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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-14
(54)【発明の名称】ポリヌクレオチド検出のための方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6827 20180101AFI20240206BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240206BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240206BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6827 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023549570
(86)(22)【出願日】2022-02-16
(85)【翻訳文提出日】2023-10-10
(86)【国際出願番号】 GB2022050411
(87)【国際公開番号】W WO2022175655
(87)【国際公開日】2022-08-25
(31)【優先権主張番号】2102166.2
(32)【優先日】2021-02-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2102178.7
(32)【優先日】2021-02-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521027629
【氏名又は名称】バイオフィデリティ・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100157923
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴喰 寿孝
(72)【発明者】
【氏名】ストラレク－ヤヌツキーヴィッチ，マグダレーナ
(72)【発明者】
【氏名】バームフォース，バーナビー・ウィリアム
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR07
4B063QR08
4B063QR14
4B063QR20
4B063QR32
4B063QR55
4B063QR56
4B063QR62
4B063QS25
4B063QX02
(57)【要約】
本発明は、癌、感染性疾患、および移植臓器拒絶の同定において使用されるものを含めた多数の診断的マーカーの存在を試験するために適切な、簡易化されたポリヌクレオチド配列検出方法に関する。これはまた、マーカーのパネルを信頼度高くかつ低価格で同定しなければならないコンパニオン診断試験にも有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中に存在する所定の核酸分析物中の標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法であって、（ａ）遮断オリゴヌクレオチドを、１つまたは複数の核酸分析物を含む第１の反応混合物に導入するステップであって、遮断オリゴヌクレオチドが、非標的ポリヌクレオチド配列の少なくとも部分組とアニーリングする、ステップと、
（ｂ）（ａ）で生成された混合物を、
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素と、
ｉｉｉ．リガーゼと
を含む第２の反応に導入するステップであって、標的分析物が、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０とアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物を作り出し、Ａ０の３’末端が二本鎖複合体を形成し、Ａ０が、３’末端から３’－５’方向で加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ１を作り出し、Ａ１がライゲーションを受けてＡ２を形成する、ステップと、
（ｃ）以前のステップの生成物に由来するシグナルを検出するステップであって、生成物が、Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分であり、それらから分析物中のポリヌクレオチド標的配列の存在または非存在を推測する、ステップと
を含む、方法。
【請求項2】
分析物と任意選択で背景ゲノムＤＮＡとから構成される生体試料をＰＣＲに供することによって分析物の複製配列を生成することによって、１つまたは複数の一本鎖分析物を生体試料から誘導するステップであって、プライマーのうちの１つまたは複数が非相補的５’テイルを有する、ステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
分析物と任意選択で背景ゲノムＤＮＡとから構成される生体試料をＰＣＲに供することによって分析物の複製配列を生成することによって、１つまたは複数の一本鎖分析物を生体試料から誘導するステップであって、プライマーのうちの１つまたは複数が非相補的５’テイルを有し、プライマーのうちの１つまたは複数が５’保護されており、ＰＣＲ産物を５’－３’エクソヌクレアーゼで処理する、ステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
第１の反応混合物が、１つまたは複数のプライマー、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、および増幅酵素をさらに含み、ステップ（ａ）中に、試料中に存在する核酸分析物が増幅を受け、所定の核酸分析物の増幅の後かつ（ｂ）の前に、試料をプロテイナーゼでさらに処理することをさらに特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
第１および第２の反応混合物を合わせることをさらに特徴とし、（ｃ）１つまたは複数の核酸分析物を、
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
ｉｉ．遮断オリゴヌクレオチドと、
ｉｉｉ．加ピロリン酸分解酵素と、
ｉｖ．リガーゼと
を含む、合わせた反応混合物に導入するステップであって、遮断オリゴヌクレオチドが、非標的ポリヌクレオチド配列の少なくとも部分組とアニーリングし、標的分析物が、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０とアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物を作り出し、Ａ０の３’末端が二本鎖複合体を形成し、Ａ０が、３’末端から３’－５’方向で加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ１を作り出し、Ａ１がライゲーションを受けてＡ２を形成する、ステップと、
（ｄ）以前のステップの生成物に由来するシグナルを検出するステップであって、生成物が、Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分であり、それらから分析物中のポリヌクレオチド標的配列の存在または非存在を推測する、ステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
加ピロリン酸分解酵素を含む反応混合物がピロリン酸イオン供給源をさらに含むことをさらに特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
生体試料中に存在するＲＮＡの標的領域が、１つまたは複数の核酸分析物を、加ピロリン酸分解酵素を含む反応混合物に導入する前に、逆転写酵素によってＤＮＡへと逆転写されることをさらに特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
遮断オリゴヌクレオチドが、標的核酸分析物と完全に相補的であり、非標的核酸分析物とミスマッチであり、非標的核酸分析物が遮断オリゴヌクレオチドと不完全にアニーリングして、非標的分子から融解するために必要な程度まで加ピロリン酸分解によって消化されることができない中間生成物を形成するステップ、
標的核酸分析物が遮断オリゴヌクレオチドと完全にアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である中間生成物を形成し、遮断オリゴヌクレオチドが３’－５’方向で加ピロリン酸分解され、標的核酸分析物を放出するステップ、
標的核酸分析物が、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０とアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物を作り出し、Ａ０の３’末端が二本鎖複合体を形成し、Ａ０が、３’末端から３’－５’方向で加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ１を作り出し、Ａ１がライゲーションを受けてＡ２を形成するステップ、および
以前のステップの生成物に由来するシグナルを検出するステップであって、生成物が、Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分であり、それらから分析物中のポリヌクレオチド標的配列の存在または非存在を推測する、ステップ
をさらに特徴とする、請求項１から３、５、または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
遮断オリゴヌクレオチドが、消化に対する耐性を与えるために３’または５’修飾を含むことをさらに特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
第２のまたは合わせた反応混合物が、Ａ０の一部分と実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含むことをさらに特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
第２のまたは合わせた反応混合物が増幅酵素をさらに含むことをさらに特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
加ピロリン酸分解反応の生成物が、検出ステップの前に、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドおよびｄＮＴＰを含む第３の反応混合物に導入されることをさらに特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
第３の反応混合物が増幅酵素をさらに含むことをさらに特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
第２のまたは合わせた反応混合物が、１つまたは複数のリガーゼと、
Ａ２上の隣接配列と相補的な２つ以上のＬＣＲプローブオリゴヌクレオチドであって、プローブが、Ａ２とのアニーリングが成功する場合、一方のＬＣＲプローブの５’リン酸が他方のＬＣＲプローブの３’ＯＨと直接隣接している、ＬＣＲプローブオリゴヌクレオチドと
をさらに含み、Ａ２の存在下では、２つのＬＣＲプローブはＡ２とのアニーリングが成功し、一緒にライゲーションされて、１つのオリゴヌクレオチド分子を形成し、その後、これが第２ラウンドの共有的ライゲーションの新しい標的として働き、目的の標的、この場合はＡ２の幾何学的増幅をもたらし、その後、これを検出することをさらに特徴とする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
加ピロリン酸分解反応の生成物が、検出ステップの前に、１つまたは複数のリガーゼと、
Ａ２上の隣接配列と相補的な２つ以上のＬＣＲプローブオリゴヌクレオチドであって、プローブが、Ａ２とのアニーリングが成功する場合、一方のＬＣＲプローブの５’リン酸が他方のＬＣＲプローブの３’ＯＨと直接隣接している、ＬＣＲプローブオリゴヌクレオチドと
を含む第３の反応混合物に導入され、Ａ２の存在下では、２つのＬＣＲプローブはＡ２とのアニーリングが成功し、一緒にライゲーションされて、１つのオリゴヌクレオチド分子を形成し、その後、これが第２ラウンドの共有的ライゲーションの新しい標的として働き、目的の標的、この場合はＡ２の幾何学的増幅をもたらし、その後、これを検出することをさらに特徴とする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
第２のまたは合わせた反応混合物が、その蛍光が、互いとまたは１つもしくは複数の蛍光クエンチャーのいずれかとのその近接によってクエンチされるように配置された、１つのまたは複数のフルオロフォアを含む、ライゲーション部位を含むＡ２の一領域と相補的であるオリゴヌクレオチドと、
二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素と
をさらに含み、Ａ２の存在下で、標識されたオリゴヌクレオチドは、フルオロフォアが互いからまたはその対応するクエンチャーから分離されており、蛍光シグナル、したがってＡ２の存在が検出可能であるように、消化されることをさらに特徴とする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
加ピロリン酸分解反応の生成物が、検出ステップの前に、その蛍光が、互いとまたは１つもしくは複数の蛍光クエンチャーのいずれかとのその近接によってクエンチされるように配置された、１つのまたは複数のフルオロフォアを含む、ライゲーション部位を含むＡ２の一領域と相補的であるオリゴヌクレオチドと、
二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素と
を含む第３の反応混合物に導入され、Ａ２の存在下で、標識されたオリゴヌクレオチドは、フルオロフォアが互いからまたはその対応するクエンチャーから分離されており、蛍光シグナル、したがってＡ２の存在が検出可能であるように、消化されることをさらに特徴とする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
部分的に消化された鎖Ａ１が、その３’および５’末端のライゲーションを通じて環状化されて、オリゴヌクレオチドＡ２を作り出すことをさらに特徴とする、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
第２のまたは合わせた反応混合物が、ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣをさらに含み、部分的に消化された鎖Ａ１が、３’末端で、Ｃの５’末端へライゲーションされて、オリゴヌクレオチドＡ２を作り出すことをさらに特徴とする、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
オリゴヌクレオチドＣが、それを３’－５’エクソヌクレアーゼ消化から保護する３’または内部修飾をさらに含むことをさらに特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
第１、第２、第３の、または合わせた反応混合物が、スプリントオリゴヌクレオチドＤをさらに含むことをさらに特徴とする、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
Ｄが、Ａ１の３’末端と相補的なオリゴヌクレオチド領域と、オリゴヌクレオチドＣの５’末端またはＡ１の５’末端のどちらかと相補的な領域とを含むことをさらに特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
Ｄが、３’修飾が原因で、またはＤの３’末端とＡ１の対応する領域との間のミスマッチのいずれかで、Ａ１に対する伸長を受けることができないことをさらに特徴とする、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
第１、第２の、または合わせた反応混合物が、５’－３’エクソヌクレアーゼをさらに含み、Ａ０の５’末端が、５’－３’エクソヌクレアーゼ消化に対する耐性が与えられていることをさらに特徴とする、請求項１から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項25】
第１、第２の、または合わせた反応混合物がホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含むことをさらに特徴とする、請求項１から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項26】
検出ステップの前またはその間に、以前のステップの生成物をピロホスファターゼまたはエクソヌクレアーゼで処理することをさらに特徴とする、請求項１から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項27】
Ａ０の加ピロリン酸分解を行って部分的に消化された鎖Ａ１を形成する酵素が、Ａ２も増幅することをさらに特徴とする、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
検出を、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを使用して達成することをさらに特徴とする、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
Ａ２の複製配列の生成から生じる経時的なシグナルの増加を使用して、分析物中の標的配列の濃度を推測することをさらに特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
複数のプローブＡ０を用い、それぞれが異なる標的配列に対して選択的であり、それぞれが同定領域を含むことをさらに特徴とし、Ａ２の複製配列がこの同定領域を含み、したがって、同定領域の検出を通じて分析物中に存在する標的配列を推測することをさらに特徴とする、請求項１から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項31】
同定領域の検出が、分子プローブを使用してまたはシーケンシングを通じて実施されることをさらに特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
方法の最終ステップが、ｉ．１つまたは複数のオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを使用して、加ピロリン酸分解ステップの生成物を標識するステップと、
ｉｉ．生成物の蛍光シグナルを測定するステップと、
ｉｉｉ．生成物を一組の変性条件に曝露させるステップと、
変性条件への曝露中の生成物の蛍光シグナルの変化をモニタリングすることによって、分析物中のポリヌクレオチド標的配列を同定するステップと
を含むことをさらに特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項33】
１つまたは複数の核酸分析物が、複数の反応体積へと分割され、それぞれの体積が、様々な標的配列を検出するために導入された１つまたは複数のプローブオリゴヌクレオチドＡ０を有することをさらに特徴とし、異なるプローブＡ０が共通のプライミング部位を含み、単一のプライマーまたは単一組のプライマーを増幅に使用することを可能にすることをさらに特徴とする、請求項１から３２に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、癌、感染性疾患、および移植臓器拒絶の同定において使用されるものを含めた多数の診断的マーカーの存在を試験するために適切な、簡易化されたポリヌクレオチド配列検出方法に関する。これはまた、マーカーのパネルを信頼度高く低価格で同定しなければならないコンパニオン診断試験にも有用である。
【背景技術】
【0002】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、実験室および診断的試料中に存在するＤＮＡまたはＲＮＡを、信頼度高く検出および／または定量することができる程度まで増幅するための、周知かつ強力な技法である。しかし、そのような分子を低レベルで含有する分析物試料を調査する目的に適用した場合、これはいくつかの制限に苦しむ。第１に、この技法は、少なければ単一の標的分子を検出することができる一方で、試料中に存在する他の核酸配列の望まない増幅が原因で偽の陽性結果を生じやすい。これにより、反応を開始させるために使用するオリゴヌクレオチドプライマーの選択が重要となり、立ち代ってこれは、所要レベルの特異性を有するプライマーの設計を比較的複雑にする。その結果、現在市場で利用可能な多くのＰＣＲに基づく試験は特異性が制限されている。
【0003】
第２の欠点は、ＰＣＲに基づく方法の複合化は、プライマー－プライマーの相互作用を回避するために、実際には最大で数十標的配列（しばしば１０個を超えない）に制限されており、比較的狭い操作ウィンドウの必要性をもたらすことである。
【0004】
別の問題は、ＰＣＲ反応サイクルが指数関数的な様式であるため、標的の定量が困難であることである。反応効率の小さな変動が、生じる検出可能な材料の量に多大な影響を与える。したがって、適切な対照および較正を行った場合でも、定量は典型的には約３倍以内の正確さに制限される。
【0005】
最後に、ＰＣＲ増幅方法による調査の標的とされた領域中の突然変異は、望まない副作用を有する場合がある。たとえば、標的生物が、試験プライマーが標的とする遺伝子領域中に突然変異を起こし、多数の偽陰性を生じたため、ＦＤＡに認可された試験を撤回しなければならなかった事例がある。逆に、特定の一塩基多型（ＳＮＰ）が増幅の標的とされている場合、野生型変異体が存在する場合はＰＣＲ方法はしばしば偽陽性を示す。これの回避には非常に注意深いプライマー設計を要し、複合化の有効性をさらに制限する。このことは、癌の試験／スクリーニングまたはコンパニオン診断における一般的な要件である、ＳＮＰのパネルを検索する際に特に関連性がある。
【0006】
ＷＯ２０２０／０１６５９０号は、試料を一本鎖プローブと接触させ、プローブが標的と相補的である場合は加ピロリン酸分解酵素で消化され、消化されたプローブを検出する、標的核酸配列を検出する方法を記載する。この方法は溶液中で起こり、加ピロリン酸分解およびライゲーションの複数のステップを使用して標的配列を検出する。以下の発明は、その間に開示されたアッセイの、より少ない酵素を使用した簡易バージョンである。
【0007】
Ｉｎｇｒａｍら（「改善された対立遺伝子特異的フットプリント法および自動クロマチン微細構造分析のためのＰＡＰ－ＬＭＰＣＲ（ＰＡＰ－ＬＭＰＣＲ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ， ａｌｌｅｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｏｔｐｒｉｎｔｉｎｇ ａｎｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｆｉｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）」、ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ、第３６巻、第３号、２００８年１月２１日）は、ライゲーション反応が加ピロリン酸分解誘導緩衝液の存在下で非常に非効率的である方法を教示する。本発明者らは、驚くべきことに、Ｉｎｇｒａｍらの開示が反対の教唆をしている、効率的に進行する合わせた加ピロリン酸分解およびライゲーションステップを含む、ＷＯ２０２０／０１６５９０号の方法への改善を見出した。
【発明の概要】
【0008】
本発明者らは今回、本発明者らの以前の特許（ＷＯ２００１６５９０ Ａ１号、ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３３６１号、ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３３６２号、ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３３６３号、ＧＢ２０２０５３９．９号、およびＧＢ２１０１１７６．２号）において用いた加ピロリン酸分解反応を使用した本発明者らの経験に基づく、改善された方法を開発した。遮断オリゴヌクレオチドを用いた組合せは、これらの制限の多くに打ち克つ。その際、これは、（１）一本鎖オリゴヌクレオチド基質または遮断基もしくはヌクレオチドミスマッチを含む二本鎖基質では効率的に進行しない反応である、加ピロリン酸分解の二本鎖特異性と、（２）非特異的結合を低下させることによって本発明の方法の特異性を増加させる、遮断オリゴヌクレオチドの能力とを利用する。したがって、本発明によれば、所定の核酸分析物中の標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法であって、
（ａ）遮断オリゴヌクレオチドを、１つまたは複数の核酸分析物を含む第１の反応混合物に導入するステップであって、遮断オリゴヌクレオチドが、非標的ポリヌクレオチド配列の少なくとも部分組とアニーリングする、ステップと、
（ｂ）（ａ）で生成された混合物を、
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素と、
ｉｉｉ．リガーゼと
を含む第２の反応に導入するステップであって、標的分析物が、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０とアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物を作り出し、Ａ０の３’末端が二本鎖複合体を形成し、Ａ０が、３’末端から３’－５’方向で加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ１を作り出し、Ａ１がライゲーションを受けてＡ２を形成する、ステップと、
（ｃ）以前のステップの生成物に由来するシグナルを検出するステップであって、生成物が、Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分であり、それらから分析物中のポリヌクレオチド標的配列の存在または非存在を推測する、ステップと
を含む、方法が提供される。
（ａ）遮断オリゴヌクレオチドを、１つまたは複数の核酸分析物を含む第１の反応混合物に導入するステップであって、遮断オリゴヌクレオチドが、非標的ポリヌクレオチド配列の少なくとも部分組とアニーリングする、ステップと、
（ｂ）（ａ）で生成された混合物を、
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素と、
ｉｉｉ．リガーゼと
を含む第２の反応に導入するステップであって、標的分析物が、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０とアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物を作り出し、Ａ０の３’末端が二本鎖複合体を形成し、Ａ０が、３’末端から３’－５’方向で加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ１を作り出し、Ａ１がライゲーションを受けてＡ２を形成する、ステップと、
（ｃ）以前のステップの生成物に由来するシグナルを検出するステップであって、生成物が、Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分であり、それらから分析物中のポリヌクレオチド標的配列の存在または非存在を推測する、ステップと
を含む、方法が提供される。
【0009】
本発明の一態様では、試料中の所定の核酸分析物中のポリヌクレオチド標的配列を検出する方法であって、以下のステップ：
（ａ）分析物と任意選択で背景ゲノムＤＮＡとから構成される生体試料をＰＣＲに供することによって分析物の複製配列を生成することによって、１つまたは複数の分析物を生体試料から誘導するステップであって、プライマーのうちの１つまたは複数が非相補的５’テイルを有する、ステップと、
（ｂ）１つまたは複数の単鎖核酸分析物を、
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素と、
ｉｉｉ．リガーゼと
を含む第１の反応混合物に導入するステップであって、分析物が、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０とアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物を作り出し、Ａ０の３’末端が二本鎖複合体を形成し、Ａ０が、３’末端から３’－５’方向で加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ１を作り出し、Ａ１がライゲーションを受けてＡ２を形成する、ステップと、
（ｃ）以前のステップの生成物に由来するシグナルを検出するステップであって、生成物が、Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分であり、それらから分析物中のポリヌクレオチド標的配列の存在または非存在を推測する、ステップと
を含む、方法が提供される。
（ａ）分析物と任意選択で背景ゲノムＤＮＡとから構成される生体試料をＰＣＲに供することによって分析物の複製配列を生成することによって、１つまたは複数の分析物を生体試料から誘導するステップであって、プライマーのうちの１つまたは複数が非相補的５’テイルを有する、ステップと、
（ｂ）１つまたは複数の単鎖核酸分析物を、
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素と、
ｉｉｉ．リガーゼと
を含む第１の反応混合物に導入するステップであって、分析物が、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０とアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物を作り出し、Ａ０の３’末端が二本鎖複合体を形成し、Ａ０が、３’末端から３’－５’方向で加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ１を作り出し、Ａ１がライゲーションを受けてＡ２を形成する、ステップと、
（ｃ）以前のステップの生成物に由来するシグナルを検出するステップであって、生成物が、Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分であり、それらから分析物中のポリヌクレオチド標的配列の存在または非存在を推測する、ステップと
を含む、方法が提供される。
【0010】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）は、分析物と任意選択で背景ゲノムＤＮＡとから構成される生体試料をＰＣＲに供することによって分析物の複製配列を生成することによって、１つまたは複数の分析物を生体試料から誘導するステップであって、プライマーのうちの１つまたは複数が非相補的５’テイルを有する、ステップを含む。
【0011】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）は、分析物と任意選択で背景ゲノムＤＮＡとから構成される生体試料をＰＣＲに供することによって分析物の複製配列を生成することによって、１つまたは複数の一本鎖分析物を生体試料から誘導するステップであって、プライマーのうちの１つまたは複数が非相補的５’テイルを有し、プライマーのうちの一方が他方よりも過剰で導入されている、ステップを含む。
【0012】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）は、分析物と任意選択で背景ゲノムＤＮＡとから構成される生体試料をＰＣＲに供することによって分析物の複製配列を生成することによって、１つまたは複数の一本鎖分析物を生体試料から誘導するステップであって、プライマーのうちの１つまたは複数が非相補的５’テイルを有し、プライマーのうちの１つまたは複数が５’保護されており、ＰＣＲ産物を５’－３’エクソヌクレアーゼで処理する、ステップを含む。
【0013】
本発明の方法を適用することができる分析物は、天然に存在するまたは合成のＤＮＡまたはＲＮＡ分子などの、探求中の標的ポリヌクレオチド配列を含めた核酸である。一実施形態では、分析物は、典型的には分析物および他の生体物質を含有する水溶液中に存在し、一実施形態では、分析物は、試験の目的のためには目的でない、他の背景核酸分子と共に存在する。一部の実施形態では、分析物は、これらの他の核酸成分と比較して低い量で存在する。好ましくは、たとえば、分析物が細胞物質を含有する生物学的検体に由来する場合は、方法のステップ（ａ）を行う前に、これらの他の核酸および外来生体物質の一部または全部を、濾過、遠心分離、クロマトグラフィー、または電気泳動などの試料調製技法を使用して除去する。適切には、分析物は、血液、血漿、痰、尿、皮膚、または生検などの、哺乳動物対象（特にヒト患者）から採った生体試料に由来する。一実施形態では、生体試料を溶解に供して、存在するすべての細胞を破壊することによって分析物を放出させる。他の実施形態では、分析物は、血液または血漿中に循環する無細胞ＤＮＡなど、試料自体内に遊離形態で既に存在し得る。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】実施例１、初期ＰＣＲ増幅において様々な濃度の遮断オリゴヌクレオチドを使用したＥＧＦＲエクソン１９ｃｏｓｍ１２３８４突然変異の検出の結果である。結果は、使用した遮断オリゴヌクレオチドの濃度が高ければ高いほど、０％と０．１％ＡＦとの間のＣｑ値の相違が大きくなることを示す。
【図2】実施例２、合わせた加ピロリン酸分解およびライゲーションステップの前の、初期ＰＣＲ増幅に続く遮断オリゴヌクレオチドの導入、ならびに０．１％ＡＦのＴ７９０Ｍの検出の結果である。結果は、遮断オリゴヌクレオチドを使用することが、より大きな０％と０．１％ＡＦとの間のＣｑ値の相違をもたらすことを示す。
【図3】実施例３、０．１％ＡＦのＴ７９０Ｍの検出の方法における、的配列と完全に相補的な様々な濃度の遮断オリゴヌクレオチドの使用の結果である。結果は、遮断オリゴヌクレオチドの存在が０％と０．１％ＡＦとの間のＣｑ値の相違を増加させ、最適な遮断オリゴの濃度が約８０ｎＭであることを示す。
【図4】遮断オリゴヌクレオチドが初期ＰＣＲ増幅中に存在し得る、本発明の一実施形態の例示的な一例を示す図である。遮断オリゴヌクレオチドは存在する野生型鎖とアニーリングし、ＰＣＲによるその増幅を防止する。これは、突然変異鎖のみの優先的な増幅を可能にする。
【図5】遮断オリゴヌクレオチドが合わせた加ピロリン酸分解およびライゲーションステップのために存在する、本発明の一実施形態の例示的な一例を示す図である。遮断オリゴヌクレオチドは野生型分子と完全にアニーリングし、プローブＡ０のアニーリングを防止する。遮断オリゴヌクレオチドと標的突然変異分子との間のミスマッチは、より低い融解温度をもたらし、これは、突然変異分子とアニーリングした遮断オリゴヌクレオチドが、加ピロリン酸分解に使用する高温で融解するか、またはプローブＡ０によって追放されるかのどちらかである一方で、野生型分子とハイブリダイズしたものがアニーリングしたままであることを引き起こす。これは、突然変異鎖とのアニーリングが成功するプローブの画分、したがって本方法の結果として検出される蛍光シグナルレベルの有意な増加を生じる。
【図6】突然変異鎖中に存在する標的配列と完全に相補的であるが、野生型鎖中の相当する配列とミスマッチである遮断オリゴヌクレオチドが、合わせた加ピロリン酸分解およびライゲーションステップについて存在する、本発明の一実施形態の例示的な一例を示す図である。遮断オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のミスマッチの存在が原因で、存在する任意の野生型鎖と不完全にアニーリングし、これが、遮断オリゴヌクレオチドの任意の加ピロリン酸分解、次いで、任意のプローブＡ０の野生型鎖とのミスマッチアニーリングを防止する。遮断オリゴヌクレオチドは、存在する任意の突然変異鎖と完全にアニーリングし、完全に加ピロリン酸分解され、存在する任意のプローブＡ０が突然変異鎖とアニーリングし、次いで加ピロリン酸分解およびライゲーションが起こることが可能となる。
【図7】Ａ１を環状化して分析物標的配列に対するＡ２を形成することを示す略図である。Ａ０は、３’－５’方向でＡ０の３’末端から標的に対して進行的に消化されて部分的に消化された鎖Ａ１を形成し、これをステップ（Ａ）および（Ｂ）として示す。この進行的消化は、Ａ０／Ａ１の５’末端と相補的な標的の領域を露呈させ、その後、Ａ１の５’末端がこの領域とハイブリダイズし、これをステップ（Ｃ）において示す。その後、Ａ１を一緒にライゲーションさせて、環状化Ａ２を形成する、ステップ（Ｄ）。
【図8】一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０が、標的ポリヌクレオチド配列とアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物を作り出し、Ａ０の３’末端が標的ポリヌクレオチド配列と二本鎖複合体を形成することを示す図である。本発明のこの簡易化された実施形態では、標的とアニーリングしていないＡ０が、どのように本方法のさらなるステップに参加しないかを例示するために、２つのＡ０分子および１つの標的ポリヌクレオチド配列が存在する。この例示的な例では、Ａ０の３’末端は標的ポリヌクレオチド配列とアニーリングする一方で、Ａ０の５’末端はアニーリングしない。Ａ０の５’末端は、５’化学遮断基、共通のプライミング配列、およびバーコード領域を含む。 部分的に二本鎖の第１の中間生成物は、加ピロリン酸分解酵素の存在下、３’－５’方向でＡ０の３’末端から加ピロリン酸分解を受けて、部分的に消化された鎖Ａ１、分析物、および標的とアニーリングしなかった未消化のＡ０分子を作り出す。
【図9】Ａ１が一本鎖トリガーオリゴヌクレオチドＢとアニーリングしており、Ａ１鎖がＢに対して５’－３’方向に伸長されて、オリゴヌクレオチドＡ２を作り出すことを示す図である。この例示的な例では、トリガーオリゴヌクレオチドＢは５’化学遮断を有する。すべての未消化のＡ０はトリガーオリゴヌクレオチドＢとアニーリングするが、５’－３’方向でＢに対して伸長して本方法の後の部分のための標的である配列を生じることができない。本実施例では、Ａ２を、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドを用いてプライミングし、複数コピーのＡ２またはＡ２の一領域が作り出される。
【図10】Ａ１が、スプリントオリゴヌクレオチドＤとアニーリングし、その後、その３’および５’末端のライゲーションによって環状化されることを示す図である。今では環状化されたＡ２を、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドを用いてプライミングし、複数コピーのＡ２またはＡ２の一領域が作り出される。この例示的な例では、スプリントオリゴヌクレオチドＤは、３’修飾（この例示中では化学的）が原因で、またはＤの３’末端とＡ２の対応する領域との間のヌクレオチドミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ１に対して伸長することができない。
【図11】スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’領域はＡ１の３’領域とアニーリングする一方で、スプリントオリゴヌクレオチドＤの５’領域はライゲーションプローブＣの５’領域とアニーリングすることを示す図である。したがって、Ａ１と、Ｃと、任意選択で、Ｃの５’末端に合わせるために５’－３’方向のＡ１の伸長によって形成された中間領域とから構成される、第２の中間生成物Ａ２が形成される。この例示的な例では、３’－５’エクソヌクレアーゼを使用してすべてのライゲーションしていないＡ１を消化することができるように、ライゲーションプローブＣは３’化学遮断基を有する。 Ａ２を、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドを用いてプライミングし、複数コピーのＡ２またはＡ２の一領域が作り出される。
【図12】遮断オリゴヌクレオチド（ＢＯ）をＰＰＬステップの前またはその間に加えた場合の、０．１％ＡＦのＴ７９０Ｍ突然変異の検出を示す図である。０％と０．１％ＡＦとの間のＣｑ値の相違を示す結果であり、どちらの条件においても遮断オリゴの存在が０と０．１％ＡＦとの間の相違を増加させる。
【図13】２つの異なるプライマー組を使用した場合の、ＥＧＦＲ受容体、Ａ）Ｃｏｓｍ６２２５およびＢ）Ｃｏｓｍ６２１８に対する０．１％ＡＦの突然変異の検出を示す図である。非相補的テイルを含むプライマーを初期ＰＣＲに使用した場合に、蛍光レベルの明白な増加をどちらのグラフ中にも見ることができる。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明の一態様では、試料中の所定の核酸分析物中のポリヌクレオチド標的配列を検出する方法であって、以下のステップ：
（ａ）遮断オリゴヌクレオチドを、１つまたは複数の核酸分析物を含む第１の反応混合物に導入するステップであって、遮断オリゴヌクレオチドが、非標的ポリヌクレオチド配列の少なくとも部分組とアニーリングする、ステップと、
（ｂ）（ａ）で生成された混合物を、
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素と、
ｉｉｉ．リガーゼと
を含む第２の反応に導入するステップであって、標的分析物が、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０とアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物を作り出し、Ａ０の３’末端が二本鎖複合体を形成し、Ａ０が、３’末端から３’－５’方向で加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ１を作り出し、Ａ１がライゲーションを受けてＡ２を形成する、ステップと、
（ｃ）以前のステップの生成物に由来するシグナルを検出するステップであって、生成物が、Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分であり、それらから分析物中のポリヌクレオチド標的配列の存在または非存在を推測する、ステップと
を含む、方法が提供される。
（ａ）遮断オリゴヌクレオチドを、１つまたは複数の核酸分析物を含む第１の反応混合物に導入するステップであって、遮断オリゴヌクレオチドが、非標的ポリヌクレオチド配列の少なくとも部分組とアニーリングする、ステップと、
（ｂ）（ａ）で生成された混合物を、
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素と、
ｉｉｉ．リガーゼと
を含む第２の反応に導入するステップであって、標的分析物が、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０とアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物を作り出し、Ａ０の３’末端が二本鎖複合体を形成し、Ａ０が、３’末端から３’－５’方向で加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ１を作り出し、Ａ１がライゲーションを受けてＡ２を形成する、ステップと、
（ｃ）以前のステップの生成物に由来するシグナルを検出するステップであって、生成物が、Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分であり、それらから分析物中のポリヌクレオチド標的配列の存在または非存在を推測する、ステップと
を含む、方法が提供される。
【0016】
本発明の一態様では、試料中の所定の核酸分析物中のポリヌクレオチド標的配列を検出する方法であって、以下のステップ：
（ａ）分析物と任意選択で背景ゲノムＤＮＡとから構成される生体試料をＰＣＲに供することによって分析物の複製配列を生成することによって、１つまたは複数の分析物を生体試料から誘導するステップであって、プライマーのうちの１つまたは複数が非相補的５’テイルを有する、ステップと、
（ｂ）１つまたは複数の単鎖核酸分析物を、
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素と、
ｉｉｉ．リガーゼと
を含む第１の反応混合物に導入するステップであって、分析物が、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０とアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物を作り出し、Ａ０の３’末端が二本鎖複合体を形成し、Ａ０が、３’末端から３’－５’方向で加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ１を作り出し、Ａ１がライゲーションを受けてＡ２を形成する、ステップと、
（ｃ）以前のステップの生成物に由来するシグナルを検出するステップであって、生成物が、Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分であり、それらから分析物中のポリヌクレオチド標的配列の存在または非存在を推測する、ステップと
を含む、方法が提供される。
（ａ）分析物と任意選択で背景ゲノムＤＮＡとから構成される生体試料をＰＣＲに供することによって分析物の複製配列を生成することによって、１つまたは複数の分析物を生体試料から誘導するステップであって、プライマーのうちの１つまたは複数が非相補的５’テイルを有する、ステップと、
（ｂ）１つまたは複数の単鎖核酸分析物を、
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素と、
ｉｉｉ．リガーゼと
を含む第１の反応混合物に導入するステップであって、分析物が、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０とアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物を作り出し、Ａ０の３’末端が二本鎖複合体を形成し、Ａ０が、３’末端から３’－５’方向で加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ１を作り出し、Ａ１がライゲーションを受けてＡ２を形成する、ステップと、
（ｃ）以前のステップの生成物に由来するシグナルを検出するステップであって、生成物が、Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分であり、それらから分析物中のポリヌクレオチド標的配列の存在または非存在を推測する、ステップと
を含む、方法が提供される。
【0017】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）は、分析物と任意選択で背景ゲノムＤＮＡとから構成される生体試料をＰＣＲに供することによって分析物の複製配列を生成することによって、１つまたは複数の分析物を生体試料から誘導するステップであって、プライマーのうちの１つまたは複数が非相補的５’テイルを有する、ステップを含む。
【0018】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）は、分析物と任意選択で背景ゲノムＤＮＡとから構成される生体試料をＰＣＲに供することによって分析物の複製配列を生成することによって、１つまたは複数の一本鎖分析物を生体試料から誘導するステップであって、プライマーのうちの１つまたは複数が非相補的５’テイルを有し、プライマーのうちの一方が他方よりも過剰で導入されている、ステップを含む。
【0019】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）は、分析物と任意選択で背景ゲノムＤＮＡとから構成される生体試料をＰＣＲに供することによって分析物の複製配列を生成することによって、１つまたは複数の一本鎖分析物を生体試料から誘導するステップであって、プライマーのうちの１つまたは複数が非相補的５’テイルを有し、プライマーのうちの１つまたは複数が５’保護されており、ＰＣＲ産物を５’－３’エクソヌクレアーゼで処理する、ステップを含む。
【0020】
一部の実施形態では、５’保護されていない１つまたは複数のプライマーは、５’リン酸基を有し得る。
一部の実施形態では、第１の反応混合物は、１つまたは複数のプライマー、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、および増幅酵素をさらに含み、ステップ（ａ）中に、試料中に存在する核酸分析物は増幅を受け、所定の核酸分析物の増幅の後かつ（ｂ）の前に、試料をプロテイナーゼでさらに処理する。
一部の実施形態では、第１の反応混合物は、１つまたは複数のプライマー、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、および増幅酵素をさらに含み、ステップ（ａ）中に、試料中に存在する核酸分析物は増幅を受け、所定の核酸分析物の増幅の後かつ（ｂ）の前に、試料をプロテイナーゼでさらに処理する。
【0021】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）の前に、試料中に存在する核酸分析物を増幅し、所定の核酸分析物の増幅の後に、試料をプロテイナーゼでさらに処理する。
一部の実施形態では、ステップ（ａ）の前に試料をプロテイナーゼで処理する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）中に試料をプロテイナーゼで処理する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）の後に試料をプロテイナーゼで処理する。
一部の実施形態では、ステップ（ａ）の前に試料をプロテイナーゼで処理する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）中に試料をプロテイナーゼで処理する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）の後に試料をプロテイナーゼで処理する。
【0022】
一部の実施形態では、方法が以下のステップ：
（ａ）１つまたは複数の核酸分析物を、
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
ｉｉ．遮断オリゴヌクレオチドと、
ｉｉｉ．加ピロリン酸分解酵素と、
ｉｖ．リガーゼと
を含む、合わせた反応混合物に導入するステップであって、遮断オリゴヌクレオチドが、非標的ポリヌクレオチド配列の少なくとも部分組とアニーリングし、標的分析物が、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０とアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物を作り出し、Ａ０の３’末端が二本鎖複合体を形成し、Ａ０が、３’末端から３’－５’方向で加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ１を作り出し、Ａ１がライゲーションを受けてＡ２を形成する、ステップと、
（ｂ）以前のステップの生成物に由来するシグナルを検出するステップであって、生成物が、Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分であり、それらから分析物中のポリヌクレオチド標的配列の存在または非存在を推測する、ステップと
を含むように、第１および第２の反応混合物を合わせる。
（ａ）１つまたは複数の核酸分析物を、
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
ｉｉ．遮断オリゴヌクレオチドと、
ｉｉｉ．加ピロリン酸分解酵素と、
ｉｖ．リガーゼと
を含む、合わせた反応混合物に導入するステップであって、遮断オリゴヌクレオチドが、非標的ポリヌクレオチド配列の少なくとも部分組とアニーリングし、標的分析物が、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０とアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物を作り出し、Ａ０の３’末端が二本鎖複合体を形成し、Ａ０が、３’末端から３’－５’方向で加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ１を作り出し、Ａ１がライゲーションを受けてＡ２を形成する、ステップと、
（ｂ）以前のステップの生成物に由来するシグナルを検出するステップであって、生成物が、Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分であり、それらから分析物中のポリヌクレオチド標的配列の存在または非存在を推測する、ステップと
を含むように、第１および第２の反応混合物を合わせる。
【0023】
一部の実施形態では、加ピロリン酸分解酵素を含む反応混合物は、ピロリン酸イオン供給源をさらに含む。
一部の実施形態では、生体試料中に存在するＲＮＡの標的領域は、加ピロリン酸分解酵素を含む反応混合物に導入する前に、逆転写酵素によってＤＮＡへと逆転写される。
一部の実施形態では、生体試料中に存在するＲＮＡの標的領域は、加ピロリン酸分解酵素を含む反応混合物に導入する前に、逆転写酵素によってＤＮＡへと逆転写される。
【0024】
一部の実施形態では、これは、逆転写酵素および適切なヌクレオチドの使用を介して達成される。
一部の実施形態では、試料中に存在するＲＮＡは、試料中に存在する核酸のＰＣＲを介した任意の事前増幅と同時に、ＤＮＡへと転写される。
一部の実施形態では、試料中に存在するＲＮＡは、試料中に存在する核酸のＰＣＲを介した任意の事前増幅と同時に、ＤＮＡへと転写される。
【0025】
一部の実施形態では、試料中に存在する任意のＲＮＡのＤＮＡへの転写は、試料中に存在する核酸のＰＣＲを介した任意の事前増幅とは別個のステップで起こる。
以前にまたは続いて記載する方法のいずれかの一部の実施形態では、試料中に存在するＲＮＡはＤＮＡへと転写されない。
以前にまたは続いて記載する方法のいずれかの一部の実施形態では、試料中に存在するＲＮＡはＤＮＡへと転写されない。
【0026】
そのような実施形態では、Ａ０は、ＲＮＡ配列に対する加ピロリン酸分解を受けて、部分的に消化された鎖Ａ１を形成し、その後、方法は、以前にまたは続いて記載するように進行する。
【0027】
本方法の一部の実施形態では、
非標的核酸分析物が遮断オリゴヌクレオチドと不完全にアニーリングして、非標的分子から融解するために必要な程度まで加ピロリン酸分解によって消化されることができない中間生成物を形成し、
標的核酸分析物が遮断オリゴヌクレオチドと完全にアニーリングして、遮断オリゴヌクレオチドの３’末端で少なくとも部分的に二本鎖である中間生成物を形成し、遮断オリゴヌクレオチドが３’－５’方向で加ピロリン酸分解され、標的核酸分析物を放出し、
標的核酸分析物が、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０とアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物を作り出し、Ａ０の３’末端が二本鎖複合体を形成し、Ａ０が、３’末端から３’－５’方向で加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ１を作り出し、Ａ１がライゲーションを受けてＡ２を形成し、
以前のステップの生成物に由来するシグナルを検出し、生成物が、Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分であり、それらから分析物中のポリヌクレオチド標的配列の存在または非存在を推測する
ように、遮断オリゴヌクレオチドは、標的核酸分析物と完全に相補的であり、非標的核酸分析物とミスマッチである。
非標的核酸分析物が遮断オリゴヌクレオチドと不完全にアニーリングして、非標的分子から融解するために必要な程度まで加ピロリン酸分解によって消化されることができない中間生成物を形成し、
標的核酸分析物が遮断オリゴヌクレオチドと完全にアニーリングして、遮断オリゴヌクレオチドの３’末端で少なくとも部分的に二本鎖である中間生成物を形成し、遮断オリゴヌクレオチドが３’－５’方向で加ピロリン酸分解され、標的核酸分析物を放出し、
標的核酸分析物が、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０とアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物を作り出し、Ａ０の３’末端が二本鎖複合体を形成し、Ａ０が、３’末端から３’－５’方向で加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ１を作り出し、Ａ１がライゲーションを受けてＡ２を形成し、
以前のステップの生成物に由来するシグナルを検出し、生成物が、Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分であり、それらから分析物中のポリヌクレオチド標的配列の存在または非存在を推測する
ように、遮断オリゴヌクレオチドは、標的核酸分析物と完全に相補的であり、非標的核酸分析物とミスマッチである。
【0028】
遮断オリゴヌクレオチドが初期ＰＣＲ増幅中に存在し得る、本発明の一実施形態の例示的な一例を、図４中に見ることができる。遮断オリゴヌクレオチドは存在する野生型鎖とアニーリングし、ＰＣＲによるその増幅を防止する。これは、突然変異鎖のみの優先的な増幅を可能にする。
【0029】
遮断オリゴヌクレオチドが合わせた加ピロリン酸分解およびライゲーションステップのために存在する、本発明の一実施形態の例示的な一例を、図５中に見ることができる。遮断オリゴヌクレオチドは存在する野生型鎖と完全にアニーリングし、プローブＡ０のミスマッチアニーリングを防止する。遮断オリゴヌクレオチドは存在する突然変異鎖と不完全にアニーリングし、合わせた加ピロリン酸分解に使用する温度が原因で融解するか、またはプローブＡ０によって追放されるかのどちらかとなる。これは、突然変異鎖とのアニーリングが成功するプローブの画分、したがって本方法の結果として検出される蛍光シグナルレベルの有意な増加を生じる。
【0030】
突然変異鎖中に存在する標的配列と完全に相補的であるが、野生型鎖中の相当する配列とミスマッチである遮断オリゴヌクレオチドが、合わせた加ピロリン酸分解およびライゲーションステップについて存在する、本発明の一実施形態の例示的な一例を、図６中に見ることができる。遮断オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のミスマッチの存在が原因で、存在する任意の野生型鎖と不完全にアニーリングし、これが、遮断オリゴヌクレオチドの任意の加ピロリン酸分解、次いで、任意のプローブＡ０の野生型鎖とのミスマッチアニーリングを防止する。遮断オリゴヌクレオチドは、存在する任意の突然変異鎖と完全にアニーリングし、完全に加ピロリン酸分解され、存在する任意のプローブＡ０が突然変異鎖とアニーリングし、次いで加ピロリン酸分解およびライゲーションが起こることが可能となる。
【0031】
一部の実施形態では、遮断オリゴヌクレオチドは、それにエクソヌクレアーゼ分解または加ピロリン酸分解による消化に対する耐性を与えるために、修飾を含む。
一部の実施形態では、遮断オリゴヌクレオチドは、それにエクソヌクレアーゼ分解または加ピロリン酸分解による消化に対する耐性を与えるために、３’修飾を含む。
一部の実施形態では、遮断オリゴヌクレオチドは、それにエクソヌクレアーゼ分解または加ピロリン酸分解による消化に対する耐性を与えるために、３’修飾を含む。
【0032】
一部の実施形態では、遮断オリゴヌクレオチドは、それにエクソヌクレアーゼ分解による消化に対する耐性を与えるために、５’修飾を含む。
一部の実施形態では、第２のまたは合わせた反応混合物は、Ａ０の一部分と実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む。
一部の実施形態では、第２のまたは合わせた反応混合物は、Ａ０の一部分と実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む。
【0033】
一部の実施形態では、第２のまたは合わせた反応混合物は、増幅／ポリメラーゼ酵素をさらに含む。
一部の実施形態では、加ピロリン酸分解反応の生成物は、検出ステップの前に、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドおよびｄＮＴＰを含む第３の反応混合物に導入される。
一部の実施形態では、加ピロリン酸分解反応の生成物は、検出ステップの前に、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドおよびｄＮＴＰを含む第３の反応混合物に導入される。
【0034】
一部の実施形態では、第３の反応混合物は、増幅／ポリメラーゼ酵素をさらに含む。
一部の実施形態では、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、
－ 少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチド、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、および増幅酵素、または
－ ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）に適した試薬、または
－ ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）に適した試薬
をさらに含み、加ピロリン酸分解酵素は、増幅を行うものと任意選択で同じ酵素である。
一部の実施形態では、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、
－ 少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチド、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、および増幅酵素、または
－ ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）に適した試薬、または
－ ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）に適した試薬
をさらに含み、加ピロリン酸分解酵素は、増幅を行うものと任意選択で同じ酵素である。
【0035】
一部の実施形態では、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）はホットスタートｄＮＴＰである。
ホットスタートデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）は、３’末端で熱不安定性保護基で修飾されたｄＮＴＰである。この修飾の存在は、ヌクレオチド保護基が熱活性化ステップを使用して除去されるまで、ＤＮＡポリメラーゼヌクレオチドの取り込みを遮断する。
ホットスタートデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）は、３’末端で熱不安定性保護基で修飾されたｄＮＴＰである。この修飾の存在は、ヌクレオチド保護基が熱活性化ステップを使用して除去されるまで、ＤＮＡポリメラーゼヌクレオチドの取り込みを遮断する。
【0036】
一実施形態では、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）のための成分をさらに含む。
【0037】
一部の実施形態では、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、５’リン酸を有するライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣ、Ａ１の３’末端と相補的なスプリントオリゴヌクレオチドＤ、およびＣの５’末端をさらに含み、部分的に消化された鎖Ａ１が、３’末端で、Ｃの５’末端へライゲーションされて、オリゴヌクレオチドＡ２を形成する。
【0038】
本実施形態では、反応混合物は、ヘアピンオリゴヌクレオチド１（ＨＯ１）およびヘアピンオリゴヌクレオチド２（ＨＯ２）をさらに含み、ヘアピンオリゴヌクレオチドのそれぞれがフルオロフォアおよびクエンチャーを含み、それぞれのオリゴヌクレオチドがヘアピン立体配置に保たれる場合に、フルオロフォアとクエンチャーは互いに接触している。ＨＯ１は、Ａ２がＨＯ１とアニーリングし、「ヘアピン」構造を開いてフルオロフォアをクエンチャーから分離させるように設計されており、ここで今は「開いた」ＨＯ１は、今はＨＯ２とアニーリングし、「ヘアピン」構造を開いてフルオロフォアをクエンチャーから分離させることができる。
【0039】
本実施形態では、１つのＡ２の存在がヘアピンオリゴヌクレオチドの開口の連鎖反応を引き起こし、検出可能な蛍光シグナルの生成をもたらすことができるように、複数のヘアピンオリゴヌクレオチドが存在する。この方法は、文献中においてハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）として知られる。
【0040】
一部の実施形態では、フルオロフォア－クエンチャー対のフルオロフォアは、それだけには限定されないが、フルオレセインファミリー、カルボキシローダミンファミリー、シアニンファミリー、およびローダミンファミリーの色素から選択される。使用することができる他の色素ファミリーとしては、たとえば、ポリハロフルオレセインファミリー色素、ヘキサクロロフルオレセインファミリー色素、クマリンファミリー色素、オキサジンファミリー色素、チアジンファミリー色素、スクアレインファミリー色素、キレート化ランタニドファミリー色素、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから商品名Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｊの下で入手可能な色素ファミリー、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ（ドイツＳｉｅｇｅｎ）から商品名Ａｔｔｏの下で入手可能な色素ファミリー、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）から商品名Ｂｏｄｉｐｙ Ｊの下で入手可能な色素ファミリーが挙げられる。フルオレセインファミリーの色素としては、たとえば、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，－テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’－ジメトキシ－４’，５’－ジクロロ－６－カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２’－クロロ－５’－フルオロ－７’，８’－融合フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）、２’－クロロ－７’－フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、および２’，４’，５’，７’－テトラクロロ－５－カルボキシ－フルオレセイン（ＺＯＥ）が挙げられる。カルボキシローダミンファミリーの色素としては、テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラプロパノ－６－カルボキシローダミン（ＲＯＸ）、テキサスレッド、Ｒ１１０、およびＲ６Ｇが挙げられる。シアニンファミリーの色素としては、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７が挙げられる。フルオロフォアは、たとえば、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）、およびＡｍｅｒｓｈａｍ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）から容易に購入される。
【0041】
一部の実施形態では、フルオロフォア－クエンチャー対のクエンチャーは、蛍光クエンチャーまたは非蛍光クエンチャーであり得る。蛍光クエンチャーとしては、それだけには限定されないが、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、ニトロチアゾールブルー（ＮＴＢ）を含むシアニン色素、アントラキノン、マラカイトグリーン、ニトロチアゾール、およびニトロイミダゾール化合物が挙げられる。フルオロフォアから吸収されたエネルギーを消散させる例示的な非蛍光クエンチャーとしては、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州Ｎｏｖａｔｏ）から商品名Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ（商標）の下で入手可能なもの、Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ワシントン州Ｂｏｔｈｅｌｌ）から商品名Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標） Ｄａｒｋの下で入手可能なもの、Ａｎａｓｐｅｃ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）から商品名Ｑｘ１Ｊの下で入手可能なもの、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アイオワ州Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ）から商品名ＺＥＮおよびＴＡＯの下で入手可能なもの、ならびにＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アイオワ州Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ）から商品名Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）の下で入手可能なものが挙げられる。
【0042】
一部の実施形態では、フルオロフォア－クエンチャー対のフルオロフォアは、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ－フィコエリスリン、９－アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４－アセトアミド－４’－イソチオ－シアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸、７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン、スクシンイミジル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｄｙｌ）１－ピレンブチレート、および４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２－，２’－ジスルホン酸誘導体であり得る。
【0043】
一部の実施形態では、フルオロフォア－クエンチャー対のフルオロフォアは、ＬＣ－Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ－Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、またはランタニドイオン（たとえばユーロピウムもしくはテルビウム）の他のキレートであり得る。
【0044】
一部の実施形態では、本発明は、二重にクエンチされた蛍光標識したオリゴヌクレオチドを利用する。第２の内部クエンチャーを含めることは、色素とクエンチャーとの間の距離を短縮させ、第１のクエンチャーと協力して、より大きな全体的な色素クエンチングを提供し、背景を低下させ、シグナル検出を増加させる。第２および第１のクエンチャーは、以前に記載したクエンチャーのうちの任意のものであり得る。
【0045】
一代替実施形態では、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、５’リン酸を有するライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣ、Ａ１の３’末端と相補的なスプリントオリゴヌクレオチドＤ、およびＣの５’末端を含み、部分的に消化された鎖Ａ１が、３’末端で、Ｃの５’末端へライゲーションされて、オリゴヌクレオチドＡ２を形成する。
【0046】
一部の実施形態では、Ａ１の５’および３’末端を一緒にライゲーションさせて、環状化Ａ２を形成する。
一部の実施形態では、Ａ１を環状化させて、ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣに対するＡ２を形成する。
一部の実施形態では、Ａ１を環状化させて、ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣに対するＡ２を形成する。
【0047】
一部の実施形態では、Ａ０を環状化させて、スプリントオリゴヌクレオチドＤに対するＡ２を形成する。
一部の実施形態では、Ａ１を環状化させて、標的配列に対するＡ２を形成する。本実施形態では、３’－５’方向でＡ０の３’末端からＡ０の進行的消化によって露呈されてＡ１を形成する、標的の領域は、Ａ０／Ａ１の５’末端と相補的である。本実施形態では、リガーゼを使用してＡ１の３’および５’末端をライゲーションさせて、環状化オリゴヌクレオチドＡ２を形成し得る。これは、たとえば図７中に示されている。一実施形態では、Ａ０／Ａ１の５’末端は、５～５０個のヌクレオチドの長さである領域にわたって、標的と相補的である。一実施形態では、これは５～２５個のヌクレオチドの長さである。一実施形態では、これは５～２０個のヌクレオチドの長さである。一実施形態では、これは５～１５個のヌクレオチドの長さである。一実施形態では、これは５～１２個のヌクレオチドの長さである。一実施形態では、これは５～１０個のヌクレオチドの長さである。
一部の実施形態では、Ａ１を環状化させて、標的配列に対するＡ２を形成する。本実施形態では、３’－５’方向でＡ０の３’末端からＡ０の進行的消化によって露呈されてＡ１を形成する、標的の領域は、Ａ０／Ａ１の５’末端と相補的である。本実施形態では、リガーゼを使用してＡ１の３’および５’末端をライゲーションさせて、環状化オリゴヌクレオチドＡ２を形成し得る。これは、たとえば図７中に示されている。一実施形態では、Ａ０／Ａ１の５’末端は、５～５０個のヌクレオチドの長さである領域にわたって、標的と相補的である。一実施形態では、これは５～２５個のヌクレオチドの長さである。一実施形態では、これは５～２０個のヌクレオチドの長さである。一実施形態では、これは５～１５個のヌクレオチドの長さである。一実施形態では、これは５～１２個のヌクレオチドの長さである。一実施形態では、これは５～１０個のヌクレオチドの長さである。
【0048】
一部の実施形態では、以前にまたは続いて記載するように、Ａ１を環状化させて、Ａ２を形成する。
一部の実施形態では、以前にまたは続いて記載するように、Ａ２を部分的に消化された鎖Ａ１から形成する。
一部の実施形態では、以前にまたは続いて記載するように、Ａ２を部分的に消化された鎖Ａ１から形成する。
【0049】
一実施形態では、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、
－ 基質アーム、部分的触媒核、およびセンサーアームを含む、オリゴヌクレオチドＡと、
－ 基質アーム、部分的触媒核、およびセンサーアームを含む、オリゴヌクレオチドＢと、
－ フルオロフォア－クエンチャー対を含む基質と
をさらに含み、Ａ２の存在下でオリゴヌクレオチドＡおよびＢが組み合わされて触媒的に多成分の核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）が形成されるように、オリゴヌクレオチドＡおよびＢのセンサーアームがＡ２のフランキング領域と相補的である。本実施形態では、ＭＮＡｚｙｍｅはＡ２の存在下でのみ形成され、検出可能な蛍光シグナルが生成されるようにフルオロフォア－クエンチャー対を含む基質を切断する。
－ 基質アーム、部分的触媒核、およびセンサーアームを含む、オリゴヌクレオチドＡと、
－ 基質アーム、部分的触媒核、およびセンサーアームを含む、オリゴヌクレオチドＢと、
－ フルオロフォア－クエンチャー対を含む基質と
をさらに含み、Ａ２の存在下でオリゴヌクレオチドＡおよびＢが組み合わされて触媒的に多成分の核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）が形成されるように、オリゴヌクレオチドＡおよびＢのセンサーアームがＡ２のフランキング領域と相補的である。本実施形態では、ＭＮＡｚｙｍｅはＡ２の存在下でのみ形成され、検出可能な蛍光シグナルが生成されるようにフルオロフォア－クエンチャー対を含む基質を切断する。
【0050】
一部の実施形態では、フルオロフォア－クエンチャー対は、以前に記載した通りであり得る。
一部の実施形態では、加ピロリン酸分解、ライゲーション、および検出可能な蛍光シグナルの生成が、さらなる試薬の添加なしで起こるように、本発明の反応混合物を合わせる。
一部の実施形態では、加ピロリン酸分解、ライゲーション、および検出可能な蛍光シグナルの生成が、さらなる試薬の添加なしで起こるように、本発明の反応混合物を合わせる。
【0051】
一代替実施形態では、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、部分的に二本鎖の核酸構築体であって、
－ 一方の鎖が、少なくとも１つのＲＮＡ塩基、少なくとも１つのフルオロフォアを含み、この鎖の一領域がＡ２の一領域と相補的であり、この鎖を「基質」鎖と呼んでよく、
－ 他方の鎖が、少なくとも１つのクエンチャーを含み、この鎖の一領域が、Ａ２の存在下で部分的に二本鎖の核酸構築体が実質的により二本鎖となるように、基質鎖が相補的である領域に隣接するＡ２の一領域と相補的であり、
実質的により二本鎖となるプロセスにおいて、二本鎖核酸構築体の基質鎖がＲＮＡ塩基で切断され、「他方の」鎖の少なくとも１つのクエンチャーが基質鎖の少なくとも１つのフルオロフォアにもはや十分近接しなくなることが原因で蛍光を生じる、核酸構築体をさらに含む。
－ 一方の鎖が、少なくとも１つのＲＮＡ塩基、少なくとも１つのフルオロフォアを含み、この鎖の一領域がＡ２の一領域と相補的であり、この鎖を「基質」鎖と呼んでよく、
－ 他方の鎖が、少なくとも１つのクエンチャーを含み、この鎖の一領域が、Ａ２の存在下で部分的に二本鎖の核酸構築体が実質的により二本鎖となるように、基質鎖が相補的である領域に隣接するＡ２の一領域と相補的であり、
実質的により二本鎖となるプロセスにおいて、二本鎖核酸構築体の基質鎖がＲＮＡ塩基で切断され、「他方の」鎖の少なくとも１つのクエンチャーが基質鎖の少なくとも１つのフルオロフォアにもはや十分近接しなくなることが原因で蛍光を生じる、核酸構築体をさらに含む。
【0052】
言い換えれば、部分的に二本鎖の核酸構築体は、Ａ２の存在下でより大きな二本鎖部分を有する。
一部の実施形態では、フルオロフォア－クエンチャー対は、以前に記載した通りであり得る。
一部の実施形態では、フルオロフォア－クエンチャー対は、以前に記載した通りであり得る。
【0053】
一部の実施形態では、適切な緩衝液および／またはイオンなどのさらなる試薬が、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物中に存在する。
【0054】
一部の実施形態では、反応混合物はＭｇ２＋イオンをさらに含む。
一部の実施形態では、反応混合物はＺｎ２＋イオンをさらに含む。
一部の実施形態では、反応混合物はＸ２＋イオンをさらに含み、Ｘは金属である。
一部の実施形態では、反応混合物はＺｎ２＋イオンをさらに含む。
一部の実施形態では、反応混合物はＸ２＋イオンをさらに含み、Ｘは金属である。
【0055】
一部の実施形態では、反応混合物は１つまたは複数のＸ２＋イオンをさらに含み、Ｘは金属である。
一代替実施形態では、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のための試薬をさらに含む。
一代替実施形態では、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のための試薬をさらに含む。
【0056】
一部の実施形態では、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、
ａ．１つまたは複数のリガーゼと、
ｂ．Ａ２上の隣接配列と相補的な２つ以上のＬＣＲプローブオリゴヌクレオチドであって、プローブが、Ａ２とのアニーリングが成功する場合、一方のＬＣＲプローブの５’リン酸が他方のＬＣＲプローブの３’ＯＨと直接隣接している、ＬＣＲプローブオリゴヌクレオチドと
を含む。
ａ．１つまたは複数のリガーゼと、
ｂ．Ａ２上の隣接配列と相補的な２つ以上のＬＣＲプローブオリゴヌクレオチドであって、プローブが、Ａ２とのアニーリングが成功する場合、一方のＬＣＲプローブの５’リン酸が他方のＬＣＲプローブの３’ＯＨと直接隣接している、ＬＣＲプローブオリゴヌクレオチドと
を含む。
【0057】
一部の実施形態では、Ａ２の存在下では、２つのＬＣＲプローブはＡ２とのアニーリングが成功し、一緒にライゲーションされて、１つのオリゴヌクレオチド分子を形成し、続いてこれが、第２ラウンドの共有的ライゲーションの新しい標的として働き、目的の標的、この場合はＡ２の幾何学的増幅をもたらす。ライゲーションされた生成物、または複製配列は、Ａ２と相補的であり、次の増幅サイクルにおいて標的として機能する。したがって、特異的標的ＤＮＡ配列の指数関数的増幅は、過剰なＬＣＲプローブの存在下における変性、ハイブリダイゼーション、およびライゲーションの繰り返しサイクルを通じて達成される。このことから、Ａ２の存在、ひいては標的ポリヌクレオチド配列の存在が暗示される。
【0058】
一部の実施形態では、Ａ２の存在下では、２つのＰＣＲプローブはＡ２とのアニーリングが成功し、一緒にライゲーションされて、１つのオリゴヌクレオチド分子を形成し、その後、これが第２ラウンドの共有的ライゲーションの新しい標的として働き、目的の標的、この場合はＡ２の幾何学的増幅をもたらし、その後、これを検出する。
【0059】
一部の実施形態では、ライゲーションされたオリゴヌクレオチド分子は、挿入色素を使用してリアルタイムで検出する。
一部の実施形態では、ライゲーションされたオリゴヌクレオチド分子は、ゲル電気泳動を使用して検出する。
一部の実施形態では、ライゲーションされたオリゴヌクレオチド分子は、ゲル電気泳動を使用して検出する。
【0060】
当業者には、ライゲーションされたオリゴヌクレオチド分子の検出を可能にするであろう数々の技法が存在することが理解されよう。
一部の実施形態では、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）はホットスタートｄＮＴＰである。
一部の実施形態では、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）はホットスタートｄＮＴＰである。
【0061】
一部の実施形態では、１つまたは複数のリガーゼは熱安定性である。
一部の実施形態では、１つまたは複数のリガーゼは天然に存在する。
別の実施形態では、１つまたは複数のリガーゼは操作されている。
一部の実施形態では、１つまたは複数のリガーゼは天然に存在する。
別の実施形態では、１つまたは複数のリガーゼは操作されている。
【0062】
一部の実施形態では、１つまたは複数のリガーゼは、以前にまたは続いて開示されている任意のリガーゼから選択される。
一部の実施形態では、１つまたは複数のポリメラーゼは熱安定性である。
一部の実施形態では、１つまたは複数のポリメラーゼは熱安定性である。
【0063】
一部の実施形態では、１つまたは複数のポリメラーゼは、以前にまたは続いて開示されている任意のポリメラーゼから選択される。
一部の実施形態では、１つまたは複数のポリメラーゼは天然に存在する。
一部の実施形態では、１つまたは複数のポリメラーゼは天然に存在する。
【0064】
別の実施形態では、１つまたは複数のポリメラーゼは操作されている。
一部の実施形態では、１つまたは複数のポリメラーゼは、加ピロリン酸分解に使用するものと同じである。
一部の実施形態では、１つまたは複数のポリメラーゼは、加ピロリン酸分解に使用するものと同じである。
【0065】
一部の実施形態では、本発明の１つまたは複数の酵素はホットスタート酵素である。
一部の実施形態では、本発明の１つまたは複数の酵素は熱安定性である。
一代替実施形態では、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、
ａ．Ａ２と相補的である、フルオロフォア－クエンチャー対を含むスプリントオリゴヌクレオチドと、
ｂ．二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素と
を含み、Ａ２の存在下では、スプリントオリゴヌクレオチドは、フルオロフォア－クエンチャー対が分離し、蛍光シグナル、したがってＡ２の存在が検出可能となるように消化される。
一部の実施形態では、本発明の１つまたは複数の酵素は熱安定性である。
一代替実施形態では、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、
ａ．Ａ２と相補的である、フルオロフォア－クエンチャー対を含むスプリントオリゴヌクレオチドと、
ｂ．二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素と
を含み、Ａ２の存在下では、スプリントオリゴヌクレオチドは、フルオロフォア－クエンチャー対が分離し、蛍光シグナル、したがってＡ２の存在が検出可能となるように消化される。
【0066】
一部の実施形態では、フルオロフォア－クエンチャー対は、以前に記載した通りであり得る。一部の実施形態では、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素はエクソヌクレアーゼである。別の実施形態では、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素は、校正活性を有するポリメラーゼである。別の実施形態では、反応混合物は、校正活性を有するエクソヌクレアーゼまたはポリメラーゼのうちの１つまたは複数の混合物を含む。
【0067】
一部の実施形態では、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素はホットスタート酵素である。
一部の実施形態では、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素は、本方法の加ピロリン酸分解反応が起こる温度で活性が低下している。
一部の実施形態では、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素は、本方法の加ピロリン酸分解反応が起こる温度で活性が低下している。
【0068】
一部の実施形態では、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素は、本方法の加ピロリン酸分解反応が起こる温度で活性を有さない。
一部の実施形態では、Ａ０の３’末端は、標的ポリヌクレオチド配列と完全に相補的である。
一部の実施形態では、Ａ０の３’末端は、標的ポリヌクレオチド配列と完全に相補的である。
【0069】
一部の実施形態では、リガーゼは、一本鎖ライゲーション活性を実質的に欠く。
一部の実施形態では、部分的に消化された鎖Ａ１を含む反応混合物を、検出ステップの前またはその間に、無機ピロホスファターゼに導入する。
一部の実施形態では、部分的に消化された鎖Ａ１を含む反応混合物を、検出ステップの前またはその間に、無機ピロホスファターゼに導入する。
【0070】
化学的科学では、メチル化とは、メチル基の基質への付加、またはメチル基による原子もしくは基の置換を示す。メチル化は、より大きな炭素鎖ではなく、具体的にメチル基を用いて水素原子を置き換えた、アルキル化の形態である。これらの用語は、化学、生化学、土壌科学、および生物科学において一般的に使用される。
【0071】
生物系では、メチル化は酵素によって触媒される。そのようなメチル化は、重金属の修飾、遺伝子発現の制御、タンパク質機能の制御、およびＲＮＡ代謝に関与する場合がある。重金属のメチル化は、生物系外で起こる場合もある。組織試料の化学的メチル化は、特定の組織学的染色人工産物を低下させるための一方法でもある。
【0072】
異常なＤＮＡメチル化プロファイルは、多数の様々な複雑な病状に関連づけられている。腫瘍学では、血清ＤＮＡ中の腫瘍抑制遺伝子の過剰メチル化は、小細胞肺癌の診断的マーカーとして使用することができる。糖尿病、関節リウマチ（ＲＡ）、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの免疫疾患を有する患者では、免疫系の細胞の異常なＤＮＡメチル化が見出される。反復要素ＡＬＵ、ＬＩＮＥ－１、およびＳａｔｅｌｌｉｔｅ ２における末梢血白血球（ＰＢＬ）の示差的ＤＮＡメチル化（全ＤＮＡメチル化の測度）が、虚血性心疾患に関連していることが見出されている。
【0073】
脊椎動物におけるＤＮＡメチル化は、典型的にはＣｐＧ部位（シトシン－リン酸－グアニン部位、すなわち、ＤＮＡ配列中でシトシンの直後にグアニンがある場所）で起こり、このメチル化はシトシンから５－メチルシトシンへの変換をもたらす。Ｍｅ－ＣｐＧの形成は酵素ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによって触媒される。哺乳動物ＤＮＡの大部分はＣｐＧ部位の約４０％がメチル化されているが、メチル化されたものが存在しない、ＧＣに富むＣｐＧアイランドとして知られる特定の領域（約６５％のＣＧ残基で構成される）が存在する。これらは、すべての遍在的に発現される遺伝子を含む、哺乳動物遺伝子の５６％のプロモーターと関連している。ヒトゲノムの１～２％はＣｐＧクラスターであり、ＣｐＧメチル化と転写活性との間に反比例関係が存在する。
【0074】
ＤＮＡメチル化は、シトシンピリミジン環の５位置またはアデニンプリン環の６窒素へのメチル基の付加を含む。この修飾は、細胞分裂を通じて遺伝することができる。ＤＮＡメチル化は、典型的には、接合体形成中に除去され、発生中の逐次的な細胞分裂を通じて再確立される。ＤＮＡメチル化は、高等生物における正常な生物発生および細胞分化の重大な部分である。ＤＮＡメチル化は、細胞が「どこに居たことがあるかを記憶する」ことができるように、細胞における遺伝子発現パターンを安定に変更させる。言い換えれば、胚発生中に膵島であるようにプログラミングされた細胞は、継続的なシグナルがそれらが膵島のままでいる必要があることを伝えなくても、生物の生涯にわたって膵島のままでいる。さらに、ＤＮＡメチル化は、時間と共に宿主のゲノム内に取り込まれた、ウイルス遺伝子および他の有害要素の発現を抑制する。ＤＮＡメチル化はまた、細胞が、単一のＤＮＡ不変配列から多細胞生命に必要な無数の特徴を形成することを可能にする、クロマチン構造の基礎も形成する。ＤＮＡメチル化はまた、ほぼすべての種類の癌の発生においても重要な役割を果たす。
【0075】
亜硫酸水素塩シーケンシングとは、ＤＮＡのメチル化パターンを決定するための、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理の使用である。ＤＮＡメチル化は最初に発見された後成的な印であり、依然として最も研究されている。これは、転写活性の抑圧にも関連づけられている。
【0076】
いくつかのｍＲＮＡ修飾のうち、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾が真核生物および核複製ウイルスにおける最も一般的な種類である。ｍ６Ａは、白血病、脳腫瘍、肝臓癌、乳癌、および肺癌を含む数々の癌種において顕著な役割を果たす。
【0077】
５－メチルシトシン（５ｍＣ）が最も研究されている後成的修飾である一方で、ＴＥＴ（１０－１１転座）酵素の触媒作用で５ｍＣは５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）へと酸化される。研究により、５ｈｍＣの分布が組織特異的であり、様々な臓器および組織における５ｈｍＣの分布に相違があることが示されている。悪性組織における５ｈｍＣの発現の減少は、黒色腫を含む広範囲の様々な癌において一貫して示されている。ヒト乳房組織において合計１５対の正常および癌腫試料を評価することによって、研究により、５ｈｍＣのレベルが健康な乳房組織と比較して癌群で劇的に低下していたことが示された。
【0078】
亜硫酸水素塩を用いたＤＮＡの処理は、シトシン残基をウラシルへと変換するが、５－メチルシトシン残基は影響を受けないままである。したがって、亜硫酸水素塩処理は、ＤＮＡ配列中に、個々のシトシン残基のメチル化状態に依存する特定の変化を導入し、ＤＮＡセグメントのメチル化状態に関する単一ヌクレオチド分解情報を与える。変更された配列に対して様々な分析を行って、この情報を取り出すことができる。したがって、目的の分析は、亜硫酸水素塩変換から生じる一塩基多型（シトシンおよびチミン）間を区別することに帰される。亜硫酸水素塩処理の際に５ｈｍＣが５ｍＣへと変換され、これはシーケンシングするとＣとして読み取られるため、５ｈｍＣと５ｍＣとを識別することができない。５ｍＣおよび５ｈｍＣの複合となるため、亜硫酸水素塩シーケンシングからのアウトプットはもはや単にＤＮＡメチル化として定義することができない。Ｔｅｔ支援の酸化的亜硫酸水素塩シーケンシングの開発は今回、単一の塩基分解で２つの修飾間を識別することができる。
【0079】
５ｈｍＣは、ＴＥＴ支援の亜硫酸水素塩シーケンシング（ＴＡＢ－ｓｅｑ）を使用して検出することができる。断片化されたＤＮＡは、逐次的Ｔ４ファージβ－グルコシルトランスフェラーゼ（Ｔ４－ＢＧＴ）、その後、１０－１１転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ処理、その後、亜硫酸水素ナトリウムの添加を使用して、酵素修飾される。Ｔ４－ＢＧＴが５ｈｍＣをグルコシル化してベータ－グルコシル－５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｇｈｍＣ）を形成し、その後、ＴＥＴを使用して５ｍＣを５ｃａＣに酸化する。５ｇｈｍＣのみが続く亜硫酸水素ナトリウムによる脱アミノ化から保護され、これにより、シーケンシングによって５ｈｍＣを５ｍＣから識別することが可能となる。
【0080】
酸化的亜硫酸水素塩シーケンシング（ｏｘＢＳ）は、５ｍＣと５ｈｍＣとを識別するための別の方法を提供する。酸化試薬過ルテニウム酸カリウムが５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）へと変換し、続く亜硫酸水素ナトリウム処理が５ｆＣをウラシルへと脱アミノ化する。５ｍＣは未変化のままであり、したがって、この方法を使用して同定することができる。
【0081】
ＡＰＯＢＥＣとカップリングした後成的シーケンシング（ＡＣＥ－ｓｅｑ）は、亜硫酸水素塩変換を完全に排除し、５ｈｍＣを検出するために酵素的変換に依存する。この方法では、Ｔ４－ＢＧＴが５ｈｍＣを５ｇｈｍＣへとグルコシル化し、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素サブユニット３Ａ（ＡＰＯＢＥＣ３Ａ）による脱アミノ化からこれを保護する。シトシンおよび５ｍＣはＡＰＯＢＥＣ３Ａによって脱アミノ化され、チミンとしてシーケンシングされる。
【0082】
ＴＥＴ支援の５－メチルシトシンシーケンシング（ＴＡｍＣ－ｓｅｑ）は５ｍＣ座位を富化させ、２つの逐次的酵素反応、次いで親和性プルダウンを利用する。断片化されたＤＮＡをＴ４－ＢＧＴで処理し、これが５ｈｍＣをグルコシル化によって保護する。その後、酵素ｍＴＥＴ１を使用して５ｍＣを５ｈｍＣへと酸化し、Ｔ４－ＢＧＴが、新しく形成された５ｈｍＣを、修飾されたグルコース部分（６－Ｎ３－グルコース）を使用して標識する。クリックケミストリーを使用してビオチンタグを導入し、これが、検出および全ゲノムプロファイリングのための５ｍＣ含有ＤＮＡ断片の富化を可能にする。
【0083】
メチローム分析方法は広く３つの群に分けられる：制限酵素に基づくもの、クロマチン免疫沈降に基づくもの（ＣｈＩＰ）、または親和性に基づくおよび亜硫酸水素塩変換（遺伝子に基づく）ものである。制限酵素に基づく方法は、ＤＮＡ配列を知らずに任意のゲノムに適用される、全メチル化分析のためのメチル化感受性制限酵素実験手法（ＲＬＧＳ、ＤＭＨなど）の使用を組み合わせることによる、小／大スケールＤＮＡメチル化分析のためのメチル化感受性制限酵素である。しかし、大量のゲノムＤＮＡが必要であり、この方法は、少量のＤＮＡが回収される試料の分析には不適切となる。他方では、ＣｈＩＰに基づく方法は、タンパク質に向けられた抗体を使用することによる、溶液からのタンパク質抗原の沈降を通じた、腫瘍における示差的なメチル化領域の同定に有用である。これらの方法はタンパク質に基づいており、癌研究において広範に適用されている。
【0084】
親和性富化は、メチル化ＤＮＡを残りのＤＮＡ集団から単離するためにしばしば使用される技法である。これは通常、抗体免疫沈降方法によって、またはメチルＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質を用いて達成される。
【0085】
メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）は、５－メチルシチジン抗体を利用してメチル化シトシンを特異的に認識する、抗体免疫沈降方法である。ＭｅＤＩＰキットは、５－メチルシチジン（５－ｍＣ）抗体が結合するために、インプットＤＮＡ試料が一本鎖であることを必要とする。
【0086】
メチル化ＤＮＡ断片の富化のための別の方法は、組換えメチル結合タンパク質ＭＢＤ２ｂまたはＭＢＤ２ｂ／ＭＢＤ３Ｌ１複合体を使用する。メチルＣｐＧ結合タンパク質富化戦略の一つの利点は、インプットＤＮＡ試料を変性させる必要がないことである。タンパク質は、メチル化ＤＮＡをそのネイティブ二本鎖形態で認識することができる。別の利点は、メチル化ＣｐＧＤＮＡの富化を確実にするために、ＭＢＤタンパク質がＣｐＧ背景でメチル化されたＤＮＡのみと結合することであり、これにより、この技法がＣｐＧアイランドを研究するために理想的となる。
【0087】
一部の実施形態では、本発明の方法のステップ（ａ）の前またはその間に、１つまたは複数の核酸分析物が選択的に修飾される。
一部の実施形態では、ステップ（ａ）の前またはその間に、１つまたは複数の核酸分析物中のメチル化されていないシトシン塩基が化学的または酵素的に変換される。
一部の実施形態では、ステップ（ａ）の前またはその間に、１つまたは複数の核酸分析物中のメチル化されていないシトシン塩基が化学的または酵素的に変換される。
【0088】
一実施形態では、未修飾のシトシン塩基は、メチルトランスフェラーゼ酵素によってウラシルへと変換される。
一実施形態では、この酵素はＭ．Ｓｓｓｌである。
一実施形態では、この酵素はＭ．Ｓｓｓｌである。
【0089】
一実施形態では、未修飾のシトシン塩基は、デアミナーゼ酵素によってウラシルへと変換される。
酵素的メチル－ｓｅｑワークフローは、シトシンをウラシルへと脱アミノ化するＡＰＯＢＥＣの能力に依存する。ＡＰＯＢＥＣは５ｍＣおよび５ｈｍＣも脱アミノ化し、シトシンとその修飾形態とを区別することが不可能となる。５ｍＣおよび５ｈｍＣを検出するために、この方法は、５ｍＣおよび５ｈｍＣをＡＰＯＢＥＣの基質ではない形態へと酵素的に修飾する、ＴＥＴ２および酸化エンハンサーも利用する。ＴＥＴ２酵素は５ｍＣを５ｃａＣへと変換し、酸化エンハンサーは５ｈｍＣを５ｇｈｍＣへと変換する。最終的に、シトシンはチミンとしてシーケンシングされ、５ｍＣおよび５ｈｍＣはシトシンとしてシーケンシングされ、それによって、元の５ｍＣおよび５ｈｍＣ配列情報の完全性が保護される。
酵素的メチル－ｓｅｑワークフローは、シトシンをウラシルへと脱アミノ化するＡＰＯＢＥＣの能力に依存する。ＡＰＯＢＥＣは５ｍＣおよび５ｈｍＣも脱アミノ化し、シトシンとその修飾形態とを区別することが不可能となる。５ｍＣおよび５ｈｍＣを検出するために、この方法は、５ｍＣおよび５ｈｍＣをＡＰＯＢＥＣの基質ではない形態へと酵素的に修飾する、ＴＥＴ２および酸化エンハンサーも利用する。ＴＥＴ２酵素は５ｍＣを５ｃａＣへと変換し、酸化エンハンサーは５ｈｍＣを５ｇｈｍＣへと変換する。最終的に、シトシンはチミンとしてシーケンシングされ、５ｍＣおよび５ｈｍＣはシトシンとしてシーケンシングされ、それによって、元の５ｍＣおよび５ｈｍＣ配列情報の完全性が保護される。
【0090】
一実施形態では、ステップ（ａ）の前またはその間に、１つまたは複数の核酸分析物を、後成的修飾感受性または後成的修飾依存性の制限エンドヌクレアーゼに導入する。
一実施形態では、後成的修飾感受性または後成的修飾依存性の制限エンドヌクレアーゼはＭｃｒＢＣである。
一実施形態では、後成的修飾感受性または後成的修飾依存性の制限エンドヌクレアーゼはＭｃｒＢＣである。
【0091】
一実施形態では、後成的修飾感受性または後成的修飾依存性の制限エンドヌクレアーゼはＭｓｐＪＩファミリーのメンバーである。
一実施形態では、エンドヌクレアーゼはＡｓｐＢＨＩである。一実施形態では、エンドヌクレアーゼはＦｓｐＥＩである。
一実施形態では、エンドヌクレアーゼはＡｓｐＢＨＩである。一実施形態では、エンドヌクレアーゼはＦｓｐＥＩである。
【0092】
一実施形態では、エンドヌクレアーゼはＬｐｎＰＩである。
一実施形態では、後成的修飾感受性または後成的修飾依存性の制限エンドヌクレアーゼはＰｖｕＲｔｓ１Ｉ／ＡｂａＳファミリーのメンバーである。
一実施形態では、後成的修飾感受性または後成的修飾依存性の制限エンドヌクレアーゼはＰｖｕＲｔｓ１Ｉ／ＡｂａＳファミリーのメンバーである。
【0093】
一実施形態では、後成的修飾感受性または後成的修飾依存性の制限エンドヌクレアーゼはＩＩＭ型エンドヌクレアーゼである。
一実施形態では、エンドヌクレアーゼはＤｐｎＩである。
一実施形態では、エンドヌクレアーゼはＤｐｎＩである。
【0094】
一実施形態では、エンドヌクレアーゼはＢｉｓＩである。
一実施形態では、後成的修飾感受性または後成的修飾依存性の制限エンドヌクレアーゼはＩＶ型エンドヌクレアーゼである。
一実施形態では、後成的修飾感受性または後成的修飾依存性の制限エンドヌクレアーゼはＩＶ型エンドヌクレアーゼである。
【0095】
一実施形態では、エンドヌクレアーゼはＥｃｏＫＭｃｒＢＣである。
一実施形態では、エンドヌクレアーゼはＳａｕＵＳＩである。
一実施形態では、エンドヌクレアーゼはＧｍｒＳＤである。
一実施形態では、エンドヌクレアーゼはＳａｕＵＳＩである。
一実施形態では、エンドヌクレアーゼはＧｍｒＳＤである。
【0096】
一実施形態では、後成的修飾感受性または後成的修飾依存性の制限エンドヌクレアーゼは、ＤｐｎＩＩ制限エンドヌクレアーゼファミリーから選択される。
一実施形態では、エンドヌクレアーゼはＤｐｎＩＩである。
一実施形態では、エンドヌクレアーゼはＤｐｎＩＩである。
【0097】
一実施形態では、エンドヌクレアーゼはＤｐｎＩである。
一実施形態では、後成的修飾感受性または後成的修飾依存性の制限エンドヌクレアーゼはＨｐａＩである。
一実施形態では、後成的修飾感受性または後成的修飾依存性の制限エンドヌクレアーゼはＨｐａＩである。
【0098】
一実施形態では、後成的修飾感受性または後成的修飾依存性の制限エンドヌクレアーゼはＨｐａＩＩである。
一部の実施形態では、ステップ（ａ）の前またはその間に、１つまたは複数の核酸分析物をメチル化感受性またはメチル化依存性制限のエンドヌクレアーゼに導入する。
一部の実施形態では、ステップ（ａ）の前またはその間に、１つまたは複数の核酸分析物をメチル化感受性またはメチル化依存性制限のエンドヌクレアーゼに導入する。
【0099】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）の前またはその間に、１つまたは複数の核酸分析物をメチル化感受性またはメチル化依存性制限のエンドヌクレアーゼに導入し、次いで、メチル化ＤＮＡのメチル化特異的多重鎖ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＳ－ＭＬＰＡ）を通じて、目的のメチル化状態を含有する標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅を行う。
【0100】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）の前またはその間に、メチル化されたまたはメチル化されていない核酸分析物の集団を還元する。
一部の実施形態では、還元は、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）を使用して実施する。
一部の実施形態では、還元は、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）を使用して実施する。
【0101】
一部の実施形態では、還元は、ＭＢＤ２ｂまたはＭＢＤ２ｂ／ＭＢＤ３Ｌ１複合体などのメチル結合タンパク質を使用して実施する。
当業者には、本発明を任意の後成的修飾の検出に向けて拡張してよく、標的ポリヌクレオチド配列のメチル化状態の検出に制限されないことが明らかであろう。たとえば、本発明を、ヒドロキシメチル化を含む他の後成的修飾、たとえば５ｍＣのヒドロキシル化形態（５－ｈｍＣ）の検出に、同等に適応させることができる。この最近認識された後成的修飾の形態は、遺伝子発現に影響を与える重要な後成的マーカーであり、ＣｐＧメチル化とは明確に異なる。他の後成的修飾は、メチルアデノシンなどがＲＮＡ上に現れ、本発明の方法によって検出することができる。
当業者には、本発明を任意の後成的修飾の検出に向けて拡張してよく、標的ポリヌクレオチド配列のメチル化状態の検出に制限されないことが明らかであろう。たとえば、本発明を、ヒドロキシメチル化を含む他の後成的修飾、たとえば５ｍＣのヒドロキシル化形態（５－ｈｍＣ）の検出に、同等に適応させることができる。この最近認識された後成的修飾の形態は、遺伝子発現に影響を与える重要な後成的マーカーであり、ＣｐＧメチル化とは明確に異なる。他の後成的修飾は、メチルアデノシンなどがＲＮＡ上に現れ、本発明の方法によって検出することができる。
【0102】
一部の実施形態では、本発明による方法は、後成的修飾がメチル化であるものである。さらなる実施形態では、後成的修飾は、ＣｐＧアイランドでのメチル化である、またはＣｐＧアイランドでのヒドロキシメチル化によるものである。
【0103】
一部の実施形態では、後成的修飾は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか中のアデニンのメチル化である。
一部の実施形態では、本発明の１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のクエンチャーの存在によって、加ピロリン酸分解および／またはエクソヌクレアーゼ消化に対する耐性が与えられている。
一部の実施形態では、本発明の１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のクエンチャーの存在によって、加ピロリン酸分解および／またはエクソヌクレアーゼ消化に対する耐性が与えられている。
【0104】
一部の実施形態では、適切な洗浄緩衝液の添加後、生じる反応混合物を混合する。
一部の実施形態では、生じる反応混合物を渦攪拌によって混合する。
一部の実施形態では、生じる反応混合物を、混合物中に存在する１つまたは複数の磁気ビーズの運動によって混合する。
一部の実施形態では、生じる反応混合物を渦攪拌によって混合する。
一部の実施形態では、生じる反応混合物を、混合物中に存在する１つまたは複数の磁気ビーズの運動によって混合する。
【0105】
一部の実施形態では、それぞれの洗浄ステップは、トリス．ＨＣｌ ｐＨ７．５～８．０、５～２０ｍＭ、ＮａＣｌ ０．４～２Ｍ、ＥＤＴＡ ０．１～１ｍＭ、および／またはＴｗｅｅｎ２０ ０～０．１％のうちの１つまたは複数を含む洗浄緩衝液の使用を含む。
【0106】
以前にまたは続いて記載する方法のいずれかの一部の実施形態では、１つまたは複数の反応混合物を合わせ得る。
一部の実施形態では、
－ Ａ１は、その３’および５’末端のライゲーションを通じて環状化されて、Ａ２を作り出すこと、あるいは
－ 第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣをさらに含み、ライゲーションＡ１が起こってＡ２を形成することが、Ａ１の３’末端とＣの５’末端とのライゲーションであること
のいずれかである。
一部の実施形態では、
－ Ａ１は、その３’および５’末端のライゲーションを通じて環状化されて、Ａ２を作り出すこと、あるいは
－ 第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣをさらに含み、ライゲーションＡ１が起こってＡ２を形成することが、Ａ１の３’末端とＣの５’末端とのライゲーションであること
のいずれかである。
【0107】
一部の実施形態では、Ａ１のライゲーションは、
ステップ（ｂ）中、
ステップ（ｃ）中、または
ステップ（ｂ）および（ｃ）の間
に起こる。
ステップ（ｂ）中、
ステップ（ｃ）中、または
ステップ（ｂ）および（ｃ）の間
に起こる。
【0108】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドＣは、それを３’－５’エクソヌクレアーゼ消化から保護する３’または内部修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドＣは、それを５’－３’エクソヌクレアーゼ消化から保護する５’修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドＣは、それを５’－３’エクソヌクレアーゼ消化から保護する５’修飾をさらに含む。
【0109】
一部の実施形態では、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、スプリントオリゴヌクレオチドＤをさらに含む。
【0110】
一部の実施形態では、Ｄは、Ａ１の３’末端と相補的なオリゴヌクレオチド領域と、オリゴヌクレオチドＣの５’末端またはＡ１の５’末端のどちらかと相補的な領域とを含む。
【0111】
一部の実施形態では、Ｄは、３’修飾が原因で、またはＤの３’末端とＡ１の対応する領域との間のミスマッチのいずれかで、Ａ１に対する伸長を受けることができない。
一部の実施形態では、方法は、ステップ（ｂ）および（ｃ）の間に行う２ステップの増幅をさらに含む。一部の実施形態では、反応体積を、２回目の増幅の前に２つ以上の別々の体積へと分割する。
一部の実施形態では、方法は、ステップ（ｂ）および（ｃ）の間に行う２ステップの増幅をさらに含む。一部の実施形態では、反応体積を、２回目の増幅の前に２つ以上の別々の体積へと分割する。
【0112】
当業者には、伸長を防止するために使用し得る大量の３’修飾が存在することが理解されよう。
一部の実施形態では、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、５’－３’エクソヌクレアーゼをさらに含み、Ａ０の５’末端は、５’－３’エクソヌクレアーゼ消化に対する耐性が与えられている。
一部の実施形態では、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、５’－３’エクソヌクレアーゼをさらに含み、Ａ０の５’末端は、５’－３’エクソヌクレアーゼ消化に対する耐性が与えられている。
【0113】
一部の実施形態では、最終ステップの前またはその間に、以前のステップの生成物をピロホスファターゼで処理する。
一部の実施形態では、最終ステップの前またはその間に、以前のステップの生成物をエクソヌクレアーゼで処理する。
一部の実施形態では、最終ステップの前またはその間に、以前のステップの生成物をエクソヌクレアーゼで処理する。
【0114】
一部の実施形態では、検出は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを使用して達成する。
一部の実施形態では、Ａ２の複製配列の生成から生じる経時的なシグナルの増加を使用して、分析物中の標的配列の濃度を推測する。
一部の実施形態では、Ａ２の複製配列の生成から生じる経時的なシグナルの増加を使用して、分析物中の標的配列の濃度を推測する。
【0115】
一部の実施形態では、複数のプローブＡ０を用い、それぞれのＡ０が、異なる標的配列に対して選択的であり、同定領域を含み、さらに、Ａ２の複製配列が同定領域を含み、したがって、同定領域の検出を通じて分析物中に存在する標的配列を推測することを特徴とする。
【0116】
複数のプローブＡ０を用いる一部の実施形態では、複数の遮断オリゴヌクレオチドも用いる。
一部の実施形態では、同定領域の検出は、分子プローブを使用してまたはシーケンシングを通じて実施する。
一部の実施形態では、同定領域の検出は、分子プローブを使用してまたはシーケンシングを通じて実施する。
【0117】
一部の実施形態では、本方法の最終ステップは、以下のステップをさらに含む：
ｉ．１つまたは複数のオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを使用して、以前のステップの生成物を標識するステップと、
ｉｉ．生成物の蛍光シグナルを測定するステップと、
ｉｉｉ．生成物を一組の変性条件に曝露させるステップと、
変性条件への曝露中の生成物の蛍光シグナルの変化をモニタリングすることによって、分析物中のポリヌクレオチド標的配列を同定するステップ。
ｉ．１つまたは複数のオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを使用して、以前のステップの生成物を標識するステップと、
ｉｉ．生成物の蛍光シグナルを測定するステップと、
ｉｉｉ．生成物を一組の変性条件に曝露させるステップと、
変性条件への曝露中の生成物の蛍光シグナルの変化をモニタリングすることによって、分析物中のポリヌクレオチド標的配列を同定するステップ。
【0118】
一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸分析物は、複数の反応体積へと分割され、それぞれの体積は、様々な標的配列を検出するために導入された１つまたは複数のプローブオリゴヌクレオチドＡ０を有する。
【0119】
一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸分析物を複数の反応体積へと分割し、それぞれの体積は、１つまたは複数のプローブオリゴヌクレオチドＡ０を有する。
一部の実施形態では、異なるプローブＡ０は、共通のプライミング部位を含み、単一のプライマーまたは単一組のプライマーを、Ａ２の一領域の増幅に使用することを可能にする。
一部の実施形態では、異なるプローブＡ０は、共通のプライミング部位を含み、単一のプライマーまたは単一組のプライマーを、Ａ２の一領域の増幅に使用することを可能にする。
【0120】
一代替実施形態では、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、１つまたは複数の部分的に二本鎖のＤＮＡ構築体をさらに含み、それぞれの構築体は１つまたは複数のフルオロフォアおよび１つまたは複数のクエンチャーを含有する。一部の実施形態では、構築体が部分的に二本鎖である場合、１つまたは複数のフルオロフォアおよび１つまたは複数のクエンチャーは、１つまたは複数のフルオロフォアの十分なクエンチングが起こるように、互いに十分に近く近接して位置する。
【0121】
一部の実施形態では、構築体は、それ自身に折り重なる自己相補的領域を有する、ＤＮＡの一方の鎖である。
一部の実施形態では、構築体は、プライマー対の一方のプライマーを含む。
一部の実施形態では、構築体は、プライマー対の一方のプライマーを含む。
【0122】
一部の実施形態では、第４の反応混合物は、プライマー対の他方のプライマーをさらに含む。
一部の実施形態では、構築体の一本鎖部分の一部分は、Ａ２とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長する。一部の実施形態では、その後、プライマー対の他方のプライマーが、伸長した構築体とハイブリダイズする。その後、このプライマーが構築体に対して伸長し、自己相補的領域を追放する。したがって、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数の色素が十分に隔てられて蛍光シグナルが検出され、反応混合物中のＡ２の存在が示される。
一部の実施形態では、構築体の一本鎖部分の一部分は、Ａ２とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長する。一部の実施形態では、その後、プライマー対の他方のプライマーが、伸長した構築体とハイブリダイズする。その後、このプライマーが構築体に対して伸長し、自己相補的領域を追放する。したがって、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数の色素が十分に隔てられて蛍光シグナルが検出され、反応混合物中のＡ２の存在が示される。
【0123】
そのような実施形態では、構築体はサンライズプライマー（Ｓｕｎｒｉｓｅ Ｐｒｉｍｓｅｒ）として知られ得る。
一部の実施形態では、構築体は２本の別々のＤＮＡ鎖を含む。
一部の実施形態では、構築体は２本の別々のＤＮＡ鎖を含む。
【0124】
一部の実施形態では、構築体の一本鎖部分の一部分は、Ａ２とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長する。一部の実施形態では、その後、プライマー対の他方のプライマーが、伸長した構築体とハイブリダイズする。その後、このプライマーが構築体に対して二本鎖部分の方向に伸長し、ＤＮＡ鎖のうちのより短い方を追放し、したがって、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数の色素が十分に隔てられて蛍光シグナルが検出され、反応混合物中のＡ２の存在が示される。
【0125】
そのような実施形態では、構築体は分子ジッパー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｚｉｐｐｅｒ）として知られ得る。
当業者には、サンライズプライマーおよび分子ジッパーのどちらについても、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数のクエンチャーの対が、それぞれの対応する構築体内の様々な位置に位置することが可能であることが理解されよう。主要な特長は、それぞれの対が互いに十分に近接して位置しており、Ａ２の非存在下、すなわち伸長および鎖の追放が起こっていない場合は、蛍光シグナルが放射されないことである。
当業者には、サンライズプライマーおよび分子ジッパーのどちらについても、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数のクエンチャーの対が、それぞれの対応する構築体内の様々な位置に位置することが可能であることが理解されよう。主要な特長は、それぞれの対が互いに十分に近接して位置しており、Ａ２の非存在下、すなわち伸長および鎖の追放が起こっていない場合は、蛍光シグナルが放射されないことである。
【0126】
以前にまたは続いて記載する方法のいずれかによる一部の実施形態では、試料中に存在するＲＮＡはＤＮＡへと転写されない。そのような実施形態では、Ａ０は、ＲＮＡ配列に対する加ピロリン酸分解を受けて、部分的に消化された鎖Ａ１を形成し、その後、方法は、以前にまたは続いて記載するように進行する。
【0127】
以前にまたは続いて記載する方法のいずれかの一部の実施形態では、１つまたは複数の反応混合物を合わせ得る。本発明によれば、所定の核酸分析物中の標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法がさらに提供される。本発明の様々な方法を適用することができる分析物は、上に言及した生体試料から、分析物を増幅するために設計された一連の予備ステップによって調製し、これを、典型的には著しい過剰で存在する背景ゲノムＤＮＡから分離し得る。
【0128】
一部の実施形態では、分析物中の標的ポリヌクレオチド配列は、癌性腫瘍細胞のＤＮＡまたはＲＮＡ内の遺伝子または染色体領域であり、たとえば１つまたは複数の一塩基多型（ＳＮＰ）の形態の、１つまたは複数の突然変異の存在によって特徴づけられるであろう。したがって、本発明は、疾患再発のモニタリングおよび／または処置において有用となるであろう。処置の後に疾患がないと宣言された患者を、疾患の再発を検出するために経時的にモニタリングし得る。これは非浸潤的に行う必要があり、血液試料からの標的配列の高感度の検出を要する。同様に、一部の癌では、処置後に患者中に残る残留癌細胞が存在する。本発明を使用して、患者の血液中に存在するこれらの細胞（または無細胞ＤＮＡ）のレベルをモニタリングすることにより、疾患の再発または現在の治療の失敗および代替方法へと切り替える必要性の検出が可能となる。
【0129】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列の検出は、疾患の処置中における患者試料の繰り返し試験を可能にして、治療に対する発生した耐性の早期検出を可能にする。たとえば、ゲフィチニブ、エルロチニブなどの表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のファーストライン処置として一般的に使用される。処置中に、腫瘍はしばしばＥＧＦＲ遺伝子中に突然変異を発生し（たとえば、Ｔ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓ）、これが処置に対する耐性を与える。これらの突然変異の早期検出が、代替治療へと患者を移行させることを可能にする。
【0130】
一部の実施形態では、分析物中の標的ポリヌクレオチド配列は、胎児由来のＤＮＡまたはＲＮＡ内の遺伝子または染色体領域であり、たとえば１つまたは複数の一塩基多型（ＳＮＰ）の形態の、１つまたは複数の突然変異の存在によって特徴づけられるであろう。したがって、本発明は、非常に低い対立遺伝子画分で、他の利用可能な試験技法よりも妊娠の初期段階で、突然変異を検出するために使用し得る。
【0131】
別の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、それ以外は健康な個体に由来する遺伝子またはゲノム領域であり得るが、得られた遺伝情報は、貴重なコンパニオン診断情報の生成を支援して、ヒト集団内の１つまたは複数の定義された群にわたって医学的または治療的結論を下すことを可能にし得る。
【0132】
さらに別の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、感染性疾患に特徴的、または特定の治療を用いた処置に対する感染性疾患の耐性に特徴的であってよく、たとえば、治療に対する耐性を与える、細菌もしくはウイルスの遺伝子もしくは染色体領域、またはその中の突然変異に特徴的なポリヌクレオチド配列である。
【0133】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ドナーＤＮＡに特徴的であり得る。移植した臓器が患者によって拒絶される場合、この臓器からのＤＮＡは患者の血流内に流される。このＤＮＡの早期検出は、拒絶の早期検出を可能にするであろう。これは、ドナーに特異的なマーカーのカスタムパネルを使用して、または、ドナー中に存在し、一部がレシピエント中に存在する、集団中で共通であることが知られている変異体のパネルを使用することによって、達成することができる。したがって、臓器レシピエントの経時的なルーチン的モニタリングが、特許請求した方法によって可能になる。
【0134】
臓器移植の成功は、ドナーにおけるいくつかの事象によって引き起こされる、臓器への累積傷害の全体的なレベルに依存する場合がある。これには、レシピエントにおける年齢、生活習慣、虚血／再灌流傷害（ＩＲＩ）、および免疫応答が含まれる。研究により、ＩＲＩがドナー臓器における後成的変化を引き起こすことが示されている。Ｃ３遺伝子のプロモーター領域は腎臓において脱メチル化され、これは移植後の慢性腎症に関連している。ＤＮＡメチル化は、免疫系の細胞の機能を制御するため、移植片に対するバランスがとれた免疫応答の主要な貢献因子である。したがって、特定のＤＮＡ配列のメチル化状態の検出は、移植後合併症の危険性にある患者の同定を可能にすることができる。
【0135】
さらに別の実施形態では、分析物を、複数の標的配列、たとえば、癌の源、癌指示薬、または感染症の複数の源について同時にスクリーニングすることができるように、プローブの様々な組合せを使用した本方法の様々なバージョン（以下を参照）を並行して用いる。この手法では、本方法の並行適用によって得られた増幅産物を、１つもしくは複数のオリゴヌクレオチド結合色素、または分子ビーコン、ヘアピンプローブなどの配列特異的分子プローブからなる検出パネルと接触させる。したがって、本発明の別の態様では、少なくとも１つのプローブおよび任意選択で１つのライゲーションオリゴヌクレオチドの、標的ポリヌクレオチド配列に選択的な１つもしくは複数の化学的および生物学的プローブと組み合わせた使用、または増幅されたプローブ領域を同定するためのシーケンシングの使用と組み合わせた使用が提供される。
【0136】
一部の実施形態では、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０は、プライミング領域と検出する標的ポリヌクレオチド配列と相補的な３’末端とを含む。これによって、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物が作り出される。一部の実施形態では、このステップは、過剰なＡ０の存在下、かつ分析物および任意の他の核酸分子を含有する水性媒体中で実施する。
【0137】
ステップ（ｂ）中、第１の中間生成物の二本鎖領域は、そのＡ０鎖の３’末端から３’－５’方向で加ピロリン酸分解される。その結果、Ａ０鎖は進行的に消化されて部分的に消化された鎖を生じ、これを本明細書中で以降Ａ１と呼ぶ。プローブオリゴヌクレオチドが非標的配列と誤ってハイブリダイズする場合、加ピロリン酸分解反応はすべてのミスマッチで停止し、方法の続くステップが進行することを防止する。別の実施形態では、この消化は、Ａ１が、安定な二重鎖を形成するために十分な分析物またはその中の標的領域との相補性を欠くまで、続く。この時点では、様々な鎖はその後、融解によって分離し、それによってＡ１が一本鎖形態で生成される。典型的な加ピロリン酸分解条件下では、この分離は、分析物とＡ０との間に６～２０個の相補的ヌクレオチドが存在する場合に起こる。
【0138】
別の実施形態では、消化は、Ａ１が、加ピロリン酸分解酵素が結合するため、または加ピロリン酸分解（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｌｙｓｉｓｉｎｇ）反応が継続するために十分な、分析物またはその中の標的領域との相補性を欠くまで、継続する。これは、典型的には、分析物とプローブとの間に６～２０個の相補的ヌクレオチドが残っている場合に起こる。一部の実施形態では、これは、６～４０個の相補的ヌクレオチドが残っている場合に起こる。
【0139】
Ａ１の５’および３’末端に対して相補性を有するスプリントオリゴヌクレオチドＤを用いる別の実施形態では（以下を参照）、消化は、Ａ１と標的との間の相補性の長さが、オリゴＤが分析物分子をＡ１から追放することがエネルギー的に好都合となる点まで縮小するまで、継続する。これは、典型的には、Ａ１と分析物分子との間の相補性領域が、オリゴＤとＡ１の３’末端との間の相補性領域と同様またはそれよりも短い長さである場合に起こるが、Ａ１の５’末端と既にハイブリダイズしていてよい、オリゴＤの分子内ハイブリダイゼーションが好都合であることが原因でＡ１と分析物分子との間の相補性がこれよりも長い場合にも、起こり得る。
【0140】
Ａ１のライゲーションを、分析物分子をスプリントとして使用して行う別の実施形態では（図８を参照）、消化は、Ａ１の３’および５’末端が隣接し、ニックによってのみ隔離されているように、Ａ１の５’末端が分析物分子とハイブリダイズすることができるまで継続し、この時点で、これらはリガーゼによって一緒にライゲーションされ、消化はもはや進行することができない。
【0141】
適切には、加ピロリン酸分解は、反応媒体中、２０～９０℃の範囲の温度、少なくとも加ピロリン酸分解活性を示すポリメラーゼおよびピロリン酸イオン供給源の存在下で実施する。ポリヌクレオチドの消化に適用する加ピロリン酸分解反応に関するさらなる情報は、たとえば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４（１９６９）ページ３０１９～３０２８、または本発明者らの以前の特許出願中に見つけることができる。
【0142】
一部の実施形態では、加ピロリン酸分解ステップは、過剰なポリピロホスフェートの供給源の存在によって駆動され、適切な供給源としては、３個以上のリン原子を含有する化合物が挙げられる。
【0143】
一部の実施形態では、第２の反応混合物は過剰なポリピロホスフェートの供給源を含む。
一部の実施形態では、加ピロリン酸分解ステップは、過剰な修飾ピロホスフェートの供給源の存在によって駆動される。適切な修飾ピロホスフェートとしては、架橋酸素の代わりに他の原子もしくは基で置換されているもの、または他の酸素上に置換もしくは修飾基を有するピロホスフェート（もしくはポリピロホスフェート）が挙げられる。当業者には、本発明における使用に適切であろう、修飾ピロホスフェートの多数のそのような例が存在することが理解されよう。その非限定的な選択肢は以下である：
一部の実施形態では、加ピロリン酸分解ステップは、過剰な修飾ピロホスフェートの供給源の存在によって駆動される。適切な修飾ピロホスフェートとしては、架橋酸素の代わりに他の原子もしくは基で置換されているもの、または他の酸素上に置換もしくは修飾基を有するピロホスフェート（もしくはポリピロホスフェート）が挙げられる。当業者には、本発明における使用に適切であろう、修飾ピロホスフェートの多数のそのような例が存在することが理解されよう。その非限定的な選択肢は以下である：
【0144】
【化1】
【0145】
一部の実施形態では、第２の反応混合物は、過剰な修飾ポリピロホスフェートの供給源を含む。
好ましい一実施形態では、ピロリン酸イオン供給源は、ＰＮＰ、ＰＣＰ、またはトリポリリン酸（ＰＰＰｉ）である。
好ましい一実施形態では、ピロリン酸イオン供給源は、ＰＮＰ、ＰＣＰ、またはトリポリリン酸（ＰＰＰｉ）である。
【0146】
さらに、制限はしないが、加ピロリン酸分解ステップ（ｃ）において使用するためのピロリン酸イオン供給源の例は、ＷＯ２０１４／１６５２１０号およびＷＯ００／４９１８０中に見つけ得る。
【0147】
一部の実施形態では、過剰な修飾ピロホスフェートの供給源は、Ｙ－Ｈとして表すことができ、Ｙは、一般式（Ｘ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｂ）－（Ｚ－Ｐ（＝Ｂ）（Ｏ－Ｘ））ｎ－に対応する［式中、ｎは、１～４の整数であり、それぞれのＺ－は、－Ｏ－、－ＮＨ－、または－ＣＨ２－から独立して選択され、それぞれのＢは、独立してＯまたはＳのどちらかであり、Ｘ基は、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、アルキル、アルケニル、または複素環基から独立して選択され、ただし、ＺおよびＢがどちらも－Ｏ－に対応し、かつｎが１である場合、少なくとも１つのＸ基はＨではない］。
【0148】
一部の実施形態では、Ｙは、一般式（Ｘ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｂ）－（Ｚ－Ｐ（＝Ｂ）（Ｏ－Ｘ））ｎ－に対応する［式中、ｎは１、２、３、または４である］。別の実施形態では、Ｙ基は、一般式（Ｘ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｏ）－Ｚ－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ－Ｈ）－に対応する［式中、Ｘ基のうちの１つは－Ｈである］。さらに別の好ましい実施形態では、Ｙは、一般式（Ｘ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｏ）－Ｚ－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ－Ｘ）－に対応する［式中、Ｘ基のうちの少なくとも１つは、メチル、エチル、アリル、またはジメチルアリルから選択される］。
【0149】
一代替実施形態では、Ｙは、一般式（Ｈ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｏ）－Ｚ－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ－Ｈ）－［式中、Ｚは、－ＮＨ－もしくは－ＣＨ２－のどちらかである］または（Ｘ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｏ）－Ｚ－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ－Ｘ）－［式中、Ｘ基は、すべて－Ｎａもしくは－Ｋのどちらかであり、Ｚは－ＮＨ－もしくは－ＣＨ２－のどちらかである］のどちらかに対応する。
【0150】
別の実施形態では、Ｙは、一般式（Ｈ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｂ）－Ｏ－Ｐ（＝Ｂ）（Ｏ－Ｈ）－に対応する［式中、それぞれのＢ基は、独立してＯまたはＳのどちらかであり、少なくとも１つはＳである］。
【0151】
Ｙの好ましい実施形態の具体的な例としては、式（Ｘ１－Ｏ）（ＨＯ）Ｐ（＝Ｏ）－Ｚ－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ－Ｘ２）のもの［式中、Ｚは、Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２であり、（ａ）Ｘ１はγ，γ－ジメチルアリルであり、Ｘ２は－Ｈである、または（ｂ）Ｘ１およびＸ２はどちらもメチルである、または（ｃ）Ｘ１およびＸ２はどちらもエチルである、または（ｄ）Ｘ１はメチルであり、Ｘ２はエチルであり、もしくはその逆である］が挙げられる。
【0152】
一部の実施形態では、分子プローブを検出に使用する場合、プローブオリゴヌクレオチドＡ０は、標的配列と相補的な領域の５’側にオリゴヌクレオチド同定領域を含むように構成され、用いる分子プローブは、この同定領域とアニーリングするように設計されている。一部の実施形態では、Ａ０の３’領域のみが標的とアニーリングすることができる、すなわち、すべての他の領域は、加ピロリン酸分解ステップを実施する温度で安定な二重鎖が存在するために十分な分析物との相補性を欠く。ここおよび全体にわたって、用語「十分な相補性」とは、所定の領域が分析物上の所定の領域と相補性を有する範囲で、相補性領域が１０ヌクレオチド長より長いことを意味する。
【0153】
本発明の方法のさらなる一態様では、任意の以前の実施形態の加リン酸分解ステップが、二本鎖特異的エクソヌクレアーゼを使用したエクソヌクレアーゼ消化ステップで置き換えられている代替実施形態が提供される。当業者には、二本鎖特異的エクソヌクレアーゼとしては、多数の他のもののうち、ＥｘｏＩＩＩなどの３’－５’方向で読み取るもの、およびラムダＥｘｏなどの５’－３’方向で読み取るものが挙げられることが理解されよう。
【0154】
本発明の一部の実施形態では、エクソヌクレアーゼ消化ステップが二本鎖特異的５’－３’エクソヌクレアーゼを利用する場合、標的分析物と相補的であるのはＡ０の５’末端であり、共通のプライミング配列および遮断基は、標的と相補的な領域の３’側上に位置する。さらなる実施形態では、分子プローブを検出に使用する場合、プローブオリゴヌクレオチドＡ０は、標的配列と相補的な領域の３’側オリゴヌクレオチド同定領域を含むように構成され、用いる分子プローブは、この同定領域とアニーリングするように設計されている。
【0155】
エクソヌクレアーゼ消化ステップが二本鎖特異的５’－３’エクソヌクレアーゼを利用する本発明の実施形態では、存在するすべての他の核酸分子を消化する一方で、Ａ０および部分的に消化された鎖Ａ１を含むすべての材料を未変化に残す目的で、３’から５’のエクソヌクレアーゼ活性を有するエクソヌクレアーゼを、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物に、任意選択で加えることができる。適切には、このエクソヌクレアーゼ分解に対する耐性は、本出願中の他の箇所に記載されているように達成される。
【0156】
本発明の好ましい一実施形態では、Ａ０の５’末端またはプライミング領域の５’側の内部部位に、エクソヌクレアーゼ分解に対する耐性が与えられている。これによって、および加ピロリン酸分解ステップの後またはそれと同時に、存在するすべての他の核酸分子を消化する一方で、Ａ０および部分的に消化された鎖Ａ１を含むすべての材料を未変化に残す目的で、５’－３’エクソヌクレアーゼ活性を有するエクソヌクレアーゼを反応媒体に任意選択で加えることができる。適切には、このエクソヌクレアーゼ分解に対する耐性は、１つまたは複数の遮断基をオリゴヌクレオチドＡ０内の所要の点に導入することによって達成される。一部の実施形態では、これらの遮断基は、ホスホロチオエート連結および当分野において一般的に使用される他の主鎖修飾、Ｃ３スペーサー、リン酸基、修飾塩基などから選択され得る。
【0157】
一部の実施形態では、同定領域は、ユニークな配列を有するバーコード領域を含む、またはそれを内部に包埋しており、増幅した成分Ａ２に適用する配列特異的分子プローブを使用して間接的、またはこれらの成分のシーケンシングによって直接、同定されるように適応されている。使用し得る分子プローブの例としては、それだけには限定されないが、分子ビーコン、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブなどが挙げられる。
【0158】
一部の実施形態では、Ａ２鎖またはその所望の領域は、複数の、典型的には数百万個のコピーが作製されるように、増幅を受ける。これは、Ａ２の一領域、続いてそれに由来する任意の複製配列を、たとえばそれ上の相補的領域とアニーリングすることができる順方向／逆方向またはセンス／アンチセンスの対の形態で提供される、一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドを用いたプライミングすることによって達成される。その後、プライミングされた鎖が増幅の起点となる。増幅方法としては、それだけには限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、およびローリングサークル増幅などの熱サイクリングおよび等温方法が挙げられ、ローリングサークル増幅は、Ａ２が環状化されている場合に適用可能である。これらの手段のうちの任意のものによって、Ａ２の一領域および一部の例ではその配列相補体の、多数の複製配列コピーを容易に迅速に作製することができる。これらの増幅方法のうちの任意のものを行うための正確な方法は当業者に周知であり、用いる正確な条件および温度レジームは、読者に指示する一般的な文献中において容易に利用可能である。具体的には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の場合、方法は、一般に、プライマーオリゴヌクレオチドを、Ａ２鎖に対して、５’－３’方向で、ポリメラーゼおよび様々な単一ヌクレオシド三リン酸の供給源を使用して、相補鎖が生成されるまで伸長するステップと、生じた二本鎖生成物を脱ハイブリダイズさせて、Ａ２鎖および相補鎖を再生するステップと、Ａ２鎖およびそのすべての複製配列を再プライミングするステップと、それ以降、これらの伸長／脱ハイブリダイゼーション／再プライミングステップを複数回繰り返して、Ａ２複製配列を信頼度高く検出することができるレベルまで、Ａ２複製配列の濃度を蓄積するステップとを含む。
【0159】
一部の実施形態では、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣをさらに含み、部分的に消化された鎖Ａ１は、Ｃの５’末端の３’末端側でライゲーションされる一方で、別の実施形態では、Ａ１は、その３’および５’末端のライゲーションを通じて環状化され、そのそれぞれの場合でオリゴヌクレオチドＡ２が作り出される。
【0160】
一部の実施形態では、Ａ１のライゲーションは、
ステップ（ｂ）中、または
ステップ（ｃ）中、または
ステップ（ｂ）および（ｃ）の間
に起こる。
ステップ（ｂ）中、または
ステップ（ｃ）中、または
ステップ（ｂ）および（ｃ）の間
に起こる。
【0161】
一部の実施形態では、Ａ１は、ライゲーションの前に任意選択で５’－３’方向に伸長される。
一部の実施形態では、この任意選択の伸長およびライゲーションは、標的オリゴヌクレオチドに対して行う一方で、別の実施形態では、これらは、伸長および／またはライゲーションの前にＡ１がアニーリングするさらなるスプリントオリゴヌクレオチドＤの付加を通じて行う。一部の実施形態では、Ｄは、Ａ１の３’末端と相補的なオリゴヌクレオチド領域と、オリゴヌクレオチドＣの５’末端またはＡ１の５’末端のどちらかと相補的な領域とを含む。別の実施形態では、Ｄは、３’末端修飾が原因で、またはＤの３’末端とＡ１の対応する領域との間のヌクレオチドミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ１に対して伸長することができない。
一部の実施形態では、この任意選択の伸長およびライゲーションは、標的オリゴヌクレオチドに対して行う一方で、別の実施形態では、これらは、伸長および／またはライゲーションの前にＡ１がアニーリングするさらなるスプリントオリゴヌクレオチドＤの付加を通じて行う。一部の実施形態では、Ｄは、Ａ１の３’末端と相補的なオリゴヌクレオチド領域と、オリゴヌクレオチドＣの５’末端またはＡ１の５’末端のどちらかと相補的な領域とを含む。別の実施形態では、Ｄは、３’末端修飾が原因で、またはＤの３’末端とＡ１の対応する領域との間のヌクレオチドミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ１に対して伸長することができない。
【0162】
一部の実施形態では、ライゲーションプローブＣは、スプリントオリゴヌクレオチドＤの５’末端領域の少なくとも一部と、または標的オリゴヌクレオチドと相補的な５’領域を有する。そのような手段によって、Ａ２鎖が、Ａ１と、Ｃと、任意選択で、Ｃの５’末端に合わせるために５’－３’方向のＡ１の伸長によって形成された中間領域とから構成される、第２の中間生成物が形成される。そのような実施形態では、プライマーをステップ（ｄ）において用いる場合、これらは、Ａ１とＣとのライゲーションが起こった部位を含む少なくともＡ２の一領域を増幅するように選択される。本実施形態では、本発明者らは、増幅および／または検出の前に３’－５’エクソヌクレアーゼを使用してすべてのライゲーションしていないＡ１を消化することができるように、Ｃ上に３’遮断基を含めることが有利であることを見出した。
【0163】
一部の実施形態では、加ピロリン酸分解反応によって生じたヌクレオシド三リン酸を加水分解によって除去し、それによって、加ピロリン酸分解反応が継続することができ、順方向の重合反応に競合で負けないことを確実にするために、第２のもしくは合わせた反応混合物、または加ピロリン酸分解ステップの生成物を検出ステップの前に導入する第３の反応混合物は、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含む。
【0164】
一部の実施形態では、ピロリン酸イオンを加水分解し、さらなる加ピロリン酸分解が起こり、順方向の重合反応が有利になることを防止するために、ステップ（ｃ）の前またはその間に、以前のステップの生成物をピロホスファターゼで処理する。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）の前またはその間に、以前のステップの生成物をエクソヌクレアーゼで処理する。
【0165】
一部の実施形態では、Ａ０の加ピロリン酸分解を行って部分的に消化された鎖Ａ１を形成する酵素は、Ａ２も増幅する。当業者には、多数のそのような酵素が存在することが理解されよう。
【0166】
オリゴヌクレオチドＡ２を検出し、得られた情報を、ポリヌクレオチド標的配列が元の分析物中に存在するかしないか、および／またはそれに関連する特性を推測するために使用することができる。たとえば、これによって、癌性腫瘍細胞に特徴的な標的配列を、探している具体的なＳＮＰを参照して検出し得る。さらなる例として、癌性腫瘍細胞に特徴的な標的配列を、探している具体的なメチル化部位を参照して検出し得る。
【0167】
別の実施形態では、ウイルスまたは細菌のゲノムに特徴的な標的配列（その突然変異を含む）を検出し得る。複製配列またはＡ２の同定領域を検出するための多数の方法を用いることができ、たとえば、オリゴヌクレオチド結合色素、蛍光標識分子ビーコンまたはヘアピンプローブなどの配列特異的分子プローブが挙げられる。あるいは、Ａ２またはその複製配列の直接シーケンシングを、用いたまたは当分野において報告されている直接シーケンシング方法のうちの１つを使用して行うことができる。オリゴヌクレオチド結合色素、蛍光標識したビーコンまたはプローブを用いる場合、刺激電磁放射源（レーザー、ＬＥＤ、ランプなど）と放射された蛍光を検出するように配置された光検出器とを含む配置を使用して生じるシグナルを検出し、特異的に設計されたアルゴリズムを使用してマイクロプロセッサまたはコンピュータによって分析することができるデータストリームを含むシグナルを、それから生成することが好都合である。
【0168】
一部の実施形態では、検出は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを使用して達成する。そのような実施形態では、Ａ２の複製配列の生成から生じる経時的なシグナルの増加を使用して、分析物中の標的配列の濃度を推測する。一部の実施形態では、本方法の最終ステップは、以下のステップをさらに含む：
ｉ．１つまたは複数のオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを使用して、ステップ（ｂ）の生成物を標識するステップと、
ｉｉ．生成物の蛍光シグナルを測定するステップと、
ｉｉｉ．生成物を一組の変性条件に曝露させるステップと、
変性条件への曝露中の生成物の蛍光シグナルの変化をモニタリングすることによって、分析物中のポリヌクレオチド標的配列を同定するステップ。
ｉ．１つまたは複数のオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを使用して、ステップ（ｂ）の生成物を標識するステップと、
ｉｉ．生成物の蛍光シグナルを測定するステップと、
ｉｉｉ．生成物を一組の変性条件に曝露させるステップと、
変性条件への曝露中の生成物の蛍光シグナルの変化をモニタリングすることによって、分析物中のポリヌクレオチド標的配列を同定するステップ。
【0169】
本発明の別の態様では、複数コピーのＡ２またはＡ２の一領域を、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを使用して標識する、本発明の任意の以前の実施形態のステップを特徴とする、所定の核酸分析物中の標的ポリヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。これらの複数コピーの蛍光シグナルを測定し、複数コピーを一組の変性条件に曝露させる。その後、変性条件への曝露中の複数コピーの蛍光シグナルの変化をモニタリングすることによって、標的ポリヌクレオチド配列を同定する。
【0170】
一部の実施形態では、変性条件は、温度を変動させる、たとえば、二本鎖が解離し始める点まで温度を増加させることによって提供し得る。それに加えてまたはその代わりに、変性条件は、条件が酸性もしくはアルカリ性であるようにｐＨを変動させることによって、あるいは、強酸もしくは塩基、濃縮無機塩、または有機溶媒、たとえばアルコールなどの、添加剤または薬剤を加えることによっても提供し得る。
【0171】
本発明の別の態様では、哺乳動物対象、特にヒト患者を、感染性疾患、癌の存在についてスクリーニングするため、またはコンパニオン診断情報を生成する目的の、上述の方法の使用が提供される。
【0172】
本発明のさらなる一態様では、上述の方法において使用するための対照プローブが提供される。本発明の実施形態には、特異的標的配列または複数の配列の存在が蛍光シグナルの生成によって解明されるものが含まれる。そのような実施形態では、試料中に存在する非標的ＤＮＡから生成される一定レベルのシグナルが必然的に存在し得る。所定の試料では、この背景シグナルは「真」のシグナルよりも後の発生を有するが、この発生は試料間で変動し得る。したがって、低濃度の標的配列または複数の配列の存在の正確な検出は、標的配列の非存在下でどのシグナルが予想されるかの知識に依存する。人工的な試料では参照が利用可能であるが、患者からの真の「ブラインド」試料では、これは当てはまらない。対照プローブ（Ｅ０）は、それぞれのアッセイプローブの予想される背景シグナルプロファイルを決定するために利用する。対照プローブは、試料中に存在すると予想されない配列を標的とし、このプローブから生成されるシグナルを、標的配列の非存在下における試料からのシグナル生成予測率を推測するために使用することができる。
【0173】
したがって、所定の核酸分析物中の標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法であって、以下のステップ：
ａ．続いてまたは同時発生的のどちらかで、３’末端領域が標的配列と少なくとも部分的にミスマッチである第２の一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＥ０を使用して、試料の別個のアリコートまたは同じアリコートのどちらかを使用して、第２の検出チャネルを使用して、方法のステップを繰り返すステップと、
ｂ．試料中にいかなる標的分析物も非存在である場合の、Ａ０から生成されると予想される背景シグナルを推測するステップと、
ｃ．（ａ）で推測された予想される背景シグナルと、標的分析物の存在下で観察された実際のシグナルとの比較を通じて、分析物中のポリヌクレオチド標的配列の存在または非存在を推測するステップと
を特徴とする、以前に記載した方法のうちの任意のものによる、方法が提供される。
ａ．続いてまたは同時発生的のどちらかで、３’末端領域が標的配列と少なくとも部分的にミスマッチである第２の一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＥ０を使用して、試料の別個のアリコートまたは同じアリコートのどちらかを使用して、第２の検出チャネルを使用して、方法のステップを繰り返すステップと、
ｂ．試料中にいかなる標的分析物も非存在である場合の、Ａ０から生成されると予想される背景シグナルを推測するステップと、
ｃ．（ａ）で推測された予想される背景シグナルと、標的分析物の存在下で観察された実際のシグナルとの比較を通じて、分析物中のポリヌクレオチド標的配列の存在または非存在を推測するステップと
を特徴とする、以前に記載した方法のうちの任意のものによる、方法が提供される。
【0174】
一部の実施形態では、対照プローブ（Ｅ０）とＡ０とを試料の別個の部分に加える一方で、別の実施形態では、Ｅ０とＡ０とを試料の同じ部分に加え、異なる検出チャネル（たとえば異なる色の色素）を使用してそのそれぞれのシグナルを測定する。その後、Ｅ０によって生成されるシグナルを利用して、試料中のポリヌクレオチド標的配列の非存在下においてＡ０によって生成されると予想される背景シグナルを推測し、それを補正し得る。たとえば、背景シグナルの補正は、Ｅ０から観察されるシグナルを、Ａ０から観察されるものから減算することを含み得る、または、変動条件下でＡ０およびＥ０によって生成された相対的シグナルの検量線を使用した、Ａ０から観察されるシグナルの較正を通じたものであり得る。
【0175】
一部の実施形態では、単一のＥ０を使用して、生成され得るすべてのアッセイプローブを較正することができる。
一部の実施形態では、別個のＥ０を使用して、初期増幅ステップで生成された試料ＤＮＡのそれぞれの複製配列を較正し得る。それぞれの複製配列は、複数の突然変異／目的の標的配列を含有し得るが、単一のＥ０が、すべてのアッセイプローブを単一の複製配列に対して較正するために十分である。
一部の実施形態では、別個のＥ０を使用して、初期増幅ステップで生成された試料ＤＮＡのそれぞれの複製配列を較正し得る。それぞれの複製配列は、複数の突然変異／目的の標的配列を含有し得るが、単一のＥ０が、すべてのアッセイプローブを単一の複製配列に対して較正するために十分である。
【0176】
さらなる実施形態では、別個のＥ０をそれぞれの標的配列に使用し得る。たとえば、Ｃ＞Ｔ突然変異が標的とされている場合、患者において起こることが知られていない、同じ部位のＣ＞Ｇ突然変異を標的とするＥ０を設計することができる。様々な条件下でＥ０によって生成されたシグナルプロファイルを、較正反応において評価することができ、これらのデータを使用して、Ｃ＞Ｔ変異体が存在しない場合に、Ｃ＞Ｔ変異体を標的とするアッセイプローブから予想されるシグナルを推測する。
【0177】
本発明の方法の特異性は、遮断オリゴヌクレオチドの導入によって改善させ得る。たとえば、遮断オリゴヌクレオチドを導入して、野生型ＤＮＡの少なくとも一部分とハイブリダイズし、Ａ０の標的ポリヌクレオチド配列のみとのアニーリングを促進し、野生型とのアニーリングは促進しないようにすることができる。その代わりにまたはそれに加えて、遮断オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の特異性を改善させて、存在するすべての野生型配列の増幅を防止するために使用することができる。使用する一般的技法は、ＰＣＲプライマー間でアニーリングし、ＰＣＲポリメラーゼによって追放または消化することができないオリゴヌクレオチドを設計することである。オリゴヌクレオチドは、非標的の（通常は健康な）配列とアニーリングする一方で、標的（突然変異）配列とミスマッチである（しばしば単一の塩基で）ように設計される。このミスマッチは２つの配列に対する異なる融解温度をもたらし、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ伸長温度で非標的配列とアニーリングしたままである一方で、標的配列から解離するように設計される。
【0178】
遮断オリゴヌクレオチドは、しばしば、ＰＣＲポリメラーゼのエクソヌクレアーゼ活性によるその消化を防止するため、または標的と非標的配列との間の融解温度差異を増強させるために、修飾を有し得る。
【0179】
ロックド核酸（ＬＮＡ）または他の融解温度を変更する修飾を遮断オリゴヌクレオチド内に取り込むことは、標的および非標的配列に対するオリゴヌクレオチドの融解温度の差異を顕著に増加させる場合がある。
【0180】
したがって、遮断オリゴヌクレオチドを使用する本発明の一実施形態が提供される。一部の実施形態では、遮断オリゴヌクレオチドは、消化または追放されないことを確実にするために、加ピロリン酸分解（ＰＰＬ）反応に対して耐性でなければならない。これは、いくつかの様々な方法で、たとえば、その３’末端でのミスマッチを介して、またはホスホロチオエート結合もしくはスペーサーなどの修飾を通じて、達成することができる。
【0181】
遮断オリゴヌクレオチドを使用する本発明のそのような実施形態または一態様では、所定の核酸分析物中の標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法は、一本鎖遮断オリゴヌクレオチドを、非標的ポリヌクレオチド配列の少なくとも部分組と、同じステップの前またはその間にアニーリングさせることを特徴とし、分析物標的配列が、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０とアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物を作り出し、Ａ０の３’末端が、分析物標的配列と二本鎖複合体を形成する。
【0182】
一部の実施形態では、遮断オリゴヌクレオチドは、その３’末端でのミスマッチを介して、加ピロリン酸分解反応に対して耐性となっている。別の実施形態では、遮断オリゴヌクレオチドは、３’遮断基の存在を介して耐性となっている。別の実施形態では、遮断オリゴヌクレオチドは、スペーサーまたは他の内部修飾の存在を介して耐性となっている。さらなる実施形態では、遮断オリゴヌクレオチドは、融解温度を増加させる修飾または修飾ヌクレオチド塩基をどちらも含み、加ピロリン酸分解に対する耐性が与えられている。
【0183】
本明細書中における「ホスファターゼ酵素」への言及とは、本発明の方法によって生成されたヌクレオシド三リン酸を加水分解によって除去する能力を有する、任意の酵素またはその機能的断片をいう。これには、リン酸モノエステルをリン酸イオンおよびアルコールへと切断する能力を有する、任意の酵素またはその機能的断片が含まれる。
【0184】
本明細書中における「ピロホスファターゼ酵素」への言及とは、１個のピロリン酸イオンから２個のリン酸イオンへの変換を触媒する能力を有する、任意の酵素またはその機能的断片をいう。
【0185】
これには、無機ピロホスファターゼおよび無機ジホスファターゼも含まれる。非限定的な例は、熱安定性無機ピロホスフェート（ＴＩＰＰ）である。
一部の実施形態では、任意の以前に記載した実施形態の改変バージョンが提供され、ピロホスファターゼの使用は任意選択である。
一部の実施形態では、任意の以前に記載した実施形態の改変バージョンが提供され、ピロホスファターゼの使用は任意選択である。
【0186】
本発明の方法の一部の実施形態は、図８～１１中に見ることができる。
図８では、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０が、標的ポリヌクレオチド配列とアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物を作り出し、Ａ０の３’末端が標的ポリヌクレオチド配列と二本鎖複合体を形成する。本発明のこの簡易化された実施形態では、標的とアニーリングしていないＡ０が、どのように本方法のさらなるステップに参加しないかを例示するために、２つのＡ０分子および１つの標的ポリヌクレオチド配列が存在する。この例示的な例では、Ａ０の３’末端は標的ポリヌクレオチド配列とアニーリングする一方で、Ａ０の５’末端はアニーリングしない。Ａ０の５’末端は、５’化学遮断基、共通のプライミング配列、およびバーコード領域を含む。
図８では、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０が、標的ポリヌクレオチド配列とアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖である第１の中間生成物を作り出し、Ａ０の３’末端が標的ポリヌクレオチド配列と二本鎖複合体を形成する。本発明のこの簡易化された実施形態では、標的とアニーリングしていないＡ０が、どのように本方法のさらなるステップに参加しないかを例示するために、２つのＡ０分子および１つの標的ポリヌクレオチド配列が存在する。この例示的な例では、Ａ０の３’末端は標的ポリヌクレオチド配列とアニーリングする一方で、Ａ０の５’末端はアニーリングしない。Ａ０の５’末端は、５’化学遮断基、共通のプライミング配列、およびバーコード領域を含む。
【0187】
部分的に二本鎖の第１の中間生成物は、加ピロリン酸分解酵素の存在下、３’－５’方向でＡ０の３’末端から加ピロリン酸分解を受けて、部分的に消化された鎖Ａ１、分析物、および標的とアニーリングしなかった未消化のＡ０分子を作り出す。
【0188】
図９では、Ａ１が一本鎖トリガーオリゴヌクレオチドＢとアニーリングしており、Ａ１鎖がＢに対して５’－３’方向に伸長されて、オリゴヌクレオチドＡ２を作り出す。この例示的な例では、トリガーオリゴヌクレオチドＢは５’化学遮断を有する。すべての未消化のＡ０はトリガーオリゴヌクレオチドＢとアニーリングするが、５’－３’方向でＢに対して伸長して本方法の後の部分のための標的である配列を生じることができない。本実施例では、Ａ２を、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドを用いてプライミングし、複数コピーのＡ２またはＡ２の一領域が作り出される。
【0189】
図１０では、Ａ１が、スプリントオリゴヌクレオチドＤとアニーリングし、その後、その３’および５’末端のライゲーションによって環状化される。今では環状化されたＡ２を、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドを用いてプライミングし、複数コピーのＡ２またはＡ２の一領域が作り出される。この例示的な例では、スプリントオリゴヌクレオチドＤは、３’修飾（この例示中では化学的）が原因で、またはＤの３’末端とＡ２の対応する領域との間のヌクレオチドミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ１に対して伸長することができない。
【0190】
図１１では、スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’領域がＡ１の３’領域とアニーリングする一方で、スプリントオリゴヌクレオチドＤの５’領域がライゲーションプローブＣの５’領域とアニーリングする。したがって、Ａ１と、Ｃと、任意選択で、Ｃの５’末端に合わせるために５’－３’方向のＡ１の伸長によって形成された中間領域とから構成される、第２の中間生成物Ａ２が形成される。この例示的な例では、３’－５’エクソヌクレアーゼを使用してすべてのライゲーションしていないＡ１を消化することができるように、ライゲーションプローブＣは３’化学遮断基を有する。
【0191】
Ａ２を、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドを用いてプライミングし、複数コピーのＡ２またはＡ２の一領域が作り出される。
本発明の一部の実施形態では、試料中に存在する所定の核酸分析物中の標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法において使用するためのキットであって、方法は、
（ａ）以前にまたは続いて記載する遮断オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）標的ポリヌクレオチド配列と第１の中間生成物を形成することができる一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間生成物が少なくとも部分的に二本鎖である一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
（ｃ）リガーゼと、
（ｄ）第１の中間生成物をＡ０の末端から３’－５’方向で消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を作り出すことができる、加ピロリン酸分解酵素と、
（ｅ）適切な緩衝液と
を含む、キットが提供される。
本発明の一部の実施形態では、試料中に存在する所定の核酸分析物中の標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法において使用するためのキットであって、方法は、
（ａ）以前にまたは続いて記載する遮断オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）標的ポリヌクレオチド配列と第１の中間生成物を形成することができる一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間生成物が少なくとも部分的に二本鎖である一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
（ｃ）リガーゼと、
（ｄ）第１の中間生成物をＡ０の末端から３’－５’方向で消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を作り出すことができる、加ピロリン酸分解酵素と、
（ｅ）適切な緩衝液と
を含む、キットが提供される。
【0192】
一実施形態では、Ａ０の３’末端は標的配列と相補的である。
一実施形態では、Ａ０の３’末端は標的配列と完全に相補的である。
一実施形態では、キットは、Ａ０の一部分と実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドを含む。
一実施形態では、Ａ０の３’末端は標的配列と完全に相補的である。
一実施形態では、キットは、Ａ０の一部分と実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドを含む。
【0193】
一実施形態では、キットは増幅酵素をさらに含む。
一実施形態では、キットは、１つまたは複数のプライマーをさらに含み、プライマーのうちの１つまたは複数は、非相補的５’テイルを有する。
一実施形態では、キットは、１つまたは複数のプライマーをさらに含み、プライマーのうちの１つまたは複数は、非相補的５’テイルを有する。
【0194】
一実施形態では、プライマーのうちの１つまたは複数は５’リン酸を有する。
一実施形態では、プライマーのうちの１つまたは複数は５’保護されている。
一実施形態では、Ａ０の３’末端は、標的ポリヌクレオチド配列と完全に相補的である。
一実施形態では、プライマーのうちの１つまたは複数は５’保護されている。
一実施形態では、Ａ０の３’末端は、標的ポリヌクレオチド配列と完全に相補的である。
【0195】
一実施形態では、リガーゼは、一本鎖ライゲーション活性を実質的に欠く。
一部の実施形態では、キットは、標的ポリヌクレオチド配列と第１の中間生成物を形成することができる一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間生成物が少なくとも部分的に二本鎖である一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
（ａ）以前にまたは続いて記載する遮断オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）リガーゼと、
（ｃ）第１の中間生成物をＡ０の末端から３’－５’方向で消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を作り出すことができる、加ピロリン酸分解酵素と、
（ｄ）適切な緩衝液と
を含む。
一部の実施形態では、キットは、標的ポリヌクレオチド配列と第１の中間生成物を形成することができる一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間生成物が少なくとも部分的に二本鎖である一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
（ａ）以前にまたは続いて記載する遮断オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）リガーゼと、
（ｃ）第１の中間生成物をＡ０の末端から３’－５’方向で消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を作り出すことができる、加ピロリン酸分解酵素と、
（ｄ）適切な緩衝液と
を含む。
【0196】
一部の実施形態では、キットは、代わりに、
－ Ａ１上の隣接配列と相補的である、２つ以上のライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）プローブオリゴヌクレオチドであって、プローブのアニーリングが成功している場合は、一方のＬＣＲプローブの５’リン酸が他方のＬＣＲプローブの３’ＯＨと直接隣接している、プローブオリゴヌクレオチドと、
－ １つまたは複数のリガーゼと
をさらに含み得る。
－ Ａ１上の隣接配列と相補的である、２つ以上のライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）プローブオリゴヌクレオチドであって、プローブのアニーリングが成功している場合は、一方のＬＣＲプローブの５’リン酸が他方のＬＣＲプローブの３’ＯＨと直接隣接している、プローブオリゴヌクレオチドと、
－ １つまたは複数のリガーゼと
をさらに含み得る。
【0197】
一部の実施形態では、Ａ２の存在下では、２つのＬＣＲプローブはＡ２とのアニーリングが成功し、一緒にライゲーションされて、１つのオリゴヌクレオチド分子を形成し、続いてこれが、第２ラウンドの共有的ライゲーションの新しい標的として働き、目的の標的、この場合はＡ２の幾何学的増幅をもたらす。ライゲーションされた生成物、または複製配列は、Ａ２と相補的であり、次の増幅サイクルにおいて標的として機能する。したがって、特異的標的ＤＮＡ配列の指数関数的増幅は、過剰なＬＣＲプローブの存在下における変性、ハイブリダイゼーション、およびライゲーションの繰り返しサイクルを通じて達成される。このことから、Ａ２の存在、ひいては標的ポリヌクレオチド配列の存在が暗示される。
【0198】
一部の実施形態では、Ａ２の存在下では、２つのＰＣＲプローブはＡ２とのアニーリングが成功し、一緒にライゲーションされて、１つのオリゴヌクレオチド分子を形成し、その後、これが第２ラウンドの共有的ライゲーションの新しい標的として働き、目的の標的、この場合はＡ２の幾何学的増幅をもたらし、その後、これを検出する。
【0199】
一部の実施形態では、キットは、代わりに、
－ ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣと、
－ スプリントオリゴヌクレオチドＤと
をさらに含んでよく、Ａ１およびＣが一緒にライゲーションされてＡ２を形成することができるように、Ｃは５’リン酸を有し、スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’末端はＣの５’末端と相補的であり、Ｄの５’末端はＡ１の３’末端と相補的である。
－ ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣと、
－ スプリントオリゴヌクレオチドＤと
をさらに含んでよく、Ａ１およびＣが一緒にライゲーションされてＡ２を形成することができるように、Ｃは５’リン酸を有し、スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’末端はＣの５’末端と相補的であり、Ｄの５’末端はＡ１の３’末端と相補的である。
【0200】
一部の実施形態では、キットは、
－ フルオロフォア－クエンチャー対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド１（ＨＯ１）であって、ＨＯ１はＡ２と相補的であり、Ａ２とアニーリングした場合に、ＨＯ１のヘアピン構造が開き、フルオロフォア－クエンチャー対が分離する、ＨＯ１と、
－ フルオロフォア－クエンチャー対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド２（ＨＯ２）であって、ＨＯ２は開いたＨＯ１と相補的であり、ＨＯ１とアニーリングした場合に、ＨＯ２のヘアピン構造が開き、フルオロフォア－クエンチャー対が分離する、ＨＯ２と
をさらに含み得る。
－ フルオロフォア－クエンチャー対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド１（ＨＯ１）であって、ＨＯ１はＡ２と相補的であり、Ａ２とアニーリングした場合に、ＨＯ１のヘアピン構造が開き、フルオロフォア－クエンチャー対が分離する、ＨＯ１と、
－ フルオロフォア－クエンチャー対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド２（ＨＯ２）であって、ＨＯ２は開いたＨＯ１と相補的であり、ＨＯ１とアニーリングした場合に、ＨＯ２のヘアピン構造が開き、フルオロフォア－クエンチャー対が分離する、ＨＯ２と
をさらに含み得る。
【0201】
一部の実施形態では、キットは、複数のＨＯ１およびＨＯ２をさらに含み得る。
一部の実施形態では、キットは、代わりに、基質アーム、部分的触媒核、およびセンサーアームを含む、オリゴヌクレオチドＡと、
－ 基質アーム、部分的触媒核、およびセンサーアームを含む、オリゴヌクレオチドＢと、
－ フルオロフォアクエンチャー対を含む基質と
をさらに含んでよく、Ａ２の存在下でオリゴヌクレオチドＡおよびＢが組み合わされて触媒的に多成分の核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）が形成されるように、オリゴヌクレオチドＡおよびＢのセンサーアームがＡ２のフランキング領域と相補的である。
一部の実施形態では、キットは、代わりに、基質アーム、部分的触媒核、およびセンサーアームを含む、オリゴヌクレオチドＡと、
－ 基質アーム、部分的触媒核、およびセンサーアームを含む、オリゴヌクレオチドＢと、
－ フルオロフォアクエンチャー対を含む基質と
をさらに含んでよく、Ａ２の存在下でオリゴヌクレオチドＡおよびＢが組み合わされて触媒的に多成分の核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）が形成されるように、オリゴヌクレオチドＡおよびＢのセンサーアームがＡ２のフランキング領域と相補的である。
【0202】
一部の実施形態では、キットは、代わりに、部分的に二本鎖の核酸構築体であって、
－ 一方の鎖が、少なくとも１つのＲＮＡ塩基、少なくとも１つのフルオロフォアを含み、この鎖の一領域がＡ２の一領域と相補的であり、この鎖を「基質」鎖と呼んでよく、
－ 他方のスタンドが、少なくとも１つのクエンチャーを含み、この鎖の一領域が、Ａ２の存在下で部分的に二本鎖の核酸構築体が実質的により二本鎖となるように、基質鎖が相補的である領域に隣接するＡ２の一領域と相補的である
、核酸構築体をさらに含み得る。
－ 一方の鎖が、少なくとも１つのＲＮＡ塩基、少なくとも１つのフルオロフォアを含み、この鎖の一領域がＡ２の一領域と相補的であり、この鎖を「基質」鎖と呼んでよく、
－ 他方のスタンドが、少なくとも１つのクエンチャーを含み、この鎖の一領域が、Ａ２の存在下で部分的に二本鎖の核酸構築体が実質的により二本鎖となるように、基質鎖が相補的である領域に隣接するＡ２の一領域と相補的である
、核酸構築体をさらに含み得る。
【0203】
言い換えれば、部分的に二本鎖の核酸構築体は、Ａ２の存在下でより大きな二本鎖部分を有する。
一部の実施形態では、キットは、少なくとも１つのＲＮＡ塩基を除去するための酵素をさらに含み得る。
一部の実施形態では、キットは、少なくとも１つのＲＮＡ塩基を除去するための酵素をさらに含み得る。
【0204】
一部の実施形態では、酵素はウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）であり、ＲＮＡ塩基はウラシルである。
一部の実施形態では、キットは、代わりに、
－ その蛍光が、互いとまたは１つもしくは複数の蛍光クエンチャーのいずれかとのその近接によってクエンチされるように配置された、１つのまたは複数のフルオロフォアを含む、ライゲーション部位を含むＡ２の一領域と相補的であるオリゴヌクレオチドと、
－ 二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素と
をさらに含んでよく、Ａ２の存在下で、標識されたオリゴヌクレオチドは、フルオロフォアが互いからまたはその対応するクエンチャーから分離されており、蛍光シグナル、ひいてはＡ２の存在が検出可能であるように、消化される。
一部の実施形態では、キットは、代わりに、
－ その蛍光が、互いとまたは１つもしくは複数の蛍光クエンチャーのいずれかとのその近接によってクエンチされるように配置された、１つのまたは複数のフルオロフォアを含む、ライゲーション部位を含むＡ２の一領域と相補的であるオリゴヌクレオチドと、
－ 二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素と
をさらに含んでよく、Ａ２の存在下で、標識されたオリゴヌクレオチドは、フルオロフォアが互いからまたはその対応するクエンチャーから分離されており、蛍光シグナル、ひいてはＡ２の存在が検出可能であるように、消化される。
【0205】
一部の実施形態では、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素はエクソヌクレアーゼである。
一部の実施形態では、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素は校正活性を有するポリメラーゼである。
一部の実施形態では、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素は校正活性を有するポリメラーゼである。
【0206】
一部の実施形態では、キットのフルオロフォアは、フルオレセインファミリー、カルボキシローダミンファミリー、シアニンファミリー、ローダミンファミリー、ポリハロフルオレセインファミリー色素、ヘキサクロロフルオレセインファミリー色素、クマリンファミリー色素、オキサジンファミリー色素、チアジンファミリー色素、スクアレインファミリー色素、およびキレート化ランタニドファミリー色素の色素から選択され得る。
【0207】
一部の実施形態では、キットのフルオロフォアは、市販の色素のうちの任意のものから選択され得る。
一部の実施形態では、キットのクエンチャーは、商品名Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ（商標）、Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）Ｄａｒｋ、Ｑｘ１Ｊ、およびＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）の下で入手可能なものから選択され得る。
一部の実施形態では、キットのクエンチャーは、商品名Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ（商標）、Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）Ｄａｒｋ、Ｑｘ１Ｊ、およびＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）の下で入手可能なものから選択され得る。
【0208】
一部の実施形態では、キットのクエンチャーは、市販のクエンチャーのうちの任意のものから選択され得る。
一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数の部分的に二本鎖のＤＮＡ構築体をさらに含んでよく、それぞれの構築体は１つまたは複数のフルオロフォアおよび１つまたは複数のクエンチャーを含有する。一部の実施形態では、構築体が部分的に二本鎖である場合、１つまたは複数のフルオロフォアおよび１つまたは複数のクエンチャーは、１つまたは複数のフルオロフォアの十分なクエンチングが起こるように、互いに十分に近く近接して位置する。
一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数の部分的に二本鎖のＤＮＡ構築体をさらに含んでよく、それぞれの構築体は１つまたは複数のフルオロフォアおよび１つまたは複数のクエンチャーを含有する。一部の実施形態では、構築体が部分的に二本鎖である場合、１つまたは複数のフルオロフォアおよび１つまたは複数のクエンチャーは、１つまたは複数のフルオロフォアの十分なクエンチングが起こるように、互いに十分に近く近接して位置する。
【0209】
一部の実施形態では、構築体は、それ自身に折り重なる自己相補的領域を有する、ＤＮＡの一方の鎖である。
一部の実施形態では、構築体は、プライマー対の一方のプライマーを含む。
一部の実施形態では、構築体は、プライマー対の一方のプライマーを含む。
【0210】
一部の実施形態では、キットは、プライマー対の他方のプライマーをさらに含み得る。
一部の実施形態では、構築体の一本鎖部分の一部分は、Ａ２とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長する。一部の実施形態では、その後、プライマー対の他方のプライマーが、伸長した構築体とハイブリダイズする。その後、このプライマーが構築体に対して伸長し、自己相補的領域を追放する。したがって、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数の色素が十分に隔てられて蛍光シグナルが検出され、Ａ２の存在が示される。
一部の実施形態では、構築体の一本鎖部分の一部分は、Ａ２とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長する。一部の実施形態では、その後、プライマー対の他方のプライマーが、伸長した構築体とハイブリダイズする。その後、このプライマーが構築体に対して伸長し、自己相補的領域を追放する。したがって、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数の色素が十分に隔てられて蛍光シグナルが検出され、Ａ２の存在が示される。
【0211】
そのような実施形態では、構築体はサンライズプライマーとして知られ得る。
一部の実施形態では、構築体は２本の別々のＤＮＡ鎖を含む。
一部の実施形態では、構築体の一本鎖部分の一部分は、Ａ２とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長する。一部の実施形態では、その後、プライマー対の他方のプライマーが、伸長した構築体とハイブリダイズする。その後、このプライマーが構築体に対して二本鎖部分の方向に伸長し、ＤＮＡ鎖のうちのより短い方を追放し、したがって、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数の色素が十分に隔てられて蛍光シグナルが検出され、Ａ２の存在が示される。
一部の実施形態では、構築体は２本の別々のＤＮＡ鎖を含む。
一部の実施形態では、構築体の一本鎖部分の一部分は、Ａ２とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長する。一部の実施形態では、その後、プライマー対の他方のプライマーが、伸長した構築体とハイブリダイズする。その後、このプライマーが構築体に対して二本鎖部分の方向に伸長し、ＤＮＡ鎖のうちのより短い方を追放し、したがって、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数の色素が十分に隔てられて蛍光シグナルが検出され、Ａ２の存在が示される。
【0212】
そのような実施形態では、構築体は分子ジッパーとして知られ得る。
当業者には、サンライズプライマーおよび分子ジッパーのどちらについても、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数のクエンチャーの対が、それぞれの対応する構築体内の様々な位置に位置することが可能であることが理解されよう。主要な特長は、それぞれの対が互いに十分に近接して位置しており、Ａ２の非存在下、すなわち伸長および鎖の追放が起こっていない場合は、蛍光シグナルが放射されないことである。
当業者には、サンライズプライマーおよび分子ジッパーのどちらについても、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数のクエンチャーの対が、それぞれの対応する構築体内の様々な位置に位置することが可能であることが理解されよう。主要な特長は、それぞれの対が互いに十分に近接して位置しており、Ａ２の非存在下、すなわち伸長および鎖の追放が起こっていない場合は、蛍光シグナルが放射されないことである。
【0213】
一実施形態では、キットはピロリン酸イオン供給源をさらに含む。適切なピロリン酸イオン供給源は以前に記載したとおりである。
一部の実施形態では、キットは、適切な陽性および陰性対照をさらに含む。
一部の実施形態では、キットは、適切な陽性および陰性対照をさらに含む。
【0214】
一部の実施形態では、キットは、以前に記載したとおりである１つまたは複数の対照プローブ（Ｅ０）をさらに含み得る。
一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数の対照プローブ（Ｅｏ）および１つまたは複数の遮断オリゴヌクレオチドをさらに含み得る。
一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数の対照プローブ（Ｅｏ）および１つまたは複数の遮断オリゴヌクレオチドをさらに含み得る。
【0215】
一部の実施形態では、Ａ０の５’末端は、５’－３’エクソヌクレアーゼ消化に対する耐性が与えられていてよく、キットは、５’－３’エクソヌクレアーゼをさらに含み得る。
【0216】
一部の実施形態では、キットは、ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣをさらに含み得る。
一部の実施形態では、キットは、スプリントオリゴヌクレオチドＤをさらに含み得る。
一部の実施形態では、キットは、スプリントオリゴヌクレオチドＤをさらに含み得る。
【0217】
一部の実施形態では、キットは、ＣおよびＤをどちらも含み得る。
ライゲーションプローブＣは、それを３’－５’エクソヌクレアーゼ消化から保護する３’または内部修飾をさらに含み得る。
ライゲーションプローブＣは、それを３’－５’エクソヌクレアーゼ消化から保護する３’または内部修飾をさらに含み得る。
【0218】
Ｄは、Ａ１の３’末端と相補的なオリゴヌクレオチド領域と、オリゴヌクレオチドＣの５’末端またはＡ１の５’末端のいずれかと相補的な領域とを含み得る。
一部の実施形態では、Ｄは、３’修飾が原因で、またはＤの３’末端とＡ１もしくはＣの対応する領域との間のミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ１に対する伸長を受けることができない場合がある。
一部の実施形態では、Ｄは、３’修飾が原因で、またはＤの３’末端とＡ１もしくはＣの対応する領域との間のミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ１に対する伸長を受けることができない場合がある。
【0219】
一部の実施形態では、キットは、試料中に存在する標的ポリヌクレオチド配列の初期増幅のための、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、および適切な緩衝液をさらに含み得る。
一部の実施形態では、キットは、高忠実度ポリメラーゼを取り込んだｄＵＴＰ、ｄＵＴＰ、およびウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）をさらに含み得る。
一部の実施形態では、キットは、高忠実度ポリメラーゼを取り込んだｄＵＴＰ、ｄＵＴＰ、およびウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）をさらに含み得る。
【0220】
一部の実施形態では、キットは、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、キットは、ピロホスファターゼをさらに含み得る。ピロホスファターゼはホットスタートであり得る。
一部の実施形態では、キットは、ピロホスファターゼをさらに含み得る。ピロホスファターゼはホットスタートであり得る。
【0221】
一部の実施形態では、キットはプロテイナーゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブをさらに含み得る。
一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブをさらに含み得る。
【0222】
一部の実施形態では、キットは、それぞれが異なる標的配列に対して選択的であり、それぞれが同定領域を含む、複数のＡ０をさらに含み得る。
一部の実施形態では、キットは、ＲＮＡ鋳型からのＤＮＡの形成のための酵素をさらに含み得る。
一部の実施形態では、キットは、ＲＮＡ鋳型からのＤＮＡの形成のための酵素をさらに含み得る。
【0223】
一部の実施形態では、酵素は逆転写酵素である。
一部の実施形態では、キットの１つまたは複数の酵素はホットスタートであり得る。
一部の実施形態では、キットの１つまたは複数の酵素は熱安定性であり得る。
一部の実施形態では、キットの１つまたは複数の酵素はホットスタートであり得る。
一部の実施形態では、キットの１つまたは複数の酵素は熱安定性であり得る。
【0224】
一部の実施形態では、キットは、適切な洗浄および緩衝試薬をさらに含み得る。
一部の実施形態では、増幅酵素および加ピロリン酸分解酵素は同じである。
一部の実施形態では、増幅酵素および加ピロリン酸分解酵素は同じである。
一部の実施形態では、増幅酵素および加ピロリン酸分解酵素は同じである。
一部の実施形態では、増幅酵素および加ピロリン酸分解酵素は同じである。
【0225】
キットは、本明細書中に記載の処理に従った、ポリヌクレオチドの一部分を単離および／または精製するための精製装置および試薬をさらに含み得る。適切な試薬は当分野で周知であり、ゲル濾過カラムおよび洗浄緩衝液が挙げられる。
【0226】
一部の実施形態では、キットは、以前に記載した通りであり得る後成的感受性および／または後成的依存性制限酵素をさらに含む。
一部の実施形態では、キットは、メチル化感受性および／またはメチル化依存性制限酵素をさらに含む。
一部の実施形態では、キットは、メチル化感受性および／またはメチル化依存性制限酵素をさらに含む。
【0227】
一部の実施形態では、キットは、１つまたはメチルＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質をさらに含む。
一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数の５－メチルシチジン（５－ｍＣ）抗体をさらに含む。
一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数の５－メチルシチジン（５－ｍＣ）抗体をさらに含む。
【0228】
一部の実施形態では、キットは、ＭＢＤ２ｂタンパク質のうちの１つもしくは複数および／またはＭＢＤ２ｂ／ＭＢＤ３Ｌ１複合体のうちの１つもしくは複数をさらに含む。
一部の実施形態では、キットは、メチル化特異的多重鎖ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＳ－ＭＬＰＡ）に適切な試薬をさらに含む。
一部の実施形態では、キットは、メチル化特異的多重鎖ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＳ－ＭＬＰＡ）に適切な試薬をさらに含む。
【0229】
本発明の一実施形態では、
第１の領域、第２の領域、および第３の領域の間の少なくとも１つの流路を含む装置であって、第１の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、
ｄＮＴＰと、
少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドと、
試料中に存在するＤＮＡの初期増幅のための増幅酵素と
を含み、第２の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、
標的ポリヌクレオチド配列と第１の中間生成物を形成することができる一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間生成物が少なくとも部分的に二本鎖である一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
第１の中間生成物をＡ０の末端から３’－５’方向で消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を作り出すことができる、加ピロリン酸分解酵素と
を含み、第３の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、
ｄＮＴＰと、
緩衝液と、
増幅酵素と、
Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分に由来するシグナルを検出するための手段と
を含み、第２の領域のウェルまたは第３の領域のウェルが、Ａ０の一部分と実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドをさらに含む、装置が提供される。
第１の領域、第２の領域、および第３の領域の間の少なくとも１つの流路を含む装置であって、第１の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、
ｄＮＴＰと、
少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドと、
試料中に存在するＤＮＡの初期増幅のための増幅酵素と
を含み、第２の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、
標的ポリヌクレオチド配列と第１の中間生成物を形成することができる一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間生成物が少なくとも部分的に二本鎖である一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
第１の中間生成物をＡ０の末端から３’－５’方向で消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を作り出すことができる、加ピロリン酸分解酵素と
を含み、第３の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、
ｄＮＴＰと、
緩衝液と、
増幅酵素と、
Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分に由来するシグナルを検出するための手段と
を含み、第２の領域のウェルまたは第３の領域のウェルが、Ａ０の一部分と実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドをさらに含む、装置が提供される。
【0230】
一部の実施形態では、第１の領域の１つまたは複数のウェルは、以前にまたは続いて記載した１つまたは複数の遮断オリゴヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、第２の領域の１つまたは複数のウェルは、以前にまたは続いて記載した１つまたは複数の遮断オリゴヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、第２の領域の１つまたは複数のウェルは、以前にまたは続いて記載した１つまたは複数の遮断オリゴヌクレオチドを含む。
【0231】
一部の実施形態では、第１の領域のウェルは、
－ ｄＮＴＰと、
－ １つまたは複数の一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドと、
－ 試料中に存在するＤＮＡの初期増幅のための増幅酵素と
を含み、プライマーのうちの１つまたは複数は非相補的５’テイルを有する。
－ ｄＮＴＰと、
－ １つまたは複数の一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドと、
－ 試料中に存在するＤＮＡの初期増幅のための増幅酵素と
を含み、プライマーのうちの１つまたは複数は非相補的５’テイルを有する。
【0232】
一部の実施形態では、プライマーのうちの１つまたは複数は５’リン酸を有する。
一部の実施形態では、プライマーのうちの１つまたは複数は５’保護されている。
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、第３の領域の１つまたは複数のウェル内に位置する。
一部の実施形態では、プライマーのうちの１つまたは複数は５’保護されている。
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、第３の領域の１つまたは複数のウェル内に位置する。
【0233】
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、装置の第３の領域内に位置する。
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、装置の隣接領域内に位置する。
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、装置の隣接領域内に位置する。
【0234】
一部の実施形態では、第１の領域のそれぞれのウェルのｄＮＴＰは、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＣＴＰであってよく、それぞれのウェルは、高忠実度ポリメラーゼを取り込んだｄＵＴＰおよびウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）をさらに含み得る。
【0235】
一部の実施形態では、第３の領域のそれぞれのウェルのｄＮＴＰは、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＣＴＰであってよく、それぞれのウェルは、高忠実度ポリメラーゼを取り込んだｄＵＴＰおよびウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）をさらに含み得る。
【0236】
一部の実施形態では、第２の領域のそれぞれのウェルは、ピロリン酸イオン供給源をさらに含み得る。
一部の実施形態では、Ａ０の５’末端は、５’－３’エクソヌクレアーゼ消化に対する耐性が与えられていてよく、第２の領域のウェルは、５’－３’エクソヌクレアーゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、Ａ０の５’末端は、５’－３’エクソヌクレアーゼ消化に対する耐性が与えられていてよく、第２の領域のウェルは、５’－３’エクソヌクレアーゼをさらに含み得る。
【0237】
一部の実施形態では、第２または第３の領域のそれぞれのウェルは、リガーゼと、ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣまたはスプリントオリゴヌクレオチドＤとをさらに含み得る。
【0238】
ライゲーションプローブＣは、それを３’－５’エクソヌクレアーゼ消化から保護する３’または内部修飾を含み得る。
スプリントオリゴヌクレオチドＤは、Ａ１の３’末端と相補的なオリゴヌクレオチド領域と、オリゴヌクレオチドＣの５’末端またはＡ１の５’末端のどちらかと相補的な領域とを含み得る。
スプリントオリゴヌクレオチドＤは、Ａ１の３’末端と相補的なオリゴヌクレオチド領域と、オリゴヌクレオチドＣの５’末端またはＡ１の５’末端のどちらかと相補的な領域とを含み得る。
【0239】
Ｄは、３’修飾が原因で、またはＤの３’末端とＡ１もしくはＣの対応する領域との間のミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ１に対する伸長を受けることができない場合がある。
【0240】
一部の実施形態では、ｄＮＴＰはホットスタートであってよく、第２の領域のそれぞれのウェルは、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第２の領域のそれぞれのウェルは、ピロホスファターゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第２の領域のそれぞれのウェルは、ピロホスファターゼをさらに含み得る。
【0241】
一部の実施形態では、ピロホスファターゼはホットスタートであり得る。
一部の実施形態では、第３の領域のそれぞれのウェルは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第３の領域のそれぞれのウェルは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブをさらに含み得る。
【0242】
一部の実施形態では、第２の領域のそれぞれのウェルは、同定領域を含む標的配列に選択的な少なくとも１つまたは複数の異なるＡ０を含み得る。
一部の実施形態では、第２の領域中の増幅酵素および加ピロリン酸分解酵素は同じであり得る。
一部の実施形態では、第２の領域中の増幅酵素および加ピロリン酸分解酵素は同じであり得る。
【0243】
一部の実施形態では、１つまたは複数のウェルを含む第４の領域が存在してよく、それぞれのウェルはプロテイナーゼを含んでよく、前記第４の領域は第１および第２の領域の間に位置し得る。
【0244】
一部の実施形態では、第２の領域のウェルが、
ｄＮＴＰと、
緩衝液と、
増幅酵素と、
Ａ１もしくはその一部分、または複数コピーのＡ１、または複数コピーのその一部分に由来するシグナルを検出するための手段と
をさらに含むように、装置の第２および第３の領域を合わせ得る。
ｄＮＴＰと、
緩衝液と、
増幅酵素と、
Ａ１もしくはその一部分、または複数コピーのＡ１、または複数コピーのその一部分に由来するシグナルを検出するための手段と
をさらに含むように、装置の第２および第３の領域を合わせ得る。
【0245】
第２の領域のウェルは、以前にまたは続いて記載した１つまたは複数の遮断オリゴヌクレオチドをさらに含み得る。
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、第２の領域の１つまたは複数のウェル内に位置する。
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、第２の領域の１つまたは複数のウェル内に位置する。
【0246】
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、装置の第２の領域内に位置する。
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、装置の隣接領域内に位置する。
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、装置の隣接領域内に位置する。
【0247】
一部の実施形態では、
第１の領域および第２の領域の間の流路を含む装置であって、第１の領域が１つまたは複数のウェルを含み、１つまたは複数のウェルが、
標的ポリヌクレオチド配列と第１の中間生成物を形成することができる一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間生成物が少なくとも部分的に二本鎖である一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
第１の中間生成物をＡ０の末端から３’－５’方向で消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を作り出すことができる、加ピロリン酸分解酵素と、
Ａ１とライゲーションしてオリゴヌクレオチドＡ２を作り出すことができる、１つまたは複数のリガーゼと
を含み、第２の領域が１つまたは複数のウェルを含む、装置が提供される。
第１の領域および第２の領域の間の流路を含む装置であって、第１の領域が１つまたは複数のウェルを含み、１つまたは複数のウェルが、
標的ポリヌクレオチド配列と第１の中間生成物を形成することができる一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間生成物が少なくとも部分的に二本鎖である一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
第１の中間生成物をＡ０の末端から３’－５’方向で消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を作り出すことができる、加ピロリン酸分解酵素と、
Ａ１とライゲーションしてオリゴヌクレオチドＡ２を作り出すことができる、１つまたは複数のリガーゼと
を含み、第２の領域が１つまたは複数のウェルを含む、装置が提供される。
【0248】
第１の領域のウェルは、以前にまたは続いて記載した１つまたは複数の遮断オリゴヌクレオチドをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第１の領域の１つまたは複数のウェルは、加ピロリン酸分解反応を順方向に駆動するためのイオン供給源をさらに含み得る。
一部の実施形態では、第１の領域の１つまたは複数のウェルは、加ピロリン酸分解反応を順方向に駆動するためのイオン供給源をさらに含み得る。
【0249】
一部の実施形態では、イオンはピロリン酸イオンである。
一部の実施形態では、Ａ０の５’末端は、５’－３’エクソヌクレアーゼ消化に対して耐性であり、第１の領域のウェルは、５’－３’エクソヌクレアーゼをさらに含む。
一部の実施形態では、Ａ０の５’末端は、５’－３’エクソヌクレアーゼ消化に対して耐性であり、第１の領域のウェルは、５’－３’エクソヌクレアーゼをさらに含む。
【0250】
一部の実施形態では、装置は、流路によって第１の領域と連結された、１つまたは複数のウェルを含む第３の領域をさらに含んでよく、第３の領域の１つまたは複数のウェルは、
ｄＮＴＰと、
一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドと、
増幅酵素と
を含む。
ｄＮＴＰと、
一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドと、
増幅酵素と
を含む。
【0251】
第３の領域のウェルは、以前にまたは続いて記載した１つまたは複数の遮断オリゴヌクレオチドをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第３の領域のｄＮＴＰは、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＡＴＰであってよく、
増幅酵素は高忠実度ポリメラーゼを取り込んだｄＵＴＰであってよく、
第３の領域の１つまたは複数のウェルは、ウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第３の領域のｄＮＴＰは、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＡＴＰであってよく、
増幅酵素は高忠実度ポリメラーゼを取り込んだｄＵＴＰであってよく、
第３の領域の１つまたは複数のウェルは、ウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼをさらに含み得る。
【0252】
一部の実施形態では、装置は、１つまたは複数のウェルを含む第１および第３の領域の間に位置する第４の領域をさらに含んでよく、１つまたは複数のウェルはプロテイナーゼを含み得る。
【0253】
一部の実施形態では、第１または第２の領域の１つまたは複数のウェルは、リガーゼと、Ａ０の一領域と相補的であるライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣとをさらに含み得る。
【0254】
一部の実施形態では、第１または第２の領域の１つまたは複数のウェルは、リガーゼと、Ａ０の一領域と相補的であるスプリントオリゴヌクレオチドＤとをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第１または第２の領域の１つまたは複数のウェルは、リガーゼと、スプリントオリゴヌクレオチドＤと、ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣとをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第１または第２の領域の１つまたは複数のウェルは、リガーゼと、スプリントオリゴヌクレオチドＤと、ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣとをさらに含み得る。
【0255】
一部の実施形態では、ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣは、それを３’－５’エクソヌクレアーゼ消化から保護する３’または内部修飾を含み得る。
一部の実施形態では、Ｄは、Ａ１の３’末端と相補的なオリゴヌクレオチド領域と、オリゴヌクレオチドＣの５’末端またはＡ１の５’末端のどちらかと相補的な領域とを含み得る。
一部の実施形態では、Ｄは、Ａ１の３’末端と相補的なオリゴヌクレオチド領域と、オリゴヌクレオチドＣの５’末端またはＡ１の５’末端のどちらかと相補的な領域とを含み得る。
【0256】
一部の実施形態では、Ｄは、３’修飾が原因で、またはＤの３’末端とＡ１もしくはＣの対応する領域との間のミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ１に対する伸長を受けることができない場合がある。
【0257】
一部の実施形態では、第１の領域の１つまたは複数のウェルは、それぞれが異なる標的配列に対して選択的であり、それぞれが同定領域を含む、少なくとも１つまたは複数の異なるＡ０を含み得る。
【0258】
一部の実施形態では、第２の領域のウェルは、
ｄＮＴＰと、
緩衝液と、
増幅酵素と、
Ａ１もしくはその一部分、または複数コピーのＡ１、または複数コピーのその一部分に由来するシグナルを検出するための手段と
を含み得る。
ｄＮＴＰと、
緩衝液と、
増幅酵素と、
Ａ１もしくはその一部分、または複数コピーのＡ１、または複数コピーのその一部分に由来するシグナルを検出するための手段と
を含み得る。
【0259】
第２の領域のウェルは、以前にまたは続いて記載した１つまたは複数の遮断オリゴヌクレオチドをさらに含み得る。
本発明の実施形態は、ｄＮＴＰ、緩衝液、増幅酵素、などを含む１つまたは複数の領域中に位置する１つまたは複数の遮断オリゴヌクレオチドを含み得る。
本発明の実施形態は、ｄＮＴＰ、緩衝液、増幅酵素、などを含む１つまたは複数の領域中に位置する１つまたは複数の遮断オリゴヌクレオチドを含み得る。
【0260】
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、第２の領域の１つまたは複数のウェル内に位置する。
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、装置の第２の領域内に位置する。
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、装置の第２の領域内に位置する。
【0261】
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、装置の隣接領域内に位置する。
一部の実施形態では、第２の領域の１つまたは複数のウェルは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第２の領域の１つまたは複数のウェルは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブをさらに含み得る。
【0262】
一部の実施形態では、装置の増幅酵素および加ピロリン酸分解酵素は同じである。
一部の実施形態では、第２の領域のウェルは、
－ Ａ１上の隣接配列と相補的である、２つ以上のライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）プローブオリゴヌクレオチドであって、プローブのアニーリングが成功している場合は、一方のＬＣＲプローブの５’リン酸が他方のＬＣＲプローブの３’ＯＨと直接隣接している、プローブオリゴヌクレオチドと、
－ １つまたは複数のリガーゼと
をさらに含む。
一部の実施形態では、第２の領域のウェルは、
－ Ａ１上の隣接配列と相補的である、２つ以上のライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）プローブオリゴヌクレオチドであって、プローブのアニーリングが成功している場合は、一方のＬＣＲプローブの５’リン酸が他方のＬＣＲプローブの３’ＯＨと直接隣接している、プローブオリゴヌクレオチドと、
－ １つまたは複数のリガーゼと
をさらに含む。
【0263】
一部の実施形態では、第２の領域のウェルは、
－ ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣと、
－ スプリントオリゴヌクレオチドＤと
を含んでよく、Ａ１およびＣが一緒にライゲーションされてオリゴヌクレオチドＡ２を形成することができるように、Ｃは５’リン酸を有し、スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’末端はＣの５’末端と相補的であり、Ｄの５’末端はＡ１の３’末端と相補的である。
－ ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣと、
－ スプリントオリゴヌクレオチドＤと
を含んでよく、Ａ１およびＣが一緒にライゲーションされてオリゴヌクレオチドＡ２を形成することができるように、Ｃは５’リン酸を有し、スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’末端はＣの５’末端と相補的であり、Ｄの５’末端はＡ１の３’末端と相補的である。
【0264】
一部の実施形態では、第２の領域のウェルは、
－ フルオロフォア－クエンチャー対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド１（ＨＯ１）であって、ＨＯ１はＡ２と相補的であり、Ａ２とアニーリングした場合に、ＨＯ１のヘアピン構造が開き、フルオロフォア－クエンチャー対が分離する、ＨＯ１と、
－ フルオロフォア－クエンチャー対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド２（ＨＯ２）であって、ＨＯ２は開いたＨＯ１と相補的であり、ＨＯ１とアニーリングした場合に、ＨＯ２のヘアピン構造が開き、フルオロフォア－クエンチャー対が分離する、ＨＯ２と
をさらに含み得る。
－ フルオロフォア－クエンチャー対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド１（ＨＯ１）であって、ＨＯ１はＡ２と相補的であり、Ａ２とアニーリングした場合に、ＨＯ１のヘアピン構造が開き、フルオロフォア－クエンチャー対が分離する、ＨＯ１と、
－ フルオロフォア－クエンチャー対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド２（ＨＯ２）であって、ＨＯ２は開いたＨＯ１と相補的であり、ＨＯ１とアニーリングした場合に、ＨＯ２のヘアピン構造が開き、フルオロフォア－クエンチャー対が分離する、ＨＯ２と
をさらに含み得る。
【0265】
一部の実施形態では、第２の領域のウェルは、複数のＨＯ１およびＨＯ２をさらに含み得る。
一部の実施形態では、第２の領域のウェルは、
－ 基質アーム、部分的触媒核、およびセンサーアームを含む、オリゴヌクレオチドＡと、
－ 基質アーム、部分的触媒核、およびセンサーアームを含む、オリゴヌクレオチドＢと、
－ フルオロフォアクエンチャー対を含む基質と
をさらに含んでよく、Ａ２の存在下でオリゴヌクレオチドＡおよびＢが組み合わされて触媒的に多成分の核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）が形成されるように、オリゴヌクレオチドＡおよびＢのセンサーアームがＡ２のフランキング領域と相補的である。
一部の実施形態では、第２の領域のウェルは、
－ 基質アーム、部分的触媒核、およびセンサーアームを含む、オリゴヌクレオチドＡと、
－ 基質アーム、部分的触媒核、およびセンサーアームを含む、オリゴヌクレオチドＢと、
－ フルオロフォアクエンチャー対を含む基質と
をさらに含んでよく、Ａ２の存在下でオリゴヌクレオチドＡおよびＢが組み合わされて触媒的に多成分の核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）が形成されるように、オリゴヌクレオチドＡおよびＢのセンサーアームがＡ２のフランキング領域と相補的である。
【0266】
一部の実施形態では、第２の領域のウェルは、部分的に二本鎖の核酸構築体であって、
－ 一方の鎖が、少なくとも１つのＲＮＡ塩基、少なくとも１つのフルオロフォアを含み、この鎖の一領域がＡ２の一領域と相補的であり、この鎖を「基質」鎖と呼んでよく、
－ 他方のスタンドが、少なくとも１つのクエンチャーを含み、この鎖の一領域が、Ａ２の存在下で部分的に鎖となった核酸構築体が実質的により二本鎖となるように、基質鎖が相補的である領域に隣接するＡ２の一領域と相補的である
、核酸構築体を含み得る。
－ 一方の鎖が、少なくとも１つのＲＮＡ塩基、少なくとも１つのフルオロフォアを含み、この鎖の一領域がＡ２の一領域と相補的であり、この鎖を「基質」鎖と呼んでよく、
－ 他方のスタンドが、少なくとも１つのクエンチャーを含み、この鎖の一領域が、Ａ２の存在下で部分的に鎖となった核酸構築体が実質的により二本鎖となるように、基質鎖が相補的である領域に隣接するＡ２の一領域と相補的である
、核酸構築体を含み得る。
【0267】
一部の実施形態では、第２の領域のウェルは、少なくとも１つのＲＮＡ塩基を除去するための酵素をさらに含み得る。
一部の実施形態では、酵素はウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）であり、ＲＮＡ塩基はウラシルである。
一部の実施形態では、酵素はウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）であり、ＲＮＡ塩基はウラシルである。
【0268】
一部の実施形態では、第２の領域の１つまたは複数のウェルは、
その蛍光が、互いとまたは１つもしくは複数の蛍光クエンチャーのいずれかとのその近接によってクエンチされるように配置された、１つのまたは複数のフルオロフォアを含む、ライゲーション部位を含むＡ２の一領域と相補的であるオリゴヌクレオチドと、
二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素と
をさらに含んでよく、Ａ２の存在下で、標識されたオリゴヌクレオチドは、フルオロフォアが互いからまたはその対応するクエンチャーから分離されており、蛍光シグナル、ひいてはＡ２の存在が検出可能であるように、消化される。
その蛍光が、互いとまたは１つもしくは複数の蛍光クエンチャーのいずれかとのその近接によってクエンチされるように配置された、１つのまたは複数のフルオロフォアを含む、ライゲーション部位を含むＡ２の一領域と相補的であるオリゴヌクレオチドと、
二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素と
をさらに含んでよく、Ａ２の存在下で、標識されたオリゴヌクレオチドは、フルオロフォアが互いからまたはその対応するクエンチャーから分離されており、蛍光シグナル、ひいてはＡ２の存在が検出可能であるように、消化される。
【0269】
一部の実施形態では、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素はエクソヌクレアーゼである。
一部の実施形態では、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素は校正活性を有するポリメラーゼである。
一部の実施形態では、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素は校正活性を有するポリメラーゼである。
【0270】
一部の実施形態では、フルオロフォアは、フルオレセインファミリー、カルボキシローダミンファミリー、シアニンファミリー、ローダミンファミリー、ポリハロフルオレセインファミリー色素、ヘキサクロロフルオレセインファミリー色素、クマリンファミリー色素、オキサジンファミリー色素、チアジンファミリー色素、スクアレインファミリー色素、およびキレート化ランタニドファミリー色素の色素から選択される。
【0271】
一部の実施形態では、装置のフルオロフォアは、市販の色素のうちの任意のものから選択され得る。
一部の実施形態では、装置のクエンチャーは、商品名Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ（商標）、Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）Ｄａｒｋ、Ｑｘ１Ｊ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）、ＺＥＮ、および／またはＴＡＯの下で入手可能なものから選択される。
一部の実施形態では、装置のクエンチャーは、商品名Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ（商標）、Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）Ｄａｒｋ、Ｑｘ１Ｊ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）、ＺＥＮ、および／またはＴＡＯの下で入手可能なものから選択される。
【0272】
一部の実施形態では、装置のクエンチャーは、市販のクエンチャーのうちの任意のものから選択され得る。
一部の実施形態では、第２の領域の１つまたは複数のウェルは、１つまたは複数の部分的に二本鎖のＤＮＡ構築体をさらに含んでよく、それぞれの構築体は１つまたは複数のフルオロフォアおよび１つまたは複数のクエンチャーを含有する。一部の実施形態では、構築体が部分的に二本鎖である場合、１つまたは複数のフルオロフォアおよび１つまたは複数のクエンチャーは、１つまたは複数のフルオロフォアの十分なクエンチングが起こるように、互いに十分に近く近接して位置する。
一部の実施形態では、第２の領域の１つまたは複数のウェルは、１つまたは複数の部分的に二本鎖のＤＮＡ構築体をさらに含んでよく、それぞれの構築体は１つまたは複数のフルオロフォアおよび１つまたは複数のクエンチャーを含有する。一部の実施形態では、構築体が部分的に二本鎖である場合、１つまたは複数のフルオロフォアおよび１つまたは複数のクエンチャーは、１つまたは複数のフルオロフォアの十分なクエンチングが起こるように、互いに十分に近く近接して位置する。
【0273】
一部の実施形態では、構築体は、それ自身に折り重なる自己相補的領域を有する、ＤＮＡの一方の鎖である。
一部の実施形態では、構築体は、プライマー対の一方のプライマーを含む。
一部の実施形態では、構築体は、プライマー対の一方のプライマーを含む。
【0274】
一部の実施形態では、第２の領域の１つまたは複数のウェルは、プライマー対の他方のプライマーをさらに含み得る。
一部の実施形態では、構築体の一本鎖部分の一部分は、Ａ２とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長する。一部の実施形態では、その後、プライマー対の他方のプライマーが、伸長した構築体とハイブリダイズして、Ａ２を表示する。その後、このプライマーが構築体に対して伸長し、自己相補的領域を追放する。したがって、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数の色素が十分に隔てられて蛍光シグナルが検出され、Ａ２の存在が示される。
一部の実施形態では、構築体の一本鎖部分の一部分は、Ａ２とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長する。一部の実施形態では、その後、プライマー対の他方のプライマーが、伸長した構築体とハイブリダイズして、Ａ２を表示する。その後、このプライマーが構築体に対して伸長し、自己相補的領域を追放する。したがって、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数の色素が十分に隔てられて蛍光シグナルが検出され、Ａ２の存在が示される。
【0275】
そのような実施形態では、構築体はサンライズプライマーとして知られ得る。
一部の実施形態では、構築体は２本の別々のＤＮＡ鎖を含む。
一部の実施形態では、構築体の一本鎖部分の一部分は、Ａ２とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長する。一部の実施形態では、その後、プライマー対の他方のプライマーが、伸長した構築体とハイブリダイズして、Ａ２を表示する。その後、このプライマーが構築体に対して二本鎖部分の方向に伸長し、ＤＮＡ鎖のうちのより短い方を追放し、したがって、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数の色素が十分に隔てられて蛍光シグナルが検出され、Ａ２の存在が示される。
一部の実施形態では、構築体は２本の別々のＤＮＡ鎖を含む。
一部の実施形態では、構築体の一本鎖部分の一部分は、Ａ２とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長する。一部の実施形態では、その後、プライマー対の他方のプライマーが、伸長した構築体とハイブリダイズして、Ａ２を表示する。その後、このプライマーが構築体に対して二本鎖部分の方向に伸長し、ＤＮＡ鎖のうちのより短い方を追放し、したがって、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数の色素が十分に隔てられて蛍光シグナルが検出され、Ａ２の存在が示される。
【0276】
そのような実施形態では、構築体は分子ジッパーとして知られ得る。
当業者には、サンライズプライマーおよび分子ジッパーのどちらについても、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数のクエンチャーの対が、それぞれの対応する構築体内の様々な位置に位置することが可能であることが理解されよう。主要な特長は、それぞれの対が互いに十分に近接して位置しており、Ａ２の非存在下、すなわち伸長および鎖の追放が起こっていない場合は、蛍光シグナルが放射されないことである。
当業者には、サンライズプライマーおよび分子ジッパーのどちらについても、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数のクエンチャーの対が、それぞれの対応する構築体内の様々な位置に位置することが可能であることが理解されよう。主要な特長は、それぞれの対が互いに十分に近接して位置しており、Ａ２の非存在下、すなわち伸長および鎖の追放が起こっていない場合は、蛍光シグナルが放射されないことである。
【0277】
一部の実施形態では、１つまたは複数の領域の１つまたは複数のウェルは、ピロホスファターゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、装置の１つまたは複数の領域の１つまたは複数のウェルは、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、装置の１つまたは複数の領域の１つまたは複数のウェルは、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含み得る。
【0278】
一部の実施形態では、装置の第１の領域の１つまたは複数のウェルは、ＲＮＡ鋳型からのＤＮＡの形成のための酵素をさらに含み得る。
一部の実施形態では、酵素は逆転写酵素である。
一部の実施形態では、酵素は逆転写酵素である。
【0279】
一部の実施形態では、装置中に存在する１つまたは複数の酵素はホットスタートである。
一部の実施形態では、装置中に存在する１つまたは複数の酵素は熱安定性である。
一部の実施形態では、装置中に存在する１つまたは複数の酵素は熱安定性である。
【0280】
一部の実施形態では、装置の第１および第２の領域を合わせる。
本発明の一部の実施形態では、
－ 第１の領域、第２の領域、および第３の領域の間の少なくとも１つの流路を含む装置であって、第１の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、
－ ｄＮＴＰと、
－ 少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドと、
－ 試料中に存在するＤＮＡの初期増幅のための増幅酵素と
を含み、第２の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、
－ 標的ポリヌクレオチド配列と第１の中間生成物を形成することができる一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間生成物が少なくとも部分的に二本鎖である一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
－ 第１の中間生成物をＡ０の末端から３’－５’方向で消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を作り出すことができる、加ピロリン酸分解酵素と
を含み、第３の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、
－ ｄＮＴＰと、
－ 緩衝液と、
－ 任意選択で増幅酵素と、
－ 任意選択で、Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分に由来するシグナルを検出するための手段と
を含み、第２の領域のウェルまたは第３の領域のウェルが、Ａ０の一部分と実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドをさらに含む、装置が提供される。
本発明の一部の実施形態では、
－ 第１の領域、第２の領域、および第３の領域の間の少なくとも１つの流路を含む装置であって、第１の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、
－ ｄＮＴＰと、
－ 少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドと、
－ 試料中に存在するＤＮＡの初期増幅のための増幅酵素と
を含み、第２の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、
－ 標的ポリヌクレオチド配列と第１の中間生成物を形成することができる一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間生成物が少なくとも部分的に二本鎖である一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
－ 第１の中間生成物をＡ０の末端から３’－５’方向で消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を作り出すことができる、加ピロリン酸分解酵素と
を含み、第３の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、
－ ｄＮＴＰと、
－ 緩衝液と、
－ 任意選択で増幅酵素と、
－ 任意選択で、Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分に由来するシグナルを検出するための手段と
を含み、第２の領域のウェルまたは第３の領域のウェルが、Ａ０の一部分と実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドをさらに含む、装置が提供される。
【0281】
一部の実施形態では、第２の領域のウェルは、
－ ｄＮＴＰと、
－ １つまたは複数の一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドと、
－ 試料中に存在するＤＮＡの初期増幅のための増幅酵素と
を含み、プライマーのうちの１つまたは複数は非相補的５’テイルを有する。
－ ｄＮＴＰと、
－ １つまたは複数の一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドと、
－ 試料中に存在するＤＮＡの初期増幅のための増幅酵素と
を含み、プライマーのうちの１つまたは複数は非相補的５’テイルを有する。
【0282】
一部の実施形態では、プライマーのうちの１つまたは複数は５’リン酸を有する。
一部の実施形態では、プライマーのうちの１つまたは複数は５’保護されている。
一部の実施形態では、第２の領域のウェルに存在していた加ピロリン酸分解酵素は第３の領域のウェルまで運ばれ、ここで加ピロリン酸分解酵素がｄＮＴＰおよび適切な緩衝液の存在下でＡ２の増幅を行う。
一部の実施形態では、プライマーのうちの１つまたは複数は５’保護されている。
一部の実施形態では、第２の領域のウェルに存在していた加ピロリン酸分解酵素は第３の領域のウェルまで運ばれ、ここで加ピロリン酸分解酵素がｄＮＴＰおよび適切な緩衝液の存在下でＡ２の増幅を行う。
【0283】
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、第３の領域の１つまたは複数のウェル内に位置する。
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、装置の第３の領域内に位置する。
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、装置の第３の領域内に位置する。
【0284】
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、装置の隣接領域内に位置する。
一部の実施形態では、第１の領域のそれぞれのウェルのｄＮＴＰは、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＣＴＰであってよく、それぞれのウェルは、高忠実度ポリメラーゼを取り込んだｄＵＴＰおよびウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）をさらに含み得る。
一部の実施形態では、第１の領域のそれぞれのウェルのｄＮＴＰは、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＣＴＰであってよく、それぞれのウェルは、高忠実度ポリメラーゼを取り込んだｄＵＴＰおよびウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）をさらに含み得る。
【0285】
一部の実施形態では、第２の領域のそれぞれのウェルは、ピロリン酸イオン供給源をさらに含み得る。
一部の実施形態では、Ａ０の５’末端は、５’－３’エクソヌクレアーゼ消化に対する耐性が与えられていてよく、第２の領域のウェルは、５’－３’エクソヌクレアーゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、Ａ０の５’末端は、５’－３’エクソヌクレアーゼ消化に対する耐性が与えられていてよく、第２の領域のウェルは、５’－３’エクソヌクレアーゼをさらに含み得る。
【0286】
一部の実施形態では、第２または第３の領域のそれぞれのウェルは、リガーゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第２または第３の領域のそれぞれのウェルは、リガーゼと、ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣまたはスプリントオリゴヌクレオチドＤとをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第２または第３の領域のそれぞれのウェルは、リガーゼと、ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣまたはスプリントオリゴヌクレオチドＤとをさらに含み得る。
【0287】
ライゲーションプローブＣは、それを３’－５’エクソヌクレアーゼ消化から保護する３’または内部修飾を含み得る。
スプリントオリゴヌクレオチドＤは、Ａ１の３’末端と相補的なオリゴヌクレオチド領域と、オリゴヌクレオチドＣの５’末端またはＡ１の５’末端のどちらかと相補的な領域とを含み得る。
スプリントオリゴヌクレオチドＤは、Ａ１の３’末端と相補的なオリゴヌクレオチド領域と、オリゴヌクレオチドＣの５’末端またはＡ１の５’末端のどちらかと相補的な領域とを含み得る。
【0288】
Ｄは、３’修飾が原因で、またはＤの３’末端とＡ１もしくはＣの対応する領域との間のミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ１に対する伸長を受けることができない場合がある。
【0289】
一部の実施形態では、ｄＮＴＰはホットスタートであり得る。
一部の実施形態では、第２の領域のそれぞれのウェルは、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第２の領域のそれぞれのウェルは、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含み得る。
【0290】
一部の実施形態では、第２の領域のそれぞれのウェルは、ピロホスファターゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、ピロホスファターゼはホットスタートである。
一部の実施形態では、ピロホスファターゼはホットスタートである。
【0291】
一部の実施形態では、第３の領域のそれぞれのウェルは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第２の領域のそれぞれのウェルは、同定領域を含む標的配列に選択的な少なくとも１つまたは複数の異なるＡ０を含み得る。
一部の実施形態では、第２の領域のそれぞれのウェルは、同定領域を含む標的配列に選択的な少なくとも１つまたは複数の異なるＡ０を含み得る。
【0292】
一部の実施形態では、第２の領域中の増幅酵素および加ピロリン酸分解酵素は同じであり得る。
一部の実施形態では、１つまたは複数のウェルを含む第４の領域が存在してよく、それぞれのウェルはプロテイナーゼを含んでよく、前記第４の領域は第１および第２の領域の間に位置し得る。
一部の実施形態では、１つまたは複数のウェルを含む第４の領域が存在してよく、それぞれのウェルはプロテイナーゼを含んでよく、前記第４の領域は第１および第２の領域の間に位置し得る。
【0293】
一部の実施形態では、第２の領域のウェルが、
－ ｄＮＴＰと、
－ 緩衝液と、
－ 増幅酵素と、
Ａ１もしくはその一部分、または複数コピーのＡ１、または複数コピーのその一部分に由来するシグナルを検出するための手段と
をさらに含むように、装置の第２および第３の領域を合わせ得る。
－ ｄＮＴＰと、
－ 緩衝液と、
－ 増幅酵素と、
Ａ１もしくはその一部分、または複数コピーのＡ１、または複数コピーのその一部分に由来するシグナルを検出するための手段と
をさらに含むように、装置の第２および第３の領域を合わせ得る。
【0294】
一部の実施形態では、第２の領域のウェルが、
－ 任意選択でｄＮＴＰと、
－ 任意選択で増幅酵素と、
－ 緩衝液と、
－ 標識したオリゴヌクレオチドプローブと
をさらに含むように、装置の第２および第３の領域を合わせ得る。
－ 任意選択でｄＮＴＰと、
－ 任意選択で増幅酵素と、
－ 緩衝液と、
－ 標識したオリゴヌクレオチドプローブと
をさらに含むように、装置の第２および第３の領域を合わせ得る。
【0295】
一部の実施形態では、第２の領域のウェルに存在していた加ピロリン酸分解酵素を利用して、ｄＮＴＰおよび適切な緩衝液の存在下でＡ２の増幅を行う。
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、第２の領域の１つまたは複数のウェル内に位置する。
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、第２の領域の１つまたは複数のウェル内に位置する。
【0296】
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、装置の第２の領域内に位置する。
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、装置の隣接領域内に位置する。
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、装置の隣接領域内に位置する。
【0297】
一部の実施形態では、第１の領域は、流体界面を介して試料容器と流体接続し得る。
本発明の一部の実施形態では、
－ 第１、第２、第３、および第４の領域の間の少なくとも１つの流路を含む装置であって、第１の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、核酸を選択的に修飾するための手段を含み、
第２の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、
－ ｄＮＴＰと、
－ 少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドと、
－ 試料中に存在するＤＮＡの初期増幅のための増幅酵素と
を含み、第３の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、
－ 標的ポリヌクレオチド配列と第１の中間生成物を形成することができる一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間生成物が少なくとも部分的に二本鎖である一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
－ 第１の中間生成物をＡ０の末端から３’－５’方向で消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を作り出すことができる、加ピロリン酸分解酵素と
を含み、第４の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、
－ ｄＮＴＰと、
－ 緩衝液と、
－ 任意選択で増幅酵素と、
－ Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分に由来するシグナルを検出するための手段と
を含み、第３の領域のウェルまたは第４の領域のウェルが、Ａ０の一部分と実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドをさらに含む、装置が提供される。
本発明の一部の実施形態では、
－ 第１、第２、第３、および第４の領域の間の少なくとも１つの流路を含む装置であって、第１の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、核酸を選択的に修飾するための手段を含み、
第２の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、
－ ｄＮＴＰと、
－ 少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドと、
－ 試料中に存在するＤＮＡの初期増幅のための増幅酵素と
を含み、第３の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、
－ 標的ポリヌクレオチド配列と第１の中間生成物を形成することができる一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間生成物が少なくとも部分的に二本鎖である一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０と、
－ 第１の中間生成物をＡ０の末端から３’－５’方向で消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を作り出すことができる、加ピロリン酸分解酵素と
を含み、第４の領域が１つまたは複数のウェルを含み、それぞれのウェルが、
－ ｄＮＴＰと、
－ 緩衝液と、
－ 任意選択で増幅酵素と、
－ Ａ２もしくはその一部分、または複数コピーのＡ２、または複数コピーのその一部分に由来するシグナルを検出するための手段と
を含み、第３の領域のウェルまたは第４の領域のウェルが、Ａ０の一部分と実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドをさらに含む、装置が提供される。
【0298】
一部の実施形態では、核酸を選択的に修飾するための手段は、標的ポリヌクレオチド配列中の未修飾のシトシン塩基を変換することができる化学薬品であり得る。
一部の実施形態では、核酸を選択的に修飾するための手段は、標的ポリヌクレオチド配列中の未修飾のシトシン塩基を変換することができる酵素であり得る。
一部の実施形態では、核酸を選択的に修飾するための手段は、標的ポリヌクレオチド配列中の未修飾のシトシン塩基を変換することができる酵素であり得る。
【0299】
一部の実施形態では、第２または第３の領域のウェルは、制限エンドヌクレアーゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第１および第２の領域の間に１つまたは複数のウェルを含む領域が位置していてよく、それぞれのウェルは、制限エンドヌクレアーゼを含み得る。
一部の実施形態では、第１および第２の領域の間に１つまたは複数のウェルを含む領域が位置していてよく、それぞれのウェルは、制限エンドヌクレアーゼを含み得る。
【0300】
一部の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、未修飾のシトシン塩基の化学的または酵素的変換によって作製された標的ポリヌクレオチド配列中の配列を認識し得る。
一部の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼが認識し得る標的ポリヌクレオチド配列中の配列は、未修飾のシトシン塩基の化学的または酵素的変換によって除去される。
一部の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼが認識し得る標的ポリヌクレオチド配列中の配列は、未修飾のシトシン塩基の化学的または酵素的変換によって除去される。
【0301】
一部の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、メチル化感受性またはメチル化依存性制限のエンドヌクレアーゼであり得る。
一部の実施形態では、第２の領域のウェルは、後成的修飾したＤＮＡの修飾特異的多重鎖ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＳ－ＭＬＰＡ）のための試薬を含み得る。
一部の実施形態では、第２の領域のウェルは、後成的修飾したＤＮＡの修飾特異的多重鎖ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＳ－ＭＬＰＡ）のための試薬を含み得る。
【0302】
一部の実施形態では、第１および第２の領域の間に１つまたは複数のウェルを含む領域が位置していてよく、それぞれのウェルは、ＰＣＲのための試薬を含み得る。
一部の実施形態では、第１および第２の領域の間に１つまたは複数のウェルを含む領域が位置していてよく、それぞれのウェルは、後成的修飾したまたは未修飾の標的配列の集団の還元のための試薬を含み得る。
一部の実施形態では、第１および第２の領域の間に１つまたは複数のウェルを含む領域が位置していてよく、それぞれのウェルは、後成的修飾したまたは未修飾の標的配列の集団の還元のための試薬を含み得る。
【0303】
一部の実施形態では、後成的修飾したまたは未修飾の標的配列の集団の還元のための試薬は、後成的修飾したＤＮＡ免疫沈降、任意選択でメチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）のための試薬である。
【0304】
一部の実施形態では、後成的修飾したまたは未修飾の標的配列の集団の還元のための試薬は、ＭＢＤ２ｂまたはＭＢＤ２ｂ／ＭＢＤ３Ｌ１複合体などのメチル結合タンパク質である。
【0305】
一部の実施形態では、後成的修飾したまたは未修飾の標的配列の集団の還元のための試薬は、第１の領域の１つまたは複数のウェル内に位置する。
装置の一部の実施形態では、後成的修飾はメチル化であり得る。一部の実施形態では、後成的修飾はＣｐＧアイランドでのメチル化であり得る。一部の実施形態では、後成的修飾はＣｐＧアイランドでのヒドロキシメチル化であり得る。
装置の一部の実施形態では、後成的修飾はメチル化であり得る。一部の実施形態では、後成的修飾はＣｐＧアイランドでのメチル化であり得る。一部の実施形態では、後成的修飾はＣｐＧアイランドでのヒドロキシメチル化であり得る。
【0306】
一部の実施形態では、第２、第３、または第４の領域のウェルは、
－ ｄＮＴＰと、
－ 少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドと、
－ 増幅酵素と
を含み得る。
－ ｄＮＴＰと、
－ 少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドと、
－ 増幅酵素と
を含み得る。
【0307】
一部の実施形態では、それぞれのウェルのｄＮＴＰは、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＣＴＰであってよく、それぞれのウェルは、高忠実度ポリメラーゼを取り込んだｄＵＴＰおよびウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）をさらに含み得る。
【0308】
一部の実施形態では、それぞれのウェルは、ピロリン酸イオン供給源をさらに含み得る。
一部の実施形態では、Ａ０の５’末端は、５’－３’エクソヌクレアーゼ消化に対する耐性が与えられていてよく、第２または第３の領域のウェルは、５’－３’エクソヌクレアーゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、Ａ０の５’末端は、５’－３’エクソヌクレアーゼ消化に対する耐性が与えられていてよく、第２または第３の領域のウェルは、５’－３’エクソヌクレアーゼをさらに含み得る。
【0309】
一部の実施形態では、第３または第４の領域のそれぞれのウェルは、リガーゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第３または第４の領域のそれぞれのウェルは、リガーゼと、ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣまたはスプリントオリゴヌクレオチドＤとをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第３または第４の領域のそれぞれのウェルは、リガーゼと、ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣまたはスプリントオリゴヌクレオチドＤとをさらに含み得る。
【0310】
ライゲーションプローブＣは、それを３’－５’エクソヌクレアーゼ消化から保護する３’または内部修飾を含み得る。
スプリントオリゴヌクレオチドＤは、Ａ１の３’末端と相補的なオリゴヌクレオチド領域と、オリゴヌクレオチドＣの５’末端またはＡ１の５’末端のどちらかと相補的な領域とを含み得る。
スプリントオリゴヌクレオチドＤは、Ａ１の３’末端と相補的なオリゴヌクレオチド領域と、オリゴヌクレオチドＣの５’末端またはＡ１の５’末端のどちらかと相補的な領域とを含み得る。
【0311】
Ｄは、３’修飾が原因で、またはＤの３’末端とＡ１もしくはＣの対応する領域との間のミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ１に対する伸長を受けることができない場合がある。
【0312】
一部の実施形態では、ｄＮＴＰはホットスタートであり得る。
一部の実施形態では、第３の領域のそれぞれのウェルは、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第３の領域のそれぞれのウェルは、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含み得る。
【0313】
一部の実施形態では、第３の領域のそれぞれのウェルは、ピロホスファターゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第４の領域のそれぞれのウェルは、ピロホスファターゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第４の領域のそれぞれのウェルは、ピロホスファターゼをさらに含み得る。
【0314】
一部の実施形態では、ピロホスファターゼはホットスタートである。
一部の実施形態では、第４の領域のそれぞれのウェルは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブをさらに含み得る。
一部の実施形態では、第４の領域のそれぞれのウェルは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブをさらに含み得る。
【0315】
一部の実施形態では、第３の領域のそれぞれのウェルは、同定領域を含む標的配列に選択的な少なくとも１つまたは複数の異なるＡ０を含み得る。
一部の実施形態では、第４の領域中の増幅酵素および第３の領域中の加ピロリン酸分解酵素は同じであってよく、したがって、一部の実施形態では、第４の領域中の増幅酵素は不要である。
一部の実施形態では、第４の領域中の増幅酵素および第３の領域中の加ピロリン酸分解酵素は同じであってよく、したがって、一部の実施形態では、第４の領域中の増幅酵素は不要である。
【0316】
一部の実施形態では、１つまたは複数のウェルを含む第５の領域が存在してよく、それぞれのウェルはプロテイナーゼを含んでよく、前記第５の領域は第１および第２の領域の間に位置し得る。
【0317】
一部の実施形態では、第５の領域は第２および第３の領域の間に位置し得る。
一部の実施形態では、第３の領域のウェルが、
－ ｄＮＴＰと、
－ 緩衝液と、
－ 増幅酵素と、
Ａ１もしくはその一部分、または複数コピーのＡ１、または複数コピーのその一部分に由来するシグナルを検出するための手段と
をさらに含むように、装置の第３および第４の領域を合わせ得る。
一部の実施形態では、第３の領域のウェルが、
－ ｄＮＴＰと、
－ 緩衝液と、
－ 増幅酵素と、
Ａ１もしくはその一部分、または複数コピーのＡ１、または複数コピーのその一部分に由来するシグナルを検出するための手段と
をさらに含むように、装置の第３および第４の領域を合わせ得る。
【0318】
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、第３の領域内に位置する。
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、隣接領域内に位置する。
一部の実施形態では、第３または第４の領域のウェルは、
－ Ａ１上の隣接配列と相補的である、２つ以上のライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）プローブオリゴヌクレオチドであって、プローブのアニーリングが成功している場合は、一方のＬＣＲプローブの５’リン酸が他方のＬＣＲプローブの３’ＯＨと直接隣接している、プローブオリゴヌクレオチドと、
－ １つまたは複数のリガーゼと
をさらに含み得る。
一部の実施形態では、シグナルを検出するための手段は、隣接領域内に位置する。
一部の実施形態では、第３または第４の領域のウェルは、
－ Ａ１上の隣接配列と相補的である、２つ以上のライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）プローブオリゴヌクレオチドであって、プローブのアニーリングが成功している場合は、一方のＬＣＲプローブの５’リン酸が他方のＬＣＲプローブの３’ＯＨと直接隣接している、プローブオリゴヌクレオチドと、
－ １つまたは複数のリガーゼと
をさらに含み得る。
【0319】
一部の実施形態では、装置の増幅酵素および加ピロリン酸分解酵素は同じである。
一部の実施形態では、第３の領域のウェルは、
－ ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣと、
－ スプリントオリゴヌクレオチドＤと
を含んでよく、Ａ１およびＣがライゲーションされてオリゴヌクレオチドＡ２を形成することができるように、Ｃは５’リン酸を有し、スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’末端はＣの５’末端と相補的であり、Ｄの５’末端はＡ１の３’末端と相補的である。
一部の実施形態では、第３の領域のウェルは、
－ ライゲーションプローブオリゴヌクレオチドＣと、
－ スプリントオリゴヌクレオチドＤと
を含んでよく、Ａ１およびＣがライゲーションされてオリゴヌクレオチドＡ２を形成することができるように、Ｃは５’リン酸を有し、スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’末端はＣの５’末端と相補的であり、Ｄの５’末端はＡ１の３’末端と相補的である。
【0320】
一部の実施形態では、第３の領域のウェルは、
－ フルオロフォア－クエンチャー対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド１（ＨＯ１）であって、ＨＯ１はＡ２と相補的であり、Ａ２とアニーリングした場合に、ＨＯ１のヘアピン構造が開き、フルオロフォア－クエンチャー対が分離する、ＨＯ１と、
－ フルオロフォア－クエンチャー対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド２（ＨＯ２）であって、ＨＯ２は開いたＨＯ１と相補的であり、ＨＯ１とアニーリングした場合に、ＨＯ２のヘアピン構造が開き、フルオロフォア－クエンチャー対が分離する、ＨＯ２と
をさらに含み得る。
－ フルオロフォア－クエンチャー対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド１（ＨＯ１）であって、ＨＯ１はＡ２と相補的であり、Ａ２とアニーリングした場合に、ＨＯ１のヘアピン構造が開き、フルオロフォア－クエンチャー対が分離する、ＨＯ１と、
－ フルオロフォア－クエンチャー対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド２（ＨＯ２）であって、ＨＯ２は開いたＨＯ１と相補的であり、ＨＯ１とアニーリングした場合に、ＨＯ２のヘアピン構造が開き、フルオロフォア－クエンチャー対が分離する、ＨＯ２と
をさらに含み得る。
【0321】
一部の実施形態では、第３の領域のウェルは、複数のＨＯ１およびＨＯ２をさらに含み得る。
一部の実施形態では、第３の領域のウェルは、
－ 基質アーム、部分的触媒核、およびセンサーアームを含む、オリゴヌクレオチドＡと、
－ 基質アーム、部分的触媒核、およびセンサーアームを含む、オリゴヌクレオチドＢと、
－ フルオロフォアクエンチャー対を含む基質と
をさらに含んでよく、Ａ２の存在下でオリゴヌクレオチドＡおよびＢが組み合わされて触媒的に多成分の核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）が形成されるように、オリゴヌクレオチドＡおよびＢのセンサーアームがＡ２のフランキング領域と相補的である。
一部の実施形態では、第３の領域のウェルは、
－ 基質アーム、部分的触媒核、およびセンサーアームを含む、オリゴヌクレオチドＡと、
－ 基質アーム、部分的触媒核、およびセンサーアームを含む、オリゴヌクレオチドＢと、
－ フルオロフォアクエンチャー対を含む基質と
をさらに含んでよく、Ａ２の存在下でオリゴヌクレオチドＡおよびＢが組み合わされて触媒的に多成分の核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）が形成されるように、オリゴヌクレオチドＡおよびＢのセンサーアームがＡ２のフランキング領域と相補的である。
【0322】
一部の実施形態では、第３の領域のウェルは、部分的に二本鎖の核酸構築体であって、
－ 一方の鎖が、少なくとも１つのＲＮＡ塩基、少なくとも１つのフルオロフォアを含み、この鎖の一領域がＡ２の一領域と相補的であり、この鎖を「基質」鎖と呼んでよく、
－ 他方のスタンドが、少なくとも１つのクエンチャーを含み、この鎖の一領域が、Ａ２の存在下で部分的に鎖となった核酸構築体が実質的により二本鎖となるように、基質鎖が相補的である領域に隣接するＡ２の一領域と相補的である
、核酸構築体を含み得る。
－ 一方の鎖が、少なくとも１つのＲＮＡ塩基、少なくとも１つのフルオロフォアを含み、この鎖の一領域がＡ２の一領域と相補的であり、この鎖を「基質」鎖と呼んでよく、
－ 他方のスタンドが、少なくとも１つのクエンチャーを含み、この鎖の一領域が、Ａ２の存在下で部分的に鎖となった核酸構築体が実質的により二本鎖となるように、基質鎖が相補的である領域に隣接するＡ２の一領域と相補的である
、核酸構築体を含み得る。
【0323】
一部の実施形態では、第３の領域のウェルは、少なくとも１つのＲＮＡ塩基を除去するための酵素をさらに含み得る。
一部の実施形態では、酵素はウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）であり、ＲＮＡ塩基はウラシルである。
一部の実施形態では、酵素はウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）であり、ＲＮＡ塩基はウラシルである。
【0324】
一部の実施形態では、第３の領域の１つまたは複数のウェルは、
その蛍光が、互いとまたは１つもしくは複数の蛍光クエンチャーのいずれかとのその近接によってクエンチされるように配置された、１つのまたは複数のフルオロフォアを含む、ライゲーション部位を含むＡ２の一領域と相補的であるオリゴヌクレオチドと、
二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素と
をさらに含んでよく、Ａ２の存在下で、標識されたオリゴヌクレオチドは、フルオロフォアが互いからまたはその対応するクエンチャーから分離されており、蛍光シグナル、ひいてはＡ２の存在が検出可能であるように、消化される。
その蛍光が、互いとまたは１つもしくは複数の蛍光クエンチャーのいずれかとのその近接によってクエンチされるように配置された、１つのまたは複数のフルオロフォアを含む、ライゲーション部位を含むＡ２の一領域と相補的であるオリゴヌクレオチドと、
二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素と
をさらに含んでよく、Ａ２の存在下で、標識されたオリゴヌクレオチドは、フルオロフォアが互いからまたはその対応するクエンチャーから分離されており、蛍光シグナル、ひいてはＡ２の存在が検出可能であるように、消化される。
【0325】
一部の実施形態では、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素はエクソヌクレアーゼである。
一部の実施形態では、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素は校正活性を有するポリメラーゼである。
一部の実施形態では、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素は校正活性を有するポリメラーゼである。
【0326】
一部の実施形態では、フルオロフォアは、フルオレセインファミリー、カルボキシローダミンファミリー、シアニンファミリー、ローダミンファミリー、ポリハロフルオレセインファミリー色素、ヘキサクロロフルオレセインファミリー色素、クマリンファミリー色素、オキサジンファミリー色素、チアジンファミリー色素、スクアレインファミリー色素、およびキレート化ランタニドファミリー色素の色素から選択される。
【0327】
一部の実施形態では、装置のフルオロフォアは、市販の色素のうちの任意のものから選択され得る。
一部の実施形態では、装置のクエンチャーは、商品名Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ（商標）、Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）Ｄａｒｋ、Ｑｘ１Ｊ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）、ＺＥＮ、および／またはＴＡＯの下で入手可能なものから選択される。
一部の実施形態では、装置のクエンチャーは、商品名Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ（商標）、Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）Ｄａｒｋ、Ｑｘ１Ｊ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）、ＺＥＮ、および／またはＴＡＯの下で入手可能なものから選択される。
【0328】
一部の実施形態では、装置のクエンチャーは、市販のクエンチャーのうちの任意のものから選択され得る。
一部の実施形態では、第３の領域のウェルは、１つまたは複数の部分的に二本鎖のＤＮＡ構築体を含んでよく、それぞれの構築体は１つまたは複数のフルオロフォアおよび１つまたは複数のクエンチャーを含有する。一部の実施形態では、構築体が部分的に二本鎖である場合、１つまたは複数のフルオロフォアおよび１つまたは複数のクエンチャーは、１つまたは複数のフルオロフォアの十分なクエンチングが起こるように、互いに十分に近く近接して位置する。
一部の実施形態では、第３の領域のウェルは、１つまたは複数の部分的に二本鎖のＤＮＡ構築体を含んでよく、それぞれの構築体は１つまたは複数のフルオロフォアおよび１つまたは複数のクエンチャーを含有する。一部の実施形態では、構築体が部分的に二本鎖である場合、１つまたは複数のフルオロフォアおよび１つまたは複数のクエンチャーは、１つまたは複数のフルオロフォアの十分なクエンチングが起こるように、互いに十分に近く近接して位置する。
【0329】
一部の実施形態では、構築体は、それ自身に折り重なる自己相補的領域を有する、ＤＮＡの一方の鎖である。
一部の実施形態では、構築体は、プライマー対の一方のプライマーを含む。
一部の実施形態では、構築体は、プライマー対の一方のプライマーを含む。
【0330】
一部の実施形態では、第３の領域のウェルは、プライマー対の他方のプライマーをさらに含み得る。
一部の実施形態では、構築体の一本鎖部分の一部分は、Ａ２とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長する。一部の実施形態では、その後、プライマー対の他方のプライマーが、伸長した構築体とハイブリダイズする。その後、このプライマーが構築体に対して伸長し、自己相補的領域を追放する。したがって、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数の色素が十分に隔てられて蛍光シグナルが検出され、反応混合物中のＡ２の存在が示される。
一部の実施形態では、構築体の一本鎖部分の一部分は、Ａ２とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長する。一部の実施形態では、その後、プライマー対の他方のプライマーが、伸長した構築体とハイブリダイズする。その後、このプライマーが構築体に対して伸長し、自己相補的領域を追放する。したがって、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数の色素が十分に隔てられて蛍光シグナルが検出され、反応混合物中のＡ２の存在が示される。
【0331】
そのような実施形態では、構築体はサンライズプライマーとして知られ得る。
一部の実施形態では、構築体は２本の別々のＤＮＡ鎖を含む。
一部の実施形態では、構築体の一本鎖部分の一部分は、Ａ２とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長する。一部の実施形態では、その後、プライマー対の他方のプライマーが、伸長した構築体とハイブリダイズして、Ａ２を表示する。その後、このプライマーが構築体に対して二本鎖部分の方向に伸長し、ＤＮＡ鎖のうちのより短い方を追放し、したがって、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数の色素が十分に隔てられて蛍光シグナルが検出され、反応混合物中のＡ２の存在が示される。
一部の実施形態では、構築体は２本の別々のＤＮＡ鎖を含む。
一部の実施形態では、構築体の一本鎖部分の一部分は、Ａ２とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長する。一部の実施形態では、その後、プライマー対の他方のプライマーが、伸長した構築体とハイブリダイズして、Ａ２を表示する。その後、このプライマーが構築体に対して二本鎖部分の方向に伸長し、ＤＮＡ鎖のうちのより短い方を追放し、したがって、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数の色素が十分に隔てられて蛍光シグナルが検出され、反応混合物中のＡ２の存在が示される。
【0332】
そのような実施形態では、構築体は分子ジッパーとして知られ得る。
当業者には、サンライズプライマーおよび分子ジッパーのどちらについても、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数のクエンチャーの対が、それぞれの対応する構築体内の様々な位置に位置することが可能であることが理解されよう。主要な特長は、それぞれの対が互いに十分に近接して位置しており、Ａ２の非存在下、すなわち伸長および鎖の追放が起こっていない場合は、蛍光シグナルが放射されないことである。
当業者には、サンライズプライマーおよび分子ジッパーのどちらについても、１つまたは複数のフルオロフォアと１つまたは複数のクエンチャーの対が、それぞれの対応する構築体内の様々な位置に位置することが可能であることが理解されよう。主要な特長は、それぞれの対が互いに十分に近接して位置しており、Ａ２の非存在下、すなわち伸長および鎖の追放が起こっていない場合は、蛍光シグナルが放射されないことである。
【0333】
一部の実施形態では、１つまたは複数の領域の１つまたは複数のウェルは、ピロホスファターゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、装置の１つまたは複数の領域の１つまたは複数のウェルは、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含み得る。
一部の実施形態では、装置の１つまたは複数の領域の１つまたは複数のウェルは、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含み得る。
【0334】
一部の実施形態では、装置の第２の領域の１つまたは複数のウェルは、ＲＮＡからＤＮＡへの転写のための酵素をさらに含み得る。
一部の実施形態では、酵素は逆転写酵素である。
一部の実施形態では、酵素は逆転写酵素である。
【0335】
一部の実施形態では、装置中に存在する１つまたは複数の酵素はホットスタートである。
一部の実施形態では、装置中に存在する１つまたは複数の酵素は熱安定性である。
一部の実施形態では、装置中に存在する１つまたは複数の酵素は熱安定性である。
【0336】
一部の実施形態では、装置の第２および第３の領域を合わせる。
一部の実施形態では、装置の第３および第４の領域を合わせる。
一部の実施形態では、１つの領域の１つもしくは複数のウェルの間および／または装置の１つもしくは複数の領域の間に、１つまたは複数の流体経路が位置する。
一部の実施形態では、装置の第３および第４の領域を合わせる。
一部の実施形態では、１つの領域の１つもしくは複数のウェルの間および／または装置の１つもしくは複数の領域の間に、１つまたは複数の流体経路が位置する。
【0337】
一部の実施形態では、第１の領域は、流体界面を介して試料容器と流体接続し得る。
一部の実施形態では、加熱および／または冷却要素が装置の１つまたは複数の領域に存在し得る。
一部の実施形態では、加熱および／または冷却要素が装置の１つまたは複数の領域に存在し得る。
【0338】
一部の実施形態では、加熱および／または冷却を、装置の１つまたは複数の領域に適用させ得る。
一部の実施形態では、装置のそれぞれの領域は、独立して少なくとも１００または２００個のウェルを含み得る。
一部の実施形態では、装置のそれぞれの領域は、独立して少なくとも１００または２００個のウェルを含み得る。
【0339】
一部の実施形態では、装置のそれぞれの領域は、独立して、約１００から３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００個、またはそれより多くのウェルを含み得る。ウェルは任意の形状のものであってよく、その位置は、基質上の任意の形式またはパターンで配置され得る。
【0340】
一部の実施形態では、ウェル基質は、金属（たとえば、非限定来な例として、金、白金、もしくはニッケル合金）、セラミック、ガラス、または他のＰＣＲ適合性ポリマー材料、あるいは複合材料から構築することができる。ウェル基質は複数のウェルを含む。
【0341】
一部の実施形態では、ウェルは、ウェル基質中に止まり穴または通し穴として形成し得る。ウェルは、ウェル基質内に、たとえば、レーザードリル（たとえばエキシマーまたは固体レーザー）、超音波エンボス、熱エンボス加工リソグラフィー、ニッケル鋳型の電気鋳造、射出成形、および射出圧縮成形によって作製し得る。
【0342】
一部の実施形態では、個々のウェル体積は、０．１～１５００ｎｌ、一実施形態では０．５～５０ｎＬの範囲であり得る。それぞれのウェルは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００ｎＬの体積を有し得る。
【0343】
一部の実施形態では、ウェル寸法は、任意の形状、たとえば、環状、楕円形、正方形、長方形、卵形、六角形、八角形、錐体、および当業者に知られている他の形状のウェルを有し得る。
【0344】
一部の実施形態では、ウェル形状は、軸に沿って変動する断面領域を有し得る。たとえば、正方形の穴が、第１の大きさから第１の大きさのほんの一部である第２の大きさまで先細になり得る。
【0345】
一部の実施形態では、ウェル寸法は、直径および深度がほぼ等しい正方形であり得る。
一部の実施形態では、ウェルを定義する壁は非平行であり得る。
一部の実施形態では、ウェルを定義する壁は、一点に収束し得る。ウェル寸法は、ウェル基質の合計体積容量から誘導することができる。
一部の実施形態では、ウェルを定義する壁は非平行であり得る。
一部の実施形態では、ウェルを定義する壁は、一点に収束し得る。ウェル寸法は、ウェル基質の合計体積容量から誘導することができる。
【0346】
一部の実施形態では、ウェル深度は２５μｍ～１０００μｍの範囲であり得る。
一実施形態では、ウェルは、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００μｍの深度を有し得る。
一実施形態では、ウェルは、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００μｍの深度を有し得る。
【0347】
一部の実施形態では、ウェル直径は約２５μｍ～約５００μｍの範囲であり得る。
一部の実施形態では、ウェルは、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００μｍの幅を有し得る。
一部の実施形態では、ウェルは、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００μｍの幅を有し得る。
【0348】
一部の実施形態では、装置の１つまたは複数の領域の一部分を、流体の接着を促すまたは妨げるために修飾し得る。ウェルを定義する表面を親水性材料でコーティングし（または親水性となるように修飾し）、したがって流体の保持を促し得る。
【0349】
一部の実施形態では、装置の１つまたは複数の領域の一部分を、疎水性材料でコーティングし（または疎水性となるように修飾し）、したがってそれ上への流体の保持を妨げ得る。当業者には、過剰な流体の排出を促すために、流体が好ましくはウェル内に保たれるが上部表面上には保たれないように、他の表面処理を行い得ることが理解されよう。
【0350】
一部の実施形態では、ウェル基質のウェルは、整列した列とカラムの単純な幾何学的パターン、または斜めもしくは六角形に配置されるパターンを有するようにパターン形成し得る。一実施形態では、ウェル基質のウェルは、無秩序パターンまたはアイソジオメトリック設計パターンなどの複雑な幾何学的パターンを有するようにパターン形成し得る。
【0351】
一部の実施形態では、試薬の相互汚染の防止を助けるために、ウェルは、互いに幾何学的に隔てられているおよび／または大きな深度対幅の比を特長としていてよい。
一部の実施形態では、装置は、油または他の化学的溶液などのプロセス流体を装置の領域のうちの１つまたは複数へと提供するために使用することができる、１つまたは複数の補助領域を含み得る。そのような補助領域は、金属箔または薄膜などの１つまたは複数の膜、弁、および／または圧力で切断可能な基質（すなわち、補助領域もしくは流路の隣接部分内の流体からの事前に決定された量の圧力に供された場合に破損する材料）を介して、装置の領域のうちの１つまたは複数と流体接続させ得る。
一部の実施形態では、装置は、油または他の化学的溶液などのプロセス流体を装置の領域のうちの１つまたは複数へと提供するために使用することができる、１つまたは複数の補助領域を含み得る。そのような補助領域は、金属箔または薄膜などの１つまたは複数の膜、弁、および／または圧力で切断可能な基質（すなわち、補助領域もしくは流路の隣接部分内の流体からの事前に決定された量の圧力に供された場合に破損する材料）を介して、装置の領域のうちの１つまたは複数と流体接続させ得る。
【0352】
一部の実施形態では、装置の流路は、非常に曲がりくねった部分を含み得る。流路の注入路と装置の領域のうちの１つまたは複数との間の曲がりくねった通路は、流体プロセスの制御および取扱いに役立つことができる。曲がりくねった通路は、流路を通る油の流れに干渉する場合があるガス気泡の形成を減らすことを助けることができる。
【0353】
一部の実施形態では、装置は、ガスを装置の１つまたは複数の領域のウェルから排出させる一方で、流体を通過させないことを可能にする、ガス透過膜をさらに含み得る。ガス透過膜は、ガス透過接着剤によって装置のウェル基質に接着させ得る。一実施形態では、膜はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から構築し、２０～１０００μｍの範囲の厚さを有し得る。一部の実施形態では、膜は１００～２００μｍの範囲の厚さを有し得る。
【0354】
一部の実施形態では、金属からウェルへの熱伝達を可能にするために、ウェル基質のすべてまたは一部分は伝導性金属部分（たとえば金）を含有し得る。一実施形態では、熱伝達を可能にするために、ウェルの内部表面を金属でコーティングし得る。
【0355】
一部の実施形態では、適切な試薬で装置の１つまたは複数の領域のウェルを充填した後、クロストークを防止するために、隔離油または熱伝導性液体を装置に適用し得る。
一部の実施形態では、装置の１つまたは複数の領域のウェルは、錐体と同様に、大きな直径からより小さな直径へと先細となるような形状にし得る。勾配壁を有する錐体形状のウェルは、試薬の非接触堆積方法（たとえばインクジェット）の使用を可能にする。錐体形状はまた、乾燥も助け、ガス透過膜が存在する場合に気泡および漏れを防止することが見出されている。
一部の実施形態では、装置の１つまたは複数の領域のウェルは、錐体と同様に、大きな直径からより小さな直径へと先細となるような形状にし得る。勾配壁を有する錐体形状のウェルは、試薬の非接触堆積方法（たとえばインクジェット）の使用を可能にする。錐体形状はまた、乾燥も助け、ガス透過膜が存在する場合に気泡および漏れを防止することが見出されている。
【0356】
一部の実施形態では、試料流体を（たとえば圧力を介して）装置の流路に沿って進めることによって、装置の１つまたは複数の領域のウェルを充填し得る。流体が装置の１つまたは複数の領域のウェルを通過する際、それぞれのウェルが流体で充填され、これは表面張力を介してウェル内に主に保持される。以前に記載したように、試料流体が通過する際のウェルの完全かつ均一な充填を促すために、装置のウェル基質の一部分を所望に応じて親水性／疎水性物質でコーティングし得る。
【0357】
一部の実施形態では、装置の１つまたは複数の領域のウェルを、充填後に油で「キャッピング」し得る。これは、ウェル基質を熱サイクリングに供する際に蒸発を減らすことを助けることができる。一実施形態では、油キャッピングの後、熱伝導率を改善させるために水溶液を装置の１つまたは複数の領域に充填することができる。
【0358】
一部の実施形態では、流体およびすべての気泡の運動を停止させるために、静止水溶液を装置の１つまたは複数の領域内で加圧し得る。
一部の実施形態では、装置の１つまたは複数の領域のウェルの隔離のため、および熱伝導率を提供するために、鉱物油などの油を使用し得る。しかし、フッ化液体（たとえば３Ｍ ＦＣ－４０）などの任意の熱伝導性液体を使用することができる。本開示における油への言及には、当分野の当業者が適用可能であると理解するであろう代替物が含まれると理解されるべきである。
一部の実施形態では、装置の１つまたは複数の領域のウェルの隔離のため、および熱伝導率を提供するために、鉱物油などの油を使用し得る。しかし、フッ化液体（たとえば３Ｍ ＦＣ－４０）などの任意の熱伝導性液体を使用することができる。本開示における油への言及には、当分野の当業者が適用可能であると理解するであろう代替物が含まれると理解されるべきである。
【0359】
一部の実施形態では、装置は１つまたは複数のセンサーアセンブリをさらに含み得る。
一部の実施形態では、１つまたは複数のセンサーアセンブリは、光ファイバー面板（ＦＯＦＰ）と連結させた電荷結合素子（ＣＣＤ）／相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）検出器を含み得る。フィルターをＦＯＰＦの上部に重ね、ウェル基質に対してまたはそれに隣接して配置し得る。一実施形態では、フィルターをＣＣＤの上部に直接重ね（結合させ）、その上にＦＯＰＦを配置することができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数のセンサーアセンブリは、光ファイバー面板（ＦＯＦＰ）と連結させた電荷結合素子（ＣＣＤ）／相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）検出器を含み得る。フィルターをＦＯＰＦの上部に重ね、ウェル基質に対してまたはそれに隣接して配置し得る。一実施形態では、フィルターをＣＣＤの上部に直接重ね（結合させ）、その上にＦＯＰＦを配置することができる。
【0360】
一部の実施形態では、装置の１つまたは複数の領域が、１００％までの湿度、または熱サイクリング中の過剰蒸発を防止するために少なくとも十分な湿度を有するように、蒸留水などの水和流体を、第１の領域または補助領域のうちの１つ内で加熱し得る。
【0361】
一部の実施形態では、装置の充填が完了した後、装置と熱接触している外部装置によってウェル基質を加熱して、ＰＣＲのための熱サイクリングを行い得る。
一部の実施形態では、ＲＦＩＤ、キュリー点、誘導加熱、またはマイクロ波加熱などの非接触加熱方法を用い得る。これらおよび他の非接触加熱方法は当業者がよく知っているであろう。熱サイクリング中、装置は、以前に記載したセンサー配置を介して化学反応についてモニタリングし得る。
一部の実施形態では、ＲＦＩＤ、キュリー点、誘導加熱、またはマイクロ波加熱などの非接触加熱方法を用い得る。これらおよび他の非接触加熱方法は当業者がよく知っているであろう。熱サイクリング中、装置は、以前に記載したセンサー配置を介して化学反応についてモニタリングし得る。
【0362】
一部の実施形態では、装置の領域のうちの１つまたは複数のウェルのうちの１つまたは複数中に堆積させる試薬は、事前に決定された配置で堆積される。
一部の実施形態では、
試料流体を装置の流路に提供するステップであって、装置が第１の領域、第２の領域、および第３の領域の間の少なくとも１つの流路を含み、第１、第２、および第３の領域が独立して１つまたは複数のウェルを含むステップと、
第２の領域の１つまたは複数のウェルが増幅した流体でコーティングされるように、第２の領域を、第１の領域からの増幅した流体で充填するステップと、
１つまたは複数のウェルが増幅した流体の少なくとも一部で湿ったままであるように、増幅した流体を第２の領域から排出するステップと、
第３の領域の１つまたは複数のウェルがこの流体でコーティングされるように、第３の領域を、第２の領域から排出された流体で充填するステップと、
１つまたは複数のウェルがこの流体の少なくとも一部で湿ったままであるように、流体を第３のチャンバーから排出するステップと
を含む方法が提供される。
一部の実施形態では、
試料流体を装置の流路に提供するステップであって、装置が第１の領域、第２の領域、および第３の領域の間の少なくとも１つの流路を含み、第１、第２、および第３の領域が独立して１つまたは複数のウェルを含むステップと、
第２の領域の１つまたは複数のウェルが増幅した流体でコーティングされるように、第２の領域を、第１の領域からの増幅した流体で充填するステップと、
１つまたは複数のウェルが増幅した流体の少なくとも一部で湿ったままであるように、増幅した流体を第２の領域から排出するステップと、
第３の領域の１つまたは複数のウェルがこの流体でコーティングされるように、第３の領域を、第２の領域から排出された流体で充填するステップと、
１つまたは複数のウェルがこの流体の少なくとも一部で湿ったままであるように、流体を第３のチャンバーから排出するステップと
を含む方法が提供される。
【0363】
本方法の一部の実施形態では、流路は無弁であり得る。
本方法の一部の実施形態では、排出された第２の領域を疎水性物質で充填し得る。
本方法の一部の実施形態では、排出された第３の領域を疎水性物質で充填し得る。
本方法の一部の実施形態では、排出された第２の領域を疎水性物質で充填し得る。
本方法の一部の実施形態では、排出された第３の領域を疎水性物質で充填し得る。
【0364】
本方法の一部の実施形態では、疎水性物質は、第２および第３の領域と流体連結している油チャンバーから供給し得る。
本方法の一部の実施形態では、試料流体は、曲がりくねった様式の流路に沿って送り得る。
本方法の一部の実施形態では、試料流体は、曲がりくねった様式の流路に沿って送り得る。
【0365】
一部の実施形態では、方法は、加熱および冷却サイクルを第１、第２、または第３の領域のうちの１つまたは複数に適用することをさらに含み得る。
本発明の様々なさらなる態様および実施形態は、本開示に鑑みて当業者に明らかとなるであろう。
本発明の様々なさらなる態様および実施形態は、本開示に鑑みて当業者に明らかとなるであろう。
【0366】
本明細書中で使用する場合、「および／または」とは、２つの指定した特長または成分のそれぞれの、他方を伴うまたは伴わない具体的な開示として解釈されるべきである。たとえば、「Ａおよび／またはＢ」は、それぞれが本明細書中に個々に記載されている場合と同程度に、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの具体的な開示であるとして解釈されるべきである。
【0367】
内容によりそうでないと指示されない限りは、上に記載した特長の説明および定義は、本発明のいかなる特定の態様または実施形態に限定されず、記載されているすべての態様および実施形態に同等に適用される。
【0368】
当業者には、本発明は、いくつかの実施形態を参照して例として記載されているが、本発明は開示した実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲中に定義されている本発明の範囲から逸脱せずに、代替実施形態を構築することができることがさらに理解されよう。
【0369】
本明細書中で使用する「磁気微粒子」とは、磁場によって引き寄せられる磁気応答性の微粒子である。本発明の方法において使用する磁気微粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡと結合することができる表面を作り出すポリマーコーティングによって全体的に囲まれる、磁性金属酸化物コアを含む。磁性金属酸化物コアは好ましくは酸化鉄であり、鉄はＦｅ２＋およびＦｅ３＋の混合物である。好ましいＦｅ２＋／Ｆｅ３＋比は好ましくは２／１であるが、約０．５／１から約４／１まで変動することができる。
【0370】
当業者には、用語「推測する」を使用する場合、たとえば、「特定の配列の存在または非存在を推測する」の場合、これは、Ａ２もしくはＡ２のコピー、またはＡ２の一領域もしくは領域Ａ２のコピーの存在または非存在に基づいて、特定の特長の存在または非存在を決定することをいうが理解されよう。
【0371】
当業者には、「プライマー」が記載されている実施形態は、その範囲内に、本文書中の以前にまたは続いて記載されているプライマーを含むことが理解されよう。
当業者には、「プライマー」が装置の特定の領域／ウェル内に位置する、または特定の反応混合物中に存在するとして記載されている実施形態は、その範囲内に、以前にまたは続いて記載した１つまたは複数の遮断オリゴヌクレオチドも同じ領域／ウェルまたは反応混合物内に存在する実施形態を含むことが理解されよう。
当業者には、「プライマー」が装置の特定の領域／ウェル内に位置する、または特定の反応混合物中に存在するとして記載されている実施形態は、その範囲内に、以前にまたは続いて記載した１つまたは複数の遮断オリゴヌクレオチドも同じ領域／ウェルまたは反応混合物内に存在する実施形態を含むことが理解されよう。
【0372】
当業者には、「一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０」が装置の特定の領域／ウェル内に位置する、または特定の反応混合物中に存在するとして記載されている実施形態は、その範囲内に、以前にまたは続いて記載した１つまたは複数の遮断オリゴヌクレオチドも内部に存在する実施形態を含むことが理解されよう。
【実施例】
【0373】
実施例１：ＥＧＦＲエクソン１９ｃｏｓｍ１２３８４突然変異の検出
本実施例では、様々な濃度の遮断オリゴヌクレオチドを初期ＰＣＲ増幅において利用した。
ａ．ＰＣＲ増幅
以下に対応する混合物を調製した：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
２００ｎＭのプライマーミックス１
２０Ｕ／ｍＬのＱ５Ｕポリメラーゼ
１０Ｕ／ｍＬの熱不安定性ＵＤＧ
０．４ｎｇ／ｕＬの断片化されたヒトゲノムＤＮＡ
＋／－０．２ａＭの突然変異オリゴヌクレオチド
０～３００ｎＭの遮断オリゴヌクレオチド
合計体積 ５０ｕＬ
Ｑ５緩衝液
Ｑ５緩衝液は市販供給業者ＮＥＢから入手可能である。
本実施例では、様々な濃度の遮断オリゴヌクレオチドを初期ＰＣＲ増幅において利用した。
ａ．ＰＣＲ増幅
以下に対応する混合物を調製した：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
２００ｎＭのプライマーミックス１
２０Ｕ／ｍＬのＱ５Ｕポリメラーゼ
１０Ｕ／ｍＬの熱不安定性ＵＤＧ
０．４ｎｇ／ｕＬの断片化されたヒトゲノムＤＮＡ
＋／－０．２ａＭの突然変異オリゴヌクレオチド
０～３００ｎＭの遮断オリゴヌクレオチド
合計体積 ５０ｕＬ
Ｑ５緩衝液
Ｑ５緩衝液は市販供給業者ＮＥＢから入手可能である。
【0374】
プライマーミックス１：
ＦＷＤ（配列番号１）：
５’－Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊ＡＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＧＧＡＴＣＴＴＧ－３’
ＲＥＶ（配列番号２）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＧＧＡＣＣＴＴＡＣＣＴＴＡＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＣＧ－３’
ＦＷＤ（配列番号３）：
５’－Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣ－３’
ＲＥＶ（配列番号４）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＣＡＣＡＴＣＧ－３’
ＦＷＤ（配列番号５）：
５’－Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧ－３’
ＲＥＶ（配列番号６）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＡＣ－３’
ＦＷＤ（配列番号７）：
５’－Ｇ＊Ａ＊Ａ＊ＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＧＴＧＣＣＴＣＴＣ－３’
ＲＥＶ（配列番号８）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＡＧＧＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＣＧＧＣＡ－３’
ＦＷＤ（配列番号９）：
５’－Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊ＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧ－３’
ＲＥＶ（配列番号１０）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴ－３’
ＦＷＤ（配列番号１１）：
５’－Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧ－３’
ＲＥＶ（配列番号１２）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧ－３’
ＦＷＤ（配列番号１３）：
５’－Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊ＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣ－３’
ＲＥＶ（配列番号１４）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧＧＡＴＡＴＴＣＴＣＧＡＣＡＣ－３’
ＦＷＤ（配列番号１５）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＡ－３’
ＲＥＶ（配列番号１６）：
５’－Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＡＴＧＡＡＧＡＣＣＴＣＡＣＡＧＴＡＡＡＡＡＴＡＧＧＴＧＡ－３’
ＦＷＤ（配列番号１７）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＴＣＴＧＡＣＧＴＣＣ－３’
ＲＥＶ（配列番号１８）：
５’－Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊ＴＴＣＴＧＣＴＧＣＣＧＴＣＧＣＴＴＧＡ－３’
ＦＷＤ（配列番号１９）：
５’－Ｔ＊Ａ＊Ｃ＊ＣＣＴＴＧＴＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＡＴＡ－３’
ＲＥＶ（配列番号２０）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＡＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＣＡＴ－３’
突然変異オリゴヌクレオチド（配列番号２１）：
５’－ＣＴＧＴＣＡＴＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＣＴＣＧＡＴＧＴＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＧＧＧＴＣ－３’
遮断オリゴヌクレオチド（配列番号２２）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＣＴＡＴＣＡＡＧＧＡＡＴＴＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧ／３ＩｎｖｄＴ／－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端リン酸を表し、／３ＩｎｖｄＴ／は３’末端逆位ｄＴを表す］
その後、この混合物をインキュベートした：
３７℃ １分間
５５℃ １０分間
９８℃ １分間
（９８℃ １０秒間
６３℃ １５秒間
７２℃ １５秒間）×５０
７２℃ ５分間
４℃ ∞
ｂ．プロテイナーゼＫ処理
以下に対応する混合物を調製した：
０．４４×プロテイナーゼＫ緩衝液
２０Ｕ／ｍＬのプロテイナーゼＫ
４０ｕＬの混合物、ポイントａ
合計体積 ９０ｕＬ
１×プロテイナーゼＫ緩衝液の組成物
トリスアセテート、ｐＨ＝８．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ２５ｍＭ
酢酸マグネシウム ５ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％
その後、この混合物を５５℃で５分間、９５℃で１０分間インキュベートした。
ＦＷＤ（配列番号１）：
５’－Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊ＡＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＧＧＡＴＣＴＴＧ－３’
ＲＥＶ（配列番号２）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＧＧＡＣＣＴＴＡＣＣＴＴＡＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＣＧ－３’
ＦＷＤ（配列番号３）：
５’－Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣ－３’
ＲＥＶ（配列番号４）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＣＡＣＡＴＣＧ－３’
ＦＷＤ（配列番号５）：
５’－Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧ－３’
ＲＥＶ（配列番号６）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＡＣ－３’
ＦＷＤ（配列番号７）：
５’－Ｇ＊Ａ＊Ａ＊ＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＧＴＧＣＣＴＣＴＣ－３’
ＲＥＶ（配列番号８）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＡＧＧＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＣＧＧＣＡ－３’
ＦＷＤ（配列番号９）：
５’－Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊ＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧ－３’
ＲＥＶ（配列番号１０）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴ－３’
ＦＷＤ（配列番号１１）：
５’－Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧ－３’
ＲＥＶ（配列番号１２）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧ－３’
ＦＷＤ（配列番号１３）：
５’－Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊ＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣ－３’
ＲＥＶ（配列番号１４）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧＧＡＴＡＴＴＣＴＣＧＡＣＡＣ－３’
ＦＷＤ（配列番号１５）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＡ－３’
ＲＥＶ（配列番号１６）：
５’－Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＡＴＧＡＡＧＡＣＣＴＣＡＣＡＧＴＡＡＡＡＡＴＡＧＧＴＧＡ－３’
ＦＷＤ（配列番号１７）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＴＣＴＧＡＣＧＴＣＣ－３’
ＲＥＶ（配列番号１８）：
５’－Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊ＴＴＣＴＧＣＴＧＣＣＧＴＣＧＣＴＴＧＡ－３’
ＦＷＤ（配列番号１９）：
５’－Ｔ＊Ａ＊Ｃ＊ＣＣＴＴＧＴＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＡＴＡ－３’
ＲＥＶ（配列番号２０）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＡＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＣＡＴ－３’
突然変異オリゴヌクレオチド（配列番号２１）：
５’－ＣＴＧＴＣＡＴＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＣＴＣＧＡＴＧＴＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＧＧＧＴＣ－３’
遮断オリゴヌクレオチド（配列番号２２）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＣＴＡＴＣＡＡＧＧＡＡＴＴＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧ／３ＩｎｖｄＴ／－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端リン酸を表し、／３ＩｎｖｄＴ／は３’末端逆位ｄＴを表す］
その後、この混合物をインキュベートした：
３７℃ １分間
５５℃ １０分間
９８℃ １分間
（９８℃ １０秒間
６３℃ １５秒間
７２℃ １５秒間）×５０
７２℃ ５分間
４℃ ∞
ｂ．プロテイナーゼＫ処理
以下に対応する混合物を調製した：
０．４４×プロテイナーゼＫ緩衝液
２０Ｕ／ｍＬのプロテイナーゼＫ
４０ｕＬの混合物、ポイントａ
合計体積 ９０ｕＬ
１×プロテイナーゼＫ緩衝液の組成物
トリスアセテート、ｐＨ＝８．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ２５ｍＭ
酢酸マグネシウム ５ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％
その後、この混合物を５５℃で５分間、９５℃で１０分間インキュベートした。
【0375】
ｃ．加ピロリン酸分解（ＰＰＬ）およびライゲーション
以下に対応する混合物を調製した：
１×ＢＦＦ６
２０Ｕ／ｍＬのクレノウ（エキソ－）
１００Ｕ／ｍＬの大腸菌リガーゼ
２Ｕ／ｍＬのアピラーゼ
１００Ｕ／ｍＬのラムダエキソ
０．５ｍＭのＰＰｉ
２０ｎＭのプローブオリゴヌクレオチド
３０ｎＭのスプリントオリゴヌクレオチド
２．２ｕＬのポイントｂからの混合物。
合計体積 １０ｕＬ
１×ＢＦＦ６組成物
トリスアセテート、ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ３０ｍＭ
酢酸マグネシウム １７．１２５ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％
プローブ（配列番号２３）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ＴＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＡＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＴＧＣＧＡＧＣＴＴＴＣＧＧＡＡＣＣＴＴＧＡＴＡ－３’
スプリントオリゴヌクレオチド（配列番号２４）：
５’－ＴＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＴＣＧＧ－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端リン酸を表す］
その後、この混合物を４５℃で３０分間インキュベートした。
以下に対応する混合物を調製した：
１×ＢＦＦ６
２０Ｕ／ｍＬのクレノウ（エキソ－）
１００Ｕ／ｍＬの大腸菌リガーゼ
２Ｕ／ｍＬのアピラーゼ
１００Ｕ／ｍＬのラムダエキソ
０．５ｍＭのＰＰｉ
２０ｎＭのプローブオリゴヌクレオチド
３０ｎＭのスプリントオリゴヌクレオチド
２．２ｕＬのポイントｂからの混合物。
合計体積 １０ｕＬ
１×ＢＦＦ６組成物
トリスアセテート、ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ３０ｍＭ
酢酸マグネシウム １７．１２５ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％
プローブ（配列番号２３）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ＴＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＡＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＴＧＣＧＡＧＣＴＴＴＣＧＧＡＡＣＣＴＴＧＡＴＡ－３’
スプリントオリゴヌクレオチド（配列番号２４）：
５’－ＴＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＴＣＧＧ－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端リン酸を表す］
その後、この混合物を４５℃で３０分間インキュベートした。
【0376】
ｄ．検出－ＲＣＡ
以下に対応する混合物を調製した：
２．６６×等温緩衝液（５３．２ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２６．６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１３３ｍＭのＫＣｌ、５．３２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．２６６％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ８．８）
０．２８ｕＭのプライマーミックス２
２８４．４Ｕ／ｍＬのＢＳＴ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ
１４．６７Ｕ／ｍＬのＴＩＰＰ
１．０６ｍＭのｄＮＴＰ
Ｓｙｔｏ８２色素 ３ｕＭ
１．２ｕＬのポイントｃからの反応混合物。
合計体積 １１．２ｕＬ
プライマーミックス２：
フォワード（配列番号２５）：
５’－Ｔ＊Ｃ＊ＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＡＴＡＴＣＴＧＣ－３’
リバース（配列番号２６）：
５’－Ｔ＊Ｇ＊ＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡ－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表す］
その後、混合物を６０℃で９０分間インキュベートした。蛍光測定を１分毎にとった。結果を図１に示す。結果は、遮断オリゴヌクレオチドの濃度が高ければ高いほど、０％と０．１％ＡＦとの間のＣｑ値の相違が大きくなることを示す。
以下に対応する混合物を調製した：
２．６６×等温緩衝液（５３．２ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２６．６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１３３ｍＭのＫＣｌ、５．３２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．２６６％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ８．８）
０．２８ｕＭのプライマーミックス２
２８４．４Ｕ／ｍＬのＢＳＴ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ
１４．６７Ｕ／ｍＬのＴＩＰＰ
１．０６ｍＭのｄＮＴＰ
Ｓｙｔｏ８２色素 ３ｕＭ
１．２ｕＬのポイントｃからの反応混合物。
合計体積 １１．２ｕＬ
プライマーミックス２：
フォワード（配列番号２５）：
５’－Ｔ＊Ｃ＊ＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＡＴＡＴＣＴＧＣ－３’
リバース（配列番号２６）：
５’－Ｔ＊Ｇ＊ＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡ－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表す］
その後、混合物を６０℃で９０分間インキュベートした。蛍光測定を１分毎にとった。結果を図１に示す。結果は、遮断オリゴヌクレオチドの濃度が高ければ高いほど、０％と０．１％ＡＦとの間のＣｑ値の相違が大きくなることを示す。
【0377】
実施例２：合わせた加ピロリン酸分解およびライゲーションステップの前の、初期ＰＣＲ増幅に続く遮断オリゴヌクレオチドの導入、ならびに０．１％ＡＦのＴ７９０Ｍの検出。
ａ．ＰＣＲ増幅
以下に対応する混合物を調製した：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
２００ｎＭのプライマーミックス１（実施例１と同様、配列番号１～２０）
２０Ｕ／ｍＬのＱ５Ｕポリメラーゼ
１０Ｕ／ｍＬの熱不安定性ＵＤＧ
０．４ｎｇ／ｕＬの断片化されたヒトゲノムＤＮＡ
＋／－０．２ａＭの突然変異オリゴヌクレオチド
合計体積 ５０ｕＬ
その後、この混合物をインキュベートした：
３７℃ １分間
５５℃ １０分間
９８℃ １分間
（９８℃ １０秒間
６３℃ １５秒間
７２℃ １５秒間）×５０
７２℃ ５分間
４℃ ∞
Ｑ５緩衝液
Ｑ５緩衝液は市販供給業者ＮＥＢから入手可能である。
ａ．ＰＣＲ増幅
以下に対応する混合物を調製した：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
２００ｎＭのプライマーミックス１（実施例１と同様、配列番号１～２０）
２０Ｕ／ｍＬのＱ５Ｕポリメラーゼ
１０Ｕ／ｍＬの熱不安定性ＵＤＧ
０．４ｎｇ／ｕＬの断片化されたヒトゲノムＤＮＡ
＋／－０．２ａＭの突然変異オリゴヌクレオチド
合計体積 ５０ｕＬ
その後、この混合物をインキュベートした：
３７℃ １分間
５５℃ １０分間
９８℃ １分間
（９８℃ １０秒間
６３℃ １５秒間
７２℃ １５秒間）×５０
７２℃ ５分間
４℃ ∞
Ｑ５緩衝液
Ｑ５緩衝液は市販供給業者ＮＥＢから入手可能である。
【0378】
突然変異オリゴヌクレオチド（配列番号２７）：
５’－ＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣｃｇＴｇｃａｇｃＴｃａＴｃａＴｇｃａｇｃＴｃａＴｇｃｃｃＴＴｃｇｇｃＴｇｃｃＴｃｃＴｇｇａｃＴａＴｇＴＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴ－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端リン酸を表す］
ｂ．プロテイナーゼＫ処理
以下に対応する混合物を調製した：
０．４４×プロテイナーゼＫ緩衝液
２０Ｕ／ｍＬのプロテイナーゼＫ
４０ｕＬの混合物、ポイントａ
合計体積 ９０ｕＬ
その後、この混合物を５５℃で５分間、９５℃で１０分間インキュベートした。
５’－ＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣｃｇＴｇｃａｇｃＴｃａＴｃａＴｇｃａｇｃＴｃａＴｇｃｃｃＴＴｃｇｇｃＴｇｃｃＴｃｃＴｇｇａｃＴａＴｇＴＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴ－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端リン酸を表す］
ｂ．プロテイナーゼＫ処理
以下に対応する混合物を調製した：
０．４４×プロテイナーゼＫ緩衝液
２０Ｕ／ｍＬのプロテイナーゼＫ
４０ｕＬの混合物、ポイントａ
合計体積 ９０ｕＬ
その後、この混合物を５５℃で５分間、９５℃で１０分間インキュベートした。
【0379】
１×プロテイナーゼＫ緩衝液の組成物
トリスアセテート、ｐＨ＝８．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ２５ｍＭ
酢酸マグネシウム ５ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％
ｃ．遮断オリゴのアニーリング
２．２ｕＬの混合物、ポイントｂ
３０ｎＭの遮断オリゴヌクレオチド
合計体積 ５ｕＬ
その後、この混合物を９５℃で５分間インキュベートし、４℃まで冷却した。
トリスアセテート、ｐＨ＝８．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ２５ｍＭ
酢酸マグネシウム ５ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％
ｃ．遮断オリゴのアニーリング
２．２ｕＬの混合物、ポイントｂ
３０ｎＭの遮断オリゴヌクレオチド
合計体積 ５ｕＬ
その後、この混合物を９５℃で５分間インキュベートし、４℃まで冷却した。
【0380】
遮断オリゴヌクレオチド（配列番号２８）：
５’－Ａ＊ＴＧＡＧＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＧ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表す］
ｄ．加ピロリン酸分解（ＰＰＬ）およびライゲーション
以下に対応する混合物を調製した：
１×ＢＦＦ６
２０Ｕ／ｍＬのクレノウ（エキソ－）
１００Ｕ／ｍＬの大腸菌リガーゼ
２Ｕ／ｍＬのアピラーゼ
１００Ｕ／ｍＬのラムダエキソ
０．５ｍＭのＰＰｉ
１０ｎＭのプローブオリゴヌクレオチド
１５ｎＭのスプリントオリゴヌクレオチド
５ｕＬのポイントｃからの混合物。
合計体積 １０ｕＬ
その後、この混合物を４５℃で３０分間インキュベートした。
５’－Ａ＊ＴＧＡＧＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＧ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表す］
ｄ．加ピロリン酸分解（ＰＰＬ）およびライゲーション
以下に対応する混合物を調製した：
１×ＢＦＦ６
２０Ｕ／ｍＬのクレノウ（エキソ－）
１００Ｕ／ｍＬの大腸菌リガーゼ
２Ｕ／ｍＬのアピラーゼ
１００Ｕ／ｍＬのラムダエキソ
０．５ｍＭのＰＰｉ
１０ｎＭのプローブオリゴヌクレオチド
１５ｎＭのスプリントオリゴヌクレオチド
５ｕＬのポイントｃからの混合物。
合計体積 １０ｕＬ
その後、この混合物を４５℃で３０分間インキュベートした。
【0381】
１×ＢＦＦ６組成物
トリスアセテート、ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ３０ｍＭ
酢酸マグネシウム １７．１２５ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％
プローブ（配列番号２９）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ＴＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＡＧＡＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＴＧＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧ－３’
スプリントオリゴヌクレオチド（配列番号３０）：
５’－ＣＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＡＣＡＴＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＣＡＡＣＴ／３ＩｎｖｄＴ／－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端リン酸を表し、／３ＩｎｖｄＴ／は３’末端逆位ｄＴを表す］
ｅ．検出－ＲＣＡ
以下に対応する混合物を調製した：
２．６６×等温緩衝液（５３．２ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２６．６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１３３ｍＭのＫＣｌ、５．３２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．２６６％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ８．８）
０．２８ｕＭのプライマーミックス２（実施例１と同様、配列番号２５および２６）
２８４．４Ｕ／ｍＬのＢＳＴ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ
１４．６７Ｕ／ｍＬのＴＩＰＰ
１．０６ｍＭのｄＮＴＰ
Ｓｙｔｏ８２色素 ３ｕＭ
１．２ｕＬのポイントｄからの反応混合物。
合計体積 １１．２ｕＬ
その後、混合物を６０℃で９０分間インキュベートした。蛍光測定を１分毎にとった。この結果は図２中に見ることができる。遮断オリゴヌクレオチドが存在する場合、０％と０．１％ＡＦとの間のＣｑ値の相違が増加する。
トリスアセテート、ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ３０ｍＭ
酢酸マグネシウム １７．１２５ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％
プローブ（配列番号２９）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ＴＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＡＧＡＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＴＧＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧ－３’
スプリントオリゴヌクレオチド（配列番号３０）：
５’－ＣＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＡＣＡＴＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＣＡＡＣＴ／３ＩｎｖｄＴ／－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端リン酸を表し、／３ＩｎｖｄＴ／は３’末端逆位ｄＴを表す］
ｅ．検出－ＲＣＡ
以下に対応する混合物を調製した：
２．６６×等温緩衝液（５３．２ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２６．６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１３３ｍＭのＫＣｌ、５．３２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．２６６％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ８．８）
０．２８ｕＭのプライマーミックス２（実施例１と同様、配列番号２５および２６）
２８４．４Ｕ／ｍＬのＢＳＴ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ
１４．６７Ｕ／ｍＬのＴＩＰＰ
１．０６ｍＭのｄＮＴＰ
Ｓｙｔｏ８２色素 ３ｕＭ
１．２ｕＬのポイントｄからの反応混合物。
合計体積 １１．２ｕＬ
その後、混合物を６０℃で９０分間インキュベートした。蛍光測定を１分毎にとった。この結果は図２中に見ることができる。遮断オリゴヌクレオチドが存在する場合、０％と０．１％ＡＦとの間のＣｑ値の相違が増加する。
【0382】
実施例３：０．１％ＡＦのＴ７９０Ｍの検出の方法における、目的配列と完全に相補的な様々な濃度の遮断オリゴヌクレオチドの使用
ａ．ＰＣＲ増幅
以下に対応する混合物を調製した：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
２００ｎＭのプライマーミックス１（実施例１と同様、配列番号１～２０）
２０Ｕ／ｍＬのＱ５Ｕポリメラーゼ
１０Ｕ／ｍＬの熱不安定性ＵＤＧ
０．４ｎｇ／ｕＬの断片化されたヒトゲノムＤＮＡ
＋／－０．２ａＭの突然変異オリゴヌクレオチド（実施例２と同様、配列番号２７）
合計体積 ５０ｕＬ
その後、この混合物をインキュベートした：
３７℃ １分間
５５℃ １０分間
９８℃ １分間
（９８℃ １０秒間
６３℃ １５秒間
７２℃ １５秒間）×５０
７２℃ ５分間
４℃ ∞
Ｑ５緩衝液
Ｑ５緩衝液は市販供給業者ＮＥＢから入手可能である。
ａ．ＰＣＲ増幅
以下に対応する混合物を調製した：
１×Ｑ５Ｕ緩衝液
２００ｎＭのプライマーミックス１（実施例１と同様、配列番号１～２０）
２０Ｕ／ｍＬのＱ５Ｕポリメラーゼ
１０Ｕ／ｍＬの熱不安定性ＵＤＧ
０．４ｎｇ／ｕＬの断片化されたヒトゲノムＤＮＡ
＋／－０．２ａＭの突然変異オリゴヌクレオチド（実施例２と同様、配列番号２７）
合計体積 ５０ｕＬ
その後、この混合物をインキュベートした：
３７℃ １分間
５５℃ １０分間
９８℃ １分間
（９８℃ １０秒間
６３℃ １５秒間
７２℃ １５秒間）×５０
７２℃ ５分間
４℃ ∞
Ｑ５緩衝液
Ｑ５緩衝液は市販供給業者ＮＥＢから入手可能である。
【0383】
ｂ．プロテイナーゼＫ処理
以下に対応する混合物を調製した：
０．４４×プロテイナーゼＫ緩衝液
２０Ｕ／ｍＬのプロテイナーゼＫ
４０ｕＬの混合物、ポイントａ
合計体積 ９０ｕＬ
その後、この混合物を５５℃で５分間、９５℃で１０分間インキュベートした。
以下に対応する混合物を調製した：
０．４４×プロテイナーゼＫ緩衝液
２０Ｕ／ｍＬのプロテイナーゼＫ
４０ｕＬの混合物、ポイントａ
合計体積 ９０ｕＬ
その後、この混合物を５５℃で５分間、９５℃で１０分間インキュベートした。
【0384】
１×プロテイナーゼＫ緩衝液の組成物
トリスアセテート、ｐＨ＝８．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ２５ｍＭ
酢酸マグネシウム ５ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％
ｃ．遮断オリゴのアニーリング
２．２ｕＬの混合物、ポイントｂ
０～１２０ｎＭの遮断オリゴヌクレオチド
合計体積 ５ｕＬ
その後、この混合物を９５℃で５分間インキュベートし、４℃まで冷却した。
トリスアセテート、ｐＨ＝８．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ２５ｍＭ
酢酸マグネシウム ５ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％
ｃ．遮断オリゴのアニーリング
２．２ｕＬの混合物、ポイントｂ
０～１２０ｎＭの遮断オリゴヌクレオチド
合計体積 ５ｕＬ
その後、この混合物を９５℃で５分間インキュベートし、４℃まで冷却した。
【0385】
遮断オリゴヌクレオチド（配列番号３１）：
５’－Ａ＊ＧＣＣＧＡＡＧＡＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧ－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表す］
ｄ．加ピロリン酸分解（ＰＰＬ）およびライゲーション
以下に対応する混合物を調製した：
１×ＢＦＦ６
２０Ｕ／ｍＬのクレノウ（エキソ－）
１００Ｕ／ｍＬの大腸菌リガーゼ
２Ｕ／ｍＬのアピラーゼ
１００Ｕ／ｍＬのラムダエキソ
０．５ｍＭのＰＰｉ
１０ｎＭのプローブオリゴヌクレオチド（実施例２と同様、配列番号２９）
１５ｎＭのスプリントオリゴヌクレオチド（実施例２と同様、配列番号３０）
５ｕＬのポイントｃからの混合物。
合計体積 １０ｕＬ
その後、この混合物を４５℃で３０分間インキュベートした。
５’－Ａ＊ＧＣＣＧＡＡＧＡＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧ－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表す］
ｄ．加ピロリン酸分解（ＰＰＬ）およびライゲーション
以下に対応する混合物を調製した：
１×ＢＦＦ６
２０Ｕ／ｍＬのクレノウ（エキソ－）
１００Ｕ／ｍＬの大腸菌リガーゼ
２Ｕ／ｍＬのアピラーゼ
１００Ｕ／ｍＬのラムダエキソ
０．５ｍＭのＰＰｉ
１０ｎＭのプローブオリゴヌクレオチド（実施例２と同様、配列番号２９）
１５ｎＭのスプリントオリゴヌクレオチド（実施例２と同様、配列番号３０）
５ｕＬのポイントｃからの混合物。
合計体積 １０ｕＬ
その後、この混合物を４５℃で３０分間インキュベートした。
【0386】
１×ＢＦＦ６組成物
トリスアセテート、ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ３０ｍＭ
酢酸マグネシウム １７．１２５ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％
ｅ．検出－ＲＣＡ
以下に対応する混合物を調製した：
２．６６×等温緩衝液（５３．２ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２６．６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１３３ｍＭのＫＣｌ、５．３２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．２６６％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ８．８）
０．２８ｕＭのプライマーミックス２（実施例１と同様、配列番号２５および２６）
２８４．４Ｕ／ｍＬのＢＳＴ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ
１４．６７Ｕ／ｍＬのＴＩＰＰ
１．０６ｍＭのｄＮＴＰ
Ｓｙｔｏ８２色素 ３ｕＭ
１．２ｕＬのポイントｄからの反応混合物。
合計体積 １１．２ｕＬ
その後、混合物を６０℃で９０分間インキュベートした。蛍光測定を１分毎にとった。この結果は図３中に見ることができる。結果は、遮断オリゴヌクレオチドの存在が０％と０．１％ＡＦとの間のＣｑ値の相違を増加させることを示す。
トリスアセテート、ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ３０ｍＭ
酢酸マグネシウム １７．１２５ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％
ｅ．検出－ＲＣＡ
以下に対応する混合物を調製した：
２．６６×等温緩衝液（５３．２ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２６．６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１３３ｍＭのＫＣｌ、５．３２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．２６６％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ８．８）
０．２８ｕＭのプライマーミックス２（実施例１と同様、配列番号２５および２６）
２８４．４Ｕ／ｍＬのＢＳＴ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ
１４．６７Ｕ／ｍＬのＴＩＰＰ
１．０６ｍＭのｄＮＴＰ
Ｓｙｔｏ８２色素 ３ｕＭ
１．２ｕＬのポイントｄからの反応混合物。
合計体積 １１．２ｕＬ
その後、混合物を６０℃で９０分間インキュベートした。蛍光測定を１分毎にとった。この結果は図３中に見ることができる。結果は、遮断オリゴヌクレオチドの存在が０％と０．１％ＡＦとの間のＣｑ値の相違を増加させることを示す。
【0387】
実施例４：
ａ．ＰＣＲ
以下に対応するＰＣＲ混合物を調製した：
４００ｎＭのプライマーミックス１またはプライマーミックス２
２０Ｕ／ｍＬのＱ５Ｕポリメラーゼ
１０Ｕ／ｍＬの熱不安定性ＵＤＧ
０．４ｎｇ／ｕＬの断片化されたヒトゲノムＤＮＡ
＋／－０．２ａＭの突然変異オリゴヌクレオチド１
＋／－０．２ａＭの突然変異オリゴヌクレオチド２
合計体積：５０ｕＬ
プライマーミックス１：
ＦＷＤ（配列番号３２）：
５’－Ａ＊Ａ＊Ｇ＊ＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡ－３’
ＲＥＶ（配列番号３３）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＣＡＣＡＴＣＧ－３’
プライマーミックス２：
ＦＷＤ（配列番号３４）：
５’－Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡ－３’
ＲＥＶ（配列番号３５）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＣＡＣＡＴＣＧ－３’
突然変異オリゴヌクレオチド１（配列番号３６）：
５’－ＣＴＧＴＣＡＴＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡＴＣＡＡＧＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＣＴＣＧＡＴＧＴＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＧＧＧＴＣ－３’
突然変異オリゴヌクレオチド２（配列番号３７）：
５’－ＣＴＧＴＣＡＴＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＣＴＣＧＡＴＧＴＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＧＧＧＴＣ－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端リン酸を表す］
その後、以下に詳述するようにこの混合物をインキュベートした：
３７℃ １分間
５５℃ １０分間
９８℃ １分間
（９８℃ １０秒間
６０℃ １５秒間
７２℃ １５秒間）×５０
７２℃ ５分間
４℃ ∞
ｂ．プロテイナーゼＫ処理
以下に対応する混合物を調製した：
０．４４×Ａ７緩衝液
２０Ｕ／ｍＬのプロテイナーゼＫ
４０ｕＬの混合物、ポイントａ
合計体積 ９０ｕＬ
１×Ａ７
トリスアセテート、ｐＨ＝８．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ２５ｍＭ
酢酸マグネシウム ５ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００、０．１％
その後、この混合物を５５℃で５分間、９５℃で１０分間インキュベートした。
ａ．ＰＣＲ
以下に対応するＰＣＲ混合物を調製した：
４００ｎＭのプライマーミックス１またはプライマーミックス２
２０Ｕ／ｍＬのＱ５Ｕポリメラーゼ
１０Ｕ／ｍＬの熱不安定性ＵＤＧ
０．４ｎｇ／ｕＬの断片化されたヒトゲノムＤＮＡ
＋／－０．２ａＭの突然変異オリゴヌクレオチド１
＋／－０．２ａＭの突然変異オリゴヌクレオチド２
合計体積：５０ｕＬ
プライマーミックス１：
ＦＷＤ（配列番号３２）：
５’－Ａ＊Ａ＊Ｇ＊ＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡ－３’
ＲＥＶ（配列番号３３）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＣＡＣＡＴＣＧ－３’
プライマーミックス２：
ＦＷＤ（配列番号３４）：
５’－Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡ－３’
ＲＥＶ（配列番号３５）：
５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＣＡＣＡＴＣＧ－３’
突然変異オリゴヌクレオチド１（配列番号３６）：
５’－ＣＴＧＴＣＡＴＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡＴＣＡＡＧＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＣＴＣＧＡＴＧＴＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＧＧＧＴＣ－３’
突然変異オリゴヌクレオチド２（配列番号３７）：
５’－ＣＴＧＴＣＡＴＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＣＴＣＧＡＴＧＴＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＧＧＧＴＣ－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端リン酸を表す］
その後、以下に詳述するようにこの混合物をインキュベートした：
３７℃ １分間
５５℃ １０分間
９８℃ １分間
（９８℃ １０秒間
６０℃ １５秒間
７２℃ １５秒間）×５０
７２℃ ５分間
４℃ ∞
ｂ．プロテイナーゼＫ処理
以下に対応する混合物を調製した：
０．４４×Ａ７緩衝液
２０Ｕ／ｍＬのプロテイナーゼＫ
４０ｕＬの混合物、ポイントａ
合計体積 ９０ｕＬ
１×Ａ７
トリスアセテート、ｐＨ＝８．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ２５ｍＭ
酢酸マグネシウム ５ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００、０．１％
その後、この混合物を５５℃で５分間、９５℃で１０分間インキュベートした。
【0388】
ｃ．加ピロリン酸分解（ＰＰＬ）およびライゲーション
以下に対応する混合物を調製した：
１×ＢＦＦ１
２０Ｕ／ｍＬのクレノウ（エキソ－）
１００Ｕ／ｍＬの大腸菌リガーゼ
１．２Ｕ／ｍＬのアピラーゼ
１００Ｕ／ｍＬのラムダエキソ
０．２５ｍＭのＰＰｉ
２０ｎＭのプローブオリゴヌクレオチド１またはプローブオリゴヌクレオチド２
３０ｎＭのスプリントオリゴヌクレオチド１またはスプリントオリゴヌクレオチド２
１．２５ｕＬのポイントｂからの混合物。
合計体積 １０ｕＬ
１×ＢＦＦ１組成物
トリスアセテート、ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ３０ｍＭ
酢酸マグネシウム １７．１２５ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００、０．１％
プローブオリゴヌクレオチド１（配列番号３８）：
５’／５Ｐｈｏｓ／Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ＴＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＡＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＣＴＴＧＡＴＡＧ－３’
スプリントオリゴヌクレオチド１（配列番号３９）：
５’－ＴＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＡＣＡＴＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＡＴＣＧＧ－３’
プローブオリゴヌクレオチド２（配列番号４０）：
５’／５Ｐｈｏｓ／Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ＴＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＡＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＴＧＣＧＡＣＧＧＡＧＡＴＧＴＴＧＣＴＴＣＣＴＴＧＡ－３’
スプリントオリゴヌクレオチド２（配列番号４１）：
５’－ＴＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＴＣＴＣＧＣＡＡＧ－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端リン酸を表す。
以下に対応する混合物を調製した：
１×ＢＦＦ１
２０Ｕ／ｍＬのクレノウ（エキソ－）
１００Ｕ／ｍＬの大腸菌リガーゼ
１．２Ｕ／ｍＬのアピラーゼ
１００Ｕ／ｍＬのラムダエキソ
０．２５ｍＭのＰＰｉ
２０ｎＭのプローブオリゴヌクレオチド１またはプローブオリゴヌクレオチド２
３０ｎＭのスプリントオリゴヌクレオチド１またはスプリントオリゴヌクレオチド２
１．２５ｕＬのポイントｂからの混合物。
合計体積 １０ｕＬ
１×ＢＦＦ１組成物
トリスアセテート、ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ３０ｍＭ
酢酸マグネシウム １７．１２５ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００、０．１％
プローブオリゴヌクレオチド１（配列番号３８）：
５’／５Ｐｈｏｓ／Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ＴＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＡＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＣＴＴＧＡＴＡＧ－３’
スプリントオリゴヌクレオチド１（配列番号３９）：
５’－ＴＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＡＣＡＴＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＡＴＣＧＧ－３’
プローブオリゴヌクレオチド２（配列番号４０）：
５’／５Ｐｈｏｓ／Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ＴＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＡＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＴＧＣＧＡＣＧＧＡＧＡＴＧＴＴＧＣＴＴＣＣＴＴＧＡ－３’
スプリントオリゴヌクレオチド２（配列番号４１）：
５’－ＴＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＴＣＴＣＧＣＡＡＧ－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端リン酸を表す。
【0389】
その後、この混合物を４５℃で１５分間インキュベートした。
ｄ．検出－ＲＣＡ
以下に対応する混合物を調製した：
２．６６×等温緩衝液（５３．２ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２６．６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１３３ｍＭのＫＣｌ、５．３２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．２６６％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ８．８）
０．２８ｕＭのプライマーミックス２（実施例２と同様、配列番号２５および２６）
２８４．４Ｕ／ｍＬのＢＳＴ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ
１４．６７Ｕ／ｍＬのＴＩＰＰ
１．０６ｍＭのｄＮＴＰ
Ｓｙｔｏ８２色素 ３ｕＭ
１．２５ｕＬのポイントｃからの反応混合物。
合計体積 １１．２５ｕＬ
その後、混合物を６０℃で９０分間インキュベートした。蛍光測定を１分毎にとった。この結果は図１３中に見ることができる。
ｄ．検出－ＲＣＡ
以下に対応する混合物を調製した：
２．６６×等温緩衝液（５３．２ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２６．６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１３３ｍＭのＫＣｌ、５．３２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．２６６％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ８．８）
０．２８ｕＭのプライマーミックス２（実施例２と同様、配列番号２５および２６）
２８４．４Ｕ／ｍＬのＢＳＴ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ
１４．６７Ｕ／ｍＬのＴＩＰＰ
１．０６ｍＭのｄＮＴＰ
Ｓｙｔｏ８２色素 ３ｕＭ
１．２５ｕＬのポイントｃからの反応混合物。
合計体積 １１．２５ｕＬ
その後、混合物を６０℃で９０分間インキュベートした。蛍光測定を１分毎にとった。この結果は図１３中に見ることができる。
【0390】
実施例５：遮断オリゴヌクレオチド（ＢＯ）をＰＰＬステップの前またはその間に加えることの効果を示すデータ：
以下に対応する混合物を調製した：
２００ｎＭのプライマーミックス１（実施例１と同様、配列番号１～２０）
２０Ｕ／ｍＬのＱ５Ｕポリメラーゼ
１０Ｕ／ｍＬの熱不安定性ＵＤＧ
０．４ｎｇ／ｕＬの断片化されたヒトゲノムＤＮＡ
＋／－０．２ａＭの突然変異オリゴヌクレオチド（実施例１と同様、配列番号２１）
合計体積 ５０ｕＬ
その後、この混合物をインキュベートした：
３７℃ １分間
５５℃ １０分間
９８℃ １分間
（９８℃ １０秒間
６３℃ １５秒間
７２℃ １５秒間）×５０
７２℃ ５分間
４℃ ∞
ｂ．プロテイナーゼＫ処理
以下に対応する混合物を調製した：
０．４４×プロテイナーゼＫ緩衝液
２０Ｕ／ｍＬのプロテイナーゼＫ
４０ｕＬの混合物、ポイントａ
合計体積 ９０ｕＬ
その後、この混合物を５５℃で５分間、９５℃で１０分間インキュベートした。
以下に対応する混合物を調製した：
２００ｎＭのプライマーミックス１（実施例１と同様、配列番号１～２０）
２０Ｕ／ｍＬのＱ５Ｕポリメラーゼ
１０Ｕ／ｍＬの熱不安定性ＵＤＧ
０．４ｎｇ／ｕＬの断片化されたヒトゲノムＤＮＡ
＋／－０．２ａＭの突然変異オリゴヌクレオチド（実施例１と同様、配列番号２１）
合計体積 ５０ｕＬ
その後、この混合物をインキュベートした：
３７℃ １分間
５５℃ １０分間
９８℃ １分間
（９８℃ １０秒間
６３℃ １５秒間
７２℃ １５秒間）×５０
７２℃ ５分間
４℃ ∞
ｂ．プロテイナーゼＫ処理
以下に対応する混合物を調製した：
０．４４×プロテイナーゼＫ緩衝液
２０Ｕ／ｍＬのプロテイナーゼＫ
４０ｕＬの混合物、ポイントａ
合計体積 ９０ｕＬ
その後、この混合物を５５℃で５分間、９５℃で１０分間インキュベートした。
【0391】
１×プロテイナーゼＫ緩衝液の組成物
トリスアセテート、ｐＨ＝８．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ２５ｍＭ
酢酸マグネシウム ５ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％
ｃ．ＰＰＬステップの前の遮断オリゴヌクレオチドの添加
ｃ．１．遮断オリゴのアニーリング
２．２ｕＬの混合物、ポイントｂ
３０ｎＭの遮断オリゴヌクレオチド（実施例３と同様、配列番号３１）
合計体積 ５ｕＬ
その後、この混合物を９５℃で５分間インキュベートし、４℃まで冷却した。
トリスアセテート、ｐＨ＝８．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ２５ｍＭ
酢酸マグネシウム ５ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％
ｃ．ＰＰＬステップの前の遮断オリゴヌクレオチドの添加
ｃ．１．遮断オリゴのアニーリング
２．２ｕＬの混合物、ポイントｂ
３０ｎＭの遮断オリゴヌクレオチド（実施例３と同様、配列番号３１）
合計体積 ５ｕＬ
その後、この混合物を９５℃で５分間インキュベートし、４℃まで冷却した。
【0392】
ｃ．２．加ピロリン酸分解（ＰＰＬ）およびライゲーション
以下に対応する混合物を調製した：
１×ＢＦＦ６
２０Ｕ／ｍＬのクレノウ（エキソ－）
１００Ｕ／ｍＬの大腸菌リガーゼ
２Ｕ／ｍＬのアピラーゼ
１００Ｕ／ｍＬのラムダエキソ
０．５ｍＭのＰＰｉ
５ｎＭのそれぞれのプローブオリゴヌクレオチド
１０ｎＭのそれぞれのスプリントオリゴヌクレオチド
５ｕＬの混合物ｃ．１。
合計体積 １０ｕＬ
その後、この混合物を４５℃で３０分間インキュベートした。
以下に対応する混合物を調製した：
１×ＢＦＦ６
２０Ｕ／ｍＬのクレノウ（エキソ－）
１００Ｕ／ｍＬの大腸菌リガーゼ
２Ｕ／ｍＬのアピラーゼ
１００Ｕ／ｍＬのラムダエキソ
０．５ｍＭのＰＰｉ
５ｎＭのそれぞれのプローブオリゴヌクレオチド
１０ｎＭのそれぞれのスプリントオリゴヌクレオチド
５ｕＬの混合物ｃ．１。
合計体積 １０ｕＬ
その後、この混合物を４５℃で３０分間インキュベートした。
【0393】
１×ＢＦＦ６組成物
トリスアセテート、ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ３０ｍＭ
酢酸マグネシウム １７．１２５ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％
Ｔ７９０Ｍプローブ（配列番号４２）：５’－
／５Ｐｈｏｓ／Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ＴＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＡＧＡＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＴＧＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧ－３’
Ｔ７９０Ｍスプリントオリゴヌクレオチド（配列番号４３）：５’－ＣＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＡＣＡＴＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＣＡＡＣＴ／３ＩｎｖｄＴ／－３’
Ｇ７１９Ｘ＿６２３９プローブ（配列番号４４）：５’
／５Ｐｈｏｓ／Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ＴＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡＣＡＴＧＣＧＣＡＧＡＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＴＧＣＧＡＡＡＣＧＣＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧ－３’
Ｇ７１９Ｘ＿６２３９スプリントオリゴヌクレオチド（配列番号４５）：５’－ＴＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＡＣＡＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＣＧＧＣＡＡ－３’
Ｇ７１９Ｘ＿６２５２プローブ（配列番号４６）：５’
／５Ｐｈｏｓ／Ｃ＊ＴＧＴＣＣＡＧＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡＣＡＴＧＣＣＧＡＧＴＡＡＴＧＡＧＡＧＴＴＴＣＧＣＡＡＡＣＧＣＡＣＣＧＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧ－３’
Ｇ７１９Ｘ＿６２５２スプリントオリゴヌクレオチド（配列番号４７）：５’－ＴＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＣＧＧＣＡＡ－３’
Ｇ７１９Ｘ＿６２５３プローブ（配列番号４８）：５’
／５Ｐｈｏｓ／Ａ＊ＣＣＴＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡＣＡＴＧＣＧＡＧＣＡＡＴＴＡＧＧＴＡＧＴＧＴＣＧＴＡＡＣＧＣＡＣＣＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧ－３’
Ｇ７１９Ｘ＿６２５３スプリントオリゴヌクレオチド（配列番号４９）：５’－ＴＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＧＡＴＣＡＧＧＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＣＧＧＣＡＡ－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端リン酸を表し、／３ＩｎｖｄＴ／は３’末端逆位ｄＴを表す］
ｄ．ＰＰＬステップ中の遮断オリゴヌクレオチドの添加
以下に対応する混合物を調製した：
１×ＢＦＦ６
２０Ｕ／ｍＬのクレノウ（エキソ－）
１００Ｕ／ｍＬの大腸菌リガーゼ
２Ｕ／ｍＬのアピラーゼ
１００Ｕ／ｍＬのラムダエキソ
０．５ｍＭのＰＰｉ
５ｎＭのプローブオリゴヌクレオチド（実施例５、ステップｃと同様、配列番号４２、４４、４６、４８）
１０ｎＭのスプリントオリゴヌクレオチド（実施例５、ステップｃと同様、配列番号４３、４５、４７、４９）
２．２ｕＬの混合物ｂ。
３０ｎＭの遮断オリゴヌクレオチド（実施例３と同様、配列番号３１）
合計体積 １０ｕＬ
その後、この混合物を４５℃で３０分間インキュベートした。
トリスアセテート、ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ３０ｍＭ
酢酸マグネシウム １７．１２５ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％
Ｔ７９０Ｍプローブ（配列番号４２）：５’－
／５Ｐｈｏｓ／Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ＴＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＡＧＡＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＴＧＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧ－３’
Ｔ７９０Ｍスプリントオリゴヌクレオチド（配列番号４３）：５’－ＣＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＡＣＡＴＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＣＡＡＣＴ／３ＩｎｖｄＴ／－３’
Ｇ７１９Ｘ＿６２３９プローブ（配列番号４４）：５’
／５Ｐｈｏｓ／Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ＴＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡＣＡＴＧＣＧＣＡＧＡＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＴＧＣＧＡＡＡＣＧＣＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧ－３’
Ｇ７１９Ｘ＿６２３９スプリントオリゴヌクレオチド（配列番号４５）：５’－ＴＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＡＣＡＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＣＧＧＣＡＡ－３’
Ｇ７１９Ｘ＿６２５２プローブ（配列番号４６）：５’
／５Ｐｈｏｓ／Ｃ＊ＴＧＴＣＣＡＧＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡＣＡＴＧＣＣＧＡＧＴＡＡＴＧＡＧＡＧＴＴＴＣＧＣＡＡＡＣＧＣＡＣＣＧＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧ－３’
Ｇ７１９Ｘ＿６２５２スプリントオリゴヌクレオチド（配列番号４７）：５’－ＴＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＣＧＧＣＡＡ－３’
Ｇ７１９Ｘ＿６２５３プローブ（配列番号４８）：５’
／５Ｐｈｏｓ／Ａ＊ＣＣＴＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡＣＡＴＧＣＧＡＧＣＡＡＴＴＡＧＧＴＡＧＴＧＴＣＧＴＡＡＣＧＣＡＣＣＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧ－３’
Ｇ７１９Ｘ＿６２５３スプリントオリゴヌクレオチド（配列番号４９）：５’－ＴＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＧＡＴＣＡＧＧＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＣＧＧＣＡＡ－３’
［＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｐｈｏｓ／は５’末端リン酸を表し、／３ＩｎｖｄＴ／は３’末端逆位ｄＴを表す］
ｄ．ＰＰＬステップ中の遮断オリゴヌクレオチドの添加
以下に対応する混合物を調製した：
１×ＢＦＦ６
２０Ｕ／ｍＬのクレノウ（エキソ－）
１００Ｕ／ｍＬの大腸菌リガーゼ
２Ｕ／ｍＬのアピラーゼ
１００Ｕ／ｍＬのラムダエキソ
０．５ｍＭのＰＰｉ
５ｎＭのプローブオリゴヌクレオチド（実施例５、ステップｃと同様、配列番号４２、４４、４６、４８）
１０ｎＭのスプリントオリゴヌクレオチド（実施例５、ステップｃと同様、配列番号４３、４５、４７、４９）
２．２ｕＬの混合物ｂ。
３０ｎＭの遮断オリゴヌクレオチド（実施例３と同様、配列番号３１）
合計体積 １０ｕＬ
その後、この混合物を４５℃で３０分間インキュベートした。
【0394】
１×ＢＦＦ６組成物
トリスアセテート、ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ３０ｍＭ
酢酸マグネシウム １７．１２５ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％
ｅ．検出－ＲＣＡ
以下に対応する混合物を調製した：
２．６６×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（５３．２ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２６．６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２．６６ｍＭのＫＣｌ、５．３２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．２６６％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ８．８）
１×プライマーミックス２
５７１．４Ｕ／ｍＬのＢＳＴ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ
１．０７ｍＭのｄＮＴＰ
１．２ｕＬのポイントｄまたはｃからの反応混合物。
合計体積 １１．２ｕＬ
プライマーミックス２は以下からなる：
４０μＭのプライマー１（配列番号５０）：５’－Ｔ＊Ｇ＊ＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡ－３’
１０μＭのプライマー２（配列番号５１）：５’－／５Ｃｙ５／Ａ＊ＣＴＧＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＡＣＡＡＴＣＧＣＴＧＴＣＧＣＣＡＴＧＡＴＣＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＡＴＡＴＣＴＧＣＧＣ
１０μＭのプライマー３（配列番号５２）：５’－／５ＴＥＸ６１５／Ａ＊ＣＴＧＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＡＣＡＡＴＣＧＣＴＧＴＣＧＣＣＡＴＧＡＴＣＧＡＴＧＣＧＡＡＡＣＴＣＴＣＡＴＴＡＣＴＣＧＧＣ
１０μＭのプライマー４（配列番号５３）：５’－／５ＨＥＸ／Ｔ＊ＡＣＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＣＣＧＣＡＧＴＡＴＧＣＴＡＣＧＡＣＡＣＴＡＣＣＴＡＡＴＴＧＣＴＣＧＣ
１０μＭのプライマー５（配列番号５４）：５’－／５ＡＴＴＯ４８８Ｎ／Ｔ＊ＡＣＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＣＣＧＣＡＧＴＡＴＧＣＴＴＣＧＧＴＧＡＴＣＡＧＴＣＣＴＣＧＡＴＧ
２０μＭのプライマー６（配列番号５５）：５’－ＴＣＧＡＴＣＡＴＧＧＣＧＡＣＡＧＣＧＡＴＴＧＴＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／
２０μＭのプライマー７（配列番号５６）：５’－ＡＧＣＡＴＡＣＴＧＣＧＧＡＣＴＧＣＴＧＴＡＡＧＧＡＧＴＧＡＧＴＣＧＧＴＣＧＴＡ／３ＩＡＢｋＦＱ／
［＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｃｙ５／はＣｙ５色素を表し、／５ＴＥＸ６１５／ＡはＴｅｘａｓＲｅｄ色素を表し、／５ＨＥＸ／はＨｅｘ色素を表し、／５ＡＴＴＯ４８８Ｎ／はＡｔｔｏ４８８色素を表し、／３ＩＡｂＲＱＳｐ／はＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＲＱクエンチャーを表し、／３ＩＡＢｋＦＱ／はＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱを表す］
その後、混合物を５８℃で１２０分間インキュベートした。４つの読取りチャネルにおける蛍光測定を１分毎にとった。この結果は図１２中に見ることができる。
トリスアセテート、ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム ３０ｍＭ
酢酸マグネシウム １７．１２５ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％
ｅ．検出－ＲＣＡ
以下に対応する混合物を調製した：
２．６６×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（５３．２ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２６．６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２．６６ｍＭのＫＣｌ、５．３２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．２６６％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ８．８）
１×プライマーミックス２
５７１．４Ｕ／ｍＬのＢＳＴ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ
１．０７ｍＭのｄＮＴＰ
１．２ｕＬのポイントｄまたはｃからの反応混合物。
合計体積 １１．２ｕＬ
プライマーミックス２は以下からなる：
４０μＭのプライマー１（配列番号５０）：５’－Ｔ＊Ｇ＊ＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＡ－３’
１０μＭのプライマー２（配列番号５１）：５’－／５Ｃｙ５／Ａ＊ＣＴＧＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＡＣＡＡＴＣＧＣＴＧＴＣＧＣＣＡＴＧＡＴＣＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＡＴＡＴＣＴＧＣＧＣ
１０μＭのプライマー３（配列番号５２）：５’－／５ＴＥＸ６１５／Ａ＊ＣＴＧＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＡＣＡＡＴＣＧＣＴＧＴＣＧＣＣＡＴＧＡＴＣＧＡＴＧＣＧＡＡＡＣＴＣＴＣＡＴＴＡＣＴＣＧＧＣ
１０μＭのプライマー４（配列番号５３）：５’－／５ＨＥＸ／Ｔ＊ＡＣＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＣＣＧＣＡＧＴＡＴＧＣＴＡＣＧＡＣＡＣＴＡＣＣＴＡＡＴＴＧＣＴＣＧＣ
１０μＭのプライマー５（配列番号５４）：５’－／５ＡＴＴＯ４８８Ｎ／Ｔ＊ＡＣＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＣＣＧＣＡＧＴＡＴＧＣＴＴＣＧＧＴＧＡＴＣＡＧＴＣＣＴＣＧＡＴＧ
２０μＭのプライマー６（配列番号５５）：５’－ＴＣＧＡＴＣＡＴＧＧＣＧＡＣＡＧＣＧＡＴＴＧＴＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／
２０μＭのプライマー７（配列番号５６）：５’－ＡＧＣＡＴＡＣＴＧＣＧＧＡＣＴＧＣＴＧＴＡＡＧＧＡＧＴＧＡＧＴＣＧＧＴＣＧＴＡ／３ＩＡＢｋＦＱ／
［＊はホスホロチオエート結合を表し、／５Ｃｙ５／はＣｙ５色素を表し、／５ＴＥＸ６１５／ＡはＴｅｘａｓＲｅｄ色素を表し、／５ＨＥＸ／はＨｅｘ色素を表し、／５ＡＴＴＯ４８８Ｎ／はＡｔｔｏ４８８色素を表し、／３ＩＡｂＲＱＳｐ／はＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＲＱクエンチャーを表し、／３ＩＡＢｋＦＱ／はＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱを表す］
その後、混合物を５８℃で１２０分間インキュベートした。４つの読取りチャネルにおける蛍光測定を１分毎にとった。この結果は図１２中に見ることができる。
【0395】
実施例６：本発明の方法のさらなる応用
ヒト癌における関連性の高いメチル化遺伝子（ＨＲＭＧ）のメチル化頻度
ヒト癌における関連性の高いメチル化遺伝子（ＨＲＭＧ）のメチル化頻度
【0396】
【表1】
【0397】
肺癌バイオマーカーのメチル化
肺癌は、その症状の顕在化が遅いおよび胸部Ｘ線撮影などのスクリーニング技法の感度が低いことを含めたいくつかの理由により、癌関連の死亡率の主な原因である。腫瘍細胞から落ちたＤＮＡ断片が、癌の分子ポートレートへの好都合かつ最小限に浸潤性のアクセスを提供することができ、これらのＤＮＡ断片は、癌患者の血液から単離した無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）中に見出される。血漿中の無細胞循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は全癌ゲノムの代理を表し、ｃｔＤＮＡは、多くの癌患者において、特に疾患の初期において全ｃｆＤＮＡの０．０５％以下という低い割合を示す。これらの特性は、ｃｔＤＮＡの異常なメチル化を有望な癌バイオマーカーにし、最近の高スループット調査により、対にした腫瘍組織からのｃｔＤＮＡとＤＮＡとの間のメチル化プロファイルにおける変化の対応が実証されている。肺癌の診断学および予後診断のためのメチル化マーカーのリストを以下に示す。
肺癌は、その症状の顕在化が遅いおよび胸部Ｘ線撮影などのスクリーニング技法の感度が低いことを含めたいくつかの理由により、癌関連の死亡率の主な原因である。腫瘍細胞から落ちたＤＮＡ断片が、癌の分子ポートレートへの好都合かつ最小限に浸潤性のアクセスを提供することができ、これらのＤＮＡ断片は、癌患者の血液から単離した無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）中に見出される。血漿中の無細胞循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は全癌ゲノムの代理を表し、ｃｔＤＮＡは、多くの癌患者において、特に疾患の初期において全ｃｆＤＮＡの０．０５％以下という低い割合を示す。これらの特性は、ｃｔＤＮＡの異常なメチル化を有望な癌バイオマーカーにし、最近の高スループット調査により、対にした腫瘍組織からのｃｔＤＮＡとＤＮＡとの間のメチル化プロファイルにおける変化の対応が実証されている。肺癌の診断学および予後診断のためのメチル化マーカーのリストを以下に示す。
【0398】
【表2】
【0399】
ＴＥＲＴおよびＭＧＭＴプロモーターのメチル化と脳癌に対する影響
Ｏ６－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）遺伝子は、ＤＮＡ修復に関与する、進化的に保存されており、遍在的に発現されるメチルトランスフェラーゼをコードしている。ＭＧＭＴは、グアニンのＯ６位置からアルキル付加物を除去して、ＤＮＡ損傷を防止し、正常細胞に対して保護効果を与える。しかし、ＭＧＭＴの内在性機能はまた、テモゾマイド（ＴＭＺ）などのアルキル化剤を用いた化学療法の、そうしなければ致死的である効果から、腫瘍細胞を保護する。その対応する遺伝子プロモーターのメチル化を通じたＭＧＭＴのサイレンシングまたは発現の低下が、グレードＩＶ神経膠腫の５０％において観察されており、ＤＮＡ修復を損なわせ、その結果、ＴＭＺなどの薬剤に対する化学感受性が増加する。したがって、ＭＧＭＴプロモーターのメチル化状態は、アルキル化化学療法に対する感度のバイオマーカーとしての潜在性を有し、最終的に臨床診療に影響を与える。予測的および予後的なバイオマーカーのどちらとしてのその能力も大規模に研究されているが、現在では、ＭＧＭＴ遺伝子プロモーターのメチル化の評価の最適方法に関するコンセンサスは存在しない。
Ｏ６－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）遺伝子は、ＤＮＡ修復に関与する、進化的に保存されており、遍在的に発現されるメチルトランスフェラーゼをコードしている。ＭＧＭＴは、グアニンのＯ６位置からアルキル付加物を除去して、ＤＮＡ損傷を防止し、正常細胞に対して保護効果を与える。しかし、ＭＧＭＴの内在性機能はまた、テモゾマイド（ＴＭＺ）などのアルキル化剤を用いた化学療法の、そうしなければ致死的である効果から、腫瘍細胞を保護する。その対応する遺伝子プロモーターのメチル化を通じたＭＧＭＴのサイレンシングまたは発現の低下が、グレードＩＶ神経膠腫の５０％において観察されており、ＤＮＡ修復を損なわせ、その結果、ＴＭＺなどの薬剤に対する化学感受性が増加する。したがって、ＭＧＭＴプロモーターのメチル化状態は、アルキル化化学療法に対する感度のバイオマーカーとしての潜在性を有し、最終的に臨床診療に影響を与える。予測的および予後的なバイオマーカーのどちらとしてのその能力も大規模に研究されているが、現在では、ＭＧＭＴ遺伝子プロモーターのメチル化の評価の最適方法に関するコンセンサスは存在しない。
【0400】
テロメア維持は染色体末端の完全性を保護し、ヒト癌の顕著な特徴である複製による不死化を可能にする。テロメア逆転写酵素（ＴＥＲＴ）癌遺伝子は、テロメア維持を司っており、通常は幹細胞の部分組中でのみ発現される、テロメラーゼホロ酵素の律速触媒サブユニットをコードしている。ＴＥＲＴ遺伝子は癌細胞のおよそ９０％で再活性化され、これらの細胞種の無限の増殖および不死化が可能となる。ＴＥＲＴ調節不全の根底にある様々な遺伝的および後成的機構が同定されており、ＴＥＲＴプロモーター領域の過剰メチル化が癌細胞のユニークな特徴を表す。興味深いことに、ＴＥＲＴ遺伝子の転写開始部位の上流（ＵＴＳＳ）において、突然変異ではなくメチル化が、小児脳腫瘍におけるＴＥＲＴ発現の増加および予後不良に強く関連していることが見出された。多種多様な癌細胞種におけるＴＥＲＴプロモーターの過剰メチル化の普及を考えると、この後成的修飾が有用な予後的バイオマーカーを表す。
遺伝子がメチル化されている／されていない、前立腺癌遺伝子などのメチル化
前立腺癌は、最も頻繁に診断される非皮膚悪性腫瘍であり、西洋の工業先進国における男性の癌関連の死の主な原因である。良性と癌性の前立腺組織の間に多数のＤＮＡメチル化の変化が観察され、変化はしばしば初期および反復性であり、これは潜在的な機能的役割を示唆している。複数の全ゲノム研究によって、いくつかの遺伝子および遺伝子ファミリーが前立腺癌において反復的に過剰メチル化されていることが報告されている。この遺伝子および遺伝子ファミリーとしては、それだけには限定されないが、ＧＳＴＰ１、ＭＧＭＴ、ＡＲ、ＥＲ、ＶＨＬ、ＲＢ１、ＡＰＣ、ＤＡＰＫ、ＣＤ４４、ＡＯＸ１、ＡＰＣ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＨＯＸＤ３、ＰＴＧＳ２、ＲＡＲＢ、ＷＴ１、ＺＮＦ１５４、Ｃ２０ｏｒｆ１０３、ＥＦＳ、ＨＯＸＣ１１、ＬＨＸ９、ＲＵＮＸ３、ＴＢＸ１５、ＢＡＲＨＬ２、ＢＤＮＦ、ＣＣＤＣ８、ＣＹＰ２７Ａ１、ＤＬＸ１、ＥＮ２、ＥＳＲ１、ＦＢＬＮ１、ＦＯＸＥ３、ＧＰ５、ＦＲＳＰ、ＨＨＥＸ、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８。ＩＲＸ１、ＫＩＴ、ＬＢＸ１、ＬＨＸ２、ＮＫＸ２－１、ＮＫＸ２－２、ＮＫＸ２－５、ＰＨＯＸＲＡ、ＰＯＵ３Ｆ３、ＲＨＣＧ、ＳＩＸ６、ＴＢＸ３、ＴＭＥＭ１０６、ＶＡＸ１、およびＷＮＴ２が挙げられる。
膵癌マーカーのメチル化
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、最も致命的な癌種のうちの１つである。この形態の癌は、現在利用可能な初期診断試験がないため診断するのが困難であり、これは、診断が、疾患が既に進行した状態で起こることを意味する（診断された事例の７５％を超える例がステージＩＩＩ／ＩＶの疾患である）。これは、高い死亡率の記録をもたらしている。ＰＤＡＣの初期の発生および／または進行を捕らえることができる信頼性のあるバイオマーカーの欠如が原因で、初期診断は困難と証明されている。現在、ＰＤＡＣを有する患者の予後的監視のための、唯一のＦＤＡ認可されたバイオマーカーは、炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９またはシアリル化ルイス抗原）である。この抗原は、疾患の検出について低い感度および特異性を示す。したがって、その使用は、他の循環バイオマーカー組み合わせて使用しない限りは、診断目的には勧められない。
遺伝子がメチル化されている／されていない、前立腺癌遺伝子などのメチル化
前立腺癌は、最も頻繁に診断される非皮膚悪性腫瘍であり、西洋の工業先進国における男性の癌関連の死の主な原因である。良性と癌性の前立腺組織の間に多数のＤＮＡメチル化の変化が観察され、変化はしばしば初期および反復性であり、これは潜在的な機能的役割を示唆している。複数の全ゲノム研究によって、いくつかの遺伝子および遺伝子ファミリーが前立腺癌において反復的に過剰メチル化されていることが報告されている。この遺伝子および遺伝子ファミリーとしては、それだけには限定されないが、ＧＳＴＰ１、ＭＧＭＴ、ＡＲ、ＥＲ、ＶＨＬ、ＲＢ１、ＡＰＣ、ＤＡＰＫ、ＣＤ４４、ＡＯＸ１、ＡＰＣ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＨＯＸＤ３、ＰＴＧＳ２、ＲＡＲＢ、ＷＴ１、ＺＮＦ１５４、Ｃ２０ｏｒｆ１０３、ＥＦＳ、ＨＯＸＣ１１、ＬＨＸ９、ＲＵＮＸ３、ＴＢＸ１５、ＢＡＲＨＬ２、ＢＤＮＦ、ＣＣＤＣ８、ＣＹＰ２７Ａ１、ＤＬＸ１、ＥＮ２、ＥＳＲ１、ＦＢＬＮ１、ＦＯＸＥ３、ＧＰ５、ＦＲＳＰ、ＨＨＥＸ、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８。ＩＲＸ１、ＫＩＴ、ＬＢＸ１、ＬＨＸ２、ＮＫＸ２－１、ＮＫＸ２－２、ＮＫＸ２－５、ＰＨＯＸＲＡ、ＰＯＵ３Ｆ３、ＲＨＣＧ、ＳＩＸ６、ＴＢＸ３、ＴＭＥＭ１０６、ＶＡＸ１、およびＷＮＴ２が挙げられる。
膵癌マーカーのメチル化
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、最も致命的な癌種のうちの１つである。この形態の癌は、現在利用可能な初期診断試験がないため診断するのが困難であり、これは、診断が、疾患が既に進行した状態で起こることを意味する（診断された事例の７５％を超える例がステージＩＩＩ／ＩＶの疾患である）。これは、高い死亡率の記録をもたらしている。ＰＤＡＣの初期の発生および／または進行を捕らえることができる信頼性のあるバイオマーカーの欠如が原因で、初期診断は困難と証明されている。現在、ＰＤＡＣを有する患者の予後的監視のための、唯一のＦＤＡ認可されたバイオマーカーは、炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９またはシアリル化ルイス抗原）である。この抗原は、疾患の検出について低い感度および特異性を示す。したがって、その使用は、他の循環バイオマーカー組み合わせて使用しない限りは、診断目的には勧められない。
【0401】
最近の研究により、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のメチル化分析が、診断的潜在性を有するバイオマーカーを発見するための有望な非浸潤性手法を表すことが示されている。ｃｆＤＮＡメチル化を、新生物発生前の病変または慢性膵炎（ＣＰ）における疾患特異的シグネチャの同定に利用することが可能であり得る。ＣＰはしばしばＰＤＡＣに先行するため、所定遺伝子組の動的ＤＮＡメチル化パターンが疾患の進行の根底にあり得る。導管細胞マーカーであるＣＵＸ２は、ＰＤＡＣにおけるシグナルの増加を示しており、導管およびエイシング（ａｃｉｎｇ）細胞マーカーであるＲＥＧ１Ａは、慢性膵炎における漸増するシグナルを示している。バイオマーカーＡＤＡＭＴＳ１およびＢＮＣ１は、原発性ＰＤＡＣおよび新生物発生前の膵臓上皮内新形成（ＰＩＮ）において高いメチル化頻度を有することが見られている（ＡＤＡＭＴＳ１およびＢＮＣ１についてそれぞれ２５％および７０％）。ＡＤＡＭＴＳ１およびＢＮＣ１の合わせたｃｆＤＮＡメチル化を、膵癌の初期診断（すなわちステージＩおよびＩＩ）に利用し得る。潜在的なバイオマーカーのリストを以下に示す。
【0402】
【表3】
【0403】
ＫＲＡＳ検出
ＫＲＡＳ遺伝子は細胞増殖を制御し、これが突然変異した場合、この負のシグナル伝達が破壊され、細胞は連続的に増殖することができ、しばしば癌へと発達する。単一のアミノ酸の置換、特に単一のヌクレオチドの置換が、様々な癌、すなわち、肺腺癌、粘液性腺腫、膵臓腺管癌、および結腸直腸癌に関連づけられる活性化突然変異の原因である。ＫＲＡＳ突然変異は、たとえば肺癌において予後的バイオマーカーとして使用されている。
ＫＲＡＳ遺伝子は細胞増殖を制御し、これが突然変異した場合、この負のシグナル伝達が破壊され、細胞は連続的に増殖することができ、しばしば癌へと発達する。単一のアミノ酸の置換、特に単一のヌクレオチドの置換が、様々な癌、すなわち、肺腺癌、粘液性腺腫、膵臓腺管癌、および結腸直腸癌に関連づけられる活性化突然変異の原因である。ＫＲＡＳ突然変異は、たとえば肺癌において予後的バイオマーカーとして使用されている。
【0404】
ＫＲＡＳ中のドライバー突然変異は、２０％までのヒト癌と関連づけられており、標的化治療がこの突然変異およびその関連する疾患に対して開発中であり、そのような治療の一部の非限定的なリストは、以下の表中に見ることができる。
【0405】
【表4】
【0406】
ＫＲＡＳ突然変異の存在は、ＥＧＦＲ阻害剤パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）およびセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）に対して非常に乏しい応答を反映することが見出されている。ＫＲＡＳをコードしている遺伝子中の活性化突然変異は結腸直腸癌の３０％～５０％で起こり、研究により、その腫瘍がＫＲＡＳ遺伝子のこの突然変異したバージョンを発現する患者は、パニツムマブおよびセツキシマブに応答しないことが示されている。野生型ＫＲＡＳ遺伝子の存在は、患者がこれらの薬物に応答することの保証ではないが、研究により、セツキシマブが、野生型ＫＲＡＳ腫瘍を有する転移性結腸直腸癌患者において有意な有効性を有することが示されている。ＥＧＦＲ拮抗剤エルロチニブまたはゲフィチニブについて、ＫＲＡＳ突然変異を保有しない患者における６０％の応答率と比較して、ＫＲＡＳ突然変異（野生型ＥＧＦＲ）について陽性である肺癌患者は５％以下と推定される応答率を有する。
【0407】
結腸直腸癌におけるセツキシマブ治療（抗ＥＧＦＲ治療）に対する獲得耐性の頻繁な駆動因子である、ＫＲＡＳ突然変異（活性化または過剰発現）の出現の早期検出は、遅延または逆方向耐性に対する処置の改変（たとえば、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ［ＭＥＫ］阻害剤の早期開始）を可能にし、したがって、本発明の方法が患者のＫＲＡＳ状態の素早く安価な検出を可能にすることは、有利である。
【0408】
突然変異の非限定的なリストは、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ａ５９Ｔ／Ｅ／Ｇ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｒ／Ｌ、Ｋ１１７Ｎ、およびＡ１４６Ｐ／Ｔ／Ｖである。
【0409】
突然変異のさらなる非限定的なリストを以下の表に示す。
【0410】
【表5】
【0411】
ＢＲＡＦ検出
ＢＲＡＦは、細胞成長の指示に関与しているシグナルを細胞内に送ることに関与している、Ｂ－Ｒａｆと呼ばれるタンパク質をコードしているヒト遺伝子である。これは、一部のヒト癌において突然変異していることが示されている。Ｂ－Ｒａｆは、成長シグナル伝達プロテインキナーゼのＲａｆキナーゼファミリーのメンバーであり、数ある中でとりわけ細胞分裂に影響を与える、ＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫシグナル伝達経路の制御において役割を果たす。
ＢＲＡＦは、細胞成長の指示に関与しているシグナルを細胞内に送ることに関与している、Ｂ－Ｒａｆと呼ばれるタンパク質をコードしているヒト遺伝子である。これは、一部のヒト癌において突然変異していることが示されている。Ｂ－Ｒａｆは、成長シグナル伝達プロテインキナーゼのＲａｆキナーゼファミリーのメンバーであり、数ある中でとりわけ細胞分裂に影響を与える、ＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫシグナル伝達経路の制御において役割を果たす。
【0412】
特定の他の遺伝性のＢＲＡＦ突然変異が先天性欠損症を引き起こす。
ヒト癌に関連づけられている、３０個を超えるＢＲＡＦ遺伝子の突然変異が同定されている。９０％の事例では、ヌクレオチド１７９９でチミンがアデニンで置換されている。これは、ヒト癌において見出される活性化セグメント中のコドン６００でバリン（Ｖ）がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されることをもたらす（ここではＶ６００Ｅと呼ぶ）。この突然変異は、
－ 結腸直腸癌
－ 黒色腫
－ 乳頭甲状腺癌
－ 非小細胞肺癌
－ エナメル上皮腫
において広く観察されている。
ヒト癌に関連づけられている、３０個を超えるＢＲＡＦ遺伝子の突然変異が同定されている。９０％の事例では、ヌクレオチド１７９９でチミンがアデニンで置換されている。これは、ヒト癌において見出される活性化セグメント中のコドン６００でバリン（Ｖ）がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されることをもたらす（ここではＶ６００Ｅと呼ぶ）。この突然変異は、
－ 結腸直腸癌
－ 黒色腫
－ 乳頭甲状腺癌
－ 非小細胞肺癌
－ エナメル上皮腫
において広く観察されている。
【0413】
見出された他の突然変異の非限定的なリストは、Ｒ４６１Ｉ、Ｉ４６２Ｓ、Ｇ４６３Ｅ、Ｇ４６３Ｖ、Ｇ４６５Ａ、Ｇ４６５Ｅ、Ｇ４６５Ｖ、Ｇ４６８Ａ、Ｇ４６８Ｅ、Ｎ５８０Ｓ、Ｅ５８５Ｋ、Ｄ５９３Ｖ、Ｆ５９４Ｌ、Ｇ５９５Ｒ、Ｌ５９６Ｖ、Ｔ５９８Ｉ、Ｖ５９９Ｄ、Ｖ５９９Ｅ、Ｖ５９９Ｋ、Ｖ５９９Ｒ、Ｖ６００Ｋ、およびＡ７２７Ｖである。
【0414】
ＢＲＡＦ突然変異によって駆動される癌を処置する薬物が開発されている。ベムラフェニブおよびダブラフェニブは、後期黒色腫の処置のためにＦＤＡによって認可されている。以前の最良の化学療法剤ダカルバジンの７～１２％と比較して、ベムラフェニブ（ｖｕｍｅｒａｆｅｎｉｂ）を用いた処置に対する応答率は転移性黒色腫について５３％であった。
ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２検出
ヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）は、ＣＤ３４０（表面抗原分類３４０）、原癌遺伝子Ｎｅｕ、Ｅｒｂｂ２（げっ歯動物）、またはＥＲＢＢ２（ヒト）としても知られ、ＥＲＢＢ２遺伝子によってコードされているタンパク質である。この癌遺伝子の増幅または過剰発現は、侵襲性の乳癌の進行において重要な役割を果たす。ＥＲＢＢ２遺伝子の過剰発現はまた、卵巣、胃、肺腺癌、および侵襲性形態の子宮癌、ならびに３０％の唾液腺管癌において起こることも知られている。過剰発現の非存在において受容体のリガンド非依存的発射を引き起こす構造的変更も同定されている。
ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２検出
ヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）は、ＣＤ３４０（表面抗原分類３４０）、原癌遺伝子Ｎｅｕ、Ｅｒｂｂ２（げっ歯動物）、またはＥＲＢＢ２（ヒト）としても知られ、ＥＲＢＢ２遺伝子によってコードされているタンパク質である。この癌遺伝子の増幅または過剰発現は、侵襲性の乳癌の進行において重要な役割を果たす。ＥＲＢＢ２遺伝子の過剰発現はまた、卵巣、胃、肺腺癌、および侵襲性形態の子宮癌、ならびに３０％の唾液腺管癌において起こることも知られている。過剰発現の非存在において受容体のリガンド非依存的発射を引き起こす構造的変更も同定されている。
【0415】
数々の標的化治療がこの突然変異およびその関連する疾患に対して認可され、開発中であり、そのような治療の一部の非限定的なリストは、以下の表中に見ることができる。
【0416】
【表6】
【0417】
ＨＥＲ２試験は、予後診断を評価し、処置に対する応答をモニタリングし、標的化治療（トラスツズマブなど）の適合性を決定するために、乳癌患者においてルーチン的に行う。トラスツズマブは高価であり、重篤な副作用（心毒性）に関連づけられているため、ＨＥＲ２＋患者のみがそれを受けるように選択することが重要であり、したがって、本発明の方法が患者のＨＥＲ２状態の素早く安価な検出を可能にすることは、有利である。
【0418】
一実施形態では、本発明の方法を使用してＥＲＢＢ２エクソン２０挿入突然変異の存在または非存在を検出する。
ＥＲＢＢ２突然変異のさらなる非限定的なリストを以下の表に示す。
ＥＲＢＢ２突然変異のさらなる非限定的なリストを以下の表に示す。
【0419】
【表7】
【0420】
ＥＭＬ４－ＡＬＫ検出
ＥＭＬ４－ＡＬＫは、棘皮動物微小管関連タンパク質様４（ＥＭＬ４）遺伝子と未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）遺伝子との異常な遺伝子融合である。この遺伝子融合はタンパク質ＥＭＬ４－ＡＬＫの生成をもたらし、これは癌細胞の悪性挙動を促進および維持すると考えられている。ＥＭＬ４－ＡＬＫ陽性肺癌は、その細胞がこの突然変異を含有する原発性悪性肺腫瘍である。
ＥＭＬ４－ＡＬＫは、棘皮動物微小管関連タンパク質様４（ＥＭＬ４）遺伝子と未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）遺伝子との異常な遺伝子融合である。この遺伝子融合はタンパク質ＥＭＬ４－ＡＬＫの生成をもたらし、これは癌細胞の悪性挙動を促進および維持すると考えられている。ＥＭＬ４－ＡＬＫ陽性肺癌は、その細胞がこの突然変異を含有する原発性悪性肺腫瘍である。
【0421】
数々の標的化治療がこの突然変異およびその関連する疾患に対して認可され、開発中であり、そのような治療の一部の非限定的なリストは、以下の表中に見ることができる。
【0422】
【表8】
【0423】
ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子融合は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のおよそ５％の原因であり、毎年米国で約９，０００件および世界中で約４５，０００件の新規事例が存在する。
ＥＭＬ４－ＡＬＫの数々の変異体が存在し、すべての変異体が、形質転換活性に必要なＥＭＬ４ Ｎ末端部分中およびＡＬＫエクソン２０のキナーゼドメイン中に、必須のコイルドコイルドメインを有する。ＥＭＬ４のエクソン１３とＡＬＫのエクソン２０との融合（変異体１：Ｖ１）、ＥＭＬ４のエクソン２０とＡＬＫのエクソン２０との融合（Ｖ２）、およびＥＭＬ４のエクソン６とＡＬＫのエクソン２０との融合（Ｖ３）が、より一般的な変異体の一部である。これらの様々な変異体の臨床的意義は、最近になってやっと明らかになっている。
ＥＭＬ４－ＡＬＫの数々の変異体が存在し、すべての変異体が、形質転換活性に必要なＥＭＬ４ Ｎ末端部分中およびＡＬＫエクソン２０のキナーゼドメイン中に、必須のコイルドコイルドメインを有する。ＥＭＬ４のエクソン１３とＡＬＫのエクソン２０との融合（変異体１：Ｖ１）、ＥＭＬ４のエクソン２０とＡＬＫのエクソン２０との融合（Ｖ２）、およびＥＭＬ４のエクソン６とＡＬＫのエクソン２０との融合（Ｖ３）が、より一般的な変異体の一部である。これらの様々な変異体の臨床的意義は、最近になってやっと明らかになっている。
【0424】
Ｖ３は、化学療法および放射線療法などの非チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）処置の後に、より短い無進行生存（ＰＦＳ）を有する可能性が高い患者の選択に適切なマーカーとして出現した。ＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ１およびＶ２と比較して、Ｖ３が第一および第二世代処置ラインを受ける患者のより短いＰＦＳおよびより悪い全生存（ＯＳ）に関連しているというさらなる証拠が存在する。
【0425】
また、Ｖ３陽性患者が、耐性突然変異の発生を通じて発生し、野生型Ｖ３のより高いＩＣ５０が原因の不完全な腫瘍細胞抑制によって促進される可能性が高い、第１および第２の処置ラインに対する耐性を発生することも見出された。不都合のＶ３の検出を使用して、より侵襲性の監視および処置戦略を要する患者を選択することができる。Ｖ３を有する患者に第三世代ロルラチニブを投与することは、Ｖ１を有するものを超える、より長いＰＦＳを与える場合があり、したがって、本発明の方法が患者が有し得る変異体の素早く安価な検出を可能にすることは、有利であると考えられる。
【0426】
本発明の方法はさらに、それだけには限定されないが、Ｇ１２０２Ｒ、Ｇ１２６９Ａ、Ｅ１２１０Ｋ、Ｄ１２０３、Ｓ１２０６Ｃ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｆ１１７４Ｃ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｉ１１７１Ｎ／Ｓ、Ｖ１１８０Ｌ、Ｔ１１５１Ｋ、およびＣ１１５６Ｙなどの耐性突然変異の検出を可能にする。
【0427】
たとえば、Ｇ１２０２Ｒは、薬物結合との干渉を引き起こし、第一および第二世代のＡＬＫ阻害剤に対する高レベルの耐性を与える、溶媒先端突然変異である。したがって、本発明の方法が、この突然変異を保有し得る患者の同定を可能にし、第一または第二ではなく第三世代処置での処置開始から恩恵を受けることが有利である。
【0428】
ＥＭＬ４－ＡＬＫ突然変異のさらなる非限定的なリストを以下の表に示す。
【0429】
【表9】
【0430】
ＥＧＦＲ検出
癌遺伝子としての表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の同定は、肺癌のためのゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ブリガチニブ、およびイコチニブ、ならびに結腸癌のためのセツキシマブなどの標的化治療の開発をもたらした。しかし、多くの人がこれらの治療に対して耐性を生じる。２つの主な耐性源は、Ｔ７９０Ｍ突然変異およびＭＥＴ癌遺伝子である。
癌遺伝子としての表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の同定は、肺癌のためのゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ブリガチニブ、およびイコチニブ、ならびに結腸癌のためのセツキシマブなどの標的化治療の開発をもたらした。しかし、多くの人がこれらの治療に対して耐性を生じる。２つの主な耐性源は、Ｔ７９０Ｍ突然変異およびＭＥＴ癌遺伝子である。
【0431】
ＥＧＦＲ突然変異はＥＧＦＲエクソン１８～２１中に起こり、エクソン１８、１９、および２１中の突然変異は、ＥＧＦＲ－ＴＫＩ（チロシンキナーゼ阻害剤）を用いた処置の適合性を示す。エクソン２０中の突然変異（いくつかの突然変異を例外とする）は、腫瘍がＥＧＦＲ－ＴＫＩ耐性であり、ＥＧＦＲ－ＴＫＩを用いた処置に適切でないことを示す。
【0432】
２つの最も一般的なＥＧＦＲ突然変異は、エクソン１９の短いインフレーム欠失およびエクソン２１中のヌクレオチド２５７３での点突然変異（ＣＴＧからＣＧＧ）であり、コドン８５８でのロイシンのアルギニンによる置換（Ｌ８５８Ｒ）をもたらす。これら２つの突然変異は一緒になって、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）におけるすべてのＥＧＦＲ突然変異の約９０％を占める。ＮＳＣＬＣを有する患者におけるこれらの突然変異のスクリーニングを使用して、どの患者がＴＫＩに応答するかを予測することができる。
【0433】
したがって、本発明の方法が、これらの突然変異を保有し、ＴＫＩでの処置開始から恩恵を受け得る患者の同定を可能にすることが、有利である。当業者には、本発明の方法がＥＧＦＲ突然変異の範囲の同定を可能にすることが理解されよう。そのような突然変異の網羅的でないリストは、Ｇ７１９Ｘ、Ｅｘ１９Ｄｅｌ、Ｓ７６８Ｉ、Ｅｘ２０Ｉｎｓ、およびＬ８６１Ｑである。
【0434】
突然変異のさらなる非限定的なリストを以下の表に示す。
【0435】
【表10-1】
【0436】
【表10-2】
【0437】
ＲＯＳ１
ＲＯＳ１は、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）タンパク質と構造的類似性を有する受容体チロシンキナーゼ（遺伝子ＲＯＳ１によってコードされている）であり、ｃ－ｒｏｓ癌遺伝子によってコードされている。
ＲＯＳ１は、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）タンパク質と構造的類似性を有する受容体チロシンキナーゼ（遺伝子ＲＯＳ１によってコードされている）であり、ｃ－ｒｏｓ癌遺伝子によってコードされている。
【0438】
ＲＯＳ１突然変異の非限定的なリストを以下の表に示す。
【0439】
【表11】
【0440】
ＲＥＴ原癌遺伝子
ＲＥＴ原癌遺伝子は、細胞外シグナル伝達分子のグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーのメンバーのための受容体チロシンキナーゼをコードしている。
ＲＥＴ原癌遺伝子は、細胞外シグナル伝達分子のグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーのメンバーのための受容体チロシンキナーゼをコードしている。
【0441】
ＲＥＴ突然変異の非限定的なリストを以下の表に示す。
【0442】
【表12】
【0443】
ＭＥＴエクソン１４
ＭＥＴエクソン１４スキッピングはＮＳＣＬＣにおいておよそ５％の頻度で起こり、扁平および腺癌の組織学のどちらにおいても見られる。
ＭＥＴエクソン１４スキッピングはＮＳＣＬＣにおいておよそ５％の頻度で起こり、扁平および腺癌の組織学のどちらにおいても見られる。
【0444】
ＭＥＴ突然変異の非限定的なリストを以下の表に示す。
【0445】
【表13】
【0446】
ＮＴＲＫ原癌遺伝子
ＮＴＲＫ遺伝子融合はＴＲＫ融合タンパク質と呼ばれる異常タンパク質をもたらし、これは癌細胞が成長することを引き起こし得る。ＮＴＲＫ遺伝子融合は、脳、頭頸部、甲状腺、軟組織、肺、および結腸の癌を含めた一部の種類の癌において見つけ得る。神経栄養性チロシン受容体キナーゼ遺伝子融合とも呼ばれる。
ＮＴＲＫ遺伝子融合はＴＲＫ融合タンパク質と呼ばれる異常タンパク質をもたらし、これは癌細胞が成長することを引き起こし得る。ＮＴＲＫ遺伝子融合は、脳、頭頸部、甲状腺、軟組織、肺、および結腸の癌を含めた一部の種類の癌において見つけ得る。神経栄養性チロシン受容体キナーゼ遺伝子融合とも呼ばれる。
【0447】
ＮＴＲＫ突然変異の非限定的なリストを以下の表に示す。
【0448】
【表14】
【0449】
パネル
本発明の一実施形態では、それぞれのＡ０が標的突然変異と相補的である、複数のプローブ分子（Ａ０）を含むパネルが提供される。突然変異は、以前に記載したもしくは続いて記載する、または知られている任意の突然変異から選択され得る。したがって、当業者には、本発明の範囲内には、以前に記載したもしくは続いて記載する、または知られている原癌遺伝子または癌遺伝子のうちの任意のものに対する１つまたは複数の突然変異の検出に有用であり得るパネルが含まれることが理解されよう。
本発明の一実施形態では、それぞれのＡ０が標的突然変異と相補的である、複数のプローブ分子（Ａ０）を含むパネルが提供される。突然変異は、以前に記載したもしくは続いて記載する、または知られている任意の突然変異から選択され得る。したがって、当業者には、本発明の範囲内には、以前に記載したもしくは続いて記載する、または知られている原癌遺伝子または癌遺伝子のうちの任意のものに対する１つまたは複数の突然変異の検出に有用であり得るパネルが含まれることが理解されよう。
【0450】
一実施形態では、パネルは、それぞれが特異的標的突然変異と相補的な、５～５００個の個々のプローブ分子を含む。一実施形態では、パネルは、それぞれが特異的標的突然変異と相補的な、５～４００個の個々のプローブ分子を含む。一実施形態では、パネルは、それぞれが特異的標的突然変異と相補的な、５～３００個の個々のプローブ分子を含む。一実施形態では、パネルは、それぞれが特異的標的突然変異と相補的な、５～２００個の個々のプローブ分子を含む。一実施形態では、パネルは、それぞれが特異的標的突然変異と相補的な、５～１００個の個々のプローブ分子を含む。一実施形態では、パネルは、それぞれが特異的標的突然変異と相補的な、５～５０個の個々のプローブ分子を含む。
【0451】
一実施形態では、同じ突然変異に特異的な複数のプローブ分子が存在し得る。一実施形態では、パネルのそれぞれの突然変異に対して特異的な１つのみのプローブ分子が存在し得る。
【0452】
一実施形態では、複数のプローブ分子を含み、１つまたは複数のプローブがＥＧＦＲ突然変異と相補的である、１つまたは複数のプローブがＫＲＡＳ突然変異と相補的である、１つまたは複数のプローブがＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２突然変異と相補的である、１つまたは複数のプローブがＥＭＬ４－ＡＬＫ突然変異と相補的である、１つまたは複数のプローブがＲＯＳ１突然変異と相補的である、１つまたは複数のプローブがＲＥＴ突然変異と相補的である、および１つまたは複数のプローブがＭＥＴ突然変異と相補的である、パネルが提供される。
【0453】
一実施形態では、複数のプローブ分子を含み、１つまたは複数のプローブがＥＧＦＲ突然変異と相補的であり得る、１つまたは複数のプローブがＫＲＡＳ突然変異と相補的であり得る、１つまたは複数のプローブがＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２突然変異と相補的であり得る、１つまたは複数のプローブがＥＭＬ４－ＡＬＫ突然変異と相補的であり得る、１つまたは複数のプローブがＲＯＳ１突然変異と相補的であり得る、１つまたは複数のプローブがＲＥＴ突然変異と相補的であり得る、および１つまたは複数のプローブがＭＥＴ突然変異と相補的であり得る、パネルが提供される。
【0454】
一実施形態では、１つまたは複数のＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２、ＥＭＬ４－ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＭＥＴ突然変異に選択的なプローブのパネルが提供される。
【0455】
一実施形態では、ＥＧＦＲ突然変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
一実施形態では、ＫＲＡＳ突然変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
一実施形態では、ＢＲＡＦ突然変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
一実施形態では、ＫＲＡＳ突然変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
一実施形態では、ＢＲＡＦ突然変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
【0456】
一実施形態では、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２突然変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
一実施形態では、ＥＭＬ４－ＡＬＫ突然変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
一実施形態では、ＥＭＬ４－ＡＬＫ突然変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
【0457】
一実施形態では、ＲＯＳ１突然変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
一実施形態では、ＲＥＴ突然変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
一実施形態では、ＮＴＲＫ突然変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
一実施形態では、ＲＥＴ突然変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
一実施形態では、ＮＴＲＫ突然変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
【0458】
一実施形態では、ＲＯＳ１突然変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
一実施形態では、ＭＥＴエクソン１４突然変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
一実施形態では、ＭＥＴエクソン１４突然変異に選択的なプローブ分子のパネルが提供される。
【0459】
一実施形態では、１つまたは複数のコード配列（ＣＤＳ）に選択的な複数のプローブ分子を含むパネルが提供される。
一実施形態では、以前に記載したパネルのうちの１つまたは複数を使用した、１つまたは複数の突然変異を検出する方法が提供される。
一実施形態では、以前に記載したパネルのうちの１つまたは複数を使用した、１つまたは複数の突然変異を検出する方法が提供される。
【0460】
一実施形態では、以前に記載したパネルのうちの１つまたは複数を使用した、１つもしくは複数の突然変異の存在もしくは非存在を検出する方法が提供される。
一実施形態では、以前にまたは続いて記載したものであり得るパネルを、以前にまたは続いて記載したものであり得る１つまたは複数の試薬と組み合わせて含むキットが提供される。
一実施形態では、以前にまたは続いて記載したものであり得るパネルを、以前にまたは続いて記載したものであり得る１つまたは複数の試薬と組み合わせて含むキットが提供される。
【0461】
当業者には、Ａ０を開示するキットの実施形態は、その範囲内に、複数のＡ０を含むパネルが存在する実施形態を含むことが理解されよう。
当業者には、本出願の開示が、捕捉オリゴヌクレオチドＢ０を含むパネルの実施形態をさらに包含することが理解されよう。これは、Ａ０およびＢ０が同じオリゴヌクレオチドＣ０の領域である実施形態を含む。
当業者には、本出願の開示が、捕捉オリゴヌクレオチドＢ０を含むパネルの実施形態をさらに包含することが理解されよう。これは、Ａ０およびＢ０が同じオリゴヌクレオチドＣ０の領域である実施形態を含む。
【0462】
一実施形態では、メチル化検出パネルが提供される。
一実施形態では、メチル化検出キットが提供される。
コンパニオン診断
本発明の方法は、適切な治療の選択の指導を助けるために使用し得る試料中の特定の遺伝子マーカーを検出するために、使用することができる。これらのマーカーは、腫瘍特異的な突然変異であってよい、または野生型ゲノム配列であってよく、組織、血液、または任意の他の種類の患者試料を使用して検出し得る。マーカーは後成的マーカーであり得る。
耐性のモニタリング
疾患の処置中における患者試料の繰り返し試験は、治療に対する発生した耐性の早期検出を可能にし得る。この一例として、応用は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）においてあり、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤（たとえば、ゲフィチニブ、エルロチニブ）をファーストライン処置として一般的に使用する。処置中に、腫瘍はしばしばＥＧＦＲ遺伝子中に突然変異を発生することができ（たとえば、Ｔ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓ）、これが薬物に対する耐性を与える。これらの突然変異の早期検出が、患者を代替治療（たとえばＴａｇｒｉｓｓｏ）へと移行させることを可能にし得る。患者のＤＮＡへの後成的変化が耐性の発生を示す場合がある。
一実施形態では、メチル化検出キットが提供される。
コンパニオン診断
本発明の方法は、適切な治療の選択の指導を助けるために使用し得る試料中の特定の遺伝子マーカーを検出するために、使用することができる。これらのマーカーは、腫瘍特異的な突然変異であってよい、または野生型ゲノム配列であってよく、組織、血液、または任意の他の種類の患者試料を使用して検出し得る。マーカーは後成的マーカーであり得る。
耐性のモニタリング
疾患の処置中における患者試料の繰り返し試験は、治療に対する発生した耐性の早期検出を可能にし得る。この一例として、応用は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）においてあり、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤（たとえば、ゲフィチニブ、エルロチニブ）をファーストライン処置として一般的に使用する。処置中に、腫瘍はしばしばＥＧＦＲ遺伝子中に突然変異を発生することができ（たとえば、Ｔ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓ）、これが薬物に対する耐性を与える。これらの突然変異の早期検出が、患者を代替治療（たとえばＴａｇｒｉｓｓｏ）へと移行させることを可能にし得る。患者のＤＮＡへの後成的変化が耐性の発生を示す場合がある。
【0463】
典型的には、耐性の発生についてモニタリングしている患者は、繰り返し組織生検を実施するには病気が重すぎる場合がある。また、繰り返し組織生検は、高価、浸潤性、かつ関連するリスクを抱える場合もある。血液から試験することが好ましいが、妥当な採血試料中に存在する目的の突然変異が非常に低いコピー数である場合がある。したがって、モニタリングは、定期的に行うことができるように方法の実施が単純かつ対費用効果が高い、本発明の方法を使用した血液試料からの高感度の試験を要する。
再発のモニタリング
本応用例では、処置の後に疾患がないと宣言された患者を、疾患の再発を検出するために経時的にモニタリングし得る。これは非浸潤的に行う必要があり、血液試料からの標的配列の高感度の検出を要する。本発明の方法を使用することによって、定期的に行うことができる単純かつ低価格な方法が提供される。標的とする配列は、目的の疾患において共通であることが知られている一般的な突然変異であり得る、または、寛解前の腫瘍組織中における変異体の検出に基づいた、具体的な患者のために設計された標的のカスタムパネルであることができる。
微小残存病変（ＭＲＤ）のモニタリング
一部の癌では、処置後に患者中に残る残留癌細胞が存在し、これは癌および白血病における再発の主要な原因である。ＭＲＤのモニタリングおよび試験はいくつかの重要な役割を有する：処置が癌を根絶させたか、または微量が残っているかを決定すること、様々な処置の有効性を比較すること、患者の寛解状態をモニタリングすることおよび白血病の再発を検出すること、ならびにこれらのニーズを最も満たす処置を選択すること。
スクリーニング
疾患の早期検出のための集団スクリーニングは、特に癌診断学において長年の目標である。課題は二重である：多すぎない偽陰性で疾患の確信的な検出を可能にするマーカーのパネルの同定、ならびに十分な感度および十分に低い価格を有する方法の開発。本発明の方法を使用して、シーケンシングに基づく診断学よりもはるかに単純なワークフローおよび低い価格で、ＰＣＲに基づく試験よりも大きな突然変異のパネルに対処することができる。
臓器移植片拒絶
移植した臓器がレシピエントによって拒絶される場合、この臓器からのＤＮＡはレシピエントの血流内に流される。このＤＮＡの早期検出は、拒絶の早期検出を可能にするであろう。これは、ドナーに特異的なマーカーのカスタムパネルを使用して、または、ドナー中に存在し、一部がレシピエント中に存在する、集団中で共通であることが知られている変異体のパネルを使用することによって、達成することができる。臓器レシピエントの経時的なルーチン的モニタリングは、本明細書中に開示した本発明の低価格かつ単純なワークフローによって可能にすることができる。
非浸潤性出生前試験（ＮＩＰＴ）
胎児ＤＮＡが母体血中に存在することが長く知られており、ＮＩＰＴ市場は現在、突然変異を同定し、特定の染色体のコピー数を数えて胎児の異常の検出を可能にするためにシーケンシングを使用する企業ですっかり飽和している。本明細書中に開示した本発明の方法は、非常に低い対立遺伝子画分で突然変異を検出し、胎児ＤＮＡのより早期の検出を潜在的に可能にする能力を有する。所定の集団における共通の突然変異の同定は、母性もしくは胎児のＤＮＡのどちらか中に存在し得る突然変異を標的とするアッセイを開発すること、または妊娠の初期段階での異常の検出を可能にすることを可能にするであろう。
再発のモニタリング
本応用例では、処置の後に疾患がないと宣言された患者を、疾患の再発を検出するために経時的にモニタリングし得る。これは非浸潤的に行う必要があり、血液試料からの標的配列の高感度の検出を要する。本発明の方法を使用することによって、定期的に行うことができる単純かつ低価格な方法が提供される。標的とする配列は、目的の疾患において共通であることが知られている一般的な突然変異であり得る、または、寛解前の腫瘍組織中における変異体の検出に基づいた、具体的な患者のために設計された標的のカスタムパネルであることができる。
微小残存病変（ＭＲＤ）のモニタリング
一部の癌では、処置後に患者中に残る残留癌細胞が存在し、これは癌および白血病における再発の主要な原因である。ＭＲＤのモニタリングおよび試験はいくつかの重要な役割を有する：処置が癌を根絶させたか、または微量が残っているかを決定すること、様々な処置の有効性を比較すること、患者の寛解状態をモニタリングすることおよび白血病の再発を検出すること、ならびにこれらのニーズを最も満たす処置を選択すること。
スクリーニング
疾患の早期検出のための集団スクリーニングは、特に癌診断学において長年の目標である。課題は二重である：多すぎない偽陰性で疾患の確信的な検出を可能にするマーカーのパネルの同定、ならびに十分な感度および十分に低い価格を有する方法の開発。本発明の方法を使用して、シーケンシングに基づく診断学よりもはるかに単純なワークフローおよび低い価格で、ＰＣＲに基づく試験よりも大きな突然変異のパネルに対処することができる。
臓器移植片拒絶
移植した臓器がレシピエントによって拒絶される場合、この臓器からのＤＮＡはレシピエントの血流内に流される。このＤＮＡの早期検出は、拒絶の早期検出を可能にするであろう。これは、ドナーに特異的なマーカーのカスタムパネルを使用して、または、ドナー中に存在し、一部がレシピエント中に存在する、集団中で共通であることが知られている変異体のパネルを使用することによって、達成することができる。臓器レシピエントの経時的なルーチン的モニタリングは、本明細書中に開示した本発明の低価格かつ単純なワークフローによって可能にすることができる。
非浸潤性出生前試験（ＮＩＰＴ）
胎児ＤＮＡが母体血中に存在することが長く知られており、ＮＩＰＴ市場は現在、突然変異を同定し、特定の染色体のコピー数を数えて胎児の異常の検出を可能にするためにシーケンシングを使用する企業ですっかり飽和している。本明細書中に開示した本発明の方法は、非常に低い対立遺伝子画分で突然変異を検出し、胎児ＤＮＡのより早期の検出を潜在的に可能にする能力を有する。所定の集団における共通の突然変異の同定は、母性もしくは胎児のＤＮＡのどちらか中に存在し得る突然変異を標的とするアッセイを開発すること、または妊娠の初期段階での異常の検出を可能にすることを可能にするであろう。
【0464】
本発明の様々なさらなる態様および実施形態は、本開示に鑑みて当業者に明らかとなるであろう。
本明細書中で使用する場合、「および／または」とは、２つの指定した特長または成分のそれぞれの、他方を伴うまたは伴わない具体的な開示として解釈されるべきである。たとえば、「Ａおよび／またはＢ」は、それぞれが本明細書中に個々に記載されている場合と同程度に、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの具体的な開示であるとして解釈されるべきである。
本明細書中で使用する場合、「および／または」とは、２つの指定した特長または成分のそれぞれの、他方を伴うまたは伴わない具体的な開示として解釈されるべきである。たとえば、「Ａおよび／またはＢ」は、それぞれが本明細書中に個々に記載されている場合と同程度に、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの具体的な開示であるとして解釈されるべきである。
【0465】
内容によりそうでないと指示されない限りは、上に記載した特長の説明および定義は、本発明のいかなる特定の態様または実施形態に限定されず、記載されているすべての態様および実施形態に同等に適用される。
【0466】
当業者には、本発明は、いくつかの実施形態を参照して例として記載されているが、本発明は開示した実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲中に定義されている本発明の範囲から逸脱せずに、代替実施形態を構築することができることがさらに理解されよう。
【0467】
当業者には、「部分的に消化された鎖Ａ１」への言及は、標的分析物配列とハイブリダイズした場合に、３’－５’方向で、相補性の欠如が原因で鎖が解離するまで、Ａ０の進行的消化によって形成された一本鎖オリゴヌクレオチドをいい得ることが理解されよう。
【0468】
当業者には、「部分的に二本鎖の」核酸への言及は、１つまたは複数の部分が二本鎖であり、１つまたは複数の部分が一本鎖である核酸をいい得ることが理解されよう。
当業者には、「実質的に二本鎖」核酸への言及は、１つまたは複数の部分が二本鎖であり、１つまたは複数のより少ない部分が一本鎖である核酸をいい得ることが理解されよう。
当業者には、「実質的に二本鎖」核酸への言及は、１つまたは複数の部分が二本鎖であり、１つまたは複数のより少ない部分が一本鎖である核酸をいい得ることが理解されよう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】