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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-13
(54)【発明の名称】部位特異的ゲノム修飾技術
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20240205BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240205BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
C12N15/11 Z ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023548848
(86)(22)【出願日】2022-02-14
(85)【翻訳文提出日】2023-10-13
(86)【国際出願番号】 US2022016313
(87)【国際公開番号】W WO2022174144
(87)【国際公開日】2022-08-18
(31)【優先権主張番号】63/149,419
(32)【優先日】2021-02-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514264569
【氏名又は名称】ノース・カロライナ・ステイト・ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ベイゼル，チェイス・ローレンス
(72)【発明者】
【氏名】コリンズ，スコット・パトリック
(57)【要約】
本開示は、鋳型媒介性ゲノム編集及び修飾に関する組成物、方法及びシステムを提供する。特に、本開示は、複製遮断傷害を導入するためのヌクレオチドの部位特異的化学修飾が関与する新規ゲノム修飾技術を提供する。本明細書に記載されている組成物、方法及びシステムは、現在のゲノム編集アプローチに伴う意図されない編集及び細胞毒性を最小化しつつ、ＤＮＡ標的の効率的な部位特異的ゲノム修飾を容易にする。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的化されたゲノム修飾のための組成物であって、ＤＮＡ認識ドメイン及びＤＮＡ修飾ドメインを含むギャップ編集因子複合体を含み、ＤＮＡ認識ドメインが、ゲノムにおけるＤＮＡ標的配列に結合し、ＤＮＡ修飾ドメインが、ゲノムにおける少なくとも１個のヌクレオチドに複製遮断部分の形成を誘導する、組成物。
【請求項2】
ドナー核酸鋳型をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
ドナー核酸鋳型が、ＤＮＡ標的配列に対応する内因性相同配列由来のポリヌクレオチドを含む、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
ドナー核酸鋳型が、外因性一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子又はＲＮＡ分子を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項5】
ドナー核酸鋳型の存在が、相同配列指向性ギャップ修復及び／又は組換えを容易にし、ドナー核酸鋳型又はその断片が、ＤＮＡ標的配列のゲノム中に組み換えられる、請求項２～４のいずれかに記載の組成物。
【請求項6】
少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子を含む、請求項１～５のいずれかに記載の組成物。
【請求項7】
ＤＮＡ認識ドメインが、デオキシリボヌクレアーゼ活性を欠如する少なくとも１個のＣａｓタンパク質又はその断片を含む、請求項１～６のいずれかに記載の組成物。
【請求項8】
ＤＮＡ認識ドメインが、デオキシリボヌクレアーゼ活性を欠如するＣａｓタンパク質の複合体を含む、請求項１～６のいずれかに記載の組成物。
【請求項9】
ＤＮＡ認識ドメインが、ニッカーゼ活性を有するＣａｓタンパク質又はその断片を含む、請求項１～６のいずれかに記載の組成物。
【請求項10】
Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質複合体が、Ｉ型カスケード、ＩＩ型Ｃａｓ９、ＩＶ型エフェクターモジュール、Ｖ型Ｃａｓ１２、Ｃａｓ９関連ＩｓｃＢ、Ｃａｓ９関連ＴｎｐＢ及びこれらの組合せを含む、請求項１～９のいずれかに記載の組成物。
【請求項11】
ＤＮＡ認識ドメイン及びＤＮＡ修飾ドメインが、機能的にカップリングされている、請求項１～１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項12】
機能的にカップリングされたものが、ポリペプチド融合、ペプチドタグ、ペプチドリンカー、ＲＮＡタグ及びこれらのいずれかの組合せを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
ＤＮＡ修飾ドメインが、（ｉ）ＤＮＡ標的配列に相補的なＤＮＡ鎖における少なくとも１個のヌクレオチド；
（ｉｉ）ＤＮＡ標的配列を含有するＤＮＡ鎖における少なくとも１個のヌクレオチド；又は
（ｉｉｉ）ＤＮＡ標的配列に相補的なＤＮＡ鎖における少なくとも１個のヌクレオチド及びＤＮＡ標的配列を含有するＤＮＡ鎖における少なくとも１個のヌクレオチドの両方
に複製遮断部分を付加することにより、ＤＮＡ複製を遮断する、請求項１～１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項14】
ＤＮＡ認識ドメインが、ＤＮＡ標的鎖における一本鎖切断を誘導し、ＤＮＡ修飾ドメインが、複製遮断部分を、ＤＮＡ標的配列に相補的なＤＮＡ鎖における少なくとも１個のヌクレオチドに付加する、請求項１～１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項15】
ＤＮＡ修飾ドメインが、低減されたＤＮＡ結合性、一本鎖ＤＮＡに対する増加した特異性及び／又は減少した酵素活性を有するように操作されている、請求項１～１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項16】
ＤＮＡ修飾ドメインが、チミン又はグアニンヌクレオチドへのＡＤＰリボースの付加を触媒する、請求項１～１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項17】
ＤＮＡ修飾ドメインが、ＤａｒＴ酵素又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアントを含む、請求項１～１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項18】
ＤＮＡ修飾ドメインが、配列番号１８～２１のいずれかと少なくとも７０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む、請求項１６又は請求項１７に記載の組成物。
【請求項19】
ＤａｒＴ酵素が、次のアミノ酸置換：Ｇ４９Ｄ、Ｋ５６Ａ、Ｍ８６Ｌ、Ｒ９２Ａ及び／又はＲ１９３Ａのうち１つ以上を含む、請求項１７又は請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
ＤＮＡ修飾ドメインが、Ｓｃａｂｉｎ酵素又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアントを含む、請求項１～１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項21】
ＤＮＡ修飾ドメインが、配列番号２２～２４のいずれかと少なくとも７０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む、請求項１６又は２０に記載の組成物。
【請求項22】
Ｓｃａｂｉｎ酵素が、Ｋ１３０Ａであるアミノ酸置換を含む、請求項２０又は請求項２１に記載の組成物。
【請求項23】
ＤＮＡ修飾ドメインが、アデニンヌクレオチドのメチルカルバモイル化を触媒する、請求項１～１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項24】
ＤＮＡ修飾ドメインが、Ｍｏｍ酵素又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアントを含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項25】
ＤＮＡ修飾ドメインが、配列番号２５～２７と少なくとも７０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む、請求項２３又は請求項２４に記載の組成物。
【請求項26】
Ｍｏｍ酵素が、Ｄ１４９Ａであるアミノ酸置換を含む、請求項２４又は請求項２５に記載の組成物。
【請求項27】
ＤＮＡ修飾ドメインが、グルコース、スレオニルカルバモイルアデノシン、アセテート、グリセリル、Ｌ－アスコルビン酸、ウリジン、アデノシン一リン酸、脂質、アミノ酸、アグマチン、Ｌ－スレオニルカルバモイルアデニル酸、Ｌ－スレオニルカルバモイル、メチルチオレート、硫黄、メチル基、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン又はＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニンのサブグループ、及びジメチルアリル二リン酸又はそのサブグループからなる群から選択される複製遮断部分の付加を触媒する、請求項１～１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項28】
ＤＮＡ修飾酵素ドメインが、ピエリシン、Ｓｃａｂｉｎ、細胞周期及びアポトーシス調節因子１（ＣＡＲＰ－１）、ＳＣＯ５４６１タンパク質（ＳｃＡＲＰ）、アデニン修飾酵素、アセチルトランスフェラーゼ、アミノ酸トランスフェラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ウリジルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼ、メチルチオトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ１０、ｔＲＮＡ（Ｍｅｔ）シチジンアセチルトランスフェラーゼ（ＴｍｃＡ）、ｔＲＮＡシチジンアセチルトランスフェラーゼ、ＧＣＮ５関連Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、ライシジンシンターゼ、ｍ７Ｇメチルトランスフェラーゼ、Ｎ６カルバモイルメチルトランスフェラーゼ（Ｍｏｍ）、Ｎ６－アデノシンスレオニルカルバモイルトランスフェラーゼ、スレオニルカルバモイル（ｃａｒｂｏｍｙｌ）トランスフェラーゼ又はスレオニルカルバモイル（ｃａｒｂｏｍｙｌ）トランスフェラーゼ複合体、ＴｓａＢ－ＴｓａＥ－ＴｓａＤ（ＴｓａＢＤＥ）複合体、ｔＲＮＡ Ｎ６－アデノシンスレオニルカルバモイルトランスフェラーゼ（Ｑｒｉ７、Ｔｃｓ４）、メチルトランスフェラーゼ、ＡＴｒｍ５ａ、ｔＲＮＡ：ｍ１Ｇ／ｉｍＧ２メチルトランスフェラーゼ、ｔＲＮＡ（アデノシン（３７）－Ｎ６）－ジメチルアリルトランスフェラーゼ、ｔＲＮＡジメチルアリルトランスフェラーゼ（ＭｉａＡ）、並びにイソペンテニルトランスフェラーゼからなる群から選択される酵素又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアントを含む、請求項１～１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項29】
少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ又はこれらのいずれかの組合せを含む、請求項６～２８のいずれかに記載の組成物。
【請求項30】
少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ハンドル配列及び標的化配列を含む、請求項６～２９のいずれかに記載の組成物。
【請求項31】
少なくとも１つのガイドＲＮＡにおける標的化配列が、ＤＮＡ標的配列に相補的である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項32】
少なくとも１つのギャップ編集因子アクセサリー因子をさらに含む、請求項１～３１のいずれかに記載の組成物。
【請求項33】
少なくとも１つのギャップ編集因子アクセサリー因子が、ゲノム修飾過程における少なくとも１つのステップを増強するタンパク質を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項34】
少なくとも１つのギャップ編集因子アクセサリー因子が、ＤＮＡ修飾ドメイン、ＤＮＡ認識ドメイン及び／又は少なくとも１つのガイドＲＮＡとの相互作用を介してギャップ編集因子複合体にリクルートされる、請求項３２に記載の組成物。
【請求項35】
ギャップ編集因子複合体への少なくとも１つのギャップ編集因子アクセサリー因子のリクルートメントが、ペプチドタグ、ペプチドリンカー、ＲＮＡタグ及びこれらのいずれかの組合せを含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項36】
少なくとも１つのギャップ編集因子アクセサリー因子が、Ｒａｐ、ＤａｒＧ、Ｏｒｆ、ＥｘｏＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ＰｒｉｍＰｏｌ、ＲｅｃＪ、ＲｅｃＱ１、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５２、ＣｔＩＰ、Ｒａｄ１８及びこれらのいずれかの組合せを含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項37】
標的化されたゲノム修飾のためのキットであって、ＤＮＡ認識ドメイン及びＤＮＡ修飾ドメインを含むギャップ編集因子複合体を含み、ＤＮＡ認識ドメインが、ゲノムにおけるＤＮＡ標的配列に結合し、ＤＮＡ修飾ドメインが、ゲノムにおける少なくとも１個のヌクレオチドに複製遮断部分の形成を誘導する、キット。
【請求項38】
ドナー核酸鋳型をさらに含む、請求項３７に記載のキット。
【請求項39】
ドナー核酸鋳型の存在が、相同配列指向性ギャップ修復及び／又は組換えを容易にする、請求項３８に記載のキット。
【請求項40】
ガイドＲＮＡ分子をさらに含む、請求項３７に記載のキット。
【請求項41】
ＤＮＡ認識ドメインが、デオキシリボヌクレアーゼ活性を欠如する少なくとも１個のＣａｓタンパク質又はその断片を含む、請求項３７～４０のいずれかに記載のキット。
【請求項42】
ＤＮＡ認識ドメインが、ニッカーゼ活性を有する少なくとも１個のＣａｓタンパク質又はその断片を含む、請求項３７～４１のいずれかに記載のキット。
【請求項43】
Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質複合体が、Ｉ型カスケード、ＩＩ型Ｃａｓ９、ＩＶ型エフェクターモジュール、Ｖ型Ｃａｓ１２、Ｃａｓ９関連ＩｓｃＢ、Ｃａｓ９関連ＴｎｐＢ及びこれらの組合せを含む、請求項３７～４２のいずれかに記載のキット。
【請求項44】
ＤＮＡ認識ドメイン及びＤＮＡ修飾ドメインが、機能的にカップリングされている、請求項３７～４３のいずれかに記載のキット。
【請求項45】
ＤＮＡ認識ドメインが、ＤＮＡ標的鎖における一本鎖切断を誘導し、ＤＮＡ修飾ドメインが、複製遮断部分を、ＤＮＡ標的配列に相補的なＤＮＡ鎖における少なくとも１個のヌクレオチドに付加する、請求項３７～４４のいずれかに記載のキット。
【請求項46】
ＤＮＡ修飾ドメインが、チミン又はグアニンヌクレオチドへのＡＤＰリボースの付加を触媒する、請求項３７～４５のいずれかに記載のキット。
【請求項47】
ＤＮＡ修飾ドメインが、ＤａｒＴ酵素、Ｓｃａｂｉｎ酵素又はそれらの機能的断片、誘導体若しくはバリアントを含む、請求項４６に記載のキット。
【請求項48】
ＤａｒＴ酵素が、低減されたＤＮＡ結合性、一本鎖ＤＮＡに対する増加した特異性及び／又は減少した酵素活性を有するように操作されている、請求項４７に記載のキット。
【請求項49】
ＤＮＡ修飾ドメインが、グルコース、スレオニルカルバモイルアデノシン、アセテート、グリセリル、Ｌ－アスコルビン酸、ウリジン、アデノシン一リン酸、脂質、アミノ酸、アグマチン、Ｌ－スレオニルカルバモイルアデニル酸、Ｌ－スレオニルカルバモイル、メチルチオレート、硫黄、メチル基、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン又はＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニンのサブグループ、及びジメチルアリル二リン酸又はそのサブグループからなる群から選択される複製遮断部分の付加を触媒する、請求項３７～４８のいずれかに記載のキット。
【請求項50】
ＤＮＡ修飾酵素ドメインが、ピエリシン、Ｓｃａｂｉｎ、細胞周期及びアポトーシス調節因子１（ＣＡＲＰ－１）、ＳＣＯ５４６１タンパク質（ＳｃＡＲＰ）、アデニン修飾酵素、アセチルトランスフェラーゼ、アミノ酸トランスフェラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ウリジルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼ、メチルチオトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ１０、ｔＲＮＡ（Ｍｅｔ）シチジンアセチルトランスフェラーゼ（ＴｍｃＡ）、ｔＲＮＡシチジンアセチルトランスフェラーゼ、ＧＣＮ５関連Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、ライシジンシンターゼ、ｍ７Ｇメチルトランスフェラーゼ、Ｎ６カルバモイルメチルトランスフェラーゼ（Ｍｏｍ）、Ｎ６－アデノシンスレオニルカルバモイルトランスフェラーゼ、スレオニルカルバモイル（ｃａｒｂｏｍｙｌ）トランスフェラーゼ又はスレオニルカルバモイル（ｃａｒｂｏｍｙｌ）トランスフェラーゼ複合体、ＴｓａＢ－ＴｓａＥ－ＴｓａＤ（ＴｓａＢＤＥ）複合体、ｔＲＮＡ Ｎ６－アデノシンスレオニルカルバモイルトランスフェラーゼ（Ｑｒｉ７、Ｔｃｓ４）、メチルトランスフェラーゼ、ＡＴｒｍ５ａ、ｔＲＮＡ：ｍ１Ｇ／ｉｍＧ２メチルトランスフェラーゼ、ｔＲＮＡ（アデノシン（３７）－Ｎ６）－ジメチルアリルトランスフェラーゼ、ｔＲＮＡジメチルアリルトランスフェラーゼ（ＭｉａＡ）、並びにイソペンテニルトランスフェラーゼからなる群から選択される酵素又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアントを含む、請求項３７～４９のいずれかに記載のキット。
【請求項51】
少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ又はこれらのいずれかの組合せを含む、請求項４０～５０のいずれかに記載のキット。
【請求項52】
少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ハンドル配列及び標的化配列を含む、請求項４０～５１のいずれかに記載のキット。
【請求項53】
少なくとも１つのガイドＲＮＡにおける標的化配列が、ＤＮＡ標的配列に相補的である、請求項５２に記載のキット。
【請求項54】
少なくとも１つのギャップ編集因子アクセサリー因子をさらに含む、請求項３７～５３のいずれかに記載のキット。
【請求項55】
標的化されたゲノム修飾のための方法であって、請求項１～３６に記載の組成物のいずれかを細胞に導入するステップ；及び
所望のゲノム変更の存在について細胞を評価するステップ
を含む方法。
【請求項56】
ギャップ編集因子複合体及び／又は少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子が、ポリペプチド、ｍＲＮＡ及び／又はＤＮＡ発現構築物として細胞に導入される、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
ギャップ編集因子複合体及び／又はガイドＲＮＡが、遺伝子駆動システムの一部として細胞に導入される、請求項５５又は５６に記載の方法。
【請求項58】
前記細胞が、原核細胞又は真核細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項59】
前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項60】
前記細胞が、植物細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項61】
程度の低減されたインデル形成、染色体再編成及び／又はＤＮＡ重複をもたらす、請求項４７～６０のいずれかに記載の方法。
【請求項62】
細胞生存能が増強される、及び／又は細胞毒性が低減される、請求項４７～６１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年２月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／１４９，４１９号に基づく優先権及びその利益を主張する。
【0002】
配列表
１４４，９０８バイトのファイルサイズを有する、２０２２年２月１４日に作成された「３９２１２－６０１＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５」という表題の、本明細書と共に出願されたコンピュータ可読配列表のテキストは、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
１４４，９０８バイトのファイルサイズを有する、２０２２年２月１４日に作成された「３９２１２－６０１＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５」という表題の、本明細書と共に出願されたコンピュータ可読配列表のテキストは、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
政府による資金提供
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）が与えた助成金番号ＧＭ１１９５６１による政府支援の下に為された。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）が与えた助成金番号ＧＭ１１９５６１による政府支援の下に為された。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【0004】
分野
本開示は、鋳型媒介性ゲノム修飾に関する組成物、方法及びシステムを提供する。特に、本開示は、複製遮断傷害を導入するためのヌクレオチドの部位特異的化学修飾が関与する新規ゲノム修飾技術を提供する。本明細書に記載されている組成物、方法及びシステムは、現在のゲノム編集アプローチに伴う意図されない編集及び細胞毒性を最小化しつつ、ＤＮＡ標的の効率的な部位特異的ゲノム修飾を容易にする。
本開示は、鋳型媒介性ゲノム修飾に関する組成物、方法及びシステムを提供する。特に、本開示は、複製遮断傷害を導入するためのヌクレオチドの部位特異的化学修飾が関与する新規ゲノム修飾技術を提供する。本明細書に記載されている組成物、方法及びシステムは、現在のゲノム編集アプローチに伴う意図されない編集及び細胞毒性を最小化しつつ、ＤＮＡ標的の効率的な部位特異的ゲノム修飾を容易にする。
【背景技術】
【0005】
ＣＲＩＳＰＲに基づくゲノム編集ツールは、その容易にプログラム可能な標的化及びロバストな活性に頼る広範な用途を見出した。このようなＣＲＩＳＰＲに基づくツールの初期の使用は、ＤＮＡを切断するＣａｓヌクレアーゼの能力に焦点を合わせた。切断されたＤＮＡを修復する過程において、ゲノム編集は、供給されたＤＮＡ修復鋳型との相同組換えを介して導入される。しかし、ＤＮＡ切断は、最も毒性が高い細胞事象の１つである；ＤＮＡ切断は、突然変異、ＤＮＡ再編成又は細胞生存能喪失をもたらす細胞の警報システムを作動させる。その後のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集ツールは、個々の塩基の標的修飾又はガイドＲＮＡ内にコードされた短い鋳型の組込みによる代替アプローチを探究した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
それでもなお、これらの方法は、生成され得る編集の範囲が制限され、望まれない編集を生じ得る。したがって、現在のシステムの限界を克服する、効率的なゲノム編集及び修飾プラットフォームの必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
（発明の要旨）
本開示の実施形態は、標的化されたゲノム修飾のための組成物を含む。このような実施形態に従って、組成物は、ＤＮＡ認識ドメイン及びＤＮＡ修飾ドメインを含むギャップ編集因子複合体を含み、ＤＮＡ認識ドメインは、ゲノムにおけるＤＮＡ標的配列に結合し、ＤＮＡ修飾ドメインは、ゲノムにおける少なくとも１個のヌクレオチドに複製遮断部分の形成を誘導する。
本開示の実施形態は、標的化されたゲノム修飾のための組成物を含む。このような実施形態に従って、組成物は、ＤＮＡ認識ドメイン及びＤＮＡ修飾ドメインを含むギャップ編集因子複合体を含み、ＤＮＡ認識ドメインは、ゲノムにおけるＤＮＡ標的配列に結合し、ＤＮＡ修飾ドメインは、ゲノムにおける少なくとも１個のヌクレオチドに複製遮断部分の形成を誘導する。
【0008】
一部の実施形態では、組成物は、ドナー核酸鋳型をさらに含む。一部の実施形態では、ドナー核酸鋳型は、ＤＮＡ標的配列に対応する内因性相同配列由来のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ドナー核酸鋳型は、外因性一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子又は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を含む。一部の実施形態では、ドナー核酸鋳型は、ＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、ドナー核酸鋳型の存在は、相同配列指向性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ギャップ修復及び／又は組換えを容易にし、ドナー核酸鋳型又はその断片は、ＤＮＡ標的配列のゲノム中に組み換えられる。
【0009】
一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメインは、デオキシリボヌクレアーゼ活性を欠如する少なくとも１個のＣａｓタンパク質又はその断片を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメインは、デオキシリボヌクレアーゼ活性を欠如するＣａｓタンパク質の複合体を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメインは、ニッカーゼ活性を有するＣａｓタンパク質又はその断片を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質複合体は、Ｉ型カスケード、ＩＩ型Ｃａｓ９、ＩＶ型エフェクターモジュール、Ｖ型Ｃａｓ１２、Ｃａｓ９関連ＩｓｃＢ、Ｃａｓ９関連ＴｎｐＢ及びこれらの組合せを含む。
【0010】
一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメイン及びＤＮＡ修飾ドメインは、機能的にカップリングされている。一部の実施形態では、機能的にカップリングされたものは、ポリペプチド融合、ペプチドタグ、ペプチドリンカー、ＲＮＡタグ及びこれらのいずれかの組合せを含む。
【0011】
一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、（ｉ）ＤＮＡ標的配列に相補的なＤＮＡ鎖における少なくとも１個のヌクレオチド；（ｉｉ）ＤＮＡ標的配列を含有するＤＮＡ鎖における少なくとも１個のヌクレオチド；又は（ｉｉｉ）ＤＮＡ標的配列に相補的なＤＮＡ鎖における少なくとも１個のヌクレオチド及びＤＮＡ標的配列を含有するＤＮＡ鎖における少なくとも１個のヌクレオチドの両方に複製遮断部分を付加することにより、ＤＮＡ複製を遮断する。
【0012】
一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメインは、ＤＮＡ標的鎖における一本鎖切断を誘導し、ＤＮＡ修飾ドメインは、複製遮断部分を、ＤＮＡ標的配列に相補的なＤＮＡ鎖における少なくとも１個のヌクレオチドに付加する。
【0013】
一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、低減されたＤＮＡ結合性、一本鎖ＤＮＡに対する増加した特異性及び／又は減少した酵素活性を有するように操作されている。
【0014】
一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、チミン又はグアニンヌクレオチドへのＡＤＰリボースの付加を触媒する。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、ＤａｒＴ酵素又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアントを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１８～２１のいずれかと少なくとも７０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤａｒＴ酵素は、次のアミノ酸置換：Ｇ４９Ｄ、Ｋ５６Ａ、Ｍ８６Ｌ、Ｒ９２Ａ及び／又はＲ１９３Ａのうち１つ以上を含む。
【0015】
一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、Ｓｃａｂｉｎ酵素又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアントを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２２～２４のいずれかと少なくとも７０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｓｃａｂｉｎ酵素は、Ｋ１３０Ａであるアミノ酸置換を含む。
【0016】
一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、アデニンヌクレオチドのメチルカルバモイル化（ｍｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を触媒する。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、Ｍｏｍ酵素又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアントを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２５～２７と少なくとも７０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｍｏｍ酵素は、Ｄ１４９Ａであるアミノ酸置換を含む。
【0017】
一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、グルコース、スレオニルカルバモイルアデノシン、アセテート、グリセリル、Ｌ－アスコルビン酸、ウリジン、アデノシン一リン酸、脂質、アミノ酸、アグマチン、Ｌ－スレオニルカルバモイルアデニル酸、Ｌ－スレオニルカルバモイル、メチルチオレート、硫黄、メチル基、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｅ）又はＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニンのサブグループ、及びジメチルアリル二リン酸又はそのサブグループからなる群から選択される複製遮断部分の付加を触媒する。
【0018】
一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾酵素ドメインは、ピエリシン（Ｐｉｅｒｉｓｉｎ）、Ｓｃａｂｉｎ、細胞周期及びアポトーシス調節因子１（ＣＡＲＰ－１）、ＳＣＯ５４６１タンパク質（ＳｃＡＲＰ）、アデニン修飾酵素、アセチルトランスフェラーゼ、アミノ酸トランスフェラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ウリジルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼ（ｒｉｂｓｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、メチルチオトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ１０、ｔＲＮＡ（Ｍｅｔ）シチジンアセチルトランスフェラーゼ（ＴｍｃＡ）、ｔＲＮＡシチジンアセチルトランスフェラーゼ、ＧＣＮ５関連Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、ライシジンシンターゼ、ｍ７Ｇメチルトランスフェラーゼ、Ｎ６カルバモイルメチルトランスフェラーゼ（Ｍｏｍ）、Ｎ６－アデノシンスレオニルカルバモイルトランスフェラーゼ、スレオニルカルバモイル（ｃａｒｂｏｍｙｌ）トランスフェラーゼ又はスレオニルカルバモイル（ｃａｒｂｏｍｙｌ）トランスフェラーゼ複合体、ＴｓａＢ－ＴｓａＥ－ＴｓａＤ（ＴｓａＢＤＥ）複合体、ｔＲＮＡ Ｎ６－アデノシンスレオニルカルバモイルトランスフェラーゼ（Ｑｒｉ７、Ｔｃｓ４）、メチルトランスフェラーゼ、ＡＴｒｍ５ａ、ｔＲＮＡ：ｍ１Ｇ／ｉｍＧ２メチルトランスフェラーゼ、ｔＲＮＡ（アデノシン（３７）－Ｎ６）－ジメチルアリルトランスフェラーゼ、ｔＲＮＡジメチルアリルトランスフェラーゼ（ＭｉａＡ）、並びにイソペンテニルトランスフェラーゼからなる群から選択される酵素又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアントを含む。
【0019】
一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ又はこれらのいずれかの組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、ハンドル配列及び標的化配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的配列に相補的である。
【0020】
一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つのギャップ編集因子アクセサリー因子をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのギャップ編集因子アクセサリー因子は、ゲノム修飾過程における少なくとも１つのステップを増強するタンパク質を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのギャップ編集因子アクセサリー因子は、ＤＮＡ修飾ドメイン、ＤＮＡ認識ドメイン及び／又は少なくとも１つのガイドＲＮＡとの相互作用を介してギャップ編集因子複合体にリクルートされる。一部の実施形態では、ギャップ編集因子複合体への少なくとも１つのギャップ編集因子アクセサリー因子のリクルートメントは、ペプチドタグ、ペプチドリンカー、ＲＮＡタグ及びこれらのいずれかの組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのギャップ編集因子アクセサリー因子は、Ｒａｐ、ＤａｒＧ、Ｏｒｆ、ＥｘｏＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ＰｒｉｍＰｏｌ、ＲｅｃＪ、ＲｅｃＱ１、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５２、ＣｔＩＰ、Ｒａｄ１８及びこれらのいずれかの組合せを含む。
【0021】
本開示の実施形態はまた、標的化されたゲノム修飾のためのキットを含む。このような実施形態に従って、キットは、ＤＮＡ認識ドメイン及びＤＮＡ修飾ドメインを含むギャップ編集因子複合体を含み、ＤＮＡ認識ドメインは、ゲノムにおけるＤＮＡ標的配列に結合し、ＤＮＡ修飾ドメインは、ゲノムにおける少なくとも１個のヌクレオチドに複製遮断部分の形成を誘導する。
【0022】
一部の実施形態では、キットは、ドナー核酸鋳型をさらに含む。一部の実施形態では、ドナー核酸鋳型の存在は、相同配列指向性ギャップ修復及び／又は組換えを容易にする。
【0023】
一部の実施形態では、キットは、ガイドＲＮＡ分子をさらに含む。
【0024】
キットの一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメインは、デオキシリボヌクレアーゼ活性を欠如する少なくとも１個のＣａｓタンパク質又はその断片を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメインは、ニッカーゼ活性を有する少なくとも１個のＣａｓタンパク質又はその断片を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質複合体は、Ｉ型カスケード、ＩＩ型Ｃａｓ９、ＩＶ型エフェクターモジュール、Ｖ型Ｃａｓ１２、Ｃａｓ９関連ＩｓｃＢ、Ｃａｓ９関連ＴｎｐＢ及びこれらの組合せを含む。
【0025】
キットの一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメイン及びＤＮＡ修飾ドメインは、機能的にカップリングされている。一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメインは、ＤＮＡ標的鎖における一本鎖切断を誘導し、ＤＮＡ修飾ドメインは、複製遮断部分を、ＤＮＡ標的配列に相補的なＤＮＡ鎖における少なくとも１個のヌクレオチドに付加する。
【0026】
キットの一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、チミン又はグアニンヌクレオチドへのＡＤＰリボースの付加を触媒する。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、ＤａｒＴ酵素又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアントを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、Ｓｃａｂｉｎ酵素又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアントを含む。一部の実施形態では、ＤａｒＴ酵素は、低減されたＤＮＡ結合性、一本鎖ＤＮＡに対する増加した特異性及び／又は減少した酵素活性を有するように操作されている。
【0027】
キットの一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、アデニンヌクレオチドのメチルカルバモイル化を触媒する。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、Ｍｏｍ酵素又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアントを含む。一部の実施形態では、Ｍｏｍ酵素は、低減されたＤＮＡ結合性、一本鎖ＤＮＡに対する増加した特異性及び／又は減少した酵素活性を有するように操作されている。
【0028】
キットの一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、グルコース、スレオニルカルバモイルアデノシン、アセテート、グリセリル、Ｌ－アスコルビン酸、ウリジン、アデノシン一リン酸、脂質、アミノ酸、アグマチン、Ｌ－スレオニルカルバモイルアデニル酸、Ｌ－スレオニルカルバモイル、メチルチオレート、硫黄、メチル基、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン又はＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニンのサブグループ、及びジメチルアリル二リン酸又はそのサブグループからなる群から選択される複製遮断部分の付加を触媒する。
【0029】
キットの一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾酵素ドメインは、ピエリシン、Ｓｃａｂｉｎ、細胞周期及びアポトーシス調節因子１（ＣＡＲＰ－１）、ＳＣＯ５４６１タンパク質（ＳｃＡＲＰ）、アデニン修飾酵素、アセチルトランスフェラーゼ、アミノ酸トランスフェラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ウリジルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼ、メチルチオトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ１０、ｔＲＮＡ（Ｍｅｔ）シチジンアセチルトランスフェラーゼ（ＴｍｃＡ）、ｔＲＮＡシチジンアセチルトランスフェラーゼ、ＧＣＮ５関連Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、ライシジンシンターゼ、ｍ７Ｇメチルトランスフェラーゼ、Ｎ６カルバモイルメチルトランスフェラーゼ（Ｍｏｍ）、Ｎ６－アデノシンスレオニルカルバモイルトランスフェラーゼ、スレオニルカルバモイル（ｃａｒｂｏｍｙｌ）トランスフェラーゼ又はスレオニルカルバモイル（ｃａｒｂｏｍｙｌ）トランスフェラーゼ複合体、ＴｓａＢ－ＴｓａＥ－ＴｓａＤ（ＴｓａＢＤＥ）複合体、ｔＲＮＡ Ｎ６－アデノシンスレオニルカルバモイルトランスフェラーゼ（Ｑｒｉ７、Ｔｃｓ４）、メチルトランスフェラーゼ、ＡＴｒｍ５ａ、ｔＲＮＡ：ｍ１Ｇ／ｉｍＧ２メチルトランスフェラーゼ、ｔＲＮＡ（アデノシン（３７）－Ｎ６）－ジメチルアリルトランスフェラーゼ、ｔＲＮＡジメチルアリルトランスフェラーゼ（ＭｉａＡ）、並びにイソペンテニルトランスフェラーゼからなる群から選択される酵素又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアントを含む。
【0030】
キットの一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ又はこれらのいずれかの組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、ハンドル配列及び標的化配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡにおける標的化配列は、ＤＮＡ標的配列に相補的である。
【0031】
一部の実施形態では、キットは、少なくとも１つのギャップ編集因子アクセサリー因子をさらに含む。
【0032】
本開示の実施形態はまた、標的化されたゲノム修飾のための方法を含む。このような実施形態に従って、方法は、本開示の組成物のいずれかを細胞に導入するステップ、及び所望のゲノム変更の存在について細胞を評価するステップを含む。
【0033】
一部の実施形態では、ギャップ編集因子複合体及び／又は少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子は、ポリペプチド（複数可）、ｍＲＮＡ（複数可）及び／又はＤＮＡ発現構築物（複数可）として細胞に導入される。一部の実施形態では、ギャップ編集因子複合体及び／又はガイドＲＮＡは、遺伝子駆動システムの一部として細胞に導入される。
【0034】
一部の実施形態では、細胞は、原核細胞又は真核細胞である。一部の実施形態では、細胞は、哺乳類細胞である。一部の実施形態では、細胞は、植物細胞である。
【0035】
一部の実施形態では、本方法は、程度の低減されたインデル形成、染色体再編成及び／又はＤＮＡ重複をもたらす。
【0036】
一部の実施形態では、細胞生存能が増強されるか、及び／又は細胞毒性が低減される。
【0037】
本開示の他の態様及び実施形態は、次の詳細な説明を踏まえて明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1A】図１Ａは、ギャップ編集の一般機構の代表的な図解を提示する。ギャップ編集因子によってＤＮＡの一方の鎖に付属された、かさ高い化学基は、ＤＮＡ複製を遮断し、一本鎖ＤＮＡギャップをもたらす。次いで、当該のギャップは、相同修復鋳型を組み込むことができる相同組換えにより修復される。反対側の鎖もまた、ニッキング又は化学修飾して、姉妹染色分体との組換えを遮断し、編集を増強することができる。
【図1B】図１Ｂは、低減されたＤＮＡ結合性を有するように操作されているＤＮＡ修飾酵素（ＤａｒＴ）を含むギャップ編集因子複合体を使用した、有意に低減された細胞傷害性効果により効率的なｌａｃＺ遺伝子修復を実証する実験の代表的な結果を含む。
【図2】図２は、ニッカーゼ活性を有するように操作されているＤＮＡ認識ドメインを含むギャップ編集因子複合体（ＤａｒＴ＿Ｇ４９Ｄ＿Ｋ５６Ａ－ＳｃｎＣａｓ９又はＧＥ２ｎ）を使用した、有意に低減された細胞傷害性効果により効率的なｌａｃＺ遺伝子修復を実証する実験の代表的な結果を含む。
【図3】図３は、ギャップ編集因子複合体のＤＮＡ修飾ドメイン（ＤａｒＴ）の機能を相殺するためにギャップ編集因子アクセサリー因子が使用された（ＤａｒＧ）場合の、ギャップ編集因子複合体によるｌａｃＺ遺伝子修復の減弱を実証する実験の代表的な結果を含む。
【図4】図４は、Ｃａｓ９ ＤＮＡ認識ドメインと組み合わせたＤＮＡ修飾ドメイン（Ｓｃａｂｉｎ）を含むギャップ編集因子複合体（Ｓｃａｂｉｎ－Ｋ１３０Ａ－ＳｃｄＣａｓ９）を使用した、カナマイシン遺伝子修復の頻度増加によるゲノム修飾の成功を実証する実験の代表的な結果を含む。
【図5】図５は、Ｃａｓ９ ＤＮＡ認識ドメインと組み合わせたＤＮＡ修飾ドメイン（Ｍｏｍ）を含むギャップ編集因子複合体（Ｍｏｍ－Ｄ１４９Ａ－ＳｃｄＣａｓ９）を使用した、カナマイシン遺伝子修復の頻度増加によるゲノム修飾の成功を実証する実験の代表的な結果を含む。
【図6】図６は、ギャップ編集因子複合体を使用したゲノム修飾の成功（例えば、カナマイシン遺伝子修復の頻度増加による（ｔｈｏｕｇｈ））が、Ｃａｓ９ ＤＮＡ認識ドメインと組み合わせたＤＮＡ修飾ドメイン（ＤａｒＴ）（ＤａｒＴ－Ｇ４９Ｄ－ＳｃｄＣａｓ９）及び活性ＲＮＡにより方向付けられた標的化に頼ることを実証する実験の代表的な結果を含む。（ＳｃｄＣａｓ９単独は、カナマイシン遺伝子修復をもたらさなかった。）
【図7】図７は、毒性を有意に低減させる特異的な突然変異（Ｒ１９３Ａ）を含むＤａｒＴ ＤＮＡ修飾ドメインを有するギャップ編集因子複合体（ＤａｒＴ－Ｇ４９Ｄ－Ｒ１９３Ａ－ＳｃｄＣａｓ９）を使用した実験の代表的な結果を含む。
【図8】図８は、それぞれカナマイシン遺伝子修復の頻度低減及び維持により実証される通り、オンターゲット編集を維持しつつバックグラウンド編集を有意に低減させる突然変異（Ｇ４９Ｄ、Ｒ１９３Ａ、Ｍ８６Ｌ及びＲ９２Ａ）を含むＤａｒＴ ＤＮＡ修飾ドメインを有するギャップ編集因子複合体を使用した実験の代表的な結果を含む。
【図9】図９は、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９ ＤＮＡ認識ドメイン（ＳｃｄＣａｓ９）と組み合わせた、毒性を有意に低減させる突然変異（Ｇ４９Ｄ及び／又はＲ１９３Ａ）を有するＤＮＡ修飾ドメイン（ＤａｒＴ）を含むギャップ編集因子複合体を使用した、カナマイシン遺伝子修復の頻度増加によるゲノム修飾の成功を実証する実験の代表的な結果を含む。Ｒ１９３Ａ突然変異をＧ４９Ｄ突然変異に加えることにより、修飾を損なうことなく、毒性がさらに低減された。部位特異的ゲノム修飾は、ほとんど１００％有効であった。
【図10】図１０は、ｆｃｙ１の遺伝子ノックアウトが、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）に対する抵抗性を付与することを実証する実験の代表的な結果を含む。Ｃａｓ９ニッカーゼ（ＳｃｎＣａｓ９）又は操作されているＤａｒＴ遺伝子とＣａｓ９ニッカーゼとの融合体によるサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるｆｃｙ１遺伝子の標的化、及び修復鋳型の提供は、ｆｃｙ１におけるゲノム修飾をもたらした。全ての突然変異について、ＤａｒＴの融合体は、ゲノム編集の率の＞１０倍増加をもたらし、真核細胞における複製遮断部分の導入の有用性を実証する。
【図11】図１１は、ｆｃｙ１の遺伝子ノックアウトが、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）に対する抵抗性を付与することを実証する実験の代表的な結果を含む。Ｃａｓ９ニッカーゼ（ＳｃｎＣａｓ９）又は操作されているＤａｒＴ遺伝子とＣａｓ９ニッカーゼとの融合体によるサッカロマイセス・セレビシエにおけるｆｃｙ１遺伝子の標的化、及び修復鋳型の提供は、ｆｃｙ１におけるゲノム修飾をもたらした。修復鋳型は、ゲノム修飾後のｆｃｙ１機能の喪失及び５－ＦＣに対する抵抗性をもたらす、ｆｃｙ１に２又は３個の終止コドンを導入する６個の突然変異をコードする。Ｇ４９Ｄ、Ｒ１９３Ａ、Ｍ８６Ｌ及びＲ９２Ａ突然変異を含む操作されているＤａｒＴバリアントの使用は、Ｇ４９Ｄ及びＲ１９３Ａ突然変異単独を有するＤａｒＴの最大でおよそ５０倍まで細胞生存能を改善する。このギャップ編集因子複合体は、酵母におけるｆｃｙ１を標的化する２種の別々のシングルガイドＲＮＡ及び修復鋳型を使用して、効率的かつ低毒性のゲノム修飾を実現する。
【図12】図１２は、サンガー配列決定による、ｆｃｙ１ゲノム修飾及び遺伝子ノックアウトの確認を提供する代表的なクロマトグラム（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）を含む。ギャップ編集因子複合体をｆｃｙ１遺伝子に標的化し、ＤＮＡ修復鋳型を提供することにより、２又は３個の終止コドンが導入された。編集されたヌクレオチドは、赤色で強調されている。ｆｃｙ１内の２種の別々の標的に対するゲノム編集が示されている。
【図13】図１３は、ｌａｃＺの遺伝子ノックアウトが、ラクトースアナログＩＰＴＧ及び比色指標Ｘ－ｇａｌの存在下で、白いコロニー色をもたらすことを実証する実験の代表的な結果を含む。操作されているＤａｒＴ遺伝子に融合されたヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ１２ａタンパク質（ｄＬｂＣａｓ１２ａ）によるＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｌａｃＺ遺伝子の標的化、及び修復鋳型の提供は、ｌａｃＺにおけるゲノム修飾をもたらした。ギャップ編集因子複合体のｌａｃＺ遺伝子への標的化を用いなければ、ゲノム修飾は観察されなかった。
【図14】図１４は、ｌａｃＺ遺伝子への１個以上の終止コドンの導入の成功を実証し、ベータ－ガラクトシダーゼ発現を排除し、これにより、異なるｃｒＲＮＡと会合したＤａｒＴ（Ｇ４９Ｄ／Ｒ１９３Ａ）－ｄＬｂＣａｓ１２ａを使用して、誘導因子ＩＰＴＧ及び比色指標Ｘ－ｇａｌの存在下でプレーティングされたときに白い色のコロニーをもたらす、代表的なクロマトグラム（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）を含む。
【図15】図１５は、ｒｐｏＢ遺伝子へのＤ５１６Ｇ突然変異の導入が、抗生物質リファンピシンに対する抵抗性を付与し、よって、ゲノム修飾の読み出し情報として機能することを実証する実験の代表的な結果を含む。Ｃａｓ９ニッカーゼ（ＳｃｎＣａｓ９）に融合された操作されているＤａｒＴバリアントによるＥ．コリにおけるｒｐｏＢ遺伝子の標的化、並びにＲＮＡ修復鋳型及び逆転写酵素の同時発現は、部位特異的ＲＮＡ鋳型ゲノム修飾をもたらした。
【図16】図１６は、ｒｐｏＢ遺伝子へのＤ５１６Ｇ突然変異の導入が、抗生物質リファンピシンに対する抵抗性を付与し、よって、ゲノム修飾の読み出し情報として機能することを実証する実験の代表的な結果を含む。Ｃａｓ９ニッカーゼ（ＳｃｎＣａｓ９）に融合された操作されているＤａｒＴバリアントによるＥ．コリにおけるｒｐｏＢ遺伝子の標的化、及び直鎖状一本鎖ＤＮＡ修復鋳型の提供は、ｒｐｏＢにおけるゲノム修飾をもたらした。ｒｐｏＢへのギャップ編集因子複合体の標的化は、ゲノム修飾率の１００～６，０００倍増加をもたらし、ギャップ編集因子の効果を実証する。
【発明を実施するための形態】
【0039】
ヌクレオチド修飾は、ある特定の位置におけるＤＮＡメチル化などの機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）修飾、又は架橋、酸化及びニトロシル化などの損傷修飾（ＤＮＡ傷害）の形態を取ることができる。これらのＤＮＡ傷害は、情報忠実性及びＤＮＡ機能性を維持するために修復される必要がある。一般的に発生する傷害は、塩基除去、ミスマッチ及びヌクレオチド除去修復過程により直接的に修復される。しかし、これらの傷害が、ＤＮＡ複製前に修復されない場合、突然変異したＤＮＡとしてゲノム内にロックされるようになる、又は完全に細胞分裂を抑えることができる。これを回避するために、複製依存性修復過程が進化した。そのような過程の１つである、損傷乗り越え合成は、一部のＤＮＡ傷害を直接的に迂回することができる；しかし、これは、一部のＤＮＡ傷害にわたってＤＮＡ突然変異を導入し得る。あるいは、傷害付近のＤＮＡの複製は、傷害の下流で合成を再プライミングすることにより、完全にスキップされ得る。この再プライミングは、ラギング鎖プライマーゼにより、又は高等真核生物では、リーディング鎖プライマーゼ－ポリメラーゼ、ＰＲＩＭＰＯＬによって発生し得る。この再プライミング作用は、複製を続けることを可能にするが、ＤＮＡ傷害及び周囲のＤＮＡに相補的な複製されていない領域を残す。細胞は依然として、ＤＮＡ傷害に相補的な適切な配列を決定することを必要とし、これを行うために、細胞は、相同配列依存性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）ギャップ修復（相同組換えのサブセット）と呼ばれる機構を用いる。
【0040】
相同配列依存性ギャップ修復（ＨＤＧＲ）は、姉妹染色分体が、傷害含有鎖に相補的なＤＮＡをコピーするための鋳型として使用される、高度に正確な修復過程である。相同組換えのサブセットとして、本明細書でさらに記載されている通りに実験を行って、この経路を利用して、姉妹染色分体の代わりに（又はこれに加えて）異所性修復鋳型を使用し、合成ゲノム編集を生成することができるか否か調査した。以前の結果は、脱塩基ＤＮＡの部位特異的導入が、ＨＤＧＲを誘発し、修復のためにプラスミド由来ＤＮＡ鋳型を使用して完了し、正確に編集されたゲノムＤＮＡを生成することができることを実証した。しかし、場合によって、このアプローチは、脱塩基部位の安定性に若干依存し得る。例えば、脱塩基部位は、細胞のＡＰエンドヌクレアーゼ活性の阻害により安定化され得るが、ＡＰエンドヌクレアーゼ阻害は、細胞生存能及びゲノム安定性にマイナスに影響する可能性があり、一部の適用では実行可能とならない場合がある。したがって、本明細書でさらに記載されている通り、ＤＮＡ傷害ほど塩基除去又は同様の修復過程に対して感受性ではない、ＤＮＡ傷害の代替クラスが同定された。本開示の実施形態は、ＤＮＡ複製を遮断し（複製遮断部分）ＨＤＧＲを容易にする、化学基のＤＮＡへの付加が関与する傷害のクラスを含む。
【0041】
例えば、アデノシン二リン酸リボース（ＡＤＰｒ）の付加が、有望なＤＮＡ傷害候補となり、複製遮断部分として作用することができるか否か調査するための実験を行った。ヌクレオチドへのＡＤＰｒ付加を触媒するＡＤＰｒトランスフェラーゼは、細胞傷害性である。したがって、細胞生存能の喪失を伴わずにＨＤＧＲを誘発する試みにおいて、ゲノムへのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ結合後に露出されるＲ－ループにＡＤＰｒ活性を限定するための方法を開発した。抽出されたｄｓＤＮＡ結合性ＡＤＰｒ－トランスフェラーゼは、真核細胞中に電気穿孔されたときに致死的であることが示された。これとは別に、ｄｓＤＮＡ結合性ＤＮＡ修飾酵素は、その活性を局在化をさせるために、ＤＮＡ結合タンパク質に融合されたが、オフターゲット修飾の高い率を保持し、このことは、活性を制御するために追加の軽減ステップを必要とする。一本鎖ＤＮＡ結合酵素は、ＤＮＡへのＣａｓエフェクターによる標的結合後に露出されたＤＮＡ Ｒ－ループに局在化されたその活性を有することができる。
【0042】
以前の研究は、細菌毒素として作用する、ＤａｒＴ及びＤａｒＴ突然変異体ＤａｒＴ＿Ｇ４９Ｄを含む、一本鎖結合ＡＤＰｒ－トランスフェラーゼ酵素のクラスについて記載した。ＤａｒＴ発現は、Ｅ．コリにおいて致死的であり、組換えにより、また、より弱いが、ヌクレオチド除去修復により主に修復されると思われる。したがって、ゲノムではなく組換えＤＮＡ配列を鋳型にした部位特異的ＨＤＧＲの誘発にＤａｒＴを使用することができるか否か調査するための実験を行った。実験は、Ｃａｓ標的部位にＡＤＰｒ修飾を局在化するためにＤａｒＴを十分に制御し、細胞傷害性を回避し、効率的なゲノム修飾を可能にすることができるか否か理解しようと努めた。
【0043】
本セクション及び本明細書の開示全体において使用されているセクション見出しは、単に組織化を目的としており、限定を意図するものではない。
【0044】
１．定義
他に定義がない限り、本明細書で使用されるあらゆる技術及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意義を有する。矛盾が生じる場合、定義を含む本文書が優先される。好まれる方法及び材料が下に記載されるが、本明細書に記載されているものと同様の又は等価の方法及び材料を、本開示の実施又は検査において使用することができる。語句「一実施形態では」は、本明細書で使用される場合、同じ実施形態を必ずしも指すとは限らないが、それを指す場合もある。さらに、語句「別の実施形態では」は、本明細書で使用される場合、異なる実施形態を必ずしも指すとは限らないが、それを指す場合もある。よって、下に記載される通り、本発明の様々な実施形態は、本発明の範囲又は精神から逸脱することなく、容易に組み合わせることができる。本明細書に言及されているあらゆる刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示されている材料、方法及び例は、単なる説明目的であり、限定を意図するものではない。
他に定義がない限り、本明細書で使用されるあらゆる技術及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意義を有する。矛盾が生じる場合、定義を含む本文書が優先される。好まれる方法及び材料が下に記載されるが、本明細書に記載されているものと同様の又は等価の方法及び材料を、本開示の実施又は検査において使用することができる。語句「一実施形態では」は、本明細書で使用される場合、同じ実施形態を必ずしも指すとは限らないが、それを指す場合もある。さらに、語句「別の実施形態では」は、本明細書で使用される場合、異なる実施形態を必ずしも指すとは限らないが、それを指す場合もある。よって、下に記載される通り、本発明の様々な実施形態は、本発明の範囲又は精神から逸脱することなく、容易に組み合わせることができる。本明細書に言及されているあらゆる刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示されている材料、方法及び例は、単なる説明目的であり、限定を意図するものではない。
【0045】
用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「を有している」、「を有する」、「できる」、「を含有する」及びこれらのバリアントは、本明細書で使用される場合、追加の行為又は構造の可能性を妨げない、オープンエンドの移行句、用語又は言葉であることを意図する。単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎｄ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそれ以外のことを明らかに指示しない限り、複数の参照を含む。本開示はまた、明示的に示されているか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態又は要素「を含む」、「からなる」及び「から本質的になる」他の実施形態を企図する。
【0046】
本明細書における数的範囲の列挙について、同じ程度の精度で、その間に介在する数のそれぞれが、明示的に企図される。例えば、６～９の範囲について、６及び９に加えて数７及び８が企図され、範囲６．０～７．０について、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０が明示的に企図される。
【0047】
「に相関される」は、本明細書で使用される場合、「と比較される」を指す。
【0048】
本明細書で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含むがこれらに限定されない、いずれかの核酸含有分子を指す。この用語は、４－アセチルシトシン、８－ヒドロキシ－Ｎ６－メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルアデニン、１－メチルシュードウラシル、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、オキシブトキソシン（ｏｘｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、シュードウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２－チオシトシン及び２，６－ジアミノプリンを含むがこれらに限定されない、ＤＮＡ及びＲＮＡの公知塩基アナログのいずれかを含む配列を包含する。
【0049】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド、前駆体又はＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ）の産生のためのコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。全長又は断片の所望の活性又は機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合性、シグナル伝達、免疫原性など）が保持される限りにおいて、ポリペプチドは、全長コード配列又はコード配列のいずれかの部分によってコードされ得る。この用語は、構造遺伝子のコード領域、並びに遺伝子が全長ｍＲＮＡの長さに対応するように、どちらかの端において約１ｋｂ以上の距離にわたり５’及び３’端の両方でコード領域に隣接して位置する配列も包含する。コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡに存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’又は下流に位置し、ｍＲＮＡに存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡ及びゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態又はクローンは、「イントロン」又は「介在領域」又は「介在配列」と命名される非コード配列に中断されたコード領域を含有する。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）へと転写される遺伝子のセグメントである；イントロンは、エンハンサーなどの調節エレメントを含有することができる。イントロンは、核又は一次転写物から除去される又は「切り出される」；したがって、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物に存在しない。ｍＲＮＡは、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列又は順序を指定するように翻訳の際に機能する。
【0050】
本明細書で使用される場合、用語「異種遺伝子」は、その天然の環境にない遺伝子を指す。例えば、異種遺伝子は、別の種に導入された、ある１つの種由来の遺伝子を含む。異種遺伝子は、何らかの仕方で変更された（例えば、突然変異された、複数コピーで付加された、非ネイティブ調節配列に連結された、など）、生物にとってネイティブな遺伝子も含む。異種遺伝子配列が、染色体中の遺伝子配列に天然に付随した状態で見出されないＤＮＡ配列に典型的に連結されている、又は自然界で見出されない染色体の部分に付随している（例えば、遺伝子が正常に発現されない遺伝子座において発現される遺伝子）という点において、異種遺伝子は、内因性遺伝子から区別される。
【0051】
本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、短い長さの一本鎖ポリヌクレオチド鎖を指す。オリゴヌクレオチドは典型的に、約３００個未満の残基長（例えば、１５～１００個の間）であるが、しかし、本明細書で使用される場合、この用語は、より長いポリヌクレオチド鎖を包含することも意図する。オリゴヌクレオチドは、その長さによって参照されることが多い。例えば、２４残基オリゴヌクレオチドは、「２４－ｍｅｒ」と称される。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイズすることによって又は他のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることによって二次及び三次構造を形成することができる。そのような構造は、二重鎖、ヘアピン、十字型、屈曲及び三重鎖を含むことができるがこれらに限定されない。
【0052】
用語「相同性」及び「相同」は、同一性の程度を指す。部分相同性又は完全相同性が存在することができる。部分的に相同な配列は、別の配列と１００％未満同一である配列である。
【0053】
本明細書で使用される場合、用語「相補的」又は「相補性」は、塩基対合の法則によって関係付けられたポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド又は標的核酸などのヌクレオチドの配列）を参照して使用される。例えば、配列「５’－Ａ－Ｇ－Ｔ－３’」は、配列「３’－Ｔ－Ｃ－Ａ－５’」と相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対合の法則に従ってマッチする、「部分的」なものであり得る。あるいは、核酸の間に「完全」又は「全」相補性が存在することができる。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に有意な効果を有する。これは、核酸の間の結合に依存する増幅反応や検出方法において特に重要である。特に、ポリヌクレオチドの文脈内で、個々のヌクレオチドを参照して、いずれかの用語を使用することもできる。例えば、オリゴヌクレオチド内の特定のヌクレオチドは、別の核酸鎖内のヌクレオチドに対するその相補性又はその欠如について、オリゴヌクレオチド及び核酸鎖の残りの間の相補性と対比又は比較して記述され得る。
【0054】
一部の文脈において、用語「相補性」及び関連用語（例えば、「相補的」、「相補体」）は、水素結合により別の核酸配列に結合することができる核酸配列のヌクレオチド、例えば、ワトソン・クリック塩基対合又は他の塩基対合により、例えば、塩基対合することができるヌクレオチドを指す。塩基対を形成することができる、例えば、互いに相補的であるヌクレオチド：シトシンとグアニン、チミンとアデニン、アデニンとウラシル、及びグアニンとウラシルは、対である。パーセンテージ相補性は、核酸配列の長さ全体にわたって計算される必要はない。相補性のパーセンテージは、例えば、最初の塩基対合したヌクレオチドから始まり、最後の塩基対合したヌクレオチドで終わる、塩基対合される核酸配列の特異的領域に限定され得る。核酸配列の相補体は、本明細書で使用される場合、一方の配列の５’端が他方の３’端と対合されるように核酸配列と整列された場合に、「逆平行会合」する、オリゴヌクレオチドを指す。天然の核酸において一般的に見出されないある特定の塩基が、本発明の核酸に含まれてよく、例えば、イノシン及び７－デアザグアニンを含む。相補性は、完璧である必要はない；安定した二重鎖は、ミスマッチ塩基対又は非対応塩基を含有することができる。核酸技術の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成及び配列、イオン強度並びにミスマッチ塩基対の発生率を含む多数の変数を考慮して、経験的に二重鎖安定性を決定することができる。
【0055】
よって、一部の実施形態では、「相補的」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個以上のヌクレオベースの領域にわたり、第２のヌクレオベース配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％同一である第１のヌクレオベース配列を指す、又は２種の配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを指す。「完全に相補的」は、第１の核酸の各ヌクレオベースが、第２の核酸の対応する位置における各ヌクレオベースと対合することができることを意味する。例えば、ある特定の実施形態では、各ヌクレオベースが核酸と相補性を有するオリゴヌクレオチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個以上のヌクレオベースの領域にわたり核酸の相補体と同一であるヌクレオベース配列を有する。
【0056】
本明細書で使用される場合、「二本鎖核酸」は、核酸の部分、より長い核酸の領域又は核酸全体であり得る。「二本鎖核酸」は、例えば、限定することなく、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドなどであり得る。二次構造（例えば、塩基対合した二次構造）及び／又はより高次の構造を有する一本鎖核酸は、「二本鎖核酸」を含む。例えば、三重鎖構造は、「二本鎖」であると考慮される。一部の実施形態では、いかなる塩基対合した核酸も、「二本鎖核酸」である。
【0057】
用語「単離された」は、「単離されたオリゴヌクレオチド」又は「単離されたポリヌクレオチド」におけるように、核酸に関連して使用される場合、その天然の供給源においてそれが通常会合している少なくとも１つの構成成分又は夾雑物から同定及び分離された核酸配列を指す。単離された核酸は、それが自然界で見出される形態又は状況とは異なる形態又は状況で存在する。対照的に、単離されていない核酸は、それが自然界で存在する状態で見出されるＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸である。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、宿主細胞染色体上で、隣接する遺伝子の近くに見出される；特異的タンパク質をコードする特異的ｍＲＮＡ配列などのＲＮＡ配列は、細胞内で、数多くのタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として見出される。しかし、所与のタンパク質をコードする単離された核酸は、例として、所与のタンパク質を通常発現する細胞内にあるそのような核酸を含み、この細胞において、核酸は、天然の細胞の位置とは異なる染色体位置にある、又はそうでなければ自然界で見出されるものとは異なる核酸配列によってフランキングされている。単離された核酸、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖形態で存在することができる。単離された核酸、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、タンパク質を発現させるために利用されることになる場合、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、最低でもセンス又はコード鎖を含有する（すなわち、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、一本鎖であり得る。）が、センス及びアンチセンス鎖の両方を含有することができる（すなわち、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、二本鎖であり得る。）。
【0058】
本明細書で使用される場合、用語「精製された」又は「を精製すること」は、試料からの構成成分（例えば、夾雑物）の除去を指す。例えば、抗体は、混入した非免疫グロブリンタンパク質の除去によって精製される；抗体はまた、標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去によって精製される。非免疫グロブリンタンパク質の除去及び／又は標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去は、試料中の標的反応性免疫グロブリンのパーセントの増加をもたらす。別の例では、組換えポリペプチドが、細菌宿主細胞内で発現され、ポリペプチドは、宿主細胞タンパク質の除去によって精製される；これにより、組換えポリペプチドのパーセントは、試料中で増加する。
【0059】
好まれる方法及び材料が下に記載されるが、本明細書に記載されているものと同様の又は等価の方法及び材料を、本開示の実施又は検査において使用することができる。本明細書に言及されているあらゆる刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示されている材料、方法及び例は、単なる説明目的であり、限定を意図するものではない。
【0060】
２．ギャップ編集因子
ＣＲＩＳＰＲに基づくゲノム編集ツールは、その容易にプログラム可能な標的化及びロバストな活性に頼る広範な用途を見出した。このようなＣＲＩＳＰＲに基づくツールの初期の使用は、ＤＮＡを切断するＣａｓヌクレアーゼの能力に焦点を合わせた。切断されたＤＮＡを修復する過程において、ゲノム編集が導入される。しかし、ＤＮＡ切断は、細胞が耐え得る最も毒性が高い事象の１つである。ＤＮＡ切断は、突然変異、ＤＮＡ再編成又は細胞生存能喪失をもたらす細胞の警報システムを作動させる。その後のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集ツールは、一本鎖ニックを代わりに導入すること又は酵素によりＤＮＡを直接的に修飾することにより、これらの毒性効果を最小化することを探究した。にもかかわらず、これらのより新しい方法は、導入され得る編集の限られた範囲を示し、望まれない挿入、欠失及び突然変異を被り得る。
ＣＲＩＳＰＲに基づくゲノム編集ツールは、その容易にプログラム可能な標的化及びロバストな活性に頼る広範な用途を見出した。このようなＣＲＩＳＰＲに基づくツールの初期の使用は、ＤＮＡを切断するＣａｓヌクレアーゼの能力に焦点を合わせた。切断されたＤＮＡを修復する過程において、ゲノム編集が導入される。しかし、ＤＮＡ切断は、細胞が耐え得る最も毒性が高い事象の１つである。ＤＮＡ切断は、突然変異、ＤＮＡ再編成又は細胞生存能喪失をもたらす細胞の警報システムを作動させる。その後のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集ツールは、一本鎖ニックを代わりに導入すること又は酵素によりＤＮＡを直接的に修飾することにより、これらの毒性効果を最小化することを探究した。にもかかわらず、これらのより新しい方法は、導入され得る編集の限られた範囲を示し、望まれない挿入、欠失及び突然変異を被り得る。
【0061】
本開示の実施形態は、効率的な無毒性ゲノム修飾を、一本鎖ＤＮＡギャップの導入及び修復により行うことができることを実証する。以前の研究は、ＤＮＡへの脱塩基部位の部位特異的導入が、相同配列依存性ギャップ組換えを駆動することを実証した。異所性ＤＮＡ修復鋳型を導入することにより、ゲノム修飾は、導入された脱塩基部位に隣接するＤＮＡ配列において達成され得る。しかし、場合によって、このアプローチは、脱塩基部位の安定化に依存し得る。したがって、本開示の実施形態は、ＤＮＡへの安定した化学基の付加を用いて相同配列依存性ギャップ修復を誘導するためのシステムの開発を含む。この修飾されたＤＮＡは、細胞グリコシラーゼによって認識も修復もされず、これは、傷害安定性を増加させ、相同配列依存性ギャップ修復を駆動する。部位特異的ＤＮＡ標的化を、Ｃａｓエフェクターへの修飾酵素の融合によって達成し、場合によって、ゲノム修飾の率を、標的ＤＮＡ鎖をニッキングするためにＣａｓエフェクターを使用して増加させ得る。本明細書でさらに記載されている通り、ニッキング及びＤＮＡ修飾の組合せは、姉妹染色分体修復を相互に抑止するため、ゲノム修飾において相乗効果を有することができる。
【0062】
当業者によって認識される通り、本来の及び最も広く使用されているＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集技術は、二本鎖切断を導入するＣａｓヌクレアーゼに頼り、二本鎖切断は次いで、ギャップ編集因子と同様に、編集鋳型を介した相同組換えにより修復される。広範に適用されているが、二本鎖切断の毒性及び突然変異又は染色体再編成を駆動するその傾向は、治療適用のための一貫した課題である。このようなＤＮＡ切断は、高度に毒性であり（特に、細菌において）、多くの場合、非相同末端結合経路によるエラープローンな修復をもたらす。切断及び修復は潜在的に、ＤＮＡの大型のセグメントを挿入する最もよく知られた仕方であり、これは、多くの科学適用及び産業適用に重要である。
【0063】
その上、塩基編集因子は、ヌクレオチドをあるものから別のものに酵素変換することにより、毒性を回避する試みにおいて使用され得る。例えば、シトシンは、チミンに変換され得、アデニンは、グアニンに変換され得る。しかし、このような塩基編集因子は、一度に１個又は数個のヌクレオチドを変化させることしかできず、望まれない編集を回避するために慎重に標的化される必要がある。さらに、塩基編集因子は、変異原性であり、これは、標的化されていないヌクレオチドが、塩基編集因子が使用されている際に不正確に複製される可能性がより高いことを意味する。塩基編集因子はまた、標的配列の利用能によって制約される。他の技法と比較して、塩基編集因子は、相対的に効率的であり、両方の鎖のカットとは反対に、ＤＮＡの一本鎖のニッキングのみに頼る。
【0064】
プライム（Ｐｒｉｍｅ）編集因子は、ごく最近記載された。最近の刊行物に基づき、プライム編集因子は、相対的に効率的であり、Ｃａｓ９シングルガイドＲＮＡの骨格にコードされた非常に小型の修復鋳型を使用するという点において大きな利点を有すると思われる。二本鎖切断を用いない技法として売り込まれたが、効率的なプライム編集は依然として、相対的に近（＜２００ｂｐ）接近したＤＮＡの両方の鎖のニッキングが関与する。このデュアルニッキングは、切断及び修復アプローチよりもごく僅かに毒性が低い。エラープローン挿入及び欠失が、依然として、デュアルニッキングの結果として哺乳類細胞において発生する。いかなる程度まで、プライム編集因子が原核生物において機能するか不明である。そのＣＲＩＳＰＲ依存性オフターゲット活性が弱められるが、いかなる変異原性副作用が、その適用において発生し得るか否かも不明である。
【0065】
他の技法と比較して、ギャップ編集因子は、その使用に関係する最小量のデータを有する。にもかかわらず、ギャップ編集因子は、本明細書でさらに記載されている通り、最小の毒性効果を有すると思われ；一部の実験は、検出可能な毒性を示さない。低毒性は典型的に、低い率の望まれない突然変異、ＤＮＡ挿入又はＤＮＡ再編成を示すため、毒性の欠如は、治療適用に特に有利となり得る。また、マルチプレックス操作は一般的に、毒性によって妨害される（特に、細菌において）。インビボ治療法のため、ギャップ編集因子は、他のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ方法の全てと同じＤＮＡ及びタンパク質送達問題を被る可能性があるが、ＲＮＰと修復鋳型との同時送達を可能にするより新しい送達プラットフォームが存在する。
【0066】
本開示の実施形態は、ゲノムにおける核酸の標的化修飾のための組成物、システム、キット及び方法を含む。このような実施形態に従って、本開示は、ＤＮＡ認識ドメイン及びＤＮＡ修飾ドメインを一般に含むギャップ編集因子及びギャップ編集因子複合体を提供する。本明細書に提供される実施例においてさらに記載される通り、ギャップ編集因子及びギャップ編集因子複合体は、相同配列指向性ギャップ修復によるゲノム修飾を駆動するための、ＤＮＡ修飾ドメインに機能的にカップリングされたＤＮＡ認識ドメインによる、プログラム可能なＤＮＡ標的化を容易にする。一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメインは、ゲノムにおけるＤＮＡ標的配列に結合し、ＤＮＡ修飾ドメインは、ゲノムにおける少なくとも１個のヌクレオチドに複製遮断部分の形成を誘導する。特異的方向性でのギャップ編集因子の標的化は、持続性ＤＮＡギャップを生成し、これにより、ギャップ編集因子効率を改善する。
【0067】
一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメイン及びＤＮＡ修飾ドメインは、機能的にカップリングされている。機能的にカップリングされているとは、ゲノム編集因子として機能させる目的のために、特異的標的部位にＤＮＡ認識ドメイン及びＤＮＡ修飾ドメインを組み込むためのいずれかの手段を含む。一部の実施形態では、「機能的にカップリングされている」は、ポリペプチド融合、ペプチドタグ、ペプチドリンカー、ＲＮＡタグ及びこれらのいずれかの組合せを含むがこれらに限定されない。例えば、ギャップ編集因子又はギャップ編集因子複合体は、ＤＮＡ修飾ドメインに融合されたＤＮＡ認識ドメイン（例えば、融合ポリペプチド）を含むことができる。ギャップ編集因子融合タンパク質のＤＮＡ認識ドメインは、標的核酸における特異的部位（例えば、ゲノムにおける核酸配列）を認識し、次いで、ＤＮＡ修飾ドメインは、標的部位内の又はその周囲の１個以上の核酸を修飾して、ゲノム修飾を容易にすることができる。
【0068】
本開示に基づき当業者によって認識される通り、本明細書に記載されているギャップ編集因子複合体は、生物又は細胞のゲノムのいずれかの一部の修飾に使用され得る。例えば、本開示のギャップ編集因子複合体は、所望の部位特異的修飾を生成するために、ゲノムにおける特異的部位の標的化に使用され得る、並びに／又は本開示のギャップ編集因子複合体は、ゲノムの部分の付加、交換及び／若しくは除去をもたらす修飾を生成するために、ゲノムにおける１個以上の特異的部位の標的化に使用され得る。その上、本開示のギャップ編集因子複合体は、オープンリーディングフレーム、イントロン、エクソン、イントロン－エクソン境界、機能的非コード領域並びにいずれかの上流及び／又は下流ＤＮＡ／遺伝子調節配列を含むがこれらに限定されない、遺伝子のいずれかの領域の標的化に使用され得る。本明細書で互換的に使用される用語「ＤＮＡ／遺伝子調節配列」、「制御エレメント」及び「調節エレメント」は、非コード配列若しくはコード配列の転写を提供する及び／又は調節する、及び／又はコードされたポリペプチドの翻訳を調節する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルその他などの転写及び翻訳制御配列を指す。よって、本開示のギャップ編集因子複合体は、変更された遺伝子発現パターン及び／又は活性（例えば、上方調節又は下方調節）をもたらす、ゲノムにおける修飾の生成に使用され得る。
【0069】
一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメイン及びＤＮＡ修飾ドメインは、融合ポリペプチドを含まない（例えば、融合ポリペプチド又はタンパク質を１つも形成しない）。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、ＤＮＡ認識ドメインによってギャップ編集因子又はギャップ編集因子複合体にリクルートされる。例えば、ギャップ編集因子のＤＮＡ認識ドメインは、タンパク質－タンパク質相互作用によりＤＮＡ修飾ドメインをリクルートすることができる。一部の実施形態では、このリクルートメントは、標的核酸の特異的部位においてＤＮＡ修飾ドメインをＤＮＡ認識ドメインにリクルートし、機能的にカップリングするのに役立つタグ又はリンカーによって容易となる。抗原－抗体相互作用（例えば、抗原結合性ドメインに融合されたＤＮＡ修飾ドメイン、及び対応する抗原に融合されたＤＮＡ認識ドメイン）、タンパク質タグ（例えば、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用）、ペプチド及び単鎖可変抗体断片、スプリットタンパク質システム、又はいずれかのリガンド－受容体相互作用を含むがこれらに限定されないタンパク質－タンパク質相互作用に基づきＤＮＡ修飾ドメインをＤＮＡ認識ドメインにリクルートし、機能的にカップリングするための他の手段が使用されてもよい。他の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、例えば、Ｃａｓ９のＨＮＨドメインをＤＮＡ修飾ドメインに置き換えること又はＰＡＭ相互作用ドメインにＤＮＡ修飾ドメインを挿入することなどにより、ＤＮＡ認識ドメインに組み込まれ得る。
【0070】
他の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、核酸との相互作用によって、ギャップ編集因子又はギャップ編集因子複合体にリクルートされる。例えば、標的核酸における部位に結合するためにＤＮＡ認識ドメインと相互作用するガイドＲＮＡ分子は、ＤＮＡ修飾ドメインに結合する配列及び／又は構造（例えば、足場ドメイン）を含むことができる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡにおける配列及び／又は構造は、ＲＮＡ結合タンパク質によって認識されるドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、ガイドＲＮＡにおけるドメインへの結合によりギャップ編集因子又はギャップ編集因子複合体にリクルートされるＲＮＡ結合タンパク質に融合される。ＲＮＡ結合相互作用に基づきＤＮＡ修飾ドメインをＤＮＡ認識ドメインにリクルートし、機能的にカップリングするための他の手段が使用されてもよい。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＭＳ２コートタンパク質、Ｔａｔ又はＲｅｖなどの異なるタンパク質又はタンパク質ドメインを認識するＲＮＡアプタマーをコードするために拡張される。次に、認識されたタンパク質又はタンパク質ドメインは、ＤＮＡ修飾ドメインに融合される。ガイドＲＮＡは、複数コピーの同じタンパク質結合ドメイン又は異なるタンパク質結合ドメインをコードすることができる。これらのタンパク質結合ドメインは、ｇＲＮＡ若しくはｓｇＲＮＡのループを介して又はｓｇＲＮＡの３’端においてなど、ｇＲＮＡの異なる一部に取り込まれ得る。
【0071】
本明細書でさらに記載されている通り、本開示のギャップ編集因子複合体は、相同配列指向性修復の機構などにより、生物又は細胞のゲノムにおける様々な修飾の生成に使用され得る。一部の実施形態では、本開示のギャップ編集因子を使用したゲノム修飾は、単一のヌクレオチド変化から大型の挿入又は欠失に及ぶ特異的ヌクレオチド修飾を生成することができる。一部の実施形態では、本開示のギャップ編集因子複合体は、ゲノムにおける別個の部位を標的化するための２種以上のガイドＲＮＡ配列の使用により、ＤＮＡの大型の配列の付加又は除去に使用され得る（例えば、２個のｇＲＮＡ標的部位の間の配列を除去する及び／又は外因性ＤＮＡ配列を挿入することにより、大型のゲノム欠失を生成する）。一部の実施形態では、複数のｇＲＮＡが、ゲノムにおけるいずれかの数の所望の修飾を生成するために、ゲノムにおける複数の部位の標的化に使用され得る（例えば、マルチプレックス化）。本開示に基づき当業者によって認識される通り、いずれかの型の遺伝学的修飾が、インビトロ、エクスビボ又はインビボ送達方法を含む、ギャップ編集因子複合体が細胞に送達される仕方（例えば、形質転換）に関係なく、いずれかの細胞型及び／又は生物において本開示のギャップ編集因子複合体を使用して達成され得る。これらの方法の一般的な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９５年に見出すことができる。
【0072】
ＤＮＡ認識ドメイン。このような実施形態に従って、本開示のギャップ編集因子又はギャップ編集因子複合体のＤＮＡ認識ドメインは、特異的核酸標的部位を標的化するための、配列特異的核酸結合構成成分（例えば、分子、生体分子、又は１個以上の分子及び／若しくは生体分子の複合体）の使用を含む）。一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメインは、ヌクレアーゼ又はデオキシリボヌクレアーゼ活性を欠如する少なくとも１個のＣａｓタンパク質又はその断片を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメインは、ヌクレアーゼ又はデオキシリボヌクレアーゼ活性を欠如するＣａｓタンパク質の複合体を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメインは、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９又はＣａｓ１２ａを含むがこれらに限定されない、ニッカーゼ活性を示す少なくとも１個のＣａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質の複合体を含む。
【0073】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質複合体は、Ｉ型カスケード、ＩＩ型Ｃａｓ９、ＩＶ型エフェクターモジュール、Ｖ型Ｃａｓ１２、Ｃａｓ９関連ＩｓｃＢ、Ｃａｓ９関連ＴｎｐＢ及びこれらの組合せを含む。カスケードは、ガイドＲＮＡと異なる比率で安定した複合体を形成するＣａｓタンパク質のセットである。ｇＲＮＡは通常、ＣＲＩＳＰＲアレイ内にコードされ、そこで、複合体のＣａｓ６タンパク質は、転写された反復配列においてヘアピンを切断する。次に、他のタンパク質は、遊離されたＲＮＡの周囲に形成される。完全に形成された複合体は、非標的鎖の５’端においてコードされたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）によってフランキングされた標的ＤＮＡに結合する。標的認識後に、複合体は次いで、Ｉ型エンドヌクレアーゼＣａｓ３をリクルートして、３’から５’の方向で非標的鎖をニッキングし、進行的に分解するが、複合体は、Ｃａｓ３の非存在下で標的ＤＮＡに安定的に結合する。カスケードにおけるタンパク質の具体的な数及び化学量論は、Ｉ－Ｃサブタイプに関するＣａｓ８ｃ（１）：Ｃａｓ５ｃ（１）：Ｃａｓ７（７）、及びＩ－Ｅサブタイプに関するＣｓｅ１（１）：Ｃｓｅ２（２）：Ｃａｓ５ｅ（１）：Ｃａｓ７（６）：Ｃａｓ６ｅ（１）など、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓサブタイプの間で変動する。さらに、これらのタンパク質は、より少ない発現されたポリペプチドとの複合体を再現するために融合されてよく、ガイドＲＮＡが、プロセシングされたＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとして発現される場合、Ｃａｓ６タンパク質は不要である。ｇＲＮＡ内のガイド配列の長さを変動させることは、カスケードのタンパク質化学量論をさらに変更させることができ、Ｒ－ループ及び置換されたＤＮＡ鎖の長さを変化させることができる。Ｃａｓ９は、非標的鎖の３’端においてコードされたＰＡＭを有する標的ＤＮＡに結合する単一エフェクターヌクレアーゼである。次に、結合したＤＮＡは、ＨＮＨ及びＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにより反対側の鎖でニッキングされ、二本鎖切断をもたらす。Ｃａｓ９によって利用されるｇＲＮＡは通常、ＣＲＩＳＰＲアレイによりコードされ、そこで、トランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、転写された反復配列と対合し、ＲＮＡ二重鎖は、エンドリボヌクレアーゼＲＮａｓｅ ＩＩＩによって切断される。その結果得られるプロセシングされたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖は、Ｃａｓ９の結合を受け、ＤＮＡ標的化を方向付ける。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖は融合されて、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成することができる。Ｃａｓ１２は、そのサブタイプによって命名されたＣａｓヌクレアーゼの多様なファミリーを表し（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｅ）、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、ＣａｓＸ又はＣａｓ１４ａなどの代替名を与えられた。Ｃａｓ１２ヌクレアーゼは、非標的鎖の５’端においてコードされたＰＡＭを有するＤＮＡを標的化し、ヌクレアーゼのＲｕｖＣドメインは、標的及び非標的鎖の両方をニッキングして、５’オーバーハングを有するスタガード（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）二本鎖切断を創出する。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲアレイ内でコードされ、ヌクレアーゼに応じて２種の機構のうち１種により、転写されたＣＲＩＳＰＲアレイからプロセシングされ得る：Ｃａｓ１２ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ１２ａ）を有するリボエンド核酸分解（ｒｉｂｏｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）ドメインによる反復配列内のヘアピンの切断、又はＲＮａｓｅ ＩＩＩによってその後切断されるｔｒａｃｒＲＮＡと転写された反復配列との対合。結果として、ヌクレアーゼ単独がｃｒＲＮＡプロセシングの原因である場合、ｇＲＮＡは、そのプロセシングされた形態で容易に発現され得、ｔｒａｃｒＲＮＡがｃｒＲＮＡプロセシングに関与する場合、ｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡとして発現され得る。
【0074】
一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメインは、タンパク質のＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン内に非活性化突然変異を導入することにより生成され得るデオキシリボヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９（「ｄＣａｓ９」）を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメインは、ＲｕｖＣ－ＩなどのＲｕｖＣドメインのうち少なくとも１個の内に非活性化突然変異を導入することにより生成され得るデオキシリボヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ１２ａ（「ｄＣａｓ１２ａ」）を含む。あるいは、ＰＡＭ遠位端においてトランケートされた、又は標的とのミスマッチを含有するガイドＲＮＡは、ＤＮＡ結合を可能にすることができるが、他の面では触媒活性があるＣａｓヌクレアーゼによるＤＮＡニッキング又は切断ができない。
【0075】
一部の実施形態では、様々な他のＤＮＡ認識ドメインが、本開示のギャップ編集因子複合体において使用されてもよい。例えば、本明細書に記載されている組成物及び方法のある特定の実施形態は、効率的なゲノム編集及び修飾を実現するためにガイドＲＮＡを要求しない。上に記載される通り、このようなギャップ編集因子複合体は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー（ＺＦ）及び転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本開示のＤＮＡ認識ドメインは、メガヌクレアーゼを含むことができる。メガヌクレアーゼは、標的化された様式で配列を置き換える、排除する又は修飾するために使用され得、その認識標的配列は、タンパク質操作により変更され得る。メガヌクレアーゼは、細菌であれ植物であれ動物であれ、あらゆるゲノム型を修飾するために使用され得、その相対的に小型のサイズにより、インビボ送達に修正可能である。メガヌクレアーゼの高い程度の標的特異性は、随伴的に高い程度の精度及びはるかにより低い細胞毒性を可能にする。しかし、新規配列の標的化は、利用できるメガヌクレアーゼの数が限定されていることが原因で困難である。
【0076】
一部の実施形態では、本開示のＤＮＡ認識ドメインは、ジンクフィンガー（ＺＦ）を含むことができる。ＺＦは、制限エンドヌクレアーゼ由来の非特異的ＤＮＡ切断ドメインとジンクフィンガータンパク質との融合体である。ＺＦＮは、特異的ＤＮＡ配列を標的化することができ、これは、ＺＦＮが、標的生物の内側にある特有の配列に向かい、正確に変化させることを可能にする。単一ジンクフィンガーは、保存されたββα形における３０個前後のアミノ酸で構成される。α－ヘリックスの表面におけるいくつかのアミノ酸は通常、ＤＮＡの滑らかな（ｓｍｏｏｔｈ）溝の内の３塩基対を選択する。９～１８ｂｐの長さのＤＮＡ配列を認識する合成ジンクフィンガータンパク質を可能にする高度に保存されたリンカー配列の開発と共に、３個を超えるドメインを有する非天然アレイの開発が利用できるようになったため、ジンクフィンガータンパク質は、カスタムＤＮＡ結合タンパク質の設計のための重要な枠組みになった。
【0077】
一部の実施形態では、本開示のＤＮＡ認識ドメインは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を含むことができる。ＴＡＬＥは、非常に多用途であり、ヌクレアーゼ、転写活性化因子及び抑制因子、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ＤＮＡ及びヒストンメチルトランスフェラーゼ並びにヒストンアセチルトランスフェラーゼを含む、多数のエフェクタードメインと組み合わせて、ゲノム構造及び機能に影響を与えることができる。ＴＡＬＥＮは、Ｆｏｋｌ切断ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインの融合体である転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼである。ＴＡＬＥは、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の細菌由来の天然起源のタンパク質であり、それぞれが単一塩基対を認識する一連の３３～３５アミノ酸反復配列ドメインで構成されたＤＮＡ結合ドメインを含有する。ＴＡＬＥ特異性は、反復配列可変性２（ｄｉ）残基（ＲＶＤ）として知られる２個の高頻度可変性アミノ酸によって決定される。ヌクレアーゼ、転写活性化因子及び部位特異的リコンビナーゼを含む、多数のエフェクタードメインが、標的化された遺伝学的修飾のためにＴＡＬＥ反復配列への融合に利用可能となった。ＴＡＬＥ－ＤＮＡ結合反復配列の単一塩基認識は、トリプレット限局ジンクフィンガーよりも優れた設計柔軟性を提供するが、反復配列ＴＡＬＥアレイのクローニングは、広範な同一反復配列による技術的課題の高まりを提示する。
【0078】
ＤＮＡ修飾ドメイン。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、ＤＮＡ標的配列における少なくとも１個のヌクレオチドへの少なくとも１個の複製遮断部分の形成又は付加を触媒する。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、ＤＮＡ標的配列に相補的なＤＮＡ鎖における少なくとも１個のヌクレオチドに複製遮断部分を付加することにより、ＤＮＡ複製を遮断する。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、ＤＮＡ標的配列を含有するＤＮＡ鎖における少なくとも１個のヌクレオチドに複製遮断部分を付加することにより、ＤＮＡ複製を遮断する。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、ＤＮＡ標的配列に相補的なＤＮＡ鎖におけるヌクレオチド及びＤＮＡ標的配列を含有するＤＮＡ鎖におけるヌクレオチドの両方に複製遮断部分を付加することにより、ＤＮＡ複製を遮断する。
【0079】
一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメインは、ＤＮＡ標的鎖における一本鎖切断を誘導し（ニッカーゼ活性により）、ＤＮＡ修飾ドメインは、複製遮断部分を、ＤＮＡ標的配列に相補的なＤＮＡ鎖における少なくとも１個のヌクレオチドに付加する。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、チミン又はグアニンヌクレオチドへのＡＤＰリボースの付加を触媒する。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、ＤａｒＴ酵素又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアントを含む。一部の実施形態では、ＤａｒＴ酵素は、低減されたＤＮＡ結合性、一本鎖ＤＮＡに対する増加した特異性及び／又は減少した酵素活性を有するように操作されている。本明細書に開示されている様々な実施形態において使用され得るＤａｒＴホモログ（及びそのいずれかの断片、誘導体又はバリアント）は、下の表１に提示されているものを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、Ｓｃａｂｉｎ酵素又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアントを含む。一部の実施形態では、Ｓｃａｂｉｎ酵素は、低減されたＤＮＡ結合性、一本鎖ＤＮＡに対する増加した特異性及び／又は減少した酵素活性を有するように操作されている。本明細書に開示されている様々な実施形態において使用され得るＳｃａｂｉｎホモログ（及びそのいずれかの断片、誘導体又はバリアント）は、下の表１に提示されているものを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｍｏｍ酵素は、低減されたＤＮＡ結合性、一本鎖ＤＮＡに対する増加した特異性及び／又は減少した酵素活性を有するように操作されている。本明細書に開示されている様々な実施形態において使用され得るＭｏｍホモログ（及びそのいずれかの断片、誘導体又はバリアント）は、下の表１に提示されているものを含むがこれらに限定されない。
【0080】
【表1】
【0081】
本開示に基づき当業者によって認識される通り、他のＤＮＡ修飾ドメイン／酵素が、所与の標的部位における複製遮断部分の形成を誘導するために、本開示のギャップ編集因子及びギャップ編集因子複合体において使用され得る。例えば、一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメイン／酵素は、次の酵素（又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアント）のいずれかを含むことができるがこれらに限定されない：ピエリシン、Ｓｃａｂｉｎ、細胞周期及びアポトーシス調節因子１（ＣＡＲＰ－１）、ＳＣＯ５４６１タンパク質（ＳｃＡＲＰ）、アデニン修飾酵素、アセチルトランスフェラーゼ、アミノ酸トランスフェラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ウリジルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼ、メチルチオトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ１０、ｔＲＮＡ（Ｍｅｔ）シチジンアセチルトランスフェラーゼ（ＴｍｃＡ）、ｔＲＮＡシチジンアセチルトランスフェラーゼ、ＧＣＮ５関連Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、ライシジンシンターゼ、ｍ７Ｇメチルトランスフェラーゼ、Ｎ６Ｃカルバモイルメチルトランスフェラーゼ（Ｍｏｍ）、Ｎ６－アデノシンスレオニルカルバモイルトランスフェラーゼ、スレオニルカルバモイル（ｃａｒｂｏｍｙｌ）トランスフェラーゼ又はスレオニルカルバモイル（ｃａｒｂｏｍｙｌ）トランスフェラーゼ複合体、ＴｓａＢ－ＴｓａＥ－ＴｓａＤ（ＴｓａＢＤＥ）複合体、ｔＲＮＡ Ｎ６－アデノシンスレオニルカルバモイルトランスフェラーゼ（Ｑｒｉ７、Ｔｃｓ４）、メチルトランスフェラーゼ、ＡＴｒｍ５ａ、ｔＲＮＡ：ｍ１Ｇ／ｉｍＧ２メチルトランスフェラーゼ、ｔＲＮＡ（アデノシン（３７）－Ｎ６）－ジメチルアリルトランスフェラーゼ、ｔＲＮＡジメチルアリルトランスフェラーゼ（ＭｉａＡ）、並びにイソペンテニルトランスフェラーゼ。
【0082】
一部の実施形態では、本開示のギャップ編集因子複合体において使用されるＤＮＡ修飾ドメインは、ゲノムにおける少なくとも１個のヌクレオチドにおける複製遮断部分の形成を誘導する触媒ドメイン（又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアント）を含む。一部の実施形態では、触媒ドメインは、本明細書でさらに記載されている通り、標的核酸のＡＤＰ－リボシル化を実行するのに十分であるＤａｒＴ酵素の部分を含む。一部の実施形態では、触媒ドメインは、本明細書でさらに記載されている通り、標的核酸のＡＤＰ－リボシル化を実行するのに十分であるＳｃａｂｉｎ酵素の部分を含む。
【0083】
例えば、本開示のギャップ編集因子複合体において使用され得るＤＮＡ修飾ドメインの触媒ドメインは、配列番号１８～２１のいずれかと少なくとも７０％アミノ酸同一性を有するいずれかの配列を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１８と少なくとも７５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１８と少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１８と少なくとも８５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１８と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１８と少なくとも９１％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１８と少なくとも９２％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１８と少なくとも９３％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１８と少なくとも９４％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１８と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１８と少なくとも９６％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１８と少なくとも９７％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１８と少なくとも９８％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１８と少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。
【0084】
一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１９と少なくとも７５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１９と少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１９と少なくとも８５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１９と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１９と少なくとも９１％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１９と少なくとも９２％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１９と少なくとも９３％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１９と少なくとも９４％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１９と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１９と少なくとも９６％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１９と少なくとも９７％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１９と少なくとも９８％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号１９と少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。
【0085】
一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２０と少なくとも７５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２０と少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２０と少なくとも８５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２０と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２０と少なくとも９１％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２０と少なくとも９２％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２０と少なくとも９３％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２０と少なくとも９４％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２０と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２０と少なくとも９６％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２０と少なくとも９７％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２０と少なくとも９８％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２０と少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。
【0086】
一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２１と少なくとも７５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２１と少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２１と少なくとも８５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２１と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２１と少なくとも９１％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２１と少なくとも９２％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２１と少なくとも９３％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２１と少なくとも９４％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２１と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２１と少なくとも９６％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２１と少なくとも９７％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２１と少なくとも９８％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２１と少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。
【0087】
一部の実施形態では、本開示のギャップ編集因子複合体において使用され得るＤＮＡ修飾ドメインの触媒ドメインは、配列番号２２～２４のいずれかと少なくとも７０％アミノ酸同一性を有するいずれかの配列を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２２と少なくとも７５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２２と少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２２と少なくとも８５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２２と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２２と少なくとも９１％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２２と少なくとも９２％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２２と少なくとも９３％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２２と少なくとも９４％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２２と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２２と少なくとも９６％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２２と少なくとも９７％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２２と少なくとも９８％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２２と少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。
【0088】
一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２３と少なくとも７５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２３と少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２３と少なくとも８５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２３と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２３と少なくとも９１％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２３と少なくとも９２％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２３と少なくとも９３％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２３と少なくとも９４％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２３と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２３と少なくとも９６％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２３と少なくとも９７％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２３と少なくとも９８％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２３と少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。
【0089】
一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２４と少なくとも７５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２４と少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２４と少なくとも８５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２４と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２４と少なくとも９１％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２４と少なくとも９２％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２４と少なくとも９３％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２４と少なくとも９４％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２４と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２４と少なくとも９６％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２４と少なくとも９７％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２４と少なくとも９８％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２４と少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。
【0090】
一部の実施形態では、本開示のギャップ編集因子複合体において使用されるＤＮＡ修飾ドメインは、Ｍｏｍ（メチルカルバモイルトランスフェラーゼ、メチルカルバモイラーゼ（ｍｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌａｓｅ）又はアセチルトランスフェラーゼとも称される）の触媒ドメイン（又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアント）を含む。触媒ドメインは、本明細書でさらに記載されている通り、標的核酸に転移されるドナー基質としてアセチルＣｏＡを使用してアデニンのメチルカルバモイル化を実行するのに十分であるメチルカルバモイラーゼ酵素の部分を含むことができる。例えば、本開示のギャップ編集因子複合体におけるＤＮＡ修飾ドメインとして使用され得るＭｏｍの触媒ドメインは、配列番号２５～２７のいずれかと少なくとも７０％アミノ酸同一性を有するいずれかの配列を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２５と少なくとも７５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２５と少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２５と少なくとも８５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２５と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２５と少なくとも９１％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２５と少なくとも９２％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２５と少なくとも９３％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２５と少なくとも９４％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２５と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２５と少なくとも９６％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２５と少なくとも９７％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２５と少なくとも９８％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２５と少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。
【0091】
一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２６と少なくとも７５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２６と少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２６と少なくとも８５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２６と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２６と少なくとも９１％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２６と少なくとも９２％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２６と少なくとも９３％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２６と少なくとも９４％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２６と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２６と少なくとも９６％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２６と少なくとも９７％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２６と少なくとも９８％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２６と少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。
【0092】
一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２７と少なくとも７５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２７と少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２７と少なくとも８５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２７と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２７と少なくとも９１％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２７と少なくとも９２％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２７と少なくとも９３％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２７と少なくとも９４％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２７と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２７と少なくとも９６％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２７と少なくとも９７％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２７と少なくとも９８％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、配列番号２７と少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有する触媒ドメインを含む。
【0093】
複製遮断部分。当業者は、本開示に基づき、複製遮断部分が、グルコース、スレオニルカルバモイルアデノシン、アセテート、グリセリル、Ｌ－アスコルビン酸、ウリジン、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸リボース、メチルカルバモイル、脂質、アミノ酸、アグマチン、Ｌ－スレオニルカルバモイルアデニル酸、Ｌ－スレオニルカルバモイル、メチルチオレート、硫黄、メチル基、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン又はＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニンのサブグループ、及びジメチルアリル二リン酸又はそのサブグループを含むことができるがこれらに限定されないことを認識する。上述及び他の複製遮断部分は、ＤＮＡ複製が遮断され、相同配列指向性ギャップ修復が誘導されるように、標的配列におけるヌクレオチドに官能性付与することが可能であるという一般特色を有する。これは、酵素手段又は酵素非依存的手段によって発生し得る。
【0094】
ガイドＲＮＡ。本開示の実施形態はまた、少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子を含むことができるギャップ編集因子及びギャップ編集因子複合体を含む。このような実施形態に従って、ガイドＲＮＡ分子は、ハンドル配列及び標的化配列を含む。標的化配列は、標的核酸における配列と相互作用し、ハンドル配列は、ギャップ編集因子又はギャップ編集因子複合体の結合を容易にする。本開示に基づき当業者によって認識される通り、シングルキメラガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、アニーリングされたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡの構造を模倣することができる；ｇＲＮＡアプローチは、２つの構成成分（例えば、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ）のみを有する単純化されたシステムを提供するため、この型のガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡよりも広く使用されるようになった。よって、核酸標的への配列特異的結合は、天然デュアルＲＮＡ複合体（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣａｓ９を含む）又はキメラシングルガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９）によってガイドされ得る（例えば、Ｊｉｎｅｋら（２０１２）「Ａ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｄｕａｌ－ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６～８２１を参照）。複数のｇＲＮＡは、ヌクレアーゼによって利用されるｃｒＲＮＡを天然にコードするＣＲＩＳＰＲアレイを使用してさらに発現され得る。ｇＲＮＡはまた、プロモーター及びターミネーターに作動可能に連結されることにより、別々に発現され得る。ｇＲＮＡはまた、リボザイムなどの介在するＲＮＡ切断部位、又はＲＮａｓｅ Ｐ、ＲＮａｓｅ Ｚ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ若しくはＣｓｙ４などのＲＮＡ切断酵素によって認識される部位を含むことにより、単一の転写物において融合され得る。ｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡは、ｃＤＮＡ修復鋳型への逆転写のためのＲＮＡ鋳型を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ギャップ編集因子複合体又はギャップ編集因子標的部位にアクセサリーゲノム編集因子をリクルートできるように、アプタマー配列、例えば、ＲＮＡ結合タンパク質認識部位を含むことができる。
【0095】
本明細書でさらに記載されている通り、本開示のギャップ編集因子を使用したゲノム修飾は、単一のヌクレオチド変化から大型の挿入又は欠失に及ぶ特異的ヌクレオチド修飾を生成することができる。一部の実施形態では、本開示のギャップ編集因子複合体は、ゲノムにおける別個の部位を標的化するための２種以上のガイドＲＮＡ配列の使用による、ＤＮＡの大型の配列の付加、交換及び／又は除去に使用され得る。例えば、大型のゲノム欠失は、２個のｇＲＮＡ標的部位の間の配列を除去する及び／又は外因性ＤＮＡ配列を挿入することにより生成され得る（例えば、細胞又は生物における内因性修復／組換え機構に基づいて）。一部の実施形態では、複数のｇＲＮＡが、ゲノムにおけるいずれかの数の所望の修飾を生成するために、ゲノムにおける複数の部位の標的化に使用され得る（例えば、マルチプレックス化）。
【0096】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ分子は、本開示のギャップ編集因子複合体において要求されない。例えば、本明細書に記載されている組成物及び方法のある特定の実施形態は、効率的なゲノム編集及び修飾を実現するためにガイドＲＮＡを要求しない。上に記載される通り、このようなギャップ編集因子複合体は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー（ＺＦ）及び転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を含むがこれらに限定されない。
【0097】
ドナー鋳型。一部の実施形態では、ドナー核酸鋳型の存在は、二本鎖標的ＤＮＡ分子中に組み換えられるドナー核酸鋳型又はその断片を含む、相同配列指向性ギャップ組換え及び／又は修復を容易にする。一部の実施形態では、ドナーＤＮＡ鋳型は、ゲノム中にコピーされる外因性ＤＮＡ又はＲＮＡによってコードされる配列をもたらす複製鋳型として機能することができるが、外因性ＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチド分子それ自体は、ゲノム中に直接的に転移されない。ドナー核酸鋳型は、一本鎖又は二本鎖であり得る。一部の実施形態では、ドナー鋳型は、内因性の、発現された、合成の又は送達されたＲＮＡから逆（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）転写されたｃＤＮＡである。ドナー核酸は、プラスミド又は直鎖状ＤＮＡとして細胞内に送達され得る。ドナー核酸はまた、逆転写酵素によって鋳型リボ核酸からインビボで生成され得る。他の実施形態では、ドナー核酸それ自体が、リボ核酸であり得る。ドナー核酸は、化学修飾を含有することもできる。ドナー核酸は、ギャップ編集因子複合体又はギャップ編集因子標的部位に特異的にリクルートされる化学修飾又は配列を含むことができる。
【0098】
一部の実施形態では、ドナー核酸鋳型は、ＤＮＡ標的配列に対応する内因性相同配列由来のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ドナー核酸鋳型は、内因性アレル由来のポリヌクレオチドを含む（例えば、ヘテロ接合性の喪失を容易にするために）。一部の実施形態では、ドナー核酸鋳型は、外因性一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子又は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を含む。一部の実施形態では、ドナー核酸鋳型の存在は、相同配列指向性ギャップ修復及び／又は組換えを容易にし、ドナー核酸鋳型又はその断片は、ＤＮＡ標的配列のゲノム中に組み換えられる。このような実施形態に従って、本開示のギャップ編集因子は、大型のドナーＤＮＡ配列の挿入、ＤＮＡの大型のセグメントの置換え、及び／又はゲノムにおける大型のＤＮＡ配列の除去に特に有利であり得る。一部の実施形態では、本開示のギャップ編集因子複合体は、ゲノムにおける別個の部位を標的化するための２種以上のガイドＲＮＡ配列の使用による、ＤＮＡの大型の配列の付加、交換及び／又は除去に使用され得る。例えば、大型のゲノム欠失は、２個のｇＲＮＡ標的部位の間の配列を除去する及び／又は外因性ＤＮＡ配列を挿入することにより生成され得る（例えば、細胞又は生物における内因性修復／組換え機構に基づいて）。一部の実施形態では、複数のｇＲＮＡが、ゲノムにおけるいずれかの数の所望の修飾を生成するために、ゲノムにおける複数の部位の標的化に使用され得る（例えば、マルチプレックス化）。
【0099】
アクセサリー因子。一部の実施形態では、本開示の組成物及びシステムは、１種のギャップ編集因子アクセサリー因子をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つのギャップ編集因子アクセサリー因子をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのギャップ編集因子アクセサリー因子は、ゲノム修飾過程における少なくとも１つのステップを増強するタンパク質を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのギャップ編集因子アクセサリー因子は、ＤＮＡ修飾ドメイン、ＤＮＡ認識ドメイン及び／又は少なくとも１つのガイドＲＮＡとの相互作用を介してギャップ編集因子複合体にリクルートされる。一部の実施形態では、ギャップ編集因子複合体への少なくとも１つのギャップ編集因子アクセサリー因子のリクルートメントは、ペプチドタグ、ペプチドリンカー、ＲＮＡタグ及びこれらのいずれかの組合せを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのギャップ編集因子アクセサリー因子は、Ｒａｐ、ＤａｒＧ、Ｏｒｆ、ＥｘｏＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ＰｒｉｍＰｏｌ、ＲｅｃＪ、ＲｅｃＱ１、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５２、ＣｔＩＰ、Ｒａｄ１８及びこれらのいずれかの組合せを含む。一部の実施形態では、また、本明細書でさらに記載されている通り、本開示は、ＤＮＡ修飾ドメインがＤａｒＴを含む、ギャップ編集因子複合体を含むことができる。このような実施形態に従って、ＤａｒＧ、ＴＡＲＧ１又は別のグリコヒドラーゼ（ｇｌｙｃｏｈｙｄｏｌａｓｅ）ドメインは、オフターゲット編集をモジュレートする（例えば、ＤａｒＴ活性を減弱する）又はＨＤＧＲが発生した後に、付加されたＡＤＰｒを除去することにより、ギャップ編集因子アクセサリー因子として含まれ得る。
【0100】
本開示に基づき当業者によって認識される通り、細胞内にギャップ編集因子及びギャップ編集因子複合体を送達するための方法は、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド／タンパク質を送達するためのいずれかの現在公知の方法及びシステムを含む。例えば、ギャップ編集因子及びギャップ編集因子複合体は、プラスミドＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、又は、脂質に基づく送達システム（例えば、カチオン性脂質を使用した）、ドナー細胞からのコンジュゲーション、ウイルス／バクテリオファージに基づく送達システム及び化学物質に基づくシステム（例えば、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリブレン）を含むがこれらに限定されない、ポリヌクレオチド分子を送達するための他の手段を使用して送達され得る。一部の実施形態では、送達システムは、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド／タンパク質（又はこれらのいずれかの組合せ）として本開示のギャップ編集因子及びギャップ編集因子複合体を送達するための機械的及び／又は電気的なデバイス及び方法を含むことができる。一部の実施形態では、ギャップ編集因子及びギャップ編集因子複合体は、遺伝子銃（例えば、微粒子銃（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）及び植物細胞に対して使用されるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換）及び電気穿孔に基づく方法、並びにポリヌクレオチド及びポリペプチド／タンパク質を送達するための手段として膜破壊を使用する他のいずれかの物理的方法（例えば、機械的、電気的、熱的、光学的、化学的刺激、その他）を使用して送達される（例えば、Ｓｕｎら、Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏ／ｎａｎｏｓｃａｌｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３、１８（２０２０）を参照）。
【0101】
３．キット、システム及び方法
本開示の実施形態はまた、核酸の標的化修飾のためのキット及びシステムを含む。このような実施形態に従って、キットは、ＤＮＡ認識ドメイン及びＤＮＡ修飾ドメインを含むギャップ編集因子複合体を含む。一部の実施形態では、キットは、少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子も含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメインは、ゲノムにおけるＤＮＡ標的配列に結合し、ＤＮＡ修飾ドメインは、ゲノムにおける少なくとも１個のヌクレオチドに複製遮断部分の形成を誘導する。本開示に基づき当業者によって認識される通り、キット及びシステムは、本明細書に記載されている遺伝子修飾組成物の他の構成成分（例えば、ギャップ編集因子アクセサリー因子）のうち１つ以上を含むこともできる。キットの一部の実施形態では、組成物は、ドナー核酸鋳型をさらに含む。キットの一部の実施形態では、ドナー核酸鋳型の存在は、相同配列指向性ギャップ修復及び／又は組換えを容易にする。
本開示の実施形態はまた、核酸の標的化修飾のためのキット及びシステムを含む。このような実施形態に従って、キットは、ＤＮＡ認識ドメイン及びＤＮＡ修飾ドメインを含むギャップ編集因子複合体を含む。一部の実施形態では、キットは、少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子も含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメインは、ゲノムにおけるＤＮＡ標的配列に結合し、ＤＮＡ修飾ドメインは、ゲノムにおける少なくとも１個のヌクレオチドに複製遮断部分の形成を誘導する。本開示に基づき当業者によって認識される通り、キット及びシステムは、本明細書に記載されている遺伝子修飾組成物の他の構成成分（例えば、ギャップ編集因子アクセサリー因子）のうち１つ以上を含むこともできる。キットの一部の実施形態では、組成物は、ドナー核酸鋳型をさらに含む。キットの一部の実施形態では、ドナー核酸鋳型の存在は、相同配列指向性ギャップ修復及び／又は組換えを容易にする。
【0102】
キットの一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメインは、デオキシリボヌクレアーゼ活性を欠如する少なくとも１個のＣａｓタンパク質又はその断片を含む。キットの一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメインは、ニッカーゼ活性を有する少なくとも１個のＣａｓタンパク質又はその断片を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質複合体は、Ｉ型カスケード、ＩＩ型Ｃａｓ９、ＩＶ型エフェクターモジュール、Ｖ型Ｃａｓ１２、Ｃａｓ９関連ＩｓｃＢ、Ｃａｓ９関連ＴｎｐＢ及びこれらの組合せを含む。
【0103】
キットの一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメイン及びＤＮＡ修飾ドメインは、機能的にカップリングされている。キットの一部の実施形態では、ＤＮＡ認識ドメインは、ＤＮＡ標的鎖における一本鎖切断を誘導し、ＤＮＡ修飾ドメインは、複製遮断部分を、ＤＮＡ標的配列に相補的なＤＮＡ鎖における少なくとも１個のヌクレオチドに付加する。キットの一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、チミン又はグアニンヌクレオチドへのＡＤＰリボースの付加を触媒する。一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、ＤａｒＴ酵素又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアントを含む。キットの一部の実施形態では、ＤａｒＴ酵素は、低減されたＤＮＡ結合性、一本鎖ＤＮＡに対する増加した特異性及び／又は減少した酵素活性を有するように操作されている。
【0104】
キットの一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、グルコース、スレオニルカルバモイルアデノシン、アセテート、グリセリル、Ｌ－アスコルビン酸、ウリジン、アデノシン一リン酸、脂質、アミノ酸、アグマチン、Ｌ－スレオニルカルバモイルアデニル酸、Ｌ－スレオニルカルバモイル、メチルチオレート、硫黄、メチル基、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン又はＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニンのサブグループ、及びジメチルアリル二リン酸又はそのサブグループからなる群から選択される複製遮断部分の付加を触媒する。キットの一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾酵素ドメインは、ピエリシン、Ｓｃａｂｉｎ、細胞周期及びアポトーシス調節因子１（ＣＡＲＰ－１）、ＳＣＯ５４６１タンパク質（ＳｃＡＲＰ）、アデニン修飾酵素、アセチルトランスフェラーゼ、アミノ酸トランスフェラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ウリジルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼ、メチルチオトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ１０、ｔＲＮＡ（Ｍｅｔ）シチジンアセチルトランスフェラーゼ（ＴｍｃＡ）、ｔＲＮＡシチジンアセチルトランスフェラーゼ、ＧＣＮ５関連Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、ライシジンシンターゼ、ｍ７Ｇメチルトランスフェラーゼ、Ｎ６カルバモイルメチルトランスフェラーゼ（Ｍｏｍ）、Ｎ６－アデノシンスレオニルカルバモイルトランスフェラーゼ、スレオニルカルバモイル（ｃａｒｂｏｍｙｌ）トランスフェラーゼ又はスレオニルカルバモイル（ｃａｒｂｏｍｙｌ）トランスフェラーゼ複合体、ＴｓａＢ－ＴｓａＥ－ＴｓａＤ（ＴｓａＢＤＥ）複合体、ｔＲＮＡ Ｎ６－アデノシンスレオニルカルバモイルトランスフェラーゼ（Ｑｒｉ７、Ｔｃｓ４）、メチルトランスフェラーゼ、ＡＴｒｍ５ａ、ｔＲＮＡ：ｍ１Ｇ／ｉｍＧ２メチルトランスフェラーゼ、ｔＲＮＡ（アデノシン（３７）－Ｎ６）－ジメチルアリルトランスフェラーゼ、ｔＲＮＡジメチルアリルトランスフェラーゼ（ＭｉａＡ）、並びにイソペンテニルトランスフェラーゼからなる群から選択される酵素又はその機能的断片、誘導体若しくはバリアントを含む。
【0105】
キットの一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ又はこれらのいずれかの組合せを含む。キットの一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、ハンドル配列及び標的化配列を含む。キットの一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡにおける標的化配列は、ＤＮＡ標的配列に相補的である。一部の実施形態では、本開示のギャップ編集因子複合体は、ゲノムにおける別個の部位を標的化するための２種以上のガイドＲＮＡ配列の使用による、ＤＮＡの大型の配列の付加、交換及び／又は除去に使用され得る。例えば、大型のゲノム欠失は、２個のｇＲＮＡ標的部位の間の配列を除去する及び／又は外因性ＤＮＡ配列を挿入することにより生成され得る（例えば、細胞又は生物における内因性修復／組換え機構に基づいて）。一部の実施形態では、複数のｇＲＮＡが、ゲノムにおけるいずれかの数の所望の修飾を生成するために、ゲノムにおける複数の部位の標的化に使用され得る（例えば、マルチプレックス化）。
【0106】
本開示の実施形態はまた、核酸の標的化修飾のための方法を含む。このような実施形態に従って、方法は、本明細書に記載されているゲノム修飾組成物の構成成分のいずれかを導入するステップ、及び当技術分野で公知の技法を使用して所望の遺伝学的変更の存在について細胞を評価するステップを含む。方法の一部の実施形態では、構成成分は、ＤＮＡ認識ドメイン及びＤＮＡ修飾ドメインを含むギャップ編集因子及びギャップ編集因子複合体、少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子、並びにドナー核酸鋳型を含む。一部の実施形態では、１つ以上のギャップ編集因子アクセサリー因子も含まれてよい。このような因子の１つ以上は、当技術分野で公知の手段によって、ポリペプチド（複数可）、ｍＲＮＡ（複数可）及び／若しくはＤＮＡ発現構築物（複数可）又はこれらのいずれかの組合せとして細胞又は生物に導入され得る。本開示に基づき当業者によって認識される通り、ギャップ編集因子組成物、システム及び方法は、ヒト、植物、家畜その他を含むがこれらに限定されない、生物全体の修飾を容易にするために使用され得る。
【0107】
方法の一部の実施形態では、これらの構成成分のうち少なくとも１種は、遺伝子駆動システムの一部として細胞に導入される。遺伝子駆動システムにおいて、ＤＮＡ認識ドメイン、ＤＮＡ修飾ドメイン、ｇＲＮＡ及びアクセサリー因子などのゲノム修飾構成成分の全て又は一部は、染色体の１コピーに存在するドナー核酸配列内にコードされる。ｇＲＮＡは、ドナー核酸配列が存在する領域において、姉妹染色体にＤＮＡ修飾ドメインを方向付ける。ギャップ編集因子タンパク質又は複合体による標的化の後に、ドナー核酸（ギャップ編集因子システムもコードする）は、新しい染色体にコピーされる。よって、ギャップ編集因子システムは、自己繁殖し、ホモ接合性に編集された生物を効率的に形成するようになる。遺伝子駆動が実行され得る生物の例は、真菌、扁形動物、蚊及びマウスを含む。
【0108】
一部の実施形態では、本開示の組成物、システム及び方法は、遺伝子修飾の１つ以上の側面を増強又は改善する１つ以上の構成成分を含む。一部の実施形態では、ゲノム修飾の１つ以上の側面の改善又は増強は、上に記載される通り、ギャップ編集因子アクセサリー因子（複数可）の使用を含む。一部の実施形態では、ゲノム修飾の１つ以上の側面を増強又は改善する方法は、ゲノム修飾が望まれる細胞におけるヌクレアーゼ活性を低減又は減弱するステップを含む。細胞におけるヌクレアーゼ活性を低減するステップは、増強又は改善された修飾頻度及び／又は効率をもたらすことができる。一部の実施形態では、細胞におけるヌクレアーゼ活性を低減するステップは、当技術分野で公知のいずれかの手段によって、内因性ＡＰエンドヌクレアーゼ（例えば、ｘｔｈＡによってコードされる）の活性を低減するステップを含む。一部の実施形態では、細胞におけるヌクレアーゼ活性は、遺伝学的手段により及び／又は薬理学的手段によって低減され得る（例えば、ＡＪＡＹ－４、ＣＲＴ００４４８７６、アウリントリカルボン酸、６－ヒドロキシ－ＤＬ－ＤＯＰＡ、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｌｕｅ ２、ミリセチン、ミトキサントロン、メチル－３，４－デホスタチン（ｄｅｐｈｏｓｔａｔｉｎ）、チオラクトマイシン及び（２Ｅ）－３－［５－（２，３－ジメトキシ－６－メチル－１，４－ベンゾキノイル（ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｙｌ））］－２－ノニル－２－プロペン酸（Ｅ３３３０）を含むがこれらに限定されないエンドヌクレアーゼ阻害剤による処置）。
【0109】
本明細書に提供される組成物、システム及び方法の実施形態は、細胞のゲノムを編集するために使用され得る。細胞は、原核細胞、真核細胞又は植物細胞であり得る。一部の実施形態では、細胞は、哺乳類細胞である。本開示はまた、本明細書に記載されている構成成分又はシステムのいずれかを含む単離された細胞を提供する。例示的な細胞は、容易にかつ確実に育成され得、合理的に速い成長速度を有し、十分に特徴付けされた発現系を有し、容易にかつ効率的に形質転換又はトランスフェクトされ得る細胞を含むことができるものを含む。適した原核細胞の例は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・ブレビ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）など）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）（クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）又はクロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）など）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（Ｅ．コリなど）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、粘液細菌（Ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）（ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）又はビブリオ・ヌトリファシエンス（Ｖｉｂｒｉｏ ｎｕｔｒｉｆａｃｉｅｎｓ）など）及びエンビニア属（Ｅｎｖｉｎｉａ）由来の細胞を含むがこれらに限定されない。適した真核細胞は、当技術分野で公知であり、例えば、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳類細胞を含む。適した酵母細胞の例は、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、リノスポリジウム属（Ｒｈｉｎｏ－ｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びシゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）由来の酵母細胞を含む。例示的な昆虫細胞は、Ｓｆ－９及びＨＩＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）を含み、例えば、Ｋｉｔｔｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４：８１０～８１７（１９９３）；Ｌｕｃｋｌｏｗ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４：５６４～５７２（１９９３）；及びＬｕｃｋｌｏｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：４５６６～４５７９（１９９３）に記載されている。
【0110】
一部の実施形態では、本開示の組成物及び方法は、インビボ及び／又はエクスビボ及び／又はインビトロで、有糸分裂又は有糸分裂後細胞においてＤＮＡ修飾及び／又は転写モジュレーションを誘導するために用いることができる（例えば、個体に再導入され得る遺伝学的に修飾された細胞を産生するために）。本開示のギャップ編集因子は、部位特異的ＤＮＡ標的化を含むため、有糸分裂及び／又は有糸分裂後の目的の細胞は、いかなる生物由来の細胞（例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単一細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻類細胞、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、クラミドモナス・レインハルドチー（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、サルガッスム・パテンス、Ｃ．アガード（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ Ｃ．Ａｇａｒｄｈ）、その他、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線形動物など）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）由来の細胞、哺乳類由来の細胞、齧歯類由来の細胞、ヒト由来の細胞など）を含むこともできる。いかなる型の細胞が、目的のものであってもよい（例えば、幹細胞、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞；体細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋肉細胞、骨細胞、肝細胞、膵細胞；いずれかのステージの胚のインビトロ又はインビボ胚性細胞、例えば、１細胞、２細胞、４細胞、８細胞などのステージのゼブラフィッシュ胚；など）。細胞は、樹立細胞株に由来し得る、又は初代細胞であり得、ここで、「初代細胞」、「初代細胞株」及び「初代培養」は、対象に由来し、限られた培養継代数にわたりインビトロで育成された、細胞及び細胞培養物を指すように本明細書で互換的に使用されている。標的細胞は、いかなる単細胞生物、多細胞生物、又は培養で育成されたいかなる細胞を含むこともできる。
【0111】
一部の実施形態では、細胞は、治療目的で使用される細胞であってもよい。細胞は、哺乳類細胞であり得、一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。多数の適した哺乳類及びヒト細胞は、当技術分野で公知であり、その多くは、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）から入手できる。適した哺乳類細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ ＤＨＦＲ－細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：４２１６～４２２０（１９８０））、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３又は２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３）及び３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ９２）を含むがこれらに限定されない。他の適した哺乳類細胞株は、サルＣＯＳ－１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１６５０）及びＣＯＳ－７細胞株（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）並びにＣＶ－１細胞株（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ７０）である。さらに例示的な哺乳類細胞は、形質転換された細胞株を含む、霊長類、齧歯類及びヒト細胞株を含む。正常二倍体細胞、初代組織や初代外植片のインビトロ培養に由来する細胞系統も適している。他の適した哺乳類細胞株は、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、ＨＥＫ、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、マウスＬ－９２９細胞及びＢＨＫ又はＨａＫハムスター細胞株を含むがこれらに限定されない。適した細胞を選択するための方法、並びに細胞の形質転換、培養、増幅、スクリーニング及び精製のための方法は、当技術分野で公知である。適した植物細胞株の例は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（ランズバーグエレクタ（Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ ｅｒｅｃｔａ）細胞株など）、サトウキビ、トマト、エンドウマメ、イネ、コムギ、タバコ（ＢＹ－２細胞株など）などの植物に由来する。
【0112】
上述の実施形態に記載されている方法に従って、本開示の組成物及びシステムは、インデル形成、染色体再編成又はＤＮＡ重複の程度を低減させる様式で細胞のゲノムを編集するために使用され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されている組成物、システム及び方法は、少なくとも一部には、標的核酸における二本鎖切断の欠如により、現在利用できる方法と比較して細胞毒性を低減させる。
【0113】
４．材料と方法
電気穿孔によってＥ．コリの中にＣａｓ９などのＤＮＡ結合ドメインに融合されたＤＮＡ修飾ドメイン（例えば、ＤａｒＴ－ＳｃｄＣａｓ９）及びｓｇＲＮＡ及び核酸ドナーを同時形質転換し、ＬＢ寒天プラス適切な抗生物質（複数可）上にプレーティングすることにより、比色アッセイによるＥ．コリにおけるギャップ編集の測定を行った。その結果生じたコロニーを採取し、ディープウェルプレートにおける７５０ｍＬの液体ＬＢ培地に播種し、３７℃で１２～１６時間にわたり一晩、９００ｒｐｍで振盪した。一晩培養物を抗生物質、１ｍＭ ＩＰＴＧ及び３３ｍＭアラビノースを有する７５０ｍＬの液体ＬＢ培地へと１：５００希釈し、８時間にわたり９００ｒｐｍで振盪することにより、ギャップ編集因子発現を誘導した。８時間後に、抗生物質、ＩＰＴＧ及びＸ－ｇａｌを有するＬＢ寒天上のスポットプレーティングのために試料を除去した。翌日、白い及び青いコロニーを計数して、ｌａｃＺ組換え及び修復の頻度を決定した。サンガー配列決定によって修復を確認した。
電気穿孔によってＥ．コリの中にＣａｓ９などのＤＮＡ結合ドメインに融合されたＤＮＡ修飾ドメイン（例えば、ＤａｒＴ－ＳｃｄＣａｓ９）及びｓｇＲＮＡ及び核酸ドナーを同時形質転換し、ＬＢ寒天プラス適切な抗生物質（複数可）上にプレーティングすることにより、比色アッセイによるＥ．コリにおけるギャップ編集の測定を行った。その結果生じたコロニーを採取し、ディープウェルプレートにおける７５０ｍＬの液体ＬＢ培地に播種し、３７℃で１２～１６時間にわたり一晩、９００ｒｐｍで振盪した。一晩培養物を抗生物質、１ｍＭ ＩＰＴＧ及び３３ｍＭアラビノースを有する７５０ｍＬの液体ＬＢ培地へと１：５００希釈し、８時間にわたり９００ｒｐｍで振盪することにより、ギャップ編集因子発現を誘導した。８時間後に、抗生物質、ＩＰＴＧ及びＸ－ｇａｌを有するＬＢ寒天上のスポットプレーティングのために試料を除去した。翌日、白い及び青いコロニーを計数して、ｌａｃＺ組換え及び修復の頻度を決定した。サンガー配列決定によって修復を確認した。
【0114】
電気穿孔によってＣａｓ９又はＣａｓ１２ａなどのＤＮＡ結合ドメインに融合されたＤＮＡ修飾ドメイン、及びｓｇＲＮＡと核酸ドナーを同時形質転換することにより、抗生物質抵抗性アッセイによるＥ．コリにおけるギャップ編集の測定を行った。形質転換混合物をＬＢ寒天プラス適切な抗生物質上にプレーティングした。その結果生じたコロニーを採取し、ディープウェルプレートにおける７５０ｍＬの液体ＬＢ培地に播種し、３０℃で１２～１６時間にわたり一晩、９００ｒｐｍで振盪した。ギャップ編集因子培養物を先ず、抗生物質を有する液体ＬＢへと１：１００で戻し希釈（ｂａｃｋ－ｄｉｌｕｔｅ）し、３７℃で１時間振盪した。次に、この培養物を抗生物質及び３３ｍＭアラビノースを有する７５０ｍＬの液体ＬＢ培地へと１：１００でさらに希釈し、５時間にわたり９００ｒｐｍで振盪することにより、ギャップ編集因子発現を誘導した。５時間の誘導後に、２枚の別々のＬＢ寒天プレート上のスポットプレーティングのために試料を除去した。一方のプレートは、ギャップ編集因子、ｓｇＲＮＡ及び修復鋳型のみについて選択するために抗生物質（典型的に、クロラムフェニコール及びアンピシリン）を含有し、他方のプレートもまた、編集された細胞を選択するためにリファンピシン又はカナマイシンのいずれかを含んだ。翌日、コロニーを計数した。ゲノム編集効率は、リファンピシン又はカナマイシンを含有しないプレート上のコロニーの数で割った、リファンピシン又はカナマイシンを含有するプレート上のコロニーの数として作表した。
【0115】
相同組換えにおける重要な因子であるｒｅｃＡを欠如するＥ．コリ系統の中にＤａｒＴ－ＳｃｄＣａｓ９ギャップ編集因子を同時形質転換することにより、図７におけるギャップ編集因子毒性の測定を行った。このような細菌は、相同組換えによる傷害迂回のための能力を欠如し、よって、ＤＮＡにおける複製遮断傷害に対して高度に感受性である。よって、ＤＮＡ修飾ドメインは、その潜在的ＤＮＡ結合活性が含有されない限りにおいて、このような系統において特に毒性があることが予想される。この様式で、本出願人らは、望ましくないオフターゲットＤＮＡ修飾についてギャップ編集因子複合体をより容易に評価することができる。形質転換及びプレーティングの後に、単一のコロニーを選択し、ディープウェルプレートにおける７５０ｍＬのＬＢクロラムフェニコールに播種し、３７℃で一晩振盪した。翌日、培養物を、グルコースを有するＬＢクロラムフェニコールへと１：５００で戻し希釈して、ギャップ編集因子抑制を維持した、又はアラビノースを有するＬＢクロラムフェニコールへと１：５００で戻し希釈して、ギャップ編集因子の発現を誘導した。培養物を、３７℃で５時間、ディープウェルプレートにおいて９００ｒｐｍで振盪しつつインキュベートした。次に、培養物をＬＢクロラムフェニコール上にスポットプレーティングした。翌日、コロニーを計数して、最終細胞密度、したがって、オフターゲットＤＮＡ修飾の率を評価した。
【0116】
鎖アニーリングベータリコンビナーゼプラスミド及びＣａｓ９などのＤＮＡ結合ドメインに融合されたＤＮＡ修飾ドメインを先ず同時形質転換することにより、リファンピシン抵抗性によるＥ．コリにおけるｓｓＤＮＡ鋳型ギャップ編集の測定を行った。その結果生じたクローンを、ベータリコンビナーゼ発現の誘導のためにＬＢ、抗生物質及びアンヒドロテトラサイクリンに播種した。このような培養物を電気穿孔に備え、ｓｇＲＮＡプラスミドで形質転換し、３７℃で、２５０ＲＰＭで振盪しつつ富栄養培地において３時間培養し、その後、２枚の別々のＬＢ寒天プレート上のスポットプレーティングを行った。一方のプレートは、ギャップ編集因子、ｓｇＲＮＡ及びリコンビナーゼのみについて選択するために抗生物質を含有した。他方のプレートはその上、編集された細胞を選択するためにリファンピシンを含んだ。翌日、コロニーを計数した。ゲノム編集効率は、リファンピシンを含有しないプレート上のコロニーの数で割った、リファンピシンを含有するプレート上のコロニーの数として作表した。
【0117】
【表2】
【実施例】
【0118】
５．実施例
当業者にとって、本明細書に記載されている本開示の方法の他の適した修飾及び適応を容易に適用及び認識でき、本開示又は本明細書に開示されている態様及び実施形態の範囲から逸脱することなく、適した均等物を使用して為すことができることが容易に明らかとなる。本開示について詳細に記載してきたが、これは、次の実施例を参照することによってより明らかに理解され、次の実施例は、単に、本開示の一部の態様及び実施形態を説明することのみを意図されるものであり、本開示の範囲の限定として考慮されるべきではない。本明細書に参照されているあらゆる雑誌参考文献、米国特許及び刊行物の開示は、これによりそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
当業者にとって、本明細書に記載されている本開示の方法の他の適した修飾及び適応を容易に適用及び認識でき、本開示又は本明細書に開示されている態様及び実施形態の範囲から逸脱することなく、適した均等物を使用して為すことができることが容易に明らかとなる。本開示について詳細に記載してきたが、これは、次の実施例を参照することによってより明らかに理解され、次の実施例は、単に、本開示の一部の態様及び実施形態を説明することのみを意図されるものであり、本開示の範囲の限定として考慮されるべきではない。本明細書に参照されているあらゆる雑誌参考文献、米国特許及び刊行物の開示は、これによりそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0119】
本開示は、次の非限定的な実施例によって説明される複数の態様を有する。
【0120】
［実施例１］
本開示のギャップ編集因子複合体の効率及び毒性を評価するための実験を行った。１セットの実験において、減弱性突然変異Ｇ４９Ｄを有するＥ．コリＥＰＥＣ由来のＤａｒＴ酵素を、長い可動性リンカーにより、完全に又は部分的に触媒失活バージョンのＳｃＣａｓ９（ＳｃｎＣａｓ９としても知られるＳｃｄＣａｓ９又はＳｃＣａｓ９ Ｄ１０Ａ）のＮ末端に融合した。化学修飾は、発生する場合、そのＤＮＡ標的へのＳｃｄＣａｓ９結合によって露出された非標的鎖に作製されることが仮定された。以前の研究は、ＤａｒＴが、おそらくＴＹＴＮほどの広さの配列モチーフ内のチミンを修飾することを指し示した。したがって、このようなギャップ編集因子複合体を使用して、Ｅ．コリにおけるゲノム編集を評価した。
本開示のギャップ編集因子複合体の効率及び毒性を評価するための実験を行った。１セットの実験において、減弱性突然変異Ｇ４９Ｄを有するＥ．コリＥＰＥＣ由来のＤａｒＴ酵素を、長い可動性リンカーにより、完全に又は部分的に触媒失活バージョンのＳｃＣａｓ９（ＳｃｎＣａｓ９としても知られるＳｃｄＣａｓ９又はＳｃＣａｓ９ Ｄ１０Ａ）のＮ末端に融合した。化学修飾は、発生する場合、そのＤＮＡ標的へのＳｃｄＣａｓ９結合によって露出された非標的鎖に作製されることが仮定された。以前の研究は、ＤａｒＴが、おそらくＴＹＴＮほどの広さの配列モチーフ内のチミンを修飾することを指し示した。したがって、このようなギャップ編集因子複合体を使用して、Ｅ．コリにおけるゲノム編集を評価した。
【0121】
ＤａｒＴ－ＳｃｄＣａｓ９融合タンパク質（ギャップ編集因子複合体）を、非標的鎖にＮＧＧ又はＮＡＧ ＰＡＭ及びＴＴＴＣモチーフを含有する４個の部位へと標的化した。この４個の部位は、ゲノム修飾の所望の部位であるｌａｃＺ遺伝子における中途終止コドンを囲んだ。複製遮断傷害が導入された場合、中途終止コドンに重複したＤＮＡギャップが形成されるように、標的を選んだ。この４個の部位は、２個のラギング鎖標的及び２個のリーディング鎖標的を含んだ。アラビノース誘導性ＤａｒＴ－ＳｃｄＣａｓ９をコードするプラスミドを、突然変異をコードする１．５ｋｂ修復鋳型を含有するプラスミドと共に同時形質転換して、ｌａｃＺ終止コドンを修復しつつＳｃｄＣａｓ９再標的化を遮断した。これらのコロニーを一晩培養した後に、細胞を誘導培地へと戻し希釈し、８時間培養し、次いで、β－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子産物）指標色素Ｘ－ｇａｌと誘導因子ＩＰＴＧを有する選択培地上にプレーティングした。
【0122】
１個の部位のみを標的化する場合、ｌａｃＺ遺伝子は、図１の結果によって実証される通り効率的に修復された。しかし、この部位の標的化は、非標的化条件と比較した、ＣＦＵの、１０分の１への降下、及びＳｃｄＣａｓ９対照と比較した、ＣＦＵの、５０分の１への降下を含んだ。この観察された細胞傷害性は、広範なＤＮＡ複製遮断を導入した、ｓｓＤＮＡへのＤａｒＴのＳｃｄＣａｓ９非依存的結合によるものである可能性がある。ＤａｒＴ内のＤＮＡ結合を減弱させることにより、ＤａｒＴが、ＤＮＡ結合に関してＳｃｄＣａｓ９にさらに依存し得ることが仮定された。コンピュータ処理による予測ツールを使用して、潜在的ＤＮＡ結合部位を同定した。予測精度を改善するために、ある程度の配列相違を有するＤａｒＴホモログのセットを同定し、これらのホモログの全てについて、ＤＮＡ結合部位が予測された。タンパク質及びＤＮＡ予測を整列することにより、いくつかのＤＮＡ結合部位予測は、これらのＤａｒＴホモログにわたって保存されていることが見出された。これに基づき、アラニン突然変異をこれらの予測される部位に導入した。一例では、Ｋ５６Ａ突然変異は、効率的なゲノム修飾活性を維持しつつ、ＤａｒＴ－ＳｃｄＣａｓ９の細胞傷害性効果を実質的に低減させた（図１）。この新しいＤａｒＴ－ＳｃｄＣａｓ９融合タンパク質は、ギャップ編集因子２（ＧＥ２）と称された。
【0123】
［実施例２］
単一の複製遮断がＤＮＡに導入されていたため、優占修復鋳型が姉妹染色分体であり、異所性修復鋳型ではないことが予想された。以前の研究は、目的のＤＮＡ配列のどちらかの端にある２個の部位の標的化が、おそらく、重複するＤＮＡギャップを創出し、姉妹染色分体修復に干渉することにより、ゲノム修飾をブーストすることができることを実証した。したがって、ＤＮＡニッキング及びＤＮＡ修飾／ギャップ形成の組合せが、姉妹染色分体修復を同様に防止し、修復に好まれる鋳型としてプラスミド修復鋳型を残すことができることが仮定された。
単一の複製遮断がＤＮＡに導入されていたため、優占修復鋳型が姉妹染色分体であり、異所性修復鋳型ではないことが予想された。以前の研究は、目的のＤＮＡ配列のどちらかの端にある２個の部位の標的化が、おそらく、重複するＤＮＡギャップを創出し、姉妹染色分体修復に干渉することにより、ゲノム修飾をブーストすることができることを実証した。したがって、ＤＮＡニッキング及びＤＮＡ修飾／ギャップ形成の組合せが、姉妹染色分体修復を同様に防止し、修復に好まれる鋳型としてプラスミド修復鋳型を残すことができることが仮定された。
【0124】
Ｃａｓ９ニッキングは、原核生物及び真核生物において低い率のゲノム編集を駆動することができる。このようなニックは、レプリソームに遭遇したときに、シングルエンド二本鎖切断（ｓｅＤＳＢ）を形成する。これは典型的に、レプリソーム解離が関与する。このようなシングルエンド切断は、最も高頻度に、姉妹染色分体との相同組換えによって修復される。重要なことに、真核細胞において、Ｃａｓ９ニッキングは、おそらく非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構によって引き起こされたインデルを最小化しつつ正確な編集を生成することができる。ｓｅＤＳＢにおいて天然の末端連結パートナーは存在しないため、ＮＨＥＪは、この切断において阻害される。
【0125】
本開示の実施形態に従って、重複するＤＮＡギャップ及びｓｅＤＳＢが、姉妹染色分体修復を相互に排除することができる（例えば、相乗効果を発揮する）ことが仮定された。ｓｅＤＳＢ末端が典型的に、姉妹染色分体における相同性を探す箇所に、代わりに、ｓｓＤＮＡギャップが存在する。同様に、ＤＮＡギャップが典型的に、相同ＤＮＡ鋳型を見出す箇所に、おそらくｓｓＤＮＡに切除されるｓｅＤＳＢが存在する。したがって、ＳｃｄＣａｓ９におけるＨ８４８Ａ突然変異が再活性化され、標的鎖ニッカーゼＳｃｎＣａｓ９を創出した。
【0126】
最も効率的な標的を使用した上に記載されているｌａｃＺ修復アッセイにおいて、このニッキングＤａｒＴ－ＳｃｎＣａｓ９融合体を検査した。図２に示す通り、ニッカーゼ単独は、標的化ｓｇＲＮＡと共に発現された場合、低レベルの遺伝子修復及びＣＦＵの実質的な降下を生じた。ＤａｒＴ－ＳｃｄＣａｓ９及び操作されているＤａｒＴ＿Ｋ５６Ａ－ＳｃｄＣａｓ９（ＧＥ２）は、中程度レベルの遺伝子修復を生じた。ニッキング能力を再活性化させた後に、ＤａｒＴ－ＳｃｎＣａｓ９は、細胞傷害性であることが明らかになったが、ＤａｒＴ＿Ｋ５６Ａ－ＳｃｎＣａｓ９は、細胞傷害性を示さず、８時間の誘導の後に細胞のほとんど８０％の編集に成功した。このニッキングバージョンのＧＥ２は、ＧＥ２ｎと称された。
【0127】
ＤａｒＴの抗毒素パートナー、ＤａｒＧの使用を調査するための実験も行って、これがＧＥ２のゲノム修飾能力を排除するか否か決定した。ＤａｒＧのＮ末端ドメインは、ＡＤＰｒ修飾チミンを直接的に修復することができるグリコヒドロラーゼを含有する。ＤａｒＧのＣ末端ドメインは、ＤａｒＴ阻害剤を含有する。ＧＥ２及びＧＥ２ｎはそれぞれ、ｌａｃＺ遺伝子修復アッセイにおいて、オペロンにおける全長ＤａｒＧ、ＤａｒＧのＣ末端ドメイン又はＤａｒＧのＮ末端ドメインと共に同時発現された（図３）。図３に示す通り、ＧＥ２及びＧＥ２ｎゲノム修飾能力は、ＤａｒＧのＮ末端及びＣ末端ドメインの両方が発現されたときに減弱された。これは、オンターゲット修飾を損なうことなく、潜在的なオフターゲット修飾効果及び毒性を軽減する手段を提供する。
【0128】
その上、本開示に基づき当業者によって認識される通り、ＤａｒＧのＮ末端又はＣ末端ドメインのいずれかを使用して、ＤａｒＴ活性を相殺することができる。Ｎ末端ドメインは、ＡＤＰリボースを除去し、ヌクレオチドをその本来の状態に復帰させることができる。Ｃ末端ドメインは、ＤａｒＴ活性を直接的に阻害することができる。よって、ＤａｒＧの単一のドメインは、低レベルで発現され、場合によって、細胞全体にランダムに分布されて、ＤａｒＴ－Ｃａｓタンパク質のオフターゲット効果の相殺を助けることができる。一部の実施形態では、単一のＤａｒＴドメインを使用して、オンターゲットゲノム修飾活性に影響することなく、オフターゲット効果を低減させることができる。
【0129】
［実施例３］
Ｅ．コリにおけるカナマイシン遺伝子修復の頻度に基づき測定されるゲノム修飾の成功を誘導する、Ｃａｓ９ ＤＮＡ認識ドメインと組み合わせたＳｃａｂｉｎ ＤＮＡ修飾ドメインを含むギャップ編集複合体（Ｓｃａｂｉｎ－Ｋ１３０Ａ－ＳｃｄＣａｓ９）の能力を検査するための実験を行った。この例示的な実験セットにおいて、Ｓｃａｂｉｎ－ｄＣａｓ９融合タンパク質の発現は、ＳｃａｂｉｎのＤＮＡ修飾触媒活性に依存するカナマイシン遺伝子修復の頻度を増加させた。Ｓｃａｂｉｎは、アデノシン二リン酸リボース基により一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ内のグアニンを修飾することが知られているが、これは、単一の共有される触媒モチーフの外側のＤａｒＴから構造的に及び進化的に分岐している。プラスミド修復鋳型及びＥ．コリゲノムにおける標的化された欠損カナマイシン遺伝子の間の組換えは、標的化された遺伝子の修復及び結果的にカナマイシン抵抗性をもたらす。したがって、カナマイシン抵抗性の割合は、ゲノム修飾の率についての読み出し情報として機能する。ＳｃａｂｉｎにおけるＫ１３０Ａ突然変異は、Ｓｃａｂｉｎの活性を減弱させ、この活性は、減弱させなければ細胞にとって毒性がある。Ｅ１６０Ａ突然変異は、Ｓｃａｂｉｎを触媒的に不活性化し、全てのＤＮＡ修飾活性を除去する（陰性対照）。図４に示す通り、Ｓｃａｂｉｎ－Ｋ１３０Ａ－ＳｃｄＣａｓ９ギャップ編集因子複合体は、カナマイシン遺伝子修復の頻度増加によるゲノム修飾の成功をもたらした。
Ｅ．コリにおけるカナマイシン遺伝子修復の頻度に基づき測定されるゲノム修飾の成功を誘導する、Ｃａｓ９ ＤＮＡ認識ドメインと組み合わせたＳｃａｂｉｎ ＤＮＡ修飾ドメインを含むギャップ編集複合体（Ｓｃａｂｉｎ－Ｋ１３０Ａ－ＳｃｄＣａｓ９）の能力を検査するための実験を行った。この例示的な実験セットにおいて、Ｓｃａｂｉｎ－ｄＣａｓ９融合タンパク質の発現は、ＳｃａｂｉｎのＤＮＡ修飾触媒活性に依存するカナマイシン遺伝子修復の頻度を増加させた。Ｓｃａｂｉｎは、アデノシン二リン酸リボース基により一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ内のグアニンを修飾することが知られているが、これは、単一の共有される触媒モチーフの外側のＤａｒＴから構造的に及び進化的に分岐している。プラスミド修復鋳型及びＥ．コリゲノムにおける標的化された欠損カナマイシン遺伝子の間の組換えは、標的化された遺伝子の修復及び結果的にカナマイシン抵抗性をもたらす。したがって、カナマイシン抵抗性の割合は、ゲノム修飾の率についての読み出し情報として機能する。ＳｃａｂｉｎにおけるＫ１３０Ａ突然変異は、Ｓｃａｂｉｎの活性を減弱させ、この活性は、減弱させなければ細胞にとって毒性がある。Ｅ１６０Ａ突然変異は、Ｓｃａｂｉｎを触媒的に不活性化し、全てのＤＮＡ修飾活性を除去する（陰性対照）。図４に示す通り、Ｓｃａｂｉｎ－Ｋ１３０Ａ－ＳｃｄＣａｓ９ギャップ編集因子複合体は、カナマイシン遺伝子修復の頻度増加によるゲノム修飾の成功をもたらした。
【0130】
例示的な実験の別のセットにおいて、Ｅ．コリにおけるカナマイシン遺伝子修復の頻度に基づき測定されるゲノム修飾の成功を誘導する、Ｃａｓ９ ＤＮＡ認識ドメインと組み合わせたＭｏｍ ＤＮＡ修飾ドメインを含むギャップ編集複合体（Ｍｏｍ－Ｄ１４９Ａ－ＳｃｄＣａｓ９）の能力も検査した。ｄＣａｓ９へのＭｏｍの融合、及び欠損カナマイシン遺伝子の標的化は、組換え、ゲノム修飾及びこれにより、カナマイシン抵抗性細胞をもたらした。Ｍｏｍタンパク質は、ＤＮＡ複製を遮断し、ギャップ修復組換えを誘発することが知られているメチルカルバモイル基によりアデニンを修飾することが知られている。ＭｏｍにおけるＤ１４９Ａ突然変異は、触媒活性を減弱させ、この活性は、減弱させなければ細胞にとって致死的である。図５に示す通り、ＭＯＭ－Ｄ１４９Ａ－ＳｃｄＣａｓ９ギャップ編集因子複合体は、カナマイシン遺伝子修復の頻度増加によるゲノム修飾の成功をもたらした。
【0131】
［実施例４］
本開示のギャップ編集複合体におけるＤＮＡ修飾ドメインを評価するための実験も行った。第一に、図６は、ギャップ編集因子複合体を使用したゲノム修飾の成功（例えば、カナマイシン遺伝子修復の頻度増加による（ｔｈｏｕｇｈ））が、Ｃａｓ９ ＤＮＡ認識ドメインと組み合わせたＤＮＡ修飾ドメイン（ＤａｒＴ）（ＤａｒＴ－Ｇ４９Ｄ－ＳｃｄＣａｓ９）に依存していることを実証する実験の代表的な結果を含む（ＳｃｄＣａｓ９単独は、カナマイシン遺伝子修復をもたらさなかった。）。これらの実験において例示的なＤＮＡ修飾ドメインとしてＤａｒＴを使用した。
本開示のギャップ編集複合体におけるＤＮＡ修飾ドメインを評価するための実験も行った。第一に、図６は、ギャップ編集因子複合体を使用したゲノム修飾の成功（例えば、カナマイシン遺伝子修復の頻度増加による（ｔｈｏｕｇｈ））が、Ｃａｓ９ ＤＮＡ認識ドメインと組み合わせたＤＮＡ修飾ドメイン（ＤａｒＴ）（ＤａｒＴ－Ｇ４９Ｄ－ＳｃｄＣａｓ９）に依存していることを実証する実験の代表的な結果を含む（ＳｃｄＣａｓ９単独は、カナマイシン遺伝子修復をもたらさなかった。）。これらの実験において例示的なＤＮＡ修飾ドメインとしてＤａｒＴを使用した。
【0132】
その上、細胞におけるその毒性効果を低減させることによりＤａｒＴが改善され得るか否かについて調査するための実験を行った。図７に示す通り、ＤａｒＴへのＲ１９３Ａ突然変異の導入（ＤａｒＴ－Ｇ４９Ｄ－Ｒ１９３Ａ－ＳｃｄＣａｓ９）は、培養培地へのアラビノースの添加によって発現が誘導された場合、ＤａｒＴの毒性を有意に低減させた。図８に示す通り、Ｍ８６Ｌ及びＲ９２Ａ突然変異は、Ｒ１９３Ａ突然変異を超えて及びそれを上回って、ＤａｒＴの毒性をさらに低減させ、また、ＣＲＩＳＰＲ非依存的オフターゲット修飾を低減させた（図７）。さらに、図９は、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９ ＤＮＡ認識ドメイン（ＳｃｎＣａｓ９）と組み合わせた、毒性を有意に低減させた突然変異（Ｇ４９Ｄ及び／又はＲ１９３Ａ）を有するＤａｒＴ ＤＮＡ修飾ドメインを含むギャップ編集因子複合体を使用したゲノム修飾の成功を示す。部位特異的ゲノム修飾は、ほとんど１００％有効であった。
【0133】
よって、これらの結果は、現在のゲノム編集アプローチに伴う意図されない修飾及び細胞毒性を最小化しつつ効率的な部位特異的ゲノム修飾を容易にする、本開示の新規ＣＲＩＳＰＲに基づくゲノム修飾技術を実証する。
【0134】
［実施例５］
図１０に示す通り、ｆｃｙ１の遺伝子ノックアウトが、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）に対する抵抗性を付与することができるか否か評価することにより、本開示のギャップ編集因子複合体を使用した真核細胞におけるゲノム修飾の有効性を評価するための実験を行った。ｆｃｙ１遺伝子は、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ＳｃｎＣａｓ９）又は操作されているＤａｒＴ遺伝子とＣａｓ９ニッカーゼとの融合体によりサッカロマイセス・セレビシエにおいて標的化され、修復鋳型が提供された。図示される通り、これは、ｆｃｙ１におけるゲノム修飾の成功をもたらした。修復鋳型は、ｆｃｙ１に２又は３個の終止コドンを導入する６個の突然変異をコードし、これは、ゲノム修飾後のｆｃｙ１機能の喪失及び５－ＦＣに対する抵抗性をもたらした。その上、図示される通り、１種のシングルガイドＲＮＡは、５種の異なる修復鋳型と組み合わされる。全ての突然変異について、ＤａｒＴの融合体は、ゲノム修飾の率の＞１０倍増加をもたらし、真核細胞における複製遮断部分の導入の有用性を実証する。
図１０に示す通り、ｆｃｙ１の遺伝子ノックアウトが、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）に対する抵抗性を付与することができるか否か評価することにより、本開示のギャップ編集因子複合体を使用した真核細胞におけるゲノム修飾の有効性を評価するための実験を行った。ｆｃｙ１遺伝子は、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ＳｃｎＣａｓ９）又は操作されているＤａｒＴ遺伝子とＣａｓ９ニッカーゼとの融合体によりサッカロマイセス・セレビシエにおいて標的化され、修復鋳型が提供された。図示される通り、これは、ｆｃｙ１におけるゲノム修飾の成功をもたらした。修復鋳型は、ｆｃｙ１に２又は３個の終止コドンを導入する６個の突然変異をコードし、これは、ゲノム修飾後のｆｃｙ１機能の喪失及び５－ＦＣに対する抵抗性をもたらした。その上、図示される通り、１種のシングルガイドＲＮＡは、５種の異なる修復鋳型と組み合わされる。全ての突然変異について、ＤａｒＴの融合体は、ゲノム修飾の率の＞１０倍増加をもたらし、真核細胞における複製遮断部分の導入の有用性を実証する。
【0135】
図１１に示す通り、ｆｃｙ１の遺伝子ノックアウトが、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）に対する抵抗性を付与することができるか否か評価することにより、本開示のギャップ編集因子複合体を使用したゲノム修飾の有効性を評価するための実験を行った。ｆｃｙ１遺伝子は、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ＳｃｎＣａｓ９）又は操作されているＤａｒＴ遺伝子とＣａｓ９ニッカーゼとの融合体によりサッカロマイセス・セレビシエにおいて標的化され、修復鋳型が提供された。図示される通り、これは、ｆｃｙ１におけるゲノム修飾の成功をもたらした。修復鋳型は、ｆｃｙ１に２又は３個の終止コドンを導入する６個の突然変異をコードし、これは、ゲノム修飾後のｆｃｙ１機能の喪失及び５－ＦＣに対する抵抗性をもたらした。Ｇ４９Ｄ、Ｒ１９３Ａ、Ｍ８６Ｌ及びＲ９２Ａ突然変異を含む操作されているＤａｒＴバリアントの使用は、Ｇ４９Ｄ及びＲ１９３Ａ突然変異単独を有するＤａｒＴよりも、最大およそ５０倍まで細胞生存能を改善した。このギャップ編集因子複合体は、酵母におけるｆｃｙ１を標的化する２種の別々のシングルガイドＲＮＡ及び修復鋳型を使用して、効率的かつ低毒性のゲノム修飾を実現する。
【0136】
図１２は、サンガー配列決定による、ｆｃｙ１ゲノム修飾及び遺伝子ノックアウトの確認を提供する代表的なクロマトグラム（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）を含む。ギャップ編集因子複合体をｆｃｙ１遺伝子に標的化し、ＤＮＡ修復鋳型を提供することにより、２又は３個の終止コドンが導入された。編集されたヌクレオチドは、赤色で強調されている。ｆｃｙ１内の２種の別々の標的に対するゲノム編集が示されている。
【0137】
［実施例６］
図１３に示す通り、ｌａｃＺの遺伝子ノックアウトを評価することにより、本開示のギャップ編集因子複合体を使用したゲノム修飾の有効性を評価するための実験を行った。ｌａｃＺの遺伝子ノックアウトは、ラクトースアナログＩＰＴＧ及び比色指標Ｘ－ｇａｌの存在下で、白いコロニー色をもたらす。ｌａｃＺ遺伝子は、操作されているＤａｒＴ遺伝子に融合されたヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ１２ａタンパク質（ｄＬｂＣａｓ１２ａ）によりＥ．コリにおいて標的化され、修復鋳型が提供された。図示される通り、これは、ｌａｃＺにおけるゲノム修飾をもたらした。修復鋳型は、終止コドンを有するｌａｃＺ ＤＮＡをコードし、これは、ゲノム修飾後のｌａｃＺ機能の喪失及び白いコロニー色をもたらした。ギャップ編集因子複合体のｌａｃＺ遺伝子への標的化を用いずに、ゲノム修飾は観察されなかった。
図１３に示す通り、ｌａｃＺの遺伝子ノックアウトを評価することにより、本開示のギャップ編集因子複合体を使用したゲノム修飾の有効性を評価するための実験を行った。ｌａｃＺの遺伝子ノックアウトは、ラクトースアナログＩＰＴＧ及び比色指標Ｘ－ｇａｌの存在下で、白いコロニー色をもたらす。ｌａｃＺ遺伝子は、操作されているＤａｒＴ遺伝子に融合されたヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ１２ａタンパク質（ｄＬｂＣａｓ１２ａ）によりＥ．コリにおいて標的化され、修復鋳型が提供された。図示される通り、これは、ｌａｃＺにおけるゲノム修飾をもたらした。修復鋳型は、終止コドンを有するｌａｃＺ ＤＮＡをコードし、これは、ゲノム修飾後のｌａｃＺ機能の喪失及び白いコロニー色をもたらした。ギャップ編集因子複合体のｌａｃＺ遺伝子への標的化を用いずに、ゲノム修飾は観察されなかった。
【0138】
図１４は、異なるｃｒＲＮＡと会合したＤａｒＴ（Ｇ４９Ｄ／Ｒ１９３Ａ）－ｄＬｂＣａｓ１２ａを使用したｌａｃＺ遺伝子への１個以上の終止コドンの導入の成功を実証する代表的なクロマトグラム（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）を含む。白い色のコロニー由来のｌａｃＺ遺伝子を増幅し、サンガー配列決定のために送った。ｌａｃＺ遺伝子に１個以上の終止コドンを導入し、ベータ－ガラクトシダーゼ発現を排除し、これにより、誘導因子ＩＰＴＧ及び比色指標Ｘ－ｇａｌの存在下でプレーティングされたときに白い色のコロニーをもたらす、突然変異が赤色で強調されている。
【0139】
［実施例７］
図１５に示す通り、ｒｐｏＢ遺伝子へのＤ５１６Ｇ突然変異の導入が、抗生物質リファンピシンに対する抵抗性を付与することができるか否か評価することにより、本開示のギャップ編集因子複合体を使用したゲノム修飾の有効性を評価するための実験を行った。ｒｐｏＢ遺伝子は、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ＳｃｎＣａｓ９）に融合された操作されているＤａｒＴバリアントによりＥ．コリにおいて標的化され、ＲＮＡ修復鋳型及び逆転写酵素は同時発現された。これは、部位特異的ＲＮＡ鋳型ゲノム修飾の成功をもたらした。ｒｅｃＴ型リコンビナーゼを同時発現させて、鎖アニーリングを加速した。ＲＮＡ修復鋳型は、Ｄ５１６Ｇ突然変異をコードし、ギャップ編集因子複合体による標的化の後にゲノムに組み込まれることに成功した。
図１５に示す通り、ｒｐｏＢ遺伝子へのＤ５１６Ｇ突然変異の導入が、抗生物質リファンピシンに対する抵抗性を付与することができるか否か評価することにより、本開示のギャップ編集因子複合体を使用したゲノム修飾の有効性を評価するための実験を行った。ｒｐｏＢ遺伝子は、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ＳｃｎＣａｓ９）に融合された操作されているＤａｒＴバリアントによりＥ．コリにおいて標的化され、ＲＮＡ修復鋳型及び逆転写酵素は同時発現された。これは、部位特異的ＲＮＡ鋳型ゲノム修飾の成功をもたらした。ｒｅｃＴ型リコンビナーゼを同時発現させて、鎖アニーリングを加速した。ＲＮＡ修復鋳型は、Ｄ５１６Ｇ突然変異をコードし、ギャップ編集因子複合体による標的化の後にゲノムに組み込まれることに成功した。
【0140】
図１６に示す通り、ｒｐｏＢ遺伝子へのＤ５１６Ｇ突然変異の導入が、抗生物質リファンピシンに対する抵抗性を付与することができるか否か評価することにより、本開示のギャップ編集因子複合体を使用したゲノム修飾の有効性を評価するための実験を行った。ｒｐｏＢ遺伝子は、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ＳｃｎＣａｓ９）に融合された操作されているＤａｒＴバリアントによりＥ．コリにおいて標的化され、直鎖状一本鎖ＤＮＡ修復鋳型が提供された。図示される通り、これは、ｒｐｏＢにおけるゲノム修飾の成功をもたらした。ｒｅｃＴ型リコンビナーゼを同時発現させて、一本鎖ＤＮＡ修復鋳型のアニーリングを加速した。修復鋳型は、リファンピシン抵抗性を付与するＤ５１６Ｇ突然変異をコードした。ｒｐｏＢ Ｄ５１６ゲノム座位における反対側のＤＮＡ鎖を標的化する、２種のガイド及び修復鋳型を検査した。ｒｐｏＢへのギャップ編集因子複合体の標的化は、ゲノム修飾率の１００～６，０００倍増加をもたらし、ギャップ編集因子の効果を実証する。
【0141】
図１７は、ｒｐｏＢ遺伝子へのギャップ編集因子複合体の標的化、ＲＮＡ修復鋳型の発現及び逆転写酵素Ｅｃ８６の発現によって導入されたｒｐｏＢ遺伝子におけるＲＮＡ鋳型突然変異の代表的なクロマトグラムを含む。突然変異は、Ｄ５１６Ｇ媒介性リファンピシン抵抗性に要求されるＡＣ＞ＧＴ突然変異を含む。
【0142】
配列。本明細書に記載されている例示的なギャップ編集因子の配列を下に提示する。
ＳＰＣ１８７９ ｄａｒＴ Ｇ４９Ｄ－ＳｃｄＣａｓ９ ｐＢＡＤ ａｒａＣ ＣｍＲ ｐ１５ａ：
ＳＰＣ１８７９ ｄａｒＴ Ｇ４９Ｄ－ＳｃｄＣａｓ９ ｐＢＡＤ ａｒａＣ ＣｍＲ ｐ１５ａ：
【0143】
【化1】
【0144】
ＳＰＣ１８８１ ＧＥ２ ｄａｒＴ Ｇ４９Ｄ－Ｋ５６Ａ－ＳｃｄＣａｓ９ ｐＢＡＤ ａｒａＣ ＣｍＲ ｐ１５ａ：
【0145】
【化2】
【0146】
ＳＰＣ１８８３ ｄａｒＴ Ｇ４９Ｄ－ＳｃｎＣａｓ９ ｐＢＡＤ ａｒａＣ ＣｍＲ ｐ１５ａ：
【0147】
【化3】
【0148】
ＳＰＣ１８８４ ＧＥ２ｎ ｄａｒＴ Ｇ４９Ｄ－Ｋ５６Ａ－ＳｃｎＣａｓ９ ｐＢＡＤ ａｒａＣ ＣｍＲ ｐ１５ａ：
【0149】
【化4】
【0150】
ＤａｒＧ：
【0151】
【化5】
【0152】
ＤａｒＧ＿Ｃ末端：
【0153】
【化6】
【0154】
ＤａｒＧ Ｎ末端：
【0155】
【化7】
【0156】
Ｍｏｍ：
【0157】
【化8】
【0158】
Ｍｏｍ＿Ｄ１４９Ａ：
【0159】
【化9】
【0160】
Ｍｏｍ＿Ｄ１４９Ａ－ＳｃｄＣａｓ９：
【0161】
【化10】
【0162】
Ｓｃａｂｉｎ：
【0163】
【化11】
【0164】
Ｓｃａｂｉｎ＿Ｋ１３０Ａ：
【0165】
【化12】
【0166】
Ｓｃａｂｉｎ＿Ｋ１３０Ａ－ＳｃｄＣａｓ９：
【0167】
【化13】
【0168】
ＤａｒＴ＿Ｇ４９Ｄ＿Ｒ１９３Ａ：
【0169】
【化14】
【0170】
ＤａｒＴ＿Ｇ４９Ｄ＿Ｒ１９３Ａ－ＳｃｄＣａｓ９：
【0171】
【化15】
【0172】
ＤａｒＴ＿Ｇ４９Ｄ＿Ｒ１９３Ａ＿Ｍ８６Ｌ＿Ｒ９２Ａ：
【0173】
【化16】
【0174】
ＤａｒＴ＿Ｇ４９Ｄ＿Ｒ１９３Ａ＿Ｍ８６Ｌ＿Ｒ９２Ａ－ＳｃｄＣａｓ９
【0175】
【化17】
【0176】
ＤａｒＴ触媒ドメインモチーフ：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ３Ｒ（配列番号１８）（式中、Ｘ１は、Ｌ、Ｉ、Ｖ又はＡであり；Ｘ２は、Ｉ、Ｑ、Ｋ、Ｔ又はＮであり；Ｘ３は、いずれかのアミノ酸である）（図１８）。
【0177】
ＤａｒＴ触媒ドメインモチーフ：Ｘ１Ｘ１Ｘ１Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＰＦＹＦＸ７Ｘ１Ｘ１Ｘ８Ｘ９ＭＸ１０Ｘ１（配列番号１９）（式中、Ｘ１は、いずれかのアミノ酸であり；Ｘ２は、Ｌ、Ｖ又はＩであり；Ｘ３は、Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｓ又はＡであり；Ｘ４は、Ｄ又はＥであり；Ｘ５は、Ｙ又はＦであり；Ｘ６は、Ｖ、Ｉ又はＡであり；Ｘ７は、Ｔ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｎ又はＷであり；Ｘ８は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＫであり；Ｘ９は、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ｉ、Ａであり；Ｘ１０は、Ｌ、Ｍ又はＦである）（図１９）。
【0178】
ＤａｒＴ触媒ドメインモチーフ：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号２０）（式中、Ｘ１は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｖ又はＣであり；Ｘ２は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ａ、Ｃ又はＦであり；Ｘ３は、Ｆ、Ｙ又はＡであり；Ｘ４は、Ｔ、Ｓ、Ｙ又はＦであり；Ｘ５は、Ｄ、Ｎ又はＳであり；Ｘ６は、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｍ又はＱであり；Ｘ７は、Ｈ、Ｎ、Ｓ又はＱであり；Ｘ８は、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｈ又はＫである）（図２０）。
【0179】
ＤａｒＴ触媒ドメインモチーフ：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（配列番号２１）（式中、Ｘ１は、いずれかのアミノ酸であり；Ｘ２は、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｆ、Ｌ、Ｔ又はＭであり；Ｘ３は、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅ又はＨであり；Ｘ４は、Ｑ、Ｍ、Ｅ、Ｙ、Ａ、Ｒ又はＨであり；Ｘ５は、Ａ、Ｑ、Ｓ又はＹであり；Ｘ６は、Ｅ、Ａ又はＱであり；Ｘ７は、Ｆ、Ａ、Ｌ、Ｅ、Ｖ又はＣであり；Ｘ８は、Ｌ、Ａ、Ｅ又はＭであり；Ｘ９は、Ｖ、Ｉ、Ｌ又はＡである）（図２１）。
【0180】
Ｓｃａｂｉｎ触媒ドメインモチーフ：Ｘ１Ｘ１Ｘ１Ｘ１Ｘ２Ｘ１ＥＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＧＧＸ７（配列番号２２）（式中、Ｘ１は、いずれかのアミノ酸であり；Ｘ２は、Ｑ、Ｅ又はＲであり；Ｘ３は、Ｖ又はＩであり；Ｘ４は、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｓ又はＴであり；Ｘ５は、Ｆ、Ｉ、Ｖ又はＬであり；Ｘ６は、Ｐ、Ａ又はＩであり；Ｘ７は、Ｉ、Ｖ又はＬである）（図２２）。配列番号２１のＤａｒＴ触媒モチーフ及び配列番号２２のＳｃａｂｉｎ触媒モチーフは、構造及び機能アナログであり、保存されたグルタミン酸（Ｅ）は、触媒残基である。
【0181】
Ｓｃａｂｉｎ触媒ドメインモチーフ：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号２３）（式中、Ｘ１は、Ｓ、Ｔ又はＧであり；Ｘ２は、いずれかのアミノ酸であり；Ｘ３は、Ｆ、Ｙ又はＬであり；Ｘ４は、Ｖ、Ｉ、Ａ又はＬであり；Ｘ５は、Ｓ、Ｇ又はＡであり；Ｘ６は、Ｔ又はＡであり；Ｘ７は、Ｔ、Ｓ又はＡである）（図２３）。
【0182】
Ｓｃａｂｉｎ触媒ドメインモチーフ：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ２Ｘ４Ｘ２Ｘ５（配列番号２４）（式中、Ｘ１は、Ｌ又はＶであり；Ｘ２は、いずれかのアミノ酸であり；Ｘ３は、Ｒ、Ｈ又はＫであり；Ｘ４は、Ｄ、Ｓ又はＡであり；Ｘ５は、Ｒ又はＤである）（図２４）。
【0183】
Ｍｏｍ触媒ドメインモチーフ：Ｘ１ＨＹＸ２Ｘ３（配列番号２５）（式中、Ｘ１は、いずれかのアミノ酸であり；Ｘ２は、Ｓ又はＬであり；Ｘ３は、Ｈ、Ｇ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｄ又はＡである）（図２５）。
【0184】
Ｍｏｍ触媒ドメインモチーフ：ＥＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ７Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３ＥＸ１４（配列番号２６）（式中、Ｘ１は、Ｌ、Ｉ又はＦであり；Ｘ２は、Ｎ、Ｇ、Ｓ又はＴであり；Ｘ３は、Ｒ又はＫであり；Ｘ４は、Ｍ、Ｌ又はＡであり；Ｘ５は、Ｗ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｆ又はＹであり；Ｘ６は、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｖ、Ｃ又はＴであり；Ｘ７は、いずれかのアミノ酸であり；Ｘ８は、Ｄ又はＥであり；Ｘ９は、Ｌ、Ａ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、Ｑ又はＴであり；Ｘ１０は、Ｐ、Ｇ、Ａ又はＬであり；Ｘ１１は、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｔ又はＭであり；Ｘ１２は、Ｎ又はＦであり；Ｘ１３は、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＧであり；Ｘ１４は、Ｓ又はＴである）（図２６）。
【0185】
Ｍｏｍ触媒ドメインモチーフ：Ｘ１Ｘ２ＤＸ３Ｘ４Ｘ４Ｘ５Ｘ４Ｘ４ＧＸ６Ｘ７ＹＸ８ＡＸ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号２７）（式中、Ｘ１は、Ｆ、Ｗ、Ｙ又はＭであり；Ｘ２は、Ａ又はＳであり；Ｘ３は、Ｅ、Ｇ、Ｐ、Ａ又はＴであり；Ｘ４は、いずれかのアミノ酸であり；Ｘ５は、Ｇ、Ｃ又はＱであり；Ｘ６は、Ｔ、Ｖ、Ｙ又はＩであり；Ｘ７は、Ｖ又はＩであり；Ｘ８は、Ｑ、Ｋ又はＲであり；Ｘ９は、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｔ又はＮであり；Ｘ１０は、Ｎ、Ｇ又はＡであり；Ｘ１１は、Ｆ、Ｗ又はＹである）（図２７）。
【0186】
前述の詳細な説明及び添付の実施例が、単なる説明目的であり、添付の特許請求の範囲及びその均等物のみによって定義される本開示の範囲に対する限定として解釈されるべきではないことが理解される。
【0187】
上述の明細書において言及されているあらゆる刊行物及び特許は、あたかも本明細書に明確に記述されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。開示されている実施形態に対する様々な変化及び修飾は、当業者にとって明らかであり、その精神及び範囲から逸脱することなく為すことができる。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】
【国際調査報告】