特表 2024-506279 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-13

(54)【発明の名称】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20240205BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240205BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240205BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20240205BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

C12N15/11 Z ZNA

C12N7/01

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023546322

(86)(22)【出願日】2022-02-10

(85)【翻訳文提出日】2023-07-31

(86)【国際出願番号】 US2022015975

(87)【国際公開番号】W WO2022173944

(87)【国際公開日】2022-08-18

(31)【優先権主張番号】63/148,350

(32)【優先日】2021-02-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518402174

【氏名又は名称】ロンザ ヒューストン インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】グ， ビンナン

(72)【発明者】

【氏名】ワン， ジェニファー

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

(57)【要約】

本開示は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生するための方法に関する。
【選択図】図５Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｅ１相補性プロデューサー細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法であって、
ａ．前記Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、
ｉ．Ｅ１Ａアデノウイルスヘルパー遺伝子と、
ｉｉ．Ｅ２Ａ、Ｅ４、又は両方から選択されるアデノウイルスヘルパー遺伝子と、
ｉｉｉ．ウイルス関連、非コードＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）と、
ｉｖ．Ｒｅｐ、Ｃａｐ、又は両方から選択されるＡＡＶ遺伝子と、を含む、１つ以上のベクターでトランスフェクトすることと、
ｂ．前記トランスフェクトされたＥ１相補性プロデューサー細胞を、前記ＡＡＶを産生するのに好適な条件下で培養することと、
ｃ．前記ＡＡＶを前記培養されたＥ１相補性プロデューサー細胞から精製し、それによって前記ＡＡＶを得ることと、を含む、方法。

【請求項2】

（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）が、単一のベクター上にある、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）が、２つ以上のベクター上にある、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）が、第１のベクター上にあり、（ｉｖ）が、第２のベクターである、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

（ｉ）が、第１のベクター上にあり、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）が、第２のベクター上にあり、（ｉｖ）が、第３のベクター上にある、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々が、別個のベクター上にある、請求項３に記載の方法。

【請求項7】

（ｉ）を含む前記ベクターが、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）を含む前記ベクターの各々に対して約１：１～約５：１の比で前記Ｅ１相補性プロデューサー細胞にトランスフェクトされる、請求項５又は６に記載の方法。

【請求項8】

前記Ｅ１相補性プロデューサー細胞にトランスフェクトされる（ｉ）を含む前記ベクターと（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）を含む前記ベクターの各々との比が、１：１である、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記Ｅ１相補性プロデューサー細胞にトランスフェクトされる（ｉ）を含む前記ベクターと（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）を含む前記ベクターの各々との比が、２：１である、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

前記Ｅ１相補性プロデューサー細胞にトランスフェクトされる（ｉ）を含む前記ベクターと（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）を含む前記ベクターの各々との比が、３：１である、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）が、１つ以上のプロモーターに作動可能に結合している、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々が、別個のプロモーターに作動可能に結合している、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

（ｉ）に作動可能に結合した前記プロモーターが、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）に作動可能に結合した前記プロモーターと比較して実質的に同じ発現レベルを提供する、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

（ｉ）に作動可能に結合した前記プロモーターが、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）に作動可能に結合した前記プロモーターと比較して少なくとも２倍高い発現を提供する、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

（ｉ）に作動可能に結合した前記プロモーターが、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）に作動可能に結合した前記プロモーターと比較して少なくとも３倍高い発現を提供する、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

（ｉ）が、プロモーターに作動可能に結合しており、エンハンサーに更に作動可能に結合しており、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）が、エンハンサーに作動可能に結合していない、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記１つ以上のベクター上の（ｉ）と（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々とのコピー数比が、約１：１～約５：１である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記１つ以上のベクター上の（ｉ）と（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々とのコピー数比が、１：１である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記１つ以上のベクター上の（ｉ）と（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々とのコピー数比が、２：１である、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

前記１つ以上のベクター上の（ｉ）と（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々とのコピー数比が、３：１である、請求項１７に記載の方法。

【請求項21】

（ｉｉ）が、Ｅ２Ａ及びＥ４を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

（ｉｖ）が、Ｒｅｐ及びＣａｐを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記培養することが、Ｅ１Ａを、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々に対して約１：１～約５：１の比で発現することを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

Ｅ１Ａの発現と（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々の発現との前記比が、１：１、２：１、又は３：１である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記１つ以上のベクターが、（ｖ）Ｅ１Ｂ、ＮＰ１、ＮＳ２、又はそれらの組み合わせから選択されるヘルパー遺伝子を更に含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記Ｅ１Ｂが、Ｅ１Ｂ－１９ｋ又はＥ１Ｂ－５５ｋである、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

（ｖ）が、ＮＰ１及びＮＳ２を含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

（ｉ）及び（ｖ）が、単一のベクター上にある、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

（ｖ）が、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）からの別個のベクター上にある、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記１つ以上のベクターが、目的の遺伝子を更に含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、目的の遺伝子を含むベクターでトランスフェクトすることを更に含み、前記遺伝子又は目的が、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）からの別個のベクター上にある、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記方法が、Ｅ１相補性プロデューサー細胞をＥ１Ａアデノウイルスヘルパー遺伝子でトランスフェクトすることを含まない方法と比較して、少なくとも１．５倍以上の力価の前記ＡＡＶを産生する、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

Ｅ１相補性プロデューサー細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法であって、
ａ．前記Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、
ｉ．第１のプロモーターに作動可能に結合したＥ１Ａを含む、第１のベクター、
ｉｉ．全て第２のプロモーターに作動可能に結合した、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びウイルス関連、非コードＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）を含む、第２のベクター、並びに
ｉｉｉ．共に第３のプロモーターに作動可能に結合した、Ｒｅｐ及びＣａｐを含む、第３のベクターでトランスフェクトすることであって、
（ｉ）と（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の各々とのトランスフェクション比が、約１：１～約３：１である、トランスフェクトすることと、
ｂ．前記トランスフェクトされたＥ１相補性プロデューサー細胞を、前記ＡＡＶを産生するのに好適な条件下で培養することと、
ｃ．前記ＡＡＶを前記培養されたＥ１相補性プロデューサー細胞から精製し、それによって前記ＡＡＶを得ることと、を含む、方法。

【請求項34】

Ｅ１相補性プロデューサー細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法であって、
ａ．前記Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、
ｉ．第１のプロモーター及びエンハンサーに作動可能に結合したＥ１Ａを含む、第１のベクター、
ｉｉ．全て第２のプロモーターに作動可能に結合した、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びウイルス関連、非コードＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）を含む、第２のベクター、並びに
ｉｉｉ．各々第３のプロモーターに作動可能に結合した、Ｒｅｐ及びＣａｐを含む、第３のベクターでトランスフェクトすることと、
ｂ．前記トランスフェクトされたＥ１相補性プロデューサー細胞を、前記ＡＡＶを産生するのに好適な条件下で培養することであって、Ｅ１Ａが、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及びＣａｐの各々に対して約１：１～約３：１の比で発現される、培養することと、
ｃ．前記ＡＡＶを前記培養されたＥ１相補性プロデューサー細胞から精製し、それによって前記ＡＡＶを得ることと、を含む、方法。

【請求項35】

Ｅ１相補性プロデューサー細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法であって、
ａ．前記Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、
ｉ．全て第１のプロモーターに作動可能に結合した、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡを含む、第１のベクター、並びに
ｉｉ．第２のプロモーターに作動可能に結合した、Ｒｅｐ及びＣａｐを含む、第２のベクターでトランスフェクトすることであって、
Ｅ１ＡとＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及びＣａｐの各々とのコピー数比が、約１：１～約３：１である、トランスフェクトすることと、
ｂ．前記トランスフェクトされたＥ１相補性プロデューサー細胞を、前記ＡＡＶを産生するのに好適な条件下で培養することと、
ｃ．前記ＡＡＶを前記培養されたＥ１相補性プロデューサー細胞から精製し、それによって前記ＡＡＶを得ることと、を含む、方法。

【請求項36】

前記第１、第２、又は第３のベクターのうちの１つ以上が、Ｅ１Ｂ、ＮＰ１、ＮＳ２、又はそれらの組み合わせから選択されるヘルパー遺伝子を更に含む、請求項３３又は３４に記載の方法。

【請求項37】

前記第１又は第２のベクターの一方又は両方が、Ｅ１Ｂ、ＮＰ１、ＮＳ２、又はそれらの組み合わせから選択されるヘルパー遺伝子を更に含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項38】

前記Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、Ｅ１Ｂ、ＮＰ１、ＮＳ２、又はそれらの組み合わせから選択されるヘルパー遺伝子を含むベクターでトランスフェクトすることを更に含む、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記Ｅ１Ｂが、Ｅ１Ｂ－１９ｋ又はＥ１Ｂ－５５ｋである、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記ヘルパー遺伝子が、ＮＰ１とＮＳ２との組み合わせを含む、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、目的の遺伝子を含むベクターでトランスフェクトすることを更に含む、請求項３３～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記Ｅ１相補性プロデューサー細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、９１１細胞、ｐＴＧ６５５９細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＧＨ３２９細胞、Ｎ５２．Ｅ６（ＣＡＰ（登録商標））細胞、ＨｅＬａ－Ｅ１細胞、ＵＲ細胞、ＶＬＩ－２９３細胞、Ａｃ５１細胞、Ａｃ１３９細胞、又はそれらのバリアント若しくは誘導体。である、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記Ｅ１相補性プロデューサー細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はＮ５２．Ｅ６（ＣＡＰ（登録商標））細胞である、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記Ｅ１相補性プロデューサー細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記ＨＥＫ２９３細胞が、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴＭ細胞、ＨＥＫ２９３ＳＧ細胞、ＨＥＫ２９３ＳＧＧＤ細胞、ＨＥＫ２９３Ｈ細胞、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞、ＨＥＫ２９３ＭＳＲ細胞、ＨＥＫ２９３Ａ細胞、又はそれらの組み合わせである、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記ＨＥＫ２９３細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記Ｅ１相補性プロデューサー細胞が、ＰＥＲ．Ｃ６細胞である、請求項４３に記載の方法。

【請求項48】

前記Ｅ１相補性プロデューサー細胞が、Ｎ５２．Ｅ６（ＣＡＰ（登録商標））細胞である、請求項４３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生するための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、非エンベロープＤＮＡウイルスである。インビボ遺伝子療法のための主要なウイルスベクターとして、ＡＡＶは、非病原性であり、広範囲のヒト組織に効果的に感染することができる。ＡＡＶゲノムは、２つの主要な遺伝子をコードする４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡを含む：Ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、パッケージング、組み込み、及び転写を支持する４つのアイソフォーム（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０）をコードし、Ｃａｐ遺伝子は、ウイルスタンパク質シェル又はキャプシド構築のための３つのＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）を合成する。

【0003】

野生型ＡＡＶは、アデノウイルス（Ａｄ）及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）などの、ヘルパーウイルスなしで複製することができない。アデノウイルスヘルパー遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡを含む、ＡＡＶ複製に必要かつ十分であると特定されている。アデノウイルス５型（Ａｄ５）５’４．３ｋｂゲノムＤＮＡは、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞の１９番染色体に組み込まれている。このＡｄ５ゲノム断片は、全てのＥ１Ａ（例えば、２８９Ｒ、２４３Ｒ、１７１Ｒ）及びＥ１Ｂ（例えば、１９Ｋ及び５５Ｋ）アイソフォームを発現する。例えば、ＰＥＲ．Ｃ６細胞及びＣＡＰ（登録商標）細胞を含む、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ組み込みを有する更なる細胞株が開発されている。例えば、Ｆａｌｌａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９（１３）：１９０９－１９１７（１９９８）及びＳｃｈｉｅｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １１（１５）：２１０５－２１１６（２０００）を参照されたい。したがって、これらの細胞は、既にＥ１Ａ及びＥ１Ｂを発現しており、したがって、「トリプルプラスミドトランスフェクション」アプローチ、すなわち、Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、及びＶＡのみをコードするヘルパープラスミド（ｐＨｅｌｐｅｒ）を、Ｒｅｐ及びＣａｐ遺伝子（ｐＲｅｐＣａｐ）並びに目的の遺伝子（ｐＡＡＶ－ＧＯＩ）をコードするプラスミドと一緒にトランスフェクトすることによって、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）産生を支持することができる。ゲノム組み込みＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子を有し、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂタンパク質を天然に発現する、そのような細胞は、「Ｅ１相補性プロデューサー細胞」として知られている。

【0004】

現在、世界におけるＡＡＶベースの遺伝子療法パイプラインの７０％超が、標準トリプルプラスミドトランスフェクション法でのＨＥＫ２９３細胞における一過性トランスフェクションを介した製造プラットフォームに依存する。ＨＥＫ２９３及び他のＥ１相補性プロデューサー細胞製造プラットフォームの生産性は、例えば、臨床開発及び商業化のための、ＡＡＶの増大する需要を満たすことができない場合がある。しかしながら、ＨＥＫ２９３細胞などのＥ１相補性プロデューサー細胞におけるＡＡＶ生産性を増加させるための現在のアプローチ、例えば、高プロデューサー細胞クローンスクリーニング及び単離、トランスフェクションプロトコル最適化、並びに製造プロセス開発は、コストがかかり、時間がかかる。

【発明の概要】

【0005】

いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、（ｉ）Ｅ１Ａアデノウイルスヘルパー遺伝子と、（ｉｉ）Ｅ２Ａ、Ｅ４、又は両方から選択されるアデノウイルスヘルパー遺伝子と、（ｉｉｉ）ウイルス関連、非コードＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）と、（ｉｖ）Ｒｅｐ、Ｃａｐ、又は両方から選択されるＡＡＶ遺伝子と、を含む、１つ以上のベクターでトランスフェクトすることと、（ｂ）トランスフェクトされたＥ１相補性プロデューサー細胞を、ＡＡＶを産生するのに好適な条件下で培養することと、（ｃ）培養されたＥ１相補性プロデューサー細胞からＡＡＶを精製し、それによってＡＡＶを得ることと、を含む、Ｅ１相補性プロデューサー細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法を提供する。

【0006】

追加の実施形態では、本開示は、（ａ）Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、（ｉ）第１のプロモーターに作動可能に結合したＥ１Ａを含む第１のベクター、（ｉｉ）全て第２のプロモーターに作動可能に結合した、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びウイルス関連、非コードＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）を含む第２のベクター、並びに（ｉｉｉ）共に第３のプロモーターに作動可能に結合した、Ｒｅｐ及びＣａｐを含む第３のベクターでトランスフェクトすることであって、（ｉ）と（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の各々とのトランスフェクション比が、約１：１～約３：１である、トランスフェクトすることと、（ｂ）トランスフェクトされたＥ１相補性プロデューサー細胞を、ＡＡＶを産生するのに好適な条件下で培養することと、（ｃ）培養されたＥ１相補性プロデューサー細胞からＡＡＶを精製し、それによってＡＡＶを得ることと、を含む、Ｅ１相補性プロデューサー細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法を提供する。好適には、第１、第２、又は第３のベクターの１つ以上は、Ｅ１Ｂ、ＮＰ１、ＮＳ２、又はそれらの組み合わせから選択されるヘルパー遺伝子を更に含む。好適には、Ｅ１Ｂは、Ｅ１Ｂ－１９ｋ又はＥ１Ｂ－５５ｋである。好適には、ヘルパー遺伝子は、ＮＰ１とＮＳ２との組み合わせを含む。実施形態では、方法は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、ＧＯＩを含むベクターでトランスフェクトすることを更に含む。

【0007】

更なる実施形態では、本開示は、（ａ）Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、（ｉ）第１のプロモーター及びエンハンサーに作動可能に結合したＥ１Ａを含む第１のベクター、（ｉｉ）全て第２のプロモーターに作動可能に結合した、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びウイルス関連、非コードＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）を含む第２のベクター、並びに（ｉｉｉ）各々第３のプロモーターに作動可能に結合した、Ｒｅｐ及びＣａｐを含む第３のベクターでトランスフェクトすることと、（ｂ）トランスフェクトされたＥ１相補性プロデューサー細胞を、ＡＡＶを産生するのに好適な条件下で培養することであって、Ｅ１Ａが、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及びＣａｐの各々に対して約１：１～約３：１の比で発現される、培養することと、（ｃ）培養されたＥ１相補性プロデューサー細胞からＡＡＶを精製し、それによってＡＡＶを得ることと、を含む、Ｅ１相補性プロデューサー細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法を提供する。好適には、第１、第２、又は第３のベクターの１つ以上は、Ｅ１Ｂ、ＮＰ１、ＮＳ２、又はそれらの組み合わせから選択されるヘルパー遺伝子を更に含む。好適には、Ｅ１Ｂは、Ｅ１Ｂ－１９ｋ又はＥ１Ｂ－５５ｋである。好適には、ヘルパー遺伝子は、ＮＰ１とＮＳ２との組み合わせを含む。実施形態では、方法は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、ＧＯＩを含むベクターでトランスフェクトすることを更に含む。

【0008】

また更なる実施形態では、本開示は、（ａ）Ｅ１相補性プロデューサーを、（ｉ）全て第１のプロモーターに作動可能に結合した、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡを含む第１のベクター、並びに（ｉｉ）第２のプロモーターに作動可能に結合した、Ｒｅｐ及びＣａｐを含む第２のベクターでトランスフェクトすることであって、Ｅ１ＡとＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及びＣａｐの各々とのコピー数比が、約１：１～約３：１である、トランスフェクトすることと、（ｂ）トランスフェクトされたＥ１相補性プロデューサー細胞を、ＡＡＶを産生するのに好適な条件下で培養することと、（ｃ）培養されたＥ１相補性プロデューサー細胞からＡＡＶを精製し、それによってＡＡＶを得ることと、を含む、Ｅ１相補性プロデューサー細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法を提供する。好適には、第１又は第２のベクターの一方又は両方は、Ｅ１Ｂ、ＮＰ１、ＮＳ２、又はそれらの組み合わせから選択されるヘルパー遺伝子を更に含む。好適には、Ｅ１Ｂは、Ｅ１Ｂ－１９ｋ又はＥ１Ｂ－５５ｋである。好適には、ヘルパー遺伝子は、ＮＰ１とＮＳ２との組み合わせを含む。実施形態では、方法は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、ＧＯＩを含むベクターでトランスフェクトすることを更に含む。

【図面の簡単な説明】

【0009】

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様の例示的な実施形態を更に示すために含まれる。

【0010】

【図1】本明細書において実施形態に記載される、Ｅ１相補性プロデューサー細胞におけるＡＡＶ産生のための標準トリプルトランスフェクションプラスミド：Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡを含有するｐＨｅｌｐｅｒプラスミド、Ｒｅｐ及びＣａｐを含有するｐＲｅｐ－Ｃａｐプラスミド、並びに逆位末端反復（ＩＴＲ）配列及び目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含有するｐＡＡＶ－ＧＯＩプラスミドを示す。

【図2】本明細書において実施形態に記載されるトランスフェクション実験のウイルス力価結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞を、標準トリプルトランスフェクションプラスミド（「３×Ｔｎｆｘ」）及び１つ以上の追加のヘルパー遺伝子（空ベクター（対照）、Ｅ１Ａ単独、Ｅ１Ｂ－１９ｋ単独、Ｅ１Ｂ－５５ｋ単独、ＮＰ１－ＮＳ２、Ｅ１Ａ＋Ｅ１Ｂ－１９ｋ、Ｅ１Ａ＋１９Ｂ－５５ｋ、Ｅ１Ｂ－１９ｋ＋Ｅ１Ｂ－５５ｋ、及びＥ１Ａ＋Ｅ１Ｂ－１９ｋ＋Ｅ１Ｂ－５５ｋ）でトランスフェクトした。粗ウイルス力価を、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって分析した。

【図3A】本明細書において実施形態に記載されるトランスフェクション実験のウイルス力価結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞を、標準トリプルトランスフェクションプラスミド（「３×Ｔｎｆｘ」）及び１つ以上の追加のヘルパー遺伝子（空ベクター（対照）、Ｅ１Ａ単独、Ｅ１Ｂ－１９ｋ単独、Ｅ１Ｂ－５５ｋ単独、ＮＰ１－ＮＳ２、及びＥ１Ａ＋ＮＰ１－ＮＳ２）でトランスフェクトした。粗ウイルス力価を、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって分析した。

【図3B】本明細書において実施形態に記載されるトランスフェクション実験からのタンパク質発現結果を示す。ウェスタンブロット分析を実施して、図３Ａ及び表に示されるＨＥＫ２９３細胞におけるＥ１Ａ（２８９Ｒ、２４３Ｒ、及び１７１Ｒアイソフォーム）、Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２アイソフォーム）、及びＣａｐ（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）のタンパク質発現レベルを評価した。β－アクチンのレベルを、対照として測定した。

【図4A】本明細書において実施形態に記載されるトランスフェクション実験からのタンパク質発現結果を示す。Ｅ１Ａを含有するプラスミドを、それぞれ、１×Ｅ１Ａ、２×Ｅ１Ａ、又は３×Ｅ１Ａとして示される、標準トリプルトランスフェクションプラスミド（「３×Ｔｎｆｘ」）の各々に対して１：１、２：１、又は３：１モル比でトランスフェクトした。ウェスタンブロット分析を実施して、表に示されるプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＥ１Ａ（２８９Ｒ、２４３Ｒ、及び１７１Ｒアイソフォーム）、Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２アイソフォーム）、及びＣａｐ（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）のタンパク質発現レベルを評価した。

【図4B】本明細書において実施形態に記載されるトランスフェクション実験のウイルス力価結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞を、それぞれ、１×Ｅ１Ａ、２×Ｅ１Ａ、又は３×Ｅ１Ａとして示される、標準トリプルトランスフェクションプラスミド（「３×Ｔｎｆｘ」）の各々に対して１：１、２：１、又は３：１モル比でＥ１Ａを含有するプラスミドでトランスフェクトした。粗ウイルス力価を、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって分析した。

【図5A】本明細書において実施形態に記載される、Ｅ１相補性プロデューサー細胞におけるＡＡＶ産生のための新規及び増強されたトリプルトランスフェクションプラスミド：Ｅ１Ａ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡを含有するｐＬＨＩ＿Ｈｅｌｐｅｒプラスミド、Ｒｅｐ及びＣａｐを含有するｐＲｅｐ－Ｃａｐプラスミド、並びに逆位末端反復（ＩＴＲ）配列及び目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含有するｐＡＡＶ－ＧＯＩプラスミドを示す。

【図5B】本明細書において実施形態に記載されるトランスフェクション実験のウイルス力価結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞を、ｐＨｅｌｐｅｒを含有する標準トリプルトランスフェクションプラスミド（図１に示される）、又はＡＡＶ２及びＡＡＶ９産生のためのｐＬＨＩ＿Ｈｅｌｐｅｒを含有する新規及び増強されたトリプルトランスフェクションプラスミド（図５に示される）でトランスフェクトした。粗ウイルス力価を、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって分析した。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本明細書における別段の定義がない限り、本開示で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。更に、文脈によって別段の必要がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、冠詞の文法的目的語の１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。一例として、「要素」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。

【0012】

特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、選択肢のみを指すことが明示的に示されるか、又は選択肢が互いに排他的でない限り、「及び／又は」を意味するように使用されるが、本開示は、選択肢のみ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。

【0013】

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの、含むの任意の変形又は形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（並びに「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」などの、有するの任意の変形又は形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（並びに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの、含むの任意の変形又は形態）、又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（並びに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの、含有するの任意の変形又は形態）という用語は、包括的な又は制限なしのものであり、追加の、列挙されていない要素又は方法ステップを排除しない。

【0014】

「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」という用語及びその対応する略語である「例えば（ｅ．ｇ．）」（イタリック体であるか否かにかかわらず）の使用は、別段の明示的な記述がない限り、列挙された特定の用語が、参照又は引用された特定の例に限定されることは意図されない本開示の代表的な例及び実施形態であることを意味する。

【0015】

本明細書で使用される場合、「間（ｂｅｔｗｅｅｎ）」は、範囲の末端を含む範囲である。例えば、ｘとｙとの間の数には、ｘ及びｙの数、並びにｘとｙとの範囲に入る任意の数が明示的に含まれる。

【0016】

本出願全体を通して、「約」という用語は、値が、その値を決定するために使用される方法／デバイスについての誤差の固有の変動を含むことを示すために使用される。典型的には、その用語は、状況に応じて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％未満の変動を包含することを意味する。

【0017】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、世界中の１２０を超える臨床試験において、遺伝子治療のための選択ベクターとして用いられている。組換えＡＡＶの急速に増大する需要を満たすために、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、又はＣＡＰ（登録商標）細胞などの、Ｅ１相補性プロデューサー細胞におけるＡＡＶ産生のための現在の標準の改善が必要である。本明細書に記載されるように、標準ＡＡＶ産生方法は、３つのプラスミドのＥ１相補性プロデューサー細胞へのトランスフェクションを含む：Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡを含有するｐＨｅｌｐｅｒ、Ｒｅｐ及びＣａｐを含有するｐＲｅｐＣａｐ、並びに「標準トリプルトランスフェクション」と称され、図１に示される、目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含有するｐＡＡＶ。Ｅ１相補性プロデューサー細胞は残りのヘルパー遺伝子Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを天然に発現し、よって、Ｅ１Ａ及びＥ１ＢはｐＨｅｌｐｅｒに含まれない。

【0018】

したがって驚くべきことに、Ｅ１ＡのＥ１相補性プロデューサー細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクション、したがって、天然に見出される上記の追加のＥ１Ａを提供することが、ＡＡＶ力価を有意に改善することが発見された。力価の増加は、一般に、Ｅ１相補性プロデューサー細胞に導入されたＥ１Ａの量に用量依存的であった。よって、本明細書では、現在の標準トリプルトランスフェクション法と比較してより高い収率でのＥ１相補性プロデューサー細胞におけるＡＡＶ産生のための方法が提供される。

【0019】

実施形態では、本開示は、（ａ）Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、（ｉ）Ｅ１Ａアデノウイルスヘルパー遺伝子と、（ｉｉ）Ｅ２Ａ、Ｅ４、又は両方から選択されるアデノウイルスヘルパー遺伝子と、（ｉｉｉ）ウイルス関連、非コードＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）と、（ｉｖ）Ｒｅｐ、Ｃａｐ、又は両方から選択されるＡＡＶ遺伝子と、を含む、１つ以上のベクターでトランスフェクトすることと、（ｂ）トランスフェクトされたＥ１相補性プロデューサー細胞を、ＡＡＶを産生するのに好適な条件下で培養することと、（ｃ）培養されたＥ１相補性プロデューサー細胞からＡＡＶを精製し、それによってＡＡＶを得ることと、を含む、Ｅ１相補性プロデューサー細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法を提供する。

【0020】

本明細書で使用される場合、「ベクター」又は「発現ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルス、又はコスミドなどの核酸レプリコンを指し、別の核酸セグメントが結合されて、宿主細胞中で結合された核酸セグメントの複製及び／又は発現をもたらし得る。「ベクター」という用語は、エピソーム（例えば、プラスミド）及び非エピソームベクターを含む。ベクターという用語はまた、合成ベクターを含んでもよい。ベクターの非限定的な例には、バキュロウイルスベクター、バクテリオファージベクター、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルスなどに基づくウイルスベクター）、Ｐ１ベースの人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、及び目的の特定の宿主に特異的な任意の他のベクター（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＣＡＰ（登録商標）細胞、及びその誘導体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載されるＥ１相補性プロデューサー細胞などの哺乳動物細胞）が含まれる。ベクターは、トランスフェクション、形質導入、細胞融合、及びリポフェクションを含むが、これらに限定されない、周知の方法によって、所望の宿主細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＣＡＰ（登録商標）細胞、又はそれらの誘導体に導入されてもよい。ベクターは、例えば、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含む、様々な調節要素を含むことができる。

【0021】

本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」とは、外因性核酸分子、例えば、ベクターの、細胞への導入を意味する。「トランスフェクトされた」細胞は、細胞内に外因性核酸分子を含み、「形質転換された」細胞は、細胞内の外因性核酸分子が細胞内の表現型変化を誘導するものである。トランスフェクトされた核酸分子は、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれ得、及び／又は細胞によって、一時的に若しくは染色体外で長期間維持され得る。外因性核酸分子又は断片を発現する宿主細胞又は生物は、「組換え」、「形質転換」、又は「トランスジェニック」生物と称される。多数のトランスフェクション技法は、一般的には、当該技術分野で既知であり、様々な化学的及び物理的方法、例えば、エレクトロポレーション、細胞注入、リン酸カルシウム曝露、リポソーム又はポリマーベースの担体システムなどを含む。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６（１９７３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６）、及びＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １３：１９７（１９８１）を参照されたい。そのような技法を使用して、本明細書に記載されるＡＡＶを産生するための１つ以上のベクターなどの１つ以上の外因性核酸分子を、ＨＥＫ２９３細胞などの好適な宿主細胞に導入することができる。

【0022】

「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、又は「オリゴヌクレオチド」は、共有結合したヌクレオチドを含むポリマー化合物を意味する。「核酸」という用語は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含み、これらの両方は、一本鎖又は二本鎖であり得る。ＤＮＡには、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、プラスミド又はベクターＤＮＡ、及び合成ＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。ＲＮＡには、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。

【0023】

実施形態では、本明細書における核酸は、参照核酸（又は参照核酸の断片）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。実施形態では、本明細書におけるポリペプチドは、参照ポリペプチド（又は参照ポリペプチドの断片）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。例えば、Ｅ１Ａ遺伝子を参照するとき、当業者であれば、Ｅ１Ａが、野生型アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有する核酸を包含するが、ただし、ＡＡＶ産生に関するＥ１Ａ遺伝子の機能は影響されないことを理解するであろう。本明細書で使用される場合、核酸の文脈における「配列同一性」又は「同一性パーセント」という用語は、核酸配列が指定された比較ウィンドウでアラインされるときに同じであるヌクレオチドのパーセンテージを指す。配列同一性の決定のためのアラインメントの方法は、周知であり、ＢＬＡＳＴなどの公開されているデータベースを使用して実施することができる。

【0024】

「遺伝子」は、ポリペプチドをコードする核酸を指し、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、「遺伝子」はまた、コード配列の前（すなわち、５’）及び後（すなわち、３’）の調節配列として機能することができる非コード核酸断片を指す。

【0025】

本明細書で使用する場合、「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）」という用語は、パルボウイルス科及びデペンドパルボウイルス属の一本鎖ＤＮＡを含む、小さなサイズの複製欠損非エンベロープウイルスを指す。これまでに１０種を超えるアデノ随伴ウイルス血清型が同定されており、血清型ＡＡＶ２が最もよく特性評価されている。ＡＡＶ血清型の他の非限定的な例は、ＡＮＣ８０、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、及びＡＡＶ１１である。これらの血清型に加えて、ＡＡＶ偽型が開発されている。ＡＡＶ偽型は、第１の血清型のカプシド及び第２の血清型のゲノムを含む（例えば、擬型ＡＡＶ２／５は、血清型ＡＡＶ２のゲノム及びＡＡＶ５のカプシドを有するＡＡＶに対応する）。

【0026】

本明細書で使用される場合、「アデノウイルス」という用語は、アデノウイルス科の二本鎖ＤＮＡを含む二十面体ヌクレオカプシドを有する非エンベロープウイルスを指す。５０種を超えるアデノウイルスサブタイプが、ヒトから単離されており、多くの追加のサブタイプが、他の哺乳動物及び鳥類から単離されている。これらのサブタイプは、アデノウイルス科に属し、該アデノウイルス科は、現在、２つの属、すなわち、マストアデノウイルス及びアビアデノウイルスに分けられる。全てのアデノウイルスは、形態学的及び構造的に類似している。しかしながら、ヒトでは、アデノウイルスは、異なる免疫学的特性を示し、したがって、血清型に分類される。アデノウイルスの２つのヒト血清型、すなわちＡｄ２及びＡｄ５は、精力的に研究され、アデノウイルスに関する一般的な情報の大部分を提供している。

【0027】

本明細書で使用される場合、「Ｅ１相補性プロデューサー細胞」という用語は、アデノウイルスＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子がそのゲノムに組み込まれるか又は挿入される、細胞株、典型的にはヒト細胞株を指す。Ｅ１相補性プロデューサー細胞は、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを天然に発現することができ、したがって、外因性Ｅ１Ａ及び／又はＥ１Ｂ遺伝子を必要とすることなく、ＡＡＶ産生に好適である。Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子は、例えば、追加のアデノウイルス配列を含有する、より長い配列の一部としてＥ１相補性プロデューサー細胞に好適に組み込まれてもよく、又はＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子は、任意の追加のアデノウイルス配列なしで、Ｅ１相補性プロデューサー細胞に好適に組み込まれてもよく、すなわち、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを発現するための最小限の必要なコード配列のみが組み込まれる。哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞へのアデノウイルス遺伝子の組み込みは、当該技術分野で既知である。Ｅ１相補性プロデューサー細胞は、任意の好適な細胞株に由来し得る。例示的なＥ１相補性プロデューサー細胞には、ＨＥＫ２９３細胞、９１１細胞、ｐＴＧ６５５９細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＧＨ３２９細胞、Ｎ５２．Ｅ６細胞（「ＣＡＰ（登録商標）」細胞としても知られている）、ＨｅＬａ－Ｅ１細胞、ＵＲ細胞、ＶＬＩ－２９３細胞、Ａｃ５１細胞、Ａｃ１３９細胞、並びにそれらのバリアント及び誘導体が含まれるが、これらに限定されない。Ｅ１相補性プロデューサー細胞は更に、例えば、Ｋｏｖｅｓｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２（８）：１６８１－１７０３（２０１０）及びＦａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １４（２）：３０５－３１１（２００６）に記載される。いくつかの実施形態では、本開示のＥ１相補性プロデューサー細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はＣＡＰ（登録商標）細胞である。

【0028】

本明細書で使用される場合、「ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞」という用語は、元々ヒト胎児腎細胞に由来し、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子を含む、約４．５ｋｂのＡｄ５ゲノムを含有する細胞株を指す。ＨＥＫ２９３細胞は、本明細書に記載される例示的なＥ１相補性プロデューサー細胞である。ＨＥＫ２９３細胞のバリアントが開発されており、例えば、ＨＥＫ２９３Ｓ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨＥＫ２９３ＦＴＭ、ＨＥＫ２９３ＳＧ、ＨＥＫ２９３ＳＧＧＤ、ＨＥＫ２９３Ｈ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３ＭＳＲ、及びＨＥＫ２９３Ａを含み、その各々は異なる特徴を有し、その全てはＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子を含む。本明細書で使用される「ＨＥＫ２９３細胞」という用語は、本明細書に記載されるバリアントを含むがこれらに限定されない、全てのＨＥＫ２９３細胞バリアント及び誘導体を包含する。例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、ＳＶ４０ Ｔ抗原の温度感受性対立遺伝子を発現し、これはＳＶ４０起源を含むベクターの増幅を可能にする。例えば、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｓｃａｔｔｅｒｅｄ Ｔｗｅｌｖｅ Ｔｒｉｂｅｓ ｏｆ ＨＥＫ２９３，”Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｊ ２０１８；１１（２）を参照されたい。

【0029】

本明細書で使用される場合、「ＰＥＲ．Ｃ６細胞」という用語は、Ａｄ５のＥ１領域で形質転換されたヒト胎児網膜細胞に由来する細胞株を指す。ＰＥＲ．Ｃ６細胞は、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを天然に発現し、本明細書に記載される例示的なＥ１相補性プロデューサー細胞である。本明細書で使用される「ＰＥＲ．Ｃ６細胞」という用語は、全てのＰＥＲ．Ｃ６細胞バリアント及び誘導体を包含する。ＰＥＲ．Ｃ６細胞は更に、例えば、Ｆａｌｌａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９（１３）：１９０９－１９１７（１９９８）に記載される。

【0030】

本明細書で使用される場合、「ＣＡＰ（登録商標）細胞」（本明細書では「ＣＥＶＥＣの羊膜細胞産生細胞」又は「Ｎ５２．Ｅ６細胞」とも称される）という用語は、Ａｄ５のＥ１領域（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿ＩＱ８８下でアクセス可能）で形質転換された初代ヒト羊膜細胞に由来する細胞株を指す。ＣＡＰ（登録商標）細胞は、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを天然に発現し、本明細書に記載される例示的なＥ１相補性プロデューサー細胞である。ＣＡＰ（登録商標）細胞バリアントは、これに限定されないが、ＣＡＰ－Ｔ（アクセッション番号：ＣＶＣＬ＿ＷＩ６１）を含み、これはＳＶ４０の大Ｔ抗原を発現する。例えば、Ｗｏｌｆｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ５（Ｓｕｐｐｌ ８）：Ｐ１３３（２０１１）を参照されたい。本明細書で使用される「ＣＡＰ（登録商標）細胞」という用語は、全てのＣＡＰ（登録商標）細胞バリアント及び誘導体を包含する。

【0031】

本明細書で使用される場合、「Ｅ１Ａ」という用語は、ウイルス寿命の初期段階におけるアデノウイルス複製中に発現される、アデノウイルス初期領域１Ａ（Ｅ１Ａ）遺伝子を指す。Ｅ１Ａ遺伝子は、これらに限定されないが、２８９Ｒ、２４３Ｒ、２１７Ｒ、１７１Ｒ、及び５５Ｒを含む、複数のタンパク質アイソフォームを産生し、２８９Ｒ、２４３Ｒ、及び１７１Ｒは、Ａｄ５ Ｅ１Ａ遺伝子の主要なアイソフォームである。本明細書で使用される場合、「Ｅ１Ｂ」という用語は、それぞれ、「Ｅ１Ｂ－１９ｋ」及び「Ｅ１Ｂ－５５ｋ」と称される、２つのタンパク質：５５ｋＤａタンパク質及び１９ｋＤａタンパク質を発現する、アデノウイルス初期領域１Ｂ（Ｅ１Ｂ）遺伝子を指す。本明細書に記載されるように、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ－１９ｋ、及びＥ１Ｂ－５５ｋは、Ｅ１相補性プロデューサー細胞によって発現されるアデノウイルスヘルパー遺伝子である。Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ－１９ｋ、及びＥ１Ｂ－５５ｋは、ＡＡＶ産生のために十分な量でＥ１相補性プロデューサー細胞によって産生されるので、従来的には、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子は、ＡＡＶを産生するとき、Ｅ１相補性プロデューサー細胞に外因的に導入されない。

【0032】

本明細書で使用される場合、「Ｅ２Ａ」という用語は、ウイルス複製を調節する７２ｋＤａのＤＮＡ結合タンパク質をコードする、アデノウイルスＥ２Ａヘルパー遺伝子を指す。本明細書で使用される場合、「Ｅ４」という用語は、Ｅ４ ＯＲＦ３及びＥ４ ＯＲＦ６を含む、ウイルス複製及びタンパク質発現を調節するタンパク質をコードする、アデノウイルスＥ４ヘルパー遺伝子を指す。実施形態では、Ｅ４は、Ｅ４ｏｒｆ３及びＥ４ｏｒｆ６の一方又は両方を含む。本明細書で使用される場合、「ウイルス関連、非コードＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）」という用語は、翻訳を調節する役割を果たし、ＶＡＩ（又はＶＡ_Ｉ若しくはＶＡ ＲＮＡＩ）及びＶＡＩＩ（又はＶＡ_ＩＩ若しくはＶＡ ＲＮＡＩＩ）を含むアデノウイルス非コードＲＮＡを指す。実施形態では、ＶＡ ＲＮＡは、ＶＡＩ及びＶＡＩＩの一方又は両方を含む。ＡＡＶ産生の文脈では、アデノウイルス遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡは、ＡＡＶ複製を媒介する。本明細書に記載されるように、Ｅ１相補性プロデューサー細胞中でＡＡＶを産生するための現在の方法は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含むｐＨｅｌｐｅｒプラスミドでトランスフェクトすることを含む。

【0033】

本明細書で使用される場合、「Ｒｅｐ」という用語は、ウイルスゲノムを複製するために集合的に必要とされる、ウイルスの複製タンパク質をコードするＡＡＶコード領域又はその機能的ホモログを指す。ＡＡＶ Ｒｅｐの機能的ホモログは、例えば、ＡＡＶ ＤＮＡ複製を媒介することも知られている、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）からのＲｅｐコード領域を含む。Ｒｅｐコード領域は、少なくともＡＡＶ Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードする遺伝子、又はそれらの機能的ホモログをコードする。Ｒｅｐコード領域は、例えば、本明細書に記載されるように、任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。Ｒｅｐコード領域は、全ての野生型遺伝子を含む必要はないが、存在するＲｅｐ遺伝子がＥ１相補性プロデューサー細胞において発現されるとき十分な複製機能を提供する限り、（例えば、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は変異によって）改変されていてもよい。

【0034】

本明細書で使用される場合、「Ｃａｐ」という用語は、ウイルスのキャプシドタンパク質をコードするＡＡＶコード領域又はその機能的ホモログを指す。キャプシドタンパク質の非限定的な例は、ＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３である。本明細書に記載されるＣａｐ遺伝子は、任意のＡＡＶ血清型又はＡＡＶ血清型の組み合わせに由来し得る。

【0035】

いくつかの実施形態では、Ｅ１相補性プロデューサー細胞は、（ｉ）Ｅ１Ａ、（ｉｉ）Ｅ２Ａ及びＥ４の一方又は両方、（ｉｉｉ）ＶＡ ＲＮＡ、並びに（ｉｖ）Ｒｅｐ及びＣａｐの一方又は両方の１つ以上を含む１つ以上のベクターでトランスフェクトされる。特定の実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）は、単一のベクター上にある。更なる実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）は、２つ以上のベクター上にある。好適には、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）は、第１のベクター上にあり得、（ｉｖ）は、第２のベクター上にあり得る。実施形態では、（ｉｉ）は、Ｅ２Ａ及びＥ４の両方を含む。更なる実施形態では、（ｉｖ）は、Ｒｅｐ及びＣａｐの両方を含む。例えば、第１のベクターは、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡを含むことができ、第２のベクターは、Ｒｅｐ及びＣａｐを含むことができる。好適には、（ｉ）は、第１のベクター上にあり得、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、第２のベクター上にあり得、（ｉｖ）は、第３のベクター上にある。例えば、第１のベクターは、Ｅ１Ａを含むことができ、第２のベクターは、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡを含むことができ、第３のベクターは、Ｒｅｐ及びＣａｐを含むことができる。好適には、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）のいずれか１つは、別個のベクター上にあり得、例えば、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々は、別個のベクター上にあり得る。例えば、第１のベクターは、Ｅ１Ａを含むことができ、第２のベクターは、Ｅ２Ａ及びＥ４を含むことができ、第３のベクターは、ＶＡ ＲＮＡを含むことができ、第４のベクターは、Ｒｅｐ及びＣａｐを含むことができる。好適には、Ｅ１相補性プロデューサー細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はＣＡＰ（登録商標）細胞である。

【0036】

いくつかの実施形態では、Ｅ１Ａは、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及びＣａｐのいずれか１つよりも高い量でＥ１相補性プロデューサー細胞にトランスフェクトされる。本明細書で考察されるように、ＡＡＶ力価は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞において発現されるＥ１Ａの量に用量依存的であることが予想外に発見された。よって、実施形態では、Ｅ１Ａは、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及びＣａｐのいずれかよりも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、又は１０倍超高い量でＥ１相補性プロデューサー細胞に導入される。特定の遺伝子の発現を増加させる方法は、例えば、細胞に導入される遺伝子の量を増加させることと、細胞における遺伝子の転写レベルを増加させることと、を含み得る。好適には、Ｅ１相補性プロデューサー細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はＣＡＰ（登録商標）細胞である。

【0037】

好適には、Ｅ１Ａを含むベクターは、Ｅ１相補性プロデューサー細胞に、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及び／若しくはＣａｐを含むベクターの各々に対して約１：１～約１０：１、又はＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及び／若しくはＣａｐを含むベクターの各々に対して、約１：１～約９：１、若しくは約１：１～約８：１、若しくは約１：１～約７：１、若しくは約１：１～約６：１、若しくは約１：１～約５：１、若しくは約１：１～約４：１、若しくは約１：１～約３：１、若しくは約１：１～約２：１、若しくは約１：１～約１．５：１の比でトランスフェクトされ得る。いくつかの実施形態では、Ｅ１相補性プロデューサー細胞にトランスフェクトされたＥ１Ａを含むベクターとＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及び／又はＣａｐを含むベクターの各々との比は、１：１である。更なる実施形態では、Ｅ１相補性プロデューサー細胞にトランスフェクトされたＥ１Ａを含むベクターとＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及び／又はＣａｐを含むベクターの各々との比は、２：１である。なお更なる実施形態では、Ｅ１相補性プロデューサー細胞にトランスフェクトされたＥ１Ａを含むベクターとＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及び／又はＣａｐを含むベクターの各々との比は、３：１である。好適には、Ｅ１相補性プロデューサー細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はＣＡＰ（登録商標）細胞である。

【0038】

いくつかの実施形態では、Ｅ１相補性プロデューサー細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はＣＡＰ（登録商標）細胞）中のＥ１Ａの発現レベルは、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及び／又はＣａｐの各々と比較してより高い。好適には、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及び／又はＣａｐの各々は、１つ以上のプロモーターに作動可能に結合することができる。いくつかの実施形態では、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及び／又はＣａｐの各々は、別個のプロモーターに作動可能に結合される。本明細書で使用される場合、「作動可能に結合した」、「作動可能な組み合わせで」、及び「作動可能な順序で」という用語は、目的のポリヌクレオチド（例えば、Ｅ１Ａ）が、目的のポリヌクレオチドの発現を可能にする様式で調節要素（例えば、プロモーター）に結合していることを意味する。本明細書で使用される場合、「プロモーター」、「プロモーター配列」、及び「プロモーター領域」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流コード又は非コード遺伝子配列の転写を開始することができるポリヌクレオチドを指す。プロモーターとしては、その関連遺伝子の連続的な転写を可能にする、構成的プロモーター、及びインデューサー分子の付加時にオフ状態からオン状態に切り替えることができる、誘導性プロモーターが挙げられる。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はシグマ因子についてのそれらの親和性に基づいて「強」又は「弱」に分類することができる。強いプロモーターは、弱いプロモーターと比較して高い転写開始速度を有する。プロモーターの非限定的な例としては、脾限局巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、ヒトポリペプチド鎖伸長因子（ＥＦ１α）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ニワトリベータ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、テトラサイクリン制御トランスアクチベーターシステム（「Ｔｅｔ－Ｏｎ」システム又はｔＴＡ依存的システムとしても知られている）、又は逆テトラサイクリン制御トランスアクチベーターシステム（「Ｔｅｔ－Ｏｆｆ」システム又はｒｔＴＡ依存的システムとしても知られている）、ラウス肉腫ウイルス長期反復（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、アクチンプロモーター、サイトケラチン１４プロモーター、又はサイトケラチン１８プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｅ１Ａに作動可能に結合したプロモーターは、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及びＣａｐのいずれかに作動可能に結合したプロモーターと比較して、より強いプロモーターである。

【0039】

好適には、Ｅ１Ａに作動可能に結合したプロモーターは、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及びＣａｐのいずれかに作動可能に結合したプロモーターと比較して、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、又は１０倍超高い発現を提供することができる。更なる実施形態では、Ｅ１Ａに作動可能に結合したプロモーターは、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及びＣａｐのいずれかに作動可能に結合したプロモーターと比較して、実質的に同じ発現レベルを提供する。本明細書で使用される場合、「実質的に同様の」又は「実質的に同じ」発現レベルは、発現レベルが、参照発現レベルの２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、又は１％以内であることを意味する。

【0040】

いくつかの実施形態では、Ｅ１Ａは、プロモーターに作動可能に結合し、エンハンサーに更に作動可能に結合し、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及び／又はＣａｐの各々は、好適にはエンハンサーに結合していない。本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、例えば、転写因子を動員することによって、それらの不在下での場合よりも高いレベルに転写を活性化する調節要素を指す。エンハンサーは、長距離にわたって（例えば、転写開始部位から最大１Ｍｂｐ離れて）配向とは無関係にプロモーター転写を活性化することができる。エンハンサーの非限定的な例としては、ＣＭＶエンハンサー、α－フェトプロテインＭＥＲＩＩエンハンサー、ＭＣＫエンハンサー、又はＳＶ４０ポリＡエンハンサーが挙げられる。好適には、プロモーター及びエンハンサーに作動可能に結合している、Ｅ１Ａは、エンハンサーに結合していない、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及び／又はＣａｐと比較して、より高い発現レベルを提供することができる。

【0041】

好適には、１つ以上のベクターは、宿主細胞によって産生されるプラスミドの数を増加させるために複製起点を含むことができ、これは、１つ以上のベクター上の遺伝子によってコードされるタンパク質の増加したレベルをもたらす。例示的な複製起点には、ＳＶ４０複製起点、エプスタイン－バー（ＥＢＶ）複製起点、及び当業者に既知の他のものが含まれるが、これらに限定されない。

【0042】

いくつかの実施形態では、１つ以上のベクター上に存在する、本明細書で「コピー数」と称される、Ｅ１Ａのコピーの数は、１つ以上のベクター上のＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及び／又はＣａｐの各々のコピーの数よりも高い。一例では、単一のベクターは、Ｅ１Ａの２つ以上のコピー、並びにＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及びＣａｐの各々の単一のコピーを含むことができる。別の例では、１つ以上のベクター上に存在するＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及びＣａｐの各コピーについて、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０コピーのＥ１Ａが１つ以上のベクター上に存在する。好適には、１つ以上のベクター上のＥ１ＡとＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及び／又はＣａｐの各々とのコピー数比は、約１：１～約１０：１、又は約１：１～約９：１、又は約１：１～約８：１、又は約１：１～約７：１、又は約１：１～約６：１、又は約１：１～約５：１、又は約１：１～約４：１、又は約１：１～約３：１、又は約１：１～約２：１、又は約１：１～約１．５：１であり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のベクター上のＥ１ＡとＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及び／又はＣａｐの各々とのコピー数比は、約１：１である。更なる実施形態では、１つ以上のベクター上のＥ１ＡとＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及び／又はＣａｐの各々とのコピー数比は、約２：１である。なお更なる実施形態では、１つ以上のベクター上のＥ１ＡとＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及び／又はＣａｐの各々とのコピー数比は、約３：１である。

【0043】

いくつかの実施形態では、方法は、追加のヘルパー遺伝子をＥ１相補性プロデューサー細胞にトランスフェクトすることを含む。よって、実施形態では、１つ以上のベクターは、（ｉ）Ｅ１Ａ、（ｉｉ）Ｅ２Ａ及びＥ４の一方又は両方、（ｉｉｉ）ＶＡ ＲＮＡ、（ｉｖ）Ｒｅｐ及びＣａｐの一方又は両方、並びに（ｖ）Ｅ１Ｂ、ＮＰ１、ＮＳ２、又はそれらの組み合わせから選択されるヘルパー遺伝子を更に含む。好適には、Ｅ１相補性プロデューサー細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はＣＡＰ（登録商標）細胞である。

【0044】

本明細書で考察されるように、Ｅ１Ｂは、アデノウイルスヘルパー遺伝子であり、ＡＡＶ産生のためにＥ１Ｂ－１９ｋ及びＥ１Ｂ－５５ｋヘルパータンパク質をコードする。本明細書で使用される場合、「ＮＰ１」及び「ＮＳ２」という用語は、それぞれ、ＮＰ１及びＮＳ２非構造タンパク質をコードする、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ１）遺伝子を指す。ＮＰ１及びＮＳ２は、ＡＡＶ複製のためのヘルパー遺伝子として発見されており、Ｅ１相補性プロデューサー細胞、すなわち、本明細書に記載されるＥ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡのための従来のアデノウイルスヘルパー遺伝子と共発現されるとき、ＡＡＶ力価を増強することが示された。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １１：４０－５１（２０１８）を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｅ１Ｂ、ＮＰ１、及びＮＳ２のうちの１つ以上を、本明細書に記載される（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）と組み合わせてトランスフェクトすることは、Ｅ１相補性プロデューサー細胞におけるＡＡＶ力価を更に増加させる。特定の実施形態では、（ｖ）は、ＥＢ１を含む。更なる実施形態では、（ｖ）は、ＮＰ１及びＮＳ２を含む。なお更なる実施形態では、（ｖ）は、Ｅ１Ｂ、ＮＰ１、及びＮＳ２を含む。好適には、Ｅ１相補性プロデューサー細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はＣＡＰ（登録商標）細胞である。

【0045】

いくつかの実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）は、単一のベクター上にある。更なる実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）は、２つ以上のベクター上にある。例えば、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）は、第１のベクター上にあり得、（ｉｖ）は、第２のベクター上にあり得、（ｖ）は、第３のベクター上にあり得る。別の例では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｖ）は、第１のベクター上にあり得、（ｉｖ）は、第２のベクター上にあり得る。更なる例では、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）は、第１のベクター上にあり得、（ｉｖ）及び（ｖ）は、１つ以上の追加のベクター上にあり得る。なお更なる例では、（ｉ）及び（ｖ）は、第１のベクター上にあり得、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）は、１つ以上の追加のベクター上にあり得る。好適には、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）のいずれか１つは、別個のベクター上にあり得、例えば、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）の各々は、別個のベクター上にあり得る。実施形態では、第１のベクターは、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡを含み、第２のベクターは、Ｒｅｐ及びＣａｐを含む。追加の実施形態では、第１のベクターは、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡを含み、第２のベクターは、Ｒｅｐ及びＣａｐを含み、第３のベクターは、Ｅ１Ｂ、ＮＰ１、ＮＳ２、又はそれらの組み合わせを含む。

【0046】

Ｅ１相補性プロデューサー細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はＣＡＰ（登録商標）細胞）は、（ｉ）Ｅ１Ａ、（ｉｉ）Ｅ２Ａ及びＥ４の一方若しくは両方、（ｉｉｉ）ＶＡ ＲＮＡ、（ｉｖ）Ｒｅｐ及びＣａｐの一方若しくは両方、（ｖ）Ｅ１Ｂ、ＮＰ１、ＮＳ２、若しくはそれらの組み合わせから選択されるヘルパー遺伝子、並びに／又はＧＯＩのトランスフェクション後、本明細書に記載される任意の好適なデバイス、施設、及び方法を使用して培養することができる。好適には、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）の発現を培養中に誘導することができる。特定の実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び／又は（ｖ）のいずれかのプロモーターは、構成的プロモーターである。更なる実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び／又は（ｖ）のいずれかのプロモーターは、誘導性プロモーターであり、本明細書に記載されるように転写を活性化するためにインデューサー分子を必要とする。一態様では、誘導性プロモーターの制御下での遺伝子の発現レベルは、インデューサー分子の量を調節することによって調節することができる。別の態様では、同じ誘導性プロモーターは、２つ以上のインデューサー分子を使用して調節して、異なる発現レベルをもたらすことができる。更なる態様では、（ｉ）に作動可能に結合したプロモーターは、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び／又は（ｖ）に作動可能に結合したプロモーターよりも強いプロモーターである。例えば、（ｉ）は、ＣＭＶ又はＳＶ４０プロモーターなどの比較的強いプロモーターの制御下にあり得、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び／又は（ｖ）は、ＵＢＣ又はＰＧＫプロモーターなどの比較的弱いプロモーターの制御下にあり得る。更なる態様では、（ｉ）に作動可能に結合したプロモーターは、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び／又は（ｖ）に作動可能に結合したプロモーターとは異なるインデューサー分子によって誘導される。例えば、（ｉ）は、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）又はドキシサイクリン（Ｄｏｘ）などのアナログによって誘導性であるＴｅｔ－Ｏｎシステムの制御下にあり得、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び／又は（ｖ）は、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＵＢＣ、又はＰＧＫなどの構成的プロモーターの制御下にあり得、Ｅ１Ａ発現のレベルは、細胞培養物に添加されるインデューサー分子（例えば、Ｔｅｔ又はＤｏｘ）の量によって調節することができる。よって、細胞培養物に添加されるインデューサー分子の量は、細胞培養物中で発現される（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び／又は（ｖ）の相対量を決定することができる。

【0047】

１つ以上のベクターが（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）を含む実施形態では、培養することは、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の発現を調節することを含み、ひいてはＥ１Ａは、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々に対して１：１～約１０：１、又は（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々に対して約１：１～約９：１、若しくは約１：１～約８：１、若しくは約１：１～約７：１、若しくは約１：１～約６：１、若しくは約１：１～約５：１、若しくは約１：１～約４：１、若しくは約１：１～約３：１、若しくは約１：１～約２：１、若しくは約１：１～約１．５：１の比で発現される。好適には、Ｅ１Ａの発現と（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々の発現との比は、約１：１である。更なる実施形態では、Ｅ１Ａの発現と（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々の発現との比は、約２：１である。なお更なる実施形態では、Ｅ１Ａの発現と（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々の発現との比は、約３：１である。

【0048】

１つ以上のベクターが（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）を含む実施形態では、培養することは、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）の発現を調節することを含み、ひいてはＥ１Ａは、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）の各々に対して１：１～約１０：１、又は約１：１～約９：１、又は約１：１～約８：１、又は約１：１～約７：１、又は約１：１～約６：１、又は約１：１～約５：１、又は約１：１～約４：１、又は約１：１～約３：１、又は約１：１～約２：１、又は約１：１～約１．５：１の比で発現される。好適には、Ｅ１Ａの発現と（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）の各々の発現との比は、約１：１、又は約２：１、又は約３：１である。

【0049】

いくつかの実施形態では、１つ以上のベクターは、目的の遺伝子（ＧＯＩ）を更に含む。好適には、ＧＯＩは、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）の各々から別個のベクター上にある。よって、実施形態では、方法は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、ＧＯＩを含むベクターでトランスフェクトすることを更に含み、ＧＯＩは、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）の各々から別個のベクター上にある。好適には、（ｉ）を含むベクターは、Ｅ１相補性プロデューサー細胞に、ＧＯＩを含むベクターに対して約１：１～約１０：１、又はＧＯＩを含むベクターに対して約１：１～約９：１、若しくは約１：１～約８：１、若しくは約１：１～約７：１、若しくは約１：１～約６：１、若しくは約１：１～約５：１、若しくは約１：１～約４：１、若しくは約１：１～約３：１、若しくは約１：１～約２：１、若しくは約１：１～約１．５：１の比でトランスフェクトされる。好適には、Ｅ１相補性プロデューサー細胞にトランスフェクトされた（ｉ）を含むベクターとＧＯＩを含むベクターとの比は、約１：１、約２：１、又は約３：１である。好適には、Ｅ１相補性プロデューサー細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はＣＡＰ（登録商標）細胞である。

【0050】

ＧＯＩを含むベクターは、ＧＯＩに隣接する２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含むことができる。当該技術分野で既知のように、これらのＩＴＲ配列は、一本鎖ヌクレオチドの配列であり、下流にその逆補体が続く。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶゲノムの複製、レスキュー、パッケージング、及び組み込みに必要とされる最小配列を表す。

【0051】

一般に、本明細書で使用される場合、「ＧＯＩ」という用語は、異種遺伝子、すなわち、通常は一緒に結合していない、及び／又は通常は特定の宿主細胞に関連していない遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、異種遺伝子は、コード配列自体が天然では見出されない構築物（例えば、天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）である。好適には、ＧＯＩは、レポーター遺伝子、選択遺伝子、又は治療目的の遺伝子であり得る。

【0052】

本明細書で言及する場合、「レポーター遺伝子」は、発現後、容易に同定及び測定することができる細胞に表現型を付与する、遺伝子である。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質をコードする。更なる実施形態では、レポーター遺伝子は、選択遺伝子を含む。

【0053】

本明細書で言及されるように、「選択遺伝子」は、酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であり、これは、宿主細胞に、そうでなければ必須栄養素を欠く培地中で増殖する能力を付与する。代替的又は追加的に、選択遺伝子は、選択遺伝子が発現される宿主細胞に抗生物質又は薬物への耐性を付与し得る。選択遺伝子を使用して、宿主細胞に特定の表現型を付与してもよい。宿主細胞が選択培地中で増殖するために選択遺伝子を発現する場合、遺伝子は、陽性選択遺伝子であると言われる。選択遺伝子はまた、特定の遺伝子を含む宿主細胞に対して選択するために使用することができ、この様式で使用される選択遺伝子は、陰性選択遺伝子と称される。

【0054】

本明細書で使用される場合、「治療目的の遺伝子」という用語は、任意の機能的に関連するヌクレオチド配列を指す。したがって、本開示の治療対象遺伝子は、標的細胞ゲノムから欠損若しくは喪失しているタンパク質をコードするか、又は所望の生物学的若しくは治療効果（例えば、抗ウイルス機能）を有する非天然タンパク質をコードする、任意の所望の遺伝子を含むことができるか、あるいは、配列は、アンチセンス機能又はリボザイム機能を有する分子に対応することができる。好適な治療対象遺伝子の代表的（非限定的）な例には、ＡＩＤＳ、がん、神経疾患、心血管疾患、高コレステロール血症などの障害を含む、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性疾患、及び感染性疾患；様々な貧血、サラセミア、及び血友病を含む、様々な血液障害；嚢胞性線維症、ゴーシェ病、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、肺気腫などの遺伝的欠陥の治療に使用されるものが含まれる。がん及びウイルス疾患のアンチセンス治療に有用ないくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡの翻訳開始部位（ＡＵＧコドン）周囲の配列に相補性な短いオリゴヌクレオチド）が、当該技術分野で説明されており、好適な治療対象遺伝子の例でもある。

【0055】

追加の実施形態では、本開示は、（ａ）Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、（ｉ）第１のプロモーターに作動可能に結合したＥ１Ａを含む第１のベクター、（ｉｉ）全て第２のプロモーターに作動可能に結合した、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びウイルス関連、非コードＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）を含む第２のベクター、並びに（ｉｉｉ）共に第３のプロモーターに作動可能に結合した、Ｒｅｐ及びＣａｐを含む第３のベクターでトランスフェクトすることであって、（ｉ）と（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の各々とのトランスフェクション比が、約１：１～約３：１である、トランスフェクトすることと、（ｂ）トランスフェクトされたＥ１相補性プロデューサー細胞を、ＡＡＶを産生するのに好適な条件下で培養することと、（ｃ）培養されたＥ１相補性プロデューサー細胞からＡＡＶを精製し、それによってＡＡＶを得ることと、を含む、Ｅ１相補性プロデューサー細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法を提供する。好適には、第１、第２、又は第３のベクターの１つ以上は、Ｅ１Ｂ、ＮＰ１、ＮＳ２、又はそれらの組み合わせから選択されるヘルパー遺伝子を更に含む。好適には、Ｅ１Ｂは、Ｅ１Ｂ－１９ｋ又はＥ１Ｂ－５５ｋである。好適には、ヘルパー遺伝子は、ＮＰ１とＮＳ２との組み合わせを含む。実施形態では、方法は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、ＧＯＩを含むベクターでトランスフェクトすることを更に含む。好適には、Ｅ１相補性プロデューサー細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はＣＡＰ（登録商標）細胞である。

【0056】

更なる実施形態では、本開示は、（ａ）Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、（ｉ）第１のプロモーター及びエンハンサーに作動可能に結合したＥ１Ａを含む第１のベクター、（ｉｉ）全て第２のプロモーターに作動可能に結合した、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びウイルス関連、非コードＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）を含む第２のベクター、並びに（ｉｉｉ）各々第３のプロモーターに作動可能に結合した、Ｒｅｐ及びＣａｐを含む第３のベクターでトランスフェクトすることと、（ｂ）トランスフェクトされたＥ１相補性プロデューサー細胞を、ＡＡＶを産生するのに好適な条件下で培養することであって、Ｅ１Ａが、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及びＣａｐの各々に対して約１：１～約３：１の比で発現される、培養することと、（ｃ）培養されたＥ１相補性プロデューサー細胞からＡＡＶを精製し、それによってＡＡＶを得ることと、を含む、Ｅ１相補性プロデューサー細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法を提供する。好適には、第１、第２、又は第３のベクターの１つ以上は、Ｅ１Ｂ、ＮＰ１、ＮＳ２、又はそれらの組み合わせから選択されるヘルパー遺伝子を更に含む。好適には、Ｅ１Ｂは、Ｅ１Ｂ－１９ｋ又はＥ１Ｂ－５５ｋである。好適には、ヘルパー遺伝子は、ＮＰ１とＮＳ２との組み合わせを含む。実施形態では、方法は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、ＧＯＩを含むベクターでトランスフェクトすることを更に含む。好適には、Ｅ１相補性プロデューサー細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はＣＡＰ（登録商標）細胞である。

【0057】

また更なる実施形態では、本開示は、（ａ）Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、（ｉ）全て第１のプロモーターに作動可能に結合した、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡを含む第１のベクター、並びに（ｉｉ）第２のプロモーターに作動可能に結合した、Ｒｅｐ及びＣａｐを含む第２のベクターでトランスフェクトすることであって、Ｅ１ＡとＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及びＣａｐの各々とのコピー数比が、約１：１～約３：１である、トランスフェクトすることと、（ｂ）トランスフェクトされたＥ１相補性プロデューサー細胞を、ＡＡＶを産生するのに好適な条件下で培養することと、（ｃ）培養されたＥ１相補性プロデューサー細胞からＡＡＶを精製し、それによってＡＡＶを得ることと、を含む、Ｅ１相補性プロデューサー細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法を提供する。好適には、第１又は第２のベクターの一方又は両方は、Ｅ１Ｂ、ＮＰ１、ＮＳ２、又はそれらの組み合わせから選択されるヘルパー遺伝子を更に含む。好適には、Ｅ１Ｂは、Ｅ１Ｂ－１９ｋ又はＥ１Ｂ－５５ｋである。好適には、ヘルパー遺伝子は、ＮＰ１とＮＳ２との組み合わせを含む。実施形態では、方法は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、ＧＯＩを含むベクターでトランスフェクトすることを更に含む。好適には、Ｅ１相補性プロデューサー細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はＣＡＰ（登録商標）細胞である。

【0058】

実施形態では、本明細書において、Ｅ１相補性プロデューサー細胞（ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はＣＡＰ（登録商標）細胞）を、（ｉ）Ｅ１Ａアデノウイルスヘルパー遺伝子と、（ｉｉ）Ｅ２Ａ、Ｅ４、又は両方から選択されるアデノウイルスヘルパー遺伝子と、（ｉｉｉ）ウイルス関連、非コードＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）と、（ｉｖ）Ｒｅｐ、Ｃａｐ、又は両方から選択されるＡＡＶ遺伝子と、を含む、１つ以上のベクターでトランスフェクトすることと、ＡＡＶを産生することと、ＡＡＶを採取することと、ＡＡＶを対象に投与することと、を含む、ＡＡＶでの治療を必要とする対象における治療の方法が提供される。ＡＡＶを産生する方法は、本明細書に更に記載される。好適には、方法は、ＧＯＩ、例えば、治療目的の遺伝子を有する対象を治療するために使用される。ヒト対象への投与は、例えば、吸入、注射、又は静脈内投与、並びに当該技術分野で既知の他の投与方法を含むことができる。

【0059】

本明細書で考察されるように、本開示の方法は、有利には、Ｅ１相補性プロデューサー細胞をＥ１Ａでトランスフェクトすることを含まない方法と比較して、Ｅ１相補性プロデューサー細胞によって産生されるＡＡＶのより高い力価を提供する。実施形態では、本開示の方法は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞をＥ１Ａでトランスフェクトすることを含まない方法と比較して、ＡＡＶの少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、又は少なくとも１０倍以上の力価を提供する。好適には、Ｅ１相補性プロデューサー細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はＣＡＰ（登録商標）細胞である。

【0060】

ＡＡＶの産生方法は、連続製造システムにおいて使用することができる。Ｅ１相補性プロデューサー細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はＣＡＰ（登録商標）細胞の培養条件は、本分野で既知である。一般には、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、及びＣＡＰ（登録商標）細胞は、懸濁培養物であり、これは、例えば、気体及び栄養素交換のための大きな表面積を可能にする培養フラスコ又は大きな懸濁槽において増殖される。懸濁細胞培養物は、適切な混合を提供するために、撹拌又は撹拌メカニズムをしばしば利用する。細胞を懸濁液中で維持するための培地及び条件は、当業者に既知である。例示的な実施形態では、懸濁細胞培養物の使用により、高い生産性及び長期培養条件でＡＡＶの大量産生が可能となり、出発細胞の各バッチについてＡＡＶの複数の回収が可能となる。

【0061】

産生方法は、撹拌タンク、気泡ポンプ、ファイバー、マイクロファイバー、ホローファイバー、セラミックマトリックス、流動床、固定床、及び／又は噴流床（ｓｐｏｕｔｅｄ ｂｅｄ）バイオリアクターを含むが、これらに限定されない、任意の好適なリアクターを利用することができる。本明細書で使用する場合、「リアクター」は、発酵器若しくは発酵ユニット、又は任意の他の反応容器を含むことができ、「リアクター」という用語は、「発酵器」と同義に使用される。例えば、いくつかの態様では、例示的なバイオリアクターユニットは、以下：栄養素及び／若しくは炭素源の供給、好適な気体（例えば、酸素）の注入、発酵若しくは細胞培養培地の流入及び流出、気相及び液相の分離、温度の維持、酸素及びＣＯ_２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、かき混ぜ（例えば、撹拌）、並びに／又は洗浄／滅菌のうちの１つ以上、又は全てを行い得る。発酵ユニットなどの例示的なリアクターユニットは、ユニット内に複数のリアクターを含んでもよく、例えば、ユニットは、各ユニットかつ／又は施設内に１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００個、又はそれを超えるバイオリアクターを有することができ、かつ／又は施設内に単一又は複数のリアクターを有する複数のユニットを含んでもよい。様々な実施形態では、バイオリアクターは、バッチ、半供給バッチ、供給バッチ、灌流、及び／又は連続発酵プロセスに好適であり得る。任意の好適なリアクター直径を使用することができる。実施形態では、バイオリアクターは、約１００ｍＬ～約５０，０００Ｌの体積を有し得る。非限定的な例としては、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、３５０リットル、４００リットル、４５０リットル、５００リットル、５５０リットル、６００リットル、６５０リットル、７００リットル、７５０リットル、８００リットル、８５０リットル、９００リットル、９５０リットル、１０００リットル、１５００リットル、２０００リットル、２５００リットル、３０００リットル、３５００リットル、４０００リットル、４５００リットル、５０００リットル、６０００リットル、７０００リットル、８０００リットル、９０００リットル、１０，０００リットル、１５，０００リットル、２０，０００リットル、及び／又は５０，０００リットルの体積が挙げられる。加えて、好適なリアクターは、マルチユース、シングルユース、ディスポーザブル、又は非ディスポーザブルであってもよく、ステンレス鋼（例えば、３１６Ｌ又は任意の他の好適なステンレス鋼）並びにインコネル、プラスチック、及び／又はガラスなどの金属合金を含む任意の好適な材料から形成され得る。

【0062】

実施形態では、及び本明細書に特に明記しない限り、本明細書に記載のデバイス、施設、及び方法はまた、特に言及されていない任意の好適な単位操作及び／又は機器、例えば、かかる産物の分離、精製、及び分離のための操作及び／又は機器を含むことができる。任意の好適な施設及び環境、例えば、従来の現場組み立て（ｓｔｉｃｋ－ｂｕｉｌｔ）施設、モジュラー設備、移動施設及び仮設施設、又は任意の他の好適な建設、施設、及び／又はレイアウトを使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、モジュラークリーンルームを使用することができる。更に、特に明記しない限り、本明細書に記載のデバイス、システム、及び方法は、単一の場所若しくは施設において収容及び／若しくは実施することができ、又は代替的に、別々若しくは複数の場所及び／若しくは施設において収容及び／若しくは実施することができる。

【0063】

特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書で引用される全ての参考文献、並びにそれらにおいて引用される参考文献は、それらが既に引用されていない程度まで、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0064】

追加の例示的な実施形態
実施形態１は、（ａ）Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、（ｉ）Ｅ１Ａアデノウイルスヘルパー遺伝子と、（ｉｉ）Ｅ２Ａ、Ｅ４、又は両方から選択されるアデノウイルスヘルパー遺伝子と、（ｉｉｉ）ウイルス関連、非コードＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）と、（ｉｖ）Ｒｅｐ、Ｃａｐ、又は両方から選択されるＡＡＶ遺伝子と、を含む、１つ以上のベクターでトランスフェクトすることと、（ｂ）トランスフェクトされたＥ１相補性プロデューサー細胞を、ＡＡＶを産生するのに好適な条件下で培養することと、（ｃ）培養されたＥ１相補性プロデューサー細胞からＡＡＶを精製し、それによってＡＡＶを得ることと、を含む、Ｅ１相補性プロデューサー細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法である。

【0065】

実施形態２は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）が、単一のベクター上にある、実施形態１の方法を含む。

【0066】

実施形態３は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）が、２つ以上のベクター上にある、実施形態１の方法を含む。

【0067】

実施形態４は、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）が、第１のベクター上にあり、（ｉｖ）が、第２のベクターである、実施形態３の方法を含む。

【0068】

実施形態５は、（ｉ）が、第１のベクター上にあり、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）が、第２のベクター上にあり、（ｉｖ）が、第３のベクター上にある、実施形態３の方法を含む。

【0069】

実施形態６は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々が、別個のベクター上にある、実施形態３の方法を含む。

【0070】

実施形態７は、（ｉ）を含むベクターが、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）を含むベクターの各々に対して約１：１～約５：１の比でＥ１相補性プロデューサー細胞にトランスフェクトされる、実施形態５又は６の方法を含む。

【0071】

実施形態８は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞にトランスフェクトされる（ｉ）を含むベクターと（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）を含むベクターの各々との比が、１：１である、実施形態７の方法を含む。

【0072】

実施形態９は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞にトランスフェクトされる（ｉ）を含むベクターと（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）を含むベクターの各々との比が、２：１である、実施形態７の方法を含む。

【0073】

実施形態１０は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞にトランスフェクトされる（ｉ）を含むベクターと（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）を含むベクターの各々との比が、３：１である、実施形態７の方法を含む。

【0074】

実施形態１１は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）が、１つ以上のプロモーターに作動可能に結合している、実施形態１～１０のいずれか１つの方法を含む。

【0075】

実施形態１２は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々が、別個のプロモーターに作動可能に結合している、実施形態１１の方法を含む。

【0076】

実施形態１３は、（ｉ）に作動可能に結合したプロモーターが、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）に作動可能に結合したプロモーターと比較して実質的に同じ発現レベルを提供する、実施形態１２の方法を含む。

【0077】

実施形態１４は、（ｉ）に作動可能に結合したプロモーターが、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）に作動可能に結合したプロモーターと比較して少なくとも２倍高い発現を提供する、実施形態１２の方法を含む。

【0078】

実施形態１５は、（ｉ）に作動可能に結合したプロモーターが、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）に作動可能に結合したプロモーターと比較して少なくとも３倍高い発現を提供する、実施形態１２の方法を含む。

【0079】

実施形態１６は、（ｉ）が、プロモーターに作動可能に結合しており、エンハンサーに更に作動可能に結合しており、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）が、エンハンサーに作動可能に結合していない、実施形態１１～１５のいずれか１つの方法を含む。

【0080】

実施形態１７は、１つ以上のベクター上の（ｉ）と（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々とのコピー数比が、約１：１～約５：１である、実施形態１～１６のいずれか１つの方法を含む。

【0081】

実施形態１８は、１つ以上のベクター上の（ｉ）と（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々とのコピー数比が、１：１である、実施形態１７の方法を含む。

【0082】

実施形態１９は、１つ以上のベクター上の（ｉ）と（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々とのコピー数比が、２：１である、実施形態１７の方法を含む。

【0083】

実施形態２０は、１つ以上のベクター上の（ｉ）と（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々とのコピー数比が、３：１である、実施形態１７の方法を含む。

【0084】

実施形態２１は、（ｉｉ）が、Ｅ２Ａ及びＥ４を含む、実施形態１～２０のいずれか１つの方法を含む。

【0085】

実施形態２２は、（ｉｖ）が、Ｒｅｐ及びＣａｐを含む、実施形態１～２１のいずれか１つの方法を含む。

【0086】

培養することが、Ｅ１Ａを（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々に対して約１：１～約５：１の比で発現することを含む、実施形態１～２２のいずれか１つの方法を含む。

【0087】

実施形態２４は、Ｅ１Ａの発現と（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の各々の発現との比が、１：１、２：１、又は３：１である、実施形態２３の方法を含む。

【0088】

実施形態２５は、１つ以上のベクターが、（ｖ）Ｅ１Ｂ、ＮＰ１、ＮＳ２、又はそれらの組み合わせから選択されるヘルパー遺伝子を含む、実施形態１～２４のいずれか１つの方法を含む。

【0089】

実施形態２６は、Ｅ１Ｂが、Ｅ１Ｂ－１９ｋ又はＥ１Ｂ－５５ｋである、実施形態２５の方法を含む。

【0090】

実施形態２７は、（ｖ）が、ＮＰ１及びＮＳ２を含む、実施形態２５の方法を含む。

【0091】

実施形態２８は、（ｉ）及び（ｖ）が、単一のベクター上にある、実施形態２５～２７のいずれか１つの方法を含む。

【0092】

（ｖ）が、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）からの別個のベクター上にある、実施形態２５～２７のいずれか１つの方法を含む。

【0093】

実施形態３０は、１つ以上のベクターが、目的の遺伝子を更に含む、請求項１～２９のいずれか１つの方法を含む。

【0094】

実施形態３１は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、目的の遺伝子を含むベクターでトランスフェクトすることを更に含み、目的の遺伝子が、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）からの別個のベクター上にある、実施形態１～２９のいずれか１つの方法を含む。

【0095】

実施形態３２は、方法が、Ｅ１相補性プロデューサー細胞をＥ１Ａアデノウイルスヘルパー遺伝子でトランスフェクトすることを含まない方法と比較して、少なくとも１．５倍以上の力価のＡＡＶを産生する、実施形態１～３１のいずれか１つの方法を含む。

【0096】

実施形態３３は、（ａ）Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、（ｉ）第１のプロモーターに作動可能に結合したＥ１Ａを含む第１のベクター、（ｉｉ）全て第２のプロモーターに作動可能に結合した、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びウイルス関連、非コードＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）を含む第２のベクター、並びに（ｉｉｉ）共に第３のプロモーターに作動可能に結合した、Ｒｅｐ及びＣａｐを含む第３のベクターでトランスフェクトすることであって、（ｉ）と（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の各々とのトランスフェクション比が、約１：１～約３：１である、トランスフェクトすることと、（ｂ）トランスフェクトされたＥ１相補性プロデューサー細胞を、ＡＡＶを産生するのに好適な条件下で培養することと、（ｃ）培養されたＥ１相補性プロデューサー細胞からＡＡＶを精製し、それによってＡＡＶを得ることと、を含む、Ｅ１相補性プロデューサー細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法である。

【0097】

実施形態３４は、（ａ）Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、（ｉ）第１のプロモーター及びエンハンサーに作動可能に結合したＥ１Ａを含む第１のベクター、（ｉｉ）全て第２のプロモーターに作動可能に結合した、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びウイルス関連、非コードＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）を含む第２のベクター、並びに（ｉｉｉ）各々第３のプロモーターに作動可能に結合した、Ｒｅｐ及びＣａｐを含む第３のベクターでトランスフェクトすることと、トランスフェクトされたＥ１相補性プロデューサー細胞を、ＡＡＶを産生するのに好適な条件下で培養することであって、Ｅ１Ａが、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及びＣａｐの各々に対して約１：１～約３：１の比で発現される、培養することと、培養されたＥ１相補性プロデューサー細胞からＡＡＶを精製し、それによってＡＡＶを得ることと、を含む、Ｅ１相補性プロデューサー細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法である。

【0098】

実施形態３５は、（ａ）Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、（ｉ）全て第１のプロモーターに作動可能に結合した、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡを含む第１のベクター、並びに（ｉｉ）第２のプロモーターに作動可能に結合した、Ｒｅｐ及びＣａｐを含む第２のベクターでトランスフェクトすることであって、Ｅ１ＡとＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡ、Ｒｅｐ、及びＣａｐの各々とのコピー数比が、約１：１～約３：１である、トランスフェクトすることと、（ｂ）トランスフェクトされたＥ１相補性プロデューサー細胞を、ＡＡＶを産生するのに好適な条件下で培養することと、（ｃ）培養されたＥ１相補性プロデューサー細胞からＡＡＶを精製し、それによってＡＡＶを得ることと、を含む、Ｅ１相補性プロデューサー細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法である。

【0099】

実施形態３６は、第１、第２、又は第３のベクターの１つ以上が、Ｅ１Ｂ、ＮＰ１、ＮＳ２、又はそれらの組み合わせから選択されるヘルパー遺伝子を更に含む、実施形態３３又は３４の方法を含む。

【0100】

実施形態３７は、第１又は第２のベクターの一方又は両方が、Ｅ１Ｂ、ＮＰ１、ＮＳ２、又はそれらの組み合わせから選択されるヘルパー遺伝子を更に含む、実施形態３５の方法を含む。

【0101】

実施形態３８は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、Ｅ１Ｂ、ＮＰ１、ＮＳ２、又はそれらの組み合わせから選択されるヘルパー遺伝子を含むベクターでトランスフェクトすることを更に含む、実施形態３３～３５のいずれか１つの方法を含む。

【0102】

実施形態３９は、Ｅ１Ｂが、Ｅ１Ｂ－１９ｋ又はＥ１Ｂ－５５ｋである、実施形態３６～３８のいずれか１つの方法を含む。

【0103】

実施形態４０は、ヘルパー遺伝子が、ＮＰ１とＮＳ２との組み合わせを含む、実施形態３６～３８のいずれか１つの方法を含む。

【0104】

実施形態４１は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞を、目的の遺伝子を含むベクターでトランスフェクトすることを更に含む、実施形態３３～４０のいずれか１つの方法を含む。

【0105】

実施形態４２は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、９１１細胞、ｐＴＧ６５５９細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＧＨ３２９細胞、Ｎ５２．Ｅ６（ＣＡＰ（登録商標））細胞、ＨｅＬａ－Ｅ１細胞、ＵＲ細胞、ＶＬＩ－２９３細胞、Ａｃ５１細胞、Ａｃ１３９細胞、又はそれらのバリアント若しくは誘導体である、実施形態１～４１のいずれか１つの方法を含む。

【0106】

実施形態４３は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はＮ５２．Ｅ６（ＣＡＰ（登録商標））細胞である、実施形態４２の方法を含む。

【0107】

実施形態４４は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、実施形態４３の方法を含む。

【0108】

実施形態４５は、ＨＥＫ２９３細胞が、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴＭ細胞、ＨＥＫ２９３ＳＧ細胞、ＨＥＫ２９３ＳＧＧＤ細胞、ＨＥＫ２９３Ｈ細胞、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞、ＨＥＫ２９３ＭＳＲ細胞、ＨＥＫ２９３Ａ細胞、又はそれらの組み合わせである、実施形態４４の方法を含む。

【0109】

実施形態４６は、ＨＥＫ２９３細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、実施形態４５の方法を含む。

【0110】

実施形態４７は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞が、ＰＥＲ．Ｃ６細胞である、実施形態４３の方法を含む。

【0111】

実施形態４８は、Ｅ１相補性プロデューサー細胞が、Ｎ５２．Ｅ６（ＣＡＰ（登録商標））細胞である、実施形態４３の方法を含む。

【実施例】

【0112】

実施例１．ＡＡＶ産生のための候補ヘルパー遺伝子のスクリーニング
トリプルトランスフェクションによってＡＡＶ産生を改善するための新しいヘルパー遺伝子を特定するために、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ－１９ｋ、Ｅ１Ｂ－５５ｋ、並びにヒトボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２についての全長ｃＤＮＡを合成した。追加のヘルパー遺伝子についてのｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターと、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにおけるウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨポリ（Ａ））シグナルとの間でサブクローニングして、過剰発現を可能にした。ＮＰ１及びＮＳ２は、単一のｍＲＮＡ転写物における二重発現のための内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）と結合した。候補プラスミドは、以下を含有した：Ｅ１Ａ単独（配列番号１）、Ｅ１Ｂ－１９ｋ単独（配列番号２）、Ｅ１Ｂ－５５ｋ単独（配列番号３）、ＮＰ１－ＮＳ２（配列番号４）、Ｅ１Ａ＋Ｅ１Ｂ－１９ｋ、Ｅ１Ａ＋１９Ｂ－５５ｋ、Ｅ１Ｂ－１９ｋ＋Ｅ１Ｂ－５５ｋ、又はＥ１Ａ＋Ｅ１Ｂ－１９ｋ＋Ｅ１Ｂ－５５ｋ。

【0113】

これらの候補プラスミドを試験するために、ＨＥＫ２９３細胞を、１２５ｍＬシェーカーフラスコにおいて３０ｍＬ培養物中で増殖させ、図１に示される標準トリプルトランスフェクションプラスミド及び候補ヘルパープラスミドでトランスフェクトした。Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドについては、ｐＲｅｐ２－Ｃａｐ９を使用し、ｐＡＡＶプラスミドについては、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰをＡＡＶ９．ＧＦＰウイルスの産生のために使用した。同じ量の空ベクターｐｃＤＮＡ３．１を、対照として共トランスフェクトした。各候補ヘルパープラスミドを２通りに試験した。

【0114】

粗ウイルスを、トランスフェクションの３日後に採取し、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）力価分析に供して、１ミリリットル当たりの粒子（ｖｇ／ｍＬ）を含有するウイルスゲノムを定量化した。図２における結果は、Ｅ１Ａ、又はＥ１Ａ＋Ｅ１Ｂアイソフォームの追加発現が、対照と比較してほぼ１００％の力価を有意に増加させた一方で、Ｅ１Ｂアイソフォーム又はボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２の発現が、ＡＡＶ力価について最小限の改善を有したことを示した。

【0115】

実施例２．ＡＡＶ産生のためのＥ１Ａ過剰発現の確認
実施例１における実験を、以下の条件：空ベクター（対照）、Ｅ１Ａ単独、Ｅ１Ｂ－１９ｋ単独、Ｅ１Ｂ－５５ｋ単独、ＮＰ１－ＮＳ２、及びＥ１Ａ＋ＮＰ１－ＮＳ２で繰り返し、粗ウイルス力価結果をｄｄＰＣＲによって分析した。図３Ａに示されるように、Ｅ１Ａ単独又はＥ１Ａ＋ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２遺伝子はＡＡＶ力価を約５０％増加させたが、ボカウイルス遺伝子単独は効果を有さなかった。

【0116】

Ｅ１Ａの過剰発現を確認するために、ウェスタンブロット分析を行って、Ｅ１Ａタンパク質発現（図３Ｂの表に示されるトランスフェクション条件）を評価した。図３Ｂに示されるように、Ｅ１Ａの追加共トランスフェクションは、ＨＥＫ２９３細胞によって内因性に発現されるＥ１Ａタンパク質のみを含有した、試料１及び２と比較して、プラスミドトランスフェクトされたＥ１Ａを有した、試料３、４、１１、及び１２においてＥ１Ａタンパク質の全ての３つのアイソフォーム（２８９Ｒ、２４３Ｒ、及び１７１Ｒ）のより高いレベルを発現した。β－アクチンレベルを対照として測定し、異なる条件間に有意差は見られなかった。Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２アイソフォーム）及びＣａｐ（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）のタンパク質発現レベルも決定され、Ｅ１Ａトランスフェクトされた試料と対照との間に有意差は検出されなかった。よって、Ｅ１Ａ過剰発現は、Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質発現の調節以外のメカニズムを通してＡＡＶ力価を改善し得る。

【0117】

実施例３．ＡＡＶ産生のためのＥ１Ａによる用量依存的改善
ＡＡＶ力価改善のためのＥ１Ａ機能を、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミドに対して１：１、２：１、又は３：１モル比でのＥ１Ａプラスミドの滴定によって更に試験し、図４Ａにおける表で、それぞれ、１×Ｅ１Ａ、２×Ｅ１Ａ、又は３×Ｅ１Ａとして示した。トランスフェクション及びＡＡＶ産生を、実施例１と同じ様式で行った。図４Ａに示されるように、Ｅ１Ａ過剰発現の増加は、ウェスタンブロット分析によって確認された。図４Ｂに示されるように、ＡＡＶ９．ＧＦＰ力価は、Ｅ１Ａ投与量依存的な様式で増加した。

【0118】

実施例４．ＡＡＶ産生のための新規及び増強されたトリプルトランスフェクション
トランスフェクション実験を簡素化するために、Ｅ１Ａ発現カセットを、実施例１のｐｃＤＮＡ３．１－Ｅ１Ａプラスミドから、図１に示される標準ｐＨｅｌｐｅｒベクターにサブクローニングした。「ｐＬＨＩ＿Ｈｅｌｐｅｒ」と称される、新しいヘルパープラスミド（配列番号５）を、図５Ａに示されるように、従来のｐＨｅｌｐｅｒの代わりにＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。図５Ｂに示されるように、標準トリプルトランスフェクションと比較して、ｐＬＨＩ＿Ｈｅｌｐｅｒ媒介トリプルトランスフェクションは、ＡＡＶ２．ＧＦＰ及びＡＡＶ９．ＧＦＰ産生を、ｐＨｅｌｐｅｒを使用する対照標準トリプルトランスフェクションに対して、それぞれ、５２．２％及び３６．１％有意に改善した。

【0119】

配列
配列番号１－Ｅ１Ａを含有する例示的なプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１－Ｅ１Ａ）
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【0120】

配列番号２－Ｅ１Ｂ－１９ｋを含有する例示的なプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１－Ｅ１Ｂ－１９Ｋ）
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【0121】

配列番号３－Ｅ１Ｂ－５５ｋを含有する例示的なプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１－Ｅ１Ｂ－５５Ｋ）
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【0122】

配列番号４－ＮＰ１及びＮＳ２を含有する例示的なプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１－ＮＰ１－ＮＳ２）
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【0123】

配列番号５－Ｅ１Ａ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡを含有する例示的なプラスミド（ｐＬＨＩ＿Ｈｅｌｐｅｒ）
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【0124】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年２月７日に作成された、当該ＡＳＣＩＩコピーの名称は、０１３２－０１５６ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは、５５，６６５バイトである。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【配列表】

2024506279000001.app

【国際調査報告】