トリチル化溶液を用いて、５’－Ｏオリゴヌクレオチドにおける酸不安定な５’ヒドロキシ保護基を除去することを含む、直鎖Ｐ結合オリゴヌクレオチドの製造のための新規な方法に関する。

【背景技術】

【0002】

オリゴヌクレオチド合成は、原則として、所望の配列が組み立てられるまで、伸長中の鎖の５’末端にヌクレオシド残基を段階的に付加することである。

【0003】

一般的に、各付加は合成サイクルと呼ばれ、原則として以下の化学反応、
ａ_１）固体支持体上の保護された５’ヒドロキシル基を脱ブロックすること、
ａ_２）第１のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとして固体支持体上の遊離ヒドロキシル基とカップリングさせること、
ａ_３）Ｐ結合した各々のヌクレオシドを酸化または硫化して、各々のホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）または各々のホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を形成させること、
ａ_４）任意に、固体支持体上のいずれかの未反応ヒドロキシル基をキャッピングすること、
ａ_５）固体支持体に結合した第１のヌクレオシドの５’ヒドロキシル基を脱ブロックすること、
ａ_６）第２のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとしてカップリングさせて、各々のＰ－Ｏ結合したダイマーを形成させること、
ａ_７）Ｐ－Ｏ結合した各々のジヌクレオシドを酸化または硫化して、各々のホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）または各々のホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を形成させること、
ａ_８）任意に、いずれかの未反応５’ヒドロキシル基をキャッピングすること、
ａ_９）所望の配列が組み立てられるまで、前述の工程ａ_５～ａ_８を繰り返すこと、からなる。

【0004】

あるいは、反応シーケンスは、固体支持体にプレロードされたヌクレオシドの保護された５’ヒドロキシル基の脱ブロックから開始してもよい。その後の工程は、上記で概説したようにシーケンスに従う。

【0005】

最後に、組み立てられたオリゴヌクレオチドを固体支持体から切断し、その後の下流処理および精製方法により、所望の純粋なオリゴヌクレオチドを得る。

【0006】

保護された５’ヒドロキシル基の脱ブロック、すなわち、５’－Ｏオリゴヌクレオチドにおける酸不安定な５’ヒドロキシ保護基の除去は、各サイクルにおいて、次のヌクレオシドとのカップリングのためにこれまでに組み立てられたオリゴヌクレオチドを調製するように、オリゴヌクレオチド合成における重要な繰返しプロセス工程である。

【0007】

脱ブロック方法は原則として標準的であり、当技術分野で周知である。

【0008】

米国特許第６，５３８，１２８号（特許文献１）明細書は、標準的な手順を例示しており、アレーン溶媒、通常はトルエンの存在下での、ジクロロ酢酸またはトリクロロ酢酸などのプロトン酸を用いた典型的な５’ヒドロキシ保護基であるトリチル基の除去を開示している。

【0009】

米国特許第６，５３８，１２８号（特許文献１）明細書は、塩化メチレンおよびアセトニトリルなどの溶媒をさらに論じている。アセトニトリルは、脱トリチル化速度を遅くすることが記載された（実施例２、１８行および表１）。

【0010】

減速効果の理由は、Ｃ．Ｈ．Ｐａｕｌら、３０４８～３０５２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９６年、第２４巻、第１５号（非特許文献１）で論じられている。アセトニトリルがプロトン酸と複合体を形成し、オリゴヌクレオチドと競合すると、脱トリチル化が劇的に遅くなると仮定された。

【0011】

ＰＣＴ国際公開第２０１２／０５９５１０号（特許文献２）パンフレットは、例えばオリゴヌクレオチド合成の一部としての脱トリチル化方法で使用される様々な溶媒中での固体支持体の膨潤によって引き起こされる固体支持体カラム内の圧力を低下させる方法を開示している。固体支持体を、脱トリチル化反応の前または後に、塩化メチレンまたはトルエンのようなアレーンを含む洗浄液で洗浄することが示唆されており、これにより、オリゴヌクレオチド合成の過程で蓄積する圧力が低下する。洗浄溶液はアセトニトリルを含み得る。脱トリチル化は、標準的な方法、すなわちトルエン中にＤＣＡを含有する酸性溶液を適用することに従う。望ましくない副反応の低減は、本ＰＣＴ開示の目的ではない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】米国特許第６，５３８，１２８号

【特許文献2】ＰＣＴ国際公開第２０１２／０５９５１０号

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Ｃ．Ｈ．Ｐａｕｌら、３０４８～３０５２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９６年、第２４巻、第１５号

【発明の概要】

【0014】

本発明の目的は、保護された５’ヒドロキシル基を脱ブロックするための方法、特にＮ－１不純物の形成および脱プリンの減少などの望ましくない副反応の低減をさらに改善することであった。

【0015】

この目的は、トルエンとアセトニトリルとの溶媒混合物中のプロトン酸を用いて行われる、５’－Ｏオリゴヌクレオチドにおける酸不安定な５’ヒドロキシ保護基の除去のための方法によって達成され得ることが見出された。

【0016】

本発明の方法は、驚くべきことに、アセトニトリルの存在下でのプリン塩基のグリコシド結合の加水分解の減少に起因して、有意に少ない脱トリチル化関連副生成物を送達するが、同時に、脱トリチル化の速度論は悪影響を受けない。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下の定義は、本明細書において本発明を説明するために使用される種々の用語の意味および範囲を例示し、定義するために記載されている。

【0018】

酸不安定な５’ヒドロキシ保護基という用語は、適切な酸の助けを借りて切断可能であり、かつ疎水性の特性を有する、保護基と定義される。

【0019】

典型的な酸不安定な５’ヒドロキシ保護基は、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、トリチル、９－フェニル－キサンテン－９－イル、９－（ｐ－トリル）－キサンテン－９－イルから、もしくはｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルから、好ましくは、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、もしくはトリチルから、またはさらにより好ましくは４，４’－ジメトキシトリチルから選択される。

【0020】

本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオチドを含む分子として当業者によって一般的に理解されるように定義される。治療的に価値のあるオリゴヌクレオチドとして使用するために、オリゴヌクレオチドは、典型的には、１０～４０ヌクレオチド、好ましくは１０～２５ヌクレオチドの長さとして合成される。

【0021】

オリゴヌクレオチドは、任意に修飾されていてもよいＤＮＡ、ＲＮＡまたはＬＮＡヌクレオシドモノマーまたはそれらの組合せからなり得る。

【0022】

ＬＮＡヌクレオシドモノマーは、ヌクレオチドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’の間にリンカー基または架橋を含む修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドはまた、文献において、架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。

【0023】

本明細書において使用される「任意に修飾されていてもよい」とは、糖部分または核酸塩基部分に対する１つまたは複数の修飾の導入によって、対応するＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＬＮＡヌクレオシドと比べて修飾されたヌクレオシドを意味する。好ましい実施形態において、修飾ヌクレオシドは修飾糖部分を含み、例えば、１つ以上の２’置換ヌクレオシドおよび／または１つ以上のＬＮＡヌクレオシドを含み得る。修飾ヌクレオシドという用語はまた、「ヌクレオシド類似体」または修飾「ユニット」または修飾「モノマー」という用語と互換的に使用されてもよい。

【0024】

ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＬＮＡヌクレオシドは、原則として、２つのヌクレオシドを互いに共有結合するホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）またはホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）ヌクレオシド間結合によって連結される。

【0025】

したがって、いくつかのオリゴヌクレオチドにおいて、全てのヌクレオシド間結合がホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）からなっていてもよく、他のオリゴヌクレオチドにおいては、全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）からなっていてもよく、またはさらに他のオリゴヌクレオチドにおいては、ヌクレオシド間結合の配列が異なっており、ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）とホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）の両方のヌクレオシド間結合を含む。

【0026】

核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基についての文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵにより示されてもよく、各文字は、任意に等価機能の修飾核酸塩基を含んでもよい。例えば、例示されるオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、ＬＮＡヌクレオシドについては大文字のＡ、Ｔ、Ｇおよび^ＭｅＣ（５－メチルシトシン）を用いて、ＤＮＡヌクレオシドについては小文字のａ、ｔ、ｇ、ｃおよび^Ｍｅｃを用いて記載される。修飾核酸塩基としては、保護基を有する核酸塩基、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル、フェノキシアセチル、ベンゾイル、アセチル、イソブチリルまたはジメチルホルムアミジノが挙げられるが、これらに限定されない。

【0027】

オリゴヌクレオチド合成の記載された原理は、当技術分野で周知である（Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒｓ．「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ、Ｔｈｅ Ｆｒｅｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ．、２０２１年１月１９日．Ｗｅｂ．２０２１年２月１６日を参照のこと）。

【0028】

現在、大規模なオリゴヌクレオチド合成は、コンピュータ制御合成装置を使用して自動的に行われている。

【0029】

原則として、オリゴヌクレオチド合成は固相合成であり、ここで、組み立てられるオリゴヌクレオチドは、その３’末端ヒドロキシ基を介して固体支持体材料に共有結合し、鎖組立ての全過程にわたってそこに結合したままである。好適な支持体は、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＰｒｉｍｅｒ支持体５ＧもしくはＫｉｎｏｖａｔｅからのＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ支持体のような市販のマクロ多孔質ポリスチレン支持体、またはＬＧＣからの核酸塩基プレロード支持体のような制御された細孔ガラス支持体である。

【0030】

上記で概説したように、オリゴヌクレオチド合成は、原則として、上記で概説したように所望の配列が組み立てられるまで、伸長中の鎖の５’末端にヌクレオシド残基を段階的に付加することである。

【0031】

その後の樹脂からの切断は、濃アンモニア水を用いて行われ得る。リン酸および核酸塩基上の保護基もこの切断手順内で除去される。

【0032】

上記で概説したように、本発明の方法は、トルエンとアセトニトリルとの溶媒混合物中のプロトン酸を用いて、５’－Ｏオリゴヌクレオチドにおける酸不安定な５’ヒドロキシ保護基を除去することを含む、直鎖Ｐ結合オリゴヌクレオチドの製造のための方法に関する。

【0033】

プロトン酸は、原則として、酢酸、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、またはトリクロロ酢酸から選択される。好ましいプロトン酸はジクロロ酢酸である。

【0034】

典型的な酸不安定な５’ヒドロキシ保護基は、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、トリチル、９－フェニル－キサンテン－９－イル、９－（ｐ－トリル）－キサンテン－９－イルから、もしくはｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルから、好ましくは、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、もしくはトリチルから、またはより好ましくは４，４’－ジメトキシトリチルから選択され得る。

【0035】

トルエン中のプロトン酸との溶媒混合物中のアセトニトリル濃度は、通常、０．１％（ｖ）～７０％（ｖ）、好ましくは１０％（ｖ）～２５％（ｖ）の範囲である。

【0036】

トルエン中のプロトン酸濃度は、通常、３％（ｖ）～２０％（ｖ）、好ましくは７％（ｖ）～１７％（ｖ）の範囲で選択される。

【0037】

したがって、好ましい実施形態において、トルエン中のジクロロ酢酸の濃度は、３％（ｖ）～２０％（ｖ）、好ましくは７％（ｖ）～１７％（ｖ）の範囲で選択される。

【0038】

アセトニトリルをトルエン中のプロトン酸と混合した後の最終的な脱トリチル化溶液の流量は、通常、０．１ＣＶ／分～２．０ＣＶ／分、好ましくは０．３ＣＶ／分～１．７ＣＶ／分の範囲である。

【0039】

典型的な例として、トルエン中のプロトン酸溶液は、標準的なオリゴヌクレオチド合成機器を使用して、最終流量、例えば、トルエン中のプロトン酸溶液８５％とアセトニトリル１５％の比での１．０ＣＶ／分の総流量に対するトルエン中のプロトン酸溶液０．８５ＣＶ／分とアセトニトリル０．１５ＣＶ／分のそれぞれの比に応じてポンプ速度を設定することによって、アセトニトリルとインラインで混合される。

【0040】

本発明の方法の条件では、８％未満、７．０％未満、６．０％未満、より好ましくは５．０％未満の「脱プリン関連不純物の合計」として表される脱プリンのレベルが達成され得る。

【0041】

さらに、本発明の方法の条件では、３．０％未満、２．５％未満、２．０％未満、より好ましくは１．５％未満の「Ｎ－１不純物の合計」として表されるＮ－１不純物のレベルが達成され得る。

【0042】

このレベルは、粗オリゴヌクレオチド段階で、すなわち、切断および脱保護の後かつ精製または限外濾過などのいずれかの下流処理が適用される前に得られたオリゴヌクレオチドについて達成および測定され得る。

【0043】

いくつかの実施形態において、樹脂結合オリゴヌクレオチド中間体は、脱トリチル化工程の前にアセトニトリルとトルエンとの混合物で洗浄される。

【0044】

他の実施形態において、樹脂結合オリゴヌクレオチド中間体は、脱トリチル化工程の後にアセトニトリルとトルエンとの混合物で洗浄される。

【0045】

好ましい実施形態において、樹脂結合オリゴヌクレオチド中間体は、脱トリチル化工程の前後にアセトニトリルとトルエンとの混合物で洗浄される。

【0046】

洗浄のためのトルエンとの溶媒混合物中のアセトニトリル濃度は、通常、０．１％（ｖ）～７０％（ｖ）、好ましくは１０％（ｖ）～２５％（ｖ）の範囲である。

【0047】

例示として、オリゴヌクレオチドは、以下から選択され得る。
Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊^ＭｅＣ＊^ＭｅＣ
式中、＊はホスホロチオエート架橋を表し、Ａ、Ｔおよび^ＭｅＣ（５－メチルシトシン）はＬＮＡヌクレオシドモノマーであり、ａ、ｔ、ｃはＤＮＡヌクレオシドモノマーである。

【0048】

本明細書に開示される化合物は、以下の核酸塩基配列を有する。
配列番号１：ｔｔａｃａｃｔｔａａｔｔａｔａｃｔｔｃｃ

【実施例】

【0049】

略語：
Ａｃ_２Ｏ＝酢酸無水物
ＢＴＴ＝５－ベンジルチオテトラゾール
Ｂｚ＝ベンジル
ＤＣＡ＝ジクロロ酢酸
ＤＥＡ＝ジエチルアミン
ＤＮＡ＝２’－デオキシリボヌクレオチド
ＤＭＴ＝４，４’－ジメトキシトリチル
ＣＶ＝カラム容積
ＬＮＡ＝２’－Ｏ－ＣＨ_２－４’架橋リボヌクレオチド
ＭｅＣＮ＝アセトニトリル
ＮＡ＝該当なし
ＮＭＩ＝Ｎ－メチルイミダゾール
ＰｈＭｅ＝トルエン

【0050】

実施例１．
Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊^ＭｅＣ＊^ＭｅＣの合成
式中、＊はホスホロチオエート架橋を表し、Ａ、Ｔおよび^ＭｅＣ（５－メチルシトシン）はＬＮＡヌクレオシドモノマーであり、ａ、ｔ、ｃはＤＮＡヌクレオシドモノマーである。

【0051】

標記化合物を、ＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ １００およびＰｒｉｍｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ（ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ＬＨ Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ ３３０）を使用して、固相上で標準的なホスホラミダイト化学によって２．６５ｍｍｏｌのスケールで製造した。

【0052】

下記のホスホラミダイトを各サイクルで使用した：

【0053】

一般的に、１．５当量のホスホラミダイトを使用した。全ての試薬を市販の供給源から受け取ったまま使用し、適切な濃度の試薬溶液を調製した（以下の詳細を参照）。水酸化アンモニウムを用いて切断および脱保護を行い、粗オリゴヌクレオチドを得た。
標準試薬溶液

【0054】

切断および脱保護工程からの粗溶液を真空中で濃縮して過剰のアンモニアを除去した。濃縮溶液を凍結乾燥させて、粗オリゴヌクレオチドを固体として得た。淡黄色固体をサンプリングし、ＬＣ－ＵＶ－ＭＳ分析に供した。不純物を、割り当てられた構造に従ってグループ分けした。全てのＮ－１不純物の合計および全ての脱プリン関連不純物の合計をプロセスパラメータの分析に使用した。

【0055】

実施例２
脱トリチル化の例
以下の表に概説されるように、トルエン中のジクロロ酢酸およびアセトニトリルの様々な溶液を使用して、脱トリチル化を行った。トルエン中のジクロロ酢酸とアセトニトリルとを表に示す比でインライン混合することによって、混合物をカラムに送達した。

【0056】

実施例２ｂ）、２ｃ）、２ｄ）、２ｈ）、２ｉ）、２ｊ）および２ｋ）が好ましいとみなされる。実施例２ｂ）および２ｋ）が最も好ましい。

【0057】

実施例２ｍ）～２ｏ）は、比較例である。

【配列表】

2024506135000001.app

【国際調査報告】