知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特表2024-506304トランスポソーム結合ビーズ上でのロングインデックス付き連結リード生成
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-13
(54)【発明の名称】トランスポソーム結合ビーズ上でのロングインデックス付き連結リード生成
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6806 20180101AFI20240205BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240205BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240205BHJP
C12Q 3/00 20060101ALN20240205BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240205BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6806 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12M1/00 A
C12Q3/00
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023547246
(86)(22)【出願日】2022-02-03
(85)【翻訳文提出日】2023-08-03
(86)【国際出願番号】 US2022015113
(87)【国際公開番号】W WO2022169972
(87)【国際公開日】2022-08-11
(31)【優先権主張番号】63/145,902
(32)【優先日】2021-02-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
２．ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ
(71)【出願人】
【識別番号】500358711
【氏名又は名称】イルミナ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107489
【弁理士】
【氏名又は名称】大塩 竹志
(72)【発明者】
【氏名】クリスティアンセン， レナ
(72)【発明者】
【氏名】スティーマーズ， フランク ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】シュロス， ゲイリー
(72)【発明者】
【氏名】トーマス， ジェルーシャ
(72)【発明者】
【氏名】ポコロック， ディミトリー ケー．
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029AA23
4B029BB20
4B029FA15
4B063QA01
4B063QA13
4B063QQ02
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR62
4B063QR83
4B063QS39
4B063QX02
(57)【要約】
本明細書に提供されるシステム、方法、及び組成物の実施形態は、オンビーズタグメンテーション及び液滴インデックス付けに関する。いくつかの実施形態は、核酸配列決定、インデックス付きＰＣＲ、核酸ライブラリの調製、メチル化状態の決定、ゲノム変異体の識別、又はタンパク質分析を含む同時アッセイを、分配されたビーズで行うことを含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸インデックス付き増幅のためのシステムであって、複数の連続性ビーズであって、各連続性ビーズがトランスポソームと会合し、ビーズ結合核酸分子を含む、複数の連続性ビーズと、
インデックス付きプライマープールであって、
複数のプライマービーズであって、各プライマービーズが、アダプター、バーコード、及びプライマーを含む、複数のプライマービーズ、並びに
溶液プライマー、を含む、インデックス付きプライマープールと、を含み、
前記連続性ビーズ及びプライマービーズが液滴中に一緒に分配され、前記システムが更に、
配列決定データを得るための検出器を含む、システム。
【請求項2】
前記連続性ビーズ及び／又は前記プライマービーズが、ヒドロゲルポリマー及び架橋剤を含むヒドロゲルビーズである、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
前記ヒドロゲルポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－チオール／ＰＥＧ－アクリレート、アクリルアミド／Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン（ＢＡＣｙ）、ＰＥＧ／ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリアクリル酸、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（ビニルスルホン酸）（ＰＶＳＡ）、ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）、ポリリジン、寒天、アガロース、アルギネート、ヘパリン、硫酸化アルギン酸、硫酸デキストラン、ヒアルロナン、ペクチン、カラギーナン、ゼラチン、キトサン、セルロース、又はコラーゲンを含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項4】
前記架橋剤が、ビスアクリルアミド、ジアクリレート、ジアリルアミン、トリアリルアミン、ジビニルスルホン、ジエチレングリコールジアリルエーテル、エチレングリコールジアクリレート、ポリメチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、トリメチロプロポアントリメタクリレート、エトキシル化トリメチロールトリアクリレート、又はエトキシル化ペンタエリスリトールテトラアクリレートを含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項5】
前記核酸が、５０，０００塩基対以上のＤＮＡ分子である、請求項１に記載のシステム。
【請求項6】
前記ポリマーが、Ｐ５プライマーである、請求項１に記載のシステム。
【請求項7】
前記溶液プライマーが、アダプター及びプライマーを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項8】
前記溶液プライマーが、Ｂ１５アダプター及びＰ７プライマーを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項9】
前記トランスポソームが、トランスポザーゼ及びトランスポゾンを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項10】
核酸インデックス付き増幅のためのフローセルデバイスであって、複数の分配された液滴を含む固体支持体であって、
トランスポソームと会合し、ビーズ結合核酸分子を含む連続性ビーズと、
アダプター、バーコード、及びプライマーを含むプライマービーズと、を含む固体支持体を含み、
前記複数の分配された液滴が、前記固体支持体の表面に沿って分布している、フローセルデバイス。
【請求項11】
前記固体支持体が、表面ポリマーで官能化されている、請求項１０に記載のフローセルデバイス。
【請求項12】
前記表面ポリマーが、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド）（ＰＡＺＡＭ）又はシランフリーアクリルアミド（ＳＦＡ）である、請求項１１に記載のフローセルデバイス。
【請求項13】
前記フローセルが、パターン化された表面を含む、請求項１０に記載のフローセルデバイス。
【請求項14】
前記パターン化された表面が、ウェルを含む、請求項１３に記載のフローセルデバイス。
【請求項15】
前記ウェルが、直径が約１０μｍ～約５０μｍ、例えば、直径が１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、若しくは５０μｍであるか、又は前述の値のうちのいずれか２つによって規定される範囲内であり、前記ウェルが、深さが約０．５μｍ～約１μｍ、例えば、深さが０．５μｍ、０．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍ、若しくは１μｍであるか、又は前述の値のうちのいずれか２つによって規定される範囲内である、請求項１４に記載のフローセルデバイス。
【請求項16】
前記ウェルが疎水性材料で構成されている、請求項１４に記載のフローセルデバイス。
【請求項17】
前記疎水性材料が、ＣＹＴＯＰ、Ｆｌｕｏｒｏｐｅｌ（登録商標）、又はＴｅｆｌｏｎ（登録商標）などの非晶質フルオロポリマーを含む、請求項１５に記載のフローセルデバイス。
【請求項18】
前記核酸が、５０，０００塩基対以上のＤＮＡ分子である、請求項１０に記載のフローセルデバイス。
【請求項19】
前記トランスポソームが、トランスポザーゼ及びトランスポゾンを含む、請求項１０に記載のフローセルデバイス。
【請求項20】
核酸インデックス付け方法であって、オンビーズタグメンテーションのための複数の連続性ビーズであって、各ビーズがトランスポソームに連結され、ビーズ結合核酸分子を含む、複数の連続性ビーズを生成することと、
前記核酸分子にタグメンテーション反応を行うことと、
複数のプライマービーズであって、各プライマービーズが、アダプター、バーコード、及びプライマーを含む、複数のプライマービーズを生成することと、
前記連続性ビーズ及び前記プライマービーズを溶液プライマーとともに液滴中に一緒に分配することと、
分配された前記液滴中で核酸分子を増幅することと、
各液滴中の前記核酸分子をインデックス付けすることと、を含む、方法。
【請求項21】
前記核酸が、５０，０００塩基対以上のＤＮＡ分子である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記タグメンテーション反応を行う前に、核酸分子に核酸増幅を行うことを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
増幅反応が、多置換増幅（ＭＤＡ）を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記タグメンテーション反応が、前記核酸を、アダプター配列及びトランスポソームを含むトランスポザーゼ混合物と接触させることを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項25】
前記インデックス付けが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項26】
前記液滴が、９００，０００を超える異なるインデックス付きＰＣＲ区画に分配される、請求項２０に記載の方法。
【請求項27】
前記液滴を固体支持体上に分配することを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項28】
前記固体支持体が、フローセルデバイスである、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願２０２１年２月４日に出願された第６３／１４５，９０２号は「ＬＯＮＧ ＩＮＤＥＸＥＤ－ＬＩＮＫＥＤ ＲＥＡＤ ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ ＯＮ ＴＲＡＮＳＰＯＳＯＭＥ ＢＯＵＮＤ ＢＥＡＤＳ」と題されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、米国特許仮出願２０２１年２月４日に出願された第６３／１４５，９０２号は「ＬＯＮＧ ＩＮＤＥＸＥＤ－ＬＩＮＫＥＤ ＲＥＡＤ ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ ＯＮ ＴＲＡＮＳＰＯＳＯＭＥ ＢＯＵＮＤ ＢＥＡＤＳ」と題されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
（配列表の参照）
本出願は、電子フォーマットでの配列表とともに出願されている。配列表は、２０２２年２月３日に作成され、サイズが２．７キロバイトであるＳｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＩＬＬＩＮＣ＿４０６ＷＯと題されたファイルとして提供される。配列表の電子フォーマット中の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子フォーマットでの配列表とともに出願されている。配列表は、２０２２年２月３日に作成され、サイズが２．７キロバイトであるＳｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＩＬＬＩＮＣ＿４０６ＷＯと題されたファイルとして提供される。配列表の電子フォーマット中の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0003】
（発明の分野）
本明細書で提供されるシステム、方法、及び組成物は、空間インデックス配列決定及び核酸ライブラリ調製のための組成物、システム、及び方法に関する。
本明細書で提供されるシステム、方法、及び組成物は、空間インデックス配列決定及び核酸ライブラリ調製のための組成物、システム、及び方法に関する。
【背景技術】
【0004】
生物学的試料中に存在する特定の核酸配列の検出は、例えば、微生物を識別及び分類する、感染症を診断する、遺伝子異常を検出及び特徴付ける、がんに関連する遺伝的変化を識別する、疾患に対する遺伝的感受性を調べる、並びに様々な種類の治療に対する応答を測定するための方法として使用されてきた。生物学的試料中の特定の核酸配列を検出するための一般的な技術は、核酸配列決定である。
【0005】
次世代シーケンサーは、配列決定実行ごとに大量のゲノムデータを生成する強力なツールである。この大量のデータを解釈しかつ分析することは、困難であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
本開示は、ビーズ結合トランスポソーム及び液滴生成器を使用してインデックス付き連結リードを作製するためのシステム、方法、及び組成物に関する。
【0007】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、核酸インデックス付き増幅のためのシステムに関する。いくつかの態様では、本システムは、複数の連続性ビーズ、インデックス付きプライマープール、及び配列決定データを得るための検出器を含む。いくつかの実施形態では、各連続性ビーズは、トランスポソームと会合している。いくつかの実施形態では、各連続性ビーズは、ビーズ結合核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、インデックス付きプライマープールは、複数のプライマービーズ及び溶液プライマーを含む。いくつかの実施形態は、各プライマービーズは、アダプター、バーコード、及びプライマーを含む。いくつかの実施形態では、連続性ビーズ及びプライマービーズは、液滴中に一緒に分配される。いくつかの実施形態では、プライマーは、Ｐ５プライマーである。いくつかの実施形態では、溶液プライマーは、アダプター及びプライマーを含む。いくつかの実施形態では、溶液プライマーは、Ｂ１５アダプター及びＰ７プライマーを含む。いくつかの実施形態では、トランスポソームは、トランスポザーゼ及びトランスポゾンを含む。
【0008】
いくつかの実施形態では、連続性ビーズ及び／又はプライマービーズは、ヒドロゲルポリマー及び架橋剤を含むヒドロゲルビーズである。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルポリマーは、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）－チオール／ＰＥＧ－アクリレート、アクリルアミド／Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン（N,N’-bis(acryloyl)cystamine、ＢＡＣｙ）、ＰＥＧ／ポリプロピレンオキシド（polypropylene oxide、ＰＰＯ）、ポリアクリル酸、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（poly(hydroxyethyl methacrylate)、ＰＨＥＭＡ）、ポリ（メチルメタクリレート）（poly(methyl methacrylate)、ＰＭＭＡ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（poly(N-isopropylacrylamide）、ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ（乳酸）（poly(lactic acid)、ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（poly(lactic-co-glycolic acid）、ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（polycaprolactone、ＰＣＬ）、ポリ（ビニルスルホン酸）（poly(vinylsulfonic acid)、ＰＶＳＡ）、ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）、ポリリジン、寒天、アガロース、アルギネート、ヘパリン、硫酸化アルギン酸、硫酸デキストラン、ヒアルロナン、ペクチン、カラギーナン、ゼラチン、キトサン、セルロース、又はコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、架橋剤は、ビスアクリルアミド、ジアクリレート、ジアリルアミン、トリアリルアミン、ジビニルスルホン、ジエチレングリコールジアリルエーテル、エチレングリコールジアクリレート、ポリメチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、トリメチロプロポアントリメタクリレート、エトキシル化トリメチロールトリアクリレート、又はエトキシル化ペンタエリスリトールテトラアクリレートを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、５０，０００塩基対以上のＤＮＡ分子である。
【0009】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、核酸インデックス付き増幅のためのフローセルデバイスに関する。いくつかの実施形態では、本デバイスは、複数の分配された液滴を含む固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、複数の分配された液滴は、トランスポソームと会合し、かつビーズ結合核酸分子と、アダプター、バーコード、及びプライマーを含むプライマービーズとを含む連続性ビーズを含む。いくつかの実施形態では、複数の分配された液滴は、固体支持体の表面に沿って分布している。
【0010】
いくつかの実施形態では、固体支持体は、表面ポリマーで官能化されている。いくつかの実施形態では、表面ポリマーは、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド）（ＰＡＺＡＭ）又はシランフリーアクリルアミド（silane free acrylamide、ＳＦＡ）である。いくつかの実施形態では、フローセルは、パターン化された表面を含む。いくつかの実施形態では、パターン化された表面は、ウェルを含む。いくつかの実施形態では、ウェルは、直径が約１０μｍ～約５０μｍ、例えば、直径が１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、若しくは５０μｍであるか、又は前述の値のうちのいずれか２つによって規定される範囲内であり、ウェルは、深さが約０．５μｍ～約１μｍ、例えば、深さが０．５μｍ、０．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍ、若しくは１μｍであるか、又は前述の値のうちのいずれか２つによって規定される範囲内である。いくつかの実施形態では、ウェルは、疎水性材料を含む。いくつかの実施形態では、疎水性材料は、ＣＹＴＯＰ、Ｆｌｕｏｒｏｐｅｌ（登録商標）、又はＴｅｆｌｏｎ（登録商標）などの非晶質フルオロポリマーを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、５０，０００塩基対以上のＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、トランスポソームは、トランスポザーゼ及びトランスポゾンを含む。
【0011】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、核酸インデックス付け方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、オンビーズタグメンテーションのための複数の連続性ビーズであって、各ビーズがトランスポソームに連結され、ビーズ結合核酸分子を含む、複数の連続性ビーズを生成することと、核酸分子にタグメンテーション反応を行うことと、複数のプライマービーズであって、各プライマービーズが、アダプター、バーコード、及びプライマーを含む、複数のプライマービーズを生成することと、連続性ビーズ及びプライマービーズを溶液プライマーとともに液滴中に一緒に分配することと、分配された液滴中で核酸分子を増幅することと、各液滴中の核酸分子をインデックス付けすることと、を含む。
【0012】
いくつかの実施形態では、核酸は、５０，０００塩基対以上のＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、本方法は、タグメンテーション反応を行う前に、核酸分子に核酸増幅を行うことを更に含む。いくつかの実施形態では、増幅反応は、多置換増幅（multiple displacement amplification、ＭＤＡ）を含む。いくつかの実施形態では、タグメンテーション反応は、核酸を、アダプター配列及びトランスポソームを含むトランスポザーゼ混合物と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、インデックス付けは、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）によって行われる。いくつかの実施形態では、液滴は、９００，０００を超える異なるインデックス付きＰＣＲ区画に分配される。いくつかの実施形態では、本方法は、固体支持体上で液滴を分配することを更に含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、フローセルデバイスである。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】ビーズ－トランスポソーム上に分配された液滴を生成するために使用することができるマイクロ流体液滴生成器システムの一実施形態の概略図である。
【図2】ビーズ上での連続性保存転位シーケンシング（ＣＰＴ－ｓｅｑ）（工程１）、分配／インデックス付きＰＣＲ（工程２）、及びインデックス付き連結リード（工程３）を含む、連結ロングリードインデックス付けを行うための例示的な方法の概略図を示す。
【図3】ビーズ上でのＣＰＴ－ｓｅｑ、液滴分配、及びインデックス付きプライマープールインデックス付けを含む、ロングリードインデックス付けを行うための例示的な方法の概略図を示す。
【図4】本明細書に記載の方法を使用した染色体レベル位相の結果の概略図を示す。
【図5】本明細書に記載のロングリードインデックス付け方法を使用したアイランド長さと比較したアイランド数の結果を示す。
【図6】１０Ｘ配列決定（右）と比較した本明細書に記載のロングリードインデックス付け方法（左）を使用した変異体コーリング及び位相ブロックの結果を示す。
【図7】ヒト白血球抗原（human leukocyte antigen、ＨＬＡ）領域に行われた本明細書に記載のロングリードインデックス付け方法の方法の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下の詳細な説明では、添付の図面を参照し、添付の図面は本明細書の一部をなす。図面において、同様の記号は、文脈上特に指示されない限り、典型的には同様の構成要素を特定する。詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載される例示的な実施形態は、限定することを意図するものではない。本明細書に提示される主題の趣旨又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変更を加え得る。本開示の態様は、本明細書に全般的に記載され、図面に例示されるように、多種多様な異なる構成で配置され、置換され、組み合わされ、分離され、及び設計され得ることが容易に理解され、それらの全てが本明細書で明示的に企図されている。
【0015】
本明細書で提供される実施形態は、ロングリードインデックス付けシステム、デバイス、及び方法に関する。本システムは、オンビーズタグメンテーションを含む。ビーズは、トランスポソームが結合しており、かつ核酸分子が結合した、本明細書に開示されるビーズのうちのいずれかを含み得る。
【0016】
いくつかの実施形態では、ビーズは、トランスポソームの存在下で混合され、かつトランスポソームに結合したビーズを形成するヒドロゲルポリマー及び架橋剤を含む。いくつかの実施形態では、ビーズが調製され、後にトランスポソームと混合され、その後、これがビーズに結合される。いくつかの実施形態では、ビーズは、ビーズを包み込むか又はビーズと会合する核酸分子の存在下で調製される。いくつかの実施形態では、ビーズが最初に調製され、トランスポソームと混合され、その後、核酸分子と混合される。いくつかの実施形態では、ビーズは、連続性を維持しながら、同じ試料に対して同時アッセイを行うことを可能にする。具体的には、本明細書で提供される方法、システム、及び組成物は、ビーズに結合した生体分子を閉じ込めてそれにアクセスすることを可能にする。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のビーズは、本明細書では連続性粒子と称される。したがって、本明細書で使用される「連続性粒子」という用語は、連続性保存転位シーケンシング（ＣＰＴ－ｓｅｑ）に使用されるビーズを指す。
【0017】
本明細書に記載の連続性粒子は、次世代区画化アプローチのために使用され、核酸分子に対して行われる多分析物アッセイを可能にし得る。本明細書に記載の連続性粒子及び使用方法は、効率的に何百万もの核酸分子が個々に分析されることを可能にし、それにより、試料調製のコストが削減され、試料連続性が維持される。本明細書に記載の組成物及び方法は、エマルジョン、固定化、又は他のマイクロコンパートメントなどの外部コンパートメント化戦略（マイクロ流体技術）を使用することなく連続性を維持する。
【0018】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の連続性粒子は、目的とする核酸分子を分析するためのアッセイに使用することができる。核酸分子に対して行われ得るアッセイには、例えば、ＤＮＡ分析、ＲＮＡ分析、核酸配列決定、タグメンテーション、核酸増幅、ＤＮＡライブラリ調製、トランスポザーゼ接近可能クロマチン使用シーケンシングのためのアッセイ（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）、連続性保存転位シーケンシング（ＣＰＴ－ｓｅｑ）、又は順次行われるそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
【0019】
核酸分子に対して１つ以上のアッセイを行うための連続性粒子の使用は、いくつかの核酸分子、例えば、１０，０００～１００万個の核酸分子、例えば、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、又は１００万個の核酸分子に対して同時アッセイを同時に行うために、複数の連続性粒子に対して同時に使用され得る。
【0020】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法には、位相及びアセンブリを含む様々な用途のためのインデックス付き連結リードを作製するための方法が含まれる。いくつかの実施形態では、本方法は、オンビーズタグメンテーションを液滴インデックス付けと組み合わせることを含む。いくつかの実施形態では、液滴インデックス付けには、エマルジョン又はプレートを含む任意の物理的区画インデックス付けが含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるビーズは、核酸分子に対してオンビーズタグメンテーションを行うことを可能にするトランスポソームを含む。いくつかの実施形態では、各核酸分子は、ビーズを包み込み、核酸分子のビーズ結合断片を生成する。いくつかの実施形態では、本方法は、インデックス付けと組み合わせられる。いくつかの実施形態では、本方法は、液滴中にビーズを分配することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、各液滴中でインデックス付きＰＣＲを行うことを含む。いくつかの実施形態では、個々の核酸分子由来の各断片は、同じバーコードを受け取り、それにより、インデックス付き連結リードが生成される。
【0021】
本明細書に記載の方法、システム、及びデバイスの実施形態は、従来の方法に勝る多数の利点を有する。例えば、本明細書に記載の方法、システム、及びデバイスは、制御されたインサートサイズを提供し、ＤＮＡを断片化することなくＤＮＡを物理的分配に移動させ、ここでＤＮＡがＰＣＲによって一意にインデックス付けされる。加えて、ビーズ上でのＣＰＴ－ｓｅｑは、９００，０００を超える異なるインデックス付きＰＣＲ区画に行われ得る。更に、ビーズ上でのＣＰＴ－ｓｅｑにより、改善されたライブラリインサート（トランスポソーム密度）の制御、効率が向上した液滴へのＤＮＡ移動、ロバストなＤＮＡ調製、液滴の前に行われ得るアッセイの工程（例えば、Ｔｎ５除去を含む）、及びより少ないＤＮＡ断片化がもたらされる。本方法の実施形態は、ビーズの鋳型溶出を可能にし、これにより、加熱後に液滴中でのタグメント化された産物の遊離ビオチン溶出がもたらされる。加えて、本方法に関連する酵素により、鎖置換ポリメラーゼ及び増加した量の酵素による高い増幅が提供される。最後に、本明細書で提供される方法の実施形態は、ＤＮＡ品質の向上をもたらし、溶解物との適合性を可能にする。
【0022】
本明細書で提供される方法、システム、及びデバイスは、ビーズ上での転位を、タグメント化された核酸の物理的分配への移動と組み合わせる。いくつかの実施形態では、ロングインデックス付きリード生成には、ビーズ結合トランスポソーム及び液滴生成器の生成を含む。いくつかの実施形態では、液滴生成器には、マイクロ流体デバイス又はエマルジョンが含まれる。いくつかの実施形態では、ビーズ上での転位には、核酸タグメンテーション及び頻度が含まれ、これは、ビーズ上のトランスポソームの密度によって制御され得る。いくつかの実施形態では、ビーズは、タグメント化された核酸を物理的分配に移動させるために使用される。
【0023】
本明細書で使用される場合、「試薬」という用語は、試料と反応する、相互作用する、試料を希釈する、又は添加するのに有用な作用物質又は２つ以上の作用物質の混合物を表し、溶解、核酸分析、核酸増幅反応、タンパク質分析、タグメンテーション反応、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ、ＣＰＴ－ｓｅｑ、又はＳＣＩ－ｓｅｑ反応、又は他のアッセイのための作用物質を含む、本明細書に記載のアッセイで使用される作用物質を含み得る。したがって、試薬には、例えば、緩衝剤、化学物質、酵素、ポリメラーゼ、５０塩基対未満のサイズを有するプライマー、鋳型核酸、ヌクレオチド、標識、色素、又はヌクレアーゼが含まれ得る。いくつかの実施形態では、試薬には、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ（例えば、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｕポリメラーゼ）、トランスポザーゼ（例えばＴｎ５）、プライマー（例えば、Ｐ５及びＰ７アダプター配列）、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝剤、又は二価カチオンが含まれる。
【0024】
連続性粒子
いくつかの実施形態では、ビーズは、ヒドロゲル組成物から調製されたポリマーシェルを有する。本明細書で使用される場合、「ヒドロゲル」という用語は、有機ポリマー（天然又は合成）が共有結合、イオン結合、又は水素結合を介して架橋されて、水分子を捕捉してゲルを形成する三次元開放格子構造体を生成するときに形成される物質を指す。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、生体適合性ヒドロゲルであり得る。本明細書で使用される場合、「生体適合性ヒドロゲル」という用語は、生物学的材料に対して毒性でないゲルを形成するポリマーを指す。いくつかの実施形態では、ヒドロゲル材料には、アルギネート、アクリルアミド、又はポリ－エチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ－アクリレート、ＰＥＧ－アミン、ＰＥＧ－カルボキシレート、ＰＥＧ－ジチオール、ＰＥＧ－エポキシド、ＰＥＧ－イソシアネート、ＰＥＧ－マレイミド、ポリアクリル酸（polyacrylic acid、ＰＡＡ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（polystyrene、ＰＳ）、ポリスチレンスルホネート（polystyrene sulfonate、ＰＳＳ）、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidone、ＰＶＰＯＮ）、Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ（乳酸）（poly(lactic acid)、ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（polycaprolactone、ＰＣＬ）、ポリ（ビニルスルホン酸）（ＰＶＳＡ）、ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）、ポリリジン、寒天、アガロース、ヘパリン、硫酸化アルギン酸、硫酸デキストラン、ヒアルロナン、ペクチン、カラギーナン、ゼラチン、キトサン、セルロース、コラーゲン、ビスアクリルアミド、ジアクリレート、ジアリルアミン、トリアリルアミン、ジビニルスルホン、ジエチレングリコールジアリルエーテル、エチレングリコールジアクリレート、ポリメチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、トリメチロプロポアントリメタクリレート、エトキシル化トリメチロールトリアクリレート、又はエトキシル化ペンタエリスリトールテトラアクリレート、又はこれらの組み合わせ若しくは混合物が含まれる。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、アルギネート、アクリルアミド、又はＰＥＧベースの材料である。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、アクリレート－ジチオール、エポキシド－アミン反応化学を有するＰＥＧベースの材料である。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、ＰＥＧ－マレイミド／ジチオール油、ＰＥＧ－エポキシド／アミン油、ＰＥＧ－エポキシド／ＰＥＧ－アミン、又はＰＥＧ－ジチオール／ＰＥＧ－アクリレートを含むポリマーシェルを形成する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲル材料は、細胞内生体分子を損傷する可能性があるフリーラジカルの生成を回避するために選択される。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルポリマーは、水などの６０～９０％の流体、及び１０～３０％のポリマーを含む。特定の実施形態では、ヒドロゲルの含水量は、約７０～８０％である。本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、数値を修飾する場合、数値に生じ得る変動を指す。例えば、変動は、特定の基質又は成分の製造における違いによって生じ得る。一実施形態では、「約」という用語は、列挙された数値の１％、５％、又は最大１０％以内を意味する。
いくつかの実施形態では、ビーズは、ヒドロゲル組成物から調製されたポリマーシェルを有する。本明細書で使用される場合、「ヒドロゲル」という用語は、有機ポリマー（天然又は合成）が共有結合、イオン結合、又は水素結合を介して架橋されて、水分子を捕捉してゲルを形成する三次元開放格子構造体を生成するときに形成される物質を指す。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、生体適合性ヒドロゲルであり得る。本明細書で使用される場合、「生体適合性ヒドロゲル」という用語は、生物学的材料に対して毒性でないゲルを形成するポリマーを指す。いくつかの実施形態では、ヒドロゲル材料には、アルギネート、アクリルアミド、又はポリ－エチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ－アクリレート、ＰＥＧ－アミン、ＰＥＧ－カルボキシレート、ＰＥＧ－ジチオール、ＰＥＧ－エポキシド、ＰＥＧ－イソシアネート、ＰＥＧ－マレイミド、ポリアクリル酸（polyacrylic acid、ＰＡＡ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（polystyrene、ＰＳ）、ポリスチレンスルホネート（polystyrene sulfonate、ＰＳＳ）、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidone、ＰＶＰＯＮ）、Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ（乳酸）（poly(lactic acid)、ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（polycaprolactone、ＰＣＬ）、ポリ（ビニルスルホン酸）（ＰＶＳＡ）、ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）、ポリリジン、寒天、アガロース、ヘパリン、硫酸化アルギン酸、硫酸デキストラン、ヒアルロナン、ペクチン、カラギーナン、ゼラチン、キトサン、セルロース、コラーゲン、ビスアクリルアミド、ジアクリレート、ジアリルアミン、トリアリルアミン、ジビニルスルホン、ジエチレングリコールジアリルエーテル、エチレングリコールジアクリレート、ポリメチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、トリメチロプロポアントリメタクリレート、エトキシル化トリメチロールトリアクリレート、又はエトキシル化ペンタエリスリトールテトラアクリレート、又はこれらの組み合わせ若しくは混合物が含まれる。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、アルギネート、アクリルアミド、又はＰＥＧベースの材料である。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、アクリレート－ジチオール、エポキシド－アミン反応化学を有するＰＥＧベースの材料である。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、ＰＥＧ－マレイミド／ジチオール油、ＰＥＧ－エポキシド／アミン油、ＰＥＧ－エポキシド／ＰＥＧ－アミン、又はＰＥＧ－ジチオール／ＰＥＧ－アクリレートを含むポリマーシェルを形成する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲル材料は、細胞内生体分子を損傷する可能性があるフリーラジカルの生成を回避するために選択される。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルポリマーは、水などの６０～９０％の流体、及び１０～３０％のポリマーを含む。特定の実施形態では、ヒドロゲルの含水量は、約７０～８０％である。本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、数値を修飾する場合、数値に生じ得る変動を指す。例えば、変動は、特定の基質又は成分の製造における違いによって生じ得る。一実施形態では、「約」という用語は、列挙された数値の１％、５％、又は最大１０％以内を意味する。
【0025】
本明細書で使用される場合、ポリマーシェルは、ビーズのポリマー表面である。本明細書に記載のビーズの性質のために、連続性粒子は、複数のアッセイ後に遺伝物質を保持することができ、物理的力によって、切断化学物質によって、又はポリマーシェルの厚さに応じて浸透圧不均衡をもたらすことによって放出することができる。
【0026】
ヒドロゲルは、親水性バイオポリマー又は合成ポリマーを架橋することによって調製され得る。したがって、いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは架橋剤を含み得る。本明細書で使用される場合、「架橋剤」という用語は、適切なベースモノマーと反応したときに三次元ネットワークを形成することができる分子を指す。１つ以上の架橋剤を含み得るヒドロゲルポリマーの例としては、ヒアルロナン、キトサン、寒天、ヘパリン、硫酸塩、セルロース、アルギネート（硫酸化アルギン酸を含む）、コラーゲン、デキストラン（硫酸デキストランを含む）、ペクチン、カラギーナン、ポリリジン、ゼラチン（Ａタイプゼラチンを含む）、アガロース、（メタ）アクリレート－オリゴラクチド－ＰＥＯ－オリゴラクチド－（メタ）アクリレート、ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯコポリマー（Pluronic）、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（メタクリレート）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ＰＬ（Ｇ）Ａ－ＰＥＯ－ＰＬ（Ｇ）Ａコポリマー、ポリ（エチレンイミン）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－チオール、ＰＥＧ－アクリレート、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン、ＰＥＧ、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリアクリル酸、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（ビニルスルホン酸）（ＰＶＳＡ）、ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）、ビスアクリルアミド、ジアクリレート、ジアリルアミン、トリアリルアミン、ジビニルスルホン、ジエチレングリコールジアリルエーテル、エチレングリコールジアクリレート、ポリメチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、トリメチロプロポアントリメタクリレート、エトキシル化トリメチロールトリアクリレート、又はエトキシル化ペンタエリスリトールテトラアクリレート、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、例えば、組み合わせは、ポリマー及び架橋剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－チオール／ＰＥＧ－アクリレート、アクリルアミド／Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン（ＢＡＣｙ）、又はＰＥＧ／ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリマーシェルは、４アームポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、４アームポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ＰＥＧ－アクリレート、ＰＥＧ－アミン、ＰＥＧ－カルボキシレート、ＰＥＧ－ジチオール、ＰＥＧ－エポキシド、ＰＥＧ－イソシアネート、及びＰＥＧ－マレイミドからなる群より選択される。
【0027】
いくつかの実施形態では、架橋剤は、即時型架橋剤又は遅延型架橋剤である。即時型架橋剤は、ヒドロゲルポリマーを即座に架橋する架橋剤であり、本明細書ではクリックケミストリーとも称される。即時型架橋剤には、ジチオール油＋ＰＥＧ－マレイミド又はＰＥＧエポキシド＋アミン油が含まれ得る。遅延型架橋剤は、ヒドロゲルポリマーを緩やかに架橋する架橋剤であり、ＰＥＧ－エポキシド＋ＰＥＧ－アミン又はＰＥＧ－ジチオール＋ＰＥＧ－アクリレートを含み得る。遅延型架橋剤は、架橋するのに数時間超かかる場合があり、例えば、架橋するのに２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２時間超を要し得る。本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、連続性粒子は、即時型架橋剤によって製剤化され、それにより、遅延型架橋剤と比較して核酸分子の状態をより良好に保存する。
【0028】
いくつかの実施形態では、架橋剤は、ヒドロゲルポリマーにおいてジスルフィド結合を形成し、それによってヒドロゲルポリマーを連結する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルポリマーは、細孔（例えば、多孔性ヒドロゲルマトリックス）を有するヒドロゲルマトリックスを形成する。これらの細孔は、ポリマーシェル内に抽出された核酸などの十分に大きい粒子を保持することができるが、試薬などの他の材料が細孔を通過し、それにより、液滴に出入りすることを可能にする。いくつかの実施形態では、ポリマーシェルの細孔径は、ポリマー濃度の架橋剤の濃度に対する比率を変動させることによって微調整される。いくつかの実施形態では、ポリマー対架橋剤の比は、３０：１、２５：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、若しくは１：３０であるか、又は前述の比のいずれか２つによって規定される範囲内の比である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプライマー、又は荷電化学基などの更なる機能をポリマーマトリックスに移植して、異なる用途の要件を満たすことができる。
【0029】
本明細書で使用される場合、「多孔度」という用語は、開放空間、例えば、細孔又は他の開口部から構成されるヒドロゲルの体積率（無次元）を意味する。ゆえに、多孔性は、材料中の空隙を測定し、０～１００％（又は０～１）の割合のような、全体積に対する空隙体積の分率である。ヒドロゲルの多孔度は、０．５～０．９９、約０．７５～約０．９９、又は約０．８～約０．９５の範囲であり得る。
【0030】
ポリマーシェルは、核酸を同時に保持しながら試薬の十分な拡散を可能にする任意の細孔径を有することができる。本明細書で使用される場合、「細孔径」という用語は、細孔の断面の直径又は有効直径を指す。「細孔径」という用語はまた、複数の細孔の測定値に基づく、細孔の断面の平均直径又は平均有効直径を指すことができる。円形ではない断面の有効直径は、非円形断面と同じ断面積を有する円形断面の直径に等しい。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、ヒドロゲルが水和されたときに膨潤し得る。次いで、細孔径のサイズがヒドロゲルの含水量に応じて変化し得る。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルの細孔は、ヒドロゲルの完全性を保持するが、試薬を通過させるのに十分なサイズの細孔を有することができる。いくつかの実施形態では、ポリマーシェルの内部は、水性環境である。いくつかの実施形態では、ポリマーシェルと会合した核酸分子は、ポリマーシェルと相互作用しない、及び／又はポリマーシェルと接触しない。
【0031】
いくつかの実施形態では、連続性粒子は、約２０μｍ～約２００μｍ、例えば、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００μｍの直径、又は前述の値のうちのいずれか２つによって規定される範囲内の直径を有する。連続性粒子のサイズは、環境要因により変化し得る。いくつかの実施形態では、連続性粒子は、連続油相から分離されて水相に浸漬されると膨張する。いくつかの実施形態では、連続性粒子の膨張により、遺伝物質に対するアッセイを行う効率が高まる。いくつかの実施形態では、連続性粒子の膨張により、さもなければ現在の細胞ベースのアッセイでは制限され得る、ＰＣＲ中に増幅されるインデックス付きインサートのためのより大きい環境が作り出される。
【0032】
いくつかの実施形態では、細孔径は、抽出された核酸がポリマーシェルを通って拡散することを可能にする。いくつかの実施形態では、連続性粒子の細孔径は、架橋化学を変化させることによって制御することができる。最終架橋細孔径は、連続性粒子の環境を変化させることによって、例えば、塩濃度、ｐＨ、又は温度を変化させ、それにより、固定された分子を連続性粒子から放出させることによって更に変化する可能性がある。
【0033】
いくつかの実施形態では、架橋剤は、可逆的架橋剤である。いくつかの実施形態では、可逆的架橋剤は、ヒドロゲルポリマーを可逆的に架橋することができ、開裂剤の存在下では架橋され得ない。いくつかの実施形態では、架橋剤は、還元剤の存在によって、高温によって、又は電界によって開裂され得る。いくつかの実施形態では、可逆的架橋剤は、Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン、ポリアクリルアミドゲルの可逆的架橋剤であってもよく、ジスルフィド連結は、好適な還元剤の存在下で破壊され得る。ビーズの多孔度を温度又は化学的手段によって増加させ、それにより、架橋剤と還元剤との接触を解放し、架橋剤のジスルフィド結合を切断し、ビーズを分解することができる。ビーズが分解し、その中に保持された核酸などの内容物を放出する。いくつかの実施形態では、架橋剤は、温度を５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００℃超に上昇させることによって切断される。いくつかの実施形態では、架橋剤は、ビーズを還元剤と接触させることによって切断される。いくつかの実施形態では、還元剤には、ホスフィン化合物、水溶性ホスフィン、窒素含有ホスフィン、並びにそれらの塩及び誘導体、ジチオエリスリトール（dithioerythritol、ＤＴＥ）、ジチオスレイトール（dithiothreitol、ＤＴＴ）（２，３－ジヒドロキシ－１，４－ジチオールブタンのそれぞれ、シス及びトランス異性体）、２－メルカプトエタノール若しくはβ－メルカプトエタノール（β-mercaptoethanol、ＢＭＥ）、２－メルカプトエタノール若しくはアミノエタンチオール、グルタチオン、チオグリコレート若しくはチオグリコール酸、２，３－メルカプトプロパノール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（tris(2-carboxyethyl)phosphine、ＴＣＥＰ）、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン（tris(hydroxymethyl)phosphine、ＴＨＰ）、又はＰ－［トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン］プロピオン酸（[tris(hydroxymethyl)phosphine]propionic acid、ＴＨＰＰ）が含まれる。
【0034】
いくつかの実施形態では、拡散を増加させるために温度を上昇させること又は還元剤と接触させることにより、架橋剤が分解する。
【0035】
いくつかの実施形態では、架橋剤の架橋により、連続性粒子中に細孔が確立される。いくつかの実施形態は、ポリマーシェル中の細孔径は調節可能であり、トランスポソームと会合するように製剤化される。オンビーズトランスポソームは、約３００塩基対を超える核酸と会合するように製剤化される。いくつかの実施形態では、オンビーズトランスポソーム及び核酸は、様々な反応を行うために様々な試薬に供され得る。いくつかの実施形態では、試薬には、遺伝物質を処理するための試薬、例えば、細胞から核酸を単離するための試薬、核酸を増幅若しくは配列決定するための試薬、又は核酸ライブラリを調製するための試薬が含まれる。いくつかの実施形態では、試薬には、例えば、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ（例えば、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｕポリメラーゼ）、トランスポゼース（例えば、Ｔｎ５）、プライマー（例えば、Ｐ５及びＰ７アダプター配列）、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチドトリホスフェート、緩衝剤、又は二価カチオンが挙げられる。
【0036】
連続性粒子を作製する方法
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、トランスポソームが会合した連続性粒子を作製する方法に関する。いくつかの実施形態では、連続性粒子は、マイクロ流体デバイスを必要とすることなく、マイクロウェル／マイクロアレイ法又は顕微解剖法などの静的手段によって調製される。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の連続性粒子は、デバイスフリーの方法によって調製される。重合の開始は、モノマー単位上の活性基と、膜タンパク質、グリカン、又は他の小分子の特定の部分との化学反応によって起こり得る。モノマー重合の最初の工程の後に、静電気力又は疎水性力のいずれかによって促進される１回又は数回のモノマー単位沈着が続き得る。モノマー層のうちのいくつかは、トランスポソームとの特異的会合のために後に使用することができるビオチン又は他のリガンドなどの官能基を含むことができる。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、トランスポソームが会合した連続性粒子を作製する方法に関する。いくつかの実施形態では、連続性粒子は、マイクロ流体デバイスを必要とすることなく、マイクロウェル／マイクロアレイ法又は顕微解剖法などの静的手段によって調製される。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の連続性粒子は、デバイスフリーの方法によって調製される。重合の開始は、モノマー単位上の活性基と、膜タンパク質、グリカン、又は他の小分子の特定の部分との化学反応によって起こり得る。モノマー重合の最初の工程の後に、静電気力又は疎水性力のいずれかによって促進される１回又は数回のモノマー単位沈着が続き得る。モノマー層のうちのいくつかは、トランスポソームとの特異的会合のために後に使用することができるビオチン又は他のリガンドなどの官能基を含むことができる。
【0037】
いくつかの実施形態では、連続性粒子は、ボルテックス支援エマルジョン、マイクロ流体液滴生成、又はバルブベースのマイクロ流体技術などの動的手段によって調製される。本明細書で使用される場合、ボルテックス支援エマルジョンとは、チューブ、バイアル、又は反応容器などの容器内でヒドロゲルポリマーをトランスポソームとボルテックスすることを指す。成分は、例えば手動又は機械的ボルテックス又は振盪によって混合することができる。いくつかの実施形態では、手動混合により、直径２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００μｍのサイズ、又は前述の値のうちのいずれか２つによって規定される範囲内のサイズを有する、トランスポソームと会合するビーズがもたらされる。いくつかの実施形態では、ビーズのサイズは不均一であり、したがってビーズのサイズは、様々な直径のビーズを含む。
【0038】
いくつかの実施形態では、連続性粒子は、マイクロ流体流技法によって調製される。マイクロ流体流は、図１に示されるように、支援ゲルエマルジョン生成のためのマイクロ流体デバイスの使用を含む。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、所望のサイズの連続性粒子を生成するように構成され、かつ所望の密度でトランスポソームと会合するように構成されたマイクロチャネルを含む。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００μｍの高さ、又は前述の値のうちのいずれか２つによって規定される範囲内の高さを有する。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、１つ以上のチャネルを含む。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、ポリマーに導入されたトランスポソーム又は核酸などの連続性粒子と会合する試薬を導入するためのチャネル、架橋剤を導入するためのチャネル、及び非混和性流体のためのチャネルを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のチャネルの幅は、同一である。いくつかの実施形態では、１つ以上のチャネルの幅は、異なる。いくつかの実施形態では、１つ以上のチャネルの幅は、２０、３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、若しくは１５０μｍ、又は前述の値のうちのいずれか２つによって規定される範囲内の幅である。チャネルの幅及び高さは、必ずしも本明細書に記載の値に制限されず、当業者であれば、連続性粒子のサイズがマイクロ流体デバイスのチャネルのサイズに部分的に依存することを認識するであろう。したがって、連続性粒子のサイズは、部分的にチャネルのサイズを修正することによって調整され得る。マイクロ流体デバイスのサイズ及びチャネルの幅に加えて、チャネルの流量も連続性粒子のサイズに影響を及ぼし得、各連続性粒子と会合したトランスポソームの密度にも影響を及ぼし得る。
【0039】
いくつかの実施形態では、マイクロ流体チャネルを通るポリマー中のトランスポソームの流速は、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、若しくは１５０μＬ／分、又は前述の値のうちのいずれか２つによって規定される範囲内の速度である。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チャネル中の架橋剤の流速は、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、若しくは１５０μＬ／分、又は前述の値のうちのいずれか２つによって規定される範囲内の速度である。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チャネル中の不混和性流体の流速は、２０、３０、５０、８０、１００、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、若しくは４００μＬ／分、又は前述の値のうちのいずれか２つによって規定される範囲内の速度である。いくつかの実施形態では、ポリマーと混合されたトランスポソームと架橋剤は、不混和性流体の上流のマイクロ流体液滴生成器内で互いに接触する。架橋剤と接触すると連続性粒子が生じ始め、トランスポソームと会合する。生じた連続性粒子は、マイクロ流体液滴生成器を通ってスペーサ油及び／又は架橋油などの不混和性流体中に不混和性流体の流速未満の流速で流れ続け、それにより、液滴が形成される。いくつかの実施形態では、不混和性流体は、図１に示されるように、例えば、スペーサ油及び架橋剤油として、２段階で導入される。いくつかの実施形態では、スペーサ油は、鉱油、炭化水素油、シリコーン油、フルオロカーボン油、若しくはポリジメチルシロキサン油、又はそれらの混合物である。本明細書で使用されるスペーサ油は、チャネル水－油相間でのポリマーの架橋を回避するために使用される。
【0040】
いくつかの実施形態では、連続性粒子は、即時型架橋剤で架橋することによって即座に形成される。例えば、トランスポソームは、マイクロ流体液滴生成器を使用して４アームＰＥＧマレイミド又はエポキシドなどのポリマーを有するビーズと会合することができ、鉱油又はＨＦＥ－７５００などのフルオロカーボン油などの油に溶解可能な架橋剤を使用して即座に架橋されて、架橋油を形成することができる。いくつかの実施形態では、架橋油は、トルエン、３，４ジチオール、２，４ジアミノトルエン、ヘキサンジチオールの場合のようにアミン官能基、ジチオールを有するトルエン、アセトン、テトラヒドロフランを含み、これらは、生じた液滴中に容易に拡散し、それにより、連続性粒子を即座に架橋する。
【0041】
いくつかの実施形態では、連続性粒子は、均一なサイズ分布で製剤化される。いくつかの実施形態では、連続性粒子のサイズは、マイクロ流体デバイスのサイズ、１つ以上のチャネルのサイズ、又はマイクロ流体チャネルを通る流速を調節することによって微調整される。いくつかの実施形態では、結果として得られた連続性粒子は、２０～２００μｍの範囲の直径、例えば、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００μｍの直径、又は前述の値のいずれか２つによって規定される範囲内の直径を有する。
【0042】
いくつかの実施形態では、連続性粒子のサイズ及び均一性は、粒子形成前のヒドロゲルポリマーを、イソプロピルアルコールを含むアルコールなどの流体改質剤と接触させることによって更に制御することができる。イソプロピルアルコールの不在下では、連続性粒子は、イソプロピルアルコールの存在下で形成される連続性粒子よりも大きい直径で形成される。イソプロピルアルコールは、ヒドロゲルポリマーの流体特性に影響を及ぼし、連続性粒子のサイズの調節を可能にする。
【0043】
当業者によって認識されるように、図１に示されるマイクロ流体デバイスは、３チャネルマイクロ流体デバイスの例示であるが、このマイクロ流体デバイスを、特定のサイズの連続性粒子を生成するように、又は様々なヒドロゲル材料若しくは架橋剤から形成される連続性粒子を生成するように、修正してもよい、変動させてもよい、又は変化させてもよい。
【0044】
いくつかの実施形態では、連続性粒子は、ボルテックス支援エマルジョンによって調製されたものであるか、又はマイクロ流体慣性流支援エマルジョンによって調製されたものである。いくつかの実施形態では、連続性粒子と会合したトランスポソームの密度は、投入された試料中のトランスポソームを含む溶液を希釈又は濃縮することによって制御することができる。トランスポソームを含む試料はヒドロゲルポリマーと混合され、トランスポソームを含むヒドロゲルポリマーは、本明細書に記載のボルテックス支援エマルジョン又はマイクロ流体流支援エマルジョンを受ける。
【0045】
いくつかの実施形態では、連続性粒子は、ヌクレオチドで官能化されている。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド又はポリＴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、連続性粒子に結合され、官能化された連続性粒子は、目的とするヌクレオチドの標的捕捉のために使用することができる。
【0046】
いくつかの実施形態では、トランスポソームと会合した連続性粒子は、行われているアッセイに基づいて複数回の緩衝液洗浄、複数回の試薬交換、及び複数の分析を含む、単一の連続性粒子に対する複数の同時アッセイの実施を維持するために硬化される。表面開始重合技法、ボルテックス、又はマイクロ流体技法を含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって調製された、製剤化された連続性粒子は、複数の同時アッセイを行うためのパターン化されたフローセル、マイクロアレイ、ウェルを有するプレート、エッチングされた表面、マイクロ流体チャネル、ビーズ、カラム、又は他の表面上に装填又は播種され得る。
【0047】
連結ロングリードインデックス付け方法
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、オンビーズタグメント化された連続性粒子を使用して連結ロングリードインデックス付けを行う方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載の連続性粒子を得ることと、粒子をトランスポソーム及び核酸分子と会合させることと、オンビーズタグメンテーションを行うことと、オンタグメント化されたビーズの分配を行うことと、インデックス付きＰＣＲとを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ビーズ上での連続性保存転位シーケンシング（ＣＰＴ－ｓｅｑ）（工程１）、分配／インデックス付きＰＣＲ（工程２）、及びインデックス付き連結リード（工程３）を含む、連結ロングリードインデックス付けを行うための例示的な方法の概略図を示す、図２に概説される工程を含む。工程１のビーズを、トランスポゾン及びトランスポザーゼを含むトランスポソームと会合させる。核酸分子がトランスポザーゼと会合し、タグメンテーション、例えば、ＣＰＴ－ｓｅｑを受ける。タグメンテーション後、オンビーズタグメンテーション産物が液滴生成器又は他の方法を使用して分配される。ビーズ上の転位ＤＮＡのかかる分配された試料は、溶液プライマー及び転位ＤＮＡをインデックス付けするインデックス付きプライマービーズに供され得る。いくつかの実施形態では、インデックス付きＤＮＡがインデックス付きＰＣＲに供され、インデックス付き連結リードが得られる。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、オンビーズタグメント化された連続性粒子を使用して連結ロングリードインデックス付けを行う方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載の連続性粒子を得ることと、粒子をトランスポソーム及び核酸分子と会合させることと、オンビーズタグメンテーションを行うことと、オンタグメント化されたビーズの分配を行うことと、インデックス付きＰＣＲとを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ビーズ上での連続性保存転位シーケンシング（ＣＰＴ－ｓｅｑ）（工程１）、分配／インデックス付きＰＣＲ（工程２）、及びインデックス付き連結リード（工程３）を含む、連結ロングリードインデックス付けを行うための例示的な方法の概略図を示す、図２に概説される工程を含む。工程１のビーズを、トランスポゾン及びトランスポザーゼを含むトランスポソームと会合させる。核酸分子がトランスポザーゼと会合し、タグメンテーション、例えば、ＣＰＴ－ｓｅｑを受ける。タグメンテーション後、オンビーズタグメンテーション産物が液滴生成器又は他の方法を使用して分配される。ビーズ上の転位ＤＮＡのかかる分配された試料は、溶液プライマー及び転位ＤＮＡをインデックス付けするインデックス付きプライマービーズに供され得る。いくつかの実施形態では、インデックス付きＤＮＡがインデックス付きＰＣＲに供され、インデックス付き連結リードが得られる。
【0048】
連続性粒子（本明細書では連続性ビーズとも称される）に加えて、プライマービーズも調製した。プライマービーズは、連続性粒子に関して本明細書に記載される材料、組成物、及び製剤のヒドロゲルビーズを含むことができるが、トランスポソームと会合する代わりに、プライマー（Ｐ５プライマーなど）、バーコード、及びアダプター（Ｎｅｘｔｅｒａアダプターなど）を含む。単一のプライマービーズは、分配された液滴中の単一の連続性粒子と一緒に、かつアダプター（Ｂ１５アダプターなど）及びプライマー（Ｐ７プライマーなど）を含み得るプライマー溶液ミックスと一緒に分配され得る。分配された液滴は、９００，０００を超えるインデックス付きバーコードのビーズプールとともに、バーコードインデックス付けのために使用され得る。
【0049】
いくつかの実施形態では、本方法は、非バーコード化転位を使用して、ビーズ上でのＣＰＴ－ｓｅｑ、液滴分配、及びインデックス付きプライマープールインデックス付けを含む、ロングリードインデックス付けを行うための例示的な方法の概略図を示す図３に概説される工程を含む。
【0050】
いくつかの実施形態では、連続性粒子は、本明細書に記載されるように調製され、液滴は、フローセルデバイス、プレートのウェル、スライド、又はパターン化された表面などの表面上に分配される。いくつかの実施形態では、表面は、フローセルデバイスであり、フローセルデバイス中の空間インデックス付けのための連続性粒子の分布のためのアレイ中にマイクロウェル又はマイクロピラーを有するインサートを含む。いくつかの実施形態では、液滴は、各ウェルに単一の連続性粒子を有するウェルプレート上に分配される。ウェルプレートは、例えば、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、１５３６ウェルプレート、３４５６ウェルプレート、若しくは９６００ウェルプレート、又はプレート中の任意の数のウェルを含み得、単一の連続性粒子を有し、核酸インデックス付けのために連続性粒子を分配して液滴インデックス付けする。いくつかの実施形態では、連続性粒子は、例えば、緩衝液洗浄、溶解、ＤＮＡ分析、ＲＮＡ分析、タンパク質分析、タグメンテーション、核酸増幅、核酸配列決定、ＤＮＡライブラリ調製、トランスポザーゼ接近可能クロマチン使用シーケンシングのためのアッセイ（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）、連続性保存転位シーケンシング（ＣＰＴ－ｓｅｑ）、又は順次行われるそれらの任意の組み合わせを含む、複数の同時アッセイに順次供される。
【0051】
いくつかの実施形態では、トランスポソームと会合した連続性粒子は、目的とする核酸をそれに会合させるように処理される。いくつかの実施形態では、目的とする核酸は、細胞から単離される。例えば、細胞は、溶解緩衝液と接触してもよい。本明細書で使用するとき、「溶解」は、細胞ＲＮＡ又はＤＮＡへのアクセス又はその放出を促進する、細胞壁又はウイルス粒子に対する摂動又は改変を意味する。細胞壁の完全な破壊と破損のどちらも、溶解の必須要件ではない。「溶解緩衝液」という用語は、少なくとも１つの溶解剤を含有する緩衝液を意味する。典型的な酵素溶解剤には、リゾチーム、グルコラーゼ、チモラーゼ、リチカーゼ、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＥ、並びにウイルスエンドリシン及びエキソリシンが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、例えば、細胞の溶解は、リゾチーム及びプロテイナーゼＫなどの溶解剤を導入することによって行われ得る。その後、細胞由来のｇＤＮＡが連続性粒子と会合する。いくつかの実施形態では、溶解処理後、単離された核酸は、連続性粒子上に保持され、更なる処理のために使用され得る。
【0052】
ＤＮＡ分析は、ＤＮＡを増幅、配列決定、又は他の方法で分析するために使用される任意の技術を指す。ＤＮＡ増幅は、ＰＣＲ技術又はパイロシーケンシングを使用して達成することができる。ＤＮＡ分析はまた、非標的化非ＰＣＲベースのＤＮＡ配列決定（例えば、メタゲノミクス）技術を含み得る。非限定的な例として、ＤＮＡ分析としては、１６Ｓ ｒＤＮＡ（リボソームＤＮＡ）のハイパー可変領域を配列決定すること、及びＤＮＡを介した種識別のための配列決定を使用することを挙げることができる。
【0053】
ＲＮＡ分析は、ＲＮＡを増幅、配列決定、又は他の方法で分析するために使用される任意の技術を指す。ＤＮＡを分析するために使用されるのと同じ技術を使用して、ＲＮＡを増幅及び配列決定することができる。ＤＮＡよりも安定でないＲＮＡは、刺激に応答したＤＮＡの翻訳である。したがって、ＲＮＡ分析は、コミュニティの代謝的に活性なメンバーのより正確な画像を提供することができ、試料中の生物のコミュニティ機能についての情報を提供するために使用され得る。核酸配列決定は、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸分子の配列中のヌクレオチドの順序を決定するための配列決定の使用を指す。
【0054】
本明細書で使用される「配列決定」という用語は、ポリヌクレオチドの少なくとも１０個の連続するヌクレオチドの同定（例えば、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、又は少なくとも２００個以上の連続するヌクレオチドの同定）が得られる方法を指す。
【0055】
「次世代シーケンシング」又は「ハイスループットシーケンシング」又は「ＮＧＳ」という用語は、一般に、大規模並列シグネチャシーケンシング、ハイスループットシーケンシング、ライゲーションによる配列決定（例えば、ＳＯＬｉＤシーケンシング）、プロトンイオン半導体シーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、単一分子シーケンシング、及びナノポアシーケンシングを含むがこれらに限定されないハイスループットシーケンシング技術を指し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、又はＲｏｃｈｅなどによって現在採用されている合成による並行シーケンシング又はライゲーションによるシーケンシングプラットフォームを指す場合もある。次世代シーケンシング方法は、ナノポアシーケンシング方法、又はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって商業化されたＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術若しくはＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって商業化された単一分子蛍光ベースの方法などの電子検出ベースの方法も含み得る。
【0056】
タンパク質分析は、タンパク質の研究を指し、プロテオーム分析、目的とするタンパク質の翻訳後修飾の決定、タンパク質発現レベルの決定、又は他のタンパク質若しくは核酸を含む他の分子とのタンパク質相互作用の決定を含み得る。
【0057】
本明細書で使用される場合、「タグメンテーション」という用語は、トランスポゾン末端配列を含むアダプターと複合体化したトランスポザーゼ酵素を含むトランスポソーム複合体によるＤＮＡの修飾を指す。タグメンテーションにより、ＤＮＡの断片化と、二重断片の両方の鎖の５’末端へのアダプターのライゲーションが同時にもたらされる。トランスポザーゼ酵素を除去するための精製工程後、追加の配列を、例えば、ＰＣＲ、ライゲーション、又は当業者に既知の任意の他の好適な方法によって、適応断片の末端に付加することができる。
【0058】
本発明の方法は、トランスポザーゼ末端配列を受容し、かつ標的核酸を断片化することができ、転移末端を結合するが、非転移末端は結合しない、いずれのトランスポザーゼも使用することができる。「トランスポソーム」は、少なくともトランスポザーゼ酵素及びトランスポザーゼ認識部位で構成されている。「トランスポソーム」と呼ばれるいくつかのかかる系では、トランスポザーゼは、転位反応を触媒することができるトランスポゾン認識部位と機能的複合体を形成することができる。トランスポザーゼ又はインテグラーゼは、トランスポザーゼ認識部位に結合し、「タグメンテーション」と呼ばれることもあるプロセスでトランスポザーゼ認識部位を標的核酸に挿入し得る。一部のそのような挿入イベントでは、トランスポザーゼ認識部位の一本鎖は、ターゲット核酸に移され得る。
【0059】
標準の試料調製方法では、各鋳型は、インサートのいずれかの末端にアダプターを含み、多くの場合、ＤＮＡ又はＲＮＡの修飾及び修飾反応の所望の産物の精製の両方を行うためにいくつかの工程が必要とされる。これらの工程は、適合した断片をフローセルに添加する前に溶液中で実行され、それらは、表面に共有結合したプライマーの末端にハイブリダイズされた断片をコピーするプライマー伸長反応によって表面に結合される。その後、これらの「シーディング（seeding）」鋳型は、数回の増幅サイクルを経てコピーされた鋳型のモノクローナルクラスターを生じさせる。
【0060】
クラスター形成及びシーケンシングの準備が整った溶液中においてアダプターで修飾されたテンプレートにＤＮＡを転換するために必要な工程の数は、トランスポザーゼに媒介される断片化及びタグ付けの使用によって最小限に抑えることができる。
【0061】
いくつかの実施形態では、例えば、Ｎｅｘｔｅｒａ（商標）ＤＮＡ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）のワークフローで例示されるように、トランスポゾンベースの技術をＤＮＡの断片化に利用することができ、ゲノムＤＮＡは、インプットＤＮＡを同時に断片化及びタグ付けする（「タグメンテーション」）操作されたトランスポソームによって断片化され、それによって、断片の末端に固有のアダプター配列を含む断片化された核酸分子の集団が生成され得る。
【0062】
いくつかの実施形態は、過剰活性Ｔｎ５トランスポザーゼ及びＴｎ５型トランスポザーゼ認識部位（Ｇｏｒｙｓｈｉｎ ａｎｄ Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：７３６７（１９９８））、又はＲ１及びＲ２末端配列を含むＭｕＡトランスポザーゼ及びＭｕトランスポザーゼ認識部位の使用を含むことができる（Ｍｉｚｕｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｃｅｌｌ，３５：７８５，１９８３、Ｓａｖｉｌａｈｔｉ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１４：４８９３，１９９５）。過剰活性Ｔｎ５トランスポザーゼと複合体を形成する例示的なトランスポザーゼ認識部位（例えば、ＥＺ Ｔｎ５（商標）Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ，Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）。
【0063】
本明細書で提供されるある特定の実施形態とともに使用することができる転位系の更なる例としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｔｎ５５２（Ｃｏｌｅｇｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：２３８４－８，２００１、Ｋｉｒｂｙ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１７３－８６，２００２）、Ｔｙ１（Ｄｅｖｉｎｅ ＆ Ｂｏｅｋｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：３７６５－７２，１９９４、及び国際公開第９５／２３８７５号）、トランスポゾンＴｎ７（Ｃｒａｉｇ，Ｎ Ｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７１：１５１２，１９９６、Ｃｒａｉｇ，Ｎ Ｌ，Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ：Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：２７－４８，１９９６）、Ｔｎ／Ｏ及びＩＳ１０（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：４９－８２，１９９６）、Ｍａｒｉｎｅｒトランスポザーゼ（Ｌａｍｐｅ Ｄ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１５：５４７０－９，１９９６）、Ｔｃ１（Ｐｌａｓｔｅｒｋ Ｒ Ｈ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：１２５－４３，１９９６）、Ｐ要素（Ｇｌｏｏｒ，Ｇ Ｂ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６０：９７－１１４，２００４）、Ｔｎ３（Ｉｃｈｉｋａｗａ ＆ Ｏｈｔｓｕｂｏ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１８８２９－３２，１９９０）、細菌挿入配列（Ｏｈｔｓｕｂｏ ＆ Ｓｅｋｉｎｅ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０４：１－２６，１９９６）、レトロウイルス（Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ ａｌ，．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８６：２５２５－９，１９８９）、及び酵母のレトロトランスポゾン（Ｂｏｅｋｅ ＆ Ｃｏｒｃｅｓ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：４０３－３４，１９８９）が挙げられる。更なる例としては、ＩＳ５、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、ＩＳ９１１、及びトランスポザーゼファミリー酵素の遺伝子操作バージョン（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００９）ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．５：ｅ１０００６８９．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｏｃｔ．１６、Ｗｉｌｓｏｎ Ｃ．ｅｔ ａｌ（２００７）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７１：３３２－５）が挙げられる。
【0064】
トランスポザーゼ接近可能クロマチン使用シーケンシングのためのアッセイ（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）とは、統合エピゲノム分析の迅速で高感度な方法を指す。ＡＴＡＣ－ｓｅｑは、オープンクロマチン部位を捕捉し、オープンクロマチン、ＤＮＡ結合タンパク質、個々のヌクレオソームのゲノム位置間の相互作用、及びヌクレオチド分解能を有するレギュラトリー領域におけるより高次のコンパクションを明らかにする。ヌクレオソームを厳密に回避する、許容できる、又はヌクレオソームと重複する傾向があるＤＮＡ結合因子のクラスが発見されている。ＡＴＡＣ－ｓｅｑを使用して、安静時のヒトＴ細胞の連続的な毎日のエピゲノムを測定し、標準的な採血を介してプロバンドから評価し、健康及び疾患を監視するための臨床的タイムスケールで個人のエピゲノムを読み取る実現可能性を実証した。より具体的には、ＡＴＡＣ－ｓｅｑは、ある細胞由来のクロマチンを挿入酵素複合体で処理して、ゲノムＤＮＡのタグ付き断片を生成することによって行われ得る。この工程では、クロマチンは、クロマチンのオープン領域でゲノムＤＮＡを切断し、断片の両端にアダプターを付加するＴｎ５又はＭｕＡなどの挿入酵素を使用してタグメント化される（例えば、同じ反応で断片化及びタグ付けされる）。
【0065】
場合によっては、クロマチンへの望ましい挿入レベル（例えば、開いた領域で平均して５０～２００塩基対ごとに起こる挿入）が得られるように条件を調整し得る。この方法で使用されるクロマチンは、任意の適切な方法によって作製され得る。いくつかの実施形態では、核は、単離され、溶解され得、クロマチンは、例えば、核エンベロープから更に精製され得る。他の実施形態では、クロマチンは、単離された核を反応緩衝液と接触させることによって単離され得る。これらの実施形態では、単離された核は、反応緩衝液（挿入酵素複合体及び他の必要な試薬を含む）と接触したときに溶解することができ、これにより、挿入酵素複合体がクロマチンにアクセスすることが可能になる。これらの実施形態では、本方法は、細胞の集団から核を単離すること、並びに単離された核をトランスポザーゼ及びアダプターと組み合わせることを含み得、この組み合わせは、核が溶解して当該クロマチンを放出すること、及びゲノムＤＮＡのアダプターでタグ付けされた断片の生成の両方をもたらす。クロマチンは、他の方法（例えば、ＣｈＩＰ－ＳＥＱ法）と同様に架橋を必要としない。
【0066】
クロマチンが断片化され、タグ付けされてゲノムＤＮＡのタグ付き断片が生成された後、アダプターでタグ付けされた断片の打ちの少なくともいくつかを配列決定して、複数の配列リードを生成する。断片は、任意の適切な方法を使用して配列決定され得る。例えば、断片は、Ｉｌｌｕｍｉｎａの可逆的ターミネータ法、Ｒｏｃｈｅのパイロシーケンシング法（４５４）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのライゲーションによるシーケンシング（ＳＯＬｉＤプラットフォーム）、又はＬｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔプラットフォームを使用して配列決定され得る。かかる方法の例は、以下の参考文献：Ｍａｒｇｕｌｉｅｓら（Ｎａｔｕｒｅ ２００５ ４３７：３７６－８０）、Ｒｏｎａｇｈｉら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６ ２４２：８４－９）、Ｓｈｅｎｄｕｒｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００５ ３０９：１７２８－３２）、Ｉｍｅｌｆｏｒｔら（Ｂｒｉｅｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２００９ １０：６０９－１８）、Ｆｏｘら（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５５３：７９－１０８）、Ａｐｐｌｅｂｙら（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５１３：１９－３９）、及びＭｏｒｏｚｏｖａら（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００８ ９２：２５５－６４）に記載されており、これらは、全ての出発生成物、ライブラリ調製のための方法、試薬、及び工程の各々での最終生成物を含む、方法及び方法の特定の工程の一般的な説明について、参照により本明細書に組み込まれる。明らかなように、選択された次世代シーケンシングプラットフォームと互換性のある順方向及び逆方向配列決定プライマー部位を、増幅工程中に断片の末端に付加することができる。特定の実施形態では、断片は、断片に付加されたタグにハイブリダイズするＰＣＲプライマーを使用して増幅され得、ＰＣＲに使用されるプライマーは、特定のシーケンシングプラットフォームと互換性のある５’尾部を有する。ＡＴＡＣ－ｓｅｑを実施する方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３８８２５号に記載されている。
【0067】
本明細書で使用される「クロマチン」という用語は、真核細胞の核に見られるような、タンパク質及びポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）を含む分子の複合体を指す。クロマチンは、一部は、ヌクレオソーム、ゲノムＤＮＡ、及び一般にゲノムＤＮＡに結合する他のＤＮＡ結合タンパク質（例えば転写因子）を形成するヒストンタンパク質で構成される。
【0068】
連続性保存転位シーケンシング（ＣＰＴ－ｓｅｑ）は、標的核酸に隣接する鋳型核酸断片の会合を維持するためにトランスポザーゼを使用することによって連続性情報を保存しながら配列決定する方法を指す。例えば、ＣＰＴは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸に関して実施され得る。ＣＰＴ核酸は、固有のインデックス又はバーコードを有する相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって捕捉され、固体支持体上に固定化され得る。いくつかの実施形態では、固体支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドは、バーコードに加えて、プライマー結合部位、一意の分子インデックスを更に含み得る。有利には、断片化された核酸の物理的近接性を維持するためのトランスポソームのそのような使用は、同じ元の分子、例えば染色体からの断片化された核酸が、固体支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドから同じ固有のバーコード及びインデックス情報を受け取る可能性を高める。これは、固有のバーコードを有する連続的に連結された配列決定ライブラリをもたらす。連続的に連結された配列決定ライブラリを配列決定して、連続配列情報を導き出すことができる。本明細書に記載の連続性粒子は、細胞から抽出された核酸にＣＰＴ－ｓｅｑを行うために、ＣＰＴ－ｓｅｑ試薬と接触してもよい。
【0069】
本明細書で使用される場合、「連続性情報」という用語は、共有情報に基づく２つ以上のＤＮＡ断片間の空間的関係を指す。情報の共有態様は、隣接、コンパートメント及び距離の空間的関係に関するものであり得る。これらの関係に関する情報は、ＤＮＡ断片に由来する配列リードの階層的アセンブリ又はマッピングを容易にする。従来のショットガン配列決定に関連して使用される伝統的なアセンブリ又はマッピング方法は、個々の配列リードが由来する２つ以上のＤＮＡ断片間の空間的関係に関する、個々の配列リードの相対的なゲノム起源又は座標を考慮しないため、この連続性情報は、そのようなアセンブリ又はマッピングの効率及び精度を改善する。
【0070】
したがって、本明細書に記載される実施形態によれば、連続情報を捕捉する方法は、隣接する空間的関係を決定するための短距離連続法、区画的空間関係を決定するための中間範囲連続法、又は距離空間関係を決定するための長距離連続法によって達成され得る。これらの方法は、ＤＮＡ配列のアセンブリ又はマッピングの精度及び品質を促進し、本明細書に記載されるような任意の配列決定法とともに使用し得る。
【0071】
連続性情報は、個々の配列リードが由来する２つ以上のＤＮＡ断片間の空間的関係に関する、個々の配列リードの相対的なゲノム起源又は座標を含む。いくつかの実施形態では、連続性情報は、非重複配列リードからの配列情報を含む。
【0072】
いくつかの実施形態では、標的核酸配列の連続性情報は、ハプロタイプ情報を示す。いくつかの実施形態では、標的核酸配列の連続性情報は、ゲノム変異体を示す。
【0073】
単一細胞コンビナトリアルインデックス付きシーケンシング（ＳＣＩ－ｓｅｑ）は、体細胞コピー数変異体検出のために数千のローパス単一細胞ライブラリを同時に作製するための配列決定法である。
【0074】
したがって、本明細書に記載のアッセイを含む複数の同時アッセイが、核酸を分析する目的のために、単独で又は任意の他のアッセイと組み合わせて、連続性粒子に行われ得る。
【0075】
インデックス付き連続性粒子は、ポスト／マイクロウェルのアレイを通して保持されたフローセル上に直接装填することもできる。インデックス付きライブラリは、連続性粒子から放出され（化学物質／温度放出）、フローセルに結合する。これにより、第１のレベルのインデックス付けが空間位置に由来し、次いで、次のレベルが単一の連続性粒子からのインデックス付きライブラリに由来する電動インデックス付けアプローチが可能になる。あるいは、連続性粒子から抽出されたインデックス付きライブラリを、フローセルに集合的に装填することができる。
【0076】
いくつかの実施形態では、連続性粒子は、核酸プロセシングのための１つ以上の試薬と接触する。いくつかの実施形態では、試薬には、溶解剤、核酸精製剤、ＤＮＡ増幅剤、タグメンテーション剤、ＰＣＲ剤、又は遺伝物質のプロセシングに使用される他の薬剤が含まれ得る。したがって、連続性粒子は、核酸の制御された反応のための微小環境を提供する。
【0077】
いくつかの実施形態では、全ＤＮＡライブラリ調製は、ｇＤＮＡ及びそのライブラリ産物をポリマーシェル内に保持しながら、多孔質ヒドロゲルを通過させることによる試薬の交換を複数回行うことにより、連続性粒子内で途切れなく達成することができる。ヒドロゲルは、異なる生化学反応を支持するように、最大９５℃まで数時間、高温に耐え得る。
【0078】
本明細書で使用される場合、「単離された」、「単離する」、「精製された」、「精製する」、「精製」という用語、及び本明細書で使用されるそれらの文法的等価物は、特に明記されない限り、試料から、又は材料が単離された供給源（例えば細胞）からの少なくとも１つの汚染物質（タンパク質及び／又は核酸配列など）の量の減少を指す。したがって、精製により、「富化」、例えば、試料中の所望のタンパク質及び／又は核酸配列の量の増加がもたらされる。
【0079】
核酸の溶解及び単離に続いて、特に単一細胞からの少量のＤＮＡを増幅するために広く使用されている技術である多置換増幅（ＭＤＡ）などの増幅を実施し得る。いくつかの実施形態では、核酸は、増幅され、配列決定され、又は核酸ライブラリの調製のために使用される。本明細書で使用される場合、核酸又は核酸反応に関して使用される「増幅する」又は「増幅された」、「増幅すること」という用語は、例えば、本発明の一実施形態による、標的核酸又は連続性粒子と会合した核酸などの特定の核酸のコピーを作製するインビトロ方法を指す。核酸を増幅する多くの方法が技術分野において公知であり、増幅反応には、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、多重アニーリング及びループ化による増幅サイクル（multiple annealing and looping based amplification cycle、ＭＡＬＢＡＣ）、ＮＡＳＢＡなどの転写媒介増幅法、ループ媒介増幅法（例えば、ループ形成配列を使用した「ＬＡＭＰ」増幅）が含まれる。増幅される核酸は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は修飾されたＤＮＡ及び／若しくはＲＮＡを含むＤＮＡとＲＮＡの混合物を含む、それらからなる、又はそれらに由来するＤＮＡであり得る。１つ又は複数の核酸分子の増幅から得られる産物（例えば「増幅産物」）は、出発核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその両方であるかどうかに関わらず、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのいずれか、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシド若しくはヌクレオチドの両方の混合物であり得るか、又は修飾されたＤＮＡ若しくはＲＮＡヌクレオシド若しくはヌクレオチドを含むことができる。「コピー」は、必ずしも標的配列に対する完全な配列相補性又は同一性を意味するわけではない。例えば、コピーは、デオキシイノシン又はデオキシウリジンなどのヌクレオチド類似体、意図的な配列改変（標的配列にハイブリダイズ可能であるが相補的ではない配列を含むプライマーを介して導入される配列改変など、及び／又は増幅中に起こる配列エラーを含むことができる。
【0080】
連続性粒子と会合した核酸は、当該技術分野で既知の任意の好適な増幅法に従って増幅することができる。いくつかの実施形態では、核酸は、連続性粒子上で増幅される。いくつかの実施形態では、連続性粒子は、固体支持体上に捕捉されて分解され、核酸が固体支持体上に放出され、核酸が固体支持体上で増幅される。
【0081】
本明細書に記載されるか、又は技術分野で一般的に公知の増幅方法のいずれかを、ユニバーサル又は標的特異的プライマーとともに利用して、核酸を増幅できることが理解されるであろう。増幅のための好適な方法には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，００３，３５４号に記載されているように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（strand displacement amplification、ＳＤＡ）、転写媒介増幅（transcription mediated amplification、ＴＭＡ）及び核酸配列ベースの増幅（nucleic acid sequence based amplification、ＮＡＳＢＡ）が含まれるが、これらに限定されない。上記の増幅方法を使用して、目的とする１つ以上の核酸を増幅することができる。例えば、マルチプレックスＰＣＲ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなどを含むＰＣＲを利用して、核酸を増幅することができる。いくつかの実施形態では、目的とする核酸に特異的に向けられるプライマーは、増幅反応に含まれる。
【0082】
核酸の増幅に好適な他の方法としては、オリゴヌクレオチド伸長及びライゲーション、ローリングサークル増幅（rolling circle amplification、ＲＣＡ）（参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５－２３２（１９９８））、並びにオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（oligonucleotide ligation assay、ＯＬＡ）技術（全て参照により組み込まれる、米国特許第７，５８２，４２０号、同第５，１８５，２４３号、同第５，６７９，５２４号、及び同第５，５７３，９０７号、欧州特許第０３２０３０８（Ｂ１）号、欧州特許第０３３６７３１（Ｂ１）号、欧州特許第０４３９１８２（Ｂ１）号、国際公開第９０／０１０６９号、国際公開第８９／１２６９６号、並びに国際公開第８９／０９８３５号を概ね参照されたい）を挙げることができる。これらの増幅方法は、核酸を増幅するように設計され得ることが理解されるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、増幅方法は、目的とする核酸に特異的に向けられるプライマーを含むライゲーションプローブ増幅又はオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）反応を含み得る。いくつかの実施形態では、増幅方法は、目的とする核酸に特異的に向けられ、ヒドロゲル細孔を通過することができるプライマーを含む、プライマー伸長ライゲーション反応を含み得る。目的とする核酸を増幅するように特別に設計することができるプライマー伸長及びライゲーションプライマーの非限定的な例として、増幅は、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５８２，４２０号及び同第７，６１１，８６９号に例示されるようなＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアッセイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）に使用されるプライマーを含み得る。記載の方法の各々において、核酸反応に関与する試薬及び成分は、核酸自体を連続性粒子中に保持しながら、連続性粒子の細孔を通過することができる。
【0083】
いくつかの実施形態では、核酸は、それぞれの内容が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の開示によって例示されるように、クラスター増幅法を使用して増幅される。米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の組み込まれている資料は、固定化された核酸分子のクラスター又は「コロニー」で構成されたアレイを形成するために増幅産物を固体支持体上に固定化させる核酸増幅法を記載する。そのようなアレイ上の各クラスター又はコロニーは、複数の同一の固定化されたポリヌクレオチド鎖及び複数の同一の固定化された相補的ポリヌクレオチド鎖から形成される。そのように形成されたアレイは、本明細書では一般に「クラスター化アレイ」と称される。米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号に記載されているような固相増幅反応の生成物は、固定化されたポリヌクレオチド鎖と固定化された相補鎖の対をアニーリングすることによって形成されるいわゆる「架橋」構造体であり、両方の鎖は、好ましくは共有結合を介して、５’末端で固体支持体上に固定化されている。クラスター増幅方法論は、固定化された核酸鋳型を使用して固定化されたアンプリコンを産生する方法の例である。他の好適な方法論を使用して、本明細書で提供される方法に従って産生された固定化されたＤＮＡ断片から固定化されたアンプリコンを産生することもできる。例えば、１つ以上のクラスター又はコロニーは、増幅プライマーの各対の一方のプライマーが固定化されているか又は両方のプライマーが固定化されているかに関わらず、固相ＰＣＲによって形成され得る。いくつかの実施形態では、核酸は、連続性粒子上で増幅され、その後、クラスター中のアレイ中に又は固体支持体上に沈着する。
【0084】
更なる増幅方法には、等温増幅が含まれる。使用することができる例示的な等温増幅法としては、例えばＤｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：５２６１－６６（２００２）により例示される多置換増幅（ＭＤＡ）、又は例えば米国特許第６，２１４，５８７号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により例示される等温鎖置換核酸増幅が挙げられるが、これらに限定されない。本開示で使用され得る他の非ＰＣＲベースの方法としては、例えば、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｖｉｒｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９５、米国特許第５，４５５，１６６号、及び同第５，１３０，２３８号、並びにＷａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１６９１－９６（１９９２）に記載されている鎖置換増幅（ＳＤＡ）又は例えば、Ｌａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３：２９４－３０７（２００３）に記載されている超分枝鎖置換増幅が挙げられ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。等温増幅法は、ゲノムＤＮＡのランダムプライマー増幅のために、鎖置換Ｐｈｉ ２９ポリメラーゼ又はＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大型断片、５’→３’エキソ－とともに使用することができる。これらのポリメラーゼの使用は、それらの高い加工性及び鎖置換活性を利用する。高い加工性により、ポリメラーゼは、１０～２０ｋｂの長さの断片を産生することが可能になる。上記のように、クレノウポリメラーゼなどの低いプロセッシビティと鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して、等温条件下でより小さな断片を産生することができる。増幅反応、条件及び成分の更なる説明は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６７０，８１０号の開示に詳細に記載されている。いくつかの実施形態では、これらの増幅反応を行うのに必要とされるポリメラーゼ、試薬、及び成分は、連続性粒子の細孔を通過して核酸と相互作用し、それにより、連続性粒子中の核酸を増幅することができる。いくつかの実施形態では、ランダムヘキサマーを変性ＤＮＡにアニーリングし、続いて触媒酵素Ｐｈｉ ２９の存在下に一定温度で鎖置換合成を行う。これにより、ＭＤＡ後の蛍光強度（ＤＮＡがＳＹＴＯＸで染色された）の増加によって確認されるように、連続性粒子中でのＤＮＡ増幅がもたらされる。独立して、Ｎｅｘｔｅｒａタグメンテーション及びＰＣＲ後の連続性粒子中での蛍光強度の実質的な増加によって示されるように、溶解及びクリーンアップ後のＮｅｘｔｅｒａベースのタグメンテーション並びにその後のＰＣＲによるｇＤＮＡ増幅も行われ得る。このＮｅｘｔｅｒａライブラリ調製後、連続性粒子が８０℃まで３分間加熱されて、連続性粒子の内容物、すなわち、配列決定の準備ができたライブラリ産物を細胞から放出し得る。
【0085】
本開示において有用な別の核酸増幅法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｒｏｔｈｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（５）：１３２１－２（１９９３）に記載されるように、定常５’領域の後にランダム３’領域が続く２ドメインプライマーの集団を使用するタグ付きＰＣＲである。増幅の最初のラウンドを実施して、ランダムに合成された３’領域からの個々のハイブリダイゼーションに基づいて、熱変性されたＤＮＡでの多数の開始を可能にする。３’領域の性質により、開始部位はゲノム全体にわたってランダムであると考えられる。その後、結合していないプライマーを除去し、定常５’領域に相補的なプライマーを使用して、更なる複製を行うことができる。
【0086】
いくつかの実施形態では、核酸は、連続性粒子上で完全又は部分的に配列決定される。核酸は、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ナノポアシーケンシングなどを含む直接シーケンシングなどの任意の適切な配列決定法に従って配列決定することができる。
【0087】
１つのシーケンシング方法は、合成によるシーケンシング（sequencing-by-synthesis、ＳＢＳ）である。ＳＢＳでは、核酸鋳型（例えば標的核酸又はそのアンプリコン）に沿った核酸プライマーの伸長を監視して、鋳型中のヌクレオチドの配列を決定する。基礎となる化学プロセスは、重合（例えば、ポリメラーゼ酵素によって触媒される）であり得る。特定のポリマーベースのＳＢＳの実施形態では、プライマーに付加されるヌクレオチドの順序及び種類の検出を使用して鋳型の配列を決定することができるように、蛍光標識ヌクレオチドを鋳型依存的にプライマーに付加する（それによってプライマーを伸長させる）。
【0088】
１つ以上の増幅された核酸は、サイクル中に試薬を繰り返し送達することを含むＳＢＳ又は他の検出技術に供することができる。例えば、第１のＳＢＳサイクルを開始するために、１つ以上の標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどを、１つ以上の増幅された核酸分子を収容する連続性粒子に流入／通過させることができる。プライマー伸長によって標識ヌクレオチドを組み込む部位は、検出することができる。任意選択的に、ヌクレオチドは、ヌクレオチドがプライマーに付加されると、更なるプライマー伸長を終結する可逆的終結特性を更に含むことができる。例えば、脱ブロック作用因子が送達されてその部分を除去するまで、その後の伸長が起こらないように、可逆的ターミネータ部分を有するヌクレオチド類似体をプライマーに付加することができる。したがって、可逆的終端を使用する実施形態では、脱ブロック試薬をフローセルに送達することができる（検出発生の前又は後）。洗浄は、様々な送達工程の間に実施することができる。次に、サイクルをｎ回繰り返してプライマーをｎ個のヌクレオチドで伸長し、それによって長さｎの配列を検出することができる。本開示の方法によって生成されるアンプリコンとともに使用するために容易に適合させることができる例示的なＳＢＳ手順、流体系及び検出プラットフォームは、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３－５９（２００８）、国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第９１／０６６７８号、国際公開第０７／１２３７４４号、米国特許第７，３２９，４９２号、米国特許第７，２１１，４１４号、米国特許第７，３１５，０１９号、米国特許第７，４０５，２８１号、及び米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0089】
パイロシーケンシングなどの、サイクル反応を使用する他の配列決定手順を使用することができる。パイロシーケンシングは、特定のヌクレオチドが新生核酸鎖に取り込まれる際の、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４２（１），８４－９（１９９６）、Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（１），３－１１（２００１）、Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１（５３７５），３６３（１９９８）、米国特許第６，２１０，８９１号、米国特許第６，２５８，５６８号、及び米国特許第６，２７４，３２０号、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。パイロシーケンシングでは、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸（adenosine triphosphate、ＡＴＰ）に即座に変換されることで検出することができ、生成されたＡＴＰのレベルは、ルシフェラーゼ産生光子を介して検出することができる。したがって、配列決定反応は、発光検出システムを介して監視することができる。蛍光ベースの検出システムに使用される励起放射線源は、パイロシーケンシング手順には必要ない。本開示に従って生成されたアンプリコンへのパイロシーケンシングの適用に適合させることができる有用な流体システム、検出器、及び手順は、例えば国際出願第ＵＳ１１／５７１１１号、米国特許出願公開第２００５／０１９１６９８（Ａ１）号、米国特許第７，５９５，８８３号、及び米国特許第７，２４４，５５９号に記載され、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0090】
いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを伴う方法を利用することができる。例えば、ヌクレオチドの取り込みは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用を介して、フルオロフォア担持ポリメラーゼとγ－リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer、ＦＲＥＴ）相互作用を通して、又はゼロモード導波路（zero mode waveguide、ＺＭＷ）を用いて検出することができる。ＦＲＥＴベースのシーケンシングのための技術及び試薬は、例えば、Ｌｅｖｅｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９，６８２－６８６（２００３）、Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３３，１０２６－１０２８（２００８）、Ｋｏｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５，１１７６－１１８１（２００８）に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【0091】
いくつかのＳＢＳ実施形態は、伸長産物へのヌクレオチドの組み込み時に放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づく配列決定は、市販されている電気検出器及び関連する技術を使用することができる。そのような配列決定システムの例は、パイロシーケンシング（例えば、Ｒｏｃｈｅの子会社である４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの市販のプラットフォーム）、γ－リン酸標識ヌクレオチドを使用した配列決定（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの市販のプラットフォーム）、プロトン検出を使用した配列決定（例えば、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ子会社の市販のプラットフォーム）、又は米国特許出願第２００９／００２６０８２（Ａ１）号、米国特許出願公開第２００９／０１２７５８９（Ａ１）号、米国特許出願公開第２０１０／０１３７１４３（Ａ１）号、若しくは米国特許出願公開第２０１０／０２８２６１７（Ａ１）号に記載されている配列決定方法及びシステムであり、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。動力学的除外を使用して標的核酸を増幅するための本明細書に記載の方法は、プロトンを検出するために使用される基質に容易に適用することができる。より具体的には、本明細書に記載の方法を使用して、プロトンを検出するために使用されるアンプリコンのクローン集団を生成することができる。
【0092】
別の配列決定技術は、ナノポア配列決定である（例えば、Ｄｅａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，１４７－１５１（２０００）、Ｄｅａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３５：８１７－８２５（２００２）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２：６１１－６１５（２００３）を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかのナノポアの実施形態では、標的核酸又は標的核酸から除去された個々のヌクレオチドは、ナノポアを通過する。核酸又はヌクレオチドがナノポアを通過するとき、各ヌクレオチドの種類は、ポアの電気コンダクタンスの変動を測定することによって識別され得る。（米国特許第７，００１，７９２号、Ｓｏｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３，１９９６－２００１（２００７）、Ｈｅａｌｙ，Ｎａｎｏｍｅｄ．２，４５９－４８１（２００７）、Ｃｏｃｋｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０，８１８－８２０（２００８）、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【0093】
本開示による検出に適用することができるアレイベースの発現及び遺伝子型分析のための例示的な方法は、米国特許第７，５８２，４２０号、同第６，８９０，７４１号、同第６，９１３，８８４号、若しくは同第６，３５５，４３１号、又は米国特許公開第２００５／００５３９８０（Ａ１）号、同第２００９／０１８６３４９（Ａ１）号、若しくは同第２００５／０１８１４４０（Ａ１）号に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【0094】
本明細書に記載されるような核酸の単離、増幅、及び配列決定の方法では、様々な試薬が核酸の単離及び調製のために使用される。そのような試薬には、例えば、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ（例えば、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｕポリメラーゼ）、トランスポザーゼ（例えばＴｎ５）、プライマー（例えば、Ｐ５及びＰ７アダプター配列）、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝剤、又は二価カチオンが含まれ得る。これらの試薬が、連続性粒子の孔を通過する一方で、遺伝物質は、連続性粒子内に保持される。本明細書に記載の方法の利点は、それらが連続性粒子上の核酸の処理のための微小環境を提供することである。
【0095】
アダプターは、シーケンシングプライマー部位、増幅プライマー部位、及びインデックスを含むことができる。本明細書で使用される場合、「インデックス」は、核酸をタグ付けするため、及び／又は核酸の供給源を識別するための分子識別子及び／又はバーコードとして使用することができるヌクレオチドの配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、インデックスを使用して、単一の核酸、又は核酸の亜集団を識別することができる。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリを、連続性粒子内で調製することができる。いくつかの実施形態では、単一細胞が、連続性粒子と会合する核酸を取得するために処理され得、次いで、例えば、連続性保存転位シーケンシング（ＣＰＴ－ｓｅｑ）アプローチを使用した、核酸の組み合わせインデックス付けに使用され得る。いくつかの実施形態では、単一細胞由来のＤＮＡは、バーコード付きトランスポゾンによるＷＧＡ増幅後の単一細胞のカプセル化によってバーコード付けされ得る。
【0096】
本明細書に記載の「空間インデックス付け」方法及び技術の実施形態は、データ分析を短縮し、単一細胞及び長いＤＮＡ分子からのライブラリ調製プロセスを簡略化する。単一細胞配列決定のための既存のプロトコルは、細胞の効率的な物理的分離、各単離された細胞の一意的なバーコーディング、全てを一緒にプールして配列決定を行うことを必要とする。合成ロングリードの現行のプロトコルはまた、各バーコード化細胞から生じる遺伝情報を区別するために、面倒なバーコーディング工程と、配列決定及びデータ分析のために各バーコード化断片を一緒にプールすることとが必要である。これらの長いプロセス中に、シーケンスに脱落を引き起こす遺伝物質の損失も存在する。本明細書に記載の実施形態は、プロセスを短縮するだけでなく、単一細胞のデータ解像度も増加させる。更に、本明細書に提供される実施形態は、新たな生物のゲノムのアセンブリを簡略化する。本明細書に記載の実施形態を使用して、希少遺伝的差異及び変異の同時発生を明らかにしてもよい。いくつかの実施形態では、放出まで連続性粒子に閉じ込められたＤＮＡライブラリは、放出プロセス及びヒドロゲル配合を制御することによって表面上に放出される断片のサイズを制御する機会を提供する。
【0097】
いくつかの実施形態では、ライブラリは、アダプター配列中のプライマー部位を使用して増幅され、アダプター配列中の配列決定プライマー部位を使用して配列決定され得る。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、核酸源を識別するためのインデックスを含み得る。後続の増幅工程の効率は、プライマーダイマーの形成によって低減され得る。後続の増幅工程の効率を高めるために、非ライゲート化一本鎖アダプターをライゲーション産物から除去することができる。
【0098】
連続性粒子を用いた核酸ライブラリの調製
本明細書に提供されるシステム、方法、及び組成物のいくつかの実施形態は、アダプターが標的核酸にライゲートされる方法を含む。アダプターは、配列決定プライマー結合部位、増幅プライマー結合部位、及びインデックスを含み得る。例えば、アダプターは、Ｐ５配列、Ｐ７配列、又はそれらの相補体を含み得る。本明細書で使用するとき、Ｐ５配列は、配列番号１（ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ）により規定される配列を含み、Ｐ７配列は、配列番号２（ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ）により規定される配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ５又はＰ７配列は、１～２０、例えば、１～１５、又は１～１０ヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長であり得る、スペーサポリヌクレオチドを更に含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサは、１０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサは、１０ＴスペーサなどのポリＴスペーサである。スペーサヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの５’末端に含まれてもよく、ポリヌクレオチドの５’末端との連結を介して好適な支持体に付着されてもよい。付着は、ポリヌクレオチドの５’末端に存在するホスホロチオエートなどの硫黄含有求核試薬によって達成することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリＴスペーサ及び５’ホスホロチオエート基を含む。したがって、いくつかの実施形態では、Ｐ５配列は、５’ホスホロチオエート－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号３）であり、いくつかの実施形態では、Ｐ７配列は、５’ホスホロチオエート－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ－３’（配列番号４）である。
本明細書に提供されるシステム、方法、及び組成物のいくつかの実施形態は、アダプターが標的核酸にライゲートされる方法を含む。アダプターは、配列決定プライマー結合部位、増幅プライマー結合部位、及びインデックスを含み得る。例えば、アダプターは、Ｐ５配列、Ｐ７配列、又はそれらの相補体を含み得る。本明細書で使用するとき、Ｐ５配列は、配列番号１（ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ）により規定される配列を含み、Ｐ７配列は、配列番号２（ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ）により規定される配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ５又はＰ７配列は、１～２０、例えば、１～１５、又は１～１０ヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長であり得る、スペーサポリヌクレオチドを更に含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサは、１０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサは、１０ＴスペーサなどのポリＴスペーサである。スペーサヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの５’末端に含まれてもよく、ポリヌクレオチドの５’末端との連結を介して好適な支持体に付着されてもよい。付着は、ポリヌクレオチドの５’末端に存在するホスホロチオエートなどの硫黄含有求核試薬によって達成することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリＴスペーサ及び５’ホスホロチオエート基を含む。したがって、いくつかの実施形態では、Ｐ５配列は、５’ホスホロチオエート－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号３）であり、いくつかの実施形態では、Ｐ７配列は、５’ホスホロチオエート－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ－３’（配列番号４）である。
【0099】
インデックスは、核酸分子の供給源を識別するのに役立ち得る。いくつかの実施形態では、アダプターは、例えば、一方又は両方の末端でアダプターの伸長を妨げるブロッキング基を付加することによって、コンカテマーの形成を防ぐように改変することができる。３’ブロッキング基の例には、３’スペーサＣ３、ジデオキシヌクレオチド、及び基質への付着が含まれる。５’ブロッキング基の例には、脱リン酸化された５’ヌクレオチド、及び基質への付着が含まれる。
【0100】
アダプターには、一本鎖核酸などの核酸が含まれる。アダプターは、約５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、それ未満若しくはそれ以上の長さ、又は前述のサイズのいずれか２つの間の範囲の長さを有する短い核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、アダプターは、連続性粒子の細孔を通過するために十分なサイズである。標的核酸には、ゲノム又はｃＤＮＡなどのＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓＲＮＡ、若しくはｒＲＮＡなどのＲＮＡ、又はＤＮＡ及びＲＮＡのハイブリッドが含まれる。核酸は、単一細胞から単離することができる。核酸は、ホスホジエステル結合を含むことができ、例えば、ホスホルアミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ－メチルホスホロアミダイト及びペプチド核酸の骨格及び結合を含む、他の種類の骨格を含むことができる。核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの任意の組み合わせ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンを含む塩基、及びニトロピロール（３－ニトロピロールを含む）及びニトロインドール（５－ニトロインドールを含む）などの塩基類似体の任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも１つの無差別塩基を含むことができる。無差別塩基は、複数の異なる種類の塩基と塩基対合することができ、例えば、ゲノムＤＮＡ試料などの複雑な核酸試料でのランダムハイブリダイゼーションに使用されるオリゴヌクレオチドプライマー又はインサートに含まれる場合、有用であり得る。無差別塩基の例には、アデニン、チミン、又はシトシンと対合し得るイノシンが含まれる。他の例としては、ヒポキサンチン、５－ニトロインドール、アクリル５－ニトロインドール、４－ニトロピラゾール、４－ニトロイミダゾール、及び３－ニトロピロールが挙げられる。少なくとも２つ、３つ、４つ以上の種類の塩基と塩基対になり得る非特異的塩基を使用することができる。
【0101】
標的核酸は、試料中の核酸の平均サイズが、約２ｋｂ、１ｋｂ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、それ未満若しくはそれ以上、又は前述のサイズのいずれか２つの間の範囲である試料を含むことができる。いくつかの実施形態では、試料中の核酸の平均サイズは、約２０００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、それ未満若しくはそれ以上、又は上記のサイズのいずれか２つの間の範囲である。いくつかの実施形態では、核酸は、核酸が連続性粒子の細孔を通過することができないように連続性粒子内に捕捉されるために十分なサイズである。
【0102】
例示的な方法は、標的核酸の５’末端を脱リン酸化して、その後のライゲーション工程でのコンカテマーの形成を防止すること；第１のアダプターの３’末端がブロックされているリガーゼを使用して、脱リン酸化された標的の３’末端に第１のアダプターを連結すること；ライゲートされた標的の５’末端を再リン酸化すること；第２のアダプターの５’末端が脱リン酸化されている一本鎖リガーゼを使用して、脱リン酸化された標的の５’末端に第２のアダプターをライゲートすることを含む。
【0103】
別の例には、５’エキソヌクレアーゼで核酸を部分消化して、一本鎖３’オーバーハングを有する二本鎖核酸を形成することが含まれる。３’ブロッキング基を含むアダプターを、３’オーバーハングを有する二本鎖核酸の３’末端にライゲートすることができる。ライゲートされたアダプターを有する３’オーバーハングを有する二本鎖核酸を脱ハイブリダイズして、一本鎖核酸を形成することができる。リン酸化されていない５’末端を含むアダプターを、一本鎖核酸の５’末端にライゲートすることができる。
【0104】
核酸の５’ヌクレオチドなどの核酸を脱リン酸化する方法には、核酸をホスファターゼと接触させることが含まれる。ホスファターゼの例には、子ウシ腸ホスファターゼ、エビアルカリホスファターゼ、南極ホスファターゼ、及びＡＰＥＸアルカリホスファターゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）が含まれる。
【0105】
核酸をライゲートする方法には、核酸をリガーゼと接触させることが含まれる。リガーゼの例には、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、ＲｔｃＢリガーゼ、メタノバクテリウム（Methanobacterium）ＲＮＡリガーゼ、及びＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ）が含まれる。
【0106】
核酸の５’ヌクレオチドなどの核酸をリン酸化する方法には、核酸をキナーゼと接触させることが含まれる。キナーゼの例には、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼが含まれる。
【0107】
本明細書に提供される実施形態は、核酸ライブラリが単一反応体積で調製されるように、連続性粒子において核酸ライブラリを調製することに関する。
【0108】
本明細書に提供されるシステム及び方法の実施形態には、連続性粒子を調製するためのヒドロゲルポリマー、架橋剤、又はマイクロ流体デバイスのうちの１つ以上を含む、キットであって、更に、遺伝物質の処理に有用な成分を含み、本明明細書に記載され、遺伝物質の各処理に使用される、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ（例えば、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｕポリメラーゼ）、トランスポゼース（例えば、Ｔｎ５）、プライマー（例えば、Ｐ５及びＰ７アダプター配列）、及びリガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチドトリホスフェート、緩衝剤、又は二価カチオンを含む、細胞溶解、並びに核酸増幅及び配列決定のため、又は核酸ライブラリ調製のための試薬を含む、キットが含まれる。
【実施例】
【0109】
実施例１－連続性粒子の調製
以下の実施例は、マイクロ流体液滴生成器を使用してトランスポソームと会合した連続性粒子を調製する実施形態を実証する。
以下の実施例は、マイクロ流体液滴生成器を使用してトランスポソームと会合した連続性粒子を調製する実施形態を実証する。
【0110】
－８０℃で保存された細胞を含有する試料を室温で解凍した。１００μＬの各試料を滅菌１．７ｍＬチューブに移し、試料を１ｍＬの０．８５％ＮａＣｌで１回洗浄した。試料をペレット化し、洗浄溶液を除去した。細胞ペレットをヒドロゲル溶液と混合して、ヒドロゲル溶液中に細胞を再懸濁した。
【0111】
均一なサイズ分布の連続性粒子を生成するために、図１に示される生成器などのマイクロ流体液滴生成器を使用した。ヒドロゲルポリマー及び細胞を含有する溶液を、マイクロ流体液滴生成器の第１のチャネルに導入した。スペーサ油として使用される鉱油を第２のチャネルに添加し、架橋剤を第３のチャネルに添加した。第３のチャネル内で架橋剤と接触すると、ヒドロゲルは、トランスポソームと会合した連続性粒子を瞬時に形成した。表１に示される、低速架橋剤又は瞬間架橋剤を含む架橋の速度を調整するために、架橋油のタイプを選択した。
【0112】
【表1】
【0113】
実施例２－連続性粒子に行われた同時アッセイ
以下の実施例は、ＳＣＩ－ｓｅｑ、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ、組み合わせインデックス付け、及び単細胞全ゲノム増幅を含む、実施例１からの連続性粒子に行われた例示的なアッセイを実証する。
以下の実施例は、ＳＣＩ－ｓｅｑ、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ、組み合わせインデックス付け、及び単細胞全ゲノム増幅を含む、実施例１からの連続性粒子に行われた例示的なアッセイを実証する。
【0114】
実施例１からの連続性粒子を取得し、単一連続性粒子が単一ウェル内に堆積されるように、ウェルを有するプレート上に堆積させた。溶解緩衝液を導入することによって細胞を溶解し、続いて、洗浄し、それによって、細胞から核酸を抽出した。次いで、溶解した細胞を有する連続性粒子を、以下に記載される一連のアッセイに曝露した。
【0115】
インデックス付きトランスポソーム（indexed transposome、ＴＳＭ）を使用して、ゲノムＤＮＡをタグメント化し、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ断片を生成した。プロテイナーゼ／ＳＤＳ処理後、ＴＳＭと同じインデックスを有するオリゴＴを各ウェルに添加して、逆転写（reverse transcription、ＲＴ）によるｃＤＮＡ合成を開始した。他方の末端上のＰＣＲアダプターを、ランダマー伸長によって導入した。これは、インデックス１を生成した。各ウェルからの連続性粒子を一緒にプールし、次いで、インデックス付きＰＣＲプレートに分割して、インデックス２を生成した。この２層インデックス付けは、最大で１５０，０００（３８４×３８４）個の細胞まで拡大することができる。生成された最終ライブラリは、同じ細胞に由来するｇＤＮＡ及びｃＤＮＡが、同じインデックスによってグループ化され、オリゴＴ－ＵＭＩパターンが、ＲＮＡシグナルをＡＴＡＣシグナルと区別するための内部マーカーとして機能した、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ及びＲＮＡ－ｓｅｑの混合物である。
【0116】
加えて、ランダム伸長も全長ＲＮＡ－ｓｅｑに使用した。この場合、ＴＳＭのインデックスは、ランダマーのインデックスとは異なった。これらの２つのインデックスセット間の１対１のマッチングは、単一細胞からのリード並びに分化したＤＮＡ及びＲＮＡシグナルを識別するのに役立った。リード分析の精度を改善するために、ＵＭＩもこの方法で適用した。
【0117】
２回のインデックス付きスプリントライゲーション及び１回のインデックス付きＰＣＲを使用して、３層組み合わせインデックス付きアッセイも行った。この方法では、ＴＳＭ及びオリゴＴは、普遍的であり、両方ともスプリント１断片を含み、スプリントライゲーションによるインデックス付加を可能にした。３層インデックス付けは、最大で１００万個の細胞のスループット（９６×９６×９６）を達成した。細胞スループットを増加させるために、インデックス付きＴＳＭを使用して、ＡＴＡＣ－ｓｅｑのための３層組み合わせインデックス付けを行った。普遍的なＴＳＭを使用するのではなく、ＴＳＭは、そのＢ７Ｇ側及びＡ７Ｇ側に独自のインデックスを含んだ。２つの異なるスプリントを使用して、インデックス付きＰＣＲに必要とされるインデックス付きアダプターを付着させた。インデックス付けは、以下の構成要素を含んだ：Ｂ１５アダプター配列（ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ、配列番号５）、Ｎ６、及びリンク１、ともにＢ１５＿Ｎ６＿リンク１配列を形成する（ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＮＮＮＮＮＮＧＡＣＴＴＧＴＣ、配列番号１１）、Ｐｈｏｓ＿リンク２、Ａ７Ｇ配列（ＴＧＧＴＡＧＡＧＡＧＧＧＴＧ、配列番号９）、及びＭＥ配列（ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ、配列番号７）、ともにＰｈｏｓ＿リンク２＿Ａ７Ｇ＿ＭＥ配列を形成する（ＴＡＧＡＧＣＡＴＮＮＮＮＮＮＴＧＧＴＡＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ、配列番号１２）、並びにＡ１４アダプター配列（ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ、配列番号６）、Ｎ６、及びリンク１、ともにＡ１４＿Ｎ６＿リンク１配列を形成する（ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＮＮＮＮＮＮＧＴＡＡＴＣＡＣ、配列番号１３）、並びにＰｈｏｓ＿リンク２、Ｂ７Ｇ（ＴＡＣＴＡＣＴＣＡＣＣＴＣＣＣ、配列番号１０）、及びＭＥ配列（ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ、配列７）、ともにＬｉｎｋ２＿Ｂ７Ｇ＿ＭＥ配列を形成する（ＣＡＴＣＡＴＣＣＮＮＮＮＮＮＴＡＣＴＡＣＴＣＡＣＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ、配列番号１４）。本実施例はまた、ＭＥ相補配列（ＴＣＴＡＣＡＣＡＣＡＴＴＣＴＣＴＧＴＣ、配列番号８）、スプリント１配列（ＡＴＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＡＧＴ、配列番号１５）、及びスプリント２配列（ＧＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＴＡ、配列番号１６）も提供する。配列では、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、又はＧである。
【0118】
連続性粒子を使用して、単細胞全ゲノム増幅も実行した。これは、個々のウェル内の連続性粒子のインデックス付きＴ７転位を使用し、続いて、Ｔ７インビトロ転写（in vitro transcription、ＩＶＴ）線形増幅を介したプール及び伸長によって行った。インデックス付きランダム伸長のためにビーズを再び分離し、プールし、最終インデックス付きＰＣＲのために再び分割した。
【0119】
連続性粒子は、ＦＡＭ標識トランスポソームによって標的化されたときに効率的なタグメンテーションを示した。核をＨｏｅｃｈｓｔ（青色発光を有するＤＮＡ染色）で染色した一方で、転移核をＦＡＭ（蛍光色素）で蛍光緑色に染色した。細胞をＳＤＳで溶解させることにより、連続性粒子のバックグラウンド蛍光が増加したが、いずれの細胞も含まない連続性粒子からはシグナルは見られなかった。結果は、ＡＴＡＣ－ｓｅｑライブラリが、タグメンテーションからの短い断片の漏出のほんの一部を有する連続性粒子と会合した核酸分子について生成され得ることを実証する。
【0120】
実施例３－連続性粒子における核酸ライブラリの調製
以下の実施例は、連続性粒子を使用した核酸調製のための方法を実証する。
以下の実施例は、連続性粒子を使用した核酸調製のための方法を実証する。
【0121】
実施例１で調製された連続性粒子を取得した。連続性粒子（contiguity particle、ＣＰ）を４５μｍのセルストレーナー上に装填し、ＰＢＳ又はトリス－Ｃｌで複数回洗浄して、カプセル化されていない細胞を除去した。連続性粒子中に細胞をカプセル化することの１つの利点は、それらを取り扱い、処理する能力の改善である。これを行うための１つの簡単な方法は、スピンカラム又はフィルタープレートの使用を通したものである。フィルターの細孔径は、ビーズ直径より小さくあり得る。フィルタープレートの例としては、２０、４０、及び６０μｍ細孔径を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ－Ｍｅｓｈ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅｓ、８．０μｍ細孔を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ、又は３０～４０μｍ細孔を有するＰａｌｌのＡｃｒｏＰｒｅｐ Ａｄｖａｎｃｅ ９６－Ｗｅｌｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅｓ ｆｏｒ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎが挙げられるが、これらに限定されない。これらのフィルタープレートを用いて、ビーズ封入細胞を溶液から容易に分離し、複数回の緩衝液交換を可能にした。
【0122】
洗浄したビーズを緩衝液中に懸濁し、フィルターから除去した。ビーズの最終濃度、細胞装填の効率を推定するために、及び非カプセル化細胞が残っていないことを確実にするために、ビーズのアリコートを顕微鏡下で可視化した。
【0123】
Ｎｅｘｔｅｒａタグメンテーションを行うために、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの２０μｍ Ｎｙｌｏｎ ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ－Ｍｅｓｈ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅを使用した。ビーズのフィルターへの接着を制限するために、ビーズをＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７で事前に湿潤させた。プレートを５００ｇで３０秒間遠心分離した後、フィルターを通して流動された緩衝液が、ビーズを維持するであろう。ビーズを２００μＬのトリス－Ｃｌ緩衝液で２回洗浄し、次いで、溶解緩衝液（０．１％ＳＤＳ）中に懸濁した。遠心分離による除去の前に、ビーズを溶解緩衝液中で１分間インキュベートした。残留溶解緩衝液を除去するために、２回の追加の２００μＬトリス－Ｃｌ洗浄を行った。次に、細胞を、上下にピペッティングすることによって４５μＬの１ｘタグメンテーション緩衝液中に懸濁し、次いで、ストリップチューブに移した。４５μＬのビーズに、５μＬのタグメンテーションＤＮＡ酵素（Tagmentation DNA Enzyme、ＴＤＥ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）を添加し、サーマルサイクラー内のインキュベーションを室温で１時間、５５℃で３０分間行った。代替的に、タグメンテーションマスターミックス中にビーズ封入細胞を懸濁し、ヒートブロック上でインキュベートすることによって、タグメンテーションをフィルタープレート上で行うことができた。タグメンテーション後、ビーズのアリコートをＨｏｅｃｈｓｔ色素で染色し、顕微鏡下で可視化した。可視化により、ＤＮＡがビーズに残留していることが確認された。
【0124】
ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔｅｒａ ＰＣＲ ＭＭ（ＮＰＭ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）及びＰＣＲプライマーを使用して、タグメント化ビーズ（２５μＬ）をＰＣＲ増幅した。マスターＰＣＲミックスに、０．１％ＳＤＳを添加して、ＤＮＡに結合したＴｎ５を除去した。ＳＤＳの存在下でのＴｎ５除去に役立つために、予備インキュベーションを７５℃で行った。１１回のＰＣＲサイクルを行って、最終ライブラリを生成した。ＰＣＲ後、０．９ｘ ＳＰＲＩを使用してライブラリを精製し、ｄｓＤＮＡ ｑｕｂｉｔ及び／又はＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用して定量化し、ＭｉＳｅｑ及び／又はＮｅｘｔＳｅｑ上で配列決定した。
【0125】
本実施例に記載される方法は、ｓｃｉＳＥＱ（Ｖｉｔａｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈ．２０１７；１４：３０２－３０８）と同様のアプローチを使用して単細胞配列決定を行うために拡張され得る。例えば、９６個のインデックス付きタグメンテーション反応を同時に行うための９６ウェルフィルタープレートの使用は、拡張プロセスにおいて行われ得る。ビーズをプレートに添加した後、連続緩衝液を添加し、次いで、遠心分離又は真空によって除去する。タグメンテーション後、ビーズをフィルターから収集し、プールする。プールしたビーズを、多重化ＰＣＲのために第２の９６ウェルＰＣＲプレートに再分配する。この二重レベルインデックス付けスキーム（タグメンテーション及びＰＣＲインデックス付け）では、単一ビーズカプセル化細胞に由来する全てのＤＮＡ断片は、細胞のゲノムを再構築するためにデコンボリューションされ得る同じバーコードを受容する。
【0126】
この実施例で概説される工程は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＨＴＳ Ｖａｃｕｕｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ又はＯｒｏｃｈｅｍの９６ウェルＰｌａｔｅ Ｖａｃｕｕｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄなどの真空マニホールドの追加による液体処理プラットフォーム上での自動化に適している。これらの真空マニホールドは、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ、Ｍｉｃｒｏｌａｂ Ｓｔａｒ、Ｔｅｃａｎ Ｇｅｎｅｓｉｓなどを含む多くの液体処理プラットフォームに追加することができる。タグメンテーションは、フィルタープレートを熱ブロックに移すことによって自動化され得る。次いで、プレートを、タグメンテーション後の洗浄のために真空マニホールドに戻して移す。
【0127】
実施例４－ロングリードインデックス付け
以下の実施例は、本明細書で提供されるロングリードインデックス付け方法及びシステムを使用した方法染色体レベルフェージングを実証する。
以下の実施例は、本明細書で提供されるロングリードインデックス付け方法及びシステムを使用した方法染色体レベルフェージングを実証する。
【0128】
トランスポソームが会合した連続性粒子（本明細書では連続性ビーズとも称される）を調製し、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）上で分析される、本明細書に記載の連結ロングリード法に供した。連続性粒子に加えて、プライマービーズも調製され、各プライマービーズは、アダプター、バーコード、及びプライマーを有する。連続性ビーズ及びプライマービーズを、アダプター及びプライマーを含んだ混合された溶液プライマーとともに、液滴内で一緒に分配した（液滴当たり１つの連続性ビーズ及び１つのプライマービーズ）。９００，０００個を超えるバーコードのビーズプールをインデックス付けするために、オンビーズタグメンテーション、増幅、及びインデックス付けを、分配された液滴を用いて行い、各バーコードが比較的等しく表された。
【0129】
図４に示されるように、染色体レベルフェージングをＨＬＡについて取得した。このアッセイを使用して、最大２６Ｍｂの染色体レベルフェージングを達成し、５０Ｍｂ長に１つだけのスイッチエラーがあり、ＳＮＰの９９％超をカバーした。分析は、１０Ｘ配列決定に必要とされる典型的な２日間のアッセイと比較して、１日のアッセイ（５．７時間の期間にわたる）を必要とした。更に、図５に示されるように、本明細書に記載されるロングリードインデックス付け方法を使用したアイランド長さと比較したアイランドの数は、フェージングメトリックに対して高いＤＮＡ品質を示す。
【0130】
図６は、１０Ｘ配列決定（右）と比較した本明細書に記載のロングリードインデックス付け方法（左）を使用した変異体コーリング及び位相ブロックの結果を示す。これらの結果は、本明細書で提供される方法が、１０Ｘ配列決定を超える平均カバレッジをもたらし、より高いＩＮＤＥＬ精度を有することを示す。
【0131】
最後に、図７並びに図８Ａ及び図８Ｂに示されるように、本明細書に記載のロングリードインデックス付け方法の方法を、ＨＬＡ領域（図７）、ＨＬＡ－ＤＰＡ１（図８Ａ）、及びＨＬＡ－Ａ（図８Ｂ）に行った。１０Ｘ配列決定と比較した、本明細書に記載の長いインデックス付きリード方法の詳細な結果を表２に提供する。
【0132】
【表2】
【0133】
本明細書に記載の実施形態、実施例、及び図面は、溶解からライブラリ生成までのプロセス中に、物理的に閉じ込められた空間内に遺伝物質を保持するための組成物、方法、及びシステムを提供する。いくつかの実施形態は、閉じ込められた空間でフローセルの表面上に放出される単一の長いＤＮＡ分子又は単一細胞から生じるライブラリを提供する。個々の区画における単一のＤＮＡ分子又は単一細胞からのライブラリがフローセルの表面に放出されると、各区画からのライブラリが互いにごく近接して播種される。
【0134】
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、「包含する」、「含有する」又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非限定的であり、更なる列挙されていない要素又は方法工程を除外しない。
【0135】
上記の説明は、本発明のいくつかの方法及び材料を開示するものである。本発明は、方法及び材料の修正、並びに製造方法及び設備の変更を受け入れる余地がある。そのような修正は、本開示又は本明細書に開示される本発明のその開示又は実施を考慮することで当業者に明らかになるであろう。したがって、本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態に限定されることを意図するものではなく、本発明の真の範囲及び趣旨に含まれる全ての修正及び代替を網羅することを意図する。
【0136】
公開及び未公開の出願、特許、並びに文献の参照を含むがこれらに限定されない、本明細書で引用される全ての参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなす。参照により組み込まれる刊行物及び特許又は特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する場合、本明細書は、そのような矛盾する資料に優先する及び／又はより上位にあることを意図する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【配列表】
【国際調査報告】