特表 2024-506313 多能性幹細胞由来の造血性内皮細胞からのリンパ球系細胞の分化方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-13

(54)【発明の名称】多能性幹細胞由来の造血性内皮細胞からのリンパ球系細胞の分化方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/078 20100101AFI20240205BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240205BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20240205BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20240205BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20240205BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20240205BHJP

   C07K 14/475 20060101ALN20240205BHJP

   C07K 14/50 20060101ALN20240205BHJP

   C07K 14/54 20060101ALN20240205BHJP

【ＦＩ】

C12N5/078

C12N5/10

C12N5/0735

C12N5/0775

C12N5/077

C07K14/47

C07K14/475

C07K14/50

C07K14/54

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023547712

(86)(22)【出願日】2022-02-04

(85)【翻訳文提出日】2023-09-22

(86)【国際出願番号】 KR2022001757

(87)【国際公開番号】W WO2022169297

(87)【国際公開日】2022-08-11

(31)【優先権主張番号】10-2021-0016845

(32)【優先日】2021-02-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518018056

【氏名又は名称】スンクワン メディカル ファウンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】リー，ジ ユン

(72)【発明者】

【氏名】リー，ア レウム

(72)【発明者】

【氏名】パーク，ジュン ウン

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065BB19

4B065BB20

4B065CA44

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045EA20

(57)【要約】

多能性幹細胞由来の造血性内皮細胞からのリンパ球系細胞の分化方法に係り、造血性内皮細胞が長期培養可能であり、リンパ球系細胞に誘導が可能であるが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞のような免疫細胞の生成を誘導するのに容易である。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

多能性幹細胞（pluripotent stem cell）を、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＳＣＦを含む培地組成物を含む第１培地で培養し、中胚葉性細胞（mesodermal cell）に分化させる段階と、
前記中胚葉性細胞を、ＴＰＯ、ＥＰＯ及びＩＧＦ－１を含む培地組成物を含む第２培地で培養し、初期造血性内皮細胞（ＥＨＥ：early hemogenic endothelial cell）に分化させる段階と、
前記ＥＨＥを、ＩＬ－５、ＩＬ－７及びＤＬＬを含む培地組成物を含む第３培地で培養し、後期造血性内皮細胞（ＬＨＥ：late hemogenic endothelial cell）に分化させる段階と、を含む、多能性幹細胞からリンパ球系細胞（lymphoid lineage blood cell）を製造する方法。

【請求項2】

前記多能性幹細胞は、胚芽幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、体細胞核置換術による胚芽幹細胞（somatic cell nuclear transfer derived stem cell）、及び成体由来間葉系幹細胞によって構成された群のうちから選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１培地は、アスコルビン酸、ＢＭＰ４、またはその混合物をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記第２培地は、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦＡ、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＣＳＦ及びＩＬ－６、またはその混合物をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記ＥＨＥは、下記（ａ）ないし（ｄ）のうちから選択される１以上の特性を有する、請求項１に記載の方法：
（ａ）ロッド型（rod type）の形態学的特性を有すること、
（ｂ）明るい黄色光を有すること、
（ｃ）分裂時間（doubling time）が１５ないし３５時間であること、及び
（ｄ）ＣＤ３１＋、Tie－２＋、ＣＤ１４４＋、ＣＤ３４＋、またはそれら組み合わせの表面抗原特性を有すること。

【請求項6】

前記第３培地は、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦＡ、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＧＦ－１、ＩＬ１５、またはその混合物をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記ＬＨＥは、下記（ａ）ないし（ｂ）のうちから選択される１以上の特性を有する、請求項１に記載の方法：
（ａ）敷石状型（cobblestone-like type）の形態学的特性を有すること、及び
（ｂ）ＣＤ３１＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ１４４＋、Ｆｌｋ－１＋、ＣＤ１４４＋ＣＤ３１＋、ＣＤ１４４＋ＣＤ３４＋、ＣＤ３１＋ＣＤ３４＋、Ｆｌｋ－１＋ＣＤ３４＋、またはそれら組み合わせの表面抗原特性を有すること。

【請求項8】

前記多能性幹細胞を中胚葉性細胞に分化させる段階は、１ないし３日間遂行する、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記中胚葉性細胞をＥＨＥに分化させる段階は、６ないし８日間遂行する、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記ＥＨＥをＬＨＥに分化させる段階は、１２ないし１３日間遂行する、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

ＬＨＥを１３ないし２８日間さらに培養し、リンパ球系細胞に分化させる段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記ＬＨＥを、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦＡ、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＧＦ－１、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－５及びＤＬＬ１によって構成された群のうちから選択されるいずれか１以上をさらに含む培地組成物を含むＥＧＭ－２基本培地で培養する、請求項１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２１年２月５日に出願された大韓民国特許出願第１０－２０２１－００１６８４５号を優先権として主張し、前記明細書全体は、本出願の参考文献である。本発明は、多能性幹細胞由来の造血性内皮細胞からのリンパ球系細胞の分化方法に関する。

【背景技術】

【0002】

全ての血液の発生と維持は、成人の骨髄に存在する極少数の造血幹細胞（hematopoietic stem cell）に頼っている。骨髄（bone marrow）由来、血液（mobilized peripheral blood）由来または臍帯血（ＵＣＢ：umbilical cord blood）由来の造血幹細胞の移植は、さまざまな遺伝的疾病または悪性疾患の治療基準として使用されている。しかしながら、組織適合性抗原（ＨＬＡ：human leukocyte antigen）一致ドナーによる制限的な可能性は、依然として大きな当面課題として残っており、臍帯血の特性上、抗原非適合性にもかかわらず、相対的に少数の造血幹細胞の量が、生着遅延または移植後の生着に、さまざまな問題を引き起こしうる。

【0003】

一方、日本登録特許第５９９５２３７号においては、動物のＡＧＭ（aorta-gonad-mesonephros）由来血管母細胞を利用し、ヒト血液細胞に分化する方法を開示し、米国公開特許第２００４－０２３５１６０号においては、動物の造血幹細胞を効果的に分化させる方法が開示されるというように、血管母細胞の生成、及びそれを活用した血液細胞の分化法開発の大切さがクローズアップされている。しかしながら、実際、ヒト血管母細胞を直接血液細胞に分化させる血管細胞分化培養技術法に係わる報告は、ほとんどなく、リンパ球系細胞にまで誘導する方法は、全くない。従って、血液細胞生成を可能にする血管母細胞の最適化された長期培養法を確立する必要がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

一態様は、多能性幹細胞（pluripotent stem cell）を、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＳＣＦを含む第１培地で培養し、中胚葉性細胞（mesodermal cell）に分化させる段階と、前記中胚葉性細胞を、ＴＰＯ、ＥＰＯ及びＩＧＦ－１を含む第２培地で培養し、初期造血性内皮細胞（ＥＨＥ：early hemogenic endothelial cell）に分化させる段階と、前記ＥＨＥを、ＩＬ－５、ＩＬ－７及びＤＬＬを含む第３培地で培養し、後期造血性内皮細胞（ＬＨＥ：late hemogenic endothelial cell）に分化させる段階と、を含む、多能性幹細胞からリンパ球系細胞（lymphoid lineage blood cell）を製造する方法を提供するものである。

【課題を解決するための手段】

【0005】

一態様は、多能性幹細胞（pluripotent stem cell）を、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＳＣＦを含む第１培地組成物を含む第１培地で培養し、中胚葉性細胞（mesodermal cell）に分化させる段階と、前記中胚葉性細胞を、ＴＰＯ、ＥＰＯ及びＩＧＦ－１を含む第２培地組成物を含む第２培地で培養し、初期造血性内皮細胞（ＥＨＥ：early hemogenic endothelial cell）に分化させる段階と、前記ＥＨＥを、ＩＬ－５、ＩＬ－７及びＤＬＬを含む第３培地組成物を含む第３培地で培養し、後期造血性内皮細胞（ＬＨＥ：late hemogenic endothelial cell）に分化させる段階と、を含む多能性幹細胞からリンパ球系細胞（lymphoid lineage blood cell）を製造する方法を提供する。

【0006】

本明細書において、用語「多能性幹細胞（pluripotent stem cell）」は、個体の全組織細胞に分化することができる多能性（pluripotent）や全能性（totipotent）がある自己再生産能（self-renewal）を有する幹細胞を意味する。前記多能性幹細胞は、例えば、胚芽幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、体細胞核置換術による胚芽幹細胞（somatic cell nuclear transfer derived stem cell）などがある。

【0007】

本明細書において、用語「造血性内皮細胞（hemogenic endothelial cell）」は、分化された稀有な血管内皮細胞であり、胚発生の間、造血細胞（hematoblast）に分化されうる。胚芽において、造血細胞の発達は、中胚葉から血管母細胞を介し、血管内皮、及び造血細胞の前駆体（hemopoietic precursor cell）に順次に進められる。

【0008】

本明細書において、用語「血管母細胞（angioblastまたはvasoformative cell）」は、骨髄から派生された一種の内皮前駆体細胞であり、血管の内皮で発達しうる間葉系（mesenchymal）細胞のうち1つである。

【0009】

本明細書において、用語「リンパ球系細胞（lymphoid lineage blood cell）」は、造血幹細胞（hematopoietic stem cell）から分化された系統細胞であり、主に適応免疫系（adaptive immunity）と先天免疫系（innate immunity）とに関与する。該リンパ球系細胞は、例えば、自然殺害細胞（ＮＫ cell：natural killer cell）、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球がある。従って、一態様による方法は、体外において、多能性幹細胞を、ＮＫ細胞、Ｔリンパ球またはＢリンパ球のようなリンパ球系細胞に効率的に分化させることができる。

【0010】

一具体例による方法は、多能性幹細胞（pluripotent stem cell）を、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦＡ及びＳＣＦを含む第１培地組成物を含む第１培地で培養し、中胚葉性細胞（mesodermal cell）に分化させる段階を含む。前記培地組成物は、通常の細胞培養用培地内に含まれるものでもある。前記細胞培養用培地は、例えば、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle’s Medium、GIBCO、米国）、ＭＥＭ（Minimal Essential Medium、GIBCO、米国）、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle、GIBCO、米国）、ＲＰＭＩ １６４０（GIBCO、米国）、ＤＭＥＭ／Ｆ１０（Dulbecco's Modified Eagle’s Medium：Nutrient Mixture F-10、GIBCO、米国）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Dulbecco's Modified Eagle’s Medium：Nutrient Mixture F-12、GIBCO、米国）、α－ＭＥＭ（α－Minimal Essential Medium、GIBCO、米国）、Ｇ－ＭＥＭ（Glasgow’s Minimal Essential Medium、GIBCO、米国）、ＩＭＤＭ（Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium、GIBCO、米国）、ＡｐｅｌII（STEMdiff APEL 2 Medium）、ＥＧＭ－２（EGM Endothelial Cell Growth Medium）などでもある。

【0011】

前記ｂＦＧＦは、１ないし２５ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ｂＦＧＦは、例えば、１ないし２５ｎｇ／ｍｌ、１ないし２０ｎｇ／ｍｌ、１ないし１５ｎｇ／ｍｌ、５ないし２５ｎｇ／ｍｌ、５ないし２０ｎｇ／ｍｌ、５ないし１５ｎｇ／ｍｌ、または７ないし１２ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。このとき、該ｂＦＧＦの含量が前記範囲を超える場合、多能性幹細胞の中胚葉性細胞への分化速度が遅いか、あるいは胚芽幹細胞の性向を帯びるという問題点がある。

【0012】

また、前記ＶＥＧＦＡは、５ないし４０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＶＥＧＦＡは、例えば、５ないし４０ｎｇ／ｍｌ、５ないし３５ｎｇ／ｍｌ、５ないし３０ｎｇ／ｍｌ、５ないし２５ｎｇ／ｍｌ、５ないし２０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし４０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし３５ｎｇ／ｍｌ、１０ないし３０ｎｇ／ｍｌ、または１５ないし２５ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。このとき、該ＶＥＧＦＡの含量が前記範囲未満である場合、細胞増殖が円滑ではないという問題点があり、前記範囲を超える場合、多能性幹細胞が血管内皮細胞に分化されうるという問題点がある。

【0013】

また、前記ＳＣＦは、２０ないし７０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＳＧＦは、例えば、２０ないし７０ｎｇ／ｍｌ、２０ないし６５ｎｇ／ｍｌ、２０ないし６０ｎｇ／ｍｌ、２０ないし５５ｎｇ／ｍｌ、２５ないし７０ｎｇ／ｍｌ、２５ないし６５ｎｇ／ｍｌ、２５ないし６０ｎｇ／ｍｌ、２５ないし５５ｎｇ／ｍｌ、３０ないし７０ｎｇ／ｍｌ、３０ないし６５ｎｇ／ｍｌ、または４０ないし６０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。

【0014】

一具体例において、前記第１組成物は、アスコルビン酸、ＢＭＰ４、ＣＨＩＲ、またはその混合物をさらに含むものでもある。前記アスコルビン酸は、５０ないし２５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記アスコルビン酸は、例えば、５０ないし２５０ｎｇ／ｍｌ、５０ないし２００ｎｇ／ｍｌ、５０ないし１５０ｎｇ／ｍｌ、７０ないし２５０ｎｇ／ｍｌ、７０ないし２３０ｎｇ／ｍｌ、７０ないし１５０ｎｇ／ｍｌ、または８０ないし１５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。

【0015】

また、前記ＢＭＰ４は、１０ないし５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＢＭＰ４は、例えば、１０ないし５０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし４５ｎｇ／ｍｌ、１０ないし４０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし３５ｎｇ／ｍｌ、１０ないし３０ｎｇ／ｍｌ、１５ないし５０ｎｇ／ｍｌ、１５ないし４５ｎｇ／ｍｌ１５ないし４０ｎｇ／ｍｌ、または２０ないし３５ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。

【0016】

また、前記ＣＨＩＲは、０．５ないし１０ｎＭの濃度で含まれるものでもある。前記ＣＨＩＲは、例えば、０．５ないし１０ｎＭ、１ないし１０ｎＭ、１ないし８ｎＭ、１ないし６ｎＭ、１ないし４ｎＭ、２ないし９ｎＭ、２ないし７ｎＭ、２ないし５ｎＭ、または３ないし６ｎＭの濃度で含まれるものでもある。このとき、該ＣＨＩＲの含量が前記範囲未満である場合、多能性幹細胞の中胚葉への分化が円滑ではないという問題点があり、前記範囲を超える場合、多能性幹細胞が肝細胞などに分化されうるという問題点がある。

【0017】

一具体例において、前記段階は、１ないし３日間遂行されうる。例えば、前記段階は、１ないし３日間、１ないし２日間、または２ないし３日間遂行されうる。このとき、培養期間が前記範囲未満である場合、多能性幹細胞が中胚葉性細胞に十分に分化されえないという問題点があり、前記範囲を超える場合、多能性幹細胞が、中胚葉から造血性内皮細胞に分化されえず、他系統の細胞に分化されるという問題点がある。

【0018】

一具体例による方法は、前記中胚葉性細胞を、基本培地にＴＰＯ、ＥＰＯ及びＩＧＦ－１を含む第２培地組成物を含む第２培地で培養し、初期造血性内皮細胞（ＥＨＥ：early hemogenic endothelial cell）に分化させる段階を含む。

【0019】

前記ＴＰＯは、５０ないし２５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＴＰＯは、例えば、５０ないし２５０ｎｇ／ｍｌ、５０ないし２００ｎｇ／ｍｌ、５０ないし１５０ｎｇ／ｍｌ、７０ないし２５０ｎｇ／ｍｌ、７０ないし２３０ｎｇ／ｍｌ、７０ないし１５０ｎｇ／ｍｌ、または８０ないし１５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。このとき、該ＴＰＯの含量が前記範囲未満である場合、確定的造血（definitive hematopoiesis）過程が円滑ではないという問題点があり、前記範囲を超える場合、巨核球（megakaryocyte）に集中分化されうるという問題点がある。

【0020】

また、前記ＥＰＯは、５ないし４０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＥＰＯは、例えば、５ないし４０ｎｇ／ｍｌ、５ないし３５ｎｇ／ｍｌ、５ないし３０ｎｇ／ｍｌ、５ないし２５ｎｇ／ｍｌ、５ないし２０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし４０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし３５ｎｇ／ｍｌ、１０ないし３０ｎｇ／ｍｌ、または１５ないし２５ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。このとき、該ＥＰＯの含量が前記範囲未満である場合、赤血球生成に長時間が必要となるという問題点がある。

【0021】

また、前記ＩＧＦ－１は、２０ないし７０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＩＧＦ－１は、例えば、２０ないし７０ｎｇ／ｍｌ、２０ないし６５ｎｇ／ｍｌ、２０ないし６０ｎｇ／ｍｌ、２０ないし５５ｎｇ／ｍｌ、２５ないし７０ｎｇ／ｍｌ、２５ないし６５ｎｇ／ｍｌ、２５ないし６０ｎｇ／ｍｌ、２５ないし５５ｎｇ／ｍｌ、３０ないし７０ｎｇ／ｍｌ、３０ないし６５ｎｇ／ｍｌ、または４０ないし６０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。このとき、前記ＩＧＦ－１の含量が前記範囲未満である場合、血液分化決定（commitment）段階が円滑ではないという問題点があり、前記範囲を超える場合、血液分化決定（commitment）段階が骨髄球系に限定されうるという問題点がある。
一具体例において、前記第２組成物は、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦＡ、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＣＳＦ及びＩＬ－６、またはその混合物をさらに含むものでもある。

【0022】

前記ｂＦＧＦは、１ないし２５ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ｂＦＧＦは、例えば、１ないし２５ｎｇ／ｍｌ、１ないし２０ｎｇ／ｍｌ、１ないし１５ｎｇ／ｍｌ、５ないし２５ｎｇ／ｍｌ、５ないし２０ｎｇ／ｍｌ、５ないし１５ｎｇ／ｍｌ、または７ないし１２ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。

【0023】

また、前記ＶＥＧＦＡは、５０ないし２５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＶＥＧＦＡは、例えば、５０ないし２５０ｎｇ／ｍｌ、５０ないし２００ｎｇ／ｍｌ、５０ないし１５０ｎｇ／ｍｌ、７０ないし２５０ｎｇ／ｍｌ、７０ないし２３０ｎｇ／ｍｌ、７０ないし１５０ｎｇ／ｍｌ、または８０ないし１５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。

【0024】

また、前記ＳＣＦは、１００ないし５００ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＳＣＦは、例えば、１００ないし５００ｎｇ／ｍｌ、１００ないし４５０ｎｇ／ｍｌ、１００ないし４００ｎｇ／ｍｌ、１００ないし３５０ｎｇ／ｍｌ、１５０ないし５００ｎｇ／ｍｌ、１５０ないし４５０ｎｇ／ｍｌ、１５０ないし３５０ｎｇ／ｍｌ、２００ないし５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ないし４００ｎｇ／ｍｌ、１７０ないし３３０ｎｇ／ｍｌ、または２２０ないし３００ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。

【0025】

また、前記ＦＬＴ３Ｌは、１００ないし４００ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＦＬＴ３Ｌは、例えば、１００ないし４００ｎｇ／ｍｌ、１００ないし３５０ｎｇ／ｍｌ、１００ないし３２０ｎｇ／ｍｌ、１００ないし３００ｎｇ／ｍｌ、１００ないし２８０ｎｇ／ｍｌ、１００ないし２６０ｎｇ／ｍｌ、１００ないし２４０ｎｇ／ｍｌ、１００ないし２２０ｎｇ／ｍｌ、１５０ないし４００ｎｇ／ｍｌ、１５０ないし３００ｎｇ／ｍｌ、または１５０ないし２５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。このとき、該ＦＬＴ３Ｌの濃度が前記範囲未満である場合、初期造血性内皮細胞の血液細胞への分化集中度が下がってしまうという問題点がある。

【0026】

また、前記ＧＣＳＦは、５ないし５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＧＣＳＦは、例えば、５ないし５０ｎｇ／ｍｌ、５ないし４５ｎｇ／ｍｌ、５ないし４０ｎｇ／ｍｌ、５ないし３５ｎｇ／ｍｌ、５ないし３０ｎｇ／ｍｌ、５ないし２５ｎｇ／ｍｌ、１０ないし５０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし４５ｎｇ／ｍｌ、１０ないし４０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし３５ｎｇ／ｍｌ、１５ないし３０ｎｇ／ｍｌ、または１５ないし２５ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。このとき、該ＧＣＳＦの含量が前記範囲未満である場合、初期造血性内皮細胞の骨髄球系細胞への分化督励が良好になされないのである。

【0027】

また、前記ＩＬ－６は、１０ないし７０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＩＬ－６は、例えば、１０ないし７０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし６５ｎｇ／ｍｌ、１０ないし６０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし５５ｎｇ／ｍｌ、２０ないし７０ｎｇ／ｍｌ、２０ないし６５ｎｇ／ｍｌ、２０ないし６０ｎｇ／ｍｌ、３０ないし６０ｎｇ／ｍｌ、または４５ないし５５ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。このとき、該ＩＬ－６の含量が前記範囲未満である場合、確定的リンパ球生成（lymphopoiesis）が良好になされないのである。

【0028】

一具体例において、前記段階は、６ないし８日間遂行されうる。このとき、培養期間が前記範囲未満である場合、造血性内皮細胞の成長と膨脹とが萎縮してしまうという問題点があり、前記範囲を超える場合、中胚葉において、造血性内皮細胞の分化が十分に起凝らず、造血性内皮細胞の頻度が少なくなるという問題点がある。

【0029】

前記初期造血性内皮細胞は、下記の（ａ）ないし（ｄ）のうちから選択される１以上の特性を有するものでもある：
（ａ）ロッド型（rod type）の形態学的特性を有すること：
（ｂ）明るい黄色光を有すること：
（ｃ）分裂時間（doubling time）が１５ないし３５時間であること：及び
（ｄ）ＣＤ３１＋、Ｔｉｅ－２＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ３４＋、またはそれら組み合わせの表面抗原特性を有すること。

【0030】

前記方法は、前記ＥＨＥを、ＩＬ－５、ＩＬ－７及びＤＬＬを含む第３培地組成物を含む第３培地で培養し、後期造血性内皮細胞（ＬＨＥ：late hemogenic endothelial cell）に分化させる段階を含む。

【0031】

前記ＩＬ－５は、２０ないし７０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＩＬ－５は、例えば、２０ないし７０ｎｇ／ｍｌ、２０ないし６５ｎｇ／ｍｌ、２０ないし６０ｎｇ／ｍｌ、２０ないし５５ｎｇ／ｍｌ、２５ないし７０ｎｇ／ｍｌ、２５ないし６５ｎｇ／ｍｌ、２５ないし６０ｎｇ／ｍｌ、３０ないし６０ｎｇ／ｍｌ、または４５ないし５５ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。このとき、該ＩＬ－５の含量が前記範囲未満である場合、リンパ球系細胞の数が少なくなりうるという問題点があり、前記範囲を超える場合、赤血球細胞が多量に生成されるという問題点がある。

【0032】

また、前記ＩＬ－７は、５ないし４０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＩＬ－７は、例えば、５ないし４０ｎｇ／ｍｌ、５ないし３５ｎｇ／ｍｌ、５ないし３０ｎｇ／ｍｌ、５ないし２５ｎｇ／ｍｌ、１０ないし４０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし３５ｎｇ／ｍｌ、１０ないし３０ｎｇ／ｍｌ、または１５ないし３５ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。このとき、該ＩＬ－７の含量が前記範囲未満である場合、ＮＫ細胞への分化が円滑ではなくなる。

【0033】

また、前記ＤＤＬ１は、５ないし５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＤＤＬ１は、例えば、５ないし５０ｎｇ／ｍｌ、５ないし４５ｎｇ／ｍｌ、５ないし４０ｎｇ／ｍｌ、５ないし３５ｎｇ／ｍｌ、５ないし３０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし５０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし４５ｎｇ／ｍｌ、１０ないし４０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし３０ｎｇ／ｍｌ、１５ないし３０ｎｇ／ｍｌ、または２０ないし３０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。このとき、該ＤＤＬ１の含量が前記範囲未満である場合、血液細胞内において、リンパ球系細胞の増殖速度が遅くなったり、血管母細胞において、リンパ球系細胞が良好に分離されえなかったりするという問題点があり、前記範囲を超える場合、ＮＫ細胞よりは、Ｔ細胞への分化が容易となってしまう。

【0034】

一具体例において、前記第３培地は、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦＡ、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＣＳＦ、及びＩＬ－６、ＩＧＦ－１、ＩＬ－１５、またはその混合物をさらに含むものでもある。

【0035】

前記ｂＦＧＦは、１ないし２５ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ｂＦＧＦは、例えば、１ないし２５ｎｇ／ｍｌ、１ないし２０ｎｇ／ｍｌ、１ないし１５ｎｇ／ｍｌ、５ないし２５ｎｇ／ｍｌ、５ないし２０ｎｇ／ｍｌ、５ないし１５ｎｇ／ｍｌ、または７ないし１２ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。

【0036】

また、前記ＶＥＧＦＡは、５ないし２５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＶＥＧＦＡは、例えば、５０ないし２５０ｎｇ／ｍｌ、５０ないし２００ｎｇ／ｍｌ、５０ないし１５０ｎｇ／ｍｌ、７０ないし２５０ｎｇ／ｍｌ、７０ないし２３０ｎｇ／ｍｌ、７０ないし１５０ｎｇ／ｍｌ、または８０ないし１５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。

【0037】

また、前記ＳＣＦは、１００ないし５００ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＳＣＦは、例えば、１００ないし５００ｎｇ／ｍｌ、１００ないし４５０ｎｇ／ｍｌ、１００ないし３５０ｎｇ／ｍｌ、１００ないし２５０ｎｇ／ｍｌ、１００ないし１５０ｎｇ／ｍｌ、１５０ないし５００ｎｇ／ｍｌ、１５０ないし４００ｎｇ／ｍｌ、１５０ないし３００ｎｇ／ｍｌ、１７０ないし２５０ｎｇ／ｍｌ、２００ないし２５０ｎｇ／ｍｌ、または３００ないし３５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。

【0038】

また、前記ＦＬＴ３Ｌは、１００ないし４００ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＦＬＴ３Ｌは、例えば、１００ないし４００ｎｇ／ｍｌ、１００ないし３５０ｎｇ／ｍｌ、１００ないし３２０ｎｇ／ｍｌ、１００ないし３００ｎｇ／ｍｌ、１００ないし２８０ｎｇ／ｍｌ、１００ないし２６０ｎｇ／ｍｌ、１００ないし２４０ｎｇ／ｍｌ、１００ないし２２０ｎｇ／ｍｌ、１５０ないし４００ｎｇ／ｍｌ、１５０ないし３００ｎｇ／ｍｌ、または１５０ないし２５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。

【0039】

また、前記ＧＣＳＦは、５ないし５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＧＣＳＦは、例えば、５ないし５０ｎｇ／ｍｌ、５ないし４５ｎｇ／ｍｌ、５ないし４０ｎｇ／ｍｌ、５ないし３５ｎｇ／ｍｌ、５ないし３０ｎｇ／ｍｌ、５ないし２５ｎｇ／ｍｌ、１０ないし５０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし４５ｎｇ／ｍｌ、１０ないし４０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし３５ｎｇ／ｍｌ、１５ないし３０ｎｇ／ｍｌ、または１５ないし２５ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。

【0040】

また、前記ＩＬ－６は、１０ないし７０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＩＬ－６は、例えば、１０ないし７０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし６５ｎｇ／ｍｌ、１０ないし６０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし５５ｎｇ／ｍｌ、２０ないし７０ｎｇ／ｍｌ、２０ないし６５ｎｇ／ｍｌ、２０ないし６０ｎｇ／ｍｌ、３０ないし６０ｎｇ／ｍｌ、または４５ないし５５ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。

【0041】

また、前記ＩＧＦ－１は、２０ないし７０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＩＧＦ－１は、例えば、２０ないし７０ｎｇ／ｍｌ、２０ないし６５ｎｇ／ｍｌ、２０ないし６０ｎｇ／ｍｌ、２０ないし５５ｎｇ／ｍｌ、２５ないし７０ｎｇ／ｍｌ、２５ないし６５ｎｇ／ｍｌ、２５ないし６０ｎｇ／ｍｌ、２５ないし５５ｎｇ／ｍｌ、３０ないし７０ｎｇ／ｍｌ、３０ないし６５ｎｇ／ｍｌ、または４０ないし６０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。

【0042】

また、前記ＩＬ－１５は、５ないし４０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。前記ＩＬ－１５は、例えば、５ないし４０ｎｇ／ｍｌ、５ないし３５ｎｇ／ｍｌ、５ないし３０ｎｇ／ｍｌ、５ないし２５ｎｇ／ｍｌ、５ないし２０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし４０ｎｇ／ｍｌ、１０ないし３５ｎｇ／ｍｌ、１０ないし３０ｎｇ／ｍｌ、または１５ないし２５ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるものでもある。このとき、該ＩＬ－１５の含量が前記範囲未満である場合、ＮＫ細胞への分化及び維持が困難であるという問題点があり、前記範囲を超える場合、Ｔ細胞のような他細胞への分化激励（encouragement）も共に起こり、ＮＫ細胞のみをターゲットにするか、あるいはリンパ球系細胞のうちいずれか1つだけへの選択的分化が困難であるという問題点がある。

【0043】

一具体例において、前記段階は、１２ないし１３日間遂行されうる。このとき、分化期間が前記範囲未満である場合、初期造血（primary hematopoiesis）過程が十分に起こらず、確定的造血（definitive hematopoiesis）過程の細胞生成とその頻度とが少なくなのに影響を与えるという問題点がある。

【0044】

前記後期造血性内皮細胞は、下記の（ａ）ないし（ｂ）のうちから選択される１以上の特性を有するものでもある：
（ａ）さざれ石型（cobble stone-like type）の形態学的特性を有すること；及び
（ｂ）ＣＤ３１＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ１４４＋、Ｆｌｋ－１＋、ＣＤ１４４＋ＣＤ３１＋、ＣＤ１４４＋ＣＤ３４＋、ＣＤ３１＋ＣＤ３４＋、Ｆｌｋ－１＋ＣＤ３４＋、またはそれら組み合わせの表面抗原特性を有すること。

【0045】

前記方法は、前記ＬＨＥを、１３ないし２８日間さらに培養し、リンパ球系細胞に分化させる段階をさらに含むものでもある。例えば、前記ＬＨＥを、１３ないし２８日間、１３ないし２７日間、１３ないし２６日間、１３ないし２５日間、１３ないし２４日間、１３ないし２２日間、１３ないし２０日間、１５ないし２８日間、１５ないし２５日間、または２０ないし２８日間さらに培養することができる。このとき、培養期間が前記範囲未満である場合、造血性内皮細胞がリンパ球系細胞に十分に分化されえないという問題点があり、前記範囲を超える場合、リンパ球系細胞の促進が遅延され、リンパ球系細胞を十分に得ることができないという問題点がある。

【0046】

また、前記リンパ球系細胞に分化させる段階は、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦＡ、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＧＦ－１、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－５及びＤＬＬ１によって構成された群のうちから選択されるいずれか１以上をさらに含む培地組成物を含むＥＧＭ－２基本培地でＬＨＥを培養することでもある。

【0047】

すなわち、一態様による方法は、リンパ球系細胞の分化適正性に合う培地条件を最適化させ、分化段階別に前記培地を適用することにより、造血性内皮細胞の長期培養が可能になるのである。

【0048】

他の態様は、前記方法によって製造されたリンパ球系細胞を提供する。

【0049】

さらに他の態様は、前記リンパ球系細胞を有効成分として含む癌の予防用または治療用の薬学的組成物を提供する。さらに他の態様は、前記リンパ球系細胞を有効成分として含む細胞治療剤を提供する。前記有効成分のリンパ球系細胞、その細胞集団、またはその培養液を、それを必要とする個体に投与する段階を含む癌の予防方法または治療方法を提供する。

【0050】

前記リンパ球系細胞の具体的な内容は、前述の通りである。前記方法によって製造されたリンパ球系細胞は、免疫活性を有するが、免疫抗癌剤に利用可能である。

【発明の効果】

【0051】

一態様による方法は、造血性内皮細胞を、長期培養することができ、リンパ球系細胞に誘導することができるが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞のような免疫細胞の生成を誘導しやすいのである。

【図面の簡単な説明】

【0052】

【図1】初期造血性内皮細胞及び後期造血性内皮細胞の性状を示した写真である。

【図2A】後期造血性内皮細胞の培養時間による細胞形態を示した写真、及び単一細胞の増殖を示したグラフである。

【図2B】後期造血性内皮細胞のマーカータンパク質発現を確認した写真である。

【図3A】ＡｐｅｌII基本培地でＨＥを培養し、１日目、３日目、７日目、及びその後の細胞形状を示した写真である。

【図3B】ＥＧＭ－２基本培地でＨＥを培養し、１日目及び３日目の細胞形状を示した写真である。

【図3C】ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地でＨＥを培養し、１日目、３日目、７日目、及びその後の細胞形状を示した写真である。

【図4A】後期造血性内皮細胞におけるマーカータンパク質を確認した結果である。

【図4B】ＣＤ３１細胞のTie－２ enrichmentを確認した写真である。

【図5A】マウスの肝臓内造血性内皮細胞におけるリンパ球系細胞生成を確認した結果である。

【図5B】マウスＡＧＭ内造血性内皮細胞におけるリンパ球系細胞生成を確認した結果である。

【図5C】それぞれの基本培地で培養した造血性内皮細胞の性状及びコロニー形成、リンパ球系細胞、並びに骨髄球系細胞の生成程度を図表化し、造血性内皮細胞の形態を確認した結果である。

【図5D】ＡＧＭ内の分化された細胞を利用し、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１の発現程度を分析した結果を示したグラフである。

【図6A】ヒト全分化能幹細胞由来の造血性内皮細胞からのリンパ球系細胞の生成段階別細胞の性状及び発現マーカーを示した結果である。

【図6B】ＩＬ－５及びＤＤＬ１を処理したスポットにおいて、リンパ球系細胞への分化がなされるか否かということをリンパ球系転写因子の発現によって確認したグラフである。

【図7A】ヒト全分化能幹細胞由来の後期造血性内皮細胞の培養３１日目Ｔリンパ球前駆細胞であるγδＴ細胞の表面マーカーをＦＡＣＳで確認した結果である。

【図7B】ヒト全分化能幹細胞由来の後期造血性内皮細胞の培養３１日目Ｔリンパ球前駆細胞であるγδＴ細胞の表面マーカーを定量化したグラフである。

【図7C】ヒト全分化能幹細胞由来の後期造血性内皮細胞の培養３１日目Ｔリンパ球前駆細胞であるγδＴ細胞の細胞形態を確認した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0053】

以下、本発明理解の一助とするために、望ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解するために提供されるものであるのみ、下記実施例により、本発明の内容が限定されるものではない。

【0054】

［製造例］
製造例１．幹細胞の造血性内皮細胞（hemogenic endothelial cell）への分化及び維持のための培養条件確立
幹細胞の造血性内皮細胞への分化及び培養条件が確認された。具体的には、(株)チァバイオテックから入手した幹細胞（以下、「ＣＨＡ５２細胞」とする）２．０ｘ１０^５個を、６ウェル培養皿のうち、マトリゲルがコーティングされた１ウェルに分注し、２日間培養した。その後、前記細胞を、基本培地（StemlineII培地）に、ｂＦＧＦ ７ｎｇ／ｍｌ、ＣＨＩＲ １ｎＭ、アスコルビン酸６０ｎｇ／ｍｌ、ＶＥＧＦＡ １５ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ ３５ｎｇ／ｍｌ及びＢＭＰ４ １８ｎｇ／ｍｌを含む中胚葉特異条件培地で３日間培養した（以下、「段階I」とする）。その後、前記細胞を、基本培地（ApelII培地）に、ｂＦＧＦ ７ｎｇ／ｍｌ、ＶＥＧＦＡ １５ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ １８０ｎｇ／ｍｌ、ＦＬＴ３Ｌ １５０ｎｇ／ｍｌ、ＧＣＳＦ １８ｎｇ／ｍｌ、ＴＰＯ ８０ｎｇ／ｍｌ、ＥＰＯ １７ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－６ ２５ｎｇ／ｍｌ及びＩＧＦ－１ ３０ｎｇ／ｍｌを含む最適化された培地で６日間さらに培養した（以下、「段階II」とする）。６日目までの期間を前造血性内皮細胞（pro ＨＥ：pro hemogenic endothelial cell）と命名し、６日目になる日、造血性内皮細胞を継代培養し、高純度に分離させた。このとき、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡで培養基内を３分間処理し、単層（single layer）に分布された非造血性内皮細胞が先に落ちるところが確認された。その後、ＤＰＢＳで培地を洗浄した後、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡでさらに処理し、造血性内皮細胞クラスタ（cluster）を単一細胞で分離させた。分離された単一細胞を、０．４４μｍフィルタで濾過した後、１ウェルから出た細胞を２ウェルに分け、基本培地（ApelII培地）に、ｂＦＧＦ １１ｎｇ／ｍｌ、ＶＥＧＦＡ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ １７０ｎｇ／ｍｌ、ＦＬＴ３Ｌ １５０ｎｇ／ｍｌ、ＧＣＳＦ １８ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－６ ３５ｎｇ／ｍｌ、ＩＧＦ－１ ２５ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－７ １５ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１５ １０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－５ ２５ｎｇ／ｍｌ及びＤＬＬ１ ７ｎｇ／ｍｌを含む条件培地で２１日間継代培養した（以下、「段階III」とする）。２１日目まで３～４日間に、１回ずつ培地の半交換（half change）を維持した。

【0055】

製造例２～４
それぞれの段階において、下記表１～３の構成及び含量を含むという点を除いては、前記製造例１と同一方法で遂行した。

【0056】

【表1】

【0057】

【表2】

【0058】

【表3】

【0059】

［実施例］
実施例１．造血性内皮細胞の性状確認
前記製造例１の段階IIIで培養した造血性内皮細胞を、培養１３日目を基準にし、初期造血性内皮細胞（ＥＨＥ：early hemogenic endothelial cell）と後期造血性内皮細胞（ＬＨＥ：late hemogenic endothelial cell）とに分けた後、各細胞の性状が、顕微鏡（ｘ１００，ｘ２００及びｘ４００）を利用して確認された。

【0060】

図１は、初期造血性内皮細胞及び後期造血性内皮細胞の性状を示した写真である。

【0061】

その結果、図１に示されているように、初期造血性内皮細胞の場合、広くない分布の細胞塊をなし、クラスターを形成するところを確認することができ、該初期造血性内皮細胞外に、他細胞が共に分布するところを確認することができた。このとき、ＣＤ３１、ＶＥ－カドヘリンのような造血性内皮細胞のマーカータンパク質が発現するところを確認することができた。

【0062】

また、培養１３日目以後の後期造血性内皮細胞の場合、初期造血性内皮細胞に比べ、さらに多くの細胞が凝集されたところを確認することができ、そこで浮び上がる血液細胞の場合、確定的血液（definitive blood）の様相を示した。そのような後期造血性内皮細胞は、培養後期に行くほど細胞質が薄くなって細くなりながら、寿命が尽きるところを確認することができた。また、該後期造血性内皮細胞から、ＦＬＫ－１＋の巨核球・赤血球の先祖細胞（progenitors）が出ることを確認することができた。それら1つの後期造血性内皮細胞から、いくつかの巨核球・赤血球の先祖細胞を生成し、クローン増殖（clonal expansion）した結果、造血性内皮細胞は、主にロッド状形態（rod-like cells）を示し、典型的な血管内皮細胞の形態である敷石状形態（cobblestone-like cells）や間葉系幹細胞（mesenchymal stromal cells）形態とは差別されることを確認することができた。該後期造血性内皮細胞によって形成された血液細胞は、初期段階の、主に原始的血液細胞（primitive blood cell（主に、骨髄球系である））であり、後期造血性内皮細胞由来の細胞においては、確定的血液細胞（definitive blood cell（骨髄球系とリンパ球系とのいずれをも含む））を有しており、生成された血管内皮細胞におけるチューブ形成（tube formation）がなされることを確認することができた。前述のような結果から推し量り、造血性内皮細胞は、血管内皮細胞の特性と、血液細胞の特性とをいずれも保有しているとで思料される。

【0063】

図２Ａは、後期造血性内皮細胞の培養時間による細胞形態を示した写真、及び単一細胞の増殖を示したグラフである。

【0064】

その結果、図２Ａに示されているように、後期造血性内皮細胞の培養１日目においては、ポルピリン（porpyrin）の前駆物質である５－アミノレブリン酸合成酵素（５－aminolevulinate synthase）によるものと推定される明るい光により（白色矢印で表示される）、顕微鏡上で明るい黄色光を示すところを確認することができた。しかしながら、赤芽球（erythroblast）を全て生成した後の造血性内皮細胞においては、明るい光が消えることを確認することができた（Ｄ９（１０日目以後））。また、５日目、造血性内皮細胞においては、出芽（budding）される赤芽球（erythroblast）の形態を確認することができ、７日目以後、赤芽球が形成されるところを確認することができた。前記造血性内皮細胞のdoubling dayは１．２日ほどであり、分裂時間（doubling time）は、平均２９．５時間ほどであることが確認された。

【0065】

図２Ｂは、後期造血性内皮細胞のマーカータンパク質発現が確認された写真である。

【0066】

その結果、図２Ｂに示されているように、９日目以後、クラスターをなす造血性内皮細胞において、マーカータンパク質であるＣＤ３１、Tie－２、ＣＤ３４などが発現されるところが確認され、一部細胞においては、ＲＵＮＸ１、ブラキウリ（Brachyury）のような中胚葉マーカーが核中に残っているところを確認することができた。また、造血性内皮細胞から血液細胞として浮び上がるとき、該血液細胞にＦＬＫ－１タンパク質が集中的に発現されるところを確認することができた。

【0067】

実施例２．培養条件による後期造血性内皮細胞の増殖及び分化
前記実施例１で培養された後期造血性内皮細胞を、１ヵ月間、冷凍保管した後、３７℃ウォーターバスで解凍させた。その後、後期造血性内皮細胞の増殖及び分化に適する培地を確認するために、３種基本培地（ApelII，ＥＧＭ－２及びＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）を使用し、ApelII培地及びＤＭＥＭ／Ｆ１２培地の場合、ｂＦＧＦ ７ｎｇ／ｍｌ、ＶＥＧＦＡ １５ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ １８０ｎｇ／ｍｌ、ＦＬＴ３Ｌ １５０ｎｇ／ｍｌ、ＧＣＳＦ １８ｎｇ／ｍｌ、ＴＰＯ ８０ｎｇ／ｍｌ、ＥＰＯ １７ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－６ ２５ｎｇ／ｍｌ、ＩＧＦ－１ ３０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－３４５ｎｇ／ｍｌ及びＣＨＩＲ １ｎＭを添加した。ＥＧＭ－２培地の場合、前記製造例１のIII段階と同一の種類及び量のサイトカインをさらに添加した。その後、冷凍後に解凍した後期造血性内皮細胞を、前記３個の培地においてそれぞれ培養し、全ての培地は、３～４日に１回ずつ、培地の半交換（half change）を維持した。後期造血性内皮細胞の場合、冷凍後に解凍した血管内皮細胞であるために、培養皿に付着（attachment）して増殖すると期待された。

【0068】

図３Ａは、ApelII基本培地において造血性内皮細胞を培養し、１日目、３日目、７日目、及びその後の細胞形状を示した写真である。

【0069】

その結果、図３Ａに示されているように、ApelII基本培地においては、ほとんどの造血性内皮細胞が、培養皿の付着（attachment）に失敗し、早く死ぬことを確認することができた。しかしながら、７日目以後まで生存した造血性内皮細胞の場合、内皮細胞としての機能が安定化されれば、白血球類似細胞（ＷＢＣ-like cell）を生成したり、赤芽球コロニーを形成したりするところを確認することができた。ただし、ＢＧＭ－２基本培地及びＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地で培養した造血性内皮細胞の血液細胞生産量に比べ、顕著に少なかった。

【0070】

図３Ｂは、ＥＧＭ－２基本培地で造血性内皮細胞を培養し、１日目及び３日目の細胞形状を示した写真である。

【0071】

その結果、図３Ｂに示されているように、ＥＧＭ－２基本培地で培養した造血性内皮細胞は、培養皿に付着した後、安定して増殖し、増殖速度も、他の基本培地に比べて速く、安定していた。特に、７日以上増殖された造血性内皮細胞の場合、典型的な敷石状形態の血管内皮前駆細胞（endothelial progenitor cell）群と、非定形的な血管内皮細胞形態の細胞群とに分けられたところを確認することができた。一方、ApelII基本培地で培養した細胞において、細胞付着がなされていない細胞を、ＥＧＭ－２培地で３日間培養し、付着細胞の増殖を誘導した後、さらにApelII培地で培養した結果、造血性内皮細胞が正常に増殖するところを確認することができた。すなわち、ＥＧＭ－２基本培地は、造血性内皮細胞の増殖と生着とに肯定的であり、培養皿内において、造血性内皮細胞が安定している付着と増殖とを行うことにより、血液細胞の生産に影響を及しうる。

【0072】

図３Ｃは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地で造血性内皮細胞を培養し、１日目、３日目、７日目、及びその後の細胞形状を示した写真である。

【0073】

その結果、図３Ｃに示されているように、ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地で培養した造血性内皮細胞は、培養皿に付着し、増殖するところを確認することができた。ＥＧＭ－２基本培地で培養した造血性内皮細胞と比較し増殖速度が４～５日ほど遅れたが、造血性内皮細胞のコロニーが多数形成され、８日目以後からは、多量の血液細胞を安定して生成するところを確認することができた。

【0074】

実施例３．造血性内皮細胞で発現するタンパク質マーカーの確認
前記実施例２の基本培地により、造血性内皮細胞で発現するマーカータンパク質の発現を比較した。その結果、基本培地によるマーカータンパク質の発現に大きく違いがなく、造血性内皮細胞において、典型的なマーカータンパク質が発現するところを確認することができた。

【0075】

図４Ａは、ＥＧＭ－２基本培地で３日間培養した造血性内皮細胞におけるマーカータンパク質を確認した結果である。

【0076】

図４Ｂは、ＥＧＭ－２基本培地で１４日間培養した造血性内皮細胞のTie－２ enrichmentを確認した写真である。

【0077】

その結果、図４Ａに示されているように、ＥＧＭ－２基本培地で培養した造血性内皮細胞グループにおいては、ＣＤ３１ ２７．９％、ＣＤ３４ ８．２％、ＣＤ１４４ ２９．９％、Ｆｌｋ－１ ４．５％のタンパク質マーカーが発現され、ＣＤ１４４＋ＣＤ３１＋１１．３％、ＣＤ１４４＋ＣＤ３４＋ ８．５％、ＣＤ３１＋ＣＤ３４＋ １０．２％、Ｆｌｋ－１＋ＣＤ３４＋ ４．９％のタンパク質マーカーが発現されるところを確認することができた。また、図４Ｂに示されているように、ＣＤ３１を利用し、ＭＡＣＳソーティング（sorting）されグループにおいて、Tie－２の発現が、ＣＤ３１＋細胞群において、２４．９％ enrichmentされているところを知ることができ、ＣＤ３１－細胞群においては、１．８％ enrichmentされているところを確認することができた。そのような結果は、ＣＤ３１＋細胞の造血性内皮細胞へのcommitmentを示唆する。また、Tie２＞ＣＤ１４４＞ＣＤ３１＞ＣＤ３４＞ＦＬＫ１の順序で、造血性内皮細胞マーカーが発現することを確認することができた。

【0078】

実施例４．リンパ球系細胞の生成誘導のための造血性内皮細胞の培養条件確認
前記実施例２の結果を基に、リンパ球系生成を誘導するための造血性内皮細胞の培養条件がさらに確認された。まず、１０．５～１１．５日のマウス胎児（rat fetus）において、ＡＧＭ（aorta gonad mesonephros）と肝組織とを分離させた。その後、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ（Eppendorf tube）ふたの裏でミンチ（mincing）した組織を、ＤＰＢＳで洗浄した後、前記実施例２と同一の３種培地において、マウスの出生日である２０日目まで培養した。それぞれの培地で培養された造血性内皮細胞の形態を確認するために、ヘマトキシリン・エオジン（hematoxylin & eosin）染色を行った。

【0079】

図５Ａは、マウスの肝臓内造血性内皮細胞におけるリンパ球系細胞生成を確認した結果であり、図５Ｂは、マウスＡＧＭ内造血性内皮細胞におけるリンパ球系細胞生成を確認した結果である。図５Ｃは、それぞれの基本培地で培養された造血性内皮細胞の性状及びコロニー形成、リンパ球系細胞、並びに骨髄球系細胞の生成程度を図表化し、造血性内皮細胞の形態を確認した結果である。

【0080】

肝組織由来血液細胞においては、造血性内皮細胞の獲得がほとんどなされていないが、該造血性内皮細胞で作られた血液細胞が肝臓に浸潤（infiltration）して成熟する過程において、それぞれの３種培地によって異なる傾向を示すところが確認された。具体的には、図５Ａに示されているように、ＥＧＭ－２基本培地の場合、造血性内皮細胞がいずれも死ぬことが確認された。一方、ApelII基本培地の場合、３日目内に、巨核球・赤血球細胞、前正赤芽球（pronormoblast）から正染性正赤芽球（orthochromic normoblast）まで細胞が迅速に誘導され、６日目内に細胞が消えるところを確認することができた。また、ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地の場合、赤血球系よりは、巨核球・赤血球細胞由来の巨核母球、巨核球（ＭＫ－II）まで分化が旺盛であり、前血小板突起とsiliaとの形成を目につくように確認することができた。特に、Ｈｅｍｅ装着赤血球系の細胞よりは、白血球系細胞の生成が多いところを確認することができた。

【0081】

なお、図５Ｂに示されているように、ＡＧＭに存在する造血性内皮細胞の場合、培地により、最大９日目までの培養程度が異なることを確認することができた。具体的には、ＥＧＭ－２基本培地の場合、血液細胞の消滅が目立って上昇しているところを確認することができた。すなわち、ヒト全分化能由来の造血性内皮細胞とは異なるように、マウスの造血性内皮細胞は、長期間生存しないということを知ることができる。しかしながら、ApelII基本培地の場合、赤血球系細胞のenrichmentが早くなされ、白血球系細胞の増殖が顕著に増大するところを確認することができた。また、ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地の場合、赤血球系細胞の分化より、巨核球と白血球との分化程度が顕著に高いことを確認することができた。結果として、図５Ｃに示されているように、肝臓及びＡＧＭに由来する細胞は、ＥＧＭ－２基本培地に比べ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地及びApelII基本培地において、付着及び細胞増殖が活発になされ、造血性内皮細胞及び血球細胞において、長期間分化が可能であることを知ることができる。

【0082】

図５Ｄは、ＡＧＭ内の分化された細胞を利用し、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１の発現程度を分析した結果を示したグラフである。

【0083】

その結果、図５Ｄに示されているように、ApelII基本培地の場合、１０日目に、浮遊（suspension）細胞内の自然殺害細胞の誘導が最も高く、ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地の場合、６日目に、巨核球と共に、ＣＤ４，ＣＤ８細胞の誘導が迅速に促されて維持されるところを確認することができた。従って、前記２個の基本培地のいずれにおいても、ＡＧＭ由来の血液細胞が維持されるということを知ることができる。

【0084】

実施例５．ヒト多能性幹細胞の造血性内皮細胞及び血液細胞への分化確認
前記実施例４において、マウス胎児の体内由来の造血性内皮細胞が血液細胞に分化するところが確認されたことを基に、前記実施例１で培養された後期造血性内皮細胞を、実施例２の培地において、分化及び増殖し、血液細胞に分化させた後、表面マーカーが確認された。具体的には、前記製造例１において、段階IないしIIIによって２１日間培養した造血性内皮細胞を、３４日目になる日までさらに培養した。このとき、培養２８日目以後には、造血性内皮細胞の脱落がなされたり、細胞死滅の頻度が増大したりするために、造血性内皮細胞の機能的な窓（functional window）を２１～２８日目までに定めた。３４日目になる日まで培養された造血性内皮細胞に限り、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡでさらに処理し、細胞クラスターを単一細胞に分離させた。その後、ＣＦＵアッセイ（assay）を行い、骨髄球系細胞のコロニー生成いかんが確認された。

【0085】

図６Ａは、ヒト全分化能幹細胞由来の造血性内皮細胞からのリンパ球系細胞の生成段階別細胞の性状及び発現マーカーを示した結果である。

【0086】

図６Ｂは、ＩＬ－５及びＤＤＬ１で処理したスポット（spot）において、リンパ球系細胞への分化がなされるか否かということを、リンパ球系転写因子の発現によって確認したグラフである。

【0087】

その結果、図６Ａに示されているように、１３日目以後３４日目まで培養された造血性内皮細胞は、骨髄球系細胞のコロニーが生成され、分化がなされることを確認することができた。また、図６Ｂに示されているように、ＩＬ－５及びＤＬＬ１で処理したスポット（spot）において、リンパ球系転写因子（transcription factor）が多数発現されることを確認することができた。すなわち、一様相による培地は、ヒト多能性幹細胞の長期培養が可能であり、造血性内皮細胞及び血管細胞（リンパ球系細胞）への分化が可能であるということを知ることができる。

【0088】

実施例６．ヒト多能性幹細胞のＴリンパ球前駆細胞への分化確認
前記実施例４において、 マウス胎児の体内由来の造血性内皮細胞が血液細胞に分化するところが確認されたことを基に、前記実施例１で培養された後期造血性内皮細胞を、実施例２の培地で分化及び増殖し、Ｔリンパ球前駆細胞、すなわち、αβＴ細胞の前駆細胞であるγδＴ細胞に分化させた後、表面マーカーが確認された。具体的には、前記製造例１において、段階IないしIIIによって２１日間培養された造血性内皮細胞を、３１日目になる日までさらに培養した。このとき、培養３１日目に、確定的造血生成過程を介し、リンパ球系細胞の生成がなされるので、造血性内皮細胞の機能的な窓（functional window）を、２１～３１日までに定めた。培養後３１日目になる日、ＦＡＣＳを行い、細胞表面マーカーを分析した。

【0089】

図７Ａは、ヒト全分化能幹細胞由来の後期造血性内皮細胞の培養３１日目Ｔリンパ球前駆細胞であるγδＴ細胞の表面マーカーをＦＡＣＳで確認した結果である。

【0090】

図７Ｂは、ヒト全分化能幹細胞由来の後期造血性内皮細胞の培養３１日目Ｔリンパ球前駆細胞であるγδＴ細胞の表面マーカーを定量化したグラフである。

【0091】

図７Ｃは、ヒト全分化能幹細胞由来の後期造血性内皮細胞の培養３１日目Ｔリンパ球前駆細胞であるγδＴ細胞の細胞形態を確認した結果である。

【0092】

その結果、図７Ａ及び図７Ｂに示されているように、後期造血性内皮細胞は、培養２２日目に、確定的造血細胞の段階に移りながら、ＣＤ３の発現が示され始めた。また、培養３１日目に、付着細胞と比較し、 浮遊（suspension）細胞において、ＣＤ３陽性細胞数が有意的に多く、約４０％の頻度率を示すことを確認することができた。また、ＣＤ３陽性細胞において、ＴＣＲ受容体亜型（subtype）を確認することができ、付着細胞と比較し、浮遊細胞において、ＴＣＲ Ｖδ２の発現が有意的に高いということを確認することができた。

【0093】

前述の本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有した者であるならば、本発明の技術的思想や、必須な特徴を変更せずとも、他の具体的な形態に容易に変形が可能であるということを理解することができるであろう。従って、以上で記述された実施例は、全ての面において、例示的なものであり、限定的ではないと理解されなければならない。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【国際調査報告】