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特表2024-506662ＲＮＡトランススプライシング分子

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-14

(54)【発明の名称】ＲＮＡトランススプライシング分子

(51)【国際特許分類】

C12N 15/11 20060101AFI20240206BHJP

C12N 15/85 20060101ALI20240206BHJP

C12N 15/38 20060101ALI20240206BHJP

C12N 7/01 20060101ALI20240206BHJP

C12N 5/16 20060101ALI20240206BHJP

A61K 35/76 20150101ALI20240206BHJP

A61K 31/7088 20060101ALI20240206BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20240206BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20240206BHJP

A61K 35/12 20150101ALI20240206BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/85 Z

C12N15/38

C12N7/01

C12N5/16

A61K35/76

A61K31/7088

A61K48/00

A61P35/00

A61K35/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023548767

(86)(22)【出願日】2022-02-11

(85)【翻訳文提出日】2023-09-15

(86)【国際出願番号】 EP2022053407

(87)【国際公開番号】W WO2022171813

(87)【国際公開日】2022-08-18

(31)【優先権主張番号】2102118.3

(32)【優先日】2021-02-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】500341551

【氏名又は名称】ケンブリッジエンタープライズリミティッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】インゲマースドッテルカリン

(72)【発明者】

【氏名】リーヴァーアンドリュー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA92X

4B065AA94X

4B065AA95X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA43

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA13

4C084ZB26

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA13

4C086ZB26

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB63

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZB26

(57)【要約】

本発明は、ヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするＲＮＡトランススプライシング分子（ＲＴＭ）に関する。ＲＴＭは、（ｉ）ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡに特異的な結合領域、（ｉｉ）トランススプライシングスプライスドメイン、及び（ｉｉｉ）自殺タンパク質のコード配列を含む。ＲＴＭの結合領域が、細胞内のＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡに結合し、コード配列が、ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡとのトランススプライシングドメインを通じてトランススプライシングされ、結果として、細胞中に自殺タンパク質を発現させるキメラｍＲＮＡが得られる。本発明のＲＴＭは、ＨＥＲＶ遺伝子を発現する細胞、例えば、がん細胞を選択的に死滅させるのに有用であり得る。ＲＴＭ、コード核酸、治療方法及び関連する方法ならびに使用が提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＲＮＡトランススプライシング分子（ＲＴＭ）であって、
（ｉ）ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡに特異的な結合領域と、
（ｉｉ）トランススプライシングドメインと、
（ｉｉｉ）自殺タンパク質のコード配列と、を含む、前記ＲＮＡトランススプライシング分子（ＲＴＭ）。

【請求項2】

前記結合領域が、細胞内のＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡに特異的に結合することにより、前記コード配列が、前記ＨＥＲＶｍＲＮＡとトランススプライシングされ、前記細胞中に前記自殺タンパク質が発現される、請求項１に記載のＲＴＭ。

【請求項3】

前記ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡが、ＨＥＲＶ－Ｋｐｒｅ－ｍＲＮＡである、請求項１または請求項２に記載のＲＴＭ。

【請求項4】

前記ＨＥＲＶ－Ｋｐｒｅ－ｍＲＮＡが、ＨＥＲＶ－ＫＮｐ９またはＨＥＲＶ－ＫＲｅｃｐｒｅ－ｍＲＮＡである、請求項３に記載のＲＴＭ。

【請求項5】

前記結合領域が、前記ＨＥＲＶ－ＫＮｐ９またはＨＥＲＶ－ＫＲｅｃｐｒｅ－ｍＲＮＡ内の配列番号２のヌクレオチド配列に特異的に結合する、請求項３に記載のＲＴＭ。

【請求項6】

前記結合領域が、配列番号４のヌクレオチド配列またはその変異体を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＲＴＭ。

【請求項7】

前記結合領域が、配列番号４の４位、１９位、２０位、３２位及び３４位に対応する１つ以上の位置で配列番号４に対して改変された配列番号４の変異体であるヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載のＲＴＭ。

【請求項8】

前記結合領域は、配列番号４の４位に対応する位置にＣからＵへの置換、１９位に対応する位置にＡからＵへの置換、２０位に対応する位置にＡからＵへの置換、３２位に対応する位置にＡからＧへの置換、及び３４位に対応する位置にＡからＧへの置換を有する配列番号４の変異体であるヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のＲＴＭ。

【請求項9】

前記結合領域が、配列番号５のヌクレオチド配列またはその変異体を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＲＴＭ。

【請求項10】

前記自殺タンパク質が、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼである、先行請求項のいずれか１項に記載のＲＴＭ。

【請求項11】

前記ＨＳＶチミジンキナーゼが、配列番号６のアミノ酸配列またはその変異体を含む、請求項１０に記載のＲＴＭ。

【請求項12】

前記ＨＳＶチミジンキナーゼは、配列番号６の４６位及び６０位に対応する位置、任意に配列番号６の１位、４６位及び６０位に対応する位置において、配列番号６に対して改変された配列番号６の変異体であるアミノ酸配列を含む、請求項１０または１１に記載のＲＴＭ。

【請求項13】

前記ＨＳＶチミジンキナーゼは、配列番号６の４６位に対応する位置にＭからＬへの置換、６０位に対応する位置にＭからＩへの置換、及び任意に１位に対応する位置にＭの欠失を有する配列番号６の変異体であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＲＴＭ。

【請求項14】

前記ＨＳＶチミジンキナーゼが、配列番号８のアミノ酸配列またはその変異体を含む、請求項１０～１３のいずれかに記載のＲＴＭ。

【請求項15】

前記ＲＴＭにおける前記結合ドメインと前記トランススプライシングドメインとの間に配置されたスペーサーをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＲＴＭ。

【請求項16】

前記スペーサーが、配列番号１０の配列またはその変異体を含む、請求項１５に記載のＲＴＭ。

【請求項17】

前記結合領域、前記トランススプライシングドメイン及び前記コード配列を５’から３’方向に順に含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＲＴＭ。

【請求項18】

前記トランススプライシングドメインが、アクセプター部位を含む、請求項１７に記載のＲＴＭ。

【請求項19】

前記トランススプライシングドメインが、配列番号１２のヌクレオチド配列またはその変異体を含む、請求項１８に記載のＲＴＭ。

【請求項20】

２Ａ自己切断ペプチドをコードする配列をさらに含み、前記配列が、前記ＲＴＭにおける前記トランススプライシングドメインと前記コード配列との間に位置する、請求項１７～１９のいずれか１項に記載のＲＴＭ。

【請求項21】

前記２Ａ切断部位が、配列番号１１の配列またはその変異体を含む、請求項２０に記載のＲＴＭ。

【請求項22】

前記自殺タンパク質の前記コード配列が、開始コドンを欠く、請求項１７～２１のいずれか１項に記載のＲＴＭ。

【請求項23】

配列番号２配列番号１３の核酸配列、配列番号１３の変異体、配列番号１５の核酸配列、または配列番号１５の変異体を含む、請求項１７～２２のいずれか１項に記載のＲＴＭ。

【請求項24】

前記コード配列、前記トランススプライシングドメイン及び前記結合領域を５’から３’方向に順に含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載のＲＴＭ。

【請求項25】

前記トランススプライシングドメインが、スプライスドナー部位を含む、請求項２３に記載のＲＴＭ。

【請求項26】

前記自殺タンパク質の前記コード配列が、開始コドンを含む、請求項２４または２５に記載のＲＴＭ。

【請求項27】

前記結合ドメインの下流（３’）に位置するリボザイム配列をさらに含み、前記リボザイム配列が、前記結合ドメインのＲＴＭ３’を切断して下流のヌクレオチド配列を除去する、請求項２４～２６のいずれか１項に記載のＲＴＭ。

【請求項28】

先行請求項のいずれか１項に記載のＲＴＭをコードする、核酸。

【請求項29】

配列番号６の４６位及び６０位に対応する位置、任意に配列番号６の１位、４６位及び６０位に対応する位置において、配列番号６に対して改変された配列番号６の変異体であるアミノ酸配列を含むＨＳＶチミジンキナーゼをコードする、核酸。

【請求項30】

前記ＨＳＶチミジンキナーゼは、配列番号６の４６位に対応する位置にＭからＬへの置換、６０位に対応する位置にＭからＩへの置換、及び任意に１位に対応する位置にＭの欠失を有する配列番号６の変異体であるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の核酸。

【請求項31】

前記ＨＳＶチミジンキナーゼが、配列番号８のアミノ酸配列またはその変異体を含む、請求項２９または３０に記載の核酸。

【請求項32】

配列番号９のヌクレオチド配列またはその変異体を含む、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の核酸。

【請求項33】

前記核酸は、標的ｐｒｅ－ｍＲＮＡに特異的な結合領域とトランススプライシングドメインをさらに含むＲＴＭである、請求項２９～３２のいずれか１項に記載の核酸。

【請求項34】

請求項２８に記載の核酸を含む発現ベクター。

【請求項35】

前記ベクターがウイルスベクターである、請求項３４に記載の発現ベクター。

【請求項36】

請求項２８に記載の核酸、または請求項３４もしくは請求項３５に記載の発現ベクターを含む、ウイルス粒子。

【請求項37】

請求項１～２７のいずれか１項に記載のＲＴＭ、請求項２８に記載の核酸、または請求項３４もしくは請求項３５に記載の発現ベクターを含む、単離細胞。

【請求項38】

請求項１～２７のいずれか１項に記載のＲＴＭ、請求項２８に記載の核酸、または請求項３４もしくは請求項３５に記載の発現ベクター、請求項３６に記載のウイルス粒子または請求項３７に記載の単離宿主細胞を含む、医薬組成物。

【請求項39】

がんを治療する方法であって、
請求項１～２７のいずれか１項に記載のＲＴＭ、請求項２８に記載の核酸、または請求項３４もしくは請求項３５に記載の発現ベクター、請求項３６に記載のウイルス粒子、請求項３７に記載の単離細胞、または請求項３８に記載の医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む、前記方法。

【請求項40】

がんの治療方法に使用するための、請求項１～２７のいずれか１項に記載のＲＴＭ、請求項２８に記載の核酸、または請求項３４もしくは請求項３５に記載の発現ベクター、請求項３６に記載のウイルス粒子、請求項３７に記載の単離宿主細胞、または請求項３８に記載の医薬組成物を含む、組成物。

【請求項41】

がんの治療に使用する医薬の製造における、請求項１～２７のいずれか１項に記載のＲＴＭ、請求項２８に記載の核酸、または請求項３４もしくは請求項３５に記載の発現ベクター、請求項３６に記載のウイルス粒子、請求項３７に記載の単離宿主細胞、または請求項３８に記載の医薬組成物の使用。

【請求項42】

前記ＲＴＭ、前記核酸、前記発現ベクター、前記ウイルス粒子、前記単離細胞または前記医薬組成物を前記個体に投与した後に、さらに、
前記個体のがん細胞において細胞毒性化合物が活性化されるように、前記自殺タンパク質によって活性化される前記細胞毒性化合物の不活性プロ体を最初の処置として前記個体に投与することを含む、請求項３９に記載の方法、請求項４０に記載の使用のための組成物、または請求項４１に記載の使用。

【請求項43】

前記細胞毒性化合物が、前記最初の処置の後に前記個体において癌細胞となった、または癌細胞となりつつある細胞において活性化されるように、前記不活性プロ体を用いた１つ以上のさらなる処置を前記個体に投与することをさらに含む、請求項４２に記載の方法、使用のための組成物、または使用。

【請求項44】

前記１つ以上のさらなる処置が、前記最初の処置の少なくとも１週間後に行われる、請求項４３に記載の方法、使用のための組成物、または使用。

【請求項45】

細胞療法を受ける個体におけるがんの発生または再発を防止する方法であって、請求項３７に記載の細胞集団を、それを必要とする個体に投与することを含む、前記方法。

【請求項46】

前記個体において癌化した、または癌化しつつある集団の細胞において細胞毒性化合物が活性化されるように、前記自殺タンパク質によって活性化される前記細胞毒性化合物の不活性プロ体を前記個体に投与することを含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記細胞は、前記個体に由来する自己細胞である、請求項４５または請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記細胞が造血細胞である、請求項４５～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

前記がんがＨＥＲＶ遺伝子の発現によって特徴付けられる、請求項３９または４２～４８のいずれか１項に記載の方法、請求項４０または４２～４４のいずれか１項に記載の使用のための組成物、または請求項４１～４４のいずれか１項に記載の使用。

【請求項50】

前記がんが膵臓癌または肝癌である、請求項３９または４２～４９のいずれか１項に記載の方法、請求項４０、４２～４４または４９のいずれか１項に記載の使用のための組成物、または請求項４１～４４または４９のいずれか１項に記載の使用。

【請求項51】

ｉｎｖｉｔｒｏで細胞を死滅させる方法であって、
細胞が前記自殺タンパク質を発現するように、前記細胞を、請求項１～２７のいずれか１項に記載のＲＴＭ、請求項２８に記載の核酸、請求項３４もしくは請求項３５に記載の発現ベクター、または請求項３６に記載のウイルス粒子と接触させることと、
前記細胞を、前記自殺タンパク質によって活性化される細胞毒性化合物の不活性プロ体と接触させ、前記細胞毒性化合物が前記自殺タンパク質によって活性化され、それによって前記細胞を死滅させることと、を含む、前記方法。

【請求項52】

前記細胞は、ＨＥＲＶ遺伝子を発現する、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

集団におけるＨＥＲＶ遺伝子発現細胞を枯渇させる方法であって、
前記細胞集団中のＨＥＲＶ遺伝子発現細胞が前記自殺タンパク質を発現するように、前記細胞集団を、請求項１～２７のいずれか１項に記載のＲＴＭ、請求項２８に記載の核酸、請求項３４または請求項３５に記載の発現ベクター、請求項３６に記載のウイルス粒子、及び／または請求項３８に記載の医薬組成物と接触させることと、
前記集団を、前記自殺タンパク質によって活性化される細胞毒性化合物の不活性プロ体と接触させ、前記自殺タンパク質が、前記集団におけるＨＥＲＶ遺伝子発現細胞において前記細胞毒性化合物を活性化し、それによって前記集団におけるＨＥＲＶ遺伝子発現細胞を枯渇させることとを含む、前記方法。

【請求項54】

前記ＨＥＲＶ遺伝子発現細胞が、癌細胞である、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記細胞集団が、個体またはその子孫から得られた細胞のサンプルである、請求項５３または５４に記載の方法。

【請求項56】

前記細胞が造血細胞である、請求項５３～５５のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＲＮＡトランススプライシング分子（ＲＴＭ）、特に自殺遺伝子のトランススプライシングを媒介するＲＴＭ、及びがんの治療におけるそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＲＮＡトランススプライシングは、２つの異なるＲＮＡ分子が一緒にスプライスされて核内にキメラｍＲＮＡ分子が生成される、スプライセオソームを介したプロセスである。核外輸送後、キメラｍＲＮＡ分子は細胞質内で翻訳されてキメラタンパク質が生成される。

【0003】

ＲＮＡトランススプライシングは、欠陥のあるＲＮＡ転写産物を、トランスで送達される補正されたｍＲＮＡ分子と交換するために使用されている（Ｈｏｎｇｅｔａｌ（２０２０）ＢｒＭｅｄＢｕｌｌ.２０２０Ｄｅｃ１５；１３６（１）：４－２０）。

【0004】

ＲＮＡトランススプライシングはまた、潜在的な癌治療として２段階の単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ－ガンシクロビル（ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ）細胞死システムを送達するためにも使用されている（Ｋｉｍｅｔａｌ（２０１６）。Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ６３５７－３６８；Ｋｗｏｎｅｔａｌ，（２００５）。Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ１２，５８２４－８３４；Ｊｕｎｇｅｔａｌ（２００６）.Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ.Ｃｏｍｍｕｎ，３４９，５５６－５６３；Ｓｏｎｇｅｔａｌ（２００９）.ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ１６，１１３－１２５；Ｓｏｎｇｅｔａｌ（２００６）.ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ５８０，５０３３－５０４３；Ｗｏｎｅｔａｌ（２００７）.Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.１２９，６１４～６１９；Ｗｏｎｅｔａｌ（２０１２）.Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.１５８，４４－４９）。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼは、リン酸化によりプロドラッグのガンシクロビルから活性化合物への変換を触媒し、ＤＮＡ複製中の連鎖停止と細胞死を引き起こす（Ｄｕａｒｔｅ，Ｓｅｔａｌ（２０１２）．ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔｅｒｓ３２４，１６０－１７０）。

【0005】

ＲＮＡトランススプライシングはまた、ＨＩＶを標的とするためにも使用されている（Ｉｎｇｅｍａｒｓｄｏｔｔｅｒ，Ｃ．Ｋ．ｅｔａｌ（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ，７，１４０－１５４）及びｃａｎｃｅｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃＲＮＡｓ（Ｐｏｄｄａｒｅｔａｌ（２０１８）．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ，１１，４１－５６；ＷＯ２０１７１７１６５４Ａ１，ＵＳ２０１５０７９６７８Ａ１，ＷＯ２０１４０６８０６３Ａ１）。

【発明の概要】

【0006】

本発明者らは、ヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするＲＮＡトランススプライシング分子（ＲＴＭ）を開発した。このＲＴＭは、ＨＥＲＶ遺伝子を発現する細胞、例えば、がん細胞を選択的に死滅させるのに有用であり得る。

【0007】

本発明の第１の態様は、
（ｉ）ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡに特異的な結合領域と、
（ｉｉ）トランススプライシングスプライスドメインと、
（ｉｉｉ）自殺タンパク質のコード配列と、を含むＲＮＡトランススプライシング分子（ＲＴＭ）を提供する。

【0008】

ＲＴＭの結合領域が、細胞内のＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡに結合し、コード配列が、ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡとのトランススプライシングドメインを通じてトランススプライシングされ、結果として、細胞中に自殺タンパク質を発現させるキメラｍＲＮＡが得られる。

【0009】

好ましいＲＴＭは、配列番号１３、配列番号１５、またはこれらのいずれかの変異体の核酸配列を含み得る。

【0010】

本発明の第２の態様は、第１の態様のＲＴＭをコードする核酸を提供する。好ましい核酸は、配列番号１４、配列番号１６、またはこれらのいずれかの変異体のヌクレオチド配列を含み得る。

【0011】

本発明の第３の態様は、第２の態様の核酸を含む発現ベクターを提供する。

【0012】

本発明の第４の態様は、第１の態様のＲＴＭ、第２の態様の核酸、または第３の態様の発現ベクターを含むウイルス粒子を提供する。

【0013】

本発明の第５の態様は、第１の態様のＲＴＭ、第２の態様の核酸、及び／または第３の態様の発現ベクターを含む単離細胞を提供する。

【0014】

本発明の第６の態様は、第１の態様のＲＴＭ、第２の態様の核酸、第３の態様の発現ベクター及び／または第４の態様のウイルス粒子を含む医薬組成物を提供する。

【0015】

本発明の第７の態様は、
第１の態様のＲＴＭ、第２の態様の核酸、第３の態様の発現ベクター、第４の態様のウイルス粒子及び／または第６の態様の医薬製剤を、それを必要とする個体に投与することを含む、がんの治療方法を提供する。

【0016】

第７の態様の方法は、自殺タンパク質によって活性化される細胞毒性化合物を個体に投与することをさらに含み得る。例えば、不活性なプロ体を個体に投与することができ、この場合、自殺タンパク質は、自殺タンパク質が発現されている細胞内で、不活性なプロ体を細胞毒性化合物の活性型に変換することができる。細胞毒性化合物は、最初の治療で個体に投与され、最初の治療後に１つ以上のさらなる治療を行うことができる。

【0017】

本発明の第８の態様は、がんの治療方法、例えば第７の態様の方法において使用するための、第１の態様のＲＴＭ、第２の態様の核酸、第３の態様の発現ベクター、第４の態様のウイルス粒子及び／または第６の態様の医薬製剤；及びがんの治療方法、例えば第７の態様の方法において使用するための医薬の製造における、第１の態様のＲＴＭ、第２の態様の核酸、第３の態様の発現ベクター、第４の態様のウイルス粒子及び／または第６の態様の医薬製剤の使用、を提供する。

【0018】

ＲＴＭ、核酸、発現ベクター、ウイルス粒子、及び／または医薬製剤は、自殺タンパク質によって活性化される細胞毒性化合物と組み合わせて提供され得る。

【0019】

本発明の第９の態様は、細胞療法を受ける個体におけるがんの発生または再発を防止する方法であって、第５の態様による細胞の集団を、それを必要とする個体に投与することを含む、方法に関する。

【0020】

本方法はさらに、個体において癌化した、または癌化しつつある集団の細胞において細胞毒性化合物が活性化されるように、自殺タンパク質によって活性化される細胞毒性化合物の不活性プロ体を個体に投与することを含み得る。

【0021】

本発明の第１０の態様は、インビトロで細胞を死滅させる方法であって、
細胞を、第１の態様のＲＴＭ、第２の態様の核酸、第３の態様の発現ベクター、第４の態様のウイルス粒子及び／または第６の態様の医薬製剤と接触させ、上記細胞が自殺タンパク質を発現させることと、
細胞を、自殺タンパク質によって活性化される細胞毒性化合物と接触させ、上記自殺タンパク質が細胞毒性化合物を活性化して細胞を死滅させることと、を含む、方法に関する。

【0022】

本発明の第１１の態様は、集団におけるＨＥＲＶ遺伝子発現細胞を枯渇させる方法であって、
細胞集団を、第１の態様のＲＴＭ、第２の態様の核酸、第３の態様の発現ベクター、第４の態様のウイルス粒子及び／または第６の態様の医薬製剤と接触させ、上記細胞集団におけるＨＥＲＶ遺伝子発現細胞が自殺タンパク質を発現することと、
集団を、上記自殺タンパク質によって活性化される細胞毒性化合物と接触させ、その結果、上記自殺タンパク質は、上記集団におけるＨＥＲＶ遺伝子発現細胞において細胞毒性化合物を活性化し、それによって上記集団におけるＨＥＲＶ遺伝子発現細胞を枯渇させることと、を含む、方法に関する。

【0023】

第１～第１１の態様の好ましい実施形態では、自殺タンパク質は、ＨＳＶチミジンキナーゼであってもよく、細胞傷害性化合物は、ガンシクロビルであってもよい。

【0024】

本発明の他の態様及び実施形態については、以下でより詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】ｇａｇ、ｐｒｏ、ｐｏｌ、及びｅｎｖオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を示したＨＥＲＶ－ＫクラスＩ及びクラスＩＩのゲノム構成（上図）を示す。Ｐｒｏ及びＰｏｌは、－１リボソームフレームシフト事象を介して発現される。ＨＥＲＶ－ＫクラスＩでは、ｅｎｖ遺伝子内に２９２塩基対の欠失があり、その結果、ＨＥＲＶ－ＫクラスＩでは代替スプライシング事象が生じ、Ｎｐ９ＲＮＡ転写産物が生成されるのに対し、Ｒｅｃは、ＨＥＲＶ－ＫクラスＩＩから生成される（中図）。ＨＥＲＶ－Ｋｅｎｖは、ｅｎｖ内のＲｅｃ／Ｎｐ９イントロンに相補的な結合ドメインを含むＲＴＭでＲＮＡトランススプライシングの標的となり得る（下図）。

【図2】Ｎｐ９ＲＮＡトランススプライシング標的及び結合ドメインの配列とアラインメントを示す。２Ａ.ＲＮＡトランススプライシング結合ドメインの標的配列。標的配列は、ｅｎｖオープンリーディングフレーム内のＨＥＲＶ－ＫＨＭＬ－２－２２ｑ１１.２１、ジェンバンク配列番号ＪＮ６７５０８７．１のヌクレオチド６５１３～６５５６に対応する。２Ｂ.選択された標的配列とＨＥＲＶ－ＫＨＭＬ－２－２２ｑ１１．２１、ジェンバンク配列番号ＪＮ６７５０８７．１とのヌクレオチドアラインメントを行い、ヌクレオチド位置６５１３－６５５６を確認する。２Ｃ.結合ドメイン設計の最適化のために選択された標的の逆相補性ヌクレオチド配列（上）。最適化された結合ドメインＤＮＡ配列(中)。最適化された結合ドメインＲＮＡ配列（下）。矢印のヌクレオチドは、ＲＮＡ構造の改善のためのＣからＵへのウォブル塩基置換、ＡからＵへのミスマッチ、ＡからＧへのウォブル塩基置換を示す。２Ｄ．結合ドメイン配列と標的配列ＨＥＲＶ－ＫＨＭＬ－２－２２ｑ１１．２１、ジェンバンク配列番号ＪＮ６７５０８７．１とのヌクレオチドアラインメントは配列相補性を示す。

【図3】結合ドメイン配列のＲＮＡ二次構造予測を示す。３Ａ.ＲＮＡｆｏｌｄウェブサーバーを用いた最小自由エネルギー（ＭＦＥ）（左）及び重心（右）のＲＮＡ二次構造予測。３Ｂ.ＲＮＡトランススプライシングカセット内でフォールドされたＮｐ９標的ＲＮＡ結合ドメインのＲＮＡ二次構造予測。ＲＮＡセントロイドフォールド（左）及びＭＦＥフォールド（右）。インサートは、ＲＮＡ結合ドメイン領域を示す。

【図4A】レンチウイルスＲＮＡのトランススプライシング送達システムを示す。パッケージングプラスミド（Ｇａｇ／Ｐｏｌ、ＶＳＶ－Ｇ、及びＲｅｖ）と、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位の間に示されるＲＮＡトランススプライシングカセットを含む遺伝子導入構築物とを含む、第３の世代のレンチウイルス遺伝子送達システムを示す図。ＲＮＡトランススプライシングカセットは、内部プロモーター、例えば、サイロキシン結合グロブリンプロモーター（ＴＢＧ）またはサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）または他の組織特異的もしくは非特異的もしくはシステム特異的（例えば、低酸素応答性）プロモーターによって駆動される。

【図4B】レンチウイルスＲＮＡのトランススプライシング送達システムを示す。Ａに示したＲＮＡトランススプライシングカセットの詳細図。ＴＢＧプロモーターに続いて、ＨＥＲＶ－ＫＮｐ９を標的とするＲＮＡ結合ドメイン配列がある。トランススプライシングドメインから結合ドメインを分離するために、結合ドメインの下流にスペーサーが含まれ、その後にＰ２Ａ切断部位が続く。トランス遺伝子単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）は、第１のＡＴＧ翻訳開始コドンを欠くが、第２及び第３のＡＴＧ（ＡＴＧ^４６及びＡＴＧ^６０）はインタクトである。ミニイントロンは、さらに下流に配置されている。

【図4C】レンチウイルスＲＮＡのトランススプライシング送達システムを示す。最適化されたＲＮＡトランススプライシングカセット。ＢｂｖＣＩ制限酵素部位及び下流ヌクレオチドを突然変異させて、潜在的なＲＮＡスプライスアクセプター部位を破壊し、シスにおいてＲＮＡスプライシングを引き起こす可能性がある。

【化1】

（ＢｂｖＣＩ制限酵素部位が強調されている）を

【化2】

に突然変異させた。ＡＵＧ翻訳開始部位をコードする第２及び第３のＡＴＧを、それぞれＡＴＧ^４６及びＡＴＧ^６０について、ＡＴＧからＣＴＧ及びＡＴＣに突然変異させた。

【図5A】Ｎｐ９を標的とするＲＮＡトランススプライシング構築物でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＨＳＶ－ｔｋタンパク質の発現を示す。ＨＳＶ－ｔｋｐｒｅ－ｍＲＮＡのＮｐ９ｐｒｅ－ｍＲＮＡ上へのＲＮＡトランススプライシングを誘導するためのＲＮＡトランススプライシング構築物、ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ及びＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔの概略図である。両方のコンストラクトはＣＭＶプロモーターから誘導される。ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ及びその最適化されたバージョンＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔは、図４Ｃに記載されている。

【図5B】Ｎｐ９を標的とするＲＮＡトランススプライシング構築物でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＨＳＶ－ｔｋタンパク質の発現を示す。ＨＳＶ－ｔｋｍＲＮＡを示すグラフ。矢印及び緑色のブロックは、ＨＳＶ－ｔｋ翻訳開始部位を示す。野生型ＨＳＶ－ｔｋｍＲＮＡ転写産物からは、ＡＴＧ１からのＰ１、ＡＴＧ１とＡＴＧ４６との間に位置する非標準的ＡＴＧ翻訳開始部位からのＰ２、ＡＴＧ４６からのＰ３、及びＡＴＧ６０からのＰ４の４つのアイソフォームが産生され得る。種々のＨＳＶ－ｔｋアイソフォームの中でも、Ｐ１及びＰ３が触媒活性であり、Ｐ２が不活性であり、かつＰ４が非常に低い活性を有することが判明した（Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ａ.Ｒ.＆Ｂｉｓｈｏｐ，Ｊ.Ｏ.（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｒｅｓｅａｒｃｈ２４２０７３－２０７９）。

【図5C】Ｎｐ９を標的とするＲＮＡトランススプライシング構築物でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＨＳＶ－ｔｋタンパク質の発現を示す。Ｎｐ９を発現する細胞及びＮｐ９を発現しない細胞の両方における、ＨＳＶ－ｔｋ野生型転写産物、ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ、及びＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔのＨＳＶ－ｔｋアイソフォームタンパク質発現に関する予測。野生型ＨＳＶ－ｔｋ転写産物は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４をある程度発現すると予想される。ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ及びＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔはともに、Ｎｐ９発現細胞においてのみＰ１を発現すると予想される。しかしながら、ＨＳＶｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔトランスフェクト細胞では、Ｐ３及びＰ４の発現が抑制されると予想される。

【図5D】Ｎｐ９を標的とするＲＮＡトランススプライシング構築物でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＨＳＶ－ｔｋタンパク質の発現を示す。ＲＮＡトランススプライシング構築物、ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓもしくはＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓｏｐｔ、または対照、ＣＭＶ－ＧＦＰもしくはＣＭＶ－ＨＳＶ－ｔｋのいずれかによってトランスフェクションしてから７２時間後にウエスタンブロットで解析したＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのタンパク質溶解物。高被曝及び低被曝の両方で検出されたＨＳＶ－ｔｋ抗体染色。

【図5E】Ｎｐ９を標的とするＲＮＡトランススプライシング構築物でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＨＳＶ－ｔｋタンパク質の発現を示す。ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓまたはＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔトランスフェクト細胞でのＰ１発現の定量化。Ｐ１タンパク質を各レーンのビンキュリンタンパク質に正規化した（ｎ＝３）。

【図5F】Ｎｐ９を標的とするＲＮＡトランススプライシング構築物でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＨＳＶ－ｔｋタンパク質の発現を示す。ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓまたはＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔトランスフェクト細胞でのＰ３発現の定量化。Ｐ１タンパク質を各レーンのビンキュリンタンパク質に正規化した（ｎ＝３）。全てのグラフに関して、エラーバーはＳ.Ｄ.を示している；ｎｓ＝有意でない；**Ｐ＜０.０１；対にされていないｔ検定である。

【図6】Ｎｐ９ｐｒｅｍＲＮＡを標的としたＲＮＡトランススプライシングレンチウイルスベクターを形質導入した後の、肝細胞癌細胞株（ＨＣＣ）Ｈｅｐ３Ｂ及びＨｕｈ７－ｍＲＦＰにおける細胞生存率の低下を示している。Ａ.Ｈｅｐ３Ｂ細胞（９６ウェルプレート中の１×１０＾４細胞／ウェル）を、未処理（ｃｔｒｌ）であるか、または陰性対照ベクターｐＳｉｃｏ、トランススプライシングベクター、３’ＥＲ－ＨＳＶｔｋ、３’ＥＲ－ＨＳＶｔｋ、もしくはＨＳＶｔｋ（陽性対照）を用いてＭＯＩ（感染多重度）１で形質導入した。３’ＥＲ－ＨＳＶｔｋ及び３’ＥＲ－ＨＳＶｔｋｏｐｔは、ＴＢＧプロモーターから駆動されることを除いて、図５Ａに示されるＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ及びＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔとそれぞれ同一である。形質導入後１日に、細胞を３００μΜのガンシクロビル（ＧＣＶ）の用量で処理し、翌日に２回目の投与をした。ＧＣＶ処理の４日後（導入５日後）の細胞生存率をＭＴＴアッセイによって分析した（Ｐａｎｎｅｃｏｕｑｕｅ，Ｃ．ｅｔａｌ（２００８）Ｎａｔｕｒｅｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，３，４２７－４３４）．Ｂ．ＨｕＨ７－ｍＲＦＰ細胞を形質転換し、Ａ.に記載されるようにＧＣＶで処理し、処理の４日後に細胞生存率を分析した。Ｃ.Ｈｅｐ３Ｂ細胞をＡ.と同様に形質導入し、形質導入後２日目及び３日目に１０μＭまたは１００μＭのＧＣＶの２つの連続用量を用いてＧＣＶで処理し、次いで、３日後にＭＴＴアッセイにより細胞生存率分析を行った。エラーバーは標準偏差（Ｓ.Ｄ.）を示す。統計分析を、スチューデントのｔ検定（両側、不均等な分散を仮定する）で*Ｐ＜０.０５；**Ｐ＜０.０１；***Ｐ＜０.００１で実行し、各サンプル＋ＧＣＶをＧＣＶなしの各サンプルと比較した。

【図7A】ＲＮＡトランススプライシングレンチウイルスベクターが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ－１、Ａｓｐｃ－１及びＭＩＡＰａＣａ－２において細胞死を誘導することを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、Ｌｖ－ＣＭＶ－ＧＦＰ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔ、またはＬｖ－ＣＭＶ－ＨＳＶ－ｔｋで、１のＭＯＩで形質導入し、１０００μＭのＧＣＶで処理した。ＣＭＶプロモーターを有するＲＮＡトランススプライシングレンチウイルスベクターで処理した細胞では、細胞生存率が著しく低下することが、ほぼすべての細胞株で観察された。ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存率を定量化した。（ｎ＝３）；エラーバーは、Ｓ.Ｄ.；*Ｐ＜０.０５；**Ｐ＜０.０１；***Ｐ＜０.００１；****Ｐ＜０.０００１；二元配置ＡＮＯＶＡに続き、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定を行う。

【図7B】ＲＮＡトランススプライシングレンチウイルスベクターが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ－１、Ａｓｐｃ－１及びＭＩＡＰａＣａ－２において細胞死を誘導することを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、Ｌｖ－ＣＭＶ－ＧＦＰ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔ、またはＬｖ－ＣＭＶ－ＨＳＶ－ｔｋで、２のＭＯＩで形質導入し、１０００μＭのＧＣＶで処理した。ＣＭＶプロモーターを有するＲＮＡトランススプライシングレンチウイルスベクターで処理した細胞では、細胞生存率が著しく低下することが、ほぼすべての細胞株で観察された。ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存率を定量化した。（ｎ＝３）；エラーバーは、Ｓ.Ｄ.；*Ｐ＜０.０５；**Ｐ＜０.０１；***Ｐ＜０.００１；****Ｐ＜０.０００１；二元配置ＡＮＯＶＡに続き、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定を行う。

【図7C】ＲＮＡトランススプライシングレンチウイルスベクターが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ－１、Ａｓｐｃ－１及びＭＩＡＰａＣａ－２において細胞死を誘導することを示す。Ｐａｎｃ－１細胞は、Ｌｖ－ＣＭＶ－ＧＦＰ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔ、またはＬｖ－ＣＭＶ－ＨＳＶ－ｔｋで、１のＭＯＩで形質導入し、１０００μＭのＧＣＶで処理した。ＣＭＶプロモーターを有するＲＮＡトランススプライシングレンチウイルスベクターで処理した細胞では、細胞生存率が著しく低下することが、ほぼすべての細胞株で観察された。ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存率を定量化した。（ｎ＝３）；エラーバーは、Ｓ.Ｄ.；*Ｐ＜０.０５；**Ｐ＜０.０１；***Ｐ＜０.００１；****Ｐ＜０.０００１；二元配置ＡＮＯＶＡに続き、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定を行う。

【図7D】ＲＮＡトランススプライシングレンチウイルスベクターが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ－１、Ａｓｐｃ－１及びＭＩＡＰａＣａ－２において細胞死を誘導することを示す。Ｐａｎｃ－１細胞は、Ｌｖ－ＣＭＶ－ＧＦＰ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔ、またはＬｖ－ＣＭＶ－ＨＳＶ－ｔｋで、２のＭＯＩで形質導入し、１０００μＭのＧＣＶで処理した。ＣＭＶプロモーターを有するＲＮＡトランススプライシングレンチウイルスベクターで処理した細胞では、細胞生存率が著しく低下することが、ほぼすべての細胞株で観察された。ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存率を定量化した。（ｎ＝３）；エラーバーは、Ｓ.Ｄ.；*Ｐ＜０.０５；**Ｐ＜０.０１；***Ｐ＜０.００１；****Ｐ＜０.０００１；二元配置ＡＮＯＶＡに続き、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定を行う。

【図7E】ＲＮＡトランススプライシングレンチウイルスベクターが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ－１、Ａｓｐｃ－１及びＭＩＡＰａＣａ－２において細胞死を誘導することを示す。Ａｓｐｃ－１細胞は、Ｌｖ－ＣＭＶ－ＧＦＰ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔ、またはＬｖ－ＣＭＶ－ＨＳＶ－ｔｋで、１のＭＯＩで形質導入し、１０００μＭのＧＣＶで処理した。ＣＭＶプロモーターを有するＲＮＡトランススプライシングレンチウイルスベクターで処理した細胞では、細胞生存率が著しく低下することが、ほぼすべての細胞株で観察された。ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存率を定量化した。（ｎ＝３）；エラーバーは、Ｓ.Ｄ.；*Ｐ＜０.０５；**Ｐ＜０.０１；***Ｐ＜０.００１；****Ｐ＜０.０００１；二元配置ＡＮＯＶＡに続き、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定を行う。

【図7F】ＲＮＡトランススプライシングレンチウイルスベクターが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ－１、Ａｓｐｃ－１及びＭＩＡＰａＣａ－２において細胞死を誘導することを示す。Ａｓｐｃ－１細胞は、Ｌｖ－ＣＭＶ－ＧＦＰ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔ、またはＬｖ－ＣＭＶ－ＨＳＶ－ｔｋで、２のＭＯＩで形質導入し、１０００μＭのＧＣＶで処理した。ＣＭＶプロモーターを有するＲＮＡトランススプライシングレンチウイルスベクターで処理した細胞では、細胞生存率が著しく低下することが、ほぼすべての細胞株で観察された。ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存率を定量化した。（ｎ＝３）；エラーバーは、Ｓ.Ｄ.；*Ｐ＜０.０５；**Ｐ＜０.０１；***Ｐ＜０.００１；****Ｐ＜０.０００１；二元配置ＡＮＯＶＡに続き、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定を行う。

【図7G】ＲＮＡトランススプライシングレンチウイルスベクターが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ－１、Ａｓｐｃ－１及びＭＩＡＰａＣａ－２において細胞死を誘導することを示す。ＭＩＡＰａＣａ－２細胞は、Ｌｖ－ＣＭＶ－ＧＦＰ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔ、またはＬｖ－ＣＭＶ－ＨＳＶ－ｔｋで、１のＭＯＩで形質導入し、１０００μＭのＧＣＶで処理した。ＣＭＶプロモーターを有するＲＮＡトランススプライシングレンチウイルスベクターで処理した細胞では、細胞生存率が著しく低下することが、ほぼすべての細胞株で観察された。ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存率を定量化した。（ｎ＝３）；エラーバーは、Ｓ.Ｄ.；*Ｐ＜０.０５；**Ｐ＜０.０１；***Ｐ＜０.００１；****Ｐ＜０.０００１；二元配置ＡＮＯＶＡに続き、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定を行う。

【図7H】ＲＮＡトランススプライシングレンチウイルスベクターが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ－１、Ａｓｐｃ－１及びＭＩＡＰａＣａ－２において細胞死を誘導することを示す。ＭＩＡＰａＣａ－２細胞は、Ｌｖ－ＣＭＶ－ＧＦＰ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔ、またはＬｖ－ＣＭＶ－ＨＳＶ－ｔｋで、２のＭＯＩで形質導入し、１０００μＭのＧＣＶで処理した。ＣＭＶプロモーターを有するＲＮＡトランススプライシングレンチウイルスベクターで処理した細胞では、細胞生存率が著しく低下することが、ほぼすべての細胞株で観察された。ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存率を定量化した。（ｎ＝３）；エラーバーは、Ｓ.Ｄ.；*Ｐ＜０.０５；**Ｐ＜０.０１；***Ｐ＜０.００１；****Ｐ＜０.０００１；二元配置ＡＮＯＶＡに続き、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定を行う。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本発明は、（ｉ）ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡに特異的な結合領域、（ｉｉ）トランススプライシングドメイン、及び（ｉｉｉ）自殺タンパク質をコードする配列を含む、リボ核酸（ＲＮＡ）トランススプライシング分子（ＲＴＭ）に関する。ＲＴＭは、ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡのトランススプライシングを、自殺タンパク質をコードする配列、例えば３’エクソン置換（３’ＥＲ）または５’エクソン置換（５’ＥＲ）によって媒介する。これにより、ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡを発現する細胞において自殺タンパク質が発現される。その後、この自殺タンパク質によって活性化される細胞毒性化合物への曝露によって、自殺タンパク質を発現する細胞を選択的に死滅させることができる。

【0027】

リボ核酸（ＲＮＡ）トランススプライシング分子（ＲＴＭ）は、内因性標的ｐｒｅ－ｍＲＮＡとＲＴＭとの間にトランススプライシング事象を誘導することができ、標的ｐｒｅ－ＲＮＡ及びＲＴＭの両方からのヌクレオチド配列を含むキメラｍＲＮＡを生成することができる異種ＲＮＡ分子である。ＲＴＭは、典型的には、標的ｐｒｅ－ｍＲＮＡへの特異性を規定する結合領域と、トランススプライシングを仲介するスプライシング要素と、標的ｐｒｅ－ｍＲＮＡの一部に置き換わるコード配列とを含む。遺伝子治療で使用するためのＲＴＭの設計及び使用が報告されている（例えば、Ｗａｌｌｙｅｔａｌ.ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ２０１２；１３２：１９５９－１９６６.ＰｔｔａｒａｊｕｅｔａｌＮａｔ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.１９９９；１７：２４６－２５２を参照）。本明細書に記載のＲＴＭは、ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とする。ＲＴＭのコード配列がＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡとトランススプライシングされる条件下で、ＲＴＭをＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡと接触させて、キメラｍＲＮＡ分子を形成することができる。このキメラｍＲＮＡ分子は、さらに処理されて細胞内で発現され得る。

【0028】

ＲＴＭの特徴（ｉ）～（ｉｉｉ）は、例えば３’エクソン置換の場合、（ｉ）、（ｉｉ）（ｉｉｉ）の順序で、または例えば５’エクソン交換の場合、（ｉｉｉ）、（ｉｉ）、（ｉ）の順序で、５’から３’への方向で順次配置され得る（例えば、Ｐｏｄｄａｒｅｔａｌ（２０１８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｈｅｒａｐｙ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ１１，４１－５６を参照）。

【0029】

本明細書に記載のＲＴＭは、ＨＥＲＶ前駆体ｍＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）を用いたトランススプライシングを媒介する。ｐｒｅ－ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡにまだ処理されていない細胞の核内の遺伝子から転写されたＲＮＡである。したがって、ｐｒｅ－ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡには存在しないイントロン及び他の特徴を含む。ｐｒｅ－ｍＲＮＡは、一次転写物、または異種核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）とも呼ばれ得る。

【0030】

ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡは、ＨＥＲＶプロウイルスに由来する遺伝子（ＨＥＲＶ遺伝子）の非連結または部分的スプライシングされた転写産物を含み得る。適切なＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡにはＨＥＲＶ－Ｋｐｒｅ－ｍＲＮＡが含まれる。

【0031】

ヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）は、ヒトゲノムに存在する内因性ウイルス要素またはプロウイルスである。ＨＥＲＶは、外因性レトロウイルスと類似したゲノム構成を示し、かつ生殖系列内で連続世代を通して垂直的に伝播する。ＨＥＲＶプロウイルスからの遺伝子の発現は、正常細胞では厳しく調節されているが、ＨＥＲＶ－Ｋ遺伝子は、癌では調節異常で過剰発現している可能性がある（例えば、ＨｏｈｎｅｔａｌＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＯｎｃｏｌｏｇｙ，３，２４６；Ｋａｓｓｉｏｔｉｓ，Ｇ.（２０１４）Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１９２，１３４３－１３４９；Ａｔｔｉｇ，Ｊ.，ｅｔａｌＧｅｎｏｍｅＲｅｓ，２９，１５７８－１５９０を参照）

【0032】

ＨＥＲＶは、完全なまたは不完全なゲノムを有する任意のクラスまたは群であり得る。例えば、ＨＥＲＶは、第１群～第６群のいずれか１種のクラスＩＨＥＲＶ、第１群～第１０群のいずれか１種のクラスＩＩＨＥＲＶまたはクラスＩＩＩＨＥＲＶであってよい。いくつかの好ましい実施形態では、ＨＥＲＶは、クラスＩＩＨＥＲＶ、例えばＨＥＲＶ－Ｋであってよい。ＨＥＲＶ－Ｋは、ヒトゲノム内のヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）のクラスである（例えば、Ｂａｎｎｅｒｔｅｔａｌ（２０１８）ＦｒｏｎｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ９，１７８を参照）。ＨＥＲＶ－２は、ＨＥＲＶ－ＫＨＭＬ－２プロウイルス、例えば、第１群及び第２群のＨＥＲＶ－ＫＨＭＬ－２プロウイルスを含み得る。
適切なＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡは、ＨＥＲＶプロウイルス遺伝子、例えばｇａｇ、ｐｒｏ、ｐｏｌまたはｅｎｖ遺伝子、例えばＨＥＲＶ－ＫＨＭＬ－２ｇａｇ、ｐｒｏ、ｐｏｌまたはｅｎｖ遺伝子から転写され得る。

【0033】

いくつかの好ましい実施形態では、ＨＥＲＶプロウイルス遺伝子は、ｅｎｖ遺伝子であり得る。例えば、適切なＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡは、ＨＥＲＶｅｎｖ遺伝子、例えばＨＥＲＶ－Ｋｅｎｖ遺伝子から転写され得る。適切なＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡは、ＨＥＲＶ－ＫＨＭＬ－２ｅｎｖ遺伝子から転写される。ＨＥＲＶ－ＫＨＭＬ－２プロウイルスは、２つの群（群１及び群２）に分類され得る。ＨＥＲＶ－ＫＨＭＬ－２の第１群のプロウイルスのｅｎｖ遺伝子は、ＨＥＲＶ－ＫＨＭＬ－２の第２群のプロウイルスのｅｎｖ遺伝子に対して２９１塩基対の欠失を有する。この欠失により、第１群及び第２群のプロウイルスでは選択的スプライシングを引き起こし、第１群のプロウイルスではＮｐ９タンパク質が、第２群のプロウイルスではＲｅｃタンパク質が生成される。

【0034】

本明細書に記載のＲＴＭでは、両方の種類のＨＥＲＶ－ＫＨＭＬ－２ｅｎｖ遺伝子転写産物を標的とすることができる。例えば、ＨＥＲＶ－Ｋｐｒｅ－ｍＲＮＡは、（ｉ）Ｎｐ９をコードするＨＥＲＶ－Ｋｐｒｅ－ｍＲＮＡ及び／または（ｉｉ）ＲｅｃをコードするＨＥＲＶ－Ｋｐｒｅ－ｍＲＮＡであってよい。例えば、本明細書に記載のＲＴＭでは、ＨＥＲＶ－ＫＨＭＬ－２の第１群のプロウイルスによって発現されるＮｐ９ｐｒｅ－ｍＲＮＡと、ＨＥＲＶ－ＫＨＭＬ－２の第２群のプロウイルスによって発現されるＲｅｃｐｒｅ－ｍＲＮＡとの両方を標的とすることができる。

【0035】

ＲＴＭの結合領域は、ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡに特異的に結合する。例えば、上記結合領域は、ｅｎｖ遺伝子から転写されるＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡに特異的に結合することができる。結合領域の結合は、ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡにＲＴＭを標的とし、自殺タンパク質をコードするコード配列をＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡとトランスススプライシングすることを可能にする。いくつかの好ましい実施形態では、結合領域は、ｅｎｖ遺伝子から転写されるＨＥＲＶ－Ｋｐｒｅ－ｍＲＮＡ、例えば、ＨＥＲＶ－ＫＮｐ９またはＨＥＲＶ－ＫＲｅｃｐｒｅ－ｍＲＮＡに特異的に結合し得る。結合領域の結合は、ＨＥＲＶ－Ｋｐｒｅ－ｍＲＮＡにＲＴＭを標的とし、自殺タンパク質をコードするコード配列をＨＥＲＶ－Ｋｐｒｅ－ｍＲＮＡとトランスススプライシングすることを可能にする。

【0036】

本明細書に記載のＲＴＭは、１つ以上の結合領域を含み得る、すなわち、ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡにハイブリダイズする１つの連続した配列または複数の連続した領域を含む。複数の結合領域は、例えば細胞死を増強するのに有用であり得る（例えば、Ｐｏｄｄａｒｅｔａｌ（２０１８）ｓｕｐｒａ）。好ましくは、本明細書に記載されるＲＴＭは、単一の結合領域を含み、すなわち、ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡにハイブリダイズする１つの連続した配列のみを含む。

【0037】

結合領域は開放構造を有し得る。例えば、自己相補配列を欠くことがあり、ＲＴＭ内の他のヌクレオチドと対にされていない、または結合されていない一連の非構造化ヌクレオチドを含み得る。結合領域は、例えば２５個未満の連続した非構造化ヌクレオチド、例えば１２～２５個の連続した非構造化ヌクレオチドを含み得る。

【0038】

好ましくは、ＲＴＭの結合領域は、ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡ、例えば、ＨＥＲＶ－Ｋｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン配列に特異的に結合する。この結合領域は、ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡにおけるスプライス部位に近いイントロン配列に特異的に結合し得る。適切なスプライス部位は、標準的な配列分析ツールを使用して同定することができる（例えば、ＮｅｕｒａｌＮｅｔｗｏｒｋＳｅｒｖｅｒｗｉｔｈｉｎｔｈｅＢｅｒｋｅｌｅｙＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔ；ＣｒｙｐＳｋｉｐｓｏｆｔｗａｒｅ，ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＨＵＳＡＲｓｅｒｖｅｒ，ＧｅｒｍａｎＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｒｅ）。３’エクソン置換の場合、結合領域は、ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡ内のスプライス部位の下流（３’）にあるイントロン配列に特異的に結合し得る。５’エクソン置換の場合、結合領域は、ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡ内のスプライス部位の上流（５’）にあるイントロン配列に特異的に結合し得る。

【0039】

結合領域は、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ中の他のイントロン配列と比較して、最小自由エネルギーが高く、非構造化ヌクレオチドの割合が高いと同定された領域に結合することができる。適切な領域は、標準的な配列分析ツールを使用して同定され得る（例えば、Ｆｏｌｄａｎａｌｙｓｅ，ＢｉｏｉｎｆｏｒｍｉｃｓＨＵＳＡＲｓｅｒｖｅｒ，ＧｅｒｍａｎＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）。例えば、ＨＥＲＶ－ＫＥｎｖ遺伝子を標的とするＲＴＭの結合領域は、配列番号１に対応するＨＥＲＶ－ＫＮｐ９またはＨＥＲＶ－ＫＲｅｃｐｒｅ－ｍＲＮＡの領域内に結合し得る（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ６５１３－６５５６ｏｆＨＥＲＶ－ＫＨＭＬ－２－２２ｑ１１．２１；ＧｅｎｂａｎｋＩＤ：ＪＮ６７５０８７．１）。

【0040】

適切な結合領域は、ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡ内の配列またはその変異体の逆相補配列を含み得る。例えば、ＨＥＲＶ－Ｋ遺伝子を標的とする適切な結合領域は、ＨＥＲＶ－Ｋｐｒｅ－ｍＲＮＡ内の配列またはその変異体の逆相補配列を含み得る。この結合領域は、配列番号３（配列番号１の逆相補配列）または配列番号４（配列番号２の逆相補配列）のヌクレオチド配列を含んでいてもよく、またはその変異体であってもよい。適切な結合領域は、２００ヌクレオチド未満の長さ、好ましくは１００ヌクレオチド未満の長さであってよい。

【0041】

いくつかの好ましい実施形態では、結合領域のヌクレオチド配列を改変して、潜在的なスプライス部位を除去し、ＲＮＡ編集を阻害し、かつ／またはトランススプライシング効率を高めることができる。例えば、ＨＥＲＶ－Ｋｅｎｖｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とする結合領域は、配列番号３のヌクレオチド配列またはその変異体を含んでもよく、そのヌクレオチド配列は、４位、１９位、２０位、３２位及び３４位の１つ以上、好ましくは全ての位置で配列番号３に対して改変を有する。例えば、ヌクレオチド配列は、４位、１９位及び２０位にＵを有し、３２位及び３４位にＧを有し得る。適切な結合領域は、配列番号３に対応する、４位にＣからＵへの置換；１９位にＡからＵへの置換；２０位にＡからＵへの置換；３２位にＡからＧへの置換；及び３４位にＡからＧへの置換を有するヌクレオチド配列を含み得る。例えば、結合領域は、配列番号５のヌクレオチド配列またはその変異体を含み得る。

【0042】

本明細書に記載される参照アミノ酸配列または参照ヌクレオチド配列の変異体は、参照配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を含み得る。特定のアミノ酸配列変異体は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個または１０個以上のアミノ酸の挿入、付加、置換または欠失により参照配列と異なり得る。特定のヌクレオチド配列変異体は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個または１０個以上のヌクレオチドの挿入、付加、置換または欠失により参照配列と異なり得る。

【0043】

配列の類似性及び同一性は、一般に、アルゴリズムＧＡＰ（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ，Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏＵＳＡ）を参照して定義されている。ＧＡＰは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いて、２つの完全な配列を、マッチの数を最大にし、ギャップの数を最小にするようにアラインメントする。一般的に、デフォルトパラメータが使用され、ギャップ作成ペナルティ＝１２及びギャップ延長ペナルティ＝４。ＧＡＰの使用が好ましい場合があるが、他のアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５－４１０の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳＵＳＡ８５：２４４４－２４４８の方法を使用する）、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．ＭｏｌＢｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）、またはＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．（１９９０）前掲のＴＢＬＡＳＴＮプログラムを使用してもよく、一般にデフォルトパラメータを採用する。特に、ｐｓｉ－Ｂｌａｓｔアルゴリズム（Ｎｕｃｌ.ＡｃｉｄｓＲｅｓ.（１９９７）２５３３８９－３４０２）を使用することができる。これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＰＡＳＴＡ，ａｎｄＦＡＳＴＡｉｎｔｈｅＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が利用可能であり、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアは、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ（Ｓｏｄｉｎｇ，Ｊ．２００５，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２１，９５１－９６０）、Ｔ－ｃｏｆｆｅｅ（Ｎｏｔｒｅｄａｍｅｅｔａｌ．２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）３０２，２０５－２１７）、Ｋａｌｉｇｎ（ＬａｓｓｍａｎｎａｎｄＳｏｎｎｈａｍｍｅｒ２００５，ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，６（２９８））、Ｇｅｎｏｍｅｑｕｅｓｔ（商標）ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｇｅｎｅ－ＩＴ，ＷｏｒｃｅｓｔｅｒＭＡＵＳＡ）及びＭＡＦＦＴ（ＫａｔｏｈａｎｄＳｔａｎｄｌｅｙ２０１３，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎ，３０（４）７７２－７８０ｓｏｆｔｗａｒｅ）が使用され得る。このようなソフトウェアを使用する場合、例えば、ギャップペナルティや延長ペナルティなどのデフォルトパラメータを使用することが望ましい。配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９７７）及びＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）にそれぞれ記載されている。配列比較は、本明細書に記載されている関連する配列の全長にわたって行うことができる。

【0044】

参照アミノ酸配列中のアミノ酸残基は、挿入、欠失または置換、好ましくは異なるアミノ酸残基への置換により変更または突然変異されて、参照アミノ酸配列の変異体を産生し得る。参照ヌクレオチド配列中のヌクレオチドは、挿入、欠失または置換、好ましくは異なるヌクレオチドの置換により変更または突然変異されて、参照ヌクレオチド配列の変異体を産生し得る。

【0045】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたＲＴＭの結合ドメインとトランススプライシングドメインとの間にスペーサーが配置され得る。スペーサーは、結合ドメインとトランススプライシングドメインまたはコード化配列との間の相互作用を低減または防止することができる。スペーサーは、結合ドメイン領域に対して相補的ではなく、結合領域、トランススプライシングドメインまたはコード配列とハイブリダイズしないか、または他の点で相互作用しない任意のヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、任意の非接合ＲＴＭの翻訳を遮断するための終結コドンをさらに含み得る。適切なスペーサーは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含んでいてもよいし、それらの変異体であってもよい。

【0046】

他の実施形態では、本明細書に記載されるＲＴＭでは、ＲＴＭの結合ドメインとトランス－スプライシングドメインとの間にスペーサーが欠ける場合がある。

【0047】

結合領域を介してＨＥＲＶ－Ｋｐｒｅ－ｍＲＮＡに結合した後、ＲＴＭ内のトランススプライシングドメインは、ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡを用いてスプライセオソーム媒介トランススプライシングされる。トランススプライシングは、自殺タンパク質をコードするヌクレオチド配列を連結して、ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡをトランスする。３’エクソン置換では、コード配列は、トランススプライシングドメインの下流（３’）に位置し、ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡ中のドナースプライス部位の上流（５’）のヌクレオチド配列とスプライシングされる。５’エクソン置換では、コード配列は、ＲＴＭのトランススプライシングドメインの上流（５’）に位置し、ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡ中のアクセプタースプライス部位の下流（３’）のヌクレオチド配列とスプライシングされる。３’及び５’エクソン置換によるトランススプライシングの技術が、当該技術分野で確立されている（例えば、前掲のＰｏｄｄａｒｅｔａｌ（２０１８）を参照）。

【0048】

ＲＴＭとＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡとのトランススプライシングは、トランススプライシングドメインによって媒介される。トランススプライシングドメインは、スプライセオソームを補充し、かつ内因性ｐｒｅ－ｍＲＮＡを用いてトランススプライシングを媒介するのに必要なモチーフを含むヌクレオチド配列である。例えば、トランススプライシングドメインは、ＲＴＭがトランススプライシングによりＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡに結合されるスプライス部位を含み得る。

【0049】

３’エクソン置換での使用に適したＲＴＭのトランススプライシングドメインは、スプライス受容部位を含み得る。スプライスアクセプター部位はＡ－Ｇジヌクレオチド配列を含み得る。例えば、スプライスアクセプター部位は、配列Ｃ－Ａ－Ｇ－Ｇ（例えば、ＡＧ）を含み得る。適切なスプライスアクセプター部位は、当該技術分野で周知である。

【0050】

３’エクソン置換に使用するのに適したＲＴＭのトランススプライシングドメインは、さらにポリピリミジントラクト（ＰＰＴ）を含み得る。ポリピリミジントラクトは、スプライス部位の上流、例えば３’エクソン置換ＲＴＭにおけるスプライスアクセプター部位の５～４０ヌクレオチド上流に位置してもよい。ポリピリミジントラクトは、ピリミジン（Ｃ及びＵ）に富む１５～２０のヌクレオチドの配列を含み得る。適切なＰＰＴは、５’－ＵＵＵＵＵＵＵＣＣＣＵＵＵＵＵＵＵＣＣ－３’及びその変異体を含む。他の適切なＰＰＴは、当該技術分野で知られている（例えば、Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ２００１ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ２１（１０）：３２８１－３２８８；ＷＯ２０１７１７１６５４Ａ１を参照）。

【0051】

３’エクソン置換に使用するのに適したＲＴＭのトランススプライシングドメインは、分岐点配列をさらに含み得る。分岐点シーケンスはＰＰＴの上流に位置することができ、例えばスプライスアクセプター部位の上流で２０～５０ヌクレオチドとすることができる。分岐点配列は、配列ＹＵＲＡＣまたはＹＮＵＲＡＣを含んでもよく、ここで、Ｒ＝プリン、Ｙ＝ピリミジン、及びＮ＝任意のヌクレオチドである。適切な分岐点配列は、５’－ＵＡＣＵＡＡＣＡ－３’を含み、当該技術分野で知られている。（例えば、ＧａｏｅｔａｌＮｕｃｌＡｃｉｄＲｅｓ２００８３６（７）２２５７－２２６７；ＵＳ２００６００９４６７５を参照）

【0052】

３’エクソン置換に使用するのに適したＲＴＭのトランススプライシングドメインは、イントロニックスプライスエンハンサー（ＩＳＥ）をさらに含み得る。ＩＳＥは、分岐点配列の上流に配置することができる。適切なＩＳＥは、

【化3】

を含み、当該技術分野で知られている（例えば、ＷａｎｇｅｔａｌＮａｔＳｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１２）１９（１０）１０４４－１０５２；ＭｃＣａｒｔｈｙｅｔａｌ（１９９８）ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ７１４９１－１４９６；Ｙｅｏｅｔａｌ（２００４）ＰＮＡＳＵＳＡ１０１１５７００－１５７０５を参照）。

【0053】

３’エクソン置換に使用するのに適したトランススプライシングドメインは、当該技術分野において周知である（例えば前掲のＰｏｄｄａｒｅｔａｌ２０１８を参照）。例えば、適切なトランススプライシングドメインは、配列番号１２のヌクレオチド配列を含んでいてもよく、またはそれらの変異体であってもよい。

【0054】

５’エクソン置換での使用に適したＲＴＭのトランススプライシングドメインは、スプライスドナー部位を含み得る。スプライスドナー部位は、ＧＵジヌクレオチド配列を含み得る。例えば、スプライスドナー部位は、配列５’－ＣＡＧ／ＧＵＡＡＧＴＡＴ－３’を含み得る。他の適切なスプライスドナーアクセプター部位は、当該技術分野で周知である。

【0055】

５’エクソン置換に使用するのに適したＲＴＭのトランススプライシングドメインは、イントロニックスプライスエンハンサー（ＩＳＥ）をさらに含み得る。ＩＳＥはスプライスドナー配列の下流に配置され得る。適切なＩＳＥは当技術分野において周知である（例えば、ＷａｎｇｅｔａｌＮａｔＳｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１２）１９（１０）１０４４－１０５２；ＭｃＣａｒｔｈｙｅｔａｌ（１９９８）ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ７１４９１－１４９６；Ｙｅｏｅｔａｌ（２００４）ＰＮＡＳＵＳＡ１０１１５７００－１５７０５を参照）。

【0056】

５’エクソン置換に使用するのに適したトランススプライシングドメインは、当該技術分野において周知である（例えば前掲のＰｏｄｄａｒｅｔａｌ２０１８を参照）。

【0057】

好ましくは、本明細書に記載されるＲＴＭは、例えばシススプライシングの仲介によるトランススプライシングドメインのトランススプライシングに干渉するスプライス部位を含まない。例えば、３’エクソン置換ＲＴＭは、トランススプライシングドメインの上流にスプライス部位を欠いているが可能性があり、すなわち、トランススプライシングドメインは、３’ＥＲＲＴＭの５’スプライス部位の下流（３'）にない。５'エクソン置換ＲＴＭは、トランススプライシングドメインの下流にスプライス部位を欠いている可能性があり、すなわち、トランススプライシングドメインは、５'ＥＲＲＴＭの３'スプライス部位の上流（５'）にない。

【0058】

本明細書に記載されるＲＴＭは、キメラｍＲＮＡ中のＨＥＲＶ配列によってコードされたアミノ酸を含まない自殺タンパク質の産生を可能にする分離要素をさらに含み得る。適切な分離要素は、当該技術分野でよく知られており（前掲のＰｏｄｄａｒｅｔａｌ２０１８）、終結コドン及び２Ａペプチドなどの自己切断ペプチドをコードする配列を含む。自殺タンパク質のコード領域には、ＳＶ４０ポリＡなどのポリＡテールが続く場合がある（Ｐｏｄｄａｒｅｔａｌ２０１８）。

【0059】

例えば、本明細書に記載される５’ＥＲＲＴＭは、自殺タンパク質をコードする配列の３’末端に、ＵＡＧ、ＵＡＡまたはＵＧＡなどの終結コドンをさらに含み得る。トランススプライシング後のキメラｍＲＮＡの翻訳は、終結コドンで終了し、キメラｍＲＮＡ中のＨＥＲＶ配列によってコードされる追加のアミノ酸なしで自殺タンパク質を生成する。

【0060】

本明細書に記載される３’ＥＲＲＴＭは、２Ａペプチドコード配列などの自己切断ペプチドコード配列をさらに含み得る。自己切断ペプチドコード配列は、トランス－スプライシングドメインと自殺タンパク質のコード配列との間に、例えばコード配列の５’末端に位置し得る。自己切断ペプチドは、翻訳時に新生ペプチド鎖を切断させ、ＨＥＲＶアミノ酸配列から自殺タンパク質を分離する。適切な２Ａペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ及びＦ２Ａペプチド（前掲のＰｏｄｄａｒｅｔａｌ（２０１８）；Ｋｉｍｅｔａｌ（２０１１）ＰＬｏＳＯＮＥ６，ｅ１８５５６）を含み得、かつ配列番号１１のアミノ酸配列またはその変異体を含み得る。自己切断ペプチドコード配列は、配列番号１７のヌクレオチド配列またはその変異体を含み得る。

【0061】

本明細書に記載される５’ＥＲＲＴＭは、触媒的に活性もしくは不活性のいずれかであるハンマーヘッドリボザイムなどのリボザイム、または安定化ＲＮＡ要素をさらに含み得る。リボザイムは結合ドメインの下流に位置してもよい。リボザイムまたは安定化ＲＮＡ要素には、スペーサー及びポリＡテールが続く場合がある。リボザイムは、ポリＡテールなどの結合ドメインの下流（３’）のヌクレオチド配列をＲＴＭから除去し得る。適切なリボザイム配列及び安定化ＲＮＡ要素は、当該技術分野で利用可能である（前掲のＰｏｄｄａｒｅｔａｌ（２０１８））。

【0062】

本明細書に記載されるＲＴＭは、自殺タンパク質のコード配列をさらに含む。癌細胞などのＨＥＲＶ遺伝子発現細胞において、コード配列がＲＴＭのトランス－スプライシングドメインを介してＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡにトランススプライシングされ、ＨＥＲＶ遺伝子発現細胞に自殺タンパク質が発現される。

【0063】

自殺タンパク質は、細胞内で発現されるタンパク質で、少なくとも１つの他の分子と相互作用して細胞の誘発または細胞死を引き起こす。自殺タンパク質をコードするコード配列は、自殺遺伝子と呼ぶことができる。このコード配列は、自殺タンパク質についての完全コード配列を含み得る。３’ＥＲＲＴＭでは、コード配列は、５’翻訳開始コドン（開始コドン：ＡＵＧ）に欠ける場合がある。これにより、トランススプライシングの非存在下でコード配列の発現が防止される。５’ＥＲＲＴＭでは、コード配列は、５’翻訳開始コドン（開始コドン：ＡＵＧ）を含み得る。

【0064】

好ましくは、自殺タンパク質は、細胞毒性化合物の不活性なプロ体を活性体に変換するプロドラッグ活性化酵素である。自殺タンパク質は不活性型プロ体から活性型細胞毒性化合物を生成するので、自殺蛋白質を発現している細胞は、プロ体への曝露に対して敏感である。本明細書に記載の使用に適した自殺タンパク質は、当該技術分野で入手可能であり（例えば、Ｍａｌｅｋｓｈａｈｅｔａｌ（２０１６）ＣｕｒｒＰｈａｒｍａｃｏｌＲｅｐｓ２２９９－３０８を参照）、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）を活性化するシトシンデアミナーゼ；イホスファミド（ＩＦＯ）またはシクロホスファミドを活性化するシトクロムＰ４５０；５－［アジリジン－１－イル］－２，４－ジニトロベンズアミドを活性化するニトロレダクターゼ；フルダラビンを活性化するプリンヌクレオシドホスホリラーゼを含む（ｅＰＮＰ；ＳｅｃｒｉｓｔｅｔａｌＮｕｃｌｅｏｓ．Ｎｕｃｌｅｏｔ．１９９９，１８，７４５－７５７；ＫｒｏｈｎｅｅｔａｌＨｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２００１）３４（３）：５１１－８）ａｎｄｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ，ｗｈｉｃｈａｃｔｉｖａｔｅｓｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＧＣＶ）。

【0065】

いくつかの好ましい実施形態では、自殺タンパク質は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）である。ＨＳＶ－ｔｋはガンシクロビルをリン酸化し、細胞毒性ガンシクロビル三リン酸を産生する。ＨＳＶチミジンキナーゼは、配列番号６（データベース登録番号ＡＦ０５７３１０．１）で示される配列を含むか、またはそれからなる、またはその変異体であり得る。ＨＳＶチミジンキナーゼをコードする適切なコード配列は、配列番号７のヌクレオチド配列またはその変異体を含み得る。

【0066】

３’エクソン置換に適したＲＴＭでは、ＨＳＶチミジンキナーゼは、配列番号６の１位に対応する位置でＮ末端Ｍ残基を欠いている場合がある。これによって、トランススプライシング事象が存在しない場合の自殺タンパク質の発現を阻止することができる。コード配列は、５’翻訳開始部位（ＡＵＧ）を欠いている場合がある。５’エクソン置換に適したＲＴＭでは、ＨＳＶチミジンキナーゼは、配列番号６の１位に対応する位置にＮ末端Ｍ残基を含み得る。

【0067】

いくつかの実施形態では、ＨＳＶチミジンキナーゼのコード配列は、エキソニックスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）を含み得る。好都合には、別の変性コドンが使用されてもよく、そのため、コードされたアミノ酸配列は、ＥＳＥの存在により変更されない。いくつかの実施形態では、コード配列は、βグロビンミニイントロンなどのイントロンをさらに含み得る。適切な配列は、当技術分野で知られている（前掲のＰｏｄｄａｒｅｔａｌ２０１８）。

【0068】

好ましくは、ＨＳＶチミジンキナーゼをコードするコード配列は、チミジンキナーゼの異常アイソフォームの発現を減少するように改変されてもよい。これは、ＨＥＲＶ－Ｋｐｒｅ－ｍＲＮＡとトランススプライシングされていない配列からの活性ＨＳＶチミジンキナーゼの産生を減少させるのに有用であり得る。例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼは、翻訳開始コドンによってコードされるＭ残基を欠失または置換するように改変されてもよい。配列番号６のＨＳＶチミジンキナーゼ配列の適切な変異体は、翻訳開始コドンによりコードされる１つ以上のＭ残基を欠いている場合がある。例えば、配列番号６の１位及び４６位に対応する位置、好ましくは配列番号６の１位、４６位及び６０位にあるＨＳＶチミジンキナーゼのＭ残基は、欠失されてもよいし、他の残基により置換されてもよい。例えば、配列番号６の１位に対応する位置にあるＨＳＶチミジンキナーゼのＭ残基は、欠失されてもよい。配列番号６の４６位に対応する位置にあるＨＳＶチミジンキナーゼのＭ残基は、異なる残基、好ましくはＬ残基で置換されてもよい。配列番号６の６０位に対応する位置にあるＨＳＶチミジンキナーゼのＭ残基は、異なる残基、好ましくはＩ残基で置換されてもよい。好ましくは、ＨＳＶチミジンキナーゼには、機能的翻訳開始部位を欠く。コード配列によりコードされた好ましいＨＳＶチミジンキナーゼは、配列番号８のアミノ酸配列またはその変異体を含み得る。

【0069】

改変されたＨＳＶチミジンキナーゼのコード配列は、翻訳改変を開始する１種以上のコドンを含む配列番号７の変異体であるアミノ酸配列を含み得る。例えば、配列番号７の１３６位―１３８位に対応する位置での翻訳開始コドン（ＡＴＧ／ＡＵＧ）の１つ以上のヌクレオチドは、コドンＡＴＧ／ＡＵＧが破壊されるかまたは廃止されるように、他のヌクレオチドで置換され得る。いくつかの実施形態では、１３６位のＡは、異なるヌクレオチドで置換され得る。例えば、ヌクレオチド配列は、１３６位でＡ＞Ｃ置換を含み得る。適切なヌクレオチド配列は、１３６位―１３８位の翻訳開始コドンを欠き、これらの位置からの翻訳開始を支持しないことがある。配列番号７の１７８位―１８０位に対応する位置での翻訳開始コドン（ＡＴＧ／ＡＵＧ）の１つ以上のヌクレオチドは、翻訳開始コドン（ＡＴＧ／ＡＵＧ）が破壊されるかまたは廃止されるように、他のヌクレオチドで置換され得る。いくつかの実施形態では、１８０位のＧは、異なるヌクレオチドで置換され得る。例えば、ヌクレオチド配列は、１８０位でＧ＞Ｃ置換を含み得る。適切なヌクレオチド配列は、１７８位―１８０位の翻訳開始コドンを欠き、これらの位置からの翻訳開始を支持しないことがある。

【0070】

いくつかの好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、１３６位―１３８位及び１７８位―１８０位において翻訳開始コドンを欠いてもよい。例えば、ヌクレオチド配列は、１３６位でＡ＞Ｃ置換、１８０位でＧ＞Ｃ置換を含み得る。

【0071】

ＨＳＶチミジンキナーゼの好ましいコード配列は、配列番号９のヌクレオチド配列またはその変異体を含み得る。

【0072】

上記のような改変されたＨＳＶチミジンキナーゼをコードする核酸配列は、一般にＲＮＡトランススプライシングの自殺遺伝子として有用であり得、本発明の一態様において提供される。上記のように、改変されたＨＳＶチミジンキナーゼは、残基Ｍ１及びＭ４６、好ましくはＭ１、Ｍ４６及びＭ６０の欠失または置換を含み得る。例えば、修飾ＨＳＶチミジンキナーゼは、上述のように、Ｍ４６Ｌ変異、好ましくはＭ４６Ｌ及びＭ６０Ｉ変異を含み得る。改変されたＨＳＶチミジンキナーゼは、配列番号８の配列またはその変異体を含み得る。核酸配列は、配列番号９の配列またはその変異体を含み得る。核酸配列を含むＲＴＭ及び発現ベクター等の核酸構築物、及びＲＴＭまたは発現ベクターなどの核酸構築物の製造におけるそのような核酸の使用も、本発明の態様として提供される。構築物及び核酸は、３’エクソン置換型トランススプライシング及びリボザイム媒介型トランススプライシングを含む、一連のトランススプライシング適用に有用であり得る。

【0073】

本明細書に記載される好ましいＲＴＭは、配列番号１３のヌクレオチド配列もしくはその変異体、または配列番号１５のヌクレオチド配列もしくはその変異体を含み得る。

【0074】

上記のＲＴＭは、ＤＮＡ分子などの核酸によってコードされ得る。核酸分子は単離することができる。核酸は、部分的にまたは全体的に合成であってもよい。

【0075】

本明細書に記載される好ましいＲＴＭは、配列番号１４のヌクレオチド配列もしくはその変異体、または配列番号１６のヌクレオチド配列もしくはその変異体を含む核酸によってコードされ得る。

【0076】

ＲＴＭをコードする核酸は、ＲＴＭの発現を指示できる１つ以上の制御要素または調節配列に作動可能に連結され得る。哺乳類の細胞、好ましくはヒトの細胞における異種核酸コード配列の発現を促進するのに適した制御要素または調節配列は、当該技術分野でよく知られており、構成的プロモーター、例えばＣＭＶまたはＳＶ４０などのウイルスプロモーター；及び組織特異的プロモーター、例えばヒトサイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターなどのプロモーター、または低酸素応答性プロモーターなどの系特異的プロモーターを含む。

【0077】

組織特異的プロモーターとしては、癌特異的プロモーター（すなわち、癌細胞に特異的な活性を有するプロモーター）、または個体において癌が発生した組織に特異的なプロモーターが挙げられる。適切なプロモーターには、例えば、膵臓癌に対するＣｏｘ－２またはＭｕｃ－１プロモーターが含まれ得る。

【0078】

さらに、本明細書に記載のＲＴＭまたは本明細書に記載のＲＴＭをコードする核酸を含む、プラスミド、ベクター（例えば、発現ベクター）、転写もしくは発現カセット、または他の送達システムの形態の構築物が提供される。例えば、ＲＴＭをコードする核酸が、発現ベクターに含まれ得る。適切な発現ベクターは、プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び必要に応じて他の配列を含む、適切な調節配列を含んで、選択または構築することができる。ベクターは、複製の起点、プロモーター領域及び選択可能なマーカーなどの配列を含んでもよく、これらは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌宿主におけるその選択、発現及び複製を可能にする。

【0079】

好ましいベクターは、トランススプライシングが必要な細胞型に向いたものであってもよく、該細胞型内の特異的発現を増強するために、適切な制御要素及び調節要素を含んでもよい。いくつかの実施形態では、スプライシングに対する内因性の有害なシス作用効果を回避するために、ベクターを非腫瘍溶解性とすることができる。

【0080】

ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス例えばファージ、またはファージミドであり得る。さらなる詳細については、例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ：３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｕｓｓｅｌｌｅｔａｌ.，２００１，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓを参照。核酸の操作、例えば核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入、及び遺伝子発現に関する多くの既知の技術及びプロトコールは、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．ｅｄｓ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２に詳細に記載されている。

【0081】

いくつかの好ましい実施形態では、発現ベクターは、レンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターであり得る。

【0082】

ウイルス発現ベクターは、標的細胞内で発現されるＲＴＭをコードする異種核酸及びウイルス配列を含む、組換え核酸である。ウイルス発現ベクターは、ウイルス粒子にパッケージングされ得る。ウイルス粒子は、ウイルスキャプシドにカプセル化されたウイルス発現ベクターを含み得る。ウイルスベクターをウイルス粒子にパッケージングするための適切な方法は、当該技術分野で十分に確立されている。

【0083】

ウイルス粒子の形成及び機能に必要な全てのウイルス成分をコードする単一のウイルス発現ベクターを用いることが可能である。しかしながら、最も多くは、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞などの宿主細胞に安定に組み込まれた複数のプラスミド発現ベクターまたは個々の発現カセットを利用して、ウイルスベクター粒子を生成する様々な遺伝成分を分離する。

【0084】

１つ以上のウイルスのパッケージング及びエンベロープタンパク質をコードする発現カセットは、哺乳動物細胞に安定に組み込まれている。これらの細胞を、本明細書に記載されるウイルス発現ベクターで形質導入すれば、さらなる発現ベクターを添加することなくウイルス粒子を産生させるのに十分である。

【0085】

あるいは、複数の発現ベクターを使用してもよい。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ウイルスのパッケージング及び、粒子形成に必要なエンベロープタンパク質をコードするウイルスのパッケージング及びエンベロープタンパク質をコードする１つ以上の発現ベクターで形質導入され得る。例えば、組換えＡＡＶベクターは、２つのＡＡＶ逆末端反復（ＩＴＲ）領域に隣接する異種核酸を含むプラスミドと、ＡＡＶエンカプシターゼ遺伝子（ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）を保持するプラスミドとを、ヒトヘルパウイルス（例えばアデノウイルス）に感染した細胞株またはその単離必須遺伝子を発現する細胞株に同時トランスフェクションすることにより調製され得る。組換えレンチウイルスベクターは、ＨＥＫ２９３などのパッケージング細胞株を、トランスファーベクタープラスミド及び２つ以上のヘルパープラスミドでトランスフェクションすることによって調製され得る。トランスファープラスミドは、ＲＴＭをコードする異種核酸を含み、それは、長末端繰り返し（ＬＴＲ）配列に隣接しており、これによって、トランスファープラスミド配列の宿主細胞への組み込みが容易になる。２つ以上のヘルパープラスミドは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ及びＲｅｖなどのビリオンタンパク質をコードする１つ以上のパッケージングプラスミドと、ＶＳＶ－Ｇなどのエンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドとを含み得る。いくつかの実施形態では、Ｇａｇ及びＰｏｌをコードする第１のパッケージングプラスミドと、Ｒｅｖをコードする第２のパッケージングプラスミドの２つのパッケージングプラスミドが採用され得る。トランスファープラスミド及びヘルパープラスミドでのトランスフェクション後、パッケージング細胞株は、ＲＴＭをコードする核酸を含む感染性レンチウイルス粒子を産生する。いくつかの実施形態では、ＶＳＶ－Ｇ－偽型レンチウイルスベクターは、偽型レンチウイルス粒子を産生するために、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｇと組み合わせて産生され得る。

【0086】

本明細書に記載のＲＴＭをコードする核酸、または本明細書に記載のＲＴＭをコードする核酸を含むウイルス発現ベクターを含む組換え細胞、例えば組換え哺乳動物細胞が提供される。これらは、例えば本明細書に記載するようなウイルス粒子を生成する際に有用であり得る。

【0087】

ウイルス粒子は、細胞上清から採取され、本明細書に記載されるように使用するために保存及び／または濃縮され得る。例えば、核酸構築物の調製、細胞へのＤＮＡの導入、及び遺伝子発現における、核酸の操作及び形質転換のための多くの公知の技法及びプロトコールが、ＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．ｅｄｓ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２に詳細に記載されている。ウイルスベクターを生成するための試薬は、商業的供給元（例えばダルマコン）から入手可能である。ウイルスベクターを調製するための適切な技術は、当技術分野で知られている（例えば、Ｄｕｎｏｌ，Ｔ.，ｅｔａｌ（１９９８）．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，８４６３－８４７１；Ｍｅｒｔｅｎｅｔａｌ（２０１６）ＭｏｌＴｈｅｒＭｅｔｈｏｄｓＣｌｉｎＤｅｖ．２０１６；３：１６０１７を参照）。

【0088】

本明細書に記載のＲＴＭ、核酸、発現ベクターまたはウイルス粒子を単独で使用（例えば、投与）することも可能であるが、ＲＴＭ、核酸、発現ベクターまたはウイルス粒子に加えて少なくとも１つの成分を含み得る、医薬組成物の形態で提供することがしばしば好ましい。したがって、医薬組成物は、ＲＴＭ、核酸、発現ベクターまたはウイルス粒子に加えて、医薬として許容され得る賦形剤、担体、緩衝液、安定化剤または当業者に周知の他の材料を含み得る。

【0089】

本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、安全な医学的判断の範囲内にあり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症のない、対象となる対象（例えば、ヒト）の組織と接触させて使用するのに好適な、合理的な利益／リスク比に見合った、化合物、成分、材料、組成物、剤形などに関する。各担体、希釈剤、賦形剤等もまた、製剤の他の成分と適合するという意味で「許容され」なければならない。適切な担体、賦形剤などは、標準的な薬剤テキスト、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ.に記載されている。

【0090】

医薬組成物及び製剤は、好都合にも単位剤形で提供することができ、薬学の分野で公知の任意の方法によって調製することができる。このような方法には、ＲＴＭ、核酸、発現ベクターまたはウイルス粒子を、１種以上の副成分を構成する担体と結合させるステップを含む。一般に、組成物は、活性化合物を液体担体と均一かつ密接に会合させることにより調製される。

【0091】

ＲＴＭ、核酸、発現ベクターまたはウイルス粒子を含む医薬組成物は、単独で、または他の治療と組み合わせて、治療される症状に応じて同時または順次に投与され得る。例えば、ＲＴＭ、核酸、発現ベクターまたはウイルス粒子を含む医薬組成物は、ＲＴＭのコード配列によりコードされた自殺タンパク質によって活性化される細胞毒性薬剤と組み合わせて投与され得る。

【0092】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、自殺タンパク質によって活性化される細胞毒性剤をさらに含み得る。例えば、組成物は、自殺タンパク質によって活性細胞毒性剤に変換される細胞毒性剤のプロ体を含み得る。

【0093】

本明細書に記載のＲＴＭであって、ＨＥＲＶ遺伝子を発現する細胞を選択的に死滅させることにより、治療、例えばがんの治療に有用である。本明細書に記載のＲＴＭ、核酸、発現ベクター、ウイルス粒子または医薬組成物を、ヒトまたは動物の体の治療方法に使用することができる。治療方法は、ＲＴＭ、核酸、発現ベクター、ウイルス粒子または医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含み得る。ＲＴＭの治療用途は、当技術分野で確立されている（Ｈｏｎｇｅｔａｌ（２０２０）ＢｒＭｅｄＢｕｌｌ１３６４－２０を参照）。好ましくは、本方法は、がんの治療方法である。本明細書に記載のがんの治療方法は、本明細書に記載のＲＴＭ、核酸、ベクター、ウイルス粒子または医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含み得る。

【0094】

本方法は、ＲＴＭのコード配列によりコードされた自殺タンパク質によって活性化される細胞傷害剤を個体に投与することをさらに含み得る。例えば、自殺タンパク質によって活性細胞傷害剤に変換される細胞傷害剤のプロ体を個体に投与してもよい。

【0095】

別の態様は、がんの治療方法に使用するための、本明細書に記載されたＲＴＭ、核酸、ベクター、ウイルス粒子または医薬組成物、及びがんの治療方法に使用するための薬剤の製造における、本明細書に記載されたＲＴＭ、核酸、ベクター、ウイルス粒子または医薬組成物の使用を提供する。

【0096】

本明細書に記載される治療に適したがんは、ＨＥＲＶ遺伝子を発現する１つ以上の癌細胞の存在を特徴とし得る。いくつかの好ましい実施形態では、１つ以上の癌細胞は、ＨＥＲＶ－ＫＨＭＬ－２ｅｎｖ遺伝子などのＨＥＲＶ－Ｋ遺伝子を発現し得る。例えば、癌細胞は、ＨＥＲＶ－ＫＨＭＬ－２グループ１Ｎｐ９遺伝子及び／またはＨＥＲＶ－ＫＨＭＬ－２グループ１Ｒｅｃ遺伝子を発現し得る。

【0097】

適切ながんは、家族性または散発性であり得る。適切ながんは、転移性または非転移性であってもよい。

【0098】

例えば、がんは、固形癌または非固形癌、または悪性リンパ腫の任意の種類であり得る。がんは、皮膚癌（特に黒色腫）、頭頸部癌、腎臓癌、肉腫、生殖細胞癌（例えば奇形癌）、肝臓癌（例えば肝細胞癌）、リンパ腫（例えばホジキンまたは非ホジキンリンパ腫）、急性骨髄性または骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄性または骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞性白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病（Ｐ－ＴＬＬ）、大顆粒リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病などの白血病、皮膚癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、食道癌、膵臓癌（膵管腺癌など）、胃癌、脳癌、好ましくは卵巣癌、大腸癌、乳癌、黒色腫、白血病、精巣癌、及び前立腺癌からなる群から選択され得る。

【0099】

いくつかの好ましい実施形態では、がんは、肝細胞癌などの肝癌、または膵管腺癌などの膵癌であり得る。

【0100】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療用のがんは、ＨＥＲＶ遺伝子を発現しているか、または閾値を超えるＨＥＲＶ遺伝子を発現しているものとして事前に同定されていてもよい。別の実施形態では、方法は、癌を、ＨＥＲＶ遺伝子を発現しているかまたは閾値を超えるＨＥＲＶ遺伝子を発現しているものとして同定し、本明細書に記載されるように癌を治療することを含み得る。本明細書に記載のＲＴＭによる治療に応答する可能性が高い癌を有する個体を選択する方法は、
上記個体から得られたサンプルにおけるＨＥＲＶ遺伝子の発現を決定することを含み得、
上記ＨＥＲＶ遺伝子の発現は、個体が治療に応答している可能性を示している。

【0101】

サンプルは、癌細胞のサンプルであってもよいし、個体における、癌細胞に由来する無細胞核酸を含む血液または他の生物学的流体のサンプルであってもよい。

【0102】

ＨＥＲＶ遺伝子の発現を決定するのに適した技術は、当該技術分野において周知である。

【0103】

上記の治療に適した個体は、齧歯類（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）、ネズミ（例えば、マウス）、イヌ科（例えば、イヌ）、ネコ科（例えば、ネコ）、ウマ科（例えば、ウマ）、霊長類、類人猿（サルや類人猿など）、サル（マーモセット、ヒヒなど）、類人猿（ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザルなど）、またはヒトなどの哺乳類であってよい。

【0104】

いくつかの好ましい実施形態では、個体は、ヒトである。他の好ましい実施形態では、非ヒト哺乳動物、特に、ヒトにおける治療有効性を実証するためのモデルとして従来使用されている哺乳動物(例えばマウス、霊長類、ブタ、イヌ、またはウサギ動物)を用いることができる。

【0105】

投与は、通常、「治療上有効な量」または「予防上有効な量」であり、これは患者に利益を示すのに十分である。そのような利点は、少なくとも１つの症状の少なくとも改善であり得る。実際の投与量、投与速度及び投与時間経過は、治療対象の性質と重症度、治療されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、組成物の送達部位、投与方法、投与のスケジューリング、及び医師に既知である他の要因に依存する。

【0106】

本明細書に記載されるＲＴＭ、核酸、発現ベクター、ウイルス粒子または医薬組成物は、単独で、または他の治療と組み合わせて、治療される個体の状況に応じて同時または順次に投与することができる。

【0107】

治療の処方、例えば、投与量の決定などは、担当医及び他の医師の責任の範囲内であり、症状の重症度及び／または治療中の疾患の進行度によって左右される場合がある。治療用ポリペプチドの適切な用量は、当該技術分野でよく知られている（ＬｅｄｅｒｍａｎｎＪ．Ａ．ｅｔａｌ．（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４７：６５９－６６４；ＢａｇｓｈａｗｅＫ．Ｄ．ｅｔａｌ．（１９９１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＩｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓａｎｄＲａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ４：９１５－９２２）。具体的な投与量は、本明細書またはＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓＤｅｓｋＲｅｆｅｒｅｎｃｅ（２００３）に記載されており、投与する医薬品の種類に応じて適切な量を使用することができる。本明細書に記載されるＲＴＭ、核酸、発現ベクター、ウイルス粒子または医薬組成物の治療上有効な量または適切な用量は、動物モデルにおけるそのｉｎｖｉｔｒｏ活性及びｉｎｖｉｖｏ活性を比較することにより決定され得る。マウス及び他の試験動物における有効投与量をヒトに外挿する方法が知られている。正確な用量は、本明細書に記載されるＲＴＭ、核酸、発現ベクター、ウイルス粒子または医薬組成物が、予防または治療のためのものであるか否か、治療される領域のサイズ及び位置、ならびにＲＴＭの正確な性質を含む、多くの要因に依存する。

【0108】

治療は、医師の判断により、毎日、週２回、週１回、または月１回の間隔で繰り返すことができる。個人に対する治療スケジュールは、ＲＴＭ、核酸、発現ベクター、ウイルス粒子または医薬組成物の免疫学的、薬物動態学的及び薬力学的特性、投与経路、及び治療される症状の性質に依存し得る。

【0109】

ＲＴＭ、核酸、発現ベクター、ウイルス粒子または医薬組成物による処置の後、活性化可能な細胞傷害性薬剤による処置は周期的であってもよく、投与間隔は約１週間以上、例えば約２週間以上、約３週間以上、約４週間以上、約１ヶ月に１回以上、約５週間以上、または約６週間以上であってもよい。例えば、治療は、２～４週間または４～８週間おきに行われてもよい。これは、例えば、初期治療後にがん化した細胞を選択的に死滅させ、再発のリスクを防止または低減するのに有用であり得る。

【0110】

ＲＴＭ、核酸、発現ベクター、ウイルス粒子もしくは医薬組成物及び／または細胞毒性薬剤のプロ体による治療は、手術の前及び／または後に行うことができ、かつ／または外傷、外科的治療または侵襲的処置の解剖学的部位に直接投与または適用することができる。適切な製剤及び投与経路は上記に記載されている。

【0111】

ＲＴＭ、核酸、発現ベクター、ウイルス粒子または医薬組成物は、ＲＴＭのコード配列によりコードされた自殺タンパク質によって活性化される細胞毒性剤と組み合わせて投与され得る。自殺タンパク質によって活性剤に変換され得る細胞毒性剤のプロ体は、標準的な医療アプローチを用いて患者に容易に投与され得る。この分野で公知の方法を用いて、プロ体の投与に最も適切な用量及び経路を決定することもできる。例えば、ガンシクロビルは、体重１ｋｇ当たり約１～２０ｍｇ／日の用量で全身（例えば、経口または非経口）投与することができ、アシクロビルは、体重１ｋｇ当たり約１～１００ｍｇ／日の用量で投与することができ、フィアウは、体重１ｋｇ当たり約１～５０ｍｇ／日の用量で投与することができる。

【0112】

本明細書で使用される場合、「がん」、「新生物」、及び「腫瘍」という用語は同義に使用され、単数形でも複数形でも、宿主生物にとって病的なものとなる悪性形質転換を起こした細胞を指す。

【0113】

原発がん細胞は、十分に確立された技法、特に組織学的検査により、非がん性細胞から容易に区別することができる。本明細書で使用されるがん細胞の定義には、原発がん細胞だけでなく、がん細胞の祖先に由来するあらゆる細胞が含まれる。これには、転移したがん細胞、ならびにがん細胞に由来するｉｎｖｉｔｒｏ培養物及び細胞株が含まれる。通常は固形腫瘍として現れるがんの種類について言及する場合、「臨床的に検出可能」な腫瘍は、腫瘍塊に基づいて、例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、Ｘ線、超音波、もしくは身体検査での触診などの手順によって検出可能であるものである。

【0114】

ＨＥＲＶ遺伝子を発現し、本明細書に記載のＲＴＭによって選択的に標的される癌細胞は、自殺タンパク質によるプロ体の変換から生じる活性な細胞毒性剤にさらされるため、細胞毒性剤による治療に対して他の細胞よりも感受性が高く、敏感である。さらに、活性化された細胞毒性剤は、隣接する癌細胞に受動的に拡散し、癌細胞死をさらに増強することができる。この「バイスタンダー効果」は、治療の有効性を高める。

【0115】

がんを有する個体は、当技術分野で公知の臨床基準に従ってがんの診断を下すのに十分である、少なくとも１つの識別可能な徴候、症状、または検査所見を示し得る。このような臨床基準の例は、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，１５ｔｈＥｄ．，ＦａｕｃｉＡＳｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ，２００１などの医学教本に見出すことができる。場合によっては、個体におけるがんの診断は、個体から取得された体液または組織のサンプル中の特定の細胞型(例えば、がん細胞)の同定を含み得る。

【0116】

処置は、ヒトのものか動物のものか（例えば獣医学的用途）を問わず、いくらかの所望の治療効果、例えば、病態の進行の阻害または遅延が達成される、あらゆる処置及び療法であり得、進行速度の低下、進行速度の停止、病態の改善、病態の治癒または寛解（部分的か完全かを問わない）、病態の１つ以上の症状及び/または徴候の防止、遅延、軽減または抑止、あるいは処置の非存在下で予想されるものを超えた対象または患者の生存期間の延長を含む。

【0117】

特に、処置には、がんの完全寛解を含むがんの成長の阻害、及び/またはがんの転移の阻害が含まれ得る。がんの成長とは、概して、より発達した形態へのがんにおける変化を示す複数の指標のうちのいずれか１つを指す。したがって、がんの成長の阻害を測定するための指標には、がん細胞の生存率の減少、腫瘍体積または形態における（例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、または他の画像法を使用して決定される）減少、腫瘍成長の遅延、または腫瘍血管構造の破壊が含まれる。本明細書に記載されるＲＴＭ、核酸、ベクター、ウイルス粒子または医薬組成物の投与は、がんの成長、特に対象に既に存在するがんの成長に抵抗する個体の能力を向上させ、及び／または個体におけるがんの成長の傾向を減少させ得る。

【0118】

本明細書に記載のＲＴＭは、ＨＥＲＶ遺伝子を発現する細胞を選択的に死滅させ、細胞療法を受けている個体、すなわち、癌などの病状の治療のために自己細胞または同種異系細胞を投与されている個体におけるがんの発生または再発を予防するのにも有用であり得る。個体の細胞は、がん化するか、がん化する過程にある場合は、ＨＥＲＶ遺伝子を発現している可能性がある。これらの細胞は、個体に癌状態が発生する前に、本明細書に記載されるように死滅させることができる。例えば、細胞の集団が投与された個体における癌の発生または再発を予防する方法であって、それを必要とする個体に上記細胞の集団を投与することを含み、ここで、上記細胞は、本明細書に記載されたＲＴＭ、核酸、発現ベクターまたはウイルス粒子を含む。自殺タンパク質によって活性化される細胞毒性化合物は、後に個体に投与され、個体において癌化した、あるいは癌化しつつある集団の細胞において細胞毒性化合物の活性化が起こる。

【0119】

細胞療法に使用するのに適した細胞は、当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｔ細胞、造血幹細胞及び骨髄細胞などの造血細胞を含み得る。

【0120】

本明細書に記載されたＲＴＭ、核酸、ベクター、ウイルス粒子または医薬組成物は、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏで自殺タンパク質をコードする核酸を送達する際に、例えば、ＨＥＲＶ遺伝子発現細胞を死滅させる際に使用するために、有用であり得る。ｉｎｖｉｔｒｏで細胞に自殺タンパク質をコードする核酸を送達する方法は、
細胞内でのＨＥＲＶ遺伝子の発現が自殺タンパク質の発現を引き起こすように、本明細書に記載されるＲＴＭ、核酸、ベクターまたはウイルス粒子を細胞に導入することを含み得る。

【0121】

細胞は、ＨＥＲＶ遺伝子を発現してもよいし、ＨＥＲＶ遺伝子の発現を引き起こす形質転換事象を受けることもある。ＨＥＲＶ遺伝子発現細胞におけるＲＴＭを、ＨＥＲＶｐｒｅ－ｍＲＮＡにトランススプライシングすることで、自殺タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むキメラｍＲＮＡ分子を形成することができる。キメラｍＲＮＡは、自殺タンパク質が細胞内で発現されるように、さらに処理及び翻訳される可能性がある。細胞は、自殺タンパク質によって活性化される細胞毒性剤と接触されることがあり、その結果、細胞毒性剤は、自殺タンパク質によって活性化され、細胞を死滅させる。

【0122】

本明細書に記載の方法は、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏで細胞を死滅させるのに有用であり得る。ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏで細胞を死滅させる方法は、
本明細書に記載のＲＴＭ、核酸、ベクターまたはウイルス粒子を細胞に導入して、
細胞内でのＨＥＲＶ遺伝子の発現が自殺タンパク質の発現を引き起こすことと、
自殺タンパク質によって活性化される細胞毒性剤と細胞を接触させて、
細胞でのＨＥＲＶ遺伝子の発現後、自殺タンパク質によって細胞傷害剤を活性化することと、を含み得る。

【0123】

本明細書に記載の方法は、細胞集団におけるＨＥＲＶ遺伝子発現細胞を枯渇させるのに有用であり得る。例えば、集団におけるＨＥＲＶ遺伝子発現細胞を枯渇させる方法は、
本明細書に記載のＲＴＭ、核酸、ベクターまたはウイルス粒子を細胞集団に導入して、上記自殺タンパク質が上記細胞集団中のＨＥＲＶ遺伝子発現細胞内で発現されることと、
上記集団を、上記自殺タンパク質によって活性化される細胞毒性化合物と接触させ、その結果、上記集団中のＨＥＲＶ遺伝子発現細胞において細胞毒性化合物を活性化し、それによって上記集団中のＨＥＲＶ遺伝子発現細胞を枯渇させることと、を含む。

【0124】

ＨＥＲＶ遺伝子発現細胞には、癌細胞または前癌細胞が含まれ得る。本明細書に記載の方法は、細胞集団から癌細胞または前癌細胞を枯渇させ、または除去するのに有用であり得る。

【0125】

細胞の集団は、個体に由来する、あるいは個体から得られた細胞のサンプル、あるいはそこから派生した培養細胞であり得る。適切な細胞には、哺乳動物、好ましくはヒト細胞が含まれる。例えば、適切な細胞には、細胞療法で使用するための細胞、例えば、Ｔ細胞、造血幹細胞や骨髄細胞などの造血細胞が含まれ得る。

【0126】

ＲＴＭ、核酸、ベクターまたはウイルス粒子は、トランスフェクション、リポフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクションまたは形質転換などの任意の簡便な技術によって、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏで細胞に導入され得る。

【0127】

本発明の他の態様及び実施形態は、上述の態様及び実施形態の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」という用語に置き換えたもの、ならびに上述の態様及び実施形態の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」という用語に置き換えたものを提供する。

【0128】

本明細書で使用される「下流」という用語は、本明細書に記載の核酸における５’から３’への方向を指し、本明細書で使用される「上流」という用語は、本明細書に記載の核酸における３’から５’への方向を指す。

【0129】

本明細書に記載のヌクレオチド配列への参照は、文脈上別段必要とされない限り、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、ＵがＴに置換されている特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。

【0130】

文脈上別段の解釈を必要としない限り、本願は、上記の態様及び上述の実施形態のいずれかの相互のあらゆる組み合わせを開示するものであることを理解されたい。同様に、本願は、文脈上別段の解釈を必要としない限り、単独で、または他の態様のいずれかと合わせて、好ましい及び/または任意選択の特徴のあらゆる組み合わせを開示する。

【0131】

上記の実施形態の改変形態、さらなる実施形態、及びそれらの改変形態は、本開示を読めば当業者には明らかとなり、したがって、これらは本発明の範囲内にある。

【0132】

本明細書で言及されるすべての文書及び配列データベースエントリーは、あらゆる目的のために、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。

【0133】

本明細書で使用される「及び/または」は、指定された２つの特徴または構成要素の各々の具体的開示であり、他方の有無にかかわらないものとして解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／またはＢ」は、あたかも各々が本明細書で個別に明記されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的開示として解釈されるべきである。

【実施例】

【0134】

記載されたＲＮＡトランススプライシングの発明は、ユニバーサル結合ドメイン配列を使用して、ｅｎｖイントロンを標的とすることにより、クラスＩプロウイルスをコードする多数のＮｐ９、またはクラスＩＩプロウイルスからのＲｅｃを標的とする。ＲＮＡトランススプライシング反応の結果として、異常なＨＳＶ－ｔｋアイソフォーム産生と、その結果として生じる望ましくないオフターゲット効果を排除するために最適化されたＨＳＶ－ｔｋ遺伝子が発現される。

【0135】

材料及び方法
ＲＮＡトランススプライシング結合ドメインの生成
Ｎｐ９標的ＲＮＡトランススプライシング結合ドメインは、以下の内因性レトロウイルス配列、ホモ・サピエンス分離株ＨＭＬ－２＿２２ｑ１１．２１内在性ウイルスＨＥＲＶ－Ｋ、完全な配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＮ６７５０８７．１）から、前述の方法に基づいて生成された（Ｉｎｇｅｍａｒｓｄｏｔｔｅｒ，Ｃ．Ｋ．ｅｔａｌ（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ，７，１４０－１５４）。簡単に説明すると、ＢｉｏｉｎｆｏｒｍｉｃｓＨＵＳＡＲｓｅｒｖｅｒ（ドイツ癌研究センター）内のＦｏｌｄａｎａｌｙｚｅソフトウェアを使用して、５０ヌクレオチドのウィンドウサイズ及び１のステップサイズで、標的配列の逆相補の最小自由エネルギー（ＭＦＥ）計算を実行した。ＨＭＬ－２＿２２ｑ１１．２１配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＮ６７５０８７．１）は、ＢｅｒｋｅｌｅｙＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔ内のＮｅｕｒａｌＮｅｔｗｏｒｋＳｅｒｖｅｒとＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＨＵＳＡＲサーバー内のＣｒｙｐＳｋｉｐソフトウェアとを使用して、スプライス部位の予測を行った。高い最小自由エネルギーと、Ｎｐ９スプライスドナー部位の近傍及び下流にある不対ヌクレオチドに基づいて、さらなるＲＮＡ二次構造予測のために、潜在的結合ドメイン配列をＦｏｌｄａｎａｌｙｚｅで選択した（Ａｒｍｂｒｕｅｓｔｅｒ，Ｖ．ｅｔａｌ（２００２）．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．８，１８００－１８０７）。

【0136】

選択された潜在的結合ドメイン領域のＲＮＡ二次構造は、ウェブサーバーＭｆｏｌｄ（Ｚｕｋｅｒ，Ｍ.，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｒｅｓｅａｒｃｈ，３１，３４０６－３４１５及びＲＮＡｆｏｌｄを用いて予測された。選択された結合ドメイン領域は、結合ドメインの長距離相互作用を除外するために、ＲＮＡトランススプライシングカセットバックボーン内でリフォールディングされた。結合ドメイン構造は、二重形成を減少させるために、ウォッブル塩基対（Ｃ～ＵまたはＡ～Ｇの修飾）を導入することによって最適化された。長い二本鎖ＲＮＡによって引き起こされる影響を防ぐために、２つのミスマッチヌクレオチドを先に記載したように導入した（Ｃｈａｌｕｐｎｉｋｏｖａ，Ｋ．ｅｔａｌ（２０１３）．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．９４２，２９１－３１４）。

【0137】

加えて、ＢｂｖＣＩ制限酵素部位及びＲＮＡトランススプライシングカセット中の結合ドメインに隣接する隣接ヌクレオチドを、

【化4】

から

【化5】

に変更して、ＢｅｒｋｅｌｅｙＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔ内のＮｅｕｒａｌＮｅｔｗｏｒｋＳｅｒｖｅｒを使用したスプライス部位予測によって同定された、潜在的なスプライスアクセプター部位を破壊した。有望な結合ドメイン構造を選択し、結合ドメイン構造を最適化した後、ＲＮＡトランススプライシング結合ドメイン及びＲＮＡトランススプライシング結合カセット配列中のフランキング領域（ＮｈｅＩ～ＭｌｕＩ制限酵素部位の間）は、ＢｅｒｋｅｌｅｙＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔ内のＮｅｕｒａｌＮｅｔｗｏｒｋＳｅｒｖｅｒを用いたスプライス部位予測によって、潜在的なスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位を分析した。任意の突然変異が導入された後、潜在的なスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位を回避するために、結合ドメイン及びフランキング領域（ＮｈｅＩ～ＭｌｕＩ）は、ＢｅｒｋｅｌｅｙＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔ内のＮｅｕｒａｌＮｅｔｗｏｒｋＳｅｒｖｅｒによるスプライス部位予測によって再分析し、導入された突然変異が新規のスプライスドナー及びスプライスアクセプター部位を導入しなかったことを確認した。

【0138】

ＨＳＶ－ｔｋ翻訳開始変異体の生成
Ｎｐ９標的結合ドメイン及びフランキング配列は、隣接するＮｈｅＩ及びＭｌｕＩ制限酵素部位を有するＧｅｎｅＡｒｔ合成によって合成された（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。このインサートを、ＮｈｅＩ及びＭｌｕＩ制限酵素（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）消化及びライゲーションを用いて、ＣＭＶプロモーターから駆動されるＢＤ１００－ＨＳＶｔｋ及びＢＤ１００－ＨＳＶｔｋｏｐｔ２ｐＶＡＸ－１バックボーンにクローニングし、ＨＩＶ標的結合ドメインＢＤ１００領域を置換した（Ｉｎｇｅｍａｒｓｄｏｔｔｅｒｅｔａｌ（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ，７，１４０－１５４）。ＢＤ１００及びＢＤ７２結合ドメイン領域は、Ｉｎｇｅｍａｒｓｄｅｔｔｅｒらにより記載されているように、それぞれ、結合ドメイン領域ＢＤ１―Ｄ４及びＢＤ２― Ｄ４に対応する。ＨＩＶ標的化ＲＮＡトランススプライシング構築物ＣｋＲｈｓｐ－ＢＤ７２－ｐＶＡＸ－１では、テンプレートとして１０ｎｇのプラスミドＣｋＲｈｓｐ－ＢＤ７２－ｐＶＡＸ－１、及び部位特異的変異誘発プライマーを用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＩＩＸＬ部位特異的変異誘発キット（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造元の指示に従って部位特異的変異誘発により、ＨＳＶ－ｔｋＡＴＧ^４６及びＡＴＧ^６０におけるＨＳＶ－ｔｋ翻訳開始変異体を生成した。
順方向：５’－ＧＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＧＣＴＡＣＴＧＣＧＧＧＴＴＴＡＴＡＴＡＧＡＣＧＧＴＣＣＣＣＡＣＧＧＧＡＴＣＧＧＧ－３’
逆方向：５’－ＣＣＣＧＡＴＣＣＣＧＴＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＡＣＣＣＧＣＡＧＴＡＧＣＧＴＧＧＧＣＡＧＴＴＴＣ－３’．

【0139】

第２のＡＴＧ、ＡＴＧ^４６の変異誘発は、シーケンシングによって確認され、得られたプラスミドＤＮＡの１０ｎｇを２回目の変異誘発ＰＣＲにおいてテンプレートとして使用し、変異誘発プライマーｔｋｔｒ３ｍｕｔにより第３のＨＳＶ－ｔｋＡＴＧ、ＡＴＧ^６０を突然変異した。
順方向；５’－ＡＣＧＧＴＣＣＣＣＡＣＧＧＧＡＴＣＧＧＧＡＡＡＡＣＣＡＣ－３’、及びｔｋｔｒ３ｍｕｔ
逆方向；５’－ＧＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＣＣＣＧＡＴＣＣＣＧＴＧＧＧＧＡＣＣＧＴ－３’

【0140】

ＰｈｕｓｉｏｎＨＦＤＮＡポリメラーゼと５倍のＰｈｕｓｉｏｎＨＦ反応緩衝液（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、１２５ｎｇの順方向及び逆方向変異誘発プライマー、１μｌのｄＮＴＰｍｉｘ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、３μｌのＱｕｉｃｋｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用。変異誘発ＰＣＲ条件：－９５℃で１分間、続いて９５℃で５０秒間、６０℃で５０秒間、６８℃で４分間を１８サイクル繰り返した後、６８℃で７分間。ＰＣＲ産物をＤｐｎ１で３７℃で１時間消化し、ＸＬ１０－Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。結果として得られたＨＳＶ－ｔｋｏｐｔドメインは、ＣｈｋＲｈｓｐ－ＢＤ１００ｏｐｔ１－ｐＶＡＸ－１バックボーンにＰｓｔＩ及びＭｌｕＩ制限消化、ライゲーション及びサブクローニングを用いてサブクローニングし、ＣｈｋＲｈｓｐ－ＢＤ１００ｏｐｔ２－ｐＶＡＸ－１を生成した。ＣｈｋＲｈｓｐプロモーターを、ＳｐｅＩ及びＮｈｅＩ制限酵素の消化、ライゲーション及びサブクローニングを用いて、ＣｈｋＲｈｓｐ－ＢＤ１００ＨＳＶ－ｔｋｏｐｔ２－ｐＶＡＸ－１及びＢＤ１００－ＨＳＶ－ｔｋ－ｐＶＡＸ－１バックボーンにおけるＣＭＶプロモーターに置換した。

【0141】

Ｎｐ９標的結合ドメイン及びフランキング配列は、隣接するＮｈｅＩ及びＭｌｕＩ制限酵素部位を有するＧｅｎｅＡｒｔ合成によって合成された（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。このインサートを、ＮｈｅＩ及びＭｌｕＩ制限酵素（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）消化及びライゲーションを用いて、ＣＭＶ－ＢＤ１００－ＨＳＶｔｋ及びＣＭＶ－ＢＤ１００－ＨＳＶｔｋｏｐｔ２ｐＶＡＸ－１バックボーンにクローニングし、Ｎｐ９標的化結合ドメインでＩｎｇｅｍａｒｓｄｏｔｔｅｒｅｔａｌ（２０１７）に記載されているＨＩＶ標的結合ドメインＢＤ１００領域を置換した。

【0142】

ＲＮＡトランススプライシングｐＶＡＸ－１シャトルプラスミドの生成
ｐＶＡＸ－１から第三世代レンチウイルス遺伝子導入プラスミドｐＳｉｃｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ、ｒｅｆ：１１５７８）へのＲＮＡトランススプライシングカセットのサブクローニングを容易にするために、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩの制限酵素部位をＨＩＶ標的化ＲＮＡトランススプライシングカセットに隣接して導入し、ＣｋＲｈｓｐ－ＢＤ１００－ｏｐｔ２ｐＶＡＸ－１バックボーン内のＲＮＡトランススプライシングカセット内のポリＡテールの上流の５’端にＸｂａＩ、３’端にＸｈｏＩを導入し（Ｉｎｇｅｍａｒｓｄｏｔｔｅｒｅｔａｌ（２０１７））、製造元の指示に従い、テンプレートとして１０ｎｇのプラスミドＣｋＲｈｓｐ－ＢＤ１００－ｏｐｔ２－ｐＶＡＸ－１を用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。

【0143】

第１の変異誘発ＰＣＲでは、以下の変異誘発プライマーを使用して、ＸｂａＩ制限酵素部位を、ＲＮＡトランススプライシングカセットの５’末端に導入した；
５’ＸｂａＩ順方向；５’－ＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧ－３’．
５’ＸｂａＩ逆方向；５’－ＣＧＴＧＧＧＧＣＴＣＡＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣ－３’．

【0144】

ＰＣＲ産物を３７℃で１時間ＤｐｎＩで消化し、ＸＬ－１０Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。陽性クローンをシーケンシングにより確認し、かつ２回目の変異誘発ＰＣＲのテンプレートとして使用して、ポリＡテールの上流にあるＲＮＡトランススプライシングカセット内の３’末端にＸｈｏＩ部位を導入した。２回目の変異誘発ＰＣＲに使用されたプライマーは以下の通りであった；
３’ＸｈｏＩ順方向；５’－ＧＧＧＡＧＧＣＧＡＡＣＴＧＡＣＴＣＧＡＧＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣ－３’及び
３’ＸｈｏＩ逆方向；５’－ＧＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＴＣＧＣＣＴＣＣＣ－３’．

【0145】

Ｎｐ９標的トランススプライシングドメインを、ＳｐｅＩ及びＰｖｕＩ制限酵素による消化及びライゲーションを用いて、ｐＶＡＸ－１シャトル５’ＸｂａＩ－ＢＤ１００－ｏｐｔ１及び５’ＸｂａＩ－ＢＤ１００－ｏｐｔ２プラスミドにクローニングした。得られたプラスミド、ＨＳＶｔｋ－ｔｓ－ｐＶＡＸシャトル及びＨＳＶｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔ－ｐＶＡＸシャトルを、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ及びＮｓｂＩで消化し、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位でｐＳｉｃｏレンチウイルスバックボーンにライゲーションして、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩ間のＮｐ９標的ＲＮＡトランススプライシングカセットを単離した。

【0146】

サイロキシン結合グロブリンプロモーターの増幅
サイロキシン結合グロブリンプロモーター（ＴＢＧ）は、プラスミドｐＡＡＶ．ＴＢＧ．ＰＩ．Ｎｕｌｌ．ｂＧＨ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：１０５５３６）から、隣接するＢｃｕＩ制限酵素部位を有する以下の順方向プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
ＴＧＢｃｕＩ順方向、

【化6】

及び隣接するＮｈｅＩ制限酵素部位を有する逆方向プライマー
ＴＧＮｈｅＩ逆方向、

【化7】

【0147】

２０ｎｇのプラスミドｐＡＡＶ．ＴＢＧ．ＰＩ．Ｎｕｌｌ．ｂＧＨ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：１０５５３６）をテンプレートとして、１ｘＧｏＴａｑ反応緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５００ｎＭの順方向プライマー及び５００ｎＭの逆方向プライマー、２００μＭのＰＣＲヌクレオチドミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＧｏＴａｑＧ２ＤＮＡポリメラーゼ１.２５Ｕを含むＰＣＲ反応において、最終反応容積５０μｌで使用した。ＰＣＲサイクル条件として、９５℃で２分間、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３５サイクル繰り返した後、７２℃で５分間及び４℃で保持するステップ。ＴＢＧプロモーターを、－ＨＳＶｔｋ－ｔｓ－ｐＶＡＸシャトル及びＨＳＶｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔ－ｐＶＡＸシャトルプラスミドにクローニングして、ＢｃｕＩ及びＮｈｅＩの二重消化及びクローニングを使用してＣＭＶプロモーターを置換した。得られたＴＢＧ－ＨＳＶｔｋ－ｔｓ－ｐＶＡＸシャトル及びＴＢＧ－ＨＳＶｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔ－ｐＶＡＸシャトルを、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ及びＮｓｂＩで消化し、ｐＳｉｃｏレンチウイルスバックボーンにライゲーションして、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩ間のＮｐ９標的ＲＮＡトランススプライシングカセットを単離した。

【0148】

細胞培養
Ｈｅｐ３Ｂ（ＡＴＣＣ）、ｍＲＦＰ（ＨｕＨ－７－ｍＲＦＰ）を発現するように操作されたＨｕＨ－７（ＪＣＲＢＣｅｌｌＢａｎｋ）、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＭＩＡＰａＣａ－２（ＰＨＥ（ＥＣＡＣＣ）及びＰａｎｃ－１細胞（ＰＨＥ（ＥＣＡＣＣ）は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）及び１％のペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ）で培養された。Ａｓｐｃ－１細胞（ＡＴＣＣ）は、１０％のＦＢＳ及び１％のペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ）中で培養された。すべてのセルを、加湿された５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に維持した。

【0149】

ウエスタンブロット
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１ｍＬ／ウェルの補充ＤＭＥＭ中の１×１０^５個の細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞を０.５μｇのプラスミド（ｐＳｉｃｏ［ＣＭＶ－ＧＦＰ］，ｐＳ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ，ｐＳ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔ，ｐＳ－ＣＭＶ－ＨＳＶ－ｔｋ）でトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ）で洗浄し、１ｘ細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞を回収し、室温で１５分間インキュベートした。次いで溶解物を１２０００ｒｐｍで２分間スピンした。上清を回収し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｈａｌｔ）で処理した。タンパク質濃度を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）標準及びブラッドフォード色素試薬（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて定量した。その後、β－メルカプトエタノール含有負荷染料を５μｇのタンパク質に加え、９５℃で５分間沸騰させた。調製したサンプルを、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で電気泳動させ、移送バッファー（２５ｍＭトリス塩基、１５０ｍＭグリシン、１０％エタノール）を使用してニトロセルロース紙に１００Ｖで１時間転写した。ブロッキングバッファー（ＢＳＡ４％、ＰＢＳ中のＴｗｅｅｎ０.０５％）を用いて膜を室温で１時間ブロッキングし、ヤギ抗ＨＳＶ－１チミジンキナーゼ抗体ｖＮ－２０（１：５０００；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｓｃ２８０３７）と一緒に染色溶液（ＢＳＡ１.５％、ＰＢＳ中のＴｗｅｅｎ０.０５％）中で、４℃で一晩インキュベートした。次に、膜をＰＢＳ－０.０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ウサギ抗ヤギＨＲＰ結合抗体（１：２０００ＤａｋｏＰ０１６０）と一緒に染色溶液中で室温にて１時間インキュベートし、最後にＰＢＳ－０.０５％Ｔｗｅｅｎでさらに３回洗浄した。染色された膜を、ＥＣＬウエスタンブロット基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて現像し、高コントラストの青色感受性Ｘ線膜で可視化した。続いて、ブロッツをＰＢＳで２回洗浄し、ストリッピングバッファー（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で１５分間インキュベートし、ＰＢＳでさらに３回洗浄した。ウサギ抗ビンキュリン抗体（１：５０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ７０００６２）及びヤギ抗ウサギＨＲＰ標識二次抗体（１：５０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ６５６１２０）を用いてゲルを再染色し、ＥＣＬウエスタンブロット基質を用いて可視化した。ウエスタンブロット定量化を、Ｆｉｊｉソフトウェア（https://imagej.net/Fiji）を使用して完了した。

【0150】

ＭＴＴ細胞生存率アッセイ
細胞生存率を、以前に確立した方法に基づいて評価した（Ｐａｎｎｅｃｏｑｕｅｅｔａｌ.（２００８）.Ｎａｔｕｒｅｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，３，４２７－４３４）。簡単に説明すると、１日目に、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｕＨ７－ｍＲＦＰ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＭＩＡＰａＣａ－２、Ｐａｎｃ－１、及びＡｓｐｃ－１細胞を、９６ウェルプレートに２×１０^４個／ウェルの密度で１００μｌの培地／ウェルに播種した。２日目に、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＭＩＡＰａＣａ－２、Ｐａｎｃ－１、及びＡｓｐｃ－１細胞を、１または２のＭＯＩでレンチウイルス（Ｌｖ－ＣＭＶ－ＧＦＰ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔ、Ｌｖ－ＣＭＶ－ＨＳＶ－ｔｋ）に形質導入した。４日目に、細胞を１０００μΜのＧＣＶ（Ｓｉｇｍａ）で処理した。Ｈｅｐ３ＢまたはＨｕＨ７－ｍＲＦＰ細胞を、レンチウイルスベクター；ｐＳｉｃｏ（陰性対照）、トランススプライシングベクター、３’ＥＲ－ＨＳＶｔｋ、３’ＥＲ－ＨＳＶｔｋｏｐｔ、またはＨＳＶｔｋ（陽性対照）を用いて１のＭＯＩで形質導入した。Ｈｅｐ３Ｂ及びＨｕＨ７－ｍＲＦＰ細胞を、３日目及び４日目に様々な濃度でＧＣＶで処理した。最後に、８日目に、テトラゾリウム色素ＭＴＴ（３－［４，５－ジメチル－２－チアゾール－２－イル］－２，５－ジフェニル－テトラゾリウム臭化物）（Ｓｉｇｍａ）を、１０％（０.５ｍｇ／ｍｌ）の最終濃度となるようにウェル中の培地に添加し、３７℃で２～２.５時間インキュベートした。次に、培地を取り出し、酸性イソプロパノールのトリトンＸ－１００溶液（０.０４ＮのＨＣｌ、６％のトリトンＸ－１００）で交換し、室温で１５分間インキュベートした。吸光度は、ｉＭａｒｋＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＡｂｓｏｒｐｔｉｏｎＲｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で５９５ｎｍ及び６５５ｎｍの両方で測定した。６５５ｎｍで読み取られたバックグランド蛍光測定値は、５９５ｎｍでの測定値から差し引いた。細胞生存率は、各プレート上の全ての未処理ウェルの平均蛍光を１００％に設定することにより計算した。

【0151】

レンチウイルスベクターの産生
レンチウイルスベクターは、プラスミドのキャリーオーバーを除去するためにベンゾナーゼ処理を追加して、前述の（Ｄｕｌｌｅｔａｌ（１９９８）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，７２，８４６３－８４７１）のように生産した。簡単に言えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、５×１０^６個の細胞／プレートの密度で１０ｃｍの皿に播種した。２４時間後、細胞は、１０μｇのトランスファープラスミド（ｐＳｉｃｏ、ｐＳ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ、ｐＳ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔ、ｐＳ－ＣＭＶ－ＨＳＶ－ｔｋ）または（３’ＥＲ－ＨＳＶｔｋ、３’ＥＲ－ＨＳＶｔｋｏｐｔ、またはｐＳｉｃｏプラスミドバックボーン内のＴＢＧプロモーターによって駆動されるＴＢＧ－ＨＳＶｔｋ（陽性対照））、６．５μｇのｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（Ｇａｇ及びＰｏｌ発現パッケージングプラスミド）、２．５μｇのｐＲＳＶ－ＲＥＶ（Ｒｅｖ発現パッケージングプラスミド）、及び３．５μｇのＶＳＶ－Ｇエンベロープ発現プラスミド）を、以前の方法（前掲のＤｕｌｌｅｔａｌ（１９９８））に基づき、ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後に、培地を取り出し、新たなＤＭＥＭと交換した。トランスフェクションの４８時間後に、培地を収集し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、細胞破片を除去した。上清を収集し、５０Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ）で処理し、３７℃で３０分間インキュベートした。残った破片を除去するために、続いて上清を０.４５μｍの界面活性剤を含まない酢酸セルロースシリンジフィルター（ＳａｒｔｏｒｉｕｓＭｉｎｉｓａｒｔ）に通して適切な超遠心管に入れ、秤量し、２０，０００ｘｇで４℃で９０分間遠心分離した。上清をチューブから除去し、レンチウイルスペレットを５００μｌのＰＢＳに再懸濁させた。

【0152】

ｑＰＣＲを用いた感染力価の計算
簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２ｍＬのＤＭＥＭ中の２×１０^５個／ウェルで１２ウェルプレートに播種した。細胞は、２４時間後、各レンチウイルスベクター（Ｌｖ－ＣＭＶ－ＧＦＰ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ、Ｌｖ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔ、Ｌｖ－ＣＭＶ－ＨＳＶ－ｔｋ）の１μＬ、５μＬ、１０μＬで、重複ウェル内に形質導入した。形質導入の３日後に、ＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造元の指示に従い、インキュベーション時間を５６℃で３０分に延長し、各形質導入から１ウェルずつのＤＮＡを採取した。残りの細胞は、前述のように形質転換の６日後に収穫した。２０ｎＭのｆｗｄ／ｒｅｖプライマーとＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲマスターミックス（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ｐＳｉｃｏプラスミドＤＮＡの連続希釈液に基づく標準曲線と並行して、ｐｓｉｑＰＣＲ定量中に１００ｎｇのゲノムＤＮＡを増幅し、ｐｓｉコピー数を決定した。１００ｎＭのｆｗｄ／ｒｅｖプライマーとＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲマスターミックス（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、アルブミンｑＰＣＲ定量時に１００ｎｇのゲノムＤＮＡを増幅し、ＨＥＫ２９３ＴゲノムＤＮＡに基づく標準曲線と並行してアルブミンコピー数を測定し、細胞数の推定に用いた。

【0153】

両方とも以下のｑＰＣＲサイクリングプロトコールを使用した：５０℃で２分間及び９５℃で２０秒間の初期昇温、９５℃で３秒間及び６０℃で３０秒間の４０サイクル、最後に９５℃と６０℃の間の温度サイクルでの融解曲線（９５℃で１５秒間、６０℃で１分間、９５℃で１５秒間及び６０℃で１５秒間）。感染性の力価は、先に記載した方法に基づいて決定した（Ｋｕｔｎｅｒ，Ｒ．Ｈ．ｅｔａｌ（２００９）ＮａｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ４４９５－５０５）．ＰｓｉａｎｄａｌｂｕｍｉｎｐｒｉｍｅｒｓｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｄｅｓｉｇｎｅｄｂｙＣｈａｒｒｉｅｒｅｔａｌ．（２００７）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１４４１５－４２８．
Ｐｓｉ－Ｆｗｄ５’－ＣＡＧＧＡＣＴＣＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧ－３’，
Ｐｓｉ－Ｒｅｖ５’－ＴＣＣＣＣＣＧＣＴＴＡＡＴＡＣＴＧＡＣＧ－３’
アルブミン－Ｆｗｄ５’－ＧＣＴＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＧＧＣＴＧＴ－３，
アルブミン－Ｒｅｖ５’－ＡＣＴＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣ－３’．

【0154】

レンチウイルスベクターｐＳｉｃｏ（陰性対照）、３’ＥＲ－ＨＳＶｔｋ、３’ＥＲ－ＨＳＶｔｋｏｐｔ、またはＴＢＧプロモーターで駆動されるＨＳＶｔｋ（陽性対照）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で滴定し、感染力価を測定した。ゲノムＤＮＡを、３連ウェル中のレンチウイルスベクター／ウェル５μｌまたは１０ｕｌで形質導入した３日後に上記のように単離し、２０ｎｇゲノムＤＮＡをテンプレートとして、２０ｎＭのＷＰＲＥ－Ｆｗｄ及び２０ｎＭのＷＰＲＥ－Ｒｅｖプライマーを使用し、２ｘＴａｑＭａｎＦａｓｔＡｄｖａｎｃｅｄＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むｑＰＣＲ反応を行った。

【0155】

（ＷＰＲＥ－Ｆｗｄ５’－ＧＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣＣＧＴＧＴ－３’、ＷＰＲＥ－Ｒｅｖ５’－ＡＧＧＧＡＣＧＴＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＧ－３’）及び１００ｎＭＷＰＲＥプローブ５’６ＦＡＭ－ＡＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴＣＧＣ－ＴＡＭ３’。ＷＰＲＥｐｒｉｍｅｒａｎｄｐｒｏｂｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｄｅｓｉｇｎｅｄｂｙＣｈａｒｒｉｅｒｅｔａｌ．（２００７）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１４４１５－４２８．
ＷＰＲＥコピー数は、ｐＳｉｃｏプラスミドＤＮＡの連続希釈の標準曲線を使用して決定した。ｑＰＣＲサイクル条件は、５０℃で２分間、９５℃で２０秒間、９５℃で３秒間及び６０℃で３０秒間を４０サイクル繰り返す。アルブミンプライマーは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から単離した連続希釈ゲノムＤＮＡの標準曲線と比較して細胞数を推定するために、１００ｎｇのゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するｑＰＣＲ反応に使用した。

【0156】

統計分析
図５及び図７の統計分析は、Ｐｒｉｓｍ７（Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェア）を使用して行った。ＨＳＶ－ｔｋＰ１、Ｐ３タンパク質の発現レベルは、パラメトリック分布を仮定して、両側対応のないｔ検定を使用して比較した。図７では、すべてのＭＴＴ細胞生存率データを、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とＴｕｋｅｙの事後多重比較検定を用いて比較した。図６では、不等分散を仮定し、スチューデントのｔ検定（Ｅｘｃｅｌ）を使用して統計分析を行った。ｐ値はすべて０．０５未満を有意とした。統計分析で使用される全ての複製は、生物学的複製ウェルである。

【0157】

結果
ＨＣＣまたはＰＤＡＣを標的とするために、不完全な単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を含むＨＥＲＶ－Ｋｅｎｖｐｒｅ－ｍＲＮＡに向けられた新規な結合ドメインを有するＲＮＡトランストランススプライシング構築物を生成した（図１）。好ましい構造を生成し、潜在的なＲＮＡ編集を回避するために、結合ドメイン配列に４つのぐらつき塩基（Ｃ～Ｕ及びＡ～Ｇ）、または２つのミスマッチ（２ｘＡ～Ｕ）が含まれた（Ｃｈａｌｕｐｎｉｋｏｖａｅｔａｌ（２０１３）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，９４２，２９１－３１４）。配列アラインメントは、ＨＥＲＶ－Ｋ標的配列（ジェンバンク配列番号ＪＮ６７５０８７．１）に対して８９％の相補性を示した（図２Ｄ）。

【0158】

単離された結合ドメインのＲＮＡ二次構造予測は、ＲＮＡｆｏｌｄによって分析した場合、最小自由エネルギー（ＭＦＥ）またはセントロイドＲＮＡ二次構造予測のいずれにおいても、結合していないヌクレオチドが多い類似した構造を示した（図３Ａ）。結合ドメインがＲＮＡトランススプライシングカセットバックボーン内に非構造化領域を含むことを確認するために、ＲＮＡ結合ドメインは、ＲＮＡトランススプライシングカセットの文脈でフォールドされた。ＭＦＥ及びセントロイドフォールドにより、ＲＮＡトランススプライシングカセット内でフォールドされた場合、最大１８個の非結合ヌクレオチドのストレッチが確認された（図３Ｂ）。

【0159】

ＲＮＡトランススプライシングアプローチをさらに改善するために、Ｎｐ９標的化をＲＴＭ内の突然変異と組み合わせて、シスにおける潜在的なオフターゲットスプライシング（図４Ｂの上側）と、２番目（ＡＴＧ４６）と３番目（ＡＴＧ６０）の正規のＨＳＶ－ｔｋ翻訳開始コドンからの異常なＨＳＶ－ｔｋペプチド産生を減少させた。（図４Ｂの下側）。

【0160】

ＨＳＶ－ｔｋ翻訳開始変異体がＨＳＶ－ｔｋアイソフォーム産生に及ぼす影響を調べるために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるトランスフェクション試験では、Ｎｐ９標的ＲＮＡトランススプライシング構築物ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓｏｐｔを、ＨＳＶ－ｔｋの最初のＡＴＧ開始コドンを欠く野生型ＡＴＧ４６及びＡＴＧ６０を保有するＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓと比較してテストし（図５Ａ）、これに加え、野生型ＨＳＶ－ｔｋのすべての正規の翻訳開始部位を含むＨＳＶ－ｔｋを陽性対照として、ＣＭＶプロモーターからＧＦＰを発現する陰性対照構築物と並べた。異なるＨＳＶ－ｔｋ翻訳開始部位から生成された翻訳産物を、図５Ｂに示し、異なる構築物から生成された予測ＨＳＶ－ｔｋアイソフォームを、図５Ｃに示す。ウエスタンブロット解析により、ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓとＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔとを比較した場合に、同様のレベルのＰ１産生が確認され（図５Ｄ）、これは、トランススプライシングが成功し、その後Ｎｐ９翻訳開始コドンからＨＳＶ－ｔｋＰ１が産生されることを示唆している。ビンキュリンのレベルに正規化されたバンドの定量（荷重制御）により、この観察が確認された（Ｐ＜０.２８７７）（図５Ｅ）。対照的に、Ｐ３の発現レベルは、ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔをトランスフェクションした後、野生型ＨＳＶ－ｔｋよりもＰ３アイソフォーム発現が過剰発現されるＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓと比較して有意に低下した（図５Ｄ）。定量したところ、ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔをトランスフェクトした細胞では、ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓと比較してＰ３発現が１８倍減少していた（Ｐ＝０．００４７）ことから、最適化したＲＮＡトランススプライシング構築物ＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔを用いることで、ＨＳＶ－ｔｋペプチドの異常産生が減少することが確認された。

【0161】

トランススプライシングレンチウイルスベクターは、肝臓及び膵臓癌細胞株において細胞死を誘導する
Ｎｐ９標的ＲＮＡトランススプライシングレンチウイルスベクターの細胞生存率への影響を調べるため、ＭＴＴアッセイで効果を評価し、ベクター導入細胞をベクタータイプごとにＧＣＶ処理前後で比較した。肝細胞癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂでは、トランススプライシングベクター３’ＥＲ－ＨＳＶ－ｔｋを用いて形質導入した後、細胞生存率の有意な低下が観察され、濃度３００μＭのＧＣＶを２回投与した後の生存細胞は２５．５４±０．４８％（Ｐ＜０．００１）であり、ＧＣＶ投与後に生存した細胞は２１．６７±２．２１％（Ｐ＜０．０１）であったＨＳＶ－ｔｋ陽性対照ベクターと同等であった。ｔｋに最適化したトランススプライシングベクター、３’ＥＲ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｏｐｔでは、生存率は４６．０１±４．３９％（Ｐ＜０．０５）に有意に低下した（図６Ａ）。

【0162】

同様の傾向はＨｕＨ７－ｍＲＦＰ細胞でも見られ、ここで、トランススプライシングベクター３’ＥＲ－ＨＳＶ－ｔｋまたは３’ＥＲ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｏｐｔを用いて形質導入した細胞では、ＧＣＶ処理後の細胞生存率はそれぞれ４１．３３±６．１１％（Ｐ＜０．０１）または６４．９６±１．７７％（Ｐ＜０．００１）に低下した。ＨＳＶ－ｔｋ陽性対照ベクターを用いて形質導入したＨｕＨ７－ｍＲＦＰ細胞では、２４.６７±４.７３％（Ｐ＜０.００１）の細胞がＧＣＶ添加後も生存していた（図６Ｂ）。

【0163】

Ｈｅｐ３Ｂ細胞では、ＧＣＶ濃度を１０ｕＭまたは１００ｕＭの２用量に低下させると細胞生存率の有意な低下が観察され、３’ＥＲ－ＨＳＶ－ｔｋでは生存細胞残存率は２０．５０±５．５％（Ｐ＜０．０５）、１０μＭのＧＣＶ処理と併用した３’ＥＲ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｏｐｔでは３９．５８±２．０７％（Ｐ＜０．０１）であった。さらに、１００μＭのＧＣＶを２回投与すると、３’ＥＲ－ＨＳＶ－ｔｋでは７．１５±３．３％（Ｐ＜０．０１）、３’ＥＲ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｏｐｔでは１４．６２±３．３８％（Ｐ＜０．０５）の細胞生存率に低下した。これらのＧＣＶ濃度では、１９.５５±２.９０％（Ｐ＜０.０５）及び５.２４±１.７１％（Ｐ＜０.０５）の細胞が、それぞれ１０μΜまたは１００μΜと組み合わせたＨＳＶ－ｔｋ陽性対照ベクターでの形質導入に耐えた（図６Ｃ）。

【0164】

次に、Ｎｐ９標的ＲＮＡトランススプライシングレンチウイルスベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞で試験し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は１と２のＭＯＩで形質導入され、１０００μＭのＧＣＶで処理され、その後ＭＴＴアッセイで細胞生存率を分析した。ＧＣＶで処理した後、トランススプライシングレンチウイルスベクターであるＬｖＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ及びＬｖＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔを１のＭＯＩで投与すると、細胞生存率がそれぞれ８１．３１±３．２５％（Ｐ＜０．０００１）及び６８．８０±５．５４％（Ｐ＜０．０００１）に有意に低下し、ＧＣＶ及び陽性対照ＣＭＶ－ＨＳＶ－ｔｋで処理したサンプルにおける細胞生存率の損失８９．７３±３．８３％（Ｐ＜０．０００１）に相当した（図７Ａ）。２のＭＯＩでは、トランススプライシング構築物は、ＬｖＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ及びＬｖＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔ処理サンプルにおいて、わずか６．１９±１．２７％及び２．９６±２．０８％の細胞しか残存せず、細胞生存率がほぼ完全に喪失された（図７Ｂ）。

【0165】

さらに、トランススプライシングレンチウイルスベクターの有効性を膵癌細胞株において評価した。ＭＩＡＰａｃａ－２、Ｐａｎｃ－１及びＡｓｐｃ－１細胞を、ＬｖＣＭＶ－ＧＦＰ、ＬｖＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ、ＬｖＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔ、ＬｖＣＭＶ－ＨＳＶ－ｔｋのいずれかを用いて１または２のＭＯＩで形質導入し、２日後に１０００μΜ ＧＣＶで処置した。両方のトランススプライシングベクターとも、ＧＣＶ存在下、両ＭＯＩで試験したすべての細胞種で細胞生存率が有意に低下したが、Ｐａｎｃ－１細胞では１のＭＯＩでＬｖＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔの場合、有意な影響は認められなかった（図７Ｃ、７Ｄ、７Ｅ、７Ｆ、７Ｇ、７Ｈ）。

【0166】

Ｐａｎｃ－１細胞では、ＬｖＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ及びＬｖＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔは、１のＭＯＩではＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ誘導細胞毒性を示し、それぞれ４４．３７±５．８０％（Ｐ＜０．０００１）及び８０．２０±５．１６％（Ｐ＝０．８４０８）の細胞生存率を示したが、２のＭＯＩではそれぞれわずか１６．９４±２．１３％（Ｐ＜０．０００１）及び５２．３８±４．９５％（Ｐ＝０．００１１）の細胞生存率を示し、非常に有意な細胞毒性を示した（図７Ｃ、７Ｄ）。トランススプライシングレンチウイルスベクター（ＬｖＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ及びＬｖＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔ）は、Ａｓｐｃ－１細胞においても、Ｐａｎｃ－１細胞よりもさらに高い程度に有効であり、１のＭＯＩで処理した場合の生存率はわずか４５．１６±１１．９９％（Ｐ＝０．０００５）及び５９．６９±５．２１％（Ｐ＝０．０２４４）であるが、２のＭＯＩで処理した場合はわずか３５．６７±１．２１％（Ｐ＝０．０００２）及び４３．９５±８．４７％（Ｐ＜０．０００１）であった（図７Ｅ、７Ｆ）。最後に、ＭＩＡＰａＣａ－２細胞では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の場合と同様に、トランススプライシングレンチウイルスベクター及び１０００μΜ ＧＣＶで治療した後、細胞生存率がほぼ完全に失われた。１のＭＯＩでは、ＬｖＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ及びＬｖＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔで処理した後、それぞれ１４．０７±２．８２％（Ｐ＜０．０００１）及び８．０３±２．１９％（Ｐ＜０．０００１）の細胞のみが残存した（図７Ｇ）。２のＭＯＩでは、ＬｖＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ及びＬｖＨＳＶ－ｔｋ－ｔｓ－ｏｐｔでそれぞれ処理した後、細胞の４．１１±４．５４％（Ｐ＜０．０００１）及び１．２２±０．３１％（Ｐ＝０．０００２）しか生存していないことから、この効果はさらに顕著であり、陽性対照であるＬｖＣＭＶ－ＨＳＶ－ｔｋで処理したサンプルで観察されたものに相当し、処理後の細胞生存率はわずか２．０９±０．５３％（Ｐ＜０．０００１）であった（図７Ｈ）。

【0167】

まとめると、これは、肝臓及び膵臓癌細胞を死滅させるためにＲＮＡトランススプライシングによってＨＥＲＶ－ＫＥｎｖを標的とする有効性が確認された。

【0168】

参照配列
ＴＧＧＡＴＡＡＴＣＣＴＡＴＡＧＡＡＧＴＡＴＡＴＧＴＴＡＡＴＧＡＴＡＧＣＧＡＡＴＧＧＧＴＡ
配列番号１－ＨＥＲＶ－Ｋ標的配列の結合領域（ＤＮＡ）

ＵＧＧＡＵＡＡＵＣＣＵＡＵＡＧＡＡＧＵＡＵＡＵＧＵＵＡＡＵＧＡＵＡＧＣＧＡＡＵＧＧＧＵＡ
配列番号２－ＨＥＲＶ－Ｋ標的配列の結合領域（ＲＮＡ）

ＴＡＣＣＣＡＴＴＣＧＣＴＡＴＣＡＴＴＡＡＣＡＴＡＴＡＣＴＴＣＴＡＴＡＧＧＡＴＴＡＴＣＣＡ
配列番号３－ＨＥＲＶ－Ｋ標的配列の逆相補体（ＤＮＡ）

ＵＡＣＣＣＡＵＵＣＧＣＵＡＵＣＡＵＵＡＡＣＡＵＡＵＡＣＵＵＣＵＡＵＡＧＧＡＵＵＡＵＣＣＡ
配列番号４－ＨＥＲＶ－Ｋ標的配列の逆相補体（ＲＮＡ）

ＵＡＣＵＣＡＵＵＣＧＣＵＡＵＣＡＵＵＵＵＣＡＵＡＵＡＣＵＵＣＵＧＵＧＧＧＡＵＵＡＵＣＣＡ
配列番号５－ＨＥＲＶ－Ｋ標的配列の改変逆相補体（ＲＮＡ）

００１ｍａｓｙｐｃｈｑｈａｓａｆｄｑａａｒｓｒｇｈｓｎｒｒｔａｌｒｐｒｒｑｑｅａｔｅｖｒｐｅｑｋｍｐｔｌｌｒｖｙｉｄｇｐｈｇｍ
０６１ｇｋｔｔｔｔｑｌｌｖａｌｇｓｒｄｄｉｖｙｖｐｅｐｍｔｙｗｒｖｌｇａｓｅｔｉａｎｉｙｔｔｑｈｒｌｄｑｇｅｉｓａｇｄａａｖｖ
１２１ｍｔｓａｑｉｔｍｇｍｐｙａｖｔｄａｖｌａｐｈｉｇｇｅａｇｓｓｈａｐｐｐａｌｔｌｉｆｄｒｈｐｉａａｌｌｃｙｐａａｒｙｌｍｇ
１８１ｓｍｔｐｑａｖｌａｆｖａｌｉｐｐｔｌｐｇｔｎｉｖｌｇａｌｐｅｄｒｈｉｄｒｌａｋｒｑｒｐｇｅｒｌｄｌａｍｌａａｉｒｒｖｙｇ
２４１ｌｌａｎｔｖｒｙｌｑｇｇｇｓｗｒｅｄｗｇｑｌｓｇｔａｖｐｐｑｇａｅｐｑｓｎａｇｐｒｐｈｉｇｄｔｌｆｔｌｆｒａｐｅｌｌａｐ
３０１ｎｇｄｌｙｎｖｆａｗａｌｄｖｌａｋｒｌｒｐｍｈｖｆｉｌｄｙｄｑｓｐａｇｃｒｄａｌｌｑｌｔｓｇｍｖｑｔｈｖｔｔｐｇｓｉｐｔ
３６１ｉｃｄｌａｒｔｆａｒｅｍｇｅａｎ

配列番号６－ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）アミノ酸配列（ＡＡＣ１６２３５．１）

３０６ａｔｇｇｃｔｔｃｇｔａｃｃｃｃｔｇｃｃａｔｃａａｃａｃｇｃｇｔｃｔｇｃｇｔｔｃｇａｃｃａｇｇｃｔｇｃｇｃｇｔｔ
３６１ｃｔｃｇｃｇｇｃｃａｔａｇｃａａｃｃｇａｃｇｔａｃｇｇｃｇｔｔｇｃｇｃｃｃｔｃｇｃｃｇｇｃａｇｃａａｇａａｇｃｃａｃｇｇ
４２１ａａｇｔｃｃｇｃｃｃｇｇａｇｃａｇａａａａｔｇｃｃｃａｃｇｃｔａｃｔｇｃｇｇｇｔｔｔａｔａｔａｇａｃｇｇｔｃｃｃｃａｃｇ
４８１ｇｇａｔｇｇｇｇａａａａｃｃａｃｃａｃｃａｃｇｃａａｃｔｇｃｔｇｇｔｇｇｃｃｃｔｇｇｇｔｔｃｇｃｇｃｇａｃｇａｔａｔｃｇ
５４１ｔｃｔａｃｇｔａｃｃｃｇａｇｃｃｇａｔｇａｃｔｔａｃｔｇｇｃｇｇｇｔｇｃｔｇｇｇｇｇｃｔｔｃｃｇａｇａｃａａｔｃｇｃｇａ
６０１ａｃａｔｃｔａｃａｃｃａｃａｃａａｃａｃｃｇｃｃｔｃｇａｃｃａｇｇｇｔｇａｇａｔａｔｃｇｇｃｃｇｇｇｇａｃｇｃｇｇｃｇｇ
６６１ｔｇｇｔａａｔｇａｃａａｇｃｇｃｃｃａｇａｔａａｃａａｔｇｇｇｃａｔｇｃｃｔｔａｔｇｃｃｇｔｇａｃｃｇａｃｇｃｃｇｔｔｃ
７２１ｔｇｇｃｔｃｃｔｃａｔａｔｃｇｇｇｇｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｃｔｃａｃａｔｇｃｃｃｃｇｃｃｃｃｃｇｇｃｃｃｔｃａｃｃｃ
７８１ｔｃａｔｃｔｔｃｇａｃｃｇｃｃａｔｃｃｃａｔｃｇｃｃｇｃｃｃｔｃｃｔｇｔｇｃｔａｃｃｃｇｇｃｃｇｃｇｃｇａｔａｃｃｔｔａ
８４１ｔｇｇｇｃａｇｃａｔｇａｃｃｃｃｃｃａｇｇｃｃｇｔｇｃｔｇｇｃｇｔｔｃｇｔｇｇｃｃｃｔｃａｔｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｔｔｇｃ
９０１ｃｃｇｇｃａｃａａａｃａｔｃｇｔｇｔｔｇｇｇｇｇｃｃｃｔｔｃｃｇｇａｇｇａｃａｇａｃａｃａｔｃｇａｃｃｇｃｃｔｇｇｃｃａ
９６１ａａｃｇｃｃａｇｃｇｃｃｃｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｃｔｔｇａｃｃｔｇｇｃｔａｔｇｃｔｇｇｃｃｇｃｇａｔｔｃｇｃｃｇｃｇｔｔｔ
１０２１ａｃｇｇｇｃｔｇｃｔｔｇｃｃａａｔａｃｇｇｔｇｃｇｇｔａｔｃｔｇｃａｇｇｇｃｇｇｃｇｇｇｔｃｇｔｇｇｃｇｇｇａｇｇａｔｔ
１０８１ｇｇｇｇａｃａｇｃｔｔｔｃｇｇｇｇａｃｇｇｃｃｇｔｇｃｃｇｃｃｃｃａｇｇｇｔｇｃｃｇａｇｃｃｃｃａｇａｇｃａａｃｇｃｇｇ
１１４１ｇｃｃｃａｃｇａｃｃｃｃａｔａｔｃｇｇｇｇａｃａｃｇｔｔａｔｔｔａｃｃｃｔｇｔｔｔｃｇｇｇｃｃｃｃｃｃｇａｇｔｔｇｃｔｇｇ
１２０１ｃｃｃｃｃａａｃｇｇｃｇａｃｃｔｇｔａｔａａｃｇｔｇｔｔｔｇｃｃｔｇｇｇｃｃｔｔｇｇａｃｇｔｃｔｔｇｇｃｃａａａｃｇｃｃ
１２６１ｔｃｃｇｔｃｃｃａｔｇｃａｃｇｔｃｔｔｔａｔｃｃｔｇｇａｔｔａｃｇａｃｃａａｔｃｇｃｃｃｇｃｃｇｇｃｔｇｃｃｇｇｇａｃｇ
１３２１ｃｃｃｔｇｃｔｇｃａａｃｔｔａｃｃｔｃｃｇｇｇａｔｇｇｔｃｃａｇａｃｃｃａｃｇｔｃａｃｃａｃｃｃｃａｇｇｃｔｃｃａｔａｃ
１３８１ｃｇａｃｇａｔｃｔｇｃｇａｃｃｔｇｇｃｇｃｇｃａｃｇｔｔｔｇｃｃｃｇｇｇａｇａｔｇｇｇｇｇａｇｇｃｔａａｃｔｇａ

配列番号７－ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）コード配列（ＡＦ０５７３１０．１）

ＡＳＹＰＣＨＱＨＡＳＡＦＤＱＡＡＲＳＲＧＨＳＮＲＲＴＡＬＲＰＲＲＱＱＥＡＴＥＶＲＰＥＱＫＬＰＴＬＬＲＶＹＩＤＧＰＨＧＩ
ＧＫＴＴＴＴＱＬＬＶＡＬＧＳＲＤＤＩＶＹＶＰＥＰＭＴＹＷＲＶＬＧＡＳＥＴＩＡＮＩＹＴＴＱＨＲＬＤＱＧＥＩＳＡＧＤＡＡＶＶ
ＭＴＳＡＱＩＴＭＧＭＰＹＡＶＴＤＡＶＬＡＰＨＩＧＧＥＡＧＳＳＨＡＰＰＡＬＴＬＩＦＤＲＨＰＩＡＡＬＬＣＹＰＡＡＲＹＬＭＧ
ＳＭＴＰＱＡＶＬＡＦＶＡＬＩＰＰＴＬＰＧＴＮＩＶＬＧＡＬＰＥＤＲＨＩＤＲＬＡＫＲＱＲＰＧＥＲＬＤＬＡＭＬＡＡＩＲＲＶＹＧ
ＬＬＡＮＴＶＲＹＬＱＧＧＧＳＷＲＥＤＷＧＱＬＳＧＴＡＶＰＰＱＧＡＥＰＱＳＮＡＧＰＲＰＨＩＧＤＴＬＦＴＬＦＲＡＰＥＬＬＡＰ
ＮＧＤＬＹＮＶＦＡＷＡＬＤＶＬＡＫＲＬＲＰＭＨＶＦＩＬＤＹＤＱＳＰＡＧＣＲＤＡＬＬＱＬＴＳＧＭＶＱＴＨＶＴＴＰＧＳＩＰＴ
ＩＣＤＬＡＲＴＦＡＲＥＭＧＥＡＮ

配列番号８－改変されたＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）アミノ酸配列

【化8】

配列番号９－改変されたＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）コード配列

ＧＧＴＧＡＣＧＡＡＡＡＣＧＴＧＣＴＡＴＣＡＧＴＴＣＧＣＴＣＣＣＣＣＡＣＴＣＣＣ

配列番号１０－スペーサー配列

ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ

配列番号１１－Ｐ２Ａ切断配列

ＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧＴＡＣＴＡＡＣＡＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＧ

配列番号１２－トランススプライシングドメイン配列

ＧＣＵＡＧＣＵＡＣＵＣＡＵＵＣＧＣＵＡＵＣＡＵＵＵＵＣＡＵＡＵＡＣＵＵＣＵＧＵＧＧＧＡＵＵＡＵＣＣＡＣＣＵＣＧＣＧＧＵＧ６０
ＡＣＧＡＡＡＡＣＧＵＧＣＵＡＵＣＡＧＵＵＣＧＣＵＣＣＣＣＣＡＣＵＣＣＣＧＣＵＵＵＣＡＵＵＵＵＵＧＵＣＵＵＧＵＣＵＵＵＵＵ１２０
ＵＵＡＡＣＣＵＧＧＧＣＣＵＧＧＧＣＣＵＧＧＧＵＡＣＵＡＡＣＡＣＧＡＵＣＧＵＵＵＵＵＵＵＣＣＣＵＵＵＵＵＵＵＣＣＡＧＧＧＧ１８０
ＡＡＧＣＧＧＡＧＣＵＡＣＵＡＡＣＵＵＣＡＧＣＣＵＧＣＵＧＡＡＧＣＡＧＧＣＵＧＧＡＧＡＣＧＵＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＵＧＧ２４０
ＧＣＣＵＧＣＵＵＣＧＵＡＣＣＣＣＵＧＣＣＡＵＣＡＡＣＡＣＧＣＧＵＣＵＧＣＧＵＵＣＧＡＣＣＡＧＧＣＧＧＣＧＣＧＡＵＣＡＣＧ３００
ＧＧＧＡＣＡＣＡＧＣＡＡＣＣＧＡＣＧＧＡＣＧＧＣＧＵＵＧＣＧＣＣＣＵＣＧＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＣＣＡＣＧＧＡＡＧＵ３６０
ＣＧＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡＡＵＧＣＣＣＡＣＧＣＵＡＣＵＧＣＧＧＧＵＵＵＡＵＡＵＡＧＡＣＧＧＵＣＣＣＣＡＣＧＧＧＡＵ４２０
ＧＧＧＧＡＡＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＣＡＡＣＵＧＣＵＧＧＵＧＧＣＣＣＵＧＧＧＵＵＣＧＣＧＣＧＡＣＧＡＡＵＵＣＧＵＣＵＡ４８０
ＣＧＵＡＣＣＣＧＡＧＣＣＧＡＵＧＡＣＵＵＡＣＵＧＧＣＧＧＧＵＧＣＵＧＧＧＧＧＣＵＵＣＣＧＡＧＡＣＡＡＵＣＧＣＧＡＡＣＡＵ５４０
ＣＵＡＣＡＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣＵＣＧＡＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵＣＡＡＧＧＵＵＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＵＵＵＡＡＧＧ６００
ＡＧＡＣＣＡＡＵＡＧＡＡＡＣＵＧＧＧＣＵＵＧＵＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＣＧＡＣＵＣＵＵＧＣＧＵＵＵＣＵＧＡＵＡＧＧＣＡＣＣ６６０
ＵＡＵＵＧＧＵＣＵＵＡＣＵＧＡＣＡＵＣＣＡＣＵＵＵＧＣＣＵＵＵＣＵＣＵＣＣＡＣＡＧＧＧＵＧＡＧＡＵＡＵＣＧＧＣＣＧＧＧＧ７２０
ＡＣＧＣＧＧＣＧＧＵＧＧＵＡＡＵＧＡＣＡＡＧＣＧＣＣＣＡＧＡＵＡＡＣＡＡＵＧＧＧＣＡＵＧＣＣＵＵＡＵＧＣＣＧＵＧＡＣＣＧ７８０
ＡＣＧＣＣＧＵＵＣＵＧＧＣＵＣＣＵＣＡＵＡＵＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＧＣＵＧＧＧＡＧＣＵＣＡＣＡＵＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＧＧ８４０
ＣＣＣＵＣＡＣＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＧＡＣＣＧＣＣＡＵＣＣＣＡＵＣＧＣＣＧＣＣＣＵＣＣＵＧＵＧＣＵＡＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＣ９００
ＧＡＵＡＣＣＵＵＡＵＧＧＧＣＡＧＣＡＵＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＧＣＣＧＵＧＣＵＧＧＣＧＵＵＣＧＵＧＧＣＣＣＵＣＡＵＣＣＣＧＣ９６０
ＣＧＡＣＣＵＵＧＣＣＣＧＧＣＡＣＡＡＡＣＡＵＣＧＵＧＵＵＧＧＧＧＧＣＣＣＵＵＣＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＵＣＧＡＣＣ１０２０
ＧＣＣＵＧＧＣＣＡＡＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＵＵＧＡＣＣＵＧＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＣＣＧＣＧＡＵＵＣ１０８０
ＧＣＣＧＣＧＵＵＵＡＣＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＣＡＡＵＡＣＧＧＵＧＣＧＧＵＡＵＣＵＧＣＡＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＵＣＧＵＧＧＣ１１４０
ＧＧＧＡＧＧＡＵＵＧＧＧＧＡＣＡＧＣＵＵＵＣＧＧＧＧＡＣＧＧＣＣＧＵＧＣＣＧＣＣＵＣＡＧＧＧＵＧＣＣＧＡＧＣＣＵＣＡＧＡ１２００
ＧＣＡＡＣＧＣＧＧＧＣＣＣＡＣＧＡＣＣＣＣＡＵＡＵＣＧＧＧＧＡＣＡＣＧＵＵＡＵＵＵＡＣＣＣＵＧＵＵＵＣＧＧＧＣＣＣＣＣＧ１２６０
ＡＧＵＵＧＣＵＧＧＣＣＣＣＣＡＡＣＧＧＣＧＡＣＣＵＧＵＡＵＡＡＣＧＵＧＵＵＵＧＣＣＵＧＧＧＣＣＵＵＧＧＡＣＧＵＣＵＵＧＧ１３２０
ＣＣＡＡＡＣＧＣＣＵＣＣＧＵＣＣＣＡＵＧＣＡＣＧＵＣＵＵＵＡＵＣＣＵＧＧＡＵＵＡＣＧＡＣＣＡＡＵＣＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＵ１３８０
ＧＣＣＧＧＧＡＣＧＣＣＣＵＧＣＵＧＣＡＡＣＵＵＡＣＣＵＣＣＧＧＧＡＵＧＧＵＣＣＡＧＡＣＣＣＡＣＧＵＣＡＣＣＡＣＣＣＣＡＧ１４４０
ＧＣＵＣＣＡＵＡＣＣＧＡＣＧＡＵＣＵＧＣＧＡＣＣＵＧＧＣＧＣＧＣＡＣＧＵＵＵＧＣＧＣＧＧＧＡＧＡＵＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＡ１５００
ＡＣＵＧＡＣＵＣＧＡＧ１５１１
配列番号１３－ＲＴＭ配列

【化9】

塩基１～６Ｎｈｅ１部位
塩基７～５０結合ドメイン実線下線
塩基５１～５６改変されたＢｂｖＣ１部位
塩基５７～９５スペーサー点線下線
塩基１２８～１４２ＩＳＥ二重下線
塩基１４３～１５０分岐点破線下線
塩基１５０～１５６Ｐｖｕ１部位
塩基１５７～１７５ポリピリミジントラクト点線＋破線下線
塩基１７６～１７８スプライス部位実線下線
塩基１７９～２４４Ｐ２Ａ配列点線下線
塩基２４５～１５０５ＨＳＶｔｋ配列波線下線
塩基５６９～７１１イントロン斜体
塩基１５０６～１５１１Ｘｈｏ１部位

配列番号１４－ＲＴＭのコードＤＮＡ配列（配列番号１３）

ＧＣＵＡＧＣＵＡＣＵＣＡＵＵＣＧＣＵＡＵＣＡＵＵＵＵＣＡＵＡＵＡＣＵＵＣＵＧＵＧＧＧＡＵＵＡＵＣＣＡＣＣＵＣＧＣＧＧＵＧ６０
ＡＣＧＡＡＡＡＣＧＵＧＣＵＡＵＣＡＧＵＵＣＧＣＵＣＣＣＣＣＡＣＵＣＣＣＧＣＵＵＵＣＡＵＵＵＵＵＧＵＣＵＵＧＵＣＵＵＵＵＵ１２０
ＵＵＡＡＣＣＵＧＧＧＣＣＵＧＧＧＣＣＵＧＧＧＵＡＣＵＡＡＣＡＣＧＡＵＣＧＵＵＵＵＵＵＵＣＣＣＵＵＵＵＵＵＵＣＣＡＧＧＧＧ１８０
ＡＡＧＣＧＧＡＧＣＵＡＣＵＡＡＣＵＵＣＡＧＣＣＵＧＣＵＧＡＡＧＣＡＧＧＣＵＧＧＡＧＡＣＧＵＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＵＧＧ２４０
ＧＣＣＵＧＣＵＵＣＧＵＡＣＣＣＣＵＧＣＣＡＵＣＡＡＣＡＣＧＣＧＵＣＵＧＣＧＵＵＣＧＡＣＣＡＧＧＣＧＧＣＧＣＧＡＵＣＡＣＧ３００
ＧＧＧＡＣＡＣＡＧＣＡＡＣＣＧＡＣＧＧＡＣＧＧＣＧＵＵＧＣＧＣＣＣＵＣＧＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＣＣＡＣＧＧＡＡＧＵ３６０
ＣＣＧＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＵＧＣＣＣＡＣＧＣＵＡＣＵＧＣＧＧＧＵＵＵＡＵＡＵＡＧＡＣＧＧＵＣＣＣＣＡＣＧＧＧＡＵ４２０
ＣＧＧＧＡＡＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＣＡＡＣＵＧＣＵＧＧＵＧＧＣＣＣＵＧＧＧＵＵＣＧＣＧＣＧＡＣＧＡＵＡＵＣＧＵＣＵＡ４８０
ＣＧＵＡＣＣＣＧＡＧＣＣＧＡＵＧＡＣＵＵＡＣＵＧＧＣＧＧＧＵＧＣＵＧＧＧＧＧＣＵＵＣＣＧＡＧＡＣＡＡＵＣＧＣＧＡＡＣＡＵ５４０
ＣＵＡＣＡＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣＵＣＧＡＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵＣＡＡＧＧＵＵＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＵＵＵＡＡＧＧ６００
ＡＧＡＣＣＡＡＵＡＧＡＡＡＣＵＧＧＧＣＵＵＧＵＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＣＧＡＣＵＣＵＵＧＣＧＵＵＵＣＵＧＡＵＡＧＧＣＡＣＣ６６０
ＵＡＵＵＧＧＵＣＵＵＡＣＵＧＡＣＡＵＣＣＡＣＵＵＵＧＣＣＵＵＵＣＵＣＵＣＣＡＣＡＧＧＧＵＧＡＧＡＵＡＵＣＧＧＣＣＧＧＧＧ７２０
ＡＣＧＣＧＧＣＧＧＵＧＧＵＡＡＵＧＡＣＡＡＧＣＧＣＣＣＡＧＡＵＡＡＣＡＡＵＧＧＧＣＡＵＧＣＣＵＵＡＵＧＣＣＧＵＧＡＣＣＧ７８０
ＡＣＧＣＣＧＵＵＣＵＧＧＣＵＣＣＵＣＡＵＡＵＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＧＣＵＧＧＧＡＧＣＵＣＡＣＡＵＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＧＧ８４０
ＣＣＣＵＣＡＣＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＧＡＣＣＧＣＣＡＵＣＣＣＡＵＣＧＣＣＧＣＣＣＵＣＣＵＧＵＧＣＵＡＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＣ９００
ＧＡＵＡＣＣＵＵＡＵＧＧＧＣＡＧＣＡＵＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＧＣＣＧＵＧＣＵＧＧＣＧＵＵＣＧＵＧＧＣＣＣＵＣＡＵＣＣＣＧＣ９６０
ＣＧＡＣＣＵＵＧＣＣＣＧＧＣＡＣＡＡＡＣＡＵＣＧＵＧＵＵＧＧＧＧＧＣＣＣＵＵＣＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＵＣＧＡＣＣ１０２０
ＧＣＣＵＧＧＣＣＡＡＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＵＵＧＡＣＣＵＧＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＣＣＧＣＧＡＵＵＣ１０８０
ＧＣＣＧＣＧＵＵＵＡＣＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＣＡＡＵＡＣＧＧＵＧＣＧＧＵＡＵＣＵＧＣＡＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＵＣＧＵＧＧＣ１１４０
ＧＧＧＡＧＧＡＵＵＧＧＧＧＡＣＡＧＣＵＵＵＣＧＧＧＧＡＣＧＧＣＣＧＵＧＣＣＧＣＣＵＣＡＧＧＧＵＧＣＣＧＡＧＣＣＵＣＡＧＡ１２００
ＧＣＡＡＣＧＣＧＧＧＣＣＣＡＣＧＡＣＣＣＣＡＵＡＵＣＧＧＧＧＡＣＡＣＧＵＵＡＵＵＵＡＣＣＣＵＧＵＵＵＣＧＧＧＣＣＣＣＣＧ１２６０
ＡＧＵＵＧＣＵＧＧＣＣＣＣＣＡＡＣＧＧＣＧＡＣＣＵＧＵＡＵＡＡＣＧＵＧＵＵＵＧＣＣＵＧＧＧＣＣＵＵＧＧＡＣＧＵＣＵＵＧＧ１３２０
ＣＣＡＡＡＣＧＣＣＵＣＣＧＵＣＣＣＡＵＧＣＡＣＧＵＣＵＵＵＡＵＣＣＵＧＧＡＵＵＡＣＧＡＣＣＡＡＵＣＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＵ１３８０
ＧＣＣＧＧＧＡＣＧＣＣＣＵＧＣＵＧＣＡＡＣＵＵＡＣＣＵＣＣＧＧＧＡＵＧＧＵＣＣＡＧＡＣＣＣＡＣＧＵＣＡＣＣＡＣＣＣＣＡＧ１４４０
ＧＣＵＣＣＡＵＡＣＣＧＡＣＧＡＵＣＵＧＣＧＡＣＣＵＧＧＣＧＣＧＣＡＣＧＵＵＵＧＣＧＣＧＧＧＡＧＡＵＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＡ１５００
ＡＣＵＧＡＣＵＣＧＡＧ１５１１

配列番号１５－改変されたＨＳＶ－ｔｋコード配列を有するＲＴＭ配列

【化10】

塩基１～６Ｎｈｅ１部位
塩基７～５０結合ドメイン実線下線
塩基５１～５６改変されたＢｂｖＣ１部位
塩基５７～９５スペーサー点線下線
塩基１２８～１４２ＩＳＥ二重下線
塩基１４３～１５０分岐点破線下線
塩基１５０～１５６Ｐｖｕ１部位
塩基１５７～１７５ポリピリミジントラクト点線＋破線下線
塩基１７６～１７８スプライス部位実線下線
塩基１７９～２４４Ｐ２Ａ配列点線下線
塩基２４５～１５０５ＨＳＶｔｋ配列波線下線
塩基３７７～３８０突然変異したＡＴＧ太字
塩基４１９～４２１突然変異したＡＴＧ太字
塩基５６９～７１１イントロン斜体
塩基１５０６～１５１１Ｘｈｏ１部位

配列番号１６－改変されたＨＳＶ－ｔｋコード配列を有するＲＴＭのコードＤＮＡ配列（配列番号１５）

ＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＧＣＣＴ

配列番号１７－Ｐ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列。

【図1】