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▶ キュー−ステート バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-14
(54)【発明の名称】ＵＢＥ３Ａアンチセンス治療剤
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240206BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240206BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240206BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240206BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20240206BHJP
A61K 31/7125 20060101ALI20240206BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240206BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240206BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20240206BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20240206BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240206BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20240206BHJP
A61K 47/55 20170101ALI20240206BHJP
A61K 47/56 20170101ALI20240206BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 130Z
C12N15/113 ZNA
A61P43/00 111
A61K48/00
A61K31/7088
A61K31/712
A61K31/7125
A61P21/00
A61P25/00
A61P25/14
A61P25/08
A61K47/64
A61K47/54
A61K47/55
A61K47/56
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023549575
(86)(22)【出願日】2022-02-17
(85)【翻訳文提出日】2023-10-04
(86)【国際出願番号】 US2022016842
(87)【国際公開番号】W WO2022178160
(87)【国際公開日】2022-08-25
(31)【優先権主張番号】63/150,188
(32)【優先日】2021-02-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516056971
【氏名又は名称】キュー－ステート バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｑ－Ｓｔａｔｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】１７９ Ｓｉｄｎｅｙ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２１３９ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】フィンク， ジェイムズ
(72)【発明者】
【氏名】ウィリアムズ， ルイス
(72)【発明者】
【氏名】リワーク， ケイトリン
(72)【発明者】
【氏名】ガーバー， デイビッド
(72)【発明者】
【氏名】ブラウン， ダンカン
(72)【発明者】
【氏名】アグラワル， スディール
(72)【発明者】
【氏名】デンプシー， グラハム ティー．
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC01
4C076CC29
4C076CC41
4C076DD69
4C076EE01
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA021
4C084ZA022
4C084ZA061
4C084ZA062
4C084ZA221
4C084ZA222
4C084ZA941
4C084ZA942
4C084ZC201
4C084ZC202
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZA06
4C086ZA22
4C086ZA94
4C086ZC20
(57)【要約】
本発明は、ＵＢＥ３Ａの過剰発現をノックダウンしＤｕｐ１５ｑ症候群と関連する状態を処置するために有用な組成物を提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＵＢＥ３Ａ転写物に相補的であり、かつインビボでハイブリダイズする短いオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)を含み得、タンパク質へのＵＢＥ３Ａ ｍＲＮＡの成功裡の翻訳を防止または阻害する。ASOは、ＲＮＡウイングが隣接した中心的ＤＮＡ部分を含む抗ＵＢＥ３Ａギャップマー－オリゴを含み、ギャップマーがＵＢＥ３Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズし、二重鎖ハイブリッドがＲＮａｓｅＨを動員し、ＵＢＥ３Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡを切断または消化し、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現を防止する。従って、ＡＳＯは、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現を防止し、本開示のＡＳＯを含む組成物での処置はＵＢＥ３Ａの過剰発現をノックダウンするために有効であり得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ユビキチンリガーゼタンパク質の発現を阻害する合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む組成物。
【請求項2】
前記タンパク質は、ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａである、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記ＡＳＯは、ＵＢＥ３Ａ遺伝子に由来する転写物中の相補的標的にハイブリダイズする、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記ＡＳＯにおける塩基の配列は、配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも８０％同一性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記ＡＳＯにおける塩基の配列は、配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも９０％同一であり、前記オリゴヌクレオチドは、ＵＢＥ３Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズし得、ＲＮａｓｅＨ媒介性切断を誘導し得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０個のＤＮＡ塩基の中心的領域に隣接する２つのウイングを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項7】
前記ＡＳＯの少なくとも１つのウイングは、改変されたＲＮＡ塩基を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
各改変されたＲＮＡ塩基は、２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡおよび２’－Ｏ－メチルＲＮＡからなる群より選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
前記ＡＳＯは、少なくとも約１５個の塩基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項10】
前記ＡＳＯは、約１５～約２５個の間の塩基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項11】
前記ＡＳＯは、複数のホスホロチオエート結合を含む骨格を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項12】
前記ＡＳＯは、スクリーニングされてヒトにおけるいずれの非標的転写物に関しても閾値マッチを満たさないように決定された塩基配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項13】
前記ＡＳＯは、非ヒト霊長類ゲノムにおける相同なセグメントに対する０個のミスマッチおよび齧歯類ゲノムにおける相同なセグメントにおいて約５個以下のミスマッチを有する塩基配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項14】
前記組成物は、配列番号１～４０、１４６、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６４、１６９、１７４、１７５、１７８、１７９、２１３、および２１４のうちの１つと少なくとも８０％同一の塩基配列を各々有する複数のＡＳＯを含み、前記ＡＳＯの各々は、ＲＮＡウイングが隣接した中心的ＤＮＡセグメントを含むギャップマー構造を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項15】
前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも９０％マッチを有し、ホスホロチオエート連結によってのみ連結される塩基を有する塩基配列を有し、前記オリゴヌクレオチドはさらに、５’ウイングおよび３’ウイングが隣接した中心的な１２個のＤＮＡ塩基を含み、前記５’ウイングおよび前記３’ウイングは各々、４個連続した２’改変されたＲＮＡ塩基を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項16】
前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１～４０、１４６、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６４、１６９、１７４、１７５、１７８、１７９、２１３、および２１４のうちの１つとマッチする塩基配列を有し、少なくとも塩基間連結の大部分は、ホスホロチオエート連結を含み、前記オリゴヌクレオチドは、５’ウイングおよび３’ウイングが隣接した中心的な１２個のＤＮＡ塩基をさらに含み、前記５’ウイングおよび前記３’ウイングは各々、４個連続した２’－ＭＯＥ ＲＮＡ塩基を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項17】
前記ＡＳＯは、炭水化物、細胞表面レセプターリガンド、薬物物質、ホルモン、親油性基質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素、ビタミン、ウイルスタンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるメンバーに結合体化される、請求項１に記載の組成物。
【請求項18】
Ｄｕｐ１５ｑ症候群を有する被験体に、請求項１～１６のいずれか１項に記載の組成物を投与して、それによって、ＵＢＥ３Ａ遺伝子の発現をノックダウンする工程を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本開示は、神経学的障害のための処置に関する。
本開示は、神経学的障害のための処置に関する。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出され、その全体において本明細書に参考として援用される配列表を含む。そのＡＳＣＩＩフォーマットにした配列表は、２０２２年２月１７日に作成し、名称は「ＱＳＴＡ－０３６－０１ＷＯ－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ」であり、サイズは４４０４８バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出され、その全体において本明細書に参考として援用される配列表を含む。そのＡＳＣＩＩフォーマットにした配列表は、２０２２年２月１７日に作成し、名称は「ＱＳＴＡ－０３６－０１ＷＯ－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ」であり、サイズは４４０４８バイトである。
【背景技術】
【0003】
背景
ユビキチンリガーゼタンパク質（例えば、Ｅ３リガーゼＥ６関連ンタンパク質（Ｅ６ＡＰ（ＵＢＥ３Ａとしても公知））は、神経学的障害および神経発達障害に関係している。例えば、Ｅ６ＡＰは、ＵＢＥ３Ａ遺伝子によってコードされ、ＵＢＥ３Ａ遺伝子の発現は、遺伝子刷り込みを介して調節される。Ｅ６ＡＰ発現の喪失は、発話および運動発達の障害、ならびに発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）によって代表的には特徴づけられる、アンジェルマン症候群の発生をもたらす。逆に、ＵＢＥ３Ａのコピー数のバリエーション（ＣＮＶｓ）は、Ｅ６ＡＰの過剰発現および結果的に自閉スペクトラム症（ＡＳＤ）の発生に関連付けられ得る。
ユビキチンリガーゼタンパク質（例えば、Ｅ３リガーゼＥ６関連ンタンパク質（Ｅ６ＡＰ（ＵＢＥ３Ａとしても公知））は、神経学的障害および神経発達障害に関係している。例えば、Ｅ６ＡＰは、ＵＢＥ３Ａ遺伝子によってコードされ、ＵＢＥ３Ａ遺伝子の発現は、遺伝子刷り込みを介して調節される。Ｅ６ＡＰ発現の喪失は、発話および運動発達の障害、ならびに発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）によって代表的には特徴づけられる、アンジェルマン症候群の発生をもたらす。逆に、ＵＢＥ３Ａのコピー数のバリエーション（ＣＮＶｓ）は、Ｅ６ＡＰの過剰発現および結果的に自閉スペクトラム症（ＡＳＤ）の発生に関連付けられ得る。
【0004】
いくつかの臨床症状において、第１５染色体の一部は、重複している。このＤｕｐ１５ｑ症候群は、２つの形態のうちの一方、余分な二動原体同腕第１５染色体または第１５染色体における中間部重複において最も一般的に起こる。Ｄｕｐ１５ｑ症候群は、筋緊張低下、ならびに粗大運動および微細運動の遅れ、知的障害、自閉スペクトラム症（ＡＳＤ）、ならびにてんかん（点頭てんかんを含む）によって特徴づけられる。メチル化された母系１５ｑ重複のコピー数の増大がタンパク質発現の増大をもたらし、ＵＢＥ３Ａの過剰発現がＤｕｐ１５ｑにおける重篤度に関連付けられると考えられる。ここで母系アレルの数の増大は、Ｄｕｐ１５ｑ病理の主要駆動因子であると考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
要旨
本発明は、ＵＢＥ３Ａ遺伝子のＣＮＶと関連する障害を処置するための組成物を提供する。具体的には、本開示は、Ｄｕｐ１５ｑ症候群に罹患した被験体において生じる発作、筋緊張低下、運動の遅れ、知的障害、発作を示す障害、および自閉スペクトラム症（ＡＳＤ）を処置するためにＵＢＥ３Ａの過剰発現をノックダウンするために有用であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明の組成物は、ＵＢＥ３Ａ転写物に相補的であり、かつインビボでハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。上記ＡＳＯは、タンパク質へのＵＢＥ３Ａ ｍＲＮＡの翻訳を防止する。具体的には、好ましい実施形態は、ＲＮＡウイングが隣接した中心的ＤＮＡ部分を含む抗ＵＢＥ３Ａギャップマー－オリゴを含む。上記ギャップマーがＵＢＥ３Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズする場合、そのハイブリッド二重鎖は、ＲＮａｓｅＨを動員し、これは、上記ＵＢＥ３Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡを切断または消化し、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現を防止する。上記ＡＳＯは、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現を防止することから、本開示のＡＳＯを含む組成物での処置は、ＵＢＥ３Ａの過剰発現をノックダウンするために有効であり得る。よって、本開示の組成物は、Ｄｕｐ１５ｑ症候群およびその症状を書治すために有用である。
本発明は、ＵＢＥ３Ａ遺伝子のＣＮＶと関連する障害を処置するための組成物を提供する。具体的には、本開示は、Ｄｕｐ１５ｑ症候群に罹患した被験体において生じる発作、筋緊張低下、運動の遅れ、知的障害、発作を示す障害、および自閉スペクトラム症（ＡＳＤ）を処置するためにＵＢＥ３Ａの過剰発現をノックダウンするために有用であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明の組成物は、ＵＢＥ３Ａ転写物に相補的であり、かつインビボでハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。上記ＡＳＯは、タンパク質へのＵＢＥ３Ａ ｍＲＮＡの翻訳を防止する。具体的には、好ましい実施形態は、ＲＮＡウイングが隣接した中心的ＤＮＡ部分を含む抗ＵＢＥ３Ａギャップマー－オリゴを含む。上記ギャップマーがＵＢＥ３Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズする場合、そのハイブリッド二重鎖は、ＲＮａｓｅＨを動員し、これは、上記ＵＢＥ３Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡを切断または消化し、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現を防止する。上記ＡＳＯは、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現を防止することから、本開示のＡＳＯを含む組成物での処置は、ＵＢＥ３Ａの過剰発現をノックダウンするために有効であり得る。よって、本開示の組成物は、Ｄｕｐ１５ｑ症候群およびその症状を書治すために有用である。
【0006】
本開示のオリゴヌクレオチドは、ユビキチンリガーゼタンパク質の合成で使用されるＲＮＡ中のある特定の標的に結合するように設計される。そのオリゴヌクレオチドの結合は、タンパク質合成を防止し、ユビキチンリガーゼの発現をダウンレギュレートする。具体的には、本発明のオリゴヌクレオチドは、ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ上で特定された標的のうちの１つに実質的にまたは完全に相補的な配列を有する。すなわち、上記オリゴヌクレオチドは、その特定された標的に対するアンチセンスである。上記アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が、その標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、それは、２本鎖のＡＳＯ：ＲＮＡ二重鎖を形成し、この二重鎖は、その２本鎖二重鎖の一部を分解する酵素（ＲＮａｓｅ Ｈ）を動員する。そのＡＳＯ：ＲＮＡ二重鎖を分解すると、Ｅ６ＡＰ ｍＲＮＡの細胞が枯渇し、これは、その細胞によって合成されるＥ６ＡＰの量を減少させる。
【0007】
従って、Ｅ６ＡＰ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ中の特定された標的に対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドを含む組成物が患者に投与される場合、その組成物は、そうでなければ、ＵＢＥ３Ａのコピー数バリエーションまたはＤｕｐ１５ｑ症候群として公知の第１５染色体ｑ１１．２－ｑ１３．１重複症候群から生じ得るＥ６ＡＰの発現を減少させる。
【0008】
ある特定の局面において、本開示は、Ｄｕｐ１５ｑを処置するための組成物を提供する。このような組成物は、ユビキチンリガーゼタンパク質の発現を阻害する合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。好ましくは、上記タンパク質は、ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａである。上記ＡＳＯは、ＵＢＥ３Ａ遺伝子の転写物中の相補的な領域にハイブリダイズする。上記ＡＳＯにおける塩基の配列は、配列番号１～２１９のうちの１つ、好ましくは配列番号１～４０のうちの１つ、ならびにより好ましくは配列番号１４６、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６４ １６９、１７４、１７５、１７８、１７９、２１３、および２１４のうちの１つと少なくとも８０％同一性を有し得る。いくつかの実施形態において、上記ＡＳＯにおける塩基の配列は、配列番号１～２１９、１～４０、または１４６、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６４ １６９、１７４、１７５、１７８、１７９、２１３、および２１４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、または１００％同一であり、上記オリゴヌクレオチドは、ＵＢＥ３Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズし得、かつそのＲＮａｓｅ切断を誘導し得る。
【0009】
いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０個のＤＮＡ塩基、好ましくは約１２個の塩基の中心的領域に隣接する２つのＲＮＡウイングを含む。上記ＡＳＯの２つのウイングのうちの少なくとも一方は、改変されたＲＮＡ塩基を含む。各改変されたＲＮＡ塩基は、２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡおよび２’－Ｏ－メチルＲＮＡからなる群より選択され得る。上記ＡＳＯは、少なくとも約２０個の塩基、好ましくは約１５～約２５個の間の塩基を含み得る。ある特定の実施形態において、上記ＡＳＯは、複数のホスホロチオエート結合を含む骨格を有する。本明細書で提供されるＡＳＯは、１０～１２個の塩基の中心的領域および４～５個の塩基の隣接する領域を含む。
【0010】
好ましいＡＳＯは、スクリーニングされてヒトにおいていかなる非標的転写物に関しても閾値マッチを満たさないように決定された塩基配列を有する。必要に応じて、上記ＡＳＯは、非ヒト霊長類ゲノムにおける相同なセグメントと０個のミスマッチおよび齧歯類ゲノムにおける相同なセグメント中で約５個以下のミスマッチを有する塩基配列を有する。
【0011】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、複数のＡＳＯを含み、各々は、配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも約８０％同一の塩基配列を有し、ここで上記ＡＳＯの各々は、ＲＮＡウイングが隣接した中心的ＤＮＡセグメントを含むギャップマー構造を有する。ある特定の好ましい実施形態において、上記組成物は、複数のＡＳＯを含み、各々は、配列番号１～４０のうちの１つ、ならびにより好ましくは配列番号１４６、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６４、１６９、１７４、１７５、１７８、１７９、２１３、および２１４のうちの１つと少なくとも約８０％同一の塩基配列を有し、ここで上記ＡＳＯの各々は、ＲＮＡウイングが隣接した中心的ＤＮＡセグメントを含むギャップマー構造を有する。各オリゴヌクレオチドは、配列番号１～２１９（好ましくは１～４０ならびにより好ましくは１４６、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６４、１６９、１７４、１７５、１７８、１７９、２１３、および２１４）のうちの１つと少なくとも約９０％（または９５％、もしくは１００％）マッチを有し、ホスホロチオエート連結によってのみ連結された塩基を有する塩基配列を有し得、上記オリゴヌクレオチドはさらに、５’ウイングおよび３’ウイングが隣接した中心的な１０個のＤＮＡ塩基を含み、上記５’ウイングおよび上記３’ウイングは各々、５個連続した２’改変されたＲＮＡ塩基を含む。
【0012】
いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、配列番号１～２１９のうちの１つとマッチする塩基配列を有し、少なくとも塩基間連結の大部分は、ホスホロチオエート連結を含み、上記オリゴヌクレオチドはさらに、５’ウイングおよび３’ウイングが隣接した中心的な１０個のＤＮＡ塩基を含み、上記５’ウイングおよび上記３’ウイングは各々、５個連続した２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ） ２’－ＭＯＥ ＲＮＡ塩基を含む。好ましい実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、配列番号１～４０のうちの１つとマッチする塩基配列を有し、少なくとも塩基間連結の大部分は、ホスホロチオエート連結を含み、上記オリゴヌクレオチドはさらに、５’ウイングおよび３’ウイングが隣接した中心的な１０個のＤＮＡ塩基を含み、上記５’ウイングおよび上記３’ウイングは各々、５個連続した２’ ＭＯＥ ＲＮＡ塩基を含む。より好ましい実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、配列番号１４６、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６４、１６９、１７４、１７５、１７８、１７９、２１３、および２１４のうちの１つとマッチする塩基配列を有し、少なくとも塩基間連結の大部分は、ホスホロチオエート連結を含み、上記オリゴヌクレオチドはさらに、５’ウイングおよび３’ウイングが隣接した中心的な１０個のＤＮＡ塩基を含み、上記５’ウイングおよび上記３’ウイングは各々、５個連続した２’ ＭＯＥ ＲＮＡ塩基を含む。
【0013】
関連する局面において、本発明は、Ｄｕｐ１５ｑ症候群を処置するための方法であって、上記方法は、本開示の組成物のうちの１つをそれを必要とする被験体に、例えば、ＵＢＥ３Ａの過剰発現をダウンレギュレートするために送達する工程を包含する方法を提供する。本開示の治療用オリゴヌクレオチドは、改変されたＲＮＡウイングが隣接した中心的ＤＮＡセグメントを含むギャップマー構造を有し得る。このような治療用オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ塩基の中心的領域（例えば、約１０～１４個のＤＮＡ塩基の、例えば、約１２個のＤＮＡ塩基の中心的領域）に隣接する２つのウイングを含み得る。好ましくは上記オリゴヌクレオチドの少なくとも一方の末端は、改変されたＲＮＡ塩基、例えば、２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡ（「２’－ＭＯＥ」）および／もしくは２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（「２’ Ｏ－Ｍｅ」）の任意の数または任意の組み合わせを含む。さらに、本発明の組成物は、エキソン－エキソン接合部を標的化し、核ｐｒｅ－ｍＲＮＡに対して細胞質ｍＲＮＡを区別して標的とするように設計され得る。従って、本発明のＡＳＯは、スプライシング、上記組成物への特異性および多機能性の付加前、またはその後に、ＲＮＡと相互作用するように設計され得る。
【0014】
種々の実施形態において、治療用オリゴヌクレオチドは、任意の適切な経路（例えば、静脈内または髄腔内を含む）を介する送達のために製剤化された溶液またはキャリア中に提供され得る。上記オリゴヌクレオチドは、任意の適切な長さ（例えば、少なくとも約１８個の塩基、および好ましくは約１５～約２５個の間の塩基）のものであり得る。上記オリゴヌクレオチドは、その骨格中にホスホロチオエート結合を有し得る。好ましい実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、ヒトにおいて、スクリーニングされて任意の長さに関して閾値マッチを満たさないように決定された塩基配列、非コードＲＮＡまたは他のオフターゲット配列もしくは転写物を有する。上記オリゴヌクレオチドは、非ヒト霊長類ゲノムにおける相同なセグメントに対する０個のミスマッチおよび齧歯類ゲノムにおける相同なセグメントにおいて約５個以下のミスマッチを有する塩基配列を有し得る。
【0015】
上記組成物がインビトロで細胞へと送達される場合、上記細胞は、ＵＢＥ３Ａの用量依存性ノックダウンを示す。上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも約９０％マッチを有し、少なくともいくつかのホスホロチオエート連結を有する塩基配列を有するギャップマーであり得る。上記連結は、全てホスホロチオエートまたはホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の混合であり得る。上記オリゴヌクレオチドはさらに、５’ウイングおよび３’ウイングが隣接した中心的な１２個のＤＮＡ塩基を有し得、上記５’ウイングおよび上記３’ウイングは各々、４個連続した２’改変されたＲＮＡ塩基を含む。好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結によって連結された塩基、ならびに５’ウイングおよび３’ウイングが隣接した中心的ＤＮＡ塩基を有する構造を有する、配列番号１～２１９のうちの１つとマッチする塩基配列を有する。上記ウイングにおけるＲＮＡ塩基および中心的セグメントにおけるＤＮＡ塩基の数は、５－１０－５もしくは４－１２－４、または類似の適切なパターンであり得る。上記５’ウイングおよび上記３’ウイングは各々、いくつかの２’－ＭＯＥ ＲＮＡ塩基を含み得る。例えば、上記オリゴヌクレオチドは、各ウイングにおいて４個連続した２’－ＭＯＥ ＲＮＡ塩基と、中心的な１２個のＤＮＡ塩基とを有し得（「４－１２－４」構造）、中心的ＤＮＡセグメント全体にわたってホスホロチオエート連結を、ならびに上記ウイングにおいてホスホロチオエート結合およびホスホジエステル結合の混合を有する。あるいは、上記オリゴヌクレオチドは、各ウイングにおいて５個連続した２’－ＭＯＥ ＲＮＡ塩基と、中心的な１０個のＤＮＡ塩基とを有し得（「５－１０－５」構造）、上記中心的ＤＮＡセグメント全体にわたってホスホロチオエート連結を、ならびに上記ウイングにおいてホスホロチオエート結合およびホスホジエステル結合の混合を有する。上記５’および３’ウイングはまた、同じＡＳＯにおいて異なる長さのものである場合もある（例えば、「４－１１－５」または「５－１１－４」構造）。
【0016】
組み合わせ実施形態において、本発明は、複数の別個の治療用ギャップマーの複数のコピー（各々、上記の説明に従う）を適切な製剤またはキャリア中に含む組成物を提供する。
【0017】
本開示の局面は、Ｄｕｐ１５ｑ症候群を処置するための医薬の製造のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用に関する。このような実施形態において、上記ＡＳＯは、配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも約７５％同一性を、およびより好ましくは少なくとも約９０％同一性を、例えば、９５％もしくは１００％同一性を有する。好ましい実施形態は、約１５～２５個の間の塩基の長さである、好ましくは約１８～２２個の間、または約１９～２１個の間（両端を含む）であるＡＳＯを使用する。一般に、「ＡＳＯ」への言及は、実質的に同一な分子の多くのコピーを含む。よって、「ＡＳＯ」は、任意の数、例えば、その示されたＡＳＯの数十万の、または数百万のコピーであり得る。好ましい実施形態において、上記ＡＳＯは、２０個の塩基の長さであり、配列番号１～２１９のうちの１つの配列を有し、Ｄｕｐ１５ｑ症候群の処置のための医薬の製造において使用される。上記ＡＳＯは、任意の適切な形式（例えば、チューブ中で凍結乾燥されるか、またはチューブ（例えば、微量遠心チューブもしくは試験管）中で溶液の状態）において提供され得る。上記使用の好ましい実施形態は、ＵＢＥ３Ａ遺伝子の転写物を標的とする。１またはこれより多くの（例えば、２、３、４、もしくは５、またはこれより多い）ＡＳＯは、医薬の製造において使用され得る。上記１またはこれより多くのＡＳＯは、ＵＢＥ３Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにおける標的にハイブリダイズし得る。ある特定の実施形態において、上記ＡＳＯにおける塩基の配列は、配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも約９０％同一である。他の実施形態において、上記ＡＳＯは、ＲＮＡウイングが隣接した中心的ＤＮＡセグメントを有するギャップマー構造（例えば、１２個のＤＮＡ塩基の中心的領域であって、その中心的な領域の両側に４個の改変されたＲＮＡ塩基を有するもの）を有し得る。各改変されたＲＮＡ塩基は、２’－ＭＯＥであり得る。好ましくは、上記ＡＳＯの骨格は、複数のホスホロチオエート結合を有する。よって、上記ＡＳＯは、最初は、注射またはポンプによる導入に適した製剤へと混合するために適した形態にあり得る。例えば、上記ＡＳＯ（１つのＡＳＯの数千または数百万またはより多くのコピー）は、チューブ中で凍結乾燥されていてもよいし、既知の量、重量モル濃度、または濃度において溶液中にあってもよい。上記ＡＳＯは、キャリア（例えば、溶媒および／または賦形剤）が上記ＡＳＯを含む薬学的に受容可能な組成物へと溶解または希釈され得、ＩＶバッグ、シリンジ、またはポンプ中に装填され得る。上記医薬は、１より多くのＡＳＯ、例えば、２、３、４、もしくは５、またはこれより多くの任意の組み合わせを使用して作製され得る。本発明の組成物における塩基は、改変された塩基または揺らぎ塩基であり得、これは、本発明の組成物の範囲および有効性を増大させるために使用され得る。１つの例において、本発明における使用のためのＡＳＯは、メチル化塩基（例えば、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル（チミン）など）を含み得る。
【0018】
本発明の組成物は、連続的な投与に適応させるために製剤化され得る。例えば、製剤は、２回またはこれより多くの別個の時に、および必要に応じて、２またはこれより多くの異なるＡＳＯで、最適な治療濃度域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）を利用し、ＡＳＯ間の潜在的な競合を回避するために投与されるための投与量を提供し得る。さらに、本発明の組成物は、連続的に投与されようがそうでなかろうが、関わる上記ＡＳＯの組成物に応じて、１またはこれより多くの標的と相互作用し得る。例えば、ＡＳＯは、多数の標的（ｍＲＮＡ種およびｐｒｅ－ｍＲＮＡ種の中およびこれらにまたがるものの両方）との相互作用を可能にし、従って、その関連付けられた処置が１より多くの遺伝子コピーからの転写物に影響を与えることを可能にする標的化されたミスマッチを含み得る。本発明の組成物はまた、時間放出フォーマットにおいて送達され得る、および／または血清半減期を増大させるためにアジュバントを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【0041】
【0042】
【0043】
【0044】
【0045】
【0046】
【発明を実施するための形態】
【0047】
詳細な説明
図１は、Ｄｕｐ１５ｑ症候群を処置するための組成物１０１を示す。組成物１０１は、ｍＲＮＡ １１７またはｐｒｅ－ｍＲＮＡにおける標的セグメント１１５にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド１０７を含む。ＲＮＡ １１７は、ユビキチンリガーゼタンパク質（例えば、ユビキチンタンパク質リガーゼＥＳＡ）をコードする。上記標的を含むＲＮＡ １１７のセグメント１１５は、配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも約７５％相補的である。ＲＮＡ １１７のセグメント１１５へのＡＳＯ １０７のハイブリダイゼーションは、上記ｍＲＮＡをＵＢＥ３Ａタンパク質へと翻訳することを防止する。好ましくは、上記オリゴヌクレオチドにおける塩基の配列は、配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも８０％同一性、より好ましくは少なくとも約９０％同一性を有する。ある特定の実施形態において、上記オリゴヌクレオチドにおける塩基の配列は、配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも約９０％同一であり、ここで上記オリゴヌクレオチドは、ＵＢＥ３Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズして、そのＲＮａｓｅ Ｈ切断を誘導する。
図１は、Ｄｕｐ１５ｑ症候群を処置するための組成物１０１を示す。組成物１０１は、ｍＲＮＡ １１７またはｐｒｅ－ｍＲＮＡにおける標的セグメント１１５にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド１０７を含む。ＲＮＡ １１７は、ユビキチンリガーゼタンパク質（例えば、ユビキチンタンパク質リガーゼＥＳＡ）をコードする。上記標的を含むＲＮＡ １１７のセグメント１１５は、配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも約７５％相補的である。ＲＮＡ １１７のセグメント１１５へのＡＳＯ １０７のハイブリダイゼーションは、上記ｍＲＮＡをＵＢＥ３Ａタンパク質へと翻訳することを防止する。好ましくは、上記オリゴヌクレオチドにおける塩基の配列は、配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも８０％同一性、より好ましくは少なくとも約９０％同一性を有する。ある特定の実施形態において、上記オリゴヌクレオチドにおける塩基の配列は、配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも約９０％同一であり、ここで上記オリゴヌクレオチドは、ＵＢＥ３Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズして、そのＲＮａｓｅ Ｈ切断を誘導する。
【0048】
オリゴヌクレオチド１０７は、ｍＲＮＡ １１７におけるセグメント１１５にハイブリダイズする。なぜならオリゴヌクレオチド１０７は、ｍＲＮＡ １１７の標的セグメント１１５に対して実質的にまたは完全にアンチセンスだからである。その局面において、上記組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。組成物１０１は、塩基対相補性を有するＲＮＡを標的とするために結合し、上記ＡＳＯの化学構造および設計に基づいて、種々の効果を発揮するＡＳＯを含む。神経学的疾患の前臨床モデルおよびヒト臨床試験開発において一般に使用される種々の機序が、使用され得る。それらの機序は、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素の動員；エキソンを含むかまたは排除するための選択的スプライシング改変、およびその標的へのｍｉＲＮＡ結合を阻害するｍｉＲＮＡ阻害を介するＲＮＡ標的分解を含む。
【0049】
本開示の好ましい実施形態は、ＵＢＥ３Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素を動員するＡＳＯを含む。上記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、上記ＲＮＡを切断し、これは、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現をダウンレギュレートする。従って、本開示のオリゴヌクレオチド１０７は、Ｄｕｐ１５ｑ症候群の標的としてＵＢＥ３Ａ ＣＮＶに対処する。本開示は、自閉スペクトラム症（ＡＳＤ）と関連する最も一般的な遺伝的改変体のうちの１つが、第１５染色体ｑ１１．２－ｑ１３．１の重複（Ｄｕｐ１５ｑ症候群）であるということをデータが示唆する洞察を元にする。第１５染色体ｑ１１．２－ｑ１３．１領域は、刷り込みされるプラダー－ウィリ／アンジェルマン症候群決定領域（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｇｉｏｎ）（ＰＷＡＣＲ）、ならびに脳発達およびシナプス機能に極めて重要ないくつかの遺伝子（例えば、ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ）、ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｎ（ＳＮＲＰＮ）、および３種のＧＡＢＡＡレセプター遺伝子（ＧＡＢＲＢ３、ＧＡＢＲＡ５、およびＧＡＢＲＧ３）を含む。Ｄｕｐ１５ｑ症候群は、１５ｑ１１．２－１３．１の重複の２つの主なタイプ： （１）１５ｐ、および１５ｑ１１の近位領域を含む過剰染色体上に２つのさらなる母系に由来するコピーを生じる（最も一般には、その領域の４つのコピーをもたらす）同腕二動原体第１５染色体（ｉｄｉｃ（１５））、または（２）１５ｑ１１．２－ｑ１３．１領域の１つ余分のコピーが、同じ染色体アーム上で起こり、代表的には、その領域の３つのコピーを生じ、全体により軽度の表現型を有する中間部１５ｑ重複、を含む。Ｈｏｇａｒｔ， ２０１０， Ｔｈｅ ｃｏｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ｏｆ ａｕｔｉｓｍ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １５ｑ１１．２－１３， Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ ３８：１８１－９１（参考として援用される）を参照のこと。メチル化された母系１５ｑ重複の増大したコピー数は、遺伝子およびタンパク質発現において変化をもたらし、ＵＢＥ３Ａの過剰発現は、Ｄｕｐ１５ｑにおける重篤度に関連付けられ、ここで母系アレルの増大した数は、Ｄｕｐ１５ｑ病理の主な駆動因子であると考えられる。Ｓｃｏｌｅｓ， ２０１１， Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｆｏｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｍａｔｅｒｎａｌ １５ｑ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ， Ｍｏｌ Ａｕｔｉｓｍ ２：１９およびＢａｋｅｒ， ２０２０、 Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＵＢＥ３Ａ ａｎｄ ＳＮＯＲＤ１１６ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ａｕｔｉｓｍ ｉｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １５ ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ， Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １０：３６２（ともに参考として援用される）を参照のこと。そこで、ＵＢＥ３Ａ ＡＳＯを含む組成物は、Ｄｕｐ１５ｑ症候群を処置するために被験体に投与される。
【0050】
従って、本開示は、患者においてＤｕｐ１５ｑ症候群を処置するための医薬の製造のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用を提供する。この使用において、上記ＡＳＯは、配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも約７５％同一性、およびより好ましくは少なくとも９０％同一性、例えば、９５％またはこれより高い同一性を有する。好ましい実施形態は、約１５～２５個の間の塩基の長さ、好ましくは約１８～２２個の間（両端を含む）であるＡＳＯを使用する。一般に、「ＡＳＯ」への言及は、実質的に同一の分子の多くのコピーを含む。よって、「ＡＳＯ」は、規定されたＡＳＯの数十万または数百万ものコピーより多い可能性がある。好ましい実施形態において、上記ＡＳＯは、２０個の塩基の長さであり、配列番号１～２１９のうちの１つの配列を有し、Ｄｕｐ１５ｑ症候群の処置のための医薬の製造において使用される。上記ＡＳＯは、任意の適切な形式（例えば、チューブ中で凍結乾燥されるか、またはチューブ（例えば、微量遠心チューブもしくは試験管）中で溶液の状態のような）において提供され得る。上記使用の好ましい実施形態は、ＵＢＥ３Ａを標的とする。１またはこれより多くの（例えば、２、３、４、もしくは５、またはこれより多い）ＡＳＯは、医薬の製造において使用され得る。上記１またはこれより多くのＡＳＯは、ＵＢＥ３Ａ ｍＲＮＡにおける標的にハイブリダイズし得る。上記使用のある特定の実施形態において、上記ＡＳＯにおける塩基の配列は、配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも約９０％同一である。上記使用の実施形態において、ＡＳＯは、ＲＮＡウイングが隣接した中心的ＤＮＡセグメントを有するギャップマー構造（例えば、１０～１２個のＤＮＡ塩基の中心的領域であって、その中心的な領域の両側に４～５個の改変されたＲＮＡ塩基を有するもの）を有し得る。各改変されたＲＮＡ塩基は、２’－ＭＯＥ ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、または他の適切な糖であり得る。好ましくは、ＡＳＯの骨格は、複数のホスホロチオエート結合（専ら、またはホスホジエステル連結をも含むかのいずれか）を有し、例えば、その糖連結のうちの大部分または全てが、上記使用の実施形態においてホスホロチオエートであり得る。上記ＡＳＯは、最初は、注射による導入に適した製剤へと混合するために適した形態にあり得る。例えば、上記ＡＳＯ（１つのＡＳＯの数千または数百万またはこれより多くのコピー）は、チューブ中に凍結乾燥されていてもよいし、既知の量、重量モル濃度、または濃度において溶液中にあってもよい。上記ＡＳＯは、キャリア（例えば、溶媒および／または賦形剤）が上記ＡＳＯを含み、ＩＶバッグ、シリンジ、またはバイアル中に装填され得る薬学的に受容可能な組成物へと溶解または希釈され得る。上記医薬は、１より多くのＡＳＯ、例えば、２、３、４、もしくは５、またはこれより多くのものの任意の組み合わせを使用して作製され得る。
【0051】
上記使用の実施形態において記載される任意のＡＳＯは、本開示の組成物中に含まれ得る。本開示の組成物の好ましい実施形態は、１または複数の治療用オリゴヌクレオチドを含み、各々、配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも８０％同一の塩基配列を有し、ここで上記治療用オリゴヌクレオチドの各々は、改変されたＲＮＡウイングが隣接した中心的ＤＮＡセグメントを含むギャップマー構造を有し、ここで上記複数の治療用オリゴヌクレオチドは、注射のために製剤化された溶液またはキャリア中に提供される。
【0052】
図２は、ギャップマー構造を有するオリゴヌクレオチド２０７を示す。オリゴヌクレオチド２０７は、約１０～１２個のＤＮＡ塩基の中心的領域２２１に隣接する２つのウイング（第１のウイング２１５および第２のウイング２１６）を含む。好ましい実施形態において、ウイング２１５、２１６は、全てまたは主にＲＮＡ塩基であるのに対して、中心的領域２２１は、全てまたは主にＤＮＡ塩基である。好ましくは、上記ウイングは、全てＲＮＡ塩基であり（改変されているかまたは改変されていない）、上記中心的領域は全てＤＮＡ塩基である。いくつかの実施形態において、各ウイングは、５個のＲＮＡ塩基からなり、そのうちの全てまたは大部分は、改変されたＲＮＡ塩基である（例えば、ここで各改変されたＲＮＡ塩基は、２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡおよび２’－Ｏ－メチルＲＮＡからなる群より選択される）。改変されたＲＮＡ塩基は、リボース糖の２’ヒドロキシル基上に置換を含み得る。２’－Ｏ－メトキシエチル（「２’－ＭＯＥ」）改変糖は、ＲＮＡ塩基中に含まれ得る。オリゴヌクレオチド２０７は、好ましくは、少なくとも約１５個の塩基を含み、約１５～約２５個の間の塩基を含み得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド２０７は、複数のホスホロチオエート結合を含む骨格を有する。１または任意の数のホスホロチオエート結合が、ＤＮＡのセグメント（例えば、オリゴヌクレオチド２０７の中心的領域２２１）の骨格中に含まれ得る。オリゴヌクレオチド２０７は、１または任意の数のホスホロチオエート結合を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチド２０７内のあらゆる骨格の連結は、ホスホロチオエートであり得るか、または大部分、もしくは約半数が、ホスホロチオエートであり得る。さらに、ホスホジエステル骨格に対する他の改変が存在し得る。
【0053】
組成物１０１は、送達のために製剤化され得る。よって、オリゴヌクレオチド１０７は、最初は、シリンジ、バッグ、または注射ポンプへの導入に適した製剤へと混合するために適切な形態にあり得る。例えば、オリゴヌクレオチド１０７（１つのオリゴヌクレオチド１０７の数千または数百万またはこれより多くのコピー）は、チューブ中で凍結乾燥されてもよいし、既知の重量モル濃度または濃度において溶液中にあってもよい。オリゴヌクレオチド１０７は、キャリア（例えば、溶媒または賦形剤）がオリゴヌクレオチド１０７を含む薬学的に受容可能な組成物へと溶解または希釈され得、ＩＶバッグ、シリンジ、またはバイアル中に装填され得る。記載されるように、組成物１０１は、配列番号１～２１９のうちの１つとの比較によって規定される配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド１０７を含む。従って、本開示の組成物は、特定された標的によって規定され、例証される。
【0054】
具体的には、オリゴヌクレオチド１０７は、配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも約７５％相補的であるｍＲＮＡのセグメントに沿ってＵＢＥ３Ａタンパク質をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズして、それによって、ＵＢＥ３Ａタンパク質への上記ｍＲＮＡの翻訳を防止する。これは、上記オリゴヌクレオチドが配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも約７５％同一性、好ましくは少なくとも約９０％または９５％または１００％同一性を有する場合に達成される。ある特定の実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１～２１９のうちの１つの配列を有するが、当業者は、相補的な標的と９０％または好ましくは９５％同一性を有するオリゴヌクレオチドが、上記標的に配列特異的様式においてなおもハイブリダイズする傾向があることを理解する。２本鎖構造の形成は、エネルギー的に、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合およびその２本鎖構造が１０個ごと程度に約１個のミスマッチ塩基対を許容し得る塩基スタッキングを通じて十分に有利である。よって、細胞における中程度にストリンジェントな生理学的条件下では、９５％同一性は、特に、オリゴヌクレオチドが、上記オリゴヌクレオチドを酵素による分解から保護するために少なくとも数個の改変されたＲＮＡ塩基またはホスホロチオエート骨格連結を有するギャップマー構造を有する場合、効果的であるはずである。
【0055】
実際に、本開示の組成物の特徴および利益は、（配列番号１～２１９の）標的が、相補体がＵＢＥ３Ａ転写物以外の分子中に存在する配列を除外するために実質的にスクリーニングされていることである。例えば、上記配列は、長い非コードＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）を含むＲＮＡ転写物のデータベースに対してスクリーニングされており、非標的配列とマッチする最初の配列は、除外された。従って、患者に投与される場合に、配列番号１～２１９の配列を有するＡＳＯは、非標的配列とハイブリダイズしてしまう機会は最小限のはずである。よって、好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチド１０７は、スクリーニングされて、ヒトにおける任意のオフターゲットコードＲＮＡ、または長い非コードＲＮＡに関する閾値マッチを満たさないように決定されている塩基配列を有する。上記で述べた基準を満たす組成物または使用は、オフターゲット物質（例えば、ＩｎｃＲＮＡ）または他のオフターゲットＲＮＡ転写物にインビボで結合しないはずである。なぜならその含まれる配列は、ＩｎｃＲＮＡおよび他のＲＮＡ転写物のデータベースに対してスクリーニングされているからである。本開示の配列は、標的特異性に関してスクリーニングされている。好ましくは、オリゴヌクレオチド１０７は、ヒトまたは非ヒト霊長類ゲノムにおける相同なセグメントに対する０個のミスマッチおよび齧歯類ゲノムにおける相同なセグメントにおいて約５個以下のミスマッチを有する塩基配列を有する。
【0056】
上記組成物が細胞に送達される場合、その細胞は、ＵＢＥ３Ａの用量依存性ノックダウンを示す。
【0057】
図３は、４０のＵＢＥ３Ａエキソン性ＡＳＯのスクリーニングからの結果を示す（１つのコントロール線維芽細胞株とともに； 結果は処理後４８時間で得られる）。その示される結果は、配列番号１～４０に相当する。図において、濃度応答（ＣＲ）において試験したＡＳＯのバーに、丸で印を付ける。
【0058】
図４は、本開示の実施形態（約２０個の塩基、ＡＳＯを通じて２’－Ｏ改変されたＲＮＡおよびホスホロチオエート連結を有するＲＮＡウイングが連結した約１２個の塩基のＤＮＡ中心的領域）に従って設計された配列番号１４、１７、４、７、８、１８、２１、２６、３４、および３５の１０のＡＳＯ候補の用量応答を（各々６つの濃度で）示す結果を示す。全１０個のＡＳＯは、用量依存性様式においてコントロール（ビヒクルのみで処理した細胞および処理しない「細胞のみ」の条件）と比較してＵＢＥ３Ａ発現を減少させた。
【0059】
核酸ハイブリダイゼーションは、ミスマッチに関してある程度許容性を有することから、配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも９０％マッチである塩基配列を有し、ホスホロチオエート連結によってのみ連結された塩基を有し、オリゴヌクレオチド１０７が、５’ウイングおよび３’ウイングが隣接したＤＮＡ塩基の中心的セグメント（例えば、上記５’ウイングおよび上記３’ウイングは各々、１２個のＤＮＡ塩基に隣接する４個連続した２’改変されたＲＮＡ塩基を含む４－１２－４構造、または５－１０－５構造、または類似のもの）を有するオリゴヌクレオチド１０７は、チャートに示されるパターンに従って用量依存性ノックダウンを示すことが見出され得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド１０７は、具体的には、配列番号１～２１９のうちの１つ（より好ましくは配列番号１～４０のうちの１つ、またはより好ましくは配列番号１４６、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６４、１６９、１７４、１７５、１７８、１７９、２１３、もしくは２１４）とマッチし、ホスホロチオエート連結によって（必要に応じていくつかのホスホジエステル連結とともに）連結された塩基を有し、上記オリゴヌクレオチド１０７は５’ウイングおよび３’ウイングが隣接した中心的な１２個のＤＮＡ塩基を有し、上記５’ウイングおよび上記３’ウイングは各々、４個連続した２’－ＭＯＥ ＲＮＡ塩基を含む塩基配列を有する。
【0060】
図５は、マウス線維芽細胞におけるマウス相同性を有するマウスエキソン性Ｕｂｅ３ａ ＡＳＯおよびヒトエキソン性ＡＳＯのスクリーニングからの結果を示す。そのスクリーニングしたヒトＡＳＯは、配列番号１、４、５、９、１５、１６、２１、２５、２８、および２９のものを含んだ。その結果は、齧歯類モデルにおいて相同な標的が存在するヒト標的に対するＡＳＯを設計することが可能であることを示す傾向にある。
【0061】
これらの組成物はＵＢＥ３Ａの発現をノックダウンするにあたって効果的であることから、本開示の組成物は、患者においてＤｕｐ１５ｑ症候群を処置するために使用され得る。本開示の方法は、本開示の任意の組成物を、それを必要とする患者に投与して、それによって、Ｄｕｐ１５ｑ症候群を処置または緩和する工程を包含する。
【0062】
本開示の組成物は、生きているニューロンのインビトロサンプルで試験され得る。例えば、インビトロでのニューロンは、光刺激下でのニューロン活性化（例えば、光に応じてニューロンを発火させる改変された藻類チャネルロドプシン）およびニューロン活性の光学的レポーター（ニューロン膜電位に比例して光を発し、ニューロン活性のシグナルを生じる改変された古細菌ロドプシン）を提供する光遺伝学的構築物（ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を含み得る。インビトロのニューロンは、蛍光顕微鏡検査機器においてアッセイされ得、必要に応じて、推定可能な様式でニューロンを発火させる神経刺激組成物で処理され得る。任意の適切な光遺伝学的構築物、光遺伝学顕微鏡（ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、または神経刺激性組成物が使用され得る。例えば、適切な光遺伝学的構築物としては、米国特許第９，５９４，０７５号（参考として援用される）に記載されるものが挙げられる。適切な光遺伝学顕微鏡としては、米国特許第１０，２８８，８６３号（参考として援用される）に記載されるものが挙げられる。
【0063】
本開示の方法および組成物は、有益なことには、Ｄｕｐ１５ｑ症候群を有する被験体においてインビボでニューロンへと本明細書で記載される治療用オリゴヌクレオチド１０７を送達するために使用され得る。任意の適切な送達アプローチが、使用され得る（例えば、全身送達（例えば、注射による）または局所送達（例えば、皮下、髄腔内、または遅延放出デバイスの移植によるもの）が挙げられる）。本開示の方法は、本開示の組成物を、１回、数日間または数週間にわたって数回、数ヶ月ごと（例えば、１年に約３回または４回）送達することを含み得る。
【0064】
本開示のオリゴヌクレオチド（例えば、組成物１０１中のギャップマー、ＡＳＯ、または治療用オリゴヌクレオチド１０７）は、表１に示される配列のうちの１つを参照して定義される配列を有し得る。例えば、本開示のオリゴヌクレオチドは、表１に示されるとおりの配列番号１～２１９のうちの１つと少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、または完全に同一である配列を有し得る。ＵＢＥ３Ａに対するある特定の好ましい実施形態は、配列番号１～４０として表示される表１中のものを含む。
【0065】
さらに、以下で示される実施例に記載されるように、本発明者らは、本発明のＡＳＯをスクリーニングした。得られたデータに基づくと、配列番号１４６、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６４、１６９、１７４、１７５、１７８、１７９、２１３、および２１４に相当するＡＳＯを、単一用量および用量応答有効性、配列モチーフ責任（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍｏｔｉｆ ｌｉａｂｉｌｉｔｉｅｓ）、およびオフターゲットアラインメント分析に基づいてリード候補ＡＳＯとして特定した。それらのＡＳＯは、最大のインビトロ有効性、最低のオフターゲットアラインメント、および制限された配列モチーフの懸念を示した。よって、ある特定の局面において、本発明に従うＵＢＥ３Ａに対する好ましいＡＳＯは、配列番号１４６、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６４ １６９、１７４、１７５、１７８、１７９、２１３および２１４に相当する配列と少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、または完全に同一である配列を有するＡＳＯを含む。
【0066】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【0067】
本開示の好ましい組み合わせの実施形態は、Ｄｕｐ１５ｑ症候群を処置するための組成物を含む。上記組成物は、以下を含む： 配列番号１～４０のうちの１つと少なくとも約９０％相補的であるｍＲＮＡのセグメントに沿ってＵＢＥ３Ａタンパク質をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチド；および必要に応じて、配列番号１～４０のうちの異なる１つと少なくとも約９０％相補的であるｍＲＮＡのセグメントに沿ってＵＢＥ３Ａタンパク質をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチド。好ましい組み合わせの実施形態において、上記治療用オリゴヌクレオチドの各々は、改変されたＲＮＡウイングが隣接した中心的ＤＮＡセグメントを含むギャップマー構造を有し得る。
【0068】
本開示のより好ましい組み合わせの実施形態は、配列番号１４６、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６４、１６９、１７４、１７５、１７８、１７９、２１３、および２１４のうちの１つと少なくとも約９０％相補的であるｍＲＮＡのセグメントに沿ってＵＢＥ３Ａタンパク質をコードするｍＲＮＡ；ならびに必要に応じて、配列番号１４６、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６４、１６９、１７４、１７５、１７８、１７９、２１３、および２１４のうちの１つと少なくとも約９０％相補的であるｍＲＮＡのセグメントに沿ってＵＢＥ３Ａタンパク質をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドを含む、Ｄｕｐ１５ｑ症候群を処置するための組成物を含む。
【0069】
いずれかまたは両方のウイングは、改変されたＲＮＡ塩基を含み得る。例えば、両方のウイングは、２’－Ｏ－メトキシエチルリボース改変を有する４個連続したＲＮＡ塩基を含み得る。各オリゴヌクレオチドの全体は、当業者に明らかであるように、ホスホジエステルもしくはホスホロチオエート連結または他のものを介して接続され得る。最も好ましくは、少なくとも末端の連結は、標準的でない（すなわち、ホスホジエステルでない（例えば、ホスホロチオエート））。より好ましくは、上記ＲＮＡウイング内の連結のうちの大部分または全てが、標準的ではない（例えば、ホスホロチオエート）。好ましくは複数の治療用オリゴヌクレオチドは、送達のためにクリニックで希釈または再構成するために、凍結乾燥または溶液の状態で提供される。すなわち、上記第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも１０００から数百万のコピー、および必要に応じて、上記第２のオリヌーの少なくとも１０００から数百万のコピーが、１またはこれより多くのチューブ中に、凍結乾燥または溶液でパッケージされる。上記組成物のこの好ましい組み合わせの実施形態は、Ｄｕｐ１５ｑ症候群の処置のためのアンチセンス治療剤として予測外の利益を有することを証明し得る。本開示の実施形態は、ＵＢＥ３Ａの過剰発現をダウンレギュレートし得るＵＢＥ３Ａを標的とするロック核酸（ＬＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含む。本発明は、１０～３０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを提供する。これは、ＵＢＥ３Ａ標的核酸と少なくとも９０％相補性（例えば、１００％相補性）を有し、インビボでのＵＢＥ３Ａの過剰発現を阻害し得る１０～３０ヌクレオチドの長さの連続したヌクレオチド配列を含む。オリゴヌクレオチド１０７は、配列番号１～２１９のうちの１つ、または好ましくは配列番号１～４０のうちの１つ、または配列番号１４６、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６４、１６９、１７４、１７５、１７８、１７９、２１３、および２１４のうちの１つと１００％同一であり得る。ある特定の局面において、オリゴヌクレオチド１０７は、配列番号１～２１９のうちの１つ、または好ましくは配列番号１～４０のうちの１つ、または配列番号１４６、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６４、１６９、１７４、１７５、１７８、１７９、２１３、および２１４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％同一であり得る。
【0070】
実施形態は、本発明に従うアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に受容可能な塩、または本発明に従う結合体を含む。
【0071】
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明の結合体、ならびに薬学的に受容可能な希釈剤、溶媒、キャリア、塩および／またはアジュバントを含む薬学的組成物を提供する。
【0072】
本発明は、医療における使用のための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明の結合体または本発明の薬学的塩もしくは組成物を提供する。
【0073】
本発明は、Ｄｕｐ１５ｑ症候群の処置または防止または緩和における使用のための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明の結合体または本発明の薬学的塩もしくは組成物を提供する。本発明は、Ｄｕｐ１５ｑ症候群の処置または防止または緩和のための医薬の調製のための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明の結合体または本発明の薬学的塩もしくは組成物の使用を提供する。
【0074】
オリゴヌクレオチドは、固相化学合成、続いて、精製および単離によって、実験室で一般には作製される。上記オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合により連結されたヌクレオチドまたはヌクレオシドの核塩基部分の配列もしくは順序、またはその改変に言及が行われる。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工物、すなわち、化学合成されたものであり得、代表的には、精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、１またはこれより多くの改変されたヌクレオシドまたはヌクレオチド（例えば、２’糖改変ヌクレオシド）を含み得る。
【0075】
上記改変されたヌクレオチドは、独立して、デオキシ－ヌクレオチド、３’末端デオキシ－チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル改変ヌクレオチド、２’－フルオロ改変ヌクレオチド、２’－デオキシ改変ヌクレオチド、ロックヌクレオチド、ロックされていないヌクレオチド、コンホメーションが制限されたヌクレオチド、制約されたエチルヌクレオチド、無塩基ヌクレオチド、２’－アミノ改変ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル改変ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル改変ヌクレオチド、２’－ヒドロキシ（ｈｙｄｒｏｘｌ）改変ヌクレオチド、２’－メトキシエチル改変ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル改変ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、非天然の塩基を含むヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール改変ヌクレオチド、シクロヘキセニル改変ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－ホスフェートを含むヌクレオチド、５’－ホスフェート摸倣物を含むヌクレオチド、グリコール改変ヌクレオチド、および２’－Ｏ－（Ｎ－メチルアセトアミド）改変ヌクレオチド、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択され得る。
【0076】
上記ＡＳＯの窒素性塩基は、天然に存在する核塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチン）ならびに天然に存在しない改変体（例えば、置換されたプリンまたは置換されたピリミジン（例えば、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チアゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル ５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’－チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリンおよび２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核塩基）であり得る。
【0077】
上記核塩基部分は、各相当する核塩基の文字コード（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵ）によって示され得、ここで各文字は、必要に応じて、等しい機能の改変された核塩基を含み得る。例えば、例示されるオリゴヌクレオチドにおいて、上記核塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、および５－メチルシトシンから選択される。必要に応じて、ＬＮＡギャップマーに関しては、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。
【0078】
本開示のオリゴヌクレオチド１０７は、ＵＢＥ３Ａの発現をダウンレギュレートする（阻害する）能力がある。いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的を阻害またはダウンレギュレートすることによって、その標的の発現を調節する能力がある。好ましくは、このような調節は、上記標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも２０％の発現の阻害、より好ましくは上記標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％阻害を生じる。
【0079】
本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、標的核酸のレベルを（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ切断を介して）減少させ得るか、または例えば、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングの調節を介して、標的核酸の機能性を減少させ得る（もしくは機能性を変化させ得る）。
【0080】
本開示のオリゴヌクレオチド１０７は、改変された糖部分（すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見出されるリボース糖部分と比較した場合のその糖部分の改変）を有する１またはこれより多くのヌクレオチドを含み得る。リボース糖部分の改変を有する多くのヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドのある特定の特性（例えば、親和性および／またはヌクレアーゼ耐性）の改善を主に目的として作製されている。このような改変は、リボース環構造が、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）、または二環式環（これは、代表的には、リボース環（ＬＮＡ）上のＣ２炭素とＣ４炭素との間の架橋を有する）、またはＣ２炭素とＣ３炭素との間の結合を代表的には欠いている連結されていないリボース環（例えば、ＵＮＡ）での置換によって改変されているものを含む。改変されたヌクレオシドはまた、糖部分が非糖部分で置換されているヌクレオシド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の場合）、またはモルホリノ核酸を含む。
【0081】
糖改変はまた、リボース環上の置換基を、水素以外の基へ、またはＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオシドにおいて天然に見出される２’－ＯＨ基へと変更することを介して作製された改変を含む。置換基は、例えば、２’、３’、４’または５’位置において導入され得る。
【0082】
上記オリゴヌクレオチドは、１またはこれより多くのロック核酸（ＬＮＡ）塩基を含み得る。ＬＮＡは、リボース環のコンホメーションを制限またはロックする、上記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’およびＣ４’のビラジカル連結（「２’－４’架橋」ともいわれる）を含む２’－改変されたヌクレオシドを含み得る。これらのヌクレオシドはまた、文献中で架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）といわれる。リボースのコンホメーションのロックは、ＬＮＡが、相補的なＲＮＡまたはＤＮＡ分子に関してオリゴヌクレオチドへと組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの増強された親和性（二重鎖安定化）と関連する。これは、上記オリゴヌクレオチド／相補体二重鎖の融解温度を測定することによって慣用的に決定され得る。限定ではないが、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、以下に開示される：ＷＯ ９９／０１４２２６、ＷＯ ００／６６６０４、ＷＯ ９８／０３９３５２、ＷＯ ２００４／０４６１６０、ＷＯ ００／０４７５９９、ＷＯ ２００７／１３４１８１、ＷＯ ２０１０／０７７５７８、ＷＯ ２０１０／０３６６９８、ＷＯ ２００７／０９００７１、ＷＯ ２００９／００６４７８、ＷＯ ２０１１／１５６２０２、ＷＯ ２００８／１５４４０１、ＷＯ ２００９／０６７６４７、およびＷＯ ２００８／１５０７２９（全て参考として援用される）。
【0083】
本開示のオリゴヌクレオチドの薬学的に受容可能な塩は、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではない、遊離塩基または遊離酸の生物学的有効性および特性を保持するそれらの塩を含む。上記塩は、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、特に塩酸）、および有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、スルホン酸、またはサリチル酸）で形成される。さらに、それらの塩は、無機塩基または有機塩基を上記遊離酸に添加することから調製され得る。無機塩基から得られる塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。有機塩基から得られる塩としては、一級、二級、および三級アミン、置換されたアミン（天然に存在する置換されたアミンを含む）、環式アミンおよび塩基性イオン交換樹脂（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニン、Ｎ－エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂）の塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【0084】
オリゴヌクレオチド１０７は、ＵＢＥ３Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ転写物のヌクレアーゼ媒介性分解を媒介または促進し得る。ヌクレアーゼ媒介性分解とは、相補的なヌクレオチド配列と二重鎖を形成する場合に、このような相補的なヌクレオチド配列の分解を媒介し得るオリゴヌクレオチドに言及する。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、本発明のオリゴヌクレオチドが、ヌクレアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、好ましくはエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）を動員し得る場合、標的核酸のヌクレアーゼ媒介性分解を介して機能し得る。ヌクレアーゼ媒介性機序を介して機能するオリゴヌクレオチド設計の例は、少なくとも５個または６個連続したＤＮＡヌクレオシドの領域を代表的には含み、親和性増強ヌクレオシドによって一方の側または両側に隣接されるオリゴヌクレオチド（例えば、ギャップマー）である。アンチセンスオリゴヌクレオチド１０７のＲＮａｓｅ Ｈ活性は、相補的ＲＮＡ分子との二重鎖にある場合に、ＲＮａｓｅ Ｈを動員するその能力に言及する。
【0085】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド１０７、またはその連続したヌクレオチド配列は、ギャップマー（ギャップマーオリゴヌクレオチドまたはギャップマー設計ともいわれる）であり得る。アンチセンスギャップマーは、一般に、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介性分解を介して標的核酸を阻害するために使用される。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、少なくとも３個の別個の構造的領域、５’→３’配向において５’－隣接、ギャップ、および３’－隣接、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、上記オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈを動員し得る連続したＤＮＡヌクレオチドのストレッチを含む。上記ギャップ領域は、１またはこれより多くの糖改変されたヌクレオシド（有利なことには、高親和性糖改変ヌクレオシド）を含む５’隣接領域（Ｆ）および１またはこれより多くの糖改変されたヌクレオシド（有利なことには、高親和性糖改変ヌクレオシド）を含む３’隣接領域（Ｆ’）によって隣接されている。領域ＦおよびＦ’における上記１またはこれより多くの糖改変されたヌクレオシドは、上記標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強する（すなわち、親和性増強糖改変ヌクレオシドである）。いくつかの実施形態において、領域ＦおよびＦ’における上記１またはこれより多くの糖改変されたヌクレオシドは、２’糖改変されたヌクレオシド（例えば、高親和性２’糖改変）である（例えば、ＬＮＡおよび２’－ＭＯＥから独立して選択される）。
【0086】
混合ウイングギャップマーは、領域ＦおよびＦ’のうちの一方または両方が、２’置換されたヌクレオシド（例えば、 ２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡユニット、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡユニット、２’－フルオロ－ＤＮＡ ユニット、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－ＭＯＥユニット、アラビノ核酸（ＡＮＡ）ユニット、２’－フルオロ－ＡＮＡユニット、またはこれらの組み合わせからなる群より独立して選択される２’置換されたヌクレオシド）を含むＬＮＡ ギャップマーである。領域ＦおよびＦ’のうちの少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも１個のＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態において、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、２’－ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群より独立して選択される。領域ＦおよびＦ’のうちの少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも２個のＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態において、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、２’－ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群より独立して選択される。いくつかの混合ウイングの実施形態において、領域ＦおよびＦ’のうちの一方または両方は、１またはこれより多くのＤＮＡヌクレオシドをさらに含み得る。ギャップマー設計は、ＷＯ ２００８／０４９０８５およびＷＯ ２０１２／１０９３９５（ともに参考として援用される）において考察されている。
【0087】
表２は、本明細書で開示されるとおりの改変された塩基および他の改変を組み込む本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例を示す。説明されるように、多くの非標準的核酸モノマーが、注文オリゴヌクレオチド製造供給元から市販されており、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドへと容易に組み込まれる．これらのモノマーユニットは、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｏｗａ， ＵＳ）によって示されるように、非標準的モノマーユニットを示す周知のオリゴヌクレオチド合成命名法を使用して記載される。例えば、表２に提供される配列において、非標準的モノマーユニットは、前方のスラッシュ「／」において囲まれ、ユニット間のアスタリスク「＊」は、ＰＳ連結を示す一方で、アスタリスクがないものは、ＰＯ連結を示す。表２はまた、上記ＡＳＯの配列番号を提供する。
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【表2-6】
【表2-7】
【表2-8】
【表2-9】
【表2-10】
【表2-11】
【表2-12】
【表2-13】
【0088】
１またはこれより多くの非ヌクレオチド部分へのオリゴヌクレオチド１０７の結合体化は、上記オリゴヌクレオチドの薬理学を、例えば、上記オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取り込みまたは安定性に影響を及ぼすことによって改善し得る。いくつかの実施形態において、上記結合体部分は、上記オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を、上記オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティー、代謝、排出、透過性、および／または細胞取り込みを改善することによって改変または増強し得る。特に、上記結合体は、上記オリゴヌクレオチドを特異的器官、組織または細胞タイプを標的にし得、それによって、その器官、組織または細胞タイプにおける上記オリゴヌクレオチドの有効性を増強し得る。上記結合体はまた、非標的細胞タイプ、組織もしくは器官における上記オリゴヌクレオチドの活性、例えば、オフターゲット活性または非標的細胞タイプ、組織もしくは器官における活性を低減するように働き得る。
【0089】
一実施形態において、上記非ヌクレオチド部分（結合体部分）は、炭水化物、細胞表面レセプターリガンド、薬物物質、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、キャプシド）またはこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0090】
本開示のオリゴヌクレオチド１０７は、前述のオリゴヌクレオチドおよび／またはそのオリゴヌクレオチド結合体もしくは塩のうちのいずれか、ならびに薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、塩および／またはアジュバントを含む薬学的組成物において提供され得る。薬学的に受容可能な希釈剤としては、ＡＣＳＦ（人工脳脊髄液）が挙げられ、薬学的に受容可能な塩としては、ナトリウム塩およびカリウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記薬学的に受容可能な希釈剤は、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水または滅菌炭酸ナトリウム緩衝液である。いくつかの好ましい実施形態において、臨床適用のための希釈剤としては、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ溶液および／またはＡＣＳＦ（人工脳脊髄液）が挙げられる。
【0091】
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、薬学的に受容可能な希釈剤中の溶液の形態にある（例えば、ＰＢＳまたは炭酸ナトリウム緩衝液中に溶解される）。上記オリゴヌクレオチドは、上記溶液中にあらかじめ製剤化されていてもよいし、いくつかの実施形態においては、投与前に薬学的に受容可能な希釈剤中に溶解され得る乾燥粉末（例えば、凍結乾燥粉末）の形態にあってもよい。適切には、例えば、上記オリゴヌクレオチドは、０．１～１００ｍｇ／ｍＬの濃度（例えば、１～１０ｍｇ／ｍＬ）において溶解され得る。
【実施例】
【0092】
実施例
以下の実施例は、本発明のＡＳＯをスクリーニングするための例示的方法を提供する。実施例において、一連のＡＳＯをスクリーニングした。得られたデータに基づいて、配列番号１４６、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６４、１６９、１７４、１７５、１７８、１７９、２１３、および２１４に相当するＡＳＯを、用量応答有効性、配列モチーフ責任、およびオフターゲットアラインメント分析に基づいてリード候補ＡＳＯとして特定した。それらのＡＳＯは、最大のインビトロ有効性、最低のオフターゲットアラインメント、および制限された配列モチーフの懸念を示した。しかし、本明細書で記載されるとおりの他のＡＳＯはまた、種々の条件の処置に対してＵＢＥ３Ａをノックダウンするために記載されるように機能する。
以下の実施例は、本発明のＡＳＯをスクリーニングするための例示的方法を提供する。実施例において、一連のＡＳＯをスクリーニングした。得られたデータに基づいて、配列番号１４６、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６４、１６９、１７４、１７５、１７８、１７９、２１３、および２１４に相当するＡＳＯを、用量応答有効性、配列モチーフ責任、およびオフターゲットアラインメント分析に基づいてリード候補ＡＳＯとして特定した。それらのＡＳＯは、最大のインビトロ有効性、最低のオフターゲットアラインメント、および制限された配列モチーフの懸念を示した。しかし、本明細書で記載されるとおりの他のＡＳＯはまた、種々の条件の処置に対してＵＢＥ３Ａをノックダウンするために記載されるように機能する。
【0093】
実施例１ ＵＢＥ３Ａ ＡＳＯの単一用量スクリーニング
４０のＵＢＥ３Ａ標的化ＡＳＯ（配列番号１～４０）を、初代線維芽細胞（９６ウェルプレートのウェルあたり１０ｋをプレート）を２００ｎＭのＡＳＯで処理することによってインビトロでスクリーニングした。ＡＳＯを、９６ウェルプレートのウェルあたり０．５μＬでＲＮＡｉ Ｍａｘを使用するトランスフェクションによって送達した。
４０のＵＢＥ３Ａ標的化ＡＳＯ（配列番号１～４０）を、初代線維芽細胞（９６ウェルプレートのウェルあたり１０ｋをプレート）を２００ｎＭのＡＳＯで処理することによってインビトロでスクリーニングした。ＡＳＯを、９６ウェルプレートのウェルあたり０．５μＬでＲＮＡｉ Ｍａｘを使用するトランスフェクションによって送達した。
【0094】
図３に示されるデータは、ビヒクルに対してＡＳＯ処理線維芽細胞の正規化した相対的ＵＢＥ３Ａ転写物発現のｑＰＣＲデータである。全てのサンプルを、第２のビヒクル条件に対して正規化した。細胞のみの条件（白）は、ＵＢＥ３Ａ発現の変化を示さない。ＵＢＥ３Ａ ｓｉＲＮＡを陽性コントロールとして使用したところ、ＵＢＥ３Ａ転写物の－８０％ノックダウンを示す。非標的化ｓｉＲＮＡを陰性コントロールとして使用したところ、ＵＢＥ３Ａのノックダウンを示さない。上のグラフは、ＵＢＥ３Ａ ＡＳＯｓ ００１－０２０（配列番号１～２０）のデータを示す。下のグラフは、ＵＢＥ３Ａ ＡＳＯｓ ０２１－０４０（配列番号２１～４０）のデータを示す。
【0095】
全ての細胞を、プレートして４８時間後にＡＳＯでトランスフェクトした。細胞を、ＡＳＯトランスフェクションのさらに４８時間後に、ｑＰＣＲのために採取した。アクチンを、ＵＢＥ３Ａに対する正規化遺伝子として使用した。各バーは、３つの技術的複製および１つの生物学的複製を表す。ある特定のバーの上にあるドットは、４０のＡＳＯのこのセット内で特定された好ましいＡＳＯを示し、配列番号４、７、８、１４、１７、１８、２１、２６、３４、および３５に相当する。
【0096】
図４は、各々６つの濃度において、本開示の実施形態（上記ＡＳＯ全体を通じて２’－Ｏ改変されたＲＮＡおよびホスホロチオエート連結を有するＲＮＡウイングが連結した約１０～１２個の塩基ＤＮＡの中心的領域を有する約２０個の塩基の長さ）に従って設計された１０のＡＳＯ候補（配列番号１４、１７、４、７、８、１８、２１、２６、３４、および３５）の用量応答を示す結果を提供する。全１０個のＡＳＯは、用量依存性様式においてコントロールと比較してＵＢＥ３Ａ発現を減少させた（ビヒクルのみで処理した細胞および処理していない「細胞のみ」条件）。
【0097】
実施例２ 全ＵＢＥ３Ａ ＡＳＯの単一用量スクリーニング
実施例１の方法を使用して、ＵＢＥ３Ａ標的化ＡＳＯ（配列番号１～８０、１０１～１３９、および１８４～２０３）を、初代線維芽細胞（９６ウェルプレートのウェルあたり１０ｋをプレート）を２００ｎＭのＡＳＯで処理することによってインビトロでスクリーニングした。ＡＳＯを、９６ウェルプレートのウェルあたり０．５μＬでＲＮＡｉ Ｍａｘを使用するトランスフェクションによって送達した。
実施例１の方法を使用して、ＵＢＥ３Ａ標的化ＡＳＯ（配列番号１～８０、１０１～１３９、および１８４～２０３）を、初代線維芽細胞（９６ウェルプレートのウェルあたり１０ｋをプレート）を２００ｎＭのＡＳＯで処理することによってインビトロでスクリーニングした。ＡＳＯを、９６ウェルプレートのウェルあたり０．５μＬでＲＮＡｉ Ｍａｘを使用するトランスフェクションによって送達した。
【0098】
全てのスクリーニングしたＡＳＯを、本開示の実施形態（すなわち、上記ＡＳＯ全体を通じて２’－Ｏ改変されたＲＮＡおよびホスホロチオエート連結を有するＲＮＡウイングが隣接した約１０～１２個の塩基のＤＮＡ中心的領域を有する約２０個の塩基の長さ）に従って設計した。
【0099】
図６～９に示されるデータは、スクリーニングされた全１３９のＡＳＯに関するＵＢＥ３Ａノックダウン（ＵＢＥ３Ａノックダウンのパーセントとして表される）のｑＰＣＲ読み出しのまとめの表として表される。全てのサンプルを、ビヒクル条件または細胞のみの条件のいずれかに対して正規化した。ＡＳＯの表は、下流の齧歯類概念立証インビボ試験のために、ＵＢＥ３Ａエキソン標的化ＡＳＯ（図６～７）、ＵＢＥ３Ａイントロン標的化ＡＳＯ（図８）、ならびにヒトおよびマウス両方のＵＢＥ３Ａ転写物と１００％相同性を有するＵＢＥ３Ａ ＡＳＯ（図９）に分類される。
【0100】
全ての細胞を、プレートして４８時間後にＡＳＯでトランスフェクトした。細胞を、ｑＰＣＲのために、ＡＳＯトランスフェクションのさらに４８時間後に採取した。アクチンを、ＵＢＥ３Ａに対する正規化遺伝子として使用した。適切な場合、ＡＳＯを、コントロール線維芽細胞およびＤｕｐ１５ｑ患者に由来する線維芽細胞の両方においてスクリーニングした（図６～８）。図９において、マウスＵＢＥ３Ａ相同性を有するＡＳＯに関しては、データは２回に対して示される。
【0101】
実施例３ ＵＢＥ３ＡリードＡＳＯ候補の用量応答スクリーニング
実施例１および２のデータに基づいて、候補リードＵＢＥ３Ａ標的化ＡＳＯを、一次単一用量スクリーニングにおいて８０～８５％より大きい転写物ノックダウンに基づいて選択した。各候補リードに関して、同一の配列を有する新たなＡＳＯを、１～３個のホスホジエステル（ＰＯ）骨格改変（各々、３’および５’において、ＡＳＯあたり合計４～５個のＰＯ改変（すなわち、ＰＯ連結で置き換えられたＰＳ連結）を有する２’－ＭＯＥ ＲＮＡ様ウイング）で合成した。これらの改変は、元々のリードＡＳＯ中のその相当するＰＳ連結に置き換わる。ＰＯ改変ＡＳＯを、娘ＡＳＯとして図１０中で言及する。
実施例１および２のデータに基づいて、候補リードＵＢＥ３Ａ標的化ＡＳＯを、一次単一用量スクリーニングにおいて８０～８５％より大きい転写物ノックダウンに基づいて選択した。各候補リードに関して、同一の配列を有する新たなＡＳＯを、１～３個のホスホジエステル（ＰＯ）骨格改変（各々、３’および５’において、ＡＳＯあたり合計４～５個のＰＯ改変（すなわち、ＰＯ連結で置き換えられたＰＳ連結）を有する２’－ＭＯＥ ＲＮＡ様ウイング）で合成した。これらの改変は、元々のリードＡＳＯ中のその相当するＰＳ連結に置き換わる。ＰＯ改変ＡＳＯを、娘ＡＳＯとして図１０中で言及する。
【0102】
次いで、これらの候補リードを、ＵＢＥ３Ａ転写物発現の用量応答調節に関して試験した。これらの実験のために、初代線維芽細胞（９６ウェルプレートのウェルあたり１０ｋをプレート）またはマウス胚性線維芽細胞（ウェルあたり１５ｋでプレート）のいずれかを、９６ウェルプレートにプレートした。ＡＳＯを、６つの用量： ６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、および２００ｎＭでスクリーニングした。ＡＳＯを、９６ウェルプレートのウェルあたり０．５μＬでＲＮＡｉ Ｍａｘを使用するトランスフェクションによって送達した。
【0103】
図１０は、Ｄｕｐ１５ｑ患者線維芽細胞（上）またはマウス胚性線維芽細胞（下）における２つのリード候補例およびそれらのＰＯ改変娘分子に関する標的発現のＵＢＥ３Ａ ＡＳＯ用量応答の例示的データを示す。全サンプルを、ビヒクルコントロールに対して正規化した。
【0104】
図１１は、用量応答をプロットし、図１０からの同じ２例のリード候補に関するＥＣ５０を示す。全細胞を、プレートして４８時間後にＡＳＯでトランスフェクトした。細胞を、ｑＰＣＲのために、ＡＳＯトランスフェクションのさらに４８時間後に採取した。アクチンを、ＵＢＥ３Ａに対する正規化遺伝子として使用した。各データ点は、２つの技術的複製および１つの生物学的複製を表す。
【0105】
実施例４ ＵＢＥ３ＡリードＡＳＯ候補の用量応答スクリーニング
候補リードＵＢＥ３Ａ標的化ＡＳＯを、実施例１および２からの一次単一用量スクリーニングにおいて８０～８５％より大きい転写物ノックダウンに基づいて選択した。各候補リードに関して、同一の配列を有する新たなＡＳＯを、実施例３に記載されるように、１～３個のＰＯ骨格改変（各々、３’および５’において、２’－ＭＯＥ ＲＮＡ様ウイング（ＡＳＯあたり合計４～５個のＰＯ改変））で合成した。次いで、全候補リードを、ＵＢＥ３Ａ転写物発現の用量応答調節に関して試験した。
候補リードＵＢＥ３Ａ標的化ＡＳＯを、実施例１および２からの一次単一用量スクリーニングにおいて８０～８５％より大きい転写物ノックダウンに基づいて選択した。各候補リードに関して、同一の配列を有する新たなＡＳＯを、実施例３に記載されるように、１～３個のＰＯ骨格改変（各々、３’および５’において、２’－ＭＯＥ ＲＮＡ様ウイング（ＡＳＯあたり合計４～５個のＰＯ改変））で合成した。次いで、全候補リードを、ＵＢＥ３Ａ転写物発現の用量応答調節に関して試験した。
【0106】
これらの実験のために、初代線維芽細胞（９６ウェルプレートのウェルあたり１０ｋをプレート）またはマウス胚性線維芽細胞（ウェルあたり１５ｋでプレート）のいずれかを、９６ウェルプレートにプレートした。ＡＳＯを、別段示されなければ、６つの用量： ６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、および２００ｎＭでスクリーニングした。ＡＳＯを、９６ウェルプレートのウェルあたり０．５μＬでＲＮＡｉ Ｍａｘを使用するトランスフェクションによって送達した。
【0107】
全サンプルを、各実験内で、ビヒクルまたはコントロール条件のいずれかに対して正規化した。全細胞を、プレートして４８時間後にＡＳＯでトランスフェクトした。細胞を、ｑＰＣＲのために、ＡＳＯトランスフェクションのさらに４８時間後に採取した。アクチンを、ＵＢＥ３Ａに対する正規化遺伝子として使用した。
【0108】
図１２は、ＵＢＥ３Ａエキソンを標的とするリード全ＰＳ骨格候補の得られた用量応答データを示す。
【0109】
図１３は、ＵＢＥ３Ａイントロンを標的とするリード全ＰＳ骨格候補の得られた用量応答データを示す。
【0110】
図１４は、齧歯類のインビボ有効性試験のために１００％マウス相同性を有するリード全ＰＳ骨格候補の得られた用量応答データを示す。
【0111】
図１５は、齧歯類のインビボ有効性試験のために１００％マウス相同性を有するＰＯ改変娘リードの得られた用量応答データを示す。
【0112】
図１６は、ヒト臨床候補試験のためにＰＯ改変娘リードの得られた用量応答データを示す。
【0113】
実施例５ ＵＢＥ３Ａ ＡＳＯを使用するＵＢＥ３Ａのタンパク質ノックダウン
ＡＳＯ処理したＤｕｐ１５ｑ患者線維芽細胞を、有効性を決定し、下流の実験のためにＡＳＯをランク付けする助けにするために、ＵＢＥ３Ａタンパク質ノックダウンに関してスクリーニングした。
ＡＳＯ処理したＤｕｐ１５ｑ患者線維芽細胞を、有効性を決定し、下流の実験のためにＡＳＯをランク付けする助けにするために、ＵＢＥ３Ａタンパク質ノックダウンに関してスクリーニングした。
【0114】
線維芽細胞を、９６ウェルプレートのウェルあたり１０ｋでプレートした。ＡＳＯ処理は、プレートして４８時間後に生じた。タンパク質ノックダウンの蓄積を許容するために、線維芽細胞を、ＡＳＯ処理の約４．５日後に、ウェスタンブロット分析のために採取した。
【0115】
図１７は、ある特定の候補リードＵＢＥ３Ａ ＡＳＯおよび同一のＡＳＯ配列を有する３個のＰＯ改変娘分子のウェスタンブロットを示す。ＧＦＰ標的化ＡＳＯを、陰性コントロールとして使用した。ＵＢＥ３Ａ発現を、ハウスキーピング遺伝子ＡＣＴＩＮに対して正規化し、次いで、ビヒクル条件に対して正規化した。
【0116】
図１８は、前述のサンプルに関するＵＢＥ３Ａタンパク質ノックダウンの定量を示す。ＵＢＥ３Ａブロットに関しては、曝露は６００ｓであった。ＧＡＰＤＨに関しては、曝露は１５ｓであった。レーンあたり５μｇのタンパク質を載せ、高分子量転写を使用した。ＵＢＥ３Ａ抗体： Ｒｂ－Ｅ６ＡＰ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｅｔｈｙｌ）－Ａ３００－３５１Ａ（１：１０００）。Ａｃｔｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ： Ｍｓ β－Ａｃｔｉｎ－（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）－８Ｈ１０Ｄ１０（１：２０００）。
【0117】
実施例６ ＵＢＥ３Ａ標的化ＡＳＯを使用するＵＢＥ３Ａのタンパク質ノックダウン
ＡＳＯ処理したＤｕｐ１５ｑ患者線維芽細胞を、有効性を決定し、下流の実験のためにＡＳＯをランク付けする助けにするために、ＵＢＥ３Ａタンパク質ノックダウンに関してスクリーニングした。
ＡＳＯ処理したＤｕｐ１５ｑ患者線維芽細胞を、有効性を決定し、下流の実験のためにＡＳＯをランク付けする助けにするために、ＵＢＥ３Ａタンパク質ノックダウンに関してスクリーニングした。
【0118】
図１９～２２は、候補リードのＵＢＥ３Ａタンパク質ノックダウンに関するまとめの表を提供する。
【0119】
ＡＳＯ処理したＤｕｐ１５ｑ患者線維芽細胞を、有効性を決定し、下流の実験のためにＡＳＯをランク付けする助けにするために、ＵＢＥ３Ａタンパク質ノックダウンに関してスクリーニングした。線維芽細胞を、９６ウェルプレートのウェルあたり１０ｋでプレートした。ＡＳＯ処理は、プレートして４８時間後に生じた。タンパク質ノックダウンの蓄積を許容するために、線維芽細胞を、ＡＳＯ処理の約４．５日後に、ウェスタンブロット分析のために採取した。全ての実験において、ＧＦＰ標的化ＡＳＯを、陰性コントロールとして使用した。ＵＢＥ３Ａ発現を、ハウスキーピング遺伝子ＡＣＴＩＮに対して正規化し、次いで、ビヒクル条件に対して正規化した。ＵＢＥ３Ａブロットに関しては、曝露は６００ｓであった。ＧＡＰＤＨに関しては、曝露は１５ｓであった。レーンあたり５μｇのタンパク質を載せ、高分子量転写を使用した。ＵＢＥ３Ａ抗体： Ｒｂ－Ｅ６ＡＰ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｅｔｈｙｌ）－Ａ３００－３５１Ａ（１：１０００）。Ａｃｔｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ： Ｍｓ β－Ａｃｔｉｎ－（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）－８Ｈ１０Ｄ１０（１：２０００）。
【0120】
図１９は、ＵＢＥ３Ａを標的とするリード全ＰＳ骨格候補のＵＢＥ３Ａタンパク質ノックダウン結果をまとめる表を提供する。
【0121】
図２０は、齧歯類のインビボ有効性試験のために１００％マウス相同性を有するリード全ＰＳ骨格候補のＵＢＥ３Ａタンパク質ノックダウン結果をまとめる表を提供する。（Ｃ）
【0122】
図２１は、齧歯類のインビボ有効性試験のために１００％マウス相同性を有するＰＯ改変娘リードのＵＢＥ３Ａタンパク質ノックダウン結果をまとめる表を提供する。
【0123】
図２２は、ヒト臨床候補のためにＰＯ改変娘リードのＵＢＥ３Ａタンパク質ノックダウン結果をまとめる表を提供する。
【0124】
実施例７ － ＵＢＥ３Ａリード候補を使用するヒトＮＧＮ２幹細胞由来ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ転写物のノックダウン
ＵＢＥ３Ａは、ニューロンにおいて刷り込みされ、この細胞タイプは、Ｄｕｐ１５ｑの病因にとって極めて重要である。本発明のＡＳＯが疾患関連ヒト細胞タイプにおいて有効であることを示すために、この実施例において、ヒト人工多能性幹細胞由来ニューロン（転写因子ＮＧＮ２の過剰発現およびＳＭＡＤシグナル伝達の低分子阻害を介して分化）を、本発明のＵＢＥ３Ａ標的化ＡＳＯで処理した。
ＵＢＥ３Ａは、ニューロンにおいて刷り込みされ、この細胞タイプは、Ｄｕｐ１５ｑの病因にとって極めて重要である。本発明のＡＳＯが疾患関連ヒト細胞タイプにおいて有効であることを示すために、この実施例において、ヒト人工多能性幹細胞由来ニューロン（転写因子ＮＧＮ２の過剰発現およびＳＭＡＤシグナル伝達の低分子阻害を介して分化）を、本発明のＵＢＥ３Ａ標的化ＡＳＯで処理した。
【0125】
ニューロンを、８０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートにプレートし、１００ｎＭのＵＢＥ３Ａ標的化ＡＳＯで処理した。ＡＳＯを、ＤＩＶ（インビトロ日数（ｄａｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ））２１においてＥｎｄｏｐｏｒｔｅｒ試薬で培養したニューロンへと送達した。細胞を、ＤＩＶ ３１において処理の１０日後にｑＰＣＲのために採取した。ＵＢＥ３Ａリード候補ＡＳＯおよび最適化したリード候補ＡＳＯをスクリーニングした。
【0126】
図２３は、このスクリーニングをまとめるデータを提供する。示されるように、多くのＡＳＯは、ヒトニューロンにおいてＵＢＥ３Ａ転写物の＞８０％ノックダウンを示した。ＵＢＥ３Ａ発現レベルを、βチューブリン転写物レベル（参照として使用されるハウスキーピング遺伝子）に対して正規化した。次いで、全ての正規化した発現を、第１のビヒクル条件に対して定量した。各バーは、３つの技術的複製および１つの生物学的複製を表す。
【0127】
実施例８ － ＵＢＥ３Ａリード候補ＡＳＯを使用するヒト初代ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ転写物のノックダウン
ＵＢＥ３Ａは、ニューロンにおいて刷り込みされ、その細胞タイプは、Ｄｕｐ１５ｑの病因にとって極めて重要である。本発明のＡＳＯが関連ヒト細胞タイプにおいて有効であることを示すために、ヒト初代ニューロン（１９週齢の男性胎児に由来；Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌから獲得）を、ＵＢＥ３Ａ標的化ＡＳＯで処理した。ニューロンを、３０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートにプレートし、５００ｎＭのＵＢＥ３Ａ標的化ＡＳＯで処理した。ＡＳＯを、裸で（ｇｙｍｎｏｔｉｃａｌｌｙ）（トランスフェクション試薬なし）でＤＩＶ １に送達した。細胞を、ＡＳＯ処理の６日後にｑＰＣＲのために採取した。ＵＢＥ３Ａリード候補ＡＳＯおよび最適化したリード候補ＡＳＯの部分セットをスクリーニングした。
ＵＢＥ３Ａは、ニューロンにおいて刷り込みされ、その細胞タイプは、Ｄｕｐ１５ｑの病因にとって極めて重要である。本発明のＡＳＯが関連ヒト細胞タイプにおいて有効であることを示すために、ヒト初代ニューロン（１９週齢の男性胎児に由来；Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌから獲得）を、ＵＢＥ３Ａ標的化ＡＳＯで処理した。ニューロンを、３０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートにプレートし、５００ｎＭのＵＢＥ３Ａ標的化ＡＳＯで処理した。ＡＳＯを、裸で（ｇｙｍｎｏｔｉｃａｌｌｙ）（トランスフェクション試薬なし）でＤＩＶ １に送達した。細胞を、ＡＳＯ処理の６日後にｑＰＣＲのために採取した。ＵＢＥ３Ａリード候補ＡＳＯおよび最適化したリード候補ＡＳＯの部分セットをスクリーニングした。
【0128】
図２４は、このスクリーンをまとめる結果を提供する。示されるように、多くのＡＳＯは、裸の送達でヒト初代ニューロンにおいてＵＢＥ３Ａ転写物の＞６０％ノックダウンを示す。ＵＢＥ３Ａ発現レベルを、βチューブリン転写物レベル（参照として使用されるハウスキーピング遺伝子）に対して正規化した。次いで、全ての正規化した発現を、第１のビヒクル条件に対して定量した。各バーは、３つの技術的複製および１つの生物学的複製を表す。
【0129】
実施例９ － ＵＢＥ３Ａリード候補ＡＳＯを使用する非ヒト霊長類初代線維芽細胞培養物におけるＵＢＥ３Ａ転写物のノックダウン
カニクイザル非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における相当する配列と１００％相同性を有するＵＢＥ３Ａ ＡＳＯを、このアッセイのために選択した。リードＡＳＯ候補を、インビボ寛容性、毒物学、ＰＫおよびＰＤに関して試験するために、ＮＨＰにおいてインビボでスクリーニングした。
カニクイザル非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における相当する配列と１００％相同性を有するＵＢＥ３Ａ ＡＳＯを、このアッセイのために選択した。リードＡＳＯ候補を、インビボ寛容性、毒物学、ＰＫおよびＰＤに関して試験するために、ＮＨＰにおいてインビボでスクリーニングした。
【0130】
本発明のＡＳＯが、関連のＮＨＰ細胞タイプにおいて有効であることを示すために、ＮＨＰ初代線維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ）を、ＵＢＥ３Ａ標的化ＡＳＯで形質導入した。線維芽細胞を、１０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートにプレートし、２００ｎＭ ＵＢＥ３Ａ ＡＳＯで処理した。ＡＳＯを、ＤＩＶ ２にＲＮＡｉ Ｍａｘを使用してＮＨＰ線維芽細胞へとトランスフェクトした。細胞を、ＡＳＯ処理の４８時間後にｑＰＣＲのために採取した。ＵＢＥ３Ａリード候補ＡＳＯおよび最適化したリード候補をスクリーニングした。
【0131】
図２５は、このスクリーニングをまとめる結果を提供する。示されるように、多くのＡＳＯは、ｓｈｏｗ ＵＢＥ３Ａ転写物の８０～９０％ノックダウンを示す。ＵＢＥ３Ａ発現レベルを、ＧＡＰＤＨ（参照として使用されるハウスキーピング遺伝子）に対して正規化した。次いで、全ての正規化した発現を、第１の細胞のみの条件に対して定量した。各バーは、２つの技術的複製および１つの生物学的複製を表す。
【0132】
実施例１０ － ＵＢＥ３Ａリード候補を使用するマウス初代皮質ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ転写物のノックダウン
ＵＢＥ３Ａは、ニューロンにおいて刷り込みされ、この細胞タイプは、Ｄｕｐ１５ｑの病因にとって極めて重要である。リードＡＳＯを、インビボ寛容性、毒物学、ＰＫおよびＰＤに関して試験するために、マウスにおいてインビボでスクリーニングする。
ＵＢＥ３Ａは、ニューロンにおいて刷り込みされ、この細胞タイプは、Ｄｕｐ１５ｑの病因にとって極めて重要である。リードＡＳＯを、インビボ寛容性、毒物学、ＰＫおよびＰＤに関して試験するために、マウスにおいてインビボでスクリーニングする。
【0133】
Ｄｕｐ１５ｑのマウスモデルは、疾患モデルシステムにおいてインビボで概念立証および有効性を示すために有用である。本発明のＡＳＯが関連マウス細胞タイプにおいて有効であることを示すために、マウス初代皮質ニューロン（Ｂｒａｉｎｂｉｔｓ）を、ＵＢＥ３Ａ ＡＳＯで処理した。ニューロンを、ウェルあたり９ｋで９６ウェルプレートにプレートし、１μＭ ＵＢＥ３Ａ ＡＳＯで処理した。ＡＳＯを、ＤＩＶ ３に裸で送達した。細胞を、ＡＳＯ処理の８日後（ＤＩＶ １１）にｑＰＣＲのために採取した。ＵＢＥ３Ａリード候補および最適化したリード候補をスクリーニングした。これらのスクリーンから得られた結果を、図２６に示す。示されるように、多くのＡＳＯは、裸の送達、特に、１００％ラット相同性を有するＡＳＯでＵＢＥ３Ａ転写物の＞６０％ノックダウンを示す。ＵＢＥ３Ａ発現レベルを、βチューブリン（参照として使用されるハウスキーピング遺伝子）に対して正規化した。次いで、全ての正規化した発現を、第２の細胞のみの条件に対して定量した。各バーは、２つの技術的複製および１つの生物学的複製を表す。
【0134】
実施例１１ － UＢＥ３Ａリード候補を使用するラット初代皮質ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ転写物のノックダウン
ＵＢＥ３Ａは、ニューロンにおいて刷り込みされ、この細胞タイプは、Ｄｕｐ１５ｑの病因にとって極めて重要である。リードＡＳＯを、インビボ寛容性、毒物学、ＰＫおよびＰＤに関して試験するために、ラットにおいてインビボでスクリーニングする。
ＵＢＥ３Ａは、ニューロンにおいて刷り込みされ、この細胞タイプは、Ｄｕｐ１５ｑの病因にとって極めて重要である。リードＡＳＯを、インビボ寛容性、毒物学、ＰＫおよびＰＤに関して試験するために、ラットにおいてインビボでスクリーニングする。
【0135】
本発明のＡＳＯが、関連ラット細胞タイプにおいて有効であることを示すために、ラット初代皮質ニューロン（Ｂｒａｉｎｂｉｔｓ）を、本明細書で記載されるとおりのＵＢＥ３Ａ ＡＳＯで処理した。ニューロンを、ウェルあたり９ｋで９６ウェルプレートにプレートし、３μＭ ＵＢＥ３Ａ ＡＳＯで処理した。ＡＳＯを、ＤＩＶ ３に裸で送達した。
【0136】
細胞を、ＡＳＯ処理の４日後および８日後（それぞれ、ＤＩＶ ７およびＤＩＶ １１）にｑＰＣＲのために採取した。ＵＢＥ３Ａリード候補および最適化したリード候補をスクリーニングした。
【0137】
図２７は、細胞を４日後にｑＰＣＲのために採取した後のスクリーニングをまとめる結果を提供する。
【0138】
図２８は、細胞を８日後にｑＰＣＲのために採取した後のスクリーニングをまとめる結果を提供する。
【0139】
図２７～２８に示されるように、多くのＡＳＯは、裸の送達、特に、１００％ラット相同性を有するＡＳＯでＵＢＥ３Ａ転写物の＞６０％ノックダウンを示す。ＵＢＥ３Ａ発現レベルを、βチューブリン（参照として使用されるハウスキーピング遺伝子）に対して正規化した。次いで、全ての正規化した発現を、第２の細胞のみの条件に対して定量した。各バーは、２つの技術的複製および１つの生物学的複製を表す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【手続補正書】
【提出日】2023-10-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】