特表2024-506227 | 知財ポータル「IP Force」

知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」

▶ ジェイ・エイチ・エムバイオファーマシューティカル（ハンチョウ）カンパニーリミテッドの特許一覧

特表2024-506227成長ホルモン融合タンパク質及びその調製方法並びに使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

目に優しい文字サイズ小中大 PDF Top

< >

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-13

(54)【発明の名称】成長ホルモン融合タンパク質及びその調製方法並びに使用

(51)【国際特許分類】

C12N 15/18 20060101AFI20240205BHJP

C12N 15/62 20060101ALI20240205BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20240205BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20240205BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20240205BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20240205BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20240205BHJP

C07K 19/00 20060101ALI20240205BHJP

C12P 21/02 20060101ALI20240205BHJP

C07K 16/18 20060101ALI20240205BHJP

C07K 14/475 20060101ALI20240205BHJP

A61K 38/27 20060101ALI20240205BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20240205BHJP

A61K 35/12 20150101ALI20240205BHJP

A61P 5/06 20060101ALI20240205BHJP

A61P 1/14 20060101ALI20240205BHJP

A61P 19/08 20060101ALI20240205BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20240205BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20240205BHJP

C12N 15/13 20060101ALN20240205BHJP

【ＦＩ】

C12N15/18

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K19/00

C12P21/02 H

C07K16/18

C07K14/475

A61K38/27

A61K48/00

A61K35/12

A61P5/06

A61P1/14

A61P19/08

A61P43/00 111

A61K39/395 Y

C12N15/13 ZNA

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023515840

(86)(22)【出願日】2022-04-28

(85)【翻訳文提出日】2023-03-08

(86)【国際出願番号】 CN2022089962

(87)【国際公開番号】W WO2023123776

(87)【国際公開日】2023-07-06

(31)【優先権主張番号】202111658414.X

(32)【優先日】2021-12-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523085164

【氏名又は名称】ジェイ・エイチ・エムバイオファーマシューティカル（ハンチョウ）カンパニーリミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＪＨＭＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ（ＨＡＮＧＺＨＯＵ）ＣＯ．，ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍｓ５０１，５０２，５０３ａｎｄ５０４，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ９，ＨｅｘｉａｎｇＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒ，ＱｉａｎｔａｎｇＤｉｓｔｒｉｃｔ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ３１００１８，Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100112656

【弁理士】

【氏名又は名称】宮田英毅

(74)【代理人】

【識別番号】100089118

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井宏明

(72)【発明者】

【氏名】バオ，グゥオチィン

(72)【発明者】

【氏名】グゥオ，リミン

(72)【発明者】

【氏名】シェン，ユバオ

(72)【発明者】

【氏名】ガオ，シン

(72)【発明者】

【氏名】リ，ジアナン

(72)【発明者】

【氏名】ワン，チャオ

(72)【発明者】

【氏名】ウー，チ

(72)【発明者】

【氏名】スン，バオツャイ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG13

4B064AG26

4B064CA02

4B064CA06

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA07

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA41

4C084DB22

4C084NA14

4C084ZA661

4C084ZA961

4C084ZC041

4C084ZC411

4C084ZC541

4C085AA33

4C085BB42

4C085CC22

4C085DD62

4C085EE01

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB65

4C087CA04

4C087NA14

4C087ZA66

4C087ZA96

4C087ZC04

4C087ZC41

4C087ZC54

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA31

4H045DA75

4H045EA30

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は成長ホルモン融合タンパク質及びその調製方法と使用に関し、本発明の実施例によれば、成長ホルモン融合タンパク質は、第１の定常領域Ｆｃセグメントと第２の定常領域Ｆｃセグメントを有する二本鎖構造体と、前記二本鎖構造体の前記第１の定常領域Ｆｃセグメントに連結される成長ホルモンと、を含み、前記成長ホルモンのＮ末端にメチオニンを有さなく、前記成長ホルモン融合タンパク質は非哺乳細胞の発現系によって発現される。本発明の実施例によれば、成長ホルモンと二本鎖構造体を融合することによって、成長ホルモンの体内の半減期を延長することができ、また、各二本鎖構造体に１つの成長ホルモンしか担持しないため、成長ホルモンの活性サイトが立体障害の影響を受けないため、その活性がより強くなり、また成長ホルモンのＮ末端にメチオニンを有さないため、安全性がより高い。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

成長ホルモン融合タンパク質であって、
第１の定常領域Ｆｃセグメントと第２の定常領域Ｆｃセグメントを有する二本鎖構造体と、
前記二本鎖構造体の前記第１の定常領域Ｆｃセグメントに連結される成長ホルモンと、
を含み、
前記成長ホルモンのＮ末端にメチオニンを有さなく、
前記成長ホルモン融合タンパク質は非哺乳細胞の発現系によって発現されることを特徴とする成長ホルモン融合タンパク質。

【請求項2】

前記成長ホルモン融合タンパク質はグリコシル化修飾を受けていないことを特徴とする請求項１に記載の成長ホルモン融合タンパク質。

【請求項3】

前記非哺乳細胞発現系は原核発現系と下等真核発現系のいずれかを少なくとも含み、好ましくは前記非哺乳細胞発現系は大腸菌発現系と酵母発現系のいずれかを少なくとも含む、ことを特徴とする請求項１または２に記載の成長ホルモン融合タンパク質。

【請求項4】

前記成長ホルモンは、
（ａ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるアミノ酸配列、
Ｘ_１ＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＸ_２ＲＳＶＥＧＳＸ_３ＧＦ、
Ｘ_１は、Ｇ、ＡまたはＳを示し、
Ｘ_２は、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｃまたは欠落を示し、
Ｘ_３は、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｃまたは欠落を示し、
または
（ｂ）、（ａ）と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかを含む、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の成長ホルモン融合タンパク質。

【請求項5】

一端が前記成長ホルモンに連結され、他端が前記二本鎖構造体に連結され、少なくとも１つの配列単位ＧＸａａ_１ＰＸａａ_２を含む連結ペプチドをさらに含み、
各前記配列単位の中で、各Ｘａａ_１はそれぞれ独立してＡ、Ｅ及びＫのいずれかを示し、各Ｘａａ_２はそれぞれ独立してＱ及びＮのいずれかを示す、ことを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の成長ホルモン融合タンパク質。

【請求項6】

前記連結ペプチドは１～２０個、好ましくは１～５個、より好ましくは３個の前記配列単位を含む、ことを特徴とする請求項５に記載の成長ホルモン融合タンパク質。

【請求項7】

前記成長ホルモンのＣ末端は前記連結ペプチドに連結される、ことを特徴とする請求項５または６に記載の成長ホルモン融合タンパク質。

【請求項8】

前記第１の定常領域Ｆｃセグメントと前記第２の定常領域Ｆｃセグメントは異なるアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項１～８のいずれか１項に記載の成長ホルモン融合タンパク質。

【請求項9】

前記第１の定常領域Ｆｃセグメントと前記第２の定常領域Ｆｃセグメントは体外でイソダイマーを形成するのに適する、ことを特徴とする請求項８に記載の成長ホルモン融合タンパク質。

【請求項10】

前記第１の定常領域Ｆｃセグメントと前記第２の定常領域Ｆｃセグメントはそれぞれ独立してＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるアミノ酸配列：
ＳＫＹＧＰＰＸ_４ＰＰＸ_５ＰＡＰＸ_６ＡＸ_７ＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＸ_８ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＸ_９ＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＸ_１０ＣＸ_１１ＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＸ_１２ＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＸ_１３ＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫを有し、
Ｘ_４はＲ、Ｋ、Ｄ、ＥまたはＣを示し、
Ｘ_５はＲ、Ｋ、Ｄ、ＥまたはＣを示し、
Ｘ_６はＲ、Ｋ、Ｄ、Ｅまたは欠落を示し、
Ｘ_７はＡ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅまたは欠落を示し、
Ｘ_８はＤ、Ｅ、Ｇ、ＱまたはＮを示し、
Ｘ_９はＤ、Ｅ、Ｇ、ＱまたはＮを示し、
Ｘ_１０はＧ、ＳまたはＷを示し、
Ｘ_１１はＡ、Ｇ、ＰまたはＬを示し、
Ｘ_１２はＤ、Ｅ、Ｇ、ＱまたはＮを示し、
Ｘ_１３はＩ、Ｐ、ＶまたはＹを示す、ことを特徴とする請求項８または９に記載の成長ホルモン融合タンパク質。

【請求項11】

Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６及びＸ_７のうちの少なくとも１つはＫまたはＥまたはＣである、ことを特徴とする請求項１０に記載の成長ホルモン融合タンパク質。

【請求項12】

前記第１の定常領域Ｆｃセグメントでは、
Ｘ_４はＣを示し、
Ｘ_５はＣを示し、
Ｘ_６はＫを示し、
Ｘ_７はＥを示し、
Ｘ_８はＮを示し、
Ｘ_９はＮを示し、
Ｘ_１０はＷを示し、
Ｘ_１１はＬを示し、
Ｘ_１２はＮを示し、
Ｘ_１３はＹを示す、ことを特徴とする請求項１０に記載の成長ホルモン融合タンパク質。

【請求項13】

前記第２の定常領域Ｆｃセグメントでは、
Ｘ_４はＣを示し、
Ｘ_５はＣを示し、
Ｘ_６はＥを示し、
Ｘ_７はＫを示し、
Ｘ_８はＱを示し、
Ｘ_９はＱを示し、
Ｘ_１０はＳを示し、
Ｘ_１１はＡを示し、
Ｘ_１２はＱを示し、
Ｘ_１３はＶを示す、ことを特徴とする請求項１０に記載の成長ホルモン融合タンパク質。

【請求項14】

請求項１～１３のいずれか１項に記載の成長ホルモン融合タンパク質をコードする、ことを特徴とする核酸分子。

【請求項15】

請求項１４に記載の核酸分子を担持する、ことを特徴とする発現ベクター。

【請求項16】

請求項１４に記載の核酸分子、または
請求項１５に記載の発現ベクターを含む、ことを特徴とする組換え細胞。

【請求項17】

請求項１～１３のいずれか１項に記載の成長ホルモン融合タンパク質の調製方法であって、
二本鎖構造体の第１の単量体と第２の単量体を取得するステップであって、前記第１の単量体は第１の定常領域Ｆｃセグメントを有し、前記第２の単量体は第２の定常領域Ｆｃセグメントを有し、前記第１の定常領域Ｆｃセグメントに成長ホルモンが連結されるステップと、
前記第１の単量体と前記第２の単量体をイソダイマーにして、前記成長ホルモン融合タンパク質を取得するステップと、を含む、ことを特徴とする成長ホルモン融合タンパク質の調製方法。

【請求項18】

前記イソダイマーは体外で形成される、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記第１の単量体と前記第２の単量体は非哺乳細胞発現系で発現される、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

前記第１の単量体と前記第２の単量体は同じ前記非哺乳細胞発現系で発現される、ことを特徴とする請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

請求項１～１３のいずれか１項に記載の成長ホルモン融合タンパク質を含む、ことを特徴とする薬物組成物。

【請求項22】

請求項１～１３のいずれか１項に記載の成長ホルモン融合タンパク質、請求項１４に記載の核酸分子、請求項１５に記載の発現ベクター、請求項１６に記載の組換え細胞、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の方法によって調製された成長ホルモン融合タンパク質、請求項２１に記載の薬物組成物の、成長ホルモン異常に関連する疾患を治療または予防するための薬物の調製における使用。

【請求項23】

前記成長ホルモン異常に関連する疾患は、
小児成長ホルモン欠乏症、ターナー症候群、慢性腎不全による小人症、特発性小人症、成人成長ホルモン欠乏、短腸症候群、ＦＧＦＲ３突然変異の軟骨発育不全から選ばれる１種を少なくとも含む、ことを特徴とする請求項２２に記載の使用。

【請求項24】

被験者における成長ホルモン異常に関連する疾患を治療または予防するための方法であって、前記被験者に請求項１～１３のいずれか１項に記載の成長ホルモン融合タンパク質、請求項１４に記載の核酸分子、請求項１５に記載の発現ベクター、請求項１６に記載の組換え細胞、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の方法によって調製された成長ホルモン融合タンパク質、または請求項２１に記載の薬物組成物を投与するステップを含む、方法。

【請求項25】

前記成長ホルモン異常に関連する疾患は、
小児成長ホルモン欠乏症、ターナー症候群、慢性腎不全による小人症、特発性小人症、成人成長ホルモン欠乏、短腸症候群、ＦＧＦＲ３突然変異の軟骨発育不全から選ばれる１種を少なくとも含む、ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

成長ホルモン異常に関連する疾患を治療または予防するための使用の、請求項１～１３のいずれか１項に記載の成長ホルモン融合タンパク質、請求項１４に記載の核酸分子、請求項１５に記載の発現ベクター、請求項１６に記載の組換え細胞、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の方法によって調製された成長ホルモン融合タンパク質、または請求項２１に記載の薬物組成物。

【請求項27】

前記成長ホルモン異常に関連する疾患は、
小児成長ホルモン欠乏症、ターナー症候群、慢性腎不全による小人症、特発性小人症、成人成長ホルモン欠乏、短腸症候群、ＦＧＦＲ３突然変異の軟骨発育不全から選ばれる１種を少なくとも含む、ことを特徴とする請求項２６に記載の使用の請求項１～１３のいずれか１項に記載の成長ホルモン融合タンパク質、請求項１４に記載の核酸分子、請求項１５に記載の発現ベクター、請求項１６に記載の組換え細胞、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の方法によって調製された成長ホルモン融合タンパク質、または請求項２１に記載の薬物組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はバイオテクノロジー分野に関し、具体的に、本発明は成長ホルモン融合タンパク質及びその調製方法並びに使用に関し、より具体的に、本発明は成長ホルモン融合タンパク質、核酸分子、発現ベクター、組換え細胞、成長ホルモン融合タンパク質の調製方法、薬物組成物及び成長ホルモン融合タンパク質、核酸分子、発現ベクター、組換え細胞または薬物組成物の薬物の調製における使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ、ｈＧＨ）脳下垂体の前葉から分泌されるタンパク質ホルモンで、１９１個のアミノ酸からなり、分子量は２２．１ＫＤａであり、成長ホルモンは骨の成長を促進し、生体タンパク質の合成及び脂肪の分解を促進し、筋肉細胞の数と筋肉細胞の体積を増やし、免疫系を調整し、免疫能力を増強する。成長ホルモンは子供の内因性成長ホルモンの欠乏による小人症、ターナー症候群、成人ＧＨＤ、火傷と創傷修復などの病状の治療に用いることができ、慢性腎不全による小人症、短腸症候群、高齢者の抗老化を治療するために用いることもできる。

【0003】

国内市場の長寿命成長ホルモンはＰＥＧ化によってその半減期を延長し、長期的な目的を達成する。しかし、ＰＥＧ化された組換えヒト成長ホルモンを成長ホルモン欠乏症にかかった子供に使用した場合、患児の体内のインスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）レベルは正常レベルに回復できなかったと報告されている。臨床前の動物実験では、実験動物にＰＥＧ化されたタンパク質薬を繰り返し投与すると、空胞病変を引き起こすことが示された。また、通常の成長ホルモン発現産物、特に大腸菌で発現する成長ホルモンについて、目的タンパク質遺伝子の開始に塩基ＡＴＧの存在が必須であるため、発現タンパク質のＮ末端に必ずメチオニンが含まれており、Ｎ末端にメチオニンを含まない成長ホルモンを得るには、タンパク質のＮ末端融合シグナルペプチドの作用によって実現する必要がある。Ｎ末端メチオニンの存在、特に成長ホルモンのＮ末端メチオニンの存在は、治療に副作用をもたらす。

【0004】

したがって、従来の長寿命成長ホルモン技術は改善する余裕がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、従来の技術に存在する成長ホルモンの上記問題を十分に考慮し、組換え成長ホルモンをさらに研究する過程において、意外にも、大腸菌などの一部の発現系は、シグナルペプチドの作用を介さずに、Ｎ末端にメチオニンを担持しない成長ホルモンに直接発現できることが示された。

【課題を解決するための手段】

【0006】

したがって、本発明はＮ末端にメチオニンを担持しない組換え成長ホルモンを効果的に調製する方法を提供する。

【0007】

第１の態様では、本発明は成長ホルモン融合タンパク質を提供し、本発明の実施例によれば、第１の定常領域Ｆｃセグメントと第２の定常領域Ｆｃセグメントを有する二本鎖構造体と、前記二本鎖構造体の前記第１の定常領域Ｆｃセグメントに連結される成長ホルモンと、を含み、前記成長ホルモンのＮ末端にメチオニンを有さなく、前記成長ホルモン融合タンパク質は非哺乳細胞の発現系によって発現される。本発明の実施例によれば、成長ホルモンと二本鎖構造体を融合することによって、成長ホルモンの体内の半減期を延長することができ、また、各二本鎖構造体に１つの成長ホルモンしか担持しないため、成長ホルモンの活性サイトが立体障害の影響を受けないため、その活性がより強くなり、また成長ホルモンのＮ末端にメチオニンを有さないため、安全性がより高い。

【0008】

第２の態様では、本発明は核酸分子を提供し、本発明の実施例によれば、前記核酸分子は第１の態様に記載の成長ホルモン融合タンパク質をコードする。該核酸分子を利用することで上記融合タンパク質を発現するために効果的に使用でき、特に原核生物や下等真核生物の発現系では上記成長ホルモンの単量体を効果的に発現することができ、さらに体外で組み立てることで最終的な成長ホルモン融合タンパク質を形成することができる。

【0009】

第３の態様では、本発明は、発現ベクターを更に提供し、本発明の実施例によれば、前記発現ベクターは第２の態様に記載の核酸分子を担持する。該発現ベクターを利用することで、細胞内で上記融合タンパク質を効果的に発現でき、特に原核生物や下等真核生物の発現系では上記成長ホルモンの単量体を効果的に発現することができ、さらに体外で組み立てることで最終的な成長ホルモン融合タンパク質を形成することができる。

【0010】

第４の態様では、本発明は組換え細胞を更に提供し、本発明の実施例によれば、該組換え細胞は、前述の核酸分子、または前述の発現ベクターを含む。

【0011】

第５の態様では、本発明は第１の態様に記載の成長ホルモン融合タンパク質の調製方法を更に提供し、二本鎖構造体の第１の単量体と第２の単量体を取得するステップであって、前記第１の単量体は第１の定常領域Ｆｃセグメントを有し、前記第２の単量体は第２の定常領域Ｆｃセグメントを有し、前記第１の定常領域Ｆｃセグメントに成長ホルモンが連結されるステップと、前記第１の単量体と前記第２の単量体をイソダイマーにして、前記成長ホルモン融合タンパク質を取得するステップと、を含む。

【0012】

これにより、前述の成長ホルモン融合タンパク質を効果的に調製することができる。

【0013】

本発明の実施例によれば、前記イソダイマーは体外で形成される。

【0014】

本発明の実施例によれば、前記第１の単量体と前記第２の単量体は非哺乳細胞の発現系で発現される。

【0015】

本発明の実施例によれば、前記第１の単量体と前記第２の単量体は同じ非哺乳細胞の発現系で発現される。

【0016】

第６の態様では、本発明は第１の態様に記載の成長ホルモン融合タンパク質を含む薬物組成物を提供する。

【0017】

第７の態様では、本発明は前述成長ホルモン融合タンパク質、前述核酸分子、前述発現ベクター、前述組換え細胞、前述の融合タンパク質の調製方法により調製された成長ホルモン融合タンパク質、または前述薬物組成物の薬物の調製における使用を更に提供し、前記薬物は、成長ホルモン異常に関連する疾患の治療または予防に用いられる。

【0018】

第８の態様では、本発明は、被験者における成長ホルモン異常に関連する疾患を治療または予防するための方法を提供し、前記被験者に前述成長ホルモン融合タンパク質、前述核酸分子、前述発現ベクター、前述組換え細胞、前述融合タンパク質の調製方法により調製された成長ホルモン融合タンパク質、または前述薬物組成物を投与するステップを含む。

【0019】

第９の態様では、本発明は、成長ホルモン異常に関連する疾患を治療または予防するための使用の前述成長ホルモン融合タンパク質、前述核酸分子、前述発現ベクター、前述組換え細胞、前述融合タンパク質の調製方法により調製された成長ホルモン融合タンパク質、または前述薬物組成物を更に提供する。

【0020】

本発明の実施例によれば、前記成長ホルモン異常に関連する疾患は、小児成長ホルモン欠乏症、ターナー症候群、慢性腎不全による小人症、特発性小人症、成人成長ホルモン欠乏、短腸症候群、ＦＧＦＲ３突然変異の軟骨発育不全から選ばれる少なくとも１つを含む。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】本発明の実施例による融合タンパク質の構成模式図である。

【図2】本発明の成長ホルモン融合タンパク質の体内で動物の成長促進作用を示す。

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下、本発明の実施例を詳しく説明し、図面を参照して説明する実施例は例示的なものであり、本発明を解釈するために使用され、本発明を制限するためのものとして理解されるべきではない。

【0023】

本発明を説明する過程において、本明細書に係る用語を解釈及び説明し、これらの解釈と説明は手段を理解しやすくするためのものに過ぎず、本発明の保護手段を制限するためのものとして見なされるべきではない。

【0024】

特に明記されていない限り、本明細書で使用される「成長ホルモン」という用語は、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモンと同一もしくは一定の相同性を有するが、生物学的機能にマイナスの影響を受けないタンパク質（または「変異体」と呼ばれる）のことであり、当業者は、既知の天然のヒト成長ホルモンのアミノ酸配列と通常の遺伝子編集手段を組み合わせることにより、所望の定点突然変異を容易に得ることができる。

【0025】

特に明記されていない限り、本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、少なくとも２つのタンパク質またはポリペプチドが融合した新型タンパク質であり、通常、遺伝子工学等の技術によって上記の融合操作、例えばＤＮＡ組換え技術によって得られた２つの遺伝子が組換えられた発現産物を実現することができる。ここでは、成長ホルモンと二本鎖構造体のＦｃセグメントが融合した状態を指すが、説明する必要がある点として、成長ホルモン融合タンパク質はタンパク質のすべての部分が融合によって形成されることを意味するわけではなく、例えば、二本鎖構造体中の２つのＦｃセグメント部分がジスルフィド結合などの化学的結合によって連結される。

【0026】

特に明記されていない限り、本明細書で使用される「同一性」という用語は、通常の方法によって２つのタンパク質配列の間の同一性を決定することができ、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集（１９９５）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第１９章（ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇａｎｄＷｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮｅｗＹｏｒｋ）；及びＡＬＩＧＮプログラム（Ｄａｙｈｏｆｆ（１９７８）、ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ５：Ｓｕｐｐｌ．３（ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）を参照する。照合配列と測定配列の同一性について、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ等（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性照合アルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ等（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ等（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４の類似性検索方法、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズ（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３－１８７（１９９７）、及びＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＢＬＡＳＴＸアルゴリズ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０参照）を含む。これらのアルゴリズムを利用したコンピュータプログラムも入手可能であり、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア、またはＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．、２６６：４６０－４８０（１９９６））、またはＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴＡｌｔｓｃｈｕｌ、以上のＦＡＳＴＡとＴＦＡＳＴＡ（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｉｎｇＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ、バージョン８、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡで入手可能である）、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａに提供されたＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ等を含むが、これらに限定されない。

【0027】

特に明記されていない限り、本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、適切な宿主でＤＮＡの発現を可能にする適切な制御配列と操作可能に連結されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築体を指す。このような制御配列には、転写を実現するプロモーター、任意に選択可能に転写を制御する操作遺伝子配列、ｍＲＮＡ上の適切なリボソーム結合サイトをコードする配列、及び転写と翻訳終了を制御する配列が含まれてもよい。細胞種類によって異なる発現ベクターを使用することが好ましい。ここで使用するように、「宿主菌株」または「宿主細胞」とは、本発明のＤＮＡを含む発現ベクターに用いられる適切な宿主を指す。本明細書では、使用される「非哺乳細胞発現系」とは、哺乳動物細胞以外の宿主細胞を用いて発現する系であり、例えば、原核細胞または下等真核細胞などの微生物細胞である。

【0028】

本発明は、発明者が従来の成長ホルモン製剤について鋭意研究した結果、完成した。小児と成人の成長ホルモン欠乏（ＧＨＤ）は、外来の成長ホルモンを補充することで治療することができる。現在、商業化組換えヒト成長ホルモンには普通成長ホルモンと長寿命成長ホルモンがあり、普通成長ホルモンの体内半減期が短く、約２－３時間であり、注射後すぐに肝臓、腎臓で除去されるため、毎日皮下注射で投与する必要があり、患者に多くの苦痛を与えるとともに、長期的に体内に組換えヒト成長ホルモンを注射しても、少数の人の体内で抗体を生成し、治療効果に影響を及ぼす。長寿命成長ホルモンは普通成長ホルモンの体内半減期が短いという欠点を克服し、高い活性を保持すると同時に、人の体内半減期を大幅に延長させ、毎週またはより長い時間の皮下注射の投与を実現でき、患者の薬物依存性を大幅に改善する。

【0029】

組換えヒト成長ホルモンは組換えＤＮＡ技術によって生産され、そのアミノ酸配列は天然のヒト成長ホルモンと全く同じで、１９１個のアミノ酸からなるポリペプチド鎖であり、５３位と１６５位及び１８２位と１８９位の間に２対のジスルフィド結合を形成する。成長ホルモン分子の表面には、それぞれ結合サイト１と結合サイト２の２つの受容体結合サイトが存在し、血液循環中の成長ホルモンは目的の組織に到達した後、まず細胞膜上の１つの成長ホルモン受容体と結合し、それから、もう１つの成長ホルモン受容体と結合して、受容体ダイマー複合体（１つの成長ホルモン分子が２つの成長ホルモン受容体と結合する）を形成し、下流のＪＡＫ２信号経路を活性化し、これによって成長促進及びその他の機能作用を発揮する。

【0030】

下垂体由来のヒト成長ホルモンから組換えヒト成長ホルモン、さらに長寿命組換えヒト成長ホルモンまで、その発展は複数の異なる段階を経た。第１世代の成長ホルモンは下垂体から抽出した下垂体由来の成長ホルモンであり、その由来は制限され、純度が低く、ウイルスに汚染されやすく、長期の使用はウイルス感染リスクがある。第２世代の成長ホルモンはＧｅｎｅｎｔｅｃｈがＥ．ｃｏｌｉ封入体技術を用いて開発した１９２個のアミノ酸を含む組換えヒト成長ホルモンであり、タンパク質のＮ末端には開始メチオニンが含まれているため、抗体が生じやすく、長期的な使用は成長ホルモンの治療作用を大幅に低下させる。また、その製剤の粉針の形のため、調製の過程で凍結乾燥する必要があり、容易に凝集体を形成し、体内の成長促進作用に影響を及ぼす。

【0031】

近年の成長ホルモンは微小球、ヒアルロン酸、ＰＥＧ修飾等の長寿命製剤技術によって製造された長寿命組換えヒト成長ホルモン水針である。長寿命化の実現は、毎日投与するのではなく、週に１回投与することで、患者コンプライアンスを高める。製剤の水針の形も、粉針の悪い欠点を克服する。しかし、これらの製剤はいずれも新しい高分子化合物を導入しており、外因性高分子化合物の長期使用は、体内抗体の生成を引き起こしたり、または免疫原性などの副作用を引き起こしたりして、体内の薬効を低下させる。

【0032】

国内で発売された長寿命成長ホルモンは主にＰＥＧ化によってその半減期を延長し、長寿命の目的を達成する。しかし、ＰＥＧ化された組換えヒト成長ホルモンを成長ホルモン欠乏症にかかった小児に使用した場合、患児の体内のインスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）レベルは正常レベルに回復できなかったと報告されている。また、臨床前動物試験の過程で試験動物にＰＥＧ化されたタンパク質薬物を繰り返して投与すると、脂肪空胞病変を引き起こすことがわかった。

【0033】

ファイザー社のＳｏｍａｔｒｏｇｏｎは、新しい分子実体であり、天然のヒト成長ホルモン配列のＣ末端とＮ末端にそれぞれ２個と１個のヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）βサブユニット由来のＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）を融合させ、その半減期を延長させ、体内の長寿命化を実現する。ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋのＳｏｍａｐａｃｉｔａｎは組換えヒト成長ホルモンの１０１番目のロイシンをシステイン（Ｌ１０１Ｃ）に突然変異し、この突然変異システインに脂肪酸側鎖を連結させることで、体内の長寿命化を実現し、化学合成および／または化学修飾技術で成長ホルモンの長寿命化を実現すると同時に、体内に導入されて高分子生成物を合成し、または脂肪酸鎖を合成し、長期的な使用は体に悪影響を及ぼす可能性がある。

【0034】

また、発明者は、従来の発現系の多くは哺乳動物細胞であり、その発現グリコシル化ベクターは成長ホルモンの長寿命化を実現し、成長ホルモンとその受容体の作用の特殊性から、成長ホルモン－受容体ダイマー複合体を形成する必要があり、しかも、１つの成長ホルモン分子に２つの受容体分子を結合しなければ、体内生物学的効果を正常に発揮できず、異なる成長ホルモン－受容体ダイマー複合体構造が成長ホルモンの体内生物学的効果の程度に影響を及ぼし、成長ホルモンとその受容体が結合する立体障害が生じ、薬効が低下することを発見した。哺乳動物細胞はＦｃ融合タンパク質やポリペプチドの調製に実用性を実現し、臨床治療の薬物に対する需要を大きく満たすが、その特点は調製プロセスが煩雑で、調製周期が長く、調製コストが高く、プロセスの拡大が困難であり、糖型の差異や電荷異性体が生じやすいことである。これにより、発明者は、大腸菌などの微生物発現系、例えば原核発現系または下等真核発現系を提案し、大腸菌は発現産物が均一で、無グリコシル化修飾で、糖型の差異及び電荷異性体が存在しなく、且つ発酵周期が短く、コストが低い顕著な利点を有するため、特に無グリコシル化に求められる組換えタンパク質の生産に特に適用する。

【0035】

発明者は、鋭意研究した結果、従来の成長ホルモンと比較して、純度がより高く、薬効がより良く、副作用がより低く、より安全で、品質がより容易に制御され、コストがより低い天然担体を含む長寿命成長ホルモン製剤を提案し、同時に、成長ホルモンとその受容体の作用原理に合わせて構造設計を行い、大腸菌発現システムを用いて長寿命成長ホルモンを生産し、患者のこの製品に対する需要を満たす。これにより、天然担体を用いてその長寿命化を実現し、遺伝子工学的発現を完全に実現でき、調製コストが顕著に削減された新しい長寿命成長ホルモン調製技術を採用することができ、調製された成長ホルモンは純度が高く、活性（力価）が高く、薬効がよいという特点があり、他の長寿命成長ホルモンに比べ、特に高活性、低コストという顕著な優位性がある。

【0036】

これにより、第１の態様では、本発明は、成長ホルモン融合タンパク質を提供し、本発明の実施例によれば、第１の定常領域Ｆｃセグメントと第２の定常領域Ｆｃセグメントを有する二本鎖構造体と、前記二本鎖構造体の前記第１の定常領域Ｆｃセグメントに連結される成長ホルモンと、を含み、前記成長ホルモンのＮ末端にメチオニンを有さなく、前記成長ホルモン融合タンパク質は非哺乳細胞の発現系によって発現される。

【0037】

本発明の実施例によれば、成長ホルモンと二本鎖構造体を融合することによって、成長ホルモンの体内の半減期を延長することができ、また、各二本鎖構造体に１つの成長ホルモンしか担持しないため、成長ホルモンの活性サイトが立体障害の影響を受けないため、その活性がより強くなり、また成長ホルモンのＮ末端にメチオニンを有さないため、安全性がより高い。

【0038】

ここでの二本鎖構造体は第１の単量体と第２の単量体を含み、第１の単量体は第１の定常領域Ｆｃセグメントを有し、第２の単量体は第２の定常領域Ｆｃセグメントを有し、第１の定常領域Ｆｃセグメントに成長ホルモンが連結され、具体的に、第１の単量体の構造はｈＧＨ－ｌｉｎｋｅｒ－ＣＨ２－ＣＨ３であり、第２の単量体の構造はＣＨ２－ＣＨ３であり、且つ第１の単量体と第２の単量体とはジスルフィド結合によって連結される。本発明による二本鎖構造体では、定常領域ＦｃセグメントにはヒトＩｇＧ４Ｆｃを採用し、天然のヒトＩｇＧ４ＦｃのＣＨ２、ＣＨ３の部分配列に対してアミノ酸配列の突然変異を行い、独立して設計された剛性Ｌｉｎｋｅｒ配列によって第１の単量体と第２の単量体を形成する。本発明における二本鎖構造体のＦｃセグメントにヒトＩｇＧ４ＦｃのＣＨ２、ＣＨ３の部分配列を採用するのは、ＩｇＧ４Ｆｃが体内補体を介したＣＤＣ効果とＮＫ細胞を介したＡＤＣＣ効果を起こさないことを考慮したためであり、天然のヒトＩｇＧ４Ｆｃヒンジ領域をＬｉｎｋｅｒとして採用せず、独自設計のＬｉｎｋｅｒを採用したのは、ＩｇＧ４分子が体内でＦａｂ－ａｒｍ交換の過程を経る可能性を回避し、ＩｇＧ４Ｆｃによる成長ホルモンの立体障害を回避するためである。

【0039】

本発明の実施例によれば、前記成長ホルモン融合タンパク質はグリコシル化修飾を受けていない。これにより、糖型の差異による免疫原性リスクを回避することができ、また、成長ホルモン融合タンパク質はグリコシル化修飾を受けていないため、調製時に、糖型の差異による品質制御が困難であることを考慮する必要がなく、調製や品質制御の面でより有利である。

【0040】

グリコシル化修飾は主に哺乳細胞が発現するタンパク質で発生し、大腸菌自体はグリコシル化作用がないため、当然、その発現するタンパク質はグリコシル化修飾がない。正しいグリコシル化修飾タンパク質は人体の天然タンパク質に近いが、ＣＨＯ細胞などの哺乳細胞、中国ハムスター卵巣細胞（ＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒＯｖａｒｙ）の略称は、非ヒト哺乳動物細胞系であり、発現糖型は人体内の天然タンパク質糖型と異なり、免疫反応などの副作用を引き起こす可能性がある。大腸菌を用いてグリコシル化修飾を受けていないタンパク質を発現させることにより、グリコシル化による副反応を避けることができる。グリコシル化を受けていないＦｃと成長ホルモンとの融合を採用することにより、成長ホルモンの体内の長寿命化を良く実現し、成長ホルモン活性にも影響を与えず、グリコシル化によって上記作用を実現する必要がない。

【0041】

本発明の実施例によれば、前記非哺乳細胞発現系は原核発現系と下等真核発現系のいずれか一方を少なくとも含み、好ましくは、前記非哺乳細胞発現系は大腸菌発現系と酵母発現系のいずれか一方を少なくとも含む。例えば、前記非哺乳細胞発現系は原核発現系と下等真核発現系の少なくとも１つを含む。好ましくは、前記非哺乳細胞発現系は大腸菌発現系、酵母発現系の少なくとも１つを少なくとも含む。本発明の実施例によれば、原核発現系と下等真核発現系の少なくとも１つを採用することにより、その投資が相対的に少なく、培養コストが低く、操作しやすく、培養時間が短く且つ高密度発酵の発現系を実現でき、例えば大腸菌、その品質の均一さがより良く、より容易に制御され、且つ発明者が、意外にも原核発現系と下等真核発現系の少なくとも１つは目的のタンパク質のグリコシル化が発生しなく、糖型の差異による免疫原性リスク、及び無糖型の差異及び電荷異性体による品質制御が困難になる可能性がある問題を回避し、同時に、これらの発現系は無動物源性培地を採用し、その安全性がより高い。

【0042】

本発明の実施例によれば、前記成長ホルモンは以下のアミノ酸配列の１つを有し、
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるアミノ酸配列、
Ｘ_１ＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＸ_２ＲＳＶＥＧＳＸ_３ＧＦ、
Ｘ_１はＧ、ＡまたはＳを示し、
Ｘ_２はＧ、Ａ、Ｓ、Ｃまたは欠落を示し、
Ｘ_３はＧ、Ａ、Ｓ、Ｃまたは欠落を示し、
または
（ｂ）は（ａ）と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性のアミノ酸配列を有し、例えば、（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性のアミノ酸配列を有し、前提として、Ｘ_１はＧ、ＡまたはＳを示し、Ｘ_２はＧ、Ａ、Ｓ、Ｃまたは欠落を示し、且つＸ_３はＧ、Ａ、Ｓ、Ｃまたは欠落を示す。

【0043】

野生型成長ホルモンのＮ末端にメチオニンが含まれるため、長期的に使用すると、体内で抗体が生じ、治療効果に影響を及ぼす。Ｎ末端にＭを含まない成長ホルモンを形成するために、Ｎ末端にアミノ酸Ｘ_１（Ｇ、ＡまたはＳ）を加え、このように、発現後、タンパク質のＮ末端にＭがないことが言うまでもない。Ｎ末端に新しいアミノ酸を加えないと、配列に示すような１番目のアミノ酸がＦである場合、発現後にＮ末端にまたＭが存在する。

【0044】

本発明において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるアミノ酸配列の中でＸ_１はＧ、ＡまたはＳを示す前提で、当業者は、Ｘ_２とＸ_３非成長ホルモンの活性中心により、Ｘ_２、Ｘ_３はそれぞれ独立してアミノ酸の置換及び欠落を行うことができ、例えばＸ_２、Ｘ_３はそれぞれ独立してＧ、Ａ、Ｓ、Ｃまたは欠落を示すことができることを理解することができる。Ｘ_２とＸ_３位置でのアミノ酸の置換または欠落は、全体的な成長ホルモン活性に影響を与えないが、一方で、体外で組み立てる過程でジスルフィド結合ミスマッチを回避し、不正確な配座を形成するタンパク質、成長ホルモンの体内活性に影響を与え、及び誤った配座タンパク質の形成に起因する可能性のある体内免疫反応を避ける。

【0045】

本発明によるＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンが含まず、Ｎ末端メチオアンモニアＭによる副作用を起こさない。且つ天然のヒト成長ホルモンよりも、Ｎ末端Ｘ_１アミノ酸は成長ホルモンの空間的構造及び生物活性に影響を与えない。

【0046】

本発明の実施例によれば、一端が前記成長ホルモンに連結され、他端が前記二本鎖構造体に連結される連結ペプチドをさらに含み、前記連結ペプチドは少なくとも１つの配列単位ＧＸａａ_１ＰＸａａ_２を含み、各前記配列単位の中で、各Ｘａａ_１はそれぞれ独立してＡ、Ｅ及びＫのいずれかを示し、各Ｘａａ_２はそれぞれ独立してＱとＮのいずれかを示す。本発明の実施例によれば、各前記配列単位の中で、各Ｘａａ_１はそれぞれ独立してＡ、Ｅ及びＫの少なくとも１つを示し、各Ｘａａ_２はそれぞれ独立してＱとＮの少なくとも１つを示す。

【0047】

本発明の実施例によれば、前記連結ペプチドは前記配列単位を１～２０個、好ましくは１～５個、より好ましくは３個含む。本発明の実施例によれば、前記成長ホルモンのＣ末端は前記連結ペプチドに連結される。従来の連結ペプチドと比べて、本発明の実施例による連結ペプチドはＧおよび／またはＡおよび／またはＰおよび／またはＱおよび／またはＫおよび／またはＥおよび／またはＮアミノ酸を豊富に含む小さなペプチド単位及びその単位の直列体であり、このような連結ペプチドは柔軟性がなく、より剛性のある構造であり、成長ホルモン活性サイトへの干渉を回避し、これにより、最終的に得られた融合タンパク質の生物活性をより向上することができる。

【0048】

発明者は、前記連結ペプチドは可撓性ジョイントである場合、通常の（Ｇ_ｍＳ_ｎ）ｘ構造のように、ｍは１－４、ｎは０－４、ｘは１－２０の間の整数であり、該構造は柔軟性が高く、該構造と融合した２つのタンパク質空間的構造に「遮蔽」が起こりやすく、立体障害が生じ、これにより、目的のタンパク質活性に影響を及ぼすことを発見した。一方で、本発明における成長ホルモンの活性サイトはＣ端に近い領域に存在し、Ｌｉｎｋｅｒの設計が悪いと、ＦｃのＮ末端が成長ホルモンのＣ端に近い領域の活性サイトに影響を及ぼし、立体障害を形成する。剛性構造Ｌｉｎｋｅｒは剛性を持っているため、融合した２つのタンパク質は、それぞれ独立して自分の空間配座を保つことができ、空間の「遮蔽」現象が生じない。そこで、本発明では、特定の剛性ジョイントを採用し、ＦｃのＮ末端が成長ホルモンのＣ端に近い領域の活性サイトに与える影響を避けることができる。

【0049】

成長ホルモン活性サイトへの干渉の原因は以下の通りである。（１）ｌｉｎｋｅｒの長さ。ｌｉｎｋｅｒが長いほど、ｌｉｎｋｅｒ自体及びＦｃの両方は成長ホルモンの活性サイトに影響を及ぼす可能性があり、特に本発明における成長ホルモンの１つの活性サイトがＣ端に近い領域にあり、その後にｌｉｎｋｅｒであり、その後に融合した他のタンパク質（Ｆｃセグメント）であり、空間的構造が近く、影響を及ぼす可能性がある。Ｌｉｎｋｅｒも短くしてはいけなく、そうでないと、立体障害が発生する。発明者は、本発明の上記長さのｌｉｎｋｅｒを採用すると、成長ホルモン活性サイトに干渉を与えなく、成長ホルモンの活性に影響を与えないことを発見した。（２）ｌｉｎｋｅｒの構造。発明者は、ｌｉｎｋｅｒ構造は柔軟性が強すぎて、融合した２つのタンパク質が空間で「揺れ」やすく、互いにそれぞれの配座に影響を与え、または立体障害を形成し、タンパク質とその受容体との結合に影響を与え、タンパク質の体内生物学作用（本発明はｈＧＨ／ＧＨＲ受容体複合体を形成し、下流へシグナル伝達を行い、体内のＩＧＦ－１レベルの変化を引き起こし、成長を促進する）に影響を与えるため、本発明は剛性Ｌｉｎｋｅｒを選択することにより、Ｌｉｎｋｅｒ前後の２つのタンパク質の空間的位置を「ほぼ固定」することができ、Ｌｉｎｋｅｒ前後の２つのタンパク質の空間的構造がそれぞれ独立して存在し、互いの配座に影響を与えたり、立体障害を形成したりしなく、成長ホルモンとその受容体の結合を阻止したり、及び体内生物学的効果の発揮に影響を与えたりしないことを発見した。

【0050】

本発明の実施例によれば、前記第１の定常領域Ｆｃセグメントと前記第２の定常領域Ｆｃセグメントは異なるアミノ酸配列を有する。これにより、融合タンパク質がホモダイマーを形成することを避ける。本発明の実施例によれば、前記第１の定常領域Ｆｃセグメントと前記第２の定常領域Ｆｃセグメントは体外でイソダイマーを形成するのに適している。本発明の実施例によれば、前記第１の定常領域Ｆｃセグメントと前記第２の定常領域Ｆｃセグメントはそれぞれ独立してＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるアミノ酸配列：ＳＫＹＧＰＰＸ_４ＰＰＸ_５ＰＡＰＸ_６ＡＸ_７ＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＸ_８ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＸ_９ＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＸ_１０ＣＸ_１１ＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＸ_１２ＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＸ_１３ＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫを有する。
ここで、
Ｘ_４はＲ、Ｋ、Ｄ、ＥまたはＣを示し、
Ｘ_５はＲ、Ｋ、Ｄ、ＥまたはＣを示し、
Ｘ_６はＲ、Ｋ、Ｄ、Ｅまたは欠落を示し、
Ｘ_７はＡ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅまたは欠落を示し、
Ｘ_８はＤ、Ｅ、Ｇ、ＱまたはＮを示し、
Ｘ_９はＤ、Ｅ、Ｇ、ＱまたはＮを示し、
Ｘ_１０はＧ、ＳまたはＷを示し、
Ｘ_１１はＡ、Ｇ、ＰまたはＬを示し、
Ｘ_１２はＤ、Ｅ、Ｇ、ＱまたはＮを示し、
Ｘ_１３はＩ、Ｐ、ＶまたはＹを示す。

【0051】

本発明の実施例によれば、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６及びＸ_７のうちの少なくとも１つはＫまたはＥまたはＣである。

【0052】

本発明の実施例によれば、前記第１の定常領域Ｆｃセグメントでは、
Ｘ_４はＣを示し、
Ｘ_５はＣを示し、
Ｘ_６はＫを示し、
Ｘ_７はＥを示し、
Ｘ_８はＮを示し、
Ｘ_９はＮを示し、
Ｘ_１０はＷを示し、
Ｘ_１１はＬを示し、
Ｘ_１２はＮを示し、
Ｘ_１３はＹを示す。

【0053】

本発明の実施例によれば、前記第２の定常領域Ｆｃセグメントでは、
Ｘ_４はＣを示し、
Ｘ_５はＣを示し、
Ｘ_６はＥを示し、
Ｘ_７はＫを示し、
Ｘ_８はＱを示し、
Ｘ_９はＱを示し、
Ｘ_１０はＳを示し、
Ｘ_１１はＡを示し、
Ｘ_１２はＱを示し、
Ｘ_１３はＶを示す。

【0054】

これにより、融合タンパク質が体外でイソダイマーを形成する効率を更に向上させ、ホモダイマーの形成を避け、生産効率を向上させ、生産コストを削減させる。

【0055】

本発明の実施例によれば、本発明はＩｇＧ４Ｆｃを開始配列として用いるのは、ＩｇＧ４分子が体内補体を介したＣＤＣ効果とＮＫ細胞を介したＡＤＣＣ効果を持たないため、ＩｇＧ機能効果による成長ホルモン受容体細胞への攻撃を回避し、安全性があると同時に、Ｆｃによって長寿命化を実現できるからである。

【0056】

本発明の実施例によれば、ＩｇＧ４Ｆｃをオリジナル配列として用い、本発明の発明者は一連の改造措置によって、Ｆｃの変異体を取得し、意外にもホモダイマーの形成を効果的に回避できることを発見した。発明者の分析の結果、改造後のＦｃセグメントの電荷分布はイソダイマーの形成に寄与すると同時に、構造もより安定であり、製剤の長期保存中の多量体の形成（より安定である）を効果的に回避でき、且つ改造後のＦｃセグメントの三次元構造もイソダイマーの形成に有利であり、目的分子中の第１の変異体定常領域Ｆｃと第２の変異体定常領域Ｆｃとの安定した結合を実現する。また、改造後のＦｃセグメントでは、タンパク質の翻訳後修飾を避けるため、目的サイトのアミノ酸突然変異を行った。翻訳後修飾（例えば脱アミド化、酸化、異性化等）はタンパク質発現後のよく見られる修飾過程であり、タンパク質とポリペプチド系薬物に普遍的に存在し、タンパク質等の生物製品の品質に深刻な影響を及ぼし、予測しにくい薬物の臨床副作用を引き起こす。その中で、脱アミド化は最もよく見られるタンパク質翻訳後修飾形式である。目的分子タンパク質の翻訳後修飾、特に脱アミド化の発生を避けるために、本発明の実施例によれば、発明者はＨＰＬＣ液相図によって本発明の融合タンパク質に修飾体の発生がないことを証明する。

【0057】

本発明の実施例によれば、本発明の融合タンパク質は天然のｈＧＨ／ＧＨＲ作用メカニズムを利用して、体内のより有効な作用、より低い投与量を実現することができる。体内で成長ホルモンとその受容体が結合するには、まず、成長ホルモンサイト１との受容体が結合して、成長ホルモン／受容体複合体を形成し、受容体複合体がさらに別の成長ホルモン受容体と結合して、成長ホルモン／受容体ダイマー複合体を形成し、さらに下流のＪＡＫ２信号経路を活性化して、成長を促進し、他の機能作用を発揮する。成長ホルモン／受容体ダイマー複合体の形成は、体内の作用を発揮する鍵である。本発明の実施例による融合タンパク質は成長ホルモン－受容体（ｈＧＨ／ＧＨＲ）の結合過程において生じる可能性がある立体障害効果を十分に考慮しており、長寿命担体（Ｆｃ）が生じる可能性がある立体障害、成長ホルモン自体及び連結ペプチドが生じる可能性がある立体障害を含む。本発明の実施例によれば、融合タンパク質構造の担体分子、連結ペプチド及び効果分子はいずれも立体障害効果が生じる可能性があり、効果分子効果機能の正常な発揮を及ぼす可能性があり、その中で、立体障害が生じる可能性がある主な影響要素の一つである連結ペプチド配列は、効果分子の受容体結合領域及び位置と関連し、融合タンパク質構造の異なる分子（担体と効果分子）が互いに影響を与えず、長寿命を実現すると同時に、分子効果が影響（長寿命、有効）を受けず、融合分子間の立体障害を効果的に低下するために、成長ホルモン分子の受容体結合サイトを十分に露出し、長寿命を実現すると同時に、体内生物活性（効果）を最大化にする。

【0058】

本発明の実施例によれば、上記融合タンパク質は原核細胞や下等真核細胞などの非哺乳動物細胞を用いる微生物発現系である。これにより、品質を制御しやすくなり、同時に、調製コストが大幅に低くなる。原核発現系発現産物は目的タンパク質のグリコシル化が発生しなく、糖型の差異による免疫原性リスク、及び無糖型の差異及び電荷異性体による品質制御が困難になる可能性がある問題を回避し、同時に、原核系の培養には無動物源性培地を採用し、その安全性がより高く、及び低コスト調製の優位として周知である。

【0059】

本発明の実施例によれば、体外細胞レベルの実験により、本発明の高活性組換え長寿命ヒト成長ホルモン融合タンパク質は体外結合活性及び生物学的活性が、販売されている長寿命ヒト成長ホルモンより顕著に高いことが示された。動物の体内試験によると、本発明の高活性組換え長寿命ヒト成長ホルモン融合タンパク質は体内薬効が販売されている長寿命ヒト成長ホルモンより顕著に高く、良好な体内ＰＫレベルを有することが示された。成長促進試験によると、普通のヒト成長ホルモン及び販売されている長寿命ヒト成長ホルモンよりも、本発明の組換えヒト成長ホルモン融合タンパク質の成長促進作用が顕著であることが示された。また、体外ＦｃＲｎ結合実験によると、活性は人体の天然ＩｇＧ４Ｆｃ効果と同じで、その体内でより長い半減期を持つ可能性があり、１週またはそれ以上の時間に１回投与することを実現でき、投与頻度を大幅に減少させ、患者のコンプライアンスを増加させることができることが示された。体外細胞検査による高活性組換え長寿命ヒト成長ホルモン融合タンパク質とＧＨＲ結合活性は、両方が設計の期待通りの結合特性を有し、高活性組換え長寿命ヒト成長ホルモン融合タンパク質は小さな立体障害を有することが示された。

【0060】

第２の態様では、本発明は核酸分子をさらに提供し、本発明の実施例によれば、前記核酸分子は第１の態様に記載の成長ホルモン融合タンパク質をコードする。該核酸分子を利用することで上記融合タンパク質を発現するために効果的に用いられることができ、特に原核生物や下等真核生物の発現系では上記成長ホルモンの単量体を効果的に発現することができ、さらに体外で組み立てることで最終的な成長ホルモン融合タンパク質を形成することができる。なお、ここでの核酸分子は上記融合タンパク質のすべての配列をコードする必要がなく、２種類の核酸分子を含んでもよく、それぞれ２つの単量体をコードし、さらに体外で組み立てることでイソダイマーを取得すればよい。例えば、前記第１の単量体は第１の定常領域Ｆｃセグメントを有し、前記第２の単量体は第２の定常領域Ｆｃセグメントを有し、前記第１の定常領域Ｆｃセグメントに成長ホルモンが連結される。

【0061】

第３の態様では、本発明は発現ベクターを更に提供し、前記発現ベクターは第２の態様に記載の核酸分子を担持する。該発現ベクターを利用することで、細胞内で上記融合タンパク質を効果的に発現することができ、特に原核生物や下等真核生物の発現系では上記成長ホルモンの単量体を効果的に発現することができ、さらに体外で組み立てることで最終的な成長ホルモン融合タンパク質を形成することができる。

【0062】

【0063】

【0064】

これにより、前述の成長ホルモン融合タンパク質を効果的に調製することができる。

【0065】

本発明の実施例は、非哺乳動物細胞を用いて上記単量体の発現を行うことができ、哺乳動物細胞発現系例えばＣＨＯに比べて、ＣＨＯ細胞は長寿命成長ホルモンを発現し、ホモダイマー産物を発現すると、発現タンパク質分子が均一で、品質が良く、純度が高い。しかし、イソダイマー産物を発現すると、大きな問題があり、その中で最も大きな問題は、発現産物が不均一で、目的産物の純度が低く、最も主な不純物であるイソダイマーを形成する２つの単量体からなるそれぞれのホモダイマーは、目的イソダイマーと２つの単量体のホモダイマーの性質が近いため、発現産物から除去することが困難であることである。またＣＨＯ発現系を採用すると、培地成分が複雑であり、培養コストが高く、ウイルス汚染リスクが大きく、培養時間が長く、制御過程が複雑であり、染菌リスクが大きく、しかも、ＣＨＯ細胞反応器は原核細胞反応器よりも投資が莫大であり、または使い捨て生物反応器を採用すると、コストが高く、投資が大きい。

【0066】

本発明の実施例によれば、投資が相対的に少なく、培養コストが低く、操作しやすく、培養時間が短く、且つ高密度発酵を実現できる微生物発現系、例えば大腸菌発現系（コストがより低く、品質の均一さがより良く、制御しやすくなる）を採用し、合成した高分子化学物質を長寿命担体として使用せず、且つ体外カップリングも不要である。体外で組み立てることによって、タンパク質の精製過程でイソダイマーに自動的に組み立てられるが、且つ発明者は意外にもイソダイマーの組み立て過程で、ＣＨＯ細胞の発現過程で発生するイソダイマーを構成する２つの単量体からなるそれぞれのホモダイマーがないことを発見した。本発明の第１の単量体と第２の単量体の体外の組み立ては当該技術分野で知られている体外の組み立て方法によって実現されてもよく、または本発明の後述する具体的な実施例に記載する方法によって実現されてもよい。大腸菌を培養した後、発現を誘導し、細胞を破砕することにより、封入体を収穫する。簡単な精製により、高純度のイソダイマー構造の目的産物を得ることができる。

【0067】

第６の態様では、本発明は第１の態様に記載の成長ホルモン融合タンパク質を含む薬物組成物を更に提供する。

【0068】

本発明のいくつかの実施例によれば、前記薬物組成物は、第１の態様に記載の成長ホルモン融合タンパク質、及び薬学的に許容できる賦形剤を含む。

【0069】

第７の態様では、本発明は、前述成長ホルモン融合タンパク質、前述核酸分子、前述発現ベクター、前述組換え細胞、前述融合タンパク質の調製方法により調製された成長ホルモン融合タンパク質、または前述薬物組成物の薬物調製における使用を更に提供し、前記薬物は、成長ホルモン異常に関連する疾患を治療または予防するために使用される。

【0070】

第８の態様では、本発明は、被験者における成長ホルモン異常に関連する疾患を治療または予防するための方法を更に提供し、前記被験者に前述成長ホルモン融合タンパク質、前述核酸分子、前述発現ベクター、前述組換え細胞、前述融合タンパク質の調製方法により調製された成長ホルモン融合タンパク質、または前述薬物組成物を投与するステップを含む。

【0071】

【0072】

【0073】

本発明において、特に説明しない限り、「ｒｈＧＨ」、「成長ホルモン」、「ｈＧＨ」、「ヒト成長ホルモン」という用語は、交換可能に使用される。

【0074】

以下、実施例を組み合わせて本発明の手段を解釈する。当業者は、以下の実施例が本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではないことを理解することができる。実施例に具体的な技術または条件が示されない場合、当該分野の文献に記載されている技術または条件に従って、または製品の明細書に従って実行する必要がある。用いられる試薬または機器にメーカーが示されない場合、市販によって購入できる従来の製品である。

【0075】

以下、実施例によって本発明の具体的なステップを詳細に説明するが、実施例によって制限されない。

【0076】

実施例１：ｒｈＧＨ－Ｆｃ／Ｆｃ発現ベクターの設計及び構築

【0077】

１．１目的遺伝子設計及び合成
目的タンパク質アミノ酸配列に従って、目的遺伝子ヌクレオチド配列を設計し、大腸菌嗜好コドンに基づいて最適化し、そのヌクレオチド配列、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：３（第１の変異体）、ＳＥＱＩＤＮＯ：４（第２の変異体）を決定する。設計配列は宝生物工学（大連）有限公司に合成を依頼する。

【0078】

ＳＥＱＩＤＮＯ：３で示されるヌクレオチド配列は以下の通りである。
ＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＣＣＡＴＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＣＧＴＣＴＧＴＴＣＧＡＣＡＡＣＧＣＴＡＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣＴＣＡＣＣＧＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＡＣＣＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＣＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＣＡＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＣＧＡＣＣＣＣＧＴＣＴＡＡＣＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＴＣＴＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＣＧＴＡＴＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＣＴＴＧＧＣＴＧＧＡＡＣＣＧＧＴＴＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＧＴＴＣＴＧＴＴＴＴＣＧＣＴＡＡＣＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＡＣＧＧＴＧＣＴＴＣＴＧＡＣＴＣＴＡＡＣＧＴＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＧＴＡＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＴＣＧＴＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＴＴＣＴＣＣＧＣＧＴＡＣＣＧＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＡＣＡＧＡＣＣＴＡＣＴＣＴＡＡＡＴＴＣＧＡＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＣＧＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＣＧＧＴＣＴＧＣＴＧＴＡＣＴＧＣＴＴＣＣＧＴＡＡＡＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＣＣＴＴＣＣＴＧＣＧＴＡＴＣＧＴＴＣＡＧＴＧＣＣＧＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＴＣＴＴＧＣＧＧＴＴＴＣＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＡＧＧＧＴＧＣＴＣＣＡＣＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＡＡＧＣＡＡＡＴＡＣＧＧＣＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＡＣＣＧＡＡＧＧＣＴＧＡＡＧＧＣＧＧＴＣＣＧＴＣＴＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＴＴＣＣＧＣＣＧＡＡＡＣＣＧＡＡＡＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＴＡＧＴＣＧＴＡＣＣＣＣＧＧＡＡＧＴＴＡＣＣＴＧＣＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＡＣＧＴＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＴＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＴＧＡＣＧＧＣＧＴＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＡＡＣＧＣＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＧＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＧＣＧＴＴＧＴＴＡＧＣＧＴＡＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＡＴＧＣＡＡＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＧＣＣＧＡＧＣＡＧＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＣＧＣＧＡＡＣＣＧＣＡＡＧＴＴＴＡＴＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＣＧＴＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＡＡＴＧＡＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＴＴＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＧＡＧＣＧＡＴＡＴＣＧＣＡＧＴＴＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＴＡＡＣＧＧＴＣＡＡＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＴＡＡＡＡＣＣＡＣＣＣＣＧＣＣＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＧＣＧＡＣＧＧＴＡＧＣＴＴＴＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＴＣＧＴＣＴＧＡＣＣＧＴＴＧＡＴＡＡＡＡＧＣＣＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＣＧＴＴＴＴＴＡＧＣＴＧＴＡＧＣＧＴＣＡＴＧＣＡＣＧＡＡＧＣＣＣＴＧＣＡＴＡＡＣＣＡＴＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣ
ＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるヌクレオチド配列は以下の通りである。
ＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＡＡＡＴＡＣＧＧＣＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＡＣＣＧＧＡＧＧＣＴＡＡＡＧＧＴＧＧＴＣＣＧＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣＧＡＡＡＣＣＧＡＡＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＴＴＣＴＣＧＴＡＣＴＣＣＧＧＡＧＧＴＡＡＣＴＴＧＣＧＴＡＧＴＡＧＴＴＧＡＴＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＴＧＡＣＧＧＴＧＴＴＧＡＧＧＴＴＣＡＴＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＴＡＡＡＣＣＡＣＧＴＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＧＣＡＣＣＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＡＡＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＴＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＡＴＧＴＡＡＡＧＴＡＡＧＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＧＣＣＧＡＧＣＡＧＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＡＧＧＣＴＡＡＡＧＧＴＣＡＡＣＣＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＴＣＡＧＧＴＧＴＣＴＣＴＧＡＧＴＴＧＴＧＣＡＧＴＴＡＡＧＧＧＴＴＴＣＴＡＣＣＣＧＡＧＣＧＡＴＡＴＴＧＣＧＧＴＡＧＡＡＴＧＧＧＡＡＴＣＴＣＡＡＧＧＴＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＴＡＡＧＡＣＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＧＴＴＣＴＧＧＡＴＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＣＣＧＴＣＴＧＡＣＣＧＴＴＧＡＣＡＡＡＴＣＣＣＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＧＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣ
ＳＥＱＩＤＮＯ：３（第１の変異体）がコードするアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：５で示される。
ＳＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦＧＡＰＱＧＡＰＱＧＡＰＱＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＫＡＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
ＳＥＱＩＤＮＯ：４（第２の変異体）がコードするアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６で示される。
ＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＫＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＱＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＱＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ

【0079】

１．２発現ベクターの構築
目的遺伝子の両端にはそれぞれＸｂａＩとＢａｍＨＩ酵素切断サイトがあり、それぞれＸｂａＩとＢａｍＨＩ二酵素切断目的遺伝子配列及びｐＥＴ－２８ａ（＋）担体を用いて、ガムを切断して回収し、酵素切断後の目的遺伝子断片とｐＥＴ－２８ａ（＋）酵素切断後の長い断片を連結し、変換、スクリーニングし、目的遺伝子を発現する遺伝子工学菌を取得する。

【0080】

実施例２：ｒｈＧＨ－Ｆｃ／Ｆｃタンパク質の発現及び精製
目的遺伝子工学菌をＬＢ培地の入った薬剤瓶に投入して培養し、ＯＤ６００が１．６－２．０に達するまで、５Ｌ発酵槽に移して培養し、開始培養体積が２．５Ｌで、培養温度が３７℃で、攪拌回転数が６００ｒｐｍであり、ＯＤ６００が５０に上昇するまで誘導を開始し、誘導剤がＩＰＴＧであり、濃度が０．５ｍＭであり、誘導時間が４－６ｈである。

【0081】

発酵液の菌体の成長を鏡検査し、発現状況を観察した。１００００ｒｐｍ、４℃で遠心分離により菌体を収集する。

【0082】

菌体を収集して高圧ホモジナイザーで破砕し、破砕圧力が７００－８００Ｂａｒであり、完全な細胞が存在しないのを鏡検査するまで少なくとも２つの循環を行う。遠心分離により封入体を収集する。

【0083】

体外の組み立て：まず、第１の変異体及び第２の変異体の封入体タンパク質を同じ８Ｍ尿素を含む封入体溶解Ｂｕｆｆｅｒにそれぞれ溶解し、すべてが溶解した後、両者が１：１の体積比で混合し、封入体溶解液を取得し、封入体溶解液を均一に混合した後に１：１０－１：１００の体積比で組み立て緩衝液に加え、一晩静置して放置する。その中で封入体溶解Ｂｕｆｆｅｒは以下の成分を含み、ＴｒｉｓまたはＴｒｉｓ－ＨＣｌ、濃度５０－１００ｍＭ、ＮａＣｌ、濃度１００－１５０ｍＭ、アルギニン、濃度１０－５０ｍＭ、ＥＤＴＡ、濃度５－２０ｍＭ、ｐＨ値６．０－８．０であり、上記組み立て緩衝液は以下の成分を含み、ＴｒｉｓまたはＴｒｉｓ－ＨＣｌ、濃度１０－２０ｍＭ、ＮａＣｌ、濃度１０－５０ｍＭ、アルギニン、濃度１００－５００ｍＭ、ＧＳＳＧ、濃度１０－２０ｍＭ、ＧＳＨ、濃度０－５ｍＭ、ＥＤＴＡ、濃度５－１０ｍＭ、ＢｕｆｆｅｒｐＨ値５．０－７．０である。

【0084】

タンパク質の精製：一晩静置して混合液を１．０Ｍの塩酸でｐＨ値を３．０－３．５に調整し、ｐｒｏｔｅｉｎＡクロマトグラフィーを行い、溶離液のｐＨ値を６．０－７．０に調整し、それぞれ疎水クロマトグラフィー、陰イオンクロマトグラフィーを行い、精製後の目的タンパク質を得た。ＰｒｏｔｅｉｎＡクロマトグラフィー条件：平衡緩衝液：２０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０、洗脱緩衝液：０．１Ｍｇｌｙｃｉｎｅ、ｐＨ３．０、中和緩衝液：１ＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．５とする。疎水クロマトグラフィー条件は、平衡緩衝液：１０－３０ｍＭＴｒｉｓまたはＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．５－１．０ＭＮａＣｌ、ｐＨ６．０－７．０とする。洗脱緩衝液：１０－３０ｍＭＴｒｉｓまたはＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．０－７．０とする。陰イオンクロマトグラフィー条件：平衡緩衝液：１０－３０ｍＭＴｒｉｓまたはＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．０－７．０とする。洗脱緩衝液：１０－３０ｍＭＴｒｉｓまたはＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．５－１．０ＭＮａＣｌ、ｐＨ６．０－７．０とする。

【0085】

実施例３：細胞生物学的活性に対するｒｈＧＨ－Ｆｃ／Ｆｃタンパク質における剛性ジョイントと柔軟性ジョイントの影響

【0086】

実施例１のＳＥＱＩＤＮＯ：５における剛性ジョイント－（ＧＡＰＱ）_３－を柔軟性ジョイント－（ＧＧＧＧＳ）_４－に置き換え、実施例２と同様して柔軟性ジョイントを含む成長ホルモン融合タンパク質（サンプル名称ＧＨ（ＧＧＧＧＳ）_４）を取得し、実施例２で得られたｒｈＧＨ－Ｆｃ／Ｆｃタンパク質（サンプル名称ＧＨ（ＧＡＰＱ）_３）と生物学的活性を比較する。

【0087】

生物学的活性の検出過程：対数成長期のＢＡＦ３／ＧＨＲ細胞を採取し、培養ボトル中の細胞懸濁液をピペットで５０ｍｌの遠心分離管に移り、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した後、上清液を除去し、２ｍｌの分析培地で細胞を重懸濁して単細胞懸濁液を作製し、細胞懸濁液を１５ｍｌの分析培地の入った培養ボトル内に入れて均一に混ぜ、ＣＯ_２インキュベーターに入れて２４－３６時間空腹にする。

【0088】

分析培地の成分は下記表１に示される。

【表1】

【0089】

空腹培養後のＢＡＦ３／ＧＨＲ細胞を採取し、培養ボトル内の細胞懸濁液をピペットで５０ｍｌの遠心分離管に移り、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した後上清液を除去し、２ｍｌの分析培地で細胞を重懸濁して単細胞懸濁液を作製する。１０μｌの単細胞懸濁液を１０μｌのトリパンブルー染色液に加え、細胞計数器または顕微鏡で計数する。

【0090】

分析培地で細胞密度を２．０±０．２×１０^５個／ｍｌに調整し、５０μｌ／ウェルで、９６ウェルの細胞培養板のＢ－Ｇ行２－１２列内に敷き、Ｂ－Ｇ行１列目のウェルごとに５０μｌの分析培地を加え、９６ウェルの細胞培養板をＣＯ_２インキュベーターに入れて１ｈ培養する。

【0091】

サンプル処理：無菌水で供試品（サンプルＧＨ（ＧＧＧＧＳ）_４、サンプルＧＨ（ＧＡＰＱ）_３）を濃度１ｍｇ／ｍｌまで溶解する。供試品溶液の予備希釈：分析培地で供試品を濃度が１００ｎｇ／ｍｌの供試品溶液に希釈し、毎回の希釈倍数は１００倍以下とする。供試品：１枚の透明な９６ウェル板を希釈板として取り、希釈板にＢ１２－Ｇ１２（陽性対照）とＢ２－Ｇ２以外、各ウェルに１００μｌの分析培地を加える。希釈板のＥ２－Ｇ２ウェルに、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌの供試品溶液を１５０μｌ加える。１２チャンネルのマイクロピペットを用いて酵素プレート上で４倍希釈した。１列目（Ｂ２－Ｇ２）から５０μＬを吸引して、２列目に移り、２０回混合した。次に、２列目から５０μＬを吸引して３列目に移り、２０回混合した。Ｂ１０－Ｇ１０列まで酵素プレート全体上でこのステップを繰り返す。Ｂ１０－Ｇ１０列から５０μＬの溶液を吸引した後に除去する。

【0092】

供試品の添加：９６ウェル細胞培養板で１ｈ培養した後、１２チャンネルのマイクロピペットを使用して、希釈板のＢ行からＧ行の各ウェルから５０μｌを細胞を含む９６ウェル培養板の対応するウェル内に移る。移った後、９６ウェル細胞培養板を３０ｓ軽く振って、次に、ＣＯ_２インキュベーターの中で６８－７２ｈ培養する。９６ウェル細胞培養板での培養が完了した後に、各添加ウェルに１０μｌのＡｌａｍａｒ－Ｂｌｕｅ検出液を添加し、ＣＯ_２インキュベーターに入れて４時間培養し続ける。９６ウェル板を酵素マーカーに入れ、励起光が５４４ｎｍで、発射光が５９０ｎｍで、検出する。

【0093】

生物学的活性の検出結果は下記表２に示される。

【0094】

【表2】

【0095】

上記表２の結果から、本発明の剛性ジョイントを有するｒｈＧＨ－Ｆｃ／Ｆｃタンパク質は、柔軟性ジョイントを含む成長ホルモン融合タンパク質よりも、ＥＣ５０が小さく、生物学的活性が高いことが示された。発明者は、本発明による成長ホルモン融合タンパク質が、剛性ジョイントを利用して第１の単量体と二本鎖構造体を連結することで、タンパク質が自分の空間配座を保ち、構造「遮蔽」現象が発生しないことを発見した。本発明は剛性ジョイントを使用することで、成長ホルモンのＣ端に近い領域の活性サイトに対するＦｃのＮ末端の影響を回避することができ、これにより、成長ホルモンの細胞生物学的活性を更に向上させる。

【0096】

実施例４：ｒｈＧＨ－Ｆｃ／Ｆｃタンパク質の細胞生物学的活性測定

【0097】

実施例３と同様な方法でＪＨＭ０２０２と市販対照品（ポリエチレングリコール組換えヒト成長ホルモン注射液）の細胞生物学的活性検出を行う。ｒｈＧＨ－Ｆｃ／Ｆｃタンパク質及び市販対照品の細胞生物学的活性は表３（ＥＣ５０：ｎＭ）に示される。

【0098】

【表3】

【0099】

表３中の１ｓｔ、２ｎｄ、３ｒｄとは、３回の生物学的活性の反復測定によって得られた結果である。

【0100】

上記データから分かるように、実施例２で精製して得られたｒｈＧＨ－Ｆｃ／Ｆｃタンパク質サンプル（ＪＨＭ０２０２）は、市販対照品よりも小さいＥＣ５０値（平均値比１／２．９８）を示した。ＪＨＭ０２０２タンパク質はより良い体外細胞生物学的活性を有することが示された。

【0101】

実施例５：ｒｈＧＨ－Ｆｃ／Ｆｃタンパク質とＦｃＲｎの結合活性

【0102】

ｒｈＧＨ－Ｆｃ／Ｆｃタンパク質は成長ホルモンとＩｇＧ４Ｆｃの融合タンパク質であり、ＩｇＧ４ＦｃはｐＨ依存的にＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）と結合し、受容体を介した再循環メカニズムにより、成長ホルモン半減期を延長し、ＳＰＲ技術でｒｈＧＨ－Ｆｃ／Ｆｃタンパク質とＦｃＲｎとの結合の親和力定数（ＫＤ）を検出する。

【0103】

脱塩カラムでＦｃＲｎサンプルを処理し、ＣＭ５チップを活性化し、ｒｈＧＨ－Ｆｃ／Ｆｃタンパク質サンプルを６μｇ／ｍＬに希釈して注入し、サンプルをカップリングし、チップを閉じる。分析物ＦｃＲｎを４６．８７５、９３．７５、１８７．５、３７５、７５０、１５００、３０００及び６０００ｎＭという８つの濃度に希釈し、注入して検出し、結合時間が６０ｓであり、解離時間は９０ｓである。実験データを平衡法でフィッティングして動力学データを得、結果を表４に示す。

【0104】

【表4】

【0105】

ＳＰＲの結果から、ｒｈＧＨ－Ｆｃ／Ｆｃサンプル（ＪＨＭ０２０２）、ＩｇＧ４Ｆｃ及びヒトＦｃＲｎはｐＨ６．０条件下で親和力が同等であることが示され、ｒｈＧＨ－Ｆｃ／Ｆｃタンパク質は天然ヒトＩｇＧ４Ｆｃと類似の体内半減期を有し、ｒｈＧＨの体内長寿命化を実現できることが示される。

【0106】

実施例６：ｒｈＧＨ－Ｆｃ／Ｆｃタンパク質の体内成長促進生物学的活性の測定

【0107】

実験において若齢の雄性ＳＤラットを採用し、耳道法手術で下垂体を摘出し、それぞれ術後２、３週間で重量を量り、２～３週間の体重増加率が±１０％以内で、外観が健康的なラットをモデリングに成功したモデルとした。体重増加率（±６．０％）に基づいて４０匹のモデルを好適に選択し、体重と体重増加率でランダムに均一に４群に分け、それぞれモデル対照群（０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＪＨＭ０２０２被験サンプル群（５１ｎｍｏｌ／ｋｇ、週に１回注射）、市販対照品群（ポリエチレングリコール組換えヒト成長ホルモン注射液、５１ｎｍｏｌ／ｋｇ、週に１回注射）及び組換えヒト成長ホルモン注射液対照群（９ｎｍｏｌ／ｋｇ）（組換えヒト成長ホルモン注射液は普通の成長ホルモンであり、毎日に１回注射）、群ごとに１０匹である。他の１０匹の偽手術ラットを正常対照群（０ｎｍｏｌ／ｋｇ）とした。

【0108】

グループ分けして皮下注射で投与し、組換えヒト成長ホルモン注射液対照群は毎日１回、連続４週間投与する。残りの実験群は１回／週、合計４回投与する。測定指標：毎日に体重を１回量り、体重増加率を計算する。実験の結果を図２に示す。体重増加率のデータ結果から、モデル対照群に比べて、各投与群は顕著な体重増加を示したことが分かった。ＪＨＭ０２０２被験サンプル群と市販対照品群はいずれも偽手術対照群の正常ラットと同等の体重増加に達した。組換えヒト成長ホルモン注射液対照群と比較して、ＪＨＭ０２０２被験サンプル群の２８日目の体重増加率は組換えヒト成長ホルモン注射液対照群（ｐ＜０．０５）より顕著に大きい。ＪＨＭ０２０２被験サンプル群の２８日の体重増加率は市販対照品群より高い。上記結果から、ＪＨＭ０２０２被験サンプル群が良好な体内成長促進作用を示すことが分かった。

【0109】

実施例７：ｒｈＧＨ－Ｆｃ／Ｆｃタンパク質体内薬物動態

【0110】

供試サンプルＪＨＭ０２０２と市販対照品（ポリエチレングリコール組換えヒト成長ホルモン注射液）のラットの体内での薬物動態。１２匹の雄性ラットをランダムに２群に分け、供試品ＪＨＭ０２０２群に６匹、市販対照品群に６匹であり、それぞれ皮下にＪＨＭ０２０２サンプル５１ｎｍｏｌ／ｋｇ及び市販対照品５１ｎｍｏｌ／ｋｇを単回注射する。各群のサンプルの採集時間点は、投与前（０ｈ）及び投与後２ｈ、４ｈ、８ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ、１２０ｈ、１６８ｈ、２１６ｈである。

【0111】

ＥＬＩＳＡ法で生物サンプル中の血中濃度を検出し、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ８．０ソフトウェアを用いて非房室モデルに従って薬物動態パラメータを計算し、表５を参照する。

【0112】

【表5】

【0113】

ラットは単回皮下単回投与量ＪＨＭ０２０２及び市販対照品を投与した後、両薬物の血中濃度はいずれも先に上昇した後に低下する傾向を示し、且つピーク到達時間の範囲が比較的に一致している。ＪＨＭ０２０２は市販対照品よりも小さい体内消除定数Ｋ_ｅｌ（１／３．６）及び長い体内消除半減期Ｔ_１／２（３．７８／１）を示し、ＪＨＭ０２０２は市販対照品（１．２５／１）よりもピーク到達血中濃度Ｃ_ｍａｘが高く、ＪＨＭ０２０２は市販対照品（１．２８／１）よりも体内曝露の程度ＡＵＣ_０－ｔも高い。ＪＨＭ０２０２は市販対照品よりもより良い体内薬物代謝特性を有し、より長い体内半減期を実現することができ、長寿命化作用がより顕著である。

【0114】

実施例８：ラットＩＧＦ－１レベルに対するｒｈＧＨ－Ｆｃ／Ｆｃタンパク質の影響

【0115】

ラットの眼窩静脈叢採血は約１ｍＬであり、３８００ｒｐｍで血漿を遠心分離して、Ｅｌｉｓａ法によりＩＧＦ－１の含有量を測定する。

【0116】

投与前、Ｄ３、Ｄ２４で、モデル対照群ラットは正常対照群（ｐ＜０．０５）よりも血漿ＩＧＦ－１含有量が顕著に低い。モデル対照群、被験サンプル群、市販対照品群（ポリエチレングリコール組換えヒト成長ホルモン注射液）及び組換えヒト成長ホルモン注射液対照群（普通の成長ホルモン、毎日１回注射）は、ラット血漿ＩＧＦ－１含有量が投与前の各群間で有意差はなかった。表６は各実験群におけるラット血漿ＩＧＦ－１含有量の変化が示された。

【0117】

【表6】

備考：＊ｐ＜０．０５モデル群との比較

【0118】

ＩＧＦ－１基づく分析結果によると、投与前に、各投与群のラット血漿ＩＧＦ－１含有量が正常対照群（ｐ＜０．０５）より有意に低いが、各投与群間に有意差はなかった。３日目、ＪＨＭ０２０２被験サンプル群及び市販対照品群のラット血漿ＩＧＦ－１含有量は組換えヒト成長ホルモン注射液対照群（ｐ＜０．０５）より有意に大きく、且つＪＨＭ０２０２被験サンプル群のラット血漿ＩＧＦ－１含有量は市販対照品群より大きく、正常対照群よりも大きい。２４日目、ＪＨＭ０２０２被験サンプル群及び市販対照品群のラット血漿ＩＧＦ－１含有量は組換えヒト成長ホルモン注射液対照群（ｐ＜０．０５）より有意に大きく、ＪＨＭ０２０２被験サンプル群のラット血漿ＩＧＦ－１含有量は市販対照品群より大きく、同時に、正常対照群よりも大きい。ＪＨＭ０２０２被験サンプル群が市販対照品群よりも良い体内刺激成長作用を有し、同時に、組換えヒト成長ホルモン注射液対照群よりも非常に良い体内刺激成長作用を有する。

【0119】

本明細書の説明では、「一実施例」、「いくつかの実施例」、「例」、「具体的な例」、または「いくつかの例」という参照用語等の説明は、該実施例または例を組み合わせて説明した具体的な特徴、構造、材料または特点が本発明の少なくとも１つの実施例または例に含まれる。本明細書では、上記用語の模式的な記述は、必ずしも同じ実施例または例を対象とする必要がない。また、説明された具体的な特徴、構造、材料または特点はいずれかまたは複数の実施例または例において適切な方法で組み合わせることができる。なお、互いに矛盾しない場合、当業者は本明細書に説明された異なる実施例または例及び異なる実施例または例の特徴を組み合わせることができる。

【0120】

以上で本発明の実施例を示して説明したが、上記実施例は例示的なものであり、本発明を制限するものとして理解されることができないことを理解でき、当業者は、本発明の範囲で上記実施例に対して変化、修正、置換及び変形を行うことができる。

【0121】

本願は、出願番号が２０２１１１６５８４１４．Ｘ、出願日が２０２１年１２月３０日である中国特許出願の優先権を主張し、上記中国特許出願の内容の全てを参照として援用することにより本願に取り入れる。

【図1】