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特表2024-506277脱塩基核酸を有する配列変換及びシグナル増幅ＤＮＡ、並びにそれを使用する検出方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-13
(54)【発明の名称】脱塩基核酸を有する配列変換及びシグナル増幅ＤＮＡ、並びにそれを使用する検出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6848 20180101AFI20240205BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240205BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6848 Z
C12N15/11 Z ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023546262
(86)(22)【出願日】2022-01-31
(85)【翻訳文提出日】2023-09-28
(86)【国際出願番号】 US2022014590
(87)【国際公開番号】W WO2022165353
(87)【国際公開日】2022-08-04
(31)【優先権主張番号】63/144,146
(32)【優先日】2021-02-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】391008788
【氏名又は名称】アボット・ラボラトリーズ
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】森川 高光
(72)【発明者】
【氏名】吉村 徹
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ05
4B063QQ42
4B063QQ58
4B063QR08
4B063QR14
4B063QR32
4B063QR38
4B063QR56
4B063QS24
4B063QS28
4B063QS36
(57)【要約】
試料中で標的核酸を検出するための方法が開示される。この方法は、試料を、ポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼの存在下で、５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列と、エンドヌクレアーゼ認識部位と、少なくとも１つの脱塩基部分を含む相補的配列とを含む、第１のオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、この相補的配列が、シグナルＤＮＡ生成配列の少なくとも一部に相補的である第１の相補的配列及び標的核酸の３’末端に相補的である第２の相補的配列を含む。第２のシグナルＤＮＡ生成配列と、エンドヌクレアーゼ認識部位と、第１のオリゴヌクレオチドの第１のシグナルＤＮＡ生成配列に相同でありかつ任意選択的に少なくとも１つの脱塩基部位を有する配列とを含む、第２のオリゴヌクレオチドを含む方法も、開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中で標的核酸を検出するための方法であって、試料を、５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列と、エンドヌクレアーゼ認識部位と、少なくとも１つの脱塩基部分を含む相補的配列とを含む、第１のオリゴヌクレオチドであって、前記相補的配列が前記シグナルＤＮＡ生成配列の少なくとも一部に相補的である第１の相補的配列及び前記標的核酸の３’末端に相補的である第２の相補的配列を含む、第１のオリゴヌクレオチド、
ポリメラーゼ、並びに
ニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼ
と接触させることを含み、
前記少なくとも１つの脱塩基部分が前記第２の相補的配列の５’末端と３’末端の間に位置し、前記第２の相補的配列の５’末端から３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ヌクレオチドであるヌクレオチド位置から選択され、
前記シグナルＤＮＡ生成配列の少なくとも一部と前記シグナルＤＮＡ生成配列の一部に相補的な前記第１の相補的配列がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する方法。
【請求項2】
前記第１のオリゴヌクレオチドが複数の脱塩基部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の３’末端に相補的な前記第２の相補的配列の５’末端から７ヌクレオチドである位置にある脱塩基部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の３’末端に相補的な前記第２の相補的配列の５’末端から７及び８ヌクレオチドである位置にある２つの脱塩基部分を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の３’末端に相補的な前記第２の相補的配列の５’末端から７、８及び９ヌクレオチドである位置にある３つの脱塩基部分を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項6】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の３’末端に相補的な前記第２の相補的配列の５’末端から７、８、９及び１０ヌクレオチドである位置にある４つの脱塩基部分を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項7】
前記方法が実質的に一定の温度で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記方法が、約２０℃～約４２℃の温度で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記ポリメラーゼが鎖置換活性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記ポリメラーゼが、３’から５’エキソヌクレアーゼ欠損、５’から３’エキソヌクレアーゼ欠損、又は両方である、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記標的核酸がマイクロＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記標的核酸が感染病原体由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記方法が、１つ以上の脱塩基改変をオリゴヌクレオチド配列中に組み込んでいるオリゴヌクレオチドを含まない対照反応と比べて、バックグラウンドシグナル増幅の９９％～１０％の減少を提供する、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
前記方法が、非特異的バックグラウンドシグナル増幅を約３０％減少させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記第１のオリゴヌクレオチドが３’末端修飾を含む、請求項１～１４のいずれかに記載の方法。
【請求項16】
試料中で標的核酸を検出するための組成物であって、５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列と、エンドヌクレアーゼ認識部位と、少なくとも１つの脱塩基部分を含む相補的配列とを含む、第１のオリゴヌクレオチドであって、前記相補的配列が前記シグナルＤＮＡ生成配列の少なくとも一部に相補的である第１の相補的配列及び前記標的核酸の３’末端に相補的である第２の相補的配列を含み、前記シグナルＤＮＡ生成配列の少なくとも一部と前記シグナルＤＮＡ生成配列の一部に相補的な前記第１の相補的配列がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第１のオリゴヌクレオチド
を含む、組成物。
【請求項17】
前記少なくとも１つの脱塩基部分が、前記第２の相補的配列の５’末端と３’末端の間に位置し、前記第２の相補的配列の５’末端から３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ヌクレオチドであるヌクレオチド位置から選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項18】
前記第１のオリゴヌクレオチドが複数の脱塩基部分を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項19】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の３’末端に相補的な前記第２の相補的配列の５’末端から７ヌクレオチドである位置にある脱塩基部分を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項20】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の３’末端に相補的な前記第２の相補的配列の５’末端から７及び８ヌクレオチドである位置にある２つの脱塩基部分を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項21】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の３’末端に相補的な前記第２の相補的配列の５’末端から７、８及び９ヌクレオチドである位置にある３つの脱塩基部分を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項22】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の３’末端に相補的な前記第２の相補的配列の５’末端から７、８、９及び１０ヌクレオチドである位置にある４つの脱塩基部分を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項23】
ポリメラーゼ及びニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項24】
前記ポリメラーゼが鎖置換活性を有する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項25】
前記ポリメラーゼが、３’から５’エキソヌクレアーゼ欠損、５’から３’エキソヌクレアーゼ欠損、又は両方である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項26】
前記第１のオリゴヌクレオチドが３’末端修飾を含む、請求項１６～２５のいずれかに記載の組成物。
【請求項27】
試料中で標的核酸を検出するためのキットであって、５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列と、エンドヌクレアーゼ認識部位と、少なくとも１つの脱塩基部分を含む相補的配列とを含む、第１のオリゴヌクレオチドであって、前記相補的配列が前記シグナルＤＮＡ生成配列の少なくとも一部に相補的である第１の相補的配列及び前記標的核酸の３’末端に相補的である第２の相補的配列を含み、前記少なくとも１つの脱塩基部分が前記第２の相補的配列の５’末端と３’末端の間に位置し、前記第２の相補的配列の５’末端から３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ヌクレオチドであるヌクレオチド位置から選択され、前記シグナルＤＮＡ生成配列の少なくとも一部と前記シグナルＤＮＡ生成配列の一部に相補的な前記第１の相補的配列がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第１のオリゴヌクレオチド
を、含むキット。
【請求項28】
５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列と、エンドヌクレアーゼ認識部位と、少なくとも１つの脱塩基部分を含む相補的配列とを含む、化学修飾されたオリゴヌクレオチドであって、前記相補的配列が前記シグナルＤＮＡ生成配列の少なくとも一部に相補的である第１の相補的配列及び前記標的核酸の３’末端に相補的である第２の相補的配列を含み、前記少なくとも１つの脱塩基部分が第２の相補的配列の５’末端と３’末端の間に位置し、前記第２の相補的配列の５’末端から３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ヌクレオチドであるヌクレオチド位置から選択され、前記シグナルＤＮＡ生成配列の少なくとも一部と前記シグナルＤＮＡ生成配列の一部に相補的な前記第１の相補的配列がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、化学修飾されたオリゴヌクレオチド。
【請求項29】
前記オリゴヌクレオチドが複数の脱塩基部位を含む、請求項２８に記載の化学修飾されたオリゴヌクレオチド。
【請求項30】
前記オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の３’末端に相補的な前記第２の相補的配列の５’末端から７ヌクレオチドである位置にある脱塩基部分を含む、請求項２８に記載の化学修飾されたオリゴヌクレオチド。
【請求項31】
前記オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の３’末端に相補的な前記第２の相補的配列の５’末端から７及び８ヌクレオチドである位置にある２つの脱塩基部分を含む、請求項２９に記載の化学修飾されたオリゴヌクレオチド。
【請求項32】
前記オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の３’末端に相補的な前記第２の相補的配列の５’末端から７、８及び９ヌクレオチドである位置にある３つの脱塩基部分を含む、請求項２９に記載の化学修飾されたオリゴヌクレオチド。
【請求項33】
前記オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の３’末端に相補的な前記第２の相補的配列の５’末端から７、８、９及び１０ヌクレオチドである位置にある４つの脱塩基部分を含む、請求項２９に記載の化学修飾されたオリゴヌクレオチド。
【請求項34】
３’末端修飾をさらに含む、請求項２８～３３のいずれかに記載の化学修飾されたオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２１年２月１日に提出された米国特許仮出願第６３／１４４，１４６号に関連しておりその優先権の利益を主張するものであり、前記特許文献は参照によりその全体をここに組み込む。
【0002】
配列表
本出願は、参照により組み込まれ「１２８３５ＷＯＯ１＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」と題するテキストファイルとしてコンピュータ可読フォーマットで本出願の提出書類と一緒に提出される配列表を含有する。配列表ファイルは、２０２２年１月３１日に作成され、サイズは７，２０８バイトである。テキストファイルは、配列表提出の目的で必要とされることがある配列表の任意のハードコピーとしての役割もする。
本出願は、参照により組み込まれ「１２８３５ＷＯＯ１＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」と題するテキストファイルとしてコンピュータ可読フォーマットで本出願の提出書類と一緒に提出される配列表を含有する。配列表ファイルは、２０２２年１月３１日に作成され、サイズは７，２０８バイトである。テキストファイルは、配列表提出の目的で必要とされることがある配列表の任意のハードコピーとしての役割もする。
【0003】
資金提供
該当なし
該当なし
【背景技術】
【0004】
試験試料中の標的核酸の検出は、医学及び生物学を含む種々の分野で重要である。多くの組成物、アッセイプラットホーム及び手順が特定の核酸分子の検出に利用可能である。検出が再現でき正確であるためには、これらの手順は非特異的バックグラウンド増幅がないか又は低いレベルであることを必要とする。しかし、増幅法は、結果の品質、精度、再現性及び全体的信頼性に影響を及ぼす偽陽性シグナルを生じることがある。一部のアッセイでは、これらの「偽」陽性シグナルは、非鋳型ＤＮＡ（非標的ＤＮＡ）を含有する対照試料又はさらにはいかなるＤＮＡ鋳型も欠く試料を含めて、試料中で検出されることがある。
【0005】
混合核酸配列の集団から特定の配列を増幅させるために使用される１つの一般的な方法はポリメラーゼ連鎖反応である（ＰＣＲ）。典型的なＰＣＲは３種の異なる温度で実行されるので、反応は、正確な温度を維持する難しさ及びタイムロスが増幅サイクルの数に比例して増加するという難しさなどの課題と関連することがある。二本鎖鋳型ＤＮＡが変性して一本鎖になる（ある程度特定の配列に依存する）には、高い「融解」温度の使用が必要になる場合が多いが、これにより使用できるＤＮＡポリメラーゼの種類は高度に熱安定である種類に限定される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
したがって、ＰＣＲで使用される反応条件よりも穏やかな反応条件下で核酸を検出する等温増幅プラットホーム技術が開発された。にも関わらず、これらの等温増幅技術は、標的配列検出を妨害することがある非特異的増幅事象及び高バックグラウンドシグナルにより提起される課題に対処していない。
【課題を解決するための手段】
【0007】
以下の開示は、ＰＣＲで使用される反応条件ほど厳密ではない反応条件下で核酸配列（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を検出するための代わりの方法及び組成物を提供する。本方法及び組成物は、試料中低濃度で存在することがある核酸分子及び／又は長さが短い核酸分子の検出を可能にする配列選択性及び感受性を維持する。本方法及び組成物は、非特異的及び／又は標的非依存性増幅事象から生じる場合がある任意のバックグラウンドシグナルも減らす。態様の中でも、本開示は、低温、等温条件下で試料中の標的核酸の検出限界を改善でき、試料調製及び自動化された検出法を簡略化する又は改善することができる新規の方法、試薬及び核酸分子を提供する。
【0008】
（発明の要旨）
一態様では、本開示は、試料中で標的核酸を検出するための方法であって、前記試料を、５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と、シグナルＤＮＡ生成配列の少なくとも一部に相補的である第１の相補的配列（Ｃ）及びその中に組み込まれる少なくとも１つの脱塩基部位（又は「脱塩基基」、「脱塩基部分」又は「脱塩基残基」）を有し標的核酸の３’末端に相補的である第２の相補的配列（Ｄ）を含む相補的配列とを含む、カバーされた（すなわち、ヘアピン）オリゴヌクレオチド（配列変換ＤＮＡ又はＳＣ ＤＮＡ）；ポリメラーゼ；並びにニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼと接触させることを含む方法に関する。本態様の実施形態では、本方法は、シグナルＤＮＡの存在又は非存在を判定することも含み、シグナルＤＮＡの存在は試料中の標的核酸の存在を示す。
一態様では、本開示は、試料中で標的核酸を検出するための方法であって、前記試料を、５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と、シグナルＤＮＡ生成配列の少なくとも一部に相補的である第１の相補的配列（Ｃ）及びその中に組み込まれる少なくとも１つの脱塩基部位（又は「脱塩基基」、「脱塩基部分」又は「脱塩基残基」）を有し標的核酸の３’末端に相補的である第２の相補的配列（Ｄ）を含む相補的配列とを含む、カバーされた（すなわち、ヘアピン）オリゴヌクレオチド（配列変換ＤＮＡ又はＳＣ ＤＮＡ）；ポリメラーゼ；並びにニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼと接触させることを含む方法に関する。本態様の実施形態では、本方法は、シグナルＤＮＡの存在又は非存在を判定することも含み、シグナルＤＮＡの存在は試料中の標的核酸の存在を示す。
【0009】
一態様では、本開示は、試料中で標的核酸を検出するための方法であって、標的核酸と１つ以上の脱塩基部位を有する第１のオリゴヌクレオチド（配列変換ＤＮＡ又はＳＣ ＤＮＡ）との相互作用がポリメラーゼによる複製をプライミングして、第１のシグナルＤＮＡ（Ｓ１）を生成し、この第１のシグナルＤＮＡ（Ｓ１）が今度は１つ以上の脱塩基部分（又は部位）を有する場合がある第２のオリゴヌクレオチド（シグナル増幅ＤＮＡ又はカスケードシグナル増幅ＤＮＡ１若しくはｃＳＡ ＤＮＡ１）と相互作用をしてポリメラーゼによる複製をプライミングして、第１のシグナルＤＮＡ（Ｓ１）と異なる第２のシグナルＤＮＡ（Ｓ２）を生成し、この第２のシグナルＤＮＡが今度は１つ以上の脱塩基部位を有する場合がある第３のオリゴヌクレオチド（カスケードシグナル増幅ＤＮＡ２又はｃＳＡ ＤＮＡ２）と相互作用をすることができ、ポリメラーゼによる複製をプライミングして、第３の特有のシグナルＤＮＡ（Ｓ３）を生成する、方法に関する。第３の特有のシグナルＤＮＡ Ｓ３は、１つ以上の脱塩基部位を有する場合がある第４のオリゴヌクレオチド（カスケードシグナル増幅ＤＮＡ３又はｃＳＡ ＤＮＡ３）と相互作用をすることができ、ポリメラーゼによる複製をプライミングして、第４の特有のシグナルＤＮＡ（Ｓ４）を生成し、この第４のシグナルＤＮＡが今度は、１つ以上の脱塩基部位を有する場合がある第５のオリゴヌクレオチド（カスケードシグナル増幅ＤＮＡ４又はｃＳＡ ＤＮＡ４）と相互作用をすることができ、ポリメラーゼによる複製をプライミングして、第５の特有のシグナルＤＮＡ Ｓ５を生成し、この第５のシグナルＤＮＡが今度は、１つ以上の脱塩基部位を有する場合がある第６のオリゴヌクレオチド（カスケードシグナル増幅ＤＮＡ５又はｃＳＡ ＤＮＡ５）と相互作用をすることができ、ポリメラーゼによる複製をプライミングして、第６の特有のシグナルＤＮＡ Ｓ６を生成して、など、所望の増幅に到達するまで続く。これらの態様の種々の実施形態では、脱塩基部位は、配列の３’側の半分のほうのヌクレオチド配列に（例えば、標的又はシグナルＤＮＡとハイブリダイズするＳＣ又はｃＳＡ ＤＮＡの３’末端の近く、又はその内部にあるオリゴヌクレオチド配列の一部内に）位置することが可能である。さらなる実施形態では、脱塩基部位（複数可）は、前記第１のオリゴヌクレオチド（例えば、上で言及される配列（Ｄ））の標的核酸の３’末端に相補的である配列の５’末端で第１のヌクレオチドから位置３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はその組合せに位置することができる。一部の実施形態は、脱塩基部位（複数可）を、エンドヌクレアーゼ認識部位の３’末端から３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ヌクレオチドである位置にある、又はこれらの位置の組合せの位置にあるものとして記載しうる。
【0010】
例えば、本明細書に記載される種々の態様の一部の実施形態では、本開示は、試料中で標的核酸を検出するための方法（並びに組成物、キット及び化学修飾されたオリゴヌクレオチド）であって、前記試料を、５’から３’方向に、第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）の少なくとも一部に相補的である第１の相補的配列（Ｃ）及び標的核酸の３’末端に相補的である第２の相補的配列（Ｄ）を含む相補的配列とを含む第１のオリゴヌクレオチド（本明細書では配列変換ＤＮＡ又はＳＣ ＤＮＡとして同定されることがある）と接触させることを含み、配列（Ｄ）は、その中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位（又は「脱塩基基」、「脱塩基部分」又は「脱塩基残基」）を有し、第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相補的な第１の相補的配列は、ハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、方法を提供する。一部のさらなる実施形態では、方法、組成物及びキットは、５’から３’方向に、第２の特有のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｆ）（ＳＣ ＤＮＡ中のエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と同じであるか又は異なっていてもよい）と、シグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）の少なくとも一部に相補的である配列（Ｇ）と、第１のＳＣ ＤＮＡオリゴヌクレオチドの第１のシグナルＤＮＡ生成配列に相同である配列（Ｈ）とを含み、配列（Ｈ）が任意選択的にその中に組み込まれた１つ又は複数の脱塩基部位（複数可）を有し、第２のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）の少なくとも一部と第２のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）に相補的な配列（Ｇ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する第２のオリゴヌクレオチド（本明細書ではシグナル増幅ＤＮＡ又はカスケードシグナル増幅ＤＮＡ１（ＳＡ ＤＮＡ又はｃＳＡ ＤＮＡ１）と同定してよい）を含む。これらの態様及び実施形態では、方法、組成物及びキットは、ポリメラーゼ及びニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼを含むことができる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）及び／又は（Ｆ）はヘアピン構造のループに位置することができる。本明細書で考察されるように、任意の数（ｎ）の特有のシグナル増幅ＤＮＡ又はカスケードシグナル増幅ＤＮＡ（又は「ｃＳＡ ＤＮＡ」）を上の反応に添加することができ、それぞれの特有なｃＳＡ ＤＮＡが特有のシグナルＤＮＡ配列を生成するように組み立ててよい。例えば、一部の実施形態では、ｎは１０、９、８、７、５、４、３、２又は１が可能であり、その場合、１０、９、８、７、５、４、３、２又は１のｃＳＡ ＤＮＡが、標的核酸及び配列変換ＤＮＡ（ＳＣ ＤＮＡ）を含む反応に添加される。この態様の実施形態では、本方法は、１つ以上のシグナルＤＮＡ（複数可）の存在又は非存在を判定し、１つ以上のシグナルＤＮＡ（複数可）の存在は、試料中の標的核酸の存在を示すことも含む。
【0011】
例えば、一部の実施形態では、本開示は、試料中の標的核酸を検出するための方法であって、前記試料を、５’から３’方向に、第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）の少なくとも一部に相補的である第１の相補的配列（Ｃ）及びその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し、標的核酸の３’末端に相補的である第２の相補的配列（Ｄ）を含む相補的配列とを含む第１のオリゴヌクレオチド（配列転換ＤＮＡ又はＳＣ ＤＮＡ）と接触させ、第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）の一部に相補的である第１の相補的配列（Ｃ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、前記方法に関する。さらなる実施形態では、本方法は、５’から３’方向に、第２の特有のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）と、エンドヌクレアーゼン認識部位（Ｆ）（ＳＣ ＤＮＡ中のエンドヌクレアーゼン認識部位（Ｂ）と同じであるか又はそれとは異なってもよい）と、第２の特有のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）の少なくとも一部に相補的である相補的配列（Ｇ）及び第１のＳＣ ＤＮＡオリゴヌクレオチドの第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）と相同である配列（Ｈ）を含む配列領域とを含み、配列（Ｈ）が任意選択的に、その中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し、第２の特有のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）に相補的な配列（Ｇ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第２のオリゴヌクレオチド（カスケードシグナル増幅ＤＮＡ１又はｃＳＡ ＤＮＡ１）；５’から３’方向に、第３の特有のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）と、エンドヌクレアーゼン認識部位（Ｊ）（エンドヌクレアーゼン認識部位（Ｂ）及び（Ｆ）と同じであるか又はそれとは異なってもよい）と、第３の特有のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）の少なくとも一部に相補的である相補的配列（Ｋ）及び第２のオリゴヌクレオチドｃＳＣ ＤＮＡ１の第２のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）と相同である配列（Ｌ）を含む配列領域とを含み、シグナル（Ｌ）が任意選択的に、その中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し、第３の特有のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）に相補的な配列（Ｋ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第３のオリゴヌクレオチド（カスケードシグナル増幅ＤＮＡ２又はｃＳＡ ＤＮＡ２）を含む。そのような実施形態では、本方法は、ポリメラーゼ；及びニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼをさらに含んでよい。さらなる実施形態では、本方法は、シグナルＤＮＡの存在又は非存在を判定し、シグナルＤＮＡの存在は試料中の標的核酸の存在を示すことも含む。
【0012】
別の態様では、本開示は、試料中の標的核酸を検出するための方法に関するものであり、標的核酸と第１のオリゴヌクレオチド（少なくとも１つの脱塩基部位を有する配列変換ＤＮＡ又はＳＣ ＤＮＡ）の相互作用が第１のシグナルＤＮＡ（Ｓ１）を生成し、この第１のシグナルＤＮＡが今度は第２のオリゴヌクレオチド（カスケードシグナル増幅ＤＮＡ１又はｃＳＡ ＤＮＡ１、任意選択的に、少なくとも１つの脱塩基部位を有する）と相互作用してＳ１と異なる第２のシグナルＤＮＡ（Ｓ２）を生成し、この第２のシグナルＤＮＡが今度は第３のオリゴヌクレオチド（カスケードシグナル増幅ＤＮＡ２又はｃＳＡ ＤＮＡ２、任意選択的に、少なくとも１つの脱塩基部位を有する）と相互作用できてシグナルＤＮＡ（Ｓ１）を生成し、このシグナルＤＮＡは標的核酸がＳＣ ＤＮＡと相互作用すると生成されるのと同じシグナルＤＮＡである。この態様では、増幅されたシグナルＤＮＡ（Ｓ２）は、カスケードシグナル増幅ＤＮＡ ｃＳＡ ＤＮＡ２と相互作用するとシグナルＤＮＡ（Ｓ１）に変換され、シグナルＤＮＡ（Ｓ１）のサイクル増幅が可能になる。
【0013】
さらなる態様では、本開示は、試料中で標的核酸を検出するための方法であって、前記試料を、５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）の少なくとも一部に相補的である第１の相補的配列（Ｃ）及びその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し前記標的核酸（Ｔ）の３’末端に相補的である第２の相補的配列（Ｄ）を含む相補的配列とを含み、第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相補的である第１の相補的配列（Ｃ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する第１のオリゴヌクレオチド（又は配列変換ＤＮＡ若しくはＳＣ ＤＮＡ）；５’から３’方向に、第１のオリゴヌクレオチドのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）と相同なシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｆ）（第１のオリゴヌクレオチドのエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と同じである）と、シグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）の少なくとも一部に相補的である相補的配列（Ｇ）及び第１のオリゴヌクレオチドのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）と相同な配列（Ｈ）を含む配列領域とを含み、配列（Ｈ）が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し、第２のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）に相補的である配列（Ｇ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する第２のオリゴヌクレオチド（又はシグナル増幅ＤＮＡ若しくはＳＡ ＤＮＡ））；ポリメラーゼ；並びにニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼと接触させることを含む方法に関する。この態様の実施形態では、本方法は、シグナルＤＮＡの存在又は非存在を判定し、シグナルＤＮＡの存在は試料中の標的核酸の存在を示すことも含む。
【0014】
ある特定の実施形態では、１つ以上の脱塩基部位（すなわち、部分）は、本明細書に記載される任意のオリゴヌクレオチドの配列に存在することができる。例えば、１つ以上の脱塩基部位は任意のシグナル変換オリゴヌクレオチド（ＳＣ ＤＮＡ）に、並びに／又は本開示に従って調製される及び／若しくは使用される任意のシグナル増幅オリゴヌクレオチド（ｃＳＡ ＤＮＡ又はＳＡ ＤＮＡ）に存在することができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの脱塩基部位が、任意のＳＣ ＤＮＡ（例えば、配列（Ｄ）内の）の３’末端から及び／又は任意のシグナル増幅ＤＮＡ（ＳＡ又はｃＳＡ ＤＮＡ；例えば、配列（Ｈ）及び／又は配列（Ｌ）内の）の３’末端から位置１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、又は１～５にある。代わりに、少なくとも１つの脱塩基部位が、任意のＳＣ ＤＮＡの３’末端から並びに／又は本開示に従って調製される及び／若しくは使用される任意のｃＳＡ ＤＮＡの３’末端から位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又はその組合せにある。一部の実施形態では、少なくとも１つの脱塩基部位が、標的核酸（例えば、配列（Ｄ））の３’末端に相補的である任意のＳＣ ＤＮＡの配列の５’末端から及び／又はシグナルＤＮＡの３’末端に相補的である任意のＳＡ若しくはｃＳＡ ＤＮＡの配列の５’末端から位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又はその組合せにある。さらに代わりに、少なくとも１つの脱塩基部位が、任意のＳＣ ＤＮＡ及び／又は本発明に従って調製される若しくは使用される任意のｃＳＡ ＤＮＡ内のエンドヌクレアーゼ認識部位の３’末端から位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又はその組合せにある。
【0015】
さらに下で考察されるように、例えば、ＳＣ ＤＮＡに１つ以上の脱塩基部位を含む配列が本明細書で開示される方法を実施される際のバックグラウンドシグナルを減らす（例えば、標的非依存性増幅から生じることがあるシグナルを減らす）のに効果的であることを例証する本開示のある特定の実施形態が説明される。
【0016】
一部の実施形態では、ＳＣ ＤＮＡに（標的核酸の３’末端に相補的である配列（Ｄ）内に）及び／又は１つ以上のｃＳＡ ＤＮＡ（複数可）（例えば、第２のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）に相同な配列（Ｌ））に脱塩基部位を組み込めば、増幅反応での非特異的バックグラウンドシグナルの生成を取り除く又は減らすことができる。他の実施形態では、ＳＣ ＤＮＡ及び／又はｃＳＡ ＤＮＡ配列に脱塩基部位を組み込めば、標的核酸の特異的で正確な測定を可能にする一期間の間非特異的増幅事象の生成／発生を遅らせることができる。したがって、本開示は、いかなる検出可能な非特異的妨害バックグラウンドシグナルであれ生成される前に標的核酸（例えば、試料中の標的配列）の存在を示すシグナル配列（複数可）の測定を可能にする核酸分子（オリゴヌクレオチド）、組成物、キット、及び方法を提供する。
【0017】
図１Ａ～１Ｃに模式的に示されるように（すなわち、配列長又はハイブリダイズしているヌクレオチド対の数に関する目盛りまでは示されていない）、ＳＣ ＤＮＡ及びｃＳＡ ＤＮＡは、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）、（Ｅ）又は（Ｉ）の少なくとも一部に相補的である配列（Ｃ）、（Ｇ）又は（Ｋ）を含む。配列（Ｃ）、（Ｇ）又は（Ｋ）の少なくとも一部は、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）、（Ｅ）又は（Ｉ）の相補的領域の少なくとも一部とハイブリダイズして、ヘアピン（又はステムループ）構造を形成する。図１Ａ～１Ｃの非限定的実施形態で説明されるように、二本鎖ステムは一方の側ではエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）、（Ｆ）又は（Ｊ）を含む不対ループ領域と隣接し、もう一方の側では標的核酸（ＳＣ ＤＮＡの場合では）に相補的な配列又は上流シグナルＤＮＡ生成配列と隣接している。一部の実施形態では、ＳＣ ＤＮＡはｃＳＡ ＤＮＡとして機能することができる（すなわち、方法が別々の増幅オリゴヌクレオチド配列を含まない場合、ＳＣ ＤＮＡは標的からのシグナルを変換しかつ増幅する）。
【0018】
任意のシグナル変換オリゴヌクレオチド（ＳＣ ＤＮＡ）では、及び／又は任意のシグナル増幅オリゴヌクレオチド（ｃＳＡ ＤＮＡ又はＳＡ ＤＮＡ）では、シグナルＤＮＡ生成配列とシグナルＤＮＡ生成配列の少なくとも一部に相補的である配列は、一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことができるヘアピン構造を形成し、この部位はエンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列に相補的な配列を含む。エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列は、エンドヌクレアーゼにより認識される配列の内部、その下流又はその上流に存在してよく、したがって、そのような相補的ハイブリダイゼーションを通じて二本鎖配列を形成しうる。適切には、二本鎖になる場合、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）、（Ｆ）又は（Ｊ）は反応中に存在するエンドヌクレアーゼにより認識されることができ、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）、（Ｆ）又は（Ｊ）（又はエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）、（Ｆ）又は（Ｊ）に隣接している配列）は二本鎖ＤＮＡの１つの鎖だけで切断されうる（すなわち、切れ目を入れられる）。ＳＣ ＤＮＡの場合、標的核酸の結合は、ＤＮＡポリメラーゼによる複製をプライミングして、エンドヌクレアーゼに対する認識部位として役立つことができる活性のある二本鎖形態のエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）を生み出す。次に、新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位（Ｂ）での又は新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位（Ｂ）に隣接する部位でのエンドヌクレアーゼニッキングは、ＤＮＡポリメラーゼによる複製をプライミングして、シグナルＤＮＡを生み出す。ｃＳＡ ＤＮＡでは、上流シグナルＤＮＡの結合がＤＮＡポリメラーゼによる複製をプライミングして、エンドヌクレアーゼに対する認識部位として役立つことができる活性のある二本鎖形態のエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｆ）又は（Ｊ）を生み出す。次に、新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位（Ｆ）若しくは（Ｊ）での、又は新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位（Ｆ）若しくは（Ｊ）に隣接する部位でのエンドヌクレアーゼニッキングは、ＤＮＡポリメラーゼによる複製をプライミングして、シグナルＤＮＡを生み出す。図２Ａ～２Ｃに例証されるように、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）、（Ｆ）及び（Ｊ）は、ＳＣ ＤＮＡでもｃＳＡ ＤＮＡでもなく、新たに複製された鎖が切れ目を入れられるように、方向付けられる。すなわち、新たに複製された鎖が生み出されると、エンドヌクレアーゼ認識部位の配向は、新たに複製された鎖のエンドヌクレアーゼ活性（切断）を方向付ける。それ故に、エンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列に相補的な配列を含み、ＳＣ ＤＮＡオリゴヌクレオチド及びｃＳＡ ＤＮＡオリゴヌクレオチドが反応の間ずっと無傷のままでいる（すなわち、切れ目を入れられないし切断もされない）ことが可能になる。
【0019】
配列（Ｃ）、（Ｇ）及び／又は（Ｋ）は長さにより制限されることはなく、約５～約１００核酸塩基、及び５～１００の間のすべての整数が可能である。一部の実施形態では、配列（Ｃ）、（Ｇ）及び／又は（Ｋ）は、約５～約３０核酸塩基、及び５～３０の間のすべての整数が可能である。配列（Ｃ）、（Ｇ）及び／又は（Ｋ）は、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）、（Ｅ）及び／又は（Ｉ）と同じ長さである必要もない。一部の実施形態では、（Ｃ）、（Ｇ）及び／又は（Ｋ）は、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）、（Ｅ）及び／若しくは（Ｉ）と同じ長さであることが可能である、又は（Ｃ）、（Ｇ）及び／若しくは（Ｋ）は、約１～２０若しくは約１～１０塩基短いことが可能である。ＳＣ ＤＮＡ及びｃＳＡ ＤＮＡのステム構造は、一般に、約３～約６０核酸塩基対長に及ぶ二本鎖ＤＮＡの長さを含んでよい。一部の実施形態では、ステムは、約５～約２０核酸塩基対長及び５～２０の間のすべての整数に及ぶ二本鎖ＤＮＡの長さを含む。
【0020】
ステムはバルジ又はミスマッチも含むことができ、配列（Ｃ）、（Ｇ）及び／又は（Ｋ）は、配列（Ａ）、（Ｅ）及び／又は（Ｉ）に１００％相補的である必要はない。一部の実施形態では、配列（Ｃ）、（Ｇ）及び／又は（Ｋ）は、配列（Ｃ）、（Ｇ）及び／又は（Ｋ）のすべてに又は一部に１００％相補的でよい。例えば、配列（Ｃ）は配列（Ａ）に約５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％よりも多く相補的であることが可能であり、配列（Ｇ）は配列（Ｅ）に約５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％よりも多く相補的であることが可能であり配列（Ｋ）は配列（Ｉ）に約５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％よりも多く相補的であることが可能である。いかなる塩基対合ミスマッチにもかかわらず、２つの配列は一般に適切な条件下で互いに選択的にハイブリダイズする能力を有する。一部の実施形態では、配列（Ａ）と配列（Ｃ）の間、配列（Ｅ）と配列（Ｇ）の間、及び配列（Ｉ）と配列（Ｋ）の間の相補性の量は約８０％～１００％であり、これは、例えば、本明細書で開示される条件などの厳密な又は高度に厳密な条件下でのハイブリダイゼーションを可能にすることができる。
【0021】
一部の実施形態では、例えば、ＳＣ ＤＮＡの配列（Ａ）及び（Ｃ）のステム－ループ構造部分並びに配列（Ｅ）及び（Ｇ）又は配列（Ｉ）及び（Ｋ）のステム－ループ構造部分の二本鎖ステムは、２０％～７０％の任意のパーセンテージを含む、約２０％～約７０％に及ぶＧＣ含量を有することができる。
【0022】
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）、（Ｆ）又は（Ｊ）の少なくとも一部は、ステムループ構造の一本鎖ループに位置している。一部の実施形態では、全エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）、（Ｆ）又は（Ｊ）は、ループ領域を含む配列に位置している。一般に、ステムループ構造中のループは、約３～約３０ヌクレオチド塩基及び中間の任意の数が可能である。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）は、４～約１０ヌクレオチド塩基長及び４と１０の間のすべての整数である。
【0023】
本開示は、標的核酸（例えば、試料中の標的配列）の存在を示すシグナルＤＮＡの測定を可能にする核酸分子（例えば、本明細書に開示されるＳＣ及びｃＳＡ ＤＮＡ）、組成物、キット及び方法も提供する。例えば、一部の実施形態では、試料中の約１ｎＭ～約１ｆＭの標的核酸の存在から生じるシグナルは、約１０～約１２０、約５～約１２０、又は約３～約１２０分内で検出可能である。
【0024】
この態様の実施形態では、ポリメラーゼは鎖置換活性を有することがある。さらなる実施形態では、ポリメラーゼは、３’から５’エキソヌクレアーゼ欠損、５’から３’エキソヌクレアーゼ欠損、又は３’から５’エキソヌクレアーゼ欠損と５’から３’エキソヌクレアーゼ欠損の両方でもよい。一部の実施形態では、ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼを含む。
【0025】
一実施形態では、エンドヌクレアーゼは、オリゴヌクレオチドに切れ目を入れる反応において使用できるニッキングエンドヌクレアーゼ又は制限エンドヌクレアーゼを含んでよい。（Ｂ）ＳＣ ＤＮＡの、（Ｅ）第１のｃＳＡ ＤＮＡ１の、（Ｈ）第２のｃＳＡ ＤＮＡ２のエンドヌクレアーゼ認識部位及び／又は任意のそれに続くｃＳＡ ＤＮＡに位置する任意の他のエンドヌクレアーゼ部位は、同一であるか、異なっているか、又は同じ及び異なる（例えば、２つは同一であり３番目は異なる）エンドヌクレアーゼ部位（複数可）の組合せが可能である。
【0026】
本明細書で開示される方法は、典型的なＤＮＡ増幅条件（例えば、標準的ＰＣＲに関連する典型的な温度、反応物濃度、時間サイクル、等）下で実施してよいが、一部の実施形態では、本方法は、等温条件下で又は実質的に一定温度下で実施してもよい。さらなる実施形態では、方法は標準的ＰＣＲ法で使用される温度よりも低い温度で実施してよい。一例として、方法の一部の実施形態は、下に記載される標的核酸（Ｔ）及びＳＣ ＤＮＡの配列（Ｄ）の、又はシグナルＤＮＡ及びｃＳＡ ＤＮＡの相補的配列の計算された最適ハイブリダイゼーション若しくはアニーリング温度、又は実験的に決定されたハイブリダイゼーション若しくはアニーリング温度での又はそれよりも下の温度で実施してよい。方法の一部の実施形態は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチド中のヘアピン構造の融解温度での又はそれよりも下の温度で実施してよい。一実施形態では、本方法は、ＳＣ ＤＮＡの配列（Ｄ）に結合している標的核酸（Ｔ）、又はｃＳＡ ＤＮＡの適切な配列に結合しているシグナルＤＮＡの融解温度よりも下の温度で実施してよい。さらに他の実施形態では、本方法は、ポリメラーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼ活性を可能にする温度で実施してよい。さらなる実施形態では、本方法は、試料中の標的核酸の検出のために反応混合物中に存在するポリメラーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼについての最適反応温度である又は約最適反応温度である温度で実施してよい。
【0027】
別の態様では、本開示は、５’から３’方向に、第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と、第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）の少なくとも一部に相補的である第１の相補的配列（Ｃ）及びその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し標的核酸の３’末端に相補的である第２の相補的配列（Ｄ）を含む相補的配列とを含み、第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相補的である配列（Ｃ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、本明細書では「配列変換ＤＮＡ」（又は「ＳＣ ＤＮＡ」）と呼ばれる場合もある化学修飾されたオリゴヌクレオチドに関する。
【0028】
別の態様では、本開示は、５’から３’方向に、特有のシグナルＤＮＡ生成配列（例えば、対になったＳＣ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）とは異なる）と、エンドヌクレアーゼ認識部位と、１つの配列領域が特有のシグナルＤＮＡ生成配列の少なくとも一部に相補的であり、第２の配列領域が任意選択的に、その中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し、配列変換ＤＮＡ（ＳＣ ＤＮＡ）のシグナルＤＮＡ生成配列に又は異なるｃＳＡ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列に相同である配列を有する２つの配列領域とを含む配列を含み、特有のシグナルＤＮＡ生成配列の少なくとも一部と特有のシグナルＤＮＡ生成配列に相補的な配列がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、本明細書では「シグナル増幅ＤＮＡ」、「カスケードシグナル増幅ＤＮＡ」（例えば、「ＳＡ ＤＮＡ」又は「ｃＳＡ ＤＮＡ」）と呼ばれる場合があるオリゴヌクレオチドに関する。
【0029】
図に関して、例えば、別の態様では、本開示は、５’から３’方向に、第２の特有なシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｆ）と、シグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）の少なくとも一部に相補的な配列（Ｇ）と、配列変換ＤＮＡ（ＳＣ ＤＮＡ）のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同な配列（Ｈ）とを含み、配列（Ｈ）が任意選択的に、その中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し、第２のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）に相補的である配列（Ｇ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、本明細書では「第１のカスケードシグナル増幅ＤＮＡ１」（又は「ｃＳＡ ＤＮＡ１」）と呼ばれる場合もある、オリゴヌクレオチドに関する。
【0030】
さらなる態様では、本開示は、５’から３’方向に、第３の特有なシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｊ）と、シグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）の少なくとも一部に相補的な配列（Ｋ）と、第１のカスケードシグナル増幅ＤＮＡ１」（ｃＳＡ ＤＮＡ１）のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）に相同な配列（Ｌ）とを含み、配列（Ｌ）が任意選択的に、その中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し、第３のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）に相補的である配列（Ｋ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、本明細書では「第２のカスケードシグナル増幅ＤＮＡ２」（又は「ｃＳＡ ＤＮＡ２」）と呼ばれる場合もある、もう１つのオリゴヌクレオチドに関する。
【0031】
標的核酸配列は、目的の任意のヌクレオチド配列でよく、一部の実施形態では、感染病原体又はマイクロＲＮＡから生じる配列を含みうる。他の実施形態では、標的核酸は、疾患又は障害に関連することがある遺伝子由来の配列を含みうる。
【0032】
一部の実施形態では、本開示に従って調製される及び／又は使用されるオリゴヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位（例えば、ＳＣ ＤＮＡエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）並びにｃＳＡ ＤＮＡエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｅ）及び（Ｈ））は、エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列に相補的な配列を含む。他の実施形態では、エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列は、エンドヌクレアーゼにより特異的に認識される配列に隣接している（下流又は上流で）。
【0033】
さらなる態様では、本開示は、試料中の標的核酸を検出するための組成物であって、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのうちの１つ以上を含む前記組成物に関する。この態様の一部の例となる実施形態は、５’から３’方向に、第１の特有のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）の少なくとも一部に相補的である第１の相補的配列（Ｃ）及びその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し標的核酸の３’末端に相補的である第２の相補的配列（Ｄ）を含む相補的配列とを含み、第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相補的である配列（Ｃ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第１のオリゴヌクレオチド（配列変換ＤＮＡ又はＳＣ ＤＮＡ）；５’から３’方向に、第２の特有のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｆ）と、シグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）の少なくとも一部に相補的である配列（Ｇ）を含む相補的配列と、第１のＳＣ ＤＮＡオリゴヌクレオチドの第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同である配列（Ｈ）とを含み、配列（Ｈ）が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し、第２のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）に相補的な配列（Ｇ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第２のオリゴヌクレオチド（カスケードシグナル増幅ＤＮＡ１又はｃＳＡ ＤＮＡ１）；５’から３’方向に、第３の特有のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｊ）と、シグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）の少なくとも一部に相補的である配列（Ｋ）及び第２のオリゴヌクレオチドｃＳＣ ＤＮＡ１の第２のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）に相同な配列（Ｌ）を含む配列領域とを含み、配列（Ｌ）が任意選択的に少なくとも１つの脱塩基部位を有し、シグナル（Ｌ）が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し、第３のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）に相補的な配列（Ｋ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第３のオリゴヌクレオチド（カスケードシグナル増幅ＤＮＡ２又はｃＳＡ ＤＮＡ２）；ポリメラーゼ、並びにニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼを含む組成物を提供する。この態様の実施形態では、組成物は、シグナルＤＮＡの存在又は非存在を判定し、シグナルＤＮＡの存在が試料中の標的核酸の存在を示すための方法において使用される。
【0034】
組成物は、ポリメラーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼ認識部位が二本鎖になっている場合はエンドヌクレアーゼも含むことができ、エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ認識部位（ＳＣ ＤＮＡのエンドヌクレアーゼ認識部位、及び存在する任意のｃＳＡ ＤＮＡの任意のエンドヌクレアーゼ認識部位（例えば、第１のｃＳＡ ＤＮＡ１のエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｆ）及び第２のｃＳＡ ＤＮＡ２のエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｊ））において、又はエンドヌクレアーゼ認識部位に隣接して、切れ目を入れることができる。それぞれの覆われた構造（すなわち、ヘアピン構造）では、新たに複製された鎖が生成される場合、エンドヌクレアーゼ認識部位の配向は、新たに複製された鎖のエンドヌクレアーゼ活性（すなわち、ニッキング／切断）を方向付ける。それゆえに、エンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列に相補的な配列を含み、これにより、ＳＣ ＤＮＡ又はｃＳＡ ＤＮＡが反応の間ずっと無傷のままでいることが可能になる。組成物は、反応バッファーなどの他の試薬、デオキシリボヌクレオチド及び、例えば、新たに合成されたＤＮＡの蛍光検出用のフルオロフォア修飾プローブＤＮＡ（例えば、分子ビーコンプローブ）などのレポーター分子も含むことができる。
【0035】
さらに別の態様では、本開示は、試料中の標的核酸を検出するためのキットであって、５’から３’方向に、第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）の少なくとも一部に相補的である第１の相補的配列（Ｃ）及びその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し標的核酸の３’末端に相補的である第２の相補的配列（Ｄ）を含む相補的配列とを含み、第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相補的である配列（Ｃ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第１のオリゴヌクレオチド（配列変換ＤＮＡ又はＳＣ ＤＮＡ）；５’から３’方向に、第２の特有のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｆ）と、シグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）の少なくとも一部に相補的である配列（Ｇ）及び第１のＳＣ ＤＮＡオリゴヌクレオチドの第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同である配列（Ｈ）を含む配列領域とを含み、配列（Ｈ）が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し、第２のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）に相補的な配列（Ｇ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第２のオリゴヌクレオチド（カスケードシグナル増幅ＤＮＡ１又はｃＳＡ ＤＮＡ１）；５’から３’方向に、第３の特有のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｊ）と、シグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）の少なくとも一部に相補的である配列（Ｋ）及び第２のオリゴヌクレオチドｃＳＣ ＤＮＡ１の第２のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）に相同である配列（Ｌ）を含む配列領域とを含み、配列（Ｌ）が任意選択的に少なくとも１つの脱塩基部位を有し、シグナル（Ｌ）が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し、第３のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）に相補的な配列（Ｋ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第３のオリゴヌクレオチド（カスケードシグナル増幅ＤＮＡ２又はｃＳＡ ＤＮＡ２）を含む前記キットに関する。一部の実施形態では、キットは、ポリメラーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼ認識部位若しくはエンドヌクレアーゼ認識部位に隣接する部位に切れ目を入れることができるエンドヌクレアーゼをさらに含むことができる。キットは、反応バッファーなどの試薬、デオキシリボヌクレオチド及び、例えば、シグナルＤＮＡなどの新たに合成されたＤＮＡの蛍光検出用のフルオロフォア修飾プローブＤＮＡ（例えば、分子ビーコンプローブ）などのレポーター分子も含むことができる。キットは、本明細書で開示される方法のうちのいずれか１つを実行するのに使用するための説明書も含むことができる。
【0036】
本明細書で開示される方法、オリゴヌクレオチド、組成物及びキットは、総合システムプラットホームと組み合わせて使用してよい。例えば、本発明の方法、オリゴヌクレオチド、組成物及びキットは、例えば、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）により、例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）又はＡｂｂｏｔｔ Ａｌｉｎｉｔｙ ｄｅｖｉｃｅｓのシリーズとして市販されている組合せ方式で使用しうる。本明細書で開示される方法、オリゴヌクレオチド、組成物及びキットは、例えば、ｍ２０００ｓｐ試料調製システム（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）などの試料調製システムプラットホームと一緒に使用しうる。同様に、本明細書で開示される方法、オリゴヌクレオチド、組成物及びキットは、例えば、Ａｂｂｏｔｔ’ｓ ｉ－ＳＴＡＴ ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｃａｒｅ ｓｙｓｔｅｍ（例えば、ｉ－ＳＴＡＴ ａｎｄ ｉ－ＳＴＡＴ Ａｌｉｎｉｔｙ、Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）などのポイントオブケアシステムプラットホームと一緒に使用してよく、任意選択的に、他のプラットホーム（例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（Ｒｏｗｖｉｌｌｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）（例えば、ＵＳ ２００６／０１３４７１３参照）、Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ ＰｏＣ ＡＳ（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）及びＣｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＵＳＡ））上で用いてもよい。さらに、本発明の方法、オリゴヌクレオチド、組成物及びキットは、例えば、ハンドヘルド蛍光検出器、マイクロｐＨメーター、マイクロ流体デバイス、マイクロアレイ、酵素検出システム、免疫クロマトグラフィー試験片、及びラテラルフローデバイスなどのいかなる数の他のデバイス、アッセイプラットホーム、及び計測手段と一緒に使用することも可能である。
【0037】
本明細書で開示される方法、オリゴヌクレオチド、組成物及びキットは、非感染性及び感染性疾患の診断を含む分子診断の分野で使用しうる。例えば、本発明の方法、オリゴヌクレオチド、組成物及びキットを使用すれば、がん及び他の遺伝性疾患を検出できる。同様に、本発明の方法、オリゴヌクレオチド、組成物及びキットを使用すれば、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、クラミジア・トラコマチス、淋病、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、又は呼吸器多核体ウイルスなどの感染性疾患から生じる標的核酸検出できる。
【0038】
本開示により提供される追加の態様、実施形態及び利点は、以下に続く説明に照らせば明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1A】図１Ａは、試料中の標的核酸を検出するための配列変換ＤＮＡ（ＳＣ ＤＮＡ）の非限定的例を模式的に図解する（すなわち、ノンスケール）図である。ＳＣ ＤＮＡは、５’から３’方向に、第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）と、ニッキング反応で使用できるエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）の少なくとも一部に相補的である第１の相補的配列（Ｃ）及びその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し標的核酸に相補的である第２の相補的配列（Ｄ）を含む相補的配列とを含み、第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相補的である配列（Ｃ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する。
【図1B】図１Ｂは、試料中の標的核酸を検出するための第１のカスケードシグナル増幅ＤＮＡ１（ｃＳＡ ＤＮＡ１）の非限定的例を模式的に図解する（すなわち、ノンスケール）図である。ｃＳＡ ＤＮＡ１は、５’から３’方向に、第２の特有のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｆ）と、シグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）の少なくとも一部に相補的である配列（Ｇ）及び第１のＳＣ ＤＮＡの第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同である配列（Ｈ）を含む配列領域とを含み、配列（Ｈ）が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し、第２のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）に相補的な配列（Ｇ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する。
【図1C】図１Ｃは、試料中の標的核酸を検出するための第２のカスケードシグナル増幅ＤＮＡ２（ｃＳＡ ＤＮＡ２）の非限定的例を模式的に図解する（すなわち、ノンスケール）図である。ｃＳＡ ＤＮＡ２は、５’から３’方向に、第３のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）と；エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｊ）と；シグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）の少なくとも一部に相補的である配列（Ｋ）及び第１のｃＳＣ ＤＮＡ１の第２のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）に相同である配列（Ｌ）を含む配列領域とを含み、配列（Ｌ）が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し、第３のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）に相補的な配列（Ｋ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する。
【図2A】図２Ａは、試料中の標的核酸を検出するための本開示の配列変換（ＳＣ）ＤＮＡとの標的（Ｔ）核酸の例示的反応の進行を模式的に図解する（すなわち、ノンスケール）図である。配列（Ａ）～（Ｄ）は図１Ａに記載される通りであり、配列（Ｔ）は標的配列を表し、配列（Ｘ）は配列（Ｄ）に結合している標的（Ｔ）がポリメラーゼにより伸長されると生成される配列を表し、配列（Ｘ’）は切れ目を入れられた伸長配列を表し、配列（Ｓ１）は、標的（Ｔ）核酸がＳＣ ＤＮＡに結合すると最終的に生成される第１のシグナルＤＮＡ配列を表す。
【図2B】図２Ｂは、試料中の標的核酸を検出するための第１のカスケードシグナル増幅ＤＮＡ１（ｃＳＡ ＤＮＡ１）とのシグナルＤＮＡ（Ｓ１）の例示的反応の進行を模式的に図解する（すなわち、ノンスケール）図である。配列（Ｅ）～（Ｈ）は図１Ｂに記載される通りであり、配列（Ｓ１）は図２Ａに記載される標的（Ｔ）核酸とＳＣ ＤＮＡの反応から生成されるシグナルＤＮＡであり、配列（Ｙ）は配列（Ｈ）に結合しているシグナルＤＮＡ（Ｓ１）がポリメラーゼにより伸長されると生成される配列を表し、配列（Ｙ’）は切れ目を入れられた伸長配列を表し、配列（Ｓ２）は最終的に生成される特有のシグナルＤＮＡ配列を表す。ｃＳＡ ＤＮＡ１シグナル生成配列（Ｅ）はＳＣシグナル生成配列（Ａ）に非相同的であるため、異なる特有のシグナルＤＮＡ（Ｓ２）が生成される。
【図2C】図２Ｃは、試料中の標的核酸を検出するための第２のカスケードシグナル増幅ＤＮＡ２（ｃＳＡ ＤＮＡ２）とのシグナルＤＮＡ（Ｓ２）の例示的反応の進行を模式的に図解する（すなわち、ノンスケール）図である。配列（Ｉ）～（Ｌ）は図１Ｃに記載される通りであり、配列（Ｓ２）は図２Ｂに記載される通り生成されるシグナルＤＮＡであり、配列（Ｕ）は配列（Ｌ）に結合しているシグナルＤＮＡ（Ｓ２）がポリメラーゼにより伸長されると生成される配列を表し、配列（Ｕ’）は切れ目を入れられた伸長配列を表し、配列（Ｓ３）は最終的に生成される特有のシグナルＤＮＡ配列を表す。ｃＳＡ ＤＮＡ２シグナル生成配列（Ｉ）はｃＳＡ１シグナル生成配列（Ｅ）に非相同的であるため、異なる特有のシグナルＤＮＡ（Ｓ３）が生成される。
【発明を実施するための形態】
【0040】
一般的な意味で、本開示は、試験試料中の標的核酸を検出するのに驚くほど効果的である核酸構築物に関する。本明細書で開示される構築物は、標的核酸の存在下で生み出されるシグナルＤＮＡの生成を可能にする核酸配列を含む。本明細書で開示される方法及び核酸構築物は、低温度及び等温条件下で有利に実施しうる標的核酸の選択的及び感度のよい検出を提供する。
【0041】
この態様の実施形態では、本開示は、試料中の標的核酸を検出するのに有用である新規の配列変換（ＳＣ）及びカスケードシグナル増幅（ｃＳＡ）オリゴヌクレオチド構築物、並びにその組合せを提供する。図１Ａの図解的実施形態により描かれるように、試料中の標的核酸の検出用の配列変換ＤＮＡ（ＳＣ ＤＮＡ）オリゴヌクレオチドは、５’から３’方向に、第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）と、ニッキング反応で使用できるエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と、少なくとも１つの脱塩基部分を含む相補的配列を含み、相補的配列はシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）の少なくとも一部に相補的である第１の相補的配列（Ｃ）及びその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し標的核酸に相補的である第２の相補的配列（Ｄ）とを含み、第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相補的である配列（Ｃ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する。この態様の一部の実施形態では、相補的配列（すなわち、（Ｃ）及び（Ｄ）を含む）は複数の脱塩基部分を含む。一部のさらなる実施形態では、第２の相補的配列（Ｄ）は、標的核酸の３’末端に相補的であり、複数の脱塩基部位（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０脱塩基部位）を含む。一部の実施形態では、化学修飾ＳＣ ＤＮＡオリゴヌクレオチドは３’末端修飾をさらに含む。
【0042】
図１Ｂの図解的実施形態により描かれるように、試料中の標的核酸の検出用の第１のカスケードシグナル増幅ＤＮＡ（ｃＳＡ ＤＮＡ１）は、５’から３’方向に、第２の特有のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｆ）（エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と同じである又は異なることが可能である）と、シグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）の少なくとも一部に相補的である配列（Ｇ）及び第１のＳＣ ＤＮＡの第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同である配列（Ｈ）を含む配列領域とを含み、配列（Ｈ）が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し、第２のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）に相補的な配列（Ｇ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する。この態様の一部の実施形態では、配列（Ｈ）は、第１のＳＣ ＤＮＡの第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同であり、複数の脱塩基部位（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０脱塩基部位）を含む。一部の実施形態では、化学修飾オリゴヌクレオチドは３’末端修飾をさらに含む。
【0043】
図１Ｃの図解的実施形態により描かれるように、試料中の標的核酸の検出用の第２のカスケードシグナル増幅ＤＮＡ２（ｃＳＡ ＤＮＡ２）は、５’から３’方向に、第３の特有なシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）と；エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｊ）（エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）及び（Ｆ）と同じである又は異なることが可能である）と；シグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）の少なくとも一部に相補的である配列（Ｋ）及び第１のｃＳＡ ＤＮＡ１の第２のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）に相同である配列（Ｌ）を含む配列領域とを含み、配列（Ｌ）が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し、第３のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）に相補的な配列（Ｋ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する。この態様の一部の実施形態では、配列（Ｌ）は、第１のｃＳＡ ＤＮＡ１の第２のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）に相同であり、複数の脱塩基部位（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０又はそれよりも多い脱塩基部位）を含む。一部の実施形態では、化学修飾オリゴヌクレオチドは３’末端修飾をさらに含む。
【0044】
本開示の実施形態では、ＳＣ ＤＮＡの配列（Ｄ）はその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し標的核酸に相補的であり、ＳＣ ＤＮＡの又は異なるｃＳＡ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列に実質的に相同であるｃＳＡ ＤＮＡの配列は、任意選択的に、その中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有する。他の実施形態では、ＳＣ ＤＮＡの配列（Ｄ）だけがその中に組み込まれた１つ以上の脱塩基部位を含む。脱塩基部位は以下の一般構造を有する：
【0045】
【化1】
【0046】
例えば、ＳＣ ＤＮＡの配列（Ｄ）中に及び／又は任意選択的に、ＳＣ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列に実質的に相同であるｃＳＡ ＤＮＡの又は本明細書に記載される異なるｃＳＡ ＤＮＡの配列中に脱塩基部位を組み込むことにより、非特異的バックグラウンドシグナル増幅は完全に取り除かれるか、減らされるか、又は非特異的バックグラウンドシグナルからのいかなる実質的な妨害もなしで、標的核酸の存在から生じるシグナル配列を検出するのに十分である期間遅延される。例えば、ある特定の実施形態では、本発明の方法、オリゴヌクレオチド、組成物、及びキットを使用する場合、非特異的バックグラウンドシグナル増幅は９９～１０％減少、９９～２０％減少、９９～３０％減少、９９～５０％減少、又は９９～７０％減少する。ある特定の実施形態では、ＳＣ ＤＮＡの配列（Ｄ）中に、及びＳＣ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列に実質的に相同であるＳＡ ＤＮＡの配列の一部中に１つ以上の脱塩基部位を組み込めば、非特異的バックグラウンドシグナル増幅を平均で少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、若しくは５０％若しくはそれよりも多く、又は平均で約１０％、約２０％、若しくは約３０％減少させることができる。
【0047】
本明細書の図に示されるように、本明細書で開示されるＳＣ及びｃＳＡ ＤＮＡは、シグナル生成配列（例えば、ＳＣ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）；ｃＳＡ ＤＮＡ１のシグナル生成配列（Ｅ）；及びｃＳＡ ＤＮＡ２のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ））を含む。これらのシグナル生成配列は、いかなる所望の核酸配列でも含むことができ、いかなる特定の配列にも限定されない。下でさらに詳細に考察されるように、これらのシグナル生成配列は、シグナルＤＮＡ（例えば、Ｓ１、Ｓ２及びＳ３）の生成にむけて鋳型の少なくとも一部を提供する。これらのシグナル生成配列は長さにより限定されない。一部の実施形態では、本開示のＳＣ ＤＮＡ及び／又はｃＳＡ ＤＮＡ（複数可）中のシグナル生成配列は、約５～約１００核酸塩基であり、５から１００までのすべての整数である。一部の実施形態では、ＳＣ ＤＮＡ及び／又はｃＳＡ ＤＮＡ（複数可）中のシグナル生成配列は、約５～約３０核酸塩基であり、５から３０までのすべての整数である。一部の実施形態では、ＳＣ ＤＮＡ及び／又はｃＳＡ ＤＮＡ（複数可）中のシグナル生成配列は、約１０～約３０核酸塩基であり、１０から３０までのすべての整数である。さらにさらなる実施形態では、ＳＣ ＤＮＡ及び／又はｃＳＡ ＤＮＡ（複数可）中のシグナル生成配列は、約１５～約３０核酸塩基であり、１５から３０までのすべての整数（例えば、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、又は約３０塩基）である。
【0048】
さらなる態様では、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）；その中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し標的核酸の３’末端に相補的である配列（Ｄ）；シグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）；及びシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に実質的に相同である配列（Ｈ）の長さは変動してもよいが、典型的には、これらの配列のそれぞれはその他とおおよそ同じ長さである。一部の実施形態では、これらの配列の１つ又は組合せの長さは、約５～約１００ヌクレオチドの範囲にあってよいが、さらに典型的には、約５～約３０、約１０～約３０、又は約１５～約３０ヌクレオチド長である。エンドヌクレアーゼ認識部位は、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼにより認識される、結合を受ける、及び切れ目を入れられることが可能な配列を含む。そのような配列は当技術分野では一般に公知である。エンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼ結合部位の５’側又は３’側（又は５’と３’の両方）に追加のヌクレオチドを含むことができるが、典型的には１０ヌクレオチド長以下である。
【0049】
本明細書に記載されるある特定の実施形態では、標的核酸の３’末端に相補的なＳＣ ＤＮＡの配列（Ｄ）における、及び任意選択的に、ＳＣ ＤＮＡの又は異なるｃＳＡ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列に実質的に相同である任意のｃＳＡ ＤＮＡ（例えば、ＳＣ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に実質的に相同であるＳＡ ＤＮＡの配列（Ｈ））の配列における脱塩基部位、又は複数の脱塩基部位の位置は、配列の３’末端に関して特定され、変動することがある。一部の実施形態では、配列中の脱塩基部位又は複数の脱塩基部位の位置は、標的核酸に相補的である配列の５’末端、シグナル配列に相補的な配列の５’末端、又はエンドヌクレアーゼ認識部位の３’末端に関して特定されうる。したがって、一部の実施形態では、脱塩基部位（単数又は複数）は、標的核酸の３’末端に相補的な配列の５’末端から位置３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はその組合せに（又は、代わりに、エンドヌクレアーゼ認識部位の３’末端の位置と比べてその同じ位置に）位置している。一部の実施形態では、脱塩基部位は、前記標的核酸の３’末端に相補的な前記配列の５’末端から７位に位置している。一部の実施形態では、２つの脱塩基部位は、前記標的核酸の３’末端に相補的な前記配列の５’末端から７及び８位に位置している。一部の実施形態では、３つの脱塩基部位は、前記標的核酸の３’末端に相補的な前記配列の５’末端から７、８及び９位に位置している。さらなる実施形態では、４つの脱塩基部位は、前記標的核酸の３’末端に相補的な前記配列の５’末端から７、８、９及び１０位に位置している。
【0050】
一部の別の実施形態では、脱塩基部位又は複数の脱塩基部位は、オリゴヌクレオチド配列の３’末端から位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０に位置している。単一の脱塩基部位を含む一部の実施形態では、脱塩基部位は、オリゴヌクレオチド配列の３’末端から位置１、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０のいずれかに位置している。
標的核酸の３’末端に相補的なＳＣ ＤＮＡの配列（Ｄ）及び／又はＳＣ ＤＮＡの又は異なるｃＳＡ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列に実質的に相同である任意のｃＳＡ ＤＮＡの配列が２つの脱塩基部位を含む実施形態では、脱塩基部位は、それぞれの配列の３’末端から位置１～３０から選択される２つの位置のいずれの組合せでも位置してよい。
標的核酸の３’末端に相補的なＳＣ ＤＮＡの配列（Ｄ）及び／又はＳＣ ＤＮＡの又は異なるｃＳＡ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列に実質的に相同である任意のｃＳＡ ＤＮＡの配列が２つの脱塩基部位を含む実施形態では、脱塩基部位は、それぞれの配列の３’末端から位置１～３０から選択される２つの位置のいずれの組合せでも位置してよい。
【0051】
標的核酸の３’末端に相補的なＳＣ ＤＮＡの配列（Ｄ）及び／又はＳＣ ＤＮＡの又は異なるｃＳＡ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列に実質的に相同である任意のｃＳＡ ＤＮＡの配列が３つの脱塩基部位を含む実施形態では、脱塩基部位は、それぞれの配列の３’末端から位置１～３０から選択される３つの位置のいずれの組合せでも位置してよい。
【0052】
標的核酸の３’末端に相補的なＳＣ ＤＮＡの配列（Ｄ）及び／又はＳＣ ＤＮＡの又は異なるｃＳＡ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列に実質的に相同である任意のｃＳＡ ＤＮＡの配列が４つの脱塩基部位を含む実施形態では、脱塩基部位は、それぞれの配列の３’末端から位置１～３０から選択される４つの位置のいずれの組合せでも位置してよい。
【0053】
ＳＣ ＤＮＡ及びｃＳＡ ＤＮＡは、エンドヌクレアーゼ認識部位（例えば、ＳＣ ＤＮＡエンドヌクレアーゼ部位（Ｂ）並びにｃＳＡ ＤＮＡ１エンドヌクレアーゼ部位（Ｆ）及びｃＳＡ ＤＮＡ２エンドヌクレアーゼ部位（Ｊ））を含み、これらの部位は同じでも異なっていてもよい。一本鎖形態（例えば、図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃの構造）では、エンドヌクレアーゼ認識部位（例えば、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）、（Ｆ）及び（Ｊ））はエンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列に相補的な配列を含む。エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列は、エンドヌクレアーゼにより認識される配列内に、それから下流に、又は上流に存在してもよい。適切には、二本鎖の場合、エンドヌクレアーゼ認識部位（例えば、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）、（Ｆ）及び（Ｊ））は、反応中に存在する１つ以上のエンドヌクレアーゼにより認識されることが可能であり、エンドヌクレアーゼ認識部位（又はエンドヌクレアーゼ認識部位に隣接する配列）は二本鎖ＤＮＡの一本鎖だけが切断され（すなわち、切れ目を入れられ）うる。
【0054】
下でさらに詳細に説明されるように、ＳＣ ＤＮＡの相補的配列（Ｄ）に標的核酸が結合すると、ＤＮＡポリメラーゼを介して複製をプライミングして、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）の、活性のある二本鎖形態を生み出し、これはその後エンドヌクレアーゼに対する認識部位として働くことができる（図２Ａ）。次に、エンドヌクレアーゼが、新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位（Ｂ）で、又は新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位（Ｂ）に隣接する部位で切れ目を入れると、ＤＮＡポリメラーゼを介して複製をプライミングして、第１のシグナルＤＮＡ（Ｓ１）を生成する（例えば、図２Ａ参照）。図２Ａで図解されているように、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）は、ＳＣ ＤＮＡではなく新たに複製された鎖が切れ目を入れられるように配向される。すなわち、新たに複製された鎖が生成されると、（Ｂ）中のエンドヌクレアーゼ認識部位の配向が、新たに複製された鎖のエンドヌクレアーゼ活性（切断）を方向付ける。したがって、エンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列に相補的な配列を含み、ＳＣオリゴヌクレオチドが反応の間ずっと無傷のままでいる（すなわち、ＳＣ ＤＮＡは切れ目も入れられないし切断もされない）ことが可能になる。
下でさらに詳細に説明されるように、ｃＳＡ ＤＮＡ１の配列（Ｈ）にＳＣ ＤＮＡのシグナル生成配列（Ａ）から生成される第１のシグナルＤＮＡ（Ｓ１）が結合すると、ＤＮＡポリメラーゼを介して複製をプライミングして、ｃＳＡ ＤＮＡ１のエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｆ）の、活性のある二本鎖形態を生み出し、これはエンドヌクレアーゼに対する認識部位として働くことができる（図２Ｂ）。次に、エンドヌクレアーゼが、ｃＳＡ ＤＮＡ１の新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位（Ｆ）で、又は新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位（Ｆ）に隣接する部位で切れ目を入れると、ＤＮＡポリメラーゼを介して複製をプライミングして、ＳＣ ＤＮＡから生成された第１のシグナルＤＮＡ（Ｓ１）とは異なる第２のシグナルＤＮＡ（Ｓ２）を生成する（図２Ｂ）。図２Ｂで図解されているように、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｆ）は、ｃＳＡ ＤＮＡ１ではなく新たに複製された鎖が切れ目を入れられるように配向される。すなわち、新たに複製された鎖が生成されると、（Ｆ）中のエンドヌクレアーゼ認識部位の配向が、新たに複製された鎖のエンドヌクレアーゼ活性（切断）を方向付ける。したがって、エンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列に相補的な配列を含み、ｃＳＡ ＤＮＡ１オリゴヌクレオチドが反応の間ずっと無傷のままでいる（すなわち、ｃＳＡ ＤＮＡ１は切れ目も入れられないし切断もされない）ことが可能になる。
下でさらに詳細に説明されるように、ｃＳＡ ＤＮＡ１の配列（Ｈ）にＳＣ ＤＮＡのシグナル生成配列（Ａ）から生成される第１のシグナルＤＮＡ（Ｓ１）が結合すると、ＤＮＡポリメラーゼを介して複製をプライミングして、ｃＳＡ ＤＮＡ１のエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｆ）の、活性のある二本鎖形態を生み出し、これはエンドヌクレアーゼに対する認識部位として働くことができる（図２Ｂ）。次に、エンドヌクレアーゼが、ｃＳＡ ＤＮＡ１の新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位（Ｆ）で、又は新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位（Ｆ）に隣接する部位で切れ目を入れると、ＤＮＡポリメラーゼを介して複製をプライミングして、ＳＣ ＤＮＡから生成された第１のシグナルＤＮＡ（Ｓ１）とは異なる第２のシグナルＤＮＡ（Ｓ２）を生成する（図２Ｂ）。図２Ｂで図解されているように、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｆ）は、ｃＳＡ ＤＮＡ１ではなく新たに複製された鎖が切れ目を入れられるように配向される。すなわち、新たに複製された鎖が生成されると、（Ｆ）中のエンドヌクレアーゼ認識部位の配向が、新たに複製された鎖のエンドヌクレアーゼ活性（切断）を方向付ける。したがって、エンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列に相補的な配列を含み、ｃＳＡ ＤＮＡ１オリゴヌクレオチドが反応の間ずっと無傷のままでいる（すなわち、ｃＳＡ ＤＮＡ１は切れ目も入れられないし切断もされない）ことが可能になる。
【0055】
下でさらに詳細に説明されるように、ｃＳＡ ＤＮＡ２の配列（Ｌ）に第１のｃＳＡ ＤＮＡ１のシグナル生成配列（Ｅ）から生成される第２のシグナルＤＮＡ（Ｓ２）が結合すると、ＤＮＡポリメラーゼを介して複製をプライミングして、ｃＳＡ ＤＮＡ２のエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｊ）の、活性のある二本鎖形態を生み出し、これはエンドヌクレアーゼに対する認識部位として働くことができる（図２Ｃ）。次に、エンドヌクレアーゼが、ｃＳＡ ＤＮＡ２の新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位（Ｊ）で、又は新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位（Ｊ）に隣接する部位で切れ目を入れると、ＤＮＡポリメラーゼを介して複製をプライミングして、ＳＣ ＤＮＡから生成された第１のシグナルＤＮＡ（Ｓ１）（図２Ａ）とは、及びｃＳＡ ＤＮＡ１から生成される第２のシグナルＤＮＡ（Ｓ２）（図２Ｂ）とは異なる第３のシグナルＤＮＡ（Ｓ３）を生成する。図２Ｃで図解されているように、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｊ）は、ｃＳＡ ＤＮＡ２ではなく新たに複製された鎖が切れ目を入れられるように配向される。すなわち、新たに複製された鎖が生成されると、（Ｊ）中のエンドヌクレアーゼ認識部位の配向が、新たに複製された鎖のエンドヌクレアーゼ活性（切断）を方向付ける。したがって、エンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列に相補的な配列を含み、ｃＳＡ ＤＮＡ２オリゴヌクレオチドが反応の間ずっと無傷のままでいる（すなわち、ｃＳＡ ＤＮＡ２は切れ目も入れられないし切断もされない）ことが可能になる。
【0056】
標的ＤＮＡに相補的であり少なくとも１つの脱塩基部位を有するＳＣ ＤＮＡの配列（Ｄ）は長さにより制限されず、約５～約１００核酸塩基であり、５から１００までのすべての整数が可能である。一部の実施形態では、ＳＣ ＤＮＡの配列（Ｄ）は、約５～約３０核酸塩基であり、５から３０までのすべての整数である。一部の実施形態では、ＳＣ ＤＮＡ中の配列（Ｄ）は、約１０～約３０核酸塩基であり、１０から３０までのすべての整数である。さらにさらなる実施形態では、ＳＣ ＤＮＡの配列（Ｄ）は、約１５～約３０核酸塩基であり、１５から３０までのすべての整数である。
【0057】
相補的配列は、水素結合相互作用を形成して二本鎖核酸構造（例えば、核酸塩基対）を形成することができる。例えば、第１の配列に相補的な配列は、第１の配列とワトソンクリック塩基対を形成できる配列を含む。本明細書で使用される場合、用語「相補的な」は、配列がその相補鎖の全長にわたり相補的である必要はなく、別の配列の一部に相補的な配列を包含する。したがって、一部の実施形態では、相補的配列は、配列の全長にわたって又はその一部にわたって（例えば、配列の長さの約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約９５％よりも多く）相補的である配列を包含する。例えば、２つの配列は、約２～約１００の連続する（切れ目のない）ヌクレオチド、又は２から１００までの任意の整数に及ぶ長さにわたって互いに相補的であることが可能である。一部の実施形態では、２つの配列は、約１５～約３０の連続する（切れ目のない）ヌクレオチド、又は１５から３０までの任意の整数に及ぶ長さにわたって互いに相補的であることが可能である。本明細書で使用される場合、相補的配列は、いくつかの配列ミスマッチを有する配列を包含することができる。例えば、相補的配列は、配列の長さの少なくとも約７０％～１００％、好ましくは、約９５％よりも多く相補的である配列を含むことができる。ある程度のミスマッチにもかかわらず、相補的配列は、一般に、例えば、本明細書に記載されている又は当業者であれば一般に知っている条件などの厳密な及び高度に厳密な条件などの適切な条件下で互いに選択的にハイブリダイズする能力を有する。
【0058】
ＳＣ及びｃＳＡ ＤＮＡが公知の方法により合成してよい。例えば、ＳＣ及びｃＳＡ ＤＮＡは、ホスホラミダイト法、リン酸トリエステル法、Ｈ－ホスホネート法又はチオホスホン酸エステル法を使用する合成することができる。一部の実施形態では、ＳＣ及び／又はｃＳＡ ＤＮＡは、例えば、イオン交換ＨＰＬＣを使用して精製することができる。
ＳＣ及びｃＳＡ ＤＮＡは、当技術分野で一般に知られているなどの化学修飾（脱塩基基の組込みに加えて）を含んでよい。一部の実施形態では、例えば、ＳＣ及びｃＳＡ ＤＮＡは、化学修飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチル誘導体、ホスホロチオエート、等）、３’末端修飾、５’末端修飾又はその任意の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、ＳＣ及びｃＳＡ ＤＮＡの３’末端は、伸長反応がＳＣ又はｃＳＡ ＤＮＡの３’末端（例えば、標的配列又は別の非標的配列に結合すると、ポリメラーゼ伸長のためのプライマーとしての働きをする可能性がある）から起こらないように修飾しうる。図２Ａに図解されるように、ＤＮＡ複製を開始するのは、ＳＣ ＤＮＡではなく、標的核酸（Ｔ）の３’末端である。ＳＣ又はｃＳＡ ＤＮＡの３’末端から開始されるいかなる複製も検出誤り（例えば、偽陽性）を生じることがある。さらに、例えば、ＳＣ ＤＮＡと非標的配列の間の結合、ＳＣ ＤＮＡと標的配列の間の不正確な位置での結合、ＳＣとｃＳＡ ＤＮＡの間の結合、又は非鋳型新規若しくは最初からの合成などの事象から生じるＳＣ ＤＮＡの非修飾３’末端からの非特異的伸長反応も検出誤りを生じることがある。したがって、一実施形態では、ＳＣ及びｃＳＡ ＤＮＡは、上で考察された伸長反応などのいずれかの望ましくない伸長反応の発生を減らす又は取り除くことができる３’末端修飾を含む。３’末端修飾の非限定的例は、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ及びＦＡＭを含む。修飾の他の非限定的例は、例えば、ビオチン化、フルオロクロム化、リン酸化、チオール化、アミノ化、反転ヌクレオチド、又は脱塩基基を含む。
ＳＣ及びｃＳＡ ＤＮＡは、当技術分野で一般に知られているなどの化学修飾（脱塩基基の組込みに加えて）を含んでよい。一部の実施形態では、例えば、ＳＣ及びｃＳＡ ＤＮＡは、化学修飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチル誘導体、ホスホロチオエート、等）、３’末端修飾、５’末端修飾又はその任意の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、ＳＣ及びｃＳＡ ＤＮＡの３’末端は、伸長反応がＳＣ又はｃＳＡ ＤＮＡの３’末端（例えば、標的配列又は別の非標的配列に結合すると、ポリメラーゼ伸長のためのプライマーとしての働きをする可能性がある）から起こらないように修飾しうる。図２Ａに図解されるように、ＤＮＡ複製を開始するのは、ＳＣ ＤＮＡではなく、標的核酸（Ｔ）の３’末端である。ＳＣ又はｃＳＡ ＤＮＡの３’末端から開始されるいかなる複製も検出誤り（例えば、偽陽性）を生じることがある。さらに、例えば、ＳＣ ＤＮＡと非標的配列の間の結合、ＳＣ ＤＮＡと標的配列の間の不正確な位置での結合、ＳＣとｃＳＡ ＤＮＡの間の結合、又は非鋳型新規若しくは最初からの合成などの事象から生じるＳＣ ＤＮＡの非修飾３’末端からの非特異的伸長反応も検出誤りを生じることがある。したがって、一実施形態では、ＳＣ及びｃＳＡ ＤＮＡは、上で考察された伸長反応などのいずれかの望ましくない伸長反応の発生を減らす又は取り除くことができる３’末端修飾を含む。３’末端修飾の非限定的例は、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ及びＦＡＭを含む。修飾の他の非限定的例は、例えば、ビオチン化、フルオロクロム化、リン酸化、チオール化、アミノ化、反転ヌクレオチド、又は脱塩基基を含む。
【0059】
別の態様では、本発明は、試料中の標的核酸（Ｔ）を検出するための方法を包含する。本方法は、一般に前記試料を、５’から３’方向に、第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と、少なくとも１つの脱塩基部分、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）の少なくとも一部に相補的である第１の相補的配列（Ｃ）及びその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し標的核酸の３’末端に相補的である第２の相補的配列（Ｄ）を含む相補的配列とを含み、第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相補的である配列（Ｃ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第１のオリゴヌクレオチド（配列変換ＤＮＡ又はＳＣ ＤＮＡ）；５’から３’方向に、第２の特有のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｆ）と、シグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）の少なくとも一部に相補的である配列（Ｇ）及び第１のＳＣ ＤＮＡオリゴヌクレオチドの第１のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同である配列（Ｈ）を含む配列領域とを含み、配列（Ｈ）が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し、第２のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）に相補的な配列（Ｇ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第２のオリゴヌクレオチド（カスケードシグナル増幅ＤＮＡ１又はｃＳＡ ＤＮＡ１）；５’から３’方向に、第３の特有のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）と、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｊ）と、シグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）の少なくとも一部に相補的である配列（Ｋ）及び第２のオリゴヌクレオチドｃＳＣ ＤＮＡ１の第２のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｅ）に相同である配列（Ｌ）を含む配列領域とを含み、配列（Ｌ）が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも１つの脱塩基部位を有し、第３のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）の少なくとも一部とシグナルＤＮＡ生成配列（Ｉ）に相補的な配列（Ｋ）がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第３のオリゴヌクレオチド（カスケードシグナル増幅ＤＮＡ２又はｃＳＡ ＤＮＡ２）；ポリメラーゼ、並びにニッキング反応のための少なくとも１つのエンドヌクレアーゼと接触させることを含む。この態様の実施形態では、本方法は、シグナルＤＮＡの存在又は非存在を判定し、シグナルＤＮＡの存在が試料中の標的核酸の存在を示すことも含む。
【0060】
本方法は、試料をエンドヌクレアーゼと接触させることを含む。エンドヌクレアーゼは、ＳＣ ＤＮＡ内のエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）に相補的な配列、第１のｃＳＡ ＤＮＡ１内のエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｆ）に相補的な配列、及び第２のｃＳＡ ＤＮＡ２内のエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｊ）に相補的な配列に切れ目を入れることができる又は切れ目を入れるのに使用することができるニッキングエンドヌクレアーゼ又は制限エンドヌクレアーゼでもよい。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡニッキング反応を触媒できる又は触媒するのに使用できるニッキングエンドヌクレアーゼ又は制限エンドヌクレアーゼを含む。ニッキングエンドヌクレアーゼを提供する実施形態では、二本鎖ＤＮＡの１つの鎖のリン酸ジエステル結合を切断して、切断部位の５’側にリン酸基を３’側にヒドロキシル基を生成してよい。ニッキングエンドヌクレアーゼの非限定的例は、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．Ｂｔｓｌ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ及びＮｔ．ＢｓｍＡＩを含む。
【0061】
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは制限エンドヌクレアーゼでよい。これらの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を、制限エンドヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡの１つの鎖だけでリン酸ジエステル結合を切断し、二本鎖に切れ目を生み出すように修飾してよい。方法又は戦略を使用して、例えば、制限酵素により切断されない二本鎖核酸のうちの少なくとも１つの鎖での化学修飾を含むなどの、制限エンドヌクレアーゼの活性を改変してよい。そのような修飾の１つの非限定的例は、１つの鎖のリン酸ジエステル結合の酸素原子を硫黄原子で置き換えることを含む。
【0062】
制限エンドヌクレアーゼを提供する実施形態では、二本鎖ＤＮＡの１つの鎖のリン酸ジエステル結合を切断して、切断部位の５’側にリン酸基を３’側にヒドロキシル基を生成してよい。制限エンドヌクレアーゼの非限定的例は、Ｈｉｎｃ ＩＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩ、Ａｖａ Ｉ、Ｆｎｕ４ＨＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ及びＮｃｉＩを含む。
【0063】
本方法は、試料をポリメラーゼと接触させることを含む。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼでよい。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く、５’－３’と３’－５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を欠くポリメラーゼでよい。ポリメラーゼは、起源が真核生物、原核生物、又はウイルスでもよく、遺伝子改変することもできる。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、環境（例えば、室内）温度を含む、低いほうの温度で機能するポリメラーゼの間から選択される。ＤＮＡポリメラーゼの非限定的例は、クレノウ断片、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の５’－３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルス・カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）由来の５’－３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼを含む。
【0064】
本明細書で開示される方法の１つの非限定的実施形態は、図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃに図解されている。手短に言えば、図２Ａに図解されるように、試料を、ＤＮＡポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）の二本鎖形態（すなわち、相補的配列）又はエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）の二本鎖形態（すなわち、相補的配列）に隣接する部位に切れ目を入れることができるエンドヌクレアーゼの存在下でＳＣ ＤＮＡと接触させる。標的核酸（Ｔ）が試料中に存在する場合、標的核酸（Ｔ）の３’末端配列はＳＣ ＤＮＡの配列（Ｄ）（標的に相補的であり少なくとも１つの脱塩基部位を有する）にハイブリダイズして、複製（反応混合物中に存在するＤＮＡポリメラーゼによる）をプライミングする又は開始し、それにより二本鎖エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）を含む二本鎖伸長配列（Ｘ）を生成する。新たに生成された二本鎖エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）の認識（反応混合物中に存在するエンドヌクレアーゼによる）、及びそれに続く新たに生成された鎖のニッキング（反応混合物中に存在するエンドヌクレアーゼによる）により、第１のオリゴヌクレオチドシグナルＤＮＡ１（Ｓ１）及び伸長配列（Ｘ’）が生成される。ニックでの配列（Ｘ’）の３’－ＯＨは鎖置換複製のその後のラウンドに対する開始部位としての働きをするので、オリゴヌクレオチド（Ｓ１）は、反応混合物においてシグナルＤＮＡ１（Ｓ１）を複製し増幅し続けるＤＮＡポリメラーゼによりＳＣ ＤＮＡから置換される。
【0065】
図２Ｂでさらに図解されるように、標的（Ｔ）核酸とＳＣ ＤＮＡの相互作用により生成される第１のシグナルＤＮＡ（Ｓ１）は、第１のカスケードシグナル増幅ＤＮＡ１（又はｃＳＡ ＤＮＡ１）の存在により第２のシグナルＤＮＡ２（Ｓ２）に変換することができる。手短に言えば、反応中に存在する第１のシグナルＤＮＡ１（Ｓ１）は、第１のｃＳＡ ＤＮＡ１の配列（Ｈ）（シグナルＤＮＡ Ｓ１に相補的であり、任意選択的に少なくとも１つの脱塩基部位を有する）にハイブリダイズして、複製（反応混合物中に存在するＤＮＡポリメラーゼによる）をプライミングする又は開始し、それにより二本鎖エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｆ）を含む二本鎖伸長配列（Ｙ）を生成する。新たに生成された二本鎖エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｆ）の認識（反応混合物中に存在するエンドヌクレアーゼによる）、及びそれに続く新たに生成された鎖のニッキング（反応混合物中に存在するエンドヌクレアーゼによる）により、異なるオリゴヌクレオチドシグナル配列（Ｓ２）及び伸長配列（Ｙ’）が生成される。ニックでの配列（Ｙ’）の３’－ＯＨは鎖置換複製のその後のラウンドに対する開始部位としての働きをするので、オリゴヌクレオチド（Ｓ２）は、反応混合物において第２の特有のシグナルＤＮＡ２（Ｓ２）を複製し増幅し続けるＤＮＡポリメラーゼによりｃＳＡ ＤＮＡ１から置換される。
【0066】
図２Ｃでさらに図解されるように、第１のシグナルＤＮＡ（Ｓ１）と第１のカスケードＳＡ ＤＮＡ（ｃＳＡ ＤＮＡ１）の相互作用により生成される第２のシグナルＤＮＡ（Ｓ２）は、第２のカスケードシグナル増幅ＤＮＡ２（又はｃＳＡ ＤＮＡ２）の存在により第３のシグナルＤＮＡ３（Ｓ３）に変換することができる。手短に言えば、反応中に存在する第２のシグナルＤＮＡ２（Ｓ２）は、第２のｃＳＡ ＤＮＡ２の配列（Ｌ）（シグナルＤＮＡ Ｓ２に相補的であり、任意選択的に少なくとも１つの脱塩基部位を有する）にハイブリダイズして、複製（反応混合物中に存在するＤＮＡポリメラーゼによる）をプライミングする又は開始し、それにより二本鎖エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｊ）を含む二本鎖伸長配列（Ｕ）を生成する。新たに生成された二本鎖エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｊ）の認識（反応混合物中に存在するエンドヌクレアーゼによる）、及びそれに続く新たに生成された鎖のニッキング（反応混合物中に存在するエンドヌクレアーゼによる）により、異なるオリゴヌクレオチドシグナル配列（Ｓ３）及び伸長配列（Ｕ’）が生成される。ニックでの配列（Ｕ’）の３’－ＯＨは鎖置換複製のその後のラウンドに対する開始部位としての働きをするので、オリゴヌクレオチド（Ｓ３）は、反応混合物において第３の特有のシグナルＤＮＡ３（Ｓ３）を複製し増幅し続けるＤＮＡポリメラーゼによりｃＳＡ ＤＮＡ２から置換される。
【0067】
一部の実施形態では、シグナルＤＮＡ（Ｓ２）／標的ＤＮＡ比は、約１００～約１０００、約１００～約８００、約１００～約６００、約１００～約４００、又は約１００～約２００である。他の実施形態では、シグナルＤＮＡ（Ｓ３）／標的ＤＮＡ比は、約１０００～約１００００、約１０００～約８０００、約１０００～約６０００、約１０００～約４０００、又は約１０００～約２０００である。
【0068】
本発明に従った方法は、等温又は実質的に一定の温度条件下で実施してもよい。実質的に一定の温度条件下で方法を実施することに関する実施形態では、温度のある程度の変動は許される。例えば、一部の実施形態では、実質的に一定の温度は、所望の又は特定された標的温度範囲（例えば、約＋／－２℃又は約＋／－５℃）内で変動してよい。一部の実施形態では、実質的に一定の温度は、熱サイクルを含まない温度を含んでよい。一部の実施形態では、本方法は、例えば、（１）ＳＣ ＤＮＡの配列（Ｄ）への標的核酸（Ｔ）のおおよその計算された／予測された又は実験的に決定された最適ハイブリダイゼーション若しくはアニーリング温度の若しくはそれよりも下の温度；（２）ＳＣ ＤＮＡに結合している標的核酸（Ｔ）の融解温度の若しくはそれよりも下の温度（典型的には、ハイブリダイゼーション又はアニーリング温度は融解温度よりもわずかに下である）；（３）ｃＳＡ ＤＮＡに結合しているシグナルＤＮＡ（Ｓ）の融解温度の若しくはそれよりも下の温度；又は（４）反応混合物中に存在するポリメラーゼ及び／若しくはエンドヌクレアーゼについてのおおよその計算された／予測された若しくは実験的に決定された最適反応温度の若しくはそれよりも下の温度などの等温又は実質的に一定の温度で実施することができる。
【0069】
本方法は、約２０℃～約７０℃に及ぶ反応温度を含んでよく、約２０℃～約４２℃の範囲内に収まるもっと低い温度も含む。一部の実施形態では、反応温度範囲は、３５℃～４０℃（例えば、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、又は４０℃）である。他の実施形態では、反応温度は６５℃よりも下であり、約５５℃、約５０℃、約４５℃、約４０℃、又は約３０℃より下のもっと低い温度も含む。さらに他の実施形態では、反応温度は、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、又は約７０℃でもよい。
【0070】
本方法は、標的核酸の存在下で検出可能量のシグナル配列の増幅を可能にするのに十分である時間実施してよい。一部の実施形態では、反応時間は約５分～１６時間、又は約３分～１６時間に及んでよい。さらに他の実施形態では、反応時間は、約５～１２０分、又は約１５～６０分に及んでよい。
【0071】
種々のシグナルＤＮＡ（Ｓ１）、（Ｓ２）及び（Ｓ３）は標的核酸（Ｔ）の存在下だけで生成されるために、本発明に従った方法は、いずれか１つのシグナルＤＮＡの存在又は非存在を検出することにより試料中の標的核酸（Ｔ）の存在又は非存在を検出する。シグナルＤＮＡ（Ｓ１）、（Ｓ２）及び（Ｓ３）は異なっており、配列によって制限されず、検出を受け入れられるいかなる配列も可能である。シグナルＤＮＡ（Ｓ１）、（Ｓ２）及び（Ｓ３）は長さによっても制限されない。好ましくは、シグナルＤＮＡ（Ｓ１）、（Ｓ２）及び（Ｓ３）は、約５～約１００塩基、５から１００の間のいかなる整数でも可能である。一部の実施形態では、シグナルＤＮＡ（Ｓ１）、（Ｓ２）及び（Ｓ３）は、約５～約３０核酸塩基、５から３０の間のすべての整数が可能である。一部の実施形態では、シグナルＤＮＡ（Ｓ１）、（Ｓ２）及び（Ｓ３）は、約１０～約３０塩基長、１０から３０の間のすべての整数が可能である。さらに一部の実施形態では、シグナルＤＮＡ（Ｓ１）、（Ｓ２）及び（Ｓ３）は、約１５～約３０塩基長、１５から３０の間のすべての整数が可能である。
【0072】
本開示に従った方法は、約４～約１０、又は約７～約９のｐＨ範囲を含むバッファー条件下で実施してよい。バッファーは、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、又は約５０ｍＭ～１５０ｍＭの塩濃度を含んでよい。一部の実施形態では、本方法は、標的核酸の存在下で検出可能な量のシグナル配列の増幅を可能にするＳＣ及び／又はｃＳＡ ＤＮＡの量を使用して実施してよい。一部の実施形態では、ＳＣ及び／又はｃＳＡ ＤＮＡ濃度は、約１００ｐＭ～約１００μＭ、約１ｎＭ～約１５０ｎＭ、約５ｎＭ～約５０ｎＭ、又は約５ｎＭ～約２５ｎＭに及んでよい。
【0073】
さらなる実施形態では、本明細書で開示されるいかなる方法、オリゴヌクレオチド、組成物、及び／又はキットも、本明細書で開示される方法に従って標的核酸の存在又は非存在について試験されている生体試料からの核酸の非特異的増幅の予防又は減少のためにカオトロピック剤と組み合わせて使用してよい。本明細書で開示されるオリゴヌクレオチド、組成物、及びキットのうちの１つ以上と組み合わせて使用できるカオトロピック剤は、限定せずに、尿素、ホルムアミド、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、過塩素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、又はその組合せを含む。
【0074】
いずれか１つのシグナルＤＮＡ（Ｓ１）、（Ｓ２）及び／又は（Ｓ３）の存在は、当技術分野で公知のいかなる方法によっても検出できる。例えば、ゲル電気泳動及び臭化エチジウムでの染色を使用することができる。その上、いずれか１つのシグナルＤＮＡ（Ｓ１）、（Ｓ２）及び／又は（Ｓ３）の存在は、蛍光偏光、免疫アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン又はローダミン）、化学発光、生物発光、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、又はフルオロフォア修飾プローブＤＮＡ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）を使用して検出できる。増幅産物も、例えば、ビオチンで標識された標識ヌクレオチドを使用することにより検出できる。そのような場合、増幅産物中のビオチンは、例えば、蛍光標識アビジン又は酵素標識アビジンを使用して検出できる。増幅産物は、当業者に公知であるレドックス干渉物質を使用することにより電極を用いて検出することもできる。増幅産物は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）、又は電気化学的方法（ナノポアセンサーを用いる方法を含む）を使用して検出することもできる。
【0075】
本発明に従った方法は、試料中で標的核酸（Ｔ）の存在又は非存在を検出する。本発明に従った方法を使用すれば、試験試料中の標的核酸の濃度を定量的に測定することもできる。例えば、本開示に従った方法は、異なる既知の濃度の範囲の標的核酸の存在下で実施することができ、検量線を当技術分野で一般的に実行されているように準備し使用することができる。
【0076】
図２Ａの標的核酸（Ｔ）は、いかなる核酸配列でも含むことができ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化学修飾された核酸、非天然核酸、核酸類似体、又はその任意のハイブリッド若しくは組合せを含むことができる。したがって、一部の実施形態では、ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡを含んでよく、ＲＮＡは全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び合成ＲＮＡを含んでよい。一部の実施形態は特定の標的核酸配列に関するが、補助核酸配列を含むいかなる核酸配列も、検出される標的核酸配列であることが可能である。本開示は、核酸が短鎖核酸である場合でも、標的核酸の検出に選択性及び感度のよさを提供する。したがって、ＳＣ ＤＮＡの配列（Ｄ）と標的核酸（Ｔ）の間の相補性の程度は、配列間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする（例えば、配列変換ＤＮＡの配列（Ｄ）と標的配列（Ｔ）配列の相補的ヌクレオチドの数は所与のセットの反応条件下での非特異的ハイブリダイゼーションを回避する）。
【0077】
一実施形態では、標的核酸配列は、例えば、ゲノムＤＮＡ、発現されたｍＲＮＡ、病原体（微生物、ウイルス）由来の核酸配列、又は治療核酸を含むいかなる数の供給源由来である、又はそれから導かれることが可能である。したがって、本明細書で開示されるＳＣ及びｃＳＡ ＤＮＡ並びに方法を、疾患（例えば、遺伝源及び感染源から生じる）の診断及び予後、汚染菌の同定（例えば、食物媒介病及び器材汚染）、個別化医療（例えば、治療法のモニタリング及び／又は予後）及び同類のもののために使用しうる。例えば、分子診断検査を、以下の感染性疾患：Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、ＨＣＶ（遺伝子型１～６）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）、クラミジア・トラコマチス、淋菌、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）及びパルボウイルスに関して実施してよい。
【0078】
一部の実施形態では、標的核酸はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含むことができる。マイクロＲＮＡは、約２２ヌクレオチドの低分子非コードＲＮＡ分子を含む。マイクロＲＮＡは、遺伝子発現の転写及び翻訳後調節において機能することが知られている。マイクロＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の相補的領域と塩基対合することにより機能し、翻訳抑制又は標的分解を介して遺伝子サイレンシングを生じることが知られている。
【0079】
標的核酸を含むことがあるいかなるタイプに試料でも、本明細書で開示される方法で使用してよい。したがって、標的核酸を含有する又は含有すると疑われる試料は特に限定されず、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、排泄物、脳脊髄液、精液、唾液、組織（例えば、がん組織又はリンパ節）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物又は細菌培養物）などの生きた対象由来の生体試料；ウイロイド、ウイルス、細菌、真菌、酵母、植物及び動物などの核酸を含有する試料；ウイルス又は細菌などの微生物を含有する又はこれに感染している可能性がある試料（例えば、食物及び生物学的製剤）；並びに土壌、産業プロセス及び製造設備、及び廃水などの生物物質を含有することがある試料、及び種々の水源（例えば、飲料水）に由来する試料を含む。さらに、本明細書で開示される方法において使用される核酸含有組成物を調製するため試料はいかなる公知の方法により加工してもよい。そのような調製物の例は、細胞破砕物（例えば、細胞ライセート及び抽出物）、試料分画、試料中の核酸及びｍＲＮＡ濃縮試料などの特定の核酸分子群を含むことができる。本発明の標的核酸を検出するための方法において使用される試料は、上で言及される生物由来物質及び天然の産物に由来する試料に限定されず、合成オリゴヌクレオチドを含有する試料でもよい。
【0080】
本発明に従った方法は、Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ試料調製システムと組み合わせて実施することができる。ｍ２０００ｓｐは磁気粒子技術を使用して核酸を捕獲し、粒子を洗浄して非結合試料成分を取り除く。結合した核酸は溶出され９６ディープウェルプレートに移される。Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐは、９６ディープウェルプレートに移された洗浄核酸と、本技術に従った方法を実施するのに必要ないかなる試薬を組み合わせることもできる。例えば、ＳＣ及びｃＳＡ ＤＮＡ、ポリメラーゼ、分子ビーコン、並びに他の試薬（例えば、ｄＮＴＰ）を必要に応じて、又は希望通りに添加することができる。
本発明に従った方法は、ポイントオブケアプラットホームと結びつけることもできる。例えば、成長するＤＮＡ鎖中へのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の組み込みは、共有結合の形成及びピロリン酸の放出及び反応のｐＨに影響を及ぼす正電荷水素イオンを必要とする。したがって、本発明の方法に従ったシグナルＤＮＡの合成は、例えば、ポイントオブケアマイクロｐＨメーターを使用してｐＨの変化を追跡することにより検出できる。例えば、Ａｂｂｏｔｔ’ｓ ｉ－ＳＴＡＴポイントオブケアシステムは、マイクロ組立てセンサー、キャリブレーション溶液、流体系、及びｐＨの分析用の廃棄物室を含有する使い捨てカートリッジと一緒に供給することができる。
本発明に従った方法は、ポイントオブケアプラットホームと結びつけることもできる。例えば、成長するＤＮＡ鎖中へのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の組み込みは、共有結合の形成及びピロリン酸の放出及び反応のｐＨに影響を及ぼす正電荷水素イオンを必要とする。したがって、本発明の方法に従ったシグナルＤＮＡの合成は、例えば、ポイントオブケアマイクロｐＨメーターを使用してｐＨの変化を追跡することにより検出できる。例えば、Ａｂｂｏｔｔ’ｓ ｉ－ＳＴＡＴポイントオブケアシステムは、マイクロ組立てセンサー、キャリブレーション溶液、流体系、及びｐＨの分析用の廃棄物室を含有する使い捨てカートリッジと一緒に供給することができる。
【0081】
本明細書で開示される方法は、追加の試薬を含むことができる。核酸増幅反応で使用できる他の試薬の一部の非限定的例は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム及び硫酸マグネシウムなどの金属塩；ｄＮＴＰ混合物などの基質；並びにトリス－ＨＣｌバッファー、トリシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー及びリン酸カリウムバッファーなどのバッファー溶液を含む。同様に、洗浄剤、オキシダント及び還元剤も本明細書で開示される方法の実行において使用できる。さらに、ジメチルスルホキシド及びベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルグリシン）；国際公開第９９／５４４５５号に記載される酸性物質；並びに陽イオン複合体などの試薬を使用可能である。
【0082】
本明細書で提供される方法及び核酸構造物は、標的核酸の存在下でシグナルＤＮＡの指数関数的増幅を提供するために他の方法と組み合わせて使用しうる。例えば、本開示に従った方法及び組成物は、「カバード配列変換ＤＮＡ及び検出方法」と題した米国特許出願第１４／５９７，９８１号に記載されるカバード配列変換ＤＮＡと組み合わせて使用してよく、前記特許文献は参照により本明細書に組み込む。本開示に従った方法及び組成物は、「ロックド核酸を有する配列変換及びシグナル増幅ＤＮＡ並びにそれを使用する検出方法」と題した米国特許出願第１４／８８２，１２４号に記載される化学修飾された配列変換及びシグナル増幅ＤＮＡと組み合わせて使用してもよく、前記特許文献は参照により本明細書に組み込む。本開示に従った方法及び組成物は、「ポリＤＮＡスペーサー配列を有する配列変換及びシグナル増幅ＤＮＡ並びにそれを使用する検出方法」と題した米国特許出願第１４／８８２，１０９号に記載されるポリＤＮＡスペーサー配列変換及びシグナル増幅ＤＮＡと組み合わせて使用してもよく、前記特許文献は参照により本明細書に組み込む。本開示に従った方法及び組成物は、「配列変換及びシグナル増幅ＤＮＡカスケード反応並びにそれを使用する検出方法」と題した米国特許出願第１４／９９８，１６２号に記載される方法及び組成物と組み合わせて使用してもよく、前記特許文献は参照により本明細書に組み込む。
【0083】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」とは一般に、当業者であれば、列挙された値に等しい（すなわち、同じ機能又は結果を有する）と見なすと考えられる数の範囲のことである。用語「約」は、本明細書で使用される場合、参照値よりもおおよそ１０～２０％大きい又は小さい値を含む範囲を指すことが意図されている。ある特定の状況では、当業者であれば、参照値の性質のせいで、用語「約」は、その値から１０～２０％よりも多い又は少ない偏差を意味することができる。
【0084】
次の実施例は、上記の態様及び実施形態を例証することが意図されている。上記開示も下記実施例も、添付の特許請求の範囲を限定するものと見なされるべきではない。当業者であれば、本開示が、本開示の種々の態様を記載し例証するために使用される特定の用語法により限定されないことを理解する。
【実施例】
【0085】
［実施例１］
一組の反応は、配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１）を有するＳＣ ＤＮＡ１又は５’末端から位置３８及び３９にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡααＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号２）を有するＳＣ ＤＮＡ２を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。１０の異なる正常血清試料（すなわち、標的核酸を欠く１０の血清試料）を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
一組の反応は、配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１）を有するＳＣ ＤＮＡ１又は５’末端から位置３８及び３９にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡααＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号２）を有するＳＣ ＤＮＡ２を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。１０の異なる正常血清試料（すなわち、標的核酸を欠く１０の血清試料）を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
【0086】
別の一組の反応を上で詳細に述べた同じＳＣ ＤＮＡ１及びＳＣ ＤＮＡ２を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。反応は、０、１００、又は１０００ｆＭのモデルＲＮＡ標的核酸（すなわち、マイクロＲＮＡ－２１に相当する配列を有するＲＮＡ）の存在下で実施した。
【0087】
反応は、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭの酢酸トリス、７．５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．９）を有するＣｕｔＳｍａｒｔバッファー、０．０２Ｕ／μＬで存在するＤＮＡポリメラーゼＢｓｔラージ断片（Ｌ．Ｆ．）、及び０．０２５Ｕ／μＬで存在するニッキングエンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｂｖＣｌを含有する１２０μＬの反応溶液中３７℃で実施した。総増幅時間は２５分間であった。生成されたシグナルＤＮＡは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴを使用する化学発光測定により検出した。
【0088】
実施例１のそれぞれの反応組の結果は、それぞれ図３Ａ（血清）及び３Ｂ（添加された標的ｍｉＲＮＡ）に示されている。
【0089】
［実施例２］
別の組の反応は、以下のＳＣ ＤＮＡ：配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１）を有するＳＣ ＤＮＡ１、５’末端から位置３８及び３９にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡααＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号２）を有するＳＣ ＤＮＡ２、又は５’末端から位置３８及び３９にエチニルｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「β」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡββＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号３）を有するＳＣ ＤＮＡ３を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。１０の異なる正常血清試料（商業的供給源から購入した）を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した（すなわち、標的核酸を欠く１０の血清試料）。
別の組の反応は、以下のＳＣ ＤＮＡ：配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１）を有するＳＣ ＤＮＡ１、５’末端から位置３８及び３９にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡααＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号２）を有するＳＣ ＤＮＡ２、又は５’末端から位置３８及び３９にエチニルｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「β」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡββＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号３）を有するＳＣ ＤＮＡ３を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。１０の異なる正常血清試料（商業的供給源から購入した）を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した（すなわち、標的核酸を欠く１０の血清試料）。
【0090】
反応は、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭの酢酸トリス、７．５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．９）を有するＣｕｔＳｍａｒｔバッファー、０．０２Ｕ／μＬで存在するＤＮＡポリメラーゼＢｓｔＬ．Ｆ．、及び０．０２５Ｕ／μＬで存在するニッキングエンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｂｖＣｌを含有する１２０μＬの反応溶液中３７℃で実施した。総増幅時間は２５分間であった。生成されたシグナルＤＮＡは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴを使用する化学発光測定により検出した。
【0091】
実施例２の結果は図４に図解されている。
【0092】
［実施例３］
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）又はＳＣ ＤＮＡ３（配列番号３）を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。反応は、０、１０、１００、又は１０００ｆＭのモデルＤＮＡ標的核酸（すなわち、マイクロＲＮＡ－２１に相当する配列を有するＤＮＡ）の存在下で実施した。
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）又はＳＣ ＤＮＡ３（配列番号３）を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。反応は、０、１０、１００、又は１０００ｆＭのモデルＤＮＡ標的核酸（すなわち、マイクロＲＮＡ－２１に相当する配列を有するＤＮＡ）の存在下で実施した。
【0093】
反応は、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭの酢酸トリス、７．５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．９）を有するＣｕｔＳｍａｒｔバッファー、０．０２Ｕ／μＬで存在するＤＮＡポリメラーゼＢｓｔＬ．Ｆ．、及び０．０２５Ｕ／μＬで存在するニッキングエンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｂｖＣｌを含有する１２０μＬの反応溶液中３７℃で実施した。総増幅時間は２５分間であった。生成されたシグナルＤＮＡは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴを使用する化学発光測定により検出した。
【0094】
実施例３の結果は図５に図解されている。
【0095】
［実施例４］
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）又はＳＣ ＤＮＡ３（配列番号３）を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。反応は、０、１０、１００、又は１０００ｆＭのマイクロＲＮＡ－２１標的核酸（すなわち、ＲＮＡ標的核酸）の存在下で実施した。
反応は、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭの酢酸トリス、７．５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．９）を有するＣｕｔＳｍａｒｔバッファー、０．０２Ｕ／μＬで存在するＤＮＡポリメラーゼＢｓｔＬ．Ｆ．、及び０．０２５Ｕ／μＬで存在するニッキングエンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｂｖＣｌを含有する１２０μＬの反応溶液中３７℃で実施した。総増幅時間は２５分間であった。生成されたシグナルＤＮＡは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴを使用する化学発光測定により検出した。
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）又はＳＣ ＤＮＡ３（配列番号３）を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。反応は、０、１０、１００、又は１０００ｆＭのマイクロＲＮＡ－２１標的核酸（すなわち、ＲＮＡ標的核酸）の存在下で実施した。
反応は、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭの酢酸トリス、７．５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．９）を有するＣｕｔＳｍａｒｔバッファー、０．０２Ｕ／μＬで存在するＤＮＡポリメラーゼＢｓｔＬ．Ｆ．、及び０．０２５Ｕ／μＬで存在するニッキングエンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｂｖＣｌを含有する１２０μＬの反応溶液中３７℃で実施した。総増幅時間は２５分間であった。生成されたシグナルＤＮＡは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴを使用する化学発光測定により検出した。
【0096】
実施例４の結果は図６に図解されている。
【0097】
［実施例５］
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）；ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）；５’末端から３８位にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣαＣＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号４）を有するＳＣ ＤＮＡ４；５’末端から位置３８、３９及び４０にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡααα ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号５）を有するＳＣ ＤＮＡ５；又は５’末端から位置３８、３９、４０及び４１にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡααα αＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号６）を有するＳＣ ＤＮＡ６を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。１０の異なる正常血清試料（すなわち、標的核酸を欠く１０の血清試料）を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）；ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）；５’末端から３８位にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣαＣＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号４）を有するＳＣ ＤＮＡ４；５’末端から位置３８、３９及び４０にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡααα ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号５）を有するＳＣ ＤＮＡ５；又は５’末端から位置３８、３９、４０及び４１にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡααα αＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号６）を有するＳＣ ＤＮＡ６を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。１０の異なる正常血清試料（すなわち、標的核酸を欠く１０の血清試料）を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
【0098】
反応は、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭの酢酸トリス、７．５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．９）を有するＣｕｔＳｍａｒｔバッファー、０．０２Ｕ／μＬで存在するＤＮＡポリメラーゼＢｓｔＬ．Ｆ．、及び０．０２５Ｕ／μＬで存在するニッキングエンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｂｖＣｌを含有する１２０μＬの反応溶液中３７℃で実施した。総増幅時間は２５分間であった。生成されたシグナルＤＮＡは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴを使用する化学発光測定により検出した。
【0099】
実施例５の結果は図７に図解されている。
【0100】
［実施例６］
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）；ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）、ＳＣ ＤＮＡ４（配列番号４）、ＳＣ ＤＮＡ５（配列番号５）及びＳＣ ＤＮＡ６（配列番号６）を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。反応は、０、１０、１００、又は１０００ｆＭのモデルＤＮＡ標的核酸（すなわち、マイクロＲＮＡ－２１に相当する配列を有するＤＮＡ）の存在下で実施した。
反応は、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭの酢酸トリス、７．５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．９）を有するＣｕｔＳｍａｒｔバッファー、０．０２Ｕ／μＬで存在するＤＮＡポリメラーゼＢｓｔＬ．Ｆ．、及び０．０２５Ｕ／μＬで存在するニッキングエンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｂｖＣｌを含有する１２０μＬの反応溶液中３７℃で実施した。総増幅時間は２５分間であった。生成されたシグナルＤＮＡは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴを使用する化学発光測定により検出した。
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）；ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）、ＳＣ ＤＮＡ４（配列番号４）、ＳＣ ＤＮＡ５（配列番号５）及びＳＣ ＤＮＡ６（配列番号６）を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。反応は、０、１０、１００、又は１０００ｆＭのモデルＤＮＡ標的核酸（すなわち、マイクロＲＮＡ－２１に相当する配列を有するＤＮＡ）の存在下で実施した。
反応は、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭの酢酸トリス、７．５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．９）を有するＣｕｔＳｍａｒｔバッファー、０．０２Ｕ／μＬで存在するＤＮＡポリメラーゼＢｓｔＬ．Ｆ．、及び０．０２５Ｕ／μＬで存在するニッキングエンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｂｖＣｌを含有する１２０μＬの反応溶液中３７℃で実施した。総増幅時間は２５分間であった。生成されたシグナルＤＮＡは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴを使用する化学発光測定により検出した。
【0101】
実施例６の結果は図８に図解されている。
【0102】
［実施例７］
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）、ＳＣ ＤＮＡ４（配列番号４）、ＳＣ ＤＮＡ５（配列番号５）及びＳＣ ＤＮＡ６（配列番号６）を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。反応は、０、１０、１００、又は１０００ｆＭのマイクロＲＮＡ－２１標的核酸（すなわち、ＲＮＡ標的配列）の存在下で実施した。
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）、ＳＣ ＤＮＡ４（配列番号４）、ＳＣ ＤＮＡ５（配列番号５）及びＳＣ ＤＮＡ６（配列番号６）を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。反応は、０、１０、１００、又は１０００ｆＭのマイクロＲＮＡ－２１標的核酸（すなわち、ＲＮＡ標的配列）の存在下で実施した。
【0103】
反応は、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭの酢酸トリス、７．５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．９）を有するＣｕｔＳｍａｒｔバッファー、０．０２Ｕ／μＬで存在するＤＮＡポリメラーゼＢｓｔＬ．Ｆ．、及び０．０２５Ｕ／μＬで存在するニッキングエンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｂｖＣｌを含有する１２０μＬの反応溶液中３７℃で実施した。総増幅時間は２５分間であった。生成されたシグナルＤＮＡは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴを使用する化学発光測定により検出した。
【0104】
実施例７の結果は図９に図解されている。
【0105】
［実施例８］
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）、５’末端から位置４０及び４１にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡＴＣα αＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号７）を有するＳＣ ＤＮＡ７、５’末端から位置３９及び４０にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡＴαα ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号８）を有するＳＣ ＤＮＡ８、５’末端から位置３７及び３８にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣααＣＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号９）を有するＳＣ ＤＮＡ９、５’末端から位置３６及び３７にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡααＴＣＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１０）を有するＳＣ ＤＮＡ１０、並びに５’末端から位置３５及び３６にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡααＡＴＣＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１１）を有するＳＣ ＤＮＡ１１を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。１０の異なる正常血清試料（すなわち、標的核酸を欠く１０の血清試料）を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）、５’末端から位置４０及び４１にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡＴＣα αＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号７）を有するＳＣ ＤＮＡ７、５’末端から位置３９及び４０にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡＴαα ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号８）を有するＳＣ ＤＮＡ８、５’末端から位置３７及び３８にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣααＣＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号９）を有するＳＣ ＤＮＡ９、５’末端から位置３６及び３７にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡααＴＣＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１０）を有するＳＣ ＤＮＡ１０、並びに５’末端から位置３５及び３６にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡααＡＴＣＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１１）を有するＳＣ ＤＮＡ１１を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。１０の異なる正常血清試料（すなわち、標的核酸を欠く１０の血清試料）を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
【0106】
反応は、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭの酢酸トリス、７．５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．９）を有するＣｕｔＳｍａｒｔバッファー、０．０２Ｕ／μＬで存在するＤＮＡポリメラーゼＢｓｔＬ．Ｆ．、及び０．０２５Ｕ／μＬで存在するニッキングエンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｂｖＣｌを含有する１２０μＬの反応溶液中３７℃で実施した。総増幅時間は２５分間であった。生成されたシグナルＤＮＡは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴを使用する化学発光測定により検出した。
【0107】
実施例８の結果は図１０に図解されている。
【0108】
［実施例９］
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）、ＳＣ ＤＮＡ７（配列番号７）、ＳＣ ＤＮＡ８（配列番号８）、ＳＣ ＤＮＡ９（配列番号９）、ＳＣ ＤＮＡ１０（配列番号１０）及びＳＣ ＤＮＡ１１（配列番号１１）を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。反応は、０、１０、１００、又は１０００ｆＭのモデルＤＮＡ標的核酸（すなわち、マイクロＲＮＡ－２１に相当する配列を有するＤＮＡ）の存在下で実施した。
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）、ＳＣ ＤＮＡ７（配列番号７）、ＳＣ ＤＮＡ８（配列番号８）、ＳＣ ＤＮＡ９（配列番号９）、ＳＣ ＤＮＡ１０（配列番号１０）及びＳＣ ＤＮＡ１１（配列番号１１）を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。反応は、０、１０、１００、又は１０００ｆＭのモデルＤＮＡ標的核酸（すなわち、マイクロＲＮＡ－２１に相当する配列を有するＤＮＡ）の存在下で実施した。
【0109】
反応は、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭの酢酸トリス、７．５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．９）を有するＣｕｔＳｍａｒｔバッファー、０．０２Ｕ／μＬで存在するＤＮＡポリメラーゼＢｓｔＬ．Ｆ．、及び０．０２５Ｕ／μＬで存在するニッキングエンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｂｖＣｌを含有する１２０μＬの反応溶液中３７℃で実施した。総増幅時間は２５分間であった。生成されたシグナルＤＮＡは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴを使用する化学発光測定により検出した。
【0110】
実施例９の結果は図１１に図解されている。
【0111】
［実施例１０］
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）、ＳＣ ＤＮＡ７（配列番号７）、ＳＣ ＤＮＡ８（配列番号８）、ＳＣ ＤＮＡ９（配列番号９）、ＳＣ ＤＮＡ１０（配列番号１０）及びＳＣ ＤＮＡ１１（配列番号１１）を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。反応は、０、１０、１００、又は１０００ｆＭのマイクロＲＮＡ－２１標的核酸（すなわち、ＲＮＡ標的核酸）の存在下で実施した。
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）、ＳＣ ＤＮＡ７（配列番号７）、ＳＣ ＤＮＡ８（配列番号８）、ＳＣ ＤＮＡ９（配列番号９）、ＳＣ ＤＮＡ１０（配列番号１０）及びＳＣ ＤＮＡ１１（配列番号１１）を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。反応は、０、１０、１００、又は１０００ｆＭのマイクロＲＮＡ－２１標的核酸（すなわち、ＲＮＡ標的核酸）の存在下で実施した。
【0112】
反応は、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭの酢酸トリス、７．５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．９）を有するＣｕｔＳｍａｒｔバッファー、０．０２Ｕ／μＬで存在するＤＮＡポリメラーゼＢｓｔＬ．Ｆ．、及び０．０２５Ｕ／μＬで存在するニッキングエンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｂｖＣｌを含有する１２０μＬの反応溶液中３７℃で実施した。総増幅時間は２５分間であった。生成されたシグナルＤＮＡは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴを使用する化学発光測定により検出した。
【0113】
実施例１０の結果は図１２に図解されている。
【0114】
［実施例１１］
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）並びに５’末端から位置３８及び３９にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡ ＴＡＧＣＡＧＡＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＴＧＣ ＴＴＣＴＴＧＣααＡ ＴＣＴＴＣＴＣＣＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１２）を有するＳＡ ＤＮＡ１を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在しており、ＳＡ ＤＮＡ１は反応中に１．４ｎＭで存在していた。１０の異なる正常血清試料（すなわち、標的核酸を欠く１０の血清試料）を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）並びに５’末端から位置３８及び３９にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡ ＴＡＧＣＡＧＡＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＴＧＣ ＴＴＣＴＴＧＣααＡ ＴＣＴＴＣＴＣＣＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１２）を有するＳＡ ＤＮＡ１を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在しており、ＳＡ ＤＮＡ１は反応中に１．４ｎＭで存在していた。１０の異なる正常血清試料（すなわち、標的核酸を欠く１０の血清試料）を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
【0115】
反応は、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭの酢酸トリス、７．５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．９）を有するＣｕｔＳｍａｒｔバッファー、０．０２Ｕ／μＬで存在するＤＮＡポリメラーゼＢｓｔＬ．Ｆ．、及び０．０２５Ｕ／μＬで存在するニッキングエンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｂｖＣｌを含有する１２０μＬの反応溶液中３７℃で実施した。総増幅時間は２５分間であった。生成されたシグナルＤＮＡは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴを使用する化学発光測定により検出した。
【0116】
実施例１１の結果は図１３に図解されている。
【0117】
［実施例１２］
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）及びＳＡ ＤＮＡ１（配列番号１２）を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に０．１４ｎＭで存在しており、ＳＡ ＤＮＡ１は反応中に１．４ｎＭで存在していた。反応は、０、１００、又は１０００ｆＭのモデルＤＮＡ標的核酸（すなわち、マイクロＲＮＡ－２１に相当する配列を有するＤＮＡ）の存在下で実施した。
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）及びＳＡ ＤＮＡ１（配列番号１２）を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に０．１４ｎＭで存在しており、ＳＡ ＤＮＡ１は反応中に１．４ｎＭで存在していた。反応は、０、１００、又は１０００ｆＭのモデルＤＮＡ標的核酸（すなわち、マイクロＲＮＡ－２１に相当する配列を有するＤＮＡ）の存在下で実施した。
【0118】
反応は、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭの酢酸トリス、７．５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．９）を有するＣｕｔＳｍａｒｔバッファー、０．０２Ｕ／μＬで存在するＤＮＡポリメラーゼＢｓｔＬ．Ｆ．、及び０．０２５Ｕ／μＬで存在するニッキングエンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｂｖＣｌを含有する１２０μＬの反応溶液中３７℃で実施した。総増幅時間は２５分間であった。生成されたシグナルＤＮＡは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴを使用する化学発光測定により検出した。
【0119】
実施例１２の結果は図１４に図解されている。
【0120】
［実施例１３］
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）及びＳＡ ＤＮＡ１（配列番号１２）を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に０．１４ｎＭで存在しており、ＳＡ ＤＮＡ１は反応中に１．４ｎＭで存在していた。反応は、０、１００、又は１０００ｆＭのマイクロＲＮＡ－２１標的核酸（すなわち、ＲＮＡ標的核酸）の存在下で実施した。
別の組の反応は、ＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）及びＳＡ ＤＮＡ１（配列番号１２）を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に０．１４ｎＭで存在しており、ＳＡ ＤＮＡ１は反応中に１．４ｎＭで存在していた。反応は、０、１００、又は１０００ｆＭのマイクロＲＮＡ－２１標的核酸（すなわち、ＲＮＡ標的核酸）の存在下で実施した。
【0121】
反応は、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭの酢酸トリス、７．５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．９）を有するＣｕｔＳｍａｒｔバッファー、０．０２Ｕ／μＬで存在するＤＮＡポリメラーゼＢｓｔＬ．Ｆ．、及び０．０２５Ｕ／μＬで存在するニッキングエンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｂｖＣｌを含有する１２０μＬの反応溶液中３７℃で実施した。総増幅時間は２５分間であった。生成されたシグナルＤＮＡは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴを使用する化学発光測定により検出した。
【0122】
実施例１３の結果は図１５に図解されている。
【0123】
［実施例１４］
非特異的バックグラウンドシグナル増幅に対するその中に組み込まれた脱塩基部位を有するＳＣ ＤＮＡ及び／又はＳＡ ＤＮＡの効果を比較するために本開示に従って一連の反応を実施した。反応は５８の正常な血清試料（すなわち、標的核酸を欠く）で実施した。それぞれの血清試料は以下の２つの反応条件を使用して分析した。
非特異的バックグラウンドシグナル増幅に対するその中に組み込まれた脱塩基部位を有するＳＣ ＤＮＡ及び／又はＳＡ ＤＮＡの効果を比較するために本開示に従って一連の反応を実施した。反応は５８の正常な血清試料（すなわち、標的核酸を欠く）で実施した。それぞれの血清試料は以下の２つの反応条件を使用して分析した。
【0124】
反応条件Ａは、配列５’－ＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡ ＴＡＧＣＡＧＡＡＣＣ ＴＣＡＧＣＴＴＣＴＧ ＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴ ＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴ ＡＡＧＴＣＴＧＡＴＡ ＡＧＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１５）を有するＳＣ ＤＮＡ１３及び配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＡＴＡＣＧ ＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧ ＣＡＡＣＡＴＡＧＣＡ ＧＡＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１６）を有するＳＡ ＤＮＡ３を使用した。ＳＣ及びＳＡ ＤＮＡは反応中にそれぞれ０．４２ｎＭ及び１．４ｎＭ存在していた。
【0125】
反応条件Ｂは、位置５０及び５１にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡ ＴＡＧＣＡＧＡＡＣＣ ＴＣＡＧＣＴＴＣＴＧ ＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴ ＧＣＴＴＣＡＡＣＡα αＡＧＴＣＴＧＡＴＡ ＡＧＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１３）を有するＳＣ ＤＮＡ１２及び位置４１及び４２にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＡＴＡＣＧ ＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧ ααＡＣＡＴＡＧＣＡ ＧＡＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１４）を有するＳＡ ＤＮＡ２を使用した。ＳＣ及びＳＡ ＤＮＡは反応中にそれぞれ０．４２ｎＭ及び１．４ｎＭ存在していた。
反応は、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭの酢酸トリス、７．５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．９）を有するＣｕｔＳｍａｒｔバッファー、０．０２Ｕ／μＬで存在するＤＮＡポリメラーゼＢｓｔＬ．Ｆ．、及び０．０２５Ｕ／μＬで存在するニッキングエンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｂｖＣｌを含有する１２０μＬの反応溶液中３７℃で実施した。総増幅時間は２５分間であった。生成されたシグナルＤＮＡは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴを使用する化学発光測定により検出した。
実施例１４の結果は図１６～１８に示されている（灰色線は個々の生物学的複写物を表し、黒色線はすべての生物学的複写物の平均を表す）。図１６は、非特異的バックグラウンドシグナルに対するＳＣ ＤＮＡ及びＳＡ ＤＮＡの効果を図解しており、それぞれがその中に組み込まれた脱塩基部位を有する。これらのデータは、それぞれが脱塩基部位を含むＳＣ ＤＮＡ及びＳＡ ＤＮＡ（反応条件Ｂ）が、ＳＣ ＤＮＡ及びＳＡ ＤＮＡが脱塩基部位を欠く（反応条件Ａ）反応と比べて非特異的バックグラウンドシグナルを減少できることを実証している。
反応は、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭの酢酸トリス、７．５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．９）を有するＣｕｔＳｍａｒｔバッファー、０．０２Ｕ／μＬで存在するＤＮＡポリメラーゼＢｓｔＬ．Ｆ．、及び０．０２５Ｕ／μＬで存在するニッキングエンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｂｖＣｌを含有する１２０μＬの反応溶液中３７℃で実施した。総増幅時間は２５分間であった。生成されたシグナルＤＮＡは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴを使用する化学発光測定により検出した。
実施例１４の結果は図１６～１８に示されている（灰色線は個々の生物学的複写物を表し、黒色線はすべての生物学的複写物の平均を表す）。図１６は、非特異的バックグラウンドシグナルに対するＳＣ ＤＮＡ及びＳＡ ＤＮＡの効果を図解しており、それぞれがその中に組み込まれた脱塩基部位を有する。これらのデータは、それぞれが脱塩基部位を含むＳＣ ＤＮＡ及びＳＡ ＤＮＡ（反応条件Ｂ）が、ＳＣ ＤＮＡ及びＳＡ ＤＮＡが脱塩基部位を欠く（反応条件Ａ）反応と比べて非特異的バックグラウンドシグナルを減少できることを実証している。
【0126】
図１７は、中間域偽陽性値（測定されたＡＲＣＨＩＴＥＣＴ値は２０００相対発光量よりも少なかった）を報告する２０の正常な血清からの非特異的バックグラウンドシグナルに対するＳＣ ＤＮＡ及びＳＡ ＤＮＡの効果を図解しており、それぞれがその中に組み込まれた脱塩基部位を有する。図１８は、高域偽陽性値（測定されたＡＲＣＨＩＴＥＣＴ値は２０００相対発光量よりも大きかった）を報告する３８の正常な血清からの非特異的バックグラウンドシグナルに対するＳＣ ＤＮＡ及びＳＡ ＤＮＡの効果を図解しており、それぞれがその中に組み込まれた脱塩基部位を有する。これらのデータは、それぞれがその中に組み込まれた脱塩基部位を有するＳＣ ＤＮＡ及びＳＡ ＤＮＡが、高域偽陽性値を報告する正常な血清と比べて中間域偽陽性値を報告する正常な血清の非特異的バックグラウンドシグナル減少に対する効果が大きいことを実証している。
【0127】
［実施例１５］
特異的及び非特異的増幅に対するＳＣ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列の少なくとも一部に相補的な配列の長さを変える効果を調べるために一組の反応を本開示に従って実施した。反応は、配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１）を有するＳＣ ＤＮＡ１、５’末端から位置３８及び３９にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡααＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号２）を有するＳＣ ＤＮＡ２、５’末端から位置４２及び４３にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＡＴＡＣＧ ＣＡＡＧＡＴＣＡＡＣ ＡααＡＧＴＣＴＧＡＴＡ ＡＧＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１７）を有するＳＣ ＤＮＡ１４、５’末端から位置４６及び４７にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＡＡＧＡ ＴＡＣＧＣＡＡＧＡＴ ＣＡＡＣＡααＡＧＴ ＣＴＧＡＴＡ ＡＧＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１８）を有するＳＣ ＤＮＡ１５及び５’末端から位置５０及び５１にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＴＧＧＡＧ ＡＡＧＡＴＡＣＧＣＡ ＡＧＡＴＣＡＡＣＡα αＡＧＴＣＴＧＡＴＡ ＡＧＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１９）を有するＳＡ ＤＮＡ１６を使用して実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。１０の異なる正常血清試料（すなわち、標的核酸を欠く１０の血清試料）を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
特異的及び非特異的増幅に対するＳＣ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列の少なくとも一部に相補的な配列の長さを変える効果を調べるために一組の反応を本開示に従って実施した。反応は、配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１）を有するＳＣ ＤＮＡ１、５’末端から位置３８及び３９にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧ ＡＴＣＡＡＣＡααＡ ＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号２）を有するＳＣ ＤＮＡ２、５’末端から位置４２及び４３にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＡＴＡＣＧ ＣＡＡＧＡＴＣＡＡＣ ＡααＡＧＴＣＴＧＡＴＡ ＡＧＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１７）を有するＳＣ ＤＮＡ１４、５’末端から位置４６及び４７にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＧＡＡＧＡ ＴＡＣＧＣＡＡＧＡＴ ＣＡＡＣＡααＡＧＴ ＣＴＧＡＴＡ ＡＧＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１８）を有するＳＣ ＤＮＡ１５及び５’末端から位置５０及び５１にｄＳｐａｃｅｒ脱塩基人工核酸（「α」）を有する配列５’－ＴＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣ ＴＣＡＧＣＴＧＧＡＧ ＡＡＧＡＴＡＣＧＣＡ ＡＧＡＴＣＡＡＣＡα αＡＧＴＣＴＧＡＴＡ ＡＧＣＴＡ－ｉｄＴ－ｉｄＴ－３’（配列番号１９）を有するＳＡ ＤＮＡ１６を使用して実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。１０の異なる正常血清試料（すなわち、標的核酸を欠く１０の血清試料）を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
【0128】
別の組の反応を、上で詳細に述べたＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）、又はＳＣ ＤＮＡ１４（配列番号１７）、ＳＣ ＤＮＡ１５（配列番号１８）、若しくはＳＣ ＤＮＡ１６（配列番号１９）を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。反応は、配列５’－ｔａｇｃｔｔａｔｃａ ｇａｃｔｇａｔｇｔｔ ｇａ－３’（配列番号２０）（すなわち、マイクロＲＮＡ－２１に相当する配列を有するＤＮＡ）を有する０、１０、１００、又は１０００ｆＭのモデルＤＮＡ標的核酸の存在下で実施した。
【0129】
別の組の反応を、上で詳細に述べたＳＣ ＤＮＡ１（配列番号１）、ＳＣ ＤＮＡ２（配列番号２）、又はＳＣ ＤＮＡ１４（配列番号１７）、ＳＣ ＤＮＡ１５（配列番号１８）、若しくはＳＣ ＤＮＡ１６（配列番号１９）を使用して本開示に従って実施した。ＳＣ ＤＮＡは反応中に１．４ｎＭで存在していた。反応は、配列５’－ｕａｇｃｕｕａｕｃａ ｇａｃｕｇａｕｇｕｕ ｇａ－３’（配列番号２１）（すなわち、マイクロＲＮＡ－２１に相当する配列を有するＲＮＡ）を有する０、１０、１００、又は１０００ｆＭのモデルＲＮＡ標的核酸の存在下で実施した。
【0130】
反応は、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭの酢酸トリス、７．５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．９）を有するＣｕｔＳｍａｒｔバッファー、０．０２Ｕ／μＬで存在するＤＮＡポリメラーゼＢｓｔラージ断片（Ｌ．Ｆ．）、及び０．０２５Ｕ／μＬで存在するニッキングエンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｂｖＣｌを含有する１２０μＬの反応溶液中３７℃で実施した。総増幅時間は２５分間であった。生成されたシグナルＤＮＡは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴを使用する化学発光測定により検出した。
【0131】
実施例１５のそれぞれの反応の組の結果は、それぞれ図１９Ａ（血清）、１９Ｂ（添加された標的ＤＮＡ）及び１９Ｃ（添加された標的ＲＮＡ）に示されている。
【0132】
下記の表１及び２は、本明細書で開示される配列の配列番号を開示する。
【0133】
【表1】
【0134】
【表2】
【0135】
本出願はある特定の態様及び実施形態に関連して説明されたが、本明細書で提供される開示には変更を加えうること、均等物を本開示の範囲から逸脱することなく置き換えうることは当業者であれば理解する。したがって、本出願は開示されている特定の態様及び実施形態に限定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲内に収まるすべての態様及び実施形態を含むと理解され認識されるべきである。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【図19C】
【配列表】
【国際調査報告】