特表 2024-506645 転写調節遺伝子の編集による疾患の治癒

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-14

(54)【発明の名称】転写調節遺伝子の編集による疾患の治癒

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240206BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240206BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20240206BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 100

C12N15/09 110

C12N15/63 Z ZNA

C12N9/16

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2023548560

(86)(22)【出願日】2022-02-11

(85)【翻訳文提出日】2023-10-06

(86)【国際出願番号】 EP2022053341

(87)【国際公開番号】W WO2022171783

(87)【国際公開日】2022-08-18

(31)【優先権主張番号】21156461.2

(32)【優先日】2021-02-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】511183559

【氏名又は名称】コーニンクレッカ ネザーランド アカデミー ヴァン ウェテンシャッペン

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(72)【発明者】

【氏名】デ ラート，ワウテル レオナルド

(57)【要約】

本発明は、γグロビン１（ＨＢＧ１）および２（ＨＢＧ２）のうちの少なくとも１つの発現を増大させるためのエクスビボでの方法に関する。本方法は、ヘモグロビン異常症の処置または予防に使用することができる。本方法は、第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼを細胞に導入するステップを含み、第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼが、染色体における第１および第２の二本鎖切断を生じさせ、これによって、第１の、介在する第２の、および第３の染色体断片を生成し、ここで、ｉ）第１の断片が、βグロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）または機能的なその断片を含み、かつｉｉ）第３の断片が、ＨＢＧ１およびＨＢＧ２のうちの少なくとも１つをコードする配列を含む。第２の介在断片の長さは、少なくとも約５ｋｂであり、第３の断片への第１の断片の結合が、ＨＢＧ１およびＨＢＧ２のうちの少なくとも１つをコードする配列にβグロビンのＬＣＲを作動可能に連結させ、これによって、ＨＢＧ１タンパク質およびＨＢＧ２タンパク質のうちの少なくとも１つの発現を増大させる。本発明は、さらに、本発明の方法において使用するための組成物にも関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

γグロビン１（ＨＢＧ１）および／または２（ＨＢＧ２）の発現を増大させるためのエクスビボでの方法であって、前記方法が、第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼを細胞に導入するステップを含み、
前記第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼが、１１番染色体における第１および第２の二本鎖切断を生じさせ、これによって、第１の、介在する第２の、および第３の染色体断片を生成し、ここで、
ｉ）前記第１の断片が、βグロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）またはその機能的断片を含み、かつ
ｉｉ）前記第３の断片が、ＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２をコードする配列を含み、
前記第１の二本鎖切断が、ＬＣＲ内またはＬＣＲの下流に位置し、
前記第２の二本鎖切断が、ＨＢＧ１転写開始部位の上流に位置し、
前記介在する第２の断片の長さが、少なくとも約６ｋｂであり、
かつ、前記第３の断片への前記第１の断片の結合が、ゲノム距離を減少させ、かつＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２をコードする配列にβグロビンのＬＣＲを作動可能に連結させ、これによって、ＨＢＧ１タンパク質および／またはＨＢＧ２タンパク質の発現を増大させる、
方法。

【請求項2】

前記細胞が、造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）、好ましくは造血前駆細胞（ＨＰＣ）である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記第１および／または前記第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９タンパク質および／またはシングルガイド（ｓｇ）ＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記ＬＣＲとＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２をコードする前記配列との間の前記ゲノム距離が、前記第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼを導入する前の前記ＬＣＲとＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２をコードする前記配列との間の前記ゲノム距離と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも９５％減少している、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記第１の断片が、ＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ５、ＨＳ４、ＨＳ３、ＨＳ２、およびＨＳ１を含み、かつ、前記第１の二本鎖切断が、ＨＳ１から約３００ｂｐ未満の位置にある、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記第１の二本鎖切断がＬＣＲ内に位置する、好ましくは、前記第１の二本鎖切断がＨＳ１、ＨＳ２、もしくはＨＳ３内に位置するか、または
ｉ）ＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ１とＨＳ２との間、
ｉｉ）ＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ２とＨＳ３との間、もしくは
ｉｉｉ）ＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ３とＨＳ４との間
に位置し、
好ましくは、前記第１の二本鎖切断がＨＳ１とＨＳ２との間に位置する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記第２の二本鎖切断が、
ｉ）ＨＢＧ１転写開始部位から－１～－１０００ｂｐの間にある位置、好ましくは、ＨＢＧ１転写開始部位から－５０～－２００ｂｐの間にある位置、または
ｉｉ）ＨＢＧ２転写開始部位から－２００～－７００ｂｐの間にある位置
にある、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記介在する第２の断片の長さが、少なくとも約７、８、９、または少なくとも約１０ｋｂである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

疾患の処置または予防において使用するための、第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼ、またはそれをコードする１つもしくは複数のベクターであって、前記第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼが、染色体における第１および第２の二本鎖切断を生じさせ得、これによって、第１の、介在する第２の、および第３の染色体断片を生成し、ここで、
ｉ）前記第１の断片が、βグロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）またはその機能的断片を含み、かつ
ｉｉ）前記第３の断片が、ＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２をコードする配列を含み、
前記第２の介在断片の長さが少なくとも約５ｋｂであり、前記第３の断片への前記第１の断片の結合が、ＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２をコードする配列にβグロビンのＬＣＲを作動可能に連結させ、これによって、ＨＢＧ１タンパク質および／またはＨＢＧ２タンパク質の発現を増大させる、
前記エンドヌクレアーゼ、またはそれをコードする１つもしくは複数のベクター。

【請求項11】

ヘモグロビン異常症の処置または予防において使用するための、請求項１０に記載の第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼ。

【請求項12】

請求項１１に記載の、使用するための第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼであって、前記ヘモグロビン異常症が鎌状赤血球症またはβサラセミアである、前記エンドヌクレアーゼ。

【請求項13】

ヘモグロビン異常症を処置する方法であって、
ヘモグロビン異常症に罹患している対象から１つまたは複数の造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）を単離するステップ、
第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼを前記単離されたＨＳＰＣに導入することによって、１つまたは複数のＨＳＰＣを修飾するステップであって、前記第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼが、染色体における第１および第２の二本鎖切断を生じさせ、これによって、第１の、介在する第２の、および第３の染色体断片を生成し、ここで、
ｉ）前記第１の断片が、βグロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）またはその機能的断片を含み、かつ
ｉｉ）前記第３の断片が、ＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２をコードする配列を含み、かつ
前記第２の介在断片の長さが少なくとも約５ｋｂであり、前記第３の断片への前記第１の断片の結合が、ＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２をコードする配列にβグロビンのＬＣＲを作動可能に連結させ、これによって、ＨＢＧ１タンパク質および／またはＨＢＧ２タンパク質の発現を増大させる、ステップ、ならびに
修飾されたＨＳＰＣを対象に投与するステップ
を含む、方法。

【請求項14】

前記ＨＳＰＣが造血前駆細胞（ＨＰＣ）である、請求項１４に記載の方法。

【請求項15】

前記対象の末梢血中のＨＢＧ１タンパク質および／またはＨＢＧ２タンパク質レベルを増大させる、請求項１３または１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遺伝子発現の分野に関する。さらに具体的には、本発明は、特定の染色体断片の切除および結合を介して遺伝子発現を制御するための組成物および方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

当技術分野において公知の多くの疾患は、異常な遺伝子発現および／または改変した活性を有する突然変異タンパク質の発現によって生じる。非限定的な例としては、ヘモグロビン異常症、例えば鎌状赤血球症（ＳＣＤ）およびβサラセミア（ｔｈａｌ）が含まれる。

【0003】

鎌状赤血球症（ＳＣＤ）では、成体型βグロビン遺伝子のコード部分における点突然変異がヘモグロビンのミスフォールディングを生じさせて、赤血球系細胞を鎌のような形状にさせ、この形状が細い血管を遮断する。βサラセミア（ｔｈａｌ）では、突然変異は成体型βグロビン遺伝子において未熟な停止コドンを生じさせる場合があるか、または、成体型βグロビン遺伝子の発現レベルを低減させる場合がある。これによって、αグロビンタンパク質とβグロビンタンパク質との間の不均衡、貧血、および、身体が貧血を補おうとする中での血球産生の過剰活性化が生じる。ＳＣＤおよびｔｈａｌは双方とも非常に重度の疾患であり、現在の疾患管理は、ほとんどの場合、出生前診断を介するものである。

【0004】

最近、遺伝子編集戦略が導入され、これら戦略が疾患を治癒し得るかどうかを試すための臨床試験が行われている。これら戦略は、ＣＤ３４＋造血前駆および幹細胞（ＨＰＣ）の単離、標的化された（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）編集、ならびに患者への自己編集されたＨＰＣの注入に依拠している（Zeng et al, Nat Med, 2020;26(4):535-54）。編集では、２つのアプローチが行われる。ＳＣＤでは、成体型βグロビンのコード部分における疾患の原因となる突然変異を復帰させるために、塩基編集が適用される。ＳＣＤおよびｔｈａｌの双方で、ＢＣＬ１１Ａの発現レベルは、ＢＣＬ１１Ａエンハンサーの編集を介して低減する（例えば、Frangoul et al, N Engl J Med, 2021;384(3):252-260を参照されたい）。ＢＣＬ１１Ａは、胎児型グロビン遺伝子の発現のリプレッサーである。細胞内のＢＣＬ１１Ａ量を低減させることによって、胎児型グロビン遺伝子の発現は再活性化され、成体型グロビン遺伝子発現が低減する。

【0005】

赤血球系細胞では、複数のＤＮａｓｅ Ｉ高感受性部位（ＨＳ）から構成される、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）と呼ばれる強力な遠位エンハンサーが、発生的に動的な様式で、βグロビン遺伝子に物理的に近接している（Carter D et al, Nat Genet. 2002; 32:623-626、Tolhuis B et al, Molecular Cell. 2002; 10:1453-1465）。実際、ヒトは、胎児期に特異的なβ様グロビン（γグロビンまたは胎児型βグロビン）遺伝子を有しており、これは、ＬＣＲに接しており、また、胎児肝臓での赤血球生成の開始から、血液形成が骨髄に徐々に移行する出生まで、転写される。

【0006】

βグロビン遺伝子クラスターは、連続的な様式で、ＬＣＲ、胚型イプシロン（ε）グロビン、胎児型（ＨＢＧ２（Ｇγ）およびＨＢＧ１（Ａγ））グロビン、ならびに成体型（δおよびβ）グロビン遺伝子を含む。これまでに、成体型赤血球系細胞における、胎児型グロビン遺伝子へのβグロビンＬＣＲの強制的なループ形成は、胎児型グロビン遺伝子の発現を再活性化し、また同時に、成体型グロビン遺伝子発現を下方調節する（ＬＣＲを胎児型遺伝子に近づけることによって、ＬＣＲは、成体型グロビン遺伝子に接してこれを活性化するその能力が妨げられる）ことが実証されている（Deng et al, Cell, 2014;158(4):849-860）。しかし、強制的なループ形成は、人工のループ形成因子の導入および安定的な発現を必要とし、当該人工のループ形成因子は、胎児型グロビンの発現を一時的に活性化することができるだけであり、頻繁な処置レジメを必要とし、その効率的な処置の可能性を妨げている。したがって、当技術分野において、ヘモグロビン異常症の効率的な処置、特に、鎌状赤血球症およびβサラセミアの処置が、依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、以下の実施形態にまとめることができる。

【0008】

実施形態１．目的のタンパク質の発現を増大させるためのエクスビボでの方法であって、当該方法が、第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼを細胞に導入するステップを含み、
第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼが、染色体における第１および第２の二本鎖切断を生じさせ、これによって、第１の、介在する第２の、および第３の染色体断片を生成し、ここで、
ｉ）第１の断片が、エンハンサー配列またはその機能的断片を含み、かつ
ｉｉ）第３の断片が、目的のタンパク質をコードする配列を含み、
第２の介在断片の長さが少なくとも約５ｋｂであり、第３の断片への第１の断片の結合が、目的のタンパク質をコードする配列にエンハンサー配列を作動可能に連結させ、これによって、目的のタンパク質の発現を増大させる、
方法。

【0009】

実施形態２．細胞が、造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）、好ましくは造血前駆細胞（ＨＰＣ）である、実施形態１に記載の方法。

【0010】

実施形態３．第１および第２の部位特異的なヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択される、実施形態１または２に記載の方法。

【0011】

実施形態４．第１および／または第２の部位特異的なヌクレアーゼが、Ｃａｓ９タンパク質およびシングルガイド（ｓｇ）ＲＮＡのうちの少なくとも１つを含むＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体である、実施形態３に記載の方法。

【0012】

実施形態５．エンハンサー配列と目的のタンパク質をコードする配列との間のゲノム距離が、第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼを導入する前のエンハンサー配列と目的のタンパク質をコードする配列との間のゲノム距離と比較して少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも約９５％減少している、上記実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0013】

実施形態６．目的のタンパク質が、γグロビン１（ＨＢＧ１）および２（ＨＢＧ２）のうちの少なくとも１つであり、かつエンハンサー配列がβグロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）である、上記実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0014】

実施形態７．第１の断片が、ＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ５、ＨＳ４、ＨＳ３、ＨＳ２、およびＨＳ１を含み、かつ、第１の二本鎖切断が、ＨＳ１から約３００ｂｐ未満の位置にある、実施形態６に記載の方法。

【0015】

実施形態８．第１の二本鎖切断がＬＣＲ内に位置する、好ましくは、第１の二本鎖切断がＨＳ１、ＨＳ２、もしくはＨＳ３内に位置するか、または
ｉ）ＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ１とＨＳ２との間、
ｉｉ）ＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ２とＨＳ３との間、もしくは
ｉｉｉ）ＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ３とＨＳ４との間
に位置し、
好ましくは、第１の二本鎖切断がＨＳ１とＨＳ２との間に位置する、実施形態６に記載の方法。

【0016】

実施形態９．第２の二本鎖切断が、
ｉ）ＨＢＧ１転写開始部位から－１～－１０００ｂｐの間にある位置、好ましくは、ＨＢＧ１転写開始部位から－５０～－２００ｂｐの間にある位置、または
ｉｉ）ＨＢＧ２転写開始部位から－２００～－７００ｂｐの間にある位置
にある、上記実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0017】

実施形態１０．介在する第２の断片の長さが、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または少なくとも約１５ｋｂである、上記実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0018】

実施形態１１．疾患の処置または予防において使用するための、第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼ、またはそれをコードする１つもしくは複数のベクターであって、第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼが、染色体における第１および第２の二本鎖切断を生じさせ得、これによって、第１の、介在する第２の、および第３の染色体断片を生成し、ここで、
ｉ）第１の断片が、エンハンサー配列またはその機能的断片を含み、かつ
ｉｉ）第３の断片が、目的のタンパク質をコードする配列を含み、
第２の介在断片の長さが少なくとも約５ｋｂであり、第３の断片への第１の断片の結合が、目的のタンパク質をコードする配列にエンハンサー配列を作動可能に連結させ、これによって、目的のタンパク質の発現を増大させる、
エンドヌクレアーゼ、またはそれをコードする１つもしくは複数のベクター。

【0019】

実施形態１２．ヘモグロビン異常症の処置または予防において使用するための、実施形態１１において定義されている第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼであって、目的のタンパク質が、ＨＢＧ１およびＨＢＧ２のうちの少なくとも１つである、エンドヌクレアーゼ。

【0020】

実施形態１３．実施形態１２に記載の、使用するための第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼであって、ヘモグロビン異常症が鎌状赤血球症またはβサラセミアである、エンドヌクレアーゼ。

【0021】

実施形態１４．ヘモグロビン異常症を処置する方法であって、
－ ヘモグロビン異常症に罹患している対象から１つまたは複数の造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）を単離するステップ、
－ 第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼを単離されたＨＳＰＣに導入することによって、１つまたは複数のＨＳＰＣを改変するステップであって、第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼが、染色体における第１および第２の二本鎖切断を生じさせ、これによって、第１の、介在する第２の、および第３の染色体断片を生成し、ここで、
ｉ）第１の断片が、エンハンサー配列またはその機能的断片を含み、かつ
ｉｉ）第３の断片が、目的のタンパク質をコードする配列を含み、
第２の介在断片の長さが少なくとも約５ｋｂであり、第３の断片への第１の断片の結合が、目的のタンパク質をコードする配列にエンハンサー配列を作動可能に連結させ、これによって、目的のタンパク質の発現を増大させ、好ましくは、ＨＳＰＣが造血前駆細胞（ＨＰＣ）である、ステップ、ならびに
－ 改変されたＨＳＰＣを対象に投与するステップ
を含む、方法。

【0022】

実施形態１５．目的のタンパク質が、ＨＢＧ１およびＨＢＧ２のうちの少なくとも１つである、実施形態１４に記載の方法。

【0023】

実施形態１６．対象の末梢血中の胎児型Ｂ－グロビンレベルを増大させる、実施形態１４または１５に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】Ａ）実験の設定の概略図であり、ＬＣＲおよびＧＦＰコード配列の位置が示されている。Ｂ）ＧＦＰ発現レベル、およびＣ）３週間の期間にわたるＧＦＰ発現レベル。

【図2】Ａ）ＨＢＧ遺伝子に（左側）、ならびに、ＬＣＲ内（右側）、ＬＣＲのＨＳ２の上流および内部に切断を生じさせるための、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体のための結合部位を示す概略図である。ＨＢＧプライマーおよびＨＳ２プライマーの位置が矢印で示されている。Ｂ）欠失を生じさせるために使用されたガイドの略図である。Ｃ）ＨＢＧプライマーおよびＨＳ２プライマー（２Ａで示されている）を使用するＰＣＲを示す図であり、ガイドの組合せ３－４、３－５、および３－７を使用してＫ５６２細胞内に欠失が形成されていることを示している。

【発明を実施するための形態】

【0025】

定義
本発明の方法、組成物、使用、および他の態様に関する様々な用語が、明細書および特許請求の範囲の全体を通して使用されている。このような用語は、別段の指示がない限り、本発明が関係する技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。他の具体的に定義されている用語は、本明細書において提供される定義と矛盾しない様式で解釈される。本明細書において記載されるものに類似のまたは同等のあらゆる方法および材料を、本発明を試験するための実施において使用することができるが、好ましい材料および方法が、本明細書において記載されている。

【0026】

「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」：これらの単数形の用語には、内容が別段のことを明らかに示していない限り、複数形の指示物が含まれる。不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、したがって、通常は「少なくとも１つ」を意味する。したがって、例えば、「細胞（a cell）」への言及には、２つ以上の細胞の組合わせ、およびこれに類するものが含まれる。

【0027】

「約」および「およそ」：これらの用語は、量、時間的持続時間、およびこれらに類するものなどの測定可能な値について言及している場合、特定された値からの±２０％または±１０％、さらに好ましくは±５％、またさらに好ましくは±１％、およびまたさらに好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味しており、このような変動は、開示されている方法を行うために適切である。加えて、量、比率、および他の数値は時として、本明細書において、範囲形式で表されている。このような範囲形式は利便性および簡潔さのために使用されていることが理解され、明確に特定された数値を範囲の限界値として含めるが、その範囲に包含される全ての個々の数値または部分範囲も、各数値および各部分範囲が明確に特定されているかのように含めることが、柔軟に理解されるべきである。例えば、約１から約２００の範囲にある比率には、明確に言及されている約１および約２００の限界値が含まれるが、約２、約３、および約４などの個々の比率、ならびに約１０から約５０、約２０から約１００などの部分範囲も含まれることが理解されるべきである。

【0028】

「および／または」：「および／または」という用語は、言及されたケースの１つまたは複数が、単独で生じ得るか、または、言及されたケースの少なくとも１つと組合せで、最大で、言及されたケースの全てと組み合わせて生じ得る、状況を指す。

【0029】

「含む」：この用語は、包括的かつオープンエンドであり、排他的ではないと解釈される。具体的には、当該用語およびこの変形は、特定された特徴、ステップ、または構成成分が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特徴、ステップ、または構成成分の存在を排除するものとは解釈されない。

【0030】

「典型的な」：この用語は、「例、実例、または例証としての役割を果たしている」ことを意味し、本明細書において開示されている他の構成を排除していると解釈されるべきではない。

【0031】

「構築物」、「核酸構築物」、「ベクター」、および「発現ベクター」という用語は、本明細書において互換的に使用され、本明細書において、組換えＤＮＡ技術を使用した結果得られた人為的な核酸分子として定義されている。これらの構築物およびベクターは、したがって、天然に存在する核酸分子から構成されてはいないが、あるベクターは、天然に存在する核酸分子（の部分）を含んでいてもよい。ベクターは、宿主細胞における、構築物に含まれているＤＮＡ領域の発現をしばしば目的とした、宿主細胞への外因性ＤＮＡの送達に使用することができる。構築物のベクター骨格は、例えば、（キメラ）遺伝子が組み込まれているプラスミドであり得るか、または、適切な転写調節配列が既に存在している場合には（例えば、（誘導性）プロモーター）、所望のヌクレオチド配列（例えば、コード配列、アンチセンス、もしくは逆反復配列）のみが転写調節配列の下流に組み込まれる。ベクターは、分子クローニングにおけるそれらの使用を促進するためのさらなる遺伝子エレメント、例えば、選択マーカー、複数のクローニング部位、およびこれらに類するものを含み得る。ベクター骨格は、例えば、当技術分野において公知であるような、バイナリーベクターまたはスーパーバイナリーベクター（例えば、米国特許第５，５９１，６１６号明細書、米国特許出願公開第２００２／１３８８７９号明細書、および国際公開第９５／０６７２２号パンフレットを参照されたい）、同時組み込みベクター、またはＴ－ＤＮＡベクターであり得る。

【0032】

本発明に従った発現ベクターは、細胞への遺伝子発現の導入、好ましくは造血前駆細胞（ＨＰＣ）における、好ましくは部位特異的なヌクレアーゼの発現の導入に特に適している。好ましい発現ベクターは、裸ＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、またはウイルスベクターであり、ＤＮＡ分子は、プラスミドであり得る。好ましい裸ＤＮＡは、直鎖状または環状の核酸分子、例えばプラスミドである。プラスミドは、標準的な分子クローニング技術などによって追加のＤＮＡセグメントが挿入され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ＤＮＡ複合体は、細胞内へのＤＮＡの送達に適した任意の担体に結びついているＤＮＡ分子であり得る。好ましい担体は、リポプレックス、リポソーム、ポリマーソーム、ポリプレックス、ウイルスベクター、デンドリマー、無機ナノ粒子、ビロソーム、および細胞膜透過ペプチドからなる群から選択される。

【0033】

「遺伝子」という用語は、細胞内でＲＮＡ分子（例えば、ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｎｃＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ断片を意味する。転写領域は、本明細書において定義されている遺伝子の一部を形成する、適切な調節領域（例えばプロモーター）に作動可能に連結し得る。遺伝子は、いくつかの作動可能に連結している断片、例えば、プロモーター、５’リーダー配列、コード領域、およびポリアデニル化部位を含む３’非翻訳配列（３’末端）を含み得る。遺伝子は、より大きなＤＮＡ分子、例えば染色体の一部であり得る。遺伝子は、ゲノム内に位置していてよい。好ましくは、転写領域は、目的のタンパク質をコードする。

【0034】

「遺伝子の発現」または「目的のタンパク質の発現」は、ＤＮＡ領域がＲＮＡに転写され、その後、タンパク質またはペプチドに翻訳される、プロセスを指す。

【0035】

「作動可能に連結している」という用語は、機能的関係にあるポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。核酸は、別のヌクレオチド配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結」している。例えば、プロモーター、エンハンサー、または他の転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結している。

【0036】

「エンハンサー」は、１つまたは複数の作動可能に連結している遺伝子の発現を増大させるかまたは誘導するための、１つまたは複数のタンパク質、好ましくは１つまたは複数の転写因子によって認識および結合され得る、一連のヌクレオチドである。本発明において使用するための好ましいエンハンサーは、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）、好ましくはβグロビンのＬＣＲである。

【0037】

「プロモーター」は、１つまたは複数の核酸の転写を制御するために機能する核酸断片を指す。プロモーター断片は、遺伝子の転写開始部位の転写方向に関して上流（５’）に位置しており、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位および転写開始部位の存在によって構造的に同定される。

【0038】

場合によって、「プロモーター」という用語はまた、５’ＵＴＲ領域（５’非翻訳領域）も含み得る（例えば、転写領域が転写および／または翻訳を調節する役割を有している場合があるため、プロモーターは、本明細書において、転写領域の翻訳開始コドンの上流の１つまたは複数の部分を含み得る）。

【0039】

「配列」または「ヌクレオチド配列」：これは、核酸のまたは核酸内のヌクレオチドの順序を指す。換言すると、核酸内のあらゆるヌクレオチドの順序を、配列またはヌクレオチド配列と言うことができる。

【0040】

「相同性」、「配列同一性」、およびこれらに類する用語は、本明細書において互換的に使用される。配列同一性は、本明細書において、配列を比較することによって決定される、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチドもしくはタンパク質）配列または２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の関係として定義される。当技術分野において、「同一性」はまた、場合に応じてアミノ酸配列または核酸配列の間の配列関連性の程度を意味し、これは、一続きのこのような配列の間のマッチによって決定され得る。２つのアミノ酸配列の間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存的アミノ酸置換物を、第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。

【0041】

「相補性」という用語は、本明細書において、完全に相補的な鎖（本明細書の以下において定義されている、例えば、第２の鎖）に対する、ある配列の配列同一性として定義される。例えば、１００％相補的な（または完全に相補的な）配列は、本明細書において、相補鎖と１００％の配列同一性を有すると理解され、例えば、８０％相補的な配列は、本明細書において、（完全に）相補的な鎖に対して８０％の配列同一性を有すると理解される。

【0042】

「同一性」および「類似性」は、公知の方法によって容易に計算することができる。「配列同一性」および「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じてグローバルアラインメントアルゴリズムまたはローカルアラインメントアルゴリズムを使用する、２つのペプチド配列または２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定することができる。長さが類似の配列は、好ましくは、全長にわたって配列を最適に整列させるグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、ニードルマン・ブンシュ）を使用して整列され、一方、長さが実質的に異なる配列は、好ましくは、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、スミス・ウォーターマン）を使用して整列される。次いで、配列は、これら配列が（デフォルトパラメータを使用して例えばプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって最適に整列された場合に）少なくともある程度の最小パーセンテージの配列同一性（以下で定義される）を共有する場合、「実質的に同一」または「本質的に類似」と言われ得る。ＧＡＰは、ニードルマンおよびブンシュのグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、２つの配列をそれらの全長（完全長）にわたって整列させて、マッチの数を最大にし、ギャップの数を最小にする。グローバルアラインメントは、２つの配列が類似の長さを有している場合に配列同一性を決定するために適切に使用される。一般に、ＧＡＰのデフォルトパラメータが使用され、ギャップ生成ペナルティー＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）であり、ギャップ伸長ペナルティー＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）である。ヌクレオチドでは、使用されるデフォルトのスコアリングマトリクスはｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質では、デフォルトのスコアリングマトリクスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919）。配列のアラインメント、および配列同一性パーセンテージのスコアは、コンピュータプログラム、例えば、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．（９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ９２１２１～３７５２ ＵＳＡ）から入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ、バージョン１０．３を使用して、または、オープンソースソフトウェア、例えば、上記のＧＡＰと同じパラメータを使用する、もしくはデフォルトの設定（「ｎｅｅｄｌｅ」および「ｗａｔｅｒ」の両方で、ならびにタンパク質アラインメントおよびＤＮＡアラインメントの両方で、デフォルトのＧａｐギャップオープニングペナルティーは１０．０であり、デフォルトのギャップ伸長ペナルティーは０．５であり、デフォルトのスコアリングマトリクスは、タンパク質ではＢｌｏｓｕｍ６２、ＤＮＡではＤＮＡＦｕｌｌである）を使用する、ＥｍｂｏｓｓＷＩＮバージョン２．１０．０のプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルなニードルマン・ブンシュアルゴリズムを使用する）もしくは「ｗａｔｅｒ」（ローカルなスミス・ウォーターマンアルゴリズムを使用する）を使用して、決定することができる。配列が、実質的に異なる全長を有している場合、ローカルアラインメント、例えば、スミス・ウォーターマンアルゴリズムを使用するローカルアラインメントが好ましい。

【0043】

あるいは、類似性または同一性のパーセンテージは、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用して、公共データベースをサーチすることによって決定することができる。したがって、本発明の核酸配列およびタンパク質配列は、他のファミリーメンバーまたは関連配列を例えば同定するために公共データベースのサーチを行うための「クエリー配列」としてさらに使用することができる。このようなサーチは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＢＬＡＳＴｎプログラムおよびＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチは、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るためには、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るためには、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行うことができる。比較目的でギャップアラインメントを得るためには、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402において記載されているような、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘおよびＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメータを使用することができる。アメリカ国立生物工学情報センターのホームページ、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/を参照されたい。

【0044】

「標的配列」は、標的化される核酸内のヌクレオチドの順序、例えば、部位特異的なエンドヌクレアーゼによって認識される配列を示すためのものである。例えば、標的配列は、ＤＮＡ二本鎖の第１の鎖に含まれるヌクレオチドの順序である。

【0045】

「エンドヌクレアーゼ」は、その認識部位に結合した二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖を加水分解する酵素である。エンドヌクレアーゼは、本明細書において、部位特異的なエンドヌクレアーゼであると理解され、「エンドヌクレアーゼ」および「ヌクレアーゼ」という用語は、本明細書において互換的に使用される。制限エンドヌクレアーゼは、本明細書において、二本鎖の両方の鎖を同時に加水分解してＤＮＡに二本鎖切断を導入するエンドヌクレアーゼであると理解される。「ニッキング」エンドヌクレアーゼは、二本鎖の一方の鎖のみを加水分解して、切断されているよりもむしろ「ニックの入った」ＤＮＡ分子を生じさせる、エンドヌクレアーゼである。

【0046】

本明細書において使用される場合、「ヘモグロビン異常症」という用語は、血液中の異常なヘモグロビン分子の存在、または血液中で通常は発現しているヘモグロビン分子の不存在を伴う状態を指す。

【0047】

ヘモグロビン異常症の例としては、限定はしないが、ＳＣＤおよびＴＨＡＬが含まれる。ＳＣＤおよびＴＨＡＬならびにこれらの症候は、当技術分野において周知であり、以下でさらに詳細に記載される。対象は、その対象がヘモグロビン異常症を患っていると認識している、理解している、分かっている、判定する、判断を下す、考える、または決定する、医療提供者、医療介護者、医師、看護師、家族または知人によって、ヘモグロビン異常症を患っていると診断され得る。

【0048】

「ＳＣＤ」という用語は、本明細書において、赤血球の鎌状への変化の結果生じるあらゆる症候性貧血の状態を含むものと定義される。ＳＣＤの兆候としては、貧血、疼痛、および／または器官の機能障害、例えば、腎不全、網膜症、急性胸部症候群、虚血、持続勃起症、および脳卒中が含まれる。本明細書において使用される場合、「ＳＣＤ」という用語は、特に、ＨｂＳにおける鎌状赤血球置換についてホモ接合型の対象における、ＳＣＤに付随する様々な臨床的問題を指す。ＳＣＤという用語の使用によって本明細書において言及される全身的兆候としては、成長および発達の遅延、特に肺炎球菌に起因する重度の感染の発症の傾向の増大、脾臓機能の顕著な障害、再発性の梗塞を伴う、循環細菌の効果的なクリアランスの阻害、および脾臓組織の最終的な破壊が挙げられる。「ＳＣＤ」という用語に同様に含まれるものは、筋骨格疼痛の急性の発症であり、これら発症は、腰椎、腹部、および大腿骨骨幹部で主に起こり、メカニズムおよび重症度が類似している。成人では、このような発作は、数週間または数カ月間ごとの短い期間の軽度または中程度の発病として一般に現れ、１年に平均で約１回生じる、５日から７日間継続する苦い発作を伴う。このような危機を引き起こすことが分かっている事象としては、アシドーシス、低酸素症、および脱水が挙げられ、これらの全てが、ＨｂＳの細胞内ポリマー化を強化する（J. H. Jandl, Blood: Textbook of Hematology, 2nd Ed., Little, Brown and Company, Boston, 1996, pages 544-545）。

【0049】

本明細書において使用される場合、「ＴＨＡＬ」は、ヘモグロビンの欠陥のある生成を特徴とする（遺伝性の）障害を指す。一実施形態では、当該用語は、ヘモグロビンの合成に影響する突然変異に起因して生じる遺伝性の貧血を包含する。他の実施形態では、当該用語には、サラセミアの状態から生じるあらゆる症候性の貧血、例えば、重度のサラセミアまたはβサラセミア、重症型サラセミア、中間型サラセミア、αサラセミア、例えばヘモグロビンＨ病が含まれる。βサラセミアは、βグロビン鎖における突然変異によって生じ、重症型または軽症型で生じ得る。重症型のβサラセミアでは、小児は生誕時には正常であるが、生誕後１年目の間に貧血を発症する。軽度の形態のβサラセミアでは、小さな赤血球が生成される。αサラセミアは、αグロビン鎖からの遺伝子ＨＢＡ１またはＨＢＡ２の一方または両方の欠失によって生じる。

【0050】

「疾患を発症するリスク」という表現は、対象がコントロール対象またはコントロール集団（例えば、健康な対象または集団）と比較して将来にヘモグロビン異常症を発症する相対的可能性を意味する。例えば、ＳＣＤに関連する遺伝子突然変異、すなわち、成体型βグロビン遺伝子のＡからＴへの突然変異を有する個体は、当該突然変異についてヘテロ接合性であってもホモ接合性であっても、当該個体のリスクを増大させる。

【0051】

詳細な説明
本発明は、遺伝子とエンハンサーとの間の染色体距離を改変してこれらの遺伝子の発現レベルを変化させる、ゲノム編集方法に関する。本発明の方法は、いくつかの治療用途を有し得る。例えば、集合的に世界で最も一般的な単一遺伝子障害である、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）およびβサラセミア（ｔｈａｌ）を含むヘモグロビン異常症は、成長の過程で抑制される胎児型βグロビン遺伝子の誘導された発現によって処置することができる。

【0052】

本発明は、胎児型グロビン遺伝子とこれらの天然のエンハンサーである上流βグロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）との間の配列の遺伝子欠失を介して、成体型赤血球系細胞において胎児型βグロビン遺伝子を活性化させる。この強力なエンハンサーと胎児型βグロビン遺伝子とが近くで直線状に並置されることによって、これら遺伝子の発現が治療レベルとなる。遺伝子競合を介して、これは、成体型βグロビン遺伝子の発現を同時に下方調節することができる。

【0053】

したがって、第１の態様において、本発明は、目的のタンパク質の発現を増大させるための方法であって、当該方法が、第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼを細胞に導入するステップを含み、
第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼが、染色体における第１および第２の二本鎖切断を生じさせ、これによって、第１の、介在する第２の、および第３の染色体断片を生成し、ここで、
ｉ）第１の断片が、エンハンサー配列またはその機能的断片を含み、かつ
ｉｉ）第３の断片が、目的のタンパク質をコードする配列を含み、
第２の介在断片の長さが少なくとも約５ｋｂであり、第３の断片への第１の断片の結合が、目的のタンパク質をコードする配列にエンハンサー配列またはその機能的断片を作動可能に連結させ、これによって、タンパク質発現を増大させる、
方法に関する。

【0054】

第１の断片と第３の断片、好ましくは「ゲノム」または「染色体」断片の結合は、非相同な末端結合（ＮＨＥＪ）などによる細胞自体の細胞修復機構を使用して得られ得る。エンハンサーを含む断片を、目的のタンパク質をコードする配列を含む断片に結合またはライゲーションすることによって、エンハンサーを含む断片と目的の配列を含む断片との間に位置していた、第２の介在する断片が切除される。結果として、エンハンサー配列および目的のタンパク質をコードする配列は、より近くなり、その結果、目的のタンパク質の発現が増大する。したがって、本明細書において詳述されている方法はまた、エンハンサー配列とコード配列との間のゲノム距離を低減させるための方法でもある。

【0055】

本明細書において、第１および第２の二本鎖切断が同一のＤＮＡ分子内に、好ましくは同一の染色体内に位置することが理解される。好ましくは、第１および第２の二本鎖切断は、１１番染色体に位置する。

【0056】

本方法は、インビボでの方法であり得る。好ましくは、本方法は、エクスビボでの方法、好ましくはインビトロでの方法である。「エクスビボ」での方法は、本明細書において、生きている生物の外側で行われる方法であると理解される。好ましいエクスビボでの方法は、脊椎動物、哺乳動物、および／または霊長類の身体の外側で、好ましくはヒトの身体の外側で行われる。「インビトロ」での方法は、本明細書において、生きている生物の外側で、かつ制御された環境において行われる方法であると理解される。好ましいインビトロでの方法は、脊椎動物、哺乳動物、および／または霊長類の身体の外側、好ましくはヒトの身体の外側で、かつ制御された環境において行われる。

【0057】

本明細書において使用される目的のタンパク質の増大した発現には、限定はしないが、目的のタンパク質の誘導された発現が含まれる。

【0058】

細胞
本発明の方法において使用するための細胞は、あらゆるタイプの細胞、例えば、限定はしないが、脊椎動物、哺乳動物、および／または霊長類の細胞であり得る。好ましくは、細胞は、ヒト細胞である。細胞は分化した細胞であり得るが、好ましくは、細胞は、幹細胞および前駆細胞のうちの少なくとも１つである。好ましくは、本発明の方法において使用するための細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、好ましくは造血前駆細胞（ＨＰＣ）である。好ましいＨＰＣは、赤血球系統のもの、好ましくは、ＣＤ３４＋細胞表面マーカーを発現しているＨＰＣである。

【0059】

本発明の方法において使用するための細胞は、好ましくは、赤血球系統のＨＰＣであり、このことは、細胞が赤血球生成を受け得、その結果、最終分化の際に赤血球（erythrocyteまたはred blood cell（ＲＢＣ））を形成することを示している。このような細胞は、骨髄の造血前駆細胞に由来し得る。特異的な増殖因子、および造血微小環境の他の構成成分に曝露されると、造血前駆細胞は、赤血球系統の全ての中間体である一連の中間分化細胞型を介して、ＲＢＣに成熟することができる。したがって、「赤血球系統」の造血幹細胞は、赤血球、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、および巨核球から、血小板までのうちの、少なくとも１つを生じさせる。好ましくは、本発明の方法において使用するための造血幹細胞は、少なくとも赤血球を生じさせる。

【0060】

場合によって、本発明の方法において使用するための造血前駆細胞は、末梢血、臍帯血、絨毛性羊水、胎盤血、および骨髄からなる群から回収される。

【0061】

場合によって、本発明の方法の後、造血前駆細胞は、使用、例えばエクスビボでの増殖および／または対象への移植の前に、凍結保存される。

【0062】

場合によって、本発明の方法の後、造血前駆細胞培養物は、使用の前に、例えば、凍結保存、および／または対象への移植／生着の前に、エクスビボで増殖される。

【0063】

場合によって、本発明の方法の後、造血前駆細胞は、使用の前に、例えば、凍結保存、および／または対象への移植／生着の前に、エクスビボで培養において分化される。

【0064】

エンハンサー配列および目的のタンパク質
本発明の方法は、エンハンサー配列を、目的のタンパク質をコードする配列に近づける、すなわち、エンハンサー配列とタンパク質コード配列との間の（ゲノム）距離を減少させる。この目的のためには、第１の二本鎖切断はエンハンサー配列内またはその近くで生じ、第２の二本鎖切断は目的のタンパク質をコードする配列の近くで、好ましくは、目的のタンパク質の発現を制御するプロモーター内で生じる。２つの外側の断片を結合し、次いで、介在する中間のまたは「第２の」断片を除去すると、エンハンサー配列とタンパク質コード配列とが近くで並置することになり、これによって、目的のタンパク質の発現が増大する。

【0065】

第１の二本鎖切断は、好ましくは、エンハンサー配列内またはその近くで生じる。好ましいエンハンサーは、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）である。「遺伝子座制御領域」は、連結している遺伝子を高レベルで発現させる、広範囲シス作用性調節エレメントである。

【0066】

好ましいエンハンサー配列は、βグロビンの遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）である。βグロビンのＬＣＲは、ＨＳ５、ＨＳ４、ＨＳ３、ＨＳ２、およびＨＳ１と呼ばれる複数のＤＮＡｓ Ｉ高感受性部位から構成され、ここで、ＨＳ１は、βグロビン遺伝子の最も近くに位置する。

【0067】

好ましくは、第１の二本鎖切断が生じた後に、生成した第１の断片は、βグロビンのＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ５、ＨＳ４、ＨＳ３、ＨＳ２、およびＨＳ１を含む。好ましくは、第１の二本鎖切断は、ＨＳ１領域の近位にある。好ましくは、ＨＳ１と第１の二本鎖切断との間の距離は、約３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、１０、５、３、または１ｂｐ未満である。好ましくは、ＨＳ１と第１の二本鎖切断との間の距離は、約３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、１０、５、３、または１ｂｐである。

【0068】

βグロビンのＬＣＲの個々のＨＳ部位がエンハンサー配列として作用し得ることは、当技術分野において公知である（例えば、Fraser et al, Genes Dev, 1993 7(1):106-13、Bender et al, Blood, 2012;119(16):3820-7を参照されたい）。したがって、第１の二本鎖切断は、βグロビンのＬＣＲ内に位置し得る。

【0069】

好ましくは、第１の二本鎖切断は、βグロビンのＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ１、ＨＳ２、ＨＳ３、またはＨＳ４内に位置する。好ましくは、第１の二本鎖切断は、βグロビンのＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ１内に位置する。好ましくは、第１の二本鎖切断は、βグロビンのＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ２内に位置する。好ましくは、第１の二本鎖切断は、βグロビンのＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ３内に位置する。好ましくは、第１の二本鎖切断は、βグロビンのＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ４内に位置する。

【0070】

好ましくは、第１の二本鎖切断は、βグロビンのＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ１とＨＳ２との間に位置し、その結果、第１の断片は、ＨＳ２、ＨＳ３、ＨＳ４、およびＨＳ５を含む。好ましくは、第１の二本鎖切断は、βグロビンのＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ２とＨＳ３との間に位置し、その結果、第１の断片は、ＨＳ３、ＨＳ４、およびＨＳ５を含む。好ましくは、第１の二本鎖切断は、βグロビンのＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ３とＨＳ４との間に位置し、その結果、第１の断片は、ＨＳ４およびＨＳ５を含む。

【0071】

第２の二本鎖切断は、好ましくは、タンパク質コード配列の近位にある。第２の二本鎖切断は、好ましくは、目的のタンパク質の発現を制御するプロモーター内に位置する。好ましい目的のタンパク質は、胎児型βグロビン、好ましくは、ＨＢＧ２（Ｇγ）およびＨＢＧ１（Ａγ）のうちの少なくとも１つである。第２の二本鎖切断は、好ましくは、ＨＢＧ１をコードする配列を含む（「第３の」）断片を生じさせる。場合によって、第２の二本鎖切断は、ＨＢＧ１をコードする配列およびＨＢＧ２をコードする配列を含む（「第３の」）断片を生じさせる。

【0072】

好ましくは、第２の二本鎖切断は、ＨＢＧ１の発現を制御するプロモーター内に位置するおよび／またはＨＢＧ２の発現を制御するプロモーター内に位置する。

【0073】

好ましくは、第２の二本鎖切断は、ＨＢＧ１の発現を制御するプロモーター内に少なくとも位置する。好ましくは、第２の二本鎖切断の位置は、ＨＢＧ１転写開始部位から約－１～－１０００ｂｐの間、好ましくはＨＢＧ１転写開始部位から約－２０～－６００ｂｐ、－３０～－５００ｂｐ、－４０～－４００ｂｐ、－５０～－３００ｂｐの間、または約－７０～－２００ｂｐの間である。好ましくは、第２の二本鎖切断の位置は、ＨＢＧ１転写開始部位から約－５０～－２００ｂｐの間である。

【0074】

二本鎖切断は、ＨＢＧ２プロモーターに固有の配列内に位置し得る。好ましくは、第２の二本鎖切断の位置は、ＨＢＧ２転写開始部位から約－２００～－７００ｂｐの間である。

【0075】

本明細書において詳述されているように、本発明の方法は、第１の断片（エンハンサー配列を含む）と第３の断片（目的のタンパク質をコードする配列を含む）との間に位置する第２の断片の除去に起因して、エンハンサー配列と目的のタンパク質をコードする配列との間のゲノム距離を減少させる。

【0076】

エンハンサー配列とプロモーター配列との間のゲノム距離は、好ましくは、第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼを導入する前のエンハンサー配列と内在性遺伝子との間のゲノム距離と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９５％、または少なくとも１００％減少している。ゲノム距離の１００％の減少は、本明細書において、エンハンサー配列が目的の配列の転写開始部位のすぐ隣に位置しているという意味で理解される。

【0077】

加えて、またはあるいは、第１および第２の二本鎖切断の位置は、切除された（第２の）断片の長さを決定することによって決定され得る。好ましくは、染色体から除去される断片の長さは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７ｋｂ、またはそれを超える長さである。場合によって、切除された（第２の）断片は、リプレッサーのための部分的なまたは完全な結合部位、すなわち、１つまたは複数の作動可能に連結している遺伝子の発現を低減させるかまたは阻害する転写因子のための結合部位を含む。場合によって、切除された（第２の）断片は、リプレッサーＢＣＬ１１Ａのための部分的なまたは完全な結合部位を含む。場合によって、切除された（第２の）断片は、ＨＢＧ１転写開始部位から－１００～－１２０ｂｐの間に位置するリプレッサーＢＣＬ１１Ａのための部分的なまたは完全な結合部位を含む。

【0078】

部位特異的なエンドヌクレアーゼ
本発明の方法は、ＤＮＡを少なくとも２つの部位特異的なヌクレアーゼに曝露するステップを含む。当業者には、任意の部位特異的なヌクレアーゼが本発明の方法における使用に適切であり得ることが理解される。ＨＳＰＣの部位特異的なゲノム改変に使用される適切なエンドヌクレアーゼおよびベクターは、例えば、参照によって本明細書に組み込まれるFerrari et al, Gene therapy using haematopoietic stem and progenitor cells, Nat Rev Genet, 2020; doi: 10.1038において開示されている。

【0079】

第１の部位特異的な（エンド）ヌクレアーゼは、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択される。同様に、第２の部位特異的な（エンド）ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択され得る。好ましくは、本発明の方法において使用されるヌクレアーゼは同一のタイプのヌクレアーゼであり、例えば、第１および第２の二本鎖切断の両方が、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮによって生じる。好ましくは、第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼの少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体である。

【0080】

エンドヌクレアーゼは、本明細書において、二本鎖の両方の鎖を同時に加水分解して二本鎖切断をＤＮＡに導入するエンドヌクレアーゼとして理解される。二本鎖切断の位置は、ガイドＲＮＡと好ましくは組み合わせて、部位特異的なヌクレアーゼによって決定される。部位特異的なヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡ内の特異的な位置で切断することが確実となるように当該ヌクレアーゼを設計する方法は、当技術分野において周知である。したがって、当業者には、所定の第１または第２の位置でＤＮＡを切断するように部位特異的なヌクレアーゼを設計する方法が分かっている。

【0081】

切断部位（第１の位置および第２の位置）は、ヌクレアーゼによって標的化される配列、すなわち標的配列によって決定される。標的配列は、通常、ダブルヘリックス核酸の鎖のうちの一方のヌクレオチド配列によって規定される。

【0082】

好ましい実施形態において、ヌクレアーゼの少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択される。好ましい実施形態において、少なくとも１つのヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体である。

【0083】

ＴＡＬＥＮ（転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ）は、標的化可能なヌクレアーゼであり、一本鎖切断および二本鎖切断を特異的なＤＮＡ部位に誘導するために使用される。ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合領域を遺伝子設計するために使用される基本的なビルディングブロックは、キサントモナス属の種（Xanthomonas spp.）のプロテオバクテリアによってコードされる天然に存在するＴＡＬＥに由来する高度に保存された反復ドメインである。ＴＡＬＥＮによるＤＮＡ結合は、高度に保存された３３～３５のアミノ酸反復のアレイによって媒介され、当該反復には、当該反復のアミノ末端およびカルボキシ末端で、さらなるＴＡＬＥ由来ドメインが隣接している。これらのＴＡＬＥ反復は、ＤＮＡの単一の塩基に特異的に結合し、その同一性は、反復の１２位および１３位で典型的に見られる２つの超可変残基によって決定され、アレイ内の反復の数は、所望の標的核酸の長さに対応しており、反復の同一性は、標的核酸配列に適合するように選択された。一部の実施形態では、核酸内の標的配列は、標的部位の選択性を最大にするために、１５から２０塩基対の間である。標的核酸の切断は、５０塩基対のＴＡＬＥＮ結合の中で典型的には生じる。ＴＡＬＥＮ認識部位の設計のためのコンピュータプログラムは、当技術分野において記載されている。例えば、Cermak et al, Nucleic Acids Res. 2011 July; 39(12): e82を参照されたい。所望の標的配列にマッチするように設計されると、ＴＡＬＥＮは、組換えによって発現され、外因性タンパク質として細胞内に導入され得るか、または細胞内のプラスミドから発現され得るか、またはｍＲＮＡとして投与され得る。

【0084】

部位特異的なヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼは、非特異的な切断ドメイン、典型的にはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの非特異的な切断ドメインを、特異的なＤＮＡ配列に結合するように遺伝子設計されているジンクフィンガータンパク質ドメインと結びつける。ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのモジュラー構造によって、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼは、部位特異的な二本鎖切断をゲノムに生じさせるための多用途のプラットフォームとなっている。ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼは二量体として切断するため、オフターゲット切断事象を予防するための１つの戦略は、隣接した９塩基対部位で結合するジンクフィンガードメインを設計することとなっている。同様に、これらの各々が参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２８５，４１６号明細書、米国特許第７，５２１，２４１号明細書、米国特許第７，３６１，６３５号明細書、米国特許第７，２７３，９２３号明細書、米国特許第７，２６２，０５４号明細書、米国特許第７，２２０，７１９号明細書、米国特許第７，０７０，９３４号明細書、米国特許第７，０１３，２１９号明細書、米国特許第６，９７９，５３９号明細書、米国特許第６，９３３，１１３号明細書、米国特許第６，８２４，９７８号明細書も参照されたい。

【0085】

ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼであり得る。メガヌクレアーゼとしても知られているホーミングエンドヌクレアーゼは、それらの標的配列が大きい（例えば＞１４ｂｐ）ために高程度の特異性でゲノムＤＮＡ内に二本鎖切断を生じさせる、配列特異的なエンドヌクレアーゼである。遺伝子設計されたホーミングエンドヌクレアーゼは、既存のホーミングエンドヌクレアーゼの特異性を改変することによって生成される。１つのアプローチでは、天然に存在するホーミングエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列に変化が導入され、次いで、得られた遺伝子設計されたホーミングエンドヌクレアーゼが、標的化された結合部位を切断する機能的タンパク質を選択するためにスクリーニングされる。別のアプローチでは、キメラホーミングエンドヌクレアーゼが、２つの異なるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位を組み合わせることによって遺伝子設計されて、各ホーミングエンドヌクレアーゼの半分の部位から構成される新たな認識部位が生じる。例えば、米国特許第８，３３８，１５７号明細書を参照されたい。

【0086】

好ましくは、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ由来の編集剤である。このような編集剤は当技術分野において公知であり、当業者には、本発明の方法がいかなる特定の編集剤にも限定されないことが容易に理解される。好ましいＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ由来の編集剤としては、限定はしないが、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓトランスポザーゼ／レコンビナーゼ、およびプライムエディターが含まれる。適切なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ由来の編集剤は、例えば、参照によって本明細書に組み込まれるAnzalone et al (Nat Biotechnol. 2020;38(7):824-844)において開示されている。

【0087】

好ましくは、部位特異的なヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体である。ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ、Ｃａｓ、Ｃａｓ－タンパク質、またはＣａｓ様タンパク質という用語は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指し、これとしては、限定はしないが、ＣＡＳ９、ＣＳＹ４、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、カスケード、ニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９＿Ｄ１０Ａ、Ｃａｓ９＿Ｈ８２０Ａ、またはＣａｓ９＿Ｈ８３９Ａ）、Ｍａｄ７、および融合タンパク質（例えば、エンドヌクレアーゼドメインなどのさらなる機能的ドメインに融合しているＣａｓ９またはＣａｓ様分子）、例えば、参照によって本明細書に組み込まれるPickar-Oliver A. and Gersbach CA (Nat Rev Mol Cell Biol, 2019;20(8):490-507)において例えば開示されているもの、ならびに他の例、例えば、Ｃｐｆ１またはＣｐｆ１＿Ｒ１２２６Ａ、および例えば、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／００６７４７号パンフレット、国際公開第２０１８／１１５３９０号パンフレット、および米国特許第９，９８２，２７９号明細書において例えば記載されているものが含まれる。Ｃａｓ９の突然変異体および誘導体ならびに他のＣａｓタンパク質を、本明細書において開示されている方法において使用することができる。好ましくは、このような他のＣａｓタンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性を有しており、標的配列を認識するように遺伝子操作されているガイドＲＮＡの存在下で細胞内にある場合、標的核酸配列を認識することができる。Ｃａｓタンパク質またはＣａｓ様タンパク質は、好ましくは、ＣＡＳ９タンパク質である。

【0088】

ＣＡＳまたはＣＡＳ様タンパク質は、限定はしないが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ９（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９ＺＷ２）、野兎病菌（Francisella tularensis）由来のＣａｓ９（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ｑ５Ｙ３）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のＣａｓ９（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｊ７ＲＵＡ５）、アクチノマイセス・ネスランディイ（Actinomyces naeslundii）由来のＣａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｊ３Ｆ２Ｂ０）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）由来のＣａｓ９（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｇ３ＥＣＲ１、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ－Ｑ０３ＪＩ６、Ｑ０３ＬＦ７）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）由来のＣａｓ９（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｃ９Ｘ１Ｇ５、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ１ＩＱ６８）、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９２７Ｐ４）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来のＣａｓ９（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ８ＤＴＥ３）、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）由来のＣａｓ９（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９ＣＬＴ２）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）由来のＣａｓ９（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ６ＮＫＩ３）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）由来のＣａｓ９（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０Ｐ８９７）、野兎病菌由来のＣｐｆ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ｑ７Ｑ２）、アシダミノコッカスの種（Acidaminococcus sp.）由来のＣｐｆ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｕ２ＵＭＱ６）、これらのあらゆるオルソログ、またはこれらに由来するあらゆるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼからなる群から選択され得る。

【0089】

本発明の方法において使用するための好ましいＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９である。他の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメイン、ＲＥＣドメイン、およびＢＨドメインのうちの少なくとも１つが高度に保存されている、Ｃａｓ９のホモログであり得る。

【0090】

ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体は、３つの基本的な設計構成成分：１）Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ、２）ｃｒＲＮＡ、および３）トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含有する。好ましい実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、一本鎖キメラＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ／ｇＲＮＡ）に組み合わされ得る。

【0091】

Ｃａｓ９タンパク質およびその改変された型（これもまた、本発明の文脈内でＣＡＳタンパク質として検討される）は、広く市販されている。Ｃａｓ９タンパク質は、（エンド）ヌクレアーゼ活性を有しており、標的配列での特異的なＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることができる。

【0092】

本発明の方法において使用するためのＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１であり得る。Ｃｐｆ１は、クラス２のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのシングルＲＮＡによってガイドされるエンドヌクレアーゼである（Cell (2015) 163(3):759-771）。Ｃｐｆ１は、シングルｃｒＲＮＡによってガイドされるエンドヌクレアーゼであり、これは、Ｔに富んだプロトスペーサー隣接モチーフを利用する。干渉を媒介するためにｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを必要とするＣａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１－ｃｒＲＮＡ複合体は単独で、すなわち、いかなる追加のＲＮＡ種も必要とすることなく、標的ＤＮＡ分子を切断することができる。Ｃｐｆ１はしたがって、代替的なＣＡＳ－タンパク質として使用することができる。

【0093】

ＣＲＩＳＰＲシステムは、基本的に、少なくとも２つの実体、すなわち「ガイド」ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および非特異的なＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）を含む。ｇＲＮＡは、Ｃａｓの結合に必要な足場配列、および改変対象のゲノム標的を規定するユーザー定義のヌクレオチド「標的化」配列から構成される、短鎖ＲＮＡである。したがって、ｇＲＮＡ内に存在する標的化配列を単に変化させるだけで、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）のゲノム標的を変化させることができる。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズしているｃｒＲＮＡであり得るか、または、例えばＣａｓ９ヌクレアーゼと組み合わせて使用される場合には、例えばJinek et al. (2012, Science 337: 816-820)において記載されているような一本鎖ガイドＲＮＡであり得る。ｇＲＮＡはさらに、Ｃｐｆ－１と共に例えば使用するためのシングルＲＮＡガイド（ｃｒＲＮＡ）であると理解される。したがって、ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼを二本鎖ＤＮＡ内の特異的な標的配列に向けるＲＮＡ分子である。

【0094】

本明細書において詳述されている発明は、第１および第２の二本鎖切断を生じさせるための第１および第２のエンドヌクレアーゼの使用を特定している。しかし、当業者には、二本鎖切断を生じさせるために、エンドヌクレアーゼの代わりに、２つのニッカーゼが向かい合った鎖を切断する２つのニッカーゼの組合せを使用し得ることが容易に理解される。好ましいニッカーゼは、ヌクレアーゼドメインの一方が突然変異しているためにもはや機能的ではない（すなわち、ヌクレアーゼ活性がない）、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼのバリアントである。非限定的な例は、Ｄ１０Ａ突然変異またはＨ８４０Ａ突然変異のいずれかを有するＣａｓ９バリアントである。Ｃｐｆ１ニッカーゼの非限定的な例は、Ｃｐｆ１ Ｒ１２２６Ａである。

【0095】

ガイドＲＮＡは、例えばＣａｓ９と組み合わせて使用される場合、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の融合体であり得る。しかし、本発明において、シングルｓｇＲＮＡの代わりに、個別のＲＮＡ分子であるｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡが例えばＣａｓ９と組み合わせて使用され得ることも検討される。

【0096】

上記で示したように、ＣＲＩＳＰＲシステムは、少なくとも２つの基本的な構成成分、すなわちＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを必要とする。当業者には、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼシステムの異なる構成成分を準備するための方法が公知である。先行技術において、その設計および使用について多くの報告が利用可能である。例えば、ｓｇＲＮＡの設計と、ＣＡＳタンパク質ＣＡＳ９（ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）から元々得られた）とのその組み合わされた使用とについて、Haeussler et al (J Genet Genomics. (2016)43(5):239-50)による概説を参照されたい。

【0097】

好ましくは、第１および／または第２の部位特異的なヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質およびシングルガイド（ｓｇ）ＲＮＡのうちの少なくとも１つを含むＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体である。

【0098】

処置
さらなる態様において、本発明は、疾患の処置または予防において使用するための、第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼ、またはそれらをコードする１つもしくは複数のベクターであって、第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼが、染色体における第１および第２の二本鎖切断を生じさせ得、これによって、第１の、介在する第２の、および第３の染色体断片を生成し、ここで、
ｉ）第１の断片が、エンハンサー配列またはその機能的断片を含み、かつ
ｉｉ）第３の断片が、目的のタンパク質をコードする配列を含み、
第２の介在断片の長さが少なくとも約５ｋｂであり、第３の断片への第１の断片の結合が、目的のタンパク質をコードする配列にエンハンサー配列を作動可能に連結させ、これによって、目的のタンパク質の発現を増大させる、
エンドヌクレアーゼ、またはそれをコードする１つもしくは複数のベクターに関する。

【0099】

好ましくは、目的のタンパク質は、ＨＢＧ１およびＨＢＧ２のうちの少なくとも１つである。第１および第２の部位特異的なヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のベクターは、好ましくは遺伝子治療ベクターである。好ましい遺伝子治療ベクターは、造血前駆細胞（ＨＰＣ）に感染またはトランスフェクトすることができる。好ましいベクターは、ウイルスベクター、例えば、限定はしないが、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、またはレトロウイルスベクター、好ましくはγレトロウイルスベクターである。このような遺伝子治療ベクターは、造血幹前駆細胞を使用する遺伝子療法のために当技術分野において周知である（Ferrari et al, Gene therapy using haematopoietic stem and progenitor cells, Nat Rev Genet, 2020; doi: 10.1038）。

【0100】

本発明の文脈において使用される場合、「予防（prevent, preventing”および”prevention”)」という用語は、疾患、好ましくはヘモグロビン異常症、好ましくは本明細書において定義されているヘモグロビン異常症の再発、発病、発症、または進行の予防または低減、あるいはヘモグロビン異常症またはその１つもしくは複数の症候の重症度および／または期間の予防または低減を指す。

【0101】

本発明の文脈において使用される場合、「治療（”therapies”および”therapy”」という用語は、疾患、好ましくはヘモグロビン異常症、好ましくは本明細書において定義されているヘモグロビン異常症、またはその１つもしくは複数の症候の予防、処置、管理、または改善において使用され得る、好ましくは本明細書の以下において特定される、任意のプロトコル、方法、および／または薬剤を指し得る。

【0102】

本明細書において使用される場合、「処置(“treat”, “treating”および”treatment”)」という用語は、ヘモグロビン異常症、好ましくは本明細書の以下において定義されるヘモグロビン異常症の進行、重症度、および／もしくは持続期間の低減もしくは改善、ならびに／または疾患の１つもしくは複数の症候の低減もしくは改善を指す。

【0103】

第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼ、またはそれらをコードする１つもしくは複数のベクターは、組成物、好ましくは医薬組成物に含めることができる。

【0104】

本明細書において使用される場合、本発明の方法において有用な「組成物(composition)」、「生成物(product)」、または「組合せ物(combination)」としては、限定はしないが静脈内、皮下、皮内、真皮下、リンパ節内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、経口、鼻、局所（口腔内および舌下を含む）、直腸、膣、エアロゾル、および／または非経口もしくは粘膜の適用を含む、様々な投与経路に適したものが含まれる。開示されている発明に従った組成物、製剤、および生成物は、通常は、薬物（単独または組合せでの）および１つまたは複数の適切な薬学的に許容可能な賦形剤を含む。

【0105】

好ましくは、本明細書において定義される第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼは、ヘモグロビン異常症の処置または予防において使用するためのものである。

【0106】

好ましくは、本明細書において定義される第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のベクターは、ヘモグロビン異常症の処置または予防において使用するためのものである。本明細書において、第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体である場合、同一のまたは追加のベクターは、本明細書において定義されているエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡをコードすることが理解される。

【0107】

好ましくは、ヘモグロビン異常症は、鎌状赤血球症およびβサラセミアのうちの少なくとも１つである。

【0108】

本明細書において記載される医学的使用は、言及された疾患の処置のための医薬品として使用するための、本明細書において定義される第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼの組合せまたはそれをコードする１つもしくは複数のベクターとして策定されるが、本明細書において定義されている組合せを使用する言及された疾患を処置する方法、言及された疾患を処置するための医薬品の調製において使用するための本明細書において定義されている組合せ、および有効量を投与することによる言及された疾患の処置のための本明細書において定義される組合せの使用としても等しく策定され得る。このような医学的使用は全て、本発明によって想定されている。

【0109】

本明細書において使用される場合、「有効量」という用語は、ヘモグロビン異常症の重症度および／もしくは持続期間を低減させる、その１つもしくは複数の症候を改善する、ヘモグロビン異常症の進行を予防する、またはヘモグロビン異常症の退行を生じさせるために十分な、あるいは、ヘモグロビン異常症またはその１つもしくは複数の症候の発症、再発、発病、または進行の予防をもたらすために十分な、薬剤の、すなわち、本明細書において定義されている第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼの組合せまたはそれをコードする１つもしくは複数のベクターの量を指す。

【0110】

ヘモグロビン異常症の治療的処置のための本発明の実施に使用される活性薬剤の有効量は、投与の様式、対象の年齢、体重、および全体的健康に応じて変化する。最終的には、主治医または獣医師が適切な量および投薬レジメンを決定する。このような量は、「有効」量と呼ばれる。したがって、本開示の文脈においてヘモグロビン異常症「に対して有効な」薬剤の投与とは、臨床的に適切な様式の投与が患者群の少なくとも統計的に有意な一部に対して有利な効果、例えば症候の改善、治癒、疾患の少なくとも１つの兆候または症候の低減、寿命の延長、クオリティー・オブ・ライフの向上、または特定のタイプの疾患もしくは状態の処置に詳しい医師によって正であると一般に認識される他の効果をもたらすことを指す。

【0111】

本発明はさらに、処置の方法であって、
－ 対象から１つまたは複数の造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）を単離するステップ、
－ 第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼを単離されたＨＳＰＣに導入することによって、１つまたは複数のＨＳＰＣを改変するステップであって、第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼが、染色体における第１および第２の二本鎖切断を生じさせ、これによって、第１の、介在する第２の、および第３の染色体断片を生成し、ここで、
ｉ）第１の断片が、エンハンサー配列またはその機能的断片を含み、かつ
ｉｉ）第３の断片が、目的のタンパク質をコードする配列を含み、
第２の介在断片の長さが少なくとも約５ｋｂであり、第３の断片への第１の断片の結合が、目的のタンパク質をコードする配列にエンハンサー配列を作動可能に連結させ、これによって、目的のタンパク質の発現を増大させる、ステップ、および
－ 修飾されたＨＳＰＣを対象に投与するステップ
を含む、方法にも関連する。

【0112】

好ましくは、目的のタンパク質は、ＨＢＧ１およびＨＢＧ２のうちの少なくとも１つである。

【0113】

好ましくは、ＨＳＰＣは、造血前駆細胞（ＨＰＣ）である。好ましくは、本方法は、ヘモグロビン異常症を処置するためのものであり、ここで、対象はヘモグロビン異常症に罹患している。ヘモグロビン異常症は、鎌状赤血球症およびβサラセミアのうちの好ましくは少なくとも１つである。

【0114】

ＨＳＰＣは、末梢血、臍帯血、絨毛性羊水、胎盤血、および骨髄からなる群から回収することができる。ＨＳＰＣをエクスビボで単離および修飾するためのあらゆる方法が、本発明の方法における使用に適している。このような方法は、例えば、Zeng et al (Therapeutic base editing of human hematopoietic stem cells, Nat Med. 2020 Apr;26(4):535-541)において開示されており、この方法は、参照によって本明細書に組み込まれる。

【0115】

第１および第２のエンドヌクレアーゼの導入は、当技術分野において公知の任意の従来の方法を使用して行うことができる。タンパク質は、細胞にタンパク質をトランスフェクトすることによって送達することができる。第１および第２の部位特異的なヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体であるケースでは、これらは、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体の直接的な送達によって送達することができる。部位特異的なヌクレアーゼは、従来の手段、例えば、限定はしないが、ＰＥＧ介在性のトランスフェクションおよびエレクトロポレーションによって送達することができる。加えて、またはあるいは、部位特異的なヌクレアーゼは、例えば、部位特異的なヌクレアーゼをコードする配列を、場合によって１つまたは複数のガイドＲＮＡ（を発現するベクター）と組み合わせて送達することによって、ＨＳＰＣにおいて発現させることができる。

【0116】

当業者には、本明細書において詳述される発明が２つの部位特異的なエンドヌクレアーゼに限定されないことが理解される。例えば、追加のエンドヌクレアーゼを、追加の二本鎖切断を第２の介在断片に導入するために使用してもよい。

【0117】

ＨＳＰＣを対象に投与するまたは「戻す」と、好ましくは、対象の末梢血中の胎児型βグロビンのレベルが増大する。これらの増大したレベルは、好ましくは、ヘモグロビン異常症を処置または予防する。

【実施例】

【0118】

[実施例１]
βグロビンのＬＣＲの、遺伝子発現を増強させる機能性に対して、ゲノム距離がどのように影響するかを決定するために、本発明者らは、ＨＢＧ１／２プロモーターによって駆動されるＧＦＰレポーター遺伝子、およびマイクロ－ＬＣＲを使用した（ＨＳ１２３４を伴う、Talbot D, et al. Nature 1989, 338:352-5を参照されたい）。遺伝子およびｕＬＣＲは、Ｋ５６２細胞のゲノム内に異所的に組み込まれており、ｕＬＣＲはその都度、ＧＦＰレポーター遺伝子から異なる距離に置かれている。

【0119】

図１Ｂは、Ｋ５６２細胞（ヒト赤白血病細胞）のヘミン誘導型の成熟の前後の、レポーター遺伝子の転写アウトプット（ＧＦＰレベル）を示している。これは、エンハンサーの距離が減少するにつれて転写アウトプットが増大することを明らかに示している。

【0120】

図１Ｃは、３週間にわたる経時的実験を示しており、これは、ｕＬＣＲが大きな距離（４０７ｋｂ、１００ｋｂ）にある場合には細胞はレポーター遺伝子のサイレンシグを開始し、一方、さらに近位のｕＬＣＲ（１１ｋｂ、４７ｋｂ）はレポーター遺伝子をサイレンシングから保護することを示している。実際、サイレンシングからの保護は、ｕＬＣＲが遺伝子のすぐ隣にある（０ｋｂ）場合に最も効果的である（データは示していない）。この所見のさらなる裏付けは、Rinzema et al, bioRxiv, Oct. 5, 2021, DOI 10.1101/2021.10.05.463209（参照によって本明細書に組み込まれる）にも示されており、これは、マイクロ－ＬＣＲと、サイレンシングされたＨＢＧプロモーター駆動型のレポーター遺伝子との間の約４００ｋｂの染色体セグメントの欠失が、ＨＢＧプロモーター駆動型のレポーター遺伝子の再活性化を実際にもたらし、マイクロ－ＬＣＲとＨＢＧプロモーター駆動型のレポーター遺伝子との間の約４００ｋｂの染色体セグメントで見られるよりもはるかに高いレポーター遺伝子の発現レベルをもたらすことを教示している（Ｒｉｎｚｅｍａら、特に図１（ｆ）および図１（ｇ））。

【0121】

したがって、一連の実験において、本発明者らは、胎児型グロビン遺伝子とＬＣＲとの間の距離を変化させ、また本発明者らは、（１）発現レベルが、ＬＣＲ間の直線距離が減少するほど増大し、介在配列の遺伝的欠失を介して達成された内因性ＬＣＲの胎児型グロビン遺伝子の近くへの並置が、胎児型グロビン遺伝子を、例えばＳＣＤおよびｔｈａｌを治癒し得るレベルまで再活性化させることを観察した。これは、成体型グロビン遺伝子内／周辺における正確な病因性突然変異とは無関係の、ＳＣＤおよびＴｈａｌの治癒のための普遍的な戦略を提供する。

【0122】

[実施例２]
ガイドＲＮＡのいくつかの組合せを、Ｋ５６２細胞内のＬＣＲのＨＢＧプロモーターの近くまたは内部およびＨＳ２の近くまたは内部での、Ｃａｓ９介在性のＤＮＡの同時の切断を可能にする能力について評価した。同時の切断は、介在する染色体セグメントの欠失を生じさせることが予想され、この欠失によって、ＬＣＲのＨＳ２～ＨＳ５がＨＢＧ遺伝子プロモーターのすぐ隣に並置される。実験の概略図を図２Ａおよび図２Ｂに示す。ガイド配列を表１に示す。

【0123】

【表1】

【0124】

ＨＢＧガイドとＨＳ２ガイドとの組合せを、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９と共にＫ５６２細胞に導入して、所望の欠失を生じさせた。１つのＨＢＧプライマーおよび１つのＨＳ２プライマーを用いるＰＣＲによって、当該欠失が、第４番、第５番、または第７番のＨＳ２ガイドと組み合わせた第３番のＨＢＧガイドで得られたと確認された（図２Ｃ）。当業者には、ガイド配列の他の組合せが所望の欠失を生じさせるために同様に適切となるであろうことが容易に理解される。

【0125】

非限定的な例として、第３番および第７番のガイドＲＮＡの組合せを、ヒト初代前赤芽球細胞においてさらに評価した。表１に示すように、第３番のガイドＲＮＡは、ＨＢＧプロモーターの近くでのＣａｓ９介在性の切断を可能にし、第７番のガイドＲＮＡは、ＬＣＲのＨＳ２の内部でのＣａｓ９介在性の切断を可能にする。サンガーシーケンシングによって、個々の対立遺伝子がインデル(indel)の存在を実際に示したことが確認され、このことは、初代前赤芽球細胞における当該対立遺伝子のそれぞれの標的部位での効率的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９切断を実証している。

【図1】

【図2】

【配列表】

2024506645000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-10-12

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

γグロビン１（ＨＢＧ１）および／または２（ＨＢＧ２）の発現を増大させるためのエクスビボでの方法であって、前記方法が、第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼを細胞に導入するステップを含み、
前記第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼが、１１番染色体における第１および第２の二本鎖切断を生じさせ、これによって、第１の、介在する第２の、および第３の染色体断片を生成し、ここで、
ｉ）前記第１の断片が、βグロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）またはその機能的断片を含み、かつ
ｉｉ）前記第３の断片が、ＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２をコードする配列を含み、前記第１の二本鎖切断が、ＬＣＲ内またはＬＣＲの下流に位置し、
前記第２の二本鎖切断が、ＨＢＧ１転写開始部位の上流に位置し、
前記介在する第２の断片の長さが、少なくとも６ｋｂであり、
かつ、前記第３の断片への前記第１の断片の結合が、ゲノム距離を減少させ、かつＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２をコードする配列にβグロビンのＬＣＲを作動可能に連結させ、これによって、ＨＢＧ１タンパク質および／またはＨＢＧ２タンパク質の発現を増大させる、
方法。

【請求項2】

前記細胞が、造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）、好ましくは造血前駆細胞（ＨＰＣ）である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記第１および／または前記第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９タンパク質および／またはシングルガイド（ｓｇ）ＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記ＬＣＲとＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２をコードする前記配列との間の前記ゲノム距離が、前記第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼを導入する前の前記ＬＣＲとＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２をコードする前記配列との間の前記ゲノム距離と比較して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも９５％減少している、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記第１の断片が、ＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ５、ＨＳ４、ＨＳ３、ＨＳ２、およびＨＳ１を含み、かつ、前記第１の二本鎖切断が、ＨＳ１から３００ｂｐ未満の位置にある、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記第１の二本鎖切断がＬＣＲ内に位置する、好ましくは、前記第１の二本鎖切断がＨＳ１、ＨＳ２、もしくはＨＳ３内に位置するか、または
ｉ）ＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ１とＨＳ２との間、
ｉｉ）ＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ２とＨＳ３との間、もしくは
ｉｉｉ）ＬＣＲのＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位ＨＳ３とＨＳ４との間
に位置し、
好ましくは、前記第１の二本鎖切断がＨＳ１とＨＳ２との間に位置する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記第２の二本鎖切断が、
ｉ）ＨＢＧ１転写開始部位から－１～－１０００ｂｐの間にある位置、好ましくは、ＨＢＧ１転写開始部位から－５０～－２００ｂｐの間にある位置、または
ｉｉ）ＨＢＧ２転写開始部位から－２００～－７００ｂｐの間にある位置
にある、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記介在する第２の断片の長さが、少なくとも約７、８、９、または少なくとも約１０ｋｂである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記第１のＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体がＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含み、前記ガイドＲＮＡが配列番号４、５、６、７および８からなる群から選択される配列を含むものであり、
前記第２のＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体がＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含み、前記ガイドＲＮＡが配列番号１、２および３からなる群から選択される配列を含むものである、請求項４に記載の方法。

【請求項11】

前記第１のＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体が配列番号７を有する配列を含むガイドＲＮＡを含むものであり、
前記第２のＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体がＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含み、前記ガイドＲＮＡが配列番号１、２および３からなる群から選択される配列を含むものである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記第１のＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体が配列番号７を有する配列を含むガイドＲＮＡを含むものであり、
前記第２のＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ複合体が配列番号３を有する配列を含むガイドＲＮＡを含むものである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

疾患の処置または予防において使用するための、第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼ、またはそれをコードする１つもしくは複数のベクターであって、前記第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼが、染色体における第１および第２の二本鎖切断を生じさせ得、これによって、第１の、介在する第２の、および第３の染色体断片を生成し、ここで、
ｉ）前記第１の断片が、βグロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）またはその機能的断片を含み、かつ
ｉｉ）前記第３の断片が、ＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２をコードする配列を含み、前記第２の介在断片の長さが少なくとも６ｋｂであり、前記第３の断片への前記第１の断片の結合が、ＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２をコードする配列にβグロビンのＬＣＲを作動可能に連結させ、これによって、ＨＢＧ１タンパク質および／またはＨＢＧ２タンパク質の発現を増大させる、
前記エンドヌクレアーゼ、またはそれをコードする１つもしくは複数のベクター。

【請求項14】

ヘモグロビン異常症の処置または予防において使用するための、請求項１３に記載の第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼ。

【請求項15】

請求項１４に記載の、使用するための第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼであって、前記ヘモグロビン異常症が鎌状赤血球症またはβサラセミアである、前記エンドヌクレアーゼ。

【請求項16】

１以上の造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）を改変するためのエキソビボの方法であって、
ヘモグロビン異常症に罹患している対象から１つまたは複数の造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）を単離するステップ、および
第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼを前記単離されたＨＳＰＣに導入することによって、１つまたは複数のＨＳＰＣを改変するステップであって、前記第１および第２の部位特異的なエンドヌクレアーゼが、染色体における第１および第２の二本鎖切断を生じさせ、これによって、第１の、介在する第２の、および第３の染色体断片を生成し、ここで、
ｉ）前記第１の断片が、βグロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）またはその機能的断片を含み、かつ
ｉｉ）前記第３の断片が、ＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２をコードする配列を含み、かつ
前記第２の介在断片の長さが少なくとも６ｋｂであり、前記第３の断片への前記第１の断片の結合が、ＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２をコードする配列にβグロビンのＬＣＲを作動可能に連結させ、これによって、ＨＢＧ１タンパク質および／またはＨＢＧ２タンパク質の発現を増大させる、ステップ
を含む、方法。

【請求項17】

前記ＨＳＰＣが造血前駆細胞（ＨＰＣ）である、請求項１６に記載の方法。

【国際調査報告】