特表 2024-506681 ｒＡＡＶ及びｒＢＶ産生のためのトランスフェクション試薬としてのヒスチジンリッチペプチドの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-14

(54)【発明の名称】ｒＡＡＶ及びｒＢＶ産生のためのトランスフェクション試薬としてのヒスチジンリッチペプチドの使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/01 20060101AFI20240206BHJP

   C07K 14/00 20060101ALI20240206BHJP

   C07K 2/00 20060101ALN20240206BHJP

   C07K 4/00 20060101ALN20240206BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20240206BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20240206BHJP

   C12N 5/071 20100101ALN20240206BHJP

   C12M 1/00 20060101ALN20240206BHJP

【ＦＩ】

C12N7/01 ZNA

C07K14/00

C07K2/00

C07K4/00

C12N5/10

C12N15/63 Z

C12N5/071

C12M1/00 D

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023548883

(86)(22)【出願日】2022-02-10

(85)【翻訳文提出日】2023-09-12

(86)【国際出願番号】 US2022015903

(87)【国際公開番号】W WO2022173893

(87)【国際公開日】2022-08-18

(31)【優先権主張番号】63/149,425

(32)【優先日】2021-02-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】506136483

【氏名又は名称】バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002631

【氏名又は名称】弁理士法人イイダアンドパートナーズ

(74)【代理人】

【識別番号】100161469

【弁理士】

【氏名又は名称】赤羽 修一

(74)【代理人】

【識別番号】100141771

【弁理士】

【氏名又は名称】星野 宏和

(74)【代理人】

【識別番号】100118809

【弁理士】

【氏名又は名称】篠田 育男

(74)【代理人】

【識別番号】100164345

【弁理士】

【氏名又は名称】後藤 隆

(72)【発明者】

【氏名】ペレヴォシチコワ・イリーナ

(72)【発明者】

【氏名】アルスラン・バラン

(72)【発明者】

【氏名】ガルダン・ジュリー

(72)【発明者】

【氏名】ブルボン・ポーリーヌ

(72)【発明者】

【氏名】アラブシャヒ・ヘライ

(72)【発明者】

【氏名】チネク・トーマス

(72)【発明者】

【氏名】シュロフ・シルパ

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B029AA02

4B029BB11

4B029BB13

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065BD39

4B065CA60

4H045AA10

4H045AA20

4H045BA18

4H045BA19

(57)【要約】

本発明は、アデノ随伴ウイルス及びバキュロウイルスを調製及び使用するための方法、組成物、及びキットを提供する。アデノ随伴ウイルス粒子及びバキュロウイルス粒子を産生するための方法は、ヒスチジンリッチペプチド及び他のカチオン性ペプチドを、トランスフェクション試薬として使用することを含む。アデノ随伴ウイルスは、特に、遺伝子療法及び／又は診断における使用のための、キャプシドでシュードタイプ化されたものである。バキュロウイルスはまた、アデノ随伴ウイルスを調製するために使用される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を調製するための方法であって、
細胞を、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、カチオン性ペプチドを使用して同時トランスフェクトするステップであって、同時トランスフェクトするステップ中に、前記カチオン性ペプチドの少なくとも一部分が、αヘリカルコンフォメーションを有し、前記αヘリカルコンフォメーションが、前記コンフォメーションの一方の側に位置する疎水性アミノ酸残基、及び前記コンフォメーションの反対の側に位置する極性アミノ酸残基を含む、ステップと、
前記トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＡＡＶを生成するステップと、
前記ｒＡＡＶを回収するステップと、を含む、方法。

【請求項2】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を調製するための方法であって、
細胞を、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、トランスフェクション試薬を使用して同時トランスフェクトするステップであって、前記トランスフェクション試薬が、ヒスチジンリッチペプチド（ＨＲＰ）を含む、ステップと、
前記トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＡＡＶを生成するステップと、
前記ｒＡＡＶを回収するステップと、を含む、方法。

【請求項3】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を調製するための方法であって、
５００リットル（Ｌ）超の培養物量で懸濁した細胞を、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、トランスフェクション試薬を使用して一過的に同時トランスフェクトするステップと、
前記トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＡＡＶを生成するステップと、
前記ｒＡＡＶを回収するステップと、を含む、方法。

【請求項4】

組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を調製する方法であって、
細胞を、異種ヌクレオチド配列を有する組換えバクミドで、カチオン性ペプチドを使用してトランスフェクトするステップであって、前記トランスフェクトするステップ中に、前記カチオン性ペプチドの少なくとも一部分が、αヘリカルコンフォメーションを有し、前記αヘリカルコンフォメーションが、前記コンフォメーションの一方の側に位置する疎水性アミノ酸残基、及び前記コンフォメーションの反対の側に位置する極性アミノ酸残基を含む、ステップと、
前記トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップと、
任意選択的に、前記ｒＢＶを回収するステップと、を含む、方法。

【請求項5】

組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を調製する方法であって、
細胞を、バキュロウイルスゲノム及び異種ヌクレオチド配列を有する組換えバクミドで、トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトするステップであって、前記トランスフェクション試薬が、ヒスチジンリッチペプチド（ＨＲＰ）を含む、ステップと、
前記トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップと、
任意選択的に、前記ｒＢＶを回収するステップと、を含む、方法。

【請求項6】

組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を調製する方法であって、
細胞を、異種ヌクレオチド配列で、カチオン性ペプチドを使用してトランスフェクトするステップであって、前記細胞が、バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分を有し、前記トランスフェクトするステップ中に、前記カチオン性ペプチドの少なくとも一部分が、αヘリカルコンフォメーションを有し、前記αヘリカルコンフォメーションが、前記コンフォメーションの一方の側に位置する疎水性アミノ酸残基、及び前記コンフォメーションの反対の側に位置する極性アミノ酸残基を含む、ステップと、
前記トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップであって、前記異種ヌクレオチド配列及び前記バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分が、組み合わさって、ｒＢＶを生成することが可能なバキュロウイルスゲノムを形成する、ステップと、
任意選択的に、前記ｒＢＶを回収するステップと、を含む、方法。

【請求項7】

組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を調製する方法であって、
細胞を、異種ヌクレオチド配列で、トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトするステップであって、前記細胞が、バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分を有し、前記トランスフェクション試薬が、ヒスチジンリッチペプチド（ＨＲＰ）を含む、ステップと、
前記トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップであって、前記異種ヌクレオチド配列及び前記バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分が、組み合わさって、ｒＢＶを生成することが可能なバキュロウイルスゲノムを形成する、ステップと、
任意選択的に、前記ｒＢＶを回収するステップと、を含む、方法。

【請求項8】

組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を調製する方法であって、
細胞を、ＡＡＶゲノムベクターを提供するヌクレオチド配列又はＲｅｐタンパク質若しくはＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する組換えバクミドで、カチオン性ペプチドを使用してトランスフェクトするステップであって、前記トランスフェクトするステップ中に、前記カチオン性ペプチドの少なくとも一部分が、αヘリカルコンフォメーションを有し、前記αヘリカルコンフォメーションが、前記コンフォメーションの一方の側に位置する疎水性アミノ酸残基、及び前記コンフォメーションの反対の側に位置する極性アミノ酸残基を含む、ステップと、
前記トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップと、
任意選択的に、前記ｒＢＶを回収するステップと、を含む、方法。

【請求項9】

組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を調製する方法であって、
細胞を、ＡＡＶゲノムベクターを提供するヌクレオチド配列又はＲｅｐタンパク質若しくはＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する組換えバクミドで、トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトするステップであって、前記トランスフェクション試薬が、ヒスチジンリッチペプチド（ＨＲＰ）を含む、ステップと、
前記トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップと、
任意選択的に、前記ｒＢＶを回収するステップと、を含む、方法。

【請求項10】

組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を調製する方法であって、
細胞を、ＡＡＶゲノムベクターを提供するヌクレオチド配列又はＲｅｐタンパク質若しくはＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列で、カチオン性ペプチドを使用してトランスフェクトするステップであって、前記細胞が、バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分を有し、前記トランスフェクトするステップ中に、前記カチオン性ペプチドの少なくとも一部分が、αヘリカルコンフォメーションを有し、前記αヘリカルコンフォメーションが、前記コンフォメーションの一方の側に位置する疎水性アミノ酸残基、及び前記コンフォメーションの反対の側に位置する極性アミノ酸残基を含む、ステップと、
前記トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップであって、前記ヌクレオチド配列及び前記バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分が、組み合わさって、ｒＢＶを生成することが可能なバキュロウイルスゲノムを形成する、ステップと、
任意選択的に、前記ｒＢＶを回収するステップと、を含む、方法。

【請求項11】

組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を調製する方法であって、
細胞を、ＡＡＶゲノムベクターを提供するヌクレオチド配列又はＲｅｐタンパク質若しくはＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列で、トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトするステップであって、前記細胞が、バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分を有し、前記トランスフェクション試薬が、ヒスチジンリッチペプチド（ＨＲＰ）を含む、ステップと、
前記トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップであって、前記ヌクレオチド配列及び前記バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分が、組み合わさって、ｒＢＶを生成することが可能なバキュロウイルスゲノムを形成する、ステップと、
任意選択的に、前記ｒＢＶを回収するステップと、を含む、方法。

【請求項12】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を生成するためのエレメントを発現することが可能な細胞を調製する方法であって、
細胞を、ｒＡＡＶを生成するために使用されるエレメントをコードするヌクレオチド配列を有するベクターで、カチオン性ペプチドを使用してトランスフェクトするステップであって、前記トランスフェクトするステップ中に、前記カチオン性ペプチドの少なくとも一部分が、αヘリカルコンフォメーションを有し、前記αヘリカルコンフォメーションが、前記コンフォメーションの一方の側に位置する疎水性アミノ酸残基、及び前記コンフォメーションの反対の側に位置する極性アミノ酸残基を含む、ステップと、
前記ヌクレオチド配列を有するゲノムを有するトランスフェクトされた細胞を単離するステップと、を含む、方法。

【請求項13】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を生成するためのエレメントを発現することが可能な細胞を調製する方法であって、
細胞を、ｒＡＡＶを生成するために使用されるエレメントをコードするヌクレオチド配列を有するベクターで、トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトするステップであって、前記トランスフェクション試薬が、ヒスチジンリッチペプチド（ＨＲＰ）を含む、ステップと、
前記ヌクレオチド配列を有するゲノムを有するトランスフェクトされた細胞を単離するステップと、を含む、方法。

【請求項14】

前記１つ以上のベクターが、前記細胞の少なくとも７０％内に同時トランスフェクトされる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクター及び前記カチオン性ペプチドが、細胞に、前記細胞が培養されている量の１０％未満である量で付加される、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクター及び前記トランスフェクション試薬が、細胞に、前記細胞が培養されている量の１０％未満である量で付加される、請求項２又は３に記載の方法。

【請求項17】

前記ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターが、ＡＡＶゲノムベクター、ＡＡＶヘルパーベクター、及び非ＡＡＶヘルパー機能ベクターを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記極性アミノ酸残基が、ヒスチジン残基を含む、請求項１、４、６、８、１０、又は１２に記載の方法。

【請求項19】

前記疎水性アミノ酸残基が、アラニン残基を含む、請求項１、４、６、８、１０、又は１２に記載の方法。

【請求項20】

前記疎水性アミノ酸残基が、ロイシン残基を含む、請求項１、４、６、８、１０、又は１２に記載の方法。

【請求項21】

前記カチオン性ペプチドが、正電荷をｐＨ７．４で有するアミノ酸残基を含むＮ末端部分を有する、請求項１、４、６、８、１０、又は１２に記載の方法。

【請求項22】

前記カチオン性ペプチドが、正電荷をｐＨ７．４で有するリジン又はアルギニン残基を含むＮ末端部分を有する、請求項１、４、６、８、１０、又は１２に記載の方法。

【請求項23】

前記カチオン性ペプチドが、正電荷をｐＨ７．４で有するアミノ酸残基を含むＣ末端部分を有する、請求項１、４、６、８、１０、又は１２に記載の方法。

【請求項24】

前記カチオン性ペプチドが、正電荷をｐＨ７．４で有するリジン又はアルギニン残基を含むＣ末端部分を有する、請求項１、４、６、８、１０、又は１２に記載の方法。

【請求項25】

カチオン性ペプチドが、１９個以上のアミノ酸を含む、請求項１、４、６、８、１０、又は１２に記載の方法。

【請求項26】

前記ＨＲＰが、１９個以上のアミノ酸を含む、請求項２、５、７、９、１１、又は１３に記載の方法。

【請求項27】

カチオン性ペプチドが、５０個以上のアミノ酸を含む、請求項１、４、６、８、１０、又は１２に記載の方法。

【請求項28】

前記ＨＲＰが、１９個以上のアミノ酸を含む、請求項２、５、７、９、１１、又は１３に記載の方法。

【請求項29】

カチオン性ペプチドが、適正製造基準に従って調製される、請求項１、４、６、８、１０、又は１２に記載の方法。

【請求項30】

カチオン性ペプチドが、生分解性である、請求項１、４、６、８、１０、又は１２に記載の方法。

【請求項31】

前記ＨＲＰが、適正製造基準に従って調製される、請求項２、５、７、９、１１、又は１３に記載の方法。

【請求項32】

前記ＨＲＰが、生分解性である、請求項２、５、７、９、１１、又は１３に記載の方法。

【請求項33】

前記トランスフェクション試薬が、適正製造基準に従って調製される、請求項３に記載の方法。

【請求項34】

前記トランスフェクション試薬が、生分解性である、請求項３に記載の方法。

【請求項35】

前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項１、２、３、１２、又は１３に記載の方法。

【請求項36】

前記細胞が、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＢＨＫ、ＨＴ １０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ－７、ＡＲＰＥ－１９、又はＭＲＣ－５細胞である、請求項１、２、３、１２、又は１３に記載の方法。

【請求項37】

前記細胞が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ、Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ａｓｃａｌａｐｈａ ｏｄｏｒａｔａ、Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ、Ａｎｏｐｈｅｌｅ、Ｃｕｌｅｘ、又はＡｅｄｅｓに由来する昆虫細胞である、請求項４～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記細胞が、Ｓｆ９、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４、ＭＧ－１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、ＢＭ－Ｎ、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、又はＡｏ３８細胞である、請求項４～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

バイオリアクターが、少なくとも５００Ｌの容積を有する、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項40】

前記細胞が、少なくとも２５０Ｌ容積を有するバイオリアクター内にある、請求項４～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクター及び前記カチオン性ペプチドが、前記同時トランスフェクトするステップ前に、一緒に混合される、請求項１に記載の方法。

【請求項42】

前記ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクター及び前記ＨＲＰが、前記同時トランスフェクトするステップ前に、一緒に混合される、請求項２に記載の方法。

【請求項43】

前記ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクター及び前記トランスフェクション試薬が、前記同時トランスフェクトするステップ前に、一緒に混合される、請求項３に記載の方法。

【請求項44】

前記組換えバクミド及び前記カチオン性ペプチドが、前記トランスフェクトするステップ前に、一緒に混合される、請求項４又は８に記載の方法。

【請求項45】

前記組換えバクミド及び前記ＨＲＰが、前記トランスフェクトするステップ前に、一緒に混合される、請求項５又は９に記載の方法。

【請求項46】

前記回収されたｒＢＶが、バキュロウイルスに以前に感染していない培養されている細胞に付加されて、ｒＡＡＶを生成する、請求項８～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記回収ステップが、バキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を回収することを含む、請求項４～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記回収ステップが、バキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を回収することを含み、前記回収されたＢＩＩＣが、バキュロウイルスに以前に感染していない培養されている細胞とともに培養されて、ｒＡＡＶを生成する、請求項８～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を調製するための方法であって、
細胞を、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、カチオン性ペプチドを使用して同時トランスフェクトするステップであって、前記カチオン性ペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、又は１２４のうちのいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、ステップと、
前記トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＡＡＶを生成するステップと、
前記ｒＡＡＶを回収するステップと、を含む、方法。

【請求項50】

組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を調製する方法であって、
細胞を、異種ヌクレオチド配列を有する組換えバクミドで、カチオン性ペプチドを使用してトランスフェクトするステップであって、前記カチオン性ペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、又は１２４のうちのいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、ステップと、
前記トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップと、
任意選択的に、前記ｒＢＶを回収するステップと、を含む、方法。

【請求項51】

組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を調製する方法であって、
細胞を、異種ヌクレオチド配列で、カチオン性ペプチドを使用してトランスフェクトするステップであって、前記細胞が、バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分を有し、前記カチオン性ペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、又は１２４のうちのいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、ステップと、
前記トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップであって、前記異種ヌクレオチド配列及び前記バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分が、組み合わさって、ｒＢＶを生成することが可能なバキュロウイルスゲノムを形成する、ステップと、
任意選択的に、前記ｒＢＶを回収するステップと、を含む、方法。

【請求項52】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を生成するためのエレメントを発現することが可能な細胞を調製する方法であって、
細胞を、ＡＡＶゲノムベクターを提供するヌクレオチド配列又はＲｅｐタンパク質若しくはＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列、カチオン性ペプチドを使用してトランスフェクトすることであって、前記カチオン性ペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、又は１２４のうちのいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、ステップと、
前記ヌクレオチド配列を有するゲノムを有するトランスフェクトされた細胞を単離するステップと、を含む、方法。

【請求項53】

組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を調製する方法であって、
細胞を、ＡＡＶゲノムベクターを提供するヌクレオチド配列又はＲｅｐタンパク質若しくはＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列で、カチオン性ペプチドを使用してトランスフェクトするステップであって、前記細胞が、バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分を有し、前記カチオン性ペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、又は１２４のうちのいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、ステップと、
前記トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップであって、前記ヌクレオチド配列及び前記バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分が、組み合わさって、ｒＢＶを生成することが可能なバキュロウイルスゲノムを形成する、ステップと、
任意選択的に、前記ｒＢＶを回収するステップと、を含む、方法。

【請求項54】

配列番号９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１２１、１２２、１２３、又は１２４のうちのいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、カチオン性ペプチド。

【請求項55】

請求項５４に記載のカチオン性ペプチドを含む、組成物。

【請求項56】

配列番号９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１２１、１２２、１２３、又は１２４のアミノ酸配列を含む、カチオン性ペプチド。

【請求項57】

請求項５６に記載のカチオン性ペプチドを含む、組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子及び組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）粒子を、ヒスチジンリッチペプチド（ＨＲＰ）をトランスフェクション試薬として使用して産生するための方法及びプロセスを対象とする。

【背景技術】

【0002】

本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生を向上させる方法を対象とする。ＡＡＶは、２０～２５ｎｍ（４．７ｋｂ）の一本鎖ＤＮＡゲノムを有する非エンベロープウイルスである。ＡＡＶは、２つの１４５ヌクレオチド長の逆位末端反復（ＩＴＲ）を末端において有する、約４．７キロ塩基（ｋｂ）の直鎖一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを有する。ウイルスは、ポリメラーゼをコードせず、したがって、ゲノム複製のために細胞のポリメラーゼに依存する。ＩＴＲは、２つのウイルス遺伝子（それぞれ非構造タンパク質及び構造タンパク質をコードするｒｅｐ（複製）及びｃａｐ（キャプシド））に隣接している。ｒｅｐ遺伝子は、２つのプロモーターの使用及び選択的スプライシングを介して、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０と称される４つの調節タンパク質をコードする。これらのタンパク質は、ＡＡＶゲノムの複製及びパッケージングに関与している。ｃａｐ遺伝子は、選択的スプライシング及び翻訳の開始を介して、ＶＰ１（ビリオンタンパク質１）、ＶＰ２、及びＶＰ３の３つのキャプシドタンパク質を生じさせ、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３は、それぞれ、８７、７２、及び６２ｋＤａの分子量を有する。これらのキャプシドタンパク質は、６０サブユニットのほぼ球状のタンパク質シェルに組み立てられる。

【0003】

ＡＡＶは、自己で複製することができず、ヘルパーウイルス、典型的には、アデノウイルス又はヘルペスウイルスの同時感染を必要とする。ヒト細胞単独が、ＡＡＶに感染したときに、ＡＡＶの遺伝子発現プログラムは、自己抑制され、細胞の潜伏感染が発生する。しかしながら、潜伏感染細胞が、ヘルパーウイルス、そのようなアデノウイルス又は単純ヘルペスウイルスに同時感染したときに、ＡＡＶ遺伝子発現が活性化されて、宿主細胞染色体からのプロウイルスＤＮＡの切除、続いて、ウイルスゲノムの複製及びパッケージングを導く。

【0004】

哺乳類又は昆虫細胞内でのウイルスベクターの産生は、ウイルスベクター産生に関与する、目的の遺伝子及び必要なタンパク質をコードする外来核酸の送達を必要とする。細胞内への外来核酸の受動的な取り込みは、細胞を可能な感染から保護するために制限される。したがって、核酸の送達の促進が必要とされる。最も一般に、トランスフェクション試薬は、核酸を細胞内にシャトルするために使用される。ウイルスベクターの大規模製造のためのトランスフェクション試薬の選択は、トランスフェクション試薬の効率、安全性、一貫性、スケーラビリティ、及びコストによって決められる。

【0005】

好適なトランスフェクション試薬は、大規模ウイルスベクター産生のための成功した候補であるために、以下のいくつかの基準、１）好ましくは、プラスミド若しくはバクミドの形態又はいずれかの他の形態で提供される外来核酸に結合すること、２）外来ＤＮＡ及びトランスフェクション試薬の複合体が、好ましくは、１０分間超にわたって安定していること、３）外来ＤＮＡ：トランスフェクション試薬の複合体が、細胞表面に結合し、細胞によって取り込まれること、４）トランスフェクション試薬が、好ましくは、外来ＤＮＡ又は外来ＤＮＡ：トランスフェクション試薬複合体のエンドソーム放出のための様式を提供すること、５）外来ＤＮＡ又は外来ＤＮＡ：トランスフェクション試薬複合体が、好ましくは、細胞の核に到達することができること、６）外来ＤＮＡ又は外来ＤＮＡ：トランスフェクション試薬複合体が、好ましくは、タンパク質の転写及び遺伝子の複製のために使用可能であること、７）トランスフェクション試薬及び外来ＤＮＡ：トランスフェクション試薬複合体が、好ましくは、細胞によって十分に許容されること、８）外来ＤＮＡ又は外来ＤＮＡ：トランスフェクション試薬複合体が、好ましくは、選択される産生培地と適合すること、並びに９）トランスフェクション試薬が、好ましくは、産生細胞を効率的にトランスフェクトすることができることを満たすべきである。

【0006】

現在市販されているトランスフェクション試薬は、上記の基準のうちの１つ以上を欠く。例えば、ウイルスベクターの産生及びワクチンの産生のために広く使用及び選択される、線状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含むトランスフェクション試薬であるＰＥＩＰＲＯ（登録商標）（ＧＭＰグレード、ＰｏｌｙＰｌｕｓ）は、ＤＮＡ：ＰＥＩ複合体の安定性が乏しいことが既知である（Ｓａｎｇ Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｓａｌｔ ｉｏｎｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ａｆｆｅｃｔ ＰＥＩ－ＤＮＡ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１５，６７（１）：６７－７４、Ｈａｎ Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ－ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｆｆｅｃｔｓ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００９，６０（１－３）：６３）。

【0007】

異なる産生系について、トランスフェクション試薬は、生物学的材料の産生の規模拡張に直接影響を及ぼす。この目的で、トランスフェクション試薬、そのようなＰＥＩは、産生のサイズを拡大することが不可能である。例えば、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞培養物産生は、５００リットル（Ｌ）以下の量に制限されていることに留意されたい。

【0008】

加えて、脂質ベースのトランスフェクション試薬は、ＤＮＡとの複合体形成前に、希釈形態で不安定である。また、昆虫及び哺乳類細胞のために使用されるトランスフェクション試薬（例えば、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）、及びＦＥＣＴＯＶＩＲ（登録商標））は、臨床目的で使用されるｒＡＡＶ産生に望ましい適正製造基準（ＧＭＰ）グレードで、依然として使用可能でない。

【0009】

したがって、ＧＭＰ状況でのウイルスベクターの大規模製造に好適であるより良好なトランスフェクション試薬の必要性がある。

【発明の概要】

【0010】

様々な実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）及び組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を調製するための方法が開示される。また、様々な実施形態では、ｒＡＡＶを産生するためのエレメントを安定して発現する細胞を生成するための方法が開示される。方法は、トランスフェクション試薬としてのカチオン性ペプチドの使用であって、ペプチドが、正電荷を６～８の範囲（例えば、７．４）のｐＨで有する、使用を含む。いくつかの例示的なカチオン性ペプチドは、ヒスチジンリッチペプチド（ＨＲＰ）を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と静電的に相互作用することが可能であり、ＤＮＡが細胞内に送達されるように、細胞膜に透過することが可能である。したがって、ＨＲＰは、プラスミド及びバクミドを細胞に送達するためのトランスフェクション試薬として使用され得る。

【0011】

様々な実施形態のｒＡＡＶ産生方法は、細胞を、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、ＨＲＰなどのカチオン性ペプチドを使用して同時トランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＡＡＶを生成するステップと、任意選択的に、ｒＡＡＶを回収するステップと、を含む。

【0012】

他の実施形態では、ｒＡＡＶ産生方法は、５００リットル（Ｌ）超の培養物量で懸濁した細胞を、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、トランスフェクション試薬を使用して一過的に同時トランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＡＡＶを生成するステップと、任意選択的に、ｒＡＡＶを回収するステップと、を含む。

【0013】

様々な実施形態のｒＢＶ産生方法は、細胞を、異種ヌクレオチド配列を有する組換えバクミドで、ＨＲＰなどのカチオン性ペプチドを使用してトランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップと、任意選択的に、ｒＢＶを回収するステップと、を含む。

【0014】

他の実施形態では、ｒＢＶ産生方法は、細胞を、異種ヌクレオチド配列で、ＨＲＰなどのカチオン性ペプチドを使用してトランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップと、任意選択的に、ｒＢＶを回収するステップと、を含む。細胞は、バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分を有する。培養ステップ中に、異種ヌクレオチド配列及びバキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分は、組み合わさって、ｒＢＶを生成することが可能なバキュロウイルスゲノムを形成する。

【0015】

他の実施形態では、ｒＢＶ産生方法は、細胞を、環状又は直鎖状のいずれかの完全又は部分的なバキュロウイルスゲノムで、かつバキュロウイルスゲノムに相同な１つ以上の領域を含有する（トランスファーベクター内に組み込まれ得る）異種ヌクレオチド配列で、ＨＲＰなどのカチオン性ペプチドを使用して同時トランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップと、任意選択的に、ｒＢＶを回収するステップと、を含む。培養ステップ中に、完全又は部分的なバキュロウイルスゲノム及び異種ヌクレオチド配列は、相同領域を介して組換えられて、ｒＢＶを生成し異種ヌクレオチド配列の少なくとも一部分を保有することが可能な組換えバキュロウイルスゲノムを形成する。

【0016】

様々な実施形態のｒＢＶ産生方法は、細胞を、ｒＡＡＶゲノムベクターを提供するヌクレオチド配列又はＲｅｐタンパク質若しくはＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する組換えバクミドで、ＨＲＰなどのカチオン性ペプチドを使用してトランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップと、任意選択的に、ｒＢＶを回収するステップと、を含む。

【0017】

他の実施形態では、ｒＢＶ産生方法は、細胞を、ＡＡＶゲノムベクターを提供するヌクレオチド配列又はＲｅｐタンパク質若しくはＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列で、ＨＲＰなどのカチオン性ペプチドを使用してトランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップと、任意選択的に、ｒＢＶを回収するステップと、を含む。細胞は、バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分を有する。培養ステップ中に、ヌクレオチド配列及びバキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分は、組み合わさって、ｒＢＶを生成することが可能なバキュロウイルスゲノムを形成する。

【0018】

他の実施形態では、ｒＢＶ産生方法は、細胞を、環状又は直鎖状のいずれかの完全又は部分的なバキュロウイルスゲノムで、かつｒＡＡＶベクターゲノム又はＡＡＶ ｒｅｐ及び／若しくはｃａｐ遺伝子のいずれかを含有し、また、バキュロウイルスゲノムに相同な１つ以上の領域を含有する（トランスファーベクター内に組み込まれ得る）異種ヌクレオチド配列で、ＨＲＰなどのカチオン性ペプチドを使用して同時トランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップと、任意選択的に、ｒＢＶを回収するステップと、を含む。培養ステップ中に、完全又は部分的なバキュロウイルスゲノム及び異種ヌクレオチド配列は、相同領域を介して組換えられて、ｒＢＶを生成して異種ヌクレオチド配列の少なくとも一部分を保有することが可能な組換えバキュロウイルスゲノムを形成する。

【0019】

様々な実施形態の細胞生成方法は、細胞を、ｒＡＡＶを生成するために使用されるエレメントをコードするヌクレオチド配列を有するベクターで、ＨＲＰなどのカチオン性ペプチドを使用してトランスフェクトするステップと、ヌクレオチド配列を有するゲノムを有するトランスフェクトされた細胞を単離するステップと、を含む。

【0020】

様々な実施形態では、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、又は１２４のうちのいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、いずれかの実施形態のカチオン性ペプチド。

【0021】

様々な実施形態では、配列番号９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１２１、１２２、１２３、又は１２４のうちのいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有するカチオン性ペプチドが開示される。他の実施形態では、配列番号９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１２１、１２２、１２３、又は１２４のアミノ酸配列を有するカチオン性ペプチドが開示される。

【0022】

様々な実施形態では、配列番号９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１２１、１２２、１２３、１２４のうちのいずれか１つ、又はそれらの組み合わせと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する１つ以上のカチオン性ペプチドを含む組成物が開示される。他の実施形態では、配列番号９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１２１、１２２、１２３、１２４、又はそれらの組み合わせのアミノ酸配列を有する１つ以上のカチオン性ペプチドを含む組成物が開示される。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】Ａｍｂｒ１５ミニバイオリアクター（１５ミリリットル（ｍＬ）の容積）内で培養されたヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞内で産生されたＢｂａ４１キャプシドの力価、並びにトランスフェクションの２４及び６６時間後の、異なるヒスチジンリッチペプチド（ＨＲＰ）及びＰＥＩＰＲＯ（登録商標）のトランスフェクション効率を開示する。細胞は、Ｂｂａ４１キャプシドを産生するための、かつ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドでトランスフェクトされた。トランスフェクション効率は、フローサイトメトリーを使用して測定されて、ＧＦＰタンパク質を発現する細胞が特定された。ＡＡＶ力価は、デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）を使用して定量化された。

【0024】

【図2】Ｂｂａ４１キャプシドを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドをトランスフェクトしたときの、振盪フラスコ（３０ｍＬの有効容積）内でのトランスフェクションの２４時間後の、ＨＥＫ２９３細胞内でのＬＡＨ４ペプチドのトランスフェクション効率を示す。トランスフェクション効率は、フローサイトメトリーを使用して測定されて、ＧＦＰタンパク質を発現する細胞が特定された。

【0025】

【図3】Ｂｂａ４１キャプシドを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、異なるＬＡＨ４ペプチド濃度及び複合体形成量を使用してトランスフェクトされた、振盪フラスコ（３０ｍＬの有効容積）内でのトランスフェクトの２４時間後の、ＨＥＫ２９３細胞のＧＦＰ蛍光強度を示す。トランスフェクション効率は、フローサイトメトリーを使用して測定されて、ＧＦＰタンパク質を発現する細胞が特定された。

【0026】

【図4】Ｂｂａ４１キャプシドを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、異なるＬＡＨ４ペプチド濃度及び複合体形成量を使用してトランスフェクトされた、振盪フラスコ（３０ｍＬの有効容積）内でのトランスフェクションの７２時間後の、ＨＥＫ２９３細胞内で産生されたＢｂａ４１キャプシドの力価を示す。ＡＡＶ力価は、ｄｄＰＣＲを使用して定量化された。

【0027】

【図5A-5C】Ｂｂａ４１キャプシドを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、異なるＬＡＨ４ペプチド濃度及び複合体形成量を使用してトランスフェクトされた、振盪フラスコ（３０ｍＬの有効容積）内のＨＥＫ２９３細胞の細胞密度を示す。細胞密度は、トランスフェクションの０時間、２４時間、４８時間、及び７２時間後に評価された。細胞密度は、自動細胞カウンタ及びトリパンブルー排除を使用して定量化された。

【0028】

【図6A-6C】Ｂｂａ４１キャプシドを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、異なるＬＡＨ４ペプチド濃度及び複合体形成量を使用してトランスフェクトされた、振盪フラスコ（３０ｍＬの有効容積）内のＨＥＫ２９３細胞の生存率を示す。生存率は、トランスフェクションの０時間、２４時間、４８時間、及び７２時間後に評価された。細胞生存率は、自動細胞カウンタ及びトリパンブルー排除を使用して定量化された。

【0029】

【図7】振盪フラスコ（３０ｍＬの有効容積）内で培養され、Ｂｂａ４１キャプシドを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、異なるＨＲＰ及びＰＥＩＰＲＯ（登録商標）を使用してトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞内で産生されたＢｂａ４１キャプシドの力価を開示する。異なるＨＲＰ及びＰＥＩＰＲＯ（登録商標）は、トランスフェクション前に、プラスミドと混合され、異なる時間にわたってインキュベートされた。ＡＡＶ力価は、ｄｄＰＣＲを使用して定量化された。

【0030】

【図8A】Ｂｂａ４１キャプシドを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドをトランスフェクトしたときのトランスフェクションの２４時間後の、振盪フラスコ（３０ｍＬの有効容積）内で培養されたＨＥＫ２９３細胞内での異なるＨＲＰ及びＰＥＩＰＲＯ（登録商標）のトランスフェクション効率を示す。異なるＨＲＰ及びＰＥＩＰＲＯ（登録商標）は、トランスフェクション前に、プラスミドと混合され、異なる時間にわたってインキュベートされた。トランスフェクション効率は、フローサイトメトリーを使用して測定されて、ＧＦＰタンパク質を発現する細胞が特定された。

【0031】

【図8B】Ｂｂａ４１キャプシドを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドをトランスフェクトしたときのトランスフェクションの４８時間後の、振盪フラスコ（３０ｍＬの有効容積）内で培養されたＨＥＫ２９３細胞内での異なるＨＲＰのトランスフェクション効率を示す。異なるＨＲＰは、トランスフェクション前に、プラスミドと混合され、異なる時間にわたってインキュベートされた。トランスフェクション効率は、フローサイトメトリーを使用して測定されて、ＧＦＰタンパク質を発現する細胞が特定された。

【0032】

【図9】ＡＡＶ９キャプシドを産生するための、かつ目的の遺伝子を含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、ＬＡＨ４ペプチド及びＰＥＩＰＲＯ（登録商標）を使用してトランスフェクトされた、１．６Ｌの振盪フラスコ（５００ｍＬの有効容積）内のＨＥＫ２９３細胞内で産生されたＡＡＶ９キャプシドの力価を示す。ＡＡＶ力価は、ｄｄＰＣＲを使用して定量化された。

【0033】

【図10A】ＡＡＶ９キャプシドを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドをトランスフェクトしたときのトランスフェクションの４８時間後の、Ａｍｂｒ１５ミニバイオリアクター（１５ｍＬの容積）内のＨＥＫ２９３細胞内での異なる複合体形成量のＬＡＨ４ペプチドのトランスフェクション効率を示す。トランスフェクション効率は、フローサイトメトリーを使用して測定されて、ＧＦＰタンパク質を発現する細胞が特定された。

【0034】

【図10B】ＡＡＶ９キャプシドを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドをトランスフェクトしたときのトランスフェクションの２４時間後の、Ａｍｂｒ１５ミニバイオリアクター（１５ｍＬの容積）内のＨＥＫ２９３細胞内での異なる複合体形成量のＬＡＨ４ペプチドのトランスフェクション効率を示す。トランスフェクション効率は、フローサイトメトリーを使用して測定されて、ＧＦＰタンパク質を発現する細胞が特定された。

【0035】

【図10C】ＡＡＶ９キャプシドを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、異なる複合体形成量のＬＡＨ４ペプチドを使用してトランスフェクトされた、Ａｍｂｒ１５ミニバイオリアクター（１５ｍＬの容積）内の内のＨＥＫ２９３細胞内で産生されたＡＡＶ９キャプシドの力価を示す。ＡＡＶ力価は、ｄｄＰＣＲを使用して定量化された。

【0036】

【図10D】ＡＡＶ９キャプシドを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、異なる複合体形成量のＬＡＨ４ペプチドを使用してトランスフェクトされた、Ａｍｂｒ１５ミニバイオリアクター（１５ｍＬの容積）内のＨＥＫ２９３細胞の生存率を示す。細胞生存率は、自動細胞カウンタ及びトリパンブルー排除を使用して定量化された。

【0037】

【図10E】ＡＡＶ９キャプシドを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドをトランスフェクトしたときのトランスフェクションの４８時間後の、Ａｍｂｒ１５ミニバイオリアクター（１５ｍＬの容積）内のＨＥＫ２９３細胞内でのＬＡＨ４ペプチドのトランスフェクション効率であって、ＬＡＨ４ペプチド及びプラスミドが、トランスフェクション前に、混合され、異なる時間にわたってインキュベートされた、トランスフェクション効率を示す。トランスフェクション効率は、フローサイトメトリーを使用して測定されて、ＧＦＰタンパク質を発現する細胞が特定された。

【0038】

【図10F】ＡＡＶ９キャプシドを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドをトランスフェクトしたときのトランスフェクションの２４時間後の、Ａｍｂｒ１５ミニバイオリアクター（１５ｍＬの容積）内のＨＥＫ２９３細胞内でのＬＡＨ４ペプチドのトランスフェクション効率であって、ＬＡＨ４ペプチド及びプラスミドが、トランスフェクション前に、混合され、異なる時間にわたってインキュベートされた、トランスフェクション効率を示す。トランスフェクション効率は、フローサイトメトリーを使用して測定されて、ＧＦＰタンパク質を発現する細胞が特定された。

【0039】

【図10G】ｒＡＡＶを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、ＨＥＫ２９３細胞内に、ＬＡＨ４ペプチドを使用してトランスフェクトしたときの、Ａｍｂｒ１５ミニバイオリアクター（１５ｍＬの容積）内のＨＥＫ２９３細胞内で産生されたＡＡＶ９キャプシドの力価であって、ＬＡＨ４ペプチド及びプラスミドが、トランスフェクション前に、混合され、異なる時間にわたってインキュベートされた、力価を開示する。ＡＡＶ力価は、ｄｄＰＣＲを使用して定量化された。

【0040】

【図10H】ＡＡＶ９キャプシドを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、ＬＡＨ４ペプチドを使用してトランスフェクトされた、Ａｍｂｒ１５ミニバイオリアクター（１５ｍＬの容積）内のＨＥＫ２９３細胞の生存率であって、ＬＡＨ４ペプチド及びプラスミドが、トランスフェクション前に、混合され、異なる時間にわたってインキュベートされた、生存率を示す。細胞生存率は、自動細胞カウンタ及びトリパンブルー排除を使用して定量化された。

【0041】

【図11】ＡＡＶ９キャプシドを産生するための、かつ目的の遺伝子を含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、ＬＡＨ４ペプチドを使用してトランスフェクトされた、３Ｌのバイオリアクター内のＨＥＫ２９３細胞内で産生されたＡＡＶ９キャプシドの力価を示す。ＡＡＶ力価は、ｄｄＰＣＲを使用して定量化された。

【0042】

【図12】異なる濃度の異なるＨＲＰ（Ｈｉｓ－ＰＴＤ４－ＬＡＨ４、ＰＴＤ４－ＬＡＨ４、ＬＡＨ４（Ｗ）、及びＡＡＶ２ ＶＰ１－２ ＢＲ３－スペーサー－ＬＡＨ４）のトランスフェクション効率を示す。９６ディープウェルプレートのウェル（０．５ｍＬ）内のＨＥＫ２９３細胞は、ｒＡＡＶを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、異なる濃度の異なるＨＲＰを使用してトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、トランスフェクション効率は、フローサイトメトリーを使用して測定されて、ＧＦＰタンパク質を発現する細胞が特定された。

【0043】

【図13】異なる濃度の異なるＨＲＰ（Ｈｉｓ－ＰＴＤ４－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４、ＰＴＤ４－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４、ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４（Ｗ）、ＡＡＶ２ ＶＰ１－２ ＢＲ３－スペーサー－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４、及びＳＶ４０－Ｔ－ＮＬＳ－スペーサー－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４）のトランスフェクション効率を示す。９６ディープウェルプレートのウェル（０．５ｍＬ）内のＨＥＫ２９３細胞は、ｒＡＡＶを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、異なる濃度の異なるＨＲＰを使用してトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、トランスフェクション効率は、フローサイトメトリーを使用して測定されて、ＧＦＰタンパク質を発現する細胞が特定された。

【0044】

【図14】異なる濃度の異なるＨＲＰ（Ｈｉｓ－ＰＴＤ４－ＬＡＨ４、ＰＴＤ４－ＬＡＨ４、ＬＡＨ４（Ｗ）、及びＡＡＶ２ ＶＰ１－２ ＢＲ３－スペーサー－ＬＡＨ４）のＡＡＶ９キャプシド力価を示す。９６ディープウェルプレートのウェル（０．５ｍＬ）内のＨＥＫ２９３細胞は、ｒＡＡＶを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、異なる濃度の異なるＨＲＰを使用してトランスフェクトされた。所定の時間後に、ＡＡＶ９キャプシドは、培養物から単離され、力価は、ｄｄＰＣＲを使用して定量化された。

【0045】

【図15】異なる濃度の異なるＨＲＰ（Ｈｉｓ－ＰＴＤ４－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４、ＰＴＤ４－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４、ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４（Ｗ）、及びＳＶ４０－Ｔ－ＮＬＳ－スペーサー－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４）のＡＡＶ９キャプシド力価を示す。９６ディープウェルプレートのウェル（０．５ｍＬ）内のＨＥＫ２９３細胞は、ｒＡＡＶを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、異なる濃度の異なるＨＲＰを使用してトランスフェクトされた。所定の時間後に、ＡＡＶ９キャプシドは、培養物から単離され、力価は、ｄｄＰＣＲを使用して定量化された。

【0046】

【図16】ＬＡＨ４ペプチドを使用する、大規模（例えば、１００Ｌ）でのＨＥＫ２９３細胞のＡＡＶ９キャプシド力価を示す。１００Ｌのバイオリアクター内のＨＥＫ２９３細胞は、ｒＡＡＶを産生するための、かつＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドでトランスフェクトされた。所定の時間後に、ＡＡＶ９キャプシドは、培養物から単離され、ＡＡＶ力価は、ｄｄＰＣＲを使用して定量化された。

【0047】

【図17】初期に、ＧＦＰ発現カセットを有するプラスミドで、異なるＨＲＰ及び対照トランスフェクション試薬（ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してトランスフェクトされたときのトランスフェクションの２４時間後の、ＧＦＰを発現するＳｆ９細胞の百分率を示す。トランスフェクション効率は、フローサイトメトリーを使用して測定された ＧＦＰタンパク質を発現する細胞を特定する。

【0048】

【図18】ｒＡＡＶを産生するためのバクミドを、異なるＨＲＰ及び対照トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトすることによって、Ｓｆ９細胞内で産生されたｒＢＶの力価を示す。

【0049】

【図19】図１３からのＨＲＰ及び対照トランスフェクション試薬を使用して生成されたｒＢＶ、並びに目的の遺伝子を有するＡＡＶゲノムベクターを提供するｒＢＶに感染したＳｆ９細胞内で産生されたｒＡＡＶの力価を示す。ＡＡＶ力価は、ｄｄＰＣＲを使用して定量化された。

【発明を実施するための形態】

【0050】

必要に応じて、本開示の詳細な実施形態が、本明細書に開示されるが、開示される実施形態は、単に例示であり、様々な形態及び代替形態で具現化され得ることを理解されたい。

【0051】

実施例を除いて、又は別途明示的に示されている場合を除いて、材料の量又は反応及び／若しくは使用の条件を示す本明細書中の全ての数値は、「約」という言葉によって修飾されるものとして理解されるべきである。例えば、「約Ｘ」を参照する説明は、「Ｘ」の説明を含む。一例では、「約」という用語は、当該技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均値の２標準偏差以内として理解される。異なる例では、「約」は、±０．０００１％、±０．０００５％、±０．００１％、±０．００５％、±０．０１％、±０．０５％、±０．１％、±０．５％、±１％、±５％、又は±１０％の変動を指す。更なる例では、「約」は、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、又は±２％以内と理解することができる。

【0052】

文脈から別途明確でない限り、本明細書に提供される全ての数値は、約という用語によって修正される。全ての範囲には、範囲のエンドポイントが含まれる。頭字語又は他の略語の第１の定義は、同じ略語の本明細書におけるその後の全ての使用に適用され、最初に定義された略語の通常の文法的バリエーションに準用され、反対に明示的に示されない限り、特性の測定は、以前に又は後で同じ特性について参照されたのと同じ技術によって決定される。

【0053】

別途示されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

【0054】

また、具体的な構成要素及び／又は条件は、もちろん、変動し得るため、本開示は、以下に記載される具体的な実施形態及び方法に限定されないことを理解されたい。更に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためにのみ使用され、なんら限定することは意図されていない。

【0055】

本出願全体を通して、刊行物が参照される場合、本発明が関連する技術水準をより完全に説明するために、これらの刊行物の開示全体は、参照により本出願に援用される。

【0056】

また、好ましくは、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明白に示さない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。例えば、単数形の構成要素への言及は、複数の構成要素を含むことが意図されている。

【0057】

「又は」及び「及び」という用語は、互換的に使用することができ、「及び／又は」を意味すると理解することができる。

【0058】

「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という用語は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」、又は「ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ（によって特徴付けられる）」と同義である。これらの用語は、包含的かつオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素又は方法のステップを排除するものではない。

【0059】

「～からなる」という語句は、特許請求の範囲で特定されていない任意の要素、ステップ、又は成分を除外するものである。この語句がプリアンブルの直後ではなく、特許請求の範囲の本文の条項に出現する場合、その条項に示されている要素のみを制限し、他の要素は全体として特許請求の範囲から除外されない

【0060】

「～から本質的になる」という語句は、特許請求の範囲を、特許請求される主題の特定の材料又はステップに加えて、本質的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。

【0061】

「含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」という用語は、代替的に使用することができる。これらの３つの用語のうちの１つが使用される場合、本開示の特許請求される主題は、他の２つの用語のいずれかの使用を含むことができる。

【0062】

本発明によれば、本発明者らは、ヒスチジンリッチペプチド（ＨＲＰ）として特定されるカチオン性ペプチド及び他のカチオン性ペプチドが、細胞を有効にトランスフェクトして、より大きい力価の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞などの異なる細胞型内で産生することが可能であることを驚くべきことに発見した。この目的で、トランスフェクション試薬としてのＨＲＰの使用は、当該技術分野の現状によって対処されておらず産業において長い間必要性が感じられてきた、生物学的材料（例えば、組換えタンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのヌクレオチド、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、生物製剤、並びにｒＡＡＶ及び組換えレンチウイルスなどの遺伝子療法ベクター）の産生の規模拡張についての制限を予想外に解決する。更に、昆虫細胞産生を含むいくつかの産生タイプのために、ＨＲＰは、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って調製されるが、他のトランスフェクション試薬は、ＧＭＰグレードとして生成されることが可能でない又はＧＭＰグレードとして生成されていない。ＨＲＰはまた、生分解性であり、細胞生存率への障害／効果がない範囲にある。

【0063】

本明細書に記載の方法は、ステップとして開示及び説明され得るが、いくつかのステップは、これらの方法に従って、異なる順序で、並びに／又は本明細書に記載の及び／若しくは当該技術分野で既知の他のステップと同時に発生し得るため、本方法は必ずしもステップの順序によって制限されるものではないことを理解されたい。

【0064】

様々な実施形態のｒＡＡＶ産生方法は、細胞を、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、カチオン性ペプチド／ＨＲＰを使用して同時トランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＡＡＶを生成するステップと、ｒＡＡＶを回収するステップと、を含む。「カチオン性ペプチド／ＨＲＰ」という用語は、ＨＲＰ及び他の記載されるカチオン性ペプチドを指す。例えば、カチオン性ペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、又は１２４のうちのいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、９９％＋、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。２つ以上のヌクレオチド又はペプチドアミノ酸配列の文脈における「パーセント同一性」、「パーセント同一」、又は「と％同一」という用語は、最大の一致について比較及びアライメントされたときに、同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基の百分率を指す。例えば、パーセント同一性は、デフォルト設定を使用するＮＣＢＩ ｂｌａｓｔｐ（アミノ酸）を使用して決定される。

【0065】

他の例では、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、又は１２４のアミノ酸配列を有するカチオン性ペプチドは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、又は５５個のアミノ酸置換、例えば、保存アミノ酸交換を有することができる。保存アミノ酸交換についての例示的な例は、アミノ酸の側鎖の構造的及び／又は機能的特性を維持するアミノ酸置換であり、例えば、芳香族アミノ酸は、別の芳香族アミノ酸に対して置換し、酸性アミノ酸は、別の酸性アミノ酸に対して置換し、塩基性アミノ酸は、別の塩基性アミノ酸に対して置換し、脂肪族アミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸に対して置換する。いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基と交換される、保存的アミノ酸置換である。類似の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。標準化及び許容される機能的に等価なアミノ酸置換が、表１に提示される。対照的に、非保存アミノ酸交換の例は、アミノ酸の側鎖の構造的及び／又は機能的特性を維持しないアミノ酸置換であり、例えば、芳香族アミノ酸は、塩基性、酸性、又は脂肪族アミノ酸に対して置換し、酸性アミノ酸は、芳香族、塩基性、又は脂肪族アミノ酸に対して置換し、塩基性アミノ酸は、酸性、芳香族、又は脂肪族アミノ酸に対して置換し、脂肪族アミノ酸は、芳香族、酸性、又は塩基性アミノ酸に対して置換する。

【0066】

【表1】

【0067】

他の実施形態では、ｒＡＡＶ産生方法は、５００リットル（Ｌ）超の培養物量で懸濁した細胞を、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、トランスフェクション試薬を使用して一過的に同時トランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＡＡＶを生成するステップと、任意選択的に、ｒＡＡＶを回収するステップと、を含む。上記のように、本発明は、当該技術分野の現状における制限を、ｒＡＡＶ又は他の生物学的産生の能力を５００Ｌ超の規模で制限する培養物で解決する。例えば、ＨＥＫ２９３細胞を使用するｒＡＡＶ又は他の生物学的産生についての当該技術分野の現状は、５００Ｌ以下に制限される。したがって、本出願に記載される本発明は、当該技術分野の現状の制限を克服する。

【0068】

様々な実施形態のｒＢＶ産生方法は、細胞を、バキュロウイルスゲノム及び異種ヌクレオチド配列を有する組換えバクミドで、カチオン性ペプチド／ＨＲＰを使用してトランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップと、任意選択的に、ｒＢＶを回収するステップと、を含む。

【0069】

他の実施形態では、ｒＢＶ産生方法は、細胞を、異種ヌクレオチド配列で、ＨＲＰなどのカチオン性ペプチドを使用してトランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップと、任意選択的に、ｒＢＶを回収するステップと、を含む。細胞は、バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分を有する。培養ステップ中に、異種ヌクレオチド配列及びバキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分は、組み合わさって、ｒＢＶを生成することが可能なバキュロウイルスゲノムを形成する。

【0070】

他の実施形態では、ｒＢＶ産生方法は、細胞を、環状又は直鎖状のいずれかの完全又は部分的なバキュロウイルスゲノムで、かつバキュロウイルスゲノムに相同な１つ以上の領域を含有する（トランスファーベクター内に組み込まれ得る）異種ヌクレオチド配列で、ＨＲＰなどのカチオン性ペプチドを使用して同時トランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップと、任意選択的に、ｒＢＶを回収するステップと、を含む。培養ステップ中に、完全又は部分的なバキュロウイルスゲノム及び異種ヌクレオチド配列は、相同領域を介して組換えられて、ｒＢＶを生成して異種ヌクレオチド配列の少なくとも一部分を保有することが可能な組換えバキュロウイルスゲノムを形成する。

【0071】

様々な実施形態のｒＢＶ産生方法は、細胞を、ＡＡＶゲノムベクターを提供するヌクレオチド配列又はＲｅｐタンパク質若しくはＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する組換えバクミドで、カチオン性ペプチド／ＨＲＰを使用してトランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップと、任意選択的に、ｒＢＶを回収するステップと、を含む。

【0072】

他の実施形態では、ｒＢＶ産生方法は、細胞を、ＡＡＶゲノムベクターを提供するヌクレオチド配列又はＲｅｐタンパク質若しくはＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列で、ＨＲＰなどのカチオン性ペプチドを使用してトランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップと、任意選択的に、ｒＢＶを回収するステップと、を含む。細胞は、バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分を有する。培養ステップ中に、ヌクレオチド配列及びバキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分は、組み合わさって、ｒＢＶを生成することが可能なバキュロウイルスゲノムを形成する。

【0073】

他の実施形態では、ｒＢＶ産生方法は、細胞を、環状又は直鎖状のいずれかの完全又は部分的なバキュロウイルスゲノムで、かつｒＡＡＶベクターゲノム又はＡＡＶ ｒｅｐ及び／若しくはｃａｐ遺伝子のいずれかを含有し、また、バキュロウイルスゲノムに相同な１つ以上の領域を含有する（トランスファーベクター内に組み込まれ得る）異種ヌクレオチド配列で、ＨＲＰなどのカチオン性ペプチドを使用して同時トランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた細胞を培養して、ｒＢＶを生成するステップと、任意選択的に、ｒＢＶを回収するステップと、を含む。培養ステップ中に、完全又は部分的なバキュロウイルスゲノム及び異種ヌクレオチド配列は、相同領域を介して組換えられて、ｒＢＶを生成して異種ヌクレオチド配列の少なくとも一部分を保有することが可能な組換えバキュロウイルスゲノムを形成する。

【0074】

様々な実施形態の細胞生成方法は、細胞を、ｒＡＡＶを生成するために使用されるエレメントをコードするヌクレオチド配列を有するベクターで、カチオン性ペプチド／ＨＲＰを使用してトランスフェクトするステップと、ヌクレオチド配列を有するゲノムを有するトランスフェクトされた細胞を単離するステップと、を含む。

【0075】

ｒＡＡＶ産生方法の様々な実施形態では、いずれかの実施形態のｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターは、少なくとも１つの細胞内に同時トランスフェクトされる。様々な実施形態では、いずれかの実施形態のｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターは、細胞の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９％＋、又は少なくとも１００％内に同時トランスフェクトされる。更なる実施形態では、１つ以上のベクターでトランスフェクトされる細胞の百分率は、上記で提供されるいずれかの２つの百分率間の範囲である。

【0076】

ｒＡＡＶ産生方法の様々な実施形態では、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、カチオン性ペプチド／ＨＲＰを使用してトランスフェクトされる細胞の百分率は、トランスフェクション条件が、１つ以上のベクターでトランスフェクトされる細胞の百分率を最大にするために最適化される場合、又は代替として、類似のトランスフェクション条件のうちの同じトランスフェクション条件下の場合、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、ポリエチレンイミン又はその誘導体を含むトランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトされる細胞の百分率よりも大きい。

【0077】

ｒＡＡＶ産生方法の様々な実施形態では、いずれかの実施形態のｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクター、並びにいずれかの実施形態のカチオン性ペプチド／ＨＲＰ及びトランスフェクション試薬のうちの１つは、細胞に、細胞が培養されている量の１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満である量で付加される。様々な実施形態では、いずれかの実施形態のｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクター、並びにいずれかの実施形態のカチオン性ペプチド／ＨＲＰ及びトランスフェクション試薬のうちの１つは、細胞に、細胞が培養されている量の０％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、又は１０％である量で付加される。更なる実施形態では、１つ以上のベクターと、カチオン性ペプチド／ＨＲＰ及びトランスフェクション試薬のうちの少なくとも１つとの混合物の量は、細胞が培養されている量の割合であり、割合は、上記で提供されるいずれかの２つの百分率間の範囲である。

【0078】

ｒＡＡＶ産生方法の様々な実施形態では、いずれかの実施形態のｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクター、並びにいずれかの実施形態のカチオン性ペプチド／ＨＲＰ及びトランスフェクション試薬のうちの１つは、同時トランスフェクトするステップ前に、一緒に混合される。混合物は、長期間安定しており、より大きい細胞培養物量での細胞のトランスフェクションを可能にする。様々な実施形態では、いずれかの実施形態の、１つ以上のベクターと、ペプチド／ＨＲＰ及びトランスフェクション試薬との混合物は、同時トランスフェクトするステップ前に、少なくとも１分間、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも５０分間、少なくとも１００分間、少なくとも２００分間、少なくとも５００分間、少なくとも１０００分間、又は少なくとも２０００分間インキュベートされる。様々な実施形態では、いずれかの実施形態の、１つ以上のベクターと、ペプチド／ＨＲＰ及びトランスフェクション試薬との混合物は、同時トランスフェクトするステップ前に、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１１分間、１２分間、１３分間、１４分間、１５分間、１６分間、１７分間、１８分間、１９分間、２０分間、２１分間、２２分間、２３分間、２４分間、２５分間、２６分間、２７分間、２８分間、２９分間、３０分間、３１分間、３２分間、３３分間、３４分間、３５分間、３６分間、３７分間、３８分間、３９分間、４０分間、４１分間、４２分間、４３分間、４４分間、４５分間、４６分間、４７分間、４８分間、４９分間、５０分間、５１分間、５２分間、５３分間、５４分間、５５分間、５６分間、５７分間、５８分間、５９分間、６０分間、６１分間、６２分間、６３分間、６４分間、６５分間、６６分間、６７分間、６８分間、６９分間、７０分間、７１分間、７２分間、７３分間、７４分間、７５分間、７６分間、７７分間、７８分間、７９分間、８０分間、８１分間、８２分間、８３分間、８４分間、８５分間、８６分間、８７分間、８８分間、８９分間、９０分間、９１分間、９２分間、９３分間、９４分間、９５分間、９６分間、９７分間、９８分間、９９分間、１００分間、１０１分間、１０２分間、１０３分間、１０４分間、１０５分間、１０６分間、１０７分間、１０８分間、１０９分間、１１０分間、１１１分間、１１２分間、１１３分間、１１４分間、１１５分間、１１６分間、１１７分間、１１８分間、１１９分間、１２０分間、１２０分間、１３０分間、１４０分間、１５０分間、１６０分間、１７０分間、１８０分間、１９０分間、２００分間、２１０分間、２２０分間、２３０分間、２４０分間、２５０分間、２６０分間、２７０分間、２８０分間、２９０分間、３００分間、３１０分間、３２０分間、３３０分間、３４０分間、３５０分間、３６０分間、３７０分間、３８０分間、３９０分間、４００分間、４１０分間、４２０分間、４３０分間、４４０分間、４５０分間、４６０分間、４７０分間、４８０分間、４９０分間、５００分間、５１０分間、５２０分間、５３０分間、５４０分間、５５０分間、５６０分間、５７０分間、５８０分間、５９０分間、６００分間、７００分間、８００分間、９００分間、１０００分間、１５００分間、又は２０００分間インキュベートされる。様々な実施形態では、インキュベーション時間は、上記で提供されるいずれかの２つの時間間の範囲である。

【0079】

ｒＡＡＶ産生方法の様々な実施形態では、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、カチオン性ペプチド／ＨＲＰを使用してトランスフェクトされる細胞の百分率は、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、ポリエチレンイミン又はその誘導体を含むトランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトされる細胞の百分率よりも大きく、カチオン性ペプチド／ＨＲＰ、及びポリエチレンイミン又はその誘導体を含むトランスフェクション試薬は、同時トランスフェクトするステップ前に、１つ以上のベクターと混合され、同じ期間インキュベートされる。様々な実施形態では、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、カチオン性ペプチド／ＨＲＰを使用してトランスフェクトされる細胞の百分率は、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、ポリエチレンイミン又はその誘導体を含むトランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトされる細胞の百分率よりも少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも５０００％、又は少なくとも１００００％大きく、カチオン性ペプチド／ＨＲＰ、及びポリエチレンイミン又はその誘導体を含むトランスフェクション試薬は、同時トランスフェクトするステップ前に、１つ以上のベクターと混合され、同じ期間インキュベートされる。

【0080】

ｒＡＡＶ産生方法の様々な実施形態では、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、カチオン性ペプチド／ＨＲＰを使用してトランスフェクトされる細胞は、トランスフェクション条件が、１つ以上のベクターでトランスフェクトされる細胞の百分率を最大にするために最適化される場合、又は代替として、類似のトランスフェクション条件のうちの同じトランスフェクション条件下の場合、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、ポリエチレンイミン又はその誘導体を含むトランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトされる細胞の比産生性（ベクターゲノム（ｖｇ）／細胞）よりも大きい比産生性を有する。比産生性は、デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）を使用して評価され得、最終力価（ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの収集液）をピーク生存細胞密度（細胞の数／ｍＬ）で除算することによって計算され得る。様々な実施形態では、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、カチオン性ペプチド／ＨＲＰを使用してトランスフェクトされる細胞の比産生性は、トランスフェクション条件が、１つ以上のベクターでトランスフェクトされる細胞の百分率を最大にするために最適化される場合、又は代替として、類似のトランスフェクション条件のうちの同じトランスフェクション条件下の場合、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、ポリエチレンイミン又はその誘導体を含むトランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトされる細胞の比産生性よりも少なくとも少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも５０００％、少なくとも１００００％、少なくとも３ｌｏｇ、少なくとも４ｌｏｇ、又は少なくとも５ｌｏｇ大きい。

【0081】

様々な実施形態では、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、カチオン性ペプチド／ＨＲＰを使用してトランスフェクトされる細胞の比産生性は、少なくとも１×１０^２ベクターゲノム（ｖｇ）／細胞、少なくとも１×１０^３ｖｇ／細胞、少なくとも１×１０^４ｖｇ／細胞、少なくとも１×１０^５ｖｇ／細胞、少なくとも１×１０^６ｖｇ／細胞、又は少なくとも１×１０^７ｖｇ／細胞である。

【0082】

ｒＡＡＶ産生方法の様々な実施形態では、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、カチオン性ペプチド／ＨＲＰを使用してトランスフェクトされる細胞は、細胞培養物量を含むトランスフェクション条件が、１つ以上のベクターでトランスフェクトされる細胞の百分率を最大にするために最適化される場合、又は代替として、類似のトランスフェクション条件のうちの同じトランスフェクション条件下の場合、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、ポリエチレンイミン又はその誘導体を含むトランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトされる細胞のｒＡＡＶ力価よりも大きいｒＡＡＶ力価をもたらす。

【0083】

ｒＡＡＶ産生方法の様々な実施形態では、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、カチオン性ペプチド／ＨＲＰを使用してトランスフェクトされる細胞によってもたらされるｒＡＡＶ力価は、細胞培養物量を含むトランスフェクション条件が、１つ以上のベクターでトランスフェクトされる細胞の百分率を最大にするために最適化される場合、又は代替として、類似のトランスフェクション条件のうちの同じトランスフェクション条件下の場合、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、ポリエチレンイミン又はその誘導体を含むトランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトされる細胞によってもたらされるｒＡＡＶ力価よりも少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも５０００％、少なくとも１００００％、又は少なくとも３ｌｏｇ大きい。

【0084】

ｒＡＡＶ産生方法の様々な実施形態では、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターで、カチオン性ペプチド／ＨＲＰを使用してトランスフェクトされる細胞によってもたらされるｒＡＡＶ力価は、少なくとも０．１×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、少なくとも０．５×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、少なくとも１×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、少なくとも１×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、少なくとも１×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、少なくとも１×１０^１３ｖｇ／ｍＬ、又は少なくとも１×１０^１４ｖｇ／ｍＬである。

【0085】

ｒＡＡＶ産生方法の様々な実施形態では、いずれかの実施形態のｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクター対いずれかの実施形態のカチオン性ペプチド／ＨＲＰ及びトランスフェクション試薬のうちの１つの重量比は、５０：１、４９：１、４８：１、４７：１、４６：１、４５：１、４４：１、４３：１、４２：１、４１：１、４０：１、３９：１、３８：１、３７：１、３６：１、３５：１、３４：１、３３：１、３２：１、３１：１、３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０、１：４１、１：４２、１：４３、１：４４、１：４５、１：４６、１：４７、１：４８、１：４９、又は１：５０である。様々な実施形態では、いずれかの実施形態のｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクター対いずれかの実施形態のカチオン性ペプチド／ＨＲＰ及びトランスフェクション試薬のうちの１つの重量比は、上記で提供されるいずれかの２つの重量比間の範囲である。

【0086】

ｒＡＡＶ産生方法の様々な実施形態では、細胞培養物中のカチオン性ペプチド／ＨＲＰの濃度は、少なくとも０．００１マイクログラム（μｇ）／ｍＬ、少なくとも０．０１μｇ／ｍＬ、少なくとも０．１μｇ／ｍＬ、少なくとも０．５μｇ／ｍＬ、少なくとも１μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１００μｇ／ｍＬ、１～２００μｇ／ｍＬ、５～５０μｇ／ｍＬ、１０～１５０μｇ／ｍＬ、又は１００～２００μｇ／ｍＬである。様々な実施形態では、細胞培養物中のカチオン性ペプチド又はＨＲＰの濃度は、１μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、３．５μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、４．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、５．５μｇ／ｍＬ、６，μｇ／ｍＬ、６．５μｇ／ｍＬ、７μｇ／ｍＬ、７．５μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、８．５μｇ／ｍＬ、９μｇ／ｍＬ、９．５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１０．５μｇ／ｍＬ、１１μｇ／ｍＬ、１１．５μｇ／ｍＬ、１２μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、１３μｇ／ｍＬ、１３．５μｇ／ｍＬ、１４μｇ／ｍＬ、１４．５μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、１５．５μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、１６．５μｇ／ｍＬ、１７μｇ／ｍＬ、１７．５μｇ／ｍＬ、１８μｇ／ｍＬ、１８．５μｇ／ｍＬ、１９μｇ／ｍＬ、１９．５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、２０．５μｇ／ｍＬ、２１μｇ／ｍＬ、２１．５μｇ／ｍＬ、２２μｇ／ｍＬ、２２．５μｇ／ｍＬ、２３μｇ／ｍＬ、２３．５μｇ／ｍＬ、２４μｇ／ｍＬ、２４．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、２６μｇ／ｍＬ、２７μｇ／ｍＬ、２８μｇ／ｍＬ、２９μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、３１μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、３３μｇ／ｍＬ、３４μｇ／ｍＬ、３５μｇ／ｍＬ、３６μｇ／ｍＬ、３７μｇ／ｍＬ、３８μｇ／ｍＬ、３９μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、４１μｇ／ｍＬ、４２μｇ／ｍＬ、４３μｇ／ｍＬ、４４μｇ／ｍＬ、４５μｇ／ｍＬ、４６μｇ／ｍＬ、４７μｇ／ｍＬ、４８μｇ／ｍＬ、４９μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、５１μｇ／ｍＬ、５２μｇ／ｍＬ、５３μｇ／ｍＬ、５４μｇ／ｍＬ、５５μｇ／ｍＬ、５６μｇ／ｍＬ、５７μｇ／ｍＬ、５８μｇ／ｍＬ、５９μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、６１μｇ／ｍＬ、６２μｇ／ｍＬ、６３μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、６５μｇ／ｍＬ、６６μｇ／ｍＬ、６７μｇ／ｍＬ、６８μｇ／ｍＬ、６９μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、７１μｇ／ｍＬ、７２μｇ／ｍＬ、７３μｇ／ｍＬ、７４μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、７６μｇ／ｍＬ、７７μｇ／ｍＬ、７８μｇ／ｍＬ、７９μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、８１μｇ／ｍＬ、８２μｇ／ｍＬ、８３μｇ／ｍＬ、８４μｇ／ｍＬ、８５μｇ／ｍＬ、８６μｇ／ｍＬ、８７μｇ／ｍＬ、８８μｇ／ｍＬ、８９μｇ／ｍＬ、９０μｇ／ｍＬ、９１μｇ／ｍＬ、９２μｇ／ｍＬ、９３μｇ／ｍＬ、９４μｇ／ｍＬ、９５μｇ／ｍＬ、９６μｇ／ｍＬ、９７μｇ／ｍＬ、９８μｇ／ｍＬ、９９μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１０１μｇ／ｍＬ、１０２μｇ／ｍＬ、１０３μｇ／ｍＬ、１０４μｇ／ｍＬ、１０５μｇ／ｍＬ、１０６μｇ／ｍＬ、１０７μｇ／ｍＬ、１０８μｇ／ｍＬ、１０９μｇ／ｍＬ、１１０μｇ／ｍＬ、１１１μｇ／ｍＬ、１１２μｇ／ｍＬ、１１３μｇ／ｍＬ、１１４μｇ／ｍＬ、１１５μｇ／ｍＬ、１１６μｇ／ｍＬ、１１７μｇ／ｍＬ、１１８μｇ／ｍＬ、１１９μｇ／ｍＬ、１２０μｇ／ｍＬ、１２１μｇ／ｍＬ、１２２μｇ／ｍＬ、１２３μｇ／ｍＬ、１２４μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、１２６μｇ／ｍＬ、１２７μｇ／ｍＬ、１２８μｇ／ｍＬ、１２９μｇ／ｍＬ、１３０μｇ／ｍＬ、１３１μｇ／ｍＬ、１３２μｇ／ｍＬ、１３３μｇ／ｍＬ、１３４μｇ／ｍＬ、１３５μｇ／ｍＬ、１３６μｇ／ｍＬ、１３７μｇ／ｍＬ、１３８μｇ／ｍＬ、１３９μｇ／ｍＬ、１４０μｇ／ｍＬ、１４１μｇ／ｍＬ、１４２μｇ／ｍＬ、１４３μｇ／ｍＬ、１４４μｇ／ｍＬ、１４５μｇ／ｍＬ、１４６μｇ／ｍＬ、１４７μｇ／ｍＬ、１４８μｇ／ｍＬ、１４９μｇ／ｍＬ、１５０μｇ／ｍＬ、１５１μｇ／ｍＬ、１５２μｇ／ｍＬ、１５３μｇ／ｍＬ、１５４μｇ／ｍＬ、１５５μｇ／ｍＬ、１５６μｇ／ｍＬ、１５７μｇ／ｍＬ、１５８μｇ／ｍＬ、１５９μｇ／ｍＬ、１６０μｇ／ｍＬ、１６１μｇ／ｍＬ、１６２μｇ／ｍＬ、１６３μｇ／ｍＬ、１６４μｇ／ｍＬ、１６５μｇ／ｍＬ、１６６μｇ／ｍＬ、１６７μｇ／ｍＬ、１６８μｇ／ｍＬ、１６９μｇ／ｍＬ、１７０μｇ／ｍＬ、１７１μｇ／ｍＬ、１７２μｇ／ｍＬ、１７３μｇ／ｍＬ、１７４μｇ／ｍＬ、１７５μｇ／ｍＬ、１７６μｇ／ｍＬ、１７７μｇ／ｍＬ、１７８μｇ／ｍＬ、１７９μｇ／ｍＬ、１８０μｇ／ｍＬ、１８１μｇ／ｍＬ、１８２μｇ／ｍＬ、１８３μｇ／ｍＬ、１８４μｇ／ｍＬ、１８５μｇ／ｍＬ、１８６μｇ／ｍＬ、１８７μｇ／ｍＬ、１８８μｇ／ｍＬ、１８９μｇ／ｍＬ、１９０μｇ／ｍＬ、１９１μｇ／ｍＬ、１９２μｇ／ｍＬ、１９３μｇ／ｍＬ、１９４μｇ／ｍＬ、１９５μｇ／ｍＬ、１９６μｇ／ｍＬ、１９７μｇ／ｍＬ、１９８μｇ／ｍＬ、１９９μｇ／ｍＬ、又は２００μｇ／ｍＬである。様々な実施形態では、細胞培養物中のカチオン性ペプチド／ＨＲＰの濃度は、上記で提供されるいずれかの２つの濃度間の範囲である。

【0087】

ｒＡＡＶ産生方法の様々な実施形態では、細胞培養物中のｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターの濃度は、少なくとも０．０００１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．００１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．０１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１，μｇ／ｍｌ、０．１～１５μｇ／ｍｌ、又は０．５～２００μｇ／ｍｌである。様々な実施形態では、細胞培養物中のｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターの濃度は、０．０００１μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、３．５μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、４．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、５．５μｇ／ｍｌ、６，μｇ／ｍｌ、６．５μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、８．５μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、９．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１０．５μｇ／ｍｌ、１１μｇ／ｍｌ、１１．５μｇ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、１３μｇ／ｍｌ、１３．５μｇ／ｍｌ、１４μｇ／ｍｌ、１４．５μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、１５．５μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、１６．５μｇ／ｍｌ、１７μｇ／ｍｌ、１７．５μｇ／ｍｌ、１８μｇ／ｍｌ、１８．５μｇ／ｍｌ、１９μｇ／ｍｌ、１９．５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２０．５μｇ／ｍｌ、２１μｇ／ｍｌ、２１．５μｇ／ｍｌ、２２μｇ／ｍｌ、２２．５μｇ／ｍｌ、２３μｇ／ｍｌ、２３．５μｇ／ｍｌ、２４μｇ／ｍｌ、２４．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、２６μｇ／ｍＬ、２７μｇ／ｍＬ、２８μｇ／ｍＬ、２９μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、３１μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、３３μｇ／ｍＬ、３４μｇ／ｍＬ、３５μｇ／ｍＬ、３６μｇ／ｍＬ、３７μｇ／ｍＬ、３８μｇ／ｍＬ、３９μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、４１μｇ／ｍＬ、４２μｇ／ｍＬ、４３μｇ／ｍＬ、４４μｇ／ｍＬ、４５μｇ／ｍＬ、４６μｇ／ｍＬ、４７μｇ／ｍＬ、４８μｇ／ｍＬ、４９μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、５１μｇ／ｍＬ、５２μｇ／ｍＬ、５３μｇ／ｍＬ、５４μｇ／ｍＬ、５５μｇ／ｍＬ、５６μｇ／ｍＬ、５７μｇ／ｍＬ、５８μｇ／ｍＬ、５９μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、６１μｇ／ｍＬ、６２μｇ／ｍＬ、６３μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、６５μｇ／ｍＬ、６６μｇ／ｍＬ、６７μｇ／ｍＬ、６８μｇ／ｍＬ、６９μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、７１μｇ／ｍＬ、７２μｇ／ｍＬ、７３μｇ／ｍＬ、７４μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、７６μｇ／ｍＬ、７７μｇ／ｍＬ、７８μｇ／ｍＬ、７９μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、８１μｇ／ｍＬ、８２μｇ／ｍＬ、８３μｇ／ｍＬ、８４μｇ／ｍＬ、８５μｇ／ｍＬ、８６μｇ／ｍＬ、８７μｇ／ｍＬ、８８μｇ／ｍＬ、８９μｇ／ｍＬ、９０μｇ／ｍＬ、９１μｇ／ｍＬ、９２μｇ／ｍＬ、９３μｇ／ｍＬ、９４μｇ／ｍＬ、９５μｇ／ｍＬ、９６μｇ／ｍＬ、９７μｇ／ｍＬ、９８μｇ／ｍＬ、９９μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１０１μｇ／ｍＬ、１０２μｇ／ｍＬ、１０３μｇ／ｍＬ、１０４μｇ／ｍＬ、１０５μｇ／ｍＬ、１０６μｇ／ｍＬ、１０７μｇ／ｍＬ、１０８μｇ／ｍＬ、１０９μｇ／ｍＬ、１１０μｇ／ｍＬ、１１１μｇ／ｍＬ、１１２μｇ／ｍＬ、１１３μｇ／ｍＬ、１１４μｇ／ｍＬ、１１５μｇ／ｍＬ、１１６μｇ／ｍＬ、１１７μｇ／ｍＬ、１１８μｇ／ｍＬ、１１９μｇ／ｍＬ、１２０μｇ／ｍＬ、１２１μｇ／ｍＬ、１２２μｇ／ｍＬ、１２３μｇ／ｍＬ、１２４μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、１２６μｇ／ｍＬ、１２７μｇ／ｍＬ、１２８μｇ／ｍＬ、１２９μｇ／ｍＬ、１３０μｇ／ｍＬ、１３１μｇ／ｍＬ、１３２μｇ／ｍＬ、１３３μｇ／ｍＬ、１３４μｇ／ｍＬ、１３５μｇ／ｍＬ、１３６μｇ／ｍＬ、１３７μｇ／ｍＬ、１３８μｇ／ｍＬ、１３９μｇ／ｍＬ、１４０μｇ／ｍＬ、１４１μｇ／ｍＬ、１４２μｇ／ｍＬ、１４３μｇ／ｍＬ、１４４μｇ／ｍＬ、１４５μｇ／ｍＬ、１４６μｇ／ｍＬ、１４７μｇ／ｍＬ、１４８μｇ／ｍＬ、１４９μｇ／ｍＬ、１５０μｇ／ｍＬ、１５１μｇ／ｍＬ、１５２μｇ／ｍＬ、１５３μｇ／ｍＬ、１５４μｇ／ｍＬ、１５５μｇ／ｍＬ、１５６μｇ／ｍＬ、１５７μｇ／ｍＬ、１５８μｇ／ｍＬ、１５９μｇ／ｍＬ、１６０μｇ／ｍＬ、１６１μｇ／ｍＬ、１６２μｇ／ｍＬ、１６３μｇ／ｍＬ、１６４μｇ／ｍＬ、１６５μｇ／ｍＬ、１６６μｇ／ｍＬ、１６７μｇ／ｍＬ、１６８μｇ／ｍＬ、１６９μｇ／ｍＬ、１７０μｇ／ｍＬ、１７１μｇ／ｍＬ、１７２μｇ／ｍＬ、１７３μｇ／ｍＬ、１７４μｇ／ｍＬ、１７５μｇ／ｍＬ、１７６μｇ／ｍＬ、１７７μｇ／ｍＬ、１７８μｇ／ｍＬ、１７９μｇ／ｍＬ、１８０μｇ／ｍＬ、１８１μｇ／ｍＬ、１８２μｇ／ｍＬ、１８３μｇ／ｍＬ、１８４μｇ／ｍＬ、１８５μｇ／ｍＬ、１８６μｇ／ｍＬ、１８７μｇ／ｍＬ、１８８μｇ／ｍＬ、１８９μｇ／ｍＬ、１９０μｇ／ｍＬ、１９１μｇ／ｍＬ、１９２μｇ／ｍＬ、１９３μｇ／ｍＬ、１９４μｇ／ｍＬ、１９５μｇ／ｍＬ、１９６μｇ／ｍＬ、１９７μｇ／ｍＬ、１９８μｇ／ｍＬ、１９９μｇ／ｍＬ、又は２００μｇ／ｍＬである。様々な実施形態では、細胞培養物中のｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターの濃度は、上記で提供されるいずれかの２つの濃度間の範囲である。

【0088】

ｒＡＡＶ産生方法の様々な実施形態では、いずれかの実施形態のｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターは、ＡＡＶゲノムベクター、ＡＡＶヘルパーベクター、及び非ＡＡＶヘルパー機能を提供するヌクレオチドを有するベクターを含む。ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターの例としては、プラスミド又はコスミドの形態のヌクレオチド配列であって、細胞内にトランスフェクトされたときに、Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質を発現し、ＡＡＶゲノムベクターの生成を提供し、ｒＡＡＶを生成するためのウイルスヘルパー機能（例えば、転写因子など）を提供する、ヌクレオチド配列が挙げられる。

【0089】

ｒＡＡＶ産生方法及び細胞生成方法の様々な実施形態では、細胞は、哺乳類細胞などの真核細胞である。哺乳類細胞の例としては、ヒト細胞が挙げられる。哺乳類細胞の他の例としては、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＢＨＫ、ＨＴ １０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ－７、ＡＲＰＥ－１９、又はＭＲＣ－５細胞が挙げられる。

【0090】

ｒＢＶ産生方法の様々な実施形態では、いずれかの実施形態の組換えバクミド及びいずれかの実施形態のカチオン性ペプチド／ＨＲＰは、トランスフェクトするステップ前に、一緒に混合される。

【0091】

ｒＢＶ産生方法の様々な実施形態では、回収ステップは、バキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を回収することを含む。ｒＢＶ産生方法の様々な実施形態では、回収ステップは、ＢＩＩＣを回収することを含み、回収されたＢＩＩＣは、バキュロウイルスに以前に感染していない培養されている細胞とともに培養されて、ｒＡＡＶを生成する。

【0092】

ｒＢＶ産生方法及び細胞生成方法の様々な実施形態では、細胞は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ、Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ａｓｃａｌａｐｈａ ｏｄｏｒａｔａ、Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ、Ａｎｏｐｈｅｌｅ、Ｃｕｌｅｘ、又はＡｅｄｅｓに由来する昆虫細胞である。昆虫細胞の例としては、Ｓｆ９、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４、ＭＧ－１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、ＢＭ－Ｎ、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、又はＡｏ３８細胞が挙げられる。

【0093】

ｒＡＡＶ又はｒＢＶ産生方法の様々な実施形態では、細胞培養物は、振盪フラスコ又はバイオリアクター内で、少なくとも１ｍＬ、少なくとも１０ｍＬ、少なくとも２０ｍＬ、少なくとも５０ｍＬ、少なくとも１００ｍＬ、少なくとも５００ｍＬ、少なくとも１リットル（Ｌ）、少なくとも１０Ｌ、少なくとも５０Ｌ、少なくとも１００Ｌ、少なくとも２５０Ｌ、少なくとも５００Ｌ、少なくとも１０００Ｌ、少なくとも１５００Ｌ、少なくとも２０００Ｌ、又は少なくとも２５００Ｌの量で産生される。様々な実施形態では、細胞培養物量は、１ｍＬ、１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、６０ｍＬ、７０ｍＬ、８０ｍＬ、９０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、３００ｍＬ、４００ｍＬ、５００ｍＬ、６００ｍＬ、７００ｍＬ、８００ｍＬ、９００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、４Ｌ、５Ｌ、６Ｌ、７Ｌ、８Ｌ、９Ｌ、１０Ｌ、１１Ｌ、１２Ｌ、１３Ｌ、１４Ｌ、１５Ｌ、１６Ｌ、１７Ｌ、１８Ｌ、１９Ｌ、２０Ｌ、２１Ｌ、２２Ｌ、２３Ｌ、２４Ｌ、２５Ｌ、２６Ｌ、２７Ｌ、２８Ｌ、２９Ｌ、３０Ｌ、３１Ｌ、３２Ｌ、３３Ｌ、３４Ｌ、３５Ｌ、３６Ｌ、３７Ｌ、３８Ｌ、３９Ｌ、４０Ｌ、４１Ｌ、４２Ｌ、４３Ｌ、４４Ｌ、４５Ｌ、４６Ｌ、４７Ｌ、４８Ｌ、４９Ｌ、５０Ｌ、５１Ｌ、５２Ｌ、５３Ｌ、５４Ｌ、５５Ｌ、５６Ｌ、５７Ｌ、５８Ｌ、５９Ｌ、６０Ｌ、６１Ｌ、６２Ｌ、６３Ｌ、６４Ｌ、６５Ｌ、６６Ｌ、６７Ｌ、６８Ｌ、６９Ｌ、７０Ｌ、７１Ｌ、７２Ｌ、７３Ｌ、７４Ｌ、７５Ｌ、７６Ｌ、７７Ｌ、７８Ｌ、７９Ｌ、８０Ｌ、８１Ｌ、８２Ｌ、８３Ｌ、８４Ｌ、８５Ｌ、８６Ｌ、８７Ｌ、８８Ｌ、８９Ｌ、９０Ｌ、９１Ｌ、９２Ｌ、９３Ｌ、９４Ｌ、９５Ｌ、９６Ｌ、９７Ｌ、９８Ｌ、９９Ｌ、１００Ｌ、１１０Ｌ、１２０Ｌ、１３０Ｌ、１４０Ｌ、１５０Ｌ、１６０Ｌ、１７０Ｌ、１８０Ｌ、１９０Ｌ、２００Ｌ、２１０Ｌ、２２０Ｌ、２３０Ｌ、２４０Ｌ、２５０Ｌ、２６０Ｌ、２７０Ｌ、２８０Ｌ、２９０Ｌ、３００Ｌ、３１０Ｌ、３２０Ｌ、３３０Ｌ、３４０Ｌ、３５０Ｌ、３６０Ｌ、３７０Ｌ、３８０Ｌ、３９０Ｌ、４００Ｌ、４１０Ｌ、４２０Ｌ、４３０Ｌ、４４０Ｌ、４５０Ｌ、４６０Ｌ、４７０Ｌ、４８０Ｌ、４９０Ｌ、５００Ｌ、５１０Ｌ、５２０Ｌ、５３０Ｌ、５４０Ｌ、５５０Ｌ、５６０Ｌ、５７０Ｌ、５８０Ｌ、５９０Ｌ、６００Ｌ、６１０Ｌ、６２０Ｌ、６３０Ｌ、６４０Ｌ、６５０Ｌ、６６０Ｌ、６７０Ｌ、６８０Ｌ、６９０Ｌ、７００Ｌ、７１０Ｌ、７２０Ｌ、７３０Ｌ、７４０Ｌ、７５０Ｌ、７６０Ｌ、７７０Ｌ、７８０Ｌ、７９０Ｌ、８００Ｌ、８１０Ｌ、８２０Ｌ、８３０Ｌ、８４０Ｌ、８５０Ｌ、８６０Ｌ、８７０Ｌ、８８０Ｌ、８９０Ｌ、９００Ｌ、９１０Ｌ、９２０Ｌ、９３０Ｌ、９４０Ｌ、９５０Ｌ、９６０Ｌ、９７０Ｌ、９８０Ｌ、９９０Ｌ、１０００Ｌ、１０１０Ｌ、１０２０Ｌ、１０３０Ｌ、１０４０Ｌ、１０５０Ｌ、１０６０Ｌ、１０７０Ｌ、１０８０Ｌ、１０９０Ｌ、１１００Ｌ、１１１０Ｌ、１１２０Ｌ、１１３０Ｌ、１１４０Ｌ、１１５０Ｌ、１１６０Ｌ、１１７０Ｌ、１１８０Ｌ、１１９０Ｌ、１２００Ｌ、１２１０Ｌ、１２２０Ｌ、１２３０Ｌ、１２４０Ｌ、１２５０Ｌ、１２６０Ｌ、１２７０Ｌ、１２８０Ｌ、１２９０Ｌ、１３００Ｌ、１３１０Ｌ、１３２０Ｌ、１３３０Ｌ、１３４０Ｌ、１３５０Ｌ、１３６０Ｌ、１３７０Ｌ、１３８０Ｌ、１３９０Ｌ、１４００Ｌ、１４１０Ｌ、１４２０Ｌ、１４３０Ｌ、１４４０Ｌ、１４５０Ｌ、１４６０Ｌ、１４７０Ｌ、１４８０Ｌ、１４９０Ｌ、１５００Ｌ、１５１０Ｌ、１５２０Ｌ、１５３０Ｌ、１５４０Ｌ、１５５０Ｌ、１５６０Ｌ、１５７０Ｌ、１５８０Ｌ、１５９０Ｌ、１６００Ｌ、１６１０Ｌ、１６２０Ｌ、１６３０Ｌ、１６４０Ｌ、１６５０Ｌ、１６６０Ｌ、１６７０Ｌ、１６８０Ｌ、１６９０Ｌ、１７００Ｌ、１７１０Ｌ、１７２０Ｌ、１７３０Ｌ、１７４０Ｌ、１７５０Ｌ、１７６０Ｌ、１７７０Ｌ、１７８０Ｌ、１７９０Ｌ、１８００Ｌ、１８１０Ｌ、１８２０Ｌ、１８３０Ｌ、１８４０Ｌ、１８５０Ｌ、１８６０Ｌ、１８７０Ｌ、１８８０Ｌ、１８９０Ｌ、１９００Ｌ、１９１０Ｌ、１９２０Ｌ、１９３０Ｌ、１９４０Ｌ、１９５０Ｌ、１９６０Ｌ、１９７０Ｌ、１９８０Ｌ、１９９０Ｌ、２０００Ｌ、２０１０Ｌ、２０２０Ｌ、２０３０Ｌ、２０４０Ｌ、２０５０Ｌ、２０６０Ｌ、２０７０Ｌ、２０８０Ｌ、２０９０Ｌ、２１００Ｌ、２１１０Ｌ、２１２０Ｌ、２１３０Ｌ、２１４０Ｌ、２１５０Ｌ、２１６０Ｌ、２１７０Ｌ、２１８０Ｌ、２１９０Ｌ、２２００Ｌ、２２１０Ｌ、２２２０Ｌ、２２３０Ｌ、２２４０Ｌ、２２５０Ｌ、２２６０Ｌ、２２７０Ｌ、２２８０Ｌ、２２９０Ｌ、２３００Ｌ、２３１０Ｌ、２３２０Ｌ、２３３０Ｌ、２３４０Ｌ、２３５０Ｌ、２３６０Ｌ、２３７０Ｌ、２３８０Ｌ、２３９０Ｌ、２４００Ｌ、２４１０Ｌ、２４２０Ｌ、２４３０Ｌ、２４４０Ｌ、２４５０Ｌ、２４６０Ｌ、２４７０Ｌ、２４８０Ｌ、２４９０Ｌ、２５００Ｌ、２５１０Ｌ、２５２０Ｌ、２５３０Ｌ、２５４０Ｌ、２５５０Ｌ、２５６０Ｌ、２５７０Ｌ、２５８０Ｌ、２５９０Ｌ、２６００Ｌ、２６１０Ｌ、２６２０Ｌ、２６３０Ｌ、２６４０Ｌ、２６５０Ｌ、２６６０Ｌ、２６７０Ｌ、２６８０Ｌ、２６９０Ｌ、２７００Ｌ、２７１０Ｌ、２７２０Ｌ、２７３０Ｌ、２７４０Ｌ、２７５０Ｌ、２７６０Ｌ、２７７０Ｌ、２７８０Ｌ、２７９０Ｌ、２８００Ｌ、２８１０Ｌ、２８２０Ｌ、２８３０Ｌ、２８４０Ｌ、２８５０Ｌ、２８６０Ｌ、２８７０Ｌ、２８８０Ｌ、２８９０Ｌ、２９００Ｌ、２９１０Ｌ、２９２０Ｌ、２９３０Ｌ、２９４０Ｌ、２９５０Ｌ、２９６０Ｌ、２９７０Ｌ、２９８０Ｌ、２９９０Ｌ、又は３０００Ｌである。更なる実施形態では、培養物量は、上記で提供されるいずれかの２つの量間の範囲である。

【0094】

様々な実施形態では、完全又は部分的なバキュロウイルスゲノムは、環状又は直鎖状バキュロウイルスゲノムであり、環状又は直鎖状バキュロウイルスゲノムは、異種配列との組換えの際に、ｒＢＶを生成することが可能である。一実施形態では、方法は、１つ以上の相同領域を保有する異種配列との組換えの頻度が低いため、環状バキュロウイルスゲノムを使用する。別の実施形態では、方法は、直鎖状バキュロウイルスゲノムを使用し、直鎖状バキュロウイルスゲノムは、非組換えバキュロウイルスの生成を減少させ、当該異種配列との組換えの頻度を増加させ、それによって、組換えバキュロウイルスを生成する確率を向上させる。更なる実施形態では、方法は、１つ以上の必須バキュロウイルス遺伝子又はそれらの部分を欠く直鎖状バキュロウイルスゲノムを使用し、それによって、非組換えバキュロウイルスの生成を防止する。必須遺伝子の相補性は、当該異種配列との組換え及びバキュロウイルスゲノムの環状化の際に発生して、高い頻度での組換えバキュロウイルスの生成を確実にする。

【0095】

様々な実施形態では、ｒＡＡＶゲノムベクターを提供する又はＲｅｐタンパク質若しくはＣａｐタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列であって、バキュロウイルスゲノムに相同な１つ以上の領域を保有する、異種ヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列は、直鎖又は環状形態で存在するか、又はトランスファーベクター内に組み込まれる。

【0096】

様々な実施形態では、細胞内への、完全又は部分的なバキュロウイルスゲノム、及びｒＡＡＶゲノムベクターを提供する又はＲｅｐタンパク質若しくはＣａｐタンパク質をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列であって、バキュロウイルスゲノムに相同な１つ以上の領域を保有する、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列の同時トランスフェクションは、完全又は部分的なバキュロウイルスゲノムへの、ＡＡＶゲノムベクターを提供する又はＲｅｐタンパク質若しくはＣａｐタンパク質をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド又はヌクレオチド配列の相同組換えをもたらす。

【0097】

様々な実施形態では、細胞内への、完全又は部分的なバキュロウイルスゲノム、及びｒＡＡＶゲノムベクターを提供する又はＲｅｐタンパク質若しくはＣａｐタンパク質をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列であって、バキュロウイルスゲノムに相同な１つ以上の領域を保有する、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列の同時トランスフェクションは、環状化組換えバキュロウイルスゲノムが形成されるような、完全又は部分的な直鎖状バキュロウイルスゲノムの末端と、ＡＡＶゲノムベクターを提供する又はＲｅｐタンパク質若しくはＣａｐタンパク質をコードする少なくとも１つの当該異種ヌクレオチド又はヌクレオチド配列との相同組換えをもたらす。

【0098】

細胞生成方法の様々な実施形態では、ベクターは、発現制御エレメントを含み、発現制御エレメントは、ｒＡＡＶを産生するためのエレメントの発現を制御するように、ヌクレオチドに作動可能に連結されている。

【0099】

細胞生成方法の様々な実施形態では、ベクターは、選択エレメントをコードするヌクレオチドを含む。方法は、単離ステップ前に、選択エレメント（例えば、抗生物質耐性タンパク質）に特異的な選択圧力（例えば、抗生物質）を適用するステップを含む。代替として、方法は、単離ステップ前に、選択エレメント（例えば、蛍光タンパク質）を特定する（例えば、蛍光波長を細胞にフローサイトメトリーを介して放射する）ステップを含む。

【0100】

細胞生成方法の様々な実施形態では、ｒＡＡＶを産生するためのエレメントは、ＡＡＶヘルパー機能を提供するエレメント又はＡＡＶ非ヘルパー機能を提供するエレメントである。

【0101】

様々な実施形態では、いずれかの実施形態のカチオン性ペプチド／ＨＲＰの少なくとも一部分は、トランスフェクション中に、αヘリカルコンフォメーションを有し、αヘリカルコンフォメーションは、コンフォメーションの一方の側に位置する疎水性アミノ酸残基、及びコンフォメーションの反対の側に位置する極性アミノ酸残基を含む。例えば、直鎖カチオン性ペプチド／ＨＲＰは、細胞膜の存在下のときに、αヘリカルコンフォメーションを形成することができる。

【0102】

様々な実施形態では、極性アミノ酸残基は、ヒスチジン残基（Ｈｉｓ又はＨ）を含む。極性アミノ酸残基の他の例としては、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、及びシステイン（Ｃｙｓ又はＣ）が挙げられる。

【0103】

様々な実施形態では、疎水性アミノ酸残基は、アラニン残基（Ａｌａ又はＡ）又はロイシン残基（Ｌｅｕ又はＬ）を含む。疎水性アミノ酸残基の他の例としては、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、又はグリシン（Ｇｌｙ又はＧ）が挙げられる。

【0104】

様々な実施形態では、いずれかの実施形態のカチオン性ペプチド／ＨＲＰは、正電荷を中性ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）で有するアミノ酸残基、例えば、リジン又はアルギニン残基を有するＮ末端又はＣ末端部分を有する。例えば、正電荷を有するアミノ酸は、カチオン性ペプチド／ＨＲＰのＮ末端又はＣ末端において位置することができる。

【0105】

様々な実施形態では、いずれかの実施形態のカチオン性ペプチド／ＨＲＰは、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）又はトリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）を含む。

【0106】

様々な実施形態では、いずれかの実施形態のカチオン性ペプチド／ＨＲＰは、少なくとも５つのアミノ酸残基、少なくとも１０個のアミノ酸残基、少なくとも１５個のアミノ酸残基、少なくとも１９個のアミノ酸残基、少なくとも２０個のアミノ酸残基、少なくとも２１個のアミノ酸残基、少なくとも２５個のアミノ酸残基、少なくとも３０個のアミノ酸残基、少なくとも３５個のアミノ酸残基、少なくとも４０個のアミノ酸残基、少なくとも４５個のアミノ酸残基、又は少なくとも５０個のアミノ酸残基を含む。様々な実施形態では、カチオン性ペプチド／ＨＲＰの長さは、１０個のアミノ酸残基、１１個のアミノ酸残基、１２個のアミノ酸残基、１３個のアミノ酸残基、１４個のアミノ酸残基、１５個のアミノ酸残基、１６個のアミノ酸残基、１７個のアミノ酸残基、１８個のアミノ酸残基、１９個のアミノ酸残基、２０個のアミノ酸残基、２１個のアミノ酸残基、２２個のアミノ酸残基、２３個のアミノ酸残基、２４個のアミノ酸残基、２５個のアミノ酸残基、２６個のアミノ酸残基、２７個のアミノ酸残基、２８個のアミノ酸残基、２９個のアミノ酸残基、３０個のアミノ酸残基、３１個のアミノ酸残基、３２個のアミノ酸残基、３３個のアミノ酸残基、３４個のアミノ酸残基、３５個のアミノ酸残基、３６個のアミノ酸残基、３７個のアミノ酸残基、３８個のアミノ酸残基、３９個のアミノ酸残基、４０個のアミノ酸残基、４１個のアミノ酸残基、４２個のアミノ酸残基、４３個のアミノ酸残基、４４個のアミノ酸残基、４５個のアミノ酸残基、４６個のアミノ酸残基、４７個のアミノ酸残基、４８個のアミノ酸残基、４９個のアミノ酸残基、５０個のアミノ酸残基、５１個のアミノ酸残基、５２個のアミノ酸残基、５３個のアミノ酸残基、５４個のアミノ酸残基、５５個のアミノ酸残基、５６個のアミノ酸残基、５７個のアミノ酸残基、５８個のアミノ酸残基、５９個のアミノ酸残基、６０個のアミノ酸残基、６１個のアミノ酸残基、６２個のアミノ酸残基、６３個のアミノ酸残基、６４個のアミノ酸残基、６５個のアミノ酸残基、６６個のアミノ酸残基、６７個のアミノ酸残基、６８個のアミノ酸残基、６９個のアミノ酸残基、７０個のアミノ酸残基、７１個のアミノ酸残基、７２個のアミノ酸残基、７３個のアミノ酸残基、７４個のアミノ酸残基、７５個のアミノ酸残基、７６個のアミノ酸残基、７７個のアミノ酸残基、７８個のアミノ酸残基、７９個のアミノ酸残基、８０個のアミノ酸残基、８１個のアミノ酸残基、８２個のアミノ酸残基、８３個のアミノ酸残基、８４個のアミノ酸残基、８５個のアミノ酸残基、８６個のアミノ酸残基、８７個のアミノ酸残基、８８個のアミノ酸残基、８９個のアミノ酸残基、９０個のアミノ酸残基、９１個のアミノ酸残基、９２個のアミノ酸残基、９３個のアミノ酸残基、９４個のアミノ酸残基、９５個のアミノ酸残基、９６個のアミノ酸残基、９７個のアミノ酸残基、９８個のアミノ酸残基、９９個のアミノ酸残基、又は１００個のアミノ酸残基である。様々な実施形態では、カチオン性ペプチド／ＨＲＰの長さは、上記で提供されるいずれかの２つの長さ間の範囲である。

【0107】

様々な実施形態では、いずれかの実施形態のカチオン性ペプチド／ＨＲＰ／トランスフェクション試薬は、適正製造基準に従って調製される。

【0108】

様々な実施形態では、いずれかの実施形態の、カチオン性ペプチド／ＨＲＰ及びトランスフェクション試薬は、生分解性である。「生分解性」という用語は、細胞培養物に付加され、細胞培養物の生理学的環境に曝露されると、化学プロセス（ｐＨ、加水分解、酵素作用）及び／又は物理プロセスによって分解又は侵食され得る材料を指す。このプロセスの動態は、数分から数日かかり得る。

【0109】

アデノ随伴ウイルス

【0110】

様々な実施形態では、いずれかの実施形態の方法によって産生されるｒＡＡＶキャプシドが開示される。ｒＡＡＶキャプシドは、同じ条件下で産生されるｒＡＡＶキャプシドのＶＰ１、ＶＰ２、又はＶＰ３タンパク質の濃度よりも大きい、ＶＰ１、ＶＰ２、又はＶＰ３タンパク質の濃度を有する。

【0111】

様々な実施形態では、いずれかの実施形態の方法によって産生されるｒＡＡＶキャプシドが開示される。

【0112】

ｒＡＡＶ及びｒＡＡＶキャプシドは、例えば、ＵＳ９，５０４，７６２、ＷＯ２０１８／０２２６０８、ＷＯ２０１９／２２２１３６、及びＵＳ２０１９／０３７６０８１に教示されているように（これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に援用される）、既知の方法に開示されているｒＡＡＶ粒子を含むか、又はそれに従って作製され得る。

【0113】

「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの標準的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、一本鎖ＤＮＡパルボウイルスであり、キャプシドによって封入されたゲノムを有する。現在、特徴付けられているＡＡＶの血清型には１３種類がある。ＡＡＶの一般的な情報及び概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で見出され得る。しかしながら、様々な血清型が、遺伝子レベルにおいても、構造的及び機能的の両方で非常に密接に関連していることが周知であるため、これらの同じ原理が、追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．、及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１ （１９７４）を参照されたい）。例えば、全てのＡＡＶ血清型が、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明白に示し、全てが、３つの関連するキャプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った遺伝子型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、及び「逆位末端反復」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにするヘテロ二本鎖分析によって更に示唆される。類似の感染性パターンは、各血清型における複製機能が類似の調節制御下にあることも示唆する。

【0114】

本明細書で使用される「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質及びキャプシド化ＡＡＶゲノムからなる感染性ウイルス粒子を指す。「組換えＡＡＶ」、又は「ｒＡＡＶ」、「ｒＡＡＶビリオン」、又は「ｒＡＡＶウイルス粒子」、又は「ｒＡＡＶベクター粒子」は、本明細書に記載される少なくとも１つのキャプシド又はＣａｐタンパク質及びキャプシド化ＡＡＶベクターゲノムから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に送達される導入遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には、「ｒＡＡＶベクター粒子」又は単に「ｒＡＡＶベクター」と称される。したがって、かかるベクターがｒＡＡＶベクター粒子内に含有されるため、ＡＡＶベクター粒子の産生には、必然的にｒＡＡＶベクターの産生が含まれる。

【0115】

本明細書中で使用される場合、「異種遺伝子」、「異種配列」、「異種」、「異種調節配列」、「異種導入遺伝子」、又は「導入遺伝子」という用語は、参照される遺伝子又は調節配列が、天然にはＡＡＶベクター又は粒子中に存在せず、その中に人工的に導入されていることを意味する。例えば、これらの用語は、異種遺伝子と、宿主細胞でその遺伝子の発現を制御する異種遺伝子に作動可能に連結された異種調節配列との両方を含む核酸を指す。本明細書における導入遺伝子は、タンパク質（例えば、酵素）、ポリペプチド、ペプチド、ＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡ）、遺伝子又は塩基編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システム）のうちの１つ以上のコンポーネント、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）媒介性エクソンスキッピング、ナンセンス媒介性分解（ＮＭＤ）を誘発する毒エクソン、又はドミナントネガティブ変異体などの生体分子（例えば、治療用生体分子）をコードできることが企図される。

【0116】

「組換え」という用語は、組換えＤＮＡ技術を使用することによって形成される核酸分子又はタンパク質を指す。例えば、組換え核酸分子は、核酸配列及び配列エレメントを組み合わせることによって形成することができる。組換えタンパク質は、組換え核酸分子を受容した細胞によって産生されるタンパク質であり得る。

【0117】

「コードする（ｅｎｃｏｄｅｓ）」、「コードされた（ｅｎｃｏｄｅｄ）」、及び「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」という用語は、遺伝子、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの核酸分子におけるヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指し、生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のための鋳型として機能する。したがって、遺伝子は、その遺伝子によって産生されるｍＲＮＡの転写及び翻訳が、細胞又は他の生物学的システムにおいてタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖との両方は、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードしていると呼ぶことができる。

【0118】

「キャプシド」は、ｒＡＡＶベクターゲノムがパッケージングされている構造を指す。キャプシドは、ＶＰ１タンパク質又はＶＰ３タンパク質を含むが、より典型的には、天然ＡＡＶに見られるように、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質の３つ全てを含む。キャプシドタンパク質の配列によって、ｒＡＡＶビリオンの血清型が決まる。ｒＡＡＶビリオンには、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ１０）、ＡＡＶ－ＤＪ（ＡＡＶＤＪ）、ＡＡＶ－ＤＪ８（ＡＡＶＤＪ８）、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－２Ｇ９、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ変異体、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－２－プレｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶ ＳＭ１０－２、ＡＡＶシャフル１００－１、ＡＡＶシャフル１００－３、ＡＡＶシャフル１００－７、ＡＡＶシャフル１０－２、ＡＡＶシャフル１０－６、ＡＡＶシャフル１０－８、ＡＡＶシャフル１００－２、ＡＡＶ ＳＭ１０－１、ＡＡＶ ＳＭ１０－８、ＡＡＶ ＳＭ１００－３、ＡＡＶ ＳＭ１００－１０、ＢＮＰ６１ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、トゥルータイプＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ１０、若しくは日本ＡＡＶ１０血清型、ＡＡＶ＿ｐｏ．６、ＡＡＶ＿ｐｏ．、ＡＡＶ＿ｐｏ．５、ＡＡＶ＿ＬＫ０３、ＡＡＶ＿ｒａ．１、ＡＡＶ＿ｂａｔ＿ＹＮＭ、ＡＡＶ＿ｂａｔ＿Ｂｒａｚｉｌ、ＡＡＶ＿ｍｏ．１、ＡＡＶ＿トリ＿ＤＡ－１、若しくはＡＡＶ＿マウス＿ＮＹ１、Ｂｂａ２１、Ｂｂａ２６、Ｂｂａ２７、Ｂｂａ２９、Ｂｂａ３０、Ｂｂａ３１、Ｂｂａ３２、Ｂｂａ３３、Ｂｂａ３４、Ｂｂａ３５、Ｂｂａ３６、Ｂｂａ３７、Ｂｂａ３８、Ｂｂａ４１、Ｂｂａ４２、Ｂｂａ４３、Ｂｂａ４４、Ｂｃｅ１４、Ｂｃｅ１５、Ｂｃｅ１６、Ｂｃｅ１７、Ｂｃｅ１８、Ｂｃｅ２０、Ｂｃｅ３５、Ｂｃｅ３６、Ｂｃｅ３９、Ｂｃｅ４０、Ｂｃｅ４１、Ｂｃｅ４２、Ｂｃｅ４３、Ｂｃｅ４４、Ｂｃｅ４５、Ｂｃｅ４６、Ｂｅｙ２０、Ｂｅｙ２２、Ｂｅｙ２３、Ｂｍａ４２、Ｂｍａ４３、Ｂｐｏ１、Ｂｐｏ２、Ｂｐｏ３、Ｂｐｏ４、Ｂｐｏ６、Ｂｐｏ８、Ｂｐｏ１３、Ｂｐｏ１８、Ｂｐｏ２０、Ｂｐｏ２３、Ｂｐｏ２４、Ｂｐｏ２７、Ｂｐｏ２８、Ｂｐｏ２９、Ｂｐｏ３３、Ｂｐｏ３５、Ｂｐｏ３６、Ｂｐｏ３７、Ｂｒｈ２６、Ｂｒｈ２７、Ｂｒｈ２８、Ｂｒｈ２９、Ｂｒｈ３０、Ｂｒｈ３１、Ｂｒｈ３２、Ｂｒｈ３３、Ｂｆｍ１７、Ｂｆｍ１８、Ｂｆｍ２０、Ｂｆｍ２１、Ｂｆｍ２４、Ｂｆｍ２５、Ｂｆｍ２７、Ｂｆｍ３２、Ｂｆｍ３３、Ｂｆｍ３４、Ｂｆｍ３５、ＡＡＶ－ｒｈ１０、ＡＡＶ－ｒｈ３９、ＡＡＶ－ｒｈ４３、ＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５、又はそれらの任意のバリアントを含むいくつかのＡＡＶ血清型に由来するものが含まれる（例えば、非天然混合血清型の開示については米国特許第８，３１８，４８０号を参照されたい）。例示的なキャプシドは、国際出願公開第２０１８／０２２６０８号及び同第２０１９／２２２１３６号（その全体が本明細書に援用される）にも提供されている。キャプシドタンパク質はまた、変異タンパク質、キメラタンパク質、又はシャフルタンパク質を含む、天然のＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のバリアントであり得る。キャプシドタンパク質は、ＡＡＶの様々なクレード内のｒｈ．１０又は他のサブタイプのものであり得る。様々なクレード及びサブタイプは、例えば、米国特許第７，９０６，１１１号に開示されている。様々な実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、ＡＡＶ－１（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＤ２７７５７．１）、ＡＡＶ－２（ＮＣＢＩ参照配列番号ＹＰ＿６８０４２６．１）、ＡＡＶ－３（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０４３９４１．１）、ＡＡＶ－３Ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＢ９５４５２．１）、ＡＡＶ－４（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０４４９２７．１）、ＡＡＶ－５（ＮＣＢＩ参照配列番号ＹＰ＿０６８４０９．１）、ＡＡＶ－６（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＢ９５４５０．１）、ＡＡＶ－７（ＮＣＢＩ参照配列番号ＹＰ＿０７７１７８．１）、ＡＡＶ－８（ＮＣＢＩ参照配列番号ＹＰ＿０７７１７９．１）、ＡＡＶ－９（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＳ９９２６４．１）、ＡＡＶ－１０（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＴ４６３３７．１）、ＡＡＶ－１１（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＴ４６３３９．１）、ＡＡＶ－１２（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢＩ１６６３９．１）、ＡＡＶ－１３（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢＺ１０８１２．１）、又はＷＯ２０１８／０２２６０８及びＷＯ２０１９／２２２１３６に開示されている任意のアミノ酸配列からのアミノ酸配列の一部と、少なくとも約５０％、
５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＰ１、ＶＰ２、又はＶＰ３タンパク質を有する。異なる血清型のＡＡＶタンパク質の構築及び使用は、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：６１９－６２３，２０００、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９７：３４２８－３４３２，２０００、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４－２２３２，１９９８、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４－１５３２，２０００、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６６１５－６６２４，２００１、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，２００１で考察されている。

【0119】

一実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶキャプシドでシュードタイプ化され、ＶＰ１タンパク質は、配列番号２～７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２～７６のうちのいずれか１つの全長にわたって少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0120】

ＡＡＶウイルス粒子は、「シュードタイプ」又は「ハイブリッド」ＡＡＶウイルス粒子であり得る。ＡＡＶウイルス粒子に関連する「ハイブリッド」及び「シュードタイプ」という用語は、本明細書で互換的に使用され、Ｒｅｐタンパク質、逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、及び／又はキャプシドタンパク質が異なる血清型であることを示すことを意図している。例えば、米国特許第９，７３７，６１８号、及びＧａｏ，Ｇ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｌａｄｅｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｒｅ ｗｉｄｅｌｙ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（１２）：６３８１－８ （２００４）（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）に開示されているように、多数の代替キャプシドバリアントが、例えば、ヒト、ヒヒ、ブタ、マーモセット、チンパンジー、及びアカゲザル、ブタオザル、及び／又はカニクイザルなどから特定されている。シュードタイプＡＡＶウイルス粒子の産生は、例えば、ＷＯ２０１８／０２２６０８及びＷＯ２００１／８３６９２に開示されている（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）。他のタイプのＡＡＶウイルス粒子バリアント、例えば、キャプシド変異を有するＡＡＶウイルス粒子も企図される。例えば、全体が参照により本明細書に援用されるＭａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。例えば、限定されないが、ＩＴＲ及び／又はＲｅｐタンパク質は、例えば、キャプシドタンパク質は、哺乳類に見出されるＡＡＶの配列に由来するもの、例えば、Ｂｂａ２１、Ｂｂａ２６、Ｂｂａ２７、Ｂｂａ２９、Ｂｂａ３０、Ｂｂａ３１、Ｂｂａ３２、Ｂｂａ３３、Ｂｂａ３４、Ｂｂａ３５、Ｂｂａ３６、Ｂｂａ３７、Ｂｂａ３８、Ｂｂａ４１、Ｂｂａ４２、Ｂｂａ４３、Ｂｂａ４４、Ｂｃｅ１４、Ｂｃｅ１５、Ｂｃｅ１６、Ｂｃｅ１７、Ｂｃｅ１８、Ｂｃｅ２０、Ｂｃｅ３５、Ｂｃｅ３６、Ｂｃｅ３９、Ｂｃｅ４０、Ｂｃｅ４１、Ｂｃｅ４２、Ｂｃｅ４３、Ｂｃｅ４４、Ｂｃｅ４５、Ｂｃｅ４６、Ｂｅｙ２０、Ｂｅｙ２２、Ｂｅｙ２３、Ｂｍａ４２、Ｂｍａ４３、Ｂｐｏ１、Ｂｐｏ２、Ｂｐｏ３、Ｂｐｏ４、Ｂｐｏ６、Ｂｐｏ８、Ｂｐｏ１３、Ｂｐｏ１８、Ｂｐｏ２０、Ｂｐｏ２３、Ｂｐｏ２４、Ｂｐｏ２７、Ｂｐｏ２８、Ｂｐｏ２９、Ｂｐｏ３３、Ｂｐｏ３５、Ｂｐｏ３６、Ｂｐｏ３７、Ｂｒｈ２６、Ｂｒｈ２７、Ｂｒｈ２８、Ｂｒｈ２９、Ｂｒｈ３０、Ｂｒｈ３１、Ｂｒｈ３２、Ｂｒｈ３３、Ｂｆｍ１７、Ｂｆｍ１８、Ｂｆｍ２０、Ｂｆｍ２１、Ｂｆｍ２４、Ｂｆｍ２５、Ｂｆｍ２７、Ｂｆｍ３２、Ｂｆｍ３３、Ｂｆｍ３４、若しくはＢｆｍ３５、又はそのバリアントとして本明細書に開示及び指定されているキャプシド配列であり得る。

【0121】

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶベクターゲノム」、「ベクターゲノム」、又は「ｒＡＡＶベクターゲノム」は、一本鎖核酸を指す。ｒＡＡＶウイルス粒子は、キャプシド内にキャプシド化されたｒＡＡＶベクターゲノムを有する。ｒＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶウイルスゲノムに対して異種である転写調節エレメント（例えば、１つ以上のプロモーター及び／又はエンハンサー、並びに任意選択的に、ポリアデニル化配列、及び／又は調節エレメント内、若しくは調節エレメントとタンパク質コード配列との間、若しくはタンパク質コード配列のエクソン間に挿入された１つ以上のイントロン）に作動可能に連結されたタンパク質コード配列（好ましくは、機能的な治療用タンパク質コード配列；例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、及びＰＡＨ）に隣接するＡＡＶ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列及びＡＡＶ ３’ＩＴＲを有する。ｒＡＡＶベクターゲノムは、ｒＡＡＶウイルス粒子中に存在する核酸を指し、本明細書に開示される核酸配列のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかであり得る。そのような一本鎖核酸のサイズは、塩基で提供される。「逆位末端反復」及び「ＩＴＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、ウイルスＤＮＡ複製の開始点として、及びウイルスゲノムのパッケージングシグナルとしてシスで機能する、ｒＡＡＶゲノムの５’末端及び３’末端に見出される、当該技術分野で認識されている領域を指す。ＡＡＶ ＩＴＲは、Ｒｅｐタンパク質とともに、宿主細胞ゲノムからの効率的な除去及びレスキュー、並びに宿主細胞ゲノムへの２つの隣接するＩＴＲ間に挿入されたヌクレオチド配列の組み込みを提供する。あるＡＡＶ関連ＩＴＲの配列は、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１）：３６４－３７９（２００５）によって開示されている。ＩＴＲはまた、「フリップ」又は「フロップ」構成において見出され、「フリップ」又は「フロップ」構成において、（ヘアピンのアームを形成する）ＡＡ’逆位反復間の配列が、逆補体内に存在する（Ｗｉｌｍｏｔｔ，Ｐａｔｒｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ３０．６（２０１９）：２０６－２１３）。異なる血清型のＡＡＶベクターゲノムの構築及び使用は、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：６１９－６２３，２０００、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９７：３４２８－３４３２，２０００、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４－２２３２，１９９８、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４－１５３２，２０００、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６６１５－６６２４，２００１、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，２００１で考察されている。広範な構築物の利用可能性及び広範な特性評価のために、以下に開示される例示的なＡＡＶベクターゲノムは、血清型２に由来する。

【0122】

「治療上有効なＡＡＶ」、「治療上有効なＡＡＶ粒子」、「治療用ＡＡＶ」、「治療上有効なｒＡＡＶ」、「治療上有効なｒＡＡＶ粒子」、「治療用ｒＡＡＶ」、及び「治療上有効なｒＡＡＶ」という用語は、感染した細胞が目的のエレメント（例えば、ヌクレオチド配列、タンパク質など）を（例えば、転写及び／又は翻訳によって）発現するように、細胞に感染することができる組換えＡＡＶを指す。この程度まで、治療上有効なｒＡＡＶ粒子は、異なる特性を有するキャプシド又はベクターゲノム（ｖｇ）を有するＡＡＶ粒子を含むことができる。例えば、治療上有効なｒＡＡＶ粒子は、異なる翻訳後修飾を有するキャプシドを有することができる。他の例では、治療上有効なＡＡＶ粒子は、異なるサイズ／長さ、プラス又はマイナス鎖配列、異なるフリップ／フロップＩＴＲ構成（フリップ／フロップ、フロップ／フリップ、フリップ／フリップ、フロップ／フロップなど）、異なる数（１、２、３など）のＩＴＲ又は切断を有するｖｇを含有し得る。例えば、大きいタンパク質をコードする「完全」な核酸が生成され、それによって、機能的で完全長の遺伝子が再構築されるように、５’末端切断及び３’末端切断を有する核酸間で、ｒＡＡＶ感染細胞において重複する相同組換えが生じる。他の例では、第２鎖合成中に「完全」な核酸が形成されるように、５’末端切断及び３’末端切断を有する相補核酸配列は、各々と相互作用する。「完全」な核酸は、大きいタンパク質をコードし、それによって、機能的で完全長の遺伝子を再構築する。治療上有効なｒＡＡＶ粒子は、重いキャプシド、完全なキャプシド、又は部分的に完全なキャプシドとも呼ばれる。

【0123】

「形質導入」及び「形質導入する」という用語は、ｒＡＡＶからレシピエント細胞への遺伝物質（例えば、ベクターゲノム）の伝達、及びレシピエント細胞におけるｒＡＡＶ遺伝物質からの導入遺伝子の発現を指す。遺伝物質の伝達は、レシピエント細胞に感染するｒＡＡＶ粒子を介して媒介される。この目的のために、「効力」という用語は、ｒＡＡＶ粒子に感染したレシピエント細胞又はレシピエント細胞における導入遺伝子の発現のレベルを指す。したがって、より大きな効力を有するｒＡＡＶは、ｒＡＡＶに感染したレシピエント細胞がより大きな導入遺伝子発現を有することを強調する。

【0124】

「治療有効量」という用語は、疾患、障害、又は状態に罹患している又は罹患しやすい対象に投与された場合、疾患、障害、又は状態を、治療、診断、予防、又はその症状の発症を遅延させるのに十分な量の治療剤を意味する。治療上有効な量が、典型的には、少なくとも１つの単位用量を含む投薬レジメンを介して投与されることが当業者には理解されるであろう。「治療的に有効な」という用語は、治療有効量の治療剤が、疾患、障害、及び／又は状態に罹患している又は罹患しやすい対象に投与された場合、疾患、障害、及び／又は状態を治療、診断、予防、及び／又はその症状の発症を遅延させるのに十分であるように十分に作用する治療剤の任意のエレメント又は組成物を指す。例えば、前述のように、治療上有効なｒＡＡＶは、感染した細胞が（例えば、転写及び／又は翻訳によって）目的のエレメント（例えば、ヌクレオチド配列、タンパク質など）を発現するように、細胞に感染することができる。治療上有効なｒＡＡＶは、治療上有効なｒＡＡＶによって感染された細胞によって使用されるベクターゲノムを有し、複製、転写、又は翻訳などの様々な方法によって目的のエレメント（例えば、ヌクレオチド配列、タンパク質など）を生成するために感染された細胞によって使用される治療上有効なヌクレオチド配列を生成する。「治療剤」には、治療上有効なｒＡＡＶ又は治療用ｒＡＡＶウイルスが含まれることにも留意されたい。

【0125】

一例として、治療用タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶビリオン、ｒＡＡＶウイルス粒子、ｒＡＡＶベクター粒子、又はｒＡＡＶウイルスを指す「治療用ｒＡＡＶウイルス」を使用して、インビボでタンパク質を置換又は補完することができる。「治療用タンパク質」は、対応する内因性タンパク質を置換するか、又はその活性の喪失若しくは低減を補完する生物活性を有するポリペプチドを指す。例えば、機能的フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）のための治療用タンパク質である。したがって、例えば、組換えｒＡＡＶ ＰＡＨウイルスを、ＰＫＵに罹患した対象の治療のための薬剤に使用することができる。薬剤は、静脈内（ＩＶ）投与によって投与され得、薬剤の投与は、対象における神経伝達物質の代謝産物又は神経伝達物質のレベルを変更するのに十分な、対象の血流中のＰＡＨタンパク質の発現をもたらす。任意選択的に、薬剤はまた、ｒＡＡＶ ＰＡＨウイルスの投与に関連する任意の肝毒性の予防及び／又は治療のための、予防的又は治療的コルチコステロイドも含み得る。予防的又は治療的コルチコステロイドの処置は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｍｇ／日、又はそれ以上のコルチコステロイドを含み得る。特定の実施形態では、薬剤は、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０週間、又はそれ以上の連続的な期間にわたって投与され得る。ＰＫＵ療法は、任意選択的に、チロシンサプリメントを含んでもよい。

【0126】

ＡＡＶキャプシドに取り込まれた導入遺伝子は、限定されないが、治療目的の任意の異種遺伝子であり得る。導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、又は他の産物をコードする導入遺伝子に隣接するベクター配列に対して異種の核酸配列である。核酸コード配列は、宿主細胞中で導入遺伝子の転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする様式で調節エレメントに作動可能に連結される。

【0127】

導入遺伝子配列の組成は、得られたベクターの使用に依存する。例えば、あるタイプの導入遺伝子配列は、発現時に検出可能なシグナルを生成するレポーター配列を含む。そのようなレポーター配列には、限定するものではないが、ｂ－ラクタマーゼ、ｂ－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、膜結合タンパク質、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を含む、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質、及び当該技術分野で周知の他のものであって、それらに対する高親和性抗体が存在するか又は従来の手段によって産生することができるもの、並びに特にヘマグルチニン又はＭｙｃ由来の抗原タグドメインに適切に融合した膜結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列が含まれる。

【0128】

これらのコード配列は、それらの発現を駆動する調節エレメントと会合したときに、酵素アッセイ、放射線撮影アッセイ、比色アッセイ、蛍光アッセイ、又は他のスペクトログラフィーアッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ、並びに酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫組織化学を含む免疫学的アッセイを含む従来の手段によって検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを有するベクターの存在は、β－ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイによって検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質又はルシフェラーゼである場合、シグナルを有するベクターは、ルミノメーターで色又は光生成によって視覚的に測定することができる。

【0129】

しかしながら、導入遺伝子は、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素、ドミナントネガティブ変異体、又は触媒ＲＮＡなどの、生物学及び医学において有用な産物をコードする非マーカー配列であることが望ましい。望ましいＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡを含む。有用なＲＮＡ配列の一例は、処置される動物において標的の核酸配列の発現を阻害するか又は消失させる配列である。典型的には、好適な標的配列には、腫瘍学的標的及びウイルス性疾患が含まれる。そのような標的の例については、免疫原に関連するセクションで後述する腫瘍標的及びウイルスを参照されたい。

【0130】

導入遺伝子は、遺伝子欠損を修正又は改善するために使用され得、遺伝子欠損は、正常な遺伝子が正常レベル未満で発現される欠損、又は機能遺伝子産物が発現されない欠損を含み得る。好ましいタイプの導入遺伝子配列は、宿主細胞で発現される治療用タンパク質又はポリペプチドをコードする。ベクターは、例えば、マルチサブユニットタンパク質によって引き起こされる遺伝子欠損を修正又は改善するために、複数の導入遺伝子を更に含み得る。特定の状況では、異なる導入遺伝子は、タンパク質の各サブユニットをコードするために、又は異なるペプチド若しくはタンパク質をコードするために使用することができる。これは、タンパク質サブユニットをコードするＤＮＡのサイズが大きい場合（例えば、免疫グロブリン、血小板由来成長因子、又はジストロフィンタンパク質）に望ましい。細胞がマルチサブユニットタンパク質を産生するために、異なるサブユニットの各々を含有する組換えウイルスを細胞に感染させる。あるいは、タンパク質の異なるサブユニットは、同じ導入遺伝子によってコードされていてもよい。この場合、単一の導入遺伝子は、各サブユニットのＤＮＡが内部リボザイム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離された、サブユニットの各々をコードするＤＮＡを含む。これは、サブユニットの各々をコードするＤＮＡのサイズが小さい場合（例えば、サブユニットをコードするＤＮＡ及びＩＲＥＳの総サイズが５キロ塩基未満）に望ましい。また、より長いゲノム（すなわち、＞５（Ｋｂ））は、標的細胞における部分的なゲノムの組換えのために、実行可能であり得ることに留意されたい。ＩＲＥＳの代替物として、翻訳後事象において自己切断する２Ａペプチドをコードする配列によってＤＮＡを分離することができる。例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（Ｐｔ １）：１３－２１（Ｊａｎｕａｒｙ １９９７）、Ｆｕｒｌｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（１ １）：８６４－８７３（Ｊｕｎｅ ２００１）、Ｋｌｕｍｐ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（ｌＯ）：８ １１－８１７（Ｍａｙ ２００１）を参照されたい。この２Ａペプチドは、ＩＲＥＳよりも著しく小さく、これは、２Ａペプチドを、スペースが制限要因であるときの使用に十分に好適にする。より多くの場合、導入遺伝子が大きい場合、マルチサブユニットからなる場合、又は２つの導入遺伝子が同時送達される場合、所望の導入遺伝子又はサブユニットを保有するｒＡＡＶを同時投与することで、インビボでそれらをコンカテマー化して、単一のベクターゲノムを形成することが可能になる。そのような実施形態では、宿主細胞での同時発現のために、第１のＡＡＶは、単一の導入遺伝子を発現する発現カセットを保有し得、第２のＡＡＶは、異なる導入遺伝子を発現する発現カセットを保有し得る。しかし、選択される導入遺伝子は、任意の生物学的に活性な産物又は他の産物（例えば、研究に望ましい産物）をコードすることができる。

【0131】

好適な導入遺伝子は、当業者によって容易に選択することができる。導入遺伝子の選択は、本発明を限定するとみなすものではない。導入遺伝子は異種タンパク質であってもよく、この異種タンパク質が、治療用タンパク質であってもよい。典型的な治療用タンパク質には、限定されないが、血液因子、例えば、ｂ－グロビン、ヘモグロビン、組織プラスミノーゲン活性化因子、及び凝固因子；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）；インターロイキン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９など；増殖因子、例えば、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、例えば塩基性ＦＧＦ及び酸性ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、増殖分化因子９（ＧＤＦ－９）、肝がん由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、神経成長因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ－ａ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－ｂ）など；可溶性受容体、例えば、可溶性ＴＮＦ－ａ受容体、可溶性ＶＥＧＦ受容体、可溶性インターロイキン受容体（例えば、可溶性ＩＬ－１受容体及び可溶性ＩＩ型ＩＬ－１受容体）、可溶性ｇ／ｄＴ細胞受容体、可溶性受容体のリガンド結合断片など；酵素、例えば、ａ－グルコシダーゼ、イミグルカラーゼ、ｂ－グルコセレブロシダーゼ、及びアルグルセラーゼ；酵素活性化剤、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子；ケモカイン、例えば、１Ｐ－１０、インターフェロン－γによって誘導されるモノカイン（Ｍｉｇ）、Ｇｒｏａ／ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、ＭＣＰ－１、ＰＦ－４など；血管新生剤、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、例えばＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－２）、神経膠腫由来増殖因子、アンギオゲニン、アンギオゲニン－２など；抗血管新生剤、例えば可溶性ＶＥＧＦ受容体；タンパク質ワクチン；神経活性ペプチド、例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、ブラジキニン、コレシストキニン、ガスチン、セクレチン、オキシトシン、ゴナドトロピン放出ホルモン、ベータエンドルフィン、エンケファリン、サブスタンスＰ、ソマトスタチン、プロラクチン、ガラニン、成長ホルモン放出ホルモン、ボンベシン、ダイノルフィン、ワーファリン，ニューロテンシン、モチリン、甲状腺刺激ホルモン、ニューロペプチドＹ、黄体形成ホルモン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、バソプレシン、アンジオテンシンＩＩ、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、血管作動性腸管ペプチド、睡眠ペプチドなど；血栓溶解剤；心房性ナトリウム利尿ペプチド；リラキシン；グリア線維性酸性タンパク質；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；ヒトα－１アンチトリプシン；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；組織因子、黄体形成ホルモン；マクロファージ活性化因子；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；好中球走化性因子（ＮＣＦ）；メタロプロテイナーゼの組織阻害剤；血管作動性腸管ペプチド；アンギオゲニン；アンギオトロピン；フィブリン；ヒルディン；ＩＦ－１受容体アンタゴニストなどが含まれる。いくつかの他の非限定的な目的のタンパク質の例には、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；ニューロトロフィン３及び４／５（ＮＴ－３及び４／５）；グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）；血友病関連凝固タンパク質、例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子；遺伝性血管浮腫関連タンパク質、例えば、Ｃ１阻害剤；ジストロフィン、ミニジストロフィン、又はマイクロジストロフィン；リソソーム酸性リパーゼ；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）；グリコーゲン蓄積疾患関連酵素、例えば、グルコース－６－ホスファターゼ、酸性マルターゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、筋グリコーゲンホスホリラーゼ、肝グリコーゲンホスホリラーゼ、筋ホスホフルクトキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ（例えばＰＨＫＡ２）、グルコーストランスポーター（例えばＧＦＵＴ２）、アルドラーゼＡ、ｂ－エノラーゼ、及びグリコーゲンシンターゼ；及び（例えば、β－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼＡ）；並びにそれらの任意のバリアントが含まれるが、これらに限定されない。他の導入遺伝子としては、心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ、β－ミオシン重鎖、心筋トロポニンＴ、心筋トロポニンＩ、ミオシン心室必須軽鎖１、ミオシン心室調節軽鎖２、心筋αアクチン（ＡＣＴＣ）、α－トロポミオシン、タイチン、４．５ＬＩＭタンパク質１、及び国際出願公開第２０１４／１７０４７０号に開示されている他の導入遺伝子が挙げられる。ＡＡＶベクターはまた、プラスミドベクターでトランスフェクトされた細胞で又はウイルスに感染した細胞でその転写、翻訳、及び／又は発現を可能にするような様式で導入遺伝子に作動可能に連結された従来の制御エレメント又は配列を含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」配列には、目的の遺伝子（ＧＯＩ）と連続する発現制御配列、及び目的の遺伝子を制御するためにトランスで、又は離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。好適な遺伝子は、Ａｎｇｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．“Ｅｎｔｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｄｅｒｎ Ｅｒａ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．ｏｆ Ｍｅｄ．７０巻，２７２～２８８頁（２０１９）、及びＤｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｅｓ ｏｆ Ａｇｅ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５９巻，６３７２号，ｅａａｎ４６７２（２０１８）で考察されている遺伝子を含む。

【0132】

発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター、及びエンハンサーの配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）のシグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、翻訳効率を高める配列（例えば、コザックコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強させる配列、及び必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強させる配列を含み得る。天然の、構成的、誘導性、及び／又は組織特異的プロモーターを含む多くの発現制御配列が当該技術分野で既知であり、利用することができる。

【0133】

構成的プロモーターの例としては、限定されないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択的にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択的にＣＭＶエンハンサーを有する）（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｌ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ｂ－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１プロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が挙げられる。誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外来的に供給される化合物、温度などの環境因子、又は特定の生理学的状態（例えば、急性期、細胞の特定の分化状態、若しくは複製細胞中のみ）の存在によって調節することができる。誘導性プロモーター及び誘導系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、及びＡｒｉａｄを含むが限定するものではない、様々な商業的供給者から入手可能である。多くの他の系が記載されており、当業者によって容易に選択することができる。外来的に供給される化合物によって調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［ＷＯ９８／１００８８］、エクジソン昆虫プロモーター［Ｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６－３３５１（１９９６）］、テトラサイクリン抑制系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７－５５５１（１９９２）］，テトラサイクリン誘導系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６－１７６９（１９９５）、Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２－５１８（１９９８）］、ＲＵ４８６誘導系［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：２３９－２４３（１９９７）及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２－４４１（１９９７）］、及びラパマイシン誘導系［Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５－２８７２（１９９７）］が挙げられる。この文脈において有用であり得る他のタイプの誘導性プロモーターは、特定の生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態、又は複製細胞中のみにより調節されるものである。

【0134】

任意選択的に、導入遺伝子の天然のプロモーターを使用してもよい。導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣すべきである場合、天然のプロモーターが好ましいものであり得る。天然プロモーターは、導入遺伝子の発現が、好ましくは、一時的に若しくは発達的に、又は組織特異的な様式で、又は特定の転写刺激に応答して調節されるときに使用され得る。更なる実施形態では、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位、又はコザックコンセンサス配列などの他の天然発現制御エレメントはまた、天然の発現を模倣するために使用することができる。

【0135】

導入遺伝子はまた、組織特異的プロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含み得る。例えば、骨格筋での発現が所望される場合、筋肉で活性なプロモーターが使用される必要がある。これらには、骨格ｂアクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子由来のプロモーター、及び天然に存在するプロモーターよりも高い活性を有する合成筋肉プロモーターが含まれる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１－２４５（１９９９）を参照されたい）。組織特異的であるプロモーターの例は、とりわけ、肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４－３２（１９９７）、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２－９（１９９６）、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ，Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４（１９９６））、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５－９６（１９９７））、骨シアロタンパク質（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４－６４（１９９６））、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３－８（１９９８）、免疫グロブリン重鎖、Ｔ細胞受容体鎖）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターなどのニューロンプロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５（１９９３））、神経フィラメント軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５（１９９１））、及びニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４（１９９５））について知られている。

【0136】

組換えＡＡＶを使用して、例えば、細胞培養で目的のタンパク質をインビトロで産生することができる。例えば、ＡＡＶは、インビトロで目的のタンパク質を産生するための方法において使用することができ、本方法は、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶを提供することと、組換えＡＡＶを細胞培養中の細胞と接触させることと、を含み、それによって、組換えＡＡＶが細胞において目的のタンパク質を発現する。目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列のサイズは変動し得る。例えば、ヌクレオチド配列は、少なくとも約０．１キロ塩基（ｋｂ）長、少なくとも約０．２ｋｂ長、少なくとも約０．３ｋｂ長、少なくとも約０．４ｋｂ長、少なくとも約０．５ｋｂ長、少なくとも約０．６ｋｂ長、少なくとも約０．７ｋｂ長、少なくとも約０．８ｋｂ長、少なくとも約０．９ｋｂ長、少なくとも約１ｋｂ長、少なくとも約１．１ｋｂ長、少なくとも約１．２ｋｂ長、少なくとも約１．３ｋｂ長、少なくとも約１．４ｋｂ長、少なくとも約１．５ｋｂ長、少なくとも約１．６ｋｂ長、少なくとも約１．７ｋｂ長、少なくとも約１．８ｋｂ長、少なくとも約２．０ｋｂ長、少なくとも約２．２ｋｂ長、少なくとも約２．４ｋｂ長、少なくとも約２．６ｋｂ長、少なくとも約２．８ｋｂ長、少なくとも約３．０ｋｂ長、少なくとも約３．２ｋｂ長、少なくとも約３．４ｋｂ長、少なくとも約３．５ｋｂ長、少なくとも約４．０ｋｂ長、少なくとも約５．０ｋｂ長、少なくとも約６．０ｋｂ長、少なくとも約７．０ｋｂ長、少なくとも約８．０ｋｂ長、少なくとも約９．０ｋｂ長、又は少なくとも約１０．０ｋｂ長であり得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは少なくとも約１．４ｋｂの長さである。

【0137】

組換えＡＡＶを使用して、動物（例えば、哺乳類）において目的のタンパク質をインビボで産生することができる。いくつかの実施形態は、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶを提供することと、組換えＡＡＶを対象に投与し、それにより組換えＡＡＶは対象において目的のタンパク質を発現することとを含む、目的のタンパク質をインビボで産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト哺乳類、例えば、サル、イヌ、ネコ、マウス、又はウシであることができる。目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列のサイズは変動し得る。例えば、ヌクレオチド配列は、少なくとも約０．１ｋｂ長、少なくとも約０．２ｋｂ長、少なくとも約０．３ｋｂ長、少なくとも約０．４ｋｂ長、少なくとも約０．５ｋｂ長、少なくとも約０．６ｋｂ長、少なくとも約０．７ｋｂ長、少なくとも約０．８ｋｂ長、少なくとも約０．９ｋｂ長、少なくとも約１ｋｂ長、少なくとも約１．１ｋｂ長、少なくとも約１．２ｋｂ長、少なくとも約１．３ｋｂ長、少なくとも約１．４ｋｂ長、少なくとも約１．５ｋｂ長、少なくとも約１．６ｋｂ長、少なくとも約１．７ｋｂ長、少なくとも約１．８ｋｂ長、少なくとも約２．０ｋｂ長、少なくとも約２．２ｋｂ長、少なくとも約２．４ｋｂ長、少なくとも約２．６ｋｂ長、少なくとも約２．８ｋｂ長、少なくとも約３．０ｋｂ長、少なくとも約３．２ｋｂ長、少なくとも約３．４ｋｂ長、少なくとも約３．５ｋｂ長、少なくとも約４．０ｋｂ長、少なくとも約５．０ｋｂ長、少なくとも約６．０ｋｂ長、少なくとも約７．０ｋｂ長、少なくとも約８．０ｋｂ長、少なくとも約９．０ｋｂ長、又は少なくとも約１０．０ｋｂ長であり得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは少なくとも約１．４ｋｂの長さである。

【0138】

特に興味深いのは、様々な疾患又は障害を治療するための１つ以上の治療用タンパク質を発現するための組換えＡＡＶの使用である。疾患の非限定的な例には、がん腫、肉腫、白血病、リンパ腫などのがん；並びに多発性硬化症などの自己免疫疾患が含まれる。がん腫の非限定的な例には、食道がん；肝細胞がん；基底細胞がん、扁平上皮がん（種々の組織）；移行上皮がんを含む膀胱がん；気管支原性がん；結腸がん；大腸がん；胃がん；肺の小細胞がん及び非小細胞がんを含む肺がん；副腎皮質がん；甲状腺がん；膵臓がん；乳がん；卵巣がん；前立腺がん；腺がん；汗腺がん；脂腺がん；乳頭がん；乳頭腺がん；嚢胞腺がん；髄様がん；腎細胞がん；非浸潤性乳管がん又は胆管がん；絨毛がん；セミノーマ；胎児性がん；ウィルムス腫瘍；子宮頸がん；子宮がん；精巣がん；骨形成がん；上皮がん；並びに鼻咽頭がんが含まれる。肉腫の非限定的な例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨原性肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫（ｓｙｎｏｖｉｏｍａ）、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、及び他の軟部組織肉腫が挙げられる。固形腫瘍の非限定的な例には、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫が含まれる。白血病の非限定的な例には、慢性骨髄増殖性症候群；急性骨髄性白血病；Ｂ細胞ＣＬＬ、Ｔ細胞ＣＬＬ前リンパ球性白血病及び有毛細胞白血病を含む、慢性リンパ球性白血病；並びに急性リンパ芽球性白血病が含まれる。リンパ腫の例には、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫等が含まれるが、これらに限定されない。

【0139】

本明細書に開示されるｒＡＡＶ及び方法を使用して治療することができる疾患の他の非限定的な例としては、鎌状赤血球症、嚢胞性線維症、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）欠損１、テイ＝サックス病、フェニルケトン尿症、ムコ多糖症、糖原病（ＧＳＤ、例えば、ＧＳＤ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、及びＸＩＶ型）、ガラクトース血症、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ筋ジストロフィー）、心筋症（例えば、肥大型心筋症、拡張型心筋症、不整脈原性右室心筋症など）、及び血友病（例えば、血友病Ａ（古典的血友病）及び血友病Ｂ（クリスマス病））、ウィルソン病、ファブリー病、ゴーシェ病、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、並びにα１アンチトリプシン欠損症が挙げられる。加えて、本明細書に開示されるｒＡＡＶ及び方法は、肝臓における導入遺伝子の局所発現によって、又は肝臓若しくは肝細胞からの分泌タンパク質の発現によって治療され得る他の障害を治療するために使用することができる。

【0140】

対象（例えば、対象の血清）において発現される異種タンパク質の量は変動し得る。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質は、対象の血清中に、少なくとも約９ミリグラム（ｍｇ）／ｍＬ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４９ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの量で発現され得る。目的のタンパク質は、対象の血清中に、約９ｐｇ／ｍＬ、約１０ｐｇ／ｍＬ、約５０ｐｇ／ｍＬ、約１００ｐｇ／ｍＬ、約２００ｐｇ／ｍＬ、約３００ｐｇ／ｍＬ、約４００ｐｇ／ｍＬ、約５００ｐｇ／ｍＬ、約６００ｐｇ／ｍＬ、約７００ｐｇ／ｍＬ、約８００ｐｇ／ｍＬ、約９００ｐｇ／ｍＬ、約１０００ｐｇ／ｍＬ、約１５００ｐｇ／ｍＬ、約２０００ｐｇ／ｍＬ、約２５００ｐｇ／ｍＬ、又はこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲の量で発現され得る。当業者は、目的のタンパク質が治療有効性に必要な発現レベルは、目的の特定のタンパク質及び治療を受けている対象などの非限定的な因子によって変動し得るものであり、有効量のタンパク質は、過度の実験をすることなく当該技術分野で既知の従来の方法を使用して当業者によって容易に決定され得ることを理解するであろう。

【0141】

他の実施形態では、本発明は、対象への投与に有用な、本発明のＡＡＶウイルス粒子の薬学的製剤を対象とする。

【0142】

一実施形態では、本発明の薬学的製剤は、本明細書に開示されるＡＡＶウイルス粒子を含む液体製剤であり、製剤中のＡＡＶウイルス粒子の濃度は、大きく変化し得る。ＡＡＶウイルス粒子及び組成物は、投与の容易さ及び投薬量の均一性のために、単位剤形で製剤化され得る。「単位剤形（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ ｆｏｒｍ）」という用語は、治療される対象のための単位投薬量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体と会合して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。単位剤形は、所望の効果を生じるのに必要なＡＡＶウイルス粒子の量に依存する。必要な量は、単一の用量で製剤化することができ、又は複数の投薬単位で製剤化することができる。用量は、好適なＡＡＶウイルス粒子濃度に調整され、任意選択的に、１つ以上の他の薬剤と組み合わせられ、使用のためにパッケージングされ得る。

【0143】

別の実施形態では、薬学的組成物は、予防的又は治療的に有効な量、すなわち、問題の疾患状態の症状を予防、軽減、又は改善するのに十分な量、又は所望の利益を付与するのに十分な量を提供するのに十分な遺伝物質を含む。

【0144】

他の実施形態では、本発明の薬学的製剤を含有するＡＡＶウイルス粒子は、保存及び／又は対象への投与のための有利な特性を有する製剤を提供するために、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む。特定の実施形態では、本明細書に提供される薬学的製剤は、少なくとも２週間、好ましくは少なくとも４週間、より好ましくは少なくとも６週間、及び更により好ましくは少なくとも約８週間、安定性の検出可能な変化なしに、６５℃未満で保存することができる。これに関して、用語「安定した」は、製剤中に存在するＡＡＶウイルス粒子が、保存中にその物理的安定性、化学的安定性、及び／又は生物活性を本質的に保持することを意味する。本発明の他の実施形態では、薬学的製剤中に存在するＡＡＶウイルス粒子は、－６５℃で決められた期間にわたる保存中、対象におけるその生物活性の少なくとも約８０％、より好ましくは、対象におけるその生物活性の少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％を保持する。

【0145】

いくつかの実施形態では、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ～約２．５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ～約２ｍｇ／ｍｌ、又は約１．４ｍｇ／ｍｌ～約１．６ｍｇ／ｍｌの濃度のリン酸二ナトリウム。特に好ましい実施形態では、本発明のＡＡＶウイルス粒子製剤は、約１．４２ｍｇ／ｍｌのリン酸二ナトリウム（乾燥）を含む。

【0146】

他の実施形態では、本発明のＡＡＶウイルス粒子製剤に使用することができる別の緩衝剤は、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物であり、これは、いくつかの実施形態では、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ～約２．５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ～約２ｍｇ／ｍｌ、又は約１．３ｍｇ／ｍｌ～約１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で使用することができる。一実施形態では、本発明のＡＡＶウイルス粒子製剤は、約１．３８ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物を含む。別の実施形態では、本発明のＡＡＶウイルス粒子製剤は、約１．４２ｍｇ／ｍｌの二塩基性リン酸ナトリウム、及び約１．３８ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物を含む。

【0147】

一実施形態では、本発明のＡＡＶウイルス粒子製剤は、好ましくは、約１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌ、例えば、約１ｍｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ～約１５ｍｇ／ｍｌ、又は約８ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度の塩化ナトリウムなどの１つ以上の等張剤を含んでもよい。別の実施形態では、本発明の製剤は、約８．１８ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウムを含む。当技術分野で知られている他の緩衝剤及び等張剤が適切であり、本開示の製剤で使用するために日常的に使用することができる。

【0148】

別の実施形態では、本発明のＡＡＶウイルス粒子製剤は、１つ以上の充填剤を含んでもよい。例示的な充填剤としては、マンニトール、スクロース、デキストラン、ラクトース、トレハロース、及びポビドン（ＰＶＰ Ｋ２４）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の好ましい実施形態では、本発明の製剤は、マンニトールを含み、これは、約５ｍｇ／ｍｌ～約４０ｍｇ／ｍｌ、又は約１０ｍｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍｌ、又は約１５ｍｇ／ｍｌ～約２５ｍｇ／ｍｌの量で存在し得る。特に好ましい実施形態では、マンニトールは、約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。

【0149】

いくつかの実施形態では、本発明のＡＡＶウイルス粒子製剤は、非イオン性界面活性剤であり得る１つ以上の界面活性剤を含んでもよい。

【0150】

例示的な界面活性剤としては、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ ８０（ポリソルベート８０、又はその化学名モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンとしても知られる）、ドデシル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ＴＲＩＴＯＮ ＡＧ ９８（Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ）、ポロキサマー４０７、ポロキサマー１８８など、及びそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。

【0151】

いくつかの実施形態では、本発明の製剤は、ポロキサマー１８８を含み、これは、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約４ｍｇ／ｍｌ、又は約０．５ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ～約２．５ｍｇ／ｍｌ、又は約１．８ｍｇ／ｍｌ～約２．２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。特に好ましい実施形態では、ポロキサマー１８８は、約２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。

【0152】

他の実施形態では、本発明の薬学的製剤は、約１．４２ｍｇ／ｍｌの二塩基性リン酸ナトリウム、約１．３８ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム、約８．１８ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム、約２０ｍｇ／ｍｌのマンニトール、及び約２ｍｇ／ｍｌのポロキサマー１８８を含む液体溶液中に製剤化されたＡＡＶウイルス粒子を含む。

【0153】

いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶウイルス含有製剤は安定しており、品質、効力、又は純度の許容できない変化なしに長期間保存することができる。

【0154】

一実施形態では、製剤は、約５℃（例えば、２℃～８℃）の温度で、少なくとも１か月間、例えば、少なくとも１か月間、少なくとも３か月間、少なくとも６か月間、少なくとも１２か月間、少なくとも１８か月間、少なくとも２４か月間、又はそれ以上安定している。

【0155】

別の実施形態では、製剤は、約－２０℃以下の温度で、少なくとも６か月間、例えば、少なくとも６か月間、少なくとも１２か月間、少なくとも１８か月間、少なくとも２４か月間、少なくとも３６か月間、又はそれ以上安定している。

【0156】

いくつかの実施形態では、製剤は、約－４０℃以下の温度で、少なくとも６か月間、例えば、少なくとも６か月間、少なくとも１２か月間、少なくとも１８か月間、少なくとも２４か月間、少なくとも３６か月間、又はそれ以上安定している。

【0157】

他の実施形態では、製剤は、約－６０℃以下の温度で、少なくとも６か月間、例えば、少なくとも６か月間、少なくとも１２か月間、少なくとも１８か月間、少なくとも２４か月間、少なくとも３６か月間、又はそれ以上安定している。

【0158】

一実施形態では、本発明は、細胞、組織、及び／若しくは目的の臓器の効率的な形質導入のための、並びに／又は遺伝子療法における使用のための、本発明のＡＡＶウイルス粒子の使用を提供する。

【0159】

一実施形態では、本発明は、細胞に、有効量の本発明のＡＡＶウイルス粒子を含む組成物を導入することを含む、細胞、組織、及び／又は目的の臓器の形質導入のための方法を提供する。

【0160】

いくつかの実施形態では、本発明のＡＡＶウイルス粒子は、対象の細胞、組織、及び／又は目的の臓器の形質導入のために使用される。

【0161】

他の実施形態では、細胞、組織、及び／又は目的の臓器の形質導入のための方法が提供され、この方法は、有効量の本発明のＡＡＶウイルス粒子を含む組成物を含む。

【0162】

一実施形態では、対象の予防的又は治療的処置のための方法が提供される。

【0163】

別の実施形態では、対象は、その予防的又は治療的処置を必要とする。

【0164】

いくつかの実施形態では、対象は、状態又は疾患を含み、対象は、当該状態又は疾患の治療を必要とする。

【0165】

他の実施形態では、対象は、哺乳類である。

【0166】

他の実施形態では、対象は、非げっ歯哺乳類、霊長類、ヒト、家畜、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、又はネコである。

【0167】

別の実施形態では、本発明のＡＡＶウイルス粒子は、様々な既知の投与技術を介して対象に投与され得る。

【0168】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、単回ボーラス投与として、又は長期間にわたってのいずれかで静脈内注射によって投与され、この長期間は、少なくとも約１、５、１０、１５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、又は２４０分間以上であってもよい。

【0169】

一実施形態では、対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む細胞（例えば、上皮細胞）は、当該ＡＡＶウイルス粒子によって形質導入される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子で形質導入された細胞（例えば、上皮細胞）は、形質導入遺伝子を発現し、当該哺乳類のＣＳＦ中に分泌する。

【0170】

別の実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子の投与は、対象の大槽、脳室内腔、脳室、くも膜下腔、髄腔内腔、及び／又は上衣への投与を含む。

【0171】

他の実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子の投与は、当該対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）への投与を含む。

【0172】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子の投与は、当該対象の上皮細胞をＡＡＶウイルス粒子と接触させることを含む。

【0173】

一実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子の投与は、当該対象の軟膜細胞、内皮細胞、又は髄膜細胞を当該ＡＡＶウイルス粒子と接触させることを含む。

【0174】

別の実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子の投与は、ＡＡＶウイルス粒子を、当該対象の脳又は脊髄の組織又は流体に注射することを含む。

【0175】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子の投与は、ＡＡＶウイルス粒子を当該対象の脳脊髄液に注射することを含む。

【0176】

別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される方法及び組成物とともに使用するためのキットを提供する。組成物及びウイルス製剤は、キットに提供され得る。キットはまた、好適な容器及び任意選択的に１つ以上の追加の薬剤を含み得る。いくつかの実施形態では、容器は、バイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器、及び／又は他の容器である。他の実施形態では、キットは、例えば、ＡＡＶウイルス粒子の投与を指示するための、ＡＡＶウイルス粒子、薬学的に許容される担体、及びその使用のための説明書を含む。

【0177】

アデノ随伴ウイルスの産生方法

【0178】

本開示は、ｒＡＡＶビリオンを、哺乳類及び昆虫細胞などの細胞内で産生するための材料及び方法を提供する。

【0179】

様々な実施形態では、いずれかの実施形態の方法は、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターを有する宿主細胞を培養するステップを含む。他の実施形態では、ｒＡＡＶ産生のための１つ以上のベクターは、ＡＡＶヘルパー機能を提供する少なくとも１つの核酸分子、又は非ＡＡＶヘルパー機能を提供する少なくとも１つの核酸分子、又はＡＡＶゲノムベクターを生成する少なくとも１つの核酸分子、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いずれかの実施形態の方法は、細胞を、ｒＡＡＶの産生を可能にする条件下で培養することを更に含む。本方法は、任意選択的に、ｒＡＡＶを回収することを含む。例えば、ＡＡＶウイルス粒子は、同時トランスフェクションの約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、約１４４時間、約１６８時間、約１９２時間、約２１６時間、約２４０時間、又はこれらの２つの時点のうちのいずれかの間の時間後に採取され得る。

【0180】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子の産生のための培養物は、以下のうちの１つ以上を含む：宿主細胞、野生型若しくは変異型アデノウイルス（温度感受性アデノウイルスなど）によって提供される好適なヘルパーウイルス機能、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、又はヘルパー機能を提供するプラスミド構築物、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子及び遺伝子産物、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子（例えば、診断用及び／又は治療用導入遺伝子など）、並びにＡＡＶウイルス粒子の産生をサポートする好適な培地及び培地成分。

【0181】

いくつかの実施形態では、昆虫細胞又は哺乳類細胞を、ヘルパープラスミド又はヘルパーウイルス、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードするウイルス構築物、及びプラスミドでトランスフェクトすることができ、同時トランスフェクション後の様々な時点で、ｒＡＡＶ粒子を採取することができる。

【0182】

いくつかの実施形態では、新規のｒＡＡＶウイルス粒子は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）で産生される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、Ｒｅｐ及びＣａｐ遺伝子とともに導入遺伝子を含むＡＡＶゲノムベクターを宿主細胞に提供することによって調製される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶゲノムベクターは、導入遺伝子、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子、及びＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子は、２つ以上のベクターを宿主細胞に提供することによって調製される。例えば、いくつかの実施形態では、導入遺伝子を含むＡＡＶゲノムベクターを、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子を含むベクター（例えば、プラスミド又はバキュロウイルス）とともに、細胞に導入（例えば、トランスフェクト又は形質導入）する。いくつかの実施形態では、細胞は、導入遺伝子を含むＡＡＶゲノムベクター、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子を含むベクター（例えば、プラスミド又はバキュロウイルス）、及びＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子を含むベクター（例えば、プラスミド又はバキュロウイルス）で、トランスフェクト又は形質導入される。

【0183】

様々な実施形態では、いずれかの実施形態の方法は、宿主細胞をｒＢＶに感染させるステップを含む。ｒＢＶは、Ｒｅｐタンパク質をコードする１つ以上の核酸分子、キャプシドタンパク質をコードする１つ以上の核酸分子、及びＡＡＶゲノムベクターを生成する少なくとも１つの核酸分子を含む。いずれかの実施形態の方法は、細胞を、ｒＡＡＶの産生を可能にする条件下で培養することを更に含む。本方法は、任意選択的に、ｒＡＡＶを回収することを含む。

【0184】

ＡＡＶウイルス粒子を生成するにはいくつかの方法がある：例えば、ベクター及びＡＡＶヘルパー配列を使用したトランスフェクションと併せて、ＡＡＶヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルス）のうちの１つによる同時感染、又は組換えＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパーベクター、及びアクセサリー機能ベクターによるトランスフェクションがあるが、これらに限定されない。ＡＡＶウイルス粒子を作製する方法は、例えば、米国特許第ＵＳ６２０４０５９号、同第ＵＳ５７５６２８３号、同第ＵＳ６２５８５９５号、同第ＵＳ６２６１５５１号、同第ＵＳ６２７０９９６号、同第ＵＳ６２８１０１０号、同第ＵＳ６３６５３９４号、同第ＵＳ６４７５７６９号、同第ＵＳ６４８２６３４号、同第ＵＳ６４８５９６６号、同第ＵＳ６９４３０１９号、同第ＵＳ６９５３６９０号、同第ＵＳ７０２２５１９号、同第ＵＳ７２３８５２６号、同第ＵＳ７２９１４９８号、及び同第ＵＳ７４９１５０８号、同第ＵＳ５０６４７６４号、同第ＵＳ６１９４１９１号、同第ＵＳ６５６６１１８号、同第ＵＳ８１３７９４８、又は国際公開第１９９６／０３９５３０号、同第１９９８／０１００８８号、同第１９９９／０１４３５４号、同第１９９９／０１５６８５号、同第１９９９／０４７６９１号、同第２０００／０５５３４２号、同第２０００／０７５３５３号、同第２００１／０２３５９７号、同第２０１５／１９１５０８号、同第２０１９／２１７５１３号、同第２０１８／０２２６０８号、同第２０１９／２２２１３６号、同第２０２０／２３２０４４号、同第２０１９／２２２１３２号、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ． Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ （１９９５）、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ （１９９４）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２－８ （１９８９）、Ｋａｊｉｇａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４６４６－５０（１９９１）、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．６６：６９２２－３０（１９９２）、Ｋｉｍｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒ．，２１９：３７－４４（１９９６）、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒ．２７２：３８２－９３（２０００）に記載されており、それらの各々の内容は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。ＡＡＶウイルス粒子を生成するための方法の詳細な説明については、例えば、米国特許第６，００１，６５０号、同第６，００４，７９７号、及び同第９，５０４，７６２号を参照されたい（各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）。一実施形態では、三重トランスフェクション法（例えば、米国特許第６，００１，６５０号を参照（参照によりその全体が本明細書に援用される））を使用して、ＡＡＶウイルス粒子を産生する。この方法は、感染性ヘルパーウイルスの使用を必要とせず、検出可能なヘルパーウイルスが存在することなく、ＡＡＶウイルス粒子を産生することを可能にする。これは、ＡＡＶウイルス粒子産生のための３つのベクター（すなわち、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、アクセサリー機能ベクター、及びＡＡＶウイルス粒子発現ベクター）の使用によって達成される。しかしながら、当業者は、これらのベクターによってコードされる核酸配列が様々な組み合わせで２つ以上のベクター上に提供され得ることを理解するであろう。他の実施形態では、宿主細胞を、ヘルパープラスミド又はヘルパーウイルス、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードするウイルス構築物及びプラスミドでトランスフェクトし得、同時トランスフェクション後にＡＡＶウイルス粒子が様々な時点において採取され得る。

【0185】

例えば、野生型ＡＡＶ及びヘルパーウイルスを使用して、ＡＡＶウイルス粒子を産生するために必要な複製機能を提供することができる（例えば、米国特許第５，１３９，９４１号（その全体が参照により本明細書に援用される））を参照されたい。あるいは、ヘルパー機能遺伝子を含有するプラスミドを、周知のヘルパーウイルスのうちの１つによる感染と組み合わせて、複製機能の供給源として使用することができる（例えば、米国特許第５，６２２，８５６号及び同第５，１３９，９４１号を参照されたい）。同様に、アクセサリー機能遺伝子を含有するプラスミドを、野生型ＡＡＶによる感染と組み合わせて使用して、必要な複製機能を提供することができる。本明細書に記載の及び／又は当該技術分野で周知の他のアプローチはまた、ＡＡＶウイルス粒子を産生するために当業者によって用いられ得る。

【0186】

様々な実施形態では、いずれかの実施形態の培養ステップは、少なくとも２０ミリリットル（ｍＬ）、少なくとも５０ｍＬ、少なくとも１００ｍＬ、少なくとも５００ｍＬ、少なくとも１リットル（Ｌ）、少なくとも１０Ｌ、少なくとも５０Ｌ、少なくとも１００Ｌ、少なくとも２５０Ｌ、少なくとも５００Ｌ、少なくとも１０００Ｌ、少なくとも１５００Ｌ、少なくとも２０００Ｌ、又は少なくとも２５００Ｌの量で発生する。

【0187】

実施例では、培養ステップは、１つ又は複数のシェイクフラスコで発生し得る。様々な実施形態では、いずれかの実施形態の培養ステップは、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、６０ｍＬ、７０ｍＬ、８０ｍＬ、９０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、３００ｍＬ、４００ｍＬ、５００ｍＬ、６００ｍＬ、７００ｍＬ、８００ｍＬ、９００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、４Ｌ、又は５Ｌの量で発生する。他の実施形態では、培養ステップの量は、上記で提供されるいずれかの２つの量間の範囲である。

【0188】

他の例では、培養ステップは、１つ又は複数のバイオリアクターで発生し得る。様々な実施形態では、いずれかの実施形態の培養ステップは、１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、４Ｌ、５Ｌ、６Ｌ、７Ｌ、８Ｌ、９Ｌ、１０Ｌ、１１Ｌ、１２Ｌ、１３Ｌ、１４Ｌ、１５Ｌ、１６Ｌ、１７Ｌ、１８Ｌ、１９Ｌ、２０Ｌ、２１Ｌ、２２Ｌ、２３Ｌ、２４Ｌ、２５Ｌ、２６Ｌ、２７Ｌ、２８Ｌ、２９Ｌ、３０Ｌ、３１Ｌ、３２Ｌ、３３Ｌ、３４Ｌ、３５Ｌ、３６Ｌ、３７Ｌ、３８Ｌ、３９Ｌ、４０Ｌ、４１Ｌ、４２Ｌ、４３Ｌ、４４Ｌ、４５Ｌ、４６Ｌ、４７Ｌ、４８Ｌ、４９Ｌ、５０Ｌ、５１Ｌ、５２Ｌ、５３Ｌ、５４Ｌ、５５Ｌ、５６Ｌ、５７Ｌ、５８Ｌ、５９Ｌ、６０Ｌ、６１Ｌ、６２Ｌ、６３Ｌ、６４Ｌ、６５Ｌ、６６Ｌ、６７Ｌ、６８Ｌ、６９Ｌ、７０Ｌ、７１Ｌ、７２Ｌ、７３Ｌ、７４Ｌ、７５Ｌ、７６Ｌ、７７Ｌ、７８Ｌ、７９Ｌ、８０Ｌ、８１Ｌ、８２Ｌ、８３Ｌ、８４Ｌ、８５Ｌ、８６Ｌ、８７Ｌ、８８Ｌ、８９Ｌ、９０Ｌ、９１Ｌ、９２Ｌ、９３Ｌ、９４Ｌ、９５Ｌ、９６Ｌ、９７Ｌ、９８Ｌ、９９Ｌ、１００Ｌ、１１０Ｌ、１２０Ｌ、１３０Ｌ、１４０Ｌ、１５０Ｌ、１６０Ｌ、１７０Ｌ、１８０Ｌ、１９０Ｌ、２００Ｌ、２１０Ｌ、２２０Ｌ、２３０Ｌ、２４０Ｌ、２５０Ｌ、２６０Ｌ、２７０Ｌ、２８０Ｌ、２９０Ｌ、３００Ｌ、３１０Ｌ、３２０Ｌ、３３０Ｌ、３４０Ｌ、３５０Ｌ、３６０Ｌ、３７０Ｌ、３８０Ｌ、３９０Ｌ、４００Ｌ、４１０Ｌ、４２０Ｌ、４３０Ｌ、４４０Ｌ、４５０Ｌ、４６０Ｌ、４７０Ｌ、４８０Ｌ、４９０Ｌ、５００Ｌ、５１０Ｌ、５２０Ｌ、５３０Ｌ、５４０Ｌ、５５０Ｌ、５６０Ｌ、５７０Ｌ、５８０Ｌ、５９０Ｌ、６００Ｌ、６１０Ｌ、６２０Ｌ、６３０Ｌ、６４０Ｌ、６５０Ｌ、６６０Ｌ、６７０Ｌ、６８０Ｌ、６９０Ｌ、７００Ｌ、７１０Ｌ、７２０Ｌ、７３０Ｌ、７４０Ｌ、７５０Ｌ、７６０Ｌ、７７０Ｌ、７８０Ｌ、７９０Ｌ、８００Ｌ、８１０Ｌ、８２０Ｌ、８３０Ｌ、８４０Ｌ、８５０Ｌ、８６０Ｌ、８７０Ｌ、８８０Ｌ、８９０Ｌ、９００Ｌ、９１０Ｌ、９２０Ｌ、９３０Ｌ、９４０Ｌ、９５０Ｌ、９６０Ｌ、９７０Ｌ、９８０Ｌ、９９０Ｌ、１０００Ｌ、１０１０Ｌ、１０２０Ｌ、１０３０Ｌ、１０４０Ｌ、１０５０Ｌ、１０６０Ｌ、１０７０Ｌ、１０８０Ｌ、１０９０Ｌ、１１００Ｌ、１１１０Ｌ、１１２０Ｌ、１１３０Ｌ、１１４０Ｌ、１１５０Ｌ、１１６０Ｌ、１１７０Ｌ、１１８０Ｌ、１１９０Ｌ、１２００Ｌ、１２１０Ｌ、１２２０Ｌ、１２３０Ｌ、１２４０Ｌ、１２５０Ｌ、１２６０Ｌ、１２７０Ｌ、１２８０Ｌ、１２９０Ｌ、１３００Ｌ、１３１０Ｌ、１３２０Ｌ、１３３０Ｌ、１３４０Ｌ、１３５０Ｌ、１３６０Ｌ、１３７０Ｌ、１３８０Ｌ、１３９０Ｌ、１４００Ｌ、１４１０Ｌ、１４２０Ｌ、１４３０Ｌ、１４４０Ｌ、１４５０Ｌ、１４６０Ｌ、１４７０Ｌ、１４８０Ｌ、１４９０Ｌ、１５００Ｌ、１５１０Ｌ、１５２０Ｌ、１５３０Ｌ、１５４０Ｌ、１５５０Ｌ、１５６０Ｌ、１５７０Ｌ、１５８０Ｌ、１５９０Ｌ、１６００Ｌ、１６１０Ｌ、１６２０Ｌ、１６３０Ｌ、１６４０Ｌ、１６５０Ｌ、１６６０Ｌ、１６７０Ｌ、１６８０Ｌ、１６９０Ｌ、１７００Ｌ、１７１０Ｌ、１７２０Ｌ、１７３０Ｌ、１７４０Ｌ、１７５０Ｌ、１７６０Ｌ、１７７０Ｌ、１７８０Ｌ、１７９０Ｌ、１８００Ｌ、１８１０Ｌ、１８２０Ｌ、１８３０Ｌ、１８４０Ｌ、１８５０Ｌ、１８６０Ｌ、１８７０Ｌ、１８８０Ｌ、１８９０Ｌ、１９００Ｌ、１９１０Ｌ、１９２０Ｌ、１９３０Ｌ、１９４０Ｌ、１９５０Ｌ、１９６０Ｌ、１９７０Ｌ、１９８０Ｌ、１９９０Ｌ、２０００Ｌ、２０１０Ｌ、２０２０Ｌ、２０３０Ｌ、２０４０Ｌ、２０５０Ｌ、２０６０Ｌ、２０７０Ｌ、２０８０Ｌ、２０９０Ｌ、２１００Ｌ、２１１０Ｌ、２１２０Ｌ、２１３０Ｌ、２１４０Ｌ、２１５０Ｌ、２１６０Ｌ、２１７０Ｌ、２１８０Ｌ、２１９０Ｌ、２２００Ｌ、２２１０Ｌ、２２２０Ｌ、２２３０Ｌ、２２４０Ｌ、２２５０Ｌ、２２６０Ｌ、２２７０Ｌ、２２８０Ｌ、２２９０Ｌ、２３００Ｌ、２３１０Ｌ、２３２０Ｌ、２３３０Ｌ、２３４０Ｌ、２３５０Ｌ、２３６０Ｌ、２３７０Ｌ、２３８０Ｌ、２３９０Ｌ、２４００Ｌ、２４１０Ｌ、２４２０Ｌ、２４３０Ｌ、２４４０Ｌ、２４５０Ｌ、２４６０Ｌ、２４７０Ｌ、２４８０Ｌ、２４９０Ｌ、２５００Ｌ、２５１０Ｌ、２５２０Ｌ、２５３０Ｌ、２５４０Ｌ、２５５０Ｌ、２５６０Ｌ、２５７０Ｌ、２５８０Ｌ、２５９０Ｌ、２６００Ｌ、２６１０Ｌ、２６２０Ｌ、２６３０Ｌ、２６４０Ｌ、２６５０Ｌ、２６６０Ｌ、２６７０Ｌ、２６８０Ｌ、２６９０Ｌ、２７００Ｌ、２７１０Ｌ、２７２０Ｌ、２７３０Ｌ、２７４０Ｌ、２７５０Ｌ、２７６０Ｌ、２７７０Ｌ、２７８０Ｌ、２７９０Ｌ、２８００Ｌ、２８１０Ｌ、２８２０Ｌ、２８３０Ｌ、２８４０Ｌ、２８５０Ｌ、２８６０Ｌ、２８７０Ｌ、２８８０Ｌ、２８９０Ｌ、２９００Ｌ、２９１０Ｌ、２９２０Ｌ、２９３０Ｌ、２９４０Ｌ、２９５０Ｌ、２９６０Ｌ、２９７０Ｌ、２９８０Ｌ、２９９０Ｌ、又は３０００Ｌの量で発生する。他の実施形態では、培養ステップの量は、上記で提供されるいずれかの２つの量間の範囲である。

【0189】

「ベクター」という用語は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、バクミド、ミニプラスミド（例えば、細菌エレメントを含まないプラスミド）、ドギーボーンＤＮＡ（例えば、最小の閉じた線形構築物）、染色体、ウイルス、ビリオン（例えば、バキュロウイルス）などの、適切な制御エレメントを伴う場合に複製することができ、かつ細胞間で遺伝子配列を伝達することができる、任意の遺伝子エレメントを指すと理解される。本明細書で使用される場合、「哺乳類細胞適合性ベクター」又は「ベクター」とは、哺乳類又は哺乳類細胞の産生的形質転換又はトランスフェクションが可能な核酸分子を指す。本明細書で使用される場合、「昆虫細胞適合性ベクター」又は「ベクター」は、昆虫又は昆虫細胞の産生的形質転換又はトランスフェクションが可能な核酸分子を指す。例示的な生物学的ベクターとしては、プラスミド、直鎖核酸分子、及び組換えウイルスが挙げられる。任意のベクターが、昆虫細胞適合性である限り用いられ得る。ベクターは、昆虫細胞ゲノムに組み込まれ得るが、昆虫細胞中のベクターの存在は、永久的である必要はなく、一過性のエピソームベクターも含まれる。ベクターは、既知の任意の手段、例えば、細胞の化学処理、エレクトロポレーション、又は感染によって導入され得る。ベクター及びそれらの使用方法は、細胞の分子工学に関する上記の引用参照文献に記載されている。

【0190】

細胞がｒＡＡＶベクターゲノムを生成するベクターは、プロモーターと、１つ以上の目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を可能にするためのプロモーターの下流の制限部位と、を含み得、プロモーター及び制限部位は、５’ＡＡＶ ＩＴＲの下流及び３’ＡＡＶ ＩＴＲの上流に位置する。ベクターはまた、制限部位の下流及び３’ＡＡＶ ＩＴＲの上流の転写後調節エレメントを含み得る。ウイルス構築物は、制限部位に挿入され、プロモーターと作動可能に連結されたポリヌクレオチドを更に含み得、ポリヌクレオチドが、対象となるタンパク質のコード領域を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス構築物は、目的の１つ以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を可能にするために、プロモーター及びプロモーターの制限部位下流を更に含み、プロモーター及び制限部位は、５’ＡＡＶ ＩＴＲの下流及び３’ＡＡＶ ＩＴＲの上流に位置している。いくつかの実施形態では、ウイルス構築物は、制限部位の転写後の調節エレメント下流及び３’ＡＡＶ ＩＴＲの上流を更に含む。いくつかの実施形態では、ウイルス構築物は、制限部位で挿入され、プロモーターで動作に連結されたポリヌクレオチドを更に含み、ポリヌクレオチドは、目的のタンパク質のコード領域を含む。当業者が認識するように、本出願に開示されているＡＡＶベクターのうちの任意の１つは、ｒＡＡＶビリオンを産生するためのウイルス構築物として、本方法において使用することができる。

【0191】

「ＡＡＶヘルパー」という用語は、増殖性ＡＡＶ複製のために今度はトランスで機能するＡＡＶ遺伝子産物を提供するために発現され得るＡＡＶ由来コード配列を指す。したがって、ＡＡＶヘルパー機能には、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であるｒｅｐ及びｃａｐの両方が含まれる。Ｒｅｐ発現産物は、特に以下のものを含む、多くの機能を有することが示されている：ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合、及びニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；並びにＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む。キャプシド（Ｃａｐ）発現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書では、ＡＡＶベクターゲノムから失われたＡＡＶ機能をトランスで補完するために使用される。

【0192】

生産のために、ＡＡＶヘルパー機能を有する細胞は、キャプシドを形成するのに十分な組換えキャプシドタンパク質を産生する。これには、少なくともＶＰ１及びＶＰ３タンパク質が含まれるが、より典型的には、天然ＡＡＶに見出されるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質の３つ全てが含まれる。キャプシドタンパク質の配列は、宿主細胞によって産生されるＡＡＶビリオンの血清型を決定する。本発明において有用なキャプシドは、１、２、３、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は混合血清型を含むいくつかのＡＡＶ血清型に由来するものを含む（例えば、米国特許第８，３１８，４８０号を、非天然混合血清型のその開示について参照されたい）。キャプシドタンパク質はまた、変異タンパク質、キメラタンパク質、又はシャフルタンパク質を含む、天然のＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のバリアントであり得る。キャプシドタンパク質は、ＡＡＶの様々なクレード内のｒｈ．１０又は他のサブタイプのものであり得る。様々なクレード及びサブタイプは、例えば、米国特許第７，９０６，１１１号に開示されている。広範な構築物の利用可能性及び広範な特徴付けのために、以下に開示される例示的なＡＡＶベクターは、血清型２に由来する。異なる血清型のＡＡＶベクター及びＡＡＶタンパク質の構築及び使用は、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：６１９－６２３，２０００、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９７：３４２８－３４３２，２０００、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４－２２３２，１９９８、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４－１５３２，２０００、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６６１５－６６２４，２００１、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，２００１で考察されている。

【0193】

様々な実施形態では、ＶＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、好適な発現制御配列に作動可能に連結され得る。様々な実施形態では、Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、真核生物プロモーターなどの好適な発現制御配列に作動可能に連結され得る。例えば、ヌクレオチド配列は、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＥＦ１Ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ｂ－アクチンプロモーター、ＴＲＥ（Ｔｅｔ、Ｔｅｔ－Ｏｎ、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ）プロモーター、クメート制御系（ＣｕＲ／ＣｕＯ）（ＵＳ２００４／０２０５８３４を参照されたい）、温度誘導性ＨＳＰ７０プロモーター、ｐ５プロモーター、ｐ１０プロモーター、ｐ１９プロモーター、及びｐ４０プロモーターなどの真核生物プロモーターに作動可能に連結され得る。別の例では、ヌクレオチド配列は、ポリヘドリン（Ｐｏｌｈ）プロモーター、ΔＩＥ１プロモーター、ｐ５プロモーター、ｐ１０プロモーター、ｐ１９プロモーター、ｐ４０プロモーター、メタロチオネインプロモーター、３９Ｋプロモーター、ｐ６．９プロモーター、及びｏｒｆ４６プロモーターなどのバキュロウイルスプロモーターに作動可能に連結され得る。

【0194】

生産のために、ＡＡＶヘルパー機能を有する細胞は、ｒＡＡＶの生産を促進するためのＲｅｐタンパク質を産生する。感染性粒子は、少なくとも１つの大きなＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８）及び少なくとも１つの小さなＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）が細胞で発現される場合に産生され得ることが見出されている。特定の実施形態では、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０の４つ全てが発現される。あるいは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ４０、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ５２、又はＲｅｐ６８及びＲｅｐ４０が発現される。以下の例は、Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ５２の組み合わせの使用を示す。Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ－２又は他の血清型に由来し得る。様々な実施形態では、Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、好適な発現制御配列に作動可能に連結され得る。様々な実施形態では、Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、真核生物プロモーターなどの好適な発現制御配列に作動可能に連結され得る。例えば、ヌクレオチド配列は、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＥＦ１Ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ｂ－アクチンプロモーター、ＴＲＥ（Ｔｅｔ、Ｔｅｔ－Ｏｎ、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ）プロモーター、クメート制御系（ＣｕＲ／ＣｕＯ）（ＵＳ２００４／０２０５８３４を参照されたい）、温度誘導性ＨＳＰ７０プロモーター、ｐ５プロモーター、ｐ１０プロモーター、ｐ１９プロモーター、及びｐ４０プロモーターなどの真核生物プロモーターに作動可能に連結され得る。別の例では、ヌクレオチド配列は、ポリヘドリン（Ｐｏｌｈ）プロモーター、ΔＩＥ１プロモーター、ｐ５プロモーター、ｐ１０プロモーター、ｐ１９プロモーター、ｐ４０プロモーター、メタロチオネインプロモーター、３９Ｋプロモーター、ｐ６．９プロモーター、及びｏｒｆ４６プロモーターなどのバキュロウイルスプロモーターに作動可能に連結され得る。

【0195】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、プラスミド又はバクミドに存在する。プラスミドは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を更に含み得、これは、ｃａｐ遺伝子と同一の血清型に対応してもよく、又は対応していなくてもよい。任意のＡＡＶ血清型由来のｃａｐ遺伝子及び／又はｒｅｐ遺伝子。

【0196】

ＡＡＶヘルパー機能を有する細胞はまた、キャプシドのアセンブリを助けるアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）を産生することができる。様々な実施形態では、ＡＡＰをコードするヌクレオチド配列は、好適な発現制御配列に作動可能に連結され得る。例えば、ヌクレオチド配列は、真核生物プロモーターに作動可能に連結され得る。別の例では、ヌクレオチド配列は、ポリヘドリン（Ｐｏｌｈ）プロモーター、ΔＩＥ１プロモーター、ｐ５プロモーター、ｐ１０プロモーター、ｐ１９プロモーター、ｐ４０プロモーター、メタロチオネインプロモーター、３９Ｋプロモーター、ｐ６．９プロモーター、及びｏｒｆ４６プロモーターなどのバキュロウイルスプロモーターに作動可能に連結され得る。

【0197】

「非ＡＡＶヘルパー機能」という用語は、ＡＡＶがその複製に依存する非ＡＡＶ由来のウイルス機能及び／又は細胞機能を指す。したがって、この用語は、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成、及びＡＡＶキャプシドアセンブリに関与する部分を含む、ＡＡＶの複製に必要なタンパク質及びＲＮＡを捕捉する。ウイルスベースのアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型を除く）、及びワクシニアウイルスなどの既知のヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。

【0198】

「非ＡＡＶヘルパー機能ベクター」という用語は、一般に、アクセサリー機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。アクセサリー機能ベクターを、好適な宿主細胞にトランスフェクトすることができ、ベクターは、次いで、宿主細胞におけるＡＡＶビリオンの産生をサポートすることができる。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルス粒子など、自然界に存在する感染性ウイルス粒子は、この用語から明示的に除外される。したがって、アクセサリー機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、又はコスミドの形態であってもよい。特に、アデノウイルス遺伝子の完全相補体は、アクセサリーヘルパー機能に必要ではないことが実証されている。例えば、ＤＮＡ複製及び後期遺伝子合成が不可能なアデノウイルス変異体は、ＡＡＶ複製を許容することが示されている。Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９７０） Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９：２４３、Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ ｅｔ ａｌ，（１９７１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：３１７。同様に、Ｅ２Ｂ及びＥ３領域内の変異体は、ＡＡＶ複製をサポートすることが示されており、Ｅ２Ｂ及びＥ３領域がアクセサリー機能の提供におそらく関与していないことが示されている。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５。しかしながら、Ｅ１領域に欠陥がある、又はＥ４領域が欠失しているアデノウイルスは、ＡＡＶ複製をサポートすることができない。したがって、Ｅ１Ａ及びＥ４領域は、直接的に又は間接的にいずれかで、ＡＡＶ複製に必要とされる可能性が高い。Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１：８６８、Ｊａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１９２５、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５。その他の特徴付けられたＡｄ変異体には、以下のものが含まれる：Ｅ１Ｂ（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２），上記、Ｊａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．（１９８１），上記、Ｏｓｔｒｏｖｅ ｅｔ ａｌ．、（１９８０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１０４：５０２）、Ｅ２Ａ（Ｈａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、（１９７５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２９：２３９、Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，（１９７６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７：１４０、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６６５、Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２９２７、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：５６７）、Ｅ２Ｂ（Ｃａｒｔｅｒ，Ｉ ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ ｅｄ．，１９９０）におけるＡｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）、Ｅ３（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３），上記）、及びＥ４（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３），上記、Ｃａｒｔｅｒ（１９９５））。変異をＥ１Ｂコード領域内に有するアデノウイルスによって提供されるアクセサリー機能の研究は、矛盾する結果をもたらしたが、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２０６－２１０は、最近、Ｅ１Ｂ５５ｋが、ＡＡＶビリオン産生のために必要とされるが、Ｅ１Ｂ１９ｋはそうでないことを報告した。加えて、国際公開第９７／１７４５８号及びＭａｔｓｈｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９８） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：９３８－９４５には、様々なＡｄ遺伝子をコードするアクセサリー機能ベクターが記載されている。特に好ましいアクセサリー機能ベクターは、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡコード領域、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ ７２ｋＤコード領域、アデノウイルスＥ１Ａコード領域、及びインタクトのＥ１Ｂ５５ｋコード領域を欠くアデノウイルスＥ１Ｂ領域を含む。かかるベクターは、国際公開第０１／８３７９７号に記載されている。

【0199】

異種タンパク質の発現のための昆虫細胞の使用は、文書により十分に裏付けられており、核酸、例えばベクター、例えば昆虫細胞適合性ベクターをそのような細胞に導入する方法、及びそのような細胞を培養液中で維持する方法等である。（例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ｅｄ． Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ Ｊ （１９９５）、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）ｖｏｌ．６３，ｐｐ．３８２２－３８２８、Ｋａｊｉｇａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）ｖｏｌ．８８，ｐｐ．４６４６－４６５０、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９９２）ｖｏｌ．６６，ｐｐ．６９２２－６９３０、Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒ．（１９９６）ｖｏｌ．２１９，ｐｐ．３７－４４、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒ．（２０００）ｖｏｌ．２７２，ｐｐ．３８２－３９３、及び米国特許第６，２０４，０５９号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、昆虫細胞においてＡＡＶをコードする核酸構築物は、昆虫細胞適合性ベクターである。「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞又はインビトロ発現系によって供給され得る。発現ベクターには、コスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドであるか又はリポソームに含まれる）、人工染色体、及び組換えポリヌクレオチドを取り込むウイルスなど、当該技術分野で既知の全てのベクターが含まれる。本明細書で使用される場合、「昆虫細胞適合性ベクター」又は「ベクター」は、昆虫又は昆虫細胞の産生的形質転換又はトランスフェクションが可能な核酸分子を指す。例示的な生物学的ベクターとしては、プラスミド、直鎖核酸分子、及び組換えウイルスが挙げられる。任意のベクターが、昆虫細胞適合性である限り用いられ得る。ベクターは、昆虫細胞ゲノムに組み込まれ得るが、昆虫細胞中のベクターの存在は、永久的である必要はなく、一過性のエピソームベクターも含まれる。ベクターは、既知の任意の手段、例えば、細胞の化学処理、エレクトロポレーション、又は感染によって導入され得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、バキュロウイルス、ウイルスベクター、又はプラスミドである。より好ましい実施形態では、ベクターはバキュロウイルスであり、すなわち構築物はバキュロウイルスベクターである。バキュロウイルスベクター及びその使用方法は、昆虫細胞の分子工学に関する上記引用文献に記載されている。

【0200】

バキュロウイルスシャトルベクター又はバクミドは、バキュロウイルスを生成するために使用される。バクミドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）などの細菌で大きなプラスミドとして増殖する。バクミドは、昆虫細胞にトランスフェクトされた場合、バキュロウイルスを生成する。

【0201】

いくつかの実施形態では、培地は、感染又はトランスフェクション培地（例えば、ＡＡＶウイルス粒子を産生する宿主細胞が遺伝子（感染又はトランスフェクション培地）で感染又はトランスフェクトされる培地）である。

【0202】

別の実施形態では、培地は、産生培地（ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｍｅｄｉｕｍ）（例えば、宿主細胞がＡＡＶウイルス粒子を産生する培地）である。これらの培地には、改変イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含むＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって製造された培地、米国特許第６，５６６，１１８号に記載されているようなカスタム組成、及び米国特許第６，７２３，５５１号に記載されているようなＳｆ－９００ＩＩ ＳＦＭ培地が含まれるが、これらに限定されない（これらの各々は、特に、ＡＡＶウイルス粒子の産生に使用するためのカスタム培地組成に関して、その全体が参照により本明細書に援用される）。

【0203】

ｒＡＡＶ粒子はまた、様々な実施形態で開示される方法を使用して産生され得る。場合によっては、ｒＡＡＶ粒子の産生に必要な成分の一部を安定的に発現する昆虫又は哺乳類細胞を使用することによって、ｒＡＡＶが産生され得る。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子と、ネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能マーカーと、を含むプラスミド（又は複数のプラスミド）は、細胞のゲノム内に組み込まれ得る。別の例では、ネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能マーカーを含むプラスミド（又は複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれ得る。次いで、昆虫、真菌、又は哺乳類細胞を、ヘルパーウイルス（例えば、ヘルパー機能を提供するアデノウイルス又はバキュロウイルス）及び５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ（及び所望する場合、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列）を含むウイルスベクターに共感染させることができる。この方法の利点は、細胞が選択可能であること、及びｒＡＡＶの大量生産に適していることである。別の非限定的な例として、プラスミドではなくアデノウイルス又はバキュロウイルスを使用して、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入することができる。

【0204】

宿主細胞

【0205】

宿主細胞は、ＡＡＶウイルス粒子の産生を可能にし、培養で維持することができる、任意の無脊椎動物又は脊椎動物の細胞型であり得る。

【0206】

一実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞又は哺乳類細胞である。

【0207】

別の実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞である。

【0208】

別の実施形態では、哺乳類細胞は、ヒト細胞である。

【0209】

別の実施形態では、哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｖｅｒａ、ＲＤ、ＢＨＫ、ＨＴ１０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ－７、ＡＲＰＥ－１９、又はＭＲＣ－５細胞である。

【0210】

いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｓｆ９００＋、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞株、蚊細胞株、例えば、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来細胞株、飼育カイコ細胞株、例えば、Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ細胞株、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞株、例えば、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞株、又は鱗翅類細胞株、例えば、Ａｓｃａｌａｐｈａ ｏｄｏｒａｔａ細胞株からのものである。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス感染に感受性の昆虫種由来の細胞であり、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｓｆ９、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ １－４，ＭＧ－１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、ＢＭ－Ｎ、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、及びＡｏ３８が含まれる。

【0211】

ＡＡＶ血清型

【0212】

表２に示されるように、特徴付けられている少なくとも１３のＡＡＶ血清型がある。本発明は、これらの特定のＡＡＶ血清型を包含するが、これに限定されない。

【表2】

【0213】

ＡＡＶの一般的な情報及び概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で見出され得る。しかしながら、様々な血清型が、遺伝子レベルにおいても、構造的及び機能的の両方で非常に密接に関連していることが周知であるため、これらの同じ原理が、追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．の１６５～１７４頁、及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１ （１９７４）を参照されたい）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに呈し、これらは全て、ＡＡＶ－６で発現されたもの等の３つの関連キャプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った遺伝子型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、及びＩＴＲに対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにするヘテロ二本鎖分析によって更に示唆される。類似の感染性パターンは、各血清型における複製機能が類似の調節制御下にあることも示唆する。

【0214】

ＡＡＶの「ｒｅｐ」及び「ｃａｐ」遺伝子は、それぞれ複製タンパク質及びキャプシド形成タンパク質をコードする遺伝子である。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、調査された全てのＡＡＶ血清型で見出されており、本明細書及び引用文献に記載されている。野生型ＡＡＶでは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は概して、ウイルスゲノム内で互いに隣接して見られ（すなわち、それらは、隣接又は重複した転写単位として一緒に「結合され」ている）、それらは概して、ＡＡＶ血清型間で保存される。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子はまた、個別に及び集合的に「ＡＡＶパッケージング遺伝子」と称される。本発明によるＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ｒｅｐ及びアデノヘルパー機能の存在下でＡＡＶベクターをパッケージングすることができ、及び標的細胞受容体に結合することができるＣａｐタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、特定のＡＡＶ血清型、例えば、表２に示される血清型に由来するか、又は哺乳類（例えば、ヒト、ヒヒ、ブタ、マーモセット、チンパンジー、若しくはマカク（例えば、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）（「カニクイザル（ｌｏｎｇ－ｔａｉｌｅｄ）」）（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、若しくはブタオザル（ｐｉｇｔａｉｌｅｄ）（Ｍ．ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ））に見出されるＡＡＶの代替キャプシドバリアント配列に由来する、アミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質をコードする。

【0215】

ＡＡＶの産生に使用されるＡＡＶ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノムに由来され得る。ＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルで有意な相同性のゲノム配列を有し得、類似の遺伝機能のセットを提供し、本質的に物理的及び機能的に同等であるビリオンを産生し、実質的に同一の機構によって複製及び集合する。例えば、ＡＡＶ血清型のゲノム配列及び／又はゲノム類似性の考察について、参照により本明細書に援用される、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ８９７９０、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ０１９０１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０４３３０３、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６、Ｃｈｌｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．７１：６８２３－３３（１９９７）、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．４５：５５５－６４（１９８３）、Ｃｈｌｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．７３：１３０９－１３１９（１９９９）、Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．７２：３０９－３１９（１９９８）、及びＷｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．７４：８６３５－４７（２０００）を参照されたい。

【0216】

多くの既知のＡＡＶ血清型のゲノム機構は非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは、約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）長未満である直鎖一本鎖ＤＮＡ分子である。逆位末端反復（ＩＴＲ）は、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質に対する固有のコードヌクレオチド配列に隣接している。ＶＰタンパク質は、キャプシドを形成する。末端の１４５ｎｔは、自己相補的であり、Ｔ字形のヘアピンを形成するエネルギー的に安定した分子内二本鎖が形成され得るように組織化される。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製の起源として機能し、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとしての役割を果たす。Ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐタンパク質であるＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードする。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８は、ｐ５プロモーターから転写され、Ｒｅｐ ５２及びＲｅｐ４０は、ｐ１９プロモーターから転写される。ｃａｐ遺伝子は、ＶＰタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから転写される。

【0217】

様々な実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能を提供するベクターは、キャプシドタンパク質、Ｒｅｐタンパク質、又はＡＡＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。任意のＡＡＶ血清型由来のｃａｐ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、及び／又はＡＡＰ遺伝子（ＡＡＶ１（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７．１）、ＡＡＶ２（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１４０１．２）、ＡＡＶ３（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１７２９．１、ＡＡＶ３Ｂ（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ０２８７０５．１）、ＡＡＶ４（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９．１）、ＡＡＶ５（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＣ＿００６１５２．１）、ＡＡＶ６（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ０２８７０４．１））、ＡＡＶ７（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＣ＿００６２６０．１）、ＡＡＶ８（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＣ＿００６２６１．１）、ＡＡＶ９（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２５０．１）、ＡＡＶ１０（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６３１９６５．１）、ＡＡＶ１１（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６３１９６６．１）、ＡＡＶ１２（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＤＱ８１３６４７．１）、ＡＡＶ１３（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＥＵ２８５５６２．１を含むが、これらに限定されない）は、ＡＡＶ－ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ１０）、ＡＡＶ－ＤＪ（ＡＡＶＤＪ）、ＡＡＶ－ＤＪ８（ＡＡＶＤＪ８）、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－２Ｇ９、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ変異体、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－２－プレｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶ ＳＭ１０－２、ＡＡＶシャフル１００－１、ＡＡＶシャフル１００－３、ＡＡＶシャフル１００－７、ＡＡＶシャフル１０－２、ＡＡＶシャフル１０－６、ＡＡＶシャフル１０－８、ＡＡＶシャフル１００－２、ＡＡＶ ＳＭ１０－１、ＡＡＶ ＳＭ１０－８、ＡＡＶ ＳＭ１００－３、ＡＡＶ ＳＭ１００－１０、ＢＮＰ６１ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、トゥルータイプＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ１０、若しくは日本ＡＡＶ１０血清型、ＡＡＶ＿ｐｏ．６、ＡＡＶ＿ｐｏ．、ＡＡＶ＿ｐｏ．５、ＡＡＶ＿ＬＫ０３、ＡＡＶ＿ｒａ．１、ＡＡＶ＿ｂａｔ＿ＹＮＭ、ＡＡＶ＿ｂａｔ＿Ｂｒａｚｉｌ、ＡＡＶ＿ｍｏ．１、ＡＡＶ＿トリ＿ＤＡ－１、若しくはＡＡＶ＿マウス＿ＮＹ１、Ｂｂａ２１、Ｂｂａ２６、Ｂｂａ２７、Ｂｂａ２９、Ｂｂａ３０、Ｂｂａ３１、Ｂｂａ３２、Ｂｂａ３３、Ｂｂａ３４、Ｂｂａ３５、Ｂｂａ３６、Ｂｂａ３７、Ｂｂａ３８、Ｂｂａ４１、Ｂｂａ４２、Ｂｂａ４３、Ｂｂａ４４、Ｂｃｅ１４、Ｂｃｅ１５、Ｂｃｅ１６、Ｂｃｅ１７、Ｂｃｅ１８、Ｂｃｅ２０、Ｂｃｅ３５、Ｂｃｅ３６、Ｂｃｅ３９、Ｂｃｅ４０、Ｂｃｅ４１、Ｂｃｅ４２、Ｂｃｅ４３、Ｂｃｅ４４、Ｂｃｅ４５、Ｂｃｅ４６、Ｂｅｙ２０、Ｂｅｙ２２、Ｂｅｙ２３、Ｂｍａ４２、Ｂｍａ４３、Ｂｐｏ１、Ｂｐｏ２、Ｂｐｏ３、Ｂｐｏ４、Ｂｐｏ６、Ｂｐｏ８、Ｂｐｏ１３、Ｂｐｏ１８、Ｂｐｏ２０、Ｂｐｏ２３、Ｂｐｏ２４、Ｂｐｏ２７、Ｂｐｏ２８、Ｂｐｏ２９、Ｂｐｏ３３、Ｂｐｏ３５、Ｂｐｏ３６、Ｂｐｏ３７、Ｂｒｈ２６、Ｂｒｈ２７、Ｂｒｈ２８、Ｂｒｈ２９、Ｂｒｈ３０、Ｂｒｈ３１、Ｂｒｈ３２、Ｂｒｈ３３、Ｂｆｍ１７、Ｂｆｍ１８、Ｂｆｍ２０、Ｂｆｍ２１、Ｂｆｍ２４、Ｂｆｍ２５、Ｂｆｍ２７、Ｂｆｍ３２、Ｂｆｍ３３、Ｂｆｍ３４、Ｂｆｍ３５、ＡＡＶ－ｒｈ１０、ＡＡＶ－ｒｈ３９、ＡＡＶ－ｒｈ４３、ＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５、又はそれらの任意のバリアントは、組換えＡＡＶを産生するために本明細書で使用することができる。例示的なキャプシドは、国際出願第２０１８／０２２６０８号及び同第２０１９／２２２１３６号にも提供されている（これらは、その全体が本明細書に援用される）。上で提供された各ＮＣＢＩ参照配列番号又はＧｅｎｂａｎｋ受入番号も、参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、血清型１、血清型２、血清型３，血清型３Ｂ、血清型４、血清型５、血清型６、血清型７、血清型８、血清型９、血清型１０、血清型１１、血清型１２、血清型１３、又はこれらのバリアントからのキャプシドをコードする。

【0218】

キャプシド、Ｒｅｐ、及びＡＡＰ遺伝子に加えて、実施形態は、ヘルパータンパク質を発現する外因性ポリヌクレオチドを含む。限定されないが、様々な組み合わせで宿主細胞で発現され得るヘルパー遺伝子産物としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ＦＫＢＰ４６、ヒトＦＫＢＰ５２、アデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ、単純ヘルペスウイルスＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ４２、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ９が挙げられる。一実施形態では、細胞は、少なくとも１つのイムノフィリン類似体（すなわち、イムノフィリン又は類似のタンパク質）及び少なくとも１つのヘルパーウイルス遺伝子産物を発現する。

【0219】

いくつかの実施形態では、３つのＡＡＶキャプシドタンパク質（すなわち、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）は、転写産物の選択的ｍＲＮＡスプライシング及び選択的翻訳開始コドン使用頻度を使用して、ｃａｐオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から重複した様式で産生される。例えば、ＶＰ１は、ｍＲＮＡ上のＡＴＧ開始コドン（アミノ酸Ｍ１）から翻訳され得るが、ＶＰ２及びＶＰ３は、より短いｍＲＮＡから生じ得、例えば、ＶＰ２の産生については異なる開始コドンを使用して、ＶＰ３の産生については次の利用可能な開始コドンまでリードスルー翻訳を使用することができる。

【0220】

Ｃａｐタンパク質は、ＶＰ１及びＶＰ３、又はＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３であり得る。ＶＰ１、ＶＰ２、又はＶＰ３遺伝子は、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ１０）、ＡＡＶ－ＤＪ（ＡＡＶＤＪ）、ＡＡＶ－ＤＪ８（ＡＡＶＤＪ８）、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－２Ｇ９、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ変異体、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－２－プレｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶ ＳＭ１０－２、ＡＡＶシャフル１００－１、ＡＡＶシャフル１００－３、ＡＡＶシャフル１００－７、ＡＡＶシャフル１０－２、ＡＡＶシャフル１０－６、ＡＡＶシャフル１０－８、ＡＡＶシャフル１００－２、ＡＡＶ ＳＭ１０－１、ＡＡＶ ＳＭ１０－８、ＡＡＶ ＳＭ１００－３、ＡＡＶ ＳＭ１００－１０、ＢＮＰ６１ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、トゥルータイプＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ１０、若しくは日本ＡＡＶ１０血清型、ＡＡＶ＿ｐｏ．６、ＡＡＶ＿ｐｏ．、ＡＡＶ＿ｐｏ．５、ＡＡＶ＿ＬＫ０３、ＡＡＶ＿ｒａ．１、ＡＡＶ＿ｂａｔ＿ＹＮＭ、ＡＡＶ＿ｂａｔ＿Ｂｒａｚｉｌ、ＡＡＶ＿ｍｏ．１、ＡＡＶ＿トリ＿ＤＡ－１、若しくはＡＡＶ＿マウス＿ＮＹ１、Ｂｂａ２１、Ｂｂａ２６、Ｂｂａ２７、Ｂｂａ２９、Ｂｂａ３０、Ｂｂａ３１、Ｂｂａ３２、Ｂｂａ３３、Ｂｂａ３４、Ｂｂａ３５、Ｂｂａ３６、Ｂｂａ３７、Ｂｂａ３８、Ｂｂａ４１、Ｂｂａ４２、Ｂｂａ４３、Ｂｂａ４４、Ｂｃｅ１４、Ｂｃｅ１５、Ｂｃｅ１６、Ｂｃｅ１７、Ｂｃｅ１８、Ｂｃｅ２０、Ｂｃｅ３５、Ｂｃｅ３６、Ｂｃｅ３９、Ｂｃｅ４０、Ｂｃｅ４１、Ｂｃｅ４２、Ｂｃｅ４３、Ｂｃｅ４４、Ｂｃｅ４５、Ｂｃｅ４６、Ｂｅｙ２０、Ｂｅｙ２２、Ｂｅｙ２３、Ｂｍａ４２、Ｂｍａ４３、Ｂｐｏ１、Ｂｐｏ２、Ｂｐｏ３、Ｂｐｏ４、Ｂｐｏ６、Ｂｐｏ８、Ｂｐｏ１３、Ｂｐｏ１８、Ｂｐｏ２０、Ｂｐｏ２３、Ｂｐｏ２４、Ｂｐｏ２７、Ｂｐｏ２８、Ｂｐｏ２９、Ｂｐｏ３３、Ｂｐｏ３５、Ｂｐｏ３６、Ｂｐｏ３７、Ｂｒｈ２６、Ｂｒｈ２７、Ｂｒｈ２８、Ｂｒｈ２９、Ｂｒｈ３０、Ｂｒｈ３１、Ｂｒｈ３２、Ｂｒｈ３３、Ｂｆｍ１７、Ｂｆｍ１８、Ｂｆｍ２０、Ｂｆｍ２１、Ｂｆｍ２４、Ｂｆｍ２５、Ｂｆｍ２７、Ｂｆｍ３２、Ｂｆｍ３３、Ｂｆｍ３４、Ｂｆｍ３５、ＡＡＶ－ｒｈ１０、ＡＡＶ－ｒｈ３９、ＡＡＶ－ｒｈ４３、又はＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５のキャプシドタンパク質を発現することができる。別の実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２、又はＶＰ３遺伝子は、混合血清型のキャプシドを発現するが、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３遺伝子が全て同じ血清型に由来するわけではない。例示的なキャプシドは、国際出願第２０１８／０２２６０８号（その全体が本明細書に援用される）に提供される。

【0221】

バキュロウイルスビリオン

【0222】

いくつかの実施形態では、バキュロウイルス系が用いられる。

【0223】

バキュロウイルスは、節足動物のエンベロープＤＮＡウイルスであり、そのうち２つのメンバーは、細胞培養で組換えタンパク質を産生するための周知の発現ベクターである。バキュロウイルスは、環状二本鎖ゲノム（８０～２００ｋｂｐ）を有し、これを操作して、特定の細胞に大量のゲノム内容物の送達を可能にすることができる。ベクターとして使用されるウイルスは、一般に、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａマルチキャプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）又はＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（Ｂｍ）ＮＰＶ）である。

【0224】

バキュロウイルスは、一般に、組換えタンパク質の発現のための昆虫細胞の感染に使用される。特に、昆虫における異種遺伝子の発現は、例えば、米国特許第４，７４５，０５１号、Ｆｒｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８６）、ＥＰ１２７，８３９、及びＥＰ１５５，４７６に記載されているように達成することができる。多数のバキュロウイルス株及びバリアント、並びにタンパク質の産生に使用することができる対応する許容昆虫宿主細胞は、当該技術分野で既知である。

【0225】

例えば、市販のＢａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ（登録商標）システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）（カタログ番号１０３５９０１６）は、組換えタンパク質発現のための発現ベクターを含む。ｐＦａｓｔＢａｃ（商標）１ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）は、高レベルのタンパク質発現のための強力なポリヘドリンプロモーター及び簡略化クローニングのための大きなマルチクローニング部位を有する。ｐＦａｓｔＢａｃ（商標）デュアル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）は、昆虫細胞における２つのタンパク質の同時発現のための単一のベクターにおける２つの強力なプロモーターであるポリヘドリンプロモーター及びｐ１０プロモーターを特徴とする単一のベクターである。

【0226】

簡潔には、例示として、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ（登録商標）などのバキュロウイルス系は、昆虫細胞における相同組換えではなく、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における部位特異的転位による組換えバキュロウイルスの生成に依存する。例えば、目的の遺伝子をｐＦａｓｔＢａｃ（商標）ベクターにクローニングし、ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に形質転換することができる。ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）には、ｌａｃＺ－ｍｉｎｉ－ａｔｔＴｎ７融合物を含む親バクミドが含まれる。ヘルパープラスミドによって提供される転位タンパク質の存在下で、ｐＦａｓｔＢａｃ（商標）ベクターのエレメントと親バクミドとの間に転位が生じる。転位が成功すると、発現カセットはｌａｃＺ遺伝子を破壊し、新しい発現ｂａｃｍｉｄは白色細菌コロニーとして視覚化され得る。新しい発現バクミドは、単離され得、例えば、Ｓｆ９又はＳｆ２１細胞を、いずれかの実施形態のトランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトするために使用され得る。適切な時間の培養後、組換えバキュロウイルスを単離することができる。組換えバキュロウイルスを使用して、細胞を感染させて、ＡＡＶウイルス粒子を産生し、かつ／又は目的の遺伝子を発現させることができる。

【0227】

ＡＡＶウイルス粒子の精製

【0228】

他の実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、カラムクロマトグラフィー、ＣｓＣｌ勾配などの様々な従来の精製方法を使用して、宿主細胞から精製することができる。例えば、アニオン交換カラム、親和性カラム、及び／又は陽イオン交換カラムを介した精製など、複数のカラム精製ステップが使用され得る。例えば、国際公開第０２／１２４５５号を参照されたい。更に、感染を用いて、アクセサリー機能を発現する場合、既知の方法を使用して、残留ヘルパーウイルスを不活性化することができる。例えば、アデノウイルスは、約６０℃の温度まで、例えば、２０分間以上加熱することによって不活性化され得る。この処理は、ヘルパーアデノウイルスが熱に不安定である一方、ＡＡＶが非常に熱安定であるため、ヘルパーウイルスのみが効果的に不活性化される。

【0229】

一実施形態では、次いで、ＡＡＶウイルス粒子ストックは、例えば、カラムクロマトグラフィー技術を使用して、空のキャプシドを除去するように処理される。

【0230】

別の実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子調製物は、トランスフェクトした細胞を溶解させて粗細胞溶解物を得ることによって得られる。次いで、濾過、遠心分離などの当該技術分野で周知の技術によって細胞デブリを除去するために、粗細胞溶解物を清澄化して、清澄化された細胞溶解物を得ることができる。次いで、ＡＡＶウイルス粒子及びＡＡＶ空キャプシドの両方を含んでいる可能性がある粗細胞溶解物又は清澄化された細胞溶解物を、非分離条件下で第１の陽イオン交換マトリックスに適用することができ、第１の陽イオン交換カラムは、ＡＡＶウイルス粒子及びＡＡＶ空キャプシドを細胞及び細胞溶解物調製物に存在する他の成分から更に分離するように機能する。細胞溶解物の初期精製を行うための方法は既知である。１つの代表的な方法は、米国特許第６，５９３，１２３号に記載されている（その全体が参照により本明細書に援用される）。

【0231】

分析技法

【0232】

概して、ｖｇ及びキャプシド（ｃｐ）力価は、それぞれのｖｇ及びキャプシドを測定するのに好適であるいずれかの様式で評価され得る。例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）が、ｖｇ力価を測定するために使用され得、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が、Ｃｐ力価を測定するために使用され得る。代替として、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）－ＨＰＬＣが、ｖｇ及びｃｐ力価を測定するために使用され得る。加えて、ＲＰ（逆相）－ＨＰＬＣ又はキャピラリー電気泳動アッセイが、ＶＰ比へのプロセスパラメータの潜在的な影響を評価するために使用され得る。

【0233】

ｑＰＣＲが、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステムなどの標準的なｑＰＣＲシステムを使用する、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によるｖｇ定量化のために使用され得る。代替として、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が、Ｖｇ定量化のために使用され得る。プライマー及びプローブは、ＡＡＶのＤＮＡを標的とするように設計され得、ＰＣＲ中に、ＤＮＡが蓄積されたときに、ＤＮＡの定量化を可能にする。ｄｄＰＣＲの例は、Ｐａｓｉ，Ｋ．Ｊｏｈｎ，ｅｔ ａｌ．“Ｍｕｌｔｉｙｅａｒ Ｆｏｌｌｏｗ－Ｕｐ ｏｆ ＡＡＶ５－ｈＦＶＩＩＩ－ＳＱ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ．”Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３８２．１（２０２０）：２９－４０、Ｒｅｇａｎ，Ｊｏｈｎ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．“Ａ Ｒａｐｉｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ．”ＰｌｏＳ ｏｎｅ １０．３ （２０１５）： ｅ０１１８２７０、及びＦｕｒｕｔａ－Ｈａｎａｗａ，Ｂｉｒｅｉ，Ｔｅｒｕｈｉｄｅ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，ａｎｄ Ｅｒｉｋｏ Ｕｃｈｉｄａ．“Ｔｗｏ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ａｓ ａ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ”Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ３０．４（２０１９）：１２７－１３６に記載されている。ｖｇ定量化のための他のシステムは、ＳＥＣ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、及びサイズ交換クロマトグラフィー多角度光散乱を含み、これらの全ては、全体が参照により援用されるＷＯ２０２１／０６２１６４に記載されている。

【0234】

キャプシドＥＬＩＳＡ（ｃｐ－ＥＬＩＳＡ）アッセイは、インタクトなキャプシドを、例えば、ＡＡＶ５又はＡＡＶ９キャプシドＥＬＩＳＡ方法を使用して測定し、市販のキット（例えば、Ｐｒｏｇｅｎ ＰＲＡＡＶ５）を使用し得る。このキットＥＬＩＳＡは、アセンブルされたＡＡＶ５又は他のキャプシド上のコンフォメーションエピトープに特異的なモノクローナル抗体を使用する。キャプシドは、プレート結合モノクローナル抗体上で捕捉され得、続いて、検出抗体の後続の結合が行われる。アッセイシグナルは、コンジュゲートストレプトアビジンペルオキシダーゼを付加し、続いて、比色ＴＭＢ基質溶液及び硫酸を付加して、反応を終了することによって生成され得る。試験試料の力価は、標的キャプシド標準物の４パラメータ較正曲線から補間される。キャプシド力価を定量化するための別のシステムは、ＷＯ２０２１／０６２１６４に記載されているＳＥＣ－ＭＡＬＳである。

【0235】

ｒＢＶの力価は、フォーカス／ウイルスプラークアッセイを使用して決定され得る。このアッセイは、細胞を、ｒＢＶを含有する溶液の段階希釈液で感染させるステップを、最初に含む。感染が所定の時間にわたって発生した後に、ｒＢＶは、培養物から除去され、細胞が、所定の時間にわたってインキュベートされる。所定の時間が経過した後に、（例えば、アガロースを含有する）プラーク培地が、培養物に付加され、硬化させる。細胞は、所定の時間にわたって更にインキュベートされ、プラークの数が、所定の時間後にカウントされる。力価は、以下の式を使用して計算される。力価（プラーク形成単位／ｍＬ）＝プラークの数×希釈係数×（１／（ｍＬの接種物／ウェル）

【0236】

カチオン性ペプチド及びヒスチジンリッチペプチド

【0237】

方法は、トランスフェクション試薬としてのカチオン性ペプチドの使用であって、ペプチドが、正電荷を６～８の範囲（例えば、７．４）のｐＨで有する、使用を含む。好適なトランスフェクション試薬は、大規模ウイルスベクター産生のための成功した候補であるために、以下のいくつかの基準、１）好ましくは、プラスミド若しくはバクミドの形態又はいずれかの他の形態で提供される外来核酸に結合すること、２）外来ＤＮＡ及びトランスフェクション試薬の複合体が、好ましくは、１０分間超にわたって安定していること、３）外来ＤＮＡ：トランスフェクション試薬の複合体が、細胞表面に結合し、細胞によって取り込まれること、４）トランスフェクション試薬が、好ましくは、外来ＤＮＡ又は外来ＤＮＡ：トランスフェクション試薬複合体のエンドソーム放出のための様式を提供すること、５）外来ＤＮＡ又は外来ＤＮＡ：トランスフェクション試薬複合体が、好ましくは、細胞の核に到達することができること、６）外来ＤＮＡ又は外来ＤＮＡ：トランスフェクション試薬複合体が、好ましくは、タンパク質の転写及び遺伝子の複製のために使用可能であること、７）トランスフェクション試薬及び外来ＤＮＡ：トランスフェクション試薬複合体が、好ましくは、細胞によって十分に許容されること、８）外来ＤＮＡ又は外来ＤＮＡ：トランスフェクション試薬複合体が、好ましくは、選択される産生培地と適合すること、並びに９）トランスフェクション試薬が、好ましくは、産生細胞を、規模拡張可能な様式でトランスフェクトすることができることを満たすべきである。

【0238】

カチオン性ペプチドの例としては、ヒスチジンリッチペプチド（ＨＲＰ）が挙げられる。ＨＲＰは、異なるタイプのカーゴを細胞内に送達するために使用されている（Ｍｏｕｌａｙ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＬＡＨ４ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅ ｃｅｌｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｔｕｄｅ ｏｆ ｃａｒｇｏ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７，２３（４）：３２０－３２８）。

【0239】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用されて、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸を含むポリマー、すなわち、ペプチドアイソスターを意味する。ポリペプチドとは、ペプチド、グリコペプチド、又はオリゴマーと一般に称される短い鎖、及びタンパク質と一般的に称されるより長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、遺伝子にコードされた２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの自然プロセス、又は当該技術分野で周知の化学修飾技法のいずれかによって修飾されたアミノ酸配列を含む。

【0240】

しかしながら、ＨＲＰは、哺乳類又は昆虫細胞内でのウイルスベクター産生のためのトランスフェクション試薬として、以前に使用されていない。

【0241】

ＨＲＰは、約２０アミノ酸長であり、細胞膜へのＨＲＰの結合を促進する疎水性アミノ酸残基と、水中でのＨＲＰの溶解性を促進する親水性残基と、いくつかのヒスチジン残基（ファミリーＬＡＨ４の十分に特徴付けられたメンバーについての４つのヒスチジン残基）と、を含有する。中性ｐＨでのヒスチジンは、正電荷を有し、負電荷を有するカーゴと結合することができる。これは、カーゴ：ペプチド複合体の全体的な電荷を正にする。（＋／－）３．６の正電荷比が、ＬＡＨ４及び所与のプラスミドについて見られた［４］。カーゴ：ペプチド複合体のこの正電荷は、負電荷を有すると一般的に考えられる細胞形質膜への結合を促進する。また、受容体依存性エンドサイトーシスは、細胞の表面上の糖タンパク質を介して発生し得ることが報告された（Ｋｉｃｈｌｅｒ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｔｉｏｎｉｃ ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ ２００６，１７５８（３）：３０１－３０７）。エンドサイトーシスＤＮＡ：ペプチド複合体は、初期エンドソームから後期エンドソームへのエンドサイトーシス経路に沿って移動する。経路に沿って、ｐＨは、より酸性になり、ヒスチジンは、よりプロトン化されて、ヒスチジンの正味電荷が、（ＬＡＨ４ペプチドについて）＋５から＋９に変化する。これは、ペプチドの約半分が、ＤＮＡ：ペプチド複合体から解離することを引き起こす。放出された遊離ペプチドは、エンドソーム膜を不安定化し、複合体を含有するＤＮＡが、サイトゾル内に脱出することを可能にする。

【0242】

ＨＲＰは、約１０個～５０個のアミノ酸の長さを有するヒスチジンペプチドである。好適なＨＲＰは、ｐＨ７．４での名目電荷が、５、６、７、８、９、又は１０であり、ｐＨ５での名目電荷が、６、７、８、９、又は１０である。ＨＲＰは更に、ｐＨ７での疎水性モーメントが、０．０２～０．４であり、例えば、ｐＨ７での疎水性モーメントは、０．０３、０．０４、０．０５。０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３。０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３０、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４０、０．４１、０．４２、０．４３、０．４４、０．４５、０．４６、０．４７、０．４８、０．，４９、０．５０であり得、極角は、２０～１６０、例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０であり得る。好ましいＨＲＰは、４つのヒスチジンが散在した、アラニン及びロイシンから作製されたコアを有する。

【0243】

様々な例では、ＨＲＰの少なくとも一部分は、細胞膜の存在下でのときに、かつシファーエドモンソンホイール表現（Ｓｃｈｉｆｆｅｒ Ｍ，Ｅｄｍｕｎｄｓｏｎ ＡＢ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．１９６７ Ｍａｒ；７（２）：１２１－３５）に従って表されたときに、αヘリカルコンフォメーションを形成する。αヘリックスは、両親媒性ヘリックスであることができ、両親媒性ヘリックスは、疎水性アミノ酸残基のクラスターを、ヘリックスの一方の側に有し、２つ～４つのヒスチジン残基を、ヘリックスの反対の側に有して、親水性角を定め、親水性角は、シファーエドモンソンホイール表現において、６０°～１８０°に含まれる。αヘリックスはまた、無極性ヘリックスであることができ、無極性ヘリックスは、疎水性アミノ酸残基のクラスターを、ヘリックスの一方の側に有し、連続したアラニン残基を、ヘリックスの反対の側に有し、当該連続したアラニン残基は、シファーエドモンソンホイール表現において、６０～１８０°の角度を定める。他の例では、ＨＲＰの部分Ｎ末端及びＣ末端は、正電荷をｐＨ７．４で有する１つ以上のアミノ酸残基を含む。例えば、ＬＡＨ４ペプチド（配列番号１）は、リジン又はアルギニン残基を、Ｎ末端及びＣ末端において有する。参照により全体が参照により援用される国際公開第２０１３／００１０４１号を参照されたい。

【0244】

ＤＮＡをトランスフェクトする目的で、例示的なＨＲＰの特徴は、比較的短いペプチドであって、ＤＮＡとの静電相互作用を可能にするが、制限された正電荷密度を有するカチオン性残基を提示し、水溶液中で可溶性であり、膜と相互作用することができ、膜を不安定化することができる、ペプチドを含む。国際公開第２００２／０９６９２８号、Ｋｉｃｈｌｅｒ，Ａｎｔｏｉｎｅ，Ａ．Ｊａｍｅｓ Ｍａｓｏｎ，ａｎｄ Ｂｕｒｋｈａｒｄ Ｂｅｃｈｉｎｇｅｒ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）－Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ １７５８．３（２００６）：３０１－３０７、Ｋｉｃｈｌｅｒ，Ａｎｔｏｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８５．２（２００７）：１９１－２０１を参照されたい。これらの参照文献は全て、それらの全体が参照により援用される。

【0245】

様々な実施形態では、カチオン性ペプチド又はＨＲＰは、共有結合修飾を含む。共有結合修飾の例としては、アシル化、アセチル化、非ペプチド高分子キャリア基への（例えば、Ｎ末端への）連結、アミド化、非ペプチド高分子キャリア基への（例えば、Ｃ末端への）連結、（例えば、アミノ酸側鎖の）グリコシル化、細胞内へのペプチドの取り込みを増進することができるアダプタータンパク質への連結、又は脂質、脂肪酸、ダンシル、カルボベンゾキシル、若しくはｔ－ブチルオキシカルボニル基などの疎水基への連結、酸化、硫酸化、エステル化、ラクトン形成、及び／あるいはリン酸化が挙げられる。他の実施形態では、カチオン性ペプチドは、カチオン性ペプチドの定量化を可能にするマーカーを含む。例えば、カチオン性ペプチドは、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）又はトリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）を含むことができる。

【0246】

様々な実施形態に記載されるカチオン性ペプチドは、ＨＲＰに限定されず、様々な実施形態にまた記載される他のカチオン性ペプチドも含むことに留意されたい。例えば、様々なカチオン性ペプチド又はＨＲＰが、表３に開示される。

【表3】

【0247】

トランスフェクション試薬として使用され得るカチオン性ペプチド及びＨＲＰの他の例は、国際公開第２０１７／１７５０７２号、米国特許第８，６５２，４８３号、及びＭｅｌｌｏ，Ｌｕｃａｓ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．“Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ａ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｔｒｏｊａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ．”Ｓｏｆｔ ｍａｔｔｅｒ １６．２０（２０２０）：４７４６－４７５５に開示されている。これらの参照文献の全ては、それらの全体が参照により援用される。

【0248】

トランスフェクションプロセスの効率は、多くの様式で表され得、例えば、タンパク質を、外来ＤＮＡが送達された遺伝子から産生する細胞の％、細胞内でトランスフェクション後に検出される外来ＤＮＡのコピーの数、送達された遺伝子から産生されるタンパク質の酵素活性、及び他の様式によって表され得る。例えば、トランスフェクション効率は、％緑色蛍光タンパク質陽性（ＧＦＰ^＋）細胞のとして、ＧＦＰについての遺伝子を保有するプラスミドのトランスフェクション後の所与の時点で決定され得る。

【0249】

ＨＲＰは、ｓｆ９細胞などの昆虫細胞内へのＡＡＶの産物でのトランスフェクションを向上させるために使用され得る。これに関して、目的の遺伝子を含有するバクミドが産生された後に、バクミドからのプラスミドは、バキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を作製するために、ＨＲＰトランスフェクション剤と一緒に使用され得る。増殖が必要とされるときに、以前に凍結保存されたＢＩＩＣは、昆虫細胞、及び産生された治療遺伝子を含有するＡＡＶキャプシドで増殖させてもよい。したがって、昆虫細胞の場合で、トランスフェクション剤は、ＢＩＩＣを作製する上流段階で使用され得る。

【0250】

ＨＲＰはまた、哺乳類細胞でのトランスフェクションを向上させるために使用され得る。この場合、ＨＲＰは、ＨＥＫ２９３細胞などの哺乳類細胞をトランスフェクトするためのプラスミドと一緒である。

【0251】

ＨＲＰは、長い安定時間を有し、低いトランスフェクション量で好適であるという利点を有する。この点において、ＨＲＰは、１％のトランスフェクション量で使用され得、少なくとも６０分間安定している。また、ＰＥＩ及びＦＥＣＴＯＶＩＲ（登録商標）などの他の多くの他のトランスフェクション試薬と異なり、ＧＭＰグレードのＨＲＰが、市販されている。加えて、細胞内に残ると推定されるＰＥＩ及びＦＥＣＴＯＶＩＲ（登録商標）と異なり、ＨＲＰは、細胞内で分解され、低い細胞毒性を有する。ＨＲＰはまた、高細胞密度培養物、例えば、２～８×１０^６細胞／ｍｌでの、少なくとも７０％及び最大９０％以上の高いトランスフェクション効率を有するトランスフェクションのために使用され得る。したがって、トランスフェクション効率は、約７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％である。１０分間超、又は１５分間超、２０分間超、２５分間超にわたって安定しているＨＲＰトランスフェクション試薬ベクター／トランスフェクション試薬複合体を使用する、本発明のトランスフェクション方法で。ＨＲＰトランスフェクション試薬によって提供される１つの利点は、低い量が使用され得ることである。これに関して、ｒＡＡＶ産生のためのベクター及びトランスフェクション試薬は、培養物量の１５％以下、培養物量の１０％以下、培養物量の５％以下である量で一緒に混合される。したがって、ｒＡＡＶ産生のためのベクター及びトランスフェクション試薬は、培養物量の１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、又は５％以下である量で一緒に混合される。

【0252】

カチオン性ペプチド又はＨＲＰは、細胞培養物に、少なくとも０．００１μｇ／ｍＬ、少なくとも０．０１μｇ／ｍＬ、少なくとも０．１μｇ／ｍＬ、少なくとも０．５μｇ／ｍＬ、少なくとも１μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１００μｇ／ｍＬ、１～２００μｇ／ｍＬ、５～５０μｇ／ｍＬ、１０～１５０μｇ／ｍＬ、又は１００～２００μｇ／ｍＬのである濃度まで付加され得る。

【0253】

上記のように、ＨＲＰはまた、ＧＭＰグレードで製造される。「適正製造基準」又は「ＧＭＰ」という語句は、米国Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）によって確立されている、ヒト使用に意図された製品を製造する方法、プロトコル、及び手順のセットを指す。「ｃＧＭＰ」という略語は、ＦＤＡ（例えば、２１ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ、パート２１１下）によって現在承認されているこれらのプロトコル及び手順を具体的に明示する。いずれかの実施形態のカチオン性ペプチド／ＨＲＰ及びトランスフェクション試薬はまた、生分解性であり、細胞生存率への効果がない範囲にある。

【0254】

本発明者らは、初めて、ＨＲＰがまた、哺乳類細胞内でのｒＡＡＶ産生及び昆虫細胞内でのｒＢＶ産生のためのトランスフェクション剤として有用であることができることを見出した。本発明は、以下の実施例で更に説明され、これらの実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。

【実施例】

【0255】

実施例１：Ｂｂａ４１キャプシドの生成
Ｂｂａ４１キャプシドを、Ａｍｂｒ１５ミニバイオリアクター（１５ｍＬの容積）内で培養されたヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞内で産生した。トランスフェクション試薬、カチオン性ペプチド、及びＨＲＰの全てを、ＧＭＰ条件下で行われ得る固相ペプチド合成を使用して合成的に生成した。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｂｂａ４１キャプシドを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、ＰＥＩＰＲＯ（登録商標）、並びにＬＡＨ４、ＬＡＨ４－Ｌ１、ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４、及びＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ２Ｄを含む異なるＨＲＰを使用してトランスフェクトした。ＰＥＩＰＲＯ（登録商標）は、カチオン性ポリマーである線状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ベースのトランスフェクション試薬である。ＰＥＩＰＲＯ（登録商標）は、ベクター産生のために最適化されており、信頼できるウイルスベクター産生及び高い感染力価収率をもたらすためのゴールドスタンダードのトランスフェクション試薬であると産業において考えられている。力価を、ｄｄＰＣＲを使用して決定した。図１に示されるように、異なるＨＲＰでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、ＰＥＩＰＲＯ（登録商標）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（約０．６×１０ｅ１１ベクターゲノム（ｖｇ）／ミリリットル（ｍＬ））と比較して、実質的により大きい力価のＢｂａ４１キャプシド（２．３×１０ｅ１１ｖｇ／ｍＬ以上）を産生した。ＧＦＰ強度を、ａｔｔｕｎｅ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒによって測定した。図１はまた、ＨＥＫ２９３細胞のより大きい百分率が、異なるＨＲＰでトランスフェクトされたときに（約５８％～約７４％）、ＰＥＩＰＲＯ（登録商標）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（約４４％）と比較して、トランスフェクションの２４時間後にＧＦＰ発現を示したことを示す。トランスフェクションの６６時間後に、ＧＦＰ発現を示す、ＨＲＰでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の百分率は、増加し（約８３％～９８％）、ＰＥＩＰＲＯ（登録商標）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（約７７％）よりも依然として大きかった。

【0256】

振盪フラスコ（３０ｍＬの有効容積）内で、Ｂｂａ４１キャプシドを、Ｂｂａ４１キャプシドを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、異なる濃度及び異なる複合体形成量のＬＡＨ４ペプチドを使用してトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞内で産生した。トランスフェクション前に、プラスミドを、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３マイクログラム（μｇ）／ｍＬの濃度のＬＡＨ４ペプチドと混合した。ＬＡＨ４／プラスミド混合物は、ＨＥＫ２９３細胞培養物量の０％、１％、及び１０％である量を有した。例えば、０％の複合体形成量をＨＥＫ２９３細胞培養物内に付加することは、ＬＡＨ４ペプチド及びプラスミドが、互いに独立して、培養物に直接付加されたことを示す。力価を、ｄｄＰＣＲを使用して決定し、ＧＦＰ強度を、ａｔｔｕｎｅ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒによって測定した。

【0257】

図２に示されるように、５～１３μｇ／ｍｌの濃度のＬＡＨ４ペプチドは、ＨＥＫ２９３細胞を、高い効率で、０％、１％、及び１０％の複合体形成量でトランスフェクトすることができた。図３はまた、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞が、異なるＬＡＨ４ペプチド濃度及び複合体形成量でトランスフェクトされたときに、高いＧＦＰ蛍光を示したことを示す。

【0258】

図４に示されるように、０％、１％、及び１０％の複合体形成量での５～１３μｇ／ｍｌの濃度のＬＡＨ４ペプチドでのトランスフェクションは、約１．２５×１０ｅ１１～約２．８×１０ｅ１１ｖｇ／ｍＬの範囲の高いｒＡＡＶ力価をもたらした。

【0259】

図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃに示されるように、０％、１％、及び１０％の複合体形成量での５～１３μｇ／ｍｌの濃度のＬＡＨ４ペプチドでのトランスフェクションは、類似の細胞密度を、異なる時点で有した。図６Ａ、図６Ｂ、及び図６Ｃはまた、０％、１％、及び１０％の複合体形成量での５～１３μｇ／ｍｌの濃度のＬＡＨ４ペプチドでのトランスフェクションが、類似の生存率を、異なる時点で有したことを示す。図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃに示される生存率は、トランスフェクションのために使用された濃度のＨＲＰが、細胞毒性を誘導しないことを強調する。

【0260】

振盪フラスコ（３０ｍＬの有効容積）内で、Ｂｂａ４１キャプシドを、ＨＥＫ２９３細胞内で、様々なＨＲＰを使用して産生した。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｂｂａ４１キャプシドを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、ＬＡＨ４、ＬＡＨ４－Ｌ１、ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４、及びＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ２Ｄを含む異なるＨＲＰを使用してトランスフェクトした。トランスフェクション前に、異なるＨＲＰ及びプラスミドを、一緒に混合し、１０及び６０分間インキュベートした。力価を、ｄｄＰＣＲを使用して決定し、ＧＦＰ強度を、ａｔｔｕｎｅ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒによって測定した。図７は、ＨＥＫ２９３細胞内で産生されたＢｂａ４１キャプシドの力価を示すトランスフェクション前に、ＰＥＩＰＲＯ（登録商標）及びプラスミドを、一緒に混合し、１０、２０、及び３０分間インキュベートした。異なるＨＲＰを使用して産生されたＢｂａ４１キャプシドの力価（６×１０ｅ１１ｖｇ／ｍＬ超）は、ＰＥＩＰＲＯ（登録商標）を使用して産生されたＢｂａ４１キャプシドの力価（１．２５×１０ｅ１１ｖｇ／ｍＬ未満）よりも実質的に大きかった。Ｂｂａ４１キャプシド力価はまた、異なるＨＲＰを使用したときに、１０及び６０分間の複合体形成時間で依然として高かった。

【0261】

図８Ａ及び図８Ｂについて、トランスフェクション効率を、ＧＦＰを発現する細胞の百分率によって決定した。図８Ａに示されるように、トランスフェクションの２４時間後の異なるＨＲＰのトランスフェクション効率は、ＰＥＩＰＲＯ（登録商標）のトランスフェクション効率よりも実質的に高かった。トランスフェクションの２４時間後の異なるＨＲＰのトランスフェクション効率はまた、１０及び６０分間の複合体形成時間で依然として高かった。更に、図８Ｂは、トランスフェクションの４８時間後の異なるＨＲＰのトランスフェクション効率が、１０及び６０分間の複合体形成時間で依然として高かった（８５％超）ことを示す。

【0262】

図１、図２、図３、図４、図５Ａ～図５Ｃ、図６Ａ～図６Ｃ、図７、図８Ａ、及び図８Ｂは、ＨＲＰが、一過的にトランスフェクトされた細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞内で、ウイルスベクターを生成するためのゴールドスタンダードのトランスフェクション試薬であると考えられるＰＥＩと比較してより良好なトランスフェクション効率を示すことを強調する。ＨＲＰはまた、ＰＥＩと比較してより高い力価のＢｂａ４１キャプシドを生成し、プラスミドと混合され長期間インキュベートされたときに、強化された安定性を示した。プラスミドと混合されたときのＰＥＩは、長期間にわたって安定していなかった。この程度まで、ＨＲＰは、より多くの量の細胞のトランスフェクションを可能にする。例えば、ウイルスベクターの現在のＨＥＫ２９３細胞産生の主な制限は、産生を５００リットル（Ｌ）超に規模拡張することができないことである。

【0263】

５００Ｌ超のＨＥＫ２９３細胞培養物量をトランスフェクトするＨＲＰの能力を試験するために、Ｂｂａ４１キャプシドを、異なる量で培養されたＨＥＫ２９３細胞内で、バイオリアクターを使用して産生する。バイオリアクターは、１００Ｌ、５００Ｌ、７５０Ｌ、１０００Ｌ、及び２０００Ｌの量を有する培養物を含む。トランスフェクション前に、異なる濃度の異なるＨＲＰを、プラスミドと混合して、Ｂｂａ４１キャプシドを、異なる重量比で産生する。ＨＲＰ／プラスミドを、異なる期間インキュベートし、その後、細胞培養物に付加する。異なる量のバイオリアクター培養物の各々について、Ｂｂａ４１キャプシドを生成する。

【0264】

実施例２：ＡＡＶ９キャプシドの生成
１．６Ｌの振盪フラスコ（５００ｍＬの有効容積）内で、ＡＡＶ９キャプシドを、ＡＡＶ９キャプシドを産生するための、かつ目的の遺伝子を有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、ＬＡＨ４ペプチド及びＰＥＩＰＲＯ（登録商標）を使用してトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞内で産生した。力価を、ｄｄＰＣＲを使用して決定した。図９は、ＡＡＶ９キャプシド力価を示す。ＴＲＭ１、ＴＲＭ２、及びＴＲＭ３は、細胞培養培地が、ＬＡＨ４ペプチドでのトランスフェクション前に交換された、３重の培養物である。ＣＣＭ１、ＣＣＭ２、及びＣＣＭ３は、細胞培養培地が、ＬＡＨ４ペプチドでのトランスフェクション前に交換されなかった、３重の培養物である。ＣＴＬ１、ＣＴＬ２、及びＣＴＬ３は、ＨＥＫ２９３細胞が、ＰＥＩＰＲＯ（登録商標）でトランスフェクトされた、３重の培養物である。図９に示されるように、ＬＡＨ４ペプチドでトランスフェクトされた培養物（例えば、ＴＲＭ１～３及びＣＣＭ１～３）は、ＡＡＶ９キャプシド力価（６×１０ｅ１０ｖｇ／ｍＬ～約１．２×１０ｅ１１ｖｇ／ｍＬ）をもたらし、これは、ＰＥＩＰＲＯ（登録商標）でトランスフェクトされた培養物（例えば、ＣＴＬ１～３）内でもたらされたＡＡＶ９キャプシド力価（２．２×１０ｅ１０ｖｇ／ｍＬ未満）よりも実質的に大きかった。

【0265】

Ａｍｂｒ１５ミニバイオリアクター（１５ｍＬの容積）内で、ＡＡＶ９キャプシドを、ＡＡＶ９キャプシドを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、異なる複合体形成量のＬＡＨ４ペプチドを使用してトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞内で産生した。トランスフェクション前に、プラスミドを、ある濃度のＬＡＨ４ペプチドと混合し、１０分間及び６０分間インキュベートした。ＬＡＨ４／プラスミド混合物は、ＨＥＫ２９３細胞培養物量の１％及び１０％である量を有した。力価を、ｄｄＰＣＲを使用して決定し、ＧＦＰ強度を、ａｔｔｕｎｅ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒによって測定した。

【0266】

図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｅ、及び図１０Ｆについて、トランスフェクション効率を、ＧＦＰを発現する細胞の百分率によって決定した。図１０Ａに示されるように、１％及び１０％の複合体形成量のＬＡＨペプチド及びプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、８７．５％超及び９５％の高い平均トランスフェクション効率を、４８時間でもたらした。図１０Ｂに示されるように、１％及び１０％の複合体形成量のＬＡＨ４ペプチド及びプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、約６７．５％超及び７０％超の高い平均トランスフェクション効率を、２４時間でもたらした。１０及び６０分間の複合体形成時間について、図１０Ｅは、ＬＡＨ４ペプチド／プラスミド混合物でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞が、約９０％の高い平均トランスフェクション効率を４８時間でもたらしたことを示し、図１０Ｆは、ＬＡＨ４ペプチド／プラスミド混合物でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞が、約７０％及び約６７．５％の高い平均トランスフェクション効率を２４時間でもたらしたことを示す。

【0267】

図１０Ｃに示されるように、１％及び１０％の複合体形成量のＬＡＨ４ペプチド及びプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、約５×１０ｅ１１～約２×１０ｅ１２ｖｇ／ｍＬの範囲の高い力価のＡＡＶ９キャプシドを産生した。１０分及び６０分間の複合体形成時間について、図１０Ｇは、ＬＡＨ４ペプチド／プラスミド混合物でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞が、高いＡＡＶ９キャプシド力価をもたらし、平均力価が、両方の複合体形成時間について、約１×１０ｅ１２ｖｇ／ｍＬの範囲であったことを示す。

【0268】

図１０Ｄに示されるように、１％及び１０％の複合体形成量のＬＡＨ４ペプチド及びプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の平均生存率は高く、７５％超及び約７２．５％の細胞生存率であった。１０及び６０分間の複合体形成時間について、図１０Ｈはまた、ＬＡＨ４ペプチド及びプラスミド混合物でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の平均生存率が高く、約７２．５％及び７５％超の細胞生存率であったことを示す。図１０Ｄ及び図１０Ｈに示される生存率は、トランスフェクションのために使用された濃度のＨＲＰが、細胞毒性を誘導しないことを強調する。

【0269】

３ＬのバイオリアクターでのＡＡＶ９キャプシドの追加の産生を、ＬＡＨ４ペプチドをトランスフェクション試薬として使用して調製した。ＨＥＫ２９３細胞を、ＡＡＶ９キャプシドを産生するための、かつ目的の遺伝子を有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、ＬＡＨ４ペプチドを使用してトランスフェクトした。力価を、ｄｄＰＣＲを使用して決定した。図１１に示されるように、追加の産生の力価は、１×１０ｅ１２ｖｇ／ｍＬ超～約２．２×１０ｅ１２ｖｇ／ｍＬの範囲の高いＡＡＶ９キャプシド力価をもたらした。

【0270】

図９、図１０Ａ～図１０Ｈ、及び図１１は、ＨＲＰが、高いトランスフェクション効率を示し、高い力価のＡＡＶ９キャプシドを生成したことを強調する。ＨＲＰはまた、より高い力価のＡＡＶ９キャプシドを生成し、プラスミドと混合され長期間インキュベートされたときに、強化された安定性を示した。プラスミドと混合されたときのＰＥＩは、長期間にわたって安定していなかった。この程度まで、ＨＲＰは、より多くの量の細胞のトランスフェクションを可能にする。例えば、ウイルスベクターの現在のＨＥＫ２９３産生の主な制限は、産生を５００Ｌ超に規模拡張することができないことである。

【0271】

追加のＨＲＰを構築した。異なるエレメントを、ＬＡＨ４及びＬＡＨ４－Ｌ１－Ｌ４ペプチドに付加した。

【0272】

例えば、細胞結合及び透過を強化するためのタンパク質形質導入ドメイン４（ＰＤＴ４）を、ＬＡＨ４及びＬＡＨ４－Ｌ１－Ｌ４ペプチド（Ｈｉｓ－ＰＴＤ４－ＬＡＨ４及び配列番号９３、ＰＴＤ４－ＬＡＨ４及び配列番号９４、Ｈｉｓ－ＰＴＤ４－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４及び配列番号９７、ＰＴＤ４－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４及び配列番号９８）に付加した。

【0273】

エンドソーム脱出の強化のためのヒスチジン残基を、ＬＡＨ４及びＬＡＨ４－Ｌ１－Ｌ４ペプチド（Ｈｉｓ－ＰＴＤ４－ＬＡＨ４及び配列番号９３、Ｈｉｓ－ペネトラチン－ＬＡＨ４及び配列番号９５、Ｈｉｓ－ＰＴＤ４－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４及び配列番号９７、Ｈｉｓ－ペネトラチン－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４及び配列番号９９、Ｈｉｓ－ペネトラチン－ＬＡＨ４－２及び配列番号１２１、Ｈｉｓ－ペネトラチン－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４－２及び配列番号１２３）に付加した。

【0274】

保存溶液定量化のための、Ｎ末端におけるトリプトファン残基を、ＬＡＨ４及びＬＡＨ４－Ｌ１－Ｌ４ペプチド（ＬＡＨ４（Ｗ）及び配列番号１０１、ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４（Ｗ）及び配列番号１０２）に付加した。

【0275】

細胞及びＤＮＡ結合並びに細胞透過の強化のためのペネトラチンを、ＬＡＨ４及びＬＡＨ４－Ｌ１－Ｌ４ペプチド（Ｈｉｓ－ペネトラチン－ＬＡＨ４及び配列番号９５、ペネトラチン－ＬＡＨ４及び配列番号９６、Ｈｉｓ－ペネトラチン－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４及び配列番号９９、ペネトラチン－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４及び配列番号１００、Ｈｉｓ－ペネトラチン－ＬＡＨ４－２及び配列番号１２１、ペネトラチン－ＬＡＨ４－２及び配列番号１２２、Ｈｉｓ－ペネトラチン－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４－２及び配列番号１２３、ペネトラチン－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４－２及び配列番号１２４）に付加した。

【0276】

プラスミドの核送達の強化のためのサルウイルス４０（ＳＶ４０）核局在化シグナル（ＮＬＳ）を、ＬＡＨ４及びＬＡＨ４－Ｌ１－Ｌ４ペプチド（ＳＶ４０ Ｔ ＮＬＳ－スペーサー－ＬＡＨ４及び配列番号１０３、ＳＶ４０ Ｔ ＮＬＳ－スペーサー－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４及び配列番号１０４）に付加した。

【0277】

プラスミドの核送達の強化のためのヌクレオプラスミンＮＬＳを、ＬＡＨ４及びＬＡＨ４－Ｌ１－Ｌ４ペプチド（ヌクレオプラスミンＮＬＳ－スペーサー－ＬＡＨ４及び配列番号１０５、ヌクレオプラスミンＮＬＳ－スペーサー－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４及び配列番号１０６）に付加した。

【0278】

プラスミドの送達の強化のためのＡＡＶ２ ＶＰ１－２ ＢＲ３を、ＬＡＨ４及びＬＡＨ４－Ｌ１－Ｌ４ペプチド（ＡＡＶ２ ＶＰ１－２ ＢＲ３－スペーサー－ＬＡＨ４及び配列番号１０７、ＡＡＶ２ ＶＰ１－２ ＢＲ３－スペーサー－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４及び配列番号１０８）に付加した。

【0279】

これらのペプチドを、化学合成し、ＨＥＫ２９３細胞を、様々な濃度のこれらのペプチドによって、ＧＦＰ及び様々な治療用導入遺伝子を含有するプラスミドでトランスフェクトした。特に、Ｈｉｓ－ＰＴＤ４－ＬＡＨ４、ＰＴＤ４－ＬＡＨ４、ＬＡＨ４（Ｗ）、ＡＡＶ２ ＶＰ１－２ ＢＲ３－スペーサー－ＬＡＨ４、Ｈｉｓ－ＰＴＤ４－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４、ＰＴＤ４－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４、ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４（Ｗ）、ＳＶ４０ Ｔ ＮＬＳ－スペーサー－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４、及びＡＡＶ２ ＶＰ１－２ ＢＲ３－スペーサー－ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４を使用して、９６ディープウェルプレートのウェル（０．５ｍＬ）内のＨＥＫ２９３細胞を、ｒＡＡＶを産生するための、かつＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶゲノムベクターを提供するためのプラスミドで、異なる濃度の異なるＨＲＰを使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、トランスフェクション効率を、ＧＦＰタンパク質を発現する細胞を特定することによって測定した。４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色を使用して、修飾ペプチドの細胞毒性を反映するための、細胞集団内のインタクトな形質膜（ＤＡＰＩ陰性）を有する細胞の百分率を監視した。フローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰタンパク質を発現する細胞をゲーティングし、トランスフェクション効率を、インタクトな形質膜を有する細胞集団内のＧＦＰを発現する陽性細胞の百分率として表した。図１２及び図１３に示されるように、異なるＨＲＰは、であったＨＥＫ２９３細胞の最大約８０％をトランスフェクトする。細胞生存率測定値は、異なるＨＲＰが、毒性効果がない範囲にあったことを示した。したがって、異なるペプチドは、ＬＡＨ４及びＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４ペプチドに近い又はこれと等価のトランスフェクション効率を示した。

【0280】

所定の時間に、ＡＡＶキャプシドを、培養物から単離した。ＡＡＶ９キャプシド力価を、ｄｄＰＣＲ及びプライマーを使用して、ベクターゲノムについて定量化した。図１４及び図１５に示されるように、異なるＨＲＰでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、力価を、１０ｅ１１ｖｇ／ｍＬの規模でもたらした。

【0281】

実施例３：ヒスチジンリッチペプチドのトランスフェクション効率
序文

【0282】

研究の目標は、ＬＡＨ４ペプチドの２つの特性が、バイオテクノロジー産業における大規模一過的トランスフェクションのためのトランスフェクション試薬としてのその使用を可能にすることについての知識における現在のギャップを解消することである。２つの特性は、１）トランスフェクション前のＤＮＡ：ＬＡＨ４複合体の安定性、２）哺乳類細胞による、トランスフェクション後のＬＡＨ４ペプチドの自然クリアランスである。

【0283】

ＬＡＨ４ペプチドを、プラスミドとともに、１時間超にわたって、大規模（１００Ｌ以上）一過的トランスフェクションのためにインキュベートすることが可能であったが、これは、このインキュベーション時間が、トランスフェクション複合体の安定性の向上を可能にし、これにより、プロセスが、堅牢かつ再現可能であったためである。ＬＡＨ４：ＤＮＡ複合体は、少なくとも１時間安定していることを発見した。フォローアップ研究において、ＬＡＨ：ＤＮＡ複合体の安定性を、２～８℃及び／又は室温で、かつ周囲光への曝露あり又はなしで貯蔵されたときに、最大１週間評価する。

【0284】

結果

【0285】

バイオプロセシング中のトランスフェクション試薬などの補助材料のクリアランスが強調される。本発明者らは、ＬＡＨ４の大部分が、トランスフェクションプロセスが完了した後に、細胞プロテアーゼによって分解されると仮定した。ＬＡＨ４の生分解性を実証するために、本発明者らは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）方法を展開して、細胞溶解物の複合体マトリックス内のＬＡＨ４ペプチドを検出した。異なる濃度のＬＡＨ４ペプチドを、３Ｌ及び１００Ｌの細胞培養物量（すなわち、バイオリアクター）に付加した。トランスフェクションの４時間後に、ＬＡＨ４ペプチド濃度は、初期ＬＡＨ４ペプチド濃度に対して、約４５％～約８５％低減された。トランスフェクションの２４時間後に、ＬＡＨ４ペプチド濃度は、初期ＬＡＨ４ペプチド濃度に対して、約８３％～約９７％低減された。トランスフェクションの４８時間後に、ＬＡＨ４ペプチド濃度は、初期ＬＡＨ４ペプチド濃度に対して、約９３％～約９９％低減された。トランスフェクションの７２時間後に、ＬＡＨ４ペプチド濃度は、初期ＬＡＨ４ペプチド濃度に対して、約９６％～約９９％低減された。データは、初期ＬＡＨ４ペプチド濃度に対して、ＬＡＨ４ペプチドの９５％超のクリアランスを、トランスフェクションの７２時間後までに示す。

【0286】

材料及び方法

【0287】

細胞培養：懸濁液ＨＥＫ２９３細胞を、製造元の使用説明書に従って、提供された細胞培養培地中で培養する。小規模トランスフェクション研究について、ＨＥＫ２９３細胞を、所定の細胞密度の範囲で、１２５ｍｌのエルレンマイヤー振盪フラスコ内に、トランスフェクションの日に播種する。

【0288】

トランスフェクション：同じバッチからのＬＡＨ４溶液を、－２０℃で、単回使用アリコートで保持する。ＬＡＨ４を、室温で解凍し、ＧＦＰレポーター遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡと混合する。ＤＮＡ：ＬＡＨ４複合体を、蒸発を防止するために閉じられたキャップチューブ内で、室温又は２～８℃のいずれかで、示される期間、トランスフェクション前に保持する。

【0289】

ＬＡＨ４：ＤＮＡ複合体の安定性：ＬＡＨ４：ＤＮＡ複合体の生物物理学的特徴付けを実行する。方法は、サイズ及び電荷測定を含むことができる。

【0290】

トランスフェクション効率：トランスフェクション効率を、トランスフェクションの２４及び４８時間後に、フローサイトメーターを使用して測定し、インタクトな形質膜を有する単細胞の集団内の％ＧＦＰ＋細胞として表す。

【0291】

細胞内のＬＡＨ４検出：試料を、トランスフェクション後に、異なる時点で採取し、ＬＣ／ＭＳアッセイを使用して分析する。

【0292】

実施例４：大規模でのＨＥＫ２９３細胞内でのＡＡＶ９キャプシドの生成
５００Ｌ超のＨＥＫ２９３細胞培養物量をトランスフェクトするＨＲＰの能力を試験するために、ＡＡＶ９キャプシドを、異なる量で培養されたＨＥＫ２９３細胞内で、バイオリアクターを使用して産生する。バイオリアクターは、１００Ｌ、５００Ｌ、７５０Ｌ、１０００Ｌ、及び２０００Ｌの量を有する培養物を含む。トランスフェクション前に、異なる濃度の異なるＨＲＰを、プラスミドと混合して、ＡＡＶ９キャプシドを、異なる重量比で産生する。ＨＲＰ／プラスミドを、異なる期間インキュベートし、その後、細胞培養物に付加する。異なる量のバイオリアクター培養物の各々について、ＡＡＶ９キャプシドを生成する。異なる実施例では、ＬＡＨ４ペプチドを使用して、２つの別個の１００Ｌのバイオリアクター産生での懸濁液中のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。特に、図１６に示されるように、２つの１００Ｌの産生は、１．４×１０ｅ１２ｖｇ／ｍＬ超及び１×１０ｅ１２ｖｇ／ｍＬ超の力価をもたらした。したがって、本発明は、プラスミド／ＨＥＫ２９３系を使用するｒＡＡＶの大規模産生を可能にする。したがって、もたらされる力価は、堅牢であり、経済的に実行可能であり、これにより、プラスミド／ＨＥＫ２９３系は、今や、実行可能な大規模ｒＡＡＶ産生系である。

【0293】

実施例５：Ｓｆ９細胞内でのｒＢＶ及びＡＡＶ５キャプシドの生成
上記で強調されるように、ｒＡＡＶを、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）内で、細胞を、キャプシド及びＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／又は発現カセットを有するＡＡＶゲノムベクターを提供するヌクレオチド配列を有する組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）に感染させることによって産生することができる。ｒＢＶを生成するために、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞を、キャプシド及びＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／又は発現カセットを有するＡＡＶゲノムベクターを提供するヌクレオチド配列を有する組換えバキュロウイルスゲノムでトランスフェクトする。組換えバキュロウイルスゲノム（すなわち、バクミド）を生成するために、異種ヌクレオチド配列をバキュロウイルスゲノム内に挿入することが可能である異なるベクター系（例えば、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ（商標）Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が存在する。

【0294】

ＬＡＨ４、ＬＡＨ４－Ｌ１、ＬＡＨ５、ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ２Ｄなどの異なるＨＲＰ、及び対照トランスフェクション試薬（ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ＧＦＰ発現カセットを有するプラスミドを、Ｓｆ９細胞内にトランスフェクトした。図１７に示されるように、異なるＨＲＰでトランスフェクトされたＳｆ９細胞の１５％～５０％超が、ＧＦＰを発現した。異なるＨＲＰのトランスフェクション効率は、対照トランスフェクション試薬のトランスフェクション効率と同等であった。

【0295】

また、ＡＡＶ５キャプシドを、Ｓｆ９細胞内で産生した。ＡＡＶ５キャプシドを産生するために、Ｓｆ９細胞を、ＡＡＶ５キャプシドを生成するためのヌクレオチド配列又はＡＡＶゲノムベクターを提供するためのヌクレオチド配列を有するバクミドで、対照トランスフェクション試薬及び異なるＨＲＰを使用してトランスフェクトした。図１８は、トランスフェクションからもたらされたｒＢＶ力価を示す。培養中に、その後、初期バクミドトランスフェクションから生成されたｒＢＶに、他のＳｆ９細胞を感染させ、次いで、このＳｆ９細胞が、更なるｒＢＶを生成した。図１８に示されるように、ＬＡＨ４、ＬＡＨ５、及びＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４でトランスフェクトされたＳｆ９細胞からのｒＢＶ力価は、対照試薬でトランスフェクトされたＳｆ９細胞からのｒＢＶ力価と同等であった。

【0296】

異なるｒＢＶが、ＡＡＶ５キャプシドを生成するためのヌクレオチド配列を有する場合、これらのｒＢＶを採取し、これらを使用して、ナイーブＳｆ９細胞を更に感染させて、ＡＡＶ５キャプシドを生成した。力価を、ｄｄＰＣＲを使用して決定した。図１９に示されるように、及びＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４でトランスフェクトされたＳｆ９細胞から産生されたｒＢＶは、対照試薬でトランスフェクトされたＳｆ９細胞内で産生されたｒＢＶと同等のＡＡＶ５キャプシド力価をもたらした。ＬＡＨ４－Ｌ１－Ｆ４を使用して産生されたＡＡＶ５キャプシドは、ＶＰ１キャプシドタンパク質の濃度及びキャプシド対ベクターゲノムの比が、対照トランスフェクション試薬を使用して産生されたＡＡＶ５キャプシドと同じであった。

【0297】

ＡＡＶ５キャプシドの大規模産生をもたらすために、異なる量のＳｆ９細胞を、ＡＡＶ５キャプシドを生成するための異なるＨＲＰ及びバクミドでトランスフェクトする。トランスフェクションから生成されたｒＢＶに、１００Ｌ、５００Ｌ、７５０Ｌ、１０００Ｌ、及び２０００Ｌの量を有する培養物を感染させて、ＡＡＶ５キャプシドを生成する。

【0298】

例示的な実施形態は上に説明されているが、これらの実施形態が本発明の全ての可能な形態を説明することは意図されていない。むしろ、本明細書で使用される単語は、限定ではなく説明の単語であり、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な変更がなされ得ることが理解される。更に、様々な実施形態の特徴を組み合わせて、本発明の更なる実施形態を形成し得る。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10A-10H】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

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【国際調査報告】