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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-13
(54)【発明の名称】胆管細胞の増殖方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20240205BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240205BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240205BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240205BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240205BHJP
A61K 35/413 20150101ALI20240205BHJP
A61K 35/407 20150101ALI20240205BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240205BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20240205BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12M1/00 A
C12Q1/02
A61P1/16
A61P43/00 121
A61K35/413
A61K35/407
A61K45/00
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023549610
(86)(22)【出願日】2022-02-16
(85)【翻訳文提出日】2023-10-12
(86)【国際出願番号】 EP2022053842
(87)【国際公開番号】W WO2022175342
(87)【国際公開日】2022-08-25
(31)【優先権主張番号】2102232.2
(32)【優先日】2021-02-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500341551
【氏名又は名称】ケンブリッジ エンタープライズ リミティッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】サンパジオティス フォティオス
(72)【発明者】
【氏名】ヴァリエ ルドヴィク
(72)【発明者】
【氏名】サエブ－パーシー クーロシュ
(72)【発明者】
【氏名】ブレビニ テレサ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B029AA21
4B029BB11
4B029CC02
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ33
4B063QS24
4B063QX01
4B065AA90X
4B065AC20
4B065BB19
4B065BC41
4B065CA44
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4C084MA02
4C084MA17
4C084MA23
4C084MA55
4C084MA66
4C084NA05
4C084ZA751
4C084ZA752
4C084ZC751
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB52
4C087BB53
4C087MA02
4C087MA17
4C087MA23
4C087MA66
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZA75
4C087ZC75
(57)【要約】
本発明は、ケノデオキシル酸（ＣＤＡ）又はオベチコール酸（ＯＣＡ）等のファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニストの存在下で胆管細胞を培養することを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの胆管細胞の増殖方法に関する。本方法により得られたＦＸＲ処理胆管細胞及びＦＸＲ処理オルガノイドは、例えば胆管障害の治療及び化合物スクリーニングに有用であり得る。ＦＸＲ処理胆管細胞オルガノイドの生成のためのキット及び培養培地の使用もまた提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
胆管細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させる方法であって、（ｉ）胆管細胞の集団を準備すること、及び
（ｉｉ）前記集団をファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニストの存在下で培養して、増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を生成すること、
を含む、方法。
【請求項2】
前記ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニストが、ケノデオキシル酸（ＣＤＡ）又はオベチコール酸（ＯＣＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記胆管細胞が、初代胆管細胞又はｉＰＳＣから分化した胆管細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記集団が、前記ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニスト、上皮成長因子（ＥＧＦ）、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤及び非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤を含む増殖培地で培養されて、前記増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を生成する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ＦＸＲ処理胆管細胞が、前記増殖培地中でオルガノイドを形成する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記胆管細胞が、肝外胆管細胞である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記胆管細胞が、肝内胆管細胞である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記胆管細胞が胆嚢胆管細胞である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記増殖培地が、ＦＸＲアゴニスト、上皮成長因子（ＥＧＦ）、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤、及び非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤を含む栄養培地である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤が、Ｗｎｔアゴニストである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｒ－スポンジンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤が、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ－１）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記初代胆管細胞が、ドナー個体由来の初代胆組織から取得又は分離することができる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
集団が、前記増殖培地中で３Ｄ培養において培養される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記増殖培地が足場マトリックスを更に含み、任意に前記足場マトリックス内に脱細胞化されたヒト又は非ヒト組織の細胞外マトリックスがある、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
増殖培地が、足場マトリックス、並びに（ｉ）ＥＧＦ、（ｉｉ）前記古典的Ｗｎｔ阻害剤、（ｉｉｉ）前記非古典的Ｗｎｔ増強剤、及び（ｉｖ）前記ＦＸＲアゴニストが補充された栄養培地を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
増殖培地が、足場マトリックス、並びに（ｉ）ＥＧＦ、（ｉｉ）前記古典的Ｗｎｔ阻害剤、（ｉｉｉ）前記非古典的Ｗｎｔ増強剤、及び（ｉｖ）前記ＦＸＲアゴニストが補充された栄養培地からなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
前記栄養培地が、化学的に定義されている、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記化学的に定義された栄養培地が、任意にニコチンアミド、重炭酸ナトリウム、２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸三ナトリウム塩、ピルビン酸ナトリウム、グルコース、ＨＥＰＥＳ、ＩＴＳ＋プレミックス、デキサメタゾン、グルタマックス、ペニシリン及びストレプトマイシンのうちの１つ以上が補充されたウィリアムＥ培地である、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
胆管細胞がヒト胆管細胞である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記胆管細胞の集団には、幹細胞は含まれない、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記増殖された集団における前記胆管細胞が、ＣＫ７、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＨＮＦ１Ｂ、γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、ＣＦＴＲ、ＳＣＲ、ＳＳＴＲ２、頂端側塩胆汁輸送体（ＡＳＢＴ）、アクアポリン１及び陰イオン交換体２型、ＦＧＦ１９、ＳＯＸ１７を発現する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記増殖された集団における前記胆管細胞が、ＡＬＰ活性、ＧＧＴ活性、ＭＤＲ１媒介性分泌、セクレチン及びソマトスタチンへの生理学的応答、胆汁酸の移出、ＣＦＴＲ媒介性塩化物輸送、ＡＴＰ及びアセチルコリンへの生理学的応答並びにＶＥＧＦに応答する増殖の増加を示す、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記増殖された集団における前記胆管細胞が、ＭＨＣ抗原を発現しないか、又は初代胆管細胞よりも低いレベルでＭＨＣ抗原を発現する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記胆管細胞が、前記増殖培地中で２０代以上の継代にわたり培養される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記増殖された集団が個別の細胞を含むように胆管細胞オルガノイドを破壊することを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を生体適合性の足場に播種することを含み、任意に前記足場マトリックス内に脱細胞化されたヒト又は非ヒト組織の細胞外マトリックスがある、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記生体適合性の足場を、ＲＸＲアゴニスト、上皮成長因子（ＥＧＦ）、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤、及び非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤を含む増殖培地中で、前記胆管細胞が前記足場に定着するように培養することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項29】
前記胆管細胞が、前記足場中で胆管上皮を形成する、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項30】
前記増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団又は足場を貯蔵することを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記増殖された集団又は足場を治療的に許容可能な賦形剤と混合することを含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法により生成される分離されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団。
【請求項33】
前記ＦＸＲ処理胆管細胞が、オルガノイド、オルガノイドに満たないクラスター又は個別の細胞の形である、請求項３２に記載の集団。
【請求項34】
前記ＦＸＲ処理胆管細胞が生体適合性の足場内にあり、任意に前記脱細胞化された足場マトリックスがヒト又は非ヒト組織の細胞外マトリックスである、請求項３２又は３３に記載の集団。
【請求項35】
前記ＦＸＲ処理胆管細胞が、ＣＫ７、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＨＮＦ１Ｂ、γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、ＣＦＴＲ、ＳＣＲ、ＳＳＴＲ２、頂端側塩胆汁輸送体（ＡＳＢＴ）、アクアポリン１及び陰イオン交換体２型、ＦＧＦ１９、ＳＯＸ１７を発現する、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の集団。
【請求項36】
前記増殖された集団における前記ＦＸＲ処理胆管細胞が、ＭＨＣ抗原を発現しないか、又は低レベルのＭＨＣ抗原を発現する、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の集団。
【請求項37】
前記ＦＸＲ処理胆管細胞が、ＡＬＰ活性、ＧＧＴ活性、ＭＤＲ１媒介性分泌、セクレチン及びソマトスタチンへの生理学的応答、胆汁酸の移出、ＣＦＴＲ媒介性塩化物輸送、ＡＴＰ及びアセチルコリンへの生理学的応答並びにＶＥＧＦに応答する増殖の増加を示す、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の集団。
【請求項38】
請求項３２～３７のいずれか一項に記載の分離された集団を含む、生体適合性の足場。
【請求項39】
胆管障害の治療において使用するための、請求項３２～３７のいずれか一項に記載の分離されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団又は請求項３８に記載の足場。
【請求項40】
胆管障害を伴う患者を治療する方法であって、請求項３２～３７のいずれか一項に記載の分離されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団又は請求項３８に記載の足場を、それを必要とする個体に投与することを含む、方法。
【請求項41】
ＦＸＲアゴニストを前記個体に投与することを更に含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
胆管障害を伴う患者を治療する方法であって、分離された胆管細胞の集団を、それを必要とする個体に投与すること、及び
ＦＸＲアゴニストを前記個体に投与すること、
を含む、方法。
【請求項43】
前記胆管細胞が、請求項３２～３７のいずれか一項に記載の分離されたＦＸＲ処理胆管細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
移植用の肝組織を調製する方法であって、該肝組織をｅｘ ｖｉｖｏでＦＸＲアゴニストに曝露することを含む、方法。
【請求項45】
胆管障害を伴う患者を治療する方法であって、前記患者から得られた肝組織をｅｘ ｖｉｖｏでＦＸＲアゴニストに曝露すること、及び
前記肝組織を前記患者に投与すること、
を含む、方法。
【請求項46】
ＦＸＲアゴニストを前記個体に投与することを更に含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
化合物をスクリーニングする方法であって、請求項３２～３７のいずれか一項に記載の分離されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団又は請求項３８に記載の足場を試験化合物と接触させること、及び
前記ＦＸＲ処理胆管細胞若しくは前記足場に対する前記試験化合物の効果及び／又は前記試験化合物に対する前記ＦＸＲ処理胆管細胞若しくは足場の効果を測定すること、
を含む、方法。
【請求項48】
増殖、ＡＬＰ活性、ＧＧＴ活性、ＭＤＲ１媒介性分泌、セクレチン及び／又はソマトスタチン応答性、胆汁酸移出、ＣＦＴＲ媒介性塩化物輸送、並びにＡＴＰ応答性、アセチルコリン応答性及びＶＥＧＦ応答性のうちの１つ以上に対する前記試験化合物の効果を測定する、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
治療用化合物への患者の感受性を決定する方法であって、（ｉ）疾患状態を伴う個体由来の疾患表現型を有する分離された胆管細胞の集団を準備すること、
（ｉｉ）前記集団を、ＦＸＲ受容体、上皮成長因子（ＥＧＦ）、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤、及び非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤を含む増殖培地中で培養することで、疾患表現型を示す増殖された胆管細胞の集団を生成すること、
（ｉｉｉ）特許請求の範囲に記載される方法により生成される増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を治療用化合物と接触させること、並びに
（ｉｖ）前記ＦＸＲ処理胆管細胞に対する前記治療用化合物の効果を測定すること、
を含み、前記ＦＸＲ処理胆管細胞の疾患表現型の改善は、前記個体が前記治療用化合物による治療に感受性があることの指標である、方法。
【請求項50】
ＦＸＲ受容体、上皮成長因子（ＥＧＦ）、非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達増強剤、及び古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤を含む増殖培地を含む、ＦＸＲ処理胆管細胞オルガノイドの生成のためのキット。
【請求項51】
ＦＸＲ処理胆管細胞オルガノイドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの生成のための培養培地の使用であって、前記培養培地が、ＦＸＲ受容体、上皮成長因子（ＥＧＦ）、非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達増強剤、及び古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤を含む、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［資金提供］
この研究は欧州肝臓学会（ＥＡＳＬ）の支援を受けた。本出願につながるプロジェクトは、欧州連合のＨｏｒｉｚｏｎ ２０２０研究イノベーション計画（助成契約番号７４１７０７）に基づく欧州研究評議会（ＥＲＣ）から資金提供を受けた。
この研究は欧州肝臓学会（ＥＡＳＬ）の支援を受けた。本出願につながるプロジェクトは、欧州連合のＨｏｒｉｚｏｎ ２０２０研究イノベーション計画（助成契約番号７４１７０７）に基づく欧州研究評議会（ＥＲＣ）から資金提供を受けた。
【0002】
本発明は、例えば疾患モデリング、薬物スクリーニング及び再生医療において使用するためのヒト胆管細胞オルガノイドの分離及び増殖に関する。
【背景技術】
【0003】
オルガノイドは、それらの元の組織の重要な機能及び特徴を保持しているため、組織修復について独自の可能性を有する。それにもかかわらず、天然の上皮を修復し、それらの複雑さを回復させる能力はヒトにおいて確立されておらず、一方、ｉｎ ｖｉｖｏでのオルガノイドの生着及び生存は限られた数の動物実験においてのみ証明されている（１）。胆管上皮は、この課題に取り組み、ヒトにおける概念実証研究を発展させるための典型的及び臨床的に重要なシステムを提示している。実際、胆汁を肝臓から十二指腸に移送する胆管系の障害は、小児肝移植の７０％、成人肝移植の最大で３分の１を占めている（２）。このため、細胞ベースの治療等の代替治療が緊急に必要とされている。さらに、再生医療用途に好適なオルガノイドは、胆管細胞として知られている胆管上皮細胞から容易に得ることができる（３）。最後に、胆管はまた、他の中空内腔器官に見られる上皮の多様性を再現する（４）。実際、胆管系に沿った種々の領域は、胆汁の化学修飾等の異なる転写プロファイル及び機能的特性を示し（５、６）、加えて、肝内管、肝外管及び胆嚢の間の疾患感受性の変動を示す。
【0004】
それにもかかわらず、胆管系の種々の領域に由来するオルガノイドの特徴及び再生可能性に及ぼすこの領域変動の影響は、まだ特徴が明らかにされていない。
【発明の概要】
【0005】
本発明者らは、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニストの存在下で生成された胆管細胞オルガノイドが、ｉｎ ｖｉｖｏ胆管細胞により近い転写プロファイルを示し、以前の胆管細胞オルガノイドと比較して改善された機能性及び再生能を有することを認識した。この方法で生成された胆管細胞オルガノイドは、治療及び他の用途において、例えば再生医療、薬物スクリーニング及び疾患モデリングにおいて有用であり得る。
【0006】
本発明の態様は、胆管細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させる方法であって、
（ｉ）胆管細胞の集団を準備すること、及び
（ｉｉ）集団をファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニストの存在下で培養して、増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞（ＦＴＣ）の集団を生成すること、
を含む、方法を提供する。
（ｉ）胆管細胞の集団を準備すること、及び
（ｉｉ）集団をファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニストの存在下で培養して、増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞（ＦＴＣ）の集団を生成すること、
を含む、方法を提供する。
【0007】
増殖された集団におけるＦＸＲ処理胆管細胞は、オルガノイドの形であり得る。
【0008】
幾つかの好ましい実施の形態では、集団は、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニスト、上皮成長因子（ＥＧＦ）、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤及び非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤を含む増殖培地で培養されて、増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を生成する。
【0009】
ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニストは、ケノデオキシル酸（ＣＤＡ）、オベチコール酸（ＯＣＡ／ＩＮＴ－７４７）、コール酸（ＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、ＧＷ４０６４、Ｐｘ－１０２／１０４、シロフェクサー、トロピフェクサー、ニデュフェクサー（Nidufexor）及びフェキサラミン等の胆汁酸であってもよい。
【0010】
非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤は、古典的及び非古典的Ｗｎｔシグナル伝達の増強剤、好ましくはＲ－スポンジン１であり得る。
【0011】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ－１）であり得る。
【0012】
好ましくは、胆管細胞は、増殖培地中で３次元培養において培養される。
【0013】
幾つかの実施の形態では、上記方法は、オルガノイドを破壊して、分離されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を生成させることを更に含み得る。分離されたＦＸＲ処理胆管細胞を、増殖培地中で更に培養することで、集団を増殖又は成長させることができる。
【0014】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法により生成された分離されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を提供する。ＦＸＲ処理胆管細胞は、オルガノイド、オルガノイドに満たない（sub-organoid）集成体又は個別の細胞の形であり得る。
【0015】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法により生成されたＦＸＲ処理胆管細胞を含む足場を提供する。
【0016】
本発明の別の態様は、本明細書に記載されるように生成された分離されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団又はＦＸＲ処理胆管細胞オルガノイドを、胆管障害の治療を必要とする個体に投与することを含む、胆管障害の治療方法を提供する。
【0017】
本発明の別の態様は、胆管障害の治療方法であって、
分離された胆管細胞の集団又は胆管細胞オルガノイドを、それを必要とする個体に投与すること、及び
ＦＸＲアゴニストを個体に投与すること、
を含む、方法を提供する。
分離された胆管細胞の集団又は胆管細胞オルガノイドを、それを必要とする個体に投与すること、及び
ＦＸＲアゴニストを個体に投与すること、
を含む、方法を提供する。
【0018】
分離された胆管細胞又はオルガノイドは、ＦＸＲ処理胆管細胞又はＦＸＲ処理オルガノイドであることが好ましい。
【0019】
本発明の別の態様は、胆管障害の治療方法であって、
個体から得られた分離された肝組織をｅｘ ｖｉｖｏでＦＸＲアゴニストに曝露すること、及び
肝組織を個体に移植すること、
を含む、方法を提供する。
個体から得られた分離された肝組織をｅｘ ｖｉｖｏでＦＸＲアゴニストに曝露すること、及び
肝組織を個体に移植すること、
を含む、方法を提供する。
【0020】
本方法は、ＦＸＲアゴニストを個体に投与することを更に含んでもよい。
【0021】
本発明の別の態様は、分離された肝組織をｅｘ ｖｉｖｏでＦＸＲアゴニストに曝露することを含む、移植用の肝組織を調製する方法を提供する。
【0022】
本発明の別の態様は、化合物をスクリーニングする方法であって、
本明細書に記載されるように生成されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を試験化合物と接触させること、及び
ＦＸＲ処理胆管細胞に対する試験化合物の効果及び／又は試験化合物に対するＦＸＲ処理胆管細胞の効果を測定すること、
を含む、方法を提供する。
本明細書に記載されるように生成されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を試験化合物と接触させること、及び
ＦＸＲ処理胆管細胞に対する試験化合物の効果及び／又は試験化合物に対するＦＸＲ処理胆管細胞の効果を測定すること、
を含む、方法を提供する。
【0023】
好ましくは、ＦＸＲアゴニスト処理胆管細胞は、オルガノイド（ＣＯ）の形で試験化合物と接触される。
【0024】
本発明の別の態様は、ＦＸＲアゴニスト、上皮成長因子（ＥＧＦ）、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤、及び非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達増強剤を含む増殖培地を含む、ＦＸＲ処理胆管細胞の生成のためのキットを提供する。
【0025】
本発明の別の態様は、胆管障害のｉｎ ｖｉｔｒｏモデリングをする方法であって、
（ｉ）胆管障害を伴う個体由来の胆管細胞の集団を準備すること、及び
（ｉｉ）集団を、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤とを含む増殖培地中で培養することで、胆管障害の遺伝子型又は表現型を示す増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を生成すること、
を含む、方法を提供する。
（ｉ）胆管障害を伴う個体由来の胆管細胞の集団を準備すること、及び
（ｉｉ）集団を、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤とを含む増殖培地中で培養することで、胆管障害の遺伝子型又は表現型を示す増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を生成すること、
を含む、方法を提供する。
【0026】
本発明の別の態様は、個体を胆管障害について試験する方法であって、
個体由来の分離された初代胆管細胞の集団を準備し、胆管細胞の集団を、上記の本発明の一態様の方法を使用して増殖させて、増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を生成すること、及び
ＦＸＲ処理胆管細胞の表現型を決定することと、
を含む、方法を提供する。
個体由来の分離された初代胆管細胞の集団を準備し、胆管細胞の集団を、上記の本発明の一態様の方法を使用して増殖させて、増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を生成すること、及び
ＦＸＲ処理胆管細胞の表現型を決定することと、
を含む、方法を提供する。
【0027】
本発明の態様及び実施形態を、以下でより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】胆管細胞オルガノイド（ＣＯ）の同一性がニッチ刺激によって制御されており、ニッチ（ｉｎ ｖｉｖｏ、例えば胆汁）又はｉｎ ｖｉｔｒｏ（ＣＤＡ）においてＦＸＲアゴニストが胆嚢の同一性を誘導し、オルガノイドの転写プロファイルをｉｎ ｖｉｖｏの対象物により近くシフトさせることを示す図である。図１Ａは、胆嚢胆汁処理前後の初代胆管細胞とそれらの対応するオルガノイドのＵＭＡＰ（３５６０３細胞）を示す。異なる領域のオルガノイド間の類似性及び胆汁に応じたそれらのシグネチャの変化を示している。ＰＲＩ、一次；ＩＨＤ、肝内管；ＣＢＤ、総胆管；ＧＢ、胆嚢；ＯＲＧ、オルガノイド；ＢＴＯ、胆汁処理オルガノイド。図１Ｂは、一次領域、オルガノイド及びＢＴＯの間の上位１００の差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）のヒートマップ（データＳ１～Ｓ２）を示す。オルガノイドが領域差を失い、培養関連遺伝子をアップレギュレートするが、胆汁処理後に胆嚢マーカーを再獲得することを示している。（図１Ｃ及び図１Ｄ）図１Ｃは、ＱＰＣＲを示し（群当たりｎ＝４試料；中心線、中央値；ボックス、四分位範囲（ＩＱＲ）；１１のひげ、範囲；ハウスキーピング遺伝子、ＨＭＢＳ；＃Ｐ＞０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）、図１Ｄは、免疫蛍光を示す。ＦＸＲ２阻害剤Ｚ－ＧＳの不存在下にて、ケノデオキシコール酸（ＣＤＡ）処理後の胆嚢マーカー及び胆汁酸標的遺伝子のアップレギュレートを示している。Ｚ－ＧＳ、Ｚ－ググルステロン。スケールバー、５０μｍ。
【図2】ＦＸＲアゴニストなしで生成された胆管細胞オルガノイド（ＣＯ）が移植後に胆管症をレスキューし、生着部位に対応する同一性を持つことを示す図である。図２Ａは、実験の概略を示す。図２Ｂは、胆嚢オルガノイド注入後の動物レスキューを示すカプラン・マイヤー曲線（リスクに曝されている動物の数）を示す。Ｐ＝０．００１８（＊＊）、ログランク検定。図２Ｃは、オルガノイド注入後の胆管症のレスキューを示す磁気共鳴胆管膵管造影（ＭＲＣＰ）を示す。図２Ｄは、肝内（ＳＯＸ４）マーカーのアップレギュレートと共に、門脈三管における赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）発現胆嚢オルガノイドの生着を示す免疫蛍光を示す。スケールバー；黄色、５０μｍ；白色、５ １００μｍ。ＰＶ、門脈。
【図3】ＦＸＲアゴニストなしで生成された胆管細胞オルガノイド（ＣＯ）が正常温度灌流（ＮＭＰ）を受けているヒト肝臓に生着し、胆汁の特性を改善することを示す図である。図３Ａは、オルガノイド注入技術の概略図を示す。図３Ｂは、使用されたＮＭＰ回路の写真を示す。ＢＤ、胆管；ＧＢ、胆嚢；ＨＡ、肝動脈；ＰＶ、門脈；ＩＶＣ、下大静脈；Ｌ、肝臓；ＲＦＰ、赤色蛍光タンパク質；Ｐ、ポンプ；Ｏ、酸素供給器；ＰＲＣ、濃縮赤血球。図３Ｃは、フローサイトメトリーにより灌流液中にＲＦＰ細胞が存在しないことが明らかになったことを示す。図３Ｄは、免疫蛍光により肝内（ＳＯＸ４）マーカーのアップレギュレート及び胆嚢（ＳＯＸ１７）マーカーの喪失と共に、ＲＦＰ胆嚢オルガノイドの生着が明らかになったことを示す。スケールバー、５０μｍ。図３Ｅは、オルガノイド注入が胆汁のｐＨ及び胆汁分泌を改善することを示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。Ｎ＝３ ＮＭＰ肝臓。各測定値は異なる１０のデータポイントで表され、各臓器は異なる記号で表される。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏ胆管細胞により近い表現型を有する胆管細胞（「ＦＸＲ処理胆管細胞」）を生成するための、ＦＸＲアゴニストを含む細胞培養培地（「増殖培地」と称される）を使用した胆管細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖に関する。
【0030】
これらのＦＸＲ処理胆管細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの胆汁抵抗性の増加、生着効率の向上、及び胆管再生能力の上昇を示す可能性がある。さらに、ＦＸＲ処理胆管細胞は、改善された機能性及びｉｎ ｖｉｖｏ胆管細胞により近い表現型を示す可能性があるため、薬物スクリーニング及び疾患モデリングに有用であり得る。
【0031】
胆管細胞は、胆管系の内腔表面を覆う単層である胆管組織の上皮に由来する細胞である。胆管細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで胆汁分泌及び電解質輸送に重要な役割を担う。
【0032】
本明細書に記載されるようなＦＸＲアゴニストの存在下での胆管細胞の増殖は、初代胆嚢胆管細胞等のｉｎ ｖｉｖｏでの初代胆管細胞の転写プロファイルに似た転写プロファイルを示す、増殖された胆管細胞の集団を生成する。例えば、胆管細胞は、ＦＧＦ１９及びＳＯＸ１７等の初代胆管細胞のより多くのマーカーを発現する可能性があり、発現は初代胆管細胞と同様のレベルである可能性がある。この増殖された集団における胆管細胞は、本明細書では「ＦＸＲ処理胆管細胞」又は「ＦＴＣ」と呼ばれることがある。
【0033】
胆管細胞の転写プロファイルは、本明細書に記載されるように、例えばｂｕｌｋＲＮＡｓｅｑ若しくはｓｃＲＮＡｓｅｑ又はｑＰＣＲ、続いて遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）又はパーティションベースのグラフ抽象化（ＰＡＧＡ）分析等のデータ分析によって測定することができる。マーカー発現はまた、免疫蛍光又はウェスタンブロット分析によって測定することができる。
【0034】
ＦＸＲ処理胆管細胞及びオルガノイドはまた、他の増殖された胆管細胞の集団及びオルガノイドと比較して機能の上昇を示す可能性がある。例えば、ＦＸＲ処理胆管細胞及びオルガノイドは、より高い胆汁抵抗性、より高いＣＴＦＲ活性、上昇した再生活性、より効率的な胆汁アルカリ化、及び改善されたバリア機能を示す可能性がある。
【0035】
胆管細胞の機能は、ＣＦＴＲアッセイ、ＳＣＲ／ＳＳＴアッセイ、ローダミンアッセイ及びＣＬＦアッセイ等の標準的な機能アッセイによって測定することができる（例えばF. Sampaziotis, et al. Nat. Protoc. 12, 814-827 (2017)及び国際公開第２０１８／２３４３２３号を参照のこと）。
【0036】
好適な胆管細胞としては、初代胆管細胞、当該技術分野において利用可能な方法を使用して初代胆管細胞から生成若しくは増殖させた胆管細胞（例えば国際公開第２０１８／２３４３２３号を参照）又は当該技術分野において利用可能な方法を使用して多能性細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化することにより生成された胆管細胞（例えばSampaziotis et al Nat Biotech 33 (8) 845-853 (2015)、国際公開第２０１６／２０７６２１号を参照）が挙げられる。
【0037】
初代胆管細胞は、胆管又は胆嚢等の、肝内又は肝外胆管組織の上皮から直接分離され、連続（人工的に不死化された）胆管細胞系統とは異なる。初代胆管細胞は、肝内又は肝外胆管細胞であり得る。
【0038】
本明細書に記載される使用のための初代胆管細胞は、哺乳動物の、好ましくはヒトの初代胆管細胞である。初代胆管細胞は、成人又は小児のドナーから取得され得る。
【0039】
初代胆管細胞の集団は、幹細胞又はその他の多能性細胞若しくは複能性細胞を含まない。集団における初代胆管細胞の分化能力は、その起源の系譜に限定されており、肝細胞又は膵臓細胞等のその他の系譜の細胞へと分化することはできない（すなわち、集団は、胆管細胞及び胆管細胞前駆体からなる）。
【0040】
幾つかの実施形態において、初代胆管細胞は、癌性細胞であり得て、該細胞は、例えば薬物スクリーニングにおいて有用であり得る。
【0041】
初代胆管細胞は、本明細書に記載される方法において初代胆組織から取得若しくは分離されてもよく、又は初代胆組織から以前に取得されたものであってもよい。適切な胆組織は、胆嚢、並びに総胆管（ＣＢＤ）、胆嚢管、総肝管、右肝管、左肝管、肝内管及び膵管を含む、肝膵胆管（ＨＰＢ）、膵胆管（ＰＢ）又は胆管系の任意の部分からの胆管を含み得る。初代胆組織は、例えば、肝外植片、肝組織、肝生検、胆管切除、胆嚢摘出、膵臓切除、内視鏡検査（ＥＲＣＰ、例えば生検、ブラッシング、スパイグラス内視鏡検査、ＥＵＳ生検）、又は胆汁（例えばＥＲＣＰ若しくはＰＴＣを通じて）から得ることができる。
【0042】
幾つかの好ましい実施形態において、胆管細胞は、肝外胆管細胞である。肝外胆管細胞は、肝外胆管系の胆管上皮に由来し、胆嚢、胆嚢管、総胆管又は総肝管等の肝外胆組織から取得され得る。
【0043】
他の実施形態において、胆管細胞は、肝内胆管細胞である。肝内胆管細胞は、肝内胆管系の胆管上皮に由来する。
【0044】
胆管細胞が得られる元の初代胆組織は、ドナー個体においてｉｎ ｓｉｔｕであっても、又は例えば胆管切除、肝切除若しくは移植、膵臓切除、胆道鏡検査若しくは胆嚢摘出等の手術若しくは解剖後にドナー個体から以前に取得された組織試料であってもよい。適切な組織は、使用前に保存液中に貯蔵され得る。
【0045】
胆管細胞の集団は、任意の適切な技術によって初代胆組織から取得され得る。幾つかの実施形態において、初代胆管細胞の集団を取り外すために、例えばブラッシング又はスクレイピングによる初代胆組織の機械的解離等の周術期技術が使用され得る。他の実施形態において、内視鏡的逆行性胆管膵管造影（ＥＲＣＰ）ブラッシング等の、侵襲が最小限の技術が使用され得る。
【0046】
幾つかの実施形態において、胆管細胞の集団は、肝生検材料又は外植組織の機械的解離により、例えば、本明細書に記載される培養条件での組織の小（例えば、ミリメートル未満）切片を、ＨＧＦ及びフォルスコリン等の因子を添加して、又はそれらの因子を添加せずに、播種することにより取得され得る。あるいは肝組織、胆嚢及び胆管外植片は、機械的解離（スクレイピング／ダイシング）とリベラーゼ、コラゲナーゼ又はヒアルロニダーゼ等のマトリックス消化酵素を使用する酵素消化との組み合わせを使用して、単一の初代細胞又は小塊へと解離され得る。引き続き、単一の初代細胞は、ＥＰＣＡＭ等の胆管マーカーに対する抗体で標識され、磁気関連セルソーティング又は蛍光関連セルソーティング（ＭＡＣＳ又はＦＡＣＳ）等の免疫単離法で分離され得る。
【0047】
分離された単一細胞は、本明細書に記載される３Ｄ培養条件を使用して播種され得るか、又は単一細胞ＲＮＡシーケンシングのために処理され得る。本明細書におけるデータは、本明細書に記載される３Ｄ培養条件で、胆管細胞オルガノイドが選択的に増殖することを示している。肝細胞等のその他の肝臓細胞型はこれらの条件で成長しない。これは、例えば、肝マーカーのダウンレギュレートにより示され得る（図２８）。
【0048】
初代胆組織は、健康な個体又は疾患モデリングを可能にすることが知られる病理を有する患者に由来し得る。
【0049】
胆管障害を伴う個体に由来する胆管細胞を使用することで、胆管障害に関連する遺伝子型又は表現型を示す増殖された集団を作製することができる。胆管障害に関連する遺伝子型又は表現型を有する胆管細胞を生成する方法は、
胆管障害を伴う個体由来の初代胆管細胞の集団を準備すること、
本明細書に記載されるように初代胆管細胞を増殖させること、及び
それにより胆管障害に関連する遺伝子型又は表現型を有する胆管細胞の集団を生成すること、
を含み得る。
胆管障害を伴う個体由来の初代胆管細胞の集団を準備すること、
本明細書に記載されるように初代胆管細胞を増殖させること、及び
それにより胆管障害に関連する遺伝子型又は表現型を有する胆管細胞の集団を生成すること、
を含み得る。
【0050】
胆管障害に関連する表現型を有する増殖された集団は、胆管障害の１つ以上の特徴を示し得る。幾つかの実施形態において、胆管障害の１つ以上の特徴は、特定の条件又は処理に応答して示され得る。例えば、胆管細胞を１種以上のその他の細胞型と共培養することで、胆管障害に関連する表現型を誘発することができる。例えば、胆管細胞をＴ細胞等の免疫細胞と共培養することで、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）等の自己免疫性胆管障害に関連する表現型を誘発することができる。
【0051】
生成された胆管障害に関連する表現型を有する胆管細胞は、例えばスクリーニングで使用するために培養、増殖及び維持され得る。
【0052】
胆管障害に関連する表現型を有する胆管細胞は、胆管障害に特徴的な１つ以上の特性、特徴又は病理を示し得る。
【0053】
増殖培地は、オルガノイド（胆管細胞オルガノイド）の形の胆管細胞の増殖を支持する細胞培養培地である。
【0054】
増殖培地は、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニストを含む栄養培地である。
【0055】
ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ、ＮＲ１Ｈ４、遺伝子ＩＤ９９７１）は、胆汁酸によって活性化されるリガンド活性化転写因子であり、胆汁酸の合成及び輸送に関与する遺伝子の発現を調節する。ＦＸＲは、データベース寄託番号ＮＰ＿００１１９３９０６．１のアミノ酸配列又はそのアイソフォームを有し得て、ＮＭ＿００１２０６９７７．２のヌクレオチド配列又はそのアイソフォームによってコードされる場合がある。
【0056】
好適なＦＸＲアゴニストは当該技術分野において知られており、ケノデオキシコール酸（ＣＤＡ）、コール酸、及びオベチコール酸（ＯＣＡ）等の胆汁酸、カフェストール、フェキサラミン、ＩＮＴ－７６７、ＡＢ２３Ａ、クルクミン、シリマリン、ヘドラゴン酸（Hedragonic acid）、ジヒドロアルテミシニン、アルテヌシン、ＰＸ－１０２、ＢＡＲ７０４、ＧＷ４０６４、並びにトロポフレクサー（tropoflexor）を含む。他のＦＸＲアゴニストは、当該技術分野において利用可能なアッセイを使用して特定することができる（例えばvan der Wiel et al Scientific Reports 9, 2193 (2019)、Han Int J Mol Sci. 2018 Jul; 19(7): 2069、Hiebl et al. Biotech Adv 2018, 36, 1657を参照のこと）。
【0057】
ＦＸＲアゴニストは、ＦＸＲを活性化又は刺激するのに十分な濃度で増殖培地中に存在してもよい。例えば、増殖培地は、１μＭ～１００μＭ、好ましくは約１０μＭの、ＣＤＡ等のＦＸＲアゴニストを含有してもよい。
【0058】
胆管細胞の培養に好適な増殖培地は当該技術分野においてよく知られている。
【0059】
幾つかの好ましい実施形態において、増殖培地は、ＥＧＦ、古典的Ｗｎｔ阻害剤及び非古典的Ｗｎｔ増強剤を更に含んでもよい。
【0060】
非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤は、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性を刺激、促進又は増加させる化合物である。
【0061】
非古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路は、脊椎動物における組織極性及び形態発生過程に関与するβ－カテニン非依存性経路である（Komiya, Y. & Habas, R. Organogenesis 4, 68-75 (2008)；Patel, V. et al.. Hum. Mol. Genet. 17, 1578-1590 (2008)；Strazzabosco, M. & Somlo, S. Gastroenterology 140, (2011)）。
【0062】
非古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の構成要素としては、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ１１、ＬＲＰ５／６、Ｄｓｈ、Ｆｚ、Ｄａａｍ１、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、Ｐｒｉｃｋｌｅ及びＳｔｒａｂｉｓｍｕｓが挙げられる。非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達経路の活性を測定するために適した方法は、当該技術分野でよく知られており、ＡＴＦ－２に基づくレポーターアッセイ（Ohkawara et al (2011) Dev Dyn 240 (1) 188-194）及びＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）に基づくアッセイが挙げられる。
【0063】
非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤は、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を選択的に増強し得るか、又はより好ましくは、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達及び古典的Ｗｎｔシグナル伝達の経路の両方を増強し得る（すなわち、Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト）。
【0064】
好ましい非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤としては、Ｗｎｔシグナル伝達アゴニストのＲ－スポンジンが挙げられる。
【0065】
Ｒ－スポンジンは、Ｗｎｔシグナル伝達経路を正に制御する２つのシステインリッチのフリン様ドメインと１つのトロンボスポンジン１型ドメインとを有する分泌性活性化タンパク質である。好ましくは、Ｒ－スポンジンは、ヒトＲ－スポンジンである。
【0066】
Ｒ－スポンジンとしては、ＲＳＰＯ１（遺伝子ＩＤ２８４６５４ 核酸配列リファレンスＮＭ＿００１０３８６３３．３、アミノ酸配列リファレンスＮＰ＿００１０３３７２２．１）、ＲＳＰＯ２（遺伝子ＩＤ３４０４１９ 核酸配列リファレンスＮＭ＿００１２８２８６３．１、アミノ酸配列リファレンスＮＰ＿００１２６９７９２．１）、ＲＳＰＯ３（遺伝子ＩＤ８４８７０、核酸配列リファレンスＮＭ＿０３２７８４．４、アミノ酸配列リファレンスＮＰ＿１１６１７３．２）又はＲＳＰＯ４（遺伝子ＩＤ３４３６３７、核酸配列リファレンスＮＭ＿００１０２９８７１．３、アミノ酸配列リファレンスＮＰ＿００１０２５０４２．２）が挙げられ得る。
【0067】
Ｒ－スポンジンは、商業的供給業者（例えば、R&D Systems、ミネソタ州、ミネアポリス）から容易に入手可能である。本明細書に記載される胆管細胞を増殖させるために適したＲ－スポンジンの濃度は、標準的な技術を使用して容易に測定することができる。例えば、増殖培地は、５０ｎｇ／ｍｌ～５μｇ／ｍｌ、好ましくは約５００ｎｇ／ｍｌのＲ－スポンジンを含み得る。
【0068】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性を阻害、遮断又は減少させる化合物である。
【0069】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路は、遺伝子発現の調節に関与するβ－カテニン依存性経路である（Klaus et al Nat. Rev. Cancer (2008) 8 387-398、Moon et al (2004) Nat. Rev. Genet. 5 691-701、Niehrs et al Nat Rev Mol. Cell Biol. (2012) 13 763-779）。古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性を測定するために適した方法は、当該技術分野でよく知られており、ＴＯＰ－ｆｌａｓｈアッセイ（Molenaar et al Cell. 1996 Aug 9; 86(3):391-9）及びβ－カテニンのためのアッセイが挙げられる。
【0070】
適切な古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤としては、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１～４（ＤＫＫ１～４）、Ｓｏｇｇｙ－１／Ｄｋｋｌ１、分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質１～５（ｓＦＲＰ１～５）、Ｗｎｔ阻害因子－１（ＷＩＦ－１）、ドラキシン、ＳＯＳＴ／スクレロスチン、ＩＧＦＢＰ－４、ＵＳＡＧ１及びＮｏｔｕｍが挙げられる。
【0071】
好ましくは、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、ＤＫＫ－１である。ＤＫＫ－１（遺伝子ＩＤ２２９４３ 核酸配列リファレンスＮＭ＿０１２２４２．２、アミノ酸配列リファレンスＮＰ＿０３６３７４．１）は、胚形成に役割を果たす２つのシステインリッチ領域を有する分泌性タンパク質である。ＤＫＫ－１は、商業的供給業者（例えば、R&D Systems、ミネソタ州、ミネアポリス）から容易に入手可能である。本明細書に記載される胆管細胞オルガノイドを増殖させるために適したＤＫＫ－１の濃度は、標準的な技術を使用して容易に測定することができる。例えば、増殖培地は、１０ｎｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ、例えば約１００ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ－１を含み得る。
【0072】
上皮成長因子（ＥＧＦ；ＮＣＢＩ 遺伝子ＩＤ：１９５０、核酸配列ＮＭ＿００１１７８１３０．１ ＧＩ：２９６０１１０１２；アミノ酸配列ＮＰ＿００１１７１６０１．１ ＧＩ：２９６０１１０１３）は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合することにより、細胞の成長、増殖及び細胞分化を刺激するタンパク質因子である。ＥＧＦは、通常の組み換え技術を使用して製造するか、又は商業的供給業者（例えば、R&D Systems、ミネソタ州、ミネアポリス；Stemgent Inc、米国）から得ることができる。本明細書に記載される胆管細胞オルガノイドを増殖させるために適したＥＧＦの濃度は、標準的な技術を使用して容易に測定することができる。例えば、増殖培地は、２ｎｇ／ｍｌ～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを含み得る。
【0073】
胆管細胞は、増殖培地中で２次元又は３次元培養において培養することができる。好ましくは、胆管細胞は、増殖培地中で３次元培養において培養される。３次元培養の場合に、増殖培地は３次元での細胞の成長及び増殖を支持し、胆管細胞がオルガノイドに集成することを可能にする足場マトリックスを更に含む。
【0074】
適切な足場マトリックスは、当該技術分野においてよく知られており、ハイドロゲル、例えばコラーゲン、コラーゲン／ラミニン、圧縮コラーゲン（例えば、ＲＡＦＴ（商標）、Lonza Biosystems）、アルギン酸塩、アガロース、複合タンパク質ハイドロゲル、例えば基底膜抽出物、及び合成ポリマーハイドロゲル（Gjorevski et al Nature（2016）539 560-564）、例えばポリグリコール酸（ＰＧＡ）ハイドロゲル及び架橋デキストラン及びＰＶＡハイドロゲル（例えば、Cellendes Gmbh、ドイツ、ロイトリンゲン）、不活性マトリックス、例えば多孔質ポリスチレン、並びに単離された天然ＥＣＭ足場（Engitix Ltd、英国、ロンドン）が挙げられる。
【0075】
他の好適な足場マトリックスとしては、脱細胞化された胆管組織、例えば、脱細胞化された胆嚢、総胆管又は肝内胆管を挙げることができる。
【0076】
足場マトリックスは、化学的に定義されたもの、例えばコラーゲン若しくは高密度化コラーゲンハイドロゲル、又は化学的に定義されていないもの、例えば複合タンパク質ハイドロゲルであり得る。好ましくは、増殖培地中の足場マトリックスは、複合タンパク質ハイドロゲルである。適切な複合タンパク質ハイドロゲルは、ラミニン、コラーゲンＩＶ、エナクチン及びヘパリン硫酸プロテオグリカン等の細胞外マトリックス成分を含み得る。複合タンパク質ハイドロゲルとしては、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞由来の細胞外マトリックスタンパク質のハイドロゲルも挙げられ得る。適切な複合タンパク質ハイドロゲルは、商業的供給業者から入手可能であり、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Corning Life Sciences）又はＣｕｌｔｒｅｘ（商標）ＢＭＥ ２ ＲＧＦ（Amsbio（商標）Inc）が挙げられる。例えば、増殖培地は、６６％のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含み得る。
【0077】
増殖培地は、足場マトリックスと、（ｉ）ＥＧＦ、（ｉｉ）ＤＫＫ－１等の古典的Ｗｎｔ阻害剤、（ｉｉｉ）Ｒ－スポンジン等の非古典的Ｗｎｔ増強剤、及び（ｉｖ）ＣＤＡ等のＦＸＲアゴニストが補充された栄養培地とを含むか又はそれらからなり得る。
【0078】
栄養培地は、基礎培地を含み得る。適切な基礎培地としては、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ハムＦ１２、アドバンスト・ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＤＭＥＭ／Ｆ１２（Price et al Focus (2003), 25 3-6）、ウィリアムＥ（Williams, G.M. et al Exp. Cell Research, 89, 139-142 (1974)）及びＲＰＭＩ－１６４０（Moore, G.E. and Woods L.K., (1976) Tissue Culture Association Manual. 3, 503-508）が挙げられる。幾つかの実施形態においては、ウィリアムＥ培地、例えば３３％のウィリアムＥ培地が好ましい場合がある。
【0079】
基礎培地には、培地添加物及び／又は１つ以上の追加成分、例えばトランスフェリン、１－チオグリセロール、脂質、Ｌ－グルタミン若しくはＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン（例えば、Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標））等の代用物、ニコチンアミド、リノール酸及び亜セレン酸（例えば、ＩＴＳ＋プレミックス）、デキサメタゾン、セレン、ピルビン酸塩、ＨＥＰＥＳ等のバッファー、重炭酸ナトリウム、ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸三ナトリウム塩、グルコース並びにペニシリン及びストレプトマイシン等の抗生物質、そして任意にポリビニルアルコール、ポリビニルアルコール及びインスリン、血清アルブミン、又は血清アルブミン及びインスリンが補充され得る。
【0080】
例えば、基礎培地には、１０ｍＭのニコチンアミド、１７ｍＭの重炭酸ナトリウム、０．２ｍＭの２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸三ナトリウム塩、６．３ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１４ｍＭのグルコース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６μｇ／ｍｌのインスリン、６μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン、６ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸、５μｇ／ｍｌのリノール酸、０．１μＭのデキサメタゾン、２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補充され得る。
【0081】
栄養培地は、化学的に定義された基礎栄養培地であり得る。化学的に定義された培地は、規定の成分、好ましくは化学構造が既知の成分のみを含有する細胞培養のための栄養液である。化学的に定義された培地には、未定義の成分、又は未定義の成分を含む構成成分、例えばフィーダー細胞、間質細胞、血清、血清アルブミン及びＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）等の複雑な細胞外マトリックスは含まれない。化学的に定義された培地は、ヒト化されていてもよい。化学的に定義されたヒト化培地には、非ヒト動物に由来する又は非ヒト動物から単離された成分又は添加物、例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びマウスフィーダー細胞は含まれない。コンディショニングされた培地は、培養される細胞からの未定義の成分を含み、化学的に定義されていない。
【0082】
適切な化学的に定義された栄養培地は、当該技術分野でよく知られており、ニコチンアミド、重炭酸ナトリウム、２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸三ナトリウム塩、ピルビン酸ナトリウム、グルコース、ＨＥＰＥＳ、ＩＴＳ＋プレミックス（インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸及びリノール酸）、デキサメタゾン、グルタマックス、ペニシリン及びストレプトマイシンが補充されたウィリアムＥ培地が挙げられる。
【0083】
胆管細胞は、増殖培地中で多重継代にわたり培養され得る。例えば、胆管細胞は、１０代以上、２０代以上、３０代以上、４０代以上又は５０代以上の継代にわたり培養され得る。１代継代には、２日間～８日間、好ましくは約５日間かかり得る。
【0084】
胆管細胞は、足場マトリックスを消化し、遠心分離により胆管細胞オルガノイドを採取し、該オルガノイドを個別の胆管細胞に破壊することにより継代され得る。胆管細胞は、増殖培地中で上記のように再懸濁及び培養され、そこで胆管細胞はオルガノイドへと再編する。
【0085】
細胞培養のために適した技術は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Basic Cell Culture Protocols, C. Helgason, Humana Press Inc. U.S. (15 Oct 2004) ISBN: 1588295451、Human Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Medicine S.) Humana Press Inc., U.S. (9 Dec 2004) ISBN: 1588292223、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, R. Freshney, John Wiley & Sons Inc (2 Aug 2005) ISBN: 0471453293、Ho WY et al J Immunol Methods. (2006) 310:40-52, Handbook of Stem Cells (ed. R. Lanza) ISBN: 0124366430、Basic Cell Culture Protocols' by J. Pollard and J. M. Walker (1997)、'Mammalian Cell Culture: Essential Techniques' by A. Doyle and J. B. Griffiths (1997)、'Human Embryonic Stem Cells' by A. Chiu and M. Rao (2003), Stem Cells: From Bench to Bedside' by A. Bongso (2005)、Peterson & Loring (2012)Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide Academic Press and 'Human Embryonic Stem Cell Protocols' by K. Turksen (2006)を参照）。その培地及び成分は、商業的供給業者（例えば、Gibco、Roche、Sigma、Europa bioproducts、R&D Systems）から取得され得る。標準的な哺乳動物細胞培養条件、例えば３７℃、２１％酸素、５％二酸化炭素が上記培養工程のために使用され得る。好ましくは、培地は２日毎に交換され、細胞は重力により沈降される。
【0086】
胆管細胞の集団は、本明細書に記載される増殖培地中でオルガノイドとして１０５倍以上、１０１０倍以上、１０１５倍以上、１０２０倍、又は１０３０倍以上に増殖され得る。
【0087】
初代胆管細胞の集団は、増殖培地中で増殖し、胆嚢様胆管細胞のオルガノイド（ＣＯ）へと集成する。胆管細胞オルガノイドは、内腔を取り囲み、それを外部環境から隔離する、密着結合により連結された胆嚢様胆管細胞の層を含む３次元多細胞集成体又は嚢胞である。ＦＸＲ処理胆管細胞は、ＣＦＴＲ等のマーカーの極性発現を示し得る。
【0088】
増殖培地中でＦＸＲ処理胆管細胞により形成されたオルガノイドは、ｉｎ ｖｉｖｏ胆管細胞、例えば胆嚢由来の胆管細胞の、形態又は物理的特性を示し得る。例えば、ＦＸＲ処理胆管細胞は、ＦＸＲの不存在下で増殖された胆管細胞と比較して、高さ対底部の比が増加した円柱状を示す可能性があり、より厚い壁を有するオルガノイドを示す可能性がある。
【0089】
オルガノイドは、例えば繊毛、密着結合、微絨毛、エキソソーム及び／又は管状構造を含み得る。オルガノイドの形態及び物理的特性は、標準的な顕微鏡法によって測定され得る。
【0090】
オルガノイドの形でも又は個別の細胞の形でも、増殖された胆嚢様胆管細胞の集団はその他の細胞型を含み得ないか又は実質的に含み得ない。すなわち、胆管細胞の集団は均質又は実質的に均質であり得る。例えば、該集団は培地中での培養後に８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の胆管細胞を含み得る。好ましくは、胆管細胞の集団は、精製が必要とされないほど十分にその他の細胞型を含まない。
【0091】
ＦＸＲ処理胆管細胞は１つ以上の胆管マーカーを発現し得る。例えば、胆管細胞は、サイトケラチン７（ＫＲＴ７又はＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＫＲＴ１９又はＣＫ１９）、γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、肝細胞核因子１ベータ（ＨＮＦ１Ｂ）、セクレチン受容体（ＳＣＴＲ）、ナトリウム依存性胆汁酸輸送体１（ＡＳＢＴ／ＳＬＣ１０Ａ２）、ＳＲＹ－ｂｏｘ ９（ＳＯＸ９）、Ｊａｇｇｅｄ １（ＪＡＧ１）、ＮＯＴＣＨ２、ＳＣＲ、ＳＳＴＲ２、頂端側塩胆汁輸送体（Apical Salt and Bile Transporter）（ＡＳＢＴ）、アクアポリン１及び陰イオン交換体並びに嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）を発現し得る。典型的には、集団中の胆管細胞の少なくとも９８％は、本明細書に記載されるように増殖培地中で２０代継代した後にＣＫ７及びＣＫ１９を同時発現し得る。ＦＸＲ処理胆管細胞は、図１Ｂに示すＳＯＸ１７、ＦＧＦ１９及び他のマーカーを更に発現し得る。
【0092】
好ましくは、ＦＸＲ処理胆管細胞は、初代胆管細胞に相当するレベルで成熟胆管マーカーを発現する。胆管細胞は成熟胆管細胞であり得て、胎児の特性を欠如し得る。
【0093】
初代胆管細胞とは対照的に、増殖された集団におけるＦＸＲ処理胆管細胞は、ＭＨＣクラス１又はクラス２のタンパク質、例えばＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－ＤＲＢ１等のＨＬＡタンパク質の発現を欠如し得る。さらに、胆管細胞は、胆管系のある領域の初代胆管細胞に特徴的である遺伝子、例えば、ＳＯＸ１７及びＦＧＦ１９等の胆汁酸勾配によって誘導される遺伝子の発現を示す可能性があり、胆管系の異なる領域に由来する初代胆管細胞に特徴的な遺伝子の発現を欠如している可能性がある。
【0094】
幾つかの実施形態において、ＦＸＲ処理胆管細胞の集団には、幹細胞又はその他の多能性細胞若しくは複能性細胞は含まれ得ない。例えば、胆管細胞は、対照細胞に対して、幹細胞マーカー、例えばＰＯＵ５Ｆ１、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、プロミニン１（ＰＲＯＭ１）、ＬＧＲ－４、５若しくは６等のロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体（ＬＧＲ）、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０、ＫＬＦ－４及びｃ－ｍｙｃの発現を示さないか又はそれらの発現が低い場合がある。幾つかの好ましい実施形態において、胆管細胞は、高レベルの胆管マーカー、低レベルのＬＧＲ５及びＰＲＯＭ１等の幹細胞マーカーを発現し、Ｏｃｔ４、ＮＡＮＯＧ及びＳｏｘ２等の多能性マーカーは発現しない。
【0095】
ＦＸＲ処理胆管細胞の集団には、肝細胞又は膵臓細胞等の非胆管細胞は含まれ得ない。胆管細胞は、肝細胞マーカー又は膵マーカー等の非胆管系譜のマーカーを発現しない。例えば、胆管細胞は、アルブミン（ＡＬＢ）、α１－アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１又は６ Ａ１ＡＴ）、膵臓及び十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）及びＡＦＰ等の胎児肝芽細胞マーカーの発現を欠如し得る。
【0096】
幾つかの実施形態において、ＦＸＲ処理胆管細胞の集団は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）マーカーの発現を欠如し得る。例えば、胆管細胞は、ビメンチン（ＶＩＭ）、ｓｎａｉｌファミリー転写リプレッサー１（ＳＮＡＩ１）及び／又はＳ１００カルシウム結合タンパク質９Ａ４（Ｓ１００Ａ４）の発現を欠如し得る。
【0097】
１つ以上の胆管マーカーの発現及び１つ以上の非胆管マーカーの発現の不存在は、増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団において観察及び／又は検出され得る。例えば、増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団における上記の成熟胆管マーカーの１つ以上の発現又は生成が測定され得る。これにより、増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団の均質性を測定及び／又は観察することが可能となる。
【0098】
本明細書に記載されるように生成された増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代胆嚢（ＧＢ）胆管細胞等の初代胆管細胞の１つ以上の機能的特性を示し得る。例えば、胆管細胞は、以下に記載される特性の１つ以上、好ましくは全てを示すオルガノイドへと集成し得る。
【0099】
ＦＸＲ処理胆管細胞オルガノイドは、胆汁酸の移動、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性及び／又はγ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）活性を示し得る。ＡＬＰ活性及びＧＧＴ活性の量は、初代胆管細胞によって示されるＡＬＰ活性及びＧＧＴ活性の量に相当し得る。ＡＬＰ活性及びＧＧＴ活性は、例えば本明細書に記載されるように測定され得る。
【0100】
ＦＸＲ処理胆管細胞オルガノイドは、能動分泌、例えば多剤耐性タンパク質－１（multidrug resistance protein-1）（ＭＤＲ１）によって媒介される分泌を示し得る。この分泌は、本明細書に記載されるように、ＭＤＲ１阻害剤のベラパミルの存在下及び不存在下で、ＦＸＲ処理胆管細胞オルガノイドの内腔におけるローダミン１２３等の蛍光性ＭＤＲ１基質の蓄積を計測することにより測定され得る。
【0101】
ＦＸＲ処理胆管細胞オルガノイドは、セクレチン及びソマトスタチンに対する応答を示し得る。例えば、胆管細胞オルガノイドは、セクレチンに応答して分泌活性の増加を示し、ソマトスタチンに応答して活性の減少を示し得る。これは、オルガノイドのサイズの変化を計測することにより測定され得る。例えば、セクレチンは胆管細胞オルガノイドのサイズを増大させ得て、ソマトスタチンはそのサイズを減少させ得る。
【0102】
ＦＸＲ処理胆管細胞オルガノイドは、胆汁酸の能動的移動、例えば頂端側塩胆汁輸送体（ＡＳＢＴ）により媒介される移動を示し得る。胆汁酸移動活性は、例えば、本明細書に記載されるように、ＦＩＴＣ等の別の蛍光性化合物に対するＣＬＦ等の蛍光性胆汁酸塩の能動的移動を計測することにより測定され得る。
【0103】
ＦＸＲ処理胆管細胞オルガノイドは、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）活性を示し得る。ＣＴＦＲ活性は、本明細書に記載されるように、様々な塩化物濃度、例えば、蛍光性の塩化物指示薬のＮ－（６－メトキシキノリル）アセトエチルエステル（ＭＱＡＥ）を有する培地に応答する細胞内及び腔内の塩化物濃度を計測することにより測定され得る。
【0104】
ＦＸＲ処理胆管細胞オルガノイドは、ＡＴＰ及びアセチルコリンに対する応答を示し得る。例えば、細胞内Ｃａ２＋レベルは、胆管細胞オルガノイドにおいて、ＡＴＰ又はアセチルコリンに応答して増大し得る。細胞内Ｃａ２＋レベルは、標準的な技術を使用して測定され得る。
【0105】
ＦＸＲ処理胆管細胞オルガノイドは、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＩＬ６等のマイトジェン及びエストロゲンに対する応答を示し得る。例えば、胆管細胞オルガノイドは、ＶＥＧＦに応答して増殖の増加を示し得る。
【0106】
胆管細胞オルガノイドは、ルマカフトール（ＶＸ８０９）等の薬物に対する応答を示し得る。例えば、サイズ、ＣＦＴＲ活性及び／又は腔内液分泌は、嚢胞性線維症を伴うドナー個体から得られた初代胆管細胞から増殖された胆管細胞オルガノイドにおいてルマカフトールに応答して増加し得る。ルマカフトールに対する応答を測定するために適した方法は、以下に記載される。
【0107】
特許請求の範囲に記載される方法により生成されたＦＸＲ処理胆管細胞オルガノイドの応答及び／又は活性の量は、初代胆管細胞、好ましくは初代肝内胆管細胞又は初代肝外胆管細胞、例えば総胆管（ＣＢＤ）胆管細胞によって示される応答及び／又は活性の量に相当し得る。さらに、特許請求の範囲に記載される方法によって生成されたＦＸＲ処理胆管細胞オルガノイドの応答及び／又は活性の量は、ＦＸＲアゴニストの不存在下で生成された胆管細胞オルガノイドの応答及び／又は活性の量よりも大きい可能性がある。
【0108】
上記のような増殖培地中での増殖後に、ＦＸＲ処理胆管細胞オルガノイドを解離又は破壊することで、個別のＦＸＲ処理胆管細胞が生成され得る。
【0109】
オルガノイドを個別の構成細胞へと解離する適切な方法は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、F. Sampaziotis et al. Nat. Protoc. 12, 814-827 (2017)を参照）。例えば、胆管細胞オルガノイドを、ディスパーゼ又は非酵素的回収溶液、例えばＣｅｌｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）（Corning）を使用して増殖培地から採取し、トリプシン等のプロテアーゼを使用して解離させることができる。適切な試薬は市販されており、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ThermoFisher Scientific）が挙げられる。
【0110】
本明細書に記載されるように増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞が１つ以上の胆管細胞機能を発揮する能力が、観察及び／又は測定され得る。例えば、細胞がオルガノイドへと集成する能力、及び／又はＭＤＲ１機能、胆汁酸の移動、ＶＥＧＦ応答、アセチルコリン応答若しくはＡＴＰ応答、ＣＦＴＲ媒介性塩化物輸送若しくはセクレチン応答若しくはソマトスタチン応答の１つ以上を発揮する能力が、観察及び／又は測定され得る。
【0111】
本明細書に記載されるように生成されるＦＸＲ処理胆管細胞は、本明細書に記載されるように増殖されるか、又は標準的な哺乳動物細胞培養技術を使用して培養若しくは維持される（例えば、F. Sampaziotis et al. Nat. Protoc. 12, 814-827 (2017)を参照）か、又は更なる操作若しくは処理に供され得る。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるように生成された胆管細胞集団は、例えば凍結乾燥及び／又は冷凍保存により貯蔵され得る。ＦＸＲ処理胆管細胞は、オルガノイド、オルガノイドに満たない集成体又は個別の細胞として貯蔵され得る。適切な貯蔵方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、胆管細胞は、冷凍保存培地（例えば、Ｃｅｌｌｂａｎｋｅｒ（商標）（AMS Biotechnology Ltd、英国））中に懸濁され、例えば－７０℃以下で凍結され得る。
【0112】
ＦＸＲ処理胆管細胞の集団は、バッファー、担体、希釈剤、保存剤及び／又は薬学的に許容可能な賦形剤等のその他の試薬と混合され得る。適切な試薬は、以下でより詳細に記載される。本明細書に記載される方法は、胆管細胞の集団を治療的に許容可能な賦形剤と混合して、治療組成物を生成することを含み得る。混合されるＦＸＲ処理胆管細胞は、オルガノイド、オルガノイドに満たない集成体又は個別の細胞の形であり得る。
【0113】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるように生成されたＦＸＲ処理胆管細胞は、ＦＸＲアゴニズムなしで生成された胆管細胞よりも高い再生能力を示し、治療において有用であり得る。治療用途のために、ＦＸＲ処理胆管細胞は、好ましくは臨床グレードの細胞である。治療に使用するためのＦＸＲ処理胆管細胞の集団は、好ましくは本明細書に記載される初代胆管細胞から、化学的に定義された増殖培地を使用して生成される。ＦＸＲ処理胆管細胞は、特定の用途に応じて、オルガノイド、オルガノイドに満たない集成体又は個別の細胞の形であり得る。
【0114】
増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団は、個体へと移植、注入又はその他の方法で投与され得る。適切な技術は、当該技術分野においてよく知られている。
【0115】
増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団は自系であり得る。すなわち、ＦＸＲ処理胆管細胞は、後に投与されるのと同じ個体から当初得られた初代胆管細胞から増殖されたものである（すなわち、ドナー個体とレシピエント個体は同じである）。レシピエント個体に投与するのに適した増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団は、個体から得られた初代胆管細胞の初期集団を準備すること、及び上記の胆管細胞の集団を増殖させて、投与のための増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を生成することを含む方法によって生成され得る。
【0116】
増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団は同種異系であり得る。すなわち、初代胆管細胞は、ＦＸＲ処理胆管細胞が後に投与される個体と異なる個体から当初得られたものである（すなわち、ドナー個体とレシピエント個体は異なる）。ドナー個体とレシピエント個体は、拒絶反応及び他の望ましくない免疫効果を避けるためにＨＬＡ適合及び／又は血液型適合されてもよい。ドナー個体とレシピエント個体はまた、過去のウイルス感染歴及び／又はウイルス免疫の状態（例えば過去のＣＭＶ感染）を適合されてもよい。幾つかの実施形態において、レシピエント個体は、同種異系ＦＸＲ処理胆管細胞の拒絶反応を低減又は防止するために免疫抑制療法を受けることができる。レシピエント個体に投与するのに好適な増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団は、ドナー個体から得られた初代胆管細胞の初期集団を準備すること、及び上記の胆管細胞の集団を増殖させて、投与のための増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を生成することを含む方法によって生成することができる。幾つかの実施形態において、増殖された集団は、ＨＬＡ等の免疫原性抗原の発現を低減又は不活性化させるように操作されてもよく、及び／又はレシピエント個体は、１つ以上の免疫抑制剤で治療されてもよい。
【0117】
幾つかの好ましい実施形態において、増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団は、脱細胞化されたヒト細胞外マトリックス又は脱細胞化された非ヒト（例えばブタ）細胞外マトリックス等の生体適合性の足場と混合されてもよい。
【0118】
生体適合性の足場に、上記のように増殖された胆管細胞が播種され得る。例えば、個別の胆管細胞又はＦＸＲ処理胆管細胞のオルガノイドに満たない集成体が、足場上若しくは足場中に注入され得るか、又は製造過程の間に足場中に混合され得る。次いで、胆管細胞を含む足場は、胆管細胞が足場に定着するように増殖培地中で培養され得る。胆管細胞は足場内で増殖し、オルガノイドへと集成し、その後に多層上皮へと集成し得る。
【0119】
適切な生体適合性の足場としては、ハイドロゲル、例えばフィブリン、キトサン、グリコサミノグリカン類、絹、フィブリン、フィブロネクチン、エラスチン、コラーゲン、フィブロネクチン等の糖タンパク質、又はキチン等の多糖、又はセルロースコラーゲン、コラーゲン／ラミニン、高密度化コラーゲン、アルギン酸塩、アガロース、複合タンパク質ハイドロゲル、例えば基底膜抽出物、生物有機ゲル（bio-organic gels）及び合成ポリマーハイドロゲル、例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）ハイドロゲル、架橋デキストラン及びＰＶＡハイドロゲル（例えば、Cellendes Gmbh、ドイツ、ロイトリンゲン）、不活性マトリックス、例えば多孔質ポリスチレン、ポリエステル、可溶性ガラス繊維、多孔質ポリスチレン及び単離された天然ＥＣＭ足場、例えば脱細胞化された胆嚢及び胆管の足場（Engitix Ltd、英国、ロンドン）が挙げられ得る。足場は生分解性であり得る。
【0120】
足場のサイズ又は形状は、意図される用途に依存する。適切な足場形状としては、例えば、パッチ、シート並びに最大で例えば１０ｍｍ～１２ｍｍの直径を有する直管及び分岐管を含む管が挙げられ得る。
【0121】
生体適合性の足場内で培養される、本明細書に記載されるように生成されたＦＸＲ処理胆管細胞は、機能的胆管上皮へと組織化する。定着された足場は、胆管上皮の１つ以上の特性を示し得る。例えば、定着された足場は、胆汁耐性であり得て、上記の機能的特性の１つ以上を示し得る。ＦＸＲ処理胆管細胞が定着した足場は、例えば治療又はスクリーニングで使用するための人工胆管上皮組織として有用であり得る。
【0122】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法により生成された分離されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を提供する。該集団は、オルガノイド、オルガノイドに満たない集成体若しくはクラスター又は個別の細胞の形であり得る。
【0123】
本明細書に記載されるように作製されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団は、その他の細胞型を実質的に有し得ない。例えば、該集団は、増殖培地中での培養後に７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上のＦＸＲ処理胆管細胞を含み得る。集団におけるＦＸＲ処理胆管細胞の存在又は割合は、上記のように胆管マーカーの発現によって測定され得る。
【0124】
好ましくは、ＦＸＲ処理胆管細胞の集団は、精製が必要とされないほど十分に、その他の細胞型を含まない。必要に応じて、胆管細胞の集団又は胆管細胞オルガノイドは、ＦＡＣＳを含む任意の適切な技術によって精製され得る。
【0125】
幾つかの実施形態において、ＦＸＲ処理胆管細胞は、異種タンパク質、例えばＧＦＰ等のマーカータンパク質若しくは酵素を発現し、及び／又は１つ以上の内因性タンパク質、例えば免疫原性に関連するタンパク質の発現を低減する若しくは妨げるように操作され得る。例えば、胆管細胞は、異種タンパク質、内因性タンパク質の発現を抑制するサプッレサーＲＮＡ、又は内因性タンパク質を不活性化させる部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターでトランスフェクトされ得る。幾つかの実施形態において、胆管細胞は、遺伝子欠陥を修正するように操作され得る。例えば、ＣＦＴＲ遺伝子中の欠陥は、嚢胞性線維症を伴う個体に由来する胆管細胞において修正され得る。他の実施形態において、胆管細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）等の免疫原性抗原を除去するように操作され得る。これは、同種異系の使用のための低免疫原性細胞又は非免疫原性細胞を作製するのに有用であり得る。
【0126】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法による胆管細胞を含む足場を提供する。適切な足場は、先に記載されている。
【0127】
本発明の別の態様は、例えば治療に使用するための、本明細書に記載の方法により生成されるＦＸＲ処理胆管細胞が定着した足場を含む人工胆管上皮組織を提供する。ＦＸＲ処理胆管細胞に加えて、人工組織は、間質細胞及び／又は内皮細胞等のその他の細胞を含み得る。
【0128】
本発明の態様はまた、溶液又は生体適合性の足場において本明細書に記載されるように生成される胆管細胞を含む医薬組成物、医薬、薬物又はその他の組成物並びにそのような胆管細胞を薬学的に許容可能な賦形剤、ビヒクル、担体又は生分解性の足場と、任意に１種以上のその他の成分とを混合することを含む医薬組成物の作製方法にも及ぶ。
【0129】
本発明により増殖されるＦＸＲ処理胆管細胞を含む医薬組成物は、１種以上の追加成分を含み得る。例えば、胆管細胞に加えて、医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、バッファー、保存剤、安定化剤、酸化防止剤又は当業者によく知られるその他の材料を含み得る。そのような材料は、非毒性であるべきであり、胆管細胞の活性を妨害すべきではない。担体又はその他の材料の厳密な性質は、投与経路に依存することとなる。
【0130】
液体医薬組成物は、一般的に水、石油、動物油若しくは植物油、鉱物油又は合成油等の液体担体を含む。生理食塩溶液、組織培地若しくは細胞培養培地、デキストロース若しくはその他の糖類溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコール等のグリコール類が含まれ得る。
【0131】
組成物は、パイロジェンフリーでありかつ適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容可能な水溶液の形で存在し得る。当業者は、例えば塩化ナトリウム、リンゲル注射液又は乳酸加リンゲル注射液等の等張性ビヒクルを使用して、適切な溶液を十分に調製することが可能である。組成物は、人工脳脊髄液を使用して調製され得る。
【0132】
本発明の別の態様は、本明細書に記載されるように生成されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を胆管障害の治療を必要とする個体に投与することを含む、胆管障害又は肝疾患の治療方法を提供する。
【0133】
本発明の別の態様は、胆管障害又は肝疾患の治療を必要とする個体へと本明細書に記載されるように生成されるＦＸＲ処理胆管細胞の集団を投与することを含む胆管障害又は肝疾患の治療方法においてそれを必要とする個体に使用するための集団を提供する。
【0134】
本発明の別の態様は、胆管障害又は肝疾患の治療において使用するための医薬の製造における、本明細書に記載されるように生成されるＦＸＲ処理胆管細胞の集団の使用を提供する。
【0135】
ＦＸＲ処理胆管細胞は、オルガノイド、オルガノイドに満たない集成体若しくはクラスター又は個別の細胞の形であり得る。
【0136】
胆管障害は、個体における胆管組織が損傷、欠陥又はその他には機能不全に陥っている状態、例えば胆管への損傷若しくは胆管の破壊、胆管の異常又は胆管の欠如を特徴とする障害である。胆管障害としては、胆管組織損傷、虚血性狭窄、外傷性胆管損傷及び胆管症、例えば遺伝性、発達性、自己免疫性及び環境誘発性の胆管症、例えば嚢胞性線維症関連胆管症、薬物誘発性胆管症、アラジール症候群、多発性嚢胞性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、ＡＩＤＳ関連胆管症、胆管消失症候群、胆管癌、突発性成人胆管減少症等の胆管減少症、術後胆管合併症、胆管閉鎖症、黄色肉芽腫性胆嚢炎（ＸＧＣ）、胆嚢腺筋腫症、胆嚢感染症、例えばサルモネラ菌、胆嚢癌、並びに肝外胆管又は肝内胆管のその他の障害が挙げられ得る。
【0137】
幾つかの実施形態において、増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団は、懸濁液において個体に投与することができる。ＦＸＲ処理胆管細胞の集団の懸濁液での投与は、例えば肝疾患及び胆管障害の治療に有用であり得る。
【0138】
肝疾患としては、胆管症、例えば、虚血性胆管減少症等の胆管減少症、アラジール症候群等の先天性胆管減少症、代謝性胆管減少症、及び薬物誘発性胆管減少症；肝内原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）及び原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、胆管消失症候群等の複合疾患；移植後胆管症、並びに肝内胆管系を冒す状態を挙げることができる。
【0139】
他の実施形態において、ＦＸＲ処理胆管細胞の集団は、生体適合性の足場内で個体に投与され得る。好適な足場としては、ＦＸＲ処理胆管細胞を播種したか、又は再定着させた胆管等の脱細胞化された臓器を挙げることができる。例えば、胆管細胞が定着した足場が個体に投与され得る。足場における胆管細胞の集団の投与は、例えば胆管閉鎖症、胆管狭窄、外傷性又は医原性の胆管損傷及び肝外胆管系を冒す状態の治療において有用であり得る。
【0140】
溶液中又は足場中の胆管細胞は、当該技術分野において知られる任意の技術により患者へと移植され得る（例えば、Lindvall, O. (1998) Mov. Disord. 13, Suppl. 1:83-7、Freed, C.R., et al., (1997) Cell Transplant, 6, 201-202、Kordower, et al., (1995) New England Journal of Medicine, 332, 1118-1124、Freed, C.R.,(1992) New England Journal of Medicine, 327, 1549-1555、Le Blanc et al, Lancet 2004 May 1;363(9419):1439-41）。特に、細胞懸濁液は、患者の胆管、胆嚢、門脈、肝実質、腹腔又は脾臓に注射又は注入され得る。胆管細胞の懸濁液は、静脈内、脾臓内、腹腔内、又は内視鏡的逆行性胆管膵管造影（ＥＲＣＰ）若しくは経皮的胆管造影（ＰＴＣ）を介して投与され得る。胆管細胞が定着した足場は、外科移植により個体に投与され得る。
【0141】
本発明による組成物の投与は、好ましくは「予防的有効量」又は「治療的有効量」（場合に応じて、予防が治療とみなされる場合がある）でなされ、その際、この量は個体に有益性を示すのに十分である。投与される実際の量並びに投与の速度及び時間的経過は、治療対象の性質及び重症度に依存することとなる。治療の処方、例えば投与量の決定等は、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内である。
【0142】
ＦＸＲ処理胆管細胞を含む組成物は、単独で又は他の治療と組み合わせて、治療される状態に応じて同時に又は逐次に投与され得る。
【0143】
本発明の方法は、例えば肝疾患又は胆管障害の治療のために、胆管細胞の移植を受ける患者の治療において有用であり得る。例えば、胆管障害の治療方法は、
分離された胆管細胞の集団又は胆管細胞オルガノイドを、それを必要とする個体に投与すること、及び
ＦＸＲアゴニストを個体に投与すること、
を含み得る。
分離された胆管細胞の集団又は胆管細胞オルガノイドを、それを必要とする個体に投与すること、及び
ＦＸＲアゴニストを個体に投与すること、
を含み得る。
【0144】
ＦＸＲアゴニストの投与は、胆管細胞又は胆管細胞オルガノイドの機能又は再生能力を改善する可能性がある。
【0145】
幾つかの実施形態において、胆管細胞又は胆管細胞オルガノイドは、ＦＸＲ処理胆管細胞又はＦＸＲ処理胆管細胞オルガノイドであってもよい。例えば、ＦＸＲ処理胆管細胞又はＦＸＲ処理胆管細胞オルガノイドは、上記のように生成した。他の実施形態において、胆管細胞又は胆管細胞オルガノイドは、ＦＸＲ処理なしで生成されてもよく、個体への投与後にＦＸＲアゴニストに曝露されてもよい。
【0146】
本発明の方法は、ｅｘ ｖｉｖｏでの肝組織の治療において有用であり得る。移植用の肝組織を調製する方法は、分離された肝組織をｅｘ ｖｉｖｏでＦＸＲアゴニストに曝露することを含み得る。
【0147】
肝組織をＦＸＲアゴニストに曝露すると、肝組織内の胆管細胞の機能的特性及び再生能力が改善される可能性がある。
【0148】
これは、例えば肝疾患又は胆管障害の治療に有用であり得る。胆管障害の治療方法は、
個体から得られた分離された肝組織をｅｘ ｖｉｖｏでＦＸＲアゴニストに曝露すること、及び
上記曝露後、肝組織を個体に移植すること、
を含み得る。
個体から得られた分離された肝組織をｅｘ ｖｉｖｏでＦＸＲアゴニストに曝露すること、及び
上記曝露後、肝組織を個体に移植すること、
を含み得る。
【0149】
方法は、個体への肝組織の移植後、個体にＦＸＲアゴニストを投与することを更に含んでもよい。これは、例えば、生着後に機能又は再生能力が改善された細胞を維持するのに有用であり得る。
【0150】
本発明の他の態様は、患者の薬物への感受性を決定するための、本明細書に記載されるように増殖されるＦＸＲ処理胆管細胞の使用に関する。方法は、
（ｉ）疾患状態、例えば胆管障害又は肝疾患を伴う個体由来の分離された初代胆管細胞の集団を準備すること、
（ｉｉ）集団を、ＦＸＲアゴニスト、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達増強剤とを含む増殖培地中で培養することで、疾患表現型を示す増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を生成すること、
（ｉｉｉ）本明細書に記載される方法により生成される増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を治療用化合物と接触させること、及び
（ｉｖ）上記ＦＸＲ処理胆管細胞に対する治療用化合物の効果を測定すること、
を含み得て、ＦＸＲ処理胆管細胞の疾患表現型の改善は、個体が治療用化合物に感受性があることの指標である。
（ｉ）疾患状態、例えば胆管障害又は肝疾患を伴う個体由来の分離された初代胆管細胞の集団を準備すること、
（ｉｉ）集団を、ＦＸＲアゴニスト、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達増強剤とを含む増殖培地中で培養することで、疾患表現型を示す増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を生成すること、
（ｉｉｉ）本明細書に記載される方法により生成される増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団を治療用化合物と接触させること、及び
（ｉｖ）上記ＦＸＲ処理胆管細胞に対する治療用化合物の効果を測定すること、
を含み得て、ＦＸＲ処理胆管細胞の疾患表現型の改善は、個体が治療用化合物に感受性があることの指標である。
【0151】
ＦＸＲ処理胆管細胞の増殖、成長、生存率若しくは胆汁酸耐性、ＦＸＲ処理胆管細胞が以下に記載される１つ以上の細胞機能若しくはオルガノイド機能を発揮する能力、又はＦＸＲ処理胆管細胞が（ｉ）移植後の非ヒト動物モデルへの生着、（ｉｉ）非ヒト動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの胆管の形成、（ｉｉｉ）非ヒト動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの疾患表現型のレスキュー、（ｉｖ）移植後の非ヒト動物モデルの生存の延長、（ｖ）非ヒト動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの細胞機能の維持、（ｖｉ）ｉｎ ｖｉｖｏでの胆管減少症の回復、（ｖｉｉ）非ヒト動物モデルにおける移植後の血清肝機能マーカーの改善、及び／又は（ｖｉｉｉ）ｅｘ－ｖｉｖｏで維持されているヒト臓器の生着、管の修復及び機能の改善のうちの１つ以上を発揮する能力は、治療用化合物の不存在下と比較して、治療用化合物の存在下において測定され得る。
【0152】
疾患表現型を有する増殖されたＦＸＲ処理胆管細胞が、治療用化合物の不存在下と比較してその存在下でこれらの機能の１つ以上を発揮する能力の増加は、その化合物が個体における疾患に対して改善効果を有することの指標である。
【0153】
上記のように生成される分離されたＦＸＲ処理胆管細胞の集団は、試験化合物と胆管細胞の相互作用とのモデリング、例えば毒性スクリーニング、胆管障害のモデリング、又は潜在的な治療効果を有する化合物のスクリーニングにおいて有用であり得る。
【0154】
幾つかの実施形態において、胆管細胞は、健康な一次組織から取得され得る。他の実施形態において、胆管細胞は、胆管疾患を伴うドナー由来の一次組織から取得され得て、疾患表現型を示し得る。
【0155】
本発明の別の態様は、疾患モデリング及び胆管障害の病因の研究のための、正常な患者又は胆管障害を伴う患者に由来するＦＸＲ処理胆管細胞の集団の使用を提供する。
【0156】
モデリング及びスクリーニングに使用するためのＦＸＲ処理胆管細胞は、オルガノイド（胆管細胞オルガノイド）、オルガノイドに満たないクラスター又は例えば胆管細胞オルガノイドの破壊により生成された個別の細胞（胆管細胞）の形であり得る。
【0157】
化合物のスクリーニング方法は、
本明細書に記載される方法により生成されるＦＸＲ処理胆管細胞の集団を試験化合物と接触させること、及び
上記胆管細胞に対する試験化合物の効果及び／又は試験化合物に対する上記胆管細胞の効果を測定すること、
を含み得る。
本明細書に記載される方法により生成されるＦＸＲ処理胆管細胞の集団を試験化合物と接触させること、及び
上記胆管細胞に対する試験化合物の効果及び／又は試験化合物に対する上記胆管細胞の効果を測定すること、
を含み得る。
【0158】
胆管細胞の増殖、成長、生存率若しくは胆汁酸耐性、又は胆管細胞が１つ以上の細胞機能若しくはオルガノイド機能を発揮する能力は、試験化合物の不存在下と比較してその存在下において測定され得る。
【0159】
増殖、成長、生存率又は１つ以上の細胞機能若しくはオルガノイド機能を発揮する能力の減少は、化合物が毒性効果を有することの指標であり、成長、生存率又は１つ以上の細胞機能若しくはオルガノイド機能を発揮する能力の増加は、化合物が胆管細胞に対して改善効果を有することの指標である。
【0160】
幾つかの実施形態において、ＦＸＲ処理胆管細胞は、胆管腫瘍に由来し得て、腫瘍由来細胞の増殖、成長、生存率又は１つ以上の細胞機能若しくはオルガノイド機能を発揮する能力に対する試験化合物の効果が測定され得る。
【0161】
遺伝子発現は、試験化合物の不存在下と比較してその存在下において測定され得る。例えば、１つ以上の胆管マーカー遺伝子の発現が測定され得る。発現の複合的な減少は、化合物が毒性効果を有するか、又は胆管細胞の機能的状態を変更し得ることの指標である。遺伝子発現は、例えばＲＴ－ＰＣＲにより核酸レベルで測定され得るか、又は例えばＥＬＩＳＡ等の免疫学的技術により、若しくは活性アッセイによりタンパク質レベルで測定され得る。シトクロムｐ４５０アッセイ、例えば発光、蛍光又は発色アッセイは、当該技術分野においてよく知られており、商業的供給業者から入手可能である。
【0162】
幾つかの実施形態において、胆管疾患のためのリスク遺伝子座又は胆管疾患、例えば上記の疾患に関連する遺伝子の発現が測定され得る。
【0163】
ＦＸＲ処理胆管細胞による試験化合物の代謝、分解又は破壊が測定され得る。幾つかの実施形態において、試験化合物及び／又は上記試験化合物の代謝産物の量又は濃度の変化が、連続的に又は１つ以上の時点で経時的に測定又は計測され得る。例えば、試験化合物の量若しくは濃度の減少、及び／又は上記試験化合物の代謝産物の量若しくは濃度の増加が測定又は計測され得る。幾つかの実施形態において、試験化合物及び／又は代謝産物の量又は濃度の変化速度が測定され得る。試験化合物又は代謝産物の量を計測するための適切な技術としては、質量分析法が挙げられる。
【0164】
これは、試験化合物のｉｎ ｖｉｖｏでの半減期、毒性、有効性又はその他のｉｎ ｖｉｖｏでの特性の測定において有用であり得る。
【0165】
ＦＸＲ処理胆管細胞の１つ以上の機能は、試験化合物の不存在下と比較してその存在下において測定及び／又は計測され得る。例えば、胆管細胞がＭＤＲ１機能、胆汁酸の移動、ＶＥＧＦ応答、アセチルコリン応答又はＡＴＰ応答、ＣＦＴＲ媒介性塩化物輸送、ＧＧＴ活性、ＡＬＰ活性又はセクレチン応答若しくはソマトスタチン応答、フォルスコリン誘発腫脹（Dekkers et al Nat Med 2013; 19:939-45）、胆汁抵抗性、重炭酸塩分泌、内腔の保全性（すなわち、該化合物は、密着結合を破壊し、オルガノイドの内腔を崩壊させる）、オルガノイドの腔内外への化合物の移動、及び腔内の細菌の存在又は生存率の１つ以上を発揮する能力が測定及び／又は計測され得る。胆管細胞が胆管細胞オルガノイドへと集成する能力も測定され得る。
【0166】
ＦＸＲ処理胆管細胞が、試験化合物の不存在下と比較してその存在下でこれらの機能の１つ以上を発揮する能力の減少は、その化合物が胆管上皮に対して毒性効果を有することの指標である。胆管細胞が、試験化合物の不存在下と比較してその存在下でこれらの機能の１つ以上を発揮する能力の増加は、その化合物が胆管誘発効果を有する（例えば、その化合物は胆管上皮の活性を促進する）ことの指標である。
【0167】
本発明の別の態様は、ＦＸＲアゴニストを含む増殖培地を含む、ＦＸＲ処理胆管細胞オルガノイドの生成のためのキットを提供する。
【0168】
キットは、上皮成長因子（ＥＧＦ）、非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達増強剤、及び古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤を更に含み得る。
【0169】
適切な増殖培地は、先により詳細に記載されている。
【0170】
キットは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）等の足場マトリックスを更に含み得る。足場マトリックスは、増殖培地の一部として提供され得るか又は別個に提供され得る。
【0171】
増殖培地は、脱イオンされた蒸留水中で配合され得る。増殖培地は、典型的には、コンタミネーションを防ぐために、例えば紫外光、加熱、照射又は濾過によって使用前に滅菌される。１種以上の培地は、貯蔵又は輸送のために凍結（例えば、約－２０℃又は－８０℃で）され得る。１種以上の培地は、コンタミネーションを防ぐために１種以上の抗生物質を含有し得る。
【0172】
キットは、初代胆組織から初代胆管細胞を分離するためのブラシ又はスクレイパー等の試料採取器を更に有し得る。キットは、組織試料から胆管細胞を機械的に分離するためのプレート又は容器と、組織破片から細胞を分離するための遠心分離管とを更に有し得る。
【0173】
キットは、細胞の抽出前に組織を保存するための保存培地を更に有し得る。適切な培地としては、ＵＷ溶液（例えば、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（商標））並びに生存促進性サイトカイン及び／又はＲｏｃｋ阻害剤が補充されたウィリアムＥ培地が挙げられる。
【0174】
キットは、洗浄培地を更に有し得る。適切な洗浄培地としては、ＥＧＦ及びＲｏｃｋ阻害剤が補充されたウィリアムＥ培地が挙げられ得る。
【0175】
キットは、ＲＯＣＫ阻害剤等の生存促進性サイトカインを更に有し得る。
【0176】
キットは、プレートヒーターを更に有し得る。
【0177】
キットは、冷凍保存溶液を更に有し得る。適切な冷凍保存培地は、先に記載されている。
【0178】
１つ以上の培地は、１倍配合物又はそれより濃縮された配合物、例えば２倍～２５０倍濃縮された培地配合物であり得る。１倍配合物では、培地中の各成分は、細胞培養を目的とする濃度、例えば上記の濃度である。濃縮された配合物では、１つ以上の成分が、細胞培養を目的とする濃度よりも高い濃度で存在する。濃縮された培養培地は、当該技術分野においてよく知られている。培養培地は、既知の方法、例えば塩沈殿又は選択的濾過を使用して濃縮され得る。濃縮された培地は、使用のために水（好ましくは、脱イオンされ蒸留された）又は任意の適切な溶液、例えば生理食塩水溶液、水性緩衝液若しくは培養培地で希釈され得る。
【0179】
キット中の１つ以上の培地は、気密封止された容器中に収容され得る。気密封止された容器は、培養培地の輸送又は貯蔵につき、コンタミネーションを防ぐために好ましい場合がある。容器は、フラスコ、プレート、ボトル、ジャー、バイアル又はバッグ等の任意の適切な容器であり得る。
【0180】
本発明の別の態様は、ＦＸＲ処理胆管細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖のための、ＦＸＲアゴニストを含む増殖培地の使用を提供する。
【0181】
増殖培地は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤、及び古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤を更に含み得る。
【0182】
増殖培地の好適な追加成分は当該技術分野において知られている（例えばF. Sampaziotis, et al. Nat. Protoc. 12, 814-827 (2017)を参照のこと）。
【0183】
本発明の他の態様及び実施形態は、「からなる（consisting of）」の用語によって置き換えられる「含む、有する（comprising）」の用語を伴う上に記載される態様及び実施形態、並びに「本質的にからなる（consisting essentially of）」の用語によって置き換えられる「含む、有する（comprising）」の用語を伴う上に記載される態様及び実施形態を提供する。
【0184】
本出願は、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、あらゆる上の態様及び上に記載される実施形態の互いとの全ての組み合わせを開示することが理解される。同様に、本出願は、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、好ましい及び／又は任意の特徴の単独の又はあらゆる他の態様との全ての組み合わせを開示する。
【0185】
上の実施形態の変形形態、更なる実施形態及びそれらの変形形態は、本開示を読むことによって当業者に明らかとなり、それら自体が本発明の範囲に含まれる。
【0186】
本明細書で言及される全ての文書及び配列データベースエントリは、全ての目的に対してそれらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【0187】
本明細書において使用される場合、「及び／又は」は、２つの明示される特徴又は成分の各々の他方を含む又は他方を含まない具体的な開示として理解される。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的な開示として、それぞれが本明細書において個別に述べられているかのように理解される。
【0188】
ここで、本発明の或る特定の態様及び実施形態を例として、また上に記載される図面を参照して解説する。
【0189】
［実験］
１．方法
組織採取
胆嚢、胆管、肝生検材料及び胆汁は、循環停止後に可能な限り速やかに、死亡した移植臓器ドナーから滅菌条件下で採取された。組織試料、及び移植のために回収されたがその後衰退した（declined）肝臓を、ウィスコンシン大学（ＵＷ（商標））の臓器提示溶液中において、４℃で研究室に移送した。
１．方法
組織採取
胆嚢、胆管、肝生検材料及び胆汁は、循環停止後に可能な限り速やかに、死亡した移植臓器ドナーから滅菌条件下で採取された。組織試料、及び移植のために回収されたがその後衰退した（declined）肝臓を、ウィスコンシン大学（ＵＷ（商標））の臓器提示溶液中において、４℃で研究室に移送した。
【0190】
組織解離
切除した組織（胆嚢、肝外管及び肝臓）を上記のように研究室に移送し、切除の直後に処理した。胆嚢及び肝外胆管試料から胆汁を排出させ、縦切開により臓器内腔を露出させた。肝臓試料を、処理前に１ｃｍ２の立方体に分割した。全ての試料をＣａ２＋Ｍｇ２＋ ＋ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）を含む温ＰＢＳで２回洗浄し、続いてリベラーゼ（０．２Ｗｕｅｎｓｃｈ／ｍｌ）を使用して、３７℃にて、２００ＲＰＭで３０分間インキュベートしたシェーカー内で酵素消化した。ＤＮＡｓｅＩ（２０００Ｕ／ｍｌ）を溶液に添加して、細胞の凝集を防ぎ、生存率を高めた。Miltenyi BiotecのＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ組織解離装置及びＧｅｎｔｌｅＭａｃｓ組織解離Ｃチューブを使用して、肝臓試料を更に解離させた。胆嚢及び肝外管の試料では、内腔の穏やかな機械的なスクレイピングが、酵素消化後に上皮細胞を剥離するのに適切であった。全ての細胞懸濁液を７０μｍフィルターに通して濾過して、デブリ及び残存組織を除去し、１％ＢＳＡ（重量／体積）を含有するＰＢＳで洗浄し、４℃の温度を維持した冷却遠心機で５分間、４００ｇにて遠心分離した。細胞をMiltenyi Biotecの赤血球（ＲＢＣ）溶解中に再懸濁させ、室温（ＲＴ）で１０分間インキュベートした。Miltenyi Biotecのデブリ除去溶液キットを、製造業者の使用説明書に従って、残存デブリ及び死細胞を除去するために使用した。肝臓試料では、得られた細胞懸濁液を５０ｇにて５分間（４℃）遠心分離して、肝細胞画分をペレット化し、上清を収集し、下記のように胆管細胞を分離した。
切除した組織（胆嚢、肝外管及び肝臓）を上記のように研究室に移送し、切除の直後に処理した。胆嚢及び肝外胆管試料から胆汁を排出させ、縦切開により臓器内腔を露出させた。肝臓試料を、処理前に１ｃｍ２の立方体に分割した。全ての試料をＣａ２＋Ｍｇ２＋ ＋ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）を含む温ＰＢＳで２回洗浄し、続いてリベラーゼ（０．２Ｗｕｅｎｓｃｈ／ｍｌ）を使用して、３７℃にて、２００ＲＰＭで３０分間インキュベートしたシェーカー内で酵素消化した。ＤＮＡｓｅＩ（２０００Ｕ／ｍｌ）を溶液に添加して、細胞の凝集を防ぎ、生存率を高めた。Miltenyi BiotecのＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ組織解離装置及びＧｅｎｔｌｅＭａｃｓ組織解離Ｃチューブを使用して、肝臓試料を更に解離させた。胆嚢及び肝外管の試料では、内腔の穏やかな機械的なスクレイピングが、酵素消化後に上皮細胞を剥離するのに適切であった。全ての細胞懸濁液を７０μｍフィルターに通して濾過して、デブリ及び残存組織を除去し、１％ＢＳＡ（重量／体積）を含有するＰＢＳで洗浄し、４℃の温度を維持した冷却遠心機で５分間、４００ｇにて遠心分離した。細胞をMiltenyi Biotecの赤血球（ＲＢＣ）溶解中に再懸濁させ、室温（ＲＴ）で１０分間インキュベートした。Miltenyi Biotecのデブリ除去溶液キットを、製造業者の使用説明書に従って、残存デブリ及び死細胞を除去するために使用した。肝臓試料では、得られた細胞懸濁液を５０ｇにて５分間（４℃）遠心分離して、肝細胞画分をペレット化し、上清を収集し、下記のように胆管細胞を分離した。
【0191】
細胞分離
組織を単一細胞に解離した後、製造業者の使用説明書に従ってMiltenyi BiotechのａｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏセパレータ及びＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）マイクロビーズを使用して、磁気関連セルソーティング（ＭＡＣＳ）により胆管細胞を分離した。得られた細胞を計数し、４４４ｇにて５分間遠心分離し、１０００細胞／μＬの濃度に再懸濁し、氷上で保存した。
組織を単一細胞に解離した後、製造業者の使用説明書に従ってMiltenyi BiotechのａｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏセパレータ及びＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）マイクロビーズを使用して、磁気関連セルソーティング（ＭＡＣＳ）により胆管細胞を分離した。得られた細胞を計数し、４４４ｇにて５分間遠心分離し、１０００細胞／μＬの濃度に再懸濁し、氷上で保存した。
【0192】
10x単一細胞ライブラリ作製プロセス
ＧＥＭ－ＲＴ（ポリアデニル化（ploy adenylated）ｍＲＮＡをバーコード化し、続いて逆転写するゲルビーズインエマルジョン）を破壊し、シラン磁気ビーズを使用して、ＧＥＭ－ＲＴ混合物から第１鎖ｃＤＮＡを精製し、次いでＰＣＲを介してｃＤＮＡを増幅した。酵素による断片化、末端修復及びＡテーリングの後、サイズ選択（ＳＰＲＩＳｅｌｅｃｔ試薬を使用）を行った。アダプターを断片にライゲートし、精製工程の後、インデックスＰＣＲを行った。ＳＲＩＳｅｌｅｃｔを用いた更なる一連のサイズ選択後、完成したライブラリを定量化し、（Agilentのバイオアナライザ及びｑＰＣＲ）、Illuminaのシーケンシング機器（ＨＳ４０００）で実行するために希釈した。
ＧＥＭ－ＲＴ（ポリアデニル化（ploy adenylated）ｍＲＮＡをバーコード化し、続いて逆転写するゲルビーズインエマルジョン）を破壊し、シラン磁気ビーズを使用して、ＧＥＭ－ＲＴ混合物から第１鎖ｃＤＮＡを精製し、次いでＰＣＲを介してｃＤＮＡを増幅した。酵素による断片化、末端修復及びＡテーリングの後、サイズ選択（ＳＰＲＩＳｅｌｅｃｔ試薬を使用）を行った。アダプターを断片にライゲートし、精製工程の後、インデックスＰＣＲを行った。ＳＲＩＳｅｌｅｃｔを用いた更なる一連のサイズ選択後、完成したライブラリを定量化し、（Agilentのバイオアナライザ及びｑＰＣＲ）、Illuminaのシーケンシング機器（ＨＳ４０００）で実行するために希釈した。
【0193】
10Xデータの処理及び正規化
シーケンシング実行による結果を手動でチェックして、全収率及び品質が予想通りであることを確認した。機器からのデータを、10Xのソフトウェアｃｅｌｌｒａｎｇｅｒに必要な入力形式であるｆａｓｔｑ形式へと変換し、10Xから入手可能なヒト参照ＧＲＣｈ３６－１．２．０を使用してアラインした。データセットは、公表されたデータセットの胆管細胞のクラスター（MacParland SA et al, 10 2018のクラスター１７）の数を統合することによって増強された（１７）。細胞は異なる起源の一部としてアノテートされており、これらは一次組織（ＰＲＩ）、未処理オルガノイド（ＯＲＧ）、及び処理オルガノイド（ＯＲＧＴ）である。各起源は、肝内管（ＩＨＤ）、総胆管（ＣＢＤ）、胆嚢（ＧＢ）の３つの領域を含む。少なくとも１つの起源の各バッチからの少なくとも３つの細胞で読み取り数が０超である遺伝子を下流分析のために維持した。低品質の細胞は、ミトコンドリアゲノムにマッピングされているＵＭＩのパーセンテージと、パッケージｓｃａｔｅｒでルーチンｉｓＯｕｔｌｉｅｒを用いて異常値（３つの中央絶対偏差）を決定することによって検出された遺伝子の数とに基づいて除去された（１８）。胆管細胞は、胆管マーカーＥＰＣＡＭ、ＫＲＴ７、ＫＲＴ１９（カウント数３超）のうち少なくとも１つを発現する細胞を保持することによって分離された。
シーケンシング実行による結果を手動でチェックして、全収率及び品質が予想通りであることを確認した。機器からのデータを、10Xのソフトウェアｃｅｌｌｒａｎｇｅｒに必要な入力形式であるｆａｓｔｑ形式へと変換し、10Xから入手可能なヒト参照ＧＲＣｈ３６－１．２．０を使用してアラインした。データセットは、公表されたデータセットの胆管細胞のクラスター（MacParland SA et al, 10 2018のクラスター１７）の数を統合することによって増強された（１７）。細胞は異なる起源の一部としてアノテートされており、これらは一次組織（ＰＲＩ）、未処理オルガノイド（ＯＲＧ）、及び処理オルガノイド（ＯＲＧＴ）である。各起源は、肝内管（ＩＨＤ）、総胆管（ＣＢＤ）、胆嚢（ＧＢ）の３つの領域を含む。少なくとも１つの起源の各バッチからの少なくとも３つの細胞で読み取り数が０超である遺伝子を下流分析のために維持した。低品質の細胞は、ミトコンドリアゲノムにマッピングされているＵＭＩのパーセンテージと、パッケージｓｃａｔｅｒでルーチンｉｓＯｕｔｌｉｅｒを用いて異常値（３つの中央絶対偏差）を決定することによって検出された遺伝子の数とに基づいて除去された（１８）。胆管細胞は、胆管マーカーＥＰＣＡＭ、ＫＲＴ７、ＫＲＴ１９（カウント数３超）のうち少なくとも１つを発現する細胞を保持することによって分離された。
【0194】
正規化、高可変遺伝子の同定及び細胞周期回帰（cell cycle regression）（Ｇ２Ｍ期及びＳ期のスコアの差を回帰）は、Ｓｅｕｒａｔパッケージを用いて実施した（１９）。バッチ補正のためにｓｃｒａｎでルーチンｆａｓｔＭＮＮを用いた（２０）。バッチ補正した試料を図２Ａに示す。Ｌｏｕｖａｉｎ法を群集検出に適用することにより得られ、ミトコンドリアゲノムにマッピングされているＵＭＩのパーセンテージと、検出された遺伝子数とにおいて異常値である細胞を特徴とする小さなクラスターは除外された。
【0195】
正規化された10Xデータの分析
正規化されたデータは、３つのクラスターを生成する解像度を選択することによってＳｃａｎｐｙパッケージのＬｏｕｖａｉｎ法を使用し（２１）、１０のランダムな初期化によりクラスター化した。Ｌｏｕｖａｉｎクラスターと起源のアノテーションとの間の類似性は、調整ランド指数（ＡＲＩ）及び調整相互情報量（ＡＭＩ）を使用して評価した。いずれの指標も間隔［０、１］内にあり、０に近い値はランダムなラベル付けを示し、正確に１は２つのパーティションが同一であることを意味する。ランダムな初期化によって得られた異なるパーティションについて計算された平均値は、両方の指標で０．９５超であり、起源とクラスターとの間の高い対応関係を示している。領域について実施した同じ分析は、領域とクラスターとの間の一致が不十分であることを示し、異なる領域に位置する細胞の転写プロファイルの類似性を示唆している。転写類似性は、パーティションベースのグラフ抽象化（ＰＡＧＡ）フレームワーク内のデータマニホールドパーティションの接続性を推定することによって、起源及び領域の解像度で定量化した。起源の解像度では、この分析により、未処理のオルガノイドと一次組織との間よりも、処理されたオルガノイドと一次組織との間のより高い転写類似性が特に強調された。興味深いことに、領域の解像度では、一次組織内の隣接する位置間でより高い転写類似性が確認され、肝内管及び胆嚢は最も低い接続値を有した。接続性と解剖学的位置との間のこの関連性は、異なる領域に位置する細胞の類似性とともに、擬似空間的な次元として表すことができる一次組織における細胞の転写プロファイルの段階的な変化を示唆した。この観点から、擬似時間的（又は擬似空間的）な順序付けのための２つの方法である、拡散擬似時間（２２）及びＭｏｎｏｃｌｅ２（２３）を適用することによって一次組織を分析した。Ｍｏｎｏｃｌｅ２では、擬似時間における差次的発現を、差分ＧｅｎｅＴｅｓｔルーチンを使用して計算した。いずれの方法でも転写類似性と解剖学的位置との間の関連性が確認され、擬似空間的な次元に沿った領域マーカーの表現が可能となった。細胞の大部分は拡散擬似時間値が０．６５超を有したため、可視化を改善し、過密を避けるために、密度プロットは［０．６５、０．９］の範囲で示した。次に、細胞の潜在的な亜集団を特定するために、オルガノイド（処理済み及び未処理）及び一次組織の各領域を個別に分析した。試料サイズが比較的小さいため、コンセンサスアプローチによって複数のクラスタリング解法を組み合わせて高い精度及び堅牢性が得られる、クラスタリング法ＳＣ３を適用した（２４）。ＳＣ３では、ユーザーがクラスターの数を事前に定義できる。この選択の恣意性により、クラスターの数を１～１０の間で変化させ、解像度をまたいでクラスターの安定性（ＳＣ３安定性指数）を計算し、クラスタリング解像度が高くなるにつれて細胞がどのように移動するかを示すクラスタリングツリーを構築した（パッケージｃｌｕｓｔｒｅｅ）（２５）。各領域内に安定なサブツリーは形成されず、細胞の亜集団を定義する安定なクラスターが存在しないことを示している。Ｓｃａｎｐｙでウィルコクソン順位和検定（ｐ値＜０．０１、｜ｌｏｇ２倍率変化｜＞１）を適用することにより、領域マーカー及び差次的発現遺伝子を同定した。パッケージＧＳＥＡ（２６）及びＥｎｒｉｃｈｒ（２７）を使用して、遺伝子セット、遺伝子オントロジー及び経路エンリッチメントを実施した。
正規化されたデータは、３つのクラスターを生成する解像度を選択することによってＳｃａｎｐｙパッケージのＬｏｕｖａｉｎ法を使用し（２１）、１０のランダムな初期化によりクラスター化した。Ｌｏｕｖａｉｎクラスターと起源のアノテーションとの間の類似性は、調整ランド指数（ＡＲＩ）及び調整相互情報量（ＡＭＩ）を使用して評価した。いずれの指標も間隔［０、１］内にあり、０に近い値はランダムなラベル付けを示し、正確に１は２つのパーティションが同一であることを意味する。ランダムな初期化によって得られた異なるパーティションについて計算された平均値は、両方の指標で０．９５超であり、起源とクラスターとの間の高い対応関係を示している。領域について実施した同じ分析は、領域とクラスターとの間の一致が不十分であることを示し、異なる領域に位置する細胞の転写プロファイルの類似性を示唆している。転写類似性は、パーティションベースのグラフ抽象化（ＰＡＧＡ）フレームワーク内のデータマニホールドパーティションの接続性を推定することによって、起源及び領域の解像度で定量化した。起源の解像度では、この分析により、未処理のオルガノイドと一次組織との間よりも、処理されたオルガノイドと一次組織との間のより高い転写類似性が特に強調された。興味深いことに、領域の解像度では、一次組織内の隣接する位置間でより高い転写類似性が確認され、肝内管及び胆嚢は最も低い接続値を有した。接続性と解剖学的位置との間のこの関連性は、異なる領域に位置する細胞の類似性とともに、擬似空間的な次元として表すことができる一次組織における細胞の転写プロファイルの段階的な変化を示唆した。この観点から、擬似時間的（又は擬似空間的）な順序付けのための２つの方法である、拡散擬似時間（２２）及びＭｏｎｏｃｌｅ２（２３）を適用することによって一次組織を分析した。Ｍｏｎｏｃｌｅ２では、擬似時間における差次的発現を、差分ＧｅｎｅＴｅｓｔルーチンを使用して計算した。いずれの方法でも転写類似性と解剖学的位置との間の関連性が確認され、擬似空間的な次元に沿った領域マーカーの表現が可能となった。細胞の大部分は拡散擬似時間値が０．６５超を有したため、可視化を改善し、過密を避けるために、密度プロットは［０．６５、０．９］の範囲で示した。次に、細胞の潜在的な亜集団を特定するために、オルガノイド（処理済み及び未処理）及び一次組織の各領域を個別に分析した。試料サイズが比較的小さいため、コンセンサスアプローチによって複数のクラスタリング解法を組み合わせて高い精度及び堅牢性が得られる、クラスタリング法ＳＣ３を適用した（２４）。ＳＣ３では、ユーザーがクラスターの数を事前に定義できる。この選択の恣意性により、クラスターの数を１～１０の間で変化させ、解像度をまたいでクラスターの安定性（ＳＣ３安定性指数）を計算し、クラスタリング解像度が高くなるにつれて細胞がどのように移動するかを示すクラスタリングツリーを構築した（パッケージｃｌｕｓｔｒｅｅ）（２５）。各領域内に安定なサブツリーは形成されず、細胞の亜集団を定義する安定なクラスターが存在しないことを示している。Ｓｃａｎｐｙでウィルコクソン順位和検定（ｐ値＜０．０１、｜ｌｏｇ２倍率変化｜＞１）を適用することにより、領域マーカー及び差次的発現遺伝子を同定した。パッケージＧＳＥＡ（２６）及びＥｎｒｉｃｈｒ（２７）を使用して、遺伝子セット、遺伝子オントロジー及び経路エンリッチメントを実施した。
【0196】
データ可用性
10Xの生データ（ｆａｓｔｑファイル）は、リポジトリＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓに寄託番号Ｅ－ＭＴＡＢ－８４９５ ２２で保管されている。
10Xの生データ（ｆａｓｔｑファイル）は、リポジトリＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓに寄託番号Ｅ－ＭＴＡＢ－８４９５ ２２で保管されている。
【0197】
オルガノイドの誘導及び培養
ｓｃＲＮＡｓｅｑ用に分離された細胞の一部を培養し、本発明者らの確立した方法論を使用してオルガノイドとして増殖させた（１１、１２）。細胞は、それらの起源の領域に関係なく、同じ条件下で培養した。
ｓｃＲＮＡｓｅｑ用に分離された細胞の一部を培養し、本発明者らの確立した方法論を使用してオルガノイドとして増殖させた（１１、１２）。細胞は、それらの起源の領域に関係なく、同じ条件下で培養した。
【0198】
免疫蛍光、ＲＮＡ抽出、及び定量的リアルタイムＰＣＲ
ＩＦ、ＲＮＡ抽出及びＱＰＣＲを、前述した（１１、１２、２８、２９）ように実施した。
ＩＦ、ＲＮＡ抽出及びＱＰＣＲを、前述した（１１、１２、２８、２９）ように実施した。
【0199】
全てのＱＰＣＲデータは、別段の定めがない限り、４つの独立した系統の中央値、四分位範囲（ＩＱＲ）及び範囲（最小から最大まで）として表される。値はハウスキーピング遺伝子のヒドロキシメチルビラン合成酵素（ＨＭＢＳ）を基準とする。全てのＩＦ画像は、ZeissのＡｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ倒立顕微鏡又はZeissのＬＳＭ ７００共焦点顕微鏡を使用して取得した。Ｉｍａｇｅｊ １．４８ｋソフトウェア（Wayne Rasband、ＮＩＨＲ、米国、http://imagej.nih.gov/ij）を画像処理のために使用した。ＩＦ画像は３回の異なる実験の代表である。
【0200】
ＧＧＴ活性
ＧＧＴ活性を、ＭａｘＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（商標）γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）酵素アッセイキット（Bioo scientific）を使用して製造業者の使用説明書に基づいて３連で計測した。エラーバーは、ＳＤを表す。
ＧＧＴ活性を、ＭａｘＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（商標）γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）酵素アッセイキット（Bioo scientific）を使用して製造業者の使用説明書に基づいて３連で計測した。エラーバーは、ＳＤを表す。
【0201】
アルカリホスファターゼ染色
アルカリホスファターゼを、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ発色基質（５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）（Promega）を使用して製造業者の使用説明書に従って実施した。
アルカリホスファターゼを、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ発色基質（５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）（Promega）を使用して製造業者の使用説明書に従って実施した。
【0202】
フローサイトメトリー分析
フローサイトメトリー分析を、先に記載したように実施した（１１、１２、２８、２９）。
フローサイトメトリー分析を、先に記載したように実施した（１１、１２、２８、２９）。
【0203】
胆汁酸処理
オルガノイドを、１０μＭのＺ－ＧＳ（Santa Cruz、ｓｃ－２０４４１４）の存在下又は不存在下にて、１０μＭのＣＤＡ（Sigma、Ｃ９３７７－５Ｇ）を用いて７２時間インキュベートした。
オルガノイドを、１０μＭのＺ－ＧＳ（Santa Cruz、ｓｃ－２０４４１４）の存在下又は不存在下にて、１０μＭのＣＤＡ（Sigma、Ｃ９３７７－５Ｇ）を用いて７２時間インキュベートした。
【0204】
動物実験
全ての動物実験は、英国内務省規制（英国内務省プロジェクトライセンス番号ＰＰＬ ７０／８７０２）に従って実施した。Ｂリンパ球、Ｔリンパ球及びＮＫリンパ球を欠如する免疫不全ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）を、インハウスで飼育し、手順前後に食餌及び水を自由飲食させた。４週齢～８週齢の雄の動物を使用した。動物を治療群と対照群とに無作為に割り当てた。実験は盲検化して実施され、これが不可能であった場合（例えば、外科的手順の実施のため）、データは実験群の同一性を盲検化して分析された。同腹仔の動物を対照として使用した。
全ての動物実験は、英国内務省規制（英国内務省プロジェクトライセンス番号ＰＰＬ ７０／８７０２）に従って実施した。Ｂリンパ球、Ｔリンパ球及びＮＫリンパ球を欠如する免疫不全ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）を、インハウスで飼育し、手順前後に食餌及び水を自由飲食させた。４週齢～８週齢の雄の動物を使用した。動物を治療群と対照群とに無作為に割り当てた。実験は盲検化して実施され、これが不可能であった場合（例えば、外科的手順の実施のため）、データは実験群の同一性を盲検化して分析された。同腹仔の動物を対照として使用した。
【0205】
細胞送達
胆管細胞は、肝外胆管系を通して肝臓に逆行的に送達された（１４）。簡単に説明すると、精細なボアカニューレを胆嚢内に配置し、固定した。注入液を肝臓に向けるために、遠位総胆管をクランプで閉塞した。細胞は、総体重１ｇ当たり１μｌの総体積で、最大速度１μｌ／秒にて胆嚢内のカニューレを通して注入された。
胆管細胞は、肝外胆管系を通して肝臓に逆行的に送達された（１４）。簡単に説明すると、精細なボアカニューレを胆嚢内に配置し、固定した。注入液を肝臓に向けるために、遠位総胆管をクランプで閉塞した。細胞は、総体重１ｇ当たり１μｌの総体積で、最大速度１μｌ／秒にて胆嚢内のカニューレを通して注入された。
【0206】
ＭＤＡ投与
総体重１ｇ当たり５０μｇの濃度で４，４’－メチレンジアニリン（ＭＤＡ）を細胞送達の７日前、５日前、及び３日前に３回腹腔内（ＩＰ）投与することにより胆管症を誘発した。ＭＤＡの追加用量は、上記のように細胞送達の前に肝外胆管系に直接投与した。
総体重１ｇ当たり５０μｇの濃度で４，４’－メチレンジアニリン（ＭＤＡ）を細胞送達の７日前、５日前、及び３日前に３回腹腔内（ＩＰ）投与することにより胆管症を誘発した。ＭＤＡの追加用量は、上記のように細胞送達の前に肝外胆管系に直接投与した。
【0207】
血液試料収集
動物を選択し屠殺する時点で終末麻酔下にて下大静脈から直接的に２３ｇの針を使用して採血し、更なる処理のために１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
動物を選択し屠殺する時点で終末麻酔下にて下大静脈から直接的に２３ｇの針を使用して採血し、更なる処理のために１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
【0208】
血液試料処理
血液試料を、ケンブリッジ大学のコアバイオケミカルアッセイ研究所（Core biochemical assay laboratory）（ＣＢＡＬ）によって通常通りに処理した。試料分析の全ては、SiemensのＤｉｍｅｎｓｉｏｎ ＥＸＬアナライザーにおいてSiemensにより供給される試薬及びアッセイプロトコルを使用して実施した。
血液試料を、ケンブリッジ大学のコアバイオケミカルアッセイ研究所（Core biochemical assay laboratory）（ＣＢＡＬ）によって通常通りに処理した。試料分析の全ては、SiemensのＤｉｍｅｎｓｉｏｎ ＥＸＬアナライザーにおいてSiemensにより供給される試薬及びアッセイプロトコルを使用して実施した。
【0209】
組織採取
切片化及び染色のための組織は、別段の定めがない限り、全ての動物実験の終了時に動物を屠殺する際に採取した。動物は、動物福祉上の理由（体重減少、黄疸及び臨床的悪化）又は移植後３ヶ月で選択的に屠殺された。各時点は、関連するカプラン・マイヤー曲線上に示されている（図３Ｂ）。
切片化及び染色のための組織は、別段の定めがない限り、全ての動物実験の終了時に動物を屠殺する際に採取した。動物は、動物福祉上の理由（体重減少、黄疸及び臨床的悪化）又は移植後３ヶ月で選択的に屠殺された。各時点は、関連するカプラン・マイヤー曲線上に示されている（図３Ｂ）。
【0210】
凍結切片
切除した組織を４％のＰＦＡ中で固定し、スクロース溶液に一晩浸し、最適切断温度（ＯＣＴ）化合物中に包埋し、切片化するまで－８０℃で貯蔵した。クライオスタットミクロトームを使用して切片を６μｍ～１０μｍの厚さに切断し、更なる分析のために顕微鏡スライド上で封入した。
切除した組織を４％のＰＦＡ中で固定し、スクロース溶液に一晩浸し、最適切断温度（ＯＣＴ）化合物中に包埋し、切片化するまで－８０℃で貯蔵した。クライオスタットミクロトームを使用して切片を６μｍ～１０μｍの厚さに切断し、更なる分析のために顕微鏡スライド上で封入した。
【0211】
ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色
Ｈ＆Ｅ染色は、アデンブルックズ病院の組織学サービスによって又はSigma-Aldrichの試薬を使用して製造業者の使用説明書に従って実施した。簡潔には、組織切片を水和し、マイヤーのヘマトキシリン液で５分間処理し（Sigma-Aldrich）、温かい水道水で１５分間洗浄し、蒸留水中に３０秒間～６０秒間置いて、エオシン溶液（Sigma-Aldrich）で３０秒間～６０秒間処理した。その後、切片を脱水し、Ｅｕｋｉｔｔ（商標）速硬性封入剤（Sigma-Aldrich）を使用して封入した。
Ｈ＆Ｅ染色は、アデンブルックズ病院の組織学サービスによって又はSigma-Aldrichの試薬を使用して製造業者の使用説明書に従って実施した。簡潔には、組織切片を水和し、マイヤーのヘマトキシリン液で５分間処理し（Sigma-Aldrich）、温かい水道水で１５分間洗浄し、蒸留水中に３０秒間～６０秒間置いて、エオシン溶液（Sigma-Aldrich）で３０秒間～６０秒間処理した。その後、切片を脱水し、Ｅｕｋｉｔｔ（商標）速硬性封入剤（Sigma-Aldrich）を使用して封入した。
【0212】
組織学
組織学切片は、肝胆管組織学（ＳＤ）に特に関心を持つ独立した組織病理学者によって再調査された。
組織学切片は、肝胆管組織学（ＳＤ）に特に関心を持つ独立した組織病理学者によって再調査された。
【0213】
マウス肝臓における移植細胞の定量化
各々の動物について、評価する異なる葉について、３つのランダムな切片を分析した。動物当たり約１００００個の細胞、合計４９８４６個の細胞を分析した。
各々の動物について、評価する異なる葉について、３つのランダムな切片を分析した。動物当たり約１００００個の細胞、合計４９８４６個の細胞を分析した。
【0214】
ＭＲイメージング
磁気共鳴胆管膵管造影は、動物の屠殺後に実施した。ＭＲＣＰは、Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｅｃ ９４／２０システムを使用して９．４Ｔで実施した（Bruker、ドイツ、エットリンゲン）。信号対雑音比をより高くして胆管の視覚化を改善するために、２次元シーケンスを、僅かに変更したパラメーター（１１ｍｓ間隔で離れたエコーにより、１１０ｍｓの有効エコー時間が得られる；繰り返し時間５７４１ｍｓ；マトリックスサイズ２５６×２５６；撮像視野４．３３×５．３５ｃｍ２により、平面解像度１７０×２００μｍ２が得られる）で使用した。スライスを、厚さ０．６ｍｍで肝臓及び胆嚢を通して冠状に取得した。この取得のために、ボリュームコイルを使用して、無線周波数の不均一性の影響を減らした。
磁気共鳴胆管膵管造影は、動物の屠殺後に実施した。ＭＲＣＰは、Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｅｃ ９４／２０システムを使用して９．４Ｔで実施した（Bruker、ドイツ、エットリンゲン）。信号対雑音比をより高くして胆管の視覚化を改善するために、２次元シーケンスを、僅かに変更したパラメーター（１１ｍｓ間隔で離れたエコーにより、１１０ｍｓの有効エコー時間が得られる；繰り返し時間５７４１ｍｓ；マトリックスサイズ２５６×２５６；撮像視野４．３３×５．３５ｃｍ２により、平面解像度１７０×２００μｍ２が得られる）で使用した。スライスを、厚さ０．６ｍｍで肝臓及び胆嚢を通して冠状に取得した。この取得のために、ボリュームコイルを使用して、無線周波数の不均一性の影響を減らした。
【0215】
胆管系を検査するために、最大値投影法により画像を作成した。腫瘍成長を除外する構造イメージングを、２５°のフリップ角、１４ｍｓの繰り返し時間及び７ｍｓのエコー時間でＴ１加重３Ｄ ＦＬＡＳＨ（高速低角度励起）シーケンスを使用して実施した。マトリックスは５１２×２５６×２５６であり、撮像視野は５．１２×２．５６×２．５６ｃｍ３であり、最終的な等方性解像度は１００μｍであった。
【0216】
胆管系のボリュームレンダリング画像は、Ｏｓｉｒｉｘソフトウェアを使用してソースデータから生成した。関心領域は、残りのデータから手動で区域化した。ＭＲＣＰ画像は、肝胆管放射線学（ＥＭＧ、ＳＵ）に特に関心を持つ２人の独立した放射線学者によって再調査された。
【0217】
ドナー肝臓のｅｘ ｖｉｖｏ正常温度灌流
先に記載したようなヒト肝臓のｅｘ ｖｉｖｏ灌流には、メトラ（OrganOx、英国、オックスフォード）正常温度肝臓灌流デバイスを使用した（１５、３０）。この装置は、移植用肝臓の保存に臨床的に使用されており（１５）、臓器をＡＢＯ血液型に適合した正常温度酸素化血液で灌流することで、長期の自動臓器保存を可能にする。灌流デバイスには、オンライン血液ガス測定に加えて、ｐＨ、ＰＯ２及びＰＣＯ２（生理学的範囲内）、温度並びに生理学的正常範囲内の平均動脈圧を維持するためのソフトウェア制御アルゴリズムが組み込まれている。簡単に説明すると、肝動脈、門脈、下大静脈及び胆管にカニューレを挿入し、デバイスに接続し、灌流を開始した。
先に記載したようなヒト肝臓のｅｘ ｖｉｖｏ灌流には、メトラ（OrganOx、英国、オックスフォード）正常温度肝臓灌流デバイスを使用した（１５、３０）。この装置は、移植用肝臓の保存に臨床的に使用されており（１５）、臓器をＡＢＯ血液型に適合した正常温度酸素化血液で灌流することで、長期の自動臓器保存を可能にする。灌流デバイスには、オンライン血液ガス測定に加えて、ｐＨ、ＰＯ２及びＰＣＯ２（生理学的範囲内）、温度並びに生理学的正常範囲内の平均動脈圧を維持するためのソフトウェア制御アルゴリズムが組み込まれている。簡単に説明すると、肝動脈、門脈、下大静脈及び胆管にカニューレを挿入し、デバイスに接続し、灌流を開始した。
【0218】
胆管カニューレ挿入
胆管のカニューレ挿入は、蛍光透視法誘導下で２本のＦｒシースを総胆管に挿入し、続いて、シースを介して２本の２．７Ｆｒマイクロカテーテルを使用して、左右の肝管、その後にそれぞれ区域３及び区域５の管のカニューレ挿入によって達成した。マイクロカテーテルの末梢配置は、少量のイオン性造影剤を用いた胆管造影によって確認した。細胞は区域３に注入し、担体は区域５に注入した。
胆管のカニューレ挿入は、蛍光透視法誘導下で２本のＦｒシースを総胆管に挿入し、続いて、シースを介して２本の２．７Ｆｒマイクロカテーテルを使用して、左右の肝管、その後にそれぞれ区域３及び区域５の管のカニューレ挿入によって達成した。マイクロカテーテルの末梢配置は、少量のイオン性造影剤を用いた胆管造影によって確認した。細胞は区域３に注入し、担体は区域５に注入した。
【0219】
細胞送達
ＲＦＰ発現オルガノイドを小さな塊と単一細胞との混合物に機械的に解離させ、約１０×１０６個のＲＦＰ発現細胞を約２ｃｍ３の分布領域を有する区域３の末梢管に投与し、蛍光透視誘導下でカニューレを挿入して、細胞送達を最大化した（胆管カニューレ挿入の項を参照）。同じ技術を使用して区域５の末梢枝に担体培地を送達し、臓器を最大１００時間ＮＭＰ上で維持した。
ＲＦＰ発現オルガノイドを小さな塊と単一細胞との混合物に機械的に解離させ、約１０×１０６個のＲＦＰ発現細胞を約２ｃｍ３の分布領域を有する区域３の末梢管に投与し、蛍光透視誘導下でカニューレを挿入して、細胞送達を最大化した（胆管カニューレ挿入の項を参照）。同じ技術を使用して区域５の末梢枝に担体培地を送達し、臓器を最大１００時間ＮＭＰ上で維持した。
【0220】
ヒト肝臓における移植細胞の定量化
ＲＦＰ標識胆嚢オルガノイドを注入した３つのヒト肝臓を分析した。細胞の分布領域（約２ｃｍ３）から切片を得た。肝臓当たり５つの切片、合計４４６３個の細胞を分析した。
ＲＦＰ標識胆嚢オルガノイドを注入した３つのヒト肝臓を分析した。細胞の分布領域（約２ｃｍ３）から切片を得た。肝臓当たり５つの切片、合計４４６３個の細胞を分析した。
【0221】
胆汁吸引
胆管カニューレ挿入は、関連する項に記載されているように実施した。カニューレ挿入後、ガイドワイヤー交換技術を使用して２つのマイクロ流体カテーテル（ＣＭＡマイクロダイアリシスカテーテル、Harvard Bioscience Inc、米国）をそれぞれの区域管内に配置した。カテーテルの内シャフト及び外シャフト並びに入口チューブ及び出口チューブはポリウレタンから製造されており、膜は膜孔径１００ｋＤａ及び外径０．４ｍｍを有するポリアリールエーテルスルホンから構成される。各カテーテルについて入口チューブをポータブルバッテリー駆動のＣＭＡ１０７マイクロダイアリシスポンプ（Harvard Bioscience Inc、米国）に接続し、ポンプを１μｌ／分の速度で吸引するように設定した。
胆管カニューレ挿入は、関連する項に記載されているように実施した。カニューレ挿入後、ガイドワイヤー交換技術を使用して２つのマイクロ流体カテーテル（ＣＭＡマイクロダイアリシスカテーテル、Harvard Bioscience Inc、米国）をそれぞれの区域管内に配置した。カテーテルの内シャフト及び外シャフト並びに入口チューブ及び出口チューブはポリウレタンから製造されており、膜は膜孔径１００ｋＤａ及び外径０．４ｍｍを有するポリアリールエーテルスルホンから構成される。各カテーテルについて入口チューブをポータブルバッテリー駆動のＣＭＡ１０７マイクロダイアリシスポンプ（Harvard Bioscience Inc、米国）に接続し、ポンプを１μｌ／分の速度で吸引するように設定した。
【0222】
胆汁の体積及びｐＨの測定
測定は、ｎ＝３の異なる肝臓で実施した。先に記載したように、可能な限り各肝臓の３への増加について最低２回の繰り返し測定を実施した（２７）。胆汁の体積は、胆汁を生成する胆管の体積に対して正規化され、これは対照治療群における細胞又は担体の分布の体積に相当する。これは、胆管造影上でこれらの管を描写するのに必要な造影剤の体積を使用して計算した。全てのカテーテルは体積測定の前にプライミングされたことに留意されたい。
測定は、ｎ＝３の異なる肝臓で実施した。先に記載したように、可能な限り各肝臓の３への増加について最低２回の繰り返し測定を実施した（２７）。胆汁の体積は、胆汁を生成する胆管の体積に対して正規化され、これは対照治療群における細胞又は担体の分布の体積に相当する。これは、胆管造影上でこれらの管を描写するのに必要な造影剤の体積を使用して計算した。全てのカテーテルは体積測定の前にプライミングされたことに留意されたい。
【0223】
超音波イメージング
肝臓は、日立Ａｌｏｋａ Ａｒｒｉｅｔａ Ｖ７０及び１０ＭＨｚハンドヘルドプローブを使用して、正常温度灌流デバイスにてｅｘ－ｖｉｖｏでイメージングした。画像を軸面及び矢状面で取得し、門脈、肝静脈及びそれらの主要な分枝の評価を行った。肝内胆管も評価され、特にオルガノイドが注入された区域３、及び担体を投与された区域５の対照領域に注目した。
肝臓は、日立Ａｌｏｋａ Ａｒｒｉｅｔａ Ｖ７０及び１０ＭＨｚハンドヘルドプローブを使用して、正常温度灌流デバイスにてｅｘ－ｖｉｖｏでイメージングした。画像を軸面及び矢状面で取得し、門脈、肝静脈及びそれらの主要な分枝の評価を行った。肝内胆管も評価され、特にオルガノイドが注入された区域３、及び担体を投与された区域５の対照領域に注目した。
【0224】
統計分析
全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して行った。記述統計が適切でない小さな試料サイズの場合には、個々のデータ点をプロットした。平均値を比較するために、両側スチューデントのｔ検定を使用して、統計的有意性を計算した。本発明者らの値の正規分布は、適宜、ダゴスティーノ・ピアソンの総括的な正規性検定を使用して確認した。試料間の分散は、ブラウン・フォーサイス検定を使用して検定された。多群と参照群との比較のために、分散が等しい群間で一元配置分散分析の後にダネット検定を使用し、その一方で、分散が等しくない群には、クラスカル・ワリス検定の後にダンの検定を適用した。生存率は、ログランク（マンテル・コックス）検定を使用して比較した。反復数（ｎ）が与えられている場合に、これは、別段の定めがない限りオルガノイド系統又は異なる動物の数を指す。
全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して行った。記述統計が適切でない小さな試料サイズの場合には、個々のデータ点をプロットした。平均値を比較するために、両側スチューデントのｔ検定を使用して、統計的有意性を計算した。本発明者らの値の正規分布は、適宜、ダゴスティーノ・ピアソンの総括的な正規性検定を使用して確認した。試料間の分散は、ブラウン・フォーサイス検定を使用して検定された。多群と参照群との比較のために、分散が等しい群間で一元配置分散分析の後にダネット検定を使用し、その一方で、分散が等しくない群には、クラスカル・ワリス検定の後にダンの検定を適用した。生存率は、ログランク（マンテル・コックス）検定を使用して比較した。反復数（ｎ）が与えられている場合に、これは、別段の定めがない限りオルガノイド系統又は異なる動物の数を指す。
【0225】
動物実験では、群サイズは以前の研究の分散に基づいて推定された。最終的な動物群サイズは、再現性を確保するために、過去３０日間に生存したｎ＞４匹の動物を維持しながら、異なる時点での選択的な屠殺を可能にするために選択した。試料サイズの計算に統計的手法は使用しなかった。動物を研究群に割り当てるための正式な無作為化方法は使用しなかった。しかしながら、ケージの同腹仔の動物は、研究に関与していない技術者によって、実験群又は対照群に無作為に割り当てられた。分析から除外された動物はいなかった。放射線イメージングには盲検法が使用した。
【0226】
２．結果
本発明者らは、胆管細胞オルガノイドを特徴付けるためのフレームワークとして使用するヒト胆管系の単一細胞マップを作成した。この目的のために、各領域（ＩＨＤ、ＣＤＢ、ＧＢ）からｓｃＲＮＡｓｅｑ用に分離した初代胆管細胞の画分を、本発明者らの確立した条件を使用してオルガノイドとして増殖させた（３、１６）。得られたオルガノイドは、胆管細胞マーカー（ＫＲＴ７、ＫＲＴ１９、ＳＯＸ９、ＨＮＦ１Ｂ、ＣＦＴＲ）を発現し、それらの起源の領域に関係なく、同等の機能性（ＡＬＰ、ＧＧＴ活性）及び同様の増殖能力を示した。これらの類似性を更に調査するために、これらのオルガノイドに対してｓｃＲＮＡｓｅｑを実施した（領域当たり２系統、ＧＢ：５８５９細胞、ＣＢＤ ５３２１細胞、ＩＨＤ ６６４１細胞）。ＵＭＡＰ及びＰＣＡの分析では、オルガノイドが重複するトランスクリプトームプロファイルを示すことが示され（図１Ａ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長した胆管細胞は、それらの起源の領域とは無関係に同様の転写シグネチャを持つことを示している。注目すべきことに、細胞周期関連遺伝子の回帰は、共通の「増殖」シグネチャが異なる空間起源のオルガノイド間の差異を覆い隠す可能性があることを除いて、これらの観察結果を変えなかった。さらに、オルガノイドの類似性が共通の前駆細胞／幹細胞の同一性を反映している可能性を除いて、既知の体性幹細胞マーカー（ＬＧＲ５、ＰＲＯＭ１、ＴＡＣＳＴＤ２、ＮＣＡＭ）を共発現するいずれの細胞も検出されなかった。
本発明者らは、胆管細胞オルガノイドを特徴付けるためのフレームワークとして使用するヒト胆管系の単一細胞マップを作成した。この目的のために、各領域（ＩＨＤ、ＣＤＢ、ＧＢ）からｓｃＲＮＡｓｅｑ用に分離した初代胆管細胞の画分を、本発明者らの確立した条件を使用してオルガノイドとして増殖させた（３、１６）。得られたオルガノイドは、胆管細胞マーカー（ＫＲＴ７、ＫＲＴ１９、ＳＯＸ９、ＨＮＦ１Ｂ、ＣＦＴＲ）を発現し、それらの起源の領域に関係なく、同等の機能性（ＡＬＰ、ＧＧＴ活性）及び同様の増殖能力を示した。これらの類似性を更に調査するために、これらのオルガノイドに対してｓｃＲＮＡｓｅｑを実施した（領域当たり２系統、ＧＢ：５８５９細胞、ＣＢＤ ５３２１細胞、ＩＨＤ ６６４１細胞）。ＵＭＡＰ及びＰＣＡの分析では、オルガノイドが重複するトランスクリプトームプロファイルを示すことが示され（図１Ａ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長した胆管細胞は、それらの起源の領域とは無関係に同様の転写シグネチャを持つことを示している。注目すべきことに、細胞周期関連遺伝子の回帰は、共通の「増殖」シグネチャが異なる空間起源のオルガノイド間の差異を覆い隠す可能性があることを除いて、これらの観察結果を変えなかった。さらに、オルガノイドの類似性が共通の前駆細胞／幹細胞の同一性を反映している可能性を除いて、既知の体性幹細胞マーカー（ＬＧＲ５、ＰＲＯＭ１、ＴＡＣＳＴＤ２、ＮＣＡＭ）を共発現するいずれの細胞も検出されなかった。
【0227】
次に、種々の領域のオルガノイドを初代胆管細胞と比較して、これらの類似性がｉｎ ｖｉｔｒｏでのそれらの本来の領域同一性の喪失に対応するかどうかを調査した（図１Ａ）。細胞周期回帰後のオルガノイド及び初代細胞は、それらの共通の胆管細胞の性質を反映するコア転写プロファイルを共有しており、これは、星細胞及びＬＳＥＣ等の異なる肝臓細胞型と比較したときの、それらのＵＭＡＰ空間での近接性及び高いＰＡＧＡ接続性によって示された。しかしながら、ＤＥＧ分析では、ＳＬＣ１３Ａ１及びＳＬＣ２６Ａ３等の領域特異的マーカーのダウンレギュレートが強調され（図２Ｂ）、一方、遺伝子オントロジー（ＧＯ）及び遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）は、胆管細胞のそれらのそれぞれの微小環境への適応を促進する因子として、これらのＤＥＧを特定した（例えば胆汁酸対培養培地処理遺伝子）。さらに、以前の報告と一致する、オルガノイドにおけるＹＡＰ標的遺伝子のアップレギュレートを確認した（１４）。したがって、オルガノイドとして増殖した初代胆管細胞は、それらの起源の領域に特異的なマーカーの発現を喪失しながらも、それらのコア転写シグネチャを維持することによって新しい微小環境に適応する。
【0228】
胆管細胞の同一性を制御するメカニズムを調査するために、胆管細胞の微小環境の主要な決定因子として、培養条件に胆汁を追加することにした。
【0229】
種々のオルガノイド（ＩＨＤ、ＣＢＤ、ＧＢ）をヒト胆嚢胆汁で７２時間処理し、次に、ｓｃＲＮＡｓｅｑを使用して特徴を明らかにした（図１Ａ）（ＧＢ：３８１５細胞、ＣＢＤ ３２２４細胞、ＩＨＤ ３６５３細胞）。ＵＭＡＰ及びＰＣＡは、処理されたオルガノイドが新しい重複する遺伝子発現プロファイルを持つことを明らかにし（図２Ａ）、胆汁への曝露に適応する共有能力を確認した。重要なことに、ＰＡＧＡ及びＤＥＧの分析では、この転写プロファイルが胆嚢の同一性に向けてシフトしていることが示された（図１Ｂ）。この遷移を制御する因子を特徴付けるために、胆汁処理オルガノイドにおいて差次的発現遺伝子を調べた。ＧＯ、ＧＳＥＡ及びＵＭＡＰの分析により、領域特異的マーカー（ＳＯＸ１７、ＭＵＣ１３、ＦＧＦ１９；図２Ｂ）の誘導が確認され、胆汁酸受容体経路及び下流標的（ＮＲ１Ｈ４／ＦＸＲ、ＮＲ１Ｉ２、ＮＲ０Ｂ２、ＳＬＣ５１Ａ、ＦＧＦ１９、ＡＢＣＡ１、ＰＰＡＲＧ；図１Ｂ）のアップレギュレートが明らかになった。注目すべきことに、これらの結果は、それぞれケノデオキシコール酸及びｚ－２２ググルステロンを使用して、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）の活性化及び阻害によって検証され（図１Ｃ及び図１Ｄ）、それによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長した胆管細胞がそれらの起源に関係なく、環境刺激に応答及び適応できることが確認された。まとめると、これらの結果は、胆管細胞オルガノイドが適切なニッチ因子によって指示された場合に、異なる領域の同一性を持つことができることを示唆している。
【0230】
胆管細胞の柔軟性を検証し、その機能的影響を調査するために、胆管系の或る領域のオルガノイドが移植後に異なる領域を修復できるかどうかを評価することにした。このため、本発明者らは、４，４’－メチレンジアニリン（ＭＤＡ）を使用して免疫不全マウスに胆管症を誘発させ（１７）（図２Ａ及び図２Ｂ）、ＦＸＲアゴニストなしで生成された、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現するヒト胆嚢オルガノイドの管内送達（１８）による表現型のレスキューを試みた。細胞を含まない担体培地を投与された対照動物は、体重が減少し、３週間以内に死亡し（図２Ｂ）、ＩＦ、組織学及び磁気共鳴胆管膵管造影（ＭＲＣＰ）（図２Ｃ）によって示される胆汁鬱滞及び胆管症を発症していた。これに対して、オルガノイドを投与された動物は、実験の終了時に選択的に屠殺されており、胆管症が解消し、血清生化学が正常な状態で最長で３ヶ月間生存した（図２Ｂ及び図２Ｃ）。移植された胆嚢胆管細胞は、再生胆管上皮の約２５％～５５％に相当する様々なサイズの肝内管に生着した（図２Ｄ）。
【0231】
コア胆管マーカー（ＫＲＴ７、ＫＲＴ１９、ＣＦＴＲ）もまた発現していたが、本発明者らは、以前の報告（１３）に従い生着細胞及び天然細胞の両方でＹＡＰ活性化を観察した。注目すべきことに、アルブミン等の他の肝系譜マーカーの発現は観察されず、胆管細胞オルガノイドの柔軟性は胆管系譜に限定される可能性が高いことを示している。さらに、生着した細胞は、天然マウス胆管細胞と同様のレベルで増殖マーカーを発現し、一方、実験の終了時にＴ１計量身体ＭＲイメージングを含む、実施された全ての分析（図２Ｃ及び図２Ｄ）において異常な成長又は腫瘍形成は認められなかった。したがって、オルガノイド移植は、損傷した上皮の修復及び急性損傷のレスキューに必要な健常な細胞を提供する。
【0232】
最後に、本発明者らの結果が肝内区画又は胆嚢オルガノイドに特異的でないことを確認するために、本発明者らの確立した方法論（３）を使用して、ＦＸＲアゴニストなしで誘導された総胆管由来の胆管細胞オルガノイドを免疫不全マウスの胆嚢に移植した。生着した細胞は総胆管マーカーの喪失及び胆嚢マーカーのアップレギュレートを示し、本発明者らの先の所見が、胆管系の異なる区画及び異なる起源のオルガノイドに適用されることを確認した。総合すると、これらの結果は、胆管系の異なる領域の胆管細胞が相互転換可能であることを立証し、肝外細胞が急性肝内管損傷の修復に使用できることを示唆している。
【0233】
マウスモデルにおける細胞移植実験は非常に有用であるが、必ずしも治療結果が予測されるものとは限らない（１９）。さらに、マウス肝臓の微小環境はヒトとは異なるため、本発明者らの結果が種間で変換されない可能性が高まる。これらの課題に対処するために、ｅｘ ｖｉｖｏ臓器灌流を利用したヒトにおける細胞ベースの治療のための新しいモデルを開発した（２０）。ｅｘ－ｖｉｖｏ正常温度灌流（ＮＭＰ）は、移植前に温酸素化血液を肝移植片に循環させることにより、臓器保存を改善し、虚血再灌流傷害を軽減するために開発された。重要なことに、胆管系は特に虚血の影響を受けやすく、その結果、管が損傷する（２１、２２）。ＮＭＰ中の低い胆汁ｐＨ（１２未満７．５）は、このタイプの胆管症の予測因子として使用される（２３）。
【0234】
ヒト胆管を修復する細胞の治療可能性を評価するために、虚血性管損傷を意味する、実験の開始時に胆汁のｐＨが７．５未満である死亡した移植ドナー肝臓（ｎ＝３）の肝内管にＦＸＲアゴニストなしで誘導されたＲＦＰ胆嚢オルガノイドを注入した。臓器は、生理的に近い微小環境を維持するために、最長で１００時間、正常体温にて酸素化血液及び栄養素で灌流した（２０）（図３Ａ～図４３Ｂ）。重要なことに、オルガノイドは、細胞の分布領域を最小限に抑え、細胞密度を最大化するために、蛍光透視誘導下で肝内管の末端枝に送達された。実験の終了時に、超音波イメージングは管の拡張又は閉塞の痕跡を示さず、一方、フローサイトメトリーでは灌流液中にＲＦＰ発現細胞は検出されず、注入された細胞が胆管区画に残っていることが確認された（図３Ｃ）。より重要なことに、移植されたオルガノイドは肝内胆管系に生着し（図３Ｄ）、注入された管の約４０％～８５％がＲＦＰ細胞で再生されており、重要な胆管マーカー（ＫＲＴ７、ＫＲＴ１９、ＣＦＴＲ、ＧＧＴ）を発現している。したがって、実験の終了時に、注入された管は、天然胆管細胞と移植胆管細胞との混合物で構成され、ドナー細胞とレシピエント細胞との間に複数の転移点があり、胆管症の痕跡はなかった（図３Ｄ）。
【0235】
逆に、細胞を投与されていない対照管は、管内腔における上皮の連続性の喪失及び細胞の脱落を伴う虚血性損傷の痕跡を示す（図３Ｄ）。本発明者らは、続いて、臓器機能に対する生着の影響を特徴付けた。生理学的には、胆管細胞は、水の移動及び重炭酸塩の分泌により胆汁の組成及びｐＨを変更する（６）。したがって、オルガノイド注入管と担体注入管の胆汁を比較した。したがって、細胞を注入した管から吸引された胆汁は、より高いｐＨ及び体積を示し（図３Ｅ）、移植された胆管細胞が胆汁組成を変更する機能を保持していることが確認された。まとめると、これらの結果は、灌流した臓器がヒト細胞の機能的生着を確認するために使用できるという最初の原理証明を提供し、胆管細胞がヒト臓器の移植に相互転換可能であることを示すことによって本発明者らのマウスのデータを検証する。
【0236】
本発明者らの結果は、胆管上皮が、局所環境によって決定される多様な転写プロファイルを持つ胆管細胞で構成されていることを示す。この多様性は、オルガノイド培養ではニッチ刺激が不足しているため失われている。しかしながら、オルガノイドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び移植後の両方で局所環境のキューに適切に適応し、領域特異的マーカーの発現を回復させ、異なる領域の同一性を持つことができる。したがって、単一領域のオルガノイドは、胆管系の全体を修復する可能性がある。この柔軟性は、再生医療に大きな影響を与える可能性がある。実際、自系細胞ベースの治療は免疫抑制の必要性を潜在的に回避するが、初代オルガノイドへの適用は、疾患が上皮に及ぼす影響によって制限される。しかしながら、胆管症は局在性疾患の一群に属し、主に臓器の特定の領域に影響を及ぼす（２４）。
【0237】
したがって、本発明者らの結果は、胆管症における最も一般的な損傷部位を構成するヒト肝内胆管を修復するための自系細胞ベースの治療に、胆嚢等の予備領域の胆管細胞を使用できるという概念実証を提供する。さらに、ヒトの灌流臓器における細胞生着のための本発明者らの新しいモデルは、移植前の移植片機能を改善するためのｅｘ ｖｉｖｏでの細胞ベースの治療の使用への道を開き、最終的には使用可能な臓器の数を増やし、移植待機リストへの圧力を低減する可能性がある。これに関連して、品質管理され、細胞バンクから容易に入手可能な同種異系胆管細胞オルガノイドは、臓器レシピエントが標準的なケアの一貫として免疫抑制を受けるため、胆管損傷のリスク（例えば低胆汁ｐＨ）に曝されている臓器における虚血性胆管症を防ぐために、今後日常的に使用される可能性がある。重要なことに、本発明者らの結果は、規制当局の承認及びファスト・タックファースト・イン・マン試験を促進する可能性のある、ヒト臓器におけるオルガノイドの移植の原理証明を提供する。最終的には、機能的な細胞生着を検証し、安全性を実証し、細胞移植技術及び有効性を改善し、新しい細胞ベースの治療法の臨床変換を加速するために、同じアプローチを様々なｅｘ ｖｉｖｏ灌流臓器及び細胞型に適用することもできる。
【0238】
参考文献
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【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【国際調査報告】