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特表2024-506394細胞トランスフェクションのための規定サイズの保存安定性があるプラスミドＤＮＡ／ポリカチオン粒子の調製方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-13
(54)【発明の名称】細胞トランスフェクションのための規定サイズの保存安定性があるプラスミドＤＮＡ／ポリカチオン粒子の調製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/88 20060101AFI20240205BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20240205BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240205BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240205BHJP
【ＦＩ】
C12N15/88 Z
C12N15/86 Z
C12N7/01
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023548912
(86)(22)【出願日】2022-02-16
(85)【翻訳文提出日】2023-09-29
(86)【国際出願番号】 US2022016583
(87)【国際公開番号】W WO2022177980
(87)【国際公開日】2022-08-25
(31)【優先権主張番号】63/149,981
(32)【優先日】2021-02-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501335771
【氏名又は名称】ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100195556
【弁理士】
【氏名又は名称】柿沼 公二
(72)【発明者】
【氏名】ハイクアン マオ
(72)【発明者】
【氏名】イチョン フー
(72)【発明者】
【氏名】イニン チョウ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BA05
4B065CA44
(57)【要約】
接着培養液および懸濁培養液の両方におけるウイルス産生細胞の効率的なトランスフェクションのため、ＤＮＡ／ポリカチオン粒子の最適な組成およびサイズが開示される。５０ｎｍ～１０００ｎｍの粒子に対するＤＮＡ／ポリカチオン粒子媒介トランスフェクションのサイズ依存特性も開示される。５０ｎｍ～１０００ｎｍの規定サイズを有する保存安定性がある粒子を調製するためのＤＮＡ／ポリカチオンナノ粒子集合の動態制御に基づく新規の拡張可能な方法も開示される。本開示のＤＮＡ／ポリカチオン粒子は、優れたかつ再現性のあるトランスフェクション活性および保存安定性を生み出し、オフザシェルフ製品として使用されうる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数のポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子を調製する方法であって、（ａ）第１の可変流量で１つまたは複数の水溶性ポリカチオンポリマーを含む第１の流れと、第２の可変流量で１つまたは複数のポリアニオンポリマーを含む第２の流れとを第１のフラッシュナノ複合体形成（ＦＮＣ）ミキサーに流し込み、第１の粒径を有する複数のナノ粒子を形成することと、
（ｂ）第３の可変流量で前記第１の粒径を有する複数のナノ粒子を含む第３の流れと、第４の可変流量で集合バッファーを含む第４の流れとを第２のＦＮＣミキサーに流し込み、複数の集合ナノ粒子を形成することと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）において形成された複数の集合ナノ粒子をしばらくの期間インキュベートし、第２の粒径を有する複数の集合ナノ粒子を形成することと、
（ｄ）第５の可変流量で前記第２の粒径を有する複数の集合ナノ粒子を含む第５の流れと、第６の可変流量で安定化バッファーを含む第６の流れとを第３のＦＮＣミキサーに流し込み、複数のポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子を形成することと
を含む、方法。
【請求項2】
前記１つまたは複数の水溶性ポリカチオンポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、キトサン、ＰＡＭＡＭデンドリマー、プロタミン、ポリ（アルギニン）、ポリ（リジン）、ポリ（ベータ－アミノエステル）、カチオン性ペプチド、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記１つまたは複数の水溶性ポリカチオンポリマーは、ポリエチレンイミンである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記１つまたは複数の水溶性ポリアニオンポリマーは、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（グルタミン酸）、負の電荷を持つブロック共重合体、ヘパリン硫酸、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、トリポリリン酸（ＴＰＰ）、オリゴ（グルタミン酸）、サイトカイン、タンパク質、ペプチド、成長因子、および１つまたは複数の核酸からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項5】
前記１つまたは複数の核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ガイドＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ベクターＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記１つまたは複数の核酸は、プラスミドＤＮＡまたは異なる種の１つもしくは複数のプラスミドＤＮＡの混合物を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記１つまたは複数の核酸は、ｍＲＮＡまたは異なる種の１つもしくは複数のｍＲＮＡの混合物を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
前記第１の可変流量、前記第２の可変流量、前記第３の可変流量、前記第４の可変流量、前記第５の可変流量、および前記第６の可変流量は、それぞれ独立して約５～４００ｍＬ／分である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記第１の粒径は、約４０ｎｍ～約１２０ｎｍの強度平均範囲を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記第１の粒径を有する複数のナノ粒子は、約２．０～４．０のｐＨおよび約０．０５～２．０ｍＳ ｃｍ－１の伝導度の条件下で形成される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ステップ（ｂ）において形成された複数のナノ粒子は、おおよそ室温（２２±４°Ｃ）で約０．２～約５時間にわたってインキュベートされる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記第２の粒径を有する複数の集合ナノ粒子は、約６．０～８．０のｐＨおよび約２．０～２５．０ｍＳ ｃｍ－１の伝導度の条件下で形成される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記集合バッファーは、リン酸緩衝食塩水を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記リン酸緩衝食塩水は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、およびそれらの組み合わせの１つまたは複数を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記第２の粒径は、約３００ｎｍ～約５００ｎｍの範囲を有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ステップ（ｄ）の複数のポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子は、約２．０～４．０のｐＨおよび約１．０～１５．０ｍＳ ｃｍ－１の伝導度の条件下で形成される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記安定化バッファーは、少なくとも１つの糖を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記１つまたは複数の糖は、トレハロースを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記１つまたは複数の糖は、約１０％～約３０％ｗ／ｗのトレハロースを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記安定化バッファーは、ＨＣｌを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記粒子を、保存のため約－８０°Ｃで凍結乾燥または凍結させることを更に含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
約６７±５ｗ／ｗ％のＤＮＡ、９±５ｗ／ｗ％の結合ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、および２４±５ｗ／ｗ％の残留ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む、複数のポリカチオン／核酸ナノ粒子。
【請求項23】
平均ゼータ電位が約３５±５ｍＶである、請求項２２に記載の複数のポリカチオン／核酸ナノ粒子。
【請求項24】
約３００ｎｍ～約５００ｎｍの粒径を有する、請求項２２または２３に記載の複数のポリカチオン／核酸ナノ粒子。
【請求項25】
前記粒径は、約３００ｎｍ、約４００ｎｍ、および約５００ｎｍからなる群から選択される、請求項２４に記載の複数のポリカチオン／核酸ナノ粒子。
【請求項26】
３００ｎｍのｚ平均粒径に対して約０．１５±０．０５の多分散性指数、４００ｎｍのｚ平均粒径に対して約０．２５±０．０５の多分散性指数、および５００ｎｍのｚ平均粒径に対して約０．３５±０．０５の多分散性指数を有する、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の複数のポリカチオン／核酸ナノ粒子。
【請求項27】
ウイルスベクターを調製する方法であって、１つまたは複数の細胞を、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法により調製されたポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子または請求項２２～２６のいずれか一項に記載の複数のポリカチオン／核酸ナノ粒子に接触させることを含む、方法。
【請求項28】
前記複数のポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子を、前記１つもしくは複数の細胞の単層培養液または前記１つもしくは複数の細胞の懸濁培養液に投与することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記１つまたは複数の細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはその誘導体を含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項30】
前記１つまたは複数の細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項31】
前記１つまたは複数の細胞は、懸濁培養液に適したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【政府の利益についての声明】
【0001】
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金ＥＢ０１８３５８の下、政府支援により成された。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子治療は、先天性症状および後天的な症状を治療するためのモダリティ、ならびに予防ワクチンおよび治療ワクチンとしてますます価値のあるものになっており、２０２０年には世界的にほぼ１，０００件に達する治験が進んでおり、最近、幾つかの製品が承認されている。これらの治療の多くには、レンチウイルス（ＬＶＶ）（ＭｉｌｏｎｅおよびＯ’Ｄｏｈｅｒｔｙ、２０１８）およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｗａｎｇら、２０１９）に基づくベクトル化ウイルスの使用が含まれている。ＬＶＶを生産する最も一般的な方法の１つは、ウイルスアクセサリータンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）およびベクターバックボーンを含むトランスファープラスミドによる、ＨＥＫ２９３パッケージング細胞株またはその誘導体の一過性トランスフェクションである（Ｍｅｒｔｅｎら、２０１６）。ベンチマークトランスフェクションビヒクルとしては、リン酸カルシウム（Ｐｅａｒら、１９９３）、リポフェクタミン（Ｄａｌｂｙら、２００４）、およびポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）（Ｂｏｕｓｓｉｆら、１９９５）が挙げられる。ＰＥＩを使用する典型的なトランスフェクション手順（例えば、図１Ａ参照）においては、ｐＤＮＡ混合物およびＰＥＩは、血清の少ない培地に別々に溶解される。手動混合に続いて、懸濁液は、典型的に、０～６０分間インキュベートされて高分子電解質複合体（ＰＥＣ）コアセルベーションを完了させ、その後、培養液に追加される。ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子は、ｐＤＮＡの細胞移入（ＭｉｓｌｉｃｋおよびＢａｌｄｅｓｃｈｗｉｅｌｅｒ、１９９６；Ｒｅｊｍａｎら、２００５）、エンドソーム脱出（Ｂｕｓら、２０１８）、および核輸送（Ｐｏｌｌａｒｄら、１９９８）を促進し、結果的にウイルスＲＮＡの転写、ならびにパッケージングタンパク質およびエンベロープタンパク質の発現を生じさせる。機能的なＬＶＶを産生するためには、ｐＤＮＡの全ての種のコトランスフェクションを成功させる必要がある。加えて、ＬＶＶの一貫した品質および安全で効果的な治療結果を保証するためには、拡張可能かつ再現性のある生産方法が不可欠である（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｏｏら、２０１５）。そのような品質の生産は、トランスフェクション過程が完全に制御され、高い効率性および一貫性がもたらされるときにのみ可能になる。
【0003】
トランスフェクションの直前に手動でｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子を調製するために広く採用されている方法は、しかしながら、バッチ間の差異が大きく、ウイルスベクター生産の信頼性および効率に悪影響を与えている。図１Ａに示すように、不一致は、（１）異なる長さの複数のｐＤＮＡからなる粒子の集合に関わる複雑さ；（２）混合容器中で均一な混合を達成する難しさ（空間的不均一性）；（３）一連の追加過程中、一貫したｐＤＮＡ／ＰＥＩ比を維持する難しさ（時間的不均一性）；および（４）生産過程を通して形成された粒子のインキュベーション時間の変化を含む幾つかの要因により直ちに生じる。より重要なことには、そのような手動の調製過程は、操作者に依存して変化しやすく、スケールアップの難易度が高い。例えば、数百リットルの医薬品バッチサイズでのＬＶＶ生産には、ｐＤＮＡ溶液およびＰＥＩ溶液のリットルスケールの混合が必要であり、液体ハンドリングにおいて物質移動の課題が生じる。そのため、拡張可能性および一貫性が高い方法で保存安定性があるｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子を生産し、使いやすさと共に高いトランスフェクション効率を保証する工学的手法の開発が極めて重要である。
【0004】
これまでに、ｐＤＮＡ／ＰＥＩナノ粒子の拡張可能な生産のためのフラッシュナノ複合体形成（ＦＮＣ）技術が報告されている（Ｓａｎｔｏｓら、２０１６）。ｉｎ ｖｉｖｏの全身送達用途のため、凍結乾燥形態の１００ｎｍ未満の離散ナノ粒子の生成が成功している（Ｈｕら、２０１９）。これらの小さなナノ粒子は、しかしながら、ウイルスベクター生産細胞株（すなわち、ＨＥＫ２９３ＴまたはＨＥＫ２９３Ｆ細胞）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションにとっては準最適であり、標準的な手動混合方法により得られた粒子のトランスフェクション効率のピークのごく一部しか示していない。１００ｎｍを超えるサイズの粒子についてのサイズ依存のトランスフェクション効率は、しかしながら、これまでにほとんど報告されておらず（Ｏｇｒｉｓら、１９９８；Ｚｈａｎｇら、２０１９）、メカニズム的な理解はほとんどない。ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子のサイズ依存のトランスフェクション効率についての洞察の乏しさは、２００ｎｍ～１０００ｎｍの範囲の粒子のサイズおよび安定性を制御する方法の不足を示している。集合動態を制御しない従来のピペット混合または液滴追加は、粒子のサイズの予測不可能性および高い不安定性をもたらす。
【発明の概要】
【0005】
いくつかの態様においては、本開示の保護対象は、複数のポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子を調製する方法であって、
（ａ）第１の可変流量で１つまたは複数の水溶性ポリカチオンポリマーを含む第１の流れと、第２の可変流量で１つまたは複数のポリアニオンポリマーを含む第２の流れとを第１のフラッシュナノ複合体形成（ＦＮＣ）ミキサーに流し込み、第１の粒径を有する複数のナノ粒子を形成することと、
（ｂ）第３の可変流量で第１の粒径を有する複数のナノ粒子を含む第３の流れと、第４の可変流量で集合バッファーを含む第４の流れとを第２のＦＮＣミキサーに流し込み、複数の集合ナノ粒子を形成することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において形成された複数の集合ナノ粒子をしばらくの期間インキュベートし、第２の粒径を有する複数の集合ナノ粒子を形成することと、
（ｄ）第５の可変流量で第２の粒径を有する複数の集合ナノ粒子を含む第５の流れと、第６の可変流量で安定化バッファーを含む第６の流れとを第３のＦＮＣミキサーに流し込み、複数のポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子を形成することと
を含む方法を提供する。
（ａ）第１の可変流量で１つまたは複数の水溶性ポリカチオンポリマーを含む第１の流れと、第２の可変流量で１つまたは複数のポリアニオンポリマーを含む第２の流れとを第１のフラッシュナノ複合体形成（ＦＮＣ）ミキサーに流し込み、第１の粒径を有する複数のナノ粒子を形成することと、
（ｂ）第３の可変流量で第１の粒径を有する複数のナノ粒子を含む第３の流れと、第４の可変流量で集合バッファーを含む第４の流れとを第２のＦＮＣミキサーに流し込み、複数の集合ナノ粒子を形成することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において形成された複数の集合ナノ粒子をしばらくの期間インキュベートし、第２の粒径を有する複数の集合ナノ粒子を形成することと、
（ｄ）第５の可変流量で第２の粒径を有する複数の集合ナノ粒子を含む第５の流れと、第６の可変流量で安定化バッファーを含む第６の流れとを第３のＦＮＣミキサーに流し込み、複数のポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子を形成することと
を含む方法を提供する。
【0006】
いくつかの態様においては、１つまたは複数の水溶性ポリカチオンポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、キトサン、ＰＡＭＡＭデンドリマー、プロタミン、ポリ（アルギニン）、ポリ（リジン）、ポリ（ベータ－アミノエステル）、カチオン性ペプチド、およびそれらの誘導体からなる群から選択される。態様によっては、１つまたは複数の水溶性ポリカチオンポリマーは、ポリエチレンイミンである。
【0007】
いくつかの態様においては、１つまたは複数の水溶性ポリアニオンポリマーは、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（グルタミン酸）、負の電荷を持つブロック共重合体、ヘパリン硫酸、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、トリポリリン酸（ＴＰＰ）、オリゴ（グルタミン酸）、サイトカイン、タンパク質、ペプチド、成長因子、および１つまたは複数の核酸からなる群から選択される。
【0008】
いくつかの態様においては、１つまたは複数の核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ガイドＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ベクターＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群から選択される。態様によっては、１つまたは複数の核酸は、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）または異なる種のプラスミドＤＮＡの混合物を含む。態様によっては、１つまたは複数の核酸は、ｍＲＮＡを含む。
【0009】
特定の態様においては、１つまたは複数の核酸は、１つまたは複数のプラスミドＤＮＡの混合物を含み、１つまたは複数のプラスミドＤＮＡは、トランスファープラスミドならびにＧａｇタンパク質、Ｐｏｌタンパク質、Ｒｅｖタンパク質、およびＥｎｖタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡからなる群から選択される。
【0010】
いくつかの態様においては、トランスファープラスミドは、レンチウイルスベクターをコードする。
【0011】
態様によっては、レンチウイルスベクターは、異種プロモーターを含む修飾左（５’）レンチウイルスＬＴＲと、Ｐｓｉパッケージ配列（Ψ＋）と、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、ＲＲＥと、治療導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、修飾ＳＩＮ（３’）レンチウイルスＬＴＲとを含む。
【0012】
他の態様においては、Ｅｎｖタンパク質は、ＶＳＶ－ｇエンベロープ糖タンパク質を含む。
【0013】
いくつかの態様においては、第１の可変流量、第２の可変流量、第３の可変流量、第４の可変流量、第５の可変流量、および第６の可変流量は、それぞれ独立して約５～約４００ｍＬ／分である。
【0014】
いくつかの態様においては、第１の粒径は、約４０ｎｍ～約１２０ｎｍの範囲を有する。態様によっては、第１の粒径を有する複数のナノ粒子は、約２．０～４．０のｐＨおよび約０．０５～２．０ｍＳ ｃｍ－１の伝導度の条件下で形成される。
【0015】
態様によっては、ステップ（ｂ）で形成された複数のナノ粒子は、しばらくの期間、おおよそ室温（２２±４°Ｃ）でインキュベートされる。特定の態様においては、期間は、約０．２～約５時間である。
【0016】
いくつかの態様においては、第２の粒径を有する複数の集合ナノ粒子は、約６．０～８．０のｐＨおよび約２．０～２５．０ｍＳ ｃｍ－１の伝導度の条件下で形成される。態様によっては、集合バッファーは、リン酸緩衝食塩水を含む。特定の態様においては、リン酸緩衝食塩水剤は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、およびその組み合わせの１つまたは複数を含む。
【0017】
態様によっては、第２の粒径は、約３００ｎｍ～約５００ｎｍの範囲を有する。
【0018】
いくつかの態様においては、ステップ（ｄ）の複数のポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子は、約２．０～４．０のｐＨおよび約１．０～１５．０ｍＳ ｃｍ－１の伝導度の条件下で形成される。態様によっては、安定化バッファーは、少なくとも１つの糖を含む。特定の態様においては、糖は、トレハロースを含む。更により特定の態様においては、１つまたは複数の糖は、約１０％～約３０％ｗ／ｗのトレハロースを含む。いくつかの態様においては、安定化バッファーは、ＨＣｌを含む。
【0019】
いくつかの態様においては、方法は、粒子を、保存のため約－８０°Ｃで凍結乾燥または凍結させることを更に含む。
【0020】
他の態様においては、本開示の保護対象は、ウイルスベクターを調製する方法であって、１つまたは複数の細胞を、本開示の方法により調製されたポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子または本開示の複数のポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子に接触させることを含む方法を提供する。いくつかの態様においては、方法は、複数のポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子を、１つまたは複数の細胞の単層培養液または１つまたは複数の細胞の懸濁培養液に投与することを含む。特定の態様においては、１つまたは複数の細胞は、ＨＥＫ２９３細胞を含む。特定の態様においては、１つまたは複数の細胞は、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴＭ細胞、ＨＥＫ２９３ＳＧ細胞、ＨＥＫ２９３ＳＧＧＤ細胞、ＨＥＫ２９３Ｈ細胞、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞、ＨＥＫ２９３ＭＳＲ細胞、またはＨＥＫ２９３Ａ細胞を含む。特定の態様においては、１つまたは複数の細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む。より特定の態様においては、１つまたは複数の細胞は、懸濁培養液に適したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む。
【0021】
本開示の保護対象により全体または一部において取り上げられている、本開示の保護対象のいくつかの態様が上述されたが、他の態様は、記載が進むにつれ、以下に最適に記載された添付の実施例および図面に関連して取り上げられたとき、明らかになるであろう。
【0022】
特許または出願ファイルは、少なくとも１つのカラー付きの図面を含む。カラー図面を有する本特許または特許出願文書のコピーは、請求および必要な手数料の支払いに応じて米国特許商標庁より提供される。
【0023】
このように、本開示の保護対象を一般的な用語で記載してきたが、次に、添付の図面を参照する。図面は必ずしも縮尺どおりに記載されていない。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子のサイズがトランスフェクション効率を支配することを示す。Ａは、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子の調製およびＬＶＶの生産のトランスフェクション過程の模式図である。各感嘆符は、トランスフェクション結果におけるバッチ間の差異の潜在的原因を示し、これらは、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子の特性および調製過程を操作することにより対処されうる。Ｂは、混合ステップにおけるｐＤＮＡ濃度および投与前のインキュベーション時間（０～６０分）に応じたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の単層培養液におけるトランスフェクション効率（ルシフェラーゼレポーターの導入遺伝子発現レベルとして特徴付けられる）を示す。５、１０、または２０μｇ ｍＬ－１のＤＮＡ濃度で混合された群に対して、粒子は、それぞれ、５、１０、または２０倍に希釈されて１μｇ ｍＬ－１とされ、細胞に投与された。Ｃは、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭにおけるｐＤＮＡおよびＰＥＩ溶液の混合後のｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子の平均サイズ（動的光散乱（ＤＬＳ）により付与されたｚ平均直径）の変化を示す。成長動態は、ｐＤＮＡの濃度に依存する。エラーバーは、３つの独立した実験に由来し、使用された実験条件下での再現性および予測性を示す。Ｄは、さまざまなｐＤＮＡ濃度およびインキュベーション時間における、トランスフェクション効率と（ＢおよびＣの）全ての実験のデータ点に基づくｚ平均粒径との直接的な相関関係を示す。
【図2】Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧは、集合動態および表面電荷変調の制御を通した、６０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲のサイズ制御されたｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子の生産の過程を示す。Ａは、段階的な動態成長および抑制の模式図である。Ｂは、異なる濃度のＰＢＳ下で誘発された断定可能なサイズ成長を示す。Ｃは、１倍のＰＢＳにおける成長曲線に沿った異なる時点において、２０ｍＭのＨＣｌを含む１９％（ｗ／ｗ）のトレハロース溶液による希釈により、粒径成長が抑制されたことを示す。Ｄは、異なるサイズの一連の安定化された粒子の、ＤＬＳにより測定されたｚ平均直径分布である。Ｅは、成長および安定化ステップと共に変化したゼータ電位、および（Ｎ／Ｐ比により測定された）結合ＰＥＩ含有量を示す。偽対照の粒子は、予混合された１倍のＰＢＳおよび２０ｍＭのＨＣｌ溶液により処理されたが、サイズは、処理後も変化しなかった（６６ｎｍ）。Ｆ－１は、ビルディングブロックとしての元の６６ｎｍのナノ粒子の条件下で得られた粒子のＴＥＭ画像である。Ｆ－２は、１２０ｎｍの平均サイズの安定化された粒子の条件下で得られた粒子のＴＥＭ画像である。Ｆ－３は、１８０ｎｍの平均サイズの安定化された粒子の条件下で得られた粒子のＴＥＭ画像である。Ｆ－４は、１８０ｎｍの平均サイズの安定化された粒子の条件下で得られた粒子のＴＥＭ画像である。Ｆ－５は、安定化された４００ｎｍの粒子の条件下で得られた粒子のＴＥＭ画像である。Ｆ－６は、安定化された４００ｎｍの粒子の１つの拡大図である。Ｆ－７は、負染色領域における塩析（白い斑点）が少ない、別の４００ｎｍの粒子の拡大図である。Ｇは、４００ｎｍの粒子のサイズ安定性、ＤＮＡ保護、およびトランスフェクション効率に対する、抑制ステップにおいて使用されたＨＣｌ濃度の効果を示す。なお、パーセンテージ軸は、データ点を広げるために反転されており、高いＨＣｌ濃度がサイズの縮小およびＤＮＡの損失をもたらしたことを示している。ＢおよびＣにおいて、エラーバーは、３つの独立した実験により得られたもので、過程の予測性および再現性を示す。Ｇにおいて、エラーバーは、単一の実験内での３回の反復により得られた。
【図3】Ａ、Ｂ、およびＣは、６０ｎｍ～１０００ｎｍに制御されたサイズの安定的な粒子のトランスフェクション効率を示す。Ａは、レポーターとしてのルシフェラーゼの導入遺伝子発現の効率を示す。Ｂは、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージに対する、ＧＦＰの導入遺伝子発現の効率を示す。Ｃは、ＧＦＰ陽性細胞の集団における平均蛍光強度に対する、ＧＦＰの導入遺伝子発現の効率を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の単層培養液の場合、細胞は、トランスフェクション後２４時間で収集かつ溶解され、エラーバーは、単一の実験における反復として４－プレートウェルの標準偏差を示す。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の懸濁培養液の場合、細胞は、トランスフェクション後４８時間で収集かつ溶解され、エラーバーは、３つまたは４つの独立した実験（それぞれ、１２－ウェルプレートの単一のウェルにおいて実施された）の標準偏差を示す。
【図4】Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、およびＬは、異なるサイズの粒子による細胞取込およびエンドソーム脱出の定量的なセロミクスハイコンテント解析（ＨＣＡ）を示す。Ａは、組織培養プレートにおいて固定細胞を直接解析する画像解析モダリティを示す。Ｂは、異なるサイズの粒子によるインキュベーション後２時間後の代表的な画像を示す。Ｃは、異なるサイズの粒子によるインキュベーション後４時間後の代表的な画像を示す。Ｄは、粒子―細胞相互作用中のサイズ制御の成功を直接示唆する粒子スポットの特徴（面積および強度）に関する定量的結果を示す。Ｅは、より大きな粒子によるより大きなエンドソーム小胞の形成を示すＧａｌ８スポットの特徴（面積および強度）に関する定量的結果を示す。Ｆは、２時間後に細胞において検出された粒子およびＧａｌ８スポットの頻度に関する定量的結果を示す。Ｇは、総粒子取り込み量の代表的測定値としての全ての時点における細胞あたりの平均総粒子強度に関する定量的結果を示す。Ｈは、このアッセイを使用したこれまでの報告に従ったトランスフェクション効率の予測指標としての役割を果たす、エンドソーム脱出レベルの指標としての全ての時点における細胞あたりのＧａｌ８スポットの平均数に関する定量的結果を示す。Ｉは、異なる粒径について観察された異なるＧａｌ８スポットの特徴に起因する、全体的なエンドソーム脱出の程度、すなわち、細胞あたりの平均総Ｇａｌ８スポット強度についての提案された定量的測定に関する定量的結果を示す。Ｊは、総細胞取込およびエンドソーム脱出レベルの傾向とよく相関する、異なる期間の異なるサイズの粒子によるインキュベーションの結果としてのトランスフェクション効率（ルシフェラーゼレポーター発現レベル）に関する定量的結果を示す。Ｋでは、粒径にかかわらず、全体的な細胞取込レベル（Ｘ軸）に対する全てのプレートウェル平均データ点の全体的なエンドソーム脱出レベル（Ｙ軸）を適合させると、投与後２～４時間後に強い正の相関関係を示す。図において、１時間の適合ラインはｎ＝２１ウェルであり、２時間および４時間の適合ラインはｎ＝４２ウェルである。Ｌでは、同一の単一細胞における細胞取込レベル（Ｘ軸）に対して、２００ｎｍ（ｎ＝５４００の細胞）、４００ｎｍ（ｎ＝４６９３の細胞）、および９００ｎｍ（ｎ＝４３３６の細胞）の群の同一のウェルにおいて評価された全ての細胞のうちの単一細胞におけるエンドソーム脱出レベル（Ｙ軸）を適合させると、強い正の相関関係を示す。プロットされた任意の相関曲線による細胞分布密度を示す、ＦｌｏｗＪｏで生成された疑似カラーヒートマップを重ね合わせることにより、図が生成された。Ａ、Ｂ、およびＣにおいて、全ての図は、Ｃｙ５パネルに示すような同一のスケールバー＝５０μｍを共有する。
【図5】Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、制御されたサイズのｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子のスケールアップ生産、およびバイオリアクターにおけるＬＶＶ生産についてのトランスフェクション効率の検証を示す。Ａは、粒子成長培地のイオン強度（すなわち、ＰＢＳ濃度、全イオン強度の０．３倍、０．４倍、０．４５倍、および０．５倍）に応じた調節可能な粒径成長動態を示す。Ｂは、４０ｍＬ ｍｉｎ－１より高い流量でＣＩＪミキサーにおいて混合ステップを実施することにより可能になるスケールアップ生産過程の模式図である。Ｃは、環境温度における４００ｎｍの粒子の安定性を示す。Ｄは、－８０°Ｃでの保存中の異なる時点での４００ｎｍの粒子の安定性を示す。粒子懸濁液サンプルは、試験の前に環境温度で解凍された。
【図6】ＡおよびＢは、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子のサイズとｐＤＮＡペイロードの相関性を示す。Ａは、３０ｎｍ～１００ｎｍのサイズ範囲で、ｐＤＮＡの長さが４ｋｂｐ、７ｋｂｐ、または１０ｋｂｐであると想定したときの、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子あたりの理論的なｐＤＮＡペイロード（ｐＤＮＡコピー数）を示す。Ｂは、１００ｎｍ～７００ｎｍのサイズ範囲で、ｐＤＮＡの長さが４ｋｂｐ、７ｋｂｐ、または１０ｋｂｐであると想定したときの、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子あたりの理論的なｐＤＮＡペイロード（ｐＤＮＡコピー数）を示す。
【図7】Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、元のサイズまたは安定化されて成長したサイズの粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。Ａは、フラッシュナノ複合体形成方法（Ｓａｎｔｏｓ，Ｊ．Ｌ．ら、２０１６）により生産された６０ｎｍのナノ粒子のビルディングブロックである。Ｂでは、サイズ成長過程において、粒子は元のサイズの２倍（１２０ｎｍ）で安定化され、６０ｎｍのナノ粒子が接触した際の境界面における会合の成長メカニズムを示す。Ｃでは、サイズ成長過程において、粒子は元のサイズの３倍（１８０ｎｍ）で安定化され、６０ｎｍのナノ粒子が接触した際の境界面における会合の成長メカニズムを示す。Ｄは、ＴＥＭ観察の異なるフィールド間での安定化された４００ｎｍの粒子の集団的特徴を示す。
【図8】Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、成長動態および均一性に対する粒子成長培地のイオン強度およびｐＨの影響を示す。ＰＢＳの非緩衝塩成分を試験するため、６０ｎｍのナノ粒子は、ｐＨは影響を受けずに、１倍のＰＢＳと同等の濃度（１５０ｍＭ）または高濃度（２００ｍＭ）のＮａＣｌにより検証された。Ａは、この結果得られた、異なるサイズで２０ｍＭのＨＣｌを含む１９％ｗ／ｗのトレハロースにより安定化された粒子の、異なるサイズ成長率を示す。Ｂは、この結果得られた、異なるサイズで２０ｍＭのＨＣｌを含む１９％ｗ／ｗのトレハロースにより安定化された粒子の、異なる多分散性指数（動的光散乱により提供される均一性測定値）を示す。Ｃは、この結果得られた、異なるサイズで２０ｍＭのＨＣｌを含む１９％ｗ／ｗのトレハロースにより安定化された粒子の、異なるサイズ分布（動的光散乱により提供される直接的な均一性の図解）を示す。ＰＢＳの緩衝成分を試験するため、６０ｎｍのナノ粒子を異なる濃度のＮａＯＨにより検証し、ｐＨシフトを模倣した。Ｄは、混合の結果としての、溶液における異なる最終ｐＨを示す。Ｅは、混合の結果としての、粒子により異なるサイジング挙動を示す。
【図9】Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦは、トランスフェクション培地における限定された粒径変化を示す。細胞トランスフェクション実験のため、２５μｇ ｍＬ－１のｐＤＮＡ濃度の安定化された粒子が、トランスフェクション培地（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３）との混合により１μｇ ｍＬ－１まで希釈された。この希釈ステップ時の粒子のサイズ変化は、動的光散乱（ＤＬＳ）によりモニタリングされた。Ａは、２０分以内の６０ｎｍまたは４００ｎｍの粒子についての、この希釈ステップ時の粒子のサイズ変化を示す。Ｂは、４時間以内の６０ｎｍ、２００ｎｍ、４００ｎｍ、または８００ｎｍの粒子についての、この希釈ステップ時の粒子のサイズ変化を示す。酢酸ウラニルによる固定（Ｏｈｉら、２００４）を、その後のＴＥＭ観察結果と共に使用し、トランスフェクション培地中で希釈された形態の粒子の変化をモニタリングした。Ｃは、希釈時から間もなく（２０分）の６０ｎｍのナノ粒子の代表的な画像を示す。Ｄは、希釈時から３時間の６０ｎｍのナノ粒子の代表的な画像を示す。Ｅは、希釈時から間もなく（２０分）の４００ｎｍの粒子の代表的な画像を示す。Ｆは、希釈時から３時間の４００ｎｍの粒子の代表的な画像を示す。
【図10】Ａは、Ｃｙ５－ｐＤＮＡ ＮＰにより、１時間インキュベートされたＢ１６Ｆ１０－Ｇａｌ８－ＧＦＰ細胞の代表的なセロミクス画像を示す。Ｂは、Ｃｙ５－ｐＤＮＡ ＮＰにより、２時間インキュベートされたＢ１６Ｆ１０－Ｇａｌ８－ＧＦＰ細胞の代表的なセロミクス画像を示す。Ｃは、Ｃｙ５－ｐＤＮＡ ＮＰにより、４時間インキュベートされたＢ１６Ｆ１０－Ｇａｌ８－ＧＦＰ細胞の代表的なセロミクス画像を示す。Ｄは、Ｃｙ５－ｐＤＮＡ ＮＰにより、８時間インキュベートされたＢ１６Ｆ１０－Ｇａｌ８－ＧＦＰ細胞の代表的なセロミクス画像を示す。同一の期間、負対照である、粒子なしのトランスフェクション培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ）により処理された細胞については、粒子シグナルもエンドソーム脱出イベント（Ｇａｌ８－ＧＦＰ斑点）も検出されなかった。全ての図は、対照群に示す同一のスケールバー＝１００μｍを共有する。これらの図では、セロミクス定量分析により見られる傾向が明確に示された。
【図11】ＡおよびＢは、Ｃｙ５－ｐＤＮＡ粒子により４時間インキュベートされたＢ１６Ｆ１０－Ｇａｌ８－ＧＦＰ細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡画像である。Ａは、細胞の高さ０．１５μｍごとにスキャンするｚスタック実験からの３Ｄビューである。Ｂは、細胞の中間の高さ（上のパネル）において、または細胞の底部（２００または４００ｎｍの群）／細胞の頂部（９００ｎｍの群）においてサンプリングされた代表的な層画像である。カラースキーム：ヘキスト３３３４２（青）；ＧＦＰ－Ｇａｌ８（緑）；Ｃｙ５－ＤＮＡ（紫）；ＧＦＰおよびＣｙ５の共局在（白）。
【図12】Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦは、セロミクスにより評価された、粒子細胞取込の完全なデータセットを示す。Ａは、平均粒子スポット面積である。Ｂは、平均粒子スポット強度である。Ｃは、細胞あたりで検出された粒子の平均数である。Ｄは、細胞あたりの平均総粒子強度（総取り込み量の指標）である。Ｅは、Ｃｙ５標識ＤＮＡ粒子の投与後１、２、４、および８時間のセロミクスハイコンテント解析により評価された粒子スポット陽性細胞のパーセンテージである。
【図13】Ａは、粒子が異なるサイズで安定化され、同一の量のレポーター溶解バッファーおよびＳＯＬＶＡＢＬＥ溶液で処置されたとき、このトリチウム標識アッセイが、粒径にかかわらずｐＤＮＡの絶対量を正確に評価できたことを示した。Ｂは、セロミクスハイコンテント解析による、蛍光の半定量的な取り込み評価（細胞あたりの平均総粒子強度、図４Ｇ）として、群間での同一の傾向および相対的な関係を示した。これにより、異なるサイズの粒子の取り込み挙動が検証された。
【図14】Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥは、セロミクスにより評価された、粒子に誘発されたエンドソーム脱出の完全なデータセットを示す。Ａは、平均Ｇａｌ８スポット面積を示す。Ｂは、平均Ｇａｌ８スポット強度を示す。Ｃは、細胞あたりで検出されたＧａｌ８スポットの平均数を示す。Ｄは、細胞あたりの平均総Ｇａｌ８スポット強度（総エンドソーム脱出レベルの指標）を示す。Ｅは、Ｃｙ５標識ＤＮＡ粒子の投与後１、２、４、および８時間のセロミクスハイコンテント解析により評価されたＧａｌ８スポット陽性細胞パーセンテージを示す。
【図15】異なるサイズのＮＰによりインキュベートされた細胞の代謝活性を示す。
【図16】Ａ、Ｂ、およびＣは、単一細胞レベルのエンドソーム脱出および細胞取込の正のスケーリングを示す。Ａは、２００ｎｍ、４００ｎｍ、または９００ｎｍの粒子により２時間インキュベートされた細胞についての、単一細胞レベルの総Ｇａｌ８スポット強度（エンドソーム脱出レベル）と総粒子スポット強度（細胞取込レベル）との関係を示す細胞密度ヒートマップを示す。Ｂは、２００ｎｍ、４００ｎｍ、または９００ｎｍの粒子により４時間インキュベートされた細胞についての、単一細胞レベルの総Ｇａｌ８スポット強度（エンドソーム脱出レベル）と総粒子スポット強度（細胞取込レベル）との関係を示す細胞密度ヒートマップを示す。なお、Ａの３つのプロットは、互いに重ね合わせることにより図４Ｌを生成するために使用された。同様に、Ｂの３つのプロットは、Ｃを生成するために使用された。
【図17】ＡおよびＢは、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の懸濁培養液における細胞取込を示す。Ａは、投与後２時間のＣｙ５－ｐＤＮＡ粒子の細胞取込の共焦点レーザー走査顕微鏡観察結果である。カラースキーム：ヘキスト３３３４２（青）；ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｇｒｅｅｎ（緑）。なお、この染料により、細胞膜の代わりに細胞体全体が着色されたが、これは恐らく４％のパラホルムアルデヒドの固定液による細胞膜浸透によるものである。しかしながら、細胞取込を評価するため、細胞体は、Ｃｙ５－ｐＤＮＡ（紫）ではっきりとマークされた。全ての画像は、対照画像と同一のスケールバーを共有する。Ｂは、投与後１、２、４、および２４時間で評価された３Ｈ－ｐＤＮＡ粒子の細胞取込動態を示す。
【図18】Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、２００μｇ ｍＬ－１のＤＮＡ濃度でのサイズ成長過程のスケーリングを示す。Ａは、異なる濃度のＰＢＳの下で誘発された断定可能なサイズ成長を示す。Ｂでは、０．７５倍のＰＢＳによる成長曲線に沿った異なる時点での２０ｍＭのＨＣｌを含む１９％（ｗ／ｗ）のトレハロース溶液による希釈により、粒径成長が停止された。Ｃは、異なるサイズの一連の安定的な粒子のＤＬＳにより測定されたｚ平均直径分布を示す。Ｄは、レポーターとしてのルシフェラーゼの導入遺伝子発現の効率を示す。これらの実験において、（小さなナノ粒子のＦＮＣ調製後の）開始時のＤＮＡ濃度は、２００μｇ ｍＬ－１であった。これらの小さなビルディングブロックは、プラスミド長さに応じて、８０ｎｍ～１００ｎｍのより大きなサイズを保持した。溶液チャレンジの際、濃度は、１００μｇ ｍＬ－１まで減少し、最終的に、粒子安定化時には５０μｇ ｍＬ－１であった。
【図19】Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦは、以下を示す：（Ａ）規定サイズのプラスミドＤＮＡ／ＰＥＩ粒子の製剤過程のスキーム、（Ｂ）閉じ込め衝突ジェット（ＣＩＪ）が接続された蠕動およびリザーバーベースのセットアップ、（Ｃ）動的散乱により評価された、５００ｍＬ／分で生成されたナノ粒子のｚ平均直径および多分散性指数（ＰＤＩ）、（Ｄ）動的散乱により評価された、１０００ｍＬ／分で生成されたナノ粒子のｚ平均直径および多分散性指数（ＰＤＩ）、（Ｅ）動的散乱により評価された、２０００ｍＬ／分で生成されたナノ粒子のｚ平均直径および多分散性指数（ＰＤＩ）、（Ｆ）動的光散乱により評価された、異なる流量により生成された成長粒子の粒径成長動態。
【図20】Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥは、以下を示す：（Ａ）動的光散乱により評価された、ステップ３後の安定化されたプラスミドＤＮＡ／ＰＥＩ粒子のｚ平均粒子直径、（Ｂ）動的光散乱により評価された、ステップ３後の安定化されたプラスミドＤＮＡ／ＰＥＩ粒子の多分散性指数、（Ｃ）ステップ３後の安定化されたプラスミドＤＮＡ／ＰＥＩ粒子の懸濁液におけるＤＮＡ濃度、（Ｄ）ルシフェラーゼの導入遺伝子発現の相対発光量（ＲＬＵ）の測定により評価された、標準的な実験室規模の調製と１０００ｍＬ／分との間のトランスフェクション効率の比較、（Ｅ）動的光散乱により評価された、標準的な実験室規模の調製と１０００ｍＬ／分との間の粒径分布の比較。
【発明を実施するための形態】
【0025】
以下、本開示の保護対象について、本発明の全てではないが一部の実施形態が示されている添付の図面を参照して、より詳細に説明する。同一の数字は、全体を通して同一の要素を指す。本開示の保護対象は、多くの異なる形態で具体化されてよく、本明細書に記載の実施形態に限定して解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用される法的要件を満たすように提供される。実際、本明細書に記載の本開示の保護対象の多くの変更および他の実施形態は、前述の説明および関連図面に示された教示の利益を有する、本開示の保護対象が属する技術分野に精通している者であれば思い浮かぶであろう。そのため、本開示の保護対象は、開示された特定の実施形態に限定されず、変更および他の実施形態は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されていることを理解されたい。
【0026】
ウイルスベクターを生産するため、細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞の効率的なトランスフェクションのために約２００ｎｍ～約１０００ｎｍのサイズ範囲の、高濃度で、安定的な、オフザシェルフＤＮＡ／ＰＥＩ粒子を生成する方法は、現在のところ当該技術分野で知られていない。本開示の保護対象は、そのような方法を提供し、トランスフェクション過程を簡略化かつ合理化して操作者非依存とし、ウイルスベクターのスケールアップ生産を促進する。本開示の保護対象は、一過性トランスフェクション過程によるウイルスベクターの生産における、低い再現性および一貫性のない収量を解決する。結果として、ウイルスベクターの生産品質および一貫性が改善されうる。本開示の方法および製剤は、さまざまなスケールのウイルスベクターの生産のためのプロセス工学において、潜在的に広範囲の用途を見出しうる。他の潜在的な使用としては、再生医療および免疫療法のための細胞のｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクションが挙げられる。
【0027】
本開示の保護対象は、いくつかの実施形態において、接着培養液および懸濁培養液の両方におけるウイルス産生細胞の効率的なトランスフェクションのため、ＤＮＡ／ポリカチオン粒子の最適な組成およびサイズを開示する。５０ｎｍ～１０００ｎｍの粒子に対するＤＮＡ／ポリカチオン粒子媒介トランスフェクションのサイズ依存特性も開示される。５０ｎｍ～１０００ｎｍの規定サイズを有する保存安定性がある粒子を調製するためのＤＮＡ／ポリカチオンナノ粒子集合の動態制御に基づく新規の拡張可能な方法も開示される。特定の実施形態においては、本開示の保護対象は、約４００ｎｍ～約５００ｎｍのサイズのオフザシェルフ粒子製剤を提供する。本開示のＤＮＡ／ポリカチオン粒子は、優れたかつ再現性のあるトランスフェクション活性および保存安定性を生み出し、オフザシェルフ製品として使用されうる。
【0028】
本明細書で上述したように、１００ｎｍよりも大きいサイズを有する粒子のサイズ依存のトランスフェクション活性は、これまでに時折報告されただけである（Ｏｇｒｉｓら、１９９８；Ｚｈａｎｇら、２０１９）。しかしながら、トランスフェクション過程の粒子サイズ依存は、体系的には理解されていない。本開示の保護対象を開発する際に実施された初めの調査では、粒径、特に１００ｎｍより大きい粒子は、特定の細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３ＴまたはＨＥＫ２９３Ｆ細胞）におけるトランスフェクション効率に影響を与える主要パラメーターであることが特定された。本開示の保護対象は、約６０ｎｍ～約１０００ｎｍの平均粒径と、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子のトランスフェクション効率の最初の直接的な相関関係を提供し、粒径が異なる条件下で調製された粒子のトランスフェクション活性の共通の決定要因であることを示す。いくつかの実施形態においては、細胞培養において使用される条件において、最適な粒径は約４００ｎｍ～約５００ｎｍである。
【0029】
これまでに、約２００ｎｍ～約１０００ｎｍの範囲のｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子のサイズおよび安定性を制御する方法は報告されていない。ピペット混合または液滴追加は、粒子のサイズの予測不可能性および高い不安定性をもたらす。その一方、本開示の保護対象は、成長動態および動態安定性を制御することにより約６０ｎｍ～約１０００ｎｍの任意の所望のサイズのｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子を生産する拡張可能な方法を提供する。この粒子シリーズを使用して定量分析が実施され、細胞内輸送およびトランスフェクション活性を制御する細胞取込の主要な律速段階が明らかになった。トランスレーショナルポテンシャルを更に改善するため、４００ｎｍのｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子のオフザシェルフ製剤が開発された。これらの粒子は、物理的性質およびトランスフェクション活性を維持したまま、－８０°Ｃで優れた保存安定性を示した。すぐに使える形態で供給されるため、この粒子製剤は、レンチウイルスベクターの複数のスケールの生産において有効であり、従来の手動の調製方法により新たに調製された、最適化された複合体に相当する一貫性のある収量を示した。
【0030】
Ａ．ポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子を調製する方法
従って、いくつかの実施形態においては、本開示の保護対象は、複数のポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子を調製する方法であって、
（ａ）第１の可変流量で１つまたは複数の水溶性ポリカチオンポリマーを含む第１の流れと、第２の可変流量で１つまたは複数のポリアニオンポリマーを含む第２の流れとを第１のフラッシュナノ複合体形成（ＦＮＣ）ミキサーに流し込み、第１の粒径を有する複数のナノ粒子を形成することと、
（ｂ）第３の可変流量で第１の粒径を有する複数のナノ粒子を含む第３の流れと、第４の可変流量で集合バッファーを含む第４の流れとを第２のＦＮＣミキサーに流し込み、複数の集合ナノ粒子を形成することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において形成された複数の集合ナノ粒子をしばらくの期間インキュベートし、第２の粒径を有する複数の集合ナノ粒子を形成することと、
（ｄ）第５の可変流量で第２の粒径を有する複数の集合ナノ粒子を含む第５の流れと、第６の可変流量で安定化バッファーを含む第６の流れとを第３のＦＮＣミキサーに流し込み、複数のポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子を形成することと
を含む方法を提供する。
従って、いくつかの実施形態においては、本開示の保護対象は、複数のポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子を調製する方法であって、
（ａ）第１の可変流量で１つまたは複数の水溶性ポリカチオンポリマーを含む第１の流れと、第２の可変流量で１つまたは複数のポリアニオンポリマーを含む第２の流れとを第１のフラッシュナノ複合体形成（ＦＮＣ）ミキサーに流し込み、第１の粒径を有する複数のナノ粒子を形成することと、
（ｂ）第３の可変流量で第１の粒径を有する複数のナノ粒子を含む第３の流れと、第４の可変流量で集合バッファーを含む第４の流れとを第２のＦＮＣミキサーに流し込み、複数の集合ナノ粒子を形成することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において形成された複数の集合ナノ粒子をしばらくの期間インキュベートし、第２の粒径を有する複数の集合ナノ粒子を形成することと、
（ｄ）第５の可変流量で第２の粒径を有する複数の集合ナノ粒子を含む第５の流れと、第６の可変流量で安定化バッファーを含む第６の流れとを第３のＦＮＣミキサーに流し込み、複数のポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子を形成することと
を含む方法を提供する。
【0031】
いくつかの実施形態においては、１つまたは複数の水溶性ポリカチオンポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、キトサン、ＰＡＭＡＭデンドリマー、プロタミン、ポリ（アルギニン）、ポリ（リジン）、ポリ（ベータ－アミノエステル）、カチオン性ペプチド、およびそれらの誘導体からなる群から選択される。実施形態によっては、１つまたは複数の水溶性ポリカチオンポリマーは、ポリエチレンイミンである。
【0032】
いくつかの実施形態においては、１つまたは複数の水溶性ポリアニオンポリマーは、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（グルタミン酸）、負の電荷を持つブロック共重合体、ヘパリン硫酸、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、トリポリリン酸（ＴＰＰ）、オリゴ（グルタミン酸）、サイトカイン、タンパク質、ペプチド、成長因子、および１つまたは複数の核酸からなる群から選択される。
【0033】
いくつかの実施形態においては、１つまたは複数の核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ガイドＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ベクターＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群から選択される。実施形態によっては、１つまたは複数の核酸は、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）または異なる種のプラスミドＤＮＡの混合物を含む。実施形態によっては、１つまたは複数の核酸は、ｍＲＮＡを含む。
【0034】
特定の実施形態においては、ｐＤＮＡの混合物は、ウイルスベクターを生産するのに必要かつ十分な、パッケージ可能なウイルスベクターと１つまたは複数のウイルス構造／アクセサリータンパク質とを含むトランスファープラスミドをコードする。
【0035】
いくつかの実施形態においては、第１の可変流量、第２の可変流量、第３の可変流量、第４の可変流量、第５の可変流量、および第６の可変流量は、それぞれ独立して約５～約４００ｍＬ／分である。
【0036】
いくつかの実施形態においては、第１の粒径は、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、および１２０ｎｍを含む、約４０ｎｍ～約１２０ｎｍの範囲を有する。実施形態によっては、第１の粒径を有する複数のナノ粒子は、約２．０～４．０のｐＨおよび約０．０５～２．０ｍＳ ｃｍ－１の伝導度の条件下で形成される。
【0037】
実施形態によっては、ステップ（ｂ）で形成された複数のナノ粒子は、しばらくの期間、おおよそ室温（２２±４°Ｃ）でインキュベートされる。特定の実施形態においては、期間は、約０．２～約５時間である。
【0038】
いくつかの実施形態においては、第２の粒径を有する複数の集合ナノ粒子は、約６．０～８．０のｐＨおよび約２．０～２５．０ｍＳ ｃｍ－１の伝導度の条件下で形成される。実施形態によっては、集合バッファーは、リン酸緩衝食塩水を含む。特定の実施形態においては、リン酸緩衝食塩水剤は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、およびその組み合わせの１つまたは複数を含む。
【0039】
実施形態によっては、第２の粒径は、約３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、および５００ｎｍを含む、約３００ｎｍ～約５００ｎｍの範囲を有する。
【0040】
いくつかの実施形態においては、ステップ（ｄ）の複数のポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子は、約２．０～４．０のｐＨおよび約１．０～１５．０ｍＳ ｃｍ－１の伝導度の条件下で形成される。実施形態によっては、安定化バッファーは、少なくとも１つの糖を含む。特定の実施形態においては、糖は、トレハロースを含む。更により特定の実施形態においては、１つまたは複数の糖は、約１０％～約３０％ｗ／ｗのトレハロースを含む。いくつかの実施形態においては、安定化バッファーは、ＨＣｌを含む。
【0041】
いくつかの実施形態においては、方法は、粒子を、保存のため約－８０°Ｃで凍結乾燥または凍結させることを更に含む。
【0042】
Ｂ．ウイルスベクターを調製する方法
他の実施形態においては、本開示の保護対象は、ウイルスベクターを調製する方法であって、１つまたは複数の細胞を、本開示の方法により調製されたポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子または本開示の複数のポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子に接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態においては、方法は、複数のポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子を、１つまたは複数の細胞の単層培養液または１つまたは複数の細胞の懸濁培養液に投与することを含む。
他の実施形態においては、本開示の保護対象は、ウイルスベクターを調製する方法であって、１つまたは複数の細胞を、本開示の方法により調製されたポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子または本開示の複数のポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子に接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態においては、方法は、複数のポリカチオン／ポリアニオン複合体ナノ粒子を、１つまたは複数の細胞の単層培養液または１つまたは複数の細胞の懸濁培養液に投与することを含む。
【0043】
特定の実施形態においては、１つまたは複数の細胞は、ウイルスベクターを生成するために本明細書において検討される、ポリカチオン／核酸ナノ粒子、例えば、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ複合体によりトランスフェクトされる。
【0044】
本明細書において検討されるナノ粒子によるトランスフェクションに適した細胞の実例としては、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ－２細胞、ＢＯＳＣ ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ １細胞、ＢＳＣ ４０細胞、ＢＭＴ １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、Ｂ－５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、２１１Ａ細胞、またはそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0045】
好適な実施形態においては、本明細書において検討されるナノ粒子によるトランスフェクションに適した細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはそれらの誘導体を含む。本明細書において検討される、特定の実施形態での使用に適したＨＥＫ２９３細胞の誘導体としては、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴＭ細胞、ＨＥＫ２９３ＳＧ細胞、ＨＥＫ２９３ＳＧＧＤ細胞、ＨＥＫ２９３Ｈ細胞、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞、ＨＥＫ２９３ＭＳＲ細胞、およびＨＥＫ２９３Ａ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【0046】
他の特に好適な実施形態においては、１つまたは複数の細胞は、懸濁培養液に適したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む。
【0047】
いくつかの実施形態においては、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。本明細書において検討される、特定の実施形態での使用に適したレトロウイルスベクターの実例としては、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ならびにレンチウイルスに由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0048】
好適な実施形態においては、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。本明細書において検討される、特定の実施形態での使用に適したレンチウイルスベクターの実例としては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；１型ＨＩＶおよび２型ＨＩＶを含む）、ビスナマエディウイルス（ＶＭＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0049】
より好適な実施形態においては、レンチウイルスベクターは、１型ＨＩＶまたは２型ＨＩＶに由来する。
【0050】
特定の実施形態においては、トランスファープラスミドは、左（５’）レンチウイルスＬＴＲと、Ｐｓｉパッケージ配列（Ψ＋）と、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）と、治療導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、右（３’）レンチウイルスＬＴＲとを含むレンチウイルスベクターをコードする。レンチウイルスベクターは、ポリアデニル化配列、インシュレーター、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＰＲＥ）、等を含むがこれらに限定されるものではない転写後調節エレメントを任意に含んでよい。
【0051】
特定の実施形態においては、トランスファープラスミドは、異種プロモーターを含む修飾左（５’）レンチウイルスＬＴＲと、Ｐｓｉパッケージ配列（Ψ＋）と、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）と、治療導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、修飾（３’）レンチウイルスＬＴＲとを含むレンチウイルスベクターをコードする。
【0052】
特定の実施形態においては、トランスファープラスミドは、修飾５’ＬＴＲを含むレンチウイルスベクターをコードし、ここで、５’ＬＴＲのＵ３領域は、異種プロモーターに置き換えられ、ウイルス粒子の生産中にウイルスゲノムの転写を推進する。使用されうる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルスサルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、前初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。
【0053】
特定の実施形態においては、トランスファープラスミドは、ウイルスベクター複製を不完全にする修飾自己不活型（ＳＩＮ）３’ＬＴＲを含むレンチウイルスベクターをコードする。ＳＩＮベクターは、３’ＬＴＲのＵ３領域の１つまたは複数の修正を含み、１回目のウイルス複製より後のウイルス転写を防止する。これは、右（３’）ＬＴＲ Ｕ３領域が、ウイルス複製中に左（５’）ＬＴＲ Ｕ３領域のテンプレートとして使用されるため、ウイルス転写物がＵ３エンハンサー－プロモーターなしでは作成できないからである。特定の実施形態においては、３’ＬＴＲは、Ｕ３領域が削除され、Ｒおよび／またはＵ５領域が、例えば、異種または合成ポリ（Ａ）配列、１つまたは複数のインシュレーターエレメント、および／または誘導性プロモーターにより置き換えられるように修飾される。
【0054】
特定の実施形態においては、１つまたは複数のｐＤＮＡは、パッケージ可能なウイルスベクターゲノムと、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、およびｎｅｆからなる群から選択されるウイルス構造／アクセサリータンパク質の１つまたは複数とを含むトランスファープラスミドをコードする。好適な実施形態においては、ウイルス構造／アクセサリータンパク質は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、およびｒｅｖからなる群から選択される。より好適な実施形態においては、ウイルス構造／アクセサリータンパク質は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、およびｒｅｖ、またはｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖからなる群から選択される。
【0055】
ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）は、最終的に細胞株から生成された組換えレトロウイルスに感染して形質転換されうる宿主細胞の範囲を判定する。１型ＨＩＶ、２型ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、およびＥＩＶなどのレンチウイルスの場合、Ｅｎｖタンパク質は、ｇｐ４１およびｇｐ１２０を含む。
【0056】
本発明において用いられうるＥｎｖ遺伝子の実例としては、ＭＬＶエンベロープ、１０Ａ１エンベロープ、ＢＡＥＶ、ＦｅＬＶ－Ｂ、ＲＤ１１４、ＳＳＡＶ、Ｅｂｏｌａ、Ｓｅｎｄａｉ、ＦＰＶ（家禽ペストウイルス）、およびインフルエンザウイルスエンベロープが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、ＲＮＡウイルス（例えば、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、アストロウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科、レトロウイルス科のＲＮＡウイルスファミリー）のエンベロープ、およびＤＮＡウイルス（ヘパドナウイルス科、サーコウイルス科、パルボウイルス科、パポバウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ）、およびイリドウイルス科のファミリー）のエンベロープをコードする遺伝子が利用されてよい。代表的な例としては、ＦｅＬＶ、ＶＥＥ、ＨＦＶＷ、ＷＤＳＶ、ＳＦＶ、狂犬病、ＡＬＶ、ＢＩＶ、ＢＬＶ、ＥＢＶ、ＣＡＥＶ、ＳＮＶ、ＣｈＴＬＶ、ＳＴＬＶ、ＭＰＭＶ、ＳＭＲＶ、ＲＡＶ、ＦｕＳＶ、ＭＨ２、ＡＥＶ、ＡＭＶ、ＣＴ１０、およびＥＩＡＶが挙げられる。
【0057】
他の実施形態においては、特定の実施形態での使用に適したＥｎｖタンパク質としては、以下のウイルスのいずれか：Ａ型インフルエンザ、例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、およびＨ５Ｎ１（鳥インフルエンザ）、Ｂ型インフルエンザ、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス群のいずれかのウイルス、腸管アデノウイルス、パルボウイルス、デング熱ウイルス、サル痘、モノネガウイルス目、リッサウイルス、例えば、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス、モコラウイルス、デュベンヘイジウイルス、ヨーロッパコウモリウイルス１＆２、およびオーストラリアコウモリウイルス、エフェメロウイルス、ベジクロウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス、例えば、１型および２型単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、６型および８型ヒトヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス、アレナウイルス、例えば、アルゼンチン出血熱ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄｉａｅ）、例えば、クリミアコンゴ出血熱ウイルス、ハンタウイルス、腎症候性出血熱ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、エボラ出血熱およびマールブルグ出血熱を含むフィロウイルス科（フィロウイルス）、キャサヌル森林病ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルスを含むフラビウイルス科、およびパラミクソウイルス科、例えば、ヘンドラウイルスおよびニパウイルス、大痘瘡および小痘瘡（天然痘）、アルファウイルス、例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ウエストナイルウイルス、いずれかの脳炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｌｔｉｓ）ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【0058】
好適な実施形態においては、Ｅｎｖ遺伝子は、ＶＳＶ－Ｇエンベロープ糖タンパク質をコードする。
【0059】
いくつかの好適な実施形態においては、本明細書において検討されるｐＤＮＡ／ＰＥＩ複合体は、異種プロモーターを含む修飾左（５’）レンチウイルスＬＴＲと、Ｐｓｉパッケージ配列（Ψ＋）と、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、ＲＲＥと、治療導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、修飾ＳＩＮ（３’）レンチウイルスＬＴＲとを含むレンチウイルスベクターをコードするトランスファープラスミド；レンチウイルスｇａｇ／ｐｏｌをコードするプラスミド、ｒｅｖをコードするプラスミド、およびＥｎｖ遺伝子をコードするプラスミド、好ましくはＶＳＶ－Ｇエンベロープ糖タンパク質を含む。
【0060】
長年の特許法の慣例に従い、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、特許請求の範囲を含めて、本願において使用されるとき、「１つまたは複数」を指す。従って、例えば、「対象（ａ ｓｕｂｊｅｃｔ）」への言及は、文脈が明らかに反対の場合（例えば、複数の対象（ａ ｐｌｕｒａｌｉｔｙ ｏｆ ｓｕｂｊｅｃｔｓ））等を除き、複数の対象を含む。
【0061】
多くの実施形態において本開示の方法によって処置される「対象」は、望ましくはヒト対象であるが、本明細書に記載の方法は、「対象」という用語に含まれることが意図されている全ての脊椎動物種に関して有効であることを理解されたい。従って、「対象」には、既存の病態もしくは疾患の治療、または病態もしくは疾患の発症を予防するための予防的治療など、医療目的のヒト対象、または医療目的、獣医学目的、もしくは開発目的の動物対象を含みうる。好適な動物対象としては、霊長類、例えば、ヒト、サル、類人猿、等；ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、例えば、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、雄ウシ（ｏｘｅｎ）、等；ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、例えば、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）等；ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅ）、例えば、ヤギ（ｇｏａｔ）等；ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、例えば、ブタ（ｐｉｇ）、雄ブタ（ｈｏｇ）、等；ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）、例えば、ウマ（ｈｏｒｓｅ）、ロバ、シマウマ、等；野生のネコ（ｃａｔ）および飼いネコ（ｃａｔ）を含むネコ（ｆｅｌｉｎｅ）；イヌ（ｄｏｇ）を含むイヌ（ｃａｎｉｎｅ）；ウサギ（ｒａｂｂｉｔ）、ノウサギ（ｈａｒｅ）、等を含むウサギ類（ｌａｇｏｍｏｒｐｈ）；およびマウス、ラット、等を含むげっ歯類を含むがこれらに限定されるものではない哺乳類が挙げられる。動物は、遺伝子導入動物であってよい。いくつかの実施形態においては、対象は、胎児、新生児、乳児、若年、および成人対象を含むがこれらに限定されるものではないヒトである。さらに、「対象」には、病態もしくは疾患に罹患している、または罹患している疑いのある患者を含みうる。したがって、本明細書では、「対象」および「患者」という用語は互換的に使用される。「対象」という用語は、対象の生物、組織、細胞、または細胞の集合体も指す。
【0062】
概して、活性薬剤または薬物送達デバイスの「有効な量」とは、所望の生物学的反応を誘発するのに必要な量を指す。当業者には理解されるように、薬剤またはデバイスの有効な量は、所望の生物学的エンドポイント、送達される薬剤、医薬組成物の構成、標的組織などの因子に応じて変化しうる。
【0063】
本明細書および特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、文脈上別段の意味を有する場合を除き、非排他的な意味で使用される。同様に、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語およびその文法的変形は、非限定的であることを意図しており、リスト内の項目の列記は、リスト化された項目に置換または追加されうる他の同様の項目を排除するものではない。
【0064】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、別段の指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される量、サイズ、寸法、比率、形状、公式化、パラメーター、パーセンテージ、数量、特性、および他の数値を表す全ての数は、「約」という用語が値、量、または範囲とともに明示的に表示されなくても、全ての場合において「約」という用語によって修飾されるものと理解される。従って、反対の指示がない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメーターは、正確ではなく、正確である必要はないが、本開示の保護対象により得ようとする所望の特性に応じて、公差、換算係数、四捨五入、測定誤差など、および当業者に公知の他の要因を反映して、近似値とするおよび／または所望により大きくまたは小さくすることができる。例えば、値について言及するとき、「約」という用語は、開示される方法を実施するため、または開示される組成を使用するために適切であるような、いくつかの実施形態においては±１００％、いくつかの実施形態においては±５０％、いくつかの実施形態においては±２０％、いくつかの実施形態においては±１０％、いくつかの実施形態においては±５％、いくつかの実施形態においては±１％、いくつかの実施形態においては±０．５％、およびいくつかの実施形態においては±０．１％の規定量からの変動を包含することを意味しうる。
【0065】
さらに、１つまたは複数の数または数値範囲に関連して使用されるとき、用語「約」は、範囲内の全ての数を含む、そのような全ての数値を指すと理解されるべきであり、記載された数値の上下に境界を拡張することによってその範囲を修正する。端点による数値範囲の記載には、その範囲に組み込まれる全ての数、例えば、その分数を含む全整数（例えば、１～５という記載には、１、２、３、４、および５、ならびにその分数、例えば、１．５、２．２５、３．７５、４．１、等が含まれる）、およびその範囲内の任意の範囲が含まれる。
【実施例】
【0066】
以下の実施例は、本開示の保護対象の代表的な実施形態を実施するための指針を当業者に提供するために含まれる。本開示および当該技術分野における一般的な技術水準に照らして、当業者であれば、以下の実施例は例示的なものであることのみを意図しており、本開示の保護対象の範囲から逸脱することなく、多数の変更、修正、および改変が採用されうることが理解できる。以下の総合的な説明および具体例は、例示を目的としたものであり、他の方法によって本開示の化合物を製造することを任意の方法で限定するものと解釈されるものではない。
【0067】
（実施例１）
細胞トランスフェクションのための規定サイズの保存安定性があるプラスミドＤＮＡ／ポリカチオン粒子の調製方法
１．１ 概要
プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）およびポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）からなる高分子電解質複合体（ＰＥＣ）粒子は、遺伝子治療のためのレンチウイルスベクター（ＬＶＶ）を生産するために広く使用されている。ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子の現在のバッチ方式の調製は、特に大規模製造過程における再現性および安定性が制限されており、トランスフェクション結果およびＬＶＶ収量の制御が困難になっている。本開示の保護対象は、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子のサイズが高いトランスフェクション効率のための主要な決定要因であり、細胞取込制限メカニズムに起因して、最適なサイズは４００ｎｍ～５００ｎｍであると特定した。ビルディングブロックとして６０ｎｍのナノ粒子を使用して、サイズ制御され（４００ｎｍ）、保存安定性がある粒子を集めるため、動態ベースのアプローチが開発された。このボトムアップの工学過程の生産スケーラビリティも示されている。コロイド安定性およびトランスフェクション効率の維持は、業界標準プロトコルを使用して生成された不安定な粒子に対して検証された。この粒子製造方法は、ウイルス製造過程を効果的に合理化し、生産品質および一貫性を向上させる。
細胞トランスフェクションのための規定サイズの保存安定性があるプラスミドＤＮＡ／ポリカチオン粒子の調製方法
１．１ 概要
プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）およびポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）からなる高分子電解質複合体（ＰＥＣ）粒子は、遺伝子治療のためのレンチウイルスベクター（ＬＶＶ）を生産するために広く使用されている。ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子の現在のバッチ方式の調製は、特に大規模製造過程における再現性および安定性が制限されており、トランスフェクション結果およびＬＶＶ収量の制御が困難になっている。本開示の保護対象は、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子のサイズが高いトランスフェクション効率のための主要な決定要因であり、細胞取込制限メカニズムに起因して、最適なサイズは４００ｎｍ～５００ｎｍであると特定した。ビルディングブロックとして６０ｎｍのナノ粒子を使用して、サイズ制御され（４００ｎｍ）、保存安定性がある粒子を集めるため、動態ベースのアプローチが開発された。このボトムアップの工学過程の生産スケーラビリティも示されている。コロイド安定性およびトランスフェクション効率の維持は、業界標準プロトコルを使用して生成された不安定な粒子に対して検証された。この粒子製造方法は、ウイルス製造過程を効果的に合理化し、生産品質および一貫性を向上させる。
【0068】
そのため、本開示の保護対象は、６０ｎｍ～１０００ｎｍの広いサイズ範囲のｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子のトランスフェクション効率の最初の直接的な相関関係を提供し、接着培養液および懸濁培養液の両方において４００ｎｍ～５００ｎｍの最適なサイズを観察する。より詳細には、本開示の保護対象は、成長動態およびコロイド安定性の制御による６０ｎｍのナノ粒子のボトムアップ集合により、６０ｎｍ～１０００ｎｍの任意のサイズでｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子を生産する拡張可能な方法を提供する。この粒子シリーズを使用して定量分析が実施され、主要な律速段階は、細胞内送達過程におけるサイズ依存の細胞取込であることが明らかになった。トランスレーショナルポテンシャルを更に改善するため、最適化された４００ｎｍのｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子のオフザシェルフ製剤が設計され、物理的性質およびトランスフェクション活性を維持したまま、－８０°Ｃで優れた保存安定性を示した。すぐに使える形態のこれらの粒子は、治療に関連する複数のスケールで生産可能であった。工業生産システムにおいて検証したとき、これらの粒子により、標準的な手動の粒子調製方法により得られるものよりも優れた治療用ＬＶＶが生成されたことが重要である。
【0069】
１．２ 結果および考察
１．２．１ 粒径はトランスフェクション効率を支配する
異なるウイルス成分をコードする複数の種のｐＤＮＡが使用される、ＬＶＶ生産の典型的なトランスフェクション過程を示すため、１０％（４．４ｋｂ、ノンコーディング）、４５％（６．８ｋｂ、ｇＷｉｚ－Ｌｕｃルシフェラーゼレポーター）、および４５％（９．６ｋｂ、ノンコーディング）の比率の３つのｐＤＮＡが、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地に溶解された。図１Ａに示すスキームに続いて、５．５の窒素／リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比で１００μＬのＰＥＩ溶液（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中）を１００μＬのｐＤＮＡ溶液（５、１０、または２０μｇ ｍＬ－１）にピペットで移した後、混合方法として１０秒のボルテックスが使用された。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるトランスフェクション試験の前に、室温で０～６０分間インキュベーションが実施された。ｐＤＮＡの投与量が一定のとき、すなわち、１μｇ ｍＬ－１で１０４個の細胞あたり０．１μｇであるとき、ルシフェラーゼ発現により特徴付けられたトランスフェクション効率は、インキュベーション時間と鐘形の関係を示し、粒子調製においてＤＮＡ濃度が異なる場合、ピークは異なるインキュベーション時間で生じた（図１Ｂ）。ＤＮＡ濃度が増加するにつれ、最も高いトランスフェクション効率を達成するのに必要な時間は減少した。次に、動的光散乱（ＤＬＳ）によりｐＤＮＡおよびＰＥＩ溶液の混合時のインキュベーション時間に応じて、粒径がモニタリングされ、インキュベーション中、断定可能な方法でサイズが増加したことが分かった（図１Ｃ）。変数の数を減らすためのブリッジとしてインキュベーション時間を使用したとき、トランスフェクション効率が、ＤＬＳから得られたｚ平均粒子直径に対して、図１Ｄにプロットされた。粒子調製における異なるｐＤＮＡ濃度下で収集された全てのデータ点に適合する曲線により、強い相関性が現れた。これにより、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子のサイズに対するトランスフェクション効率の支配的な依存、および最も高い導入遺伝子発現レベルをもたらす４００ｎｍ～５００ｎｍの最適なサイズ範囲が示された。
１．２．１ 粒径はトランスフェクション効率を支配する
異なるウイルス成分をコードする複数の種のｐＤＮＡが使用される、ＬＶＶ生産の典型的なトランスフェクション過程を示すため、１０％（４．４ｋｂ、ノンコーディング）、４５％（６．８ｋｂ、ｇＷｉｚ－Ｌｕｃルシフェラーゼレポーター）、および４５％（９．６ｋｂ、ノンコーディング）の比率の３つのｐＤＮＡが、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地に溶解された。図１Ａに示すスキームに続いて、５．５の窒素／リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比で１００μＬのＰＥＩ溶液（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中）を１００μＬのｐＤＮＡ溶液（５、１０、または２０μｇ ｍＬ－１）にピペットで移した後、混合方法として１０秒のボルテックスが使用された。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるトランスフェクション試験の前に、室温で０～６０分間インキュベーションが実施された。ｐＤＮＡの投与量が一定のとき、すなわち、１μｇ ｍＬ－１で１０４個の細胞あたり０．１μｇであるとき、ルシフェラーゼ発現により特徴付けられたトランスフェクション効率は、インキュベーション時間と鐘形の関係を示し、粒子調製においてＤＮＡ濃度が異なる場合、ピークは異なるインキュベーション時間で生じた（図１Ｂ）。ＤＮＡ濃度が増加するにつれ、最も高いトランスフェクション効率を達成するのに必要な時間は減少した。次に、動的光散乱（ＤＬＳ）によりｐＤＮＡおよびＰＥＩ溶液の混合時のインキュベーション時間に応じて、粒径がモニタリングされ、インキュベーション中、断定可能な方法でサイズが増加したことが分かった（図１Ｃ）。変数の数を減らすためのブリッジとしてインキュベーション時間を使用したとき、トランスフェクション効率が、ＤＬＳから得られたｚ平均粒子直径に対して、図１Ｄにプロットされた。粒子調製における異なるｐＤＮＡ濃度下で収集された全てのデータ点に適合する曲線により、強い相関性が現れた。これにより、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子のサイズに対するトランスフェクション効率の支配的な依存、および最も高い導入遺伝子発現レベルをもたらす４００ｎｍ～５００ｎｍの最適なサイズ範囲が示された。
【0070】
１．２．２ ６０～１０００ｎｍの範囲に制御されたサイズの安定的なｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子の生産
粒径がトランスフェクション効率を支配するという知見は、我々に４００ｎｍ～５００ｎｍの制御されたサイズの保存安定性があるｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子を生産する方法を開発する動機を与えた。これまでに、このサイズ範囲程度のｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子を使用して細胞をトランスフェクトする実験が報告されている（Ｏｇｒｉｓら、１９９８；Ｚｈａｎｇら、２０１９）。しかしながら、安定性を維持しながら、この範囲で粒径および均一性を制御する具体的な取り組みは、これまでに報告されていない。
粒径がトランスフェクション効率を支配するという知見は、我々に４００ｎｍ～５００ｎｍの制御されたサイズの保存安定性があるｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子を生産する方法を開発する動機を与えた。これまでに、このサイズ範囲程度のｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子を使用して細胞をトランスフェクトする実験が報告されている（Ｏｇｒｉｓら、１９９８；Ｚｈａｎｇら、２０１９）。しかしながら、安定性を維持しながら、この範囲で粒径および均一性を制御する具体的な取り組みは、これまでに報告されていない。
【0071】
この範囲でｐＤＮＡの粒径を制御することは、特に難易度が高い。静的光散乱を使用した（Ｈｕら、２０１９）および分析超遠心を使用した（Ｔｏｃｋａｒｙら、２０１９）これまでの特徴付け作業では、単一のｐＤＮＡ分子からなる１つのｐＤＮＡ／ポリカチオンナノ粒子のサイズは２０ｎｍ～５０ｎｍのみであることが示され、これは、４００～５００ｎｍの粒子を構成するには、ほぼ数千コピーのｐＤＮＡが必要となることを示している（図６）。
【0072】
粒子集合過程の間、負の電荷を持つｐＤＮＡは、正の電荷を持つＰＥＩと電荷中和すると、凝集状態に崩壊する（Ｏｓａｄａら、２０１０）。集合動態は極めて速く、数百ミリ秒の時間スケールである一方、ｐＤＮＡおよび複合体の拡散速度はずっと緩やかである。よって、集合過程で極めて高いＤＮＡ濃度を使用しなければ、単一のステップで４００～５００ｎｍのサイズを達成することはできない。要求される濃度は１ｍｇ ｍＬ－１をはるかに超えると推定されるが、高粘度であるため、取り扱いおよびスケールアップが非常に難しくなる（Ｈｕら、２０１９）。
【0073】
これまでに（Ｈｕら、２０１９）、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子の集合の動態に関して、粒子の重量平均モル質量は、混合条件にかかわらず、ｚ平均粒子直径の３乗に直線的に比例していることが示唆されている。異なるＮ／Ｐ比にわたる結果も同様である。
【数1】
【0074】
概算では、二重鎖ｐＤＮＡの場合、１ｂｐあたり６５０Ｄａ、Ｎ／Ｐ＝２．７～３．０に相当する一定の結合ＰＥＩ分率（Ｈｕら、２０１９；Ｙｕｅ，Ｙ．ら、２０１１）、および４３Ｄａの線形ＰＥＩの一反復単位の分子量を採用した。そのため、単一のｐＤＮＡとそれに関連した全てのＰＥＩとの総モル質量は、１ｂｐあたり８８０Ｄａ程度と判定されうる。ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子あたりの理論的なｐＤＮＡペイロードと粒径との相関性は、続いて、上記の式から導き出すことができる。機能発現カスケードを持つ一般的なｐＤＮＡが４ｋｂｐ～１０ｋｂｐの範囲の長さを有することを考慮すると、４ｋｂｐ、７ｋｂｐ、または１０ｋｂｐの長さのｐＤＮＡの３つの例は、図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、ペイロード－サイズ相関性を示す。注目すべきは、４００～５００ｎｍの粒子は、４ｋｂｐのｐＤＮＡの場合、およそ１０００～２５００のｐＤＮＡを含み、１０ｋｂｐのｐＤＮＡの場合、５００～１０００のｐＤＮＡを含むが、これらは、短い粒子集合時間内に単一のステップで集めるには多すぎるということである。
【0075】
この課題を回避するため、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子の動態成長の特徴に基づくボトムアップの集合ストラテジーが開発された（図２Ａ）。まず、均一で小さなナノ粒子が低塩（伝導度：おおよそ０．４ｍＳ ｃｍ－１）、低ｐＨ（おおよそ３のｐＨ）の条件で調製され、これらのナノ粒子は、二次集合のためのビルディングブロックとして使用された。ＰＥＩの緩衝能力（Ｃｕｒｔｉｓら、２０１６）により、８０％を超える二次窒素群がｐＨ３でプロトン化される（すなわち、正の電荷を持つ）。この条件下で調製された個々のナノ粒子は、粒子表面に存在しているＰＥＩ分子の正味の正電荷による凝集に対して十分安定的である。
【0076】
培地がｐＨ７に切り替えられると、ナノ粒子表面は十分に脱プロトン化する（ゼータ電位はおおよそ＋４０ｍＶから＋２０ｍＶに低下する）。食塩誘発性の電荷スクリーニングの残留表面電荷と関連するデバイ長の短縮と結び付いて、培地条件の変更は、ナノ粒子の粒子会合およびサイズ成長のトリガーとなる。なお、イオン強度がｐＤＮＡ／ＰＥＩ ＰＥＣの解離（Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒら、２００６）を誘発せず、ナノ粒子会合を引き起こすだけのレベルで制御される必要があることが重要である。粒子成長は、培地の粒子濃度およびイオン強度により判定される速度で、主にファンデルワールス力により駆動される。粒子成長は、（粒子表面を再プロトン化するため）ｐＨを３に反転させることにより、かつイオン強度を減少させるための希釈により、効果的に抑制され、それにより長期のデバイ・スクリーニングが再構築される。
【0077】
ビルディングブロックのｐＤＮＡ／ＰＥＩナノ粒子は、高流量誘導の乱流混合下、閉じ込め衝突ジェット（ＣＩＪ）ミキサー（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＰｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ、２００３；Ｈａｏら、２０２０）で、ＦＮＣ技術（Ｓａｎｔｏｓら、２０１６；Ｈｕら、２０１９）を使用して調製された。そのような混合条件により、ｐＤＮＡおよびＰＥＩ溶液の特徴的な混合時間が、特徴的なナノ粒子集合時間よりも短くなり、均一な集合動態および制御されたナノ粒子サイズおよび組成が達成される（Ｈｕら、２０１９）。１００μｇ／ｍＬの入力ｐＤＮＡ濃度により、ｐＤＮＡ／ＰＥＩナノ粒子は、ＤＬＳおよび透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により測定された６６．０±１．０ｎｍの平均サイズを保持した（図２Ｂおよび図７Ａ）。
【0078】
提案されたストラテジーは、まず、粒子集合方法としてピペット操作を使用した小さなバッチスケールで試験された。ナノ粒子懸濁液は、同量のＰＢＳと混合されることにより検証され、これにより、ゆっくりとしたサイズ成長が引き起こされた。成長率は、ＰＢＳ濃度に依存した（図２Ｂ）。ＰＢＳの緩衝成分がｐＨ変化をもたらし、粒子の均一性を維持するために重要であった一方、塩成分は主に成長動態を決定したことも明らかになった（図８）。
【0079】
１倍のＰＢＳのチャレンジを進め、成長曲線に沿った異なる時点で、同量の、２０ｍＭのＨＣｌを含む１９％ｗ／ｗのトレハロース（抗凍結剤）と混合することで成長を抑制することにより、高い均一性で（図２Ｄ）、２００、３００、４００、５００、７００、および９００ｎｍ（図２Ｃ）に、平均粒径を上手く安定化させた。これらのサイズは、原理の証明として意図的に選択されたが、任意の他の所望のサイズも、異なる時点で成長を停止するにより容易に達成されうる。５００ｎｍ未満の平均サイズの全ての粒子は、調製培地において、環境温度で少なくとも４時間安定的であった（図２Ｃ）。より大きな粒子は、これらの条件下でずっとゆっくりとした速度であっても、４時間で約１００ｎｍ成長し続けた。
【0080】
ＰＢＳの組成は、２つのサブセット：ｐＨ緩衝成分（すなわちＮａ２ＨＰＯ４およびＫＨ２ＰＯ４）および非緩衝塩成分（すなわちＮａＣｌおよびＫＣｌ）に分類できた。６０ｎｍのナノ粒子の成長を誘発するため、同一のイオン強度で１倍のＰＢＳの非緩衝塩成分のみを使用したとき、１倍のＰＢＳと比較して非常にゆっくりとした成長率が示された（図８Ａ）。２００ｍＭの高いＮａＣｌ濃度を使用すると、成長率は同程度まで上昇した。ＮａＣｌ単独では、しかしながら、均一な粒子を生成できなかった。同量の、２０ｍＭのＨＣｌを含む１９％ｗ／ｗのトレハロースと混合することにより粒子が安定化すると、多分散性指数（ＰＤＩ（図８Ｂ）、高い均一性は低いＰＤＩ値と相関関係を持つ）およびサイズ分布（図８Ｃ）は、両方のＮａＣｌ濃度によるチャレンジから、粒子の不均一な性質を示した。これは、非常に低いＰＤＩ（図８Ｂ）およびはっきりと異なるサイズピーク（図２Ｄ）が得られる１倍のＰＢＳによる誘発により調製された粒子と著しい対照を成した。サイズ成長メカニズムに関して、ＰＥＩの不十分な脱プロトン化は、粒子会合に対する追加的な障壁を生じさせた。これにより、システムは、拡散、活性化、およびもしかすると粒径の関数である立体効果により同時に制御されうる。
【0081】
６０ｎｍのナノ粒子を（１００μｇ ｍＬ－１のＤＮＡ濃度で）同量の１倍のＰＢＳと混合すると、懸濁液のｐＨはおおよそ３から７に増加した。非緩衝塩を含まないＮａＯＨ溶液と直接混合することによりｐＨが５～８に変更されたとき（図８Ｄ）、サイズ成長は観察されなかった（図８Ｅ）。粒子のサイズは上方にシフトしたが、この観察結果は、低塩環境におけるＰＥＩのゆっくりとした脱プロトン化と関連する形状変換の結果かもしれない（Ｓａｎｔｏｓ，Ｊ．Ｌ．ら、２０１６）。ｐＨが９を超えてシフトしたときのみ、遅延性の制御できないほど速いサイズ成長が誘発された。ＰＥＩのプロトン化分率が、なお７～８のｐＨ範囲の４０％よりわずかに高いことを考慮すると、このデータセットにより、部分的な脱プロトン化は粒子会合を誘発するには十分ではなく、粒子表面上に残っている電荷のスクリーニングは不可欠であることが示された。よって、ＰＢＳ中の非緩衝塩は、成長動態の主要な決定要因として機能した。
【0082】
提案されたサイズ制御メカニズムは、成長粒子および安定化された粒子の位相解析光散乱（ＰＡＬＳ）およびＰＥＩ組成評価（Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒら、２００４）によるゼータ電位測定により検証された（図２Ｆ）。１倍のＰＢＳによるチャレンジの際、ゼータ電位は、＋３７ｍＶから＋２０ｍＶに低下し、ＨＣｌ溶液により一旦安定化されると、元のレベルに戻った。変化の２つのステップは、ｐＤＮＡによる電荷中和（結合ＰＥＩの増加）に関わるＰＥＩ分子を増加させるＰＥＩの脱プロトン化、および効果を反転させるＰＥＩの再プロトン化と関連していた。制御された成長ステップ中、適切なイオン強度の存在下でポテンシャルエネルギー障壁を乗り越えるには、＋２０ｍＶのゼータ電位で十分であった。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析により、境界面で結合した元の個々のナノ粒子の会合の形態および性質を示すＤＬＳ測定結果が確認された（図２Ｆ－２、図２Ｆ－３、図２Ｆ－４、および図７Ｂ、図７Ｃ）。安定化された４００ｎｍの粒子は、高レベルの均一性を有する均一に分布した凝集体構築物として存在した（図２Ｃ－５、図２Ｃ－６、図２Ｃ－７、および図７Ｄ）。成長を抑制するのに適切なＨＣｌ濃度は、成長期中に追加された緩衝塩を完全にプロトン化するのに必要なＨＣｌ濃度に近い。より低いまたはより高い濃度では、安定化に効果がなかった、または、それぞれ、粒子の縮小およびＤＮＡ分解をもたらした（図２Ｇ）。これらの安定性測定基準も、これらの粒子のトランスフェクション効率により確認された。
【0083】
１．２．３ 制御されたサイズの安定的なｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子のトランスフェクション効率
安定化された粒子は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の単層培養液またはＨＥＫ２９３Ｆ細胞の懸濁培養液に投与され、レポーターとしてのルシフェラーゼまたはＧＦＰのいずれかをコードするｐＤＮＡを使用して、それらの粒子のトランスフェクション効率が試験された。トランスフェクション実験のため、粒子懸濁液は、１μｇ ｐＤＮＡ ｍＬ－１の濃度に希釈され、これにより、ｐＨが中性かつ高塩濃度の培地におけるトランスフェクション条件下での更なるサイズ成長が効果的に制限された（図９）。
安定化された粒子は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の単層培養液またはＨＥＫ２９３Ｆ細胞の懸濁培養液に投与され、レポーターとしてのルシフェラーゼまたはＧＦＰのいずれかをコードするｐＤＮＡを使用して、それらの粒子のトランスフェクション効率が試験された。トランスフェクション実験のため、粒子懸濁液は、１μｇ ｐＤＮＡ ｍＬ－１の濃度に希釈され、これにより、ｐＨが中性かつ高塩濃度の培地におけるトランスフェクション条件下での更なるサイズ成長が効果的に制限された（図９）。
【0084】
なお、粒子を、細胞と相互作用しているときにトランスフェクション培地（生理食塩条件、中性ｐＨ）に追加すると、粒子はより大きなサイズに成長できたことは重要である。成長動態は、希釈（２５μｇ ｐＤＮＡ ｍＬ－１から１μｇ ｐＤＮＡ ｍＬ－１に２５倍）により課された拡散限界のためゆっくりであり、サイズ成長は、初めのサイズが小さいほど顕著であった（図９Ａ、図９Ｂ）。しかしながら、６０ｎｍまたは２００ｎｍの粒子を例にすると、細胞とのインキュベーションの時間スケール（単層トランスフェクションの場合は４時間、懸濁トランスフェクションの場合は全培養期間、すなわち、４８時間）内での顕著なサイズ成長でも、粒子をより効果的にすることはなかった（図３）。この観察結果により、トランスフェクション培地中の希釈された形態でのサイズ成長が、制御可能な方法によるサイズ成長と異なるかどうかを検討することになった（図２）。ＴＥＭ画像により、以下のことが確認された：（１）６０ｎｍのナノ粒子では確かにサイズ成長が見られた。培地が希釈されると間もなく、広範囲のサイズの粒子が観察できた。緑の矢印は１００ｎｍ未満のナノ粒子を指し、黄色の矢印は１００ｎｍ～２５０ｎｍの粒子を指し、赤の矢印は２５０ｎｍを超える粒子を指す（図９Ｃ）。同一の時点において、ＤＬＳは、２５０ｎｍのｚ平均サイズ測定値を示した。３時間後、粒子は、４００ｎｍのサイズ範囲の安定化された粒子（図２Ｆ、および図７Ｄ）と比較して形態に有意差なく、不均一により大きく成長した（図９Ｄ）；（２）４００ｎｍの粒子は、トランスフェクション培地において希釈して２０分または３時間後にサンプリングされたとき、元の形態を明確に維持していた（図８Ｅ、図８Ｆ）。インキュベーション中にサイズ成長も見られた。
【0085】
ＴＥＭ観察結果は、トランスフェクション培地においてゆっくりとしたサイズ成長が生じたというＤＬＳモニタリング結果を裏付けた。しかしながら、培地におけるサイズ成長の能力があるにも関わらず、トランスフェクション培地に投与する前にサイズが３００ｎｍ未満の粒子には効果がない理由は、理解できないままである。これについては、将来的な調査が必要であり、安定した方法でトランスフェクションの投与前に粒径を制御する重要性が強調されている。
【0086】
ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子の観察は、酢酸ウラニルを使用したネガティブ染色により可能になった。正の電荷を持つＰＥＩ表面を有する安定化された粒子は、正の電荷を持つ染料と混じり合わず、優れた３Ｄ構造を示す画像において著しい対照を成す（図２Ｆ、図７）。トランスフェクション培地において、主に表面電荷がスクリーニングされる。染料浸透およびそのｐＤＮＡとの相互作用は著しく、粒子コアに染料が集中し、暗すぎて観察ができなくなった。このような場合には、図９の全ての画像に、２～４のべき乗のガンマ補正が適用され、暗いエリアを明るくした。これにより、取得された画像の解像度および品質は犠牲になったが、全般的な考察および結論には影響がなかった。
【0087】
ルシフェラーゼ活性の読み出し（図３Ａ）により、図１Ｄで観察された単層培養液における４００ｎｍという最適なサイズが検証され、懸濁培養液における５００ｎｍという最適なサイズが示された。ＧＦＰの読み出し（図３Ｂ、図３Ｃ）により、単層培養液においては、２００ｎｍ～３００ｎｍで質的な効率ジャンプが生じ、４００ｎｍで定常に達する一方、懸濁培養液においては、３００ｎｍ～４００ｎｍで質的な効率ジャンプが生じ、５００ｎｍで定常に達することが示唆された。ルシフェラーゼおよびＧＦＰレポーターの傾向は、６０ｎｍ～５００ｎｍの粒径ではよく一致していたが、５００ｎｍを超える粒子では異なっていた。これは恐らく、２つのレポーターの発現動態、タンパク質安定性、および評価方法が異なることに起因する。明らかに、２００ｎｍ未満のサイズの小さい粒子は、最終的にトランスフェクション培地で成長して大きくなったとしても、トランスフェクションにおいては効果がなかった（図８）。懸濁培養液において、粒子は、トランスフェクション培地から除去されず、４８時間の全培養期間にわたって細胞にアクセスしていた。そのため、結果には、細胞に投与する前に粒径を制御する重要性が示された。
【0088】
１．２．４ サイズ依存のトランスフェクション効率のための細胞内輸送メカニズム
トランスフェクションにとっての２つの主要な細胞内障壁（ＬａｃｈｅｌｔおよびＷａｇｎｅｒ、２０１５）である、異なるサイズのｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子の細胞取込およびエンドソーム脱出を評価するため、ｐＤＮＡは、Ｃｙ５で標識され、評価ツールとして、ＧＦＰと融合したガレクチン－８（Ｇａｌ８）を発現する遺伝子組換えＢ１６Ｆ１０細胞株が使用された。サイトゾル中に分布したＧａｌ８タンパク質は、エンドソーム小胞の損傷時に露出した細胞膜グリカンに結合し、その後、凝集して、ＧＦＰ斑点を形成する（図４Ａ）（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、２０１２）。これまでの報告により、カチオン性ポリマーによるｓｉＲＮＡ（Ｋｉｌｃｈｒｉｓｔら、２０１９）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質（Ｒｕｉら、２０１９）の送達効率が、細胞あたりで検出されたＧａｌ８スポットの平均数、すなわち、成功したエンドソーム脱出イベントと正に相関することが示唆されている。
トランスフェクションにとっての２つの主要な細胞内障壁（ＬａｃｈｅｌｔおよびＷａｇｎｅｒ、２０１５）である、異なるサイズのｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子の細胞取込およびエンドソーム脱出を評価するため、ｐＤＮＡは、Ｃｙ５で標識され、評価ツールとして、ＧＦＰと融合したガレクチン－８（Ｇａｌ８）を発現する遺伝子組換えＢ１６Ｆ１０細胞株が使用された。サイトゾル中に分布したＧａｌ８タンパク質は、エンドソーム小胞の損傷時に露出した細胞膜グリカンに結合し、その後、凝集して、ＧＦＰ斑点を形成する（図４Ａ）（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、２０１２）。これまでの報告により、カチオン性ポリマーによるｓｉＲＮＡ（Ｋｉｌｃｈｒｉｓｔら、２０１９）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質（Ｒｕｉら、２０１９）の送達効率が、細胞あたりで検出されたＧａｌ８スポットの平均数、すなわち、成功したエンドソーム脱出イベントと正に相関することが示唆されている。
【0089】
粒子取り込み（Ｃｙ５スポット）およびエンドソーム脱出（ＧＦＰスポット）の両方が、１、２、４、または８時間の粒子の処理の際に、固定細胞に対するセロミクスハイコンテント解析（ＨＣＡ）により定量的に分析された（全データパネルは図１２、図１４にある）。認識された粒子は、粒径が増加するにつれ、面積および強度において明確な増加傾向を示した（図４Ｂ～図４Ｄおよび図１０および図１１）。なお、図１４Ａおよび図１４Ｂの２時間のデータ点は図４Ｅにも示され、図１４Ｃの全てのデータ点は図４Ｈに示され、図１４Ｄの全てのデータ点は図４Ｉに示され、図１４Ｅの２時間のデータ点は図４Ｆに示される。
【0090】
図１１の共焦点レーザー走査顕微鏡による観察により、以下のハイスループットセロミクス測定の主要な知見が裏付けられた：（１）粒径差は、異なる群間で、細胞内で明確に区別され、大きな粒子ほど、大きなＧａｌ８－ＧＦＰ斑点により示唆される大きな細胞内小胞を誘発した；（２）エンドソーム脱出のレベルは、全体の取り込みレベルに対応し、サイズが大きいほど、エンドソーム脱出が強くなる。
【0091】
以下のことも注目すべきである：（１）白の矢印は、粒子シグナルと、エンドソーム脱出指標のＧａｌ８－ＧＦＰ斑点との重なりを示す。これにより、いくつかの粒子は、エンドソームの破裂を誘発するが、損傷した小胞膜となお結合していることが示唆されている；（２）９００ｎｍの群における黄色の矢印は、エンドソームから脱出したばかりの巨大な粒子から解離したと思われるサテライト状に分布した小さな粒子を示す。巨大な粒子の本体は、損傷した小胞膜となお結合している；（３）より小さな粒子、特に２００ｎｍの群の粒子の場合、図１１Ｂの２００ｎｍおよび４００ｎｍの群の下のパネルに示すように、粒子は、細胞が表面に付着する基底外側の近くに集中した。そのような特徴は、９００ｎｍの群では観察されなかった。（２）および（３）の意味するところは、なおはっきりしないものであるが、本研究の焦点ではない。
【0092】
なお、図１０に示す画像は、セロミクスにより取得された画像のプールからランダムに選択されている（各サイズ群９０枚中の１枚）。粒子－細胞相互作用をより詳細に示すため、画像の元の面積の１／４のフレームが代表的な領域を含んで作られ、続いて４倍に拡大されることで図４Ｂの各画像が生成された。
【0093】
なお、図１２Ａおよび図１２Ｂの２時間のデータ点は図４Ｄに示され、図１２Ｃの２時間のデータ点は図４Ｆに示され、図１２Ｄの全てのデータ点は図４Ｇの本文に示され、図１２Ｅの２時間のデータ点は図４Ｆに示される。
【0094】
図１２Ａおよび図１２Ｂは、トリチウムで標識されたｐＤＮＡによる粒子の細胞取込の検証を示す。図１２Ａは、異なるサイズの粒子の対象サンプル（０．５μｇのｐＤＮＡを有する安定化された粒子の１００μＬの懸濁液）で検出された１分あたりの壊変イベント（ＤＰＭ）であり、シンチレーションアッセイに粒径は影響しないことを示している。図１２Ｂは、１０４個の細胞あたり０．１μｇのｐＤＮＡの総投与量に対する、２または４時間の粒子インキュベーション後の、異なるサイズの粒子の絶対的な取り込み測定値を示す。
【0095】
ｐＤＮＡの３Ｈ標識および絶対的な細胞ｐＤＮＡ取り込みの評価の方法は、これまでの報告に十分に記載されている（Ｈｕら、２０１９；Ｗｉｌｌｉｆｏｒｄら、２０１６）。この放射性基質トリチウムの使用は、ジョンズ・ホプキンス大学の放射線安全管理室により承認された。簡潔に言えば、ｐＤＮＡは、ＳＡＭ［３Ｈ］（アデノシル－Ｌ－メチオニン、Ｓ－［メチル－３Ｈ］）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳＡ）を基質としてメチルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、ＵＳＡ）により仲介されたメチル化反応を通して３Ｈにより標識された。ｐＤＮＡは、続いて、標準的なＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｐＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用したカラム洗浄を受けた。標識されたｐＤＮＡは、本文に記載されているように、粒子の製剤および細胞への投与前に、非標識ｐＤＮＡと混合された。投与後１または２時間で、粒子を含むトランスフェクション培地が排出され、続いて、ヘパリン含有ＰＢＳ（１００ＩＵ ｍＬ－１、表面に結合した粒子を除去するため）および新しいＰＢＳでの強い洗浄が行われた。細胞は、同量のＳＯＬＶＡＢＬＥ溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳＡ）と混合されたライセートにより、レポーター溶解バッファー中、２回の凍結解凍サイクルにより溶解された。ＳＯＬＶＡＢＬＥ溶液は、続いて追加されたＵｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄシンチレーション液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳＡ）にアクセスした３Ｈ標識ヌクレオチドを可溶化した。放射活性（壊変毎分、ＤＰＭ、絶対的な３Ｈ量の定量的測定）は、Ｔｒｉ－Ｃａｒｂ ２２００ＣＡ液シンチレーションアナライザー（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）により評価された。
【0096】
粒子が大きくなるほど、平均面積および強度が大きいＧａｌ８スポットを誘発した（図４Ｅ）が、これは、Ｇａｌ８結合の表面積が大きくなるほど、脱出イベントに先立って大きな細胞内小胞が形成されることを示している。これらのｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子のサイズ範囲（９００ｎｍまで）がクラスリン依存または非依存のエンドサイトーシス経路（Ｒｅｊｍａｎら、２００４；ＭａｙｏｒおよびＰａｇａｎｏ、２００７）に許容できる典型的なサイズを超えていることを考慮すると、これらの粒子の取り込みは、貪食様経路を通る可能性が高い（Ｋｏｐａｔｚら、２００４）。粒子あたりのｐＤＮＡペイロードの増加の結果としての粒子の個数濃度の減少を考慮すると、サイズが増加するにつれて細胞あたりの粒子数が低下した（図４Ｆ）ことは予測通りであった。それにもかかわらず、より大きな粒子が少ないほど、エンドソーム脱出の効率はずっと高く、Ｇａｌ８スポット陽性細胞のパーセンテージが高いことが示された（図４Ｆ）。Ｇａｌ８スポット陽性のパーセンテージは、導入遺伝子発現陽性のパーセンテージと概して一致する（図３Ｂ）ことも注目すべきである。総取り込み量（細胞あたりの平均総粒子強度、および図１３に記載された別の定量的な３Ｈ標識ＤＮＡアッセイより測定）は、６０ｎｍ～５００ｎｍのサイズ範囲の全ての時点において急激な増加を示し、粒径が５００ｎｍから９００ｎｍに増加するにつれ、わずかに増加した（図４Ｇ）。各群の細胞あたりの平均Ｇａｌ８スポット数が測定され、トランスフェクション効率と強く相関していると報告された全体のエンドソーム脱出レベルが評価された（図４Ｈ）（Ｋｉｌｃｈｒｉｓｔら、２０１９；Ｒｕｉら、２０１９）。Ｇａｌ８スポット面積および強度において観察された差異（図４Ｅ）を考慮すると、細胞あたりの平均総Ｇａｌ８スポット強度により、全体のエンドソーム脱出レベルのより良い評価がもたらされる（図４Ｉ）。加えて、取り込みおよびエンドソーム脱出の動態は、異なる長さの粒子インキュベーションの後、ルシフェラーゼ発現の動態と一致した（図４Ｊ）。４００ｎｍ（ＨＥＫ２９３Ｔ）または５００ｎｍ（ＨＥＫ２９３Ｆ）より大きなサイズの粒子により仲介されたトランスフェクション効率が、粒子の取り込みおよびエンドソーム脱出の程度が高いにも関わらず、低下した理由は、将来的な研究で解明される予定であるが、細胞の代謝活性の変化に起因するものではなかった（図１５）。
【0097】
図１５のデータについて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が単層培養液中で４時間ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子とインキュベートされた後、アラマーブルー試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）がＨＥＫ２９３Ｔ細胞に追加された、またはアラマーブルー試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）がｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子と共にＨＥＫ２９３Ｆ細胞に追加された。アッセイ試薬は、単層培養液の場合は２０時間、懸濁培養液の場合は４８時間、培地内に残っていた。１００％の基準レベルは、無粒子のトランスフェクション培地で処理された対照細胞に由来した。５７０ｎｍおよび６００ｎｍの波長における吸光度ベースのアッセイは、製造業者のプロトコルに従って１００μＬの最終培地で実施された。
【0098】
結果を以下に示す：（１）粒子のサイズが大きくなるにつれて取り込みが増加したが、それに伴う細胞の代謝活性の低下は見られなかった。これにより、４００／５００ｎｍ～９００ｎｍで見られるトランスフェクション効率の低下は、粒子およびＰＥＩの高い取り込みレベルに起因する潜在的な細胞毒性により説明できないことが示唆された；（２）最も高いトランスフェクション効率を誘発する粒径、つまり単層培養液の場合は４００および５００ｎｍ、懸濁培養液の場合は４００ｎｍ、５００ｎｍ、および７００ｎｍで、代謝活性のわずかな減少が見られた。この観察結果が示唆するところは、今のところ不明である。
【0099】
ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子媒介トランスフェクションについて、プレートウェル平均（図４Ｋ）または単一細胞レベル（図４Ｌ）における細胞取込とエンドソーム脱出との関係が分析された。エンドソーム脱出イベントは、主に、粒子との１時間のインキュベーション後に生じた。単一の直線回帰は、粒径にかかわらず、投与後２時間および４時間後のプレートウェル平均測定値（図４Ｋ）の全てのデータ点により共有された。単一の細胞レベルにおける異なる粒径にわたるヒートマップにおいて、最も高い細胞密度の全てのエリアにわたり、正の相関関係が見られた（図４Ｌおよび図１６、セロミクスによりエクスポートされ、ＦｌｏｗＪｏにより処理されたＦＡＣＳファイルを使用してプロット）。これらの分析により、エンドソーム脱出の程度は、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子の細胞取込の程度に対応することが示され、観察されたトランスフェクション効率は、細胞取込により制限されたサイズ依存のメカニズムにより制御された。
【0100】
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の懸濁培養液において、異なるサイズの粒子の細胞取込は、３Ｈ－ＤＮＡアッセイにより定量化され、共焦点レーザー走査顕微鏡により直接観察されたように、ＨＥＫ２９３ＴまたはＢ１６Ｆ１０－ＧＦＰ－Ｇａｌ８細胞の単層培養液における知見と一致していることが分かった（図１７）。この知見により、異なるサイズの粒子のトランスフェクション活性に見られた類似性が部分的に説明された（図３）。
【0101】
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の懸濁培養液が、単層培養液とよく似た結果を示した（図１０、図１１）ことは注目に値する：（１）細胞体内の粒子は、それらの比較的制御されたサイズの通りに、はっきりと異なるサイズを示した（図１７Ａ）が、これにより、トランスフェクション培地中に希釈された性質が、動力学的に粒子の成長を制限し、それらのサイズを維持した（図９）こと、かつ、投与前にサイズを制御することが重要であることが再度証明された；（２）画像により定性的に示され、３Ｈ標識アッセイ（方法は、図１３の関連注記に記載）により定量的に証明されたように、取り込みは、粒径と正に相関した。このアッセイにより、細胞内ｐＤＮＡ量は、投与後１時間以内にピークに達し、培養が続くにつれ減少することが更に明らかになり、単層培養液との取り込み動態の極端な差異が示された。これは、投与後間もなくの急速な細胞－粒子接触を可能にした懸濁培養液における厳しい混合条件の結果であるかもしれない。そのような条件下でも、大きな粒子ほど、高い取り込み率を示した。これらの知見により、粒径の制御は、レンチウイルスベクターの生産のための一過性トランスフェクション過程の最適化のカギであるという見解が強化された。
【0102】
１．２．５ 濃縮された４００ｎｍの粒子のスケールアップ製造およびＬＶＶ生産のための製品検証
粒子集合過程は、ＣＩＪデバイスにおいて比較的高い流量（例えば、４０ｍＬ ｍｉｎ－１）で２つの混合ステップ（粒子成長および安定化）を実施することによりスケールアップできた。大きなバイオリアクターで要求される大量の粒子を生成するには、なおかなりの時間がかかるため、図２Ｃに示す速い成長動態は、実際的でなかった。このことに対処するため、ｐＤＮＡ濃度を２倍として必要量を減らし、粒子のサイズ制御、安定性、およびトランスフェクション効率を検証した（図１８）。培地のイオン強度は、操作のしやすさのため粒子成長率を１～３時間以内に制御する粒子成長ステップのために最適化された（図５Ａ）。図５Ｂに合理化されたように、粒子成長時間の延長を考慮すると、成長粒子をＣＩＪミキサー＃２から流し出し、ＣＩＪミキサー＃３に溶液を充填するのに必要な時間はわずかであった。これにより、全過程が操作者非依存で、再現性が高くなり、インキュベーションの正確なタイミングに影響を受けにくくなる。粒子成長培地のイオン強度の低下、およびその結果としての、安定化ステップにおいてｐＨを戻すために必要な酸の量の低下は、粒子のコロイド安定性の維持および保存中のトランスフェクション活性の維持に追加的な利益をもたらした。粒子は、環境温度での懸濁液形態においては２日間（図５Ｃ）、－８０°Ｃで保存されたときには４カ月より長く（図５Ｄ）、安定的であった。保存期間中、異なる時点でサンプルから解凍すると、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子は、物理的性質およびトランスフェクション効率においてわずかな変化を示した。
粒子集合過程は、ＣＩＪデバイスにおいて比較的高い流量（例えば、４０ｍＬ ｍｉｎ－１）で２つの混合ステップ（粒子成長および安定化）を実施することによりスケールアップできた。大きなバイオリアクターで要求される大量の粒子を生成するには、なおかなりの時間がかかるため、図２Ｃに示す速い成長動態は、実際的でなかった。このことに対処するため、ｐＤＮＡ濃度を２倍として必要量を減らし、粒子のサイズ制御、安定性、およびトランスフェクション効率を検証した（図１８）。培地のイオン強度は、操作のしやすさのため粒子成長率を１～３時間以内に制御する粒子成長ステップのために最適化された（図５Ａ）。図５Ｂに合理化されたように、粒子成長時間の延長を考慮すると、成長粒子をＣＩＪミキサー＃２から流し出し、ＣＩＪミキサー＃３に溶液を充填するのに必要な時間はわずかであった。これにより、全過程が操作者非依存で、再現性が高くなり、インキュベーションの正確なタイミングに影響を受けにくくなる。粒子成長培地のイオン強度の低下、およびその結果としての、安定化ステップにおいてｐＨを戻すために必要な酸の量の低下は、粒子のコロイド安定性の維持および保存中のトランスフェクション活性の維持に追加的な利益をもたらした。粒子は、環境温度での懸濁液形態においては２日間（図５Ｃ）、－８０°Ｃで保存されたときには４カ月より長く（図５Ｄ）、安定的であった。保存期間中、異なる時点でサンプルから解凍すると、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子は、物理的性質およびトランスフェクション効率においてわずかな変化を示した。
【0103】
１．３ 実験セクション
１．３．１ 細胞培養およびトランスフェクションの研究
単層培養液の研究では、トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＵＳＡ；ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳおよび２ｍＭのＬ－グルタミン中で維持、３７°Ｃ、５％のＣＯ２、および飽和湿度）が、２５，０００細胞 ウェル－１の細胞密度で２４－ウェルプレートに散布された。粒子は、５ｍｌの微小遠心管内でＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地にピペットで移され、続いて速やかに１０秒間ボルテックスされ、１μｇ ｐＤＮＡ ｍＬ－１の最終粒子濃度に達した。例えば、２５μｇ ｐＤＮＡ ｍＬ－１の１００μＬの粒子懸濁液が、２．４ｍＬの無血清のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地にピペットで移された。ウェル内の元の培地は、続いて排出され、５００μＬの粒子含有培地により置き換えられた。投与後４時間で、培地は、新しい満タンの培地により置き換えられた。その後の２０時間のインキュベーションにより、導入遺伝子発現が可能になった。懸濁培養液の研究では、トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ；ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地中で維持、３７°Ｃ、８％のＣＯ２、および飽和湿度）が、０．５×１０６細胞 ｍＬ－１の細胞密度で、ＳｐｉｎΩＴＭ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓプレートスピナ（３Ｄｎａｍｉｃｓ、ＵＳＡ）を備える１２－ウェルプレートに散布された。スピナは、実験の期間中、１分あたり１５０回転の速度でモーター駆動された。粒子は、ウェルにピペットで一度に移され、続いてプレートは短時間シェイクされ、１μｇ ｐＤＮＡ ｍＬ－１の最終粒子濃度がもたらされた。例えば、２５μｇ ｐＤＮＡ ｍＬ－１の８０μＬの粒子懸濁液が、単一のウェル内で２ｍＬの細胞懸濁液にピペットで移された。全プレートで終了すると、スピナが再接続された。その後の４８時間のインキュベーションにより、導入遺伝子発現がピークに達した。レポーターとしてルシフェラーゼを特徴付けるとき、細胞は、標準化されたルシフェラーゼサンプル（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）により生成されたラダーに対してルシフェリンアッセイ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を追加する際、ルミノメーターにより特徴付けられたライセートを有して、２つの凍結解凍サイクルを使用して、レポーター溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）により溶解された。レポーターとしてＧＦＰを特徴付けるとき、細胞は、１％のＦＢＳおよび０．５ｍＭのＥＤＴＡが補充されたＰＢＳ中で、トリプシン－ＥＤＴＡにより懸濁され、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）により分析された。
１．３．１ 細胞培養およびトランスフェクションの研究
単層培養液の研究では、トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＵＳＡ；ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳおよび２ｍＭのＬ－グルタミン中で維持、３７°Ｃ、５％のＣＯ２、および飽和湿度）が、２５，０００細胞 ウェル－１の細胞密度で２４－ウェルプレートに散布された。粒子は、５ｍｌの微小遠心管内でＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地にピペットで移され、続いて速やかに１０秒間ボルテックスされ、１μｇ ｐＤＮＡ ｍＬ－１の最終粒子濃度に達した。例えば、２５μｇ ｐＤＮＡ ｍＬ－１の１００μＬの粒子懸濁液が、２．４ｍＬの無血清のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地にピペットで移された。ウェル内の元の培地は、続いて排出され、５００μＬの粒子含有培地により置き換えられた。投与後４時間で、培地は、新しい満タンの培地により置き換えられた。その後の２０時間のインキュベーションにより、導入遺伝子発現が可能になった。懸濁培養液の研究では、トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ；ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地中で維持、３７°Ｃ、８％のＣＯ２、および飽和湿度）が、０．５×１０６細胞 ｍＬ－１の細胞密度で、ＳｐｉｎΩＴＭ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓプレートスピナ（３Ｄｎａｍｉｃｓ、ＵＳＡ）を備える１２－ウェルプレートに散布された。スピナは、実験の期間中、１分あたり１５０回転の速度でモーター駆動された。粒子は、ウェルにピペットで一度に移され、続いてプレートは短時間シェイクされ、１μｇ ｐＤＮＡ ｍＬ－１の最終粒子濃度がもたらされた。例えば、２５μｇ ｐＤＮＡ ｍＬ－１の８０μＬの粒子懸濁液が、単一のウェル内で２ｍＬの細胞懸濁液にピペットで移された。全プレートで終了すると、スピナが再接続された。その後の４８時間のインキュベーションにより、導入遺伝子発現がピークに達した。レポーターとしてルシフェラーゼを特徴付けるとき、細胞は、標準化されたルシフェラーゼサンプル（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）により生成されたラダーに対してルシフェリンアッセイ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を追加する際、ルミノメーターにより特徴付けられたライセートを有して、２つの凍結解凍サイクルを使用して、レポーター溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）により溶解された。レポーターとしてＧＦＰを特徴付けるとき、細胞は、１％のＦＢＳおよび０．５ｍＭのＥＤＴＡが補充されたＰＢＳ中で、トリプシン－ＥＤＴＡにより懸濁され、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）により分析された。
【0104】
１．３．２ 異なるサイズの安定的な粒子の集合
ビルディングブロックとしてのｐＤＮＡ／ＰＥＩナノ粒子が、これまでの報告（Ｓａｎｔｏｓら、２０１６；Ｈｕら、２０１９）に基づいてまず合成された。簡潔に言えば、ｐＤＮＡ（レポーターとして、Ａｌｄｅｖｒｏｎ、ＵＳＡのｇＷｉｚ－ＬｕｃまたはｇＷｉｚ－ＧＦＰを有する複数の種）およびＰＥＩｐｒｏ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、フランス）が、別々に超純水中に溶解され、続いて２０ｍＬ ｍｉｎ－１の流量で閉じ込め衝突ジェット（ＣＩＪ）ミキサーにポンプで注入された（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＰｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ、２００３；Ｈａｏら、２０２０）。濃度は、１００μｇ ｐＤＮＡ ｍＬ－１（図２、６０～７０ｎｍのナノ粒子を生成）または２００μｇ ｐＤＮＡ ｍＬ－１（図５、８０～１００ｎｍのナノ粒子を生成）のいずれかであり、Ｎ／Ｐ比は５．５であった。小さなバッチ調製（図２～図４）の場合、１００μＬのＰＢＳ溶液（０．２倍～２倍）が、１００μＬの６０ｎｍのナノ粒子懸濁液にピペットで移され、続いて速やかに３秒間ボルテックスされた。異なる時点で（図２Ｂに示す）、２００μＬの、２０ｍＭのＨＣｌを含む１９％（ｗ／ｗ）のトレハロース溶液が、成長粒子にピペットで移され、続いて速やかに３秒間ボルテックスされた。粒子は安定化され、使用および特徴付けの準備が整った。
ビルディングブロックとしてのｐＤＮＡ／ＰＥＩナノ粒子が、これまでの報告（Ｓａｎｔｏｓら、２０１６；Ｈｕら、２０１９）に基づいてまず合成された。簡潔に言えば、ｐＤＮＡ（レポーターとして、Ａｌｄｅｖｒｏｎ、ＵＳＡのｇＷｉｚ－ＬｕｃまたはｇＷｉｚ－ＧＦＰを有する複数の種）およびＰＥＩｐｒｏ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、フランス）が、別々に超純水中に溶解され、続いて２０ｍＬ ｍｉｎ－１の流量で閉じ込め衝突ジェット（ＣＩＪ）ミキサーにポンプで注入された（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＰｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ、２００３；Ｈａｏら、２０２０）。濃度は、１００μｇ ｐＤＮＡ ｍＬ－１（図２、６０～７０ｎｍのナノ粒子を生成）または２００μｇ ｐＤＮＡ ｍＬ－１（図５、８０～１００ｎｍのナノ粒子を生成）のいずれかであり、Ｎ／Ｐ比は５．５であった。小さなバッチ調製（図２～図４）の場合、１００μＬのＰＢＳ溶液（０．２倍～２倍）が、１００μＬの６０ｎｍのナノ粒子懸濁液にピペットで移され、続いて速やかに３秒間ボルテックスされた。異なる時点で（図２Ｂに示す）、２００μＬの、２０ｍＭのＨＣｌを含む１９％（ｗ／ｗ）のトレハロース溶液が、成長粒子にピペットで移され、続いて速やかに３秒間ボルテックスされた。粒子は安定化され、使用および特徴付けの準備が整った。
【0105】
ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子の大量生産（図５）の場合、８０～１００ｎｍのナノ粒子およびＰＢＳ（０．４倍または０．４５倍）が、シリンジに別々に充填され、２０ｍＬ ｍｉｎ－１の流量でＣＩＪデバイスにポンプで注入された。溶出液は、撹拌せずに、室温下で収集され、インキュベートされた。動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＺＳ９０、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＳＡ）が定期的に実施され、サイズがモニタリングされた。粒子が標的サイズに達すると、粒子懸濁液、および２．５ｍＭのＨＣｌを含む１９％（ｗ／ｗ）のトレハロースの溶液が、シリンジに別々に充填され、２０ｍＬ ｍｉｎ－１の流量でＣＩＪデバイスにポンプで注入された。粒子は、使える状態とするか、長期保存のため－８０°Ｃまで凍結された。トランスフェクション実験の場合、凍結された粒子は、環境温度で解凍することにより回収され、続いて短時間ボルテックスされた。粒子は、その後、使える状態とするか、トランスフェクション活性を損なわずに環境温度で１～２日間、一時的に保存された。
【0106】
１．３．３ セロミクスによる定量的な細胞取込およびエンドソーム脱出評価
ｐＤＮＡは、ＮＨＳ－ソラレン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）のＵＶ誘発架橋を介して、ｐＤＮＡへの共有結合Ｃｙ５－アミン（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ、ＵＳＡ）により標識された（Ｗｉｌｓｏｎら、２０１７）。Ｃｙ５標識ｐＤＮＡは、粒子製剤に先立って、ｐＤＮＡ混合物に５％で混合された。ＧＦＰ結合ガレクチン－８（ＧＦＰ－Ｇａｌ８）を発現するＢ１６Ｆ１０細胞株は、Ｓｕｐｅｒ ＰｉｇｇｙＢａｃ Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）およびＰｉｇｇｙｂａｃ－トランスポゾン－ＧＦＰ－Ｇａｌ８（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１２７１９１）およびポリ（ベータ－アミノエステル）（ＰＢＡＥ）キャリア（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、２０２０）をコードするプラスミドを使用するトランスフェクションにより取得され、続いてＳＨ８００セルソーター（Ｓｏｎｙ、日本）により２回分類された。細胞は、ウェルあたり１００，０００個の細胞で、１０％のＦＢＳが補充されたＤＭＥＭで培養された。粒子は、この細胞株における最適な結果のため、トランスフェクション培地がＯｐｔｉ－ＭＥＭに切り替えられたことを除いては、上述したように、２４時間後に投与された。所定の時間のインキュベーション後、細胞は、ＰＢＳにより３回洗浄され、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液により固定され、ヘキスト３３３４２により着色され、続いてＰＢＳにより３回洗浄された。
ｐＤＮＡは、ＮＨＳ－ソラレン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）のＵＶ誘発架橋を介して、ｐＤＮＡへの共有結合Ｃｙ５－アミン（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ、ＵＳＡ）により標識された（Ｗｉｌｓｏｎら、２０１７）。Ｃｙ５標識ｐＤＮＡは、粒子製剤に先立って、ｐＤＮＡ混合物に５％で混合された。ＧＦＰ結合ガレクチン－８（ＧＦＰ－Ｇａｌ８）を発現するＢ１６Ｆ１０細胞株は、Ｓｕｐｅｒ ＰｉｇｇｙＢａｃ Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）およびＰｉｇｇｙｂａｃ－トランスポゾン－ＧＦＰ－Ｇａｌ８（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１２７１９１）およびポリ（ベータ－アミノエステル）（ＰＢＡＥ）キャリア（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、２０２０）をコードするプラスミドを使用するトランスフェクションにより取得され、続いてＳＨ８００セルソーター（Ｓｏｎｙ、日本）により２回分類された。細胞は、ウェルあたり１００，０００個の細胞で、１０％のＦＢＳが補充されたＤＭＥＭで培養された。粒子は、この細胞株における最適な結果のため、トランスフェクション培地がＯｐｔｉ－ＭＥＭに切り替えられたことを除いては、上述したように、２４時間後に投与された。所定の時間のインキュベーション後、細胞は、ＰＢＳにより３回洗浄され、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液により固定され、ヘキスト３３３４２により着色され、続いてＰＢＳにより３回洗浄された。
【0107】
プレートは、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ ＣＸ７ハイコンテント解析（ＨＣＡ）プラットフォーム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）により分析された。分析過程の簡単な例を図４Ａに挙げる。画像化は、５０１．２×５０１．２μｍ２の面積と相関関係を持つ、フィールドあたり１１０４×１１０４ピクセル２の解像度により、２０倍の倍率で実施された。合計３０フィールドがプレートの各ウェル内で分析され、ウェル平均結果は、全てのフィールドにおける全ての細胞の平均値を求めることにより生成された。露出時間を固定し、チャンネル１：３８６／４４０ｎｍ、チャンネル２：４８５／５２１ｎｍ、およびチャンネル３：６５０／６９４ｎｍのレーザー／フィルターセットにより、製造業者により提供された＜ＳｐｏｔＤｅｔｅｃｔｏｒ．Ｖ４＞プログラムが使用された。分析において、細胞核、ＧＦＰ－Ｇａｌ８スポット、およびＣｙ５－ｐＤＮＡスポットの識別は、サンプル画像において正しい認識が得られるように、目視で検証された適切な平滑化および閾値化設定により実施された。閾値化において、＜Ｉｓｏｄａｔａ＞（各ピクセルをその周囲と比較）は、その高いバックグラウンド（サイトゾルＧａｌ８）のため、ＧＦＰ－Ｇａｌ８に使用された。一方、＜Ｆｉｘｅｄ＞（所定のレベルを設定）は、そのクリーンなバックグラウンド、潜在的に不規則な形状、および大きな面積のため、Ｃｙ５－ｐＤＮＡに使用された。細胞体（サイトゾルエリア）の識別および分割は、識別された各核から外側に３０ピクセル（１３．６μｍ）ずつ、隣接した細胞間で重なることなく、エリアを拡大することにより近似された（図４Ａ）。
【0108】
１．４ 概要
本研究により、ＬＶＶ生産細胞株におけるトランスフェクション効率は、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子のサイズに決定的に依存するという重要な洞察が明らかになり、トランスフェクションに最適なサイズ範囲は４００ｎｍ～５００ｎｍであると特定された。段階的な過程は、表面電荷の反転およびイオン強度の条件付けに基づいて設計され、６０ｎｍ～１０００ｎｍの平均サイズのｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子が、高いサイズ制御により調製された。調製された粒子は、標準的な操作の場合は環境温度で、長期保存の場合は－８０°Ｃで、懸濁液中で優れた安定性を示した。この粒径操作方法により、高い均一性がもたらされ、一連のステップにより、集合動態の高い同調性が可能になる。スケールアップ生産方法は、混合手順を提供するのに合わせた集合動態により、継続的な流動混合過程－ＦＮＣプラットフォーム－に基づいて開発された。４００ｎｍのｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子製剤の最適なトランスフェクション活性および安定性は、予め調製され、凍結保存され、輸送され、そして解凍された粒子を使用したＬＶＶの生産において有効であり、実際のバイオリアクター設定において業界標準を使用して生産された粒子と一致する性能が示された。この新たな拡張可能な製造方法は、生産性および量の制御の改善により、広範囲の遺伝子治療ベクターの生産まで容易に拡張可能な、高いトランスレーショナルポテンシャルを有する。
本研究により、ＬＶＶ生産細胞株におけるトランスフェクション効率は、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子のサイズに決定的に依存するという重要な洞察が明らかになり、トランスフェクションに最適なサイズ範囲は４００ｎｍ～５００ｎｍであると特定された。段階的な過程は、表面電荷の反転およびイオン強度の条件付けに基づいて設計され、６０ｎｍ～１０００ｎｍの平均サイズのｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子が、高いサイズ制御により調製された。調製された粒子は、標準的な操作の場合は環境温度で、長期保存の場合は－８０°Ｃで、懸濁液中で優れた安定性を示した。この粒径操作方法により、高い均一性がもたらされ、一連のステップにより、集合動態の高い同調性が可能になる。スケールアップ生産方法は、混合手順を提供するのに合わせた集合動態により、継続的な流動混合過程－ＦＮＣプラットフォーム－に基づいて開発された。４００ｎｍのｐＤＮＡ／ＰＥＩ粒子製剤の最適なトランスフェクション活性および安定性は、予め調製され、凍結保存され、輸送され、そして解凍された粒子を使用したＬＶＶの生産において有効であり、実際のバイオリアクター設定において業界標準を使用して生産された粒子と一致する性能が示された。この新たな拡張可能な製造方法は、生産性および量の制御の改善により、広範囲の遺伝子治療ベクターの生産まで容易に拡張可能な、高いトランスレーショナルポテンシャルを有する。
【0109】
（実施例２）
比較例－規定サイズのプラスミドＤＮＡ／ポリカチオン粒子のスケールアップ生産
２．１ 実験セットアップ
プラスミドＤＮＡ（４．４ｋｂ）が、４００μｇ／ｍＬの濃度で超純水中に溶解され、ポリカチオン、すなわち、ポリ（エチレンイミン）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、Ｉｎｃ．のｉｎ ｖｉｖｏ－ｊｅｔＰＥＩ）が、６の窒素／リン酸塩比に相当する、３１７．６μｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解された。規定サイズの粒子を取得する典型的な製剤過程は、図１９Ａに示され、３つのステップ：ステップ１、複合体形成；ステップ２、サイズ成長；およびステップ３、安定化を含む。５００ｍＬ／分、１０００ｍＬ／分、または２０００ｍＬ／分の操作流量の３つの実験群について、拡大閉じ込め衝突ジェット（ＣＩＪ）ミキサーが使用され、各インレットは、蠕動ポンプにより駆動されたリザーバーから溶液を引き出した（図１９Ｂ）。ステップ１では、プラスミドＤＮＡおよびＰＥＩ溶液が、ＣＩＪミキサーにポンプで注入され、充填され、安定的なナノ粒子が生成された。ナノ粒子は、総流量の一部として、直接アリコートとされ、複合体形成の安定性が評価された（図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ）。ステップ２では、ナノ粒子懸濁液および０．４４倍のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の溶液が、ＣＩＪミキサーにポンプで注入され、充填され、成長粒子が生成された。ステップ３では、成長粒子のサイズが４００ｎｍの標的に達すると、成長粒子懸濁液および２．５ｍＭのＨＣｌと１９％（ｗ／ｗ）のトレハロース溶液との溶液が、ＣＩＪミキサーにポンプで注入され、充填され、４００ｎｍの規定サイズの安定化された粒子が生成された。
比較例－規定サイズのプラスミドＤＮＡ／ポリカチオン粒子のスケールアップ生産
２．１ 実験セットアップ
プラスミドＤＮＡ（４．４ｋｂ）が、４００μｇ／ｍＬの濃度で超純水中に溶解され、ポリカチオン、すなわち、ポリ（エチレンイミン）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、Ｉｎｃ．のｉｎ ｖｉｖｏ－ｊｅｔＰＥＩ）が、６の窒素／リン酸塩比に相当する、３１７．６μｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解された。規定サイズの粒子を取得する典型的な製剤過程は、図１９Ａに示され、３つのステップ：ステップ１、複合体形成；ステップ２、サイズ成長；およびステップ３、安定化を含む。５００ｍＬ／分、１０００ｍＬ／分、または２０００ｍＬ／分の操作流量の３つの実験群について、拡大閉じ込め衝突ジェット（ＣＩＪ）ミキサーが使用され、各インレットは、蠕動ポンプにより駆動されたリザーバーから溶液を引き出した（図１９Ｂ）。ステップ１では、プラスミドＤＮＡおよびＰＥＩ溶液が、ＣＩＪミキサーにポンプで注入され、充填され、安定的なナノ粒子が生成された。ナノ粒子は、総流量の一部として、直接アリコートとされ、複合体形成の安定性が評価された（図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ）。ステップ２では、ナノ粒子懸濁液および０．４４倍のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の溶液が、ＣＩＪミキサーにポンプで注入され、充填され、成長粒子が生成された。ステップ３では、成長粒子のサイズが４００ｎｍの標的に達すると、成長粒子懸濁液および２．５ｍＭのＨＣｌと１９％（ｗ／ｗ）のトレハロース溶液との溶液が、ＣＩＪミキサーにポンプで注入され、充填され、４００ｎｍの規定サイズの安定化された粒子が生成された。
【0110】
トランスフェクション試験では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、粒子投与の１日前に、１００，０００細胞／ウェルで、２４－ウェルプレートに散布された。安定化された粒子（ステップ３後、５０μｇ／ｍＬのＤＮＡ濃度で、５％のルシフェラーゼプラスミドを含む）は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地により１μｇ／ｍＬのＤＮＡ濃度まで希釈された。細胞は、粒子含有培地中で４時間インキュベートされ、続いて満タンの培地で２０時間培養された。
【0111】
２．２ 説明
ステップ１では、標準的な実験室規模の設定により、５６ｎｍのｚ平均直径および０．１３３の多分散性指数（ＰＤＩ）のナノ粒子が生成された。蠕動ポンプおよびリザーバーベースのセットアップを使用すると、流れが安定しているとき、５００ｍＬ／分の流量で、同一のサイズおよび同様のＰＤＩが得られた（図１Ｃ）。流量が１０００ｍＬ／分まで増加すると、同一のサイズだが高いＰＤＩ（０．３～０．４）のナノ粒子が取得された（図１９Ｄ）。流量が２０００ｍＬ／分まで更に増加すると、ナノ粒子は、ほぼ２倍のサイズ（１５０ｎｍ程度）および高いＰＤＩ（０．４程度）を有したが、ナノ粒子の質は、全流動過程中、安定しているようであった（図１Ｅ）。しかしながら、ナノ粒子のサイズおよび／またはＰＤＩの増加は、全ての流量が、標準的な実験室規模の操作と比較したときと同様の成長プロファイルを有したように、ステップ２の成長動態に重大な影響を及ぼさなかった（図１Ｆ）。
ステップ１では、標準的な実験室規模の設定により、５６ｎｍのｚ平均直径および０．１３３の多分散性指数（ＰＤＩ）のナノ粒子が生成された。蠕動ポンプおよびリザーバーベースのセットアップを使用すると、流れが安定しているとき、５００ｍＬ／分の流量で、同一のサイズおよび同様のＰＤＩが得られた（図１Ｃ）。流量が１０００ｍＬ／分まで増加すると、同一のサイズだが高いＰＤＩ（０．３～０．４）のナノ粒子が取得された（図１９Ｄ）。流量が２０００ｍＬ／分まで更に増加すると、ナノ粒子は、ほぼ２倍のサイズ（１５０ｎｍ程度）および高いＰＤＩ（０．４程度）を有したが、ナノ粒子の質は、全流動過程中、安定しているようであった（図１Ｅ）。しかしながら、ナノ粒子のサイズおよび／またはＰＤＩの増加は、全ての流量が、標準的な実験室規模の操作と比較したときと同様の成長プロファイルを有したように、ステップ２の成長動態に重大な影響を及ぼさなかった（図１Ｆ）。
【0112】
【表1】
【0113】
ステップ３で、異なる流量での全ての調製により、４００ｎｍの標的規定サイズ（図２０Ａ）および同様のＰＤＩ（図２０Ｂ）の粒子が生成された。懸濁液中での（５０μｇ／ｍＬの標的による）ＤＮＡ濃度のナノ液滴評価により、５００ｍＬ／分および１０００ｍＬ／分では、製剤過程中に損失が生じなかった一方、２０００ｍＬ／分では、わずかな損失（５μｇ／ｍＬ程度、図２０Ｃ）が生じたことが明らかになった。これらの特徴は、凍結（摂氏マイナス８０度まで）および解凍のサイクルの際に維持された（図２０Ａ～２０Ｃ）。５％のルシフェラーゼプラスミドが、標準的な実験室規模の４０ｍＬ／分の流量または１０００ｍＬ／分のスケールアップ流量により調製された製剤に追加されると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションアッセイは、同様のトランスフェクション効率を示した（図２０Ｄ）。これらの２つの製剤は、動的光散乱により評価されたように、同様の粒径分布も有した（図２０Ｅ）。これらのデータは、トータルで、規定サイズのプラスミドＤＮＡ／ＰＥＩ粒子を生成する図１９Ａに示すような製剤方法が拡張可能であることを示している。
［参照］
［参照］
【0114】
本明細書に記載の全ての出版物、特許出願、特許、および他の参照文献は、本開示の保護対象が属する技術分野に精通している者のレベルを示すものである。全ての出版物、特許出願、特許、および他の参照文献は、個々の出版物、特許出願、特許、および他の参照文献が具体的にかつ個々に参照により組み込まれる場合と同一の程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。多数の特許出願、特許、および他の参照文献が本明細書で参照されているが、このような参照は、これらの文書のいずれかが当技術分野における一般的な知識の一部を形成していることを認めるものではないことが理解されよう。本明細書と組み込まれた参考文献との間に矛盾がある場合は、本明細書（組み込まれた参考文献に基づく場合がある、その修正を含む）が優先するものとする。本明細書では、特に断りのない限り、標準的な技術上認められた用語の意味を使用する。本明細書では、さまざまな用語の標準的な略語を使用する。
【0115】
Ｍｉｌｏｎｅ， Ｍ．Ｃ． ａｎｄ Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ， Ｕ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３２， １５２９－１５４１ （２０１８）．
Ｗａｎｇ， Ｄ．， Ｔａｉ， Ｐ．Ｗ．Ｌ． ａｎｄ Ｇａｏ， Ｇ． Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ａｓ ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １８， ３５８－３７８ （２０１９）．
Ｍｅｒｔｅｎ， Ｏ．－Ｗ．， Ｈｅｂｂｅｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｂｏｖｏｌｅｎｔａ， Ｃ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ － Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３， １６０１７ （２０１６）．
Ｐｅａｒ， Ｗ．Ｓ．， Ｎｏｌａｎ， Ｇ．Ｐ．， Ｓｃｏｔｔ， Ｍ．Ｌ． ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｄ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｔｉｔｅｒ ｈｅｌｐｅｒ－ｆｒｅｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９０， ８３９２－８３９６ （１９９３）．
Ｄａｌｂｙ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ａｄｖａｎｃｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ｒｅａｇｅｎｔ： ｐｒｉｍａｒｙ ｎｅｕｒｏｎｓ， ｓｉＲＮＡ， ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ３３， ９５－１０３ （２００４）．
Ｂｏｕｓｓｉｆ， Ｏ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ： ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９２， ７２９７－７３０１ （１９９５）．
Ｍｉｓｌｉｃｋ， Ｋ．Ａ． ａｎｄ Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｉｅｌｅｒ， Ｊ．Ｄ． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ ｉｎ ｃａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９３， １２３４９－１２３５４ （１９９６）．
Ｒｅｊｍａｎ， Ｊ．， Ｂｒａｇｏｎｚｉ， Ａ． ａｎｄ Ｃｏｎｅｓｅ， Ｍ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｌａｔｈｒｉｎ－ ａｎｄ ｃａｖｅｏｌａｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｌｉｐｏ－ ａｎｄ ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １２， ４６８－４７４ （２００５）．
Ｂｕｓ， Ｔ．， Ｔｒａｅｇｅｒ， Ａ． ａｎｄ Ｓｃｈｕｂｅｒｔ， Ｕ．Ｓ． Ｔｈｅ ｇｒｅａｔ ｅｓｃａｐｅ： ｈｏｗ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｔｈｅ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｂａｒｒｉｅｒ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂ ６， ６９０４－６９１８ （２０１８）．
Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ ｂｕｔ Ｎｏｔ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｕｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７３， ７５０７－７５１１ （１９９８）．
ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｏｏ， Ｊ．Ｃ．Ｍ． ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ， Ｊ．Ｆ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ． Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５， Ｒ４２－Ｒ５２ （２０１５）．
Ｓａｎｔｏｓ， Ｊ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｓｃｒｅｔｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ－Ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｆｌａｓｈ Ｎａｎｏｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ． Ｓｍａｌｌ １２， ６２１４－６２２２ （２０１６）．
Ｈｕ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ／Ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ． ＡＣＳ Ｎａｎｏ １３， １０１６１－１０１７８ （２０１９）．
Ｏｇｒｉｓ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ＤＮＡ／ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－ＰＥＩ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５， １４２５－１４３３ （１９９８）．
Ｚｈａｎｇ， Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｎｏ－Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ： Ｌａｒｇｅ， Ｂｏｔｒｙｏｉｄ－Ｓｈａｐｅｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｅｎｈａｎｃｅ ＤＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｉａ Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ． Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ９， １５８０－１５９８ （２０１９）．
Ｔｏｃｋａｒｙ， Ｔ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ－Ｐａｃｋａｇｅｄ Ｐｏｌｙｐｌｅｘ Ｍｉｃｅｌｌｅ ａｓ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ－Ｖｉｒｕｓ－Ｉｎｓｐｉｒｅｄ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｖｅｃｔｏｒ ｔｏ Ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｔｒｏｍａ－Ｒｉｃｈ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ． ＡＣＳ Ｎａｎｏ １３， １２７３２－１２７４２ （２０１９）．
Ｏｓａｄａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｑｕａｎｔｉｚｅｄ Ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ ｗｉｔｈ Ｂｌｏｃｋ Ｃａｔｉｏｍｅｒ ｉｎｔｏ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｒｏｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３２， １２３４３－１２３４８ （２０１０）．
Ｃｕｒｔｉｓ， Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｕｎｕｓｕａｌ Ｓａｌｔ ａｎｄ ｐＨ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ． ＰＬＯＳ ＯＮＥ １１， ｅ０１５８１４７ （２０１６）．
Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ－ＤＮＡ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １１６， ９６－１０４ （２００６）．
Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｂ．Ｋ． ａｎｄ Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ， Ｒ．Ｋ． Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｍｉｘｉｎｇ ｉｎ ｃｏｎｆｉｎｅｄ ｉｍｐｉｎｇｉｎｇ ｊｅｔｓ． ＡＩＣｈＥ Ｊｏｕｒｎａｌ ４９， ２２６４－２２８２ （２００３）．
Ｈａｏ， Ｙ．， Ｓｅｏ， Ｊ．－Ｈ．， Ｈｕ， Ｙ．， Ｍａｏ， Ｈ．－Ｑ． ａｎｄ Ｍｉｔｔａｌ， Ｒ． Ｆｌｏｗ ｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ ｍｉｘｉｎｇ ｑｕａｌｉｔｙ ｉｎ ａ ｃｏｎｆｉｎｅｄ ｉｍｐｉｎｇｉｎｇ ｊｅｔ ｍｉｘｅｒ． ＡＩＰ Ａｄｖａｎｃｅｓ １０， ０４５１０５ （２０２０）．
Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ， Ｍ．， Ｃｈａｂｏｃｈｅ， Ｓ．， Ｊｏｒｄａｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｗｕｒｍ， Ｆ．Ｍ． Ａ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ ｉｎ ＤＮＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３４， １９６－１９８ （２００４）．
Ｌａｃｈｅｌｔ， Ｕ． ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ， Ｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ： Ａ Ｊｏｕｒｎｅｙ ｏｆ ５０ Ｙｅａｒｓ （ａｎｄ Ｂｅｙｏｎｄ）． Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １１５， １１０４３－１１０７８ （２０１５）．
Ｔｈｕｒｓｔｏｎ， Ｔ．Ｌ．Ｍ．， Ｗａｎｄｅｌ， Ｍ．Ｐ．， ｖｏｎ Ｍｕｈｌｉｎｅｎ， Ｎ．， Ｆｏｅｇｌｅｉｎ， Ａ． ａｎｄ Ｒａｎｄｏｗ， Ｆ． Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８ ｔａｒｇｅｔｓ ｄａｍａｇｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｔｏ ｄｅｆｅｎｄ ｃｅｌｌｓ ａｇａｉｎｓｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ４８２， ４１４－４１８ （２０１２）．
Ｋｉｌｃｈｒｉｓｔ， Ｋ．Ｖ． ｅｔ ａｌ． Ｇａｌ８ Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｄｏｓｏｍｅ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ Ｐｒｅｄｉｃｔｓ Ｃａｒｒｉｅｒ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｄｒｕｇ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ． ＡＣＳ Ｎａｎｏ １３， １１３６－１１５２ （２０１９）．
Ｒｕｉ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ ｂｒａｎｃｈｅｄ ｐｏｌｙ（β－ａｍｉｎｏ ｅｓｔｅｒ） ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｎａｂｌｅ ｒｏｂｕｓｔ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ． Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ５， ｅａａｙ３２５５ （２０１９）．
Ｒｅｊｍａｎ， Ｊ．， Ｏｂｅｒｌｅ， Ｖ．， Ｚｕｈｏｒｎ， Ｉ．Ｓ． ａｎｄ Ｈｏｅｋｓｔｒａ， Ｄ． Ｓｉｚｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｖｉａ ｔｈｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｃｌａｔｈｒｉｎ－ ａｎｄ ｃａｖｅｏｌａｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ３７７， １５９－１６９ （２００４）．
Ｍａｙｏｒ， Ｓ． ａｎｄ Ｐａｇａｎｏ， Ｒ．Ｅ． Ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８， ６０３－６１２ （２００７）．
Ｋｏｐａｔｚ， Ｉ．， Ｒｅｍｙ， Ｊ．－Ｓ． ａｎｄ Ｂｅｈｒ， Ｊ．－Ｐ． Ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ： ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｙｎｄｅｃａｎ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｐｏｗｅｒｅｄ ｂｙ ａｃｔｉｎ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６， ７６９－７７６ （２００４）．
Ｗｉｌｓｏｎ， Ｄ．Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ａ Ｔｒｉｐｌｅ－Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ－Ｌａｂｅｌｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｐＨ Ｎａｎｏｓｅｎｓｏｒ ｔｏ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ Ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５， １６９７－１７０９ （２０１７）．
Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｊ．， Ｒｈｏｄｅｓ， Ｋ．Ｒ．， Ｇｒｅｅｎ， Ｊ．Ｊ． ａｎｄ Ｔｚｅｎｇ， Ｓ．Ｙ． Ｐｏｌｙ（ｂｅｔａ－ａｍｉｎｏ ｅｓｔｅｒ）ｓ ａｓ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅｓ： ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ １７， １３９５－１４１０ （２０２０）．
Ｙｕｅ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅｖｉｓｉｔ ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＤＮＡ ａｎｄ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ － Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｕｎｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｃｈａｉｎｓ ｆｒｅｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １５５， ６７－７６ （２０１１）．
Ｏｈｉ， Ｍ．， Ｌｉ， Ｙ．， Ｃｈｅｎｇ， Ｙ． ａｎｄ Ｗａｌｚ， Ｔ． Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｍａｇｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ － ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌｓ ｉｎ ｍｏｄｅｒｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ Ｏｎｌｉｎｅ ６， ２３－３４ （２００４）．
Ｗｉｌｌｉｆｏｒｄ， Ｊ．－Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ＰＥＧ Ｇｒａｆｔｓ ｏｎ ｌＰＥＩ／ＤＮＡ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ． ＡＣＳ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２， ５６７－５７８ （２０１６）．
Ｗａｎｇ， Ｄ．， Ｔａｉ， Ｐ．Ｗ．Ｌ． ａｎｄ Ｇａｏ， Ｇ． Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ａｓ ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １８， ３５８－３７８ （２０１９）．
Ｍｅｒｔｅｎ， Ｏ．－Ｗ．， Ｈｅｂｂｅｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｂｏｖｏｌｅｎｔａ， Ｃ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ － Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３， １６０１７ （２０１６）．
Ｐｅａｒ， Ｗ．Ｓ．， Ｎｏｌａｎ， Ｇ．Ｐ．， Ｓｃｏｔｔ， Ｍ．Ｌ． ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｄ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｔｉｔｅｒ ｈｅｌｐｅｒ－ｆｒｅｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９０， ８３９２－８３９６ （１９９３）．
Ｄａｌｂｙ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ａｄｖａｎｃｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ｒｅａｇｅｎｔ： ｐｒｉｍａｒｙ ｎｅｕｒｏｎｓ， ｓｉＲＮＡ， ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ３３， ９５－１０３ （２００４）．
Ｂｏｕｓｓｉｆ， Ｏ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ： ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９２， ７２９７－７３０１ （１９９５）．
Ｍｉｓｌｉｃｋ， Ｋ．Ａ． ａｎｄ Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｉｅｌｅｒ， Ｊ．Ｄ． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ ｉｎ ｃａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９３， １２３４９－１２３５４ （１９９６）．
Ｒｅｊｍａｎ， Ｊ．， Ｂｒａｇｏｎｚｉ， Ａ． ａｎｄ Ｃｏｎｅｓｅ， Ｍ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｌａｔｈｒｉｎ－ ａｎｄ ｃａｖｅｏｌａｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｌｉｐｏ－ ａｎｄ ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １２， ４６８－４７４ （２００５）．
Ｂｕｓ， Ｔ．， Ｔｒａｅｇｅｒ， Ａ． ａｎｄ Ｓｃｈｕｂｅｒｔ， Ｕ．Ｓ． Ｔｈｅ ｇｒｅａｔ ｅｓｃａｐｅ： ｈｏｗ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｔｈｅ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｂａｒｒｉｅｒ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂ ６， ６９０４－６９１８ （２０１８）．
Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ ｂｕｔ Ｎｏｔ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｕｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７３， ７５０７－７５１１ （１９９８）．
ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｏｏ， Ｊ．Ｃ．Ｍ． ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ， Ｊ．Ｆ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ． Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５， Ｒ４２－Ｒ５２ （２０１５）．
Ｓａｎｔｏｓ， Ｊ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｓｃｒｅｔｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ－Ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｆｌａｓｈ Ｎａｎｏｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ． Ｓｍａｌｌ １２， ６２１４－６２２２ （２０１６）．
Ｈｕ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ／Ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ． ＡＣＳ Ｎａｎｏ １３， １０１６１－１０１７８ （２０１９）．
Ｏｇｒｉｓ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ＤＮＡ／ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－ＰＥＩ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５， １４２５－１４３３ （１９９８）．
Ｚｈａｎｇ， Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｎｏ－Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ： Ｌａｒｇｅ， Ｂｏｔｒｙｏｉｄ－Ｓｈａｐｅｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｅｎｈａｎｃｅ ＤＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｉａ Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ． Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ９， １５８０－１５９８ （２０１９）．
Ｔｏｃｋａｒｙ， Ｔ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ－Ｐａｃｋａｇｅｄ Ｐｏｌｙｐｌｅｘ Ｍｉｃｅｌｌｅ ａｓ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ－Ｖｉｒｕｓ－Ｉｎｓｐｉｒｅｄ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｖｅｃｔｏｒ ｔｏ Ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｔｒｏｍａ－Ｒｉｃｈ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ． ＡＣＳ Ｎａｎｏ １３， １２７３２－１２７４２ （２０１９）．
Ｏｓａｄａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｑｕａｎｔｉｚｅｄ Ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ ｗｉｔｈ Ｂｌｏｃｋ Ｃａｔｉｏｍｅｒ ｉｎｔｏ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｒｏｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３２， １２３４３－１２３４８ （２０１０）．
Ｃｕｒｔｉｓ， Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｕｎｕｓｕａｌ Ｓａｌｔ ａｎｄ ｐＨ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ． ＰＬＯＳ ＯＮＥ １１， ｅ０１５８１４７ （２０１６）．
Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ－ＤＮＡ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １１６， ９６－１０４ （２００６）．
Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｂ．Ｋ． ａｎｄ Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ， Ｒ．Ｋ． Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｍｉｘｉｎｇ ｉｎ ｃｏｎｆｉｎｅｄ ｉｍｐｉｎｇｉｎｇ ｊｅｔｓ． ＡＩＣｈＥ Ｊｏｕｒｎａｌ ４９， ２２６４－２２８２ （２００３）．
Ｈａｏ， Ｙ．， Ｓｅｏ， Ｊ．－Ｈ．， Ｈｕ， Ｙ．， Ｍａｏ， Ｈ．－Ｑ． ａｎｄ Ｍｉｔｔａｌ， Ｒ． Ｆｌｏｗ ｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ ｍｉｘｉｎｇ ｑｕａｌｉｔｙ ｉｎ ａ ｃｏｎｆｉｎｅｄ ｉｍｐｉｎｇｉｎｇ ｊｅｔ ｍｉｘｅｒ． ＡＩＰ Ａｄｖａｎｃｅｓ １０， ０４５１０５ （２０２０）．
Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ， Ｍ．， Ｃｈａｂｏｃｈｅ， Ｓ．， Ｊｏｒｄａｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｗｕｒｍ， Ｆ．Ｍ． Ａ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ ｉｎ ＤＮＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３４， １９６－１９８ （２００４）．
Ｌａｃｈｅｌｔ， Ｕ． ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ， Ｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ： Ａ Ｊｏｕｒｎｅｙ ｏｆ ５０ Ｙｅａｒｓ （ａｎｄ Ｂｅｙｏｎｄ）． Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １１５， １１０４３－１１０７８ （２０１５）．
Ｔｈｕｒｓｔｏｎ， Ｔ．Ｌ．Ｍ．， Ｗａｎｄｅｌ， Ｍ．Ｐ．， ｖｏｎ Ｍｕｈｌｉｎｅｎ， Ｎ．， Ｆｏｅｇｌｅｉｎ， Ａ． ａｎｄ Ｒａｎｄｏｗ， Ｆ． Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８ ｔａｒｇｅｔｓ ｄａｍａｇｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｔｏ ｄｅｆｅｎｄ ｃｅｌｌｓ ａｇａｉｎｓｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ４８２， ４１４－４１８ （２０１２）．
Ｋｉｌｃｈｒｉｓｔ， Ｋ．Ｖ． ｅｔ ａｌ． Ｇａｌ８ Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｄｏｓｏｍｅ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ Ｐｒｅｄｉｃｔｓ Ｃａｒｒｉｅｒ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｄｒｕｇ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ． ＡＣＳ Ｎａｎｏ １３， １１３６－１１５２ （２０１９）．
Ｒｕｉ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ ｂｒａｎｃｈｅｄ ｐｏｌｙ（β－ａｍｉｎｏ ｅｓｔｅｒ） ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｎａｂｌｅ ｒｏｂｕｓｔ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ． Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ５， ｅａａｙ３２５５ （２０１９）．
Ｒｅｊｍａｎ， Ｊ．， Ｏｂｅｒｌｅ， Ｖ．， Ｚｕｈｏｒｎ， Ｉ．Ｓ． ａｎｄ Ｈｏｅｋｓｔｒａ， Ｄ． Ｓｉｚｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｖｉａ ｔｈｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｃｌａｔｈｒｉｎ－ ａｎｄ ｃａｖｅｏｌａｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ３７７， １５９－１６９ （２００４）．
Ｍａｙｏｒ， Ｓ． ａｎｄ Ｐａｇａｎｏ， Ｒ．Ｅ． Ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８， ６０３－６１２ （２００７）．
Ｋｏｐａｔｚ， Ｉ．， Ｒｅｍｙ， Ｊ．－Ｓ． ａｎｄ Ｂｅｈｒ， Ｊ．－Ｐ． Ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ： ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｙｎｄｅｃａｎ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｐｏｗｅｒｅｄ ｂｙ ａｃｔｉｎ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６， ７６９－７７６ （２００４）．
Ｗｉｌｓｏｎ， Ｄ．Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ａ Ｔｒｉｐｌｅ－Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ－Ｌａｂｅｌｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｐＨ Ｎａｎｏｓｅｎｓｏｒ ｔｏ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ Ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５， １６９７－１７０９ （２０１７）．
Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｊ．， Ｒｈｏｄｅｓ， Ｋ．Ｒ．， Ｇｒｅｅｎ， Ｊ．Ｊ． ａｎｄ Ｔｚｅｎｇ， Ｓ．Ｙ． Ｐｏｌｙ（ｂｅｔａ－ａｍｉｎｏ ｅｓｔｅｒ）ｓ ａｓ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅｓ： ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ １７， １３９５－１４１０ （２０２０）．
Ｙｕｅ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅｖｉｓｉｔ ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＤＮＡ ａｎｄ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ － Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｕｎｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｃｈａｉｎｓ ｆｒｅｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １５５， ６７－７６ （２０１１）．
Ｏｈｉ， Ｍ．， Ｌｉ， Ｙ．， Ｃｈｅｎｇ， Ｙ． ａｎｄ Ｗａｌｚ， Ｔ． Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｍａｇｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ － ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌｓ ｉｎ ｍｏｄｅｒｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ Ｏｎｌｉｎｅ ６， ２３－３４ （２００４）．
Ｗｉｌｌｉｆｏｒｄ， Ｊ．－Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ＰＥＧ Ｇｒａｆｔｓ ｏｎ ｌＰＥＩ／ＤＮＡ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ． ＡＣＳ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２， ５６７－５７８ （２０１６）．
【0116】
前述の保護対象は、理解を明瞭にする目的で、図示および例示によってある程度詳細に説明されたが、当業者には、添付の特許請求の範囲内で特定の変更および修正を実施できることが理解されよう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11a】
【図11b】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19-1】
【図19-2】
【図20】
【国際調査報告】