特表 2024-506346 組換えヒト酸性アルファグルコシダーゼ及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-13

(54)【発明の名称】組換えヒト酸性アルファグルコシダーゼ及びその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/47 20060101AFI20240205BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20240205BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20240205BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240205BHJP

   A61K 47/14 20170101ALI20240205BHJP

   A61K 47/04 20060101ALI20240205BHJP

   C12N 9/24 20060101ALN20240205BHJP

   C12P 21/02 20060101ALN20240205BHJP

【ＦＩ】

A61K38/47

A61P3/00

A61K47/12

A61K47/26

A61K47/14

A61K47/04

C12N9/24 ZNA

C12P21/02 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023548587

(86)(22)【出願日】2022-02-11

(85)【翻訳文提出日】2023-10-10

(86)【国際出願番号】 US2022016124

(87)【国際公開番号】W WO2022174037

(87)【国際公開日】2022-08-18

(31)【優先権主張番号】63/148,596

(32)【優先日】2021-02-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/162,683

(32)【優先日】2021-03-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507170099

【氏名又は名称】アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ドゥ， ハング

(72)【発明者】

【氏名】ゴッシャル， ラッセル

(72)【発明者】

【氏名】チャー， ヒング

(72)【発明者】

【氏名】バース， ジェイ

【テーマコード（参考）】

4B064

4C076

4C084

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4C076BB01

4C076CC21

4C076DD26Z

4C076DD38

4C076DD43

4C076DD43Z

4C076DD46

4C084AA01

4C084AA02

4C084BA01

4C084CA18

4C084CA53

4C084CA56

4C084DC22

4C084NA14

4C084ZC21

(57)【要約】

本明細書には、ポンペ病を治療する方法であって、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ分子の集団又はその医薬組成物若しくは製剤と、薬理学的シャペロンとを投与することを含む方法が提供される。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

必要としている対象のポンペ病を治療する方法であって、前記対象に、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）分子の集団を薬理学的シャペロンと同時に又は逐次的に投与することを含む方法において；
前記ｒｈＧＡＡ分子が７つの潜在的なＮ－グリコシル化部位を含み；
前記ｒｈＧＡＡ分子上のＮ－グリカンの４０％～６０％が複合型Ｎ－グリカンであり；
前記ｒｈＧＡＡ分子が、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いて決定したとき、第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位に１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり少なくとも０．５ｍｏｌのビス－マンノース－６－リン酸（ビス－Ｍ６Ｐ）を含み；及び
前記方法が、１）ベースライン、又は（２）アルグルコシダーゼアルファと前記薬理学的シャペロンのプラセボとを投与することを含む対照治療と比較して、前記対象の１つ以上の疾患アウトカムを改善する、方法。

【請求項2】

６分間歩行テストによって測定されるとおりの、前記対象の運動機能を改善する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

６分間歩行距離（６ＭＷＤ）のベースラインからの変化が少なくとも２０メートルである、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

６ＭＷＤのベースラインからの前記変化が５２週間の治療後に少なくとも２０メートルである、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記対象の６ＭＷＤが前記対照治療と比較すると少なくとも１０増加する、請求項２に記載の方法。

【請求項6】

前記対照治療と比較すると、前記対象の６ＭＷＤが５２週間の治療後に少なくとも１３メートル改善する、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記対象が３００メートル未満のベースライン６ＭＷＤを有する、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記対象が３００メートル以上のベースライン６ＭＷＤを有する、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

努力肺活量（ＦＶＣ）テストによって測定されるとおりの、前記対象の肺機能を改善する、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

治療後、前記対象のパーセント対予測値ＦＶＣが、ベースラインと比較すると増加するか、又はベースラインと比較すると３％未満の低下となるかのいずれかである、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

治療後、前記対象のパーセント対予測値ＦＶＣが、ベースラインと比較すると１％未満の低下となる、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記対象のパーセント対予測値ＦＶＣが、５２週間の治療後にベースラインと比較すると１％未満の低下となる、請求項１０又は１１に記載の方法。

【請求項13】

前記対照治療と比較すると、前記対象のパーセント対予測値ＦＶＣが治療後に有意に改善するか又は安定化する、請求項９に記載の方法。

【請求項14】

前記対照治療と比較すると、前記対象のパーセント対予測値ＦＶＣが治療後に少なくとも３％改善する、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記対照治療と比較すると、前記対象のパーセント対予測値ＦＶＣが５２週間の治療後に少なくとも３％改善する、請求項１２又は１３に記載の方法。

【請求項16】

前記対象が５５％未満のベースラインＦＶＣを有する、請求項９～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記対象が５５％以上のベースラインＦＶＣを有する、請求項９～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

歩行・階段・ガワーズ・椅子（ＧＳＧＣ）テストによって測定されるとおりの、前記対象の運動機能を改善する、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

ベースラインと比較すると、前記対象のＧＳＧＣスコアが、治療後に少なくとも０．５点の低下によって指示されるとおり改善する、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

ベースラインと比較すると、前記対象のＧＳＧＣスコアが、５２週間の治療後に少なくとも０．５点の低下によって指示されるとおり改善する、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記対照治療と比較すると、前記対象のＧＳＧＣスコアが、治療後に有意に改善する、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

前記対照治療と比較すると、前記対象のＧＳＧＣスコアが、治療後に少なくとも１点の低下によって指示されるとおり改善する、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記対照治療と比較すると、前記対象のＧＳＧＣスコアが、５２週間の治療後に少なくとも１点の低下によって指示されるとおり改善する、請求項２１又は２２に記載の方法。

【請求項24】

少なくとも１つの筋損傷マーカー及び／又は少なくとも１つのグリコーゲン蓄積マーカーのレベルを減少させる、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

前記少なくとも１つの筋損傷マーカーがクレアチンキナーゼ（ＣＫ）を含み、及び／又は前記少なくとも１つのグリコーゲン蓄積マーカーが尿中ヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

ベースラインと比較すると、前記対象のＣＫレベルが治療後に少なくとも２０％減少し、及び／又は前記対象の尿中Ｈｅｘ４レベルが治療後に少なくとも３０％減少する、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

ベースラインと比較すると、前記対象のＣＫレベルが５２週間の治療後に少なくとも２０％減少し、及び／又は前記対象の尿中Ｈｅｘ４レベルが５２週間の治療後に少なくとも３０％減少する、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記対照治療と比較すると、前記対象のＣＫ及び／又は尿中Ｈｅｘ４レベルが治療後に有意に減少する、請求項２５に記載の方法。

【請求項29】

前記対照治療と比較すると、前記対象のＣＫレベルが治療後に少なくとも３０％減少し、及び／又は前記対象の尿中Ｈｅｘ４レベルが治療後に少なくとも４０％減少する、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記対照治療と比較すると、前記対象のＣＫレベルが５２週間の治療後に少なくとも３０％減少し、及び／又は前記対象の尿中Ｈｅｘ４レベルが５２週間の治療後に少なくとも４０％減少する、請求項２８又は２９に記載の方法。

【請求項31】

前記対象が、ＥＲＴ歴のある患者である、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記対象が、ＥＲＴ未経験の患者である、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

必要としている対象のポンペ病を治療する方法であって、前記対象に、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）分子の集団を薬理学的シャペロンと同時に又は逐次的に投与することを含む方法において；
前記ｒｈＧＡＡ分子が７つの潜在的なＮ－グリコシル化部位を含み；
前記ｒｈＧＡＡ分子上のＮ－グリカンの４０％～６０％が複合型Ｎ－グリカンであり；
前記ｒｈＧＡＡ分子が、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いて決定したとき、第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位に１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり少なくとも０．５ｍｏｌのビス－マンノース－６－リン酸（ビス－Ｍ６Ｐ）を含み；
前記方法が、１）ベースライン、又は（２）アルグルコシダーゼアルファと前記薬理学的シャペロンのプラセボとを投与することを含む対照治療と比較すると、前記対象の１つ以上の疾患症状を改善し、及び
前記対象が、ＥＲＴ歴のある患者である、方法。

【請求項34】

６分間歩行テストによって測定されるとおりの、前記対象の運動機能を改善する、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

ベースラインと比較すると、前記対象の６分間歩行距離（６ＭＷＤ）が治療後に少なくとも１５メートル又は少なくとも５％増加する、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

ベースラインと比較すると、前記対象の６分間歩行距離（６ＭＷＤ）が５２週間の治療後に少なくとも１５メートル又は少なくとも４％増加する、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記対照治療と比較すると、前記対象の６ＭＷＤが治療後に有意に改善する、請求項３３に記載の方法。

【請求項38】

前記対照治療と比較すると、前記対象の６ＭＷＤが治療後に少なくとも１５メートル改善する、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記対照治療と比較すると、前記対象の６ＭＷＤが５２週間の治療後に少なくとも１５メートル改善する、請求項３７又は３８に記載の方法。

【請求項40】

前記対象が３００メートル未満のベースライン６ＭＷＤを有する、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記対象が３００メートル以上のベースライン６ＭＷＤを有する、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

努力肺活量（ＦＶＣ）テストによって測定されるとおりの、前記対象の肺機能を改善する、請求項３３に記載の方法。

【請求項43】

治療後、前記対象のパーセント対予測値ＦＶＣが、ベースラインと比較すると少なくとも０．１％増加する、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記対象のパーセント対予測値ＦＶＣが、５２週間の治療後にベースラインと比較すると少なくとも０．１％増加する、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記対照治療と比較すると、前記対象のパーセント対予測値ＦＶＣが治療後に有意に改善する、請求項４２に記載の方法。

【請求項46】

前記対照治療と比較すると、前記対象のパーセント対予測値ＦＶＣが治療後に少なくとも４％改善する、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記対照治療と比較すると、前記対象のパーセント対予測値ＦＶＣが５２週間の治療後に少なくとも４％改善する、請求項４５又は４６に記載の方法。

【請求項48】

前記対象が５５％未満のベースラインＦＶＣを有する、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記対象が５５％以上のベースラインＦＶＣを有する、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

歩行・階段・ガワーズ・椅子（ＧＳＧＣ）テストによって測定されるとおりの、前記対象の運動機能を改善する、請求項３３に記載の方法。

【請求項51】

ベースラインと比較すると、前記対象のＧＳＧＣスコアが、治療後に少なくとも０．５点の低下によって指示されるとおり改善する、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

ベースラインと比較すると、前記対象のＧＳＧＣスコアが、５２週間の治療後に少なくとも０．５点の低下によって指示されるとおり改善する、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記対照治療と比較すると、前記対象のＧＳＧＣスコアが、治療後に有意に改善する、請求項５０に記載の方法。

【請求項54】

前記対照治療と比較すると、前記対象のＧＳＧＣスコアが、治療後に少なくとも１点の低下によって指示されるとおり改善する、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記対照治療と比較すると、前記対象のＧＳＧＣスコアが、５２週間の治療後に少なくとも１点の低下によって指示されるとおり改善する、請求項５３又は５４に記載の方法。

【請求項56】

少なくとも１つの筋損傷マーカー及び／又は少なくとも１つのグリコーゲン蓄積マーカーのレベルを減少させる、請求項３３に記載の方法。

【請求項57】

前記少なくとも１つの筋損傷マーカーがクレアチンキナーゼ（ＣＫ）を含み、及び／又は前記少なくとも１つのグリコーゲン蓄積マーカーが尿中ヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）を含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

ベースラインと比較すると、前記対象のＣＫレベルが治療後に少なくとも１５％減少し、及び／又は前記対象の尿中Ｈｅｘ４レベルが治療後に少なくとも２５％減少する、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

ベースラインと比較すると、前記対象のＣＫレベルが治療後に少なくとも１５％減少し、及び／又は前記対象の尿中Ｈｅｘ４レベルが５２週間の治療後に少なくとも２５％減少する、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記対照治療と比較すると、前記対象のＣＫ及び／又は尿中Ｈｅｘ４レベルが治療後に有意に減少する、請求項５７に記載の方法。

【請求項61】

前記対照治療と比較すると、前記対象のＣＫレベルが治療後に少なくとも３０％減少し、及び／又は前記対象の尿中Ｈｅｘ４レベルが治療後に少なくとも４０％減少する、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記対照治療と比較すると、前記対象のＣＫレベルが治療後に少なくとも３０％減少し、及び／又は前記対象の尿中Ｈｅｘ４レベルが５２週間の治療後に少なくとも４０％減少する、請求項６０又は６１に記載の方法。

【請求項63】

前記ｒｈＧＡＡ分子集団が、５ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、任意選択で２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記ｒｈＧＡＡ分子集団が隔週で投与される、請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記ｒｈＧＡＡ分子集団が静脈内投与される、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

前記薬理学的シャペロンがミグルスタット又はその薬学的に許容可能な塩であり、更に任意選択で前記ミグルスタット又はその薬学的に許容可能な塩が経口投与される、請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記ミグルスタット又はその薬学的に許容可能な塩が１９５ｍｇ又は２６０ｍｇの用量で投与される、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記ミグルスタット又はその薬学的に許容可能な塩が、前記ｒｈＧＡＡ分子集団の投与前、任意選択で前記ｒｈＧＡＡ分子集団の投与１時間前に投与される、請求項６６又は６７に記載の方法。

【請求項69】

前記対象が、ミグルスタット又はその薬学的に許容可能な塩の投与前の少なくとも２時間及び投与後の少なくとも２時間にわたって絶食する、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記ｒｈＧＡＡ分子が、配列番号４又は配列番号６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記ｒｈＧＡＡ分子が、配列番号４又は配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１～７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項72】

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて決定したとき、前記ｒｈＧＡＡ分子の少なくとも３０％が、１個のマンノース－６－リン酸残基（モノ－Ｍ６Ｐ）又はビス－Ｍ６Ｐを担持するＮ－グリカン単位を１つ以上含む、請求項１～７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて決定したとき、前記ｒｈＧＡＡ分子が平均して１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり０．５ｍｏｌ～７．０ｍｏｌのモノ－Ｍ６Ｐ又はビス－Ｍ６Ｐを含む、請求項１～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて決定したとき、前記ｒｈＧＡＡ分子が平均して１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり２．０～８．０ｍｏｌのシアル酸を含む、請求項１～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて決定したとき、前記ｒｈＧＡＡ分子が平均して１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり少なくとも２．５ｍｏｌのＭ６Ｐ及び１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり少なくとも４ｍｏｌのシアル酸を含む、請求項１～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり、前記ｒｈＧＡＡ分子が平均して
（ａ）第２の潜在的なＮ－グリコシル化部位に０．４～０．６ｍｏｌのモノ－Ｍ６Ｐ；
（ｂ）第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位に０．４～０．６ｍｏｌのビス－Ｍ６Ｐ；又は
（ｃ）第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位に０．３～０．４ｍｏｌのモノ－Ｍ６Ｐ
を含み；
（ａ）～（ｃ）がＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて決定される、請求項１～７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり、前記ｒｈＧＡＡ分子が４ｍｏｌ～７．３ｍｏｌのシアル酸を更に含み；及び
１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり、前記ｒｈＧＡＡ分子が平均して
（ａ）第３の潜在的なＮ－グリコシル化部位に０．９～１．２ｍｏｌのシアル酸；
（ｂ）第５の潜在的なＮ－グリコシル化部位に０．８～０．９ｍｏｌのシアル酸；又は
（ｃ）第６の潜在的なＮ－グリコシル化部位に１．５～４．２ｍｏｌのシアル酸
を含み；
（ａ）～（ｃ）がＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて決定される、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

前記ｒｈＧＡＡ分子集団が医薬組成物に製剤化される、請求項１～７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

前記医薬組成物が、クエン酸塩、リン酸塩、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝液と、マンニトール、ポリソルベート８０、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤とを更に含み；前記医薬組成物が５．０～７．０のｐＨを有する、請求項７８に記載の方法。

【請求項80】

前記医薬組成物が５．０～６．０のｐＨを有する、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

前記医薬組成物が、水、酸性化剤、アルカリ化剤、又はこれらの組み合わせを更に含む、請求項７８又は７９に記載の方法。

【請求項82】

前記医薬組成物中、前記ｒｈＧＡＡ分子集団が５～５０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、前記少なくとも１つの緩衝液が、１０～１００ｍＭの濃度で存在するクエン酸ナトリウム緩衝液であり、前記少なくとも１つの賦形剤が、１０～５０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するマンニトール及び０．１～１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するポリソルベート８０であり、及び前記医薬組成物が水を更に含み、及び任意選択で酸性化剤及び／又はアルカリ化剤を含み；前記医薬組成物が６．０のｐＨを有する、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記医薬組成物中、前記ｒｈＧＡＡ分子集団が１５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、前記クエン酸ナトリウム緩衝液が２５ｍＭの濃度で存在し、前記マンニトールが２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、及び前記ポリソルベート８０が０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

前記ｒｈＧＡＡがチャイニーズハムスター卵巣細胞から産生される、請求項１～８３のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年３月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／１６２，６８３号明細書、及び２０２１年２月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／１４８，５９６号明細書の利益を主張するものであり、これらの各々の開示は本明細書によって全体として参照により援用される。

【0002】

電子的に提出されたテキストファイルに関する記載
本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、全体として参照により本明細書に援用される：コンピュータ可読形式の複製物である配列表（ファイル名：ＡＭＣＳ＿０１３＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０２２年２月１１日、ファイルサイズ約４５，５６０バイト）。

【0003】

本開示は、組換えヒトα－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）及びポンペ病の治療に関する。

【背景技術】

【0004】

ポンペ病は、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）活性の欠損によって生じる遺伝性のリソソーム蓄積症である。ポンペ病を有する人は、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）を欠いているか、又はそのレベルが低く、ＧＡＡとは、グリコーゲンを分解して、筋肉の主なエネルギー源であるグルコースに変える酵素である。この酵素欠損症は、通常はグリコーゲン及び他の細胞残屑又は老廃物を分解する酵素を持つ細胞内小器官であるリソソームに、過剰なグリコーゲン蓄積を引き起こす。ポンペ病を有する対象のある種の組織、特に筋肉にグリコーゲンが蓄積すると、細胞が正常に機能する能力が損なわれる。ポンペ病では、グリコーゲンが正しく代謝されず、特に骨格筋細胞、及びこの疾患の乳児発症型では心筋細胞のリソソームに徐々に蓄積する。グリコーゲンの蓄積は、筋肉及び神経細胞並びに他の罹患組織の細胞に損傷を与える。

【0005】

従来、ポンペ病は、臨床的には、発症年齢に応じて早期乳児型又は遅発型のいずれかとして認識されている。発症年齢は、ポンペ病を引き起こす遺伝子突然変異の重症度と平行する傾向がある。最も重症度の高い遺伝子突然変異は、ＧＡＡ活性の完全な喪失を引き起こし、乳児期に早期発症型疾患として現れる。ＧＡＡ活性を減少させるが、それを消失させることはない遺伝子突然変異は、発症及び進行の遅延を呈する型のポンペ病と関連付けられる。乳児発症のポンペ病は生後間もなく現れ、筋脱力、呼吸不全及び心不全を特徴とする。治療しなければ、通常は２年以内に死亡に至る。若年及び成人発症のポンペ病は人生のより遅い時期に現れ、通常、乳児発症疾患と比べると進行が緩徐である。この型の疾患もまた、それが概して心臓には発症しないとはいえ、骨格筋及び呼吸に関わる筋肉の衰弱が原因で死に至り得る。

【0006】

ポンペ病の現在の非姑息的治療には、ＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）及びＭＹＯＺＹＭＥ（登録商標）の商標で販売されている組換えアルグルコシダーゼアルファ製剤を使用した酵素補充療法（ＥＲＴ）が関わる。この従来の酵素補充療法は、ｒｈＧＡＡを投与することによってリソソームに欠けているＧＡＡを補充し、ひいては細胞がリソソームのグリコーゲンを分解する能力を修復することによってポンペ病を治療しようとするものである。ＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）及びＭＹＯＺＹＭＥ（登録商標）は、Ｇｅｎｚｙｍｅによって生物製剤として生産又は販売されている、米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）の承認を受けている従来型のｒｈＧＡＡであり、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（２０１４）（これは本明細書によって参照により援用される）に参照として記載されている。アルグルコシダーゼアルファは、化学名［１９９－アルギニン，２２３－ヒスチジン］プレプロ－α－グルコシダーゼ（ヒト）；分子式、Ｃ_４７５８Ｈ_７２６２Ｎ_１２７４Ｏ_１３６９Ｓ_３５；ＣＡＳ番号４２０７９４－０５－０として識別される。これらの製剤は、ＩＩ型糖原病（ＧＳＤ－ＩＩ）又は酸性マルターゼ欠損症としても知られるポンペ病の対象に投与される。

【0007】

しかしながら、現在のＥＲＴは、良くても、筋機能、筋力及び呼吸機能の尺度の限られた改善を一定の期間に限りもたらすものでしかなく、その後これらのパラメータはゆっくりと悪化する（Ｔｏｓｃａｎｏ ａｎｄ Ｓｃｈｏｓｅｒ ２０１３；Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ ２０１２）。

【0008】

２０１２年、遅発型ポンペ病（ＬＯＰＤ）の対象で実施された全ての試験の系統的レビューが、Ｔｏｓｃａｎｏ ａｎｄ Ｓｃｈｏｓｅｒ ２０１３により実施された。このレビューには、既発表の試験からのＬＯＰＤの対象３６８例に関するデータが含まれ、その中には、それまで少なくとも２年間にわたってアルグルコシダーゼアルファの投与を受けていた２７例の若年対象（年齢範囲：２～１７歳）及び２５１例の成人対象が含まれた。結果が指し示すところは、３０％を超える対象でアルグルコシダーゼアルファによる治療時に初期の改善が見られず、治療を行っても筋機能及び呼吸機能の増悪が起こり続けたというものであった。当初アルグルコシダーゼアルファ治療に反応した対象の群では、幾つかの追加的な長期試験により、改善が通常約２年ほどしか続かないことが明らかになった。その後、対象は概してプラトーに達してから、次第に悪化し始めた。

【0009】

２０１２年、英国国立健康研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の一部としての英国医療技術評価（Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）プログラム（Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ ２０１２）は、現在承認されているＥＲＴ標準治療、アルグルコシダーゼアルファを受けた８１例のポンペ病患者（乳児発症型及び遅発型（小児及び成人）を含む）の時系列データのレビューから導き出された勧告を出した。ポンペ病進行の主要マーカー（努力肺活量、人工呼吸依存状態、運動性、６分間歩行テスト、筋力、及びボディ・マス・インデックス）が評価され、アルグルコシダーゼアルファ療法を受けている治療時間でモデル化された。この評価の結果が指し示すところは、ＬＯＰＤ患者のＦＶＣ、６分間歩行距離、及び筋力の改善が、アルグルコシダーゼアルファによるＥＲＴの開始後最初の２年間に起こり、この時間枠を超えると、治療継続の傍ら悪化が起こるというものであった。加えて、アルグルコシダーゼアルファの投与を受けているＬＯＰＤの対象３８例における３年間の試験では、対象が治療初年度に運動機能の改善を実証し、それが２年目も概して安定したまま、３年目に悪化し始めたことが明らかになった（Ｒｅｇｎｅｒｙ ｅｔ ａｌ ２０１２）。

【0010】

更には、第３相ＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）試験での１０年間のフォローアップを提供する報告によれば、治療の最初の数年間に運動及び肺機能の何らかの改善が見られた後、治療が続く一方で対象はゆっくりと悪化し始めたことが明らかになった（ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌｏｅｇ ｅｔ ａｌ ２０１７）。この試験では、療法を受けて３年目から６年目までに、ベースライン６分間歩行距離パーセント対予測値の平均約１０％の悪化があり、約８０％の対象に悪化が見られた。

【0011】

アルグルコシダーゼアルファに関する忍容性の最も重大な問題は、注入関連反応（ＩＡＲ）の発生であり、これには、一部の例では、生命を脅かすようなアナフィラキシー又は他の重症アレルギー反応が含まれ得る（ＭＹＯＺＹＭＥ（登録商標）Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１８）。これらの事象の管理には、用量の減量、注入速度及び長時間に及ぶ注入時間の低減、及び投与の中断又は中止が含まれる。抗ヒスタミン薬及びステロイド薬の（注入前の）前投薬もまた、アルグルコシダーゼアルファ注入に関係するＩＡＲ及び過敏反応の発生及び重症化を予防し及び低減するため定期的に用いられている。これらの対策にもかかわらず、ポンペ病患者にはなおもＩＡＲが起こる恐れがあり、中には現在承認されているＥＲＴの定期的な注入を忍容できない患者もいる。

【0012】

２０１７年、欧州１１ヵ国からのポンペ病分野の専門家のネットワークである欧州ポンペ病コンソーシアム（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｏｍｐｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）により、文献の系統的レビューが行われた（ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌｏｅｇ ｅｔ ａｌ ２０１７）。総計５８６例の個別の成人対象を網羅した、１件の臨床試験及び４３件の観察研究から得られたデータに基づき、群レベルでのＥＲＴの効果のエビデンスがこのコンソーシアムにより評価された。現在の欧州ポンペ病コンソーシアム（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｏｍｐｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）の統一見解では、重篤なＩＡＲの発生又は疾患症状の臨床的悪化の進行、並びに高中和抗体（Ａｂ）価の発生があれば、それらは既存のＥＲＴ治療を事実上無効にするものであり、ＥＲＴ療法を中止することとしている。欧州ポンペ病コンソーシアム（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｏｍｐｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）の勧告にはまた、ＥＲＴを止めた後に疾患の進行及び臨床的悪化が再び起こった場合には、ＥＲＴ治療の再開を検討することも含まれる。

【0013】

このように、有害事象を低減したポンペ病の治療に有効な改良されたｒｈＧＡＡ療法を特定することが依然として求められている。

【0014】

ｒｈＧＡＡ分子の細胞取込みは、筋細胞などの標的細胞上に存在するカチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合する特殊化した炭水化物、マンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）によって促進される。結合が起こると、ｒｈＧＡＡ分子は標的細胞に取り込まれ、続いて細胞内のリソソームへと輸送される。しかしながら、従来のｒｈＧＡＡ製剤の多くは、モノ－Ｍ６Ｐ－及びビス－Ｍ６Ｐ担持Ｎ－グリカン類（即ち、それぞれ、１個のＭ６Ｐ残基を担持するＮ－グリカン類又は２個のＭ６Ｐ残基を担持するＮ－グリカン類）の高い総含量が不足しているため、ＣＩＭＰＲを介したその細胞取込み及びリソソーム送達が限られており、ひいては従来の酵素補充療法の有効性は不十分となっている。例えば、２０ｍｇ／ｋｇ以上の用量の従来のｒｈＧＡＡ製剤は、実にポンペ病の幾つかの側面を好転させるものの、とりわけ、（ｉ）根底にある細胞の機能不全の治療、（ｉｉ）筋肉構造の修復、又は（ｉｉｉ）骨格筋などの多くの標的組織における蓄積したグリコーゲンの低減という点で、疾患の進行を好転させるだけの適切な能力がない。更に、高用量では、ｒｈＧＡＡの静脈内投与に必要な注入時間が長くなるなど、対象並びに対象の治療を担う医療専門家に更なる負担がかかり得る。

【0015】

Ｃａｎｆｉｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，５３４，３００号明細書によって記載されるホスホトランスフェラーゼ及び脱被覆酵素によってＧＡＡ又はｒｈＧＡＡのグリコシル化をインビトロで酵素的に修飾すると、Ｍ６Ｐ基を作成することができる。しかしながら、酵素的グリコシル化は適切に制御することができず、望ましくない免疫学的及び薬理学的特性を有するｒｈＧＡＡが作り出され得る。酵素的に修飾されたｒｈＧＡＡは、高マンノース型オリゴ糖のみを含有し得ることになり、その全てが、インビトロでホスホトランスフェラーゼ又は脱被覆酵素によって酵素的にリン酸化される可能性があり得る。追加の末端マンノース残基、特にリン酸化されていない末端マンノース残基は、修飾されたｒｈＧＡＡの薬物動態に悪影響を及ぼすため、インビトロでＧＡＡの酵素処理によって作り出されるグリコシル化パターンには問題がある。かかる酵素的に修飾された製剤がインビボで投与されると、それらのマンノース基によってＧＡＡの非生産的クリアランスが増加し、酵素的に修飾されたＧＡＡの免疫細胞による取込みが増加し、及び骨格筋細胞などの標的とする組織に到達するＧＡＡが少なくなるため、ｒｈＧＡＡ治療有効性が低下する。例えば、末端非リン酸化マンノース残基は、肝臓及び脾臓におけるマンノース受容体の公知のリガンドであり、酵素的に修飾されたｒｈＧＡＡの急速なクリアランス及び標的組織に標的化されるｒｈＧＡＡの減少につながる。その上、末端非リン酸化マンノース残基を持つ高マンノース型Ｎ－グリカン類を有するという酵素的に修飾されたＧＡＡのグリコシル化パターンは、酵母及びカビで産生される糖タンパク質にあるものと類似しており、酵素的に修飾されたｒｈＧＡＡに対し、生命を脅かす重症アレルギー（アナフィラキシー）反応又は過敏性反応など、免疫反応又はアレルギー反応が惹起されるリスクが増加する。

【0016】

従来の組換えｒｈＧＡＡ製剤及びインビトロでリン酸化されたｒｈＧＡＡと比較すると、本開示に係る二成分療法で使用されるｒｈＧＡＡは、体内分布及びリソソーム取込みの増強に最適化されたＮ－グリカンプロファイルを有し、それによって投与後のｒｈＧＡＡの非生産的クリアランスを最小限に抑える。本開示は、安定している又は悪化しつつあるポンペ病患者に、細胞レベルで疾患の進行を好転させる有効な療法を－リソソームグリコーゲンを現在の標準治療よりも効率的に除去することを含め、提供する。ｒｈＧＡＡと薬学的シャペロン（例えば、ミグルスタット）とを含む本開示の二成分療法で治療される患者は、臨床試験からの様々な有効性結果（例えば、実施例８及び９）に実証されるとおり、筋力、運動機能、及び／又は肺機能の改善を含め、及び／又は疾患の進行を好転させることを含め、有意な健康の改善を呈する。

【発明の概要】

【0017】

本明細書には、対象のポンペ病などの疾患又は障害を治療する方法であって、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）分子の集団と薬理学的シャペロン（例えば、ミグルスタット）とを投与することを含む方法が提供される。

【0018】

本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ分子は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に発現させてもよく、７つの潜在的なＮ－グリコシル化部位を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおりのｒｈＧＡＡ分子集団のＮ－グリコシル化プロファイルは、液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いて決定される。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ分子は、平均して１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり３～４ｍｏｌのマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ分子は、第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均して１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり少なくとも約０．５ｍｏｌのビスリン酸化Ｎ－グリカン基（ビス－Ｍ６Ｐ）を含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、配列番号４又は配列番号６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、配列番号４又は配列番号６と同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ分子のうち少なくとも３０％の分子は、１個又は２個のＭ６Ｐ残基を担持するＮ－グリカン単位を１つ以上含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ分子は、平均して１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり約０．５ｍｏｌ～約７．０ｍｏｌの１個又は２個のＭ６Ｐ残基を担持するＮ－グリカン単位を含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ分子は、平均して１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり２．０～８．０ｍｏｌのシアル酸を含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ分子は、平均して１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり少なくとも２．５モルのＭ６Ｐ残基と１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり少なくとも４ｍｏｌのシアル酸残基とを含む。一部の実施形態において、１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり平均３～４ｍｏｌのＭ６Ｐ残基及び第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり少なくとも平均約０．５ｍｏｌのビス－Ｍ６Ｐを含むｒｈＧＡＡ分子は、平均で第２の潜在的なＮ－グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．４～約０．６ｍｏｌのモノリン酸化Ｎ－グリカン類（モノ－Ｍ６Ｐ）、第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．４～約０．６ｍｏｌのビス－Ｍ６Ｐ、及び第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．３～約０．４ｍｏｌのモノ－Ｍ６Ｐを更に含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ分子は、第３の潜在的なＮ－グリコシル化部位におけるｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．９～約１．２ｍｏｌのシアル酸、第５の潜在的なＮ－グリコシル化部位におけるｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．８～約０．９ｍｏｌのシアル酸、及び第６の潜在的なＮ－グリコシル化部位におけるｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約１．５～約４．２ｍｏｌのシアル酸を含め、平均して１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり約４ｍｏｌ～約７．３ｍｏｌのシアル酸残基を更に含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ分子集団は、医薬組成物に製剤化される。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ分子集団を含む医薬組成物は、クエン酸塩、リン酸塩、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝液と、マンニトール、ポリソルベート８０、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤とを更に含む。一部の実施形態において、医薬組成物のｐＨは、約５．０～約７．０、約５．０～約６．０、又は約６．０である。一部の実施形態において、医薬組成物は、水、酸性化剤、アルカリ化剤、又はこれらの組み合わせを更に含む。一部の実施形態において、医薬組成物は６．０のｐＨを有し、且つ約５～５０ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＡＡ分子集団、約１０～１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液、約１０～５０ｍｇ／ｍＬマンニトール、約０．１～１ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、及び水を含み、及び任意選択で酸性化剤及び／又はアルカリ化剤を含む。一部の実施形態において、医薬組成物は６．０のｐＨを有し、且つ約１５ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＡＡ分子集団、約２５ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液、約２０ｍｇ／ｍＬマンニトール、約０．５ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、及び水を含み、及び任意選択で酸性化剤及び／又はアルカリ化剤を含む。

【0019】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ分子集団は、約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ又は約５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ分子集団は、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ分子集団は、隔月、毎月、隔週、毎週、週２回、又は毎日、例えば、隔週で投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ分子集団は、静脈内投与される。

【0020】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ分子集団は、ミグルスタット（別名ＡＴ２２２１）などの薬理学的シャペロン又はその薬学的に許容可能な塩と同時投与又は逐次投与される。一部の実施形態において、ミグルスタット又はその薬学的に許容可能な塩は、例えば、約５０ｍｇ～約２００ｍｇ又は約２００ｍｇ～約６００ｍｇ、及び任意選択で約１３０ｍｇ、約１９５ｍｇ、又は約２６０ｍｇの用量で経口投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ分子集団は、約５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、及びミグルスタット又はその薬学的に許容可能な塩は、約２３３ｍｇ～約５００ｍｇの用量で経口投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ分子集団は、約５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、及びミグルスタット又はその薬学的に許容可能な塩は、約５０ｍｇ～約２００ｍｇの用量で経口投与される。一実施形態において、ｒｈＧＡＡ分子集団は、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、及びミグルスタット又はその薬学的に許容可能な塩は、約２６０ｍｇの用量で経口投与される。一実施形態において、ｒｈＧＡＡ分子集団は、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、及びミグルスタット又はその薬学的に許容可能な塩は、約１９５ｍｇの用量で経口投与される。一部の実施形態において、ミグルスタット又はその薬学的に許容可能な塩は、ｒｈＧＡＡ分子集団の投与より前に（例えば、それより約１時間前に）投与される。少なくとも１つの実施形態において、対象は、ミグルスタット又はその薬学的に許容可能な塩の投与前の少なくとも２時間及び投与後の少なくとも２時間にわたって絶食する。

【0021】

本開示の実施形態は、本明細書に記載される二成分療法がポンペ病の対象の疾患を治療し、及びその進行を好転させる有効性を実証する。一部の実施形態において、対象は、ＥＲＴ歴のある患者である。一部の実施形態において、対象は、ＥＲＴ未経験の患者である。

【0022】

一部の実施形態において、本開示に係る二成分療法は、（１）ベースライン、又は（２）アルグルコシダーゼアルファと薬理学的シャペロンのプラセボとを投与することを含む対照治療と比較してポンペ病の対象の１つ以上の疾患症状を改善する。かかる対照治療では、薬理学的シャペロンの代わりにプラセボを投与した。

【0023】

一部の実施形態において、本開示に係る二成分療法は、６分間歩行テスト（６ＭＷＴ）によって測定されるとおりの、対象の運動機能を改善する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象の６分間歩行距離（６ＭＷＤ）は、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、又は５０メートル又は少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％増加する。一部の実施形態において、対象の６ＭＷＤは、５２週間の治療後に少なくとも２０メートル又は少なくとも５％増加する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の６ＭＷＤは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、又は５０メートル改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の６ＭＷＤは、５２週間の治療後に少なくとも１３メートル改善する。一部の実施形態において、対象は、３００メートル未満のベースライン６ＭＷＤを有する。一部の実施形態において、対象は、３００メートル以上のベースライン６ＭＷＤを有する。

【0024】

一部の実施形態において、本開示に係る二成分療法は、努力肺活量（ＦＶＣ）テストによって測定されるとおりの、対象の肺機能を安定化させる。一部の実施形態において、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、ベースラインと比較すると増加するか、又はベースラインと比較すると０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％未満の低下となるかのいずれかである。一部の実施形態において、５２週間の治療後に、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、ベースラインと比較すると１％未満の低下となる。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、治療後に有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、又は６％有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、５２週間の治療後に少なくとも３％有意に改善する。一部の実施形態において、対象は、５５％未満のベースラインＦＶＣを有する。一部の実施形態において、対象は、５５％以上のベースラインＦＶＣを有する。

【0025】

一部の実施形態において、本開示に係る二成分療法は、歩行・階段・ガワーズ・椅子（ＧＳＧＣ）テストによって測定されるとおりの、対象の運動機能を改善する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、１２、２６、３８又は５２週間の治療後に少なくとも０．１、０．３、０．５、０．７、１．０、１．５、又は２．５点の低下によって指示されるとおり改善する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、５２週間の治療後に少なくとも０．５点の低下によって指示されるとおり改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、治療後に有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも０．３、０．５、０．７、１．０、１．５、２．５、又は５点の低下によって指示されるとおり有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、５２週間の治療後に少なくとも１．０点の低下によって指示されるとおり有意に改善する。

【0026】

一部の実施形態において、本開示に係る二成分療法は、治療後に少なくとも１つの筋損傷マーカーのレベルを減少させる。一部の実施形態において、少なくとも１つの筋損傷マーカーは、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）を含む。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象のＣＫレベルは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、又は５０％減少する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象のＣＫレベルは、５２週間の治療後に少なくとも２０％減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＣＫレベルは、治療後に有意に減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＣＫレベルは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、又は５０％有意に減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＣＫレベルは、５２週間の治療後に少なくとも３０％有意に減少する。

【0027】

一部の実施形態において、本開示に係る二成分療法は、治療後に少なくとも１つのグリコーゲン蓄積マーカーのレベルを減少させる。一部の実施形態において、少なくとも１つのグリコーゲン蓄積マーカーは、尿中ヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）を含む。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、又は６０％減少する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、５２週間の治療後に少なくとも３０％減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、治療後に有意に減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、又は６０％有意に減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、５２週間の治療後に少なくとも４０％有意に減少する。

【0028】

一部の実施形態において、本開示に係る二成分療法は、（１）ベースライン、又は（２）アルグルコシダーゼアルファと薬理学的シャペロンのプラセボとを投与することを含む対照治療と比較すると、ＥＲＴ歴のあるポンペ病の患者対象の１つ以上の疾患症状を改善する。

【0029】

一部の実施形態において、ＥＲＴ歴のあるポンペ病の対象に対する二成分療法は、６ＭＷＴによって測定されるとおりの、対象の運動機能を改善する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象の６ＭＷＤは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、又は５０メートル又は少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％増加する。一部の実施形態において、対象の６ＭＷＤは、５２週間の治療後に少なくとも１５メートル又は少なくとも５％増加する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の６ＭＷＤは、治療後に有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の６ＭＷＤは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、３０、４０、又は５０メートル有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の６ＭＷＤは、５２週間の治療後に少なくとも１５メートル有意に改善する。一部の実施形態において、対象は、３００メートル未満のベースライン６ＭＷＤを有する。一部の実施形態において、対象は、３００メートル以上のベースライン６ＭＷＤを有する。

【0030】

一部の実施形態において、ＥＲＴ歴のあるポンペ病の対象に対する二成分療法は、ＦＶＣテストによって測定されるとおりの、対象の肺機能を改善する。一部の実施形態において、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、ベースラインと比較すると少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、２％、３％、４％、又は５％増加する。一部の実施形態において、５２週間の治療後に、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、ベースラインと比較すると少なくとも０．１％増加する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、治療後に有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、８％、又は１０％有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、５２週間の治療後に少なくとも４％有意に改善する。一部の実施形態において、対象は、５５％未満のベースラインＦＶＣを有する。一部の実施形態において、対象は、５５％以上のベースラインＦＶＣを有する。

【0031】

一部の実施形態において、ＥＲＴ歴のあるポンペ病の対象に対する二成分療法は、ＧＳＧＣテストによって測定されるとおりの、対象の運動機能を改善する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも０．１、０．３、０．５、０．７、１．０、１．５、又は２．５点の低下によって指示されるとおり改善する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、５２週間の治療後に少なくとも０．５点の低下によって指示されるとおり改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、治療後に有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも０．３、０．５、０．７、１．０、１．５、２．５、又は５点の低下によって指示されるとおり有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、５２週間の治療後に少なくとも１．０点の低下によって指示されるとおり有意に改善する。

【0032】

一部の実施形態において、ＥＲＴ歴のあるポンペ病の対象に対する二成分療法は、治療後に少なくとも１つの筋損傷マーカーのレベルを減少させる。一部の実施形態において、少なくとも１つの筋損傷マーカーは、ＣＫを含む。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象のＣＫレベルは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、又は５０％減少する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象のＣＫレベルは、５２週間の治療後に少なくとも１５％減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＣＫレベルは、治療後に有意に減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＣＫレベルは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、又は５０％有意に減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＣＫレベルは、５２週間の治療後に少なくとも３０％有意に減少する。

【0033】

一部の実施形態において、ＥＲＴ歴のあるポンペ病の対象に対する二成分療法は、治療後に少なくとも１つのグリコーゲン蓄積マーカーのレベルを減少させる。一部の実施形態において、少なくとも１つのグリコーゲン蓄積マーカーは、尿中Ｈｅｘ４を含む。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、又は６０％減少する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、５２週間の治療後に少なくとも２５％減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、治療後に有意に減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、又は６０％有意に減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、５２週間の治療後に少なくとも４０％有意に減少する。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1A】非リン酸化高マンノース型Ｎ－グリカン、モノ－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカン、及びビス－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカンを示す。各四角がＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を表し、各丸がマンノースを表し、及び各Ｐがリン酸を表す。

【図1B】Ｍ６Ｐ基の化学構造を示す。

【図2A】Ｍ６Ｐを担持するＮ－グリカン類によってｒｈＧＡＡを標的組織（例えば、ポンペ病の対象の筋組織）に向ける生産的ターゲティングを説明する。

【図2B】非標的組織（例えば、肝臓及び脾臓）への又は非Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカン類が非標的組織に結合することによる非生産的薬物クリアランスを説明する。

【図3】組換えリソソームタンパク質の例示的な製造、捕捉及び精製工程の概略図である。

【図4】ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡによるＣＨＯ細胞の形質転換用ＤＮＡコンストラクトを示す。

【図5】陰イオン交換（ＡＥＸ）カラムへの捕捉あり（実施形態２）及び捕捉なし（実施形態１）でのＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲアフィニティークロマトグラフィーの結果を示すグラフである。

【図6A】図６Ａ～図６Ｈは、２つの異なるＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析技法を用いた、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。図６Ａは、ＡＴＢ２００についての７つの潜在的なＮ－グリコシル化部位の部位占有率を示す。

【図6B】ＡＴＢ２００についての第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位のＮ－グリコシル化プロファイルの２つの分析を示す。

【図6C】ＡＴＢ２００についての第２の潜在的なＮ－グリコシル化部位のＮ－グリコシル化プロファイルの２つの分析を示す。

【図6D】ＡＴＢ２００についての第３の潜在的なＮ－グリコシル化部位のＮ－グリコシル化プロファイルの２つの分析を示す。

【図6E】ＡＴＢ２００についての第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位のＮ－グリコシル化プロファイルの２つの分析を示す。

【図6F】ＡＴＢ２００についての第５の潜在的なＮ－グリコシル化部位のＮ－グリコシル化プロファイルの２つの分析を示す。

【図6G】ＡＴＢ２００についての第６の潜在的なＮ－グリコシル化部位のＮ－グリコシル化プロファイルの２つの分析を示す。

【図6H】第１、第２、第３、第４、第５、及び第６の潜在的なＮ－グリコシル化部位についてのモノリン酸化種及びビスリン酸化種の相対的パーセントを要約する。

【図7】ＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）（細い線、左に溶出）及びＡＴＢ２００（太い線、右に溶出）のＰｏｌｙｗａｘ溶出プロファイルを示すグラフである。

【図8】ＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）のＮ－グリカン構造を、ＢＰ－ｒｈＧＡＡ、ＡＴＢ２００－１及びＡＴＢ２００－２として識別されるＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの３つの異なる製剤と比較した要約を示す表である。

【図9A】ＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）のＣＩＭＰＲアフィニティークロマトグラフィーの結果を示すグラフである。

【図9B】ＭＹＯＺＹＭＥ（登録商標）のＣＩＭＰＲアフィニティークロマトグラフィーの結果を示すグラフである。

【図10A】ＣＩＭＰＲ結合親和性についてＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ（左の線）をＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）（右の線）と比較するグラフである。

【図10B】ビス－Ｍ６Ｐ含量についてＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）とＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡとを比較する表である。

【図11A】様々なＧＡＡ濃度での正常な線維芽細胞内部におけるＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ活性（左の線）をＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）ｒｈＧＡＡ活性（右の線）と比較するグラフである。

【図11B】様々なＧＡＡ濃度でのポンペ病を有する対象からの線維芽細胞内部におけるＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ活性（左の線）をＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）ｒｈＧＡＡ活性（右の線）と比較する表である。

【図11C】正常な対象及びポンペ病の対象からの線維芽細胞のＫ_{ｕｐｔａｋｅ}を比較する表である。

【図12】ＳＹＰＲＯオレンジを使用した熱安定性アッセイにおいて、タンパク質が変性すると色素の蛍光が増加することに伴い判定した、酸性又は中性ｐＨ緩衝液中でのＡＴＢ２００の安定性を図示する。

【図13】アミログルコシダーゼ消化を用いて決定した、ＷＴマウス又は媒体、アルグルコシダーゼアルファ、若しくはＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１で治療したＧａａ ＫＯマウスの組織中グリコーゲン含量を示す。バーは、７匹のマウス／群の平均値±ＳＥＭを表す。^＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ分析下でのダネットの方法を用いた多重比較におけるアルグルコシダーゼアルファとの比較。

【図14】媒体、アルグルコシダーゼアルファ、若しくはＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１で治療したＧａａ ＫＯマウス又はＷＴマウスの筋繊維におけるＬＡＭＰ１陽性小胞を図示する。画像は外側広筋から撮ったものであり、各群７匹のマウスの代表的な画像であった。倍率＝２００倍（挿入図は１，０００倍）。

【図15A】媒体、アルグルコシダーゼアルファ、若しくはＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１で治療したＧａａ ＫＯマウス又はＷＴマウスの筋繊維におけるＬＣ３陽性凝集体を示す。画像は外側広筋から撮ったものであり、各群７匹のマウスの代表的な画像であった。倍率＝４００倍。

【図15B】ＬＣ３ ＩＩタンパク質のウエスタンブロット分析を示す。各レーンに合計３０ｍｇのタンパク質をロードした。

【図16】媒体、アルグルコシダーゼアルファ、若しくはＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１で治療したＧａａ ＫＯマウス又はＷＴマウスの筋繊維におけるジスフェリン発現を示す。画像は外側広筋から撮ったものであり、各群７匹のマウスの代表的な画像であった。倍率＝２００倍。

【図17】媒体、アルグルコシダーゼアルファ、又はＡＴＢ２００で治療したＧａａ ＫＯマウスの白色腓腹筋から単離した単一の繊維におけるＬＡＭＰ１（緑色）（例えば、「Ｂ」を参照）及びＬＣ３（赤色）（例えば、「Ａ」を参照）の共免疫蛍光染色を図示する。「Ｃ」は、オートファジー残屑が除去され、肥大したリソソームが存在しないことを図示する。各動物から最低でも３０本の繊維を調べた。

【図18】ＡＴＢ２００単独と比較したときの、それぞれ、１７μＭのＡＴ２２２１、及び１７０μＭ ＡＴ２２２１によるＡＴＢ２００の安定化を図示する。

【図19A】図１９Ａ～図１９Ｈは、プロテアーゼ消化したＡＴＢ２００のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を用いた、第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位についてのＮ－グリコシル化プロファイルを含むＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。図１９Ａ～図１９Ｈは、異なる規模で作製した１０ロットのＡＴＢ２００の平均データを提供する。図１９Ａは、ＡＴＢ２００についての７つの潜在的なＮ－グリコシル化部位の平均部位占有率を示す。Ｎ－グリコシル化部位は、配列番号１に従い提供される。ＣＶ＝変動係数。

【図19B】図１９Ｂ～図１９Ｈは、ＡＴＢ２００についての７つ全ての潜在的なＮ－グリコシル化部位の部位特異的Ｎ－グリコシル化分析を示し、部位の番号は配列番号５に従い提供される。バーは、分析した１０ロットのＡＴＢ２００について特定のＮ－グリカン基と同定されたＮ－グリカン種の割合の最大値及び最小値を表す。図１９Ｂは、ＡＴＢ２００についての第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。

【図19C】ＡＴＢ２００についての第２の潜在的なＮ－グリコシル化部位のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。

【図19D】ＡＴＢ２００についての第３の潜在的なＮ－グリコシル化部位のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。

【図19E】ＡＴＢ２００についての第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。

【図19F】ＡＴＢ２００についての第５の潜在的なＮ－グリコシル化部位のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。

【図19G】ＡＴＢ２００についての第６の潜在的なＮ－グリコシル化部位のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。

【図19H】ＡＴＢ２００についての第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。

【図20A】図２０Ａ～図２０Ｂは、図１９Ａ～図１９Ｈにもまた示されるとおりのＡＴＢ２００のＮ－グリコシル化プロファイルを更に特徴付け、要約する。図２０Ａは、ＡＴＢ２００の２－アントラニル酸（２－ＡＡ）グリカンマッピング及びＬＣ／ＭＳ－ＭＳ分析を示し、ＡＴＢ２００に同定されたＮ－グリカン種を全蛍光に対するパーセンテージとして要約する。２－ＡＡグリカンマッピング及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のデータは表５にも図示する。

【図20B】ＡＴＢ２００の７つ全ての潜在的なＮ－グリコシル化部位についての、平均部位占有率並びに全リン酸化、モノリン酸化、ビスリン酸化、及びシアル化を含めた平均Ｎ－グリカンプロファイルを要約する。ＮＤ＝検出せず。

【図21】ＡＴＢ２００－０３試験デザインの概略図を示す。

【図22】ＡＴＢ２００－０３試験に参加した１２２例の対象のベースライン６分間歩行距離（６ＭＷＤ）及び座位努力肺活量（ＦＶＣ）の特徴を示す。ＡＴ－ＧＡＡ群：ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療を受けた対象；アルグルコシダーゼアルファ群：アルグルコシダーゼアルファ／プラセボ治療を受けた対象。

【図23A】全集団（ｎ＝１２２）についての６ＭＷＤ及びＦＶＣデータを図示し、ベースライン、５２週目におけるベースラインからの変化（「ＣＦＢＬ」）、差、及びＰ値を示す。ＡＴ－ＧＡＡ群：ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療を受けた対象；アルグルコシダーゼアルファ群：アルグルコシダーゼアルファ／プラセボ治療を受けた対象。

【図23B】全集団についてのベースラインからの経時的変化を示す６ＭＷＤ及びＦＶＣデータを図示する（ｎ＝１２２）。シパグルコシダーゼアルファ／ミグルスタット群：ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療を受けた対象；アルグルコシダーゼアルファ／プラセボ：アルグルコシダーゼアルファ／プラセボ治療を受けた対象。

【図24】ＥＲＴ歴のある集団（ｎ＝９５）についての６ＭＷＤ及びＦＶＣデータを図示し、ベースライン、５２週目におけるＣＦＢＬ、差、及びＰ値を示す。ＡＴ－ＧＡＡ群：ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療を受けた対象；アルグルコシダーゼアルファ群：アルグルコシダーゼアルファ／プラセボ治療を受けた対象。

【図25】ＥＲＴ歴のある集団（ｎ＝９５）についての１２週目、２６週目、及び３８週目、及び５２週目における６ＭＷＤ及びＦＶＣのベースラインに対する相対的変化を図示する。

【図26A】ＥＲＴ未経験集団（ｎ＝２７）についての６ＭＷＤ及びＦＶＣデータを図示し、ベースライン、５２週目におけるＣＦＢＬ、差、及びＰ値を示す。ＡＴ－ＧＡＡ群：ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療を受けた対象；アルグルコシダーゼアルファ群：アルグルコシダーゼアルファ／プラセボ治療を受けた対象。

【図26B】ＥＲＴ未経験集団（ｎ＝２７）についての６ＭＷＤ及びＦＶＣデータを図示し、ベースラインからの経時的変化を示す。シパグルコシダーゼアルファ／ミグルスタット群：ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療を受けた対象；アルグルコシダーゼアルファ／プラセボ：アルグルコシダーゼアルファ／プラセボ治療を受けた対象。

【図27】全集団及びＥＲＴ歴のある集団についての鍵となる副次的評価項目及びバイオマーカーに関するベースライン特性を図示する。ＡＴ－ＧＡＡ群：ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療を受けた対象；アルグルコシダーゼアルファ群：アルグルコシダーゼアルファ／プラセボ治療を受けた対象。

【図28】全集団（左）及びＥＲＴ歴のある集団（右）についての１２週目、２６週目、３８週目、及び５２週目における下肢徒手筋力テスト（ＭＭＴ）のベースラインに対する相対的変化を図示する。

【図29】全集団（左）及びＥＲＴ歴のある集団（右）についての１２週目、２６週目、３８週目、及び５２週目における歩行・階段・ガワーズ・椅子（ＧＳＧＣ）のベースラインに対する相対的変化を図示する。シパグルコシダーゼアルファ／ミグルスタット群：ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療を受けた対象；アルグルコシダーゼアルファ／プラセボ：アルグルコシダーゼアルファ／プラセボ治療を受けた対象。

【図30】全集団（左）及びＥＲＴ歴のある集団（右）についての１２週目、２６週目、３８週目、及び５２週目における身体機能のベースラインに対する相対的変化に関する患者報告アウトカム測定情報システム（ＰＲＯＭＩＳ）を図示する。

【図31】全集団（左）及びＥＲＴ歴のある集団（右）についての１２週目、２６週目、３８週目、及び５２週目における疲労のベースラインに対する相対的変化に関するＰＲＯＭＩＳを図示する。

【図32】全集団（左）及びＥＲＴ歴のある集団（右）についての１２週目、２６週目、３８週目、及び５２週目におけるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）バイオマーカーのベースラインに対する相対的変化を図示する。

【図33】全集団（左）及びＥＲＴ歴のある集団（右）についての１２週目、２６週目、３８週目、及び５２週目における尿中ヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）バイオマーカーのベースラインに対する相対的変化を図示する。

【図34】全集団（左）及びＥＲＴ歴のある集団（右）についての主要、副次的及びバイオマーカー評価項目ヒートマップを示す。ＡＴ－ＧＡＡ群：ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療を受けた対象；アルグルコシダーゼアルファ群：アルグルコシダーゼアルファ／プラセボ治療を受けた対象。

【図35】ＡＴＢ２００－０３試験の安全性データを要約する。ＡＴ－ＧＡＡ群：ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療を受けた対象；アルグルコシダーゼアルファ群：アルグルコシダーゼアルファ／プラセボ治療を受けた対象。ＴＥＡＥ：治療中に発生した有害事象；ＩＡＲ：注入関連反応。

【図36】ＡＴＢ２００－０３試験の結果を要約する。

【図37】ＡＴＢ２００－０３試験の試験目的及び統計的方法を説明する。

【図38】ＡＴＢ２００－０３試験の主要評価項目及び副次的評価項目を説明する。

【図39】ＡＴＢ２００－０３試験の患者の配分を要約する。

【図40】ＡＴＢ２００－０３試験のベースライン人口統計学的特性を要約する。

【図41A】ＡＴＢ２００－０３試験における全集団（ｎ＝１２２）のベースライン状態別の６ＭＷＤ及びＦＶＣのベースラインからの変化に関するサブグループ分析を示す。

【図41B】ＡＴＢ２００－０３試験におけるＥＲＴ歴のある患者（ｎ＝９５）のベースライン状態別の６ＭＷＤ及びＦＶＣのベースラインからの変化に関するサブグループ分析を示す。

【図42】ＡＴＢ２００－０３試験の任意の群で１０％以上の患者において治療中に発生した有害事象（ＴＥＡＥ）の一覧を示す。

【発明を実施するための形態】

【0035】

本開示の幾つかの例示的実施形態を説明する前に、本開示は以下の説明に示される構造又は方法ステップの詳細に限定されないことが理解されるべきである。本開示は、他の実施形態が可能であり、様々な方法での実践又は実行が可能である。

【0036】

本明細書には、ポンペ病の治療方法であって、個体に組換えヒトα－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）と薬理学的シャペロンとを投与することを含む方法が提供される。ｒｈＧＡＡは、従来のｒｈＧＡＡ製剤と比較してマンノース－６－リン酸担持Ｎ－グリカン類の総含量が高く、優れた筋細胞への取込み及び続くリソソームへの送達を呈し、及びそれをポンペ病を有する対象の酵素補充療法に特に有効なものにする他の薬物動態特性を備えている。それに応じて、本開示に係る二成分療法は、従来の療法と比較して、ポンペ病に罹患している対象の疾患を治療し、及びその進行を好転させるのに優れた有効性を呈する。

【0037】

Ｉ．定義
本明細書で使用される用語は、本開示の文脈の範囲内で、及び各用語が使用される具体的な文脈において、概して当該技術分野におけるその通常の意味を有する。ある種の用語については、本開示の組成物及び方法、並びにそれらをどのように作成し及び使用すればよいかを説明する中で実施者に追加的な手引きを提供するために、以下で、又は本明細書の他の部分で考察する。冠詞「ある（ａ）」及び「ある（ａｎ）」は、その冠詞の文法上の指示対象の１つ又は２つ以上（即ち、少なくとも１つ）を指す。用語「又は」は、文脈上特に明らかに指示されない限り、用語「及び／又は」を意味し、及びそれと同義的に使用される。本願において、特に具体的に明記されない限り、単数形の使用は複数形を含む。更には、用語「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」並びに他の形、例えば、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「～に含まれる」などの使用は、限定するものではない。本明細書に記載される任意の範囲には、それらの端点及び端点の間にある全ての値が含まれることが理解されるであろう。本明細書では、明示的な文言又は必要な含意のために文脈上特に必要となる場合を除き、語句「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、又は変化形、例えば「～を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは包括的な意味で使用され、即ち、示される特徴の存在を指定するが、本開示の様々な実施形態における更なる特徴の存在又は追加を除外しない。

【0038】

用語「ＧＡＡ」は、リソソームグリコーゲンのα－１，４－及びα－１，６－グリコシド結合の加水分解を触媒するヒト酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）酵素並びに酵素活性を発揮するＧＡＡアミノ酸配列の挿入、関係（ｒｅｌａｔｉｏｎａｌ）、又は置換変異体及び長鎖ＧＡＡ配列の断片を指す。ヒト酸性α－グルコシダーゼはＧＡＡ遺伝子（国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ）遺伝子ＩＤ ２５４８）によってコードされ、この遺伝子は、１７番染色体の長腕（位置１７ｑ２５．２～ｑ２５．３）にマッピングされているものである。ＧＡＡの例示的アミノ酸配列は、ＮＰ ０００１４３．２である（これは参照により援用される）。本開示はまた、ＮＰ ０００１４３．２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列も包含する。現在、ヒトＧＡＡ遺伝子には５００個を超える突然変異が同定されており、その多くがポンペ病に関連している。酸性α－グルコシダーゼ酵素の誤った折り畳み又は誤ったプロセシングを生じさせる突然変異としては、Ｔ１０６４Ｃ（Ｌｅｕ３５５Ｐｒｏ）及びＣ２１０４Ｔ（Ａｒｇ７０２Ｃｙｓ）が挙げられる。加えて、この酵素の成熟及びプロセシングに影響を及ぼすＧＡＡ突然変異として、Ｌｅｕ４０５Ｐｒｏ及びＭｅｔ５１９Ｔｈｒが挙げられる。酸性α－グルコシダーゼタンパク質の活性には、アミノ酸残基５１６～５２１にある保存されているヘキサペプチドＷＩＤＭＮＥ（配列番号７）が必要である。本明細書で使用されるとき、略語「ＧＡＡ」は、ヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素を指すことが意図され、一方で斜体で書かれる略語「ＧＡＡ」は、ヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素をコードするヒト遺伝子を指すことが意図される。斜体で書かれる略語「Ｇａａ」は、限定はされないが、ラット又はマウス遺伝子を含めた非ヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素をコードする非ヒト遺伝子を指すことが意図され、略語「Ｇａａ」は、非ヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素を指すことが意図される。

【0039】

用語「ｒｈＧＡＡ」は、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素を指すことが意図され、内因性ＧＡＡを合成の又は組換え産生されるＧＡＡ（例えば、ＧＡＡをコードするＤＮＡで形質転換されたＣＨＯ細胞又は他の宿主細胞から産生されるＧＡＡ）と区別するために使用される。用語「ｒｈＧＡＡ」は、個別のｒｈＧＡＡ分子の集団を包含する。ｒｈＧＡＡ分子集団の特性は、本明細書に提供される。用語「従来のｒｈＧＡＡ製剤」は、ＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）又はＭＹＯＺＹＭＥ（登録商標）など、アルグルコシダーゼアルファを含有する製剤を指すことが意図される。

【0040】

用語「遺伝子修飾された」又は「組換えの」は、遺伝子産物をコードするコード配列を、そのコード配列の発現を制御する調節エレメントと共に含む核酸の導入後に、ｒｈＧＡＡなど、特定の遺伝子産物を発現するＣＨＯ細胞などの細胞を指す。核酸の導入は、遺伝子ターゲティング及び相同組換えを含め、当該技術分野において公知の任意の方法により達成されてよい。本明細書で使用されるとき、この用語にはまた、内因性遺伝子又はかかる細胞が通常は発現しない遺伝子産物を発現し又は過剰発現するように、例えば、遺伝子活性化技術によって操作されている細胞も含まれる。

【0041】

本明細書で使用されるとき、用語「アルグルコシダーゼアルファ」は、［１９９－アルギニン，２２３－ヒスチジン］プレプロ－α－グルコシダーゼ（ヒト）；ケミカルアブストラクツ登録番号４２０７９４－０５－０として識別される組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを指すことが意図される。アルグルコシダーゼアルファは、製剤ＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）及びＭＹＯＺＹＭＥ（登録商標）として、Ｇｅｎｚｙｍｅによる米国での販売が承認されている。

【0042】

本明細書で使用されるとき、用語「ＡＴＢ２００」は、米国特許第１０，９６１，５２２号明細書（この開示は本明細書において参照により援用される）に記載されている組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを指すことが意図される。ＡＴＢ２００は、「シパグルコシダーゼアルファ」とも称される。

【0043】

本明細書で使用されるとき、用語「グリカン」は、タンパク質又はポリペプチド上のアミノ酸残基に共有結合的に結合したオリゴ糖を指すことが意図される。本明細書で使用されるとき、用語「Ｎ－グリカン」又は「Ｎ－結合型グリカン」は、タンパク質又はポリペプチド上のアスパラギン残基に、そのアスパラギン残基の窒素原子との共有結合性の結合を介して結び付いている多糖鎖を指すことが意図される。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡに結び付いているＮ－グリカン単位は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ Ｐｒｏ（商標）質量分析計、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｌｕｍｏｓ Ｔｒｉｂｉｄ（商標）質量分析計、又はＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ（登録商標）Ｇ２－ＸＳ ＱＴｏｆ質量分析計などの機器を利用する液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）により決定される。

【0044】

本明細書で使用されるとき、努力肺活量、又は「ＦＶＣ」は、対象が可能な限り深く息を吸い込んだ後に対象の肺から強制的に呼出させることのできる空気の量である。

【0045】

本明細書で使用されるとき、「６分間歩行テスト」（６ＭＷＴ）は、個体が硬い平坦な表面を合計６分間で歩くことのできる距離を測るテストである。このテストは、個体を６分間で可能な限り遠くまで歩かせることによって行われる。

【0046】

本明細書で使用されるとき、「１０メートル歩行テスト」（１０ＭＷＴ）は、ウォーキングシューズを履いた個体が平坦な表面を１０メートル歩くのにかかる時間を測るテストである。

【0047】

本明細書で使用されるとき、化合物ミグルスタット、別名Ｎ－ブチル－１－デオキシノジリマイシン又はＮＢ－ＤＮＪ又は（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）－１－ブチル－２－（ヒドロキシメチル）ピペリジン－３，４，５－トリオールは、以下の化学式を有する化合物である：

【化1】

【0048】

ミグルスタットの一つの製剤は、１型ゴーシェ病に対する単剤療法として商標名ＺＡＶＥＳＣＡ（登録商標）で市販されている。一部の実施形態において、ミグルスタットは、ＡＴ２２２１と称される。

【0049】

以下で考察するとおり、本開示では、ミグルスタットの薬学的に許容可能な塩もまた使用することができる。ミグルスタットの塩が使用されるとき、塩の投薬量は、患者が受け取るミグルスタットの用量が、ミグルスタット遊離塩基を使用したならば受け取ったであろう量と等価になるように調整されることになる。

【0050】

本明細書で使用されるとき、化合物ドゥボグルスタット、別名１－デオキシノジリマイシン又はＤＮＪ又は（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）－２－（ヒドロキシメチル）ピペリジン－３，４，５－トリオールは、以下の化学式を有する化合物である：

【化2】

【0051】

本明細書で使用されるとき、用語「薬理学的シャペロン」又は時には単純に用語「シャペロン」は、酸性α－グルコシダーゼに特異的に結合する分子であって、以下の効果のうちの１つ以上を有する分子を指すことが意図される：
・タンパク質の安定した分子コンホメーションの形成を増強する；
・タンパク質の小胞体から別の細胞部位、好ましくは天然の細胞部位への適切な輸送を増強し、それによってタンパク質の小胞体関連分解を防止する；
・コンホメーションが不安定な又は誤って折り畳まれたタンパク質の凝集を防止する；
・タンパク質の少なくとも一部の野生型機能、安定性、及び／又は活性を回復させる、及び／又は増強する；及び／又は
・酸性α－グルコシダーゼを内包する細胞の表現型又は機能を改善する。

【0052】

このように、酸性α－グルコシダーゼの薬理学的シャペロンは、酸性α－グルコシダーゼに結合する結果、酸性α－グルコシダーゼの適切な折り畳み、輸送、非凝集、及び活性をもたらす分子である。少なくとも１つの実施形態において、薬理学的シャペロンは、ミグルスタットである。酸性α－グルコシダーゼの薬理学的シャペロンの別の非限定的な例は、ドゥボグルスタットである。

【0053】

本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容可能」は、生理的に忍容可能な、且つヒトへの投与時に典型的には有害な反応を生じない分子実体及び組成物を指すことが意図される。好ましくは、本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容可能」は、動物、より詳細にはヒトでの使用が連邦政府若しくは州政府の規制当局によって承認されていること、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められている薬局方に収載されていることを意味する。本明細書で使用されるとき、用語「担体」は、化合物と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又は媒体を指すことが意図される。好適な医薬担体は当該技術分野において公知であり、少なくとも１つの実施形態では、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ又は他の版による「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。

【0054】

用語「薬学的に許容可能な塩」は、本明細書で使用されるとき、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応などを伴わない、ヒト及び下等動物の組織と接触した使用に好適な、合理的なリスク対効果比に相応の、概して水溶性又は油溶性又は分散性の、且つその使用目的に有効な塩を意味することが意図される。この用語には、薬学的に許容可能な酸付加塩及び薬学的に許容可能な塩基付加塩が含まれる。好適な塩の一覧については、例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６，ｐｐ．１－１９（本明細書において参照により援用される）が参照される。用語「薬学的に許容可能な酸付加塩」は、本明細書で使用されるとき、遊離塩基の生物学的有効性及び特性を保持している、且つ生物学的に又は他の点で望ましくないものでない、無機酸と形成される塩を意味することが意図される。用語「薬学的に許容可能な塩基付加塩」は、本明細書で使用されるとき、遊離酸の生物学的有効性及び特性を保持している、且つ生物学的に又は他の点で望ましくないものでない、無機塩基と形成される塩を意味することが意図される。

【0055】

本明細書で使用されるとき、用語「緩衝液」は、ｐＨの変化を防ぐ助けとなる弱酸及びその共役塩基又は弱塩基及びその共役酸を含有する溶液を指す。

【0056】

本明細書で使用されるとき、用語「治療有効用量」及び「有効量」は、対象に治療反応を生じさせるのに十分な酸性α－グルコシダーゼの量及び／又はミグルスタットの量及び／又はこれらの二成分療法の量を指すことが意図される。

【0057】

治療反応にはまた、グリコーゲン蓄積、リソソーム増殖、及びオートファジー領域の形成など、分子反応も含まれてよい。治療反応は、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡによる治療の前及び治療後の筋生検の生理反応及び分子反応を比較することにより判定し得る。例えば、生検試料に存在するグリコーゲンの量を、治療反応を決定する際のマーカーとして使用することができる。別の例としては、ＬＡＭＰ－１、ＬＣ３、及びジスフェリンなどのバイオマーカーが挙げられ、これらはリソソーム貯蔵不全の指標として使用することができる。例えば、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡによる治療の前及び治療後に採取した筋生検を、これらのバイオマーカーのうちの１つを認識する抗体で染色しもよい。治療反応にはまた、疲労の低下又は他の患者報告アウトカム（例えば、日常生活動作、ウェルビーイング等）の改善も含まれ得る。

【0058】

本明細書で使用されるとき、用語「酵素補充療法」又は「ＥＲＴ」は、非天然の精製した酵素の、かかる酵素が欠損している個体への導入を指すことが意図される。投与されるタンパク質は、天然の供給源から、又は組換え発現によって入手することができる。この用語はまた、他の場合には精製酵素の投与が必要な、又はそれから利益を受ける個体における精製酵素の導入も指す。少なくとも１つの実施形態において、かかる個体は酵素の不足を被っている。導入される酵素は、インビトロで作製される精製された組換え酵素であるか、又は、例えば、胎盤若しくは動物の乳汁など、単離された組織若しくは体液から、又は植物から精製されるタンパク質であってもよい。

【0059】

本明細書で使用されるとき、用語「二成分療法」は、２つ以上の個別の療法が同時に又は逐次的に投与される任意の療法を指すことが意図される。一部の実施形態において、二成分療法の結果は、各療法が個別に実施されたときのその効果と比較すると増強される。増強には、様々な療法の効果についての、単独で実施したときのそれらの療法によって実現する結果と比較して有利な結果をもたらし得る何らかの改善が含まれ得る。効果又は結果の増強には、増強された効果が、それ単独で実施したときの各療法の相加効果よりも大きくなる、相乗的増強；増強された効果が、それ単独で実施したときの各療法の相加効果と実質的に等しい、相加的増強；又は増強された効果が、それ単独で実施したときの各療法の相加効果より低いが、それ単独で実施したときの各療法の効果よりはなおも良好である、相加未満の効果が含まれ得る。増強された効果は、当該技術分野において治療有効性又はアウトカムを測定できることが公知の任意の手段により測定し得る。

【0060】

「ポンペ病」は、酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）活性の欠損によりリソソームグリコーゲン代謝が損なわれることを特徴とする常染色体劣性ＬＳＤを指す。この酵素欠損はリソソームグリコーゲン蓄積につながり、進行性の骨格筋脱力、心機能低下、呼吸不全、及び／又は疾患末期にはＣＮＳ機能障害をもたらす。ＧＡＡ遺伝子の遺伝子突然変異が、発現低下をもたらすか、又は安定性、及び／又は生物学的活性が変化している突然変異形態の酵素を生じさせるかのいずれかであり、最終的に疾患につながる（概要として、Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ Ｒ，１９９５，「ＩＩ型糖原病：酸性ａ－グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）欠損、遺伝性疾患の代謝及び分子基盤（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ：Ａｃｉｄ ａ－Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（Ａｃｉｄ Ｍａｌｔａｓｅ）Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ）」，Ｓｃｒｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，７ｔｈ ｅｄ．，ｐａｇｅｓ ２４４３－２４６４を参照のこと）。ポンペ病の３つの認識されている臨床型（乳児型、若年型、及び成人型）は、残留α－グルコシダーゼ活性のレベルと相関する（Ｒｅｕｓｅｒ Ａ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９５，「糖原病ＩＩ型（酸性マルターゼ欠損症）（Ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｓｉｓ Ｔｙｐｅ ＩＩ（Ａｃｉｄ Ｍａｌｔａｓｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ））」，Ｍｕｓｃｌｅ ＆ Ｎｅｒｖｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３，Ｓ６１－Ｓ６９）。乳児型ポンペ病（Ｉ型又はＡ型）は、最も多く見られ、且つ最も重篤であり、生後２年以内の発育障害、全身性筋緊張低下、心肥大、及び心肺不全を特徴とする。若年型ポンペ病（ＩＩ型又はＢ型）は中間的な重症度であり、筋肉症状が優勢で、心肥大がないことを特徴とする。若年型ポンペ病の個体は、通常、２０歳になる前に呼吸不全が原因で死亡する。成人型ポンペ病（ＩＩＩ型又はＣ型）は、１０代又は遅ければ６０代で緩徐進行性ミオパチーとして見られることが多い（Ｆｅｌｉｃｉａ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９５，「成人発症型酸性マルターゼ欠損症の臨床的ばらつき：罹患同胞の報告及び文献レビュー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ａｄｕｌｔ－Ｏｎｓｅｔ Ａｃｉｄ Ｍａｌｔａｓｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ Ａｆｆｅｃｔｅｄ Ｓｉｂｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ）」，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７４，１３１－１３５）。ポンペ病では、α－グルコシダーゼが、グリコシル化、リン酸化、及びタンパク質分解プロセシングによる広範な翻訳後修飾を受けることが示されている。最適なグリコーゲン触媒作用には、リソソームでのタンパク質分解による１１０キロダルトン（ｋＤａ）前駆体から７６及び７０ＫＤａ成熟形態への変換が必要となる。本明細書で使用されるとき、用語「ポンペ病」は、あらゆる種類のポンペ病を指す。本願に開示される製剤化及び投与レジメンは、例えば、Ｉ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型ポンペ病の治療に使用し得る。

【0061】

本明細書で使用されるとき、「有意」は、統計的有意性を指す。この用語は、２つの治療群間に差があるという統計的証拠を指す。これは、帰無仮説が実際に真実であるときに帰無仮説を棄却するという判断を下す確率として定義することができる。この判断は、多くの場合に比較についての好適な統計分析から導き出されるｐ値＜０．０５を用いて行われる。例えば、実施例９を参照のこと。

【0062】

「対象」又は「患者」は、好ましくはヒトであるが、グリコーゲンの蓄積が関わる障害を有する他の哺乳類及び非ヒト動物もまた治療され得る。対象は、ポンペ病又は他のグリコーゲン貯蔵若しくは蓄積障害のある胎児、新生児、小児、若年、又は成人であり得る。治療を受ける個体の一例は、ＧＳＤ－ＩＩ（例えば、乳児型ＧＳＤ－ＩＩ、若年型ＧＳＤ－ＩＩ、又は成人発症型ＧＳＤ－ＩＩ）を有する個体（胎児、新生児、小児、若年、青年、又は成人ヒト）である。この個体は、残留ＧＡＡ活性を有することもあり、又は測定可能な活性を有しないこともある。例えば、ＧＳＤ－ＩＩを有する個体は、正常ＧＡＡ活性の約１％未満のＧＡＡ活性（乳児型ＧＳＤ－ＩＩ）、正常ＧＡＡ活性の約１～１０％のＧＡＡ活性（若年型ＧＳＤ－ＩＩ）、又は正常ＧＡＡ活性の約１０～４０％のＧＡＡ活性（成人型ＧＳＤ－ＩＩ）を有し得る。一部の実施形態において、対象又は患者は、過去に酵素補充療法を受けたことのあるポンペ病患者を指す、「ＥＲＴ歴のある」又は「ＥＲＴ変更」患者である。一部の実施形態において、「ＥＲＴ歴のある」又は「ＥＲＴ変更」患者は、２４ヵ月以上にわたるアルグルコシダーゼアルファの投与を受けたことがあるか、又は現在受けているポンペ病患者である。一部の実施形態において、対象又は患者は、過去に酵素補充療法を受けたことがないポンペ病患者を指す、「ＥＲＴ未経験」患者である。特定の実施形態において、対象又は患者は、歩行可能（例えば、歩行可能なＥＲＴ変更患者又は歩行可能なＥＲＴ未経験患者）である。特定の実施形態において、対象又は患者は、歩行不能（例えば、歩行不能のＥＲＴ変更患者）である。歩行可能又は歩行不能な状態は、６分間歩行テスト（６ＭＷＴ）により決定されてもよい。一部の実施形態において、歩行可能な患者とは、６ＭＷＴで少なくとも２００メートル歩くことが可能なポンペ病患者である。一部の実施形態において、歩行不能の患者とは、補助がないと歩くことができない又は車椅子に拘束されているポンペ病患者である。

【0063】

用語「治療する」及び「治療」は、本明細書で使用されるとき、疾患に関連する１つ以上の症状の向上、疾患の１つ以上の症状の発生の遅延、及び／又は疾患の１つ以上の症状の重症度又は頻度の軽減を指す。例えば、治療とは、心臓状態の改善（例えば、拡張終期及び／又は収縮終期容積の増加、又はＧＳＤ－ＩＩに典型的に見られる進行性心筋症の低減若しくは向上）又は肺機能の改善（例えば、啼泣時肺活量のベースライン量と比べた増加、及び／又は啼泣時の酸素不飽和化の正常化）；神経発達及び／又は運動技能の改善（例えば、ＡＩＭＳスコアの増加）；疾患に罹患している個体の組織中のグリコーゲンレベルの低減；又はこれらの効果の任意の組み合わせを指し得る。好ましい一実施形態において、治療には、心臓状態の改善、特にＧＳＤ－ＩＩ関連心筋症の低減が含まれる。

【0064】

用語「改善する」、「増加する」、及び「減少する」は、本明細書で使用されるとき、ベースライン測定値又は対照治療からの対応する値、例えば、同じ個体における本明細書に記載される治療の開始前の測定値、本明細書に記載される治療がない対照個体（又は複数の対照個体）における測定値、又は対照治療後の測定値などに対する相対的な値を指示する。対照個体とは、治療下の個体と同じ型（乳児型、若年児型、又は成人発症型のいずれか）のＧＳＤ－ＩＩに罹患していて、治療下の個体とほぼ同じ年齢の（治療されている個体と１例又は複数の対照個体との疾患のステージが比較可能であることを確実にするため）個体である。一部の実施形態において、対照治療は、アルグルコシダーゼアルファと薬理学的シャペロンのプラセボとを投与することを含む（実施例９を参照）。

【0065】

本明細書で使用されるとき、用語「約」及び「近似的に」は、測定の性質又は精度を所与とした測定される分量に関する許容できる誤差の程度を指すことが意図される。例えば、誤差の程度は、当該技術分野において理解されているとおり、その測定について提供される有効桁数によって指示されてもよく、限定はされないが、測定について報告される最も正確な有効桁で±１の変動が含まれる。典型的な例示的誤差の程度は、所与の値又は値の範囲から２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、及びより好ましくは５％以内である。本明細書の中で与えられる数量は、特に明記しない限り近似値であり、つまり、明記されないときにも用語「約」又は「近似的に」を推測し得ることを意味する。

【0066】

本明細書に引用される参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、及び特許出願は全て、あらゆる目的から全体として参照により援用される。しかしながら、本明細書に引用されるいずれの参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、及び特許出願への言及も、それらが有効な先行技術を成す又は世界のどの国においても技術常識の一部を形成するということの承認でなく、又はいかなる形態の示唆でもなく、及びそのように解釈されてはならない。

【0067】

本明細書で使用される節の見出しは、編成を目的としているに過ぎず、記載されている主題を限定するものと解釈されてはならない。

【0068】

ＩＩ．組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）
一部の実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に示されるとおりのアミノ酸配列を有する酵素である。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、配列番号２に示されるとおりのヌクレオチド配列によってコードされる。

【0069】

【表1】

【0070】

【表2】

【0071】

【表3】

【0072】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、米国特許第８，５９２，３６２号明細書に記載されるとおりの、配列番号１に示されるとおりのＧＡＡアミノ酸配列を有し、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＨＥ２４１０４．１（ＧＩ：５６８７６０９７４）を有する。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｙ００８３９．１を有するｍＲＮＡ配列である配列番号２にコードされるとおりのＧＡＡアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、配列番号３に示されるとおりのＧＡＡアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、配列番号４に示されるとおりのＧＡＡアミノ酸配列を有し、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ）アクセッション番号ＮＰ＿０００１４３．２又はＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１０２５３を有する。

【0073】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、最初は配列番号１又は配列番号４に示されるとおりの野生型ＧＡＡの完全長９５２アミノ酸配列を有するものとして発現し、このｒｈＧＡＡが細胞内プロセシングを受けると、アミノ酸の一部、例えば、最初の５６アミノ酸が除去される。それに応じて、宿主細胞から分泌されるｒｈＧＡＡは、細胞内で最初に発現するｒｈＧＡＡよりも短いアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態において、このより短いタンパク質は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有し、これは、配列番号１と比べると、シグナルペプチド及び前駆体ペプチドを含む最初の５６アミノ酸が除去されていて、ひいては８９６アミノ酸を有するタンパク質となっている点のみが異なる。一部の実施形態において、このより短いタンパク質は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有し、これは、配列番号４と比べると、シグナルペプチド及び前駆体ペプチドを含む最初の５６アミノ酸が除去されていて、ひいては８９６アミノ酸を有するタンパク質となっている点のみが異なる。配列番号１、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、又はそれ以上の欠失、置換及び／又は挿入を有するなど、アミノ酸の数に関する他の変形例もまた可能である。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ産物には、異なるアミノ酸長を有する組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ分子の混合物が含まれる。

【0074】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、配列番号４又は配列番号６と少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。２つの配列間の同一性の計算には、ＦＡＳＴＡ、又はＧＣＧ配列解析パッケージ（ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）の一部として利用可能なＢＬＡＳＴを含め、様々なアラインメントアルゴリズム及び／又はプログラムを使用してもよく、これらは、例えば、デフォルト設定で使用することができる。例えば、本明細書に記載される、及び好ましくは実質的に同じ機能を呈する特定のポリペプチドと少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有するポリペプチド、並びにかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが企図される。特に指示されない限り、類似性スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づくことになる。ＢＬＡＳＴＰが使用されるとき、類似性パーセントはＢＬＡＳＴＰ正値スコアに基づき、配列同一性パーセントは、ＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」は、高スコア配列対中の同一である総残基の数及び割合を示す；及びＢＬＡＳＴＰ「正値」は、アラインメントスコアが正の値を有する、且つ互いに類似している残基の数及び割合を示す。本明細書に開示されるアミノ酸配列とこうした度合いの同一性又は類似性の又は任意の中間的な度合いの同一性又は類似性を有するアミノ酸配列が企図され、本開示に包含される。類似のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝子コードを用いて推論され、従来の手段により、詳細には、遺伝子コードを用いてそのアミノ酸配列を逆翻訳することによって入手し得る。

【0075】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、タンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基に翻訳後修飾及び／又は化学修飾を受ける。例えば、メチオニン及びトリプトファン残基は、酸化を受けることができる。別の例として、配列番号６のＮ末端グルタミンは、更に修飾されて、ピログルタミン酸を形成することができる。別の例として、アスパラギン残基はアスパラギン酸へのアミド分解を受けることができる。更に別の例として、アスパラギン酸残基は、イソアスパラギン酸への異性化を受けることができる。更に別の例として、タンパク質中の対を成さないシステイン残基が、遊離グルタチオン及び／又はシステインとジスルフィド結合を形成することができる。それに応じて、一部の実施形態において、酵素は、最初は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に示されるとおりのアミノ酸配列、又は配列番号２によってコードされるアミノ酸配列を有するものとして発現し、その酵素がこれらの翻訳後修飾及び／又は化学修飾の１つ以上を受ける。かかる修飾もまた、本開示の範囲内にある。

【0076】

ＩＩＩ．ｒｈＧＡＡのＮ－結合型グリコシル化
単一のｒｈＧＡＡ分子上には、潜在的なＮ－結合型グリコシル化部位が７つある。これらの潜在的なグリコシル化部位は、配列番号６の以下の位置にある：Ｎ８４、Ｎ１７７、Ｎ３３４、Ｎ４１４、Ｎ５９６、Ｎ８２６、及びＮ８６９。同様に、配列番号４の完全長アミノ酸配列について、これらの潜在的なグリコシル化部位は、以下の位置にある：Ｎ１４０、Ｎ２３３、Ｎ３９０、Ｎ４７０、Ｎ６５２、Ｎ８８２、及びＮ９２５。ｒｈＧＡＡの他の変異体も、アスパラギン残基の位置に応じて同様のグリコシル化部位を有し得る。概して、タンパク質アミノ酸配列中のＡｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ又はＡｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒの配列が潜在的なグリコシル化部位を指示し、但し、ＸがＨｉｓ又はＰｒｏであることはできないものとする。

【0077】

本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ分子は、平均してそのＮ－グリカン上に１、２、３、又は４個のマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）基を有し得る。例えば、ｒｈＧＡＡ分子上の１個のＮ－グリカンのみがＭ６Ｐを担持していてもよく（モノリン酸化型又はモノ－Ｍ６Ｐ）、単一のＮ－グリカンが２個のＭ６Ｐ基を担持していてもよく（ビスリン酸化型又はビス－Ｍ６Ｐ）、又は同じｒｈＧＡＡ分子上の２個の異なるＮ－グリカンが、各々、単一のＭ６Ｐ基を担持していてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ分子は、平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たりそのＮ－グリカン上に３～４ｍｏｌのＭ６Ｐ基を有する。組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ分子はまた、Ｍ６Ｐ基を担持しないＮ－グリカンも有し得る。別の実施形態において、平均してｒｈＧＡＡは、ｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり２．５ｍｏｌを超えるＭ６Ｐと、ｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり４ｍｏｌを超えるシアル酸とを含む。一部の実施形態において、平均してｒｈＧＡＡは、ｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約３～３．５ｍｏｌのＭ６Ｐを含む。一部の実施形態において、平均してｒｈＧＡＡは、ｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約４～５．４ｍｏｌのシアル酸を含む。平均してｒｈＧＡＡ上の全Ｎ－グリカンの少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０％、又は２０％がモノ－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカンの形態であってもよく、例えば、全Ｎ－グリカンの約６．２５％が単一のＭ６Ｐ基を持っていてもよく、及び平均して、ｒｈＧＡＡ上の全Ｎ－グリカンの少なくとも約０．５、１、１．５、２．０、２．５、３．０％が、ビス－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカンの形態であり、及び平均して全ｒｈＧＡＡの２５％未満が、ＣＩＭＰＲに結合するリン酸化Ｎ－グリカンを含有しない。一部の実施形態において、平均してｒｈＧＡＡ上の全Ｎ－グリカンの約１０％～約１４％がモノリン酸化されている。一部の実施形態において、平均してｒｈＧＡＡ上の全Ｎ－グリカンの約７％～約２５％がビスリン酸化されている。一部の実施形態において、平均してｒｈＧＡＡは、ｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約１．３ｍｏｌのビス－Ｍ６Ｐを含む。

【0078】

本明細書に記載されるｒｈＧＡＡは、平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり０．５～７．０ｍｏｌのＭ６Ｐ、又はｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、又は７．０ｍｏｌのＭ６Ｐを含めた、その任意の中間値若しくは部分的範囲を有し得る。ｒｈＧＡＡは、分画して、特定の画分を選択することによるか、又は異なる画分を選択的に組み合わせることにより、種々の平均モノ－Ｍ６Ｐ担持Ｎ－グリカン数又はビス－Ｍ６Ｐ担持Ｎ－グリカン数のｒｈＧＡＡ調製物を提供することができ、ひいては、標的組織のリソソームへのｒｈＧＡＡターゲティングの更なるカスタマイズが可能となる。

【0079】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ上のＮ－グリカンの最大６０％が完全にシアル化されていてもよく、例えば、Ｎ－グリカンの最大１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又は６０％が完全にシアル化されていてもよい。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ上のＮ－グリカンの５０％以下が完全にシアル化されている。一部の実施形態において、全Ｎ－グリカンの４％～２０％が完全にシアル化されている。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡ上のＮ－グリカンの５％、１０％、２０％又は３０％以下が、シアル酸及び末端ガラクトース残基（Ｇａｌ）を持っている。この範囲には、あらゆる中間値及び部分的範囲が含まれ、例えば、ｒｈＧＡＡ上の全Ｎ－グリカンの７％～３０％が、シアル酸及び末端ガラクトースを持っていてもよい。更に他の実施形態において、ｒｈＧＡＡ上のＮ－グリカンの５％、１０％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％以下が末端ガラクトースのみを有し、シアル酸は含有しない。この範囲には、あらゆる中間値及び部分的範囲が含まれ、例えば、組成物中のｒｈＧＡＡ上の全Ｎ－グリカンの８％～１９％が、末端ガラクトースのみを有し、シアル酸は含有しない。

【0080】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ上の全Ｎ－グリカンの４０％～６０％、４５％～６０％、５０％～６０％、又は５５％～６０％が複合型Ｎ－グリカンであるか；又はｒｈＧＡＡ上の全Ｎ－グリカンの１％、２％、３％、４％、５％、６，％、又は７％以下がハイブリッド型Ｎ－グリカンである；ｒｈＧＡＡ上の高マンノース型Ｎ－グリカンの５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％以下が非リン酸化型である；ｒｈＧＡＡ上の高マンノース型Ｎ－グリカンの少なくとも５％又は１０％が、モノリン酸化されている
；及び／又はｒｈＧＡＡ上の高マンノース型Ｎ－グリカンの少なくとも１％又は２％が、ビスリン酸化されている。これらの値には、あらゆる中間値及び部分的範囲が含まれる。ｒｈＧＡＡは、上記に記載される含量範囲の１つ以上を満たし得る。

【0081】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、平均して１モルのｒｈＧＡＡ当たり２．０～８．０モルのシアル酸残基を担持し得る。この範囲には、ｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、及び８．０ｍｏｌのシアル酸残基を含め、そのあらゆる中間値及び部分的範囲が含まれる。理論によって拘束されるものではないが、シアル酸残基を担持するＮ－グリカン単位の存在が、アシアロ糖タンパク質受容体によるｒｈＧＡＡの非生産的クリアランスを防止し得ると考えられる。

【0082】

１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、ある特定の潜在的なＮ－グリコシル化部位に、ある特定のＮ－グリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、７つの潜在的なＮ－グリコシル化部位を有する。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％は、第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位（例えば、配列番号６についてＮ８４及び配列番号４についてＮ１４０）においてリン酸化されている。例えば、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％が、第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位においてリン酸化されていてもよい。このリン酸化は、モノ－Ｍ６Ｐ及び／又はビス－Ｍ６Ｐ単位の結果であり得る。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位にモノ－Ｍ６Ｐ単位を担持している。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位にビス－Ｍ６Ｐ単位を担持している。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約１．４ｍｏｌのＭ６Ｐ（モノ－Ｍ６Ｐ及びビス－Ｍ６Ｐ）を含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり少なくとも約０．５ｍｏｌのビス－Ｍ６Ｐを含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．２５ｍｏｌのモノ－Ｍ６Ｐを含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．２ｍｏｌ～約０．３ｍｏｌのシアル酸を含む。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈＧＡＡは、図６Ａに図示されるとおりの第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位占有率及び図６Ｂに図示されるとおりのＮ－グリコシル化プロファイルを含む。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈＧＡＡは、図１９Ａに図示されるとおりの第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位占有率及び図１９Ｂ又は図２０Ｂに図示されるとおりのＮ－グリコシル化プロファイルを含む。

【0083】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％は、第２の潜在的なＮ－グリコシル化部位（例えば、配列番号６についてＮ１７７及び配列番号４についてＮ２２３）においてリン酸化されている。例えば、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％が、第２のＮ－グリコシル化部位においてリン酸化されていてもよい。このリン酸化は、モノ－Ｍ６Ｐ及び／又はビス－Ｍ６Ｐ単位の結果であり得る。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、第２のＮ－グリコシル化部位にモノ－Ｍ６Ｐ単位を担持している。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、第２のＮ－グリコシル化部位にビス－Ｍ６Ｐ単位を担持している。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第２の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．５ｍｏｌのＭ６Ｐ（モノ－Ｍ６Ｐ及びビス－Ｍ６Ｐ）を含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第２の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．４～約０．６ｍｏｌのモノ－Ｍ６Ｐを含む。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈＧＡＡは、図６Ａに図示されるとおりの第２の潜在的なＮ－グリコシル化部位占有率及び図６Ｃに図示されるとおりのＮ－グリコシル化プロファイルを含む。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈＧＡＡは、図１９Ａに図示されるとおりの第２の潜在的なＮ－グリコシル化部位占有率及び図１９Ｃ又は図２０Ｂに図示されるとおりのＮ－グリコシル化プロファイルを含む。

【0084】

１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％は、第３の潜在的なＮ－グリコシル化部位（例えば、配列番号６についてＮ３３４及び配列番号４についてＮ３９０）においてリン酸化されている。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％未満が、第３の潜在的なＮ－グリコシル化部位においてリン酸化されている。例えば、第３の潜在的なＮ－グリコシル化部位は、非リン酸化高マンノース型Ｎ－グリカン類と、ジアンテナ型、トリアンテナ型、及びテトラアンテナ型複合型Ｎ－グリカン類と、主要種としてのハイブリッド型Ｎ－グリカン類との混合物を有することができる。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％は、第３の潜在的なＮ－グリコシル化部位においてシアル化されている。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第３の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．９～約１．２ｍｏｌのシアル酸を含む。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈＧＡＡは、図６Ａに図示されるとおりの第３の潜在的なＮ－グリコシル化部位占有率及び図６Ｄに図示されるとおりのＮ－グリコシル化プロファイルを含む。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈＧＡＡは、図１９Ａに図示されるとおりの第３の潜在的なＮ－グリコシル化部位占有率及び図１９Ｄ又は図２０Ｂに図示されるとおりのＮ－グリコシル化プロファイルを含む。

【0085】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％は、第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位（例えば、配列番号６についてＮ４１４及び配列番号４についてＮ４７０）においてリン酸化されている。例えば、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％が、第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位においてリン酸化されていてもよい。このリン酸化は、モノ－Ｍ６Ｐ及び／又はビス－Ｍ６Ｐ単位の結果であり得る。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位にモノ－Ｍ６Ｐ単位を担持している。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位にビス－Ｍ６Ｐ単位を担持している。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、又は２５％は、第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位においてシアル化されている。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約１．４ｍｏｌのＭ６Ｐ（モノ－Ｍ６Ｐ及びビス－Ｍ６Ｐ）を含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．４～約０．６ｍｏｌのビス－Ｍ６Ｐを含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．３～約０．４ｍｏｌのモノ－Ｍ６Ｐを含む。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈＧＡＡは、図６Ａに図示されるとおりの第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位占有率及び図６Ｅに図示されるとおりのＮ－グリコシル化プロファイルを含む。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈＧＡＡは、図１９Ａに図示されるとおりの第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位占有率及び図１９Ｅ又は図２０Ｂに図示されるとおりのＮ－グリコシル化プロファイルを含む。

【0086】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％は、第５の潜在的なＮ－グリコシル化部位（例えば、配列番号６についてＮ５９６及び配列番号４についてＮ６９２）においてリン酸化されている。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％未満が、第５の潜在的なＮ－グリコシル化部位においてリン酸化されている。例えば、第５の潜在的なＮ－グリコシル化部位は、主要種としてのフコシル化したジアンテナ型複合型Ｎ－グリカン類を有することができる。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、第５の潜在的なＮ－グリコシル化部位においてシアル化されている。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第５の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．８～約０．９ｍｏｌのシアル酸を含む。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈＧＡＡは、図６Ａに図示されるとおりの第５の潜在的なＮ－グリコシル化部位占有率及び図６Ｆに図示されるとおりのＮ－グリコシル化プロファイルを含む。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈＧＡＡは、図１９Ａに図示されるとおりの第５の潜在的なＮ－グリコシル化部位占有率及び図１９Ｆ又は図２０Ｂに図示されるとおりのＮ－グリコシル化プロファイルを含む。

【0087】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％は、第６のＮ－グリコシル化部位（例えば、配列番号６についてＮ８２６及び配列番号４についてＮ８８２）においてリン酸化されている。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％又は２５％未満が、第６のＮ－グリコシル化部位においてリン酸化されている。例えば、第６のＮ－グリコシル化部位は、主要種としてのジアンテナ型、トリアンテナ型、及びテトラアンテナ型複合型Ｎ－グリカンの混合物を有することができる。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％は、第６のＮ－グリコシル化部位においてシアル化されている。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第６の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約１．５～約４．２ｍｏｌのシアル酸を含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第６の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．９ｍｏｌのアセチル化シアル酸を含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第６の潜在的なＮ－グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり少なくとも平均０．０５ｍｏｌの、ポリ－Ｎ－アセチル－Ｄ－ラクトサミン（ポリ－ＬａｃＮＡｃ）残基を有するグリカン種を含む。一部の実施形態において、１０％を超えるｒｈＧＡＡが、第６の潜在的なＮ－グリコシル化部位にポリ－ＬａｃＮＡｃ残基を担持しているグリカンを含む。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈＧＡＡは、図６Ａに図示されるとおりの第６の潜在的なＮ－グリコシル化部位占有率及び図６Ｇに図示されるとおりのＮ－グリコシル化プロファイルを含む。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈＧＡＡは、図１９Ａに図示されるとおりの第６の潜在的なＮ－グリコシル化部位占有率及び図１９Ｇ又は図２０Ｂに図示されるとおりのＮ－グリコシル化プロファイルを含む。

【0088】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％は、第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位（例えば、配列番号６についてＮ８６９及び配列番号４についてＮ９２５）においてリン酸化されている。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％未満が、第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位においてリン酸化されている。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡの４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、又は６５％未満が、第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位に何らかのＮ－グリカンを有する。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３０％、３５％、又は４０％は、第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位にＮ－グリカンを有する。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり少なくとも０．５ｍｏｌのシアル酸を含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり少なくとも０．８ｍｏｌのシアル酸を含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．８６ｍｏｌのシアル酸を含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり少なくとも平均０．３ｍｏｌの、ポリ－ＬａｃＮＡｃ残基を担持しているグリカン種を含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡのほぼ半分が、第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位にポリ－ＬａｃＮＡｃ残基を担持しているグリカンを含む。少なくとも１つの実施形態において、第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位に同定される全てのＮ－グリカンが、複合型Ｎ－グリカンである。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈＧＡＡは、図６Ａに図示されるとおりの、又は図１９Ａに図示されるとおりの第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位占有率及び図１９Ｈ又は図２０Ｂに図示されるとおりのＮ－グリコシル化プロファイルを含む。

【0089】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり３～４ｍｏｌのＭ６Ｐ残基及びｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約４～約７．３ｍｏｌのシアル酸を含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、平均して、第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり少なくとも約０．５ｍｏｌのビス－Ｍ６Ｐ、第２の潜在的なＮ－グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．４～約０．６ｍｏｌのモノ－Ｍ６Ｐ、第３の潜在的なＮ－グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．９～約１．２ｍｏｌのシアル酸、第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．４～約０．６ｍｏｌのビス－Ｍ６Ｐ、第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．３～約０．４ｍｏｌのモノ－Ｍ６Ｐ、第５の潜在的なＮ－グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．８～約０．９ｍｏｌのシアル酸、及び第６の潜在的なＮ－グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約１．５～約４．２ｍｏｌのシアル酸を更に含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり少なくとも０．５ｍｏｌのシアル酸を更に含む。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり少なくとも０．８ｍｏｌのシアル酸を含む。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈＧＡＡは、第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位に平均してｒｈＧＡＡ １ｍｏｌ当たり約０．８６ｍｏｌのシアル酸を更に含む。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈＧＡＡは、図６Ａ～図６Ｈに図示されるとおりの占有率及びＮ－グリコシル化プロファイルの７つの潜在的なＮ－グリコシル化部位を含む。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈＧＡＡは、図１９Ａ～図１９Ｈ及び図２０Ａ～図２０Ｂに図示されるとおりの占有率及びＮ－グリコシル化プロファイルの７つの潜在的なＮ－グリコシル化部位を含む。

【0090】

ｒｈＧＡＡを作成する方法が、２０１４年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／０５７，８４２号明細書（その内容全体は参照により本明細書に援用される）に開示されている。

【0091】

リソソーム内に入ると、ｒｈＧＡＡは、蓄積したグリコーゲンを酵素的に分解することができる。しかしながら、従来のｒｈＧＡＡ製剤はモノ－Ｍ６Ｐ及びビス－Ｍ６Ｐ担持Ｎ－グリカン類の総レベルが低く、ひいては、筋細胞の標的化が不十分であるため、リソソームへのｒｈＧＡＡの送達が劣ることになる。こうした従来の製剤における大多数のｒｈＧＡＡ分子はリン酸化Ｎ－グリカン類を有しないため、ＣＩＭＰＲに対する親和性を欠いている。非リン酸化高マンノース型Ｎ－グリカン類はまた、マンノース受容体によって除去され得るため、ＥＲＴの非生産的クリアランスとなる（図２Ｂ）。対照的に、図２Ａに示されるとおり、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡは、より多量のモノ－Ｍ６Ｐ及びビス－Ｍ６Ｐ担持Ｎ－グリカン類を含有し得るため、筋肉などの特異的組織へのｒｈＧＡＡの生産的取込みにつながる。

【0092】

ＩＶ．Ｎ－結合型グリコシル化ｒｈＧＡＡの作製及び精製
米国特許第１０，９６１，５２２号明細書（この全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるとおり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの細胞を使用して、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡを作製し得る。高Ｍ６Ｐ ｒｈＧＡＡをＣＨＯ細胞で発現させるというのは、ｒｈＧＡＡのグリカンプロファイルを翻訳後に修飾するのと比べると、少なくとも一部には、前者のみがグリカン分解によって変換されて、最適なグリコーゲン加水分解の形態のｒｈＧＡＡになり、ひいては治療有効性が増強されることになり得るため、有利である。

【0093】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、好ましくは、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡコンストラクトで形質転換される１つ以上のＣＨＯ細胞株によって作製される。かかるＣＨＯ細胞株は、ＧＡＡをコードするポリヌクレオチドの、５、１０、１５、又は２０コピー又はそれ以上など、遺伝子の複数のコピーを含有し得る。酸性α－グルコシダーゼのアレル変異体又は他の変異体酸性α－グルコシダーゼアミノ酸配列、例えば、配列番号４又は配列番号６と少なくとも９０％、９５％、９８％、又は９９％同一のものなどを発現するＤＮＡコンストラクトを構築し、ＣＨＯ細胞で発現させてもよい。当業者は、かかるＤＮＡコンストラクトを作製するためのＣＨＯ細胞の形質転換に好適な代替的ベクターを選択し得る。

【0094】

かかるＣＨＯ細胞株を作成する方法は、米国特許第１０，９６１，５２２号明細書（この全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。簡潔に言えば、これらの方法には、ＧＡＡ又はＧＡＡ変異体をコードするＤＮＡでＣＨＯ細胞を形質転換すること、ＧＡＡをコードするＤＮＡをその１つ又は複数の染色体へと安定に組み込む、且つＧＡＡを安定に発現するＣＨＯ細胞を選択すること、及びモノ－Ｍ６Ｐ又はビス－Ｍ６Ｐを担持しているＮ－グリカン類の含量が高いＧＡＡを発現するＣＨＯ細胞を選択すること、及び、任意選択で、高シアル酸含量のＮ－グリカン類を有する、及び／又は低非リン酸化高マンノース含量のＮ－グリカン類を有するＣＨＯ細胞を選択することが関わる。選択されたＣＨＯ細胞株を使用してｒｈＧＡＡ及びｒｈＧＡＡ組成物を、ＣＨＯ細胞株を培養すること、及びＣＨＯ細胞の培養物から前記組成物を回収することにより作製し得る。一部の実施形態において、選択されたＣＨＯ細胞株から作製されるｒｈＧＡＡは、ＣＩＭＰＲを標的化するモノ－Ｍ６Ｐ又はビス－Ｍ６Ｐを担持しているＮ－グリカン類を高含量で含有する。一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおり作製されるｒｈＧＡＡは、末端ガラクトースのある複合型Ｎ－グリカン類のレベルが低い。一部の実施形態において、選択されたＣＨＯ細胞株は、ＧＡ－ＡＴＢ２００又はＡＴＢ２００－Ｘ５－１４と称される。一部の実施形態において、選択されたＣＨＯ細胞株は、かかるＣＨＯ細胞培養物の継代培養物又は誘導体を包含する。一部の実施形態において、選択されたＣＨＯ細胞株から作製されるｒｈＧＡＡは、ＡＴＢ２００と称される。

【0095】

本明細書に記載されるとおり作製されるｒｈＧＡＡは、米国特許第１０，２２７，５７７号明細書及び米国仮特許出願第６２／５０６，５６９号明細書（これらは両方とも全体として参照により本明細書に援用される）に記載される方法に従うことによって精製されてもよい。ＣＨＯ細胞株から作製されるｒｈＧＡＡの作製、捕捉、及び精製についての例示的プロセスを図３に示す。

【0096】

簡潔に言えば、バイオリアクター６０１に、ｒｈＧＡＡを発現して周囲の液体培養培地へと分泌するＣＨＯ細胞などの細胞の培養物が入っている。バイオリアクター６０１は、灌流式、バッチ式又はフェドバッチ式バイオリアクターなど、細胞の培養に適切な任意のバイオリアクターであってよい。培養培地は、細胞がｒｈＧＡＡを産生するのに十分な時間が経った後、バイオリアクターから取り出される。かかる培地の取り出しは、灌流式バイオリアクターでは連続的であってもよく、又はバッチ式若しくはフェドバッチ式リアクターではバッチ毎であってもよい。培地をろ過システム６０３によりろ過することにより、細胞を取り出し得る。ろ過システム６０３は、交互タンジェンシャルフローろ過（ＡＴＦ）システム、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）システム、及び／又は遠心ろ過システムを含め、任意の好適なろ過システムであってよい。様々な実施形態において、ろ過システムは、約１０ナノメートル～約２マイクロメートルの細孔径を有するフィルタを利用する。

【0097】

ろ過後、ろ液をタンパク質捕捉システム６０５にロードする。タンパク質捕捉システム６０５は、１つ以上のクロマトグラフィーカラムを備え得る。２つ以上のクロマトグラフィーカラムが使用される場合には、最初のカラムがロードされたところで次のカラムをロードし始めることができるように、カラムを直列に配置し得る。或いは、カラムを切り替えている間は培地取り出しプロセスを中止してもよい。

【0098】

様々な実施形態において、タンパク質捕捉システム６０５は、ｒｈＧＡＡ、特に高Ｍ６Ｐ含量のｒｈＧＡＡの直接的な産物捕捉のための１つ以上の陰イオン交換（ＡＥＸ）カラムを備える。タンパク質捕捉システム６０５によって捕捉されたｒｈＧＡＡは、カラムのｐＨ及び／又は塩含量を変更することによって１つ又は複数のカラムから溶出させる。ＡＥＸカラムの例示的条件を表２に提供する。

【0099】

【表4】

【0100】

溶出したｒｈＧＡＡは、更なる精製ステップ及び／又は品質保証ステップに供することができる。例えば、溶出したｒｈＧＡＡをウイルス死滅化ステップ６０７に供してもよい。かかるウイルス死滅化６０７には、低ｐＨによる死滅化、界面活性剤による死滅化、又は当該技術分野において公知の他の技法のうちの１つ以上が含まれ得る。ウイルス死滅化ステップ６０７からのｒｈＧＡＡは、第２のクロマトグラフィーシステム６０９に導入して、ｒｈＧＡＡ産物を更に精製してもよい。或いは、タンパク質捕捉システム６０５からの溶出したｒｈＧＡＡを第２のクロマトグラフィーシステム６０９に直接送り込んでもよい。様々な実施形態において、第２のクロマトグラフィーシステム６０９には、不純物を更に除去するための１つ以上の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムが含まれる。ＩＭＡＣカラムの例示的条件を以下の表３に提供する。

【0101】

【表5】

【0102】

ｒｈＧＡＡを第２のクロマトグラフィーシステム６０９にロードした後、１つ又は複数のカラムから組換えタンパク質を溶出させる。溶出したｒｈＧＡＡは、ウイルス死滅化ステップ６１１に供することができる。ウイルス死滅化６０７と同様に、ウイルス死滅化６１１にもまた、低ｐＨによる死滅化、界面活性剤による死滅化、又は当該技術分野において公知の他の技法のうちの１つ以上が含まれ得る。一部の実施形態では、ウイルス死滅化６０７又は６１１の一方のみが用いられ、又はウイルス死滅化は、精製プロセスにおいて同じ段階で実施される。

【0103】

ウイルス死滅化ステップ６１１からのｒｈＧＡＡは、第３のクロマトグラフィーシステム６１３に導入して、組換えタンパク質産物を更に精製してもよい。或いは、第２のクロマトグラフィーシステム６０９からの溶出した組換えタンパク質を第３のクロマトグラフィーシステム６１３に直接送り込んでもよい。様々な実施形態において、第３のクロマトグラフィーシステム６１３には、不純物を更に除去するための１つ以上の陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）カラム及び／又はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムが含まれる。次に第３のクロマトグラフィーシステム６１３からｒｈＧＡＡ産物を溶出させる。ＣＥＸカラムの例示的条件を以下の表４に提供する。

【0104】

【表6】

【0105】

ｒｈＧＡＡ製剤はまた、更なる処理工程に供し得る。例えば、別のろ過システム６１５を使用してウイルスを除去してもよい。一部の実施形態において、かかるろ過は、５～５０μｍの細孔径のフィルタを利用することができる。他の産物処理工程には、産物調整ステップ６１７が含まれてもよく、ここでは組換えタンパク質産物の滅菌、ろ過、濃縮、保存、及び／又は最終産物製剤化のための追加的な成分の添加が行われ得る。

【0106】

本明細書で使用されるとき、用語「ＡＴＢ２００」は、モノ－Ｍ６Ｐ及びビス－Ｍ６Ｐを担持しているＮ－グリカン類の含量が高いｒｈＧＡＡを指し、これは、本明細書に記載される方法を用いてＧＡ－ＡＴＢ２００細胞株から作製され、精製される。

【0107】

Ｖ．医薬組成物
様々な実施形態において、単独、又は他の治療用薬剤との組み合わせのいずれかの本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ、及び／又は薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が提供される。

【0108】

１つ以上の実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、薬学的に許容可能な塩を含む。

【0109】

一部の実施形態において、本明細書において使用される薬学的に許容可能な塩は、薬学的に許容可能な酸付加塩である。薬学的に許容可能な酸付加塩としては、限定はされないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、硝酸、リン酸など、及び有機酸であって、限定はされないが、酢酸、トリフルオロ酢酸、アジピン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、酪酸、ショウノウ酸、カンファースルホン酸、桂皮酸、クエン酸、ジグルコン酸、エタンスルホン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリセロリン酸、ヘミ硫酸（ｈｅｍｉｓｕｌｆｉｃ ａｃｉｄ）、ヘキサン酸、ギ酸、フマル酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸（イセチオン酸）、乳酸、ヒドロキシマレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メシチレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ニコチン酸、２－ナフタレンスルホン酸、シュウ酸、パモ酸、ペクチン酸、フェニル酢酸、３－フェニルプロピオン酸、ピバル酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ウンデカン酸を含めたものなどを挙げることができる。

【0110】

一部の実施形態において、本明細書において使用される薬学的に許容可能な塩は、薬学的に許容可能な塩基付加塩である。薬学的に許容可能な塩基付加塩としては、限定はされないが、アンモニア又はアンモニウム若しくは金属カチオン、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムなどの水酸化物、炭酸塩、又は重炭酸塩を挙げることができる。薬学的に許容可能な有機非毒性塩基から誘導される塩としては、限定はされないが、第一級、第二級、及び第三級アミン、第四級アミン化合物、天然に存在する置換アミンを含めた置換アミン、環状アミン及び塩基性イオン交換樹脂、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、イソプロピルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、２－ジメチルアミノエタノール、２－ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン類、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ－エチルピペリジン、テトラメチルアンモニウム化合物、テトラエチルアンモニウム化合物、ピリジン、Ν，Ν－ジメチルアニリン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、ジベンジルアミン、Ν，Ν－ジベンジルフェネチルアミン、１－エフェナミン、Ν，Ν’－ジベンジルエチレンジアミン、ポリアミン樹脂などの塩が挙げられる。

【0111】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ又はその薬学的に許容可能な塩は、静脈内投与に適した医薬組成物として製剤化されてもよい。一部の実施形態において、医薬組成物は、滅菌等張緩衝水溶液中にある溶液である。必要ならば、組成物はまた、可溶化剤及び注射部位の疼痛を和らげるための局所麻酔薬も含み得る。医薬組成物の成分は、例えば、活性薬剤の分量が指示されているアンプル又はサシェなどのハーメチックに密封された容器内にある乾燥した凍結乾燥粉末又は水分のない濃縮物として、別個に供給されても、又は一緒に単位剤形に混合されても、いずれであってもよい。組成物が注入によって投与されることになる場合、それは、滅菌された医薬品グレードの水、生理食塩水又はデキストロース／水が入った注入ボトルで分注され得る。一部の実施形態において、注入は病院又は診療所で行われてもよい。一部の実施形態において、注入は病院又は診療所のセッティング外で、例えば、対象の自宅で行われてもよい。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合し得るようにするため、滅菌注射用水又は生理食塩水のアンプルが提供されてもよい。

【0112】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ又はその薬学的に許容可能な塩は、経口投与用に製剤化されてもよい。経口投与される組成物は、錠剤、カプセル、膣坐薬、エリキシル剤、溶液又は懸濁液、ゲル、シロップ、洗口液、又は使用前に水若しくは他の好適な媒体で再構成する乾燥粉末の形態で、任意選択で香味料及び着色剤と共に、即時放出、遅延放出、調節放出、持続放出、パルス放出、又は制御放出適用向けに製剤化されてもよい。錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、丸薬、巨丸剤、散剤、ペースト、顆粒、弾丸剤（ｂｕｌｌｅｔ）、糖衣剤、又はプレミックス調合剤などの固体組成物もまた使用することができる。経口使用向けの固体及び液体組成物は、当該技術分野において周知の方法のとおりに調製し得る。かかる組成物はまた、固体又は液体剤形であってよい１つ以上の薬学的に許容可能な担体及び賦形剤も含有することができる。錠剤又はカプセルは、限定はされないが、結合剤、充填剤、滑沢剤、崩壊剤、又は湿潤剤を含め、薬学的に許容可能な賦形剤と共に従来の手段によって調製することができる。好適な薬学的に許容可能な賦形剤は当該技術分野において公知であり、限定はされないが、アルファ化デンプン、ポリビニルピロリドン、ポビドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルエチルセルロース（ＨＰＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン、アカシア、ラクトース、微結晶性セルロース、リン酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、タルク、シリカ、コーン、ジャガイモ又はタピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、グリシン クロスカルメロースナトリウム、及び複合ケイ酸塩が挙げられる。錠剤は、当該技術分野において周知の方法によってコーティングすることができる。

【0113】

一部の実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、米国特許第１０，５１２，６７６号明細書及び米国仮特許出願第６２／５０６，５７４号明細書（両方とも全体として参照により本明細書に援用される）のとおりに製剤化されてもよい。例えば、一部の実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物のｐＨは、約５．０～約７．０又は約５．０～約６．０である。一部の実施形態において、ｐＨは約５．５～約６．０の範囲である。一部の実施形態において、医薬組成物のｐＨは６．０である。一部の実施形態において、ｐＨは、水酸化ナトリウム及び／又は塩酸など、ｐＨ調整剤（例えば、アルカリ化剤及び酸性化剤）を使用することによって目標ｐＨに調整し得る。

【0114】

本明細書に記載される医薬組成物は、クエン酸塩システム、リン酸塩システム、及びこれらの組み合わせなどの緩衝システムを含み得る。クエン酸塩及び／又はリン酸塩は、クエン酸ナトリウム又はリン酸ナトリウムであってもよい。他の塩としては、カリウム塩及びアンモニウム塩が挙げられる。１つ以上の実施形態において、緩衝液は、クエン酸塩を含む。更なる実施形態において、緩衝液は、クエン酸ナトリウム（例えば、無水クエン酸ナトリウムとクエン酸一水和物との混合物）を含む。１つ以上の実施形態において、クエン酸塩を含む緩衝溶液は、クエン酸ナトリウムとクエン酸とを含み得る。一部の実施形態において、クエン酸塩及びリン酸塩緩衝液の両方が存在する。

【0115】

一部の実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、少なくとも１つの賦形剤を含む。賦形剤は、等張化剤、増量剤、及び／又は安定剤として機能し得る。等張化剤は、製剤がヒト血液と同様の又は同じ浸透圧を有することを確実にする助けとなる成分である。増量剤は、製剤（例えば、凍結乾燥状）の嵩を増やす成分であり、ケーキに適切な構造を与える。安定剤は、疎水性の気液界面での凝集体形成を防止し、又は最小限に抑えることのできる化合物である。１つの賦形剤が、等張化剤及び増量剤として同時に機能し得る。例えば、マンニトールは等張化剤として機能するとともに、増量剤としても有益性をもたらし得る。

【0116】

等張化剤の例としては、塩化ナトリウム、マンニトール、スクロース、及びトレハロースが挙げられる。一部の実施形態において、等張化剤は、マンニトールを含む。一部の実施形態において、１つ又は複数の等張化剤の総量は、約１０ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬの量の範囲である。更なる実施形態において、１つ又は複数の等張化剤の総量は、約１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ｍｇ／ｍＬ～約１６、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０ｍｇ／ｍＬの量の範囲である。

【0117】

一部の実施形態において、賦形剤は、安定剤を含む。一部の実施形態において、安定剤は、界面活性剤である。一部の実施形態において、安定剤は、ポリソルベート８０である。１つ以上の実施形態において、安定剤の総量は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。更なる実施形態において、安定剤の総量は、約０．１、０．２、０．３、０．４、又は０．５ｍｇ／ｍＬ～約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、又は１．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。更に別の実施形態において、安定剤の総量は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、又は１．０ｍｇ／ｍＬである。

【0118】

一部の実施形態において、医薬組成物は、（ａ）ｒｈＧＡＡ（ＡＴＢ２００など）、（ｂ）クエン酸塩、リン酸塩、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝液、及び（ｃ）マンニトール、ポリソルベート８０、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤を含み、（ｉ）約５．０～約６．０、又は（ｉｉ）約５．０～約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態において、組成物は、水を更に含む。一部の実施形態において、組成物は、酸性化剤及び／又はアルカリ化剤を更に含み得る。

【0119】

一部の実施形態において、医薬組成物は、（ａ）約５～５０ｍｇ／ｍＬ、約５～３０ｍｇ／ｍＬ、又は約１５ｍｇ／ｍＬの濃度のｒｈＧＡＡ（ＡＴＢ２００など）、（ｂ）約１０～１００ｍＭ又は約２５ｍＭの濃度のクエン酸ナトリウム緩衝液、（ｃ）約１０～５０ｍｇ／ｍＬ、又は約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のマンニトール、（ｄ）約０．１～１ｍｇ／ｍＬ、約０．２～０．５ｍｇ／ｍＬ、又は約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するポリソルベート８０、及び（ｅ）水を含み、約６．０のｐＨを有する。少なくとも１つの実施形態において、医薬組成物は、（ａ）１５ｍｇ／ｍＬ ｒｈＧＡＡ（ＡＴＢ２００など）（ｂ）２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、（ｃ）２０ｍｇ／ｍＬマンニトール（ｄ）０．５ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、及び（ｅ）水を含み、約６．０のｐＨを有する。一部の実施形態において、組成物は、酸性化剤及び／又はアルカリ化剤を更に含み得る。

【0120】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡを含む医薬組成物は、それを必要としている対象に投与する前に希釈される。

【0121】

一部の実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、シャペロンを含む。一部の実施形態において、シャペロンは、ミグルスタット又はその薬学的に許容可能な塩である。別の実施形態において、シャペロンは、ドゥボグルスタット又はその薬学的に許容可能な塩である。

【0122】

一部の実施形態において、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡは１つの医薬組成物に製剤化され、一方でミグルスタットなどのシャペロンは別の医薬組成物に製剤化される。一部の実施形態において、ミグルスタットを含む医薬組成物は、ＺＡＶＥＳＣＡ（登録商標）（Ａｃｔｅｌｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）として市販されている製剤をベースとする。

【0123】

一部の実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、凍結乾燥（フリーズドライ）処理を受けて、ケーキ又は粉末を提供し得る。それに応じて、一部の実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、凍結乾燥後のｒｈＧＡＡ組成物に関する。凍結乾燥混合物は、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ（例えば、ＡＴＢ２００）と、クエン酸塩、リン酸塩、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される緩衝液と、トレハロース、マンニトール、ポリソルベート８０、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤とを含み得る。一部の実施形態において、この凍結乾燥混合物に、他の成分（例えば、他の賦形剤）が加えられてもよい。凍結乾燥製剤を含む医薬組成物はバイアルに提供されてもよく、次にはそれを保存し、輸送し、再構成し、及び／又は患者に投与することができる。

【0124】

ＶＩ．治療方法
Ａ．疾患の治療
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物を投与することによるグリコーゲン貯蔵調節異常に関係する疾患又は障害の治療方法に関する。一部の実施形態において、疾患は、ポンペ病（別名、酸性マルターゼ欠損症（ＡＭＤ）及びＩＩ型糖原病（ＧＳＤ ＩＩ））である。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、ＡＴＢ２００である。一部の実施形態において、医薬組成物は、ＡＴＢ２００を含む。また、本明細書には、ポンペ病を治療するためのｒｈＧＡＡ又はＡＴＢ２００の使用も提供される。

【0125】

一部の実施形態において、本明細書に開示される方法によって治療される対象は、ＥＲＴ歴のある患者である。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法によって治療される対象は、ＥＲＴ未経験の患者である。

【0126】

本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物は、適切な経路によって投与される。一実施形態において、ｒｈＧＡＡ又は医薬組成物は、静脈内投与される。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡ又は医薬組成物は、心臓又は骨格筋（例えば、筋肉内）、又は神経系（例えば、脳；脳室内；髄腔内への直接の注射）など、標的組織への直接投与により投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ又は医薬組成物は、経口投与される。必要であれば、２つ以上の経路を同時に用いることができる。

【0127】

一部の実施形態において、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物の治療効果は、以下の判定基準のうちの１つ以上に基づき評価されてもよい：（１）心臓状態（例えば、拡張終期容積及び／又は収縮終期容積の増加、又はＧＳＤ－ＩＩに典型的に見られる進行性心筋症の低減、向上若しくは予防）、（２）肺機能（例えば、ベースライン量と比べた啼泣時肺活量の増加、及び／又は啼泣時の酸素不飽和化の正常化）、（３）神経発達及び／又は運動技能（例えば、ＡＩＭＳスコアの増加）、及び（４）疾患に罹患している個体の組織中のグリコーゲンレベルの低減。

【0128】

一部の実施形態において、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物の１つ以上の投薬量の投与後に、対象の心臓状態は、媒体で治療した対象のもの又は治療前の対象のものと比較すると、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％（又は間にある任意のパーセンテージ）だけ改善する。対象の心臓状態は、拡張終期及び／又は収縮終期容積を測定することにより、及び／又は心筋症を臨床的に判定することにより評価し得る。一部の実施形態において、対象の肺機能は、ＡＴＢ２００又はＡＴＢ２００を含む医薬組成物の１つ以上の投薬量の投与後に、媒体で治療した対象のもの又は治療前の対象のものと比較すると、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％（又は間にある任意のパーセンテージ）だけ改善する。特定の実施形態において、改善は、投与から１週間、２週間、３週間、１ヵ月、２ヵ月、又はそれ以上（又は間にある任意の期間）経った後に実現する。特定の実施形態において、ＡＴＢ２００又はＡＴＢ２００を含む医薬組成物は、投与から１週間、２週間、３週間、１ヵ月、２ヵ月、又はそれ以上（又は間にある任意の期間）経った後に対象の肺機能を改善する。

【0129】

一部の実施形態において、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物の１つ以上の投薬量の投与後に、対象の肺機能は、媒体で治療した対象のもの又は治療前の対象のものと比較すると、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％（又は間にある任意のパーセンテージ）だけ改善する。対象の肺機能は、ベースライン量と比べた啼泣時肺活量、及び／又は啼泣時の酸素不飽和化の正常化により評価し得る。一部の実施形態において、ＡＴＢ２００又はＡＴＢ２００を含む医薬組成物の１つ以上の投薬量の投与後に、対象の肺機能は、媒体で治療した対象のもの又は治療前の対象のものと比較すると、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％（又は間にある任意のパーセンテージ）だけ改善する。特定の実施形態において、改善は、投与から１週間、２週間、３週間、１ヵ月、２ヵ月、又はそれ以上（又は間にある任意の期間）経った後に実現する。特定の実施形態において、ＡＴＢ２００又はＡＴＢ２００を含む医薬組成物は、投与から１週間、２週間、３週間、１ヵ月、２ヵ月、又はそれ以上（又は間にある任意の期間）経った後に対象の肺機能を改善する。

【0130】

一部の実施形態において、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物の１つ以上の投薬量の投与後に、対象の神経発達及び／又は運動技能は、媒体で治療した対象のもの又は治療前の対象のものと比較すると、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％（又は間にある任意のパーセンテージ）だけ改善する。対象の神経発達及び／又は運動技能は、ＡＩＭＳスコアを決定することにより評価し得る。ＡＩＭＳは、臨床医が施行して点数化する１２項目のアンカー尺度である（Ｒｕｓｈ ＪＡ Ｊｒ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ｍｅａｓｕｒｅｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２０００，１６６－１６８を参照のこと）。項目１～１０は、５点のアンカー尺度で評点が付けられる。項目１～４は、口腔顔面の動きを評価する。項目５～７は、四肢及び体幹のジスキネジアを取り扱う。項目８～１０は、試験者が判断するとおりの全般的な重症度、並びに動き及びそれに伴う苦痛の患者の意識を取り扱う。項目１１～１２は、歯及び／又は義歯の問題に関するはい／いいえ形式の質問である（かかる問題はジスキネジアの誤診につながり得る）。一部の実施形態において、ＡＴＢ２００又はＡＴＢ２００を含む医薬組成物の１つ以上の投薬量の投与後に、対象の神経発達及び／又は運動技能は、媒体で治療した対象のもの又は治療前の対象のものと比較すると、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％（又は間にある任意のパーセンテージ）だけ改善する。特定の実施形態において、改善は、投与から１週間、２週間、３週間、１ヵ月、２ヵ月、又はそれ以上（又は間にある任意の期間）経った後に実現する。特定の実施形態において、ＡＴＢ２００又はＡＴＢ２００を含む医薬組成物は、投与から１週間、２週間、３週間、１ヵ月、２ヵ月、又はそれ以上（又は間にある任意の期間）経った後に対象の神経発達及び／又は運動技能を改善する。

【0131】

一部の実施形態において、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物の１つ以上の投薬量の投与後に、対象の特定の組織のグリコーゲンレベルは、媒体で治療した対象のもの又は治療前の対象のものと比較すると、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％（又は間にある任意のパーセンテージ）だけ減少する。一部の実施形態において、組織は、四頭筋、三頭筋、及び腓腹筋などの筋肉である。組織のグリコーゲンレベルは、当該技術分野において公知の方法を用いて分析することができる。アミログルコシダーゼ消化に基づくグリコーゲンレベルの決定が周知であり、Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９），「ヒト酸性アルファグルコシダーゼをコードする修飾アデノウイルスベクターの肝臓ターゲティング後における筋障害型ＩＩ型糖原病の全身修正（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｓｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ ｉｉ ａｆｔｅｒ ｈｅｐａｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｃｉｄ－ａｌｐｈａｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）」，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９６：８８６１－８８６６などの刊行物に記載されている。一部の実施形態において、ＡＴＢ２００又はＡＴＢ２００を含む医薬組成物の１つ以上の投薬量の投与後に、対象の筋肉のグリコーゲンレベルは、媒体で治療した対象のもの又は治療前の対象のものと比較すると、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％（又は間にある任意のパーセンテージ）だけ減少する。特定の実施形態において、減少は、投与から１週間、２週間、３週間、１ヵ月、２ヵ月、又はそれ以上（又は間にある任意の期間）経った後に実現する。特定の実施形態において、ＡＴＢ２００又はＡＴＢ２００を含む医薬組成物は、投与から１週間、２週間、３週間、１ヵ月、２ヵ月、又はそれ以上（又は間にある任意の期間）経った後に対象の筋肉のグリコーゲンレベルを減少させる。

【0132】

Ｂ．バイオマーカー
ポンペ病の対象における酵素補充療法の治療効果の評価及び比較には、尿中ヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）など、対象のグリコーゲン蓄積のバイオマーカーが使用されてもよい。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡを含む医薬組成物がグリコーゲン蓄積に及ぼす治療効果は、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルを測定することにより評価される。

【0133】

ポンペ病の対象における酵素補充療法の治療効果の評価及び比較には、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）などの筋傷害又は筋損傷のバイオマーカーが使用されてもよい。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡを含む医薬組成物が筋損傷に及ぼす治療効果は、対象のＣＫ、ＡＬＴ、及び／又はＡＳＴレベルを測定することにより評価される。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡを含む医薬組成物が筋損傷に及ぼす治療効果は、対象のＣＫレベルを測定することにより評価される。

【0134】

ＬＡＭＰ－１、ＬＣ３、及びジスフェリンなどのバイオマーカーもまた、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物の治療効果の評価及び比較に使用されてもよい。ポンペ病では、ＧＡＡがリソソームグリコーゲンを加水分解できないため、一部の組織でグリコーゲンが詰まった大型リソソームの異常蓄積につながる（Ｒａｂｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２７３：１９０８６－１９０９２，１９９８）。ポンペ病のマウスモデル研究では、骨格筋における肥大したリソソームによっては機械的性能の低下を適切に説明することができず、分解された筋原繊維が入った大型の封入体の存在（即ち、オートファジービルドアップ）が筋機能障害に寄与することが示されている（Ｒａｂｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １７：３８９７－３９０８，２００８）。報告からはまた、オートファジーフラックスの障害が、ポンペ病患者における治療アウトカムの不良に関連することも示唆される（Ｎａｓｃｉｍｂｅｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｄｏｉ：１０．１１１１／ｎａｎ．１２２１４，２０１５；Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １４：８３１－８３９，２００６）。加えて、遅発型ポンペ病は、未分類の肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）によく見られ（Ｐｒｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ １１０：２８７－２８９，２０１３）、ＬＧＭＤは、様々な重症度の３０を超える遺伝的に定義付けられた亜型のある遺伝的に異質の一群の神経筋疾患である。ＩＨＣ検査により、Ｇａａ ＫＯマウスの骨格筋繊維にジスフェリンの筋形質存在量が実質的に上昇していることが明らかになった。

【0135】

様々な公知の方法を用いてかかるバイオマーカーの遺伝子発現レベル及び／又はタンパク質レベルを測定することができる。例えば、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物で治療した対象から、組織、詳細には筋肉の生検など、試料を入手することができる。一部の実施形態において、試料は、対象の筋肉の生検である。一部の実施形態において、筋肉は、四頭筋、三頭筋、及び腓腹筋から選択される。対象から入手した試料は、かかるバイオマーカーを検出する１つ以上の抗体又は他の検出剤で染色してもよく、又は質量分析法により同定及び定量化してもよい。試料はまた、又はそれに代えて、バイオマーカーをコードするｍＲＮＡなどの核酸の存在を、例えば、ＲＴ－ｑＰＣＲ法によって検出するために処理してもよい。

【0136】

一部の実施形態において、１つ以上のバイオマーカーの遺伝子発現レベル及び／又はタンパク質レベルが、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物による治療の前及び治療後に、個体から入手した筋生検において測定される。一部の実施形態において、１つ以上のバイオマーカーの遺伝子発現レベル及び／又はタンパク質レベルが、媒体で治療した個体から入手した筋生検において測定される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物の１つ以上の投薬量の投与後に、１つ以上のバイオマーカーの遺伝子発現レベル及び／又はタンパク質レベルは、媒体で治療した対象のもの又は治療前の対象のものと比較すると、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％（又は間にある任意のパーセンテージ）だけ減少する。一部の実施形態において、ＡＴＢ２００又はＡＴＢ２００を含む医薬組成物の１つ以上の投薬量の投与後に、１つ以上のバイオマーカーの遺伝子発現レベル及び／又はタンパク質レベルは、媒体で治療した対象のもの又は治療前の対象のものと比較すると、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％（又は間にある任意のパーセンテージ）だけ減少する。特定の実施形態において、減少は、投与から１週間、２週間、３週間、１ヵ月、２ヵ月、又はそれ以上（又は間にある任意の期間）経った後に実現する。特定の実施形態において、ＡＴＢ２００又はＡＴＢ２００を含む医薬組成物は、投与から１週間、２週間、３週間、１ヵ月、２ヵ月、又はそれ以上（又は間にある任意の期間）経った後に１つ以上のバイオマーカーの遺伝子発現レベル及び／又はタンパク質レベルを減少させる。

【0137】

Ｃ．ｒｈＧＡＡの投薬量
医薬製剤又は再構成された組成物は、治療有効量（例えば、一定の間隔で投与したときに、疾患に付随する症状を改善すること、疾患の発生を遅延させること、及び／又は疾患の症状の重症度若しくは頻度を軽減することによるなどして疾患を治療するのに十分である投薬量）で投与される。疾患の治療において治療上有効な量は、疾患の効果の性質及び程度に依存してもよく、標準的な臨床技法により決定することができる。加えて、インビトロ又はインビボアッセイを任意選択で用いると、最適な投薬量範囲を同定する助けとなり得る。少なくとも１つの実施形態において、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡを含む医薬組成物は、約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇなど、典型的には約５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物は、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、又は約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、又は１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈＧＡＡ又は医薬組成物は、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ又は医薬組成物は、薬理学的シャペロンと同時投与又は逐次投与される。一部の実施形態において、薬理学的シャペロンは、ミグルスタットである。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２６０ｍｇの経口用量として投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約１９５ｍｇの経口用量として投与される。特定の個体に対する有効用量は、時間の経過に伴い個体の必要性に応じて変わり得る（例えば、増加又は減少し得る）。例えば、身体的な病気又はストレスがあるときは、又は抗酸性α－グルコシダーゼ抗体が存在するようになるか、若しくはそれが増加した場合には、又は疾患症状が悪化した場合には、ｒｈＧＡＡ及び／又はミグルスタットの量を調整することができる。

【0138】

一部の実施形態において、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物の治療有効用量は、従来のｒｈＧＡＡ製剤よりも低い。例えば、従来のｒｈＧＡＡ製剤の治療有効用量が２０ｍｇ／ｋｇである場合、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物が従来のｒｈＧＡＡ製剤と同じか又はそれより良好な治療効果を生み出すために必要な用量は、２０ｍｇ／ｋｇよりも低くてよい。治療効果は、上記で考察した１つ以上の判定基準（例えば、心臓状態、グリコーゲンレベル、又はバイオマーカー発現）に基づき評価されてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物の治療有効用量は、従来のｒｈＧＡＡ製剤と比べて少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれ以上低い。

【0139】

一部の実施形態において、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物の治療効果は、運動機能の改善、筋力（上半身、下半身、又は全身）の改善、肺機能の改善、疲労の低下、筋傷害に関する少なくとも１つのバイオマーカーのレベルの減少、グリコーゲン蓄積に関する少なくとも１つのバイオマーカーのレベルの減少、又はこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物の治療効果は、筋繊維のリソソーム病変の回復、筋繊維のグリコーゲン含量のより速い及び／又はより有効性の高い減少、６分間歩行テスト距離の増加、タイムアップアンドゴーテスト時間の減少、階段４段上りテスト時間の減少、１０メートル歩行テスト時間の減少、歩行－階段－ガワーズ－椅子スコアの低下、上肢筋力の増加、肩の内転の改善、肩の外転の改善、肘の屈曲の改善、肘の伸展の改善、上半身強度の改善、下半身強度の改善、全身強度の改善、立位（座位）努力肺活量の改善、最大呼気圧の改善、最大吸気圧の改善、疲労重症度尺度スコアの低下、尿中ヘキソース四糖レベルの減少、クレアチンキナーゼレベルの減少、アラニンアミノトランスフェラーゼレベルの減少、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐａｒａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）レベルの減少、又はこれらの任意の組み合わせを含む。

【0140】

一部の実施形態において、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物は、同じ用量で投与したとき、所望の治療効果を従来のｒｈＧＡＡ製剤よりも速く実現する。治療効果は、上記で考察した１つ以上の判定基準（例えば、心臓状態、グリコーゲンレベル、又はバイオマーカー発現）に基づき評価されてもよい。例えば、単一用量の従来のｒｈＧＡＡ製剤が治療した個体の組織中のグリコーゲンレベルを１週間で１０％低下させる場合、同じ用量の本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物を投与すると、同じ程度の減少を１週間未満で実現し得る。一部の実施形態において、同じ用量で投与したとき、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物は、従来のｒｈＧＡＡ製剤と比べて少なくとも約１．２５、１．５、１．７５、２．０、３．０、又はそれ以上速く所望の治療効果を実現し得る。

【0141】

一部の実施形態において、治療有効量のｒｈＧＡＡ（又はｒｈＧＡＡを含む組成物若しくは医薬）は、２回以上投与される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物は、疾患の効果の性質及び程度に応じて一定の間隔で、継続的に投与される。「一定の間隔」での投与とは、本明細書で使用されるとき、その治療有効量が定期的に（１回限りの用量と区別されるものとして）投与されることを指示している。間隔は、標準的な臨床技法により決定することができる。特定の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、隔月、毎月、隔週、毎週、週２回、又は毎日投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、週２回、毎週、又は隔週で静脈内投与される。単一の個体に対する投与間隔が固定的な間隔である必要はなく、時間の経過に伴い個体の必要性に応じて変えることができる。例えば、身体的な病気又はストレスがあるときは、抗ｒｈＧＡＡ抗体が存在するようになるか、若しくはそれが増加した場合には、又は疾患症状が悪化した場合には、用量間の間隔は減らすことができる。

【0142】

一部の実施形態において、同じ用量で使用されるとき、本明細書に記載されるとおりのｒｈＧＡＡ又は医薬組成物は、従来のｒｈＧＡＡ製剤よりも低い頻度で投与してもよく、それでも従来のｒｈＧＡＡ製剤と同じか又はそれより良好な治療効果を生み出す能力がある。例えば、従来のｒｈＧＡＡ製剤が毎週２０ｍｇ／ｋｇで投与される場合、本明細書に記載されるとおりのｒｈＧＡＡ又は医薬組成物は、２０ｍｇ／ｋｇで投与したとき、ｒｈＧＡＡ又は医薬組成物がより低い頻度で、例えば、隔週又は毎月投与されたとしても、従来のｒｈＧＡＡ製剤と同じか又はそれより良好な治療効果を生み出し得る。治療効果は、上記で考察した１つ以上の判定基準（例えば、心臓状態、グリコーゲンレベル、又はバイオマーカー発現）に基づき評価されてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物の２用量間の間隔は、従来のｒｈＧＡＡ製剤よりも長い。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ又は医薬組成物の２用量間の間隔は、従来のｒｈＧＡＡ製剤と比べて少なくとも約１．２５、１．５、１．７５、２．０、３．０、又はそれ以上長い。

【0143】

一部の実施形態において、同じ治療条件下で（例えば、同じ間隔で投与される同じ用量）、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物は、従来のｒｈＧＡＡ製剤によって提供されるものよりも優れた程度の治療効果を提供する。治療効果は、上記で考察した１つ以上の判定基準（例えば、心臓状態、グリコーゲンレベル、又はバイオマーカー発現）に基づき評価されてもよい。例えば、毎週２０ｍｇ／ｋｇで投与される従来のｒｈＧＡＡ製剤と比較したとき、毎週２０ｍｇ／ｋｇで投与されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物によれば、治療した個体の組織中のグリコーゲンレベルはより高度に減少し得る。一部の実施形態において、同じ治療条件下で投与されるとき、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又は医薬組成物は、従来のｒｈＧＡＡ製剤よりも少なくとも約１．２５、１．５、１．７５、２．０、３．０、又はそれ以上大きい治療効果を提供する。

【0144】

Ｄ．二成分療法
１つ以上の実施形態において、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡを含む医薬組成物は、薬理学的シャペロンと同時投与又は逐次投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡ又は医薬組成物は、薬理学的シャペロンと比較したとき異なる経路で投与される。例えば、薬理学的シャペロンを経口投与してもよく、一方、ｒｈＧＡＡ又は医薬組成物は静脈内投与される。

【0145】

様々な実施形態において、薬理学的シャペロンは、ミグルスタットである。いかなる理論による拘束も望むものではないが、共投与したとき、ミグルスタットはＡＴＢ２００を体循環中での変性から安定化させるため、それによってリソソームへの活性成分ＡＴＢ２００の送達が増強されると考えられる。

【0146】

一部の実施形態において、ミグルスタットは、約５０ｍｇ～約６００ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２００ｍｇ～約６００ｍｇの経口用量、又は約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、又は約６００ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２３３ｍｇ～約５００ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２５０～約２７０ｍｇの経口用量、又は約２５０ｍｇ、約２５５ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２６５ｍｇ又は約２７０ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２６０ｍｇの経口用量として投与される。

【0147】

当業者は、成人患者には、その体重に応じて、約２００ｍｇ～６００ｍｇの範囲又はこれらによる任意のより小さい範囲のミグルスタットの経口用量が好適であり得ることを理解するであろう。例えば、限定はされないが、乳児、小児、又は低体重の成人を含め、約７０ｋｇよりも大幅に軽い体重の患者については、医師によってより低い用量が好適と見なされ得る。従って、少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約５０ｍｇ～約２００ｍｇの経口用量として、又は約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、約１９５ｍｇ、約２００ｍｇ、又は約２６０ｍｇの経口用量として投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約６５ｍｇ～約１９５ｍｇの経口用量として、又は約６５ｍｇ、約１３０ｍｇ、又は約１９５ｍｇの経口用量として投与される。

【0148】

一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、約５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、及びミグルスタットは、約５０ｍｇ～約６００ｍｇの用量で経口投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、約５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、及びミグルスタットは、約５０ｍｇ～約２００ｍｇの用量で経口投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、約５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、及びミグルスタットは、約２００ｍｇ～約６００ｍｇの用量で経口投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、約５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、及びミグルスタットは、約２００ｍｇ～約５００ｍｇの用量で経口投与される。一実施形態において、ｒｈＧＡＡは、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、及びミグルスタットは、約２６０ｍｇの用量で経口投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、約５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、及びミグルスタットは、約１３０ｍｇ～約２００ｍｇの用量で経口投与される。一実施形態において、ｒｈＧＡＡは、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、及びミグルスタットは、約１９５ｍｇの用量で経口投与される。

【0149】

一部の実施形態において、ミグルスタット及びｒｈＧＡＡは、同時投与される。例えば、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与前又は投与後１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１分以内に投与されてもよい。一部の実施形態において、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与前又は投与後５、４、３、２、又は１分以内に投与される。

【0150】

一部の実施形態において、ミグルスタット及びｒｈＧＡＡは、逐次投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与まで３時間未満に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与の約２時間前に投与される。例えば、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与の約１．５時間前、約１時間前、約５０分前、約３０分前、又は約２０分前に投与し得る。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与の約１時間前に投与される。

【0151】

一部の実施形態において、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与後に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与後３時間以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与後２時間以内に投与される。例えば、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与後約１．５時間、約１時間、約５０分、約３０分、又は約２０分以内に投与し得る。

【0152】

一部の実施形態において、対象は、ミグルスタットの投与前の少なくとも２時間及び投与後の少なくとも２時間絶食する。

【0153】

一部の実施形態において、本開示に係る二成分療法は、（１）ベースライン、又は（２）アルグルコシダーゼアルファと薬理学的シャペロンのプラセボとを投与することを含む対照治療と比較してポンペ病の対象の１つ以上の疾患症状を改善する。かかる対照治療では、薬理学的シャペロンの代わりにプラセボを投与した。一部の実施形態において、二成分療法で治療される対象は、ＥＲＴ歴のある患者である。一部の実施形態において、二成分療法で治療される対象は、ＥＲＴ未経験の患者である。

【0154】

一部の実施形態において、本開示に係る二成分療法は、６分間歩行テスト（６ＭＷＴ）によって測定されるとおりの、対象の運動機能を改善する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象の６分間歩行距離（６ＭＷＤ）は、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、又は５０メートル又は少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％増加する。一部の実施形態において、対象の６ＭＷＤは、５２週間の治療後に少なくとも２０メートル又は少なくとも５％増加する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の６ＭＷＤは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、又は５０メートル改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の６ＭＷＤは、５２週間の治療後に少なくとも１３メートル改善する。一部の実施形態において、対象は、３００メートル未満のベースライン６ＭＷＤを有する。一部の実施形態において、対象は、３００メートル以上のベースライン６ＭＷＤを有する。

【0155】

一部の実施形態において、本開示に係る二成分療法は、努力肺活量（ＦＶＣ）テストによって測定されるとおりの、対象の肺機能を安定化させる。一部の実施形態において、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、ベースラインと比較すると増加するか、又はベースラインと比較すると０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％未満の低下となるかのいずれかである。一部の実施形態において、５２週間の治療後に、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、ベースラインと比較すると１％未満の低下となる。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、治療後に有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、又は６％有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、５２週間の治療後に少なくとも３％有意に改善する。一部の実施形態において、対象は、５５％未満のベースラインＦＶＣを有する。一部の実施形態において、対象は、５５％以上のベースラインＦＶＣを有する。

【0156】

一部の実施形態において、本開示に係る二成分療法は、歩行・階段・ガワーズ・椅子（ＧＳＧＣ）テストによって測定されるとおりの、対象の運動機能を改善する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、１２、２６、３８又は５２週間の治療後に少なくとも０．１、０．３、０．５、０．７、１．０、１．５、又は２．５点の低下によって指示されるとおり改善する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、５２週間の治療後に少なくとも０．５点の低下によって指示されるとおり改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、治療後に有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも０．３、０．５、０．７、１．０、１．５、２．５、又は５点の低下によって指示されるとおり有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、５２週間の治療後に少なくとも１．０点の低下によって指示されるとおり有意に改善する。

【0157】

一部の実施形態において、本開示に係る二成分療法は、治療後に少なくとも１つの筋損傷マーカーのレベルを減少させる。一部の実施形態において、少なくとも１つの筋損傷マーカーは、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）を含む。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象のＣＫレベルは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、又は５０％減少する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象のＣＫレベルは、５２週間の治療後に少なくとも２０％減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＣＫレベルは、治療後に有意に減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＣＫレベルは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、又は５０％有意に減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＣＫレベルは、５２週間の治療後に少なくとも３０％有意に減少する。

【0158】

一部の実施形態において、本開示に係る二成分療法は、治療後に少なくとも１つのグリコーゲン蓄積マーカーのレベルを減少させる。一部の実施形態において、少なくとも１つのグリコーゲン蓄積マーカーは、尿中ヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）を含む。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、又は６０％減少する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、５２週間の治療後に少なくとも３０％減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、治療後に有意に減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、又は６０％有意に減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、５２週間の治療後に少なくとも４０％有意に減少する。

【0159】

一部の実施形態において、本開示に係る二成分療法は、（１）ベースライン、又は（２）アルグルコシダーゼアルファと薬理学的シャペロンのプラセボとを投与することを含む対照治療と比較すると、ＥＲＴ歴のあるポンペ病の患者対象の１つ以上の疾患症状を改善する。

【0160】

一部の実施形態において、ＥＲＴ歴のあるポンペ病の対象に対する二成分療法は、６ＭＷＴによって測定されるとおりの、対象の運動機能を改善する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象の６ＭＷＤは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、又は５０メートル又は少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％増加する。一部の実施形態において、対象の６ＭＷＤは、５２週間の治療後に少なくとも１５メートル又は少なくとも５％増加する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の６ＭＷＤは、治療後に有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の６ＭＷＤは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、３０、４０、又は５０メートル有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の６ＭＷＤは、５２週間の治療後に少なくとも１５メートル有意に改善する。一部の実施形態において、対象は、３００メートル未満のベースライン６ＭＷＤを有する。一部の実施形態において、対象は、３００メートル以上のベースライン６ＭＷＤを有する。

【0161】

一部の実施形態において、ＥＲＴ歴のあるポンペ病の対象に対する二成分療法は、ＦＶＣテストによって測定されるとおりの、対象の肺機能を改善する。一部の実施形態において、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、ベースラインと比較すると少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、２％、３％、４％、又は５％増加する。一部の実施形態において、５２週間の治療後に、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、ベースラインと比較すると少なくとも０．１％増加する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、治療後に有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、８％、又は１０％有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のパーセント対予測値ＦＶＣは、５２週間の治療後に少なくとも４％有意に改善する。一部の実施形態において、対象は、５５％未満のベースラインＦＶＣを有する。一部の実施形態において、対象は、５５％以上のベースラインＦＶＣを有する。

【0162】

一部の実施形態において、ＥＲＴ歴のあるポンペ病の対象に対する二成分療法は、ＧＳＧＣテストによって測定されるとおりの、対象の運動機能を改善する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも０．１、０．３、０．５、０．７、１．０、１．５、又は２．５点の低下によって指示されるとおり改善する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、５２週間の治療後に少なくとも０．５点の低下によって指示されるとおり改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、治療後に有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも０．３、０．５、０．７、１．０、１．５、２．５、又は５点の低下によって指示されるとおり有意に改善する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＧＳＧＣスコアは、５２週間の治療後に少なくとも１．０点の低下によって指示されるとおり有意に改善する。

【0163】

一部の実施形態において、ＥＲＴ歴のあるポンペ病の対象に対する二成分療法は、治療後に少なくとも１つの筋損傷マーカーのレベルを減少させる。一部の実施形態において、少なくとも１つの筋損傷マーカーは、ＣＫを含む。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象のＣＫレベルは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、又は５０％減少する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象のＣＫレベルは、５２週間の治療後に少なくとも１５％減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＣＫレベルは、治療後に有意に減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＣＫレベルは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、又は５０％有意に減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象のＣＫレベルは、５２週間の治療後に少なくとも３０％有意に減少する。

【0164】

一部の実施形態において、ＥＲＴ歴のあるポンペ病の対象に対する二成分療法は、治療後に少なくとも１つのグリコーゲン蓄積マーカーのレベルを減少させる。一部の実施形態において、少なくとも１つのグリコーゲン蓄積マーカーは、尿中Ｈｅｘ４を含む。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、又は６０％減少する。一部の実施形態において、ベースラインと比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、５２週間の治療後に少なくとも２５％減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、治療後に有意に減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、１２、２６、３８、又は５２週間の治療後に少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、又は６０％有意に減少する。一部の実施形態において、対照治療と比較すると、対象の尿中Ｈｅｘ４レベルは、５２週間の治療後に少なくとも４０％有意に減少する。

【0165】

Ｅ．キット
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡ療法の実施に好適なキットに関する。１つ以上の実施形態において、このキットは、ｒｈＧＡＡ又は医薬組成物（凍結乾燥前又は凍結乾燥後のいずれか）を含む容器（例えば、バイアル、チューブ、バッグ等）と、再構成、希釈及び投与に関する説明書とを含む。１つ以上の実施形態において、このキットは、薬理学的シャペロン（例えば、ミグルスタット）及びｒｈＧＡＡを含む医薬組成物（凍結乾燥前又は凍結乾燥後のいずれか）を含む容器（例えば、バイアル、チューブ、バッグ等）と、ｒｈＧＡＡを薬理学的シャペロンと共にした再構成、希釈、及び投与に関する説明書とを含む。

【実施例】

【0166】

実施例１：高いモノ－又はビス－Ｍ６Ｐ担持Ｎ－グリカン含量を有するｒｈＧＡＡを産生するＣＨＯ細胞の調製。
ＤＧ４４ ＣＨＯ（ＤＨＦＲ－）細胞に、ｒｈＧＡＡを発現するＤＮＡコンストラクトをトランスフェクトした。このＤＮＡコンストラクトは図４に示す。トランスフェクション後、安定に組み込まれたＧＡＡ遺伝子を持つＣＨＯ細胞をヒポキサンチン／チミジン不含（－ＨＴ）培地で選択した）。これらの細胞のＧＡＡ発現をメトトレキサート処理（ＭＴＸ、５００ｎＭ）によって誘導した。

【0167】

ＧＡＡの発現量が高い細胞プールをＧＡＡ酵素活性アッセイにより同定し、ｒｈＧＡＡを産生する個別のクローンの樹立に使用した。個別のクローンは半固体培地プレート上で作成し、ＣｌｏｎｅＰｉｘシステムによってピッキングして、２４ディープウェルプレートに移し替えた。これらの個別のクローンをＧＡＡ酵素活性に関してアッセイし、ＧＡＡを高度に発現するクローンを同定した。ＧＡＡ活性を決定するための馴化培地は、４－ＭＵ－α－グルコシダーゼ基質を使用した。ＧＡＡ酵素アッセイにより測定したときＧＡＡを高度に産生するクローンについて、生存率、成長能力、ＧＡＡ産生力、Ｎ－グリカン構造及び安定したタンパク質発現を更に判定した。モノ－Ｍ６Ｐ又はビス－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカンが増強されたｒｈＧＡＡを発現するＣＨＯ細胞株は、ＣＨＯ細胞株ＧＡ－ＡＴＢ２００を含め、この手順を用いて単離した。

【0168】

実施例２：ｒｈＧＡＡの精製
本開示に係るｒｈＧＡＡの複数のバッチをＣＨＯ細胞株ＧＡ－ＡＴＢ２００を使用して振盪フラスコ及び灌流バイオリアクターに作製した。この産物は「ＡＴＢ２００」と称される。弱陰イオン交換（「ＷＡＸ」）液体クロマトグラフィーを用いてＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡを末端リン酸塩及びシアル酸に基づき分画した。ＥＲＴを漸増量の塩で溶出させることにより、溶出プロファイルを作成した。これらのプロファイルをＵＶ（Ａ２８０ｎｍ）によりモニタした。異なる産生バッチからの精製ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡについて、同様のＣＩＭＰＲ受容体結合（少なくとも約７０％）プロファイルが観察され（図５）、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡを一貫して作製できることが示された。

【0169】

実施例３：ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡのオリゴ糖の特徴付け
ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡを部位特異的Ｎ－グリカンプロファイルに関して異なるＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析技法を用いて分析した。最初の２つのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法の結果は、図６Ａ～図６Ｈに示す。２－ＡＡグリカンマッピングによる第３のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法の結果は、図１９Ａ～図１９Ｈ、図２０Ａ～図２０Ｂ、及び表５に示す。

【0170】

最初のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析では、タンパク質を変性させて、還元し、アルキル化し、及び消化した後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。タンパク質の変性及び還元時、２００μｇのタンパク質試料、５μＬの１ｍｏｌ／Ｌトリス－ＨＣｌ（最終濃度５０ｍＭ）、７５μＬの８ｍｏｌ／ＬグアニジンＨＣｌ（最終濃度６Ｍ）、１μＬの０．５ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（最終濃度５ｍＭ）、２μＬの１ｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ（最終濃度２０ｍＭ）、及びＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水を１．５ｍＬチューブに加え、１００μＬの総容積を提供した。この試料を混合し、乾式浴にて５６℃で３０分間インキュベートした。アルキル化時、変性させて還元したタンパク質試料を５μＬの１ｍｏｌ／Ｌ ヨードアセトアミド（ＩＡＭ、最終濃度５０ｍＭ）と混合し、次に暗所下１０～３０℃で３０分間インキュベートした。アルキル化後、試料に４００μＬの予冷したアセトンを加え、この混合物を－８０℃の冷凍下に４時間凍結した。次に試料を４℃にて１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去した。ペレットに４００μＬの予冷したアセトンを加え、それを４℃にて１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去した。次に試料を暗所下に氷上で風乾してアセトン残留分を除去した。試料に４０マイクロリットルの８Ｍ尿素及び１６０μＬの１００ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３を加えてタンパク質を溶解させた。トリプシン消化時、次に５０μｇのタンパク質をトリプシン消化緩衝液と共に加えて最終容積を１００μＬにし、及び５μＬの０．５ｍｇ／ｍＬトリプシン（タンパク質対酵素比２０／１ｗ／ｗ）を加えた。この溶液を十分に混合し、３７℃で一晩（１６±２時間）インキュベートした。２．５マイクロリットルの２０％ＴＦＡ（最終濃度０．５％）を加えて反応をクエンチした。次にＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ Ｐｒｏ（商標）質量分析計を使用して試料を分析した。

【0171】

第２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析では、同様の変性、還元、アルキル化、及び消化手順によりＡＴＢ２００試料を調製し、但し、アルキル化試薬としてＩＡＭの代わりにヨード酢酸（ＩＡＡ）を使用し、次にＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｌｕｍｏｓ Ｔｒｉｂｉｄ（商標）質量分析計を使用して分析した。

【0172】

第１及び第２の分析の結果を図６Ａ～図６Ｈに示す。図６Ａ～図６Ｈでは、第１の分析の結果を左のバー（濃い灰色）で表し、及び第２の分析の結果を右のバー（薄い灰色）で表す。グリカン表現の記号命名法は、Ｖａｒｋｉ，Ａ．，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．，Ｅｓｋｏ Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００９）に従う。

【0173】

図６Ａ～図６Ｈを見ると分かるとおり、これらの２つの分析は同様の結果を提供し、しかし結果の間で幾らかのばらつきはあった。このばらつきは、使用した機器及びＮ－グリカン分析の完全さを含め、幾つもの要因に起因し得る。例えば、リン酸化Ｎ－グリカン類の一部の種が同定及び／又は定量化されなかった場合には、そのときリン酸化Ｎ－グリカン類の総数は実際よりも少なく評価されることになり得るとともに、その部位におけるリン酸化Ｎ－グリカン類を担持するｒｈＧＡＡの割合は実際よりも少なく評価されることになり得る。別の例として、非リン酸化Ｎ－グリカン類の一部の種が同定及び／又は定量化されなかった場合には、そのとき非リン酸化Ｎ－グリカン類の総数は実際よりも少なく評価されることになり得るとともに、その部位にあるリン酸化Ｎ－グリカン類を担持するｒｈＧＡＡの割合が実際よりも多く評価されることになり得る。

【0174】

図６Ａは、ＡＴＢ２００のＮ－グリコシル化部位占有率を示す。図６Ａを見ると分かるとおり、第１、第２、第３、第４、第５、及び第６のＮ－グリコシル化部位は、ほぼ占有されており、両分析とも、９０％前後又はそれを超える、最大約１００％に至るまでのＡＴＢ２００酵素が、潜在的なＮ－グリコシル化部位の各々に検出されたＮ－グリカンを有することを検出した。しかしながら、第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位については、Ｎ－グリコシル化されているのは約２分の１であった。

【0175】

図６Ｂは、第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位、Ｎ８４のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。図６Ｂを見ると分かるとおり、主要なＮ－グリカン種は、ビス－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカンである。第１及び第２の分析とも、７５％を超えるＡＴＢ２００が第１の部位にビス－Ｍ６Ｐを有することを検出し、これは、第１の部位におけるＡＴＢ２００ １ｍｏｌ当たり平均約０．８ｍｏｌのビス－Ｍ６Ｐに対応した。

【0176】

図６Ｃは、第２の潜在的なＮ－グリコシル化部位、Ｎ１７７のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。図６Ｃを見ると分かるとおり、主要なＮ－グリカン種は、モノ－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカン及び非リン酸化高マンノース型Ｎ－グリカンである。第１及び第２の分析とも、４０％を超えるＡＴＢ２００が第２の部位にモノ－Ｍ６Ｐを有することを検出し、これは、第２の部位におけるＡＴＢ２００ １ｍｏｌ当たり平均約０．４～約０．６ｍｏｌのモノ－Ｍ６Ｐに対応した。

【0177】

図６Ｄは、第３の潜在的なＮ－グリコシル化部位、Ｎ３３４のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。図６Ｄを見ると分かるとおり、主要なＮ－グリカン種は、非リン酸化高マンノース型Ｎ－グリカン、ジアンテナ型、トリアンテナ型、及びテトラアンテナ型複合型Ｎ－グリカン、並びにハイブリッド型Ｎ－グリカンである。第１及び第２の分析とも、２０％を超えるＡＴＢ２００が第３の部位にシアル酸残基を有することを検出し、これは、第３の部位におけるＡＴＢ２００ １ｍｏｌ当たり平均約０．９～約１．２ｍｏｌのシアル酸に対応した。

【0178】

図６Ｅは、第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位、Ｎ４１４のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。図６Ｅを見ると分かるとおり、主要なＮ－グリカン種は、ビス－Ｍ６Ｐ及びモノ－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカンである。第１及び第２の分析とも、４０％を超えるＡＴＢ２００が第４の部位にビス－Ｍ６Ｐを有することを検出し、これは、第４の部位におけるＡＴＢ２００ １ｍｏｌ当たり平均約０．４～約０．６ｍｏｌのビス－Ｍ６Ｐに対応した。第１及び第２の分析とも、２５％を超えるＡＴＢ２００が第４の部位にモノ－Ｍ６Ｐを有することもまた検出し、これは、第４の部位におけるＡＴＢ２００ １ｍｏｌ当たり平均約０．３～約０．４ｍｏｌのモノ－Ｍ６Ｐに対応した。

【0179】

図６Ｆは、第５の潜在的なＮ－グリコシル化部位、Ｎ５９６のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。図６Ｆを見ると分かるとおり、主要なＮ－グリカン種は、フコシル化したジアンテナ型複合型Ｎ－グリカンである。第１及び第２の分析とも、７０％を超えるＡＴＢ２００が第５の部位にシアル酸残基を有することを検出し、これは、第５の部位におけるＡＴＢ２００ １ｍｏｌ当たり平均約０．８～約０．９ｍｏｌのシアル酸に対応した。

【0180】

図６Ｇは、第６の潜在的なＮ－グリコシル化部位、Ｎ８２６のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。図６Ｇを見ると分かるとおり、主要なＮ－グリカン種は、ジアンテナ型、トリアンテナ型、及びテトラアンテナ型複合型Ｎ－グリカンである。第１及び第２の分析とも、８０％を超えるＡＴＢ２００が第６の部位にシアル酸残基を有することを検出し、これは、第６の部位におけるＡＴＢ２００ １ｍｏｌ当たり平均約１．５～約１．８ｍｏｌのシアル酸に対応した。

【0181】

第７の部位、Ｎ８６９におけるＮ－グリコシル化の分析では、約４０％のＮ－グリコシル化が明らかとなり、最も多く見られるＮ－グリカンは、Ａ４Ｓ３Ｓ３ＧＦ（１２％）、Ａ５Ｓ３Ｇ２Ｆ（１０％）、Ａ４Ｓ２Ｇ２Ｆ（８％）及びＡ６Ｓ３Ｇ３Ｆ（８％）であった。

【0182】

図６Ｈは、７つの潜在的なＮ－グリコシル化部位の各々におけるリン酸化の要約を示す。図６Ｈを見ると分かるとおり、第１及び第２の分析の両方とも、第１、第２、及び第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位に高いリン酸化レベルを検出した。両方の分析とも、８０％を超えるＡＴＢ２００が第１の部位でモノ又はビスリン酸化されていること、４０％を超えるＡＴＢ２００が第２の部位でモノリン酸化しされていること、及び８０％を超えるＡＴＢ２００が第４の部位でモノ又はビスリン酸化されていることを検出した。

【0183】

ＡＴＢ２００の別のＮ－グリコシル化分析を、以下に記載するとおりのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法により実施した。この分析から、１０ロットにわたるＡＴＢ２００の平均Ｎ－グリコシル化プロファイルが作られた（図１９Ａ～図１９Ｈ、図２０Ａ～図２０Ｂ）。

【0184】

ＡＴＢ２００からのＮ－結合型グリカンをＰＮＧａｓｅ－Ｆで酵素的に放出させて、２－アントラニル酸（２－ＡＡ）で標識した。２－ＡＡ標識したＮ－グリカンを固相抽出（ＳＰＥ）により更に処理して、過剰な塩及び他の夾雑物を除去した。精製した２－ＡＡ Ｎ－グリカンをアセトニトリル／水（２０／８０；ｖ／ｖ）に溶解させ、１０マイクログラムをアミノポリマー分析カラム（ａｐＨｅｒａ（商標）、Ｓｕｐｅｌｃｏ）にロードして、高速液体クロマトグラフィーと蛍光検出（ＨＰＬＣ－ＦＬＤ）及び高分解能マススペクトロメトリー（ＨＲＭＳ）分析にかけた。

【0185】

液体クロマトグラフ（ＬＣ）分離を順相条件下において移動相Ａ（アセトニトリル中２％酢酸）及び移動相Ｂ（５％酢酸；水酸化アンモニウムでｐＨ４．３に調整した水中２０ミリモル酢酸アンモニウム）のグラジエント溶離モードで実施した。開始時移動相の組成は、７０％Ａ／３０％Ｂであった。蛍光検出について、検出器（ＲＦ－２０Ａｘｓ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）のパラメータは、励起（Ｅｘ）：３２０ｎｍ；発光（Ｅｍ）：４２０ｎｍであった。ＨＲＭＳ分析は、独立データ収集（ＩＤＡ）モードで動作する四重極飛行時間型質量分析計（Ｓｃｉｅｘ Ｘ５００Ｂ ＱＴＯＦ）を使用して行った。取得されたデータファイルをＰｒｏｔｅｏＷｉｚａｒｄのＭＳＣｏｎｖｅｒｔを使用してｍｚＭＬファイルに変換し、次にＧＲＩＴＳツールボックス１．２ Ｍｏｒｎｉｎｇ Ｂｌｅｎｄソフトウェア（ＵＧＡ）を利用してグリカンデータベース検索にかけ、続いて同定されたＮ－グリカンにアノテーションを付けた。Ｎ－グリカンは、プレカーサーモノアイソトピック質量（ｍ／ｚ）及びプロダクトイオンｍ／ｚの両方を用いて同定した。実験的プロダクトイオン及びフラグメンテーションパターンをＧｌｙｃｏＷｏｒｋｂｅｎｃｈ ２アプリケーションを使用してインシリコで確認した。

【0186】

ＡＴＢ２００からのＮ－結合型グリカンの相対的定量化を決定するため、ＨＰＬＣ－ＦＬＤ－ＱＴＯＦ ＭＳ／ＭＳ実験から取得されたデータを以下のとおり処理した。ＦＬＤクロマトグラムの全てのＮ－グリカンピークを積分し、各ピークに、ＦＬＤクロマトグラムの全てのピークの総面積に対するパーセンテージを割り当てた。ピーク面積として表した蛍光シグナルが、試料中の各Ｎ－グリカンの量の定量的尺度である。しかしながら、ほとんどの場合に、複数のＮ－グリカン種が同じＦＬＤピークに含まれた。従って、各Ｎ－グリカン種の相対的定量を入手するには、質量分析データもまた必要であった（表５）。データから各Ｎ－グリカンのイオン強度シグナルを「抽出」して、抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）と呼ばれるクロマトグラフィーピークを作り出した。ＦＬＤクロマトグラフィーピークと整列したＸＩＣは、１つのＮ－グリカン種に対してのみ特異的であった。次に、イオン強度シグナルから作り出されたＸＩＣピークを積分した。このピーク面積が、存在するグリカンの量の相対的定量尺度である。ＦＬＤピーク面積及び質量分析計ＸＩＣピーク面積の両方を用いることにより、本明細書に報告されるＡＴＢ２００の全てのＮ－結合型グリカン種の相対的定量化が可能となった。

【0187】

このＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の結果は、以下の表５に提供する。グリカン表現の記号命名法は、Ｗｏｐｅｒｅｉｓ Ｗ，ｅｔ ａｌ．２００６．「シアル酸尿症患者における超シアル化Ｏ－グリカン類による異常なグリコシル化（Ａｂｎｏｒｍａｌ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｙｐｅｒｓｉａｌｙｌａｔｅｄ Ｏ－ｇｌｙｃａｎｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｓｉａｌｕｒｉａ）」．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．１７６２：５９８－６０７；Ｇｏｒｎｉｋ Ｏ，ｅｔ ａｌ．２００７．「敗血症及び急性膵炎における血清グリカンの変化（Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｇｌｙｃａｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｐｓｉｓ ａｎｄ ａｃｕｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）」．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．１７：１３２１－１３３２；Ｋａｔｔｌａ ＪＪ，ｅｔ ａｌ．２０１１．「生物学的タンパク質グリコシル化（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」．Ｉｎ：Ｍｕｒｒａｙ Ｍｏｏ－Ｙｏｕｎｇ（ｅｄ．），Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３：４６７－４８６；Ｔｈａｒｍａｌｉｎｇａｍ－Ｊａｉｋａｒａｎ Ｔ，ｅｔ ａｌ．「鍵となる主席卵胞発育段階におけるウシ卵胞液のＮ－グリカンプロファイリング（Ｎ－ｇｌｙｃａｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ ａｔ ｋｅｙ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｓｔａｇｅｓ）」．２０１４．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．１４８：５６９－５８０；Ｃｌｅｒｃ Ｆ，ｅｔ ａｌ．「ヒト血漿タンパク質Ｎ－グリコシル化（Ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」．２０１５．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ．ＤＯＩ １０．１００７／ｓ１０７１９－０１５－９６２６－２；及びＢｌａｃｋｌｅｒ ＲＪ，ｅｔ ａｌ．２０１６．「単鎖抗体断片Ｍ６Ｐ－１は、分岐特異的方法でＮ－グリカンリン酸化を区別するマンノース６－リン酸単糖特異的結合ポケットを持つ（Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｍ６Ｐ－１ ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ ａ ｍａｎｎｏｓｅ ６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ ｔｈａｔ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ Ｎ－ｇｌｙｃａｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｂｒａｎｃｈ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｎｎｅｒ）」．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２６－２：１８１－１９２に従う。

【0188】

【表7】

【0189】

この２－ＡＡ及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に基づけば、及び更に要約するとおり、試験したＡＴＢ２００は、１ｍｏｌのＡＴＢ２００当たり３～５ｍｏｌの平均Ｍ６Ｐ含量（モノ－Ｍ６Ｐ及びビス－Ｍ６Ｐの両方が占める）及び１ｍｏｌのＡＴＢ２００当たり４～７ｍｏｌのシアル酸含量を有する。

【0190】

図１９Ａ～図１９Ｈに示され、及び図２０Ｂに要約されるとおり、ＡＴＢ２００の第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位は、約０．２５ｍｏｌのモノ－Ｍ６Ｐ／ｍｏｌ ＡＴＢ２００の平均モノ－Ｍ６Ｐ含量及び約０．５６ｍｏｌのビス－Ｍ６Ｐ／ｍｏｌ ＡＴＢ２００の平均ビス－Ｍ６Ｐ含量が占める約１．４ｍｏｌのＭ６Ｐ／ｍｏｌ ＡＴＢ２００の平均Ｍ６Ｐ含量を有し；ＡＴＢ２００の第２の潜在的なＮ－グリコシル化部位は、約０．５ｍｏｌのＭ６Ｐ／ｍｏｌ ＡＴＢ２００の平均Ｍ６Ｐ含量を有し、ここで主要なリン酸化Ｎ－グリカン種はモノ－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカンであり；ＡＴＢ２００の第３の潜在的なＮ－グリコシル化部位は約１ｍｏｌのシアル酸／ｍｏｌ ＡＴＢ２００の平均シアル酸含量を有し；ＡＴＢ２００の第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位は、約０．３５ｍｏｌのモノ－Ｍ６Ｐ／ｍｏｌ ＡＴＢ２００の平均モノ－Ｍ６Ｐ含量及び約０．５２ｍｏｌのビス－Ｍ６Ｐ／ｍｏｌ ＡＴＢ２００の平均ビス－Ｍ６Ｐ含量が占める約１．４ｍｏｌのＭ６Ｐ／ｍｏｌ ＡＴＢ２００の平均Ｍ６Ｐ含量を有し；ＡＴＢ２００の第５の潜在的なＮ－グリコシル化部位は約０．８６ｍｏｌのシアル酸／ｍｏｌ ＡＴＢ２００の平均シアル酸含量を有し；ＡＴＢ２００の第６の潜在的なＮ－グリコシル化部位は約４．２ｍｏｌのシアル酸／ｍｏｌ ＡＴＢ２００の平均シアル酸含量を有し；及びＡＴＢ２００の第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位は約０．８６ｍｏｌのシアル酸／ｍｏｌ ＡＴＢ２００の平均シアル酸含量を有する。

【0191】

また、この２－ＡＡ及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析的技法によれば、ＡＴＢ２００の第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位におけるＮ－グリカンの平均約６５％が高マンノース型Ｎ－グリカンであり、ＡＴＢ２００の第２の潜在的なＮ－グリコシル化部位におけるＮ－グリカンの約８９％が高マンノース型Ｎ－グリカンであり、ＡＴＢ２００の第３の潜在的なＮ－グリコシル化部位における半分を超えるＮ－グリカンがシアル化されており（２０％近くが完全にシアル化されている）、及びＡＴＢ２００の第３の潜在的なＮ－グリコシル化部位におけるＮ－グリカンの約８５％が複合型Ｎ－グリカンであり、ＡＴＢ２００の第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位におけるＮ－グリカンの約８４％が高マンノース型Ｎ－グリカンであり、ＡＴＢ２００の第５の潜在的なＮ－グリコシル化部位におけるＮ－グリカンの約７０％がシアル化されており（約２６％が完全にシアル化されている）、及びＡＴＢ２００の第５の潜在的なＮ－グリコシル化部位におけるＮ－グリカンの約１００％が複合型Ｎ－グリカンであり、ＡＴＢ２００の第６の潜在的なＮ－グリコシル化部位におけるＮ－グリカン類の約８５％がシアル化されており（２７％近くが完全にシアル化されている）、及びＡＴＢ２００の第６の潜在的なＮ－グリコシル化部位におけるＮ－グリカンの約９８％が複合型Ｎ－グリカン類であり、及びＡＴＢ２００の第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位におけるＮ－グリカンの約８７％がシアル化されており（８％近くが完全にシアル化されている）、及びＡＴＢ２００の第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位におけるＮ－グリカンの約１００％が複合型Ｎ－グリカンである。

【0192】

実施例４：ＡＴＢ２００及びＭＹＯＺＹＭＥ（登録商標）／ＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）の分析的比較
精製したＡＴＢ２００及びＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）Ｎ－グリカンをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより判定して、各ＥＲＴに見られる個別のＮ－グリカン構造を決定した。ＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）を商業的供給元から入手した。図７に示されるとおり、ＡＴＢ２００は、ＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）の右側に溶出した４つの顕著なピークを呈した。この判定はＣＩＭＰＲ親和性よりむしろ、末端電荷によるものであるため、これにより、ＡＴＢ２００がＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）よりも高度にリン酸化していたことが確認される。図８に要約されるとおり、ＡＴＢ２００試料は、ＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）よりも非リン酸化高マンノース型Ｎ－グリカンの含有量が低いことが分かった。

【0193】

ＭＹＯＺＹＭＥ（登録商標）及びＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）における従来のｒｈＧＡＡがＣＩＭＰＲと相互作用する能力を判定するため、２つの従来のｒｈＧＡＡ製剤をＣＩＭＰＲアフィニティーカラム（これは、Ｍ６Ｐ基を有するｒｈＧＡＡを結合する）に注入し、フロースルーを回収した。結合した材料を遊離Ｍ６グラジエントで溶出させた。９６ウェルプレートに画分を回収し、４ＭＵ－α－グルコシダーゼ基質によってＧＡＡ活性をアッセイした。未結合のｒｈＧＡＡ（フロースルー）と結合したｒｈＧＡＡ（溶出したＭ６Ｐ）との相対量をＧＡＡ活性に基づき決定し、全酵素に対する割合として報告した。図９Ａ及び図９Ｂは、ＭＹＯＺＹＭＥ（登録商標）及びＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）におけるｒｈＧＡＡの結合プロファイルを示す：ＭＹＯＺＹＭＥ（登録商標）におけるｒｈＧＡＡの７３％（図９Ｂ）及びＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）におけるｒｈＧＡＡの７８％（図９Ａ）が、ＣＩＭＰＲに結合しなかった。実際、ＭＹＯＺＹＭＥ（登録商標）におけるｒｈＧＡＡの僅か２７％及びＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）におけるｒｈＧＡＡの２２％のみが、それを筋細胞上のＣＩＭＰＲへと標的化するのに生産的であり得るＭ６Ｐを含有した。対照的に、図５に示されるとおり、同じ条件下で、ＡＴＢ２００の７０％を超えるｒｈＧＡＡがＣＩＭＰＲに結合することが分かった。

【0194】

ＣＩＭＰＲに結合することのできるｒｈＧＡＡの割合が大きいことに加えて、その相互作用の質を理解することが重要である。ＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）及びＡＴＢ２００受容体結合をＣＩＭＰＲプレート結合アッセイを用いて決定した。簡潔に言えば、ＣＩＭＰＲでコートしたプレートを使用してＧＡＡを捕捉した。固定化した受容体に様々な濃度のｒｈＧＡＡを適用し、未結合のｒｈＧＡＡを洗い流した。残留しているｒｈＧＡＡの量をＧＡＡ活性により決定した。図１０Ａに示されるとおり、ＡＴＢ２００はＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）よりも有意に良好にＣＩＭＰＲに結合した。図１０Ｂは、ＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）（従来のｒｈＧＡＡ製剤）及び本発明に係るＡＴＢ２００におけるビス－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカンの相対含量を示す。ＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）については、平均して僅か１０％の分子がビスリン酸化Ｎ－グリカンを有する。対照的に、ＡＴＢ２００では、平均してあらゆるｒｈＧＡＡ分子が少なくとも１つのビスリン酸化Ｎ－グリカンを有する。

【0195】

全体的に見て、ＡＴＢ２００におけるＭ６Ｐ Ｎ－グリカンの含量がＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）よりも高いことは、ＡＴＢ２００ではより高い割合のｒｈＧＡＡ分子が筋細胞を標的化できることを指し示している。上記に示すとおり、ＭＡＬＤＩにより決定された高い割合のモノリン酸化及びビスリン酸化構造は、ＡＴＢ２００がＣＩＭＰＲ受容体に有意に大きく結合することを説明するＣＩＭＰＲプロファイルと一致している。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法によるＮ－グリカン分析により、平均して各ＡＴＢ２００分子が少なくとも１つの天然のビス－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカン構造を持っていることが確認された。このＡＴＢ２００でのより高いビス－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカン含量は、Ｍ６Ｐ受容体プレート結合アッセイにおけるＣＩＭＰＲに対する高い親和性結合（Ｋ_Ｄ約２～４ｎＭ）と直接相関している。

【0196】

ＡＴＢ２００及びＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）ｒｈＧＡＡの相対的細胞取込みを正常な及びポンペ病の線維芽細胞株を使用して比較した。比較には、５～１００ｎＭの本開示に係るＡＴＢ２００と１０～５００ｎＭの従来のｒｈＧＡＡ製剤ＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）が関わった。１６時間のインキュベーション後、外部にあるｒｈＧＡＡをトリス塩基で不活性化し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、回収した。インターナライズされたＧＡＡを４ＭＵ－α－グルコシド加水分解により測定し、全細胞タンパク質に対してグラフ化した。結果は図１１Ａ～図１１Ｃに見られる。

【0197】

ＡＴＢ２００はまた、細胞に効率的にインターナライズされたことを示した。図１１Ａ～図１１Ｂに図示されるとおり、ＡＴＢ２００は、正常及びポンペ病の両方の線維芽細胞にインターナライズされ、インターナライズされる程度は従来のｒｈＧＡＡ製剤ＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）よりも大きい。ＡＴＢ２００は約２０ｎＭで細胞受容体を飽和させる一方、細胞受容体を飽和させるには約２５０ｎＭのＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）（登録商標）が必要である。これらの結果から推定される取込み効率定数（Ｋ_{ｕｐｔａｋｅ}）は、図１１Ｃに示されるとおり、ＡＴＢ２００について２～３ｎｍ及びＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）について５６ｎＭである。これらの結果は、ＡＴＢ２００が、ポンペ病に対する良好に標的化された治療であることを示唆している。

【0198】

実施例５：ＡＴＢ２００及び薬理学的シャペロン
酸性又は中性ｐＨ緩衝液中でのＡＴＢ２００の安定性を、ＳＹＰＲＯオレンジを使用した熱安定性アッセイにおいて、タンパク質が変性すると色素の蛍光が増加することに伴い判定した。図１２に示されるとおり、ＡＴ２２２１を加えると、ＡＴＢ２００はｐＨ７．４で濃度依存的に安定化し、これは、リソソームの酸性環境を模倣する条件であるｐＨ５．２におけるＡＴＢ２００の安定性と同等であった。表６に要約されるとおり、ＡＴ２２２１を加えると、ＡＴＢ２００の融解温度（Ｔ_ｍ）がほぼ１０℃上昇した。

【0199】

【表8】

【0200】

実施例６：Ｇａａ ＫＯマウスにおけるＡＴＢ２００及びＡＴ２２２１の共投与
Ｇａａ ＫＯマウスにおいてＡＴＢ２００及びＡＴ２２２１の治療効果を判定し、アルグルコシダーゼアルファと比較した。この試験には、雄Ｇａａ ＫＯ（３～４ヵ月齢）及び年齢対応野生型（ＷＴ）マウスを使用した。アルグルコシダーゼアルファをボーラス尾静脈静脈内（ＩＶ）注射により投与した。共投与レジメンでは、ＡＴＢ２００の静脈内注射の３０分前にＡＴ２２２１を強制経口投与（ＰＯ）により投与した。治療は隔週で与えた。最終回投与から１４日後に、治療したマウスを犠牲死させ、更なる分析用に様々な組織を採取した。表７は、試験デザインを要約する。

【0201】

【表9】

【0202】

組織試料の組織中グリコーゲン含量を、上記で考察したとおり、アミログルコシダーゼ消化を用いて決定した。図１３に示されるとおり、２０ｍｇ／ｋｇ ＡＴＢ２００と１０ｍｇ／ｋｇ ＡＴ２２２１との組み合わせでは、４つの異なる組織（四頭筋、三頭筋、腓腹筋、及び心臓）において、同じ投薬量のアルグルコシダーゼアルファと比較したときグリコーゲン含量が有意に低下した。

【0203】

組織試料をまた、Ｋｈａｎｎａ Ｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１２），「薬理学的シャペロンＡＴ２２２０はポンペ病マウスモデルにおいて組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ取込み及びグリコーゲン低下を増加させる（Ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ＡＴ２２２０ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｃｉｄ α－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ）」，Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ７（７）：ｅ４０７７６；及びＫｈａｎｎａ，Ｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４），「薬理学的シャペロンＡＴ２２２０はポンペ病トランスジェニックマウスモデルにおいて突然変異体酸性α－グルコシダーゼの特異的活性及びリソソーム送達を増加させ、グリコーゲン低下を促進する（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ＡＴ２２２０ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｍｕｔａｎｔ Ａｃｉｄ α－Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ａｎｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐｏｍｐｅ Ｄｉｓｅａｓｅ）」，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（７）：ｅ１０２０９２に考察される方法に従い、バイオマーカーの変化に関しても分析した。図１４に示されるとおり、ＷＴと比較して、Ｇａａ ＫＯ動物の筋繊維には、リソソーム増殖を指示するものであるＬＡＭＰ１陽性小胞の著明な増加及びその肥大が見られた。ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１の共投与により、正常化したＬＡＭＰ１レベルの繊維が多くなることにつながった一方、残りのＬＡＭＰ１陽性小胞もまたサイズが減少した（挿入図）。

【0204】

同様に、未治療Ｇａａ ＫＯマウスの筋繊維における著しいＬＣ３陽性凝集体は、オートファジー領域及びオートファジービルドアップの存在の表れである。ＬＣ３陽性凝集体（赤色）は、アルグルコシダーゼアルファで治療したマウスと比較したとき、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１共投与で治療したマウスで優先的に減少した（図１５Ａ）。ＬＣ３の発現をウエスタンブロットを用いて評価したときにも、同様の観察が得られた。図１５Ｂに示されるとおり、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１で治療した動物の大多数が、オートファゴソームに関連する脂質化した形態であるＬＣ３ ＩＩのレベルの有意な低下を示したことから、オートファジーフラックスの改善が示唆される。比較すると、アルグルコシダーゼアルファがオートファジーに及ぼす効果はそれほど大きくなかった。

【0205】

膜修復に関与するタンパク質であって、その欠損／誤った輸送が幾つもの筋ジストロフィーに関連するジスフェリンについてもまた評価した。図１６に示されるとおり、ジスフェリン（茶色）は、Ｇａａ ＫＯマウスの筋形質に重度に蓄積した。アルグルコシダーゼアルファと比較して、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１は、より多数の筋繊維の筋鞘にジスフェリンを回復させることができた。

【0206】

これらのデータは、ＡＴＢ２００及びミグルスタットで治療したヒトポンペ病患者において実証された細胞レベルでの改善（例えば、これらの患者はグリコーゲン蓄積及び筋傷害のバイオマーカーレベルの減少を呈する）と一致しており、ポンペ病の有効な治療というだけでなく、疾患の進行を好転させることにもつながる。ヒトポンペ病患者における臨床データは、以下の実施例８及び９に要約する。

【0207】

実施例７：単一繊維分析
図１７に示されるとおり、媒体治療のマウスの大多数は、著しく肥大したリソソーム（緑色）（例えば「Ｂ」を参照）及び塊状のオートファジービルドアップの存在（赤色）（例えば「Ａ」を参照）を示した。ＭＹＯＺＹＭＥ（登録商標）治療のマウスは、媒体治療マウスと比較したとき、いかなる有意差も示さなかった。対照的に、ＡＴＢ２００で治療したマウスから単離したほとんどの繊維が、リソソームサイズの劇的な減少を示した（例えば、「Ｃ」を参照）。更には、オートファジービルドアップの範囲についてもまた、様々な程度の減少があった（例えば、「Ｃ」を参照）。結果として、ＡＴＢ２００治療マウスからの分析した筋繊維の大きな割合（３６～６０％）が、正常又はほぼ正常であるように見えた。以下の表８は、図１７に示す単一繊維分析を要約する。

【0208】

【表10】

【0209】

全体的に見て、このデータは、そのＭ６Ｐ含量が高いＡＴＢ２００が、単独でも、血液の中性ｐＨで薬理学的シャペロンＡＴ２２２１によって更に安定化させたものも両方とも、図１８に図示されるとおりのＡＴ２２２１によるＡＴＢ２００の安定化と一致して、アルグルコシダーゼアルファと比較して、Ｇａａ ＫＯマウスに投与したときの組織標的化及びリソソーム輸送の効率が高いことを指し示している。結果として、ＡＴＢ２００の投与及びＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１の共投与は、グリコーゲン蓄積、リソソーム増殖、及びオートファジー領域の形成など、疾患関連病変の一部を修正することにおける有効性がアルグルコシダーゼアルファよりも高かった。これらの正の治療効果に起因して、ＡＴＢ２００の投与及びＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１共投与は、最適なＧＡＡ活性を欠くことが原因で細胞に蓄積したグリコーゲンを除去することにより、筋繊維を損傷から回復させて、更には損傷を好転させる可能性があることが示される。実施例６と同様に、これらのデータはまた、ＡＴＢ２００及びミグルスタットの投与後にポンペ病の有効な治療及び疾患進行の好転の両方につながるヒトポンペ病患者で実証された細胞レベルでの改善とも一致している。ヒトポンペ病患者の臨床データは、以下の実施例８及び９に要約する。

【0210】

実施例８：ＡＴＢ２００－０２治験
ポンペ病を有する成人対象におけるＡＴＢ２００とＡＴ２２２１の静脈内注入について安全性、忍容性、薬物動態、薬力学、及び暫定的な有効性を評価する第１／２相（ＡＴＢ２００－０２、ＮＣＴ－０２６７５４６５）非盲検、固定順序、用量漸増臨床試験を行った。このデータは国際公開第２０２０／１６３４８０号パンフレット（この開示は本明細書において参照により援用される）に報告された。

【0211】

実施例９：ＡＴＢ２００－０３治験：ポンペ病患者におけるＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１の第３相イン・ヒューマン試験
ＡＴＢ２００－０３治験は、アルグルコシダーゼアルファ／プラセボと比較した、アルグルコシダーゼアルファによる酵素補充療法を受けたことがある（即ち、ＥＲＴ歴あり）又はＥＲＴを一度も受けたことがない（即ち、ＥＲＴ未経験）遅発型ポンペ病（ＬＯＰＤ）の成人対象におけるＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１の第３相二重盲検、無作為化、多施設、国際試験であった。

【0212】

研究デザイン
図２１に示されるとおり、この治験は、最長３０日間のスクリーニング期間、１２ヵ月間の治療期間、及び３０日間の安全性フォローアップ期間からなった。適格な対象をＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１又はアルグルコシダーゼアルファ／プラセボの投与を受けるように２：１の比で無作為に割り付け、ＥＲＴ状態別（ＥＲＴ歴あり、ＥＲＴ未経験）及びベースライン６分間歩行距離（６ＭＷＤ）別（７５メートル以上１５０メートル未満、１５０メートル以上４００メートル未満、４００メートル以上）に層別化した。

【0213】

有効性評価（即ち、機能評価）には、歩行機能の判定（６ＭＷＴ）、運動機能テスト（歩行・階段・ガワーズ・椅子動き（ＧＳＧＣ）テスト及びタイムアップアンドゴー（ＴＵＧ）テスト）、筋力（徒手筋力テスト及び定量的筋力テスト）、及び肺機能検査（ＦＶＣ、ＳＶＣ、ＭＩＰ、ＭＥＰ、及びＳＮＩＰ）が含まれた。患者報告アウトカム（Ｒａｓｃｈ－ｂｕｉｌｔ Ｐｏｍｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ（Ｒ Ｐａｃｔ）尺度、ＥｕｒｏＱｏｌ ５ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ ５レベルインスツルメント（ＥＱ－５Ｄ－５Ｌ）、身体機能、疲労、呼吸困難、及び上肢についての患者報告アウトカム測定情報システム（ＰＲＯＭＩＳ（登録商標））インスツルメント、及び対象による変化の全般的印象（Ｓｕｂｊｅｃｔ’ｓ Ｇｌｏｂａｌ Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈａｎｇｅ）を記録した。医師による変化の全般的印象（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｇｌｏｂａｌ Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈａｎｇｅ）もまた実施した。

【0214】

薬力学的評価には、筋傷害についてのバイオマーカー（クレアチンキナーゼ（ＣＫ）及び疾患基質（尿中ヘキソース四糖（Ｈｅｘ４））の測定が含まれた。血漿中の総ＧＡＡタンパク質レベル及びＡＴ２２２１濃度を決定するため、ＥＲＴ歴のある対象における母集団ＰＫ分析用の低密度血液試料を採取した。ＥＲＴ未経験対象では、総ＧＡＡタンパク質及びＡＴ２２２１のＰＫプロファイルを特徴付けるため時系列血液試料採取を行った。

【0215】

安全性評価には、注入関連反応（ＩＡＲ）を含めた有害事象（ＡＥ）のモニタリング、臨床検査（化学、血液学、及び検尿）、バイタルサイン、体重を含む理学的検査、心電図（ＥＣＧ）、及び免疫原性が含まれた。併用薬及び非薬物療法もまた記録した。

【0216】

対象の選択
試験に参加した対象は、以下の組入れ基準を全て満たし、且ついかなる除外基準も満たさなかった。全体では、１２２例の対象がこのＡＴＢ２００－０３治験に参加した。そのうち、８５例の対象（ＥＲＴ歴あり：６５例；ＥＲＴ未経験：２０例）がＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療を受け、３７例の対象（ＥＲＴ歴あり：３０例；ＥＲＴ未経験：７例）がアルグルコシダーゼアルファ／プラセボ治療を受けた。図２２に示されるとおり、ベースライン６ＭＷＤ及びＦＶＣデータは集団の代表であり、２つの治療群で概して同様であった。

【0217】

組入れ基準：
１．任意の試験関連手順を実施する前に、対象は署名したインフォームドコンセントを提出した。
２．男性及び女性対象はスクリーニング時に１８歳以上及び体重４０ｋｇ以上であった。
３．妊娠の可能性がある女性対象及び男性対象は、本試験中及び最終回の試験薬投与後９０日間は医学上認められている避妊方法を用いることに同意した。
４．対象は、以下のうちの１つの文書記録に基づくＬＯＰＤの診断を有した：
ａ．ＧＡＡ酵素の欠損
ｂ．ＧＡＡ遺伝子タイピング
５．対象は、ＥＲＴ状態に関して以下のうちの１つに分類された：
ａ．ＥＲＴ歴あり、標準治療ＥＲＴ（アルグルコシダーゼアルファ）を推奨される用量及びレジメン（即ち、２週間毎に２０ｍｇ／ｋｇ用量）で２４ヵ月以上にわたって受けたことがあるとして定義される
オーストラリアについては特別に、ＥＲＴ歴あり、標準治療ＥＲＴ（アルグルコシダーゼアルファ）を２週間毎に除脂肪体重又は理想体重を基準とする２０ｍｇ／ｋｇの用量で、推奨される用量及びレジメンで受けたことがあるとして定義される
ｂ．ＥＲＴ未経験、治験薬又は市販薬のＥＲＴを一度も受けたことがないとして定義される
６．対象はスクリーニング時に座位ＦＶＣが健康成人についての予測値（全国健康栄養調査ＩＩＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ Ｓｕｒｖｅｙ ＩＩＩ））の３０％以上であった。
７．対象はスクリーニング時に２回の６ＭＷＴを実施し、それらは臨床判定者が決定するとき有効であったとともに、以下の判定基準を全て満たした：
ａ．６ＭＷＤの両方のスクリーニング値とも、７５メートル以上であった
ｂ．６ＭＷＤの両方のスクリーニング値とも、健康成人についての予測値の９０％以下であった
ｃ．６ＭＷＤの低い方の値が６ＭＷＤの高い方の値から２０％以内であった

【0218】

除外基準：
１．対象は、１日目に先立つ３０日間又はその療法若しくは治療の５半減期のいずれか長い方のうちに、ポンペ病に対する何らかの治験中の療法又はアルグルコシダーゼアルファ以外の薬理学的治療を受けたことがあったか、又は試験中にそれを受ける見込みがあった。
２．対象はポンペ病に対する遺伝子療法を受けたことがあった。
３．対象は、１日目に先立つ３０日間のうちに以下の禁止薬物のいずれかを服用中であった：
・ミグリトール
・ミグルスタット
・アカルボース
・ボグリボース
４．対象は、覚醒時に１日６時間を超える侵襲的又は非侵襲的換気補助の使用が必要であった。
５．対象は、ＡＴＢ２００、アルグルコシダーゼアルファ、又はＡＴ２２２１中の賦形剤のいずれかに対する過敏症を有した。
６．対象は、治験責任医師又はメディカルモニターの意見によれば、対象に過度の安全性リスクを及ぼす、又は対象がプロトコル要件を順守する能力を損なうか若しくはそれに悪影響を与えるような医学的状態又は任意の他の酌量すべき状況を有した。これには、（精神科医又は他のメンタルヘルスの専門家が診断したとき）制御されない又は制御不良の症状を伴う臨床的うつ病が含まれた。
７．対象は、女性の場合に、スクリーニング時に妊娠中又は授乳中であった。
８．対象は、男女問わず、試験中に妊娠する計画を有した。
９．対象は遺伝子検査を受けることを拒否した。

【0219】

治験薬、投薬量、及び投与方法
ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１又はアルグルコシダーゼアルファ／プラセボのいずれかの投与を受けるように対象を少なくとも２：１の無作為化比で無作為化した。以下の表９は、登録した対象の治療を要約する。

【0220】

【表11】

【0221】

データ判定及び統計的考察
主要有効性評価項目は、ベースラインから５２週目までの６ＭＷＤの変化であった。主要評価項目は、反復測定混合効果モデル（ＭＭＲＭ）及び正規性が破れた場合には事前指定された非パラメトリック検定を用いて、アルグルコシダーゼアルファ／プラセボに対するＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１の優位性に関して検定した。

【0222】

鍵となる副次的有効性評価項目は、事前指定された階層的重要性の順に、以下のとおりであった。これらの副次的評価項目は、共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）モデルと、直近の観測値を代入する欠測値補完法を用いて分析した（ＩＴＴ ＬＯＣＦ）。
・座位ＦＶＣ（％対予測値）のベースラインから５２週目までの変化
・下肢徒手筋力テストスコアのベースラインから５２週目までの変化
・ＰＲＯＭＩＳ－身体機能の総スコアのベースラインから５２週目までの変化
・ＰＲＯＭＩＳ－疲労の総スコアのベースラインから５２週目までの変化
・ＧＳＧＣ総スコアのベースラインから５２週目までの変化

【0223】

他の副次的有効性評価項目は、以下のとおりであった：
・運動機能に関する以下の変数のベースラインから５２週目までの変化：
－ ＧＳＧＣテストの１０メートル歩行を完了するのにかかる時間（即ち、歩行の評価）
－ ＧＳＧＣテストの４段の階段上りを完了するのにかかる時間
－ ＧＳＧＣテストのガワーズの動きを完了するのにかかる時間
－ ＧＳＧＣテストの一部としての椅子から立ち上がるのにかかる時間
－ ＴＵＧテストを完了するのにかかる時間
・筋力に関する以下の変数のベースラインから５２週目までの変化：
－ 上肢徒手筋力テストスコア
－ 徒手筋力テスト総スコア
－ 上肢定量的筋力テスト値（ｋｇ）
－ 下肢定量的筋力テスト値（ｋｇ）
－ 定量的筋力テスト合計値（ｋｇ）
・患者報告アウトカム尺度からの以下の変数のベースラインから５２週目までの変化：
－ ＰＲＯＭＩＳ－呼吸困難の総スコア
－ ＰＲＯＭＩＳ－上肢の総スコア
－ Ｒ－ＰＡｃｔ尺度総スコア
－ ＥＱ－５Ｄ－５Ｌ健康状態
・対象による変化の全般的印象（Ｓｕｂｊｅｃｔ’ｓ Ｇｌｏｂａｌ Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈａｎｇｅ）によって測定されるとおりの、５２週目の以下の生活領域における試験薬の効果に関する対象の機能状態（改善、安定、又は悪化）の実測値
－ 全般的な身体的健康
－ 呼吸努力
－ 筋力
－ 筋機能
－ 動き回る能力
－ 日常生活活動
－ 活力の程度
－ 筋肉痛の程度
・医師による変化の全般的印象（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｇｌｏｂａｌ Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈａｎｇｅ）によって測定されるとおりの、５２週目における対象の機能状態（改善、安定、又は悪化）の実測値
・以下のとおりの、以下の肺機能尺度のベースラインから５２週目までの変化：
－ 座位ＦＶＣ（％対予測値）
－ ＭＩＰ（ｃｍＨ_２Ｏ）
－ ＭＩＰ（％対予測値）
－ ＭＥＰ（ｃｍＨ_２Ｏ）
－ ＭＥＰ（％対予測値）
－ ＳＮＩＰ（ｃｍＨ_２Ｏ）

【0224】

薬力学的評価項目は以下のとおりであった：
・血清ＣＫレベルのベースラインから５２週目までの変化
・尿中Ｈｅｘ４レベルのベースラインから５２週目までの変化

【0225】

ＥＲＴ歴のある対象については、総ＧＡＡタンパク質レベル及びＡＴ２２２１濃度の母集団ＰＫ分析からの薬物動態評価項目を収集した。ＥＲＴ未経験対象については、血漿総ＧＡＡタンパク質濃度及びＡＴ２２２１のＰＫパラメータを計算した。

【0226】

ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１の安全性プロファイルは、治療中に発生した有害事象（ＴＥＡＥ）、重篤有害事象（ＳＡＥ）、及び試験薬の中止につながるＡＥの発生率、即時及び遅発ＩＡＲの頻度及び重症度、並びに他の安全性評価で認められた任意の異常を用いて特徴付けた。ＡＴＢ２００及びアルグルコシダーゼアルファに対する免疫原性が安全性及び有効性に及ぼす影響もまた評価した。

【0227】

統計的方法には、標本無作為化、標本サイズ計算、有効性分析、及び安全性分析に関して以下の考慮を含めた。

【0228】

無作為化。以下の２つの因子をデザイン層別化変数として同定した：１．ベースライン６ＭＷＤ（７５以上１５０メートル未満、１５０以上４００メートル未満、４００メートル以上）；及び２．ＥＲＴ状態（ＥＲＴ歴あり、ＥＲＴ未経験）。これらの２つの因子が、６つの因子の組み合わせ（即ち、レベル、層）を形成した。中央施設でのブロック無作為化手順を用いて上記のリスク因子の均衡をとることにより、１）バイアスを低減して統計的推定の精度を増加させ、及び２）様々な計画された及び計画外のサブセット分析を可能にした。ブロック無作為化スキームは、６層の各々について実施した。無作為化比は、固定した、２：１のＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１対アルグルコシダーゼアルファ／プラセボである。

【0229】

標本サイズの計算。０．０５の両側有意水準及び２：１無作為化スキーム（９９例の対象の合計標本サイズについて、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１群に６６例の対象及びアルグルコシダーゼアルファ／プラセボ群に３３例の対象）による２標本ｔ検定では、優位性検定においてこれらの２標本間に０．７の標準化効果量を検出するのに約９０％の検出力を有すると決定された。この計算は、Ｎｑｕｅｒｙ ８（著作権）（登録商標）を使用して実施した。１０％の脱落率を仮定すると、標本サイズは約１１０例の対象となった。

【0230】

有効性分析。パラメトリック共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）モデルを用いて主要有効性評価項目（即ち、６ＭＷＤのベースラインから５２週目までの変化）を分析し、新規治療と対照とを比較した。このモデルは、典型的にはベースライン６ＭＷＤ（連続共変量としての）を調整し、２つの因子を使用して無作為化を層別化することになった：ＥＲＴ状態（ＥＲＴ未経験対ＥＲＴ歴あり）及びベースライン６ＭＷＤ（７５以上１５０メートル未満、１５０以上４００メートル未満、４００メートル以上）。しかしながら、ベースライン６ＭＷＤをモデルで２回（連続変数及びカテゴリー変数の両方として）使用することは、それらの間に高い点双列相関が予想されたためできなかった。従って、６ＭＷＤ連続変数をモデルに残し、しかしカテゴリー６ＭＷＤは除去した。ひいてはＡＮＣＯＶＡモデルは、治療、ベースライン６ＭＷＤ（連続）、及びＥＲＴ状態（カテゴリー）の頂を有した。

【0231】

加えて、治療×共変量相互作用の可能性（即ち、治療×ＥＲＴ状態及び治療×ベースライン６ＭＷＤ連続）を調べた。相互作用項が統計的に有意であり（例えば、ｐ＜０．１０、両側）、且つ論理的な生物学的解釈があった場合、ひいてはその相互作用項を最終的なＡＮＣＯＶＡモデルに加えることができ、それが主要評価項目分析に使用されることになる可能性があった。ひいてはデータはＡＮＣＯＶＡモデルに基づき分析し、全ての関連性のある推定（例えば、各治療群のＬＳ平均、差のＬＳ平均、ＬＳ平均差についての９５％信頼区間（ＣＩ）、及び２つの治療群間の比較に関するｐ値）を提供した。

【0232】

臨床的有益性の解釈を裏付けるため、治療アウトカムデータの総計に基づき複合対象レベル反応を定義した。対象を、治療アウトカムに基づき有意な改善、中程度の改善、又は僅かな改善／改善全く無しからなる順序反応変数によって分類した。

【0233】

鍵となる副次的評価項目は、段階的閉検定手順を用いて第１種の過誤率を制御して、階層的順序に従い分析した。鍵となる副次的及び他の副次的評価項目は、主要評価項目分析に使用したのと同様の方法で別個に分析した。

【0234】

安全性分析。安全性データは、カテゴリーデータについてはカウント及びパーセンテージ並びに連続データについては記述統計量（平均値、標準偏差、中央値、最小値、最大値）を使用して要約した。

【0235】

ＡＴＢ２００－０３治験の有効性結果
全集団では、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療は、５２週目に（図２３Ａ）及び時間の経過に伴い（図２３Ｂ）、ベースラインと比べて６ＭＷＤの改善及びパーセント対予測値ＦＶＣの安定化を示した。アルグルコシダーゼアルファ／プラセボと比較して、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療は、５２週目に全集団における６ＭＷＤのより大きい改善を示した（図２３Ａ）。更には、図２３Ａに示されるとおり、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療は、アルグルコシダーゼアルファ／プラセボと比較して、５２週目に全集団におけるパーセント対予測値ＦＶＣの臨床的に有意な改善を示した。

【0236】

ＥＲＴ歴のある集団では、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療は、ベースラインと比べて５２週目に６ＭＷＤの改善及びパーセント対予測値ＦＶＣの安定化を示した（図２４）。アルグルコシダーゼアルファ／プラセボと比較して、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療は、ＥＲＴ歴のある集団において６ＭＷＤの時間の経過に伴う改善及びパーセント対予測値ＦＶＣの時間の経過に伴う安定化を示した（図２５）。更には、図２４に示されるとおり、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療は、アルグルコシダーゼアルファ／プラセボと比較して、ＥＲＴ歴のある集団において５２週目に６ＭＷＤ及びパーセント対予測値ＦＶＣの両方の臨床的に有意な改善を示した。

【0237】

図２６Ａ及び図２６Ｂに示されるとおり、より小さいＥＲＴ未経験の集団では（ｎ＝２７）、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療は、ベースラインと比べて５２週目に（図２６Ａ）及び時間の経過に伴い（図２６Ｂ）６ＭＷＤの改善及びパーセント対予測値ＦＶＣの安定化を示した。２つの治療群間のばらつきがより大きく、６ＭＷＤ又はパーセント対予測値ＦＶＣの臨床的に有意な改善は認められなかった（図２６Ａ）。

【0238】

図２８に示されるとおり、全集団、ＥＲＴ歴のある集団では、下肢ＭＭＴは、アルグルコシダーゼアルファ／プラセボと比較して、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療の方が良好な数値であった。

【0239】

図２９に示されるとおり、全集団及びＥＲＴ歴のある集団では、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療は、アルグルコシダーゼアルファ／プラセボと比較して、５２週目にＧＳＧＣの臨床的に有意な改善を示した。

【0240】

図３０に示されるとおり、全集団及びＥＲＴ歴のある集団では、ＰＲＯＭＩＳ身体機能は、アルグルコシダーゼアルファ／プラセボと比較して、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療の方が良好な数値であった。

【0241】

図３１に示されるとおり、全集団及びＥＲＴ歴のある集団では、ＰＲＯＭＩＳ疲労は２つの治療群間で同程度に改善された。

【0242】

ＡＴＢ２００－０３治験のバイオマーカー結果
全集団及びＥＲＴ歴のある集団では、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療により、時間の経過に伴う筋損傷（ＣＫ）及び疾患基質（Ｈｅｘ４）のバイオマーカーの改善が示された（図３２及び図３３）。更には、図３２及び図３３に示されるとおり、全集団及びＥＲＴ歴のある集団では、ＣＫ及び尿中Ｈｅｘ４の減少が、アルグルコシダーゼアルファ／プラセボと比較して、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療で５２週目に有意に大きかった。

【0243】

図３４に要約されるとおり、全集団及びＥＲＴ歴のある集団では、運動機能、肺機能、筋力、患者報告アウトカム（ＰＲＯ）及びバイオマーカーで見た評価項目について、アルグルコシダーゼアルファ／プラセボよりもＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療の方が一貫して良好であった。更には、評価した１７個の有効性及びバイオマーカー評価項目のうち、１６個について、アルグルコシダーゼアルファ／プラセボよりもＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療の方が良好であった。

【0244】

ＡＴＢ２００－０３治験の安全性結果
図３５に示されるとおり、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１治療群の全体的な安全性プロファイルは、アルグルコシダーゼアルファ／プラセボ群と同様であった。

【0245】

図３６～図４０は、ＡＴＢ２００－０３治験の追加的な側面を記載する。

【0246】

実施例１０：ＰＲＯＰＥＬ第３相臨床治験の結果
ＡＴ－ＧＡＡは、ピボタル第３相ＰＲＯＰＥＬ試験において、標準治療と比較して遅発型ポンペ病の筋骨格及び呼吸器の両方の尺度の臨床的に有意味且つ有意な改善を示した。ＰＲＯＰＥＬは「ＡＴＢ２００－０３」とも称される。実施例９を参照のこと。

【0247】

承認されている標準治療ＥＲＴ（アルグルコシダーゼアルファ）からＡＴ－ＧＡＡに変更した患者は、平均して更に１７メートル多く歩いた（ｐ＝０．０４６）。

【0248】

ＡＴ－ＧＡＡに変更した患者はまた、アルグルコシダーゼアルファで治療した患者の悪化と比較して、ポンペ病における呼吸機能の最も重要な尺度であるパーセント対予測値努力肺活量（ＦＶＣ）の改善も示した（ＦＶＣ差４．１％；ｐ＝０．００６）。

【0249】

ＡＴ－ＧＡＡは、アルグルコシダーゼアルファで治療した患者と比較して、ＦＶＣの第１の鍵となる副次的評価項目の優位性に関して名目上統計的に有意且つ臨床的に有意味な差を示した（ＦＶＣ差３．０％；ｐ＝０．０２３）。

【0250】

ＥＲＴ変更患者とＥＲＴ未経験患者との組み合わせ試験対象集団では、主要評価項目上はＡＴ－ＧＡＡがアルグルコシダーゼアルファよりも１４メートル優れた成績であり（２１ｍに対して７ｍ）、優位性に関しては統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．０７２）。

【0251】

組み合わせ試験対象集団についてポンペ病の２つの重要なバイオマーカー（Ｈｅｘ－４及びＣＫ）の改善は、アルグルコシダーゼアルファと比較してＡＴ－ＧＡＡの方が有意に良好であった（ｐ＜０．００１）。

【0252】

ＰＲＯＰＥＬは、ＡＴ－ＧＡＡの有効性、安全性及び忍容性を、現在の標準治療、酵素補充療法（ＥＲＴ）であるアルグルコシダーゼアルファと比較して評価するように設計された５２週二重盲検無作為化国際試験であった。この試験には、まだ歩行能力及び機械的換気なしに呼吸する能力のある１２３例の成人ポンペ病患者が登録し、５大陸の２４ヵ国における６２ヵ所の臨床施設で行われた。これは、これまでリソソーム障害で行われた中で最も大規模な対照臨床試験であった。

【0253】

ＰＲＯＰＥＬに登録した患者は２：１で無作為化し、従ってＡＴ－ＧＡＡでの治療に無作為化される患者２例につき、アルグルコシダーゼアルファでの治療に１例が無作為化された。ＰＲＯＰＥＬに登録したポンペ病患者のうち、７７％が登録直前にアルグルコシダーゼアルファによる治療を受けている者であり（ｎ＝９５）、２３％がいかなるＥＲＴによる治療も一度も受けたことがない者であった（ｎ＝２８）。１１７例の患者がＰＲＯＰＥＬ試験を完了し、全１１７例が自らの意志で長期延長試験に登録し、現在、そのポンペ病の治療がＡＴ－ＧＡＡによってのみ行われているところである。

【0254】

ＥＲＴ変更及びＥＲＴ未経験の組み合わせ試験対象集団における６分間歩行距離（６ＭＷＤ）及びパーセント対予測値努力肺活量（ＦＶＣ）の事前指定分析：
この試験の主要評価項目は、ＥＲＴ変更及びＥＲＴ未経験組み合わせ患者集団での５２週間時点におけるベースライン測定値と比較したときの６分間歩行距離の平均変化であった。この組み合わせ集団では、ＡＴ－ＧＡＡを服用した患者（ｎ＝８５）は、アルグルコシダーゼアルファで治療した患者（ｎ＝３７）の７メートルと比較して、５２週間時点で平均して更に２１メートル歩いた（表１０）。組み合わせ集団におけるこの主要評価項目を優位性に関して評価し、数値的には大きいものの、アルグルコシダーゼアルファアームと比較したとき、ＡＴ－ＧＡＡアームについて、この組み合わせ集団での優位性に関する統計的有意性は実現しなかった（ｐ＝０．０７２）。

【0255】

統計解析計画書の階層によれば、この試験の第１の鍵となる副次的評価項目は、組み合わせ集団での５２週間時点におけるパーセント対予測値ＦＶＣの変化平均であった。この組み合わせ集団では、ＡＴ－ＧＡＡを服用した患者は、アルグルコシダーゼアルファで治療した患者に対する優位性に関して名目上統計的に有意且つ臨床的に有意味な差を実証した。ＡＴ－ＧＡＡは、５２週間後に患者の呼吸器悪化速度を有意に遅らせた。ＡＴ－ＧＡＡで治療した患者は、パーセント対予測値ＦＶＣについて、アルグルコシダーゼアルファアームの４．０％の絶対的悪化と比較して０．９％の絶対的悪化を示した（ｐ＝０．０２３）（表１１）。パーセント対予測値ＦＶＣは、ポンペ病における呼吸筋機能の最も重要な尺度であり、アルグルコシダーゼアルファの承認の基礎となった。

【0256】

【表12】

【0257】

【表13】

【0258】

ＥＲＴ変更試験対象集団（ｎ＝９５）における６分間歩行距離（６ＭＷＤ）及びパーセント対予測値努力肺活量（ＦＶＣ）の事前指定分析：
最低でも２年間にわたってアルグルコシダーゼアルファで治療されていたＰＲＯＰＥＬ変更患者が試験に参加した。３分の２を超える（６７％＋）これらの患者が、ＰＲＯＰＥＬ試験への参加前に５年間を超えてＥＲＴ治療中であった（平均７．４年）。

【0259】

アルグルコシダーゼアルファから変更した患者の６分間歩行距離に関する事前指定分析が示したところによれば、ＡＴ－ＧＡＡ治療患者（ｎ＝６５）は、変更から５２週間後に、アルグルコシダーゼアルファのまま留まるように無作為化された患者（ｎ＝３０）の０．０メートルと比較して、そのベースラインよりも更に１６．９メートル多く歩いた（ｐ＝０．０４６）（表１２）。

【0260】

アルグルコシダーゼアルファから変更した患者のパーセント対予測値ＦＶＣに関する事前指定分析が示したところによれば、ＡＴ－ＧＡＡ治療患者は、この重要な尺度に関してその呼吸機能が安定化し、僅かに改善した一方、アルグルコシダーゼアルファのまま留まった患者は呼吸筋機能が有意に悪化し続けた。ＡＴ－ＧＡＡ患者は、１年間でパーセント対予測値ＦＶＣの０．１％の絶対的増加を示した一方、アルグルコシダーゼアルファ患者は４．０％の絶対的悪化を示した（ｐ＝０．００６）（表１３）。

【0261】

【表14】

【0262】

【表15】

【0263】

ＥＲＴ治療未経験集団（ｎ＝２８）における６分間歩行距離（６ＭＷＤ）及びパーセント対予測値努力肺活量（ＦＶＣ）の事前指定分析：
過去にいかなるＥＲＴによっても一度も治療されたことがない患者の６分間歩行距離に関する事前指定分析が示したところによれば、５２週間後にＡＴ－ＧＡＡ治療患者（ｎ＝２０）はそのベースラインよりも更に３３メートル多く歩いた。アルグルコシダーゼアルファ治療患者（ｎ＝７）は、そのベースラインよりも更に３８メートル多く歩いた。この２群間の差は、統計的に有意でなかった（ｐ＝０．６０）（表１４）。

【0264】

過去にいかなるＥＲＴによっても一度も治療されたことがない患者の事前指定分析が示したところによれば、パーセント対予測値努力肺活量（ＦＶＣ）は５２週間時点でＡＴ－ＧＡＡ治療患者について－４．１％及びアルグルコシダーゼアルファ治療患者について－３．６％と、同様の悪化であった（表１５）。この２群間の差は、統計的に有意でなかった（ｐ＝０．５７）。

【0265】

【表16】

【0266】

【表17】

【0267】

ＥＲＴ変更及びＥＲＴ未経験の全試験対象集団における他の鍵となる副次的及バイオマーカー評価項目の事前指定分析：
筋骨格及び他の鍵となる副次的評価項目：
ＧＳＧＣ（歩行・階段・ガワーズ・椅子）：ＧＳＧＣは、ポンペ病において重要な、広く使用されている、筋力、協調及び運動性を捕捉する評価項目である。ＡＴ－ＧＡＡ治療患者は、この重要な評価において、全集団でアルグルコシダーゼアルファ治療患者が悪化したのと比較して、統計的に有意なスコアの改善を実証した（ｐ＜０．０５）。

【0268】

下肢ＭＭＴ（徒手筋力テスト）、ＰＲＯＭＩＳ身体機能：筋力及び患者報告アウトカムに関するこれらのバリデートされた尺度の両方に関して、ＡＴ－ＧＡＡ治療患者は数値的にアルグルコシダーゼアルファ治療患者よりも大きく改善したが、それらの結果は統計的に有意でなかった。

【0269】

ＰＲＯＭＩＳ疲労：この尺度によって測定されるとおりの疲労については、アルグルコシダーゼアルファ治療患者よりもＡＴ－ＧＡＡ治療患者の方が僅かに良好であった。

【0270】

疾患に対する治療効果のバイオマーカー：
尿中Ｈｅｘ－４：ＥＲＴ変更患者及びＥＲＴ未経験患者の両方の組み合わせ試験対象集団について、ＡＴ－ＧＡＡの投与を受けている患者は、このバイオマーカーに関して実質的な改善を示し、５２週間後のＨｅｘ－４の減少の平均は、アルグルコシダーゼアルファ治療患者におけるＨｅｘ－４の＋１１．０％の増加（即ち、悪化）と比較して－３１．５％であった（ｐ＝＜０．００１）。尿中Ｈｅｘ－４は、ポンペ病においてよく使用されるバイオマーカーであり、ＥＲＴの投与を受けているポンペ病患者における骨格グリコーゲンクリアランスの程度についての間接的な尺度として使用される。グリコーゲンは、ポンペ病患者の筋肉のリソソームに蓄積する基質である。

【0271】

ＣＫ（クレアチンキナーゼ）：５２週間後、ＡＴ－ＧＡＡ治療患者は、このバイオマーカーに関しても同様に実質的な改善を示し、ＣＫの減少の平均は、アルグルコシダーゼアルファ治療患者における＋１５．６％の増加（即ち、悪化）と比較して－２２．４％であった（ｐ＜０．００１）。ＣＫは、損傷した筋細胞から漏れ出す酵素であり、ポンペ病患者で上昇する。

【0272】

ＡＴ－ＧＡＡは、アルグルコシダーゼアルファと同様の安全性プロファイルを実証した。ＡＴ－ＧＡＡの投与を受けている２例の患者（２．４％）が、有害事象が原因で治療を中止し、比較してアルグルコシダーゼアルファについては、治療とは無関係な１例（２．６％）であった。ＡＴ－ＧＡＡ参加者の２５％及びアルグルコシダーゼアルファ患者の２６％に注射関連反応（ＩＡＲ）が報告された。

【0273】

事後サブグループ分析：
ベースライン６ＭＷＤ及びＦＶＣカテゴリー：ＥＲＴ未経験集団（ｎ＝２７）：３例の患者が３００ｍ未満のベースライン６ＭＷＤを有し、３例が５５％未満のベースラインＦＶＣを有した；これらのサブグループでは、患者数が少なかったため、ＣＦＢＬの分析は実施しなかった。３００ｍ以上のベースライン６ＭＷＤ：シパグルコシダーゼアルファ／ミグルスタット（ＡＴ－ＧＡＡ）群（ｎ＝１８）及びアルグルコシダーゼアルファ／プラセボ群（ｎ＝６）の両方とも、時間の経過に伴い同様の改善を示した（５２週目までのＣＦＢＬ平均値［ＳＥ］：それぞれ、＋３４．４［１２．１］ｍ及び＋３０．８［９．６］ｍ）。５５％以上のベースラインＦＶＣ：シパグルコシダーゼアルファ／ミグルスタット群（ｎ＝１９）及びアルグルコシダーゼアルファ／プラセボ群（ｎ＝５）の両方とも、時間の経過に伴い悪化した（５２週目までのＣＦＢＬ平均値［ＳＥ］：それぞれ、－３．７［１．５］％及び－３．３［２．６］％）。図４１Ａ及び図４１Ｂに示されるとおり、全集団及びＥＲＴ歴のある集団では、ベースライン６ＭＷＤが３００ｍ未満及び３００ｍ以上、及びＦＶＣが５５％未満及び５５％以上の患者において、アウトカムはシパグルコシダーゼアルファ／ミグルスタットの方が一貫して良好であった。

【0274】

ＥＲＴ未経験患者及びＥＲＴ歴のある患者を含む全試験対象集団では、シパグルコシダーゼアルファ／ミグルスタットは、運動及び呼吸機能に関して、ベースライン６ＭＷＤ及び％ＦＶＣ評価とは無関係に、並びに事前指定分析及び事後サブグループ分析の両方で、承認されているＥＲＴと比較してポジティブな傾向又は臨床的に有意味な改善を示した。

【0275】

シパグルコシダーゼアルファ／ミグルスタットは、アルグルコシダーゼアルファ／プラセボと同様の安全性プロファイルを実証した（図４２）。

【0276】

ＡＴ－ＧＡＡについて
ＡＴ－ＧＡＡは、細胞への取込みが増強されるように最適化された炭水化物構造体、特にビスリン酸化マンノース－６リン酸（ビス－Ｍ６Ｐ）グリカンを有するユニークな組換えヒト酸性アルファグルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）酵素であるシパグルコシダーゼアルファ（ＡＴＢ２００）からなる、シパグルコシダーゼアルファの安定剤であるミグルスタット（ＡＴ２２２１）と併せて投与される治験中の二成分療法である。前臨床試験では、ＡＴ－ＧＡには、成熟リソソーム形態のＧＡＡレベルの増加及び筋肉中のグリコーゲンレベルの減少、オートファジー欠陥の軽減及び筋力の改善が付随した。

【0277】

ポンペ病について
ポンペ病は、酵素酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）の欠損によって引き起こされる遺伝性のリソソーム障害である。ＧＡＡレベルのレベル低下又は欠如が、細胞におけるグリコーゲンの蓄積につながり、それがポンペ病の臨床症状をもたらすと考えられている。この疾患は消耗性であることもあり、時間の経過に伴い増悪する重度の筋脱力を特徴とする。ポンペ病は、心臓機能への重大な影響を伴う速やかに死に至る乳児型から、主に骨格筋に発症するより緩徐な進行の遅発型にまで及ぶ。世界で約５，０００～１０，０００人がポンペ病に罹患していると推定される。

【0278】

番号付きの実施形態
添付の特許請求の範囲にもかかわらず、本開示は以下の番号付きの実施形態を示す。

【0279】

１．必要としている対象のポンペ病を治療する方法であって、対象に、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）分子の集団を薬理学的シャペロンと同時に又は逐次的に投与することを含む方法において；
ｒｈＧＡＡ分子が７つの潜在的なＮ－グリコシル化部位を含み；
ｒｈＧＡＡ分子上のＮ－グリカンの４０％～６０％が複合型Ｎ－グリカンであり；
ｒｈＧＡＡ分子が、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いて決定したとき、第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位に１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり少なくとも０．５ｍｏｌのビス－マンノース－６－リン酸（ビス－Ｍ６Ｐ）を含み；及び
方法が、１）ベースライン、又は（２）アルグルコシダーゼアルファと薬理学的シャペロンのプラセボとを投与することを含む対照治療と比較して、対象の１つ以上の疾患アウトカムを改善する、方法。

【0280】

２．６分間歩行テストによって測定されるとおりの、対象の運動機能を改善する、実施形態１に記載の方法。

【0281】

３．６分間歩行距離（６ＭＷＤ）のベースラインからの変化が少なくとも２０メートルである、実施形態２に記載の方法。

【0282】

４．６ＭＷＤのベースラインからの変化が５２週間の治療後に少なくとも２０メートルである、実施形態３に記載の方法。

【0283】

５．対象の６ＭＷＤが対照治療と比較すると少なくとも１０増加する、実施形態２に記載の方法。

【0284】

６．対照治療と比較すると、対象の６ＭＷＤが５２週間の治療後に少なくとも１３メートル改善する、実施形態５に記載の方法。

【0285】

７．対象が３００メートル未満のベースライン６ＭＷＤを有する、実施形態２～６のいずれか１つに記載の方法。

【0286】

８．対象が３００メートル以上のベースライン６ＭＷＤを有する、実施形態２～６のいずれか１つに記載の方法。

【0287】

９．努力肺活量（ＦＶＣ）テストによって測定されるとおりの、対象の肺機能を改善する、実施形態１に記載の方法。

【0288】

１０．治療後、対象のパーセント対予測値ＦＶＣが、ベースラインと比較すると増加するか、又はベースラインと比較すると３％未満の低下となるかのいずれかである、実施形態９に記載の方法。

【0289】

１１．治療後、対象のパーセント対予測値ＦＶＣが、ベースラインと比較すると１％未満の低下となる、実施形態１０に記載の方法。

【0290】

１２．対象のパーセント対予測値ＦＶＣが、５２週間の治療後にベースラインと比較すると１％未満の低下となる、実施形態１０又は１１に記載の方法。

【0291】

１３．対照治療と比較すると、対象のパーセント対予測値ＦＶＣが治療後に有意に改善するか又は安定化する、実施形態９に記載の方法。

【0292】

１４．対照治療と比較すると、対象のパーセント対予測値ＦＶＣが治療後に少なくとも３％改善する、実施形態１３に記載の方法。

【0293】

１５．対照治療と比較すると、対象のパーセント対予測値ＦＶＣが５２週間の治療後に少なくとも３％改善する、実施形態１２又は１３に記載の方法。

【0294】

１６．対象が５５％未満のベースラインＦＶＣを有する、実施形態９～１５のいずれか１つに記載の方法。

【0295】

１７．対象が５５％以上のベースラインＦＶＣを有する、実施形態９～１５のいずれか１つに記載の方法。

【0296】

１８．歩行・階段・ガワーズ・椅子（ＧＳＧＣ）テストによって測定されるとおりの、対象の運動機能を改善する、実施形態１に記載の方法。

【0297】

１９．ベースラインと比較すると、対象のＧＳＧＣスコアが、治療後に少なくとも０．５点の低下によって指示されるとおり改善する、実施形態１８に記載の方法。

【0298】

２０．ベースラインと比較すると、対象のＧＳＧＣスコアが、５２週間の治療後に少なくとも０．５点の低下によって指示されるとおり改善する、実施形態１９に記載の方法。

【0299】

２１．対照治療と比較すると、対象のＧＳＧＣスコアが、治療後に有意に改善する、実施形態１８に記載の方法。

【0300】

２２．対照治療と比較すると、対象のＧＳＧＣスコアが、治療後に少なくとも１点の低下によって指示されるとおり改善する、実施形態２１に記載の方法。

【0301】

２３．対照治療と比較すると、対象のＧＳＧＣスコアが、５２週間の治療後に少なくとも１点の低下によって指示されるとおり改善する、実施形態２１又は２２に記載の方法。

【0302】

２４．少なくとも１つの筋損傷マーカー及び／又は少なくとも１つのグリコーゲン蓄積マーカーのレベルを減少させる、実施形態１に記載の方法。

【0303】

２５．少なくとも１つの筋損傷マーカーがクレアチンキナーゼ（ＣＫ）を含み、及び／又は少なくとも１つのグリコーゲン蓄積マーカーが尿中ヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）を含む、実施形態２４に記載の方法。

【0304】

２６．ベースラインと比較すると、対象のＣＫレベルが治療後に少なくとも２０％減少し、及び／又は対象の尿中Ｈｅｘ４レベルが治療後に少なくとも３０％減少する、実施形態２５に記載の方法。

【0305】

２７．ベースラインと比較すると、対象のＣＫレベルが５２週間の治療後に少なくとも２０％減少し、及び／又は対象の尿中Ｈｅｘ４レベルが５２週間の治療後に少なくとも３０％減少する、実施形態２６に記載の方法。

【0306】

２８．対照治療と比較すると、対象のＣＫ及び／又は尿中Ｈｅｘ４レベルが治療後に有意に減少する、実施形態２５に記載の方法。

【0307】

２９．対照治療と比較すると、対象のＣＫレベルが治療後に少なくとも３０％減少し、及び／又は対象の尿中Ｈｅｘ４レベルが治療後に少なくとも４０％減少する、実施形態２８に記載の方法。

【0308】

３０．対照治療と比較すると、対象のＣＫレベルが５２週間の治療後に少なくとも３０％減少し、及び／又は対象の尿中Ｈｅｘ４レベルが５２週間の治療後に少なくとも４０％減少する、実施形態２８又は２９に記載の方法。

【0309】

３１．対象が、ＥＲＴ歴のある患者である、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法。

【0310】

３２．対象が、ＥＲＴ未経験の患者である、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法。

【0311】

３３．必要としている対象のポンペ病を治療する方法であって、対象に、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）分子の集団を薬理学的シャペロンと同時に又は逐次的に投与することを含む方法において；
ｒｈＧＡＡ分子が７つの潜在的なＮ－グリコシル化部位を含み；
ｒｈＧＡＡ分子上のＮ－グリカンの４０％～６０％が複合型Ｎ－グリカンであり；
ｒｈＧＡＡ分子が、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いて決定したとき、第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位に１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり少なくとも０．５ｍｏｌのビス－マンノース－６－リン酸（ビス－Ｍ６Ｐ）を含み；
方法が、１）ベースライン、又は（２）アルグルコシダーゼアルファと薬理学的シャペロンのプラセボとを投与することを含む対照治療と比較すると、対象の１つ以上の疾患症状を改善し、及び
対象が、ＥＲＴ歴のある患者である、方法。

【0312】

３４．６分間歩行テストによって測定されるとおりの、対象の運動機能を改善する、実施形態３３に記載の方法。

【0313】

３５．ベースラインと比較すると、対象の６分間歩行距離（６ＭＷＤ）が治療後に少なくとも１５メートル又は少なくとも５％増加する、実施形態３４に記載の方法。

【0314】

３６．ベースラインと比較すると、対象の６分間歩行距離（６ＭＷＤ）が５２週間の治療後に少なくとも１５メートル又は少なくとも４％増加する、実施形態３５に記載の方法。

【0315】

３７．対照治療と比較すると、対象の６ＭＷＤが治療後に有意に改善する、実施形態３３に記載の方法。

【0316】

３８．対照治療と比較すると、対象の６ＭＷＤが治療後に少なくとも１５メートル改善する、実施形態３７に記載の方法。

【0317】

３９．対照治療と比較すると、対象の６ＭＷＤが５２週間の治療後に少なくとも１５メートル改善する、実施形態３７又は３８に記載の方法。

【0318】

４０．対象が、３００メートル未満のベースライン６ＭＷＤを有する、実施形態３４～３９のいずれか１つに記載の方法。

【0319】

４１．対象が、３００メートル以上のベースライン６ＭＷＤを有する、実施形態３４～３９のいずれか１つに記載の方法。

【0320】

４２．努力肺活量（ＦＶＣ）テストによって測定されるとおりの、対象の肺機能を改善する、実施形態３３に記載の方法。

【0321】

４３．治療後、対象のパーセント対予測値ＦＶＣが、ベースラインと比較すると少なくとも０．１％増加する、実施形態４２に記載の方法。

【0322】

４４．対象のパーセント対予測値ＦＶＣが、５２週間の治療後にベースラインと比較すると少なくとも０．１％増加する、実施形態４３に記載の方法。

【0323】

４５．対照治療と比較すると、対象のパーセント対予測値ＦＶＣが治療後に有意に改善する、実施形態４２に記載の方法。

【0324】

４６．対照治療と比較すると、対象のパーセント対予測値ＦＶＣが治療後に少なくとも４％改善する、実施形態４５に記載の方法。

【0325】

４７．対照治療と比較すると、対象のパーセント対予測値ＦＶＣが５２週間の治療後に少なくとも４％改善する、実施形態４５又は４６に記載の方法。

【0326】

４８．対象が５５％未満のベースラインＦＶＣを有する、実施形態４２～４７のいずれか１つに記載の方法。

【0327】

４９．対象が５５％以上のベースラインＦＶＣを有する、実施形態４２～４７のいずれか１つに記載の方法。

【0328】

５０．歩行・階段・ガワーズ・椅子（ＧＳＧＣ）テストによって測定されるとおりの、対象の運動機能を改善する、実施形態３３に記載の方法。

【0329】

５１．ベースラインと比較すると、対象のＧＳＧＣスコアが、治療後に少なくとも０．５点の低下によって指示されるとおり改善する、実施形態５０に記載の方法。

【0330】

５２．ベースラインと比較すると、対象のＧＳＧＣスコアが、５２週間の治療後に少なくとも０．５点の低下によって指示されるとおり改善する、実施形態５１に記載の方法。

【0331】

５３．対照治療と比較すると、対象のＧＳＧＣスコアが、治療後に有意に改善する、実施形態５０に記載の方法。

【0332】

５４．対照治療と比較すると、対象のＧＳＧＣスコアが、治療後に少なくとも１点の低下によって指示されるとおり改善する、実施形態５３に記載の方法。

【0333】

５５．対照治療と比較すると、対象のＧＳＧＣスコアが、５２週間の治療後に少なくとも１点の低下によって指示されるとおり改善する、実施形態５３又は５４に記載の方法。

【0334】

５６．少なくとも１つの筋損傷マーカー及び／又は少なくとも１つのグリコーゲン蓄積マーカーのレベルを減少させる、実施形態３３に記載の方法。

【0335】

５７．少なくとも１つの筋損傷マーカーがクレアチンキナーゼ（ＣＫ）を含み、及び／又は少なくとも１つのグリコーゲン蓄積マーカーが尿中ヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）を含む、実施形態５６に記載の方法。

【0336】

５８．ベースラインと比較すると、対象のＣＫレベルが治療後に少なくとも１５％減少し、及び／又は対象の尿中Ｈｅｘ４レベルが治療後に少なくとも２５％減少する、実施形態５７に記載の方法。

【0337】

５９．ベースラインと比較すると、対象のＣＫレベルが治療後に少なくとも１５％減少し、及び／又は対象の尿中Ｈｅｘ４レベルが５２週間の治療後に少なくとも２５％減少する、実施形態５８に記載の方法。

【0338】

６０．対照治療と比較すると、対象のＣＫ及び／又は尿中Ｈｅｘ４レベルが治療後に有意に減少する、実施形態５７に記載の方法。

【0339】

６１．対照治療と比較すると、対象のＣＫレベルが治療後に少なくとも３０％減少し、及び／又は対象の尿中Ｈｅｘ４レベルが治療後に少なくとも４０％減少する、実施形態６０に記載の方法。

【0340】

６２．対照治療と比較すると、対象のＣＫレベルが治療後に少なくとも３０％減少し、及び／又は対象の尿中Ｈｅｘ４レベルが５２週間の治療後に少なくとも４０％減少する、実施形態６０又は６１に記載の方法。

【0341】

６３．ｒｈＧＡＡ分子集団が、５ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、任意選択で２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１～６２のいずれか１つに記載の方法。

【0342】

６４．ｒｈＧＡＡ分子集団が隔週で投与される、実施形態１～６３のいずれか１つに記載の方法。

【0343】

６５．ｒｈＧＡＡ分子集団が静脈内投与される、実施形態１～６４のいずれか１つに記載の方法。

【0344】

６６．薬理学的シャペロンがミグルスタット又はその薬学的に許容可能な塩であり、更に任意選択でミグルスタット又はその薬学的に許容可能な塩が経口投与される、実施形態１～６５のいずれか１つに記載の方法。

【0345】

６７．ミグルスタット又はその薬学的に許容可能な塩が１９５ｍｇ又は２６０ｍｇの用量で投与される、実施形態６６に記載の方法。

【0346】

６８．ミグルスタット又はその薬学的に許容可能な塩が、ｒｈＧＡＡ分子集団の投与前、任意選択でｒｈＧＡＡ分子集団の投与１時間前に投与される、実施形態６６又は６７に記載の方法。

【0347】

６９．対象が、ミグルスタット又はその薬学的に許容可能な塩の投与前の少なくとも２時間及び投与後の少なくとも２時間にわたって絶食する、実施形態６８に記載の方法。

【0348】

７０．ｒｈＧＡＡ分子が、配列番号４又は配列番号６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態１～６９のいずれか１つに記載の方法。

【0349】

７１．ｒｈＧＡＡ分子が、配列番号４又は配列番号６のアミノ酸配列を含む、実施形態１～７０のいずれか１つに記載の方法。

【0350】

７２．ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて決定したとき、ｒｈＧＡＡ分子の少なくとも３０％が、１個のマンノース－６－リン酸残基（モノ－Ｍ６Ｐ）又はビス－Ｍ６Ｐを担持するＮ－グリカン単位を１つ以上含む、実施形態１～７１のいずれか１つに記載の方法。

【0351】

７３．ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて決定したとき、ｒｈＧＡＡ分子が平均して１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり０．５ｍｏｌ～７．０ｍｏｌのモノ－Ｍ６Ｐ又はビス－Ｍ６Ｐを含む、実施形態１～７２のいずれか１つに記載の方法。

【0352】

７４．ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて決定したとき、ｒｈＧＡＡ分子が平均して１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり２．０～８．０ｍｏｌのシアル酸を含む、実施形態１～７３のいずれか１つに記載の方法。

【0353】

７５．ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて決定したとき、ｒｈＧＡＡ分子が平均して１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり少なくとも２．５ｍｏｌのＭ６Ｐ及び１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり少なくとも４ｍｏｌのシアル酸を含む、実施形態１～７３のいずれか１つに記載の方法。

【0354】

７６．１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり、ｒｈＧＡＡ分子が平均して
（ａ）第２の潜在的なＮ－グリコシル化部位に０．４～０．６ｍｏｌのモノ－Ｍ６Ｐ；
（ｂ）第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位に０．４～０．６ｍｏｌのビス－Ｍ６Ｐ；又は
（ｃ）第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位に０．３～０．４ｍｏｌのモノ－Ｍ６Ｐ
を含み；
（ａ）～（ｃ）がＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて決定される、実施形態１～７５のいずれか１つに記載の方法。

【0355】

７７．１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり、ｒｈＧＡＡ分子が４ｍｏｌ～７．３ｍｏｌのシアル酸を更に含み；及び
１ｍｏｌのｒｈＧＡＡ当たり、ｒｈＧＡＡ分子が平均して
（ａ）第３の潜在的なＮ－グリコシル化部位に０．９～１．２ｍｏｌのシアル酸；
（ｂ）第５の潜在的なＮ－グリコシル化部位に０．８～０．９ｍｏｌのシアル酸；又は
（ｃ）第６の潜在的なＮ－グリコシル化部位に１．５～４．２ｍｏｌのシアル酸
を含み；
（ａ）～（ｃ）がＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて決定される、実施形態７６に記載の方法。

【0356】

７８．ｒｈＧＡＡ分子集団が医薬組成物に製剤化される、実施形態１～７７のいずれか１つに記載の方法。

【0357】

７９．医薬組成物が、クエン酸塩、リン酸塩、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝液と、マンニトール、ポリソルベート８０、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤とを更に含み；医薬組成物が５．０～７．０のｐＨを有する、実施形態７８に記載の方法。

【0358】

８０．医薬組成物が５．０～６．０のｐＨを有する、実施形態７９に記載の方法。

【0359】

８１．医薬組成物が、水、酸性化剤、アルカリ化剤、又はこれらの組み合わせを更に含む、実施形態７８又は７９に記載の方法。

【0360】

８２．医薬組成物中、ｒｈＧＡＡ分子集団が５～５０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、少なくとも１つの緩衝液が、１０～１００ｍＭの濃度で存在するクエン酸ナトリウム緩衝液であり、少なくとも１つの賦形剤が、１０～５０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するマンニトール及び０．１～１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するポリソルベート８０であり、及び医薬組成物が水を更に含み、及び任意選択で酸性化剤及び／又はアルカリ化剤を含み；医薬組成物が６．０のｐＨを有する、実施形態８１に記載の方法。

【0361】

８３．医薬組成物中、ｒｈＧＡＡ分子集団が１５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、クエン酸ナトリウム緩衝液が２５ｍＭの濃度で存在し、マンニトールが２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、及びポリソルベート８０が０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、実施形態８２に記載の方法。

【0362】

８４．ｒｈＧＡＡがチャイニーズハムスター卵巣細胞から産生される、実施形態１～８３のいずれか１つに記載の方法。

【図1A】

【図1B】

【図2A-2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図6H】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図19E】

【図19F】

【図19G】

【図19H】

【図20A】

【図20B】

【図21】

【図22】

【図23A】

【図23B】

【図24】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【配列表】

2024506346000001.app

【国際調査報告】