特表 2024-506435 化合物、組成物、および骨折を処置するための使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-14

(54)【発明の名称】化合物、組成物、および骨折を処置するための使用方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/22 20060101AFI20240206BHJP

   A61K 38/29 20060101ALI20240206BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20240206BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20240206BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20240206BHJP

   A61P 19/10 20060101ALI20240206BHJP

   A61P 5/18 20060101ALI20240206BHJP

   C07K 14/635 20060101ALN20240206BHJP

【ＦＩ】

A61K38/22

A61K38/29

A61K47/54

A61K47/64

A61P19/08

A61P19/10

A61P5/18

C07K14/635 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023525002

(86)(22)【出願日】2021-08-26

(85)【翻訳文提出日】2023-06-26

(86)【国際出願番号】 US2021047824

(87)【国際公開番号】W WO2022093373

(87)【国際公開日】2022-05-05

(31)【優先権主張番号】63/105,669

(32)【優先日】2020-10-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/193,748

(32)【優先日】2021-05-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523008417

【氏名又は名称】パーデュー リサーチ ファウンデーション

【氏名又は名称原語表記】Ｐｕｒｄｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ロウ，フィリップ，エス．

(72)【発明者】

【氏名】ロウ，スチュワート

(72)【発明者】

【氏名】ニールセン，ジェフリー

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC50

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA19

4C084BA23

4C084BA42

4C084CA53

4C084DB32

4C084MA66

4C084NA13

4C084ZA961

4C084ZA962

4C084ZA971

4C084ZA972

4C084ZC061

4C084ZC062

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA17

4H045BA18

4H045BA20

4H045BA41

4H045BA50

4H045CA40

4H045DA30

4H045EA30

4H045FA33

4H045GA45

(57)【要約】

【解決手段】
骨指向性リガンド骨同化剤化合物および関連する組成物、ならびに骨折を処置するための使用方法。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（１）

【化1】

の構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｘは、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはその誘導体もしくはフラグメント、ＰＴＨ関連のタンパク質（ＰＴＨｒＰ）またはその誘導体もしくはフラグメント、およびアバロパラチドまたはその誘導体もしくはフラグメントからなる群から選択される骨同化剤であり、
Ｙは、不在、放出型リンカー、または非放出型リンカーであり、
Ｚは骨指向性リガンドである、
化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項2】

Ｘが、配列番号３を含むアバロパラチドまたはその誘導体もしくはフラグメントであり、ｘがメチルアラニンであり、「ｅ」がＤキラリティを示す、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項3】

Ｚの前記骨指向性リガンドが、少なくとも１１のアミノ酸残基を含む酸性オリゴペプチド（ＡＯＰ）である、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項4】

前記ＡＯＰが１１～１００のアミノ酸残基を含む、請求項３に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項5】

Ｘが、骨同化活性を有するＰＴＨまたはその誘導体もしくはフラグメント、骨同化活性を有するＰＴＨｒＰまたはその誘導体もしくはフラグメント、および骨同化活性を有するアバロパラチドまたはその誘導体もしくはフラグメントからなる群から選択される骨同化剤である、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項6】

前記骨同化剤が、骨同化活性を有するアバロパラチドまたはその誘導体もしくはフラグメントである、請求項１～５のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項7】

Ｚがテトラサイクリン、ラネレート、カルシウムキレート剤、金属キレート剤、ビスホスホネート、またはＡＯＰである、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項8】

Ｚが、モノビスホスホネート、トリビスホスホネート、およびポリビスホスホネートからなる群から選択されるビスホスホネートである、請求項１、２、５、または７のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項9】

Ｚがアミノ酸残基の直鎖である、請求項１～５のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項10】

Ｚがアミノ酸残基の分岐鎖である、請求項１～５のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項11】

Ｚが、少なくとも４つのグルタミン酸アミノ酸残基または少なくとも４つのアスパラギン酸アミノ酸残基を含むＡＯＰである、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項12】

Ｚが、同じキラリティを有する少なくとも４つのアミノ酸残基を含む、請求項１、２、５、および１１のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項13】

Ｚが少なくとも４つのアミノ酸残基を含み、かかるアミノ酸残基のうち少なくとも４つはＤキラリティを有する、請求項１、２、５、および１１のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項14】

Ｚが、少なくとも４つのグルタミン酸アミノ酸残基、少なくとも４つのアスパラギン酸アミノ酸残基、または少なくとも４つのグルタミン酸アミノ酸残基と少なくとも４つのアスパラギン酸アミノ酸残基を含む、請求項１、２、５、および１１のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項15】

Ｚが、４～２０のＤグルタミン酸アミノ酸残基、４～２０のＤアスパラギン酸アミノ酸残基、または４～２０のＤグルタミン酸アミノ酸残基と４～２０のＤアスパラギン酸アミノ酸残基を含む、請求項１、２、５、および１１のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項16】

Ｚがグルタミン酸アミノ酸残基とアスパラギン酸アミノ酸残基との混合物を含む、請求項１～５および１１のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項17】

Ｚが、少なくとも１５の反復Ｄグルタミン酸アミノ酸残基（ＤＥ１５）、または少なくとも２０の反復Ｄグルタミン酸アミノ酸残基（ＤＥ２０）を含む、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項18】

ＺがＤＥ１０またはＤＥ２０である、請求項１、２、５、および１１のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項19】

Ｚが４～７５の酸性アミノ酸残基を含む、請求項１、２、５、および１１のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項20】

Ｚが４～７５のＤグルタミン酸アミノ酸残基を含む、請求項１、２、５、および１１のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項21】

Ｚが８～３０の酸性アミノ酸残基を含む、請求項１、２、５、および１１のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項22】

Ｚが８～３０のＤグルタミン酸アミノ酸残基を含む、請求項１、２、５、および１１のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項23】

Ｘが、骨同化活性を有するアバロパラチドまたはその誘導体もしくはフラグメントであり、ＺがＤＥ２０である、請求項１、３～５、１１、および１７のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項24】

Ｙが非放出型リンカーである、請求項１～５、１１、および１７のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項25】

Ｙが、少なくとも１つの炭素炭素結合および／または少なくとも１つのアミド結合を含む非放出型リンカーである、請求項１～５、１１、および１７のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項26】

Ｙが放出型リンカーである、請求項１～５、１１、および１７のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項27】

Ｙが、少なくとも１つのジスルフィド結合、少なくとも１つのエステル、および／または少なくとも１つのアミド結合を含む放出型リンカーである、請求項１～５、１１、および１７のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項28】

Ｘが、骨同化活性を有するアバロパラチドまたはその誘導体もしくはフラグメントであり、Ｙが非放出型オリゴペプチドリンカーであり、ＺがＤＥ２０である、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項29】

Ｘが、骨同化活性を有するアバロパラチドまたはその誘導体もしくはフラグメントであり、Ｙが、少なくとも１つのプロテアーゼ特異的アミド結合を含む放出型オリゴペプチドリンカーであり、ＺがＤＥ２０である、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項30】

前記化合物が、配列番号３に対し少なくとも７５％以上の配列同一性、少なくとも８５％以上の配列同一性、少なくとも９０％以上の配列同一性、または少なくとも９５％以上の配列同一性を有する、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項31】

前記化合物が、配列番号１４に対し少なくとも７５％以上の配列同一性、少なくとも８５％以上の配列同一性、少なくとも９０％以上の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項32】

前記化合物が、配列番号４に対し少なくとも７５％以上の配列同一性、少なくとも８５％以上の配列同一性、少なくとも９０％以上の配列同一性、または少なくとも９５％以上の配列同一性有する、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項33】

請求項１～３２のいずれか１つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物。

【請求項34】

薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、請求項３３に記載の医薬組成物。

【請求項35】

骨折の処置を必要とする患者の骨折を処置する方法であって、該方法は、請求項１～３２のいずれか１つに記載の化合物、または請求項３３もしくは３４に記載の医薬組成物を治療有効量で前記患者に投与する工程であって、それにより前記患者の骨折を処置する、工程を含む方法。

【請求項36】

前記患者が、骨折を起こしやすい、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記患者が、糖尿病、骨粗しょう症、顎顔面の損傷、顎顔面の欠損、および顎顔面の欠乏からなる群から選択される１つ以上の併発症を患う、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記顎顔面の損傷が顎顔面骨折である、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

請求項１～３８のいずれか１つに記載の化合物または医薬組成物を治療有効量で投与することが、注射、非経口的投与、または腸内投与によるものである、請求項３５～３７のいずれか１つに記載の方法。

【請求項40】

前記注射が皮下である、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

骨折または１つ以上の併発症を処置するために、第２の治療を前記患者に施す工程をさらに含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項42】

前記患者が少なくとも糖尿病を患っており、前記第２の治療を施すことが、インスリンを治療有効量で前記患者に投与することを含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記第２の治療を施すことが、骨折部位へのハードウェアまたは１つ以上の治療化合物の植込みを含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項44】

治療有効量の前記化合物または医薬組成物が、前記患者の体重１ｋｇにつき０．１ｍｇ、１ｋｇにつき１ｍｇ、またはそれらの間の化合物濃度を含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項45】

前記患者に治療有効量の前記化合物または医薬組成物を投与することが、処置の過程の間に１～８００回繰り返される、請求項３５に記載の方法。

【請求項46】

投与することが、治療有効量の前記化合物または医薬組成物の投与後３週間以内に前記患者の疼痛の軽減をもたらす、請求項３５に記載の方法。

【請求項47】

骨成長の促進を必要とする患者の骨成長を促進させる方法であって、該方法は、請求項１～３２のいずれか１つに記載の化合物、または請求項３３もしくは３４に記載の医薬組成物を治療有効量で前記患者に投与する工程でであって、それにより前記患者の骨ミネラル密度を処置前よりも増加させる、工程を含む方法。

【請求項48】

前記患者が骨粗しょう症を患っている、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記骨の骨ミネラル密度の増加が骨折部位で生じる、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記骨の骨ミネラル密度の増加が、前記投与する工程の前に骨に存在する１つ以上の吸収窩にて生じる、請求項４８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
優先権
本特許出願は、（ａ）２０２０年１０月２６日に出願された米国仮特許出願第６３／１０５，６６９号、および（ｂ）２０２１年５月２７日に出願された米国の仮特許出願第６３／１９３，７４８号に関連し、これらの優先権の利益を主張する。前述の優先出願の内容は、その全文が参照により本明細書に援用される。

【0002】

政府支援の声明
本発明は、国立衛生研究所によって与えられたＤＥ０２８７１３の下、政府支援で行われた。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。

【0003】

本開示は、骨指向性リガンド（ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ ｌｉｇａｎｄｓ）、骨同化剤（ｂｏｎｅ ａｎａｂｏｌｉｃ ａｇｅｎｔｓ）、両方を含むコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、同じものを含む組成物、および骨折を処置するための使用方法に関連する。

【0004】

配列表の簡単な説明
本明細書に記載された配列表は、図の中で明記され、さらに、本明細書に提出されたコンピュータで読み取り可能な形式で提供され、および参照により本明細書に援用される。コンピュータで読取り可能な形式に記録された情報は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§ １．８２１（ｆ）に準拠して本明細書に提供される配列表と同一である。

【技術背景】

【0005】

毎年、１，８３０万件を超える骨折が、アメリカ合衆国で発生している。骨折によっては、身体活動の障害、生産性の損失、および生活の質の低下を引き起こし得る一方、癒合しない骨折（ｎｏｎｕｎｉｏｎ ｆｒａｃｔｕｒｅｓ）は、回復までの時間を非常に長引かせることによって、これらの病的状態を増大させる場合がある。頭蓋顔面骨折は、食事と会話を困難にすることを伴うために、特に衰弱につながる場合がある。高齢者の股関節骨折の治癒が遅れると、多くの場合で、早死につながる恐れがある。まとめると、骨折の治療費、療養費、および理学療法にかかる経済的な影響は、４５８億ドルと推定され、これらの費用は、我々の人口の高齢化が進むにつれて増加すると予想される。

【0006】

本明細書におけるいくつかの実施形態では提供されるのは、骨折の治癒を（例えば、コンジュゲート）の併用によって）処置または改善するための組成物および方法（例えば、骨指向性リガンドおよび骨同化剤である。これと他の目的および利点は、進歩的特徴と同様に、本明細書で提供される記載から明白になるであろう。

【発明の概要】

【0007】

本明細書におけるいくつかの実施形態では、（例えば、処置を必要とする）個体の骨治癒に関する事象（例えば、骨折）を処置する方法が提供され、この方法は、本明細書に提供される（例えば、治療有効量の）化合物またはその薬学的に許容される塩、例えば、骨標的剤（例えば、骨指向性リガンド）および／または同化剤（例えば、骨同化剤）を含む化合物またはその薬学的に許容される塩など投与することを含む。

【0008】

本明細書におけるいくつかの実施形態では、式（Ｉ）、

【0009】

【数1】

の構造を有する化合物が提供される。

【0010】

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の構造を有する化合物は、その薬学的に許容される塩である。いくつかの実施形態では、Ｘは骨同化剤である。いくつかの実施形態では、Ｘは、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）（または、例えばその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する））、ＰＴＨ関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）（あるいは、例えばその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する））、およびアバロパラチド（例えば、骨同化活性を有する））、ＰＴＨ関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）（または、例えばその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する））からなる群から選択される骨同化剤である。いくつかの実施形態では、Ｙは存在しないか、またはリンカー（例えば、放出型リンカーまたは非放出型リンカー）である。いくつかの実施形態では、Ｙは放出型リンカー、または非放出型リンカーである。いくつかの実施形態では、Ｚは骨指向性リガンド（例えば、酸性オリゴペプチド（ＡＯＰ）（例えば、少なくとも４つのアミノ酸残基（例えば４～２０のアミノ酸残基）を含む））である。

【0011】

いくつかの実施形態では、Ｘは、ＰＴＨ（または、例えばその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する））、ＰＴＨｒＰ（または、例えばその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する））、およびアバロパラチド（または、例えばその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する））からなる群から選択される骨同化剤である。

【0012】

いくつかの実施形態では、骨同化剤は、ＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰ、または、それらの誘導体もしくはフラグメントである（（例えば（配列番号１および／または骨同化活性を有する））。いくつかの実施形態では、骨同化剤は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）（または、例えばその誘導体もしくはフラグメント）である。いくつかの実施形態では、骨同化剤は、ＰＴＨｒＰまたは誘導体もしくはフラグメントである。いくつかの実施形態では、骨同化剤は修正ＰＴＨ、または誘導体もしくはフラグメントである。例えば、修正ＰＴＨまたは誘導体もしくはフラグメントは、合成的に修正される。いくつかの実施形態では、骨同化剤は修正ＰＴＨｒＰ、または、例えば配列番号１などの誘導体もしくはフラグメントである。ある実施形態では、修正ＰＴＨｒＰまたは誘導体もしくはフラグメントは、合成的に修正される。いくつかの実施形態では、骨同化剤は、アバロパラチド（または、例えばその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する））である。いくつかの実施形態では、骨同化剤は、アバロパラチド（配列番号２）である。いくつかの実施形態では、骨同化剤は（例えば合成的）修正アバロパラチドである。

【0013】

いくつかの実施形態では、ＸはＰＴＨ、またはその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する）である。

【0014】

いくつかの実施形態では、ＸはＰＴＨｒＰ、またはその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する）である。

【0015】

いくつかの実施形態では、Ｘはアバロパラチド、またはその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する）である。

【0016】

いくつかの実施形態では、Ｘはダサチニブである。

【0017】

いくつかの実施形態では、Ｘはプロインスリン様成長因子ＩＩ（ｐｒｏ－ＩＧＦ－ＩＩ）である。

【0018】

いくつかの実施形態では、Ｘは、環状ペプチド（例えば、任意に（１０１）で代用、または任意に（１０２）で代用される）である。いくつかの実施形態では、Ｘは任意に（１０１）で代用される。いくつかの実施形態では、Ｘは任意に（１０２）で代用される。いくつかの実施形態では、Ｘは（１０１）である。いくつかの実施形態では、Ｘは（１０２）である。

【0019】

いくつかの実施形態では、Ｘはインテグリンα５β１活性を調節する。いくつかの実施形態では、Ｘはインテグリンα５β１のリガンドである。いくつかの実施形態では、（１０１）および（１０２）は、インテグリンα５β１活性を調節する。

【0020】

いくつかの実施形態では、Ｚは、テトラサイクリン、ホスホン酸塩（例えば、モノビスホスホネート、トリビスホスホネート、またはポリビスホスホネート）、あるいはＡＯＰである。いくつかの実施形態では、Ｚはテトラサイクリンである。いくつかの実施形態では、Ｚはモノビスホスフホネート、トリビスホスホネートあるいはポリビスホスホネートである。いくつかの実施形態では、Ｚはモノビスホスフホネートである。いくつかの実施形態では、Ｚはトリビスホスホネートである。いくつかの実施形態では、Ｚはポリビスホスホネートである。

【0021】

いくつかの実施形態では、Ｚはアミノ酸残基の直鎖である。いくつかの実施形態では、Ｚはアミノ酸残基の分岐鎖である。いくつかの実施形態では、Ｚは、ＡＯＰ（例えば、少なくとも４のグルタミン酸アミノ酸残基、または４のアスパラギン酸アミノ酸残基を含む）である。

【0022】

いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４のアミノ酸残基（例えば４以上、１０以上、２０以上、３０以上、５０以上、７５以上、または１００以上）を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは４～７５の酸性アミノ酸残基（例えば、Ｄ－グルタミン酸アミノ酸残基）を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは高々１００のアミノ酸残基（例えば１００以下、７５以下、５０以下、３０以下、２０以下、１０以下、または４以下）を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４、および高々３５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４、および高々２０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも６、および高々３０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも８、および高々３０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも８、および高々２０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｚはグルタミン酸アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、ＺはＤ－グルタミン酸アミノ酸残基を含む。

【0023】

いくつかの実施形態では、Ｚは４～７５のＤ－グルタミン酸アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは８～３０のＤ－グルタミン酸アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは８～２０のＤ－グルタミン酸アミノ酸残基を含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、ＡＯＰは、約４～約２０のアミノ酸残基（４～約２０、または約４～２０など）、あるいは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０などのより多くのアミノ酸残基を含む。様々な実施形態では、ＡＯＰは、２０のアミノ酸残基などの約２０のアミノ酸残基を含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４つの（例えば、Ｄ－）グルタミン酸アミノ酸残基（例えば、４～２０のＤ－グルタミン酸アミノ酸残基）、および／または少なくとも４つの（例えば、Ｄ－）アスパラギン酸アミノ酸残基（例えば、４～２０のＤ－アスパラギン酸アミノ酸残基）を含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、アミノ酸は、アスパラギン酸（文字Ｄによって表される）、グルタミン酸（文字Ｅによって表される）、またはその混合物である。アミノ酸残基は、Ｄキラリティ、Ｌキラリティ、またはその混合物を有し得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基は、Ｄキラリティを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基はＬキラリティを有する。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４つの（例えば、酸性）アミノ酸残基（例えば、同じキラリティ（例えばＤ－またはＬ－アミノ酸残基）がある）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも４つの（例えば、酸性）アミノ酸残基の各々は、Ｄキラリティを有する。いくつかの実施形態では、アスパラギン酸はＤアスパラギン酸またはＬ－アスパラギン酸である。いくつかの実施形態では、グルタミン酸は、Ｄ－グルタミン酸またはＬ－グルタミン酸である。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４および高々２０のＤ－グルタミン酸残基またはＬ－グルタミン酸残基を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４および高々２０のＤ－アスパラギン酸残基またはＬ－アスパラギン酸残基を含む。

【0027】

いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４の（例えば、Ｄ－）グルタミン酸アミノ酸残基（例えば、４～２０のＤ－グルタミン酸アミノ酸残基）、および／または少なくとも４つの（例えば、Ｄ－）アスパラギン酸アミノ酸残基（例えば、４～２０のＤ－アスパラギン酸アミノ酸残基）を含む。

【0028】

いくつかの実施形態では、Ｚは、（例えばＤ－）グルタミン酸アミノ酸残基と（例えばＤ－）アスパラギン酸アミノ酸残基との混合物を含む。

【0029】

いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４の反復（ｒｅｐｅａｔｉｎｇ）Ｄ－グルタミン酸アミノ酸残基（例えば、４の反復Ｄ－グルタミン酸アミノ酸残基（ＤＥ４）もしくはそれ以上、６の反復Ｄ－グルタミン酸アミノ酸残基（ＤＥ６）もしくはそれ以上、８の反復Ｄ－グルタミン酸アミノ酸残基（ＤＥ８）もしくはそれ以上、１０の反復Ｄ－グルタミン酸アミノ酸残基（ＤＥ１０）もしくはそれ以上、１５の反復Ｄ－グルタミン酸アミノ酸残基（ＤＥ１５）もしくはそれ以上、２０の反復Ｄ－グルタミン酸アミノ酸残基（ＤＥ２０）もしくはそれ以上、２５の反復Ｄ－グルタミン酸アミノ酸残基（ＤＥ２５）もしくはそれ以上、３０の反復Ｄ－グルタミン酸アミノ酸残基（ＤＥ３０）もしくはそれ以上、または３５の反復Ｄ－グルタミン酸アミノ酸残基（ＤＥ３５）もしくはそれ以上）を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくともＤＥ１０もしくはそれ以上、ＤＥ１５もしくはそれ以上、またはＤＥ２０もしくはそれ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＺはＤＥ１０、またはＤＥ２０である。

【0030】

少なくともいくつかの実施形態では、Ｚは少なくともＤＥ１５または少なくともＤＥ２０を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、Ｘはアバロパラチド、またはその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する）である。

【0032】

いくつかの実施形態では、Ｙは非放出型リンカーである。いくつかの実施形態では、Ｙは少なくとも１つの炭素－炭素結合を含有している非放出型リンカーである。いくつかの実施形態では、Ｙは少なくとも１つのアミド結合を含有している非放出型リンカーである。いくつかの実施形態では、Ｙは少なくとも１つの炭素－炭素結合、および１つのアミド結合を含有している非放出型リンカーである。

【0033】

いくつかの実施形態では、Ｙは非放出型リンカーであり、１以上のアミド結合を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは非放出型リンカーであり、１～２０のアミド結合を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは非放出型リンカーであり、１～１０のアミド結合を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは非放出型リンカーであり、１０～２０のアミド結合を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは非放出型リンカーであり、１～５のアミド結合を含む。

【0034】

いくつかの実施形態では、Ｙは非放出型リンカーであり、１以上のアミノ酸リンカー基を含む。いくつかの実施形態では、Ｙはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは１～２０のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは１～１０のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは１０～２０のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは１～５のアミノ酸残基を含む。

【0035】

いくつかの実施形態では、Ｙは非放出型リンカーであり、１以上のエーテル結合（Ｃ－Ｏ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは非放出型リンカーであり、１～２０のエーテル結合（Ｃ－Ｏ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは非放出型リンカーであり、１～１０のエーテル結合（Ｃ－Ｏ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは非放出型リンカーであり、１０～２０のエーテル結合（Ｃ－Ｏ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは非放出型リンカーであり、１～５のエーテル結合（Ｃ－Ｏ）を含む。

【0036】

いくつかの実施形態では、Ｙは非放出型リンカーであり、１以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー基を含む。いくつかの実施形態では、ＹはＰＥＧである。

【0037】

いくつかの実施形態では、Ｙは非放出型リンカーであり、１以上のチオエーテル結合（Ｃ－Ｓ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは非放出型リンカーであり、１０～２０のチオエーテル結合（Ｃ－Ｓ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは非放出型リンカーであり、１～１０のチオエーテル結合（Ｃ－Ｓ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは非放出型リンカーであり、１０～２０のチオエーテル結合（Ｃ－Ｓ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは非放出型リンカーであり、１～５のチオエーテル結合（Ｃ－Ｓ）を含む。

【0038】

いくつかの実施形態では、Ｙは放出型リンカーである。いくつかの実施形態では、Ｙは少なくとも１つのジスルフィド（Ｓ－Ｓ）を含有している放出型リンカーである。いくつかの実施形態では、Ｙは少なくとも１つのエステル（例えば、Ｏ（Ｃ＝Ｏ））を含有している放出型リンカーである。いくつかの実施形態では、Ｙは少なくとも１つの（例えば、プロテアーゼに特有の）アミド結合を含有している放出型リンカーである。

【0039】

いくつかの実施形態では、Ｙは放出型リンカーであり、１以上のアミド結合を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは放出型リンカーであり、１～２０のアミド結合を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは放出型リンカーであり、１～１０のアミド結合を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは放出型リンカーであり、１０～２０のアミド結合を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは放出型リンカーであり、１～５のアミド結合を含む。

【0040】

いくつかの実施形態では、Ｙは放出型リンカーであり、１以上のアミノ酸リンカー基を含む。いくつかの実施形態では、Ｙはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは１～２０のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは１～１０のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは１０～２０のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは１～５のアミノ酸残基を含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、Ｙは放出型リンカーであり、１以上のエーテル結合（Ｃ－Ｏ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは放出型リンカーであり、１～２０のエーテル結合（Ｃ－Ｏ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは放出型リンカーであり、１～１０のエーテル結合（Ｃ－Ｏ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは放出型リンカーであり、１０～２０のエーテル結合（Ｃ－Ｏ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは放出型リンカーであり、１～５のエーテル結合（Ｃ－Ｏ）を含む。

【0042】

いくつかの実施形態では、Ｙは放出型リンカーであり、１以上のＰＥＧリンカー基を含む。

【0043】

いくつかの実施形態では、Ｘはアバロパラチド（あるいは、例えばその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する））であり、Ｙは、少なくとも１つのプロテアーゼに特有のアミド結合を含む放出型オリゴペプチドリンカーであり、および、Ｚは２０の反復ＤＥ２０である。

【0044】

いくつかの実施形態では、Ｘはアバロパラチド（あるいは、例えばその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する））であり、Ｙは、非放出型オリゴペプチドリンカーであり、および、ＺはＤＥ１０である。いくつかの実施形態では、化合物は配列番号３である。いくつかの実施形態では、化合物は配列番号１４である。

【0045】

いくつかの実施形態では、Ｘはアバロパラチド、またはその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する）であり、Ｙは非放出型オリゴペプチドリンカーであり、およびＺはＤＥ２０である。いくつかの実施形態では、化合物は配列番号４である。

【0046】

いくつかの実施形態では、Ｘはアバロパラチド、またはその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する）であり、Ｙは非放出型オリゴペプチドリンカーであり、およびＺはＤＥ２０である。いくつかの実施形態では、化合物は配列番号１１である。

【0047】

いくつかの実施形態では、Ｘは（ポリ）ペプチドである。いくつかの実施例では、式（Ｉ）の構造を有する化合物は、（ポリ）ペプチドである。

【0048】

本明細書における、いくつかの実施形態では、骨同化活性を有する（ポリ）ペプチド（例えば、アバロパラチド（配列番号２））が提供される。本明細書における、いくつかの実施形態では、骨同化活性を有する実質的に純粋な（ポリ）ペプチド（例えば、アバロパラチド）が提供され、この（ポリ）ペプチドは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では配列番号３および／または配列番号１４は、骨同化活性（および、例えば、骨標的活性）を有する。いくつかの実施形態では配列番号４は、骨同化活性（および、例えば、骨標的活性）を有する。他の実施形態では、（ポリ）ペプチドは、例えば、ＰＴＨもしくはＰＴＨｒＰ（配列番号１）、アバロパラチド（Ａｂａｌｏ）（配列番号２））、または配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性（例えば、少なくとも７５％の配列同一性もしくはそれ以上、少なくとも８５％の配列同一性もしくはそれ以上、少なくとも９０％の配列同一性もしくはそれ以上、または少なくとも９５％の配列同一性もしくはそれ以上）を有するアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、（ポリ）ペプチドは、例えば、ＰＴＨもしくはＰＴＨｒＰ（配列番号１）、Ａｂａｌ（配列番号２））、または配列番号４に記載のアミノ酸配列少なくとも７５％の配列同一性（例えば、少なくとも７５％以上の配列同一性、少なくとも８５％以上の配列同一性、少なくとも９０％以上の配列同一性、または少なくとも９５％以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、（ポリ）ペプチドは、図１Ａに示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％以上の配列同一性、少なくとも８５％以上の配列同一性、少なくとも９０％以上の配列同一性、または少なくとも９５％以上の配列同一性を有するアミノ配列である。

【0049】

別の実施形態では、（ポリ）ペプチドは図１Ａに示されるアミノ酸配列である。別の実施形態では、（ポリ）ペプチドは、図１Ｂに示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％以上の配列同一性、少なくとも８５％以上の配列同一性、少なくとも９０％以上の配列同一性、または少なくとも９５％以上の配列同一性を有するアミノ配列である。別の実施形態では、（ポリ）ペプチドは図１Ｂに示されるアミノ酸配列である。別の実施形態では、（ポリ）ペプチドは、（１０１）（例えば、図１Ａに示される配列番号７を参照）と少なくとも７５％以上の配列同一性、少なくとも８５％以上の配列同一性、少なくとも９０％以上の配列同一性、または少なくとも９５％以上の配列同一性を有するアミノ配列である。いくつかの実施形態では、（ポリ）ペプチドは、（１０１）（例えば、図１Ａに示される配列番号７を参照）である。別の実施形態では、（ポリ）ペプチドは、（１０８）（例えば、図１Ｂに示される配列番号８を参照）と少なくとも７５％以上の配列同一性、少なくとも８５％以上の配列同一性、少なくとも９０％以上の配列同一性、または少なくとも９５％以上の配列同一性を有するアミノ配列である。いくつかの実施形態では、（ポリ）ペプチドは、（１０２）（例えば、図１Ｂに示される配列番号８を参照）である。

【0050】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される化合物は、ペイロードを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、アバロ（Ａｂａｌｏ）、またはその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する）（配列番号２）を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、本明細書に」提供されるリンカー（例えば配列番号１２）を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードはアバロ、またはその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する）（配列番号２）、および本明細書に提供されるリンカー（例えば配列番号１２）を含む。

【0051】

いくつかの実施形態では、リンカーは配列番号１２であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、本質的に配列番号１２からなるポリペチドであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１２の１以上のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１２の各アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは配列番号１２である。

【0052】

いくつかの実施形態では、（ポリ）ペプチドは、本明細書に提供される任意の化合物の薬学的に許容される塩（例えば、式（Ｉ）である、配列番号３または配列番号４の構造を有する）である。

【0053】

本明細書におけるいくつかの実施形態では、本明細書に提供される任意の化合物を含む医薬組成物（例えば、式（Ｉ）である、配列番号３または配列番号４の構造を有する化合物）、またはその薬学的に許容される塩が提供される。ある実施形態では、医薬組成物は、本明細書に提供される任意の化合物、および少なくとも１つの薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を含む。

【0054】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される化合物（例えば式（Ｉ）である、配列番号３または配列番号４）は、個体（例えば、処置を必要とする患者または個体）に（例えば、皮下に）投与される。

【0055】

本明細書におけるいくつかの実施形態において提供されるのは、式（Ｘ－Ｙ－Ｚ）のコンジュゲートである。

【0056】

いくつかの実施形態では、Ｘは、ＰＴＨ、ＰＴＨｒＰ（配列番号１）、アバロパラチド（配列番号２）、骨同化活性を有する上記の任意の誘導体、および骨同化活性を有する上記の任意のフラグメントからなる群から選択される骨同化剤である。

【0057】

いくつかの実施形態では、Ｙは、存在する場合、放出型または非放出型であり得るリンカーである。

【0058】

別の実施形態では、リンカーは、図１Ａに示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％以上の配列同一性、少なくとも８５％以上の配列同一性、少なくとも９０％以上の配列同一性、少なくとも９５％以上の配列同一性を有するアミノ配列である。別の実施形態では、リンカーは図１Ａに示されるアミノ酸配列である。別の実施形態では、リンカーは、図１Ｂに示されるアミノ酸配列（例えば、配列番号１２）と少なくとも７５％以上の配列同一性、少なくとも８５％以上の配列同一性、少なくとも９０％以上の配列同一性、少なくとも９５％以上の配列同一性を有するアミノ配列である。別の実施形態では、リンカーは、図１Ｂで示されるアミノ酸配列（例えば、配列番号１２）である。

【0059】

いくつかの実施形態では、Ｚは、少なくとも１１～１００のアミノ酸残基を含むＡＯＰである骨指向性リガンドである。

【0060】

アミノ酸残基には、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはその混合物があり得る。アミノ酸残基には、Ｄキラリティがあり得る。ＡＯＰは、アミノ酸残基の直鎖になり得る。Ｙが存在する場合、Ｙは、少なくとも１つの炭素ー炭素結合、および／または少なくとも１つのアミド結合を含有している非放出型リンカーになり得る。あるいは、Ｙが存在する場合、Ｙは、少なくとも１つのジスルフィド、エステル、および／またはプロテアーゼに特有のアミド結合を含有している放出型リンカーになり得る。

【0061】

本明細書における、いくつかの実施形態では、本明細書に提供される任意の化合物を含む医薬組成物（例えば、式（Ｉ）である、配列番号３または配列番号４の構造を有する化合物）、またはその薬学的に許容される塩（および、例えば、少なくとも１つの薬学的に許容される担体もしくは賦形剤）が提供される。

【0062】

さらに、本明細書におけるいくつかの実施形態では、上記コンジュゲートおよび薬学的に許容される担体の有効な量を含む医薬組成物が提供される。

【0063】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される化合物（例えば式（Ｉ）である、配列番号３または配列番号４）は、個体（例えば、処置を必要とする患者または個体）に（例えば、皮下に）投与される。

【0064】

本明細書におけるいくつかの実施形態では、（例えば、個体（例えば処置を必要とする患者または個体）の）骨折を処置する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に提供される任意の化合物（例えば、式（Ｉ）、配列番号３または配列番号４の構造を有する化合物）を治療有効量で個体（例えば、処置を必要とする患者または個体）に投与する（例えば、皮下に）工程を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される任意の化合物（例えば、式（Ｉ）、配列番号３または配列番号４の構造を有する化合物）を治療有効量で個体（例えば、処置を必要とする患者または個体）に（例えば、皮下に）投与することは、個体（例えば、処置を必要とする患者または個体）の骨折を処置し、またはその治癒を改善する。

【0065】

本明細書におけるいくつかの実施形態では、（例えば、処置を必要とする）患者の骨折を処置する方法、つまり、治療有効量の任意の化合物（例えば、式（Ｉ）、配列番号３または配列番号４の構造を有する化合物）、本明細書に提供される薬学的に許容される組成物を（例えば、処置を必要とする）患者に（例えば、皮下に）投与することで、（例えば、処置を必要とする）患者の骨折を処置する方法が提供される。

【0066】

いくつかの実施形態では、（例えば、処置を必要とする）患者は、骨折を起こしやすい。いくつかの実施形態では、（例えば、処置を必要とする）患者は、糖尿病を患っている。いくつかの実施形態では、（例えば、処置を必要とする）患者は、骨粗しょう症を患っている。いくつかの実施形態では、（例えば、処置を必要とする）患者は、顎顔面の欠乏、欠損または損傷（例えば、顎顔面骨折）を患っている。いくつかの実施形態では、顎顔面骨折には、マイクロプレートで安定した下顎骨切り術が行われる。いくつかの実施形態では、（例えば、処置を必要とする）患者は、糖尿病、骨粗しょう症、および／または顎顔面の欠乏、欠損もしくは損傷（例えば、顎顔面骨折）を患っている。いくつかの実施形態では、患者は、糖尿病、骨粗しょう症、顎顔面の損傷および顎顔面の欠乏からなる群から選択される１つ以上の併発症を患う。

【0067】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される任意の（例えば、式（Ｉ）の構造を有する）化合物または医薬組成物を治療有効量で（例えば皮下に）投与することは、注射によるものである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される任意の（例えば、式（Ｉ）の構造を有する）化合物または医薬組成物を治療有効量で（例えば皮下に）投与することは、皮下注射によるものである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される任意の化合物または医薬組成物は、治療有効量が非経口的投与あるいは腸内投与によって投与される。

【0068】

本明細書における、いくつかの実施形態では、（例えば、個体（例えば処置を必要とする患者または個体）の）骨折を処置する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に提供される任意の化合物（例えば、式（Ｉ）、配列番号３または配列番号４の構造を有する化合物）を治療有効量で個体（例えば、処置を必要とする患者または個体）に（例えば、皮下に）投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される任意の化合物（例えば、式（Ｉ）である、配列番号３または配列番号４の構造を有する化合物）を治療有効量で個体（例えば、処置を必要とする患者または個体）に（例えば、皮下に）投与することは、個体（例えば、処置を必要とする患者または個体）の骨折を処置し、またはその治癒を改善する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される、治療有効量の任意の化合物または医薬組成物は、非経口的投与あるいは腸内投与によって投与される。

【0069】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される化合物または医薬組成物の治療有効量で投与してから３週間以内（例えば、２～３週間）は、患者の疼痛の軽減をもたらす。

【0070】

（例えば、処置を必要とする）患者の骨の成長を促進する方法も提供される。ある実施形態では、方法は、本明細書に提供される治療有効量の化合物または医薬組成物を患者に投与する工程を含み、それによって、前処置（例えば、本明細書に提供される化合物または医薬組成物の投与前の骨密度（ｂｏｎｅ ｄｅｎｓｉｔｙ））と比較して、患者の骨ミネラル密度（ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ））を上昇させる。

【0071】

いくつかの実施形態では、骨ミネラル密度の上昇は、骨折部位または（例えば、骨粗しょう症を経験している患者における）骨に存在する１つ以上の吸収窩において発生する。本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態では、本明細書に提供される化合物は、（例えば、治療の必要のある個体に）皮下投与される。

【0072】

方法のいくつかの実施形態では、本明細書に提供される任意の化合物あるいは医薬組成物は、毎日、毎週、隔週、または毎月（例えば、１週、１か月、１年、またはそれよりも多くの期間）治療有効量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される任意の化合物または医薬組成物は、１週間に１回または２回、治療有効量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される任意の化合物または医薬組成物は、１～８００回にわたり独立して、治療有効量で投与される。ある実施形態では、治療有効量の化合物または医薬組成物は、化合物の濃縮をしている、患者体重１ｋｇにつき０．０１ｍｇ、１ｍｇ、またはその間の濃度の化合物を有する。

【0073】

いくつかの実施形態では、骨同化剤はＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰ（配列番号１）、または、それらの誘導体もしくはフラグメントである（例えば、骨同化活性を有する））。
いくつかの実施形態では、骨同化剤はＰＴＨ、または、その誘導体もしくはフラグメントである。いくつかの実施形態では、骨同化剤はＰＴＨｒＰ（配列番号１）、または、その誘導体もしくはフラグメントである。いくつかの実施形態では、骨同化剤は（例えば合成的）修正ＰＴＨ、または、その誘導体もしくはフラグメントである。いくつかの実施形態では、骨同化剤は（例えば合成的）修正ＰＴＨｒＰ（配列番号１）、または、その誘導体もしくはフラグメントである。いくつかの実施形態では、骨同化剤はアバロパラチド、あるいはその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する）である。いくつかの実施形態では、骨同化剤は、アバロパラチド（配列番号２）である。いくつかの実施形態では、骨同化剤は（例えば合成的）修正アバロパラチドである。

【0074】

いくつかの実施形態では、Ｚはアミノ酸残基の直鎖である。いくつかの実施形態では、Ｚは、（例えば、少なくとも４つのグルタミン酸アミノ酸残基あるいは４つのアスパラギン酸アミノ酸残基を含む）ＡＯＰである。

【0075】

いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４（例えば４以上、１０以上、２０以上、３０以上、５０以上、７５以上、または１００以上）のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは高々１００（例えば１００以下、７５以下、５０以下、３０以下、２０以下、１０以下、または４以下）のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４、および高々３５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４、および高々２０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも６、および高々３０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも８、および高々３０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも８、および高々２０のアミノ酸を含む。

【0076】

いくつかの実施形態では、ＡＯＰは、約４～約２０（４～約２０、または約４～２０など）のアミノ酸残基、あるいは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０などのより多くのアミノ酸残基を含む。様々な実施例では、ＡＯＰは、２０のアミノ酸残基などの約２０のアミノ酸残基を含む。

【0077】

いくつかの実施形態では、アミノ酸は、アスパラギン酸（文字Ｄによって表される）、グルタミン酸（文字Ｅによって表される）、またはその混合物である。アミノ酸残基には、Ｄキラリティ、Ｌキラリティ、またはその混合物があり得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基にはＤキラリティがある。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基にはＬキラリティがある。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４つの（例えば、酸性）アミノ酸残基（例えば、同じキラリティ（例えばＤ－またはＬ－アミノ酸残基）がある）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも４つの（例えば、酸性）アミノ酸残基の各々にはＤキラリティがある。いくつかの実施形態では、アスパラギン酸はＤ－アスパラギン酸またはＬ－アスパラギン酸である。いくつかの実施形態では、グルタミン酸はＤ－グルタミン酸またはＬ－グルタミン酸である。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４および高々２０のＤ－グルタミン酸残基またはＬ－グルタミン酸残基を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４および高々２０のＤ－アスパラギン酸残基またはＬ－アスパラギン酸残基を含む。

【0078】

いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４の（例えば、Ｄ－）グルタミン酸アミノ酸残基（例えば、４～２０のＤ－グルタミン酸アミノ酸残基）、および／または少なくとも４つの（例えば、Ｄ－）アスパラギン酸アミノ酸残基（例えば、４～２０のＤ－アスパラギン酸アミノ酸残基）を含む。

【0079】

いくつかの実施形態では、Ｚは、（例えばＤ－）グルタミン酸アミノ酸残基、および（例えばＤ－）アスパラギン酸アミノ酸残基の混合物を含む。

【0080】

いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４つの反復Ｄ－グルタミン酸アミノ酸残基（例えば、ＤＥ４、それ以上、ＤＥ６、それ以上、ＤＥ８、それ以上、ＤＥ１０、それ以上、ＤＥ１５、それ以上、あるいはＤＥ２０、それ以上、ＤＥ２５、それ以上、ＤＥ３０、それ以上、あるいはＤＥ３５、それ以上）を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも１０の反復Ｄ－グルタミン酸アミノ酸残基（例えば、ＤＥ４、それ以上、ＤＥ６、それ以上、ＤＥ８、それ以上、ＤＥ１０、それ以上、ＤＥ１５、それ以上、あるいはＤＥ２０、それ以上、ＤＥ２５、それ以上、ＤＥ３０、それ以上、あるいはＤＥ３５、それ以上）を含む。いくつかの実施形態では、Ｘはアバロパラチド、またはその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する）である。

【0081】

いくつかの実施形態では、Ｙは非放出型リンカーである。いくつかの実施形態では、Ｙは少なくとも１つの炭素ー炭素結合を含有している非放出型リンカーである。いくつかの実施形態では、Ｙは少なくとも１つのアミド結合を含有している非放出型リンカーである。いくつかの実施形態では、Ｙは少なくとも１つの炭素ー炭素結合および少なくとも１つのアミド結合を含有している非放出型リンカーである。

【0082】

いくつかの実施形態では、Ｙは放出型リンカーである。いくつかの実施形態では、Ｙは少なくとも１つのジスルフィド（Ｓ－Ｓ）を含有している放出型リンカーである。いくつかの実施形態では、Ｙは少なくとも１つのエステル（例えば、Ｏ（Ｃ＝Ｏ））を含有している放出型リンカーである。いくつかの実施形態では、Ｙは少なくとも１つの（例えば、プロテアーゼに特有の）アミド結合を含有している放出型リンカーである。

【0083】

いくつかの実施形態では、Ｙは本明細書の他のところに（例えば、上記に）記載されたリンカーである。

【0084】

いくつかの実施形態では、Ｚは本明細書の他のところに（例えば、上記に）記載された骨指向性リガンドである。

【0085】

いくつかの実施形態では、Ｘはアバロパラチド、またはその誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する）であり、Ｙは非放出型オリゴペプチドリンカーであり、およびＺはＤＥ２０である。いくつかの実施形態では、化合物は配列番号１１である。

【0086】

いくつかの実施形態では、Ｘはアバロパラチドあるいは、その誘導体もしくはフラグメント（例えば、骨同化活性を有する）であり、Ｙは、少なくとも１つのプロテアーゼに特有のアミド結合を含む放出型オリゴペプチドリンカーであり、および、ＺはＤＥ２０である。

【0087】

いくつかの実施形態では、化合物は、造影剤（例えば、色素）である。

【0088】

いくつかの実施形態では、化合物は、単一光子放射断層撮影（Ｓｉｎｇｌｅ ｐｈｏｔｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）／コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣ／ＣＴ）造影剤である。

【0089】

いくつかの実施形態では、化合物は本明細書の他のところに（例えば、上記に）記載される。

【0090】

いくつかの実施形態では、化合物は配列番号３である。いくつかの実施形態では、化合物は配列番号４である。

【0091】

本明細書におけるいくつかの実施形態では、本明細書に提供される任意の化合物を含む医薬組成物（例えば、式（Ｉ）である、配列番号３または配列番号４の構造を有する化合物）、またはその薬学的に許容される塩（例えば、および少なくとも１つの薬学的に許容される担体もしくは賦形剤である）が提供される。

【0092】

本明細書におけるいくつかの実施形態では、骨折を処置する方法がさらに提供される。いくつかの実施形態では、方法は、有効な量の式Ｘ－Ｙ－Ｚのコンジュゲート、または同じものを含む医薬組成物を骨折の患者に投与（例えば皮下に）する工程を含み、その上で、患者の骨折が処置される。患者は、糖尿病、骨粗しょう症、またはマイクロプレートで安定した下顎骨切り術などの顎顔面の骨折を患っている場合がある。有効な量のコンジュゲートまたは有効な量の医薬組成物は、皮下注射などの注射によって投与され得る。

【0093】

さらなる実施形態、および本開示の適用可能な全範囲は、詳細な説明から明白になるだろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、単なる例示として与えられることは理解する必要がある。本開示の主旨および範囲内の様々な変更および修正は、当業者に明白になるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0094】

【図1A】配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６（ダサチニブの標的コンジュゲートの構造）、および配列番号７を示す。

【図1B】配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５を示す。

【図2A】テトラサイクリン、モノビスホスホネート、ポリホスフェート、および放射性標識されたチロシルシステインにコンジュゲートした酸性のオリゴペプチドを示す。

【図2B】 ^１２５Ｉチロシルシステインペイロードを送達する骨標的リガンドについて、コンジュゲート対骨折した大腿骨／健康な大腿骨比率のグラフを示す。

【図3A】非標的／遊離配列番号１と比較した、標的配列番号１に関する、組織対注射量／ｇの割合のグラフを示す。

【図3B】哺乳類の骨折した大腿骨における、標的配列番号１および遊離配列番号１の注射後２４時間に関する、コンジュゲート対注射量／ｇの割合のグラフを示す。

【図3C】非標的／遊離配列番号１と比較した、標的配列番号１に関する、コンジュゲート対骨折した大腿骨／健康な大腿骨比率のグラフを示す。

【図4】（Ｌ）Ａｓｐ_１０に結合した、６つの異なる放射ヨウ素標識されたペイロード（ｒａｄｉｏ－ｉｏｄｉｎａｔｅｄ ｐａｙｌｏａｄｓ）の注射後２４時間に関する、組織対注射量／ｇの割合のグラフを示す。

【図5】非標的ＣＫ２．３に対して、１０（Ｌ）アスパラギン酸に結合した、放射ヨウ素標識されたカゼインキナーゼ２．３ペプチド（ＣＫ２．３）に関する、組織対注射量／ｇの割合のグラフを示す。

【図6】非標的ＣＫ２．３に対して、１０（Ｌ）アスパラギン酸、１０（Ｌ）グルタミン酸、または１０（Ｌ）アミノアジピン酸に結合した、放射ヨウ素標識されたＣＫ２．３に関する、組織対注射量／グラムの割合のグラフを示す。

【図7】非標的ＣＫ２．３に対して、１０または２０（Ｌ）グルタミン酸に結合した、放射ヨウ素標識されたＣＫ２．３に関する、組織対パーセント注射量／ｇのグラフを示す。

【図8】非標的ＣＫ２．３に関する、２０Ｌグルタミン酸またはＤ－グルタミン酸に結合した、放射ヨウ素標識されたＣＫ２．３に関する、組織対パーセント注射量／ｇのグラフを示す。

【図9】大腿骨中部骨折を負って１０日後の哺乳類における、１０ＬまたはＤ－アスパラギン酸と結合したＳ０４５６（近赤外線（ＩＲ）蛍光体）の注射後の異なる時点に関する、注射後の時間対μｇ色素／ｍｇ組織のグラフを示す。

【図10】非標的ＣＫ２．３に対して、異なる酸性のオリゴペプチドに結合した、放射ヨウ素標識されたＣＫ２．３に関する、標的リガンド対パーセント注射量／グラムのグラフを示す。

【図11A】（Ｄ）Ｇｌｕ１０酸に連結した９９ＴｃをキレートするＴｃキレート剤ＥＣ２０の単一光子放射断層撮影／コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣ／ＣＴ）画像を示す。

【図11B】（Ｄ）Ｇｌｕ２０酸に連結された９９ＴｃをキレートするＴｃキレート剤ＥＣ２０のＳＰＥＣ／ＣＴ画像を示す。

【図11C】異なる組織における、標識（Ｄ）Ｇｌｕ１０および（Ｄ）Ｇｌｕ２０化合物に関する、組織対パーセント注射量／ｇのグラフを示す。

【図11D】９９ＴｃをキレートするＥＣ２０（Ｄ）Ｇｌｕ１０の構造を示す。

【図12】トリビスホスホネート標的リガンドの構造を示す。

【図13】４週後の哺乳動物における、試験された薬剤対標的同化コンジュゲートの骨量（ｂｏｎｅ ｖｏｌｕｍｅ）（ＢＶ）のグラフを示す。

【図14】４週後の哺乳動物における、試験された薬剤対標的同化コンジュゲートの骨量／全体積（ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ）（ＢＶ／ＴＶ）のグラフを示す。

【図15】４週後の哺乳動物における、試験された薬剤対標的同化コンジュゲートの最大（ＭＡＸ）ロード（Ｎ）のグラフを示す。

【図16】４週後の哺乳動物における、試験された薬剤対標的同化コンジュゲートの骨折までの仕事量（ｗｏｒｋ ｔｏ ｆｒａｃｔｕｒｅ）（ｍＪ）のグラフを示す。

【図17】４週後の哺乳動物における、試験された薬剤対標的同化コンジュゲートの降伏後の変位（ｐｏｓｔ ｙｉｅｌｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（ｍｍ）のグラフを示す。

【図18】本明細書に提供される化合物を使用した４週間の治療期間の間、Ｉ型糖尿病のげっ歯動物に関する、日数対血糖（ｍｇ／ｄｌ）のグラフを示す。

【図19】Ｉ型糖尿病の骨折したハツカネズミの処置群について、日数対体重の平均変化率のグラフを示す。

【図20A】４週後の哺乳動物における、試験された薬剤対標的同化コンジュゲートの骨量のグラフを示す。

【図20B】４週後の哺乳動物における、試験された薬剤対標的同化コンジュゲートの骨量／全体積のグラフを示す。

【図21A】４週後の哺乳動物における、インスリンを用いて試験された薬剤対標的同化コンジュゲートの骨梁幅(ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ)のグラフを示す。

【図21B】４週後の哺乳動物における、インスリンを用いて試験された薬剤対標的同化コンジュゲートの骨梁中心距離（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｓｐａｃｉｎｇ）のグラフを示す。

【図22A】４週後の哺乳動物における、インスリンを用いて試験された薬剤対標的同化コンジュゲートの最大力のグラフを示す。

【図22B】４週後の哺乳動物における、インスリンを用いて試験された薬剤対標的同化コンジュゲートの骨折までの仕事量（ｍＪ）のグラフを示す。

【図22C】４週後の哺乳動物における、インスリンを用いて試験された薬剤対標的同化コンジュゲートのモジュラス（ＭＰａ）のグラフを示す。

【図23A】４週後の哺乳動物における、試験された薬剤対標的同化コンジュゲートのＢＶのグラフを示す。

【図23B】試験された薬剤対４週後の哺乳動物における、試験された薬剤対標的同化コンジュゲートの骨量／全体積（ＢＶ／ＴＶ）のグラフを示す。

【図24A】４週後の哺乳動物における、試験された薬剤対標的同化コンジュゲートの最大負荷（Ｎ）のグラフを示す。

【図24B】４週後の哺乳動物における、試験された薬剤対標的同化コンジュゲートの骨折への仕事量（ｍＪ）のグラフを示す。

【図24C】４週後の哺乳動物における、試験された薬剤対標的同化コンジュゲートの剛性（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）（ＭＰａ）のグラフを示す。

【図25】大腿骨中部骨折モデルの哺乳動物における、試験された薬剤対血清カルシウムの処置の血清カルシウム濃度（ｍｇ／ｄｌ）のグラフを示す。

【図26】異なる処置群について、日数対自発運動用オープンフィールドボックスにおいて移動した距離（ｃｍ）のグラフを示す。

【図27】異なる処置群について、日数対自発運動用オープンフィールドボックスにおいて運動に費やされた時間のグラフを示す。

【図28】異なる処置群について、日数対自発運動用オープンフィールドボックスにおける平均速度（ｃｍ／ｓ）のグラフを示す。

【図29】欠損と移植、および頭蓋骨の欠損について、薬剤対非石灰化領域（ｍｍ^２）、スクリューについて、薬品対遊走した割合（％）、下顎骨切り術について、薬剤対ギャップ直径（ｍｍ）、および下顎骨切り術について、薬剤対最大負荷（Ｎ）のグラフを示す。

【図30】時対本明細書に提供される化合物の血液における注射量の割合（ｃｐｍ／ｇ）のグラフを示す。

【図31】時対骨折した大腿骨および反対側の大腿骨において、本明細書に提供される化合物の、骨における注射量の割合（ｃｐｍ／ｇ）のグラフを示す。

【図32】本明細書に提供される化合物の処置対最大負荷（Ｎ）のグラフを示す。

【図33】本明細書に提供される化合物の処置対骨折への仕事量（ｍＪ）のグラフを示す。

【図34】本明細書に提供される化合物の処置対最大負荷（Ｎ）のグラフを示す。

【図35】非標的アバロパラチドを用いた処置が始まってから３週間後に撮影された骨のＣＴ画像を示す。

【発明の詳細な説明】

【0095】

本開示は、骨折を処置する化合物と組成物の調製および使用に関する。いくつかの実施形態では、化合物、組成物、および方法は、治療薬を骨折または他の対象の骨の損傷に（例えば、選択的に）局在化させる戦略に重点を置いている。例えば、提供される化合物、組成物および方法は、骨指向性リガンドを含み得る。いくつかの実施形態では、化合物および組成物は、滞留時間（例えば、劣化に対する耐性が高まったことによるなど）が増加したことを表すように製剤されたため、標的部位（例えば、骨折部位）で治療有効濃度を維持するために化合物または組成物を再投与する頻度が減少した。これに関する化合物、組成物および方法は、骨折を処置するために用いられる従来の治療を上回る大きな利点を得ることを可能にする。例えば、標的治療は、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ２）のような治療薬の局所応用に使用される従来のボーラス投与に比べて、治療薬濃度を長く維持する非侵襲的方法を可能にする。これにより、治癒のより堅調な刺激、およびより速い回復がもたらされる。非侵襲性が、医師は薬物を投与する時間および方法を制御することを可能にするため、医師は、骨折治癒の様々な段階に影響を与え、患者の治癒時間の変動に合わせて処置戦略を調整することができる。それは、全身暴露および副作用を軽減することができ、タンパク質同化剤の局所応用のように隣接組織への漏出も防ぐことができる。

【0096】

骨折は、骨粗しょう症の患者において現れることがある。骨粗しょう症は、個体が後世（例えば、＞６５歳）に患う併存疾患となり得、骨芽細胞と破骨細胞との間の不均衡の結果となることがある。女性では、不均衡は、閉経期のエストロゲンの低下によって引き起こされることがある。不均衡による骨密度の低下は、（若い時期に比べて）比較的抑制された力で骨折するように骨をもろくする場合がある。骨の基本単位における不均衡は、さらに骨折の治癒を遅くすることがある。

【0097】

５０歳以上の女性３人のうち少なくとも１人および男性５人のうち少なくとも１人は、骨粗しょう症性骨折を患うことになる。骨粗しょう症の患者は、骨折する確率が少なくとも２倍（例えば、サルコペニアおよび弱まった骨による）あるから、骨粗しょう症性骨折は、リスク集団に対する課題になり得る。この集団は、骨折治癒を促進する非侵入的戦略から利益を得ることになる。

【0098】

同様に、糖尿病患者は、糖尿病でない患者に比べて６倍も骨折をすることが多い。糖尿病患者は、健康な患者に比べて２倍も非癒合骨折をすることが多い。いくつかの実例では、骨折の増加は、（例えば、骨の細胞外マトリックスにおいて）微細構造の変化から発生する。高血糖は、コラーゲン鎖の間の非酵素のクロスリンクを引き起こすことがある。さらに、Ｉ型糖尿病では、ランゲルハンス島中のβ細胞からのインスリン産生の低下は、（例えば、インスリンは骨芽細胞に対して同化作用があるため）骨ミネラル密度の減少を引き起こすことがある。さらに、骨折治癒は、貧弱な血管新生およびニューロパシーから害されることがある。例えば、患者は、固定された場合に、併発症になりやすくなり得るので、これらの患者の骨折治癒を加速することは、重要であり得る。糖尿病患者は、現在の骨折治癒処置オプションで処置するには、難しい整形外科の患者になることがある。

【0099】

長管骨骨折が一時的な固定化および短期のライフスタイルの変化を必要とする一方、顎顔面骨骨折は、一貫して生活の質を著しく悪化させることになる（例えば、損傷した骨がしっかりと修復されるまで、続くことがよくある）。この生活の質が低下することは、頭蓋顔面領域の神経末端が高密度であることと、これらのエリアにおける５つの主要な感覚すべてが集中すること、から発生する疼痛、および、例えば、コミュニケーションおよび咀嚼などの、このエリアの重大な機能の喪失により引き起こされ得る。

【0100】

米国における骨折の身体的および財政的負担は、しばしば嘆かれてきたが、これらの骨折を処置する方法は、驚くほど改善していない。ある実例には、処置方法は、ロッド、プレート、および／またはギプスを用いた安定に頼っている。

【0101】

多くの実例では、現在までに承認された骨形成の薬は、手術中に局所的に適用される。例えば、手術はほとんどの骨折には適応されないので、これらの薬理学的薬剤を採用する機会は困難になることがある。

【0102】

多くの実例では、承認された骨同化剤の代謝回転は比較的速いので、治療効果が持続するのが局所塗布後のわずかな期間に限定することがある。

【0103】

さらに、局所的に適用された同化薬が周辺組織に漏出すると、例えば、異所性骨の成長など望ましくない副作用を引き起こすことがある。いくつかの実例では、骨形成剤の全身投与は、例えば、神経、筋肉、血管系などの健康な組織の望まない同化プロセスを刺激する。いくつかの実例では、骨同化薬の全身投与について、高カルシウム血症、高血圧、免疫抑制、さらに癌は懸念材料である。

【0104】

考えられる解決方法は、骨標的である。今日まで、骨標的は、主に、骨粗しょう症、骨髄炎、および骨転移などの骨折に関連のない整形外科の病理にペイロードを送達することに重点を置いている。これらの処置のほとんどは、骨に化合物を選択的に送達するビスホスホネートである。しかしながら、骨折を処置する場合、薬剤をすべての骨に非特異的に投与した場合に起こりうる異所性骨化を避けるために、骨折部位に選択的に化合物を投与することが不可欠である。テトラサイクリンが、健康な骨よりも骨折した骨を適度に選択し得る一方、テトラサイクリンは骨、肝臓および腎臓に有毒である場合があるので、理想的な解決方法ではない。

【0105】

ビスホスホネートを骨折標的に使用することには、正常な骨のリモデリング、および、線維性骨から層板骨への骨折カルスの変化に不可欠な破骨細胞を阻害することを含む、いくつかの制約も存在する。ビスホスホネートを、標的リガンドとして使用することの別の問題は、その骨における半減期が最長２０年であり、治療用カーゴ（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｃａｒｇｏ）の安定性次第では、分子標的への刺激が不必要に長引く可能性があることである。

【0106】

同様の標的は、ラネレートで観察されることがある。これらの化合物は、標的分子として多くの骨疾患に使用し、骨の成長と治癒を促進するために同化剤に付着させることができる。しかしながら、ビスホスホネートのように、それらは、長い半減期を有する。

【0107】

ビスホスホネート、ラネレート、およびポリホスフェートには、合成の煩雑性および難溶性を含む問題があり、そのような欠点を呈しない骨指向性リガンドの必要性が残る。望ましくは、骨指向性リガンドは、付着したペプチド性の治療薬を骨折、特に骨折カルスに送達することができる。

【0108】

アバロパラチド（配列番号２）は、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）（配列番号１）の同化３４－アミノ酸の合成類似体である。それは、骨の成長を促進し、かつ骨密度を保つことに役立つことができ、骨粗しょう症を処置するために使用することができる。アバロパラチド（配列番号２）は、ＰＴＨｒＰ（配列番号１）と同じように作用し、副甲状腺ホルモン１（ＰＴＨ１）受容体（ＰＴＨ１Ｒ）を標的、結合、および活性化する。

【0109】

ＰＴＨ１Ｒは、骨芽細胞および骨間質細胞で発現されるＧタンパク質コンジュゲート型受容体（ＧＰＣＲ）である。ＰＴＨ１Ｒは、次に、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）シグナル経路および骨同化シグナル経路を活性化するので、骨の成長および骨ミネラル密度と体積の増加を引き起こす。骨量と骨の強度が増えることは、骨粗しょう症を防ぎ／処置し、および骨折のリスクを減らすことに役立つ。

【0110】

折れた骨を管理することは、骨同化剤を治癒プロセスの全過程にわたって連続的に適用することにより改善され得る。いくつかの実例では、ハイドロキシアパタイトは、折れた骨に曝露される。ハイドロキシアパタイトに対して高い親和性と特異性を有して結合する分子は、いくつかの実例では、骨同化剤を骨折に標的する処置を提供し得る（および、例えば、骨折治癒の連続的な刺激を提供する）。

【0111】

骨折をした患者は、例えば、骨折の疼痛および骨折の安定性の欠如により、機能の喪失を患うことがある。骨格の機能喪失に対する従来の治療法は、例えば、プレートおよびロッドを外科的に植込むことによる安定性の向上、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）およびオピオイドを用いた疼痛の緩和、ならびに、同化薬の局所的な適用を含む。ロッドやプレートの外科的移植は侵襲的であり、疼痛を伴うことがある。例えば、いくつかの実例では、患者が体の骨折した部分をあまりに早く使ってしまい、これにより治癒を遅らせてしまう。オピオイドは、いくつかの実例では、認知障害を誘発し、ならびに、例えば、１）最も多い薬物乱用クラス（例えば、若年層と高齢層の両方において、整形外科的外傷の後）であり、および２）いくつかの実例では、損傷の治癒後に、いくつかの疼痛症候群が継続する原因となる。さらに、いくつかの実例では、オピオイドはめまいや立ちくらみを誘発することがあり、これにより、例えば、転倒し、すでに患っている骨の損傷をさらに悪化させるか、または新たな骨の損傷を引き起こしてしまうことになる。いくつかの実例では、骨折の疼痛に対してＮＳＡＩＤを使用することは、治癒プロセスを損なうことがあるので、推奨されない。例えば、疼痛を緩和するためにＮＳＡＩＤを投与することは、骨密度の減少、骨折の初期骨折固定の間の軟骨形成の減少、最終的には骨の欠損が非癒合になり得る。このように治癒が損なわれるメカニズムは、例えば、幹細胞の分化の遅れおよびＢＭＰ２産生の低下を含み得る。いくつかの実例では、患者は、処置後も疼痛を感じ続け、そのため、より良いレントゲン結果にもかかわらず、機能の喪失をもたらす。ＢＭＰ２は、骨折の治癒を高められるように骨折を処置するための承認された治療であるが、いくつかの実例では、手術後に疼痛を増加させ、これにより、骨折後に、機能を獲得することを遅らせ得ることが報告されている。

【0112】

化合物
本明細書におけるいくつかの実施形態で提供されるのは、酸性のオリゴペプチド（ＡＯＰ）（例えば、酸性アミノ酸の１０量体および２０量体、アスパラギン酸かグルタミン酸のどちらかの１０量体および２０量体、あるいは上記の様々な組合せ）を含む化合物である。いくつかの実施形態では、ＡＯＰは効果的に脊椎固定を標的にする。いくつかの実施形態では、２０量体は、１０量体よりも効果的である。いくつかの実施形態では、ＡＯＰｓは、ビスホスホネートとテトラサイクリンと比べて、高度に選択的である。いくつかの実施形態では、グルタミン酸ポリマーおよびアスパラギン酸ポリマーは、送達部位で同様の滞留時間を有する。いくつかの実施形態では、オリゴアスパラギン酸は腎臓における非特異的な滞留時間を減少しているが、オリゴグルタミン酸で観察された滞留時間のわずかな増加は一時的なものである。いくつかの実施形態では、アスパラギン酸オリゴペプチドおよびグルタミン酸オリゴペプチドの両方は、１８時間後に（例えば、ほとんど定量的に）、腎臓から除かれる。いくつかの実施形態では、ＡＯＰは、すべての化学的分類（例えば、疎水性、中性、カチオン性、アニオン、短いオリゴペプチド、また長いポリペプチド）のペプチドを標的する。いくつかの実施形態では、この標的は、他の標的治療を発展するために、このプラットフォームの発展および幅広い使用を可能にするので、特に有益である（例えば、多くの骨同化剤はペプチド性であるが、それらの物理的性質は大幅に変わることがある）。

【0113】

本明細書におけるいくつかの実施形態で提供されるのは、ＡＯＰの非天然型のＤエナンチオマーを含む化合物であって、いくつかの実例では、それぞれのＬエナンチオマーと比べて、破断面での滞留時間の増加を表すことがある。このことは、例えば、他の化合物と比べると、劣化に対する耐性が高まったことによることがある。いくつかの実施形態では、滞留時間が増加したことは、手術の標的部位（例えば、骨折部位）で治療有効濃度を維持するために、治療薬の再投与を必要とする頻度に影響を与える。いくつかの実施形態では、滞留時間が増加したことは、標的反応（例えば、治療反応）を誘発するために再投与する必要がある治療薬の量に影響を与える。いくつかの実施形態では、例えば、干渉が減少、または存在しないことにより）直鎖状ＡＯＰは分岐状ＡＯＰよりも優れている。

【0114】

いくつかの実施形態では、同化剤の標的送達は、（例えば、遠位部での皮下注射のような注射を介して）治療薬の骨折へ局在化させることを供給する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される化合物は、（例えば、処置を必要とする）患者に繰り返し投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される化合物は、（例えば、処置を必要とする）患者に比較的少ない量が投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される化合物は、（例えば、処置を必要とする）患者に安全量が投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される化合物は、（例えば、処置を必要とする）患者に治療量が投与される。いくつかの実施形態では、標的送達は、同化剤のドリフト（例えば、他の組織および望まない石灰化への）を最小限にする（例え、取り除けないとしても）。いくつかの実施形態では、領域における骨の成長は、比較的長時間刺激される（例えば、比較的速い結果になる）（例えば、その結果、非標的送達方法と比べて、患者が手術後により早く移動できるようになる）。

【0115】

本明細書におけるいくつかの実施形態では、式（Ｉ）

【0116】

【数2】

の構造を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩が本明細書に提供され、式中、
Ｘは骨同化剤であり、
Ｙは、存在する場合、放出型または非放出型でもよいリンカーであり、および、
Ｚは骨指向性リガンドである。

【0117】

Ｚは、任意の適切な骨指向性リガンドであってもよい。いくつかの実施形態では、骨指向性リガンドには、骨、例えば、ハイドロキシアパタイトへの類似性が存在する。いくつかの実施形態では、骨指向性リガンドは、化合物（または、その誘導体もしくはフラグメント）を骨（例えば、治癒する）に方向づけることに役立つ。いくつかの実施形態では、骨指向性リガンドには、骨折または他の骨の損傷に骨同化剤を標的にする可能性がある。いくつかの実施形態では、骨指向性リガンドは、ハイドロキシアパタイトへの類似性を有するリガンドである。いくつかの実施形態では、骨指向性リガンドは、ラネレート、ビスホスホネート（例えば、アレンドロネート）、テトラサイクリン、ポリホスフェート、酸性分子（２つ以上のカルボン酸を有する分子など）、カルシウムキレート剤、金属キレート剤あるいはＡＯＰである。いくつかの実施形態では、骨指向性リガンドはＡＯＰである。いくつかの実施形態では、骨指向性リガンドは、モノビスホスホネート、トリビスホスホネートおよびポリビスホスホネートからなる群から選択されるビスホスホネートである。

【0118】

いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４（例えば、４以上、１０以上、２０以上、３０以上、５０以上、７５以上、または１００以上）のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは高々１００（例えば、１００以下、７５以下、５０以下、３０以下、２０以下、１０以下、または４以下）のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４、および高々３０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４、および高々２０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＡＯＰは、約４～約２０（４～約２０、または約４～２０など）のアミノ酸残基、あるいは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０などのより多くのアミノ酸残基を含む。様々な実施例では、ＡＯＰは、２０のアミノ酸残基などの約２０のアミノ酸残基を含む。他の実施形態では、ＡＯＰは、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、あるいは１００ものアミノ酸残基のような２０を超えるアミノ酸残基を含むことができる。

【0119】

いくつかの実施形態では、アミノ酸は、アスパラギン酸（文字Ｄによって表される）、グルタミン酸（文字Ｅによって表される）、またはその混合物であり得る。アミノ酸残基には、Ｄキラリティ、Ｌキラリティ、またはその混合物があり得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基にはＤキラリティがある。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基には、Ｌキラリティがある。いくつかの実施形態では、アスパラギン酸はＤアスパラギン酸またはＬ－アスパラギン酸である。いくつかの実施形態では、グルタミン酸はＤ－グルタミン酸またはＬ－グルタミン酸である。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４および高々２０のＤ－グルタミン酸残基またはＬ－グルタミン酸残基を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは少なくとも４および高々２０のＤ－グルタミン酸残基またはＬ－アスパラギン酸残基を含む。

【0120】

いくつかの実施形態では、ＡＯＰは、（例えば、ＡＯＰが骨指向性リガンドとして有効に機能することを条件として）１つ以上の中性または塩基性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＡＯＰは、１つ以上の合成アミノ酸（例えば、酸性、中性、または塩基性であり得る）を含む。

【0121】

いくつかの実施形態では、ＡＯＰは、リニア（直鎖）または分岐（分岐鎖）である。直鎖は、様々な実施例の中で使用される。いくつかの実施形態では、ＡＯＰは環化することができる。

【0122】

骨指向性リガンド（Ｚ）は、単一ユニット、ポリマー、デンドリマーあるいは複合ユニットであり得る。いくつかの実施形態では、骨指向性リガンドはポリマーである。いくつかの実施形態では、同化剤は環状である。いくつかの実施形態では、同化剤は環状ペプチドである。いくつかの実例では、環状ペプチドは、鎖状に連結した２つ以上のアミノ酸からなる化合物（または、そのラジカル）であり、化合物の２つの部分が結合して複素環式（例えば、ペプチド）分子を形成する。環状ペプチドの例には、構造体（１０１）および（１０２）（例えば、図１Ａおよび１Ｂを参照）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0123】

いくつかの実施形態では、Ｘは任意の適切な骨同化剤である。いくつかの実施形態では、骨同化剤は中性、アニオン性、カチオン性、または疎水性である。いくつかの実施形態では、骨同化剤は、オリゴペプチド（例えば、１０、９、８、７、６、５または４のアミノ酸残基などの約１０未満（または１０未満）のアミノ酸残基）である。いくつかの実施形態では、骨同化剤は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０アミノ酸残基などの約１０以上（または１０超）のアミノ酸残基を含む。

【0124】

同化剤の例は、アバロパラチド（配列番号２）、配列番号５（例えば、膵島のβ細胞によって分泌される３４残基のペプチドホルモンは、プロインスリン様成長因子ＩＩ（ｐｒｏ－ＩＧＦ－ＩＩ）のＥペプチドのＡｓｐ６９－Ｌｅｕ１０２に対応する）、配列番号７（例えば、１０のグルタミン酸残基と結合したＩＴＧＡ（ＩＴＧＡ５））、配列番号６（１０のグルタミン酸残基との複合体）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）（配列番号１）、または骨同化活性を有する前述のいずれかの誘導体（例えば、挿入、欠失、自然発生のアミノ酸または非自然発生のアミノ酸との置換など、１つ以上のアミノ酸変異）、または骨同化活性を有する前述のいずれかのフラグメントを含むが、これらに限定されない。

【0125】

いくつかの実施形態では、例えばＤ２０などのＤ＃という名称が後に続く骨同化剤は、骨同化剤が骨指向性リガンド（例えば、２０のアスパラギン酸残基を有する骨指向性リガンドなど）に付着（または、Ｎ末端またはＣ末端などで結合または接続）されていることを示す。いくつかの実施形態では、骨同化剤の後に、例えばＥ２０などのＥ＃という名称が続く骨同化剤は、骨同化剤が骨指向性リガンド（例えば、２０のグルタミン酸残基を有する骨指向性リガンドなど）に付着（またはＮ末端またはＣ末端などで結合または接続）されていることを示す。

【0126】

いくつかの実施形態では、配列番号１はＡＶＳＥＨＱＬＬＨＤＫＧＫＳＩＱＤＬＲＲＲＦＦＬＨＨＬＩＡＥＩＨＴＡＥＩＲＡＴＳＥＶＳＰＮＳＫＰＳＰＮＴＫＮＨＰＶＲＦＧＳＤＤＥＧＲＹＬＴＱ ＥＴＮＫＶＥＴＹＫＥ ＱＰＬＫＴＰである。

【0127】

いくつかの実施形態では配列番号２はＡＶＳＥＨＱＬＬＨＤＫＧＫＳＩＱＤＬＲＲＲＥＬＬＥＫＬＬｘＫＬＨＴＡであり、ここでｘはα－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）－である。
いくつかの実施形態では、配列番号２のＣ末端は、アミド化されている。いくつかの実施形態では、配列番号２は、ＡＶＳＥＨＱＬＬＨＤＫＧＫＳＩＱＤＬＲＲＲＥＬＬＥＫＬＬｘＫＬＨＴＡであり、ここでｘはＡｉｂであり、Ｃ末端はアミド化されている。

【0128】

いくつかの実施形態では、配列番号１５は、ＡＶＳＥＨＱＬＬＨＤＫＧＫＳＩＱＤＬＲＥＬＬＥＫＬＬｘＫＬＨＴＡＥＩＲＡＴＳＥＶＳＰＮＳであり、ここでｘはＡｉｂである。いくつかの実施形態では、配列番号３は、「ｅ」がＤ－グルタミン酸（例えば、配列番号３）を意味する「ｅｅｅｅｅｅｅｅｅｅ」をさらに含む。いくつかの実施形態では、「ＥＥＥＥＥＥＥＥＥ」は、配列番号１５の末尾に付加されて、配列番号１４を得ることができ、ここで「Ｅ」は、Ｌ－グルタミン酸を示す。

【0129】

いくつかの実施形態では、配列番号４は、ＡＶＳＥＨＱＬＬＨＤＫＧＫＳＩＱＤＬＲＲＲＥＬＬＥＫＬＬｘＫＬＨＴＡＥＩＲＡＴＳＥＶＳＰＮＳｅｅｅｅｅｅｅｅｅｅｅｅｅｅｅｅｅｅｅｅｅであり、ここで、ｘはＡｉｂである。いくつかの実施形態では、「Ｅ」はＤ－グルタミン酸を示す（例えば、「ｅ」はＬ－グルタミン酸を示し、一方、「ｅ」はＤ－グルタミン酸を示す）。いくつかの実施形態では、配列番号４は、ＡＶＳＥＨＱＬＬＨＤＫＧＫＳＩＱＤＬＲＲＲＥＬＬＥＫＬＬｘＫＬＨＴＡＥＩＲＡＴＳＥＶＳＰＮＳｅｅｅｅｅｅｅｅｅｅｅｅｅであり、ここでｘはＡｉｂであり、「ｅ」はＤ－グルタミン酸を示す。

【0130】

いくつかの実施形態では、化合物は、配列番号３に対して少なくとも７５％以上の配列同一性、少なくとも８５％以上の配列同一性、少なくとも９０％以上の配列同一性、または少なくとも９５％以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、化合物は、配列番号４に対して少なくとも７５％以上の配列同一性、少なくとも８５％以上の配列同一性、少なくとも９０％以上の配列同一性、または少なくとも９５％以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、化合物は、配列番号１４に対して少なくとも７５％以上の配列同一性、少なくとも８５％以上の配列同一性、少なくとも９０％以上の配列同一性、または少なくとも９５％以上の配列同一性を有する。

【0131】

式（Ｉ）のいくつかの実施形態では、Ｙは、非放出型リンカーである。いくつかの実施形態では、Ｙは、少なくとも１つの炭素－炭素結合および／または少なくとも１つのアミド結合を含む非放出型リンカーである。いくつかの実施形態では、Ｙは放出型リンカーである。いくつかの実施形態では、Ｙは、少なくとも１つのジスルフィド（Ｓ－Ｓ）、エステル（例えば、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－）、および／またはプロテアーゼ特異的アミド結合を含有する放出型リンカーである。

【0132】

いくつかの実施形態では、標的分子（すなわち、骨指向性リガンド）は、化合物がインビボで治療的に有効であるために、薬剤／同化剤から切断しない。このことは、骨折部位または他の標的部位への化合物の標的送達より前に、同化剤の無視できる量（もしあれば）だけが（例えば、全身に）放出されるため、骨指向性リガンドおよび同化剤を含む組成物の使用することを可能にするので、利点であり得る。いくつかの実施形態では、活性成分の放出特性を変えることは、有効な医薬組成物の調製において向困難な側面がある。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される非放出型リンカーを含む化合物は、（例えば、放出のタイミングを合わせる必要性を取り除くことによって）有効な医薬組成物の調製の困難さを回避する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される化合物の同化剤は、結合（例えば、骨指向性リガンドに複合）したときに活性である。したがって、いくつかの実施形態では、非放出型リンカー（例えば、Ｙ）と複合した標的分子（例えば、Ｚ）を含む化合物は、それに連結した同化剤（Ｘ）の全身曝露および／または全身的副作用を低減できる。

【0133】

いくつかの実施形態では、非放出型リンカーを含むコンジュゲートは、コンジュゲートから遊離形態（例えば、本明細書に提供される化合物および／またはリガンドの遊離形態）で放出される成分の毒性を低減または除去する。

【0134】

放出型および非放出型リンカーは、ＰＥＧ化および同類のものなどを通じて、当該技術分野で一般的に知られている方法論または以下に発展される方法論に従って、生体内分布、生体利用性、および（例えば、化合物の）ＰＫ／ＰＤを最適化すること、ならびに／あるいは標的組織への取り込み（例えば、化合物の）を増加させるように設計することができる。リンカーはさらに、当技術分野で公知の概念に従って、分子標的（例えば、標的が細胞内であるか細胞外であるか）を考慮して設計することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞（例えば、骨細胞）による捕捉の前に、循環中の薬学的に活性な量の同化剤の著しい放出を回避するように構成される。

【0135】

いくつかの実施形態では、リンカーは、（例えば、特定の放出時間を促進するため、標的組織への取り込みの増加を促進するため、ならびに／あるいは化合物の生体内分布、生体利用性、および／またはＰＫ／ＰＤを最適化するための）１以上のスペーサーを含み得る。スペーサーは、アルキル鎖、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ペプチド、糖、ペプチドグリカン、クリッカブルリンカー（例えば、トリアゾール）、ポリプロリンおよびポリピペリジンなどのリジッドリンカー、および同様のもののうちの１つ以上を含むことができる。

【0136】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される化合物の１つ以上のリンカーは、ＰＥＧ、ＰＥＧ誘導体、または本明細書に説明される目的を達成できる当技術分野で既知の、もしくは以下で発展される他の任意のリンカーを含むことができる。いくつかの実施形態では、リンカーはｎ回繰り返され、ここで、ｎは正の整数である。

【0137】

コンジュゲートは、固相ペプチド合成など、当技術分野で既知であり、かつ本明細書で例示される方法に従って合成されることができる。

【0138】

医薬組成物
本明細書に記載の化合物は、単独で投与することができるか、または化合物もしくは化合物と１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物として製剤化することができる。本明細書で使用する場合、用語「組成物」は、一般に、本明細書に記載の化合物を含む、１つ以上の成分を含む任意の産物を指す。本明細書に記載の組成物は、単離された化合物から、または化合物の塩、溶液、水和物、溶媒和物、および他の形態から調製できることが理解されよう。ヒドロキシ基、アミノ基、および同様の基などの特定の官能基は、化合物の様々な物理的形態において、水および／または様々な溶媒と錯体を形成し得る。また、組成物は、化合物の様々な非晶質、晶質、部分結晶、結晶、および／または他の形態学的形態から調製することができ、ならびに、組成物は、化合物の様々な水和物および／または溶媒和物から調製することができることが理解されよう。したがって、化合物を記載するそのような医薬組成物は、化合物の様々な形態学的形態および／または溶媒和物もしくは水和物の形態のそれぞれか、その任意の組合せか、あるいは個々の形態を含む。

【0139】

一実施形態は、式（Ｉ）の化合物もしくはそのような式によってカバーされる任意の化合物、またはその薬学的に許容される塩、および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。

【0140】

一実施形態は、治療（または予防）有効量の式（Ｉ）の化合物またはそのような式によってカバーされる任意の化合物、またはその薬学的に許容される塩、および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。

【0141】

本明細書におけるいくつかの実施形態で提供されるのは、必要とする患者に治療有効量で投与（例えば、皮下投与）することができる、本明細書で提供される任意の化合物を含む医薬組成物である。様々な実施形態において、組成物は、皮下注射に適した組成物などの注射用組成物である。

【0142】

本明細書に記載の化合物および／または組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤、賦形剤、および／またはビヒクル、ならびにそれらの組合せを含む単位剤形および／または組成物で投与することができる。

【0143】

本明細書で使用される場合、用語「投与すること」は、一般に、経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、吸入、頬、眼、舌下、膣、直腸、および同様の投与経路によるものを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の化合物を宿主である対象者に導入する任意の全ての手段を指す。

【0144】

塩としての化合物の投与は適切であり得る。許容される塩の例は、限定されないが、アルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム、もしくはリチウム）またはアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）塩を含むが、一般的に無毒かつ処置される対象に投与される場合に有効である任意の塩が許容可能である。少なくとも１つの実施形態では、塩は、酢酸アンモニウム塩であり得る。同様に、「薬学的に許容される塩」は、薬剤に使用され得る対イオンを有するそれらの塩を指す。このような塩としては、限定されないが、（１）塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸、硫酸、過塩素酸、および同類のものなどの無機酸、または酢酸、シュウ酸、（Ｄ）もしくは（Ｌ）リンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、マロン酸、および同類のもの有機酸との親化合物の遊離塩基の反応により得ることができる酸付加塩類、あるいは（２）親化合物に存在する酸性プロトンが、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、もしくはアルミニウムイオンなどの金属イオンで置換されるか、またはエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トリメタミン、Ｎ－メチルグルカミン、および同類のものなどの有機塩基で配位される（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）場合に形成される塩を含み得る。薬学的に許容される塩は当業者によく周知であり、そのような任意の薬学的に許容される塩が企図される。

【0145】

許容される塩は、十分に酸性な化合物を適切な塩基と反応させ、生理学的に許容されるアニオンを与えることを含む（限定されない）、当技術分野で既知の標準的な手順を使用して得ることができる。適切な酸付加塩は、非毒性塩を形成する酸から形成される。非限定的ではあるが、例示的な例は、アセテート、アスパルテート、ベンゾエート、ベシレート、バイカーボネート／カーボネート、ビスサルフェート／サルフェート、ボレート、カムシレート、シトレート、エディシレート、エシリレート、フォーメート、フマレート、グルセプテート、グルコネート、グルクロン酸、ヘキサフルオロホスファート、ヒベンゼート、塩酸塩／塩化物、臭化水素酸塩／臭化物、ヒドロヨージド／ヨウ化物、イセチオネート、ラクテート、リンゴ酸、マレイン酸、メシレート、メチルサルフェート、ナフチレート、２－ナプシレート、ニコチネート、ナイトレート、オロテート、オキサレート、パルミテート、パモアート、リン酸／水素リン酸／二水素リン酸、サッカレート、ステアレート、コハク酸、タートレート、トシレートおよびトリフルオロ酢酸の塩を含む。本明細書に記載の化合物の好適な塩基塩は、非毒性塩を形成する塩基から形成される。非限定的ではあるが、例示的な例は、アルギニン、ベンザチン、カルシウム、コリン、ジエチルアミン、ジオラミン、グリシン、リジン、マグネシウム、メグルミン、オラミン、カリウム、ナトリウム、トロメタミンおよび亜鉛の塩を含む。また、例えばヘミスルフェート塩やヘミカリウム塩などの、酸および塩基のヘミ塩が形成すれ得る。

【0146】

化合物は、選択された投与の経路に適合した様々な形態で、医薬組成物として製剤化され、ヒト患者などの哺乳類宿主に投与することができる。例えば、医薬組成物は、骨内、静脈内、動脈内、腹腔内、頭蓋内、筋肉内、局所、吸入および／または皮下経路のために処方され、かつこれらを介して投与され得る。少なくとも１つの実施形態では、化合物および／または組成物は、損なわれた骨組織の空洞欠陥に、および／または骨折部位に直接（注射、配置、またはその他の方法を介して）投与され得る。少なくとも１つの実施形態では、化合物は、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体のような薬学的に許容されるビヒクルとの組合せで全身投与することができる。経口治療投与の場合、活性化合物は、１つ以上の賦形剤と組合せて、摂取可能な錠剤、頬錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハース、および同類のものなどの形態で使用することができる。組成物および調製物の割合は様々であり、活性成分（複数可）と結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、および／または甘味剤（当技術分野で知られるように）の約１～約９９重量％の間であってもよい。このような、治療に役立つ組成物における活性化合物の量は、有効な投与量が得られるような量である。

【0147】

無菌条件下での非経口用化合物／組成物の調製は、例えば凍結乾燥によって、当業者に周知の標準的な薬学的技術を使用して容易に達成することができる。少なくとも１つの実施形態では、非経口用組成物の調製に使用される化合物の溶解度は、溶解度促進剤の組み込みなどの適切な製剤技術の使用によって高めることができる。

【0148】

前述のとおり、化合物／組成物はまた、注入または注射（例えば、針（マイクロニードルを含む）注射器および／または無針注射器を使用して）を介して投与することができる。活性組成物の溶液は、水性であり、任意選択で非毒性界面活性剤と混合され、ならびに／あるいは塩、炭水化物および緩衝剤などの担体または賦形剤を含むことができるが（好ましくは、３～９のｐＨで）、いくつかの用途では、滅菌非水性溶液として、または滅菌、パイロゲンフリー水またはリン酸緩衝食塩水のような適したビークルと組合せて使用する乾燥形態として、より適切に処方することができる。例えば、分散液は、グリセロール、液体ＰＥＧ、トリアセチン、およびそれらの混合物中、および油中で調製することができる。通常の保管および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存剤をさらに含むことができる。

【0149】

注射又は注入に適した医薬剤形は、無菌の注射用もしくは注入用の溶液または分散液の即席の調製に適合された活性成分を含む無菌の水性溶液もしくは分散液または無菌粉末を任意選択でリポソームにカプセル化された状態で、含み得る。すべての場合において、最終的な剤形は、無菌であり、流動性があり、および製造もしくは保存の条件下で安定である必要がある。液体担体またはビヒクルは、例えば、限定するものではないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ＰＥＧ（ｓ）等）、植物油、非毒性グリセリルエステル、および／またはそれらの適切な混合物を含む溶媒もしくは液体分散媒体であり得る。少なくとも１つの実施形態では、適切な流動性は、リポソームの形成によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、または界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の活動は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、および同様のものなどの様々な抗菌剤および抗真菌剤の添加によって防止することができる。ある場合には、糖類、緩衝剤、塩化ナトリウムなどの１つ以上の等張剤を含むことが望ましい。注射可能な組成物の長時間の吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような、吸収を遅延させるように配合された薬剤の組み込みによって引き起こされ得る。

【0150】

無菌の注射可能または注入可能な溶液は、活性化合物および／または組成物を必要な量の適切な溶媒に、必要に応じて上記の他の成分の１つ以上を組み入れ、次いでフィルター滅菌を行うことによって調製することができる。無菌注射液の調製に用いる無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥と凍結乾燥であり、これにより、有効成分の粉末と、事前に無菌ろ過した溶液中に存在する追加の所望の成分が得られる。

【0151】

局所投与のために、化合物を、固体、液体、またはゲルマトリックスであり得る許容される担体と組合せた組成物または製剤として骨に投与することが望ましいことがある。例えば、特定の実施形態では、有用な液体担体は、水、アルコールもしくはグリコール、または水－アルコール／グリコールブレンドを含むことができ、その中で化合物は、任意選択で、非毒性の界面活性剤と共に、有効なレベルで溶解または分散することができる。追加として、または代替として、抗菌剤などのアジュバントは、所定の用途に応じて最適な特性を最適化するために、追加することができる。結果として得た液体組成物は、吸収パッドから塗布したり、絆創膏および／または他の包帯に含浸させるために使用したり、ポンプ型またはエアロゾルスプレーヤーを使用して標的領域に噴霧したり、あるいは被験者の所望の領域（例えば、骨折部位）に単に直接塗布したりすることができる。

【0152】

合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩、脂肪酸エステル、脂肪アルコール、変性セルロースまたは変性鉱物質などの増粘剤も、被験者の皮膚に直接適用するために、広げやすいペースト、ゲル、軟膏、石鹸、および同類のものを形成する液体担体と共に採用することができる。

【0153】

本明細書で使用する時、用語「治療有効量」とは、（特に別段の記載がない限り）１回または治療サイクルの過程で投与した場合に、被験者の健康、幸福または死亡率に影響を与える（例えば、限定はしないが、骨折の治癒もしくは骨の成長を支持または促進させる）化合物の量を意味する。

【0154】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される任意の化合物または医薬組成物の治療有効量は、当技術分野で既知の方法（例えば、動物モデル、ヒトデータ、および同様の薬理活性を示す化合物のヒトデータ）に従い決定される。化合物の有用な投与量は、それらのインビトロ活性と動物モデルにおけるインビボ活性を比較することによって決定することができる。マウスおよび他の動物における有効な投与量をヒトに外挿する方法は、当技術分野で既知である。実際に、化合物の投与量は、宿主被験者の状態、処置される骨折、化合物の投与経路と、組織分布、ならびに他の治療法の共用（例えば、成長因子、幹細胞、天然移植片、生物学ベース、および合成ベースの組織工学的足場のようなものなど、骨の成長を促進する他の注射組成物の投与、ハードウェア移植、および／または超音波治療などとの併用で、ならびに／あるいは、例えば、インスリンのような他の治療薬の投与との併用で）の可能性に依存して相当に変化する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される任意の化合物または医薬組成物の治療有効量は、例えば、式（Ｉ）のＸの効能（例えば、採用する同化剤のタイプ）、体重、投与の様式（例えば、皮下に）、処置される疾患または状態、疾患または状態その重症度、あるいは、それらの任意の組合せを考慮することによって決定する。治療における使用に必要な組成物の量（例えば、治療有効量または用量）は、特定の用途だけでなく、選択された塩（該当する場合）および被験者の特性（例えば、年齢、状態、性別、被験者の体表面積および／または質量、薬剤に対する耐性など）により異なり、最終的に、主治医、臨床医またはその他の裁量によるであろう。

【0155】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される任意の化合物または医薬組成物の治療有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から約１，０００ｍｇ／ｋｇ／日までである。例えば、治療有効量または用量は、患者体重１ｋｇにつき約０．０５ｍｇから患者体重１ｋｇにつき約３０．０ｍｇ、または患者体重１ｋｇにつき約０．０１ｍｇから患者体重１ｋｇにつき約５．０ｍｇにまで及び、これらは、患者体重１ｋｇにつき０．０１ｍｇ、０．０２ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、３．０ｍｇ、４．５ｍｇ、および５．０ｍｇを含むが、これらに限定されない。静脈内投与量は、数桁低くなり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される任意の化合物または医薬組成物の治療有効量は、毎日、毎週、隔週、毎月、または隔月に投与される（例えば、皮下に）。

【0156】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される任意の化合物または医薬組成物は、治療有効量が、１～８００回の投薬で投与される。特定の実施形態では、治療有効量の化合物または医薬組成物は、患者体重１ｋｇにつき０．０１ｍｇから患者体重１ｋｇにつき１ｍｇ、またはその間の化合物の濃度を有する。

【0157】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される任意の化合物または医薬組成物（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４など）の（例えば、個体に投与される）治療有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から約１，０００ｍｇ／ｋｇ／日までである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される任意の化合物または医薬組成物（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４など）の治療有効量（例えば、個体に投与）は、約１μｇ／投与から約１０ｍｇ／投与である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される任意の化合物または医薬組成物（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４など）の治療有効量（例えば、個体に投与）は、約５０μｇ／投与～約５ｍｇ／投与である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される任意の化合物または医薬組成物（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４など）の（例えば、個体に投与）治療有効量は、約０．０１ｎｍｏｌ／ｋｇ／投与～約１０ｎｇ／ｋｇ／投与である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される任意の化合物または医薬組成物（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４など）の治療的有効量（例えば、個体に投与）は、約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ／投与～約５ｎｇ／ｋｇ／投与である。

【0158】

化合物の治療有効な総量は、単回投与または分割投与で投与することができ、医師の裁量で、本明細書に与えられる一般的な範囲から外れてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される任意の化合物または医薬組成物は、週に１回または２回治療有効量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される任意の化合物または薬学的組成物は、週に１回治療有効量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される任意の化合物または医薬組成物は、週に２回治療有効量で投与される。

【0159】

有効量のコンジュゲートを含む医薬組成物などの、有効量のＸ－Ｙ－Ｚコンジュゲートは、任意の適切な経路によって投与することができる。適切な経路の例は、皮下注射などの注射によるものである。適切な経路の他の例は、非経口および経腸である。

【0160】

処置の方法
本明細書におけるいくつかの実施形態では提供されるのは、提供される化合物および／または組成物を使用して（例えば、それを必要とする個体における）骨折を処置する方法である。化合物、組成物および方法は、化合物または組成物内に存在する同化剤の標的外効果を防止するために、骨折部位を（例えば、選択的に）標的とする戦略を活用し得る。

【0161】

いくつかの実施形態では、患者（例えば、それを必要とする）の骨折を処置する方法は、治療有効量の化合物（例えば、式（Ｉ）の構造を有する）または本明細書に提供される医薬組成物を患者に投与する（例えば、皮下）ことを含み、それにより患者の骨折を処置する。いくつかの実施形態では、治療有効量の本明細書で提供される化合物または医薬組成物の投与は、投与後２～３週間以内に、患者の疼痛の軽減をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される化合物または医薬組成物は、治療有効量で投与されてから３週間以内に患者の疼痛の軽減をもたらす。いくつかの実施形態では、患者（例えば、それを必要としている）は、骨折を起こしやすい。例えば、患者は、糖尿病、骨粗しょう症、顎顔面損傷（例えば、顎顔面骨折）、顎顔面欠乏、および顎顔面欠損からなる群から選択される１つ以上の併存症を有し得る。

【0162】

患者（例えば、それを必要としている）における骨の成長を促進するための方法も提供される。いくつかの実施形態では、そのような方法は、本明細書で提供される治療有効量の化合物（例えば、式（Ｉ）の構造を有する）または医薬組成物を患者に投与する（例えば、皮下に）ことを含み、それによって、治療前と比較して患者の骨の骨ミネラル密度が増加する。いくつかの実施形態では、骨における骨ミネラル密度の増加は骨折部位で生じる。いくつかの実施形態では、骨における骨ミネラル密度の増加は、投与ステップの前に骨に存在する１つ以上の吸収窩（例えば、患者が骨粗しょう症を患っている場所）で起こる。

【0163】

いくつかの実施形態では、患者は、糖尿病を患っている。いくつかの実施形態では、患者は糖尿病を患い、Ｘは、アバロパラチド（配列番号２）、配列番号７、配列番号８（グルタミン酸残基１０のコンジュゲート）、骨同化活性を有するその誘導体（例えば、自然発生のアミノ酸または非自然発生のアミノ酸との挿入、欠失、置換などの１つ以上のアミノ酸変異）、または骨同化活性を有するそのフラグメントである。

【0164】

いくつかの実施形態では、患者は骨粗しょう症である。いくつかの実施形態では、患者は骨粗しょう症を患い、式（Ｉ）のＸは、副甲状腺ホルモン、骨同化活性を有するその誘導体（例えば、天然由来のアミノ酸または非天然由来のアミノ酸との挿入、欠失、置換などの１以上のアミノ酸変異）、または骨同化活性を有するそのフラグメントである。

【0165】

いくつかの実施形態では、患者は、例えば、マイクロプレートで安定される下顎骨骨切りなどの顎顔面損傷（すなわち、顎顔面骨折）を患う。患者は、骨移植片（例えば、オッセオインテグレーション）、補綴インプラント（例えば、プレート、ネジ、および／またはオッセオインテグレーション）、または医師により誘発される骨の欠損（例えば、下顎骨骨切り、頭蓋欠損、または移植片の欠損）が含まれる欠損を患うことがある。いくつかの実施形態では、患者は、顎顔面欠損を患う。

【0166】

いくつかの実施形態では、方法は、骨の骨折（例えば、疼痛止め、骨移植片、インプラント（例えば、メッシュ）、成長ホルモン、および同様のもの）、または患者の１つ以上の併存疾患を処置するための第２の治療を患者に施すことをさらに含み得る。患者が少なくとも糖尿病を患ういくつかの実施形態では、第２の治療を施すことは、インスリンを治療有効量で患者に投与することを含み得る。患者が少なくとも骨の骨折を患っているいくつかの実施形態では、第２の治療を施すことは、骨の骨折部位にハードウェア（例えば、メッシュまたはピン）、または１つ以上の治療化合物を移植することを含み得る。

【0167】

図２Ａに示すように、いくつかの実施形態では、投与される場合、本明細書で提供される特定の化合物の標的リガンド（例えば、式（Ｉ）のＺがヒドロキシアパタイトの標的リガンドを含む）は、大腿骨骨折部位において異なる特異性で蓄積され得る（図２Ｂを参照）。いくつかの実施形態では、テトラサイクリン、モノビスホスホネート、ポリホスフェート、および^１２５Ｉ－チロシンで標識され、かつ骨折持ちマウスに静脈内注射された（Ｌ）Ａｓｐ８（８個のＬ－アスパラギン酸からなる酸性オリゴペプチド）は、大腿骨骨折部位に異なる特異性で蓄積する（図２Ｂ）。いくつかの実施形態では、骨折した大腿骨の、健常な大腿骨に対する^１２５Ｉ－標識テトラサイクリンの選択比率は２．６であり、このことは、骨格全体の代わりに、主に骨折部位で同化作用を引き出す薬剤の開発を支持するので重要である。

【0168】

いくつかの実例では、骨折対健常の比率は、テトラサイクリンリガンド（式（Ｉ）のＺ）がアレンドロネート、ポリホスフェート、および／または酸性オクタ－アスパラギン酸に交換されるに従って、連続的に増加する。いくつかの実施態様では、オクタ－アスパラギン酸は、健康な骨よりも骨折した骨に対して、最高の特異性（例えば、試験したリガンドにおける）を有し、選択比率は１１．２である。いくつかの実施態様では、テトラサイクリンは、健康な骨よりも骨折した骨に対して、選択比率が最も高い特異性（例えば、式（Ｉ）のＺについて試験したリガンドにおいて）を有する。

【0169】

いくつかの実例では、モノ－ビスホスホネートおよびポリホスフェートは、骨折した骨に対する特異性の低下を示す。いくつかの実施態様では、モノビスホスホネートおよびポリホスフェートペプチド標的能力は、より特異的な骨指向性リガンドと比較される。いくつかの実施態様では、ＰＴＨｒＰ（配列番号１）のＮ末端３４アミノ酸を^１２５Ｉで標識し、モノビスホスホネート（例えば、アレンドロネート）、トリビスホスホネート（例えば、中央ハブに結合した３つのアレンドロネートから構成される（図１２））、ポリホスフェート（例えば、無水物結合によって接続された４５個のリン酸からなる）、またはデカアスパラギン酸（例えば、本明細書に記載のオクタアスパラギン酸と同様である）にテザーされる。例えば、標的配列番号１の生体内分布は、組織対パーセント注射量／ｇのグラフである図３Ａに示される。

【0170】

いくつかの実例では、標的リガンド（例えば、式（Ｉ）のＺ）としてのモノビスホスホネート（例えば、アレンドロネート）は、ある量の（例えば、中程度の）^１２５Ｉ－配列番号１（１－３４）を骨折部位に送達することを可能にする。いくつかの実施態様では、標的リガンド（例えば、式（Ｉ）のＺ）としてのモノビスホスホネート（例えば、アレンドロネート）は、健康な骨よりも骨折した骨に対して約２：１の特異性を有する（図３Ｃ）。本明細書のいくつかの実例では、例えば図３Ｃ（例えば、コンジュゲート対骨折した／健康な大腿骨比のグラフ）のように、本明細書に記載の化合物又は組成物（例えば、配列番号１）で標的化された骨折カルスと反対側の健康大腿骨との選択性の比が挙げられる。

【0171】

本明細書におけるいくつかの実例では、１つ以上のアレンドロネート（例えば、少なくとも１つのアレンドロネート、少なくとも２つのアレンドロネート、少なくとも３つのアレンドロネート、またはそれ以上）を含む化合物（例えば、リガンド）が提供される。いくつかの実例では、本明細書で提供される化合物（例えば、３つのアレンドロネートを含む）は、骨折への標的化を減衰させる。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される化合物（例えば、ポリホスフェート）は、^１２５Ｉ－配列番号１（１～３４）の骨折表面への送達が最小限である（例えば、注入された薬物の１．５５％のみが２４時間後に骨折表面に存在する）。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される化合物（例えば、ＡＯＰ（例えば、１０個のアスパラギン酸から構成される））は、骨折した骨への（例えば、高い）特異的送達（例えば、モノビスホスホネートよりも骨折に対する特異性および骨折における蓄積性が３．５倍高い（図３Ｂ））を有する。本明細書におけるいくつかの実施態様では、例えば図３Ｂ（例えば、コンジュゲート対パーセント注射量／ｇのグラフ）など、骨折における、標的化合物（例えば、配列番号１）および遊離化合物（例えば、配列番号１）の骨折の蓄積（例えば、注入後２４時間のマウスの大腿骨）が提供される。

【0172】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載のＡＯＰは、本明細書に記載の付属する同化ペプチド（例えば、式（Ｉ）のＸ）を骨折表面に送達する。いくつかの実施態様では、（１）ペイロードの化学的特性、（２）ＡＯＰ側鎖構造、（３）ＡＯＰ長、（４）ＡＯＰ分岐、および／または（５）ＡＯＰ安定性が、付属する同化ペプチドを骨折表面に送達するＡＯＰの能力に影響を与える。

【0173】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の治療用ペイロードの特性（例えば、サイズ、電荷、および疎水性）は、骨折部位に（例えば、活性薬剤；例えば、式（Ｉ）のＸ）を濃縮するために付属するＡＯＰに影響を与えることがある。いくつかの実例では、ＣＫ２．３（例えば、正味電荷が＋５のカチオン性ペプチド）、オステオポンチン由来ペプチド（ＯＤＰ）（例えば、正味電荷が－３のアニオン性ペプチド）、または化学伝達隠蔽ペプチド（ＣＴＣ）（例えば、正味電荷が０の中性ペプチド）は、治療用ペイロードである。いくつかの実施態様では、Ｐ４（例えば、疎水性指標（ＧＲＡＶＹ）が０．４９である疎水性ペプチド）は、治療用ペイロードである。いくつかの実施態様では、Ｆ１０９（例えば、９アミノ酸の鎖長を有する）またはカゼインキナーゼ２．３ペプチド（ＣＫ２．３）（例えば、３９および３０アミノ酸の鎖長を有する）である。いくつかの実施態様では、治療用ペイロードは、表１に提供される。いくつかの実例では、骨同化ペプチドは、Ｌ－Ａｓｐ１０に結合し、ヨードゲン^１２５Ｉで放射性標識される（例えば、大腿骨の骨折したマウスに注射し、組織生体内分布の評価の前に１８時間循環させられる）。

【0174】

【表1】

【0175】

本明細書に提供されるのは、骨折後１０日の大腿骨中節骨折（ｍｉｄｓｈａｆｔ ｆｅｍｕｒ ｆｒａｃｔｕｒｅｓ）を有するＮＤ－４ Ｓｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（ｎ＝６）への（Ｌ）Ａｓｐ_１０に結合した６種類の異なる放射性ヨウ素化ペイロードの注入２４時間後の生体分布を示す組織対注射量パーセント／ｇのグラフである（例えば、図４）。いくつかの実例では、ペプチドの化学的特性は、Ｌ－Ａｓｐ_１０の、骨折表面にペプチドを標的にする能力にほとんど影響を及ぼさなかった（図４参照）。いくつかの実例では、３９アミノ酸のＰＡＣＡＰは、骨折の標的性において他の同化ペプチドとは多少異なっていた。いくつかの実例では、ペイロードサイズも他の主要な化学的／物理的変数も、ＡＯＰを介した骨ターゲティングに対して整合性がある影響を及ぼさなかった（例えば、同様の長さのペプチド（ＣＫ２．３）は、骨折蓄積の減少を示さなかったため）。いくつかの実例では、他の同化作用のあるカーゴも同様にターゲティングするようである（例えば、付属するＡＯＰがペプチドカーゴの生体内分布で優位になり得ることを示唆している）。

【0176】

ペプチド分岐がペイロード標的に及ぼす影響を調べるために、それぞれ５個のアスパラギン酸の２個の鎖または１０個のアスパラギン酸の単一の直鎖で構成される酸性オリゴアスパラギン酸の骨折表面にＣＫ２．３ペイロードを送達する能力が、比較された。本明細書に提供されるのは、収集した組織対パーセント注射量／ｇのグラフであり（例えば、非標的ＣＫ２．３に対する、１０（Ｌ）アスパラギン酸の分岐鎖または直鎖に結合した放射性ヨウ素化ＣＫ２．３の生体内分布を示す）（例えば、図５）。生体内分布は、骨折後１０日目の大腿骨中節骨折を負ったＮＤ－４ Ｓｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（ｎ＝５）に注入後１８時間して決定した。図５に示すように、いくつかの実例では、直鎖状ペプチドは分岐状ペプチドに比べて骨折表面への濃縮が２．７倍良好であった。さらに、非標的ＣＫ２．３は骨折部位にほとんど取り込まれなかったことから、非特異的な外傷に媒介されるＣＫ２．３の沈着が骨折部位での酸性オリゴペプチド結合体の蓄積に大きく寄与するものから除外してもよい。

【0177】

いくつかの実例では、本明細書に記載のＡＯＰの骨折表面との相互作用は、露出したカルシウムとの相互作用によって媒介される。例えば、カルシウムは、隣接するアニオン電荷が８．６Ａの距離だけ離れているときにキレートすることができる。ＡＯＰのアニオン性側鎖の長さが、負電荷間のこの分離距離を決定し得ることを認識し、側鎖カルボキシルがそれぞれ１、２および３個の炭素だけペプチド骨格から延び、オリゴペプチド側鎖のアニオン電荷間の分離が増加することを可能にしたアスパラギン酸、グルタミン酸およびアミノジピン酸の標的能力を、比較した。

【0178】

いくつかの実例では、図６は、組織対パーセント注射量／グラムのグラフを示す（例えば、非標的ＣＫ２．３に対する、１０（Ｌ）アスパラギン酸、１０（Ｌ）グルタミン酸、または１０（Ｌ）アミノアジピン酸の直鎖に結合した放射性ヨウ素化ＣＫ２．３の生体内分布を示すものである）。生体内分布は、骨折後１０日の大腿骨中節骨折を負ったＮＤ－４Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（ｎ＝５）に注射後１８時間で決定した。いくつかの実例では、デカグルタミン酸およびデカアスパラギン酸は、骨折部位で最大の取り込みを表した（例えば、非標的Ｃｋ２．３よりも６倍多い蓄積を示し、非標的Ｃｋ２．３と有意な差はないが、アミノアジピン酸が骨折保持を促進する）（図６）。いくつかの実例では、グルタミン酸またはアスパラギン酸からなるＡＯＰは、カルシウム結合に最適な電荷分離を有するペプチドを構成する（例えば、分岐ペプチドが結合を減少させることを説明する）。自然は、骨石灰化におけるカルシウム結合の機能のためにグルタミン酸を主に選択してきたいう事実と、グルタミン酸オリゴマーの合成は、アスパルタミドの不要な形成によりアスパラギン酸オリゴマーよりも、はるかに効率的であり得るという観測が繰り返されたこととにより、骨折を標的としたグルタミン酸オリゴマーの最適化に焦点を当てることを促進した。

【0179】

式（Ｉ）のＺとして採用される分子の骨折標的能力に対するオリゴペプチドの鎖長さの影響を調べるために、１０または２０アミノ酸長のオリゴグルタミン酸の、骨折した大腿骨表面に同じＣＫ２．３カーゴを送達する能力が比較された。図７は、組織対注射量パーセント／ｇのグラフであり、非標的ＣＫ２．３に対する、１０または２０（Ｌ）のグルタミン酸の直鎖に結合した放射性ヨウ素化ＣＫ２．３の生体内分布を示すものである。生体内分布は、注射後１８時間（例えば、骨折後１０日の大腿骨中節骨折を負ったＮＤ－４ Ｓｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（ｎ＝５）へ）で決定された。いくつかの実例では、長い方のオリゴグルタミン酸に繋留されたＣＫ２．３は、短い方のオリゴグルタミン酸よりも骨折部位に多く（例えば、３．３倍）蓄積される。非コンジュゲート酸性オリゴペプチドの親和性は、わずか８アミノ酸の鎖長で最大になるようであるが（例えば、Ｓｅｋｉｄｏら、“Ｎｏｖｅｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｂｏｎｅ ｕｓｉｎｇ ａｃｉｄｉｃ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ： ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，” ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３１０９／１０６１１８６０１０８９９７９２２ （２００１）を参照）、２０量体の親和性が１０量体の親和性よりも増加したことが観察されたが、その理由は、骨折表面でＣＫ２．３のサイズのペイロードを滞留するためには、ハイドロキシアパタイトとの結合がより広範囲に必要だからである。また、２０量体によるＣＫ２．３ペイロードの局在性の向上は、標的リガンドにおけるペイロードによる立体障害が相対的に減少したことが一因であり得る。

【0180】

他のグループによる研究は、酸性オリゴペプチドが容易に経口生物学的利用できないことを実証している（例えば、Ｓｈａｊｉら、“Ｏｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉ．７０：１８９－２００（２００５）を参照）が、いくつかの実例では、頻繁に注射することは患者のコンプライアンスを妨げ、それゆえに、問題となることがある。本明細書のいくつかの実例では提供されるのは、長期持続型（例えば、注射可能な）製剤である。いくつかの実例では、Ｄ－およびＬ－アミノ酸から構成される酸性オリゴペプチドのヒドロキシアパタイトに対する親和性は同様である（Ｓｅｋｉｄｏら（２００１）、前掲書）。いくつかの実例では、（例えば、代謝の悪い）Ｄ－グルタミン酸で構成される直鎖オリゴグルタミン酸鎖（例えば、Ｌ－グルタミン酸で構成される容易に消化できる鎖よりも）は、骨折表面でのより長い薬剤の滞留をもたらした。いくつかの実施例では、骨折部位に蓄積し持続するグルタミン酸２０量体のＤおよびＬエナンチオマーの能力が本明細書で比較された。

【0181】

例えば、図８は、２０のＬ－またはＤ－グルタミン酸の直鎖に結合した放射性ヨウ素化ＣＫ２．３の非標的ＣＫ２．３に対する生体内分布を表す組織対注射量パーセント／ｇのグラフである。いくつかの実例では、生物内分布は、（例えば、骨折後１０日の大腿骨中節骨折を有するＮＤ－４ Ｓｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（ｎ＝５）へ）注射後１８時間に決定される。例えば、図８に示すように、Ｇｌｕ_２０のＤエナンチオマーは、骨折した大腿骨においてＬエナンチオマーよりも４．７倍、非標的ＣＫ２．３よりも９１．９倍多く蓄積した。

【0182】

いくつかの実例では、蛍光色素ＳＯ４５６は、Ａｓｐ_１０ペプチドのＤとＬの両方のエナンチオマーに付着した（図９参照）。骨折した大腿骨と健康な対側大腿骨の両方において、異なる標識されたエナンチオマー鎖の蓄積を定量化した。

【0183】

図９は、注入後の時間対μｇ色素／ｍｇ組織のグラフであり、これは、骨折後１０日の中大腿骨中節骨折を負ったＮＤ－４ Ｓｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおける、１０個のＬ－またはＤ－アスパラギン酸の直鎖と結合したＳ０４５６（近赤外蛍光体）の注入後の異なる時点における蓄積を示す。いくつかの実例では、健常体（例えば、損傷していない反対側の大腿骨）および骨折した大腿骨における標識化合物の蓄積を、死後に溶解した大腿骨から抽出された標識色素の量として定量化した。例えば、図９に示すように、Ａｓｐ_１０の保持半減期は～３５時間であるのに対し、（Ｄ）Ａｓｐ_１０のそれは１００時間以上であると予測された。いくつかの実例では、この差は、放射性標識ペプチドペイロードで検出されたものよりわずかに小さく、このことは、蛍光ペイロードに比べてペプチドペイロードの半減期が短いことに起因し得る。いくつかの実例では、安定性が強化されたことが、例えば、腎臓を介したクリアランスの延長をもたらし、これは、ゆっくりと分解されるＤ－異性体がＬ－異性体よりも骨および他の組織からゆっくりと放出されたためであり得る。

【0184】

いくつかの実施態様では、ＤＥ２０は、本明細書で提供される他の標的リガンド（例えば、どの標的リガンド）よりも有意に多くのカーゴを骨折部位に送達した（図１０参照）。例えば、図１０は、標的リガンド対パーセント注射量／グラムのグラフであり、非標的ＣＫ２．３に対する、異なる酸性オリゴペプチドに結合した放射性ヨウ素化ＣＫ２．３の骨折大腿骨における蓄積を示す。生体内分布は、（例えば、骨折後１０日の大腿骨中節骨折を有するＮＤ－４ Ｓｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（ｎ＝５）へ）注射後１８時間に決定した。いくつかの実例では、骨折した大腿骨における標識化合物の蓄積は、組織１グラムあたりのパーセント注射量として報告される。

【0185】

いくつかの実例では、例えば、標的リガンドの延長の影響が予想以上に大きかったなどの理由で、ＤＥ１０およびＤＥ２０オリゴペプチドの生体内分布を視覚的に比較するために、両方のオリゴペプチドのＳＰＥＣＴ／ＣＴ造影を実施し、それらの生体内分布を視覚的に検討する。例えば、図１１Ａは、ＤＥ１０酸に結合した９９ＴｃをキレートするＴｃキレーターＥＣ２０の単一光子放射断層撮影／コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣ／ＣＴ）画像（９９ＴｃをキレートするＥＣ２０（Ｄ）Ｇｌｕ_１０の構造は、図１１Ｄに示される）であり、図１１ＢはＤＥ２０酸に結合した９９ＴｃをキレートするＴｃキレーターのＳＰＥＣ／ＣＴ画像である。図１１Ａおよび図１１Ｂに示されるように、両酸性オリゴペプチドは、標的放射線造影剤がほとんど骨折部位に結集された高分解能の画像をもたらした。体積に対する信号の比は、成長板など他の吸着部位に比べて、骨折部では１０倍を超えて高かった。それでも、いくつかの実例では、成長板への吸着は、患者を大人に限定し得る。

【0186】

第２の生体分布分析も実施された。組織対注入用量パーセント／ｇのグラフである図１１Ｃは、異なる組織における標識ＤＥ１０およびＤＥ２０化合物の蓄積の定量化を、グラムあたりの注入用量のパーセントとして示す（ｎ＝１０）。信号の大部分は、大腿骨の骨折カルスにおいて観察され、骨の代謝回転が高い部位では微量の薬剤濃度が観察された。いくつかの実例では、ＤＥ１０とＤＥ２０は同様の特異性を有していたが、ＤＥ２０の方が骨における滞留時間が長かった。図１１Ｃに示す結果は、図１０の結果と非常に類似している（すなわち、ＤＥ２０は、ＤＥ１０よりも骨折部位で～５倍効率的に蓄積する）。したがって、本明細書に記載の試験において、ＤＥ２０は、本明細書で試験されたすべてのリガンドの中で最大の骨折標的能力を示し、ＤＥ２０オリゴペプチドは、骨折部位に対する最大の選択性を示した（例えば、本明細書で試験された標的リガンドのすべての中で）。

【0187】

また、本明細書の標的同化化合物の骨折を治癒する効力も、Ｉ型糖尿病を経験するマウス対象においてインビボで試験された。図１３は、試験した薬剤（生理食塩水およびインスリン（対照）と比較して、配列番号３、５、６、または７を含む化合物）対骨量（ＢＶ）のグラフである。これらの結果は、４週間後における、標的同化コンジュゲートの、雄性ＩＧＳ－１骨折保有マウス（ｎ＝１０）に対するインビボでのＩ型糖尿病骨折治癒効力が、対照よりも高い（すなわち、より治療的に有効である）ことを指示する。

【0188】

図１４は、試験した薬剤（生理食塩水およびインスリン（対照）と比較した配列番号３、５、６、または７を含む化合物）対骨量／全体積（ＢＶ／ＴＶ）のグラフを表す。これらの結果は４週間後の、雄性ＩＧＳ－１骨折担架マウス（ｎ＝１０）に対する、標的同化コンジュゲートのインビボでのＩ型糖尿病骨折治癒効果を表す。

【0189】

図１５は、試験した薬剤（生理食塩水およびインスリン（対照）と比較した配列番号３、５、６、または７を含む化合物）対最大荷重（Ｎ）のグラフであり、これは、４週間後の雄性ＩＧＳ－１骨折を負っているマウス（ｎ＝１０）に対する標的同化コンジュゲートの、インビボのＩ型糖尿病骨折治癒効力を示している。いくつかの実例では、最大荷重は、死後の４点曲げ解析において再度骨折する前に、治癒した大腿骨が耐えた最大力を表す。いくつかの実例では、最大荷重は、骨折修復部位において骨がどのくらい強いのかを表す尺度である。

【0190】

図１６は、試験した薬剤（生理食塩水及びインスリン（対照）と比較した配列番号３、５、６、または７を含む化合物）対骨折までの仕事量（ｍＪ）のグラフで、４週間後のオスＩＧＳ－１骨折保有マウス（ｎ＝１０）に対する標的同化コンジュゲートのインビボのＩ型糖尿病骨折治癒の有効性を示す。いくつかの実例では、骨折までの仕事量は、死後の４点曲げ解析において再骨折する前に、治癒した大腿骨が吸収したエネルギーの総量を表す。いくつかの実例では、骨折までの仕事量は、骨折修復部位において骨がどのくらい強いのかを表す尺度である。

【0191】

図１７は、試験した薬剤（生理食塩水およびインスリン（対照）と比較した配列番号３、５、６、または７を含む化合物）対降伏後の変位（ｍｍ）のグラフであり、４週間後の雄性ＩＧＳ－１骨折保有マウス（ｎ＝１０）に対する標的同化コンジュゲートでのインビボのＩ型糖尿病骨折治癒効力を示す。ここで、降伏後の変位は、骨がどの程度脆いかの尺度である（例えば、糖尿病は、一般的に、骨をより脆くする）。いくつかの実例では、本明細書で提供される化合物は、骨の脆さを軽減させた（例えば、図１７）。

【0192】

図１８は、日数対血糖値（ｍｇ／ｄｌ）のグラフであり、これは、配列番号３、５、６、または７を含む化合物（ならびにインスリンおよび生理食塩水の対照）の４週間の処置期間中のＩ型糖尿病マウスの平均血糖値を示す。いくつかの実例では、異なる処置群の血糖の長期にわたる追跡は、例えば、本明細書で提供される化合物の効果が血糖代謝を介さないことを示唆するように、インスリンだけが高血糖に大きな影響を与えたことを示した。いくつかの実例では、標的リガンドの、配列番号５のＣ末端への付着は、配列番号５のグルコース調節効果を妨げる。いくつかの実例では、カルスのマイクロＣＴスキャンは、配列番号７を除くすべての処置が軟骨内骨化に有利であることを例示した。

【0193】

図１９は、日数対体重の平均変化率のグラフであり、これは、処置の期間中の、Ｉ型糖尿病骨折マウス治療群の平均体重変化を示す。いくつかの実例では、生理食塩水マウスは、例えば、高用量でいくらかの毒性を示した配列番号６を含む薬剤（ダサチニブの標的コンジュゲート（例えば、Ｄ１０－エステル－ダサチニブ））で処理したマウスと同様に、（糖尿病を患っているように）体重が減った。いくつかの実例では、配列番号６は、カルスの石灰化を改善することなく強度を改善した（例えば、これはその老化細胞除去効果によるものであり得る）。

【0194】

したがって、いくつかの実例では、本明細書で提供される化合物は、（例えば、総重量の変化に関して）非毒性である。さらに、本明細書で提供される化合物の投与は、石灰化および強度を改善することができる（例えば、高血糖状態がインスリン治療群を除くいずれの群においても制御されなかったにしても）。いくつかの実例では、高血糖は幹細胞に対して毒性である。

【0195】

特定の実施形態では、インスリンは、本明細書に提供される化合物及び組成物と共に投与される。図２０Ａ～２２Ｃに示すデータによって支持されるように、本明細書の化合物は、インスリンのみで処置した群と比較して、治癒を有意に改善することができる。

【0196】

図２０Ａは、生理食塩水およびインスリン（対照）と比較して試験した本明細書の薬剤（配列番号４、８、または９を含む）対骨量のグラフであり、これは、４週間後の雄性ＩＧＳ－１骨折保有マウス（ｎ＝１０）に対する標的同化コンジュゲートの、インビボＩ型糖尿病骨折治癒の効力を示している。図２０Ａに示されるように、骨量は、骨折カルスの最も厚いマイクロＣＴスライド１００枚の骨量を示し、骨折修復部位で骨がどれだけ石灰化したかを指標である。図２０Ｂは、試験した薬剤（対照として生理食塩水およびインスリンと比較して）対骨量／全体積（ＢＶ／ＴＶ）のグラフであり、これは４週間後の雄性ＩＧＳ－１骨折保有マウス（ｎ＝１０）に対する標的同化コンジュゲートのインビボＩ型糖尿病骨折治癒の有効性を示す。ここで、ＢＶ／ＴＶは、骨折カルスの最も厚いマイクロＣＴスライド１００枚の総体積で割った骨量を表し、骨の折修復部位で、骨がどのくらいの密度であるのかを表す指標である。

【0197】

いくつかの実例では、図２０Ａおよび２０Ｂに示すように、本明細書で提供される化合物は、（例えば、インスリン単独での処置と比較して）カルスを石灰化することを改善した。いくつかの実例では、そのような化合物は、（例えば、インスリン単独よりもより多く）骨折カルス密度を増加させた。

【0198】

図２１Ａは、インスリン投与と組合せて試験した薬剤（例えば、配列番号４、８、または９）対骨梁の厚さのグラフであり、これは、４週間後の雄性ＩＧＳ－１骨折保有マウス（ｎ＝１０）に対する標的同化コンジュゲートのインビボのＩ型糖尿病骨折治癒の有効性を示す。図２１Ｂは、インスリン投与と組合せて試験した薬剤（例えば、配列番号４、８、または９）（生理食塩水およびインスリン単独と比較して）対骨梁隔のグラフであり、これは、４週間後の雄性ＩＧＳ－１骨折保有マウス（ｎ＝１０）に対する標的同化コンジュゲートのインビボのＩ型糖尿病骨折治癒の有効性を示す。

【0199】

図２２Ａは、インスリンと共に試験した薬剤（例えば、配列番号４、８、または９）対最大力（Ｎ）のグラフであり、４週間後の雄性ＩＧＳ－１骨折保有マウス（ｎ＝１０）に対する標的同化コンジュゲートのインビボ骨折治癒の有効性を示す。ここで、最大力は、治癒した大腿骨が再骨折する前に耐えた最大力を表す。図２２Ｂは、インスリン投与と組合せて試験した薬剤（例えば、配列番号４、８、または９）（生理食塩水およびインスリン単独と比較して）対骨折までの仕事量（ｍＪ）のグラフを表示し、これは、４週間後の雄性ＩＧＳ－１骨折保有マウス（ｎ＝１０）に対する標的同化コンジュゲートのインビボ骨折治癒の有効性を表示する。骨折までの仕事量は、治癒した大腿骨が再骨折するまでに吸収したエネルギーの総量を表し、骨折修復部位で骨がどのくらい強いのかを表す指標となることがある。図２２Ｃは、インスリン投与と組合せて試験した薬剤（例えば、配列番号４、８、または９）（生理食塩水およびインスリン単独と比較）対モジュラス（ＭＰａ）のグラフであり、４週間後の雄性ＩＧＳ－１骨折保有マウス（ｎ＝１０）に対する標的同化コンジュゲートのインビボ骨折治癒の有効性を示す。剛性は、死後の４点曲げ解析における治癒した大腿骨のヤング率の尺度であり、骨が変形に対してどのくらい抵抗するかを指標となることがある。いくつかの実例では、本明細書で提供される化合物（例えば、アバロパラチド（配列番号３内にある配列番号２）および配列番号８を含む）は、インスリン対照と比較して（例えば、著しく）強度を向上させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される化合物（例えば、アバロパラチド（配列番号２）および配列番号８）は、インスリン単独よりも強度および石灰化を改善する。

【0200】

いくつかの実例では、本明細書で提供される化合物は、（例えば、生理食塩水と比較して（例えば、エストロゲン置換よりも））骨折カルスの石灰化および密度を改善する（図２３Ａ～２３Ｂ）。

【0201】

図２３Ａは、（例えば、配列番号３、６、７、または１０を含む）試験した薬剤対骨量のグラフであり、これは、４週間後の雌性卵巣摘出Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ骨折保有マウス（ｎ＝９）に対する標的同化コンジュゲートの、インビボの閉経後骨粗しょう症骨折治癒の有効性を示す。図２３Ａで言及したように、骨量は骨折カルスの最も厚い１００枚のマイクロCTスライスの骨量を表し、骨折修復部位において骨がどのくらい石灰化したのかを表す尺度である。図２３Ｂは、試験した薬剤対骨量／全体積（ＢＶ／ＴＶ）のグラフであり、これは、４週間後の雌性卵巣摘出Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ骨折保有マウス（ｎ＝９）に対する標的同化コンジュゲートの、インビボでの閉経後骨粗しょう症骨折治癒の有効性を示す。図２３Ｂにおいて、ＢＶ／ＴＶは、骨折カルスの最も厚い１００枚のマイクロＣＴスライスの全体積で割った骨量を表し、骨折修復部位の骨がどのくらいの密度かを表す指標である。

【0202】

いくつかの実例では、本明細書に提供される化合物は、大腿骨の強度を改善する（例えば、図２４Ａ～２４Ｃを参照）。

【0203】

図２４Ａは、（例えば、配列番号３、６、７または１０を含む）試験した薬剤対最大荷重（Ｎ）のグラフであり、４週間後のＯＶＸ Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ骨折保有 雌性マウス（ｎ＝９）に対する標的同化コンジュゲートのインビボ閉経後骨粗しょう症骨折治癒の有効性を示す。図２４Ａにおいて、最大荷重は、治癒した大腿骨が再骨折するまでに耐えた最大力を表す。

【0204】

図２４Ｂは、（例えば、配列番号３、６、７または１０を含む）（対照として生理食塩水またはエストロゲンと比較して）試験した薬剤対骨折までの仕事量（ｍＪ）のグラフであり、４週間後の雌性ＯＶＸ Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ骨折保有マウス（ｎ＝９）に対する標的同化コンジュゲートの、インビボでの閉経後骨粗しょう症骨折治癒の有効性を示す。図２４Ｂにおいて、骨折までの仕事量は、骨折修復部位の骨がどのくらい強いのかを表す指標である。

【0205】

図２４Ｃは、（例えば、配列番号３、６、７または１０を含む）（対照として生理食塩水またはエストロゲンと比較して）試験した薬剤対剛性（ＭＰａ）のグラフであり、これは、４週間後の雌性ＯＶＸ Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ骨折保有 雌性マウス（ｎ＝９）に対する標的同化コンジュゲートの、インビボでの閉経後骨粗しょう症骨折治癒の有効性を示す。図２４Ｃにおいて、剛性は、死後の４点曲げ解析において、治癒した大腿骨のヤング率の指標であり、骨の変形に対してどのくらい抵抗があるかを表す指標として使用することができる。

【0206】

いくつかの実例では、本明細書で提供される化合物は、骨折大腿骨の治癒を（例えば、有意に）改善する（例えば、本明細書に記載の低エストロゲン状態において）（例えば、エストロゲンの補充でエストロゲンの喪失を制御するよりはるかに良好である）。いくつかの実例では、本明細書で提供される化合物は、骨折を患う骨粗しょう症患者に投与される。

【0207】

図２５は、（例えば、配列番号３、６、７または１０を含む）（対照として生理食塩水またはエストロゲンと比較して）試験した薬剤対血清カルシウム濃度（ｍｇ／ｄｌ）のグラフであり、これは、大腿骨中節骨折モデルのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおける血清カルシウムに対する２１日間の処理の効果を示す。いくつかの実例では、（例えば、遊離同化剤とは対照的に）本明細書に記載の標的同化剤を使用することは、例えば、副甲状腺ホルモンに応じて腎臓で起こるカルシウム代謝調節への影響を制限できるため、骨折を治療するのに有益である。

【0208】

いくつかの実例では、骨折部位における配列番号４の上昇した蓄積は、骨折治癒を改善する（例えば、図２６～図３０）。いくつかの実例では、骨粗しょう症のアバロパラチド（配列番号２）治療に処方されるヒト用量のアロメトリックスケーリングによって計算される開始用量の投与後の大腿骨骨折治癒時間を比較する。いくつかの実例では、ＣＴ画像は、非標的アバロパラチドによる治療開始の３週間後に撮像された骨沈着が骨折の周辺部に集中しており、対向するカルスを橋渡しする（つなげる）密度が最小であることを示している（例えば、図３５参照）。

【0209】

いくつかの実例では、例えば、標的アバロパラチド（配列番号４）による３週間の治療後、本明細書に提供される化合物の投与に続いて、骨折部全体に骨密度が（例えば、より）均一に分布する（例えば、カルス全体のサイズもアバロパラチド処置マウスにおけるそれを上回る）。骨の形態分析では、配列番号４で処理したマウスにおいて、全骨量（全体積；ＴＶ）に対する石灰化量（骨量；ＢＶ）の比が１．５倍増加することが確認された。さらに詳細な形態分析により、この骨密度の増加は、配列番号４で処理した大腿骨における海綿体の厚さの増加よりも、骨梁幅の減少に主に起因することがさらに判明した。

【0210】

いくつかの実例では、例えば、観察された骨堆積の増加が機械的特性の改善につながるかどうかを立証するなどのために、治癒した大腿骨を再骨折するまで曲げるために必要な力が測定された。いくつかの実例では、配列番号４で処理した骨折（例えば、大腿骨中節骨折を有するマウスの）は、遊離アバロパラチド処理した大腿骨よりも２．５倍大きい最大荷重を維持することが観察された（図３２）。

【0211】

いくつかの実例では、配列番号４で処理したマウスにおいて、骨折するのに必要な力は、同じまたは類似のマウスにおける対側の健康な大腿骨、または生理食塩水で処理したマウスにおける未修復大腿骨を骨折するのに必要な力を上回った。このことは、この時点での修復された大腿骨が、元の折れていない大腿骨よりも３０％強くなっていることを示唆する。いくつかの実例では、（例えば、同様の機械的研究において）骨折するまでの仕事量は、大腿骨中節骨折を有するマウスのアバロパラチド処理した大腿骨（図３３）よりも配列番号４で処理した大腿骨の方が平均して３．５倍高かった。

【0212】

まとめると、これらのデータは、Ｄ－Ｇｌｕ_２０を介したアバロパラチドの骨折表面への累積が治癒プロセスを大幅に促進し、このことが、骨折した大腿骨を、生理食塩水またはアバロパラチド処理したマウスにおける大腿骨よりも迅速に完全な機械的強度に戻すことを実証している。

【0213】

いくつかの実例では、配列番号４は、（例えば、骨治癒を改善するときに）配列番号３よりも効果的である。

【0214】

配列番号３が、いくつかの実例では、アバロパラチドよりも優れている一方、患者が必要とする投与回数が少ない場合に、その臨床的妥当性は劇的に改善され得る。標的オリゴペプチドの鎖長を増すことで、骨折部位での同化ペイロードの保持が延長され、必要な投薬の頻度がより少なくなるように、折れた骨に対する薬物の親和性が十分に増加するかどうかを決定した。マウスは、毎日ではなく、３日ごとに１回投与された。ＣＴスキャンの目視検査により、標的アバロパラチドを投与したマウスは、非標的アバロパラチドを投与したマウスに対して、骨折後３週間でより多くの骨が沈着していることを明らかになった。アバラード１０対アバラード２０で骨折前に達成される最大荷重を比較すると、傾向として２０～３０％高い強度が示された。各薬剤を生理食塩水と比較した場合、配列番号４は有意に高い一方、配列番号３は３日ごとに投与した場合に有意性を欠いた。結果は、図３４に示されており、これは、大腿骨中節骨折を有するマウスの処置（生理食塩水、配列番号３（０．１ ｎｍｏｌ／ｍｇ（０．１ｘ）、１ ｎｍｏｌ／ｍｇ（１ｘ）、および１０ ｎｍｏｌ／ｍｇ（１０ｘ））対最大負荷（Ｎ））のグラフである。

【0215】

本明細書で述べられるすべての特許、特許出願公開、雑誌論文、教科書、および他の出版物は、本開示が関係する当業者のレベルを示している。そのような出版物はすべて、個々の出版物が参照により本明細書に援用されることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に援用される。

【0216】

本開示の特定の実施形態が本明細書に示され、かつ記載されてきた一方、そのような実施形態が例示としてのみ提供されることは、当業者にとって明らかであろう。特許請求の範囲に係る発明が、本明細書内で提供される特定の例によって限定されることは意図されていない。

【0217】

本明細書における実施形態の記載および例示は、限定的な意味で解釈されることを意図しない。多数の変形、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者にもたらされるであろう。さらに、本発明のすべての態様は、本明細書に記述された特定の描写、構成または相対的な割合に限定されるものではなく、多様な条件および変数次第であることが理解されよう。本明細書に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替案が、本発明を実行することにおいて採用され得ることを理解されたい。したがって、本発明は、そのような任意の代替物、修正物、変形物、または同等物なども網羅することが企図される。以下の請求項が本発明の範囲を規定し、これらの請求項の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物がそれによって網羅されることが意図される。

【0218】

特定の定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ］、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかでない限り、複数のものを含める。したがって、例えば、「化合物」への言及は、そのような化合物の複数のものを含む。本明細書において、分子量などの物理的特性、または化学式などの化学的特性について範囲が使用される場合、範囲のすべての組合せおよび部分的な組合せ、ならびにその中の特定の実施形態が含まれることを意図している。用語「約」は、数値または数値範囲に言及する場合、言及される数値または数値範囲が、実験変動範囲内（または、統計的実験誤差内）の近似であることを意味し、したがって、数値または数値範囲は、所定の数値または数値範囲の１％と１５％の間で変化し得る。用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」もしくは「（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの関連用語）は、記載された特徴「からなる」または「から本質的になる」ことがありえるいかなる化合物、組成物、方法、プロセスなどの実施形態も除外することを意図していない。本明細書に例示的に記載された本発明は、本明細書に具体的に開示されていない要素（複数可）または制限（複数可）がない場合にも、好適に実施し得る。

【0219】

配列に対する参照に関する「パーセント（％）配列同一性」とは、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない、参照配列中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸または核酸残基のそれぞれのパーセントとして定義する。配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の技術の範囲内にある様々な方法で達成することができる。例えば、配列間のパーセント同一性または類似性の決定は、例えば、ＧＡＰプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐのソフトウェア；現在はＡｃｃｅｌｒｙｓを介してｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍで入手可能）を使用して行うことができ、アラインメントは、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（ＶＮＴＩソフトウェア、ＩｎｆｏｒＭａｘ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して行うことができる。さらに、配列データベースは、関心のある核酸またはアミノ酸の配列を使用して、検索することができる。データベース検索のアルゴリズムは、典型的にはＢＬＡＳＴソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）に基づくが、当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。いくつかの実施形態では、パーセント同一性は、核酸またはアミノ酸配列の全長に沿って決定することができる。

【0220】

本明細書に記載されるように、本開示の特定の化合物は、「任意選択で置換された」部位を含有することができる。一般に、用語「置換された」は、用語「任意選択で」が先行するか否かにかかわらず、指定された部分の１つ以上の水素が適切な置換基で置換されていることを意味する。別段の指示がない限り、「任意で置換された」基は、その基の置換可能な各位置に適切な置換基を有することができ、任意の所定の構造における２つ以上の位置が、特定の基から選択される２つ以上の置換基で置換され得る場合、置換基は各位置で同じか異なるかのいずれかであり得る。想定される置換基の組合せは、好ましくは、安定なまたは化学的に実現可能な化合物の形成をもたらす。

【0221】

本明細書で使用される場合、用語「患者」、「対象」、および「個体」は、互換的に使用される。いずれの用語も、医療従事者の監督を必要としない。例えば、個体に投与することは、治療薬を自分自身に投与する個体、および治療薬を個体に投与する医療関係者を含む。

【0222】

本明細書で使用する用語「ラジカル」は、分子のフラグメントを指し、そのフラグメントは、結合形成のための付着点である開放原子価を有するものである。一価のラジカルは、別の化学基と１つの結合を形成することができるような１つの開放原子価を有する。いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるような分子のラジカル（例えば、葉酸受容体結合剤のラジカル）は、その分子から１つの水素原子を除去して、水素原子が除去された場所に１つの開放原子価を有する１価のラジカルを生成することによって作成される。適切な場合、ラジカルは、２価、３価などであり得、ここで、２、３またはそれ以上の水素原子が除去されて、２、３またはそれ以上の化学基と結合することができるラジカルが作成されている。適切な場合、ラジカルを形成する分子中の全原子のうち、除去された原子が小さな画分（原子数の約２０％以下）である限り、水素原子以外の原子（例えば、ハロゲン原子）の除去、または２以上の原子（例えば、ヒドロキシル基）の除去により、ラジカル開放原子価を作成することができる。

【0223】

用語「処置する」、「処置している」、または「処置」は、慢性または急性の治療シナリオのいずれかにおいて、骨折、糖尿病、骨粗しょう症に関連する症状を低減、緩和、軽減、改善、和らげる、または弱めることを含む。

【0224】

採用されている用語及び表現は、説明用語として使用されており、限定するものではない。このことに関して、特定の用語が「特定の定義」の下で定義され、それ以外が「発明の詳細な説明」で定義、記載、または論じられる場合、すべてのそのような定義、説明、および議論は、そのような用語に起因することが意図される。また、このような用語や表現の使用には、示され、かつ記載された特徴の等価物、またはその一部を排除する意図もない。さらに、例えば「特定の定義」などの小見出しが「発明の詳細な説明」において使用されているが、このような使用は単に参照を容易にするためであり、１つの段落で行われる開示をその段落のみに限定することを意図せず、むしろ、１つの小見出しで行われる開示は、他のすべての小見出しでの開示を構成すると意図されている。

【実施例】

【0225】

以下の実施例は、本開示を説明するのに役立つ。実施例は、請求項に係る本発明の範囲をいかなる形でも限定することを意図していない。

【0226】

すべての統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．０；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＣＡ）を用いて実行した。データを、平均値±標準偏差で表示する。図において、統計的有意性のレベルを、以下の定義に従ってアスタリスクで示す：^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１．統計解析を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびＤｕｎｎｅｔｔのポストホック分析を用いて実行し、ｐ値０．０５で報告される有意性を調整した。図４～８について、ボンフェローニのポストホック分析を、Ｄｕｎｎｅｔｔのポストホック分析の代わりに実行した。図９を、Ｄｕｎｎｅｔｔのポストホック解析を用いた二元配置のＡＮＯＶＡで分析した。

【0227】

実施例１：ペプチドペイロードの合成
すべてのペイロード（例えば、図１Ａ）を、アルゴンの流れの下、固相ペプチド合成バイアルで合成した。Ｗａｎｇ樹脂（０．６ｍｍｏｌ／ｇ）を、触媒量の４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を用いて、９：１ｖ／ｖ ＣＨ_２Ｃ_ｌ２／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）において４時間、３倍過量の第１アミノ酸（システイン）、ＨＯＢｔ－ＣｌおよびＤＩＣで負荷した。次いで、樹脂を２当量の酢酸無水物及びピリジンで３０分間キャップして、樹脂上の任意の未反応ヒドロキシル基をブロック（ｂｌｏｃｋ）した。これらの工程の後、塩化メチレン（ＤＣＭ）およびＤＭＦで連続して３回洗浄した。

【0228】

各カップリング反応後、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基を、ＤＭＦにおいて２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンで１０分間培養を２回することにより除去した。次いで、樹脂を、次のアミノ酸を添加する前に、ＤＭＦで２回洗浄した。各アミノ酸を、３倍過量の２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）／Ｎ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）において３０分間反応させ、続いて、３倍過量のベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリピロリジンホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）／Ｎ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）を用いて３０分間のダブルカップリングを行った。すべてのアミノ酸を、上記の条件に従って添加した。特に断りのない限り、酸感受性側鎖保護基を有する標準的なＦｍｏｃ保護アミノ酸を使用した。次いで、チロシンまたは表１に示すペプチド配列を、自動ペプチド合成機（Ｆｏｃｕｓ ＸＣ，ＡＡＰＰＴｅｃ）を使用し、かつ上に列挙した固相手順を使用してペプチドに添加した。合成が完了すると、末端のＦｍｏｃは、樹脂がＤＭＦで３回、ＤＣＭで３回、メタノールで２回洗浄され、次いでアルゴンガスで乾燥された後、前述の条件を用いて除去した。

【0229】

ペプチドを含む乾燥樹脂を、９５：２．５：２．５トリフルオロ酢酸／水／トリイソプロピルシランと過剰のＴＣＥＰを用いて、２時間切断した。次いで、ペプチドを、１０倍量の冷ジエチルエーテルを用いて、切断溶液から沈殿させた。溶液を、２，０００相対遠心力（ＲＣＦ）で５分間回転し、次いでデカントした。次いで、ペレットを、乾燥させ、合成を確認するために、分析用液体クロマトグラフィー質量分析（１２２０ ＬＣ； ６１３０ ＭＳ， Ａｇｉｌｅｎｔ）に提出した。粗ペプチドを、ＤＭＦと水の混合物に溶解させ、分取逆相高速液体クロマトグラフィー（１２９０、アジレント、サンタクララ、カリフォルニア州）を介して精製した。４０分間０～５０％酢酸アンモニウム：アセトニトリル移動相を有するＣ－１８カラムを使用して、２，２，６，６－テトラメチルピペリジン（ＴＭＰ）を精製した。分析用液体クロマトグラフィー質量分析（１２２０ ＬＣ；６１３０ ＭＳ、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）により評価された純粋なペイロードのみを含む画分を凍結乾燥し（ＦｒｅｅＺｏｎｅ、ＬＡＢＣＯＮＣＯ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）、標的リガンドと結合するまで凍結乾燥粉末として－２０℃で保存した。

【0230】

以下の置換、Ｇｌｕ２２、Ｇｌｕ２５、Ｌｅｕ２３、Ｌｅｕ２８、Ｌｅｕ３１、Ｌｙｓ２６、Ｌｙｓ３０、およびＡｉｂ２９を、当技術分野で既知の方法に従って、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）（配列番号１）の残基１～４６に導入した。これらの置換は、ペプチドの安定性を高め、骨粗しょう症患者の骨密度を増加させ、毒性を増加させることなく最大同化活性のウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ）を拡大する。露出したヒドロキシアパタイトへの吸着後に同化ペプチドのシグナル伝達を最大化するために、このＰＴＨｒＰフラグメントのＣ末端を、標準的な固相ペプチド化学を用いて、２０個のＤ－グルタミン酸（Ｅ）残基（Ｄ－Ｇｌｕ_２０またはＤＥ２０）の直鎖状ペプチドにコンジュゲートし、これにより、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および質量分析法によって証明されるように，最終融合タンパク質（配列番号４）を１９％の全体収率と９４％の最終純度にて得た。

【0231】

実施例２：（直鎖状）骨指向性ペプチドの合成
すべての標的リガンドペプチドを、上記の固相合成法に従って、その名称が示すように、適切な長さ、アミノ酸組成物、およびエナンチオマー立体化学を達成するように合成した。樹脂上にある間、Ｎ末端アミンを、上記のように脱保護し、ＤＭＦ中で、３倍マレイミドプロピオン酸、３倍過量のベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰＹＢＯＰ）、ＨＯＢｔ－Ｃｌおよび５倍過量のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）により４時間反応した。次いで、１０倍過量のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）においてマレイミド化学を用いて、ペプチドをシステイン含有ペプチドに室温で２４時間カップリングした。その後、標的ペイロードコンジュゲートを、切断し、脱保護し、および上記のように精製した。

【0232】

実施例３：（分岐鎖）骨指向性ペプチドの合成
手短に言えば、アルゴンの流れの下で固相ペプチド合成を用いて、分岐した標的リガンドを合成した。２－クロロトリチル樹脂（０．６ｍｍｏｌ／ｇ）を、ＤＣＭおよびＤＩＰＥＡ中で６０分間、Ｎα，Ｎε－ｄｉ－Ｆｍｏｃ－Ｌ－リジンで負荷した。次いで、樹脂を、ＭｅＯＨで４回洗浄、次いでＤＣＭおよびＤＭＦで３回、連続して洗浄し、キャッピングした。次いで、分岐鎖を上記のように合成した。Ｎ末端のＦｍｏｃは残り、ペプチドを、酢酸／テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）／ＤＣＭの１：１：８混合液で３０分間ソフトに切断した。切断液を、減圧下で蒸発させ、および末端カルボン酸を、ＤＣＭ中で３倍過量のＮ－（２－アミノエチル）マレイミド、３倍過量のＰＹＢＯＰおよびＨＯＢｔ－Ｃｌならびに５倍過量のＤＩＰＥＡと４時間コンジュゲートした。次いで、酸感受性の保護基を、９５：２．５：２．５トリフルオロ酢酸／水／トリイソプロピルシラン中で２時間培養することにより、脱保護した。次いで、ペプチドを、１０容量の冷ジエチルエーテルで沈殿され、ＤＭＦにおける２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンで１５分間の培養、それに続く冷ジエチルエーテルでの沈殿により末端Ｆｍｏｃを脱保護した。結果として得た粗生成物を、上記のように分取逆相高速液体クロマトグラフィー（１２９０、Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して精製した。最後に、精製された標的リガンドを、同じく上記のようにマレイミドカップリングを介して異なるペイロードとコンジュゲートした。

【0233】

実施例４：モノビスホスホネート標的リガンドの合成
アレンドロン酸を、水酸化ナトリウムに溶解し、次いで、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液で希釈し、ＨＣｌでｐＨを５まで低下させた。３当量の３－マレイミドプロピオン酸を、４当量の１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カボジイミド（ＥＤＣ）で予め活性化した（ｐｒｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ）。反応物を、４０℃で一晩撹拌し、粗生成物は、０～２５％酢酸アンモニウム／アセトニトリル移動相を用いたＣ－１８カラム上の分取逆相高速液体クロマトグラフィー（１２９０、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）によって４０分かけて精製した。

【0234】

分析液体クロマトグラフィー質量分析（１２２０ ＬＣ；６１３０ ＭＳ、Ａｇｉｌｅｎｔ）によって分析された純粋なマレイミド生成物のみを含む画分を、凍結乾燥され、上述のようにマレイミドカップリングを介してペイロードと結合するために必要となるまで－２０℃で保存した。

【0235】

実施例５：トリビスホスホネート標的リガンドの合成
ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－２，２’－（（３－アミノ－２－（２－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－２－オキソエトキシ）エチル）ペンタン－１，５－ジイル）ビス（オキシ））ジアセテートを、ＤＣＭ中４５℃で２４時間、１．５当量の３－マレイミドプロピオン酸、４当量のＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および３当量のＤＩＰＥＡと反応させた。ジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）の沈殿物を濾過し、用量を減圧下で減少させた。生成物を、フラッシュクロマトグラフィーで精製し、カルボン酸を、５０：５０ ＴＦＡ／ ＤＣＭで３０分間脱保護した。溶媒を、減圧下で除去し、結果として得た２，２’－（（２－（３－（カルボキシメトキシ）－１－（３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）プロパンアミド）プロピル）ブタン－１，４－ジイル）ビス（オキシ））二酢酸を、ｐＨ４．５のＭＥＳバッファーにおいて４５℃で、２４時間、アレンドロン酸＋１２当量のＥＤＣを反応した。結果として得た粗生成物を、分取逆相高速液体クロマトグラフィー（１２９０、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を介して精製し、および精製した標的リガンドを、上記のようにマレイミドカップリングを介して異なるペイロードとコンジュゲートした。トリビスホスホネートの構造を、図１２に示す。Ｒは、任意のペプチドまたは低分子を表すことがある。

【0236】

実施例６：ポリホスフェート標的リガンドの合成
４５個のホスフェートのホスフェートガラスポリマーを、１０ｍＭの濃度で１００ｍＭのＭＥＳに溶解した。次いで、十分なＥＤＣを、１００ｍＭの濃度になるように添加し、次いで３当量のＤＩＰＥＡ、続いて５当量のＮ－（２－アミノエチル）－マレイミドを添加された。精製した標的リガンドを、上記のようにマレイミドカップリングを介して異なるペイロードとコンジュゲートした。

【0237】

実施例７：９９ｍＴｃキレーター分子の合成
Ｄ－Ｇｌｕ_２０（ＤＥ２０）およびＤ－Ｇｌｕ_１０（ＤＥ１０）に連結した^９９ｍＴｃキレーターを、先に述べたように標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成を介して合成した。Ｆｍｏｃシステイン（ＴＲＴ）が負荷されたＷａｎｇ樹脂を、Ｆｍｏｃアスパラギン酸（ＯｔＢｕ）に結合させ、次いでＮ^α－Ｂｏｃ－Ｎ^β－Ｆｍｏｃ－Ｌ－２，３－ジアミノプロピオン酸に結合させ、^９９ｍＴｃキレーターを作成した（例えば、Ｌｅａｍｏｎら、「ＥＣ２０：Ａ ｎｅｗ ｆｏｌａｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ，^９９ｍＴｃ－ｂａｓｅｄ ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１３：１２００－１２１０（２００２））。このキレーターを、標準的なアミド化学で８－（Ｆｍｏｃ－アミノ）－３，６－ジオキサオクタン酸に結合し、これを、標準的なアミド結合を介して１０または２０個のＤ－グルタミン酸の直鎖オリゴペプチドにコンジュゲートした。次いで、オリゴペプチドを前記のように切断かつ精製した。

【0238】

実施例８：近赤外（ＮＩＲ）色素コンジュゲートの合成
近赤外（ＮＩＲ）蛍光色素Ｓ０４５６のマレイミド誘導体を、上記の骨破壊標的リガンドの標識に使用するために調製した。これは、スキームＩ（下記）に示されるように合成した。この目的のために、Ｓ０４５６、Ｎ－Ｂｏｃ－チラミンおよび水酸化カリウム（ＫＯＨ）を、固体を溶解するために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むフラスコ中で混合し、および溶液を、アルゴン下で６０℃で１．２時間撹拌した。結果として得た溶液を、冷酢酸エチルで沈殿させ、激しく攪拌した後、３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。濃緑色の固形物を、真空デシケーターで一晩乾燥させ、４０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／ＤＣＭで３０分間脱保護した後真空中で濃縮して、すべてのＴＦＡとＤＣＭを除去した。次に、粗固形物を、水に溶解させ、分取逆相高速液体クロマトグラフィー（１２９０、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）精製に供した。純粋なフラクションを、真空中で濃縮して凍結乾燥させた。マレイミドで誘導体化するために、固形物を、Ｎ－スクシンイミジル３－マレイミドプロピオネートおよびＤＩＰＥＡとともにＤＭＳＯに溶解し、上記のように分取逆相高速液体クロマトグラフィー（１２９０、Ａｇｉｌｅｎｔ、サンタクララ、カリフォルニア）を通じて精製される前に、アルゴン空気下で１時間撹拌した。Ｎ末端システインを有するデカアスパラギン酸（ＬおよびＤ）標的リガンドを、前記のように調製および精製した。デカアスパラギン酸システインのＳ０４５６－マレイミドへのコンジュゲートのために、Ｓ０４５６－マレイミドを、アルゴンで脱気したフラスコ中のＤＭＳＯに溶解し、続いて、Ａｓｐ_１０－Ｃｙｓを撹拌により溶液に添加した。混合物を、分取逆相高速液体クロマトグラフィー（１２９０，Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で精製する前に、室温で２．５時間撹拌した。精製し凍結乾燥した生成物は、緑色のふわふわした固形物として現れた。（Ｄ）Ａｓｐ_１０－Ｓ０４５６コンジュゲートの合成は、（Ｄ）Ａｓｐ_１０の合成にＤ－アスパラギン酸を使用した以外は、（Ｌ）Ａｓｐ_１０－Ｓ０４５６について述べた同じ手順を踏んだ。

【0239】

【化1】

【0240】

実施例９：大腿骨中腹部骨折モデル
無菌外科技術を使用し、骨折する前の骨に内固定するために、麻酔をかけた１２週齢の雌性ＮＤ－４ Ｓｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒ年齢適合マウスの大腿骨に、髄内釘として２３ゲージの針を挿入した。Ｃ５７／ＢＬ６マウスおよびＳｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒ ＮＤ－４マウスなどの近交系間で標的能力の差は見られなかった。手短に言えば、後肢の右膝を囲むマウス毛を除去し、この動物を麻酔気化器（ＶｅｔＥｑｉｐ， Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ，ＣＡ）を用いて３％イソフルラン麻酔した。次いで、皮膚を、ベタジンのスクラブで洗浄し、続いて７０％エタノールのスクラブで洗浄した。次いで、膝蓋骨の上を切開し、膝蓋腱を露出させ、腱を切断し、大腿骨の遠位顆を露出させた。滅菌した２３ゲージの針を、顆の間の大腿骨遠位部の膝蓋骨表面中央の皮質殻を貫通して穿孔した。ピンを、大腿骨近位骨端の骨内表面に達するまで、髄腔の中心から挿入した。次いで、針を、ワイヤーカッターで切断して大腿骨の遠位端と同一平面にし、皮膚を、４－０非吸収性ナイロン縫合糸で閉じた。次いで、ＲＩＳｙｓｔｅｍ社の落錘式骨折装置を用いて、安定化された大腿骨において骨折を誘発し、Ｘ線キャビネット（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ，Ｋｏｄａｋ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）を用いてＸ線で確認した。疼痛を軽減するために、骨折後３日間、マウスにブプレノルフィン（０．０３ｍｇ／日）を投与した。すべての動物実験を、Ｐｕｒｄｕｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）が承認したプロトコルに沿って実行した。

【0241】

実施例１０：半減期および生体内分布
骨折部位における標的蛍光コンジュゲートの半減期を解析するため、Ｌ－Ａｓｐ_１０－Ｓ０４５６またはＤ－Ａｓｐ_１０－Ｓ０４５６を、ＰＢＳに溶解し、滅菌ろ過し、および骨折の１０日後に、２５０ ｎｍｏｌ／マウスの最終用量を達成するために皮下注入した。次いで、マウスを、注射後２、２４、４８、７２、および９６時間で安楽死させ、中性緩衝エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の１２％溶液で骨折カルスを切除・溶解することにより、骨折部位での蛍光を定量化した。手短に言えば、骨折させた大腿骨を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、真空デシケーターで一晩徹底して乾燥させ、小片に砕き、前述のＥＤＴＡ溶液に浸漬する前に、秤量した。サンプルを、骨を脱灰するために、シェーカー上で８時間撹拌し、次いで、上清を回収するために、８，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。定量化用色素の既知の濃度標準曲線を用いて、上清みにおけるＬ－Ａｓｐ_１０－Ｓ０４５６またはＤＡｓｐ_１０－Ｓ０４５６の濃度を、そのＯＤ７８０から判断した。

【0242】

実施例１１：ペプチドの放射性標識
１０（１０）μｇのＰｉｅｒｃｅ Ｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ（ヨードゲン；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）試薬を、２００μＬのクロロホルムに溶解させ、次いで、６Ｘ５０ｍｍのガラス試験管に加え、およびアルゴンの安定した流れの下で蒸発させた。次いで、４０μＬのＰＢＳに溶解した５０ｎｍｏｌのペプチドコンジュゲートを、１０μＬ（１ｍＣｉ）のＮａ^１２５Ｉ（ＡＲＣ）と共に添加した。ガラス試験管を密封し、シェーカーに３０分間置き、次いで、水：アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡの０～１００％グラジエントを用いた放射性分取逆相高速液体クロマトグラフィー（１２６０ＨＰＬＣ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｆｌｏｗ－ＲＡＭ ｒａｄｉｏｄｅｃｔｅｃｔｏｒ， Ｌａｂｌｏｇｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ， Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ， ＵＫ）により精製した。正しい滞留時間と放射性シグナルを有するフラクションを単離させ、かつ凍結乾燥させた。ペイロードペプチドを、内因性チロシン、トリプトファン、またはヒスチジン残基において放射性ヨウ素化させ、最も長いヨウ素化実験（２７時間）の間安定し続けていた（Ｓａｖｏｉｅら、「Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｍｏｎｏ－ ａｎｄ ｄｉｉｏｄｏｈｉｓｔｉｄｉｎｅ． Ｉ． Ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｏｄｏｈｉｓｔｉｄｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｙｒｏｉｄａｌ ｉｏｄｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｍａｎ ａｎｄ ｒａｔ」Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ５２： １０６－１１５ （１９７３）を参照）。

【0243】

^９９ｍＴｃ標識のために、窒素が散布された水中のＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物（１０ｍｇ／ｍｌ）に溶解された溶液０．６ｍｇを、窒素が散布された水中のグルコン酸ナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）５０ｍｇに添加した。その混合液に、窒素攪拌した０．２Ｎ塩酸に溶解された塩化第一スズ二水和物（１０ｍｇ／ｍｌ）溶液０．２ｍｇを添加した。次いで、４μｍｏｌの^９９ｍＴｃキレート含有ペプチドを、その溶液に添加し、ｐＨを、ＮａＯＨを用いて６．８に調整した（Ｌｅａｍｏｎら（２００２）、前掲）。この溶液を、液体窒素中で瞬間凍結させ、かつ一晩凍結乾燥させた。次いで、この化合物を、１５ｍＣｉのｍ^９９Ｔｃ（Ｃａｒｄｉｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ）と混合させ、１５分間撹拌した後、定量キレートを、分析用放射性逆相高速液体クロマトグラフィー（１２６０ＨＰＬＣ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｆｌｏｗ－ＲＡＭ ｒａｄｉｏｄｅｃｔｅｃｔｏｒ、Ｌａｂｌｏｇｉｃ）により確認した。

【0244】

実施例１２：生体内分布の解析
生きた動物研究のために、^９９ｍＴｃ－または^１２５Ｉ－放射性標識ペプチドをＰＢＳに溶解させ、血流がその領域に戻ったことを確実にするために、大腿骨中腹骨折の誘発の１０日後にマウスに皮下注射した。各マウスに、０．２５ ｍＣｉ（０．１ ｍＬのビヒクルにおける１２．５ ｎｍｏｌのペプチド）の放射性ヨウ素化ペプチド、または３ ｍＣｉ（０．１ ｍｌ）用量の^９９ｍＴｃ標識ペプチドの両方を皮下に投与した。１８時間後、血液を、心臓穿刺により除去し、マウスをＣＯ_２窒息により犠牲にした。臓器および組織（心臓、肺、筋肉、皮膚、肝臓、脾臓、腎臓、大腿骨骨折、健康な大腿骨）を切除し、重さを測り、およびガンマ計測器（Ｃｏｂｒａ Ａｕｔｏ－Ｇａｍｍａ，Ｐａｃｋａｒｄ；ＧＭＩ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＩＮ）を用いて放射能を計測した。パーセント注射量は、以下の方法で計算された。

【0245】

【数3】

骨折／健康比率は、以下の方法で計算した。

【0246】

【数4】

【0247】

実施例１３：ＳＰＥＣＴ／ＣＴ
^９９ｍＴｃ標識Ｄ－Ｇｌｕ１０－キレーターおよびＤ－Ｇｌｕ２０－キレーターを、７ｍＣｉ／１００μｌに製剤し、および大腿骨骨折の２週間後に尾静脈から注入した。１８時間後、マウスを、ＣＯ_２窒息で安楽死させ、単光子放出コンピュータ断層撮影／コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣ／ＣＴ）スキャナー（Ｕ－ＳＰＥＣＴ－ＩＩ／ＣＴ、ＭｉＬａｂｓ、Ｈｏｕｔｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて撮影した。ＣＴ画像を、高解像度の全身１２分スキャンで収集し、続いて０．６ｍｍコリメータを用いて１時間ＳＰＥＣＴスキャンを行った。エネルギーウィンドウを１４０ｋｅＶ、再構成パラメータを１６サブセット、ポストフィルターなしで４イテレーションを選択したＭｉＬａｂｓソフトウェアを用いて、ＳＰＥＣ／ＣＴ画像を再構成した。３Ｄ再構成を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて実行した。

【0248】

実施例１４：骨折修復モデル－糖尿病
配列番号５、アバロパラチド（配列番号２）、配列番号６、および配列番号９（１０個のアスパラギン酸残基を有するコンジュゲート）の標的コンジュゲートを、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成を使用して合成した。配列番号５からアミノ酸１～３４を使用し、アバロパラチド（配列番号２）は、配列番号１のアミノ酸１～３６を安定化したものである。８週齢の雄性ＣＤ－１マウス４０匹において、血糖値が２５０ｍｇ／ｄＬを超えるまで、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を７回皮下注射することにより、糖尿病を誘発した。マウスを、この糖尿病が確認された状態で２ヶ月間放置し、糖尿病が骨に作用できるようにした。次いで、骨折をＲＩＳｙｓｔｅｍ社の落錘式骨折装置で誘発しかつＸ線により確認する前に、無菌手術技術を使用して、麻酔をかけたマウスの大腿骨に髄内釘として２３ゲージの針を内固定のために置いた。マウスに、骨折後３日間、ブプレノルフィンを投与した。それらに、インスリンの陽性対照、ビヒクルの陰性対照、配列番号５、またはアバロパラチド（配列番号２）を４週間にわたって毎日皮下に投与した。骨折の治癒を、マイクロＣＴ（Ｓｃａｎｃｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｇ）を用いて定性的に評価した。骨折した大腿骨を、４点曲げ破壊における強度について、ＥｌｅｃｔｒｏＦｏｒｃｅ ＴｅｓｔＢｅｎｃｈ（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）を用いて試験した。最大荷重、剛性、降伏後の変位、および骨折までの作業データを作成した。統計解析は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して実行し、ｐ値が０．０５（^＊）および０．０１（^＊＊）未満であると報告される場合に有意性があるとした。すべての動物実験を、Ｐｕｒｄｕｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＩＡＣＵＣによって承認されたプロトコルに従って実施した。

【0249】

４つの化合物を試験した。アバロパラチド（Ｄ）＿ｅ１０、配列番号６、および配列番号７（図１Ａおよび図１Ｂ）は、いずれも健康な大腿骨骨折の治癒を繰り返し促進していた。アバロパラチド（配列番号２）は、副甲状腺関連タンパク質ホルモンの安定化されたバージョンである。ダサチニブは、骨芽細胞と破骨細胞の両方に対して標的外効果を有するＳＲＣキナーゼであり、全体的な骨密度を改善する。また、ダサチニブは、老化細胞除去剤であることが証明されている。ＩＴＧＡは、膜内骨折治癒を促進するフィブロネクチン模倣剤である。配列番号５は、プレプチン（Ｐｒｅｐｔｉｎ）１～１６が中程度の骨同化活性を有していたので、この研究に含んだ。また、全長化合物（図１Ａおよび図１Ｂ参照）は、グルコース感受性も改善することを示した。したがって、完全長配列番号５のグルコース調節特性が、２つのメカニズムを介して治癒を改善し得るデュアルアクション化合物として、Ｉ型糖尿病性骨折の治癒に有益であり得るとの仮説を立てた。化合物を、陽性対照としてインスリン、陰性対照として生理食塩水と比較した。

【0250】

配列番号６を除くすべての標的化合物は、生理食塩水に比べて石灰化および骨密度を改善し、配列番号５はカルスの石灰化に最も影響を与え、アバロパラチドは密度に最も影響を与えた。その結果は、図１３および図１４に示される。ＢＶは、骨折カルスの最も厚い１００枚のマイクロＣＴスライスの骨量を表し、骨が骨折修復部位でどれくらい石灰化したかの指標である。ＢＶ／ＴＶは、骨折カルスの最も厚いマイクロＣＴスライド１００枚のＢＶをＴＶで割った値を表し、骨が骨折修復部位でどのくらいの密度であるかの指標である。インスリンを、２ＩＵ／日として投薬した。０．１ｘ、５０ｘ、および１０ｘの用量は、それぞれ、皮下注射によって毎日送達されるコンジュゲートの０．１ｎｍｏｌ、５０ｎｍｏｌ、および１０ｎｍｏｌである。配列番号６は、１日おきに１０μｍｏｌ／ｋｇで投薬した。

【0251】

すべての標的化合物は、単なるインスリン処置単独よりも骨折の強度を改善した。インスリンが石灰化を改善したにもかかわらず、高血糖で傷ついた骨の質を回復させることはできなかったので、骨はまだ弱かった。骨の脆さが、糖尿病患者の骨折の多さにつながるものである。脆さの指標は、４点曲げ試験における降伏後の変位である。その結果は、図１５と図１６に示される。

【0252】

インスリンを、２ＩＵ／日で投薬した。０．１ｘ、５０ｘ、および１０ｘの用量は、それぞれ、皮下注射によって毎日送達されるコンジュゲートの０．１ｎｍｏｌ、５０ｎｍｏｌ、および１０ｎｍｏｌである。配列番号６を、１日おきに１０μｍｏｌ／ｋｇで投薬した。

【0253】

配列番号６を除くすべての化合物は、骨の脆さを減少させた（図１７）。インスリンは、血糖値を改善する唯一の化合物であった（図１８）。骨折を処置することにより、動物は、糖尿病により失われていた体重を取り戻すことができた（図１９）。

【0254】

しかしながら、非糖尿病患者は、本明細書で提供される化合物を摂取するためにインスリンを摂取することを止めないので、インスリンと一緒に投薬される化合物で実験を繰り返した（図２０～２２）。

【0255】

図２０Ａおよび２０Ｂについて、インスリンを２ＩＵ／日で投薬し、０．１ｘ、１０ｘ、および１００ｘの用量は、それぞれ皮下注射によって毎日送達されるコンジュゲートの０．１ｎｍｏｌ、１０ｎｍｏｌ、および１００ｎｍｏｌである。図は、配列番号８がインスリンよりもカルスの石灰化を改善し、すべての実験治療薬が、インスリン単独よりも骨折カルス密度の増加を導いたことを示す。

【0256】

図２１Ａおよび２１Ｂについて、インスリンを２ＩＵ／日で投薬して、０．１倍、１０倍、および１００倍の用量は、それぞれ、皮下注射によって毎日送達されるコンジュゲートの、０．１ｎｍｏｌ、１０ｎｍｏｌ、および１００ｎｍｏｌの用量である。図は、海綿骨に有意な変化は観察されなかったことを示す。

【0257】

図２２Ａ～２２Ｃについて、インスリンを、生理食塩水を除くすべての群において２ＩＵ／日で投薬した。０．１ｘ、１０ｘ、および１００ｘの用量は、それぞれ、皮下注射によって毎日送達されるコンジュゲートの０．１ｎｍｏｌ、１０ｎｍｏｌ、および１００ｎｍｏｌである。図は、アバロパラチド（配列番号２）および配列番号８が、インスリン対照と比較して、強度を有意に改善したことを示す。すべての有意水準を、生理食塩水対照群ではなく、インスリン処置群に対して計算した。全体として、配列番号９は、糖尿病患者における骨折治癒を有意に改善しなかった。しかし、アバロパラチド（配列番号２）および配列番号８は、インスリン単独よりも強度と石灰化を改善し、潜在的な治療薬として有望であることを示す。

【0258】

実施例１５：骨折修復モデル－閉経後の骨粗しょう症
骨粗しょう症の間に骨格全体に存在する増加した吸収窩は、骨粗しょう症の存在だけでは中度の局在化部位として機能する。しかしながら、局在化は、骨粗しょう症の間、骨格の他の場所でも依然として起こる。その大部分は骨折部位に依然として局在している。このため、ある種の骨標的療法を禁忌とする必要がある集団をもたらすことがある。しかしながら、骨折をした骨粗しょう症患者にとって、吸収窩を治癒するための標的外骨格への影響は、実際にはプラスの副作用となり、問題を呈し得ない。将来の骨折を予防するために、骨折を治癒し、かつ骨粗しょう症も処置するという二重の効果が期待できるであろう。

【0259】

８週齢の雌性Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（ｎ＝１０）に、両側卵巣摘出を介して閉経後骨粗しょう症を外科的に誘発させた。骨粗しょう症を、マイクロＣＴによって測定される骨ミネラル密度の全体的な喪失を介して確認した。

【0260】

マウスを、２～３％イソフルランを使用して麻酔した。ブプレノルフィン（０．０３ｍｇ／ｋｇ）を、術後疼痛緩和のために皮下投与した。腸骨稜から背側に３ｃｍ×２．５ｃｍの面積を削った。その面積を、ベタジン、続いて７０％エタノールで洗浄し、次いでドレーピングした。２ｃｍの正中切開を行い、皮膚を、下の筋膜から切開した。筋膜を通して正中線の１ｃｍの側切開を行い、腹腔に到達した。腹腔内の卵巣を囲む脂肪組織を引き戻し、静かに引き抜いた。

【0261】

卵巣を分離し、この構造から０．５ｃｍ近位にある子宮角と血管を結紮した。卵巣を摘出し、このプロセスを対側で繰り返した。モノフィラメント縫合を用いて、腹腔を閉じ、続いて皮膚も閉じた。マウスを、清潔な回復ケージに入れ、麻酔から覚醒することを可能にした。マウスに、ブプレノルフィンを１２時間ごとに３～５日間投薬した。骨粗しょう症が４～６週間以内に発症すると予想し、その時点でマウスに、上記のように大腿骨骨折の安定化を受けさせた。

【0262】

骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を、骨粗しょう症の発症を確認するため、卵巣摘出前および卵巣摘出８週間後に測定した。８週間、低エストロゲンレベルに長期間曝露した後、マウスの大腿骨に髄間釘を留置し、次いでアインホルン骨折モデルを、落錘を介して誘発し、Ｘ線によって確認した。マウスに４週間毎日投与した。構造変化を、マイクロＣＴを介して定量化し、機械的特性を、４点曲げ破壊試験で評価した。

【0263】

Ｓ０４５６、ｂｏｃ－ｔｙｒａｍｉｎｅ、およびＫＯＨを、脱気された５０ｍＬのＲＢフラスコに投入した。ＤＭＳＯ（５ｍＬ）を加えて固体をすべて溶解し、次いで混合物をアルゴン雰囲気下、６０℃で１．２時間撹拌した。結果として得た混合物を、室温まで冷却し、および冷酢酸エチル（５０ｍＬ）に滴下添加し。結果として得た混合物を、激しく撹拌し、次いで３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。遠心分離後、濃緑色の固体を、コニカルチューブの底に見ることができた。上澄液（ごくわずかに緑がかった透明な溶液）を、新しい冷酢酸エチルのバッチが固体に添加される前に、捨てた。混合物を激しく撹拌し、前と同じ遠心分離工程にかけた。結果として得た暗緑色の固体を、４０％ＴＦＡ／ＤＣＭ溶液（５ｍＬ）が添加される前に、真空デシケーターで一晩乾燥させた。混合物を、すべてのＴＦＡおよびＤＣＭを除去するために、真空中で濃縮する前に室温で３０分間撹拌した。濃縮された粗製物を、３ｍＬの水に溶解し、および分取ＨＰＬＣ精製にかけた。Ｓ０４５６－ｔｙｒａｍｉｎｅの純粋な画分を収集し、真空中で濃縮し、凍結し、および凍結乾燥させ、ふわふわの暗緑色の固体として純粋な生成物をもたらした。この固体（１２０ｍｇ）を、Ｎ－スクシンイミジル ３－マレイミドプロピオネート（３０ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（４０μＬ）とともにＤＭＳＯ（３ｍＬ）に溶解し、それにより、分取ＨＰＬＣでの精製の前にアルゴン雰囲気下で１時間撹拌した。Ｓ０４５６－マレイミドの純粋な画分を収集し、真空中で濃縮し、凍結し、および凍結乾燥させ、それにより、暗緑色のふわふわした固体（１２５ｍｇ）として純生成物をもたらした。

【0264】

Ｄ_１０－Ｃｙｓは、以下のように合成した。ＳＰＰＳ樹脂の初期負荷のために、２－クロロトリチル塩化樹脂（０．４ｇ、１．４ｍｍｏｌ／ｇ）を、ＤＣＭ（１０ｍＬ／ｇ樹脂）で膨潤させ、続いてＤＣＭ（１４ｍＬ）に溶解したＦｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（１．１５ｇ、２．８ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．６６ｍＬ、９．５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、１時間アルゴンをバブリングすることによって撹拌し、その後、溶液を、２０ｍＬのキャッピングカクテル（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＤＩＰＥＡ＝１７：２：１）が添加される前に、排出し、および溶液を、再び２０分間バブリングした。次いで、樹脂を、各カップリング反応後にＤＭＦ（３回）、ＤＣＭ（３回）、およびＩＰＡ（３回）で洗浄、ならびに各脱保護後にＤＭＦ（３回）で洗浄することからなる標準的な洗浄手順にかけた。最初の負荷の後、すべての後に続くカップリング反応を、ＤＭＦ（１４ｍＬ）中のＦｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（１．１５ｇ，２．８ｍｍｏｌ）、もしくはＦｍｏｃ－Ｓ－トリチル－Ｌ－システイン（１．６４ｇ，２．８ｍｍｏｌ），ＰｙＢＯＰ（１．４２ｇ，２．７５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．６６ｍＬ，９．５ｍｍｏｌ）の溶液で実行した。１時間の標準カップリング時間を、すべてのアスパラギン酸およびシステイン残基のために使用した。Ｆｍｏｃ－脱保護を、各５分と１０分の２セッションにおいて、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン溶液を用いて行った。１１量体のペプチド生成物を、９０％ＴＦＡ、３．３％ＴＩＰＳ、３．３％水、３．３％ＥＤＴからなる切断カクテルを用いて、樹脂から切断した。切断の後、粗生成物を、大部分のＴＦＡ、水、ＴＩＰＳ、およびＥＤＴを除去するために減圧下で濃縮し、次いで、Ｅｔ_２Ｏで３回洗浄し、ならびに白色粉末としてＤ_１０－Ｃｙｓ １を生成するために、減圧下で２４時間乾燥させた（６８０ｍｇ、全収率８１．３％、平均カップリング効率９８．１％）。

【0265】

Ｄ_１０－Ｓ０４５６複合体を、以下のように合成した。Ｓ０４５６－マレイミド（１００ｍｇ）を、アルゴンで脱気されたフラスコ中で２ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、続いてＤ_１０－Ｃｙｓを溶液に添加し、撹拌を伴った。混合物を、分取ＨＰＬＣで精製する前に、室温で２．５時間攪拌した。精製し、かつ凍結乾燥した生成物は、緑色のふわふわした固体（５７ｍｇ）として現れた。

【0266】

前述のように大腿骨中節骨折および両側卵巣摘出術を受けた雌性１２週齢のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒに、１０ｎｍｏｌのＳ０４５６コンジュゲートを襟首付近に皮下注射した。２４時間後に、それらを犠牲にし、剖検を実行した。組織を、Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ａｍｉ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍで、７４５ｎｍで５％の励起力で１秒間励起して撮影した。蛍光発光を８１０ｎｍで収集した。

【0267】

カルシウムイオン（Ｃａ^２＋）の定量的な測定およびカルシウム代謝に対する薬物効果の評価について、ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）のＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ Ｃａｌｃｉｕｍ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用した。キットに含まれるフェノールスルホンフタレイン色素は、遊離カルシウムと非常に安定した青色の複合体を特異的に形成する。６１２ｎｍで測定される色の強度は、サンプル中のカルシウム濃度に正比例する。最適化された製剤は、マグネシウム、脂質、タンパク質、およびビリルビンなどの物質による任意の干渉を最小限に抑える。投薬２１日後の治療試験終了時にマウスから１ｍＬの血液を、３％イソフルランで誘導した麻酔下で心臓穿刺により、採血した。細胞をペレット化するために、血液を、５００Ｇで５分間回転した。血清を細胞ペレットから除去し、かつカルシウム濃度定量になるまで－８０℃で保存した。１２５μＬの２０ｍｇ／ｄＬ標準と１２５μＬのｄＨ_２Ｏを混合することで、標準を１０ｍｇ／ｄＬ Ｃａ２^＋に希釈した。全血サンプル（５μＬ）を、ウェルに移した。次に、２００μＬの作業試薬を添加し、プレートを、混合するために軽く叩いた。その後、サンプルを室温で３分間培養し、および５７０～６５０ｎｍの光学濃度（６１２ｎｍの吸光度ピーク）がＯＤＳＡＭＰＬＥを得るために読み取られた。その後、１０ｍｇ／ｄＬ標準（５μＬ）は、サンプルウェルに移した。プレートを混合するために叩き、および光学密度を、ＯＤＳＴＡＮＤＡＲＤを得るために同じ波長で測定した。次に、２０ｍＭ ＥＤＴＡ ５μＬを、先程と同じウェルに添加し、およびプレートを、混合するために叩いた。同じ波長で光学密度を読み取り、ＯＤＢＬＡＮＫを得た。全血サンプル濃度を、以下のように計算した。
［Ｃａ^２＋］＝（ＯＤＳＡＭＰＬＥ－ＯＤＢＬＡＮＫ）／（ＯＤＳＴＡＮＤＡＲＤ－ＯＤＳＡＭＰＬＥ）ｘ１０ｘｎ（ｍｇ／ｄＬ）
式中、ＯＤＳＡＭＰＬＥ、ＯＤＢＬＡＮＫ、およびＯＤＳＴＡＮＤＡＲＤはそれぞれＳａｍｐｌｅ、Ｓａｍｐｌｅ Ｂｌａｎｋ、および、Ｓａｍｐｌｅ ｐｌｕｓ ＳｔａｎｄａｒｄのＯＤ測定値であり、１０は標準の濃度（ｍｇ／ｄＬ）、ｎはサンプル希釈倍数である。計算されたカルシウム濃度が１０ｍｇ／ｄＬより大きい場合、サンプルをｄＨ_２Ｏで希釈し、アッセイを繰り返した。次いで、その結果に希釈倍数ｎを掛けた。

【0268】

当初、４つの化合物を試験した。配列番号３、配列番号６、および配列番号７は、いずれも健康な大腿骨骨折の治癒を繰り返し促進しており、アバロパラチド（配列番号２）は副甲状腺関連タンパク質ホルモンの安定化バージョンであった。ダサチニブは、骨芽細胞と破骨細胞の両方に対して標的外効果を有するＳＲＣキナーゼであり、全体の骨密度を向上させる。また、老化細胞除去剤であることも示される。ＩＴＧＡは、膜内骨折治癒を促進するフィブロネクチン模倣薬である。

【0269】

配列番号１０（２０個のグルタミン酸残基を有するコンジュゲート）を除くすべての標的化合物は、生理食塩水と比較して骨折カルスの石灰化および密度を改善し、エストロゲン補充よりもかなり改善した（図２３Ａ～Ｂ）。

【0270】

図２３Ａおよび２３Ｂについては、安息香酸エストロゲンを、３０μｇ／ｋｇで毎週投薬した。０．１ｘ、１ｘ、および１０ｘの用量は、それぞれ皮下注射によって毎日送達されるコンジュゲートの０．１ｎｍｏｌ、１ｎｍｏｌ、および１０ｎｍｏｌである。配列番号６を、１日おきに１０μｍｏｌ／ｋｇで投薬した。

【0271】

同じ３つの化合物は、大腿骨の強度を改善するのに有効であることが証明された（図２４Ａ～Ｃ）。

【0272】

図２４Ａ～Ｃに関して、安息香酸エストロゲンを、３０μｇ／ｋｇで毎週投薬した。０．１ｘ、１ｘ、および１０ｘの用量は、それぞれ、皮下注射によって毎日送達されるコンジュゲートの０．１ｎｍｏｌ、１ｎｍｏｌ、および１０ｎｍｏｌである。配列番号６を、１日おきに１０μｍｏｌ／ｋｇで投薬した。

【0273】

化合物の多くは、エストロゲン補充でエストロゲンの喪失を制御するよりも、この低エストロゲン状態における骨折大腿骨の治癒をはるかに良好に有意に改善した。このことは、標的化合物を、骨折した骨粗しょう症患者をより早く治癒することに役立てるために魅力的となり得る。著しく障害を患った患者集団を表している糖尿病マウスで見出されたように、対照マウスのカルス治癒のすべての測定基準は、標準的な健康マウスのものよりも有意に低かった。

【0274】

骨粗しょう症のマウスを、遊離同化物（配列番号１）または標的同化物（ａｂａｌｏｐａｒａｔｉｄｅ＿Ｄ_１０（配列番号１の標的安定化バージョン））のいずれかで４週間処置する効果が調べられた。高齢のマウスは自然に骨密度の低下を発症するので、加齢による骨粗しょう症を発症した２０ヶ月齢のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ 雌性マウスを検査した。骨粗しょう症によって最も影響を受ける領域である大腿骨、骨盤、および腰椎に存在する平均骨ミネラル密度は、骨格の影響を受ける部分の骨ミネラル密度を定量化するために、標準ファントムを使用してＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ｍｉｃｒｏ－ＣＴを介して定量化した。マウスを、４週間処置した。

【0275】

標的治療および遊離型治療は、処置されたマウスのＢＭＤを改善した。骨粗しょう症の処置における標的薬剤の利点を判断するために、他の測定基準を評価する必要がある。両方が改善することに有効であれば、副作用を減らすという観点で、標的薬剤は依然として望ましいことがある。遊離型の骨粗しょう症治療薬は、全身的な副作用によって制限がある。特に副甲状腺科は、血中カルシウムに対する効果によって制限される。しかし、図２５で明らかなように、Ｆｏｒｔｅｏ（登録商標）の標的型（配列番号１３）は、遊離型と比較して血中カルシウムを有意に増加させなかった。

【0276】

０．１ｎｍｏｌの遊離型ＰＴＨ（Ｆｏｒｔｅｏ（登録商標）の標的型）を、生理食塩水を対照として使用し、標的型ＰＴＨ（配列番号１３）と比較した。つまり、骨粗しょう症は全身疾患であるが、標的同化剤は、副甲状腺ホルモンの腎臓で起こるカルシウム代謝の調節への影響を制限することができるので、遊離型同化剤とは反対に標的同化剤を使用する利点がある。

【0277】

実施例１６：骨折修復モデル－顎顔面
化合物の適用結果を、以下の５つのラットモデル（ｉ）重要でないサイズの下顎欠損を使用してモデル化された顎骨骨折（図２９、パネル１）、（ｉｉ）骨移植材で満たされた重要なサイズの欠損を導入することでモデル化された主要顎顔面外科手術（図２９、パネル２）、（ｉｉｉ）移植された金属のオッセオインテグレーション（図２９、パネル３）、（ｉｖ）重大なサイズの頭蓋欠損（図２９、パネル４）、および（ｖ）マイクロプレートで安定化させた下顎骨切り術（図２９，パネル５および６）において、検討した。ある程度の治癒が、下顎欠損を除くすべての手術で、観察された。マイクロプレートで安定化させた下顎骨切り術は、将来的に最も成功する可能性を明示する。術後３週間までに、劇的な改善が、骨切りの隙間の減少において観察され、処置群の隙間の直径は、生理食塩水対照群の直径の１３％だった（ｐ＜０．０１）。マイクロアーキテクチャーも改善された。処置群では、骨の構造がほぼ正常な骨にリモデリングされた一方、生理食塩水群では明らかな隙間が残っていた。最後に、処置した顎が壊れる前に耐えられる最大負荷は生理食塩水の２．７倍であり（ｐ＜０．５）、および処置した顎の強度を対側の顎の強度と比較すると、骨折していない骨の強度に戻っていることが判明した。結果は図２９にまとめられ、欠損と移植、および頭蓋欠損について薬剤対非石灰化面積（ｍｍ^２）、スクリューについて薬剤対移動率（％）、下顎骨切り術について薬剤対隙間直径（ｍｍ）、ならびに下顎骨切り術の薬剤対最大負荷（Ｎ）のグラフを示す。

【0278】

実施例１７：疼痛／機能の結果
マウスの疼痛／機能の結果を、行動試験に目を向けることによって入手した。アロディニアを、Ｖｏｎ Ｆｒｅｙプローブを用いて評価する一方、ＤｉｇｉＧａｉｔを用いて利得を評価し、ランニングホイールを用いて機能性を評価し、自発運動オープンフィールド試験を用いて機能性と関連する不安を評価した。自発運動オープンフィールド試験は、最も一貫した測定をもたらした。

【0279】

マウスを、自発運動活性の試験前に３０～６０分間、行動観察室に順化させた。動物を、実験開始前に、一度、自発運動器ボックスに１０分間順価させた。次いで、それらを、赤外線追跡ビームを有する自発運動ボックスに１０分間個別に入れ、その後取り出し、ホームケージに戻した。マウスを、３点指向性テストを使用し、ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎを介して追跡した。マウスを、実験前に２週間測定した。次いで、それらに、大腿骨中節骨折モデルを受けさせ、およびそれらを、１）アバロパラチドＤＥ２０を週２回投与、２）リン酸緩衝生理食塩水を週２回投与、３）その水の中にイブプロフェン（０．６ｇ／Ｌ）の３つの治療群のいずれかに割り当てた。マウスを、骨折後５週間処置し、かつ１週間に１回測定した。

【0280】

ベースライン状態では、すべてのマウスが、ボックスの中の至る所を走り回り、これは元気であることを示すものである。しかしながら、骨折後、生理食塩水とイブプロフェンで処置したマウスは、端や隅にいることを好み、そのことはそれらが体調不良や不安を感じていることを示した。アバロパラチドで処置したマウスは、以前のような良好な状態に戻り、至る所を走り回った。興味深いのは、イブプロフェンを投与したマウスは、疼痛／機能の結果が改善されなかったことである。イブプロフェンは骨折の修復を阻害することが知られているので、受けた鎮痛は、動物の治癒が低下することにより克服され得る。しかしながら、配列番号４のマウスによる骨折の治癒を促進することは、より多くの機能性およびより良い健康につながったのである。マウスは、より良い健康を有することを示す領域に局在化しただけでなく、図２６～２８に示すように、この試験の自発運動部分において、それらの機能性の判定基準を定量的に改善した。

【0281】

図２６は、日数対移動距離（ｃｍ）のグラフであり、これは、異なる処置群（ｎ＝７）について、自発運動オープンフィールドボックスにおいて１０分間の期間に移動した平均総距離を示すものである。図２７は、日数対移動時間のグラフであり、これは、異なる処置群（ｎ＝７）について、自発運動オープンフィールドボックスで１０分間の間に移動に費やされた平均時間を示すものである。図２８は、日数対平均速度（ｃｍ／ｓ）のグラフであり、これは、異なる処置群（ｎ＝７）について、自発運動オープンフィールドボックスにおける１０分間の時間における平均速度を示すものである。

【0282】

図２６～２８について、０日目は骨折前のベースラインデータを表す。生理食塩水および配列番号４（１ｎｍｏｌ）を２回／週注射した。イブプロフェンを、マウスの水中に０．６ｇ／Ｌの濃度で絶えず投与した。

【0283】

図２６は、アバロパラチドで処置したマウスがより遠くまで走り始めたことを示し、一方、図２７は、より長い時間走り始めたことを示し、および図２８は、アバロパラチドで処置したマウスがより速く走り始めたことを示す。これらの測定基準はすべて、機能性の向上とパフォーマンスの改善を示しており、このことは、マイクロＣＴやバイオメカニカルテストを介して定量化された構造的かつ機械的治癒の増加が、機能性の向上と疼痛の軽減にも対応していることを示している。これらの結果は、ＢＭＰ処置で見られたと報告されてきたものの、すなわち、ＢＭＰは、骨折修復のために承認されているにもかかわらず、疼痛または機能性を改善しないということを上回るものである。そこで、骨折後２～３週間の間に、骨を以前の折れていない強度に戻す標的骨同化剤である配列番号４を動物に投薬することで、疼痛の軽減は、それまでに実現することができる。

【0284】

実施例１８：ＰＫ特性
配列番号４を、骨折を伴うマウスに皮下注射した。^１２５Ｉ標識アバロパラチドおよび配列番号４に関する、循環半減期（４．２時間対３．７時間）または累積全身性曝露（ＡＵＣ、それぞれ２４．４時間および２０時間）のいずれにおいても有意差が観察されず、そのことは、いかなる標的外曝露または結果として生じる全身性毒性が標的薬剤と非標的薬剤の間で同様であろうことを示している。結果は、図３０に示されており、これは、大腿骨中節骨折を起こしたマウスの時間対血中注射用量パーセント（ｃｐｍ／ｇ）のグラフである。対照的に、骨折部位における２つのアバロパラチドの滞留時間には大きな差が観察され、そこでは、配列番号４の半減期が６７時間であることが判明したのに対し、非標的アバロパラチド（配列番号２）は８．８時間であった。半減期の差は、アバロパラチド（配列番号２）に対して配列番号４の累積滞留時間（ＡＵＣ）が１１倍大きくなる（すなわち、８時間に対して９６時間）こともたらした。対側の大腿骨における配列番号４の滞留時間は、骨折した大腿骨における滞留時間よりも８倍低く、このことは、健康な骨の成長を刺激することに関する懸念が、最小限であろうことが示された。この結果は、図３１に示され、これは、大腿骨中節骨折のマウスの時間対骨内注射量パーセント（ｃｐｍ／ｇ）のグラフである。こうして、Ｄ－Ｇｌｕ_２０標的アバロパラチドおよびＤ－Ｇｌｕ_２０非標的アバロパラチドの全身曝露は同様であるが、骨折表面における配列番号４の濃度が著しく高まることは、関連する骨折の修復率を改善することが予想される。

【0285】

請求される発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。こうして、本発明は、好ましい実施形態および任意選択の特徴に関して、具体的に開示されているが、当業者は、本明細書に開示される概念の修正および変形に頼り得ることを理解されたい。そのような修正および変形は、本明細書で請求される本発明の範囲内であると考えられる。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20A】

【図20B】

【図21A】

【図21B】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図23A】

【図23B】

【図24A】

【図24B】

【図24C】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【配列表】

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【国際調査報告】