特表 2024-506712 細胞外ベシクルを負荷する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-14

(54)【発明の名称】細胞外ベシクルを負荷する方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/127 20060101AFI20240206BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20240206BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20240206BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240206BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240206BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20240206BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20240206BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20240206BHJP

   A61K 47/55 20170101ALI20240206BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20240206BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20240206BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20240206BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240206BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240206BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240206BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20240206BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240206BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240206BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240206BHJP

   A61K 31/70 20060101ALI20240206BHJP

   A61K 31/196 20060101ALI20240206BHJP

   C12N 15/88 20060101ALI20240206BHJP

   C12N 5/00 20060101ALI20240206BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20240206BHJP

【ＦＩ】

A61K9/127

A61K47/02

A61K47/12

A61K47/18

A61K47/26

A61K47/10

A61K47/20

A61K47/64

A61K47/55

A61K47/54

A61K47/65

A61K47/42

A61P43/00 111

A61K48/00

A61K45/00

A61K38/02

A61K31/7088

A61K31/7105

A61K31/713

A61K31/70

A61K31/196

C12N15/88 Z

C12N5/00

C12N15/113 Z ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023549583

(86)(22)【出願日】2022-02-17

(85)【翻訳文提出日】2023-10-13

(86)【国際出願番号】 US2022016825

(87)【国際公開番号】W WO2022178147

(87)【国際公開日】2022-08-25

(31)【優先権主張番号】63/150,497

(32)【優先日】2021-02-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522228126

【氏名又は名称】ロンザ セールス アーゲー

【氏名又は名称原語表記】ＬＯＮＺＡ ＳＡＬＥＳ ＡＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】エリス， キンバリー

(72)【発明者】

【氏名】ノイズ， アーロン

(72)【発明者】

【氏名】ウッド， アンドリュー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BD32

4B065BD50

4B065CA23

4B065CA44

4C076AA19

4C076CC29

4C076CC41

4C076DD22

4C076DD23

4C076DD24

4C076DD26

4C076DD38

4C076DD41

4C076DD43

4C076DD49

4C076DD50

4C076DD51

4C076DD55

4C076DD59

4C076DD60

4C076DD63

4C076DD67

4C076DD70

4C076EE23

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF11

4C076FF36

4C076FF63

4C076GG41

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084AA17

4C084BA44

4C084MA05

4C084MA24

4C084NA13

4C084NA20

4C084ZC411

4C084ZC412

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA01

4C086EA16

4C086EA20

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA24

4C086NA13

4C086NA20

4C086ZC41

4C206AA01

4C206AA02

4C206FA53

4C206MA03

4C206MA05

4C206MA44

4C206NA13

4C206NA20

(57)【要約】

本開示は、ＥＶにペイロードを負荷する方法に関する。一部の態様では、ペイロードとＥＶとは、ＥＶの外側表面に関連するペイロードの量が増加するように、特定の負荷条件（例えば、本開示の塩濃度、負荷温度、負荷期間、ペイロード供給濃度、及び／又はＥＶ供給濃度）で混合される。細胞外ベシクルを産生するための方法及び疾患又は障害を処置するために細胞外ベシクルを使用するための方法も本明細書において提供される。
【選択図】 図１Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ペイロードを細胞外ベシクルに負荷する方法であって、約２００ｍＭ、約１９０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１２０ｍＭ、又は約１１０ｍＭ未満の濃度の塩を含む負荷緩衝剤中で、前記ペイロードを前記細胞外ベシクルと混合するステップを含む、方法。

【請求項2】

前記塩濃度が、約１ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約５ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約２０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約３０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約６０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約７０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約８０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約１０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約２０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約３０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約１０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約２０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約３０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約６０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約７０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約８０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１００ｍＭの間、約１００ｍＭ～約１５０ｍＭの間、又は約９０ｍＭ～約１１０ｍＭの間である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記塩濃度が、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍ、約１８０ｍＭ、又は約１９０ｍＭである、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記塩濃度が、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、又は約１５０ｍＭである、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

ペイロードを細胞外ベシクルに負荷する方法であって、約２００ｍＭ～約４５０ｍＭの間の濃度の塩を含む負荷緩衝剤中で、前記ペイロードを前記細胞外ベシクルと混合するステップを含む、方法。

【請求項6】

前記塩濃度が、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、又は約４５０ｍＭである、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記塩が、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ＫＣｌ（塩化カリウム）、ＰＯ_４（リン酸塩）、ＣａＣｌ_２（塩化カルシウム）、ＭｇＣｌ_２（塩化マグネシウム）、Ｍｇ_２ＳＯ_４（硫酸マグネシウム）、ＺｎＣｌ_２（塩化亜鉛）、ＭｎＣｌ_２（塩化マンガン）、ＭｎＳＯ_４（硫酸マンガン）、ＮａＳＣＮ（チオシアン酸ナトリウム）、ＫＳＣＮ（チオシアン酸カリウム）、ＬｉＣｌ（塩化リチウム）、Ｋ_２ＨＰＯ_４（リン酸二カリウム）、Ｎａ_２ＳＯ_４（硫酸ナトリウム）、ＮａＰＯ_４（リン酸ナトリウム）、Ｋ_２ＳＯ_４（リン酸カリウム）、酢酸ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウム、臭化リチウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化リチウム、ヨウ化リチウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、ヨウ化カリウム、硫酸カルシウム、硫酸ナトリウム、三塩化クロム、硫酸クロム、クエン酸ナトリウム、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化イットリウム（ＩＩＩ）、硫酸カリウム、塩化第一鉄、クエン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、塩化第二鉄、アルギニン－ＨＣｌ、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記塩を含む前記負荷緩衝剤が、前記塩を含まないか又は前記塩の濃度がより低い対応する負荷緩衝剤と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、前記ＥＶに対する前記ペイロードの前記負荷を増加させる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

ペイロードを細胞外ベシクルに負荷する方法であって、４℃より高い負荷温度で、前記ペイロードを前記細胞外ベシクルと混合するステップを含む、方法。

【請求項10】

前記負荷温度が、約５℃～約４０℃の間、約１０℃～約４０℃の間、約１５℃～約４０℃の間、約２０℃～約４０℃の間、約２５℃～約４０℃の間、約３０℃～約４０℃の間、約３５℃～約４０℃の間、約５℃～約３８℃の間、約１０℃～約３８℃の間、約１５℃～約３８℃の間、約２０℃～約３８℃の間、約２５℃～約３８℃の間、約３０℃～約３８℃の間、約３５℃～約３８℃の間、約５℃～約３７℃の間、約１０℃～約３７℃の間、約１５℃～約３７℃の間、約２０℃～約３７℃の間、約２５℃～約３７℃の間、約３０℃～約３７℃℃の間、又は約３５℃～約３７℃の間である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記負荷温度が、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、又は約７０℃である、請求項９又は１０に記載の方法。

【請求項12】

前記負荷温度が、前記負荷温度よりも低い参照温度での負荷と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、前記ＥＶに対する前記ペイロードの前記負荷を増加させる、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

ペイロードを細胞外ベシクルに負荷する方法であって、約１時間より長い負荷期間、前記ペイロードを前記細胞外ベシクルと混合するステップを含む、方法。

【請求項14】

前記負荷期間が、約１時間～約４８時間の間、約１時間～約４２時間の間、約１時間～約３６時間の間、約１時間～約３０時間の間、約１時間～約２４時間の間、約６時間～約４８時間の間、約６時間～約４２時間の間、約６時間～約３６時間の間、約６時間～約３０時間の間、約６時間～約２４時間の間、約１２時間～約４８時間の間、約１２時間～約４２時間の間、約１２時間～約３６時間の間、約１２時間～約３０時間の間、又は約１２時間～約２４時間の間である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記負荷期間が、約６時間、約１２時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、又は約７日間である、請求項１３又は１４に記載の方法。

【請求項16】

前記負荷期間が、前記負荷期間よりも短い参照期間での負荷と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、前記ＥＶに対する前記ペイロードの前記負荷を増加させる、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

ペイロードを細胞外ベシクルに負荷する方法であって、２００ｍＭ未満の濃度の塩を含む負荷緩衝剤中で、約５℃～約５０℃の間の負荷温度で、１時間～約４８時間の間の負荷期間、前記ペイロードを前記細胞外ベシクルと混合するステップを含む、方法。

【請求項18】

前記塩濃度が、約１ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約５ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約２０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約３０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約６０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約７０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約８０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約１０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約２０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約３０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約１０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約２０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約３０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約６０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約７０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約８０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１００ｍＭの間、約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ、又は約９０ｍＭ～約１１０ｍＭの間である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記塩濃度が、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍ、約１８０ｍＭ、又は約１９０ｍＭである、請求項１７又は１８に記載の方法。

【請求項20】

前記塩濃度が、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、又は約１５０ｍＭである、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記塩が、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ＫＣｌ（塩化カリウム）、ＰＯ_４（リン酸塩）、ＣａＣｌ_２（塩化カルシウム）、ＭｇＣｌ_２（塩化マグネシウム）、Ｍｇ_２ＳＯ_４（硫酸マグネシウム）、ＺｎＣｌ_２（塩化亜鉛）、ＭｎＣｌ_２（塩化マンガン）、ＭｎＳＯ_４（硫酸マンガン）、ＮａＳＣＮ（チオシアン酸ナトリウム）、ＫＳＣＮ（チオシアン酸カリウム）、ＬｉＣｌ（塩化リチウム）、Ｋ_２ＨＰＯ_４（リン酸二カリウム）、Ｎａ_２ＳＯ_４（硫酸ナトリウム）、ＮａＰＯ_４（リン酸ナトリウム）、Ｋ_２ＳＯ_４（リン酸カリウム）、酢酸ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウム、臭化リチウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化リチウム、ヨウ化リチウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、ヨウ化カリウム、硫酸カルシウム、硫酸ナトリウム、三塩化クロム、硫酸クロム、クエン酸ナトリウム、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化イットリウム（ＩＩＩ）、硫酸カリウム、塩化第一鉄、クエン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、塩化第二鉄、アルギニン－ＨＣｌ、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記負荷温度が、約５℃～約４０℃の間、約１０℃～約４０℃の間、約１５℃～約４０℃の間、約２０℃～約４０℃の間、約２５℃～約４０℃の間、約３０℃～約４０℃の間、約３５℃～約４０℃の間、約５℃～約３８℃の間、約１０℃～約３８℃の間、約１５℃～約３８℃の間、約２０℃～約３８℃の間、約２５℃～約３８℃の間、約３０℃～約３８℃の間、約３５℃～約３８℃の間、約５℃～約３７℃の間、約１０℃～約３７℃の間、約１５℃～約３７℃の間、約２０℃～約３７℃の間、約２５℃～約３７℃の間、約３０℃～約３７℃の間、又は約３５℃～約３７℃の間である、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記負荷温度が、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、又は約５０℃である、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記負荷期間が、約１時間～約４８時間の間、約１時間～約４２時間の間、約１時間～約３６時間の間、約１時間～約３０時間の間、約１時間～約２４時間の間、約６時間～約４８時間の間、約６時間～約４２時間の間、約６時間～約３６時間の間、約６時間～約３０時間の間、約６時間～約２４時間の間、約１２時間～約４８時間の間、約１２時間～約４２時間の間、約１２時間～約３６時間の間、約１２時間～約３０時間の間、又は約１２時間～約２４時間の間である、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記負荷期間が、約６時間、約１２時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、又は約４８時間である、請求項１７～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記塩濃度が、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭの間であり、前記負荷温度が、約３０℃～約４０℃の間であり、前記負荷期間が、約２０時間～約３０時間の間である、請求項１７に記載の方法。

【請求項27】

前記塩濃度が、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭの間であり、前記負荷温度が、約３０℃～約４０℃の間であり、前記負荷期間が、約１２時間～約３０時間の間である、請求項１７に記載の方法。

【請求項28】

ペイロードを細胞外ベシクルに負荷する方法であって、約１００ｍＭの濃度の塩を含む負荷緩衝剤中で、約３７℃の負荷温度で、約２４時間の間の負荷期間、前記ペイロードを前記細胞外ベシクルと混合するステップを含む、方法。

【請求項29】

ペイロードを細胞外ベシクルに負荷する方法であって、約１５０ｍＭ～約４５０ｍＭの間の濃度の塩を含む負荷緩衝剤中で、約３７℃～約７０℃の間の負荷温度で、約２４時間～約７日間の間の負荷期間、前記ペイロードを前記細胞外ベシクルと混合するステップを含む、方法。

【請求項30】

前記塩濃度が、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、又は約４５０ｍＭである、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記塩が、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ＫＣｌ（塩化カリウム）、ＰＯ_４（リン酸塩）、ＣａＣｌ_２（塩化カルシウム）、ＭｇＣｌ_２（塩化マグネシウム）、Ｍｇ_２ＳＯ_４（硫酸マグネシウム）、ＺｎＣｌ_２（塩化亜鉛）、ＭｎＣｌ_２（塩化マンガン）、ＭｎＳＯ_４（硫酸マンガン）、ＮａＳＣＮ（チオシアン酸ナトリウム）、ＫＳＣＮ（チオシアン酸カリウム）、ＬｉＣｌ（塩化リチウム）、Ｋ_２ＨＰＯ_４（リン酸二カリウム）、Ｎａ_２ＳＯ_４（硫酸ナトリウム）、ＮａＰＯ_４（リン酸ナトリウム）、Ｋ_２ＳＯ_４（リン酸カリウム）、酢酸ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウム、臭化リチウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化リチウム、ヨウ化リチウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、ヨウ化カリウム、硫酸カルシウム、硫酸ナトリウム、三塩化クロム、硫酸クロム、クエン酸ナトリウム、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化イットリウム（ＩＩＩ）、硫酸カリウム、塩化第一鉄、クエン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、塩化第二鉄、アルギニン－ＨＣｌ、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項２９又は３０に記載の方法。

【請求項32】

前記負荷温度が、約３７℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、又は約７０℃である、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記負荷期間が、約２４時間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、又は約７日間である、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記塩濃度での前記負荷温度における前記負荷期間での前記負荷が、前記塩を含まない、４℃の温度の、及び／又は１時間の期間の負荷と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、前記細胞外ベシクルに対する前記ペイロードの負荷を増加させる、請求項１７～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記混合するステップの後に、前記ＥＶに負荷されたペイロードの量を測定するステップと、前記ＥＶの負荷密度を決定するステップとをさらに含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

１つ又は複数の負荷パラメーターが、前記ＥＶの前記負荷密度をさらに増加させるために調整され、前記１つ又は複数の負荷パラメーターが、前記負荷緩衝剤の塩濃度、負荷温度、負荷期間、ペイロード供給濃度、ＥＶ供給濃度、又はこれらの組合せから選択される、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記ＥＶに負荷されたペイロードの前記量が、粒子カウンター、ＮＴＡ、紫外線吸収、可視吸収、蛍光、近赤外、赤外、静的光散乱、動的光散乱、オブスキュレーション、ラマン分光法、濁度、又はこれらの組合せを使用して測定される、請求項３５又は３６に記載の方法。

【請求項38】

前記混合するステップが、バッチモード、セミバッチモード、半連続モード、又は連続モードで起こる、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

細胞外ベシクル（ＥＶ）への負荷後に、ＥＶからのペイロードの解離を減少させる方法であって、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法に従って、前記ペイロードを前記ＥＶに負荷するステップを含む、方法。

【請求項40】

前記ＥＶからの前記ペイロードの前記解離が、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法に従わずに、前記ペイロードが前記ＥＶに負荷された場合に観察される対応する解離と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は約１００％低減される、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

ペイロードが負荷された細胞外ベシクル（ＥＶ）の安定性を増加させる方法であって、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法に従って、前記ペイロードを前記ＥＶに負荷するステップを含む、方法。

【請求項42】

前記ペイロードが負荷された前記ＥＶの前記安定性が、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法に従わずに、前記ペイロードが前記ＥＶに負荷された場合に観察される対応する安定性と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加する、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

ペイロードが負荷された後に、細胞外ベシクルの１つ又は複数の特性を改善する方法であって、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法に従って、前記ペイロードを前記ＥＶに負荷するステップを含む、方法。

【請求項44】

前記１つ又は複数の特性が、粒子間相互作用、粒子剛性、粒子サイズ、又はこれらの組合せを含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記１つ又は複数の特性の前記改善が、前記ＥＶの濾過性の増加を可能にする、請求項４３又は４４に記載の方法。

【請求項46】

前記負荷緩衝剤が、１つ又は複数の構成成分をさらに含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記１つ又は複数の構成成分が、トリス、スクロース、グルコース、トレハロース、マンノース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、ヒスチジン、アルギニン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ポリマー、界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０及び２０）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、クエン酸塩）、無機酸、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記１つ又は複数の構成成分が、スクロースである、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記スクロースが、約１０％ｗ／ｖ未満、約９％ｗ／ｖ未満、約８％ｗ／ｖ未満、約７％ｗ／ｖ未満、約６％ｗ／ｖ未満、約５％ｗ／ｖ未満、約４％ｗ／ｖ未満、約３％ｗ／ｖ未満、又は約２．５％ｗ／ｖ未満の濃度である、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記スクロースが、約１％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖの間、約２％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖの間、約３％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖの間、約４％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖの間、約５％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖの間、約１％ｗ／ｖ～約８％ｗ／ｖの間、約２％ｗ／ｖ～約８％ｗ／ｖの間、約３％ｗ／ｖ～約８％ｗ／ｖの間、約４％ｗ／ｖ～約８％ｗ／ｖの間、約５％ｗ／ｖ～約８％ｗ／ｖの間、約１％ｗ／ｖ～約５％ｗ／ｖの間、約２％ｗ／ｖ～約５％ｗ／ｖの間、約３％ｗ／ｖ～約５％ｗ／ｖの間、約４％ｗ／ｖ～約５％ｗ／ｖの間、又は約５％ｗ／ｖ～約６％ｗ／ｖの間の濃度である、請求項４８に記載の方法。

【請求項51】

前記負荷緩衝剤が、約１００～約６００ｍＯｓｍ／ｋｇの間のモル浸透圧濃度である、請求項１～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記負荷緩衝剤が、約２７５～約４５０の間、約２８０～約４５０の間、約３００～約４５０の間、約２７５～約４００の間、約２８０～約４００の間、約３００～約４００の間、約２７５～約３８０の間、約２８０～約３８０の間、約３００～約３８０の間、約２７５～約３５０の間、約２８０～約３５０の間、約３００～約３５０の間、約２７５～約３１０の間、約２８０～約３１０の間、又は約３００～約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの間のモル浸透圧濃度である、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記負荷緩衝剤が、約３６０、約３７０、約３８０、約３９０、約３９５、又は約４００ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度である、請求項５１又は５２に記載の方法。

【請求項54】

前記負荷緩衝剤が、約６～約８の間のｐＨである、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記ｐＨが、約６～約７の間又は約７～約８の間である、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記ｐＨが、約６、約７、又は約８である、請求項５４に記載の方法。

【請求項57】

前記負荷緩衝剤が、約９のｐＨである、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記ペイロードが、ペプチド、小分子、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＰＭＯ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｃＲＮＡ、アンタゴミル、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ペプチド核酸、細胞透過性ペプチド、アジュバント、タンパク質、炭水化物、糖、アミノ酸、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項１～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記ペイロードが、核酸を含む、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記核酸が、約４０未満、約３５未満、約３０未満、約２５未満、約２０未満、約１９未満、約１８未満、約１７未満、約１６未満、又は約１５未満のヌクレオチドの長さの連続配列を含む、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記核酸が、約１０～約３０の間、約１４～約３０の間、約１５～約３０の間、約１６～約３０の間、約１７～約３０の間、約１８～約３０の間、約１９～約３０の間、約２０～約３０の間、約１０～約２５の間、約１４～約２５の間、約１５～約２５の間、約１６～約２５の間、約１７～約２５の間、約１８～約２５の間、約１９～約２５の間、約２０～約２５の間、約１０～約２２の間、約１４～約２２の間、約１５～約２２の間、約１６～約２２の間、約１７～約２２の間、約１８～約２２の間、約１９～約２２の間、又は約２０～約２２の間の長さの連続配列を含む、請求項５９又は６０に記載の方法。

【請求項62】

前記核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項５９～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１つ又は複数の遺伝子に特異的に結合し、前記１つ又は複数の遺伝子にコードされるタンパク質の発現を低下させる、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記１つ又は複数の遺伝子が、ＳＴＡＴ６、Ｋｒａｓ、Ｎｒａｓ、ＰＭＰ２２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＳＴＡＴ３、ＮＬＲＰ３、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記負荷緩衝剤中の前記ペイロードが、約１００～約１０００μＭの間の濃度である、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

前記負荷緩衝剤中の前記ペイロードが、約１００μＭ～約２００μＭの間、約２００μＭ～約３００μＭの間、約３００μＭ～約４００μＭの間、約４００μＭ～約５００μＭの間、約５００μＭ～約６００μＭの間、約６００μＭ～約７００μＭの間、約７００μＭ～約８００μＭの間、約８００μＭ～約９００μＭの間、又は約９００μＭ～約１０００μＭの間の濃度である、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

前記負荷緩衝剤中の前記ペイロードが、約１００μＭ、約２００μＭ、約３００μＭ、約４００μＭ、約５００μＭ、約６００μＭ、約７００μＭ、約８００μＭ、約９００μＭ、又は約１０００μＭの濃度である、請求項６５に記載の方法。

【請求項68】

前記負荷緩衝剤中の前記ペイロードが、約１０００μＭ～約２５００μＭの間の濃度である、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記ペイロードが、配列番号４１～１１２のいずれか１つに記載されているヌクレオチド配列を含み、前記ペイロードの前記濃度が、約６００μＭである、請求項６５に記載の方法。

【請求項70】

前記ペイロードが、アンカー部分にコンジュゲートされている、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

前記アンカー部分が、ステロール、ＧＭ１、脂質、リン脂質、ビタミン、小分子、ペプチド、又はこれらの組合せを含む、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記アンカー部分が、少なくとも約６個の炭素原子、少なくとも７個の炭素原子、少なくとも８個の炭素原子、少なくとも９個の炭素原子、少なくとも１０個の炭素原子、少なくとも１１個の炭素原子、少なくとも１２個の炭素原子、少なくとも１３個の炭素原子、少なくとも１４個の炭素原子、少なくとも１５個の炭素原子、少なくとも１６個の炭素原子、少なくとも１７個の炭素原子、少なくとも１８個の炭素原子、少なくとも１９個の炭素原子、少なくとも２０個の炭素原子、少なくとも２５個の炭素原子、少なくとも３０個の炭素原子、少なくとも３５個の炭素原子、少なくとも４０個の炭素原子、少なくとも４５個の炭素原子、少なくとも５０個の炭素原子、少なくとも５５個の炭素原子、少なくとも６０個の炭素原子、少なくとも６５個の炭素原子、少なくとも７０個の炭素原子、少なくとも７５個の炭素原子、少なくとも８０個の炭素原子、少なくとも８５個の炭素原子、又は少なくとも９０個の炭素原子を含む、請求項７０又は７１に記載の方法。

【請求項73】

前記アンカー部分が、ステロール、ステロイド、ホパノイド、ヒドロキシステロイド、セコステロイド、そのアナログ、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項７１又は７２に記載の方法。

【請求項74】

前記アンカー部分が、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、コレステロール、２４Ｓ－ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、シクロアルテノール、フコステロール、サリンゴステロール、カンペステロール、β－シトステロール、シトスタノール、コプロスタノール、アベナステロール、スチグマステロール、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記アンカー部分が、

【化1】

からなる群から選択される構造を有する、コレステロール又は誘導体である、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

前記アンカー部分がステロイドを含み、ステロイドは、ジヒドロテストステロン、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン、プロゲステロン、コルチゾール、又はこれらの任意の組合せである、請求項７１～７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記アンカー部分が、脂質を含む、請求項７１に記載の方法。

【請求項78】

前記アンカー部分が、Ｃ_２～Ｃ_６０鎖を含む、請求項７１～７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

前記アンカー部分が、Ｃ_４～Ｃ_４０、Ｃ_２～Ｃ_３８、Ｃ_２～Ｃ_３６、Ｃ_２～Ｃ_３４、Ｃ_２～Ｃ_３２、Ｃ_２～Ｃ_３０、Ｃ_４～Ｃ_３０、Ｃ_２～Ｃ_２８、Ｃ_４～Ｃ_２８、Ｃ_２～Ｃ_２６、Ｃ_４～Ｃ_２６、Ｃ_２～Ｃ_２４、Ｃ_４～Ｃ_２４、Ｃ_６～Ｃ_２４、Ｃ_８～Ｃ_２４、Ｃ_１０～Ｃ_２４、Ｃ_２～Ｃ_２２、Ｃ_４～Ｃ_２２、Ｃ_６～Ｃ_２２、Ｃ_８～Ｃ_２２、Ｃ_１０～Ｃ_２２、Ｃ_２～Ｃ_２０、Ｃ_４～Ｃ_２０、Ｃ_６～Ｃ_２０、Ｃ_８～Ｃ_２０、Ｃ_１０～Ｃ_２０、Ｃ_２～Ｃ_１８、Ｃ_４～Ｃ_１８、Ｃ_６～Ｃ_１８、Ｃ_８～Ｃ_１８、Ｃ_１０～Ｃ_１８、Ｃ_１２～Ｃ_１８、Ｃ_１４～Ｃ_１８、Ｃ_１６～Ｃ_１８、Ｃ_２～Ｃ_１６、Ｃ_４～Ｃ_１６、Ｃ_６～Ｃ_１６、Ｃ_８～Ｃ_１６、Ｃ_１０～Ｃ_１６、Ｃ_１２～Ｃ_１６、Ｃ_１４～Ｃ_１６、Ｃ_２～Ｃ_１５、Ｃ_４～Ｃ_１５、Ｃ_６～Ｃ_１５、Ｃ_８～Ｃ_１５、Ｃ_９～Ｃ_１５、Ｃ_１０～Ｃ_１５、Ｃ_１１～Ｃ_１５、Ｃ_１２～Ｃ_１５、Ｃ_１３～Ｃ_１５、Ｃ_２～Ｃ_１４、Ｃ_４～Ｃ_１４、Ｃ_６～Ｃ_１４、Ｃ_８～Ｃ_１４、Ｃ_９～Ｃ_１４、Ｃ_１０～Ｃ_１４、Ｃ_１１～Ｃ_１４、Ｃ_１２～Ｃ_１４、Ｃ_２～Ｃ_１３、Ｃ_４～Ｃ_１３、Ｃ_６～Ｃ_１３、Ｃ_７～Ｃ_１３、Ｃ_８～Ｃ_１３、Ｃ_９～Ｃ_１３、Ｃ_１０～Ｃ_１３、Ｃ_１０～Ｃ_１３、Ｃ_１１～Ｃ_１３、Ｃ_２～Ｃ_１２、Ｃ_４～Ｃ_１２、Ｃ_６～Ｃ_１２、Ｃ_７～Ｃ_１２、Ｃ_８～Ｃ_１２、Ｃ_９～Ｃ_１２、Ｃ_１０～Ｃ_１２、Ｃ_２～Ｃ_１１、Ｃ_４～Ｃ_１１、Ｃ_６～Ｃ_１１、Ｃ_７～Ｃ_１１、Ｃ_８～Ｃ_１１、Ｃ_９～Ｃ_１１、Ｃ_２～Ｃ_１０、Ｃ_４～Ｃ_１０、Ｃ_２～Ｃ_９、Ｃ_４～Ｃ_９、Ｃ_２～Ｃ_８、Ｃ_２～Ｃ_７、Ｃ_４～Ｃ_７、Ｃ_２～Ｃ_６、又はＣ_４～Ｃ_６鎖を含む、請求項７８に記載の方法。

【請求項80】

前記アンカー部分が、直鎖脂肪酸、分岐脂肪酸、不飽和脂肪酸、モノ不飽和脂肪酸、ポリ不飽和脂肪酸、ヒドロキシ脂肪酸、ポリカルボン酸、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項７１～７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記アンカー部分が、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ヘキサコサン酸、オクタコサン酸、トリアコンタン酸及びｎ－ドトリアコンタン酸、並びにプロピオン酸、ｎ－吉草酸、エナント酸、ペラルゴン酸、ヘンデカン酸、トリデカン酸、ペンタデカン酸、ヘプタデカン酸、ノナデカン酸、ヘネイコサン酸、トリコサン酸、ペンタコサン酸、ヘプタコサン酸などの奇数の炭素原子を有するもの、又はこれらの任意の組合せである直鎖脂肪酸を含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記アンカー部分が、分岐脂肪酸、イソ酪酸、イソカプロン酸、イソカプリル酸、イソカプリン酸、イソラウリン酸、１１－メチルドデカン酸、イソミリスチン酸、１３－メチル－テトラデカン酸、イソパルミチン酸、１５－メチル－ヘキサデカン酸、イソステアリン酸、１７－メチルオクタデカン酸、イソアラキン酸、１９－メチルエイコサン酸、α－エチルヘキサン酸、α－ヘキシルデカン酸、α－ヘプチルウンデカン酸、２－デシルテトラデカン酸、２－ウンデシルテトラデカン酸、２－デシルペンタデカン酸、２－ウンデシルペンタデカン酸、Ｆｉｎｅ ｏｘｏｃｏｌ１８００酸（日産化学工業株式会社（Ｎｉｓｓａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）の製品）、イソブチル基で終結するアンテイソ脂肪酸、６－メチル－オクタン酸、８－メチル－デカン酸、１０－メチル－ドデカン酸、１２－メチル－テトラデカン酸、１４－メチル－ヘキサデカン酸、１６－メチルオクタデカン酸、１８－メチルエイコサン酸、２０－メチルドコサン酸、２２－メチルテトラコサン酸、２４－メチルヘキサコサン酸、及び２６－メチルオクタコサン酸、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記アンカー部分が、４－デセン酸、カプロレイン酸、４－ドデセン酸、５－ドデセン酸、ラウロレイン酸、４－テトラデセン酸、５－テトラデセン酸、９－テトラデセン酸、パルミトレイン酸、６－オクタデセン酸、オレイン酸、９－オクタデセン酸、１１－オクタデセン酸、９－エイコセン酸、ｃｉｓ－１１－エイコセン酸、セトオレイン酸、１３－ドコセン酸、１５－テトラコセン酸、１７－ヘキサコセン酸、６，９，１２，１５－ヘキサデカテトラエン酸、リノール酸、リノレン酸、α－エレオステアリン酸、β－エレオステアリン酸、プニカ酸、６，９，１２，１５－オクタデカテトラエン酸、パリナリン酸、５，８，１１，１４－エイコサテトラエン酸、５，８，１１，１４，１７－エイコサペンタエン酸、７，１０，１３，１６，１９－ドコサペンタエン酸、４，７，１０，１３，１６，１９－ドコサヘキサエン酸、又はこれらの任意の組合せである不飽和脂肪酸を含む、請求項７１～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記アンカー部分が、α－ヒドロキシラウリン酸、α－ヒドロキシミリスチン酸、α－ヒドロキシパルミチン酸、α－ヒドロキシステアリン酸、ω－ヒドロキシラウリン酸、α－ヒドロキシアラキン酸、９－ヒドロキシ－１２－オクタデセン酸、リシノール酸、α－ヒドロキシベヘン酸、９－ヒドロキシ－ｔｒａｎｓ－１０，１２－オクタデカジエン酸、カモレン酸、イプロール酸、９，１０－ジヒドロキシステアリン酸、１２－ヒドロキシステアリン酸、又はこれらの任意の組合せであるヒドロキシ脂肪酸を含む、請求項７１～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記アンカー部分が、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、Ｄ，Ｌ－リンゴ酸、又はこれらの任意の組合せであるポリカルボン酸を含む、請求項７１～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記アンカー部分が、リン脂質を含む、請求項７１に記載の方法。

【請求項87】

前記リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、又はこれらの任意の組合せである、請求項８６に記載の方法。

【請求項88】

前記アンカー部分が、ビタミンを含む、請求項７１に記載の方法。

【請求項89】

前記アンカー部分が、ビタミンＤ、ビタミンＫ、ナイアシン、ピリドキシン（ｐｙｒｉｄｏｘｏｎｅ）、ビタミンＥ、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項８８に記載の方法。

【請求項90】

前記アンカー部分が、前記ペイロードと前記アンカー部分との間にリンカーをさらに含む、請求項７０～８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

前記リンカーが、非切断性リンカーを含む、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

前記非切断性リンカーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロール、アルキル、ホスホロチオエート、スクシンイミド、マレイミド、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

前記非切断性リンカーが、式Ｒ３－（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｎ－又はＲ３－（０－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｎ－Ｏ－（式中、Ｒ３は、水素、メチル又はエチルであり、ｎは、２～２００の間の整数である）によって特徴付けられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項９１に記載の方法。

【請求項94】

前記非切断性リンカーが、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、ペンタエチレングリコール、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項９１に記載の方法。

【請求項95】

前記リンカーが、式（（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＨ－ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－）（式中、Ｒ３は、水素、メチル又はエチルであり、ｎは、３～２００の間の整数である）を有するポリグリセロール（ＰＧ）を含む、請求項９０又は９１に記載の方法。

【請求項96】

前記リンカーが、ジグリセロール、トリグリセロール、テトラグリセロール（ＴＧ）、ペンタグリセロール、ヘキサグリセロール（ＨＧ）、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項９０又は９１に記載の方法。

【請求項97】

前記リンカーが、アルキルを含む、請求項９０又は９１に記載の方法。

【請求項98】

前記リンカーが、切断性リンカーを含む、請求項９０に記載の方法。

【請求項99】

前記切断性リンカーが、酸化還元切断性リンカー、活性酸素種切断性リンカー、ｐＨ依存性切断性リンカー、酵素切断性リンカー、プロテアーゼ切断性リンカー、エステラーゼ切断性リンカー、酸化還元酵素切断性リンカー、ホスホリパーゼ切断性リンカー、ホスファターゼ切断性リンカー、光活性化切断性リンカー、自己犠牲リンカー、又はこれらの任意の組合せである、請求項９８に記載の方法。

【請求項100】

前記切断性リンカーが、自己犠牲リンカーである、請求項９９に記載の方法。

【請求項101】

前記切断性リンカーが、シンナミル基、ナフチル基、ビフェニル基、複素環式環、ホモ芳香族基、クマリン、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピロール、ピラゾール、ピリジン、イミダゾン、トリアゾール、又はこれらの任意の組合せである、請求項９９に記載の方法。

【請求項102】

前記リンカーが、式：
－Ａ_ａ－Ｙ_ｙ－
（式中、各－Ａ－は、独立的にアミノ酸単位であり、ａは、独立的に１～１２の整数であり；－Ｙ－は、スペーサー単位であり、ｙは、０、１、又は２である）を有する、請求項９９～１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

－Ａ_ａ－が、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、又はヘキサペプチドである、請求項１０２に記載の方法。

【請求項104】

ａが２であり、－Ａ_ａ－が、バリン－アラニン、バリン－シトルリン、グルタミン酸－バリン－シトルリン、フェニルアラニン－リシン、Ｎ－メチルバリン－シトルリン、グリシン－ヒスチジン－ロイシン－グリシン、シクロヘキシルアラニン－リシン、及びベータ－アラニン－リシンからなる群から選択される、請求項１０２に記載の方法。

【請求項105】

－Ａ_ａ－が、バリン－アラニン、又はバリン－シトルリン、又はグルタミン酸－バリン－シトルリンである、請求項１０２に記載の方法。

【請求項106】

－Ａ_ａ－が、アルギニン、リシン、又はその両方である、請求項１０２に記載の方法。

【請求項107】

ｙが１である、請求項１０２～１０６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項108】

－Ｙ－が－自己犠牲スペーサーである、請求項１０２～１０７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項109】

－Ｙ_ｙ－が、式（Ｖ）：

【化2】

（式中、各Ｒ^２は、独立的にＣ_１～８アルキル、－Ｏ－（Ｃ_１～８アルキル）、ハロゲン、ニトロ、又はシアノであり；ｍは、０～４の整数である）を有する、請求項１０８に記載の方法。

【請求項110】

ｍが、０、１、又は２である、請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

ｍが、０である、請求項１１０に記載の方法。

【請求項112】

前記切断性リンカーが、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメート又はバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートである、請求項１１０に記載の方法。

【請求項113】

前記アンカー部分が、

【化3】

を含む、請求項７０に記載の方法。

【請求項114】

（ｉ）配列番号４１～１１２のいずれか１つに記載されているヌクレオチド配列を含むペイロード、及び（ｉｉ）表１又は表２のリンカーの組合せから選択されるリンカーを含む、請求項７０に記載の方法。

【請求項115】

前記ペイロードが、コレステロールにコンジュゲートされている、請求項１１４に記載の方法。

【請求項116】

前記ペイロードが、５’ＧｂｓＣｂｓＡｂｓｄＡｓｄＧｓｄＡｓｄＴｓ（５ＭｄＣ）ｓ（５ＭｄＣ）ｓ（５ＭｄＣ）ｓｄＧｓｄＧｓｄＡｓｄＴｓｄＴｓ（５ＭｄＣ）ｓｄＧｓＧｂｓＴｂｓＣｂ３’を含み、ＮｂがＬＮＡであり、ｄＮはＤＮＡであり、（５ＭｄＣ）が５－メチル－ｄＣであり、ｓはホスホロチオエートであり、ＴＥＧはトリエチレングリコールであり、ＨＥＧはヘキサエチレングリコールである、請求項１１５に記載の方法。

【請求項117】

前記ペイロードが、ＴＥＧ－ＨＥＧによってコレステロールに連結されている、請求項１１４又は１１５に記載の方法。

【請求項118】

前記細胞外ベシクルが、少なくとも約１×１０^１１、少なくとも約２×１０^１１、少なくとも約３×１０^１１、少なくとも約４×１０^１１、少なくとも約５×１０^１１、少なくとも約６×１０^１１、少なくとも約７×１０^１１、少なくとも約８×１０^１１、少なくとも約９×１０^１１、少なくとも約１×１０^１２、少なくとも約２×１０^１２、少なくとも約３×１０^１２、少なくとも約４×１０^１２、少なくとも約５×１０^１２、少なくとも約６×１０^１２、少なくとも約７×１０^１２、少なくとも約８×１０^１２、少なくとも約９×１０^１２、少なくとも約１×１０^１３、少なくとも約２×１０^１３、少なくとも約３．０×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約４×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約５×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約６×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約７×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約８×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約９×１０^１３ｐ／ｍＬ、又は少なくとも約１×１０^１４個の粒子／ｍＬの濃度である、請求項１～１１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項119】

前記細胞外ベシクルが、約１×１０^１２～約５×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約１×１０^１２～約４×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約１×１０^１２～約３×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約１×１０^１２～約２×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約２×１０^１２～約５×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約２×１０^１２～約４×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約２×１０^１２～約３×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約２×１０^１２～約２×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約３×１０^１２～約５×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約３×１０^１２～約４×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約３×１０^１２～約３×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約３×１０^１２～約２×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約４×１０^１２～約５×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約４×１０^１２～約４×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約４×１０^１２～約３×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約４×１０^１２～約２×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約５×１０^１２～約５×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約５×１０^１２～約４×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約５×１０^１２～約３×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、又は約５×１０^１２～約２×１０^１３個の間の粒子／ｍＬの濃度である、請求項１～１１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項120】

前記細胞外ベシクルが、約５×１０^１２～約２×１０^１３個の間の粒子／ｍＬの濃度である、請求項１～１１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項121】

前記細胞外ベシクルが、約１×１０^１３個の粒子／ｍＬの濃度である、請求項１～１２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項122】

前記細胞外ベシクルが、前記細胞外ベシクルの膜にタンパク質をさらに含む、請求項１～１２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項123】

前記タンパク質が、プロスタグランジンＦ２受容体陰性調節因子（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンベータ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンアルファ－４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；ＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）；これらの機能的断片；及びこれらの任意の組合せを含む、請求項１２２に記載の方法。

【請求項124】

前記タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮタンパク質又はその機能的断片を含む、請求項１２３に記載の方法。

【請求項125】

請求項１～１２４のいずれか一項に記載の方法によって調製された細胞外ベシクル。

【請求項126】

細胞外ベシクルの外部表面にペイロードを含む細胞外ベシクルであって、前記細胞外ベシクルの前記表面のペイロードの数が、少なくとも約１，０００個、少なくとも約２，０００個、少なくとも約３，０００個、少なくとも約４０００個、少なくとも約５０００個、少なくとも約６０００個、少なくとも約７０００個、少なくとも約８０００個、少なくとも約９０００個、少なくとも約１０，０００個、少なくとも約１１，０００個、少なくとも約１２０００個、少なくとも約１３，０００個、少なくとも約１４，０００個、少なくとも約１５，０００個、少なくとも約１６，０００個、少なくとも約１７，０００個、少なくとも約１８，０００個、少なくとも約２０，０００個、少なくとも約２５，０００個、又は少なくとも約３０，０００個である、細胞外ベシクル。

【請求項127】

前記細胞外ベシクルの前記表面のペイロードの数が、約５，０００～約２０，０００個の間、約６，０００～約２０，０００個の間、約７，０００～約２０，０００個の間、約８，０００～約２０，０００個の間、約９，０００～約２０，０００個の間、約１０，０００～約２０，０００個の間、約５，０００～約１８，０００個の間、約６，０００～約１８，０００個の間、約７，０００～約１８，０００個の間、約８，０００～約１８，０００個の間、約９，０００～約１８，０００個の間、約１０，０００～約１８，０００個の間、約５，０００～約１５，０００個の間、約６，０００～約１５，０００個の間、約７，０００～約１５，０００個の間、約８，０００～約１５，０００個の間、約９，０００～約１５，０００個の間、又は約１０，０００～約１５，０００個の間である、請求項１２６に記載の細胞外ベシクル。

【請求項128】

前記細胞外ベシクルの前記表面のペイロードの数が、約１０，０００～約１５，０００個の間である、請求項１２６に記載の細胞外ベシクル。

【請求項129】

前記ペイロードが、配列番号４１～１１２のいずれか１つに記載されているヌクレオチド配列を含む、請求項１２６～１２８のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル。

【請求項130】

前記ペイロードが、ステロール、ＧＭ１、脂質、リン脂質、ビタミン、小分子、ペプチド、又はこれらの組合せにコンジュゲートされている、請求項１２９に記載の方法。

【請求項131】

前記ペイロードが、コレステロールにコンジュゲートされている、請求項１３０に記載の細胞外ベシクル。

【請求項132】

前記ペイロードが、５’ＧｂｓＣｂｓＡｂｓｄＡｓｄＧｓｄＡｓｄＴｓ（５ＭｄＣ）ｓ（５ＭｄＣ）ｓ（５ＭｄＣ）ｓｄＧｓｄＧｓｄＡｓｄＴｓｄＴｓ（５ＭｄＣ）ｓｄＧｓＧｂｓＴｂｓＣｂ３’（配列番号４８）を含み、ＮｂがＬＮＡであり、ｄＮがＤＮＡであり、（５ＭｄＣ）が５－メチル－ｄＣであり、ｓがホスホロチオエートである、請求項１２６～１３１のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル。

【請求項133】

前記ペイロードが、ＴＥＧ－ＨＥＧによってコレステロールに連結されている、請求項１３２に記載の細胞外ベシクル。

【請求項134】

請求項１２５～１３３のいずれか一項に記載の細胞外ベシクルを含む細胞外ベシクルの集団。

【請求項135】

前記細胞外ベシクルの少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％が、請求項１２６～１３３のいずれか一項に記載の細胞外ベシクルである、請求項１３４に記載の細胞外ベシクルの集団。

【請求項136】

請求項１２５～１３３のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル又は請求項１３４若しくは１３５のいずれか一項に記載の細胞外ベシクルの集団を含む組成物。

【請求項137】

請求項１２５～１３３のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル又は請求項１３４若しくは１３５に記載の細胞外ベシクルの集団を含む医薬組成物。

【請求項138】

それを必要とする対象における疾患又は状態を処置する方法であって、請求項１２５～１３３のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル又は請求項１３４若しくは１３５に記載の細胞外ベシクルの集団を、それを必要とする前記対象に投与するステップを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
[0001]本ＰＣＴ出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２１年２月１７日に出願された米国特許仮出願第６３／１５０，４９７号の優先権の利益を主張する。

【0002】

［ＥＦＳ－ＷＥＢにより電子的に提出された配列表への言及］
[0002]本出願において提出された電子的に提出された配列表（名称：４０００＿１２６ＰＣ０２＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：４６４，８６６バイト；及び作成日：２０２２年２月１７日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0003】

[0003]本開示は、細胞外ベシクル（ＥＶ）にペイロード（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を負荷する方法に関する。一部の態様では、方法は、負荷プロセス中に以下のうちの１つ又は複数をモジュレートするステップを含む：塩濃度、温度、負荷時間、及び供給濃度。本開示は、本明細書に記載の方法を使用して負荷されるペイロードを含むＥＶ（例えば、エクソソーム）にも関する。

【背景技術】

【0004】

[0004]多くの生物活性化合物は、治療を目的とする強力な生物活性を有する。しかし、これらの化合物は、非標的器官において毒性を呈することが多い。非標的組織への曝露を制限するための１つの方法は、小分子を、治療用化合物を特定の細胞型に向けることができる抗体などの親和性に基づく試薬に化学的にコンジュゲートさせることであるが（Ｄｏｓｉｏ，Ｆら、Ｔｏｘｉｎｓ（Ｂａｓｅｌ） ３（７）：８４８～８８３（２０１１））、このアプローチは、抗体に結合することができる目的の化合物の分子数（典型的には、抗体当たり２～６個の分子）、及び非標的細胞に結合せずに、標的となる関連疾患／エフェクター細胞に特異的に結合する抗体の利用可能性／存在によって制限される。これらの２つの問題は、それぞれ効力の低下及びと全身毒性の増加によって抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の使用を制限する。したがって、特定の組織又は器官を選択的に標的とする一方で、同時に治療用化合物への全身曝露を全体的に制限することができる、ＡＤＣよりも高いペイロードを有する送達系が必要とされている。

【0005】

[0005]ＥＶは、細胞内伝達の重要なメディエーターである。薬物送達ビヒクルとして、ＥＶは、多くの治療分野における新しい治療モダリティーとして、従来の薬物送達方法（例えば、ペプチド免疫、ＤＮＡワクチン）よりも多くの利点をもたらす。しかしながら、その利点にもかかわらず、多くのＥＶの臨床的有効性は限られている。例えば、樹状細胞に由来するエクソソーム（ＤＥＸ）は、手術不能の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を有する患者における第一選択化学療法後の維持免疫療法として、第ＩＩ相臨床試験で検討された。しかし、主要評価項目（化学療法中止の４か月後に無増悪生存（ＰＦＳ）を示す患者の少なくとも５０％）に達しなかったため、試験は終了した。Ｂｅｓｓｅ，Ｂ．ら、Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（４）：ｅ１０７１００８（２０１５）。

【0006】

[0006]したがって、ＥＶに基づく技術の治療的使用及び他の適用をより良好に可能にするためには、新しい、より効果的な操作されたＥＶ（例えば、より高いペイロード濃度を含む）が必要である。

【発明の概要】

【0007】

[0007]ペイロードを細胞外ベシクルに負荷する方法であって、約２００ｍＭ、約１９０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１２０ｍＭ、又は約１１０ｍＭ未満の濃度の塩を含む負荷緩衝剤中で、ペイロードを細胞外ベシクルと混合するステップを含む、方法が本明細書において提供される。

【0008】

[0008]一部の態様では、塩濃度は、約１ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約５ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約２０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約３０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約６０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約７０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約８０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約１０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約２０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約３０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約１０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約２０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約３０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約６０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約７０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約８０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１００ｍＭの間、約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ、又は約９０ｍＭ～約１１０ｍＭの間である。ある特定の態様では、塩濃度は、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍ、約１８０ｍＭ、又は約１９０ｍＭである。一部の態様では、塩濃度は、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、又は約１５０ｍＭである。

【0009】

[0009]ペイロードを細胞外ベシクルに負荷する方法であって、約２００ｍＭ～約４５０ｍＭの間の濃度の塩を含む負荷緩衝剤中で、ペイロードを細胞外ベシクルと混合するステップを含む、方法も本明細書において提供される。一部の態様では、塩濃度は、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、又は約４５０ｍＭである。

【0010】

[0010]上記で提供される方法のいずれかについて、一部の態様では、塩は、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ＫＣｌ（塩化カリウム）、ＰＯ_４（リン酸塩）、ＣａＣｌ_２（塩化カルシウム）、ＭｇＣｌ_２（塩化マグネシウム）、Ｍｇ_２ＳＯ_４（硫酸マグネシウム）、ＺｎＣｌ_２（塩化亜鉛）、ＭｎＣｌ_２（塩化マンガン）、ＭｎＳＯ_４（硫酸マンガン）、ＮａＳＣＮ（チオシアン酸ナトリウム）、ＫＳＣＮ（チオシアン酸カリウム）、ＬｉＣｌ（塩化リチウム）、Ｋ_２ＨＰＯ_４（リン酸二カリウム）、Ｎａ_２ＳＯ_４（硫酸ナトリウム）、ＮａＰＯ_４（リン酸ナトリウム）、Ｋ_２ＳＯ_４（リン酸カリウム）、酢酸ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウム、臭化リチウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化リチウム、ヨウ化リチウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、ヨウ化カリウム、硫酸カルシウム、硫酸ナトリウム、三塩化クロム、硫酸クロム、クエン酸ナトリウム、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化イットリウム（ＩＩＩ）、硫酸カリウム、塩化第一鉄、クエン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、塩化第二鉄、アルギニン－ＨＣｌ、又はこれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、塩を含む緩衝剤は、塩を含まないか又は塩の濃度がより低い対応する負荷緩衝剤と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、ＥＶに対するペイロードの負荷を増加させる。

【0011】

[0011]ペイロードを細胞外ベシクルに負荷する方法であって、４℃より高い負荷温度で、ペイロードを細胞外ベシクルと混合するステップを含む、方法が本明細書において提供される。

【0012】

[0012]一部の態様では、負荷温度は、約５℃～約４０℃の間、約１０℃～約４０℃の間、約１５℃～約４０℃の間、約２０℃～約４０℃の間、約２５℃～約４０℃の間、約３０℃～約４０℃の間、約３５℃～約４０℃の間、約５℃～約３８℃の間、約１０℃～約３８℃の間、約１５℃～約３８℃の間、約２０℃～約３８℃の間、約２５℃～約３８℃の間、約３０℃～約３８℃の間、約３５℃～約３８℃の間、約５℃～約３７℃の間、約１０℃～約３７℃の間、約１５℃～約３７℃の間、約２０℃～約３７℃の間、約２５℃～約３７℃の間、約３０℃～約３７℃の間、又は約３５℃～約３７℃の間である。ある特定の態様では、負荷温度は、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、又は約７０℃である。

【0013】

[0013]一部の態様では、負荷温度は、負荷温度よりも低い参照温度での負荷と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、ＥＶに対するペイロードの負荷を増加させる。

【0014】

[0014]ペイロードを細胞外ベシクルに負荷する方法であって、約１時間より長い負荷期間、ペイロードを細胞外ベシクルと混合するステップを含む、方法が本明細書において提供される。

【0015】

[0015]一部の態様では、負荷期間は、約１時間～約４８時間の間、約１時間～約４２時間の間、約１時間～約３６時間の間、約１時間～約３０時間の間、約１時間～約２４時間の間、約６時間～約４８時間の間、約６時間～約４２時間の間、約６時間～約３６時間の間、約６時間～約３０時間の間、約６時間～約２４時間の間、約１２時間～約４８時間の間、約１２時間～約４２時間の間、約１２時間～約３６時間の間、約１２時間～約３０時間の間、又は約１２時間～約２４時間の間である。ある特定の態様では、負荷期間は、約６時間、約１２時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、又は約７日間である。

【0016】

[0016]一部の態様では、負荷期間は、負荷期間よりも短い参照期間での負荷と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、又は少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、ＥＶに対するペイロードの負荷を増加させる。

【0017】

[0017]ペイロードを細胞外ベシクルに負荷する方法であって、２００ｍＭ未満の濃度の塩を含む負荷緩衝剤中で、約５℃～約５０℃の間の負荷温度で、１時間～約４８時間の間の負荷期間、ペイロードを細胞外ベシクルと混合するステップを含む、方法も本明細書において提供される。

【0018】

[0018]一部の態様では、塩濃度は、約１ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約５ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約２０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約３０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約６０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約７０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約８０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約１０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約２０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約３０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約１０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約２０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約３０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約６０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約７０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約８０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１００ｍＭの間、約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ、又は約９０ｍＭ～約１１０ｍＭの間である。ある特定の態様では、塩濃度は、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍ、約１８０ｍＭ、又は約１９０ｍＭである。一部の態様では、塩濃度は、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、又は約１５０ｍＭである。

【0019】

[0019]一部の態様では、塩は、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ＫＣｌ（塩化カリウム）、ＰＯ_４（リン酸塩）、ＣａＣｌ_２（塩化カルシウム）、ＭｇＣｌ_２（塩化マグネシウム）、Ｍｇ_２ＳＯ_４（硫酸マグネシウム）、ＺｎＣｌ_２（塩化亜鉛）、ＭｎＣｌ_２（塩化マンガン）、ＭｎＳＯ_４（硫酸マンガン）、ＮａＳＣＮ（チオシアン酸ナトリウム）、ＫＳＣＮ（チオシアン酸カリウム）、ＬｉＣｌ（塩化リチウム）、Ｋ_２ＨＰＯ_４（リン酸二カリウム）、Ｎａ_２ＳＯ_４（硫酸ナトリウム）、ＮａＰＯ_４（リン酸ナトリウム）、Ｋ_２ＳＯ_４（リン酸カリウム）、酢酸ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウム、臭化リチウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化リチウム、ヨウ化リチウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、ヨウ化カリウム、硫酸カルシウム、硫酸ナトリウム、三塩化クロム、硫酸クロム、クエン酸ナトリウム、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化イットリウム（ＩＩＩ）、硫酸カリウム、塩化第一鉄、クエン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、塩化第二鉄、アルギニン－ＨＣｌ、又はこれらの任意の組合せを含む。

【0020】

[0020]一部の態様では、負荷温度は、約５℃～約４０℃の間、約１０℃～約４０℃の間、約１５℃～約４０℃の間、約２０℃～約４０℃の間、約２５℃～約４０℃の間、約３０℃～約４０℃の間、約３５℃～約４０℃の間、約５℃～約３８℃の間、約１０℃～約３８℃の間、約１５℃～約３８℃の間、約２０℃～約３８℃の間、約２５℃～約３８℃の間、約３０℃～約３８℃の間、約３５℃～約３８℃の間、約５℃～約３７℃の間、約１０℃～約３７℃の間、約１５℃～約３７℃の間、約２０℃～約３７℃の間、約２５℃～約３７℃の間、約３０℃～約３７℃の間、又は約３５℃～約３７℃の間である。ある特定の態様では、負荷温度は、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、又は約５０℃である。

【0021】

[0021]一部の態様では、負荷期間は、約１時間～約４８時間の間、約１時間～約４２時間の間、約１時間～約３６時間の間、約１時間～約３０時間の間、約１時間～約２４時間の間、約６時間～約４８時間の間、約６時間～約４２時間の間、約６時間～約３６時間の間、約６時間～約３０時間の間、約６時間～約２４時間の間、約１２時間～約４８時間の間、約１２時間～約４２時間の間、約１２時間～約３６時間の間、約１２時間～約３０時間の間、又は約１２時間～約２４時間の間である。ある特定の態様では、負荷期間は、約６時間、約１２時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、又は約４８時間である。

【0022】

[0022]一部の態様では、塩濃度は、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭの間であり、負荷温度は、約３０℃～約４０℃の間であり、負荷期間は、約２０時間～約３０時間の間である。一部の態様では、塩濃度は、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭの間であり、負荷温度は、約３０℃～約４０℃の間であり、負荷期間は、約１２時間～約３０時間の間である。

【0023】

[0023]本開示は、ペイロードを細胞外ベシクルに負荷する方法であって、約１００ｍＭの濃度の塩を含む負荷緩衝剤中で、約３７℃の負荷温度で、約２４時間の負荷期間、ペイロードを細胞外ベシクルと混合するステップを含む、方法もさらに提供する。

【0024】

[0024]一部の態様では、塩濃度での負荷温度における負荷期間中の負荷は、塩を含まない、４℃の温度の、及び／又は１時間の期間の負荷と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、細胞外ベシクルに対するペイロードの負荷を増加させる。

【0025】

[0025]ペイロードを細胞外ベシクルに負荷する方法であって、約１５０ｍＭ～約４５０ｍＭの間の濃度の塩を含む負荷緩衝剤中で、約３７℃～約７０℃の間の負荷温度で、約２４時間～約７日間の間の負荷期間、ペイロードを細胞外ベシクルと混合するステップを含む、方法も本明細書において提供される。一部の態様では、塩濃度は、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、又は約４５０ｍＭである。一部の態様では、塩は、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ＫＣｌ（塩化カリウム）、ＰＯ_４（リン酸塩）、ＣａＣｌ_２（塩化カルシウム）、ＭｇＣｌ_２（塩化マグネシウム）、Ｍｇ_２ＳＯ_４（硫酸マグネシウム）、ＺｎＣｌ_２（塩化亜鉛）、ＭｎＣｌ_２（塩化マンガン）、ＭｎＳＯ_４（硫酸マンガン）、ＮａＳＣＮ（チオシアン酸ナトリウム）、ＫＳＣＮ（チオシアン酸カリウム）、ＬｉＣｌ（塩化リチウム）、Ｋ_２ＨＰＯ_４（リン酸二カリウム）、Ｎａ_２ＳＯ_４（硫酸ナトリウム）、ＮａＰＯ_４（リン酸ナトリウム）、Ｋ_２ＳＯ_４（リン酸カリウム）、酢酸ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウム、臭化リチウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化リチウム、ヨウ化リチウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、ヨウ化カリウム、硫酸カルシウム、硫酸ナトリウム、三塩化クロム、硫酸クロム、クエン酸ナトリウム、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化イットリウム（ＩＩＩ）、硫酸カリウム、塩化第一鉄、クエン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、塩化第二鉄、アルギニン－ＨＣｌ、又はこれらの任意の組合せを含む。

【0026】

[0026]上記パラグラフに記載の方法について、一部の態様では、負荷温度は、約３７℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、又は約７０℃である。一部の態様では、負荷期間は、約２４時間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、又は約７日間である。

【0027】

[0027]上記で提供される方法のいずれかについて、一部の態様では、方法は、混合するステップの後に、ＥＶに負荷されたペイロードの量を測定するステップと、ＥＶの負荷密度を決定するステップとをさらに含む。一部の態様では、１つ又は複数負荷パラメーターは、ＥＶの負荷密度をさらに増加させるために調整され、１つ又は複数の負荷パラメーターは、負荷緩衝剤の塩濃度、負荷温度、負荷期間、ペイロード供給濃度、ＥＶ供給濃度、又はこれらの組合せから選択される。一部の態様では、ＥＶに負荷されたペイロードの量は、粒子カウンター、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）、紫外線吸収、可視吸収、蛍光、近赤外、赤外、静的光散乱、動的光散乱、オブスキュレーション、ラマン分光法、濁度、又はこれらの組合せを使用して測定される。

【0028】

[0028]細胞外ベシクル（ＥＶ）への負荷後に、ＥＶからのペイロードの解離を減少させる方法であって、本明細書において提供される負荷方法（例えば、上記で提供されるものなど）のいずれかに従って、ペイロードをＥＶに負荷するステップを含む、方法も本明細書において提供される。一部の態様では、ＥＶからのペイロードの解離は、本明細書において提供される負荷方法のいずれかに従わずに、ペイロードがＥＶに負荷された場合に観察される対応する解離と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は約１００％低減される。

【0029】

[0029]ペイロードが負荷された細胞外ベシクル（ＥＶ）の安定性を増加させる方法であって、本明細書において提供される負荷方法のいずれかに従って、ペイロードをＥＶに負荷するステップを含む、方法が本明細書において提供される。一部の態様では、ペイロードが負荷されたＥＶの安定性は、本開示の負荷方法のいずれかに従わずに、ペイロードがＥＶに負荷された場合に観察される対応する安定性と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上増加する。

【0030】

[0030]本開示は、ペイロードが負荷された後に、細胞外ベシクルの１つ又は複数の特性を改善する方法であって、本明細書において提供される負荷方法のいずれかに従って、ペイロードをＥＶに負荷するステップを含む、方法をさらに提供する。一部の態様では、１つ又は複数の特性は、粒子間相互作用、粒子剛性、粒子サイズ、又はこれらの組合せを含む。一部の態様では、１つ又は複数の特性の改善は、ＥＶの濾過性の増加を可能にする。

【0031】

[0031]上記で提供される方法のいずれかについて、一部の態様では、負荷緩衝剤は、１つ又は複数の構成成分をさらに含む。ある特定の態様では、１つ又は複数の構成成分は、トリス、スクロース、グルコース、トレハロース、マンノース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、ヒスチジン、アルギニン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ポリマー、界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０及び２０）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、クエン酸塩）、無機酸、又はこれらの任意の組合せを含む。

【0032】

[0032]一部の態様では、負荷緩衝剤は、スクロースをさらに含む。ある特定の態様では、スクロースは、約１０％ｗ／ｖ未満、約９％ｗ／ｖ未満、約８％ｗ／ｖ未満、約７％ｗ／ｖ未満、約６％ｗ／ｖ未満、約５％ｗ／ｖ未満、約４％ｗ／ｖ未満、約３％ｗ／ｖ未満、又は約２．５％ｗ／ｖ未満の濃度である。一部の態様では、スクロースは、約１％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖの間、約２％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖの間、約３％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖの間、約４％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖの間、約５％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖの間、約１％ｗ／ｖ～約８％ｗ／ｖの間、約２％ｗ／ｖ～約８％ｗ／ｖの間、約３％ｗ／ｖ～約８％ｗ／ｖの間、約４％ｗ／ｖ～約８％ｗ／ｖの間、約５％ｗ／ｖ～約８％ｗ／ｖの間、約１％ｗ／ｖ～約５％ｗ／ｖの間、約２％ｗ／ｖ～約５％ｗ／ｖの間、約３％ｗ／ｖ～約５％ｗ／ｖの間、約４％ｗ／ｖ～約５％ｗ／ｖの間、又は約５％ｗ／ｖ～約６％ｗ／ｖの間の濃度である。

【0033】

[0033]一部の態様では、負荷緩衝剤は、約１００～約６００ｍＯｓｍ／ｋｇの間のモル浸透圧濃度である。一部の態様では、負荷緩衝剤は、約２７５～約４５０の間、約２８０～約４５０の間、約３００～約４５０の間、約２７５～約４００の間、約２８０～約４００の間、約３００～約４００の間、約２７５～約３８０の間、約２８０～約３８０の間、約３００～約３８０の間、約２７５～約３５０の間、約２８０～約３５０の間、約３００～約３５０の間、約２７５～約３１０の間、約２８０～約３１０の間、又は約３００～約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの間のモル浸透圧濃度である。ある特定の態様では、負荷緩衝剤は、約３６０、約３７０、約３８０、約３９０、約３９５、又は約４００ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度である。一部の態様では、負荷緩衝剤は、約１００～約６００ｍＯｓｍ／ｋｇの間のモル浸透圧濃度である。

【0034】

[0034]一部の態様では、負荷緩衝剤は、約６～約８の間のｐＨである。ある特定の態様では、ｐＨは、約６～約７の間又は約７～約８の間である。一部の態様では、ｐＨは、約６、約７、又は約８である。一部の態様では、負荷緩衝剤は、約９のｐＨである。

【0035】

[0035]一部の態様では、本明細書において提供される負荷方法のいずれかを使用してＥＶに負荷され得るペイロードは、ペプチド、小分子、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＰＭＯ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｃＲＮＡ、アンタゴミル、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ペプチド核酸、細胞透過性ペプチド、アジュバント、タンパク質、炭水化物、糖、アミノ酸、又はこれらの任意の組合せを含む。

【0036】

[0036]一部の態様では、ペイロードは、核酸を含む。一部の態様では、核酸は、約４０未満、約３５未満、約３０未満、約２５未満、約２０未満、約１９未満、約１８未満、約１７未満、約１６未満、又は約１５未満のヌクレオチドの長さの連続配列を含む。

【0037】

[0037]核酸が、約１０～約３０の間、約１４～約３０の間、約１５～約３０の間、約１６～約３０の間、約１７～約３０の間、約１８～約３０の間、約１９～約３０の間、約２０～約３０の間、約１０～約２５の間、約１４～約２５の間、約１５～約２５の間、約１６～約２５の間、約１７～約２５の間、約１８～約２５の間、約１９～約２５の間、約２０～約２５の間、約１０～約２２の間、約１４～約２２の間、約１５～約２２の間、約１６～約２２の間、約１７～約２２の間、約１８～約２２の間、約１９～約２２の間、又は約２０～約２２の間の長さの連続配列を含む、請求項３９に記載の方法。

【0038】

[0038]一部の態様では、ペイロードは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の遺伝子に特異的に結合し、１つ又は複数の遺伝子にコードされるタンパク質の発現を低下させる。一部の態様では、１つ又は複数の遺伝子は、ＳＴＡＴ６、Ｋｒａｓ、Ｎｒａｓ、ＰＭＰ２２、Ｃ／ＥＢＰβ、ＳＴＡＴ３、ＮＬＲＰ３、又はこれらの任意の組合せを含む。

【0039】

[0039]一部の態様では、負荷緩衝剤中のペイロードは、約１００μＭ～約１０００μＭの間の濃度である。一部の態様では、負荷緩衝剤中のペイロードは、約１００μＭ～約２００μＭの間、約２００μＭ～約３００μＭの間、約３００μＭ～約４００μＭの間、約４００μＭ～約５００μＭの間、約５００μＭ～約６００μＭの間、約６００μＭ～約７００μＭの間、約７００μＭ～約８００μＭの間、約８００μＭ～約９００μＭの間、又は約９００μＭ～約１０００μＭの間の濃度である。ある特定の態様では、負荷緩衝剤中のペイロードは、約１００μＭ、約２００μＭ、約３００μＭ、約４００μＭ、約５００μＭ、約６００μＭ、約７００μＭ、約８００μＭ、約９００μＭ、又は約１０００μＭの濃度である。一部の態様では、負荷緩衝剤中のペイロードは、約１０００μＭ～約２５００μＭの間の濃度である。一部の態様では、ペイロードは、配列番号４１～１１２のいずれか１つに記載されているヌクレオチド配列を含み、ペイロードの濃度は、約６００μＭである。

【0040】

[0040]一部の態様では、ペイロードは、アンカー部分にコンジュゲートされている。ある特定の態様では、アンカー部分は、ステロール、ＧＭ１、脂質、リン脂質、ビタミン、小分子、ペプチド、又はこれらの組合せを含む。

【0041】

[0041]一部の態様では、アンカー部分は、少なくとも約６個の炭素原子、少なくとも７個の炭素原子、少なくとも８個の炭素原子、少なくとも９個の炭素原子、少なくとも１０個の炭素原子、少なくとも１１個の炭素原子、少なくとも１２個の炭素原子、少なくとも１３個の炭素原子、少なくとも１４個の炭素原子、少なくとも１５個の炭素原子、少なくとも１６個の炭素原子、少なくとも１７個の炭素原子、少なくとも１８個の炭素原子、少なくとも１９個の炭素原子、少なくとも２０個の炭素原子、少なくとも２５個の炭素原子、少なくとも３０個の炭素原子、少なくとも３５個の炭素原子、少なくとも４０個の炭素原子、少なくとも４５個の炭素原子、少なくとも５０個の炭素原子、少なくとも５５個の炭素原子、少なくとも６０個の炭素原子、少なくとも６５個の炭素原子、少なくとも７０個の炭素原子、少なくとも７５個の炭素原子、少なくとも８０個の炭素原子、少なくとも８５個の炭素原子、又は少なくとも９０個の炭素原子を含む。

【0042】

[0042]一部の態様では、アンカー部分は、ステロール、ステロイド、ホパノイド、ヒドロキシステロイド、セコステロイド、若しくはそのアナログ、又はこれらの任意の組合せを含む。ある特定の態様では、アンカー部分は、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、コレステロール、２４Ｓ－ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、シクロアルテノール、フコステロール、サリングステロール、カンペステロール、β－シトステロール、シトスタノール、コプロスタノール、アベナステロール、スチグマステロール、又はこれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、アンカー部分は、

【化1】

からなる群から選択される構造を有する、コレステロール又は誘導体である。

【0043】

[0043]一部の態様では、アンカー部分はステロイドを含み、ステロイドは、ジヒドロテストステロン、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン、プロゲステロン、コルチゾール、又はこれらの任意の組合せである。ある特定の態様では、アンカー部分は、脂質を含む。

【0044】

[0044]一部の態様では、アンカー部分は、Ｃ_２～Ｃ_６０鎖を含む。ある特定の態様では、アンカー部分は、Ｃ_４～Ｃ_４０、Ｃ_２～Ｃ_３８、Ｃ_２～Ｃ_３６、Ｃ_２～Ｃ_３４、Ｃ_２～Ｃ_３２、Ｃ_２～Ｃ_３０、Ｃ_４～Ｃ_３０、Ｃ_２～Ｃ_２８、Ｃ_４～Ｃ_２８、Ｃ_２～Ｃ_２６、Ｃ_４～Ｃ_２６、Ｃ_２～Ｃ_２４、Ｃ_４～Ｃ_２４、Ｃ_６～Ｃ_２４、Ｃ_８～Ｃ_２４、Ｃ_１０～Ｃ_２４、Ｃ_２～Ｃ_２２、Ｃ_４～Ｃ_２２、Ｃ_６～Ｃ_２２、Ｃ_８～Ｃ_２２、Ｃ_１０～Ｃ_２２、Ｃ_２～Ｃ_２０、Ｃ_４～Ｃ_２０、Ｃ_６～Ｃ_２０、Ｃ_８～Ｃ_２０、Ｃ_１０～Ｃ_２０、Ｃ_２～Ｃ_１８、Ｃ_４～Ｃ_１８、Ｃ_６～Ｃ_１８、Ｃ_８～Ｃ_１８、Ｃ_１０～Ｃ_１８、Ｃ_１２～Ｃ_１８、Ｃ_１４～Ｃ_１８、Ｃ_１６～Ｃ_１８、Ｃ_２～Ｃ_１６、Ｃ_４～Ｃ_１６、Ｃ_６～Ｃ_１６、Ｃ_８～Ｃ_１６、Ｃ_１０～Ｃ_１６、Ｃ_１２～Ｃ_１６、Ｃ_１４～Ｃ_１６、Ｃ_２～Ｃ_１５、Ｃ_４～Ｃ_１５、Ｃ_６～Ｃ_１５、Ｃ_８～Ｃ_１５、Ｃ_９～Ｃ_１５、Ｃ_１０～Ｃ_１５、Ｃ_１１～Ｃ_１５、Ｃ_１２～Ｃ_１５、Ｃ_１３～Ｃ_１５、Ｃ_２～Ｃ_１４、Ｃ_４～Ｃ_１４、Ｃ_６～Ｃ_１４、Ｃ_８～Ｃ_１４、Ｃ_９～Ｃ_１４、Ｃ_１０～Ｃ_１４、Ｃ_１１～Ｃ_１４、Ｃ_１２～Ｃ_１４、Ｃ_２～Ｃ_１３、Ｃ_４～Ｃ_１３、Ｃ_６～Ｃ_１３、Ｃ_７～Ｃ_１３、Ｃ_８～Ｃ_１３、Ｃ_９～Ｃ_１３、Ｃ_１０～Ｃ_１３、Ｃ_１０～Ｃ_１３、Ｃ_１１～Ｃ_１３、Ｃ_２～Ｃ_１２、Ｃ_４～Ｃ_１２、Ｃ_６～Ｃ_１２、Ｃ_７～Ｃ_１２、Ｃ_８～Ｃ_１２、Ｃ_９～Ｃ_１２、Ｃ_１０～Ｃ_１２、Ｃ_２～Ｃ_１１、Ｃ_４～Ｃ_１１、Ｃ_６～Ｃ_１１、Ｃ_７～Ｃ_１１、Ｃ_８～Ｃ_１１、Ｃ_９～Ｃ_１１、Ｃ_２～Ｃ_１０、Ｃ_４～Ｃ_１０、Ｃ_２～Ｃ_９、Ｃ_４～Ｃ_９、Ｃ_２～Ｃ_８、Ｃ_２～Ｃ_７、Ｃ_４～Ｃ_７、Ｃ_２～Ｃ_６、又はＣ_４～Ｃ_６鎖を含む。

【0045】

[0045]一部の態様では、アンカー部分は、直鎖脂肪酸、分岐脂肪酸、不飽和脂肪酸、モノ不飽和脂肪酸、ポリ不飽和脂肪酸、ヒドロキシ脂肪酸、ポリカルボン酸、又はこれらの任意の組合せを含む。

【0046】

[0046]一部の態様では、アンカー部分は、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ヘキサコサン酸、オクタコサン酸、トリアコンタン酸及びｎ－ドトリアコンタン酸、並びにプロピオン酸、ｎ－吉草酸、エナント酸、ペラルゴン酸、ヘンデカン酸、トリデカン酸、ペンタデカン酸、ヘプタデカン酸、ノナデカン酸、ヘネイコサン酸、トリコサン酸、ペンタコサン酸、ヘプタコサン酸などの奇数の炭素原子を有するもの、又はこれらの任意の組合せである直鎖脂肪酸を含む。一部の態様では、アンカー部分は、イソ酪酸、イソカプロン酸、イソカプリル酸、イソカプリン酸、イソラウリン酸、１１－メチルドデカン酸、イソミリスチン酸、１３－メチル－テトラデカン酸、イソパルミチン酸、１５－メチル－ヘキサデカン酸、イソステアリン酸、１７－メチルオクタデカン酸、イソアラキン酸、１９－メチルエイコサン酸、α－エチルヘキサン酸、α－ヘキシルデカン酸、α－ヘプチルウンデカン酸、２－デシルテトラデカン酸、２－ウンデシルテトラデカン酸、２－デシルペンタデカン酸、２－ウンデシルペンタデカン酸、ファインオキソコール（Ｆｉｎｅ ｏｘｏｃｏｌ） １８００酸（日産化学工業株式会社（Ｎｉｓｓａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）の製品）、６－メチル－オクタン酸、８－メチル－デカン酸、１０－メチル－ドデカン酸、１２－メチル－テトラデカン酸、１４－メチル－ヘキサデカン酸、１６－メチルオクタデカン酸、１８－メチルエイコサン酸、２０－メチルドコサン酸、２２－メチルテトラコサン酸、２４－メチルヘキサコサン酸、及び２６－メチルオクタコサン酸などのイソブチル基で終結するアンテイソ脂肪酸、又はこれらの任意の組合せである分岐脂肪酸を含む。一部の態様では、アンカー部分は、４－デセン酸、カプロレイン酸（ｃａｐｒｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、４－ドデセン酸、５－ドデセン酸、ラウロレイン酸（ｌａｕｒｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、４－テトラデセン酸、５－テトラデセン酸、９－テトラデセン酸、パルミトレイン酸、６－オクタデセン酸、オレイン酸、９－オクタデセン酸、１１－オクタデセン酸、９－エイコセン酸、ｃｉｓ－１１－エイコセン酸、セトオレイン酸、１３－ドコセン酸、１５－テトラコセン酸、１７－ヘキサコセン酸、６，９，１２，１５－ヘキサデカテトラエン酸、リノール酸、リノレン酸、α－エレオステアリン酸、β－エレオステアリン酸、プニカ酸、６，９，１２，１５－オクタデカテトラエン酸、パリナリン酸、５，８，１１，１４－エイコサテトラエン酸、５，８，１１，１４，１７－エイコサペンタエン酸、７，１０，１３，１６，１９－ドコサペンタエン酸、４，７，１０，１３，１６，１９－ドコサヘキサエン酸、又はこれらの任意の組合せである不飽和脂肪酸を含む。一部の態様では、アンカー部分は、α－ヒドロキシラウリン酸、α－ヒドロキシミリスチン酸、α－ヒドロキシパルミチン酸、α－ヒドロキシステアリン酸、ω－ヒドロキシラウリン酸、α－ヒドロキシアラキン酸、９－ヒドロキシ－１２－オクタデセン酸、リシノール酸、α－ヒドロキシベヘン酸、９－ヒドロキシ－ｔｒａｎｓ－１０，１２－オクタデカジエン酸、カモレン酸、イプロール酸、９，１０－ジヒドロキシステアリン酸、１２－ヒドロキシステアリン酸、又はこれらの任意の組合せであるヒドロキシ脂肪酸を含む。一部の態様では、アンカー部分は、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、Ｄ，Ｌ－リンゴ酸、又はこれらの任意の組合せであるポリカルボン酸を含む。

【0047】

[0047]一部の態様では、アンカー部分は、リン脂質を含む。一部の態様では、リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、又はこれらの任意の組合せである。

【0048】

[0048]一部の態様では、アンカー部分は、ビタミンを含む。一部の態様では、アンカー部分は、ビタミンＤ、ビタミンＫ、ナイアシン、ピリドキシン、ビタミンＥ、又はこれらの任意の組合せを含む。

【0049】

[0049]一部の態様では、アンカー部分は、ペイロードとアンカー部分との間にリンカーをさらに含む。

【0050】

[0050]一部の態様では、リンカーは、非切断性リンカーを含む。一部の態様では、非切断性リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロール、アルキル、ホスホロチオエート、スクシンイミド、マレイミド、又はこれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、非切断性リンカーは、式Ｒ３－（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｎ－又はＲ３－（０－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｎ－Ｏ－（式中、Ｒ３は、水素、メチル又はエチルであり、ｎは、２～２００の間の整数である）によって特徴付けられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。一部の態様では、非切断性リンカーは、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、ペンタエチレングリコール、又はこれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、リンカーは、式（（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＨ－ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－）（式中、Ｒ３は、水素、メチル又はエチルであり、ｎは、３～２００の間の整数である）を有するポリグリセロール（ＰＧ）を含む。一部の態様では、リンカーは、ジグリセロール、トリグリセロール、テトラグリセロール（ＴＧ）、ペンタグリセロール、ヘキサグリセロール（ＨＧ）、又はこれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、リンカーは、アルキルを含む。

【0051】

[0051]一部の態様では、リンカーは、切断性リンカーを含む。一部の態様では、切断性リンカーは、酸化還元切断性リンカー、活性酸素種切断性リンカー、ｐＨ依存性切断性リンカー、酵素切断性リンカー、プロテアーゼ切断性リンカー、エステラーゼ切断性リンカー、酸化還元酵素切断性リンカー、ホスホリパーゼ切断性リンカー、ホスファターゼ切断性リンカー、光活性化切断性リンカー、自己犠牲リンカー、又はこれらの任意の組合せである。一部の態様では、切断性リンカーは、自己犠牲リンカーである。一部の態様では、切断性リンカーは、シンナミル基、ナフチル基、ビフェニル基、複素環式環、ホモ芳香族基、クマリン、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピロール、ピラゾール、ピリジン、イミダゾン、トリアゾール、又はこれらの任意の組合せである。

【0052】

[0052]一部の態様では、リンカーは、式：
－Ａ_ａ－Ｙ_ｙ－
（式中、各－Ａ－は、独立的にアミノ酸単位であり、ａは、独立的に１～１２の整数であり；－Ｙ－は、スペーサー単位であり、ｙは、０、１、又は２である）を有する。一部の態様では、－Ａ_ａ－は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、又はヘキサペプチドである。一部の態様では、ａは２であり、－Ａ_ａ－は、バリン－アラニン、バリン－シトルリン、グルタミン酸－バリン－シトルリン、フェニルアラニン－リシン、Ｎ－メチルバリン－シトルリン、グリシン－ヒスチジン－ロイシン－グリシン、シクロヘキシルアラニン－リシン、及びベータ－アラニン－リシンからなる群から選択される。一部の態様では、－Ａ_ａ－は、バリン－アラニン、又はバリン－シトルリン、又はグルタミン酸－バリン－シトルリンである。一部の態様では、－Ａ_ａ－は、アルギニン、リシン、又はその両方である。一部の態様では、ｙは、１である。一部の態様では、－Ｙ－は、自己犠牲スペーサーである。一部の態様では、－Ｙ_ｙ－は、式（Ｖ）：

【化2】

（式中、各Ｒ^２は、独立的にＣ_１～８アルキル、－Ｏ－（Ｃ_１～８アルキル）、ハロゲン、ニトロ、又はシアノであり；ｍは、０～４の整数である）を有する。一部の態様では、ｍは、０、１、又は２である。一部の態様では、ｍは、０である。一部の態様では、切断性リンカーは、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメート又はバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートである。

【0053】

[0053]一部の態様では、アンカー部分は、

【化3】

を含む。

【0054】

[0054]一部の態様では、方法は、（ｉ）ペイロードが、配列番号４１～１１２のいずれか１つに記載されているヌクレオチド配列を含むこと、及び（ｉｉ）表１又は表２のリンカーの組合せから選択されるリンカーを含む。

【0055】

[0055]一部の態様では、ペイロードは、コレステロールにコンジュゲートされている。一部の態様では、ペイロードは、５’ＧｂｓＣｂｓＡｂｓｄＡｓｄＧｓｄＡｓｄＴｓ（５ＭｄＣ）ｓ（５ＭｄＣ）ｓ（５ＭｄＣ）ｓｄＧｓｄＧｓｄＡｓｄＴｓｄＴｓ（５ＭｄＣ）ｓｄＧｓＧｂｓＴｂｓＣｂ３’を含み、ＮｂはＬＮＡであり、ｄＮはＤＮＡであり、（５ＭｄＣ）は５－メチル－ｄＣであり、ｓはホスホロチオエートであり、ＴＥＧはトリエチレングリコールであり、ＨＥＧはヘキサエチレングリコールである。一部の態様では、ペイロードは、ＴＥＧ－ＨＥＧによってコレステロールに連結されている。

【0056】

[0056]一部の態様では、細胞外ベシクルは、少なくとも約１×１０^１１、少なくとも約２×１０^１１、少なくとも約３×１０^１１、少なくとも約４×１０^１１、少なくとも約５×１０^１１、少なくとも約６×１０^１１、少なくとも約７×１０^１１、少なくとも約８×１０^１１、少なくとも約９×１０^１１、少なくとも約１×１０^１２、少なくとも約２×１０^１２、少なくとも約３×１０^１２、少なくとも約４×１０^１２、少なくとも約５×１０^１２、少なくとも約６×１０^１２、少なくとも約７×１０^１２、少なくとも約８×１０^１２、少なくとも約９×１０^１２、少なくとも約１×１０^１３、少なくとも約２×１０^１３、少なくとも約３×１０^１３、少なくとも約４×１０^１３、少なくとも約５×１０^１３、少なくとも約６×１０^１３、少なくとも約７×１０^１３、少なくとも約８×１０^１３、少なくとも約９×１０^１３、又は少なくとも約１×１０^１４個の粒子／ｍＬの濃度である。一部の態様では、細胞外ベシクルは、約１×１０^１２～約５×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約１×１０^１２～約４×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約１×１０^１２～約３×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約１×１０^１２～約２×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約２×１０^１２～約５×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約２×１０^１２～約４×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約２×１０^１２～約３×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約２×１０^１２～約２×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約３×１０^１２～約５×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約３×１０^１２～約４×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約３×１０^１２～約３×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約３×１０^１２～約２×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約４×１０^１２～約５×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約４×１０^１２～約４×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約４×１０^１２～約３×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約４×１０^１２～約２×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約５×１０^１２～約５×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約５×１０^１２～約４×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、約５×１０^１２～約３×１０^１３個の間の粒子／ｍＬ、又は約５×１０^１２～約２×１０^１３個の間の粒子／ｍＬの濃度である。一部の態様では、細胞外ベシクルは、約５×１０^１２～約２×１０^１３個の間の粒子／ｍＬの濃度である。一部の態様では、細胞外ベシクルは、約１×１０^１３個の粒子／ｍＬの濃度である。

【0057】

[0057]一部の態様では、細胞外ベシクルは、細胞外ベシクルの膜内にタンパク質をさらに含む。一部の態様では、タンパク質は、プロスタグランジンＦ２受容体陰性調節因子（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンベータ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンアルファ－４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；ＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）；これらの機能的断片；及びこれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮタンパク質又はその機能的断片を含む。

【0058】

[0058]本明細書で開示されている方法のいずれか１つによって調製される細胞外ベシクルが本明細書において提供される。

【0059】

[0059]細胞外ベシクルの外部表面にペイロードを含む細胞外ベシクルであって、細胞外ベシクル表面のペイロードの数が、少なくとも約１０００、少なくとも約２０００、少なくとも約３０００、少なくとも約４０００、少なくとも約５０００、少なくとも約６０００、少なくとも約７０００、少なくとも約８０００、少なくとも約９０００、少なくとも約１０，０００、少なくとも約１１，０００、少なくとも約１２０００、少なくとも約１３，０００、少なくとも約１４，０００、少なくとも約１５，０００、少なくとも約１６，０００、少なくとも約１７，０００、少なくとも約１８，０００、少なくとも約２０，０００、少なくとも約２２，０００、少なくとも約２４，０００、少なくとも約２６，０００、少なくとも約２８，０００、少なくとも約３０，０００、少なくとも約３５，０００、又は少なくとも約４０，０００である、細胞外ベシクルが本明細書において提供される。一部の態様では、細胞外ベシクル表面のペイロードの数は、約５，０００～約２０，０００個、約６，０００～約２０，０００個、約７，０００～約２０，０００個、約８，０００～約２０，０００個、約９，０００～約２０，０００個、約１０，０００～約２０，０００個、約５，０００～約１８，０００個、約６，０００～約１８，０００個、約７，０００～約１８，０００個、約８，０００～約１８，０００個、約９，０００～約１８，０００個、約１０，０００～約１８，０００個、約５，０００～約１５，０００個、約６，０００～約１５，０００個、約７，０００～約１５，０００個、約８，０００～約１５，０００個、約９，０００～約１５，０００個、又は約１０，０００～約１５，０００個の間である。一部の態様では、細胞外ベシクルの表面のペイロードの数は、約１０，０００～約１５，０００個の間である。一部の態様では、ペイロードは、配列番号４１～１１２のいずれか１つに記載されているヌクレオチド配列を含む。

【0060】

[0060]一部の態様では、本明細書で開示されている細胞外ベシクルのペイロードは、ステロール、ＧＭ１、脂質、リン脂質、ビタミン、小分子、ペプチド、又はこれらの組合せにコンジュゲートされている。一部の態様では、ペイロードは、コレステロールにコンジュゲートされている。一部の態様では、ペイロードは、構造：５’ＧｂｓＣｂｓＡｂｓｄＡｓｄＧｓｄＡｓｄＴｓ（５ＭｄＣ）ｓ（５ＭｄＣ）ｓ（５ＭｄＣ）ｓｄＧｓｄＧｓｄＡｓｄＴｓｄＴｓ（５ＭｄＣ）ｓｄＧｓＧｂｓＴｂｓＣｂ３’を含み、ここで、ＮｂはＬＮＡであり、ｄＮはＤＮＡであり、（５ＭｄＣ）は５－メチル－ｄＣであり、ｓはホスホロチオエートである。

【0061】

[0061]本開示は、本明細書に記載の細胞外ベシクルのいずれかを含む、細胞外ベシクルの集団をさらに提供する。一部の態様では、細胞外ベシクルの少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％は、本明細書に記載の細胞外ベシクルのいずれか１つの細胞外ベシクルである。

【0062】

[0062]本明細書に記載の細胞外ベシクル又は細胞外ベシクルの集団のいずれかを含む組成物も本明細書において提供される。本明細書に記載の細胞外ベシクル又は細胞外ベシクルの集団を含む医薬組成物が本明細書において提供される。

【0063】

[0063]それを必要とする対象における疾患又は状態を処置する方法であって、本明細書に記載の細胞外ベシクル又は細胞外ベシクルの集団を投与するステップを含む、方法も本明細書において提供される。

【図面の簡単な説明】

【0064】

【図1A】図１Ａは、細胞外ベシクルのＡＳＯ負荷に対する時間及び温度を増加させることの効果を示す。図１Ｂは、超遠心分離（ＵＣ）及びＣａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ７００樹脂（ＣＣ７００）を使用するクロマトグラフィーによるクリーンアップ後の、ＥＶに負荷されたＡＳＯの濃度を示す。

【図1B】図１Ａは、細胞外ベシクルのＡＳＯ負荷に対する時間及び温度を増加させることの効果を示す。図１Ｂは、超遠心分離（ＵＣ）及びＣａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ７００樹脂（ＣＣ７００）を使用するクロマトグラフィーによるクリーンアップ後の、ＥＶに負荷されたＡＳＯの濃度を示す。

【図2A】図２Ａ及び２Ｂは、本明細書で開示されているペイロード（例えば、ＡＳＯ）をコンジュゲートするために使用することができる２つの例示的なコレステロール部分の例示を提供する。図２Ａは、Ｃｈｏｌ２の構造を提供する。図２Ｂは、Ｃｈｏｌ４の構造を提供する。

【図2B】図２Ａ及び２Ｂは、本明細書で開示されているペイロード（例えば、ＡＳＯ）をコンジュゲートするために使用することができる２つの例示的なコレステロール部分の例示を提供する。図２Ａは、Ｃｈｏｌ２の構造を提供する。図２Ｂは、Ｃｈｏｌ４の構造を提供する。

【図3A】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、及び３Ｇは、本明細書において提供される負荷方法を使用して、ＥＶに負荷することができる例示的なＡＳＯの配列を列挙する表を提供する。図３Ａでは、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ６転写物を標的とする。図３Ｂでは、ＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物を標的とする。図３Ｃでは、ＡＳＯは、ＮＲＡＳ転写物を標的とする。図３Ｄでは、ＡＳＯは、ＰＭＰ２２転写物を標的とする。図３Ｅでは、ＡＳＯは、Ｃ／ＥＢＰβ転写物を標的とする。図３Ｆでは、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物を標的とする。図３Ｇでは、ＡＳＯは、ＮＬＲＰ３転写物を標的とする。

【図3B】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、及び３Ｇは、本明細書において提供される負荷方法を使用して、ＥＶに負荷することができる例示的なＡＳＯの配列を列挙する表を提供する。図３Ａでは、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ６転写物を標的とする。図３Ｂでは、ＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物を標的とする。図３Ｃでは、ＡＳＯは、ＮＲＡＳ転写物を標的とする。図３Ｄでは、ＡＳＯは、ＰＭＰ２２転写物を標的とする。図３Ｅでは、ＡＳＯは、Ｃ／ＥＢＰβ転写物を標的とする。図３Ｆでは、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物を標的とする。図３Ｇでは、ＡＳＯは、ＮＬＲＰ３転写物を標的とする。

【図3C】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、及び３Ｇは、本明細書において提供される負荷方法を使用して、ＥＶに負荷することができる例示的なＡＳＯの配列を列挙する表を提供する。図３Ａでは、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ６転写物を標的とする。図３Ｂでは、ＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物を標的とする。図３Ｃでは、ＡＳＯは、ＮＲＡＳ転写物を標的とする。図３Ｄでは、ＡＳＯは、ＰＭＰ２２転写物を標的とする。図３Ｅでは、ＡＳＯは、Ｃ／ＥＢＰβ転写物を標的とする。図３Ｆでは、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物を標的とする。図３Ｇでは、ＡＳＯは、ＮＬＲＰ３転写物を標的とする。

【図3D】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、及び３Ｇは、本明細書において提供される負荷方法を使用して、ＥＶに負荷することができる例示的なＡＳＯの配列を列挙する表を提供する。図３Ａでは、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ６転写物を標的とする。図３Ｂでは、ＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物を標的とする。図３Ｃでは、ＡＳＯは、ＮＲＡＳ転写物を標的とする。図３Ｄでは、ＡＳＯは、ＰＭＰ２２転写物を標的とする。図３Ｅでは、ＡＳＯは、Ｃ／ＥＢＰβ転写物を標的とする。図３Ｆでは、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物を標的とする。図３Ｇでは、ＡＳＯは、ＮＬＲＰ３転写物を標的とする。

【図3E】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、及び３Ｇは、本明細書において提供される負荷方法を使用して、ＥＶに負荷することができる例示的なＡＳＯの配列を列挙する表を提供する。図３Ａでは、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ６転写物を標的とする。図３Ｂでは、ＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物を標的とする。図３Ｃでは、ＡＳＯは、ＮＲＡＳ転写物を標的とする。図３Ｄでは、ＡＳＯは、ＰＭＰ２２転写物を標的とする。図３Ｅでは、ＡＳＯは、Ｃ／ＥＢＰβ転写物を標的とする。図３Ｆでは、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物を標的とする。図３Ｇでは、ＡＳＯは、ＮＬＲＰ３転写物を標的とする。

【図3F】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、及び３Ｇは、本明細書において提供される負荷方法を使用して、ＥＶに負荷することができる例示的なＡＳＯの配列を列挙する表を提供する。図３Ａでは、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ６転写物を標的とする。図３Ｂでは、ＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物を標的とする。図３Ｃでは、ＡＳＯは、ＮＲＡＳ転写物を標的とする。図３Ｄでは、ＡＳＯは、ＰＭＰ２２転写物を標的とする。図３Ｅでは、ＡＳＯは、Ｃ／ＥＢＰβ転写物を標的とする。図３Ｆでは、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物を標的とする。図３Ｇでは、ＡＳＯは、ＮＬＲＰ３転写物を標的とする。

【図3G】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、及び３Ｇは、本明細書において提供される負荷方法を使用して、ＥＶに負荷することができる例示的なＡＳＯの配列を列挙する表を提供する。図３Ａでは、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ６転写物を標的とする。図３Ｂでは、ＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物を標的とする。図３Ｃでは、ＡＳＯは、ＮＲＡＳ転写物を標的とする。図３Ｄでは、ＡＳＯは、ＰＭＰ２２転写物を標的とする。図３Ｅでは、ＡＳＯは、Ｃ／ＥＢＰβ転写物を標的とする。図３Ｆでは、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物を標的とする。図３Ｇでは、ＡＳＯは、ＮＬＲＰ３転写物を標的とする。

【図4】図４は、様々な量のマウス及びヒトのＳＴＡＴ６を標的とするＡＳＯを負荷したＥＶによる処置後の肝臓におけるＳＴＡＴ６発現のノックダウンを示す。様々なＥＶの具体的なＡＳＯ密度が括弧内に示されている。ＳＴＡＴ６発現は、対照（ＰＢＳ単独で処置又はビヒクル対照で処置）に対して正規化して示されている。

【図5】図５は、異なる脂質リンカーを用いて合成した４つの異なるＡＳＯ配列の負荷密度（ＥＶごとのＡＳＯ）の比較を提供する。ＡＳＯは、以下の：緑色蛍光タンパク質（「ＥＧＦＰ」）、ホタルルシフェラーゼ（「ＦＦＬＵＣ」）、ウミシイタケルシフェラーゼ（「ＲＬＵＣ」）、及び治療遺伝子（「治療遺伝子」）のいずれか１つを標的とした。Ｔｏｃｏ＝トコフェロール、Ｃｈｏｌ＝コレステロール、Ｐａｌ＝パルミチン酸、Ｃ６＝ヘキサメチレン、Ｃ８＝オクタメチレン、ＴＥＧ＝テトラエチレングリコール、ＨＥＧ＝ヘキサエチレングリコール。

【発明を実施するための形態】

【0065】

[0069]本開示は、ＥＶに（例えば、ＥＶの外側表面に）ペイロード（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を負荷する方法であって、負荷プロセスの１つ又は複数のパラメーター（本明細書において「負荷パラメーター」と称される）をモジュレートするステップ（例えば、増加させるか又は低下させるステップ）を含む、方法を対象とする。一部の態様では、１つ又は複数のパラメーターは、塩濃度、負荷温度、負荷期間、ペイロード供給濃度、ＥＶ供給濃度、又はこれらの組合せを含む。本明細書で実証されるように、１つ又は複数のパラメーターをモジュレートするステップは、ＥＶに（例えば、ＥＶの外側表面に）負荷されるペイロードの量を増加させることができる。様々な態様の非限定的な例が本開示に示されている。

【0066】

[0070]本開示がより詳細に説明される前に、本発明が説明される特定の組成物又は処理ステップに限定されず、当然のことながら変更されてもよいことが理解されるべきである。本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書において記載及び例示された個々の態様の各々は、本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの態様のいずれかの特徴から容易に分離する又はそれと組み合わせることができる個別の構成成分及び特徴を有する。任意の記載された方法は、記載された事象の順序又は論理的に可能な他の順序で実施することができる。

【0067】

[0071]本明細書で示される見出しは、本開示の様々な態様の限定ではなく、全体として本明細書を参照して定義され得る。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、本明細書で使用される用語は、単に特定の態様を説明するためのものに過ぎず、限定的であることを意図しないことも理解されるべきである。

【0068】

[0072]したがって、すぐ下に定義される用語は、全体として本明細書を参照してより十分に定義される。

【0069】

Ｉ．定義
[0073]本発明の記載をより容易に理解することができるように、ある特定の用語が最初に定義される。さらなる定義は詳細な説明全体を通して記載されている。

【0070】

[0074]用語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」の実体は、その実体のうちの１つ又は複数を指すことに留意されるべきであり、例えば、「ヌクレオチド配列」は、１つ又は複数のヌクレオチド配列を表すことが理解される。このように、用語「１つの（ａ）（又は「１つの（ａｎ）」）」、「１つ又は複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、及び「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、本明細書において互換的に使用され得る。特許請求の範囲が任意選択のいずれかの要素を除外するように起草できることにさらに留意されたい。このように、この記載は、請求項要素の記載と併せて、「単に（ｓｏｌｅｌｙ）」、「単に（ｏｎｌｙ）」などの排他的用語を使用する場合、又は否定的限定を使用する場合の先行詞としての役割を果たすことを意図する。

【0071】

[0075]さらに、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」は、本明細書で使用される場合、他の要件若しくは構成要素を有するか又は有さない、２つの特定の要件又は構成要素のそれぞれについての具体的開示として解釈されるべきである。よって、本明細書において「Ａ及び／又はＢ（Ａ ａｎｄ／ｏｒ Ｂ）」などの句において使用される用語「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、並びに「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ（Ａ，Ｂ，ａｎｄ／ｏｒ Ｃ）」などの句において使用される用語「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」は、以下の態様のそれぞれを包含することを意図する：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）。

【0072】

[0076]本明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という表現で態様が記載されている場合には、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語で記載されている別の類似の態様も提供されることが理解される。

【0073】

[0077]別段に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示に関する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ、第２版、２００２年、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、１９９９年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；及びｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、改訂版、２０００年、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の多くについて一般的な辞書を当業者に提供する。

【0074】

[0078]単位、接頭辞、及び記号は、国際単位系（ＳＩ）で認められている形式で表記されている。数値範囲は、その範囲を規定する数値を包含する。値の範囲が記載されている場合、その範囲の上限と下限の間に介在する各整数値、及びその各分数も、このような値の間の各下位範囲と一緒に具体的に開示されていることが理解されるべきである。任意の範囲の上限及び下限は、その範囲に独立的に含まれることもその範囲から除外されることもあり、いずれか一方、いずれも、又は両方の限界値が含まれる各範囲も、本開示に包含される。よって、本明細書に記載された範囲は、記載された端点を包含する、その範囲内の値のすべての略記であると理解される。例えば、１～１０という範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群に由来する任意の数、数の組合せ、又は下位範囲を含むことが理解される。

【0075】

[0079]値が明示的に記載されている場合、記載された値とほぼ同じ量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）又は量（ａｍｏｕｎｔ）である値も本開示の範囲内であることが理解されるべきである。組合せが開示されている場合、その組合せの要素の各部分的組合せも具体的に開示されており、本開示の範囲内である。逆に、異なる要素又は要素の群が個別に開示されている場合、その組合せも開示されている。ある開示のいずれかの要素が複数の選択肢を有することが開示されている場合、各選択肢が単一で又は他の選択肢とのいずれかの組合せで除外されるその開示の例も本明細書で開示されており；ある開示の２つ以上の要素がこのような除外を有する可能性があり、このような除外を有する要素のすべての組合せが本明細書で開示されている。

【0076】

[0080]ヌクレオチドは、一般的に受け入れられている１文字コードで呼ばれる。別段に示されていなければ、ヌクレオチド配列は５’から３’の方向で左から右に書かれる。ヌクレオチドは、本明細書において、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される一般的に知られている１文字記号で呼ばれる。したがって、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｕはウラシルを表す。

【0077】

[0081]アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で左から右に書かれる。アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される一般的に知られている３文字記号又は１文字記号で呼ばれる。

【0078】

[0082]用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）、およそ（ｒｏｕｇｈｌｙ）、およそ（ａｒｏｕｎｄ）、又はその領域内を意味するために本明細書で使用される。用語「約」が数値範囲と併せて使用される場合、記載された数値の上下に境界を拡張することによってその範囲を修正する。一般に、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、例えば１０パーセントの上下（高低）の変動によって、記載された値の上下に数値を修正することができる。

【0079】

[0083]用語「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」、「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」、及びこれらの文法的変形は、本開示のＥＶなどの組成物を、薬学的に許容できる経路を介して対象に導入することを指す。本開示のＥＶなどの組成物の対象への導入は、腫瘍内、経口的、肺内、経鼻、非経口的（静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下）、直腸内、リンパ内、髄腔内、眼周囲、又は局所的を含む任意の好適な経路によるものである。投与には、自己投与及び他者による投与が含まれる。好適な投与経路は、組成物又は薬剤がその意図する機能を発揮することを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物又は薬剤を対象の静脈に導入することによって投与される。

【0080】

[0084]本明細書で使用される場合、用語「アゴニスト」は、受容体に結合し、受容体を活性化して生物学的応答を引き起こす分子を指す。受容体は、内因性アゴニスト又は外因性アゴニストのいずれかによって活性化され得る。内因性アゴニストの非限定的な例としては、ホルモン、神経伝達物質、及び環状ジヌクレオチドが挙げられる。外因性アゴニストの非限定的な例としては、薬物、小分子、及び環状ジヌクレオチドが挙げられる。アゴニストは、完全アゴニスト、部分アゴニスト、又は逆アゴニストであり得る。

【0081】

[0085]用語「アミノ酸置換」は、親配列又は参照配列（例えば、野生型配列）に存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置き換えることを指す。アミノ酸は、親配列又は参照配列（例えば、野生型ポリペプチド配列）において、例えば、化学的ペプチド合成を介して、又は当技術分野で公知の組換え方法によって置換され得る。したがって、「Ｘ位の置換」という言及は、Ｘ位に存在するアミノ酸の代替アミノ酸残基による置換を指す。一部の態様では、置換パターンは、図式ＡｎＹによって記載することができ、ここで、Ａは、ｎ位に天然に又は元々存在するアミノ酸に対応する１文字コードであり、Ｙは、置換アミノ酸残基である。一部の態様では、置換パターンは、図式Ａｎ（ＹＺ）によって記載することができ、ここで、Ａは、ｎ位に天然に又は元々存在するアミノ酸を置換するアミノ酸残基に対応する１文字コードであり、Ｙ及びＺは、Ａを置き換えることができる代替の置換アミノ酸残基である。

【0082】

[0086]用語「アニオン」及び「カチオン」は、それぞれ、負及び正に荷電したイオンを指す。「二価の」カチオンは、原子価が２＋のカチオンを指す。二価のカチオンの例としては、以下に限定されないが、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｂａ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ａｌ^２＋、Ａｇ^２＋、Ｃｕ^２＋、及びＭｎ^２＋が挙げられる。「一価の」カチオンは、原子価が１＋のカチオンを指す。一価のカチオンの例としては、以下に限定されないが、Ｌｉ^＋、Ｋ^＋、Ｎａ^＋、ＮＨ_４ ^＋、Ｃｕ^＋が挙げられる。アニオンの例としては、以下に限定されないが、ＳＣＮ^－、Ｃｌ^－、ＳＯ_４ ^－、及びＰＯ_４が挙げられる。一部の態様では、アニオン及び／又はカチオン（例えば、一価のカチオン又は二価のカチオン）は、塩、例えば、相補的な原子価の少なくとも１つのアニオンと少なくとも１つのカチオンとの混合物中に存在し得る。本明細書で開示されているアニオン又はカチオンを含む任意の塩を本明細書で開示されている方法において使用することができる。

【0083】

[0087]本明細書で使用される場合、用語「アンタゴニスト」は、受容体に結合した際に、それ自体が生物学的応答を惹起するのではなく、アゴニストに媒介される応答を遮断又は減弱させる分子を指す。多くのアンタゴニストは、受容体上の構造的に規定された結合部位で内因性リガンド又は基質と競合することによってその効力を実現する。アンタゴニストの非限定的な例としては、アルファ遮断剤、ベータ遮断剤、及びカルシウムチャネル遮断剤が挙げられる。アンタゴニストは、競合的、非競合的、又は不競合的なアンタゴニストであり得る。

【0084】

[0088]本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、天然又は部分的若しくは全体的に合成的に産生された免疫グロブリン、及びその断片を包含する。この用語は、免疫グロブリン結合ドメインと相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質も網羅する。「抗体」は、抗原と特異的に結合し、それを認識する、免疫グロブリン遺伝子由来のフレームワーク領域を含むポリペプチド又はその断片も含む。抗体という用語の使用は、全抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、その断片を含むことを意味し、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス－ヒト、マウス－霊長類、霊長類－ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ１）_２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片、ダイアボディ、及び抗体関連ポリペプチドをさらに含む。抗体は、所望の生物学的な活性又は機能を示す限り、二特異性抗体及び多重特異性抗体を含む。本開示の一部の態様では、生物学的に活性な分子は、抗体又はその抗原結合断片を含む分子である。

【0085】

[0089]用語「抗体－薬物コンジュゲート」及び「ＡＤＣ」は、互換的に使用され、治療剤（本明細書において、薬剤、薬物、又は薬学的有効成分と称されることがある）又は薬剤に、例えば共有結合的に連結した抗体を指す。本開示の一部の態様では、生物学的に活性な分子は、抗体－薬物コンジュゲートである。

【0086】

[0090]本明細書で使用される場合、目的の１つ又は複数の値に適用される用語「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、記載された基準値に類似する値を指す。ある特定の態様では、用語「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、別段記載されていない限り又はそうでなければ文脈から明らかでない限り（このような数値が可能な値の１００％を超える場合を除く）、記載された基準値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれより低い割合のいずれかの方向（より大きい又はより小さい）に収まる値の範囲を指す。

【0087】

[0091]用語「アリール」は、炭素環式芳香族基を指す。アリール基の例としては、以下に限定されないが、フェニル、ナフチル及びアントラセニルが挙げられる。炭素環式芳香族基は、非置換であっても、又は－Ｃ_１～８アルキル、－Ｏ－（Ｃ_１～８アルキル）、－アリール、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）_２－、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＨ、－ハロゲン、－Ｎ_３、－ＮＨ_２、－ＮＨ（Ｒ’）、－Ｎ（Ｒ’）_２及び－ＣＮ（式中、各Ｒ’は、独立的に、Ｈ、－Ｃ_１～８アルキル、又はアリールである）を含むがこれらに限定されない１つ又は複数の基で置換されていてもよい。

【0088】

[0092]用語「アリーレン」は、２つの共有結合を有するアリール基を指し、以下の構造：

【化4】

［式中、フェニル基は、非置換であっても、又は－Ｃ_１～８アルキル、－Ｏ－（Ｃ_１～８アルキル）、－アリール、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）_２－、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＨ、－ハロゲン、－Ｎ_３、－ＮＨ_２、－ＮＨ（Ｒ’）、－Ｎ（Ｒ’）_２及び－ＣＮ（式中、各Ｒ’は、独立的に、Ｈ、－Ｃ_１～８アルキル、又はアリールである）を含むがこれらに限定されない最大４つの基で置換されていてもよい］に示されているオルト、メタ、又はパラ立体配置であってもよい。

【0089】

[0093]本明細書で使用される場合、用語「アリールアルキル」又は「アラルキル」は、アリール基又はヘテロアリール基がアルキル基に結合して、ラジカルである－アルキル－アリール及び－アルキル－ヘテロアリールを生じるこれらのラジカルを含むことを意味し、アルキル、アリール及びヘテロアリールは本明細書において定義されている。例示的な「アリールアルキル」又は「アラルキル」基は、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチル等を含む。

【0090】

[0094]本明細書で使用される場合、用語「アリールオキシ」は、－Ｏ－アリールという基を指し、アリールは本明細書において定義されている通りである。ある特定の態様では、アリールオキシ基のアリール部分は、フェニル又はナフチルである。

【0091】

[0095]用語「ヘテロアリール」又は「ヘテロ芳香族の」は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ及びＢ（例えば、Ｎ、Ｏ及びＳ）から選択される少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、１～５個のヘテロ原子、例えば１～３個のヘテロ原子）を含有する、ポリ不飽和５、６又は７員の芳香族部分を指し、窒素及び硫黄の原子は任意選択的に酸化されており、窒素原子（複数可）は任意選択的に四級化されている。「ヘテロアリール」基は、単一の環であるか又は他のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキル環（例えば、１～３個の他の環）に融合され得る。「ヘテロアリール」基が融合したアリール、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキル環を含む場合、「ヘテロアリール」基は、ヘテロアリール環を介して分子の残りの部分に結合している。ヘテロアリール基は、炭素原子又はヘテロ原子を介して、分子の残りの部分に結合され得る。

【0092】

[0096]一部の態様では、ヘテロアリール基は、４～１０個の炭素原子並びにＯ、Ｓ及びＮから選択される１～５個のヘテロ原子を有する。ヘテロアリール基の非限定的な例としては、ピリジル、ピリミジニル、キノリニル、ベンゾチエニル、インドリル、インドリニル、ピリダジニル、ピラジニル、イソインドリル、イソキノリル、キナゾリニル、キノキサリニル、フタラジニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、インドリジニル、インダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、フラニル、チエニル、ピロリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソチアゾリル、ナフチリジニル、イソクロマニル、クロマニル、テトラヒドロイソキノリニル、イソインドリニル、イソベンゾテトラヒドロフラニル、イソベンゾテトラヒドロチエニル、イソベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ピリドピリジル、ベンゾテトラヒドロフラニル、ベンゾテトラヒドロチエニル、プリニル、ベンゾジオキソリル、トリアジニル、プテリジニル、ベンゾチアゾリル、イミダゾピリジル、イミダゾチアゾリル、ジヒドロベンゾイソオキサジニル、ベンゾイソオキサジニル、ベンゾオキサジニル、ジヒドロベンゾイソチアジニル、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、クロモニル、クロマノニル、ピリジル－Ｎ－オキシド、テトラヒドロキノリニル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロキノリノニル、ジヒドロイソキノリノニル、ジヒドロクマリニル、ジヒドロイソクマリニル、イソインドリノニル、ベンゾジオキサニル、ベンゾオキサゾリノニル、ピロリルＮ－オキシド、ピリミジニルＮ－オキシド、ピリダジニルＮ－オキシド、ピラジニルＮ－オキシド、キノリニルＮ－オキシド、インドリルＮ－オキシド、インドリニルＮ－オキシド、イソキノリルＮ－オキシド、キナゾリニルＮ－オキシド、キノキサリニルＮ－オキシド、フタラジニルＮ－オキシド、イミダゾリルＮ－オキシド、イソオキサゾリルＮ－オキシド、オキサゾリルＮ－オキシド、チアゾリルＮ－オキシド、インドリジニルＮ－オキシド、インダゾリルＮ－オキシド、ベンゾチアゾリルＮ－オキシド、ベンゾイミダゾリルＮ－オキシド、ピロリルＮ－オキシド、オキサジアゾリルＮ－オキシド、チアジアゾリルＮ－オキシド、トリアゾリルＮ－オキシド、テトラゾリルＮ－オキシド、ベンゾチオピラニルＳ－オキシド、ベンゾチオピラニルＳ，Ｓ－ジオキシドが挙げられる。例示的なヘテロアリール基としては、イミダゾリル、ピラゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサジアゾリル、及びピリジルが挙げられる。他の例示的なヘテロアリール基としては、１－ピロリル、２－ピロリル、３－ピロリル、３－ピラゾリル、２－イミダゾリル、４－イミダゾリル、ピラジニル、２－オキサゾリル、４－オキサゾリル、２－フェニル－４－オキサゾリル、５－オキサゾリル、３－イソオキサゾリル、４－イソオキサゾリル、５－イソオキサゾリル、２－チアゾリル、４－チアゾリル、５－チアゾリル、２－フリル、３－フリル、２－チエニル、３－チエニル、２－ピリジル、３－ピリジル、ピリジン－４－イル、２－ピリミジル、４－ピリミジル、５－ベンゾチアゾリル、プリニル、２－ベンゾイミダゾリル、５－インドリル、１－イソキノリル、５－イソキノリル、２－キノキサリニル、５－キノキサリニル、３－キノリル、及び６－キノリルが挙げられる。上述のアリール及びヘテロアリール環系の各置換基は、以下に記載する許容できるアリール基置換基群から選択される。

【0093】

[0097]本明細書で使用される場合、用語「アルキル」は、それ自体で又は別の置換基の一部として、別段に記載されていない限り、指定された数の炭素原子（例えば、Ｃ_１～Ｃ_１０は１～１０個の炭素原子を意味する）を有する直鎖又は分岐鎖炭化水素ラジカルを意味する。典型的には、アルキル基は１～２４個の炭素原子を有し、例えば１～１０個の炭素原子、１～８個の炭素原子又は１～６個の炭素原子を有する。「低級アルキル」基は、１～４個の炭素原子を有するアルキル基である。用語「アルキル」は、二価及び多価のラジカルを含む。適宜、例えば、式がアルキル基が二価であることを示す場合又は置換基が接合して環を形成している場合には、用語「アルキル」は「アルキレン」を含む。アルキルラジカルの非限定的な例としては、以下に限定されないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、並びに例えばｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル及びｎ－オクチルのホモログ及び異性体が挙げられる。

【0094】

[0098]用語「アルキレン」は、それ自体で又は別の置換基の一部として、二価の（ジラジカル）アルキル基を意味し、アルキルは本明細書において定義されている。「アルキレン」は、以下に限定されないが、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－によって例示される。一部の態様では、「アルキレン」基は、１～２４個の炭素原子を含み、例えば１０個以下の炭素原子（例えば、１～８個又は１～６個の炭素原子）を有する。「低級アルキレン」基は、１～４個の炭素原子を有するアルキレン基である。

【0095】

[0099]用語「アルケニル」は、それ自体で又は別の置換基の一部として、２～２４個の炭素原子、及び少なくとも１つの二重結合を有する直鎖又は分岐鎖の炭化水素ラジカルを指す。典型的なアルケニル基は、２～１０個の炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を有する。ある特定の態様では、アルケニル基は、２～８個の炭素原子又は２～６個の炭素原子及び１～３個の二重結合を有する。例示的なアルケニル基としては、ビニル、２－プロペニル、１－ブタ－３－エニル、クロチル、２－（ブタジエニル）、２，４－ペンタジエニル、３－（１，４－ペンタジエニル）、２－イソペンテニル、１－ペンタ－３－エニル、１－ヘキサ－５－エニルなどが挙げられる。

【0096】

[0100]用語「アルキニル」は、それ自体で又は別の置換基の一部として、２～２４個の炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する直鎖又は分岐鎖の不飽和又は多価不飽和炭化水素ラジカルを指す。典型的な「アルキニル」基は、２～１０個の炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する。本開示の一態様では、アルキニル基は、２～６個の炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する。例示的なアルキニル基としては、プロパ－１－イニル、プロパ－２－イニル（すなわち、プロパルギル）、エチニル及び３－ブチニルが挙げられる。

【0097】

[0101]用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ」（又はチオアルコキシ）は、それらの従来の意味で使用され、それぞれ、酸素原子、アミノ基、又は硫黄原子を介して分子の残りの部分に結合しているアルキル基を指す。

【0098】

[0102]用語「ヘテロアルキル」は、それ自体で又は別の用語と組み合わせて、記述した数の炭素原子（例えば、Ｃ_２～Ｃ_１０、又はＣ_２～Ｃ_８）及び例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｂ及びＰ（ある特定の態様では、Ｎ、Ｏ及びＳ）から選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなる安定な、直鎖又は分岐鎖の炭化水素ラジカルを指し、窒素、硫黄及びリン原子は任意選択的に酸化され、窒素原子（複数可）は任意選択的に四級化されている。ヘテロ原子（複数可）は、ヘテロアルキル基の内部の任意の位置に配置されている。ヘテロアルキル基の例としては、以下に限定されないが、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ（Ｏ）－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ（Ｏ）_２－ＣＨ_３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｏ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３、－ＣＨ_２－ＣＨ＝Ｎ－ＯＣＨ_３、及び－ＣＨ＝ＣＨ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_３が挙げられる。最大２個のヘテロ原子は、例えば、－ＣＨ_２－ＮＨ－ＯＣＨ_３及び－ＣＨ_２－Ｏ－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３のように連続的であり得る。

【0099】

[0103]用語「ヘテロアルキレン」は、それ自体で又は別の置換基の一部として、以下に限定されないが、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－及び－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－によって例示されているように、ヘテロアルキルに由来する二価のラジカルを指す。典型的には、ヘテロアルキル基は、３～２４個の原子（炭素及び水素を除くヘテロ原子）を有する（３～２４員のヘテロアルキル）。別の例では、ヘテロアルキル基は、合計３～１０個の原子（３～１０員のヘテロアルキル）又は３～８個の原子（３～８員のヘテロアルキル）を有する。適宜、例えば、式がヘテロアルキル基が二価であることを示す場合又は置換基が接合して環を形成している場合には、用語「ヘテロアルキル」は「ヘテロアルキレン」を含む。

【0100】

[0104]用語「シクロアルキル」は、それ自体で又は他の用語と組み合わせて、３～２４個の炭素原子、例えば、３～１２個の炭素原子を有する、飽和又は不飽和の、非芳香族炭素環式ラジカル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルキル又はＣ_３～Ｃ_６シクロアルキル）を表す。シクロアルキルの例としては、以下に限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、１－シクロヘキセニル、３－シクロヘキセニル、シクロヘプチル等が挙げられる。用語「シクロアルキル」は、架橋した、多環式（例えば、二環式）構造、例えば、ノルボルニル、アダマンチル及びビシクロ［２．２．１］ヘプチルも含む。「シクロアルキル」基は、アリール（例えば、フェニル）、ヘテロアリール（例えば、ピリジル）及び非芳香族（例えば、炭素環式又は複素環式の）環から選択される少なくとも１つ（例えば、１～３個）の他の環に融合され得る。「シクロアルキル」基が融合したアリール、ヘテロアリール又は複素環式環を含む場合、「シクロアルキル」基は、炭素環式環を介して分子の残りの部分に結合している。

【0101】

[0105]用語「ヘテロシクロアルキル」、「複素環式の」、「複素環」、又は「ヘテロシクリル」は、それ自体で又は他の用語と組み合わせて、例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｂ及びＰ（例えば、Ｎ、Ｏ及びＳ）から選択される少なくとも１つであって最大５個のヘテロ原子を含有する炭素環式の非芳香族環（例えば、３～８員の環及び例えば、４、５、６又は７員の環）であって、窒素、硫黄及びリン原子が任意選択的に酸化されており、窒素原子（複数可）が任意選択的に四級化されている（例えば、窒素、酸素及び硫黄から選択される１～４個のヘテロ原子）、炭素環式の非芳香族環、又は当業者に公知の安定な組合せで、少なくとも１つであって最大１０個のヘテロ原子（Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１～５個のヘテロ原子）を含有する４～８員の環の融合環系を表す。例示的なヘテロシクロアルキル基は、融合フェニル環を含む。「複素環式」基が融合したアリール、ヘテロアリール又はシクロアルキル環を含む場合、「複素環式」基は、複素環を介して分子の残りの部分に結合している。ヘテロ原子は、複素環が分子の残りの部分に結合している位置を占め得る。

【0102】

[0106]本明細書で使用される場合、用語「に関連した」は、第１の部分（例えば、ペイロード）と第２の部分（例えば、ＥＶ）との間の相互作用を指す。例えば、一部の態様では、第１の部分は、第２の部分内に封入され得る（例えば、ペイロードは、ＥＶの内腔内に存在し得る）。一部の態様では、第１の部分は、第２の部分に連結され得るか又は融合され得る（例えば、ペイロードは、ＥＶの外側表面及び／又は内腔表面に連結され得る）。

【0103】

[0107]用語「生物学的に活性な分子」は、本明細書で使用される場合、アンカー部分を介してＥＶに結合することができる任意の分子を指し、分子は、それを必要とする対象において治療効果若しくは予防効果を有することができるか、又は診断目的で使用することができる。一部の態様では、目的のこのような分子は、本明細書において、「目的の部分」とも称される。したがって、例として、生物学的に活性な分子という用語は、タンパク質（例えば、抗体、タンパク質、ポリペプチド、並びにそれらの誘導体、断片、及びバリアント）、脂質及びそれらの誘導体、炭水化物（例えば、糖タンパク質中のグリカン部分）、又は小分子を含む。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、抗原、アジュバント、免疫モジュレーター、標的部分、又はこれらの組合せを含む。このような生物学的に活性な分子の非限定的な例は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０２０／０１９１３６１号において提供される。ある特定の態様では、生物学的に活性な分子はペイロード（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）である。

【0104】

[0108]用語「Ｃ_１～８アルキル」は、本明細書で使用される場合、１～８個の炭素原子を有する直鎖の又は分岐した、飽和炭化水素を指す。代表的な「Ｃ_１～８アルキル」基としては、以下に限定されないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、イソプロピル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチル、及び２－メチルブチルが挙げられる。

【0105】

[0109]用語「Ｃ_１～１０アルキレン」は、式－（ＣＨ_２）_１～１０－の飽和した直鎖炭化水素基を指す。Ｃ_１～１０アルキレンの例としては、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、ノニレン、及びデカレンが挙げられる。

【0106】

[0110]用語「Ｃ_３～８炭素環」は、３、４、５、６、７又は８員の飽和又は不飽和非芳香族炭素環式環を指す。代表的なＣ_３～８炭素環としては、以下に限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンタジエニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、１，３－シクロヘキサジエニル、１，４－シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、１，３－シクロヘプタジエニル、１，３，５－シクロヘプタトリエニル、シクロオクチル、及びシクロオクタジエニルが挙げられる。Ｃ_３～８炭素環式基は、非置換であっても、又は－Ｃ_１～８アルキル、－Ｏ－（Ｃ_１～８アルキル）、アリール、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）_２－、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＨ、－ハロゲン、－Ｎ_３、－ＮＨ_２、－ＮＨ（Ｒ’）、－Ｎ（Ｒ’）_２及び－ＣＮ（式中、各Ｒ’は、独立的に、Ｈ、－Ｃ_１～８アルキル、又はアリールである）を含むがこれらに限定されない１つ又は複数の基で置換されていてもよい。

【0107】

[0111]用語「Ｃ_３～８カルボシクロ」は、炭素環式の水素原子のうちの１つ又は複数が結合で置き換えられている、上記で定義されたＣ_３－８炭素環式基を指す。

【0108】

[0112]用語「Ｃ_３～８複素環」は、環の炭素原子のうちの１～４つが、Ｏ、Ｓ及びＮからなる群から選択されるヘテロ原子で独立的に置き換えられている芳香族又は非芳香族Ｃ_３～８炭素環を指す。Ｃ_３～８複素環の代表的な例としては、以下に限定されないが、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェン、インドリル、ベンゾピラゾリル、クマリニル、イソキノリニル、ピロリル、チオフェニル、フラニル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、キノリニル、ピリミジニル、ピリジニル、ピリドニル、ピラジニル、ピリダジニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル及びテトラゾリルが挙げられる。Ｃ_３～８複素環は、非置換であっても、又は－Ｃ_１～８アルキル、－Ｏ－（Ｃ_１～８アルキル）、－アリール、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）_２－、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＨ、－ハロゲン、－Ｎ_３、－ＮＨ_２、－ＮＨ（Ｒ’）、－Ｎ（Ｒ’）_２、及び－ＣＮ（式中、各Ｒ’は、独立的に、Ｈ、－Ｃ_１～８アルキル、又はアリールである）を含むがこれらに限定されない最大７つの基で置換されていてもよい。

【0109】

[0113]用語「Ｃ_３～８ヘテロシクロ」は、ヘテロ環式基の水素原子のうちの１つが結合で置き換えられている、上記で定義されたＣ_３－８複素環式基を指す。Ｃ_３～８ヘテロシクロは、非置換であっても、又は－Ｃ_１～８アルキル、－Ｏ－（Ｃ_１～８アルキル）、－アリール、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）_２－、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＨ、－ハロゲン、－Ｎ_３、－ＮＨ_２、－ＮＨ（Ｒ’）、－Ｎ（Ｒ’）_２及び－ＣＮ（式中、各Ｒ’は、独立的に、Ｈ、－Ｃ_１～８アルキル、又はアリールである）を含むがこれらに限定されない最大６つの基で置換されていてもよい。

【0110】

[0114]「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。よって、ポリペプチドにおけるアミノ酸が同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸で置き換えられている場合、その置換は保存的であると考えられる。ある特定の態様では、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーのメンバーの順序及び／又は組成が異なる構造的に類似するストリングと保存的に置き換えることができる。

【0111】

[0115]本明細書で使用される場合、用語「保存された」は、比較される２つ以上の配列の同じ位置に非改変状態で存在するものである、それぞれポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列のヌクレオチド又はアミノ酸残基を指す。比較的保存されたヌクレオチド又はアミノ酸は、配列の他所に出現するヌクレオチド又はアミノ酸より関連性の高い配列の間で保存されているものである。

【0112】

[0116]一部の態様では、２つ以上の配列は、これらが互いに１００％同一であれば、「完全に保存されている」か又は「同一」であると言われる。一部の態様では、２つ以上の配列は、これらが互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一であれば、「高度に保存されている」と言われる。一部の態様では、２つ以上の配列は、これらが互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％、又は約９９％同一であれば、「高度に保存されている」と言われる。一部の態様では、２つ以上の配列は、これらが互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一であれば、「保存されている」と言われる。一部の態様では、２つ以上の配列は、これらが互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、又は約９９％同一であれば、「保存されている」と言われる。配列の保存は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの全長に適用してもよく、又はその一部、領域若しくは特徴に適用してもよい。

【0113】

[0117]用語「賦形剤」及び「担体」は、互換的に使用され、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。

【0114】

[0118]本明細書で使用される場合、用語「細胞外ベシクル」、「ＥＶ」、及びその文法上の変形は、互換的に使用され、内部空間を囲む膜を含む細胞由来のベシクルを指す。細胞外ベシクルは、これらが由来する細胞よりも小さな直径を有するすべての膜結合ベシクル（例えば、エクソソーム、ナノベシクル）を含む。一部の態様では、細胞外ベシクルは、直径は２０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲であり、内部空間（すなわち、内腔）内に、細胞外ベシクルの外部表面に提示されて、及び／又は膜にまたがって、様々な高分子ペイロードを含み得る。一部の態様では、ペイロードは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、及び／又はこれらの組合せを含み得る。ある特定の態様では、細胞外ビヒクルは、エクソソームタンパク質を含む。例としてであって限定されないが、細胞外ベシクルは、アポトーシス小体、細胞の断片、直接的又は間接的な操作（例えば、連続的な押出し又はアルカリ溶液による処理）によって細胞から導出されたベシクル、小胞化したオルガネラ、及び生細胞によって産生されたベシクル（例えば、直接的な原形質膜の出芽又は後期エンドソームの原形質膜との融合によって）を含む。細胞外ベシクルは、生きた若しくは死んだ生物、外植された組織若しくは器官、原核細胞若しくは真核細胞、及び／又は培養細胞に由来し得る。一部の態様では、細胞外ベシクルは、１つ又は複数の導入遺伝子産物を発現する細胞によって産生される。別段に示されていない限り、ＥＶは、エクソソーム、ナノベシクル、ミクロソーム、マイクロベシクル、細胞外体、アポトーシス体、又はこれらの組合せを含む。ある特定の態様では、本開示に対して有用なＥＶは、エクソソームである。

【0115】

[0119]本明細書で使用される場合、用語「エクソソーム」は、２０～３００ｎｍ（例えば、４０～２００ｎｍ）の間の直径を有する細胞外ベシクルを指す。エクソソームは、内部空間（すなわち、内腔）を囲む膜を含み、一部の態様では、直接的な原形質膜の出芽又は後期エンドソームの原形質膜との融合によって、細胞（例えば、産生細胞）から生じ得る。ある特定の態様では、エクソソームは、エクソソームタンパク質を含む。後述するように、エクソソームは、産生細胞に由来し、そのサイズ、密度、生化学的パラメーター、又はこれらの組合せに基づいて産生細胞から単離することができる。一部の態様では、本開示のエクソソームは、１つ又は複数の導入遺伝子産物を発現する細胞によって産生される。

【0116】

[0120]本明細書で使用される場合、用語「機能的断片」は、タンパク質の機能を保持するタンパク質の断片を指す。例えば、一部の態様では、エクソソームタンパク質、例えばＰＴＧＦＲＮの機能的断片は、生物学的に活性な分子を、ＥＶの内腔面又は外部表面に係留する能力を保持する。

【0117】

[0121]断片が機能的断片であるか否かは、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ解析及び断片と例えばＧＦＰのような自己蛍光タンパク質との融合を含む、ＥＶのタンパク質含量を決定するための当技術分野で公知の任意の方法によって評価することができる。

【0118】

[0122]本明細書で使用される場合、生物学的に活性な分子を、本開示のＥＶの内腔又は外部表面に「係留する（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）」とは、生物学的に活性な分子を、それぞれ、ＥＶの内腔又は外部表面に、共有結合により結合させることを指す。

【0119】

[0123]本明細書で使用される場合、用語「相同性」は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）間及び／又はポリペプチド分子間の全体的関連性を指す。一般に、用語「相同性」は、２つの分子間の進化的関係を意味する。よって、相同である２つの分子は、共通の進化的祖先を有することになる。本開示の文脈では、相同性という用語は、同一性と類似性の両方を包含する。

【0120】

[0124]一部の態様では、ポリマー分子は、分子内のモノマーの少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％が同一である（正確に同じモノマーである）か又は類似する（保存的置換）場合に、互いに「相同」であると考えられる。「相同な」という用語は、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列）間の比較を必然的に指す。

【0121】

[0125]本開示の文脈では、置換（これらがアミノ酸置換として言及される場合でも）は、核酸レベルで行われ、すなわち、アミノ酸残基を代替のアミノ酸残基で置換することは、第１のアミノ酸をコードするコドンを第２のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって行われる。

【0122】

[0126]本明細書で使用される場合、用語「同一性」は、ポリマー分子間、例えば、ポリペプチド分子又はポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）間の全体的モノマー保存を指す。いずれのさらなる修飾語も有さない「同一な」という用語、例えば、タンパク質Ａはタンパク質Ｂと同一であるとは、配列が１００％同一（１００％の配列同一性）であることを意味する。２つの配列が、例えば「７０％同一である」という記載は、これらが、例えば、「７０％の配列同一性」を有するという記載と等しい。

【0123】

[0127]例えば、２つのポリペプチド配列の同一性パーセントの計算は、２つの配列を最適な比較のためにアラインさせることによって実施することができる（例えば、最適なアライメントのために第１のポリペプチド配列と第２のポリペプチド配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、同一でない配列は比較するために無視することができる）。ある特定の態様では、比較のためにアラインされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸が比較される。

【0124】

[0128]第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸によって占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適アライメントに導入される必要のあるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一な位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。

【0125】

[0129]タンパク質配列とヌクレオチド配列の両方のアライメントに好適なソフトウェアプログラムは、様々な供給源から入手可能である。配列同一性のパーセントを決定するための１つの好適なプログラムは、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センターのＢＬＡＳＴウェブサイトから入手可能なＢＬＡＳＴプログラム一式の一部であるｂｌ２ｓｅｑである。ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用する２つの配列間の比較を実施する。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために使用されるが、一方、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用される。他の好適なプログラムは、例えば、バイオインフォマティクスプログラムのＥＭＢＯＳＳ一式の一部である、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、又はＭａｔｃｈｅｒであり、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ）からも入手可能である。

【0126】

[0130]配列アライメントは、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥなどのような当技術分野で公知の方法を使用して行うことができる。

【0127】

[0131]ポリヌクレオチド又はポリペプチド参照配列とアラインする単一のポリヌクレオチド又はポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それぞれ独自の配列同一性パーセントを有し得る。配列同一性パーセントの値は小数点以下第２位を四捨五入することに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は８０．１に切り捨てられ、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は８０．２に切り上げられる。長さの値は常に整数となることにも留意されたい。

【0128】

[0132]ある特定の態様では、第１のアミノ酸配列（又は核酸配列）の第２のアミノ酸配列（又は核酸配列）に対する同一性百分率（％ＩＤ）は、％ＩＤ＝１００×（Ｙ／Ｚ）として計算され、ここで、Ｙは、第１及び第２の配列のアライメント（目視検査又は特定の配列アライメントプログラムによってアラインされたもの）において完全一致としてスコア化されたアミノ酸残基（又は核酸塩基）の数であり、Ｚは、第２の配列中の残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第１の配列の第２の配列に対する同一性パーセントは、第２の配列の第１の配列に対する同一性パーセントよりも高くなる。

【0129】

[0133]当業者は、配列同一性パーセントの計算のための配列アラインメントの生成が一次配列データによって排他的に駆動されるバイナリ配列間比較に限定されないことを認識するであろう。また、配列アライメントは、配列データを、構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能データ（例えば、突然変異の位置）、又は系統学的データなどの異種供給源からのデータと統合することによって生成され得ることも認識されるであろう。異種データを統合して多重配列アライメントを生成する好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇ、或いはＥＢＩなどから入手可能なＴ－Ｃｏｆｆｅｅである。配列同一性パーセントを計算するために使用される最終的なアライメントは、自動的又は手動で精選され得ることも認識されるであろう。

【0130】

[0134]「免疫応答」は、本明細書で使用される場合、外来物質又は異常細胞、例えばがん性細胞に対する脊椎動物内の生物学的応答を指し、この応答は、これらの物質及びそれらに起因する疾患に対して生物を保護する。免疫応答は、免疫系の１つ又は複数の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、樹状細胞又は好中球）と、これらの細胞又は肝臓によって産生される可溶性高分子（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）の作用によって媒介され、侵入病原体、病原体に感染した細胞若しくは組織、がん性細胞若しくは他の異常細胞、又は自己免疫若しくは病的炎症の場合には正常なヒトの細胞若しくは組織を、選択的に標的とする、それに結合する、それに対して損傷を与える、それを破壊させる、及び／又はそれを脊椎動物の体から排除する。免疫反応には、例えば、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞、Ｔｈ細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、若しくはＴｒｅｇ細胞の活性化若しくは阻害、又は免疫系の任意の他の細胞、例えば、ＮＫ細胞の活性化若しくは阻害が含まれる。したがって、免疫応答には、体液性免疫応答（例えば、Ｂ細胞によって媒介される）、細胞免疫応答（例えば、Ｔ細胞によって媒介される）、又は体液性免疫応答と細胞免疫応答の両方が含まれ得る。本開示の一部の態様では、生物学的に活性な分子は、免疫応答を誘発することが可能な分子である。

【0131】

[0135]一部の態様では、免疫応答は、「阻害性」免疫応答である。阻害性免疫応答は、刺激（例えば、抗原）の効果を遮断するか又は減少させる免疫応答である。ある特定の態様では、阻害性免疫応答は、刺激に対する阻害性抗体の産生を含む。一部の態様では、免疫応答は、「刺激性」免疫応答である。刺激性免疫応答は、標的抗原（例えば、腫瘍抗原又はウイルス）を破壊し、取り除くことができるエフェクター細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球）の生成をもたらす免疫応答である。

【0132】

[0136]本明細書で使用される場合、用語「単離された」、「精製された」、「抽出された」、及びそれらの文法上の変形は、互換的に使用され、１つ又は複数の精製工程、例えば所望のＥＶ、例えばエクソソーム調製物の選択又は濃縮を経た、所望のＥＶ（例えば、既知又は未知の量及び／又は濃度の複数のＥＶ）調製物の状態を指す。一部の態様では、単離すること又は精製することは、本明細書で使用される場合、ＥＶを産生細胞を含有する試料から取り除く、部分的に取り除く（例えば、その画分）工程である。一部の態様では、単離されたＥＶの組成物は検出可能な望ましくない活性を有さないか、或いは、望ましくない活性のレベル又は量が許容可能なレベル若しくは量であるか又はそれを下回る。一部の態様では、単離されたＥＶの組成物は、許容できる量及び／又は濃度であるか又はそれを上回る、所望のＥＶの量及び／又は濃度を有する。一部の態様では、単離されたＥＶの組成物は、組成物が得られる出発材料（例えば、産生細胞調製物）と比較して濃縮されている。この濃縮は、出発材料と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、少なくとも約９９．９９９％、少なくとも約９９．９９９９％であるか、又は９９．９９９９％を超え得る。一部の態様では、単離されたＥＶの調製物は、残留生物由来物質を実質的に含まない。一部の態様では、単離されたＥＶの調製物は、いずれかの夾雑する生体物質を１００％含まないか、少なくとも約９９％含まないか、少なくとも約９８％含まないか、少なくとも約９７％含まないか、少なくとも約９６％含まないか、少なくとも約９５％含まないか、少なくとも約９４％含まないか、少なくとも約９３％含まないか、少なくとも約９２％含まないか、少なくとも約９１％含まないか、又は少なくとも約９０％含まない。残留生体由来物質は、アビオティック物質（化学物質を含む）又は不要な核酸、タンパク質、脂質、若しくは代謝産物を含み得る。残留生体由来物質を実質的に含まないとは、ＥＶの組成物が検出可能な産生細胞を含有しないこと、及びＥＶのみが検出可能であることも意味し得る。

【0133】

[0137]用語「連結した」、「融合した」、及びその文法上の変形は、互換的に使用され、それぞれ、第２の部分、例えば第２のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列に、共有結合又は非共有結合により接合した第１の部分、例えば、第１のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を指す。第１の部分は、第２の部分に直接接合若しくは並置され得るか、或いは介在する部位が第１の部分を第２の部分に共有結合により接合させ得る。用語「連結した」は、Ｃ末端又はＮ末端における第１の部分の第２の部分への融合だけでなく、第１の部分（又は第２の部分）全体の、第２の部分（又はそれぞれ、第１の部分）のいずれか２点、例えばアミノ酸への挿入も含む。一態様では、第１の部分はペプチド結合又はリンカーによって第２の部分に連結されている。第１の部分は、ホスホジエステル結合又はリンカーによって第２の部分に連結され得る。リンカーは、ペプチド若しくはポリペプチド（ポリペプチド鎖では）又はヌクレオチド若しくはヌクレオチド鎖（ヌクレオチド鎖では）又は任意の化学部分（ポリペプチド若しくはポリヌクレオチド鎖又は任意の化学分子では）であり得る。用語「連結した」は、ハイフン（－）によっても示される。

【0134】

[0138]本明細書で使用される場合、用語「負荷すること」又は「負荷された」は、目的の部分（例えば、ペイロード、例えば、ＡＳＯ）の、ＥＶ中への導入、ＥＶ上への導入、又はそうでなければ、目的の部分がＥＶに関連するようにＥＶに関連付けること指す。本明細書に記載されているように、一部の態様では、ペイロードを負荷されたＥＶは、ペイロードがＥＶの外側表面に連結されているか又はそれとコンジュゲートしているＥＶを指す。

【0135】

[0139]用語「負荷効率」は、溶液中の全ペイロード（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）と比較した、ＥＶに負荷されたペイロード（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の比率（例えば、負荷されたペイロード／ペイロードの合計）を指す。本開示から明らかなように、一部の態様では、負荷効率の増加は、参照値（例えば、本開示とは異なる負荷方法で観察された負荷効率）と比較して、溶液（ＥＶとペイロードとの混合物を含む）中のペイロード（例えば、ＡＳＯ）がより多くＥＶ上に負荷されたことを意味する。指定されない限り、用語「負荷効率」及び「負荷密度」は、本明細書において交換可能に使用することができる。

【0136】

[0140]本明細書で使用される場合、用語「内腔を操作されたＥＶ」は、操作されたＥＶの内腔の内腔表面が修飾前のＥＶ又は天然に存在するＥＶのものと異なるように、ＥＶの膜又は内腔の内腔表面の組成が修飾されたＥＶを指す。

【0137】

[0141]操作するステップは、ＥＶの内腔及び／又は内腔表面が変化するように、直接的にＥＶの内腔（すなわち、ＥＶ内の空隙）又はＥＶの膜、特にＥＶの内腔表面内であり得る。例えば、膜は、ＥＶの内腔表面が修飾されるように、タンパク質、脂質、小分子、炭水化物などの組成において修飾される。同様に、内腔内の含有物が変更され得る。組成は、化学的、物理的、若しくは生物学的な方法によって、又は化学的、物理的、若しくは生物学的な方法によって以前に修飾された細胞から生成されることによって変化させることができる。具体的には、組成は、遺伝子工学によって、又は遺伝子工学によって以前に修飾された細胞から生成されることによって変化させることができる。一部の態様では、内腔を操作されたＥＶは、ＥＶの内腔表面若しくは内腔に露出され得るか、又はＥＶの内側の層に露出された部分のアンカーポイント（結合）となり得る、外因性タンパク質（すなわち、ＥＶが天然には発現しないタンパク質）又はその断片若しくはバリアントを含む。

【0138】

[0142]本明細書で使用される場合、用語「巨大分子」は、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、代謝物、又はその組合せを指す。

【0139】

[0143]用語「修飾された」は、本明細書に記載のＥＶに関連して使用される場合、修飾されたＥＶが天然に存在するＥＶと異なるように、ＥＶ及び／又はその産生細胞を変更又は操作することを指す。一部の態様では、本明細書に記載の修飾されたＥＶは、天然に存在するＥＶの膜と比較して、タンパク質、脂質、小分子、炭水化物などの組成が異なる膜を含む。例えば、本明細書で実証されるように、本明細書に記載のＥＶは、ＥＶにおいて天然には見られないペイロード（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の量が増加するように修飾されている。ある特定の態様では、このような膜への修飾は、ＥＶの外側表面を変化させる（例えば、表面を操作されたＥＶ）。ある特定の態様では、膜へのこのような修飾は、ＥＶの内腔表面を変化させる（例えば、本明細書に記載の内腔を操作されたＥＶ）。

【0140】

[0144]本明細書で使用される場合、用語「修飾されたタンパク質」又は「タンパク質修飾」は、タンパク質の非突然変異アミノ酸配列に対して少なくとも１５％の同一性を有するタンパク質を指す。タンパク質の修飾は、タンパク質の断片又はバリアントを含む。タンパク質の修飾は、タンパク質の断片又はバリアントに対する化学的、又は物理的修飾をさらに含み得る。

【0141】

[0145]本明細書で使用される場合、用語「モジュレートする」、「修飾する」、及びこれらの文法上の変形は、特定の濃度、レベル、発現、機能又は挙動に適用された場合、例えば、アンタゴニスト又はアゴニストとして作用するために、特定の濃度、レベル、発現、機能又は挙動を、増加させるか又は低下させる、例えば、直接的又は間接的に、促進する／刺激する／上方調節する又は妨げる／阻害する／下方調節することによって、変更する能力を一般に指す。一部の事例では、モジュレーターは、対照と比較して、又は一般的に予測される平均活性レベルと比較して、又は対照の活性レベルと比較してある特定の濃度、レベル、活性若しくは機能を増加及び／又は低下させ得る。

【0142】

[0146]本明細書で使用される場合、用語「ナノベシクル」は、２０～２５０ｎｍの間（例えば、３０～１５０ｎｍの間）の直径を有する細胞外ベシクルを指し、ナノベシクルが操作なしに細胞によって産生されないように直接的又は間接的な操作によって細胞（例えば、産生細胞）から生成される。ナノベシクルを産生する細胞の適切な操作としては、以下に限定されないが、連続的押出し、アルカリ溶液による処理、超音波処理、又はこれらの組合せが挙げられる。一部の態様では、ナノベシクルの産生は、産生細胞の破壊をもたらす可能性がある。一部の態様では、本明細書に記載のナノベシクルの集団は、原形質膜からの直接出芽又は後期エンドソームの原形質膜との融合によって細胞から誘導されるベシクルを実質的に含まない。ナノベシクルは、一旦産生細胞から誘導されると、そのサイズ、密度、生化学的パラメーター、又はこれらの組合せに基づいて、産生細胞から単離され得る。

【0143】

[0147]本明細書で使用される場合、用語「ペイロード」は、本明細書に記載のＥＶと接触した標的（例えば、標的細胞）で作用する生物学的に活性な分子（例えば、治療剤）を指す。ＥＶに導入することができるペイロードの非限定的な例としては、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分若しくは毒素を含むヌクレオチド、又は転写を破壊するヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素などのポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ分子、又はｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチドがコンジュゲートしたホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの調節機能を有するＲＮＡ分子）、アミノ酸（例えば、検出可能な部分若しくは毒素を含むアミノ酸、又は翻訳を破壊するアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、及び小分子（例えば、小分子薬物及び毒素）などの治療剤が挙げられる。一部の態様では、ペイロードは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。

【0144】

[0148]用語「薬学的に許容できる担体」、「薬学的に許容できる賦形剤」、及びこれらの文法上の変形は、ヒトを含む動物において使用するための、米国連邦政府の規制当局によって承認されたか、又は米国薬局方に列挙された薬剤のいずれか、並びに対象への組成物の投与を禁止する程度まで望ましくない生理学的効果の生成を引き起こさず、且つ投与された化合物の生物活性及び特性を無効にしない任意の担体又は希釈剤を包含する。医薬組成物の調製に有用であり、一般に安全で、無毒性であり、望ましい賦形剤及び担体が含まれる。

【0145】

[0149]本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」は、本明細書に記載の化合物（例えば、ＥＶ）のうちの１つ又は複数を、薬学的に許容できる担体及び賦形剤などの１つ又は複数の他の化学構成成分と混合若しくは混和させるか、又はその中に懸濁させたものを指す。医薬組成物の１つの目的は、対象へのＥＶの調製物の投与を容易にすることである。

【0146】

[0150]用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらのアナログ、又はそれらの混合物を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指す。この用語は分子の一次構造を指す。よって、この用語には、三本鎖、二本鎖及び一本鎖のデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、並びに三本鎖、二本鎖及び一本鎖のリボ核酸（「ＲＮＡ」）が含まれる。例えば、アルキル化、及び／又はキャッピングによる修飾形態のポリヌクレオチド、並びに非修飾形態のポリヌクレオチドも含まれる。ある特定の態様では、用語「ポリヌクレオチド」は、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｍＲＮＡを含む、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含有する）、スプライシングされたか又はスプライシングされていないかにかかわらず、プリン塩基又はピリミジン塩基のＮ－又はＣ－グリコシドである他の種類のポリヌクレオチド、並びに非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸「ＰＮＡ」）及びポリモルホリノポリマー、並びにポリマーが、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるような塩基対合及び塩基スタッキングを可能にする立体配置で核酸塩基を含有する他の合成配列特異的核酸ポリマーを含む。特定の態様では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。ある特定の態様では、ｍＲＮＡは、合成ｍＲＮＡである。一部の態様では、合成ｍＲＮＡは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。一部の態様では、ある特定の分類のすべての核酸塩基は、非天然核酸塩基で置き換えられている（例えば、本明細書で開示されているポリヌクレオチドのすべてのウリジンは、非天然核酸塩基、例えば５－メトキシウリジンで置き換えられている可能性がある）。本開示の一部の態様では、生物学的に活性な分子は、ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）である。

【0147】

[0151]用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。ポリマーは、修飾されたアミノ酸を含み得る。この用語は、天然に又は介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識構成成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作若しくは修飾によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１つ又は複数のアナログ（例えば、ホモシステイン、オルニチン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、Ｄ－アミノ酸、及びクレアチンなどの非天然アミノ酸を含む）を含有するポリペプチド、及び当技術分野で公知の他の修飾もこの定義内に含まれる。

【0148】

[0152]用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、任意のサイズ、構造、又は機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。ポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、前記のものの断片及び他の均等物、バリアント、及びアナログを含む。ポリペプチドは、単一のポリペプチドであっても、又は二量体、三量体若しくは四量体などの多分子の複合体であってもよい。これらは、一本鎖又は複数鎖のポリペプチドも含み得る。最も一般的なジスルフィド連結は、複数鎖のポリペプチドに見られる。ポリペプチドという用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的アナログであるアミノ酸ポリマーにも当てはまる可能性がある。一部の態様では、「ペプチド」は、５０アミノ酸長未満であるか又はそれに等しい、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０アミノ酸長であり得る。

【0149】

[0153]用語「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「防止すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、及びその変形は、本明細書で使用される場合、疾患、障害及び／若しくは状態の発症を部分的若しくは完全に遅延させること；特定の疾患、障害、及び／若しくは状態の１つ若しくは複数の症状、特徴、若しくは臨床症状の発症を部分的若しくは完全に遅延させること；特定の疾患、障害、及び／若しくは状態の１つ若しくは複数の症状、特徴、若しくは症状の発症を部分的若しくは完全に遅延させること；特定の疾患、障害、及び／若しくは状態からの進行を部分的若しくは完全に遅延させること；並びに／又は疾患、障害、及び／若しくは状態に関連する病態を発症するリスクを低下させることを指す。一部の態様では、転帰を防止することは、予防的処置によって実現される。

【0150】

[0154]本明細書で使用される場合、用語「産生細胞」は、ＥＶを生成するために使用される細胞を指す。産生細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞であるか、又はｉｎ ｖｉｖｏの細胞であり得る。産生細胞としては、以下に限定されないが、ＥＶを生成するのに有効であることが知られている細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪間葉系幹細胞、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞が挙げられる。ある特定の態様では、産生細胞は、抗原提示細胞ではない。一部の態様では、産生細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、マクロファージ、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、これらの細胞のいずれかに由来する細胞、又はこれらのいずれかの組合せではない。

【0151】

[0155]本明細書で使用される場合、「予防の」は、疾患若しくは状態の発症を予防するために、又は疾患若しくは状態に関連する症状を防止若しくは遅延させるために使用される治療法又は一連の作用を指す。

【0152】

[0156]本明細書で使用される場合、「予防」は、健康を維持し、出血エピソードの発症を予防若しくは遅延させるために、又は疾患若しくは状態に関連する症状を防止若しくは遅延させるためにとられる手段を指す。

【0153】

[0157]「組換え」ポリペプチド又はタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生されるポリペプチド又はタンパク質を指す。操作された宿主細胞において発現される組換えによって産生されたポリペプチド及びタンパク質は、本開示の目的のために単離されたと考えられ、任意の好適な技法によって分離され、画分化され、又は部分的若しくは実質的に精製された天然ポリペプチド又は組合せポリペプチドも同様である。本明細書で開示されているポリペプチドは、当技術分野で公知の方法を使用して組換えによって産生され得る。或いは、本明細書で開示されているタンパク質及びペプチドは、化学的に合成することができる。本開示の一部の態様では、ＥＶに存在するエクソソームタンパク質は、産生細胞においてエクソソームタンパク質を過剰発現させることによって組換えにより産生され、その結果、得られたＥＶ中のエクソソームタンパク質のレベルは、このようなエクソソームタンパク質を過剰発現していない産生細胞のＥＶ中に存在するエクソソームタンパク質のレベルに対して有意に増加する。

【0154】

[0158]本明細書で使用される場合、用語「エクソソームタンパク質」は、ＥＶの表面で特定されたＥＶタンパク質を指す。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第１０，１９５，２９０号を参照されたい。エクソソームタンパク質の非限定的な例としては、プロスタグランジンＦ２受容体陰性調節因子（「ＰＴＧＦＲＮ」）；ベイシジン（「ＢＳＧ」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（「ＩＧＳＦ２」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（「ＩＧＳＦ３」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（「ＩＧＳＦ８」）；インテグリンベータ－１（「ＩＴＧＢ１」）；インテグリンアルファ－４（「ＩＴＧＡ４」）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（「ＳＬＣ３Ａ２」）；及びＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（「ＡＴＰ１Ａ１」、「ＡＴＰ１Ａ２」、「ＡＴＰ１Ａ３」、「ＡＴＰ１Ａ４」、「ＡＴＰ１Ｂ３」、「ＡＴＰ２Ｂ１」、「ＡＴＰ２Ｂ２」、「ＡＴＰ２Ｂ３」、「ＡＴＰ２Ｂ」）が挙げられる。一部の態様では、エクソソームタンパク質は、全タンパク質又はその断片（例えば、機能的断片、例えば、ＥＶの外部表面又は内腔表面に別の部位を係留することが可能な最小断片）であり得る。一部の態様では、エクソソームタンパク質は、生物学的に活性な分子を、ＥＶの外部表面又は内腔に係留することができる。本開示に関して使用することができる他のエクソソームタンパク質の非限定的な例としては、アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）；Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ、別名膜メタロエンドペプチダーゼ（ＭＭＥ）；エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）；Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－１（ＮＲＰ１）；ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂが挙げられる。

【0155】

[0159]Ｅの内腔内で特定されたさらなるエクソソームタンパク質。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０２０／０３４７１１２を参照されたい。エクソソームタンパク質の非限定的な例としては、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（「ＭＡＲＣＫＳ」）、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（「ＭＡＲＣＫＳＬ１」）、及び脳酸可溶性タンパク質１（「ＢＡＳＰ１」）が挙げられる。一部の態様では、エクソソームタンパク質は、全タンパク質又はその断片（例えば、機能的断片、例えばＥＶの内腔表面に部位を係留することが可能な最小断片）であり得る。一部の態様では、エクソソームは、部分をＥＶの内腔表面に係留させ得る。本開示の一部の態様では、部分はエクソソームに共有結合され得る。

【0156】

[0160]本明細書で使用される場合、用語「類似性」は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）間及び／又はポリペプチド分子間の全体的関連性を指す。ポリマー分子の互いへの類似性パーセントの計算は、類似性パーセントの計算では当技術分野で理解されている保存的置換を考慮に入れること以外は、同一性パーセントの計算と同じように実施することができる。類似性のパーセンテージが、使用される比較スケール、すなわち、アミノ酸が、例えば、それらの進化的近接性、電荷、体積、可撓性、極性、疎水性、芳香族性、等電点、抗原性、又はこれらの組合せに従って比較されるかどうかに依存することが理解される。

【0157】

[0161]用語「スペーサー」は、本明細書で使用される場合、２つの間隔のあいた部分（例えば、切断性リンカー及び生物学的に活性な分子）を共有結合により連結させて、通常安定な異なる分子にすることが可能な二官能性の化学的部分を指す。

【0158】

[0162]別段に示されていない限り、１つ又は複数の立体中心を有する化合物への言及は、その各立体異性体、及び立体異性体のすべての組合せを意図する。

【0159】

[0163]用語「対象」、「患者」、「個体」、及び「宿主」、並びにこれらの変形は、本明細書で互換的に使用され、診断、処置、又は治療が所望される、ヒト、飼育動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）、特にヒトを含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物対象を指す。本明細書に記載の方法は、ヒトの治療と獣医学的適用の両方に適用可能である。

【0160】

[0164]本明細書で使用される場合、用語「実質的に含まない」は、ＥＶを含む試料が、質量／体積（ｍ／ｖ）パーセンテージ濃度で、１０％未満の巨大分子、例えば夾雑物しか含まない。一部の画分は、０．００１％未満、０．０１％未満、０．０５％未満、０．１％未満、０．２％未満、０．３％未満、０．４％未満、０．５％未満、０．６％未満、０．７％未満、０．８％未満、０．９％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、又は１０％未満（ｍ／ｖ）の巨大分子しか含有しない場合がある。

【0161】

[0165]本明細書で使用される場合、用語「表面を操作されたＥＶ」は、操作されたＥＶの表面が修飾前のＥＶ又は天然に存在するＥＶの表面と異なるように、ＥＶの膜又は表面の組成が修飾されたＥＶを指す。

【0162】

[0166]本明細書で使用される場合、用語「表面を操作されたエクソソーム」は、操作されたエクソソームの表面が修飾前のエクソソーム又は天然に存在するエクソソームの表面と異なるように、エクソソームの膜又は表面（外部表面又は内腔表面）の組成が修飾されたエクソソームを指す。

【0163】

[0167]操作は、ＥＶの表面が変化するように、ＥＶの表面及び／又は膜内でなされ得る。例えば、膜は、例えば、タンパク質、脂質、小分子、炭水化物、又はこれらの組合せの組成が修飾され得る。組成は、化学的、物理的、若しくは生物学的な方法によって、又は化学的、物理的、若しくは生物学的な方法によって以前に若しくは同時に修飾された細胞から生成されることによって変化させることができる。具体的には、組成は、遺伝子工学によって、又は遺伝子工学によって以前に修飾された細胞から生成されることによって変化させることができる。一部の態様では、表面を操作されたＥＶは、ＥＶの表面に露出され得るか、又はＥＶの表面に露出された部分のアンカーポイント（結合）となり得る、外因性タンパク質（すなわち、ＥＶが天然には発現しないタンパク質）又はその断片若しくはバリアントを含む。一部の態様では、表面を操作されたＥＶは、ＥＶの表面に露出され得るか、又はＥＶの表面に露出された部分のアンカーポイント（結合）となり得る、より高い発現の（例えば、より多数の）天然のＥＶ、例えばエクソソームタンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）又はその断片若しくはバリアントを含む。

【0164】

[0168]本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、それを必要とする対象に所望の治療効果、薬理学的効果及び／又は生理学的効果をもたらすのに十分である、本明細書に記載のＥＶを含む試薬又は医薬化合物の量である。治療有効量は、予防を治療と考えることができるため、「予防有効量」であり得る。

【0165】

[0169]用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、又は「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、本明細書で使用される場合、例えば、疾患又は状態の重症度の低減；疾患経過期間の低減；疾患又は状態に関連する１つ又は複数の症状の軽快又は排除；疾患又は状態を必ずしも治癒させることなく、疾患又は状態を有する対象に有益な効果を提供することを指す。この用語は、疾患若しくは状態又はその症状の予防又は防止も含む。一態様では、用語「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、対象において抗原に対する免疫応答を誘導することを意味する。

【0166】

[0170]本明細書で使用される場合、分子（例えば、機能的分子、抗原、又はエクソソームタンパク質）の「バリアント」という用語は、当技術分野で公知の方法によって比較すると、別の分子とある特定の構造的及び機能的同一性を共有する分子を指す。例えば、タンパク質のバリアントは、別のタンパク質における置換、挿入、欠失、フレームシフト又は再配列を含み得る。

【0167】

[0171]天然に存在するバリアントは、「対立遺伝子バリアント」と呼ばれ、生物の染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態のうちの１つを指す（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子バリアントは、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドレベルで変化する可能性があり、本開示に含まれる。或いは、天然に存在しないバリアントは、突然変異誘発技法又は直接的合成によって産生され得る。

【0168】

[0172]タンパク質操作及び組換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用して、ポリペプチドの特徴を改善又は変更するためにバリアントが生成され得る。例えば、１つ又は複数のアミノ酸は、生物学的機能を実質的に喪失させずに、分泌タンパク質のＮ末端又はＣ末端から欠失され得る。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｏｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：２９８４～２９８８頁（１９９３）は、３、８、又は２７個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失させた後にもヘパリン結合活性を有するバリアントＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンガンマは、このタンパク質のカルボキシ末端から８～１０個のアミノ酸残基を欠失させた後に、最大１０倍高い活性を呈した。（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９～２１６頁（１９８８））。

【0169】

[0173]さらに、バリアントが天然に存在するタンパク質と同様の生物活性を保持することが多いことを実証する十分な証拠がある。例えば、Ｇａｙｌｅ及び共同研究者（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５～２２１１１頁（１９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ－１ａの広範な変異解析を行った。彼らは、ランダム突然変異誘発を使用して、３，５００個を超える個々のＩＬ－１ａ変異体を生成し、分子の全長にわたってバリアント当たり平均２．５個のアミノ酸を変化させた。複数の変異が、可能性のあるすべてのアミノ酸位置で調査された。研究者らは、「分子の大部分が、（結合又は生物活性）にほとんど影響を与えることなく変更され得る」ことを発見した。（要約を参照されたい）。実際、調査された３５００を超えるヌクレオチド配列のうち、野生型と活性が有意に異なるタンパク質を産生したのは、２３個の固有のアミノ酸配列だけであった。

【0170】

[0174]上述したように、バリアント又は誘導体は、例えば、修飾されたポリペプチドを含む。一部の態様では、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖タンパク質のバリアント又は誘導体は、化学修飾及び／又は内因性修飾の結果である。一部の態様では、バリアント又は誘導体は、ｉｎ ｖｉｖｏ修飾の結果である。一部の態様では、バリアント又は誘導体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾の結果である。さらに一部の態様では、バリアント又は誘導体は、産生細胞における細胞内修飾の結果である。

【0171】

ＩＩ．ペイロードの負荷方法
[0175]ＥＶの負荷効率が増加するように、ＥＶにペイロードを負荷する方法が本明細書に記載されている。

【0172】

[0176]一部の態様では、ＥＶを生成する方法は、目的の１つ又は複数の部分（例えば、ペイロード）をＥＶ中又はＥＶ上に直接的に導入することによって単離されたＥＶを修飾するステップを含む。例えば、本明細書に記載されているように、ペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、例えば、本明細書に記載の負荷条件下で、ペイロードをＥＶと混合するステップによってＥＶに導入され得る。一部の態様では、ペイロードをＥＶと混合するステップにより、コレステロールがＥＶの脂質膜と相互作用し、それにより、ペイロードをＥＶの外側表面に結合させることが可能になるように、ペイロードをコレステロールにコンジュゲートする。本明細書で使用される場合、用語「混合するステップ」は、ＥＶにペイロードが負荷され得る、例えば、ペイロードがＥＶの外側表面に関連する（例えば、外部表面にコンジュゲートされる）、ペイロードがＥＶの内腔表面に関連する（例えば、内腔表面にコンジュゲートされる）、ペイロードがＥＶの内腔内に存在するように、又はこれらの任意の組合せであるように、ペイロードとＥＶとをより近接させるプロセスを指す。別段に示されていない限り、混合するステップは、当技術分野で公知の任意の好適な方法を使用して実施することができる。例えば、一部の態様では、混合するステップは、バッチモードで起こり得る（例えば、ペイロード及びＥＶは、混合プロセスの開始時に添加される）。一部の態様では、混合するステップは、連続的プロセスで起こり得る（例えば、ペイロード及びＥＶは、混合プロセスの経過中に、例えば連続的撹拌槽反応器（ＣＳＴＲ）中で、混合物に連続的に添加される）。一部の態様では、混合するステップは、セミバッチモードで起こり得る。一部の態様では、混合するステップは、半連続モードで起こり得る。

【0173】

[0177]ある特定の態様では、１つ又は複数の部分（例えば、ペイロード）は、トランスフェクションによってＥＶに導入される。一部の態様では、１つ又は複数の部分（例えば、ペイロード）は、カチオン性の脂質及びポリマーなどの合成巨大分子を使用してＥＶ中に導入され得る（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２： Ｓ１１８～Ｓ１３０頁（２００５））。ある特定の態様では、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、又はポリブレンなどの化学物質は、１つ又は複数の部分（例えば、ペイロード）をＥＶに導入するために使用することができる。

【0174】

[0178]一部の態様では、１つ又は複数の部分（例えば、ペイロード）は、ＥＶの表面にコンジュゲートされ得る（すなわち、ＥＶの外側表面又はＥＶの内腔表面にコンジュゲートされ得るか又は直接的に連結され得る）。コンジュゲーションは、当技術分野で公知の方法によって、化学的又は酵素的に実現され得る。

【0175】

[0179]一部の態様では、ＥＶは、化学的にコンジュゲートされた１つ又は複数の部分（例えば、ペイロード）を含む。化学的コンジュゲーションは、本明細書で開示されているリンカー又は親和性リガンドを使用して又は使用せずに、１つ又は複数の部分（例えば、ペイロード及び／又は標的部分）を別の分子に共有結合させることによって達成され得る。このようなコンジュゲートの形成は、当業者の技術の範囲内であり、コンジュゲーションを達成するための様々な技法が公知であり、コンジュゲートされる物質によってガイドされる特定の技法が選択される。ある特定の態様では、ポリペプチドがＥＶにコンジュゲートされる。一部の態様では、脂質、炭水化物、核酸、及び小分子などの非ポリペプチドがＥＶにコンジュゲートされる。

【0176】

[0180]本明細書に記載されるように、本明細書において提供される方法を使用してペイロードをＥＶに負荷することは、負荷効率を増加させるだけでなく、ＥＶの１つ又は複数の追加の特性も改善させ得る。本明細書において実証されるように（例えば、実施例６を参照されたい）、一部の態様では、本明細書において提供される負荷パラメーター（例えば、塩濃度、負荷温度、負荷期間、ペイロード供給濃度、ＥＶ供給濃度）は、ペイロードの負荷後にＥＶの安定性を改善することができる。本明細書で使用される場合、用語「安定性」は、化合物（例えば、本明細書に記載のものなどのペイロードが負荷されたＥＶ）の、貯蔵寿命を通して特定の制限内で、その化学的、物理的、微生物学的、及び／又は生物製剤的特性を保持する能力を指す。例えば、一部の態様では、ペイロードを負荷したＥＶは、複数の（例えば、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、又は少なくとも５回の）凍結及び解凍処置後に安定なままである。一部の態様では、ペイロードを負荷したＥＶは安定なままであり、次の精製ステップの間も凝集しにくい。いかなる理論にも拘束されるものではないが、安定性が増すため、ペイロードは、ＥＶに負荷されると、ＥＶに関連したままである。したがって、一部の態様では、本明細書において提供される負荷方法は、ＥＶ負荷後のＥＶからのペイロードの解離を減少させるのに役立つ。また、本開示から明らかなように、一部の態様では、負荷効率の増加により、ＥＶの効力を改善することができる（例えば、実施例４を参照されたい）。

【0177】

ＩＩ．Ａ．塩濃度
[0181]一部の態様では、本開示は、ＥＶにペイロードを負荷する方法であって、塩を含む緩衝剤（本明細書において「負荷緩衝剤」とも称される）中でペイロードをＥＶと混合するステップを含み、塩の濃度（「塩濃度」）が、参照緩衝剤（例えば、塩を含まないか又は本開示の負荷緩衝剤の塩濃度よりも低い塩濃度を有する対応する緩衝剤）と比較して、増加している、方法を提供する。一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、参照緩衝剤の塩濃度と比較して、約０．１倍より高いか、約０．２倍より高いか、約０．３より高いか、約０．４より高いか、約０．５より高いか、約０．６より高いか、約０．７より高いか、約０．８より高いか、約０．９より高いか、約１より高いか、約２より高いか、約３より高いか、約４より高いか、約５より高いか、約６より高いか、約７より高いか、約８より高いか、約９より高いか、約１０より高いか、約１５より高いか、約２０より高いか、約２５より高いか、約３０より高いか、約３５より高いか、約４０倍より高いか、約４５倍より高いか、又は約５０倍より高い。

【0178】

[0182]一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約４０ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約６０ｍＭ、少なくとも約７０ｍＭ、少なくとも約８０ｍＭ、少なくとも約９０ｍＭ、少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約１１０ｍＭ、少なくとも約１２０ｍＭ、少なくとも約１３０ｍＭ、少なくとも約１４０ｍＭ、少なくとも約１５０ｍＭ、少なくとも約１６０ｍＭ、少なくとも約１７０ｍＭ、少なくとも約１８０ｍＭ、少なくとも約１９０ｍＭ、少なくとも約２００ｍＭ、少なくとも約２２５ｍＭ、少なくとも約２５０ｍＭ、少なくとも約２７５ｍＭ、少なくとも約３００ｍＭ、少なくとも約３２５ｍＭ、少なくとも約３５０ｍＭ、少なくとも約３７５ｍＭ、少なくとも約４００ｍＭ、少なくとも約４２５ｍＭ、少なくとも約４５０ｍＭ、少なくとも約４７５ｍＭ、又は少なくとも約５００ｍＭである。一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約５００ｍＭ未満、約４７５ｍＭ未満、約４５０ｍＭ未満、約４２５ｍＭ未満、約４００ｍＭ未満、約３７５ｍＭ未満、約３５０ｍＭ未満、約３２５ｍＭ未満、又は約３００ｍＭ未満である。一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約２００ｍＭ未満、約１９０ｍＭ未満、約１８０ｍＭ未満、約１７０ｍＭ未満、約１６０ｍＭ未満、約１５０ｍＭ未満、約１４０ｍＭ未満、約１３０ｍＭ未満、約１２０ｍＭ未満、又は約１１０ｍＭ未満である。

【0179】

[0183]一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約１ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約５ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約２０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約３０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約６０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約７０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約８０ｍＭ～約１５０ｍＭの間、約１０ｍＭ～約１４０ｍＭの間、約２０ｍＭ～約１４０ｍＭの間、約３０ｍＭ～約１４０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約１４０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１４０ｍＭの間、約１０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約２０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約３０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１３０ｍＭの間、約１０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約２０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約３０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約６０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約７０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約８０ｍＭ～約１２０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約１００ｍＭの間、約１００ｍＭ～約１５０ｍＭの間、又は約９０ｍＭ～約１１０ｍＭの間である。

【0180】

[0184]一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍ、約１８０ｍＭ、又は約１９０ｍＭである。ある特定の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、又は約１５０ｍＭである。ある特定の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約１００ｍＭである。ある特定の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約１１０ｍＭである。ある特定の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約１２０ｍＭである。ある特定の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約１３０ｍＭである。ある特定の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約１４０ｍＭである。ある特定の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約１５０ｍＭである。ある特定の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約９０ｍＭである。ある特定の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約８０ｍＭである。

【0181】

[0185]一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約２５ｍＭ～約５００ｍＭの間である。一部の態様では、塩濃度は、約１５０ｍＭ～約４５０ｍＭの間である。一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約１５０ｍＭ以上である。例えば、一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約１７５ｍＭである。一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約２００ｍＭである。一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約２２５ｍＭである。一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約２５０ｍＭである。一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約２７５ｍＭである。一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約３００ｍＭである。一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約３２５ｍＭである。一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約３５０ｍＭである。一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約３７５ｍＭである。一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約４００ｍＭである。一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約４２５ｍＭである。一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約４５０ｍＭである。一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約４７５ｍＭである。一部の態様では、負荷緩衝剤の塩濃度は、約５００ｍＭである。

【0182】

[0186]本明細書で実証されるように、負荷緩衝剤の塩濃度は、ＥＶ中のペイロード（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の負荷効率に影響を及ぼし得る。例えば、出願人は、負荷緩衝剤の塩濃度（例えば、特に、本明細書で開示されている塩濃度の範囲内）の増加によってＥＶの負荷効率が増加し得ることを特定した。したがって、一部の態様では、本明細書で開示されている塩濃度のうちの１つ又は複数を含む負荷緩衝剤中でペイロード（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）をＥＶと混合するステップにより、参照緩衝剤（塩を含まないか又は塩を含むがより低い濃度の塩を含む）中でのＥＶにおけるペイロードの負荷と比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、ＥＶにおける（例えば、外側表面への、内腔表面への、及び／又は内腔内への）ペイロードの負荷を増加させる。本開示から明らかであるように、ペイロードの負荷の増加は、ＥＶのペイロード濃度の増加をもたらす。

【0183】

[0187]例えば、一部の態様では、塩濃度が増加した（例えば、本明細書に記載の塩濃度の範囲）負荷緩衝剤中でペイロードとＥＶとを混合するステップにより、ＥＶの外側表面に関連するペイロードの量（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの数）が増加する。一部の態様では、ＥＶの外側表面に関連するペイロードの量は、参照量（例えば、ペイロードが参照緩衝剤と共に負荷された場合のＥＶの外側表面におけるペイロードの量）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加している。一部の態様では、塩濃度が増加した負荷緩衝剤中でペイロードとＥＶとを混合するステップにより、ＥＶの内腔表面に関連するペイロードの量が増加する。一部の態様では、ＥＶの内腔表面に関連するペイロードの量は、参照量（例えば、ペイロードが参照緩衝剤と共に負荷された場合のＥＶの内腔表面におけるペイロードの量）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上増加している。一部の態様では、塩濃度が増加した負荷緩衝剤中でペイロードとＥＶとを混合するステップにより、ＥＶの内腔に関連するペイロードの量が増加する。一部の態様では、ＥＶの内腔に関連するペイロードの量は、参照量（例えば、ペイロードが参照緩衝剤と共に負荷された場合のＥＶの内腔内のペイロードの量）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加している。一部の態様では、塩濃度が増加した負荷緩衝剤中でペイロードとＥＶとを混合するステップにより、ＥＶの外側表面、ＥＶの内腔表面、ＥＶの内腔、又はこれらの任意の組合せに関連するペイロードの量が増加する。

【0184】

[0188]本明細書に記載の負荷緩衝剤は、当技術分野で公知の任意の好適な塩を含み得る。一部の態様では、塩は、一価の塩、二価の塩、三価の塩、又はこれらの組合せを含む。ある特定の態様では、塩は、一価の塩を含む。一部の態様では、塩は、二価の塩を含む。一部の態様では、塩は、三価の塩を含む。このような塩の非限定的な例は、以下にさらに提供される。一部の態様では、塩は、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ＫＣｌ（塩化カリウム）、ＰＯ_４（リン酸塩）、ＣａＣｌ_２（塩化カルシウム）、ＭｇＣｌ_２（塩化マグネシウム）、Ｍｇ_２ＳＯ_４（硫酸マグネシウム）、ＺｎＣｌ_２（塩化亜鉛）、ＭｎＣｌ_２（塩化マンガン）、ＭｎＳＯ_４（硫酸マンガン）、ＮａＳＣＮ（チオシアン酸ナトリウム）、ＫＳＣＮ（チオシアン酸カリウム）、ＬｉＣｌ（塩化リチウム）、Ｋ_２ＨＰＯ_４（リン酸二カリウム）、Ｎａ_２ＳＯ_４（硫酸ナトリウム）、ＮａＰＯ_４（リン酸ナトリウム）、Ｋ_２ＳＯ_４（リン酸カリウム）、酢酸ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウム、臭化リチウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化リチウム、ヨウ化リチウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、ヨウ化カリウム、硫酸カルシウム、硫酸ナトリウム、三塩化クロム、硫酸クロム、クエン酸ナトリウム、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化イットリウム（ＩＩＩ）、硫酸カリウム、塩化第一鉄、クエン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、塩化第二鉄、アルギニン－ＨＣｌ、又はこれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、塩は、ＮａＣｌを含む。

【0185】

[0189]一部の態様では、負荷効率の増加は、以下のいずれかによって実現され得る：塩若しくは塩濃度の変更、ｐＨの変更、又は有機修飾剤、有機溶媒、小分子、洗剤、両性イオン、アミノ酸、ポリマー、ポリオール（例えば、スクロース、グルコース、トレハロース、マンノース、ソルビトール、マンニトール、グリセロールなど）、抗酸化剤（例えば、メチオニン）、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及び／若しくは尿素の添加、溶液の極性を変更する賦形剤の添加、ＥＶの構造をモジュレートする賦形剤の添加、又はこれらの任意の組合せ。

【0186】

[0190]一部の態様では、負荷効率の増加は、一価の塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、塩化リチウム、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウム、臭化リチウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化リチウム、ヨウ化リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、及びヨウ化カリウム）、２価若しくは３価の塩（例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸カルシウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、三塩化クロム、硫酸クロム、クエン酸ナトリウム、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化イットリウム（ＩＩＩ）、リン酸カリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム、塩化第一鉄、クエン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、又は塩化第二鉄）、又はこれらの組合せの濃度を増加させることによって実現され得る。

【0187】

ＩＩ．Ｂ．負荷温度
[0191]本明細書において実証されるように、出願人は、ペイロードとＥＶとが混合される温度を上昇させること（本明細書において「負荷温度」とも称される）によって、ＥＶの負荷効率も増加され得ることをさらに特定した。したがって、一部の態様では、本開示は、ＥＶにペイロードを負荷する方法であって、約０℃より高い負荷温度（例えば、約２℃より高いか又は約４℃より高い）で、ペイロードをＥＶと混合するステップを含む、方法を提供する。一部の態様では、負荷温度は、少なくとも約０℃、少なくとも約１℃、少なくとも約２℃、少なくとも約３℃、少なくとも約４℃、少なくとも約５℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約１５℃、少なくとも約２０℃、少なくとも約２５℃、少なくとも約３０℃、少なくとも約３５℃、少なくとも約３７℃、少なくとも約４０℃、少なくとも約４５℃、少なくとも約５０℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、少なくとも約７０℃、少なくとも約７５℃、又は少なくとも約８０℃である。一部の態様では、負荷温度は、約０℃～約４０℃の間、約１℃～約４０℃の間、約２℃～約４０℃の間、約３℃～約４０℃の間、約４℃～約４０℃の間、約５℃～約４０℃の間、約１０℃～約４０℃の間、約１５℃～約４０℃の間、約２０℃～約４０℃の間、約２５℃～約４０℃の間、約３０℃～約４０℃の間、約３５℃～約４０℃の間、約５℃～約３８℃の間、約１０℃～約３８℃の間、約１５℃～約３８℃の間、約２０℃～約３８℃の間、約２５℃～約３８℃の間、約３０℃～約３８℃の間、約３５℃～約３８℃の間、約５℃～約３７℃の間、約１０℃～約３７℃の間、約１５℃～約３７℃の間、約２０℃～約３７℃の間、約２５℃～約３７℃の間、約３０℃～約３７℃の間、又は約３５℃～約３７℃の間である。一部の態様では、負荷温度は、約０℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、又は約８０℃である。

【0188】

[0192]一部の態様では、負荷温度は、約０℃～約８０℃の間である。一部の態様では、負荷温度は、約３７℃～約７０℃の間である。一部の態様では、負荷温度は、約３７℃である。一部の態様では、負荷温度は、約４０℃である。一部の態様では、負荷温度は、約４５℃である。一部の態様では、負荷温度は、約５０℃である。一部の態様では、負荷温度は、約５５℃である。一部の態様では、負荷温度は、約６０℃である。一部の態様では、負荷温度は、約６５℃である。一部の態様では、負荷温度は、約７０℃である。一部の態様では、負荷温度は、約７５℃である。一部の態様では、負荷温度は、約８０℃である。

【0189】

[0193]一部の態様では、本明細書に記載の負荷温度でペイロードとＥＶとを混合するステップにより、参照温度（例えば、負荷温度より低い）でのＥＶにおけるペイロードの負荷と比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、ＥＶにおける（外側表面への、内腔表面への、及び／又は内腔内への）ペイロードの負荷が増加する。本開示から明らかであるように、ペイロードの負荷の増加は、ＥＶのペイロード濃度の増加をもたらす。

【0190】

[0194]一部の態様では、ペイロードとＥＶとが混合される負荷温度を上昇させることにより、ＥＶの外側表面に関連するペイロードの量（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの数）が増加する。一部の態様では、ＥＶの外側表面に関連するペイロードの量は、参照量（例えば、ペイロードが参照温度で負荷された場合のＥＶの外側表面におけるペイロードの量）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加している。一部の態様では、ペイロードとＥＶとが混合される負荷温度を上昇させることにより、ＥＶの内腔表面に関連するペイロードの量が増加する。一部の態様では、ＥＶの内腔表面に関連するペイロードの量は、参照量（例えば、ペイロードが参照温度で負荷された場合のＥＶの内腔表面におけるペイロードの量）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加している。一部の態様では、ペイロードとＥＶとが混合される負荷温度を上昇させることにより、ＥＶの内腔に関連するペイロードの量が増加する。一部の態様では、ＥＶの内腔に関連するペイロードの量は、参照量（例えば、ペイロードが参照温度で負荷された場合のＥＶの内腔内のペイロードの量）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加している。一部の態様では、ペイロードとＥＶとが混合される負荷温度を上昇させることにより、ＥＶの外側表面、ＥＶの内腔表面、ＥＶの内腔、又はこれらの任意の組合せに関連するペイロードの量が増加する。

【0191】

ＩＩ．Ｃ．負荷期間
[0195]本明細書で実証されるように、一部の態様では、ペイロードとＥＶとを混合させる時間（本明細書において「負荷期間」とも称される）を増加させることにより、ＥＶにおけるペイロード（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の負荷効率も増加し得る。一部の態様では、本開示は、ＥＶにペイロードを負荷する方法であって、少なくとも約５分（例えば、少なくとも約１時間）の負荷期間、ペイロードをＥＶと混合するステップを含む、方法を提供する。ある特定の態様では、負荷期間は、約５分～約４８時間の間、約５分～約４２時間の間、約５分～約３６時間の間、約５分～約４０時間の間、約５分～約２４時間の間、約１０分～約４８時間の間、約１０分～約４２時間の間、約１０分～約３６時間の間、約１０分～約３０時間の間、約１０分～約２４時間の間、約２０分～約４８時間の間、約２０分～約４２時間の間、約２０分～約３６時間の間、約２０分～約３０時間の間、約２０分～約２４時間の間、約３０分～約４８時間の間、約３０分～約４２時間の間、約３０分～約３６時間の間、約３０分～約３０時間の間、約３０分～約２４時間の間、約１時間～約４８時間の間、約１時間～約４２時間の間、約１時間～約３６時間の間、約１時間～約３０時間の間、約１時間～約２４時間の間、約６時間～約４８時間の間、約６時間～約４２時間の間、約６時間～約３６時間の間、約６時間～約３０時間の間、約６時間～約２４時間の間、約１２時間～約４８時間の間、約１２時間～約４２時間の間、約１２時間～約３６時間の間、約１２時間～約３０時間の間、又は約１２時間～約２４時間の間である。ある特定の態様では、負荷期間は、約６時間、約１２時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、又は約４８時間である。

【0192】

[0196]一部の態様では、負荷期間は、約１時間～約１０日間の間である。一部の態様では、負荷期間は、約２４時間～約７日間の間である。一部の態様では、負荷期間は、約１時間である。一部の態様では、負荷期間は、約６時間である。一部の態様では、負荷期間は、約１２時間である。一部の態様では、負荷期間は、約２４時間である。一部の態様では、負荷期間は、約２日間である。一部の態様では、負荷期間は、約３日間である。一部の態様では、負荷期間は、約４日間である。一部の態様では、負荷期間は、約５日間である。一部の態様では、負荷期間は、約６日間である。一部の態様では、負荷期間は、約７日間である。一部の態様では、負荷期間は、約８日間である。一部の態様では、負荷期間は、約９日間である。一部の態様では、負荷期間は、約１０日間である。

【0193】

[0197]一部の態様では、本明細書に記載の負荷期間（例えば、少なくとも約２４時間）でペイロードとＥＶとを混合するステップにより、参照期間（例えば、負荷期間より短い）でのＥＶにおけるペイロードの負荷と比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、ＥＶにおける（外側表面への、内腔表面への、及び／又は内腔内への）ペイロードの負荷が増加する。本開示から明らかであるように、ペイロードの負荷の増加は、ＥＶのペイロード濃度の増加をもたらす。

【0194】

[0198]一部の態様では、負荷期間を増加させることにより、ＥＶの外側表面に関連するペイロードの量（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの数）が増加する。一部の態様では、ＥＶの外側表面に関連するペイロードの量は、参照量（例えば、ペイロードが参照期間でＥＶと混合された場合のＥＶの外側表面におけるペイロードの量）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加している。一部の態様では、負荷期間を増加させることにより、ＥＶの内腔表面に関連するペイロードの量が増加する。一部の態様では、ＥＶの内腔表面に関連するペイロードの量は、参照量（例えば、ペイロードが参照期間でＥＶと混合された場合のＥＶの内腔表面におけるペイロードの量）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加している。一部の態様では、負荷期間を増加させることにより、ＥＶの内腔に関連するペイロードの量が増加する。一部の態様では、ＥＶの内腔に関連するペイロードの量は、参照量（例えば、ペイロードが参照期間でＥＶと混合された場合のＥＶの内腔表面におけるペイロードの量）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加している。一部の態様では、負荷期間を増加させることにより、ＥＶの外側表面、ＥＶの内腔表面、ＥＶの内腔、又はこれらの任意の組合せに関連するペイロードの量が増加する。

【0195】

ＩＩ．Ｄ．ペイロード供給濃度
[0199]一部の態様では、本明細書において提供されるＥＶにペイロード（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を負荷する方法は、ＥＶとペイロードとが混合されるペイロード供給濃度を増加させるステップを含み、ペイロード供給濃度の増加は、ペイロードの負荷効率を増強する。本明細書で使用される場合、用語「ペイロード供給濃度」は、本明細書に記載の負荷方法において、ＥＶと混合されるペイロードの量を指す。

【0196】

[0200]一部の態様では、ペイロード供給濃度は、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭ、少なくとも約５０μＭ、少なくとも約６０μＭ、少なくとも約７０μＭ、少なくとも約８０μＭ、少なくとも約９０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約１５０μＭ、少なくとも約２００μＭ、少なくとも約２５０μＭ、少なくとも約３００μＭ、少なくとも約３５０μＭ、少なくとも約４００μＭ、少なくとも約４５０μＭ、少なくとも約５００μＭ、少なくとも約５５０μＭ、少なくとも約６００μＭ、少なくとも約６５０μＭ、少なくとも約７００μＭ、少なくとも約７５０μＭ、少なくとも約８００μＭ、少なくとも約８５０μＭ、少なくとも約９００μＭ、少なくとも約９５０μＭ、少なくとも約１０００μＭ、少なくとも約１０５０μＭ、少なくとも約１１００μＭ、少なくとも約１１５０μＭ、少なくとも約１２００μＭ、少なくとも約１２５０μＭ、少なくとも約１３００μＭ、少なくとも約１３５０μＭ、少なくとも約１４００μＭ、少なくとも約１４５０μＭ、少なくとも約１５００μＭ、少なくとも約１６００μＭ、少なくとも約１７００μＭ、少なくとも約１８００μＭ、少なくとも約１９００μＭ、少なくとも約２０００μＭ、少なくとも約２１００μＭ、少なくとも約２２００μＭ、少なくとも約２３００μＭ、少なくとも約２４００μＭ、少なくとも約２５００μＭ、少なくとも約２６００μＭ、少なくとも約２７００μＭ、少なくとも約２８００μＭ、少なくとも約２９００μＭ、又は少なくとも約３０００μＭである。一部の態様では、ペイロード供給濃度は、約６００μＭである。一部の態様では、ペイロード供給濃度は、約８００μＭである。

【0197】

[0201]一部の態様では、ペイロード供給濃度は、約５０μＭ～約１０００μＭの間、約１００μＭ～約１０００μＭの間、約２００μＭ～約１０００μＭの間、約３００μＭ～約１０００μＭの間、約４００μＭ～約１０００μＭの間、約５００μＭ～約１０００μＭの間、約５０μＭ～約９００μＭの間、約１００μＭ～約９００μＭの間、約２００μＭ～約９００μＭの間、約３００μＭ～約９００μＭの間、約４００μＭ～約９００μＭの間、約５００μＭ～約９００μＭの間、約５０μＭ～約８００μＭの間、約１００μＭ～約８００μＭの間、約２００μＭ～約８００μＭの間、約３００μＭ～約８００μＭの間、約４００μＭ～約８００μＭの間、約５００μＭ～約８００μＭの間、約５０μＭ～約７００μＭの間、約１００μＭ～約７００μＭの間、約２００μＭ～約７００μＭの間、約３００μＭ～約７００μＭの間、約４００μＭ～約７００μＭの間、又は約５００μＭ～約７００の間である。一部の態様では、ペイロード供給濃度は、約１０００μＭ～約１１００μＭの間、約１２００μＭ～約１３００μＭの間、約１３００μＭ～約１４００μＭの間、約１４００μＭ～約１５００μＭの間、約１５００μＭ～約１６００μＭの間、約１６００μＭ～約１７００μＭの間、約１７００μＭ～約１８００μＭの間、約１８００μＭ～約１９００μＭの間、約１９００μＭ～約２０００μＭの間、約２０００μＭ～約２１００μＭの間、約２１００μＭ～約２２００μＭの間、約２２００μＭ～約２３００μＭの間、約２３００μＭ～約２４００μＭの間、約２４００μＭ～約２５００μＭの間、約２５００μＭ～約２６００μＭの間、約２６００μＭ～約２７００μＭの間、約２７００μＭ～約２８００μＭの間、約２８００μＭ～約２９００μＭの間、又は約２９００μＭ～約３０００μＭの間である。

【0198】

[0202]本明細書に記載されるように、一部の態様では、ペイロード供給濃度を増加させることにより、参照ペイロード供給濃度（例えば、本明細書に記載のペイロード供給濃度より低い）と比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、ＥＶにおける（外側表面への、内腔表面への、及び／又は内腔内への）ペイロードの負荷が増加する。本開示から明らかであるように、ペイロードの負荷の増加は、ＥＶのペイロード濃度の増加をもたらす。

【0199】

[0203]一部の態様では、ペイロード供給濃度を増加させることにより、ＥＶの外側表面に関連するペイロードの量（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの数）が増加する。一部の態様では、ＥＶの外側表面に関連するペイロードの量は、参照量（例えば、ペイロードが参照ペイロード供給濃度でＥＶと混合された場合のＥＶの外側表面におけるペイロードの量）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加している。一部の態様では、ペイロード供給濃度を増加させることにより、ＥＶの内腔表面に関連するペイロードの量が増加する。一部の態様では、ＥＶの内腔表面に関連するペイロードの量は、参照量（例えば、ペイロードが参照ペイロード供給濃度でＥＶと混合された場合のＥＶの外側表面におけるペイロードの量）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加している。一部の態様では、ペイロード供給濃度を増加させることにより、ＥＶの内腔に関連するペイロードの量が増加する。一部の態様では、ＥＶの内腔に関連するペイロードの量は、参照量（例えば、ペイロードが参照ペイロード供給濃度でＥＶと混合された場合のＥＶの外側表面におけるペイロードの量）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加している。一部の態様では、ペイロード供給濃度を増加させることにより、ＥＶの外側表面、ＥＶの内腔表面、ＥＶの内腔、又はこれらの任意の組合せに関連するペイロードの量が増加する。

【0200】

ＩＩ．Ｅ．ＥＶ供給濃度
[0204]一部の態様では、本開示は、ＥＶにペイロード（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を負荷する方法であって、ＥＶ供給濃度を増加させてペイロードとＥＶとを混合するステップを含み、ＥＶ供給濃度の増加によりペイロードの負荷効率が増強される、方法を提供する。本明細書で使用される場合、用語「ＥＶ供給濃度」は、本開示の負荷方法において、ペイロードと混合されるＥＶの量を指す。

【0201】

[0205]一部の態様では、ＥＶ供給濃度は、少なくとも約１×１０^１１個の粒子／ｍＬ（ｐ／ｍＬ）、少なくとも約２×１０^１１ｐ／ｍＬ、少なくとも約３×１０^１１ｐ／ｍＬ、少なくとも約４×１０^１１ｐ／ｍＬ、少なくとも約５×１０^１１ｐ／ｍＬ、少なくとも約６×１０^１１ｐ／ｍＬ、少なくとも約７×１０^１１ｐ／ｍＬ、少なくとも約８×１０^１１ｐ／ｍＬ、少なくとも約９×１０^１１ｐ／ｍＬ、少なくとも約０．１×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約０．２×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約０．３×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約０．４×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約０．５×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約０．６×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約０．７×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約０．８×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約０．９×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約１．０×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約１．１×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約１．２×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約１．３×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約１．４×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約１．５×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約１．６×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約１．７×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約１．８×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約１．９×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約２．０×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約２．１×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約２．２×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約２．３×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約２．４×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約２．５×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約２．６×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約２．７×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約２．８×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約２．９×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約３．０×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約４×１０^１３ｐ^／ｍＬ、少なくとも約５×１０^１３ｐ^／ｍＬ、少なくとも約６×１０^１３ｐ^／ｍＬ、少なくとも約７×１０^１３ｐ／ｍＬ、少なくとも約８×１０^１３ｐ^／ｍＬ、少なくとも約９×１０^１３ｐ／ｍＬ、又は少なくとも約１×１０^１４ｐ／ｍＬである。一部の態様では、ＥＶ供給濃度は、約１．０×０^１３ｐ／ｍＬである。一部の態様では、ＥＶ供給濃度は、約１．４×１０^１３ｐ／ｍＬである。一部の態様では、ＥＶ供給濃度は、約６．０×１０^１２ｐ／ｍＬである。

【0202】

[0206]一部の態様では、ＥＶ供給濃度は、約０．２×１０^１３ｐ／ｍＬ～約２．０×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約０．４×１０^１３ｐ／ｍＬ～約２．０×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約０．６×１０^１３ｐ／ｍＬ～約２．０×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約０．８×１０^１３ｐ／ｍＬ～約２．０×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約１．０×１０^１３ｐ／ｍＬ～約２．０×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約０．２×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．８×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約０．４×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．８×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約０．６×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．８×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約０．８×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．８×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約１．０×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．８×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約０．２×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．６×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約０．４×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．６×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約０．６×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．６×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約０．８×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．６×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約１．０×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．６×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約０．２×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．４×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約０．４×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．４×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約０．６×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．４×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約０．８×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．４×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約１．０×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．４×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約０．２×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．２×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約０．４×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．２×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約０．６×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．２×１０^１３ｐ／ｍＬの間、約０．８×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．２×１０^１３ｐ／ｍＬ、又は約１．０×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１．２×１０^１３ｐ／ｍＬの間である。一部の態様では、ＥＶ供給濃度は、約２×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１×１０^１４ｐ／ｍＬの間、約３×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１×１０^１４ｐ／ｍＬの間、約４×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１×１０^１４ｐ／ｍＬの間、約５×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１×１０^１４ｐ／ｍＬの間、約６×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１×１０^１４ｐ／ｍＬの間、約７×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１×１０^１４ｐ／ｍＬの間、約８×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１×１０^１４ｐ／ｍＬの間、又は約９×１０^１３ｐ／ｍＬ～約１×１０^１４ｐ／ｍＬの間である。

【0203】

[0207]一部の態様では、ＥＶ供給濃度を増加させることにより、参照ＥＶ供給濃度（例えば、本明細書に記載の供給濃度より低い）と比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、ＥＶにおける（外側表面への、内腔表面への、及び／又は内腔内への）ペイロードの負荷が増加する。本開示から明らかであるように、ペイロードの負荷の増加は、ＥＶのペイロード濃度の増加をもたらす。

【0204】

[0208]一部の態様では、ＥＶ供給濃度を増加させることにより、ＥＶの外側表面に関連するペイロードの量（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの数）が増加する。一部の態様では、ＥＶの外側表面に関連するペイロードの量は、参照量（例えば、ペイロードが参照ＥＶ供給濃度でＥＶと混合された場合のＥＶの外側表面におけるペイロードの量）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加している。一部の態様では、ＥＶ供給濃度を増加させることにより、ＥＶの内腔表面に関連するペイロードの量が増加する。一部の態様では、ＥＶの内腔表面に関連するペイロードの量は、参照量（例えば、ペイロードが参照ＥＶ供給濃度でＥＶと混合された場合のＥＶの外側表面におけるペイロードの量）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加している。一部の態様では、ＥＶ供給濃度を増加させることにより、ＥＶの内腔に関連するペイロードの量が増加する。一部の態様では、ＥＶの内腔に関連するペイロードの量は、参照量（例えば、ペイロードが参照ＥＶ供給濃度でＥＶと混合された場合のＥＶの外側表面におけるペイロードの量）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加している。一部の態様では、ＥＶ供給濃度を増加させることにより、ＥＶの外側表面、ＥＶの内腔表面、ＥＶの内腔、又はこれらの任意の組合せに関連するペイロードの量が増加する。

【0205】

[0209]本開示から明らかなように、一部の態様では、本開示の負荷方法は、本明細書に記載のものなどの複数の（例えば、２つ以上の）負荷パラメーターをモジュレートするステップを含み得る。一部の態様では、塩濃度、負荷温度、負荷期間、ペイロード供給濃度、ＥＶ供給濃度、又はこれらの組合せを増加させる。

【0206】

[0210]例えば、一部の態様では、本明細書において提供されるＥＶにペイロードを負荷する方法は、負荷緩衝剤の塩濃度（例えば、約１５０ｍＭ以上）と負荷温度（例えば、約３７℃以上）との両方を増加させるステップを含む。一部の態様では、ペイロードとＥＶとがこのような条件下で混合される場合、負荷効率は、ペイロードとＥＶとが、（ｉ）塩濃度が低下した負荷緩衝剤中で、（ｉｉ）低下した負荷温度で、又は（ｉｉｉ）塩濃度が低下した負荷緩衝剤中で、かつ低下した負荷温度で混合された場合に観察される負荷効率と比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加している。

【0207】

[0211]一部の態様では、本明細書において提供される負荷方法は、複数の負荷パラメーターをモジュレートして、ＥＶ中のペイロードの負荷効率を増加させるステップを含み得る。例えば、一部の態様では、本明細書において提供されるＥＶにペイロードを負荷する方法は、負荷緩衝剤の塩濃度（例えば、約１５０ｍＭ以上）と負荷期間（例えば、少なくとも約２４時間）との両方を増加させるステップを含む。一部の態様では、方法は、負荷温度（例えば、約３７℃以上）と負荷期間（例えば、少なくとも約２４時間）との両方を増加させるステップを含む。一部の態様では、本明細書において提供される負荷方法は、負荷緩衝剤の塩濃度を増加させるステップ（例えば、約１５０ｍＭ以上）と、負荷温度を上昇させるステップ（例えば、約３７℃以上）と、負荷期間を増加させるステップ（例えば、少なくとも約２４時間）とを含む。一部の態様では、ペイロードとＥＶとがこのような条件下で混合される場合、負荷効率は、ペイロードとＥＶとが、（ｉ）塩濃度が低下した負荷緩衝剤中で、（ｉｉ）低下した負荷温度で、（ｉｉｉ）より短い負荷期間で、又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの組合せで混合された場合に観察される負荷効率と比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加している。

【0208】

[0212]一部の態様では、本明細書において提供される負荷方法は、負荷緩衝剤の塩濃度（例えば、約１５０ｍＭ以上）とペイロード供給濃度（例えば、約８００μＭ以上）との両方を増加させるステップを含み得る。一部の態様では、負荷方法は、負荷温度（例えば、約３７℃以上）とペイロード供給濃度（例えば、約８００μＭ以上）との両方を増加させるステップを含む。一部の態様では、本明細書において提供されるＥＶにペイロードを負荷する方法は、負荷期間（例えば、少なくとも約２４時間）とペイロード供給濃度（例えば、約８００μＭ以上）との両方を増加させるステップを含む。一部の態様では、負荷効率を増加させるために、本明細書において提供される負荷方法は、負荷緩衝剤の塩濃度（例えば、約１５０ｍＭ以上）、負荷温度（例えば、約３７℃以上）、負荷期間（例えば、少なくとも約２４時間）、及びペイロード供給濃度（例えば、約８００μＭ以上）を増加させるステップを含む。一部の態様では、ペイロードとＥＶとがこのような条件下で混合される場合、負荷効率は、ペイロードとＥＶとが、（ｉ）塩濃度が低下した負荷緩衝剤中で、（ｉｉ）低下した負荷温度で、（ｉｉｉ）より短い負荷期間で、（ｉｖ）低下したペイロード供給濃度で、又は（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかの組合せで混合された場合に観察される負荷効率と比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加している。

【0209】

[0213]一部の態様では、本明細書において提供されるＥＶにペイロードを負荷する方法は、負荷緩衝剤の塩濃度（例えば、約１５０ｍＭ以上）とＥＶ供給濃度（例えば、約１．４×１０^１３ｐ／ｍＬ以上）との両方を増加させるステップを含む。一部の態様では、負荷方法は、負荷温度（例えば、約３７℃以上）とＥＶ供給濃度（例えば、約１．４×１０^１３ｐ／ｍＬ以上）との両方を増加させるステップを含む。一部の態様では、負荷方法は、負荷期間（例えば、少なくとも約２４時間）とＥＶ供給濃度（例えば、約１．４×１０^１３ｐ／ｍＬ以上）との両方を増加させるステップを含む。一部の態様では、負荷方法は、ペイロード供給濃度（例えば、約８００μＭ以上）とＥＶ供給濃度（例えば、約１．４×１０^１３ｐ／ｍＬ以上）との両方を増加させるステップを含む。一部の態様では、本明細書に記載のＥＶ負荷方法は、負荷緩衝剤の塩濃度（例えば、約１５０ｍＭ以上）、負荷温度（例えば、約３７℃以上）、負荷期間（例えば、少なくとも約２４時間）、ペイロード供給濃度（例えば、約８００μＭ以上）、及びＥＶ供給濃度（例えば、約１．４×１０^１３ｐ／ｍＬ以上）を増加させるステップを含む。一部の態様では、ペイロードとＥＶとがこのような条件下で混合される場合、負荷効率は、ペイロードとＥＶとが、（ｉ）塩濃度が低下した負荷緩衝剤中で、（ｉｉ）低下した負荷温度で、（ｉｉｉ）より短い負荷期間で、（ｉｖ）低下したペイロード供給濃度で、（ｖ）低下したＥＶ供給濃度で、又は（ｖｉ）（ｉ）～（ｖ）のいずれかの組合せで混合された場合に観察される負荷効率と比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加している。

【0210】

[0214]本明細書において実証されるように、ＥＶの負荷効率を増加させるために、上記で提供される負荷パラメーター（塩濃度、負荷温度、負荷期間、ペイロード供給濃度、及びＥＶ供給濃度）のすべてを調整する（例えば、増加させる）必要はない。一部の態様では、本明細書に記載の負荷パラメーターのうちの１つ又は複数を増加させることにより、負荷効率に悪影響を及ぼすことなく、他の負荷パラメーターを一定に保つか又は低下させることができる。例えば、一部の態様では、塩濃度、負荷温度、ペイロード供給濃度、及び／又はＥＶ供給濃度は、負荷時間が本明細書において提供される値未満である間に増加させることができる（例えば、本明細書に記載される範囲まで）（例えば、セクションＩＩ．Ｃを参照されたい）。したがって、本明細書に記載の１つ又は複数の負荷パラメーター（例えば、塩濃度、負荷温度、ペイロード供給濃度、及び／又はＥＶ供給濃度）が増加した場合、負荷期間は約１時間未満であり得る。ある特定の態様では、負荷期間は、約３０秒、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、又は約１時間であり得る。同様に、負荷期間を増加させることにより、負荷効率に悪影響を及ぼすことなく、他の負荷パラメーター（例えば、塩濃度、負荷温度、ペイロード供給濃度、及び／又はＥＶ供給濃度）を一定に保つか又は低下させることができる。

【0211】

[0215]一部の態様では、ＥＶにペイロード（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を負荷する方法であって、（ｉ）少なくとも約１ｍＭの塩濃度を有する負荷緩衝剤中で、（ｉｉ）約４℃より高い負荷温度で、及び（ｉｉｉ）少なくとも約１時間の負荷期間で、ペイロードをＥＶと混合するステップを含む、方法が本明細書において提供される。一部の態様では、（ｉ）負荷緩衝剤の塩濃度は、約２００ｍＭ未満であり、（ｉｉ）負荷温度は、約５℃～約４０℃の間であり、（ｉｉｉ）負荷期間は、約１時間～約４８時間の間である。ある特定の態様では、（ｉ）塩濃度は、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭの間であり、（ｉｉ）負荷温度は、約１５℃～約４０℃の間であり、（ｉｉｉ）負荷期間は、約１２時間～約３６時間の間である。ある特定の態様では、（ｉ）塩濃度は、約１００ｍＭであり、（ｉｉ）負荷温度は、約３７℃であり、（ｉｉｉ）負荷期間は、約２４時間である。一部の態様では、（ｉ）塩濃度は、約１ｍＭ～約５００ｍＭの間であり、（ｉｉ）負荷温度は、約０℃～約８０℃の間であり、（ｉｉｉ）負荷期間は、約５分～約１０日間の間である。一部の態様では、（ｉ）塩濃度は、約１５０ｍＭ～約４５０ｍＭの間であり、（ｉｉ）負荷温度は、約３７℃～約７０℃の間であり、（ｉｉｉ）負荷期間は、約２４時間～約７日間の間である。

【0212】

[0216]一部の態様では、上記例示的な方法は、ペイロード供給濃度、ＥＶ供給濃度、又はその両方を増加させるステップをさらに含む。したがって、ある特定の態様では、（ｉ）負荷緩衝剤の塩濃度は、約２００ｍＭ未満であり、（ｉｉ）負荷温度は、約５℃～約４０℃の間であり、（ｉｉｉ）負荷期間は、約１時間～約４８時間の間であり、（ｉｖ）ペイロード供給濃度は、約５０μＭ～約１０００μＭの間であり、（ｖ）ＥＶ供給濃度は、約０．２×１０^１３ｐ／ｍＬ～約２．０×１０^１３ｐ／ｍＬの間である。ある特定の態様では、（ｉ）塩濃度は、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭの間であり、（ｉｉ）負荷温度は、約１５℃～約４０℃の間であり、（ｉｉｉ）負荷期間は、約１２時間～約３６時間の間であり、（ｉｖ）ペイロード供給濃度は、約１００μＭ～約１０００μＭの間であり、（ｖ）ＥＶ供給濃度は、約０．５×１０^１３ｐ／ｍＬ～約２．０×１０^１３ｐ／ｍＬの間である。一部の態様では、（ｉ）塩濃度は、約１００ｍＭであり、（ｉｉ）負荷温度は、約３７℃であり、（ｉｉｉ）負荷期間は、約２４時間であり、（ｉｖ）ペイロード供給濃度は、約６００μＭであり、（ｖ）ＥＶ供給濃度は、約１．０×１０^１３ｐ／ｍＬである。一部の態様では、（ｉ）塩濃度は、約１ｍＭ～約５００ｍＭの間であり、（ｉｉ）負荷温度は、約０℃～約８０℃の間であり、（ｉｉｉ）負荷期間は、約５分間～約１０日間の間であり、（ｉｖ）ペイロード供給濃度は、約１０μＭ～約２５００μＭの間であり、（ｖ）ＥＶ供給濃度は、約１×１０^１１ｐ／ｍＬ～約１×１０^１４ｐ／ｍＬの間である。一部の態様では、（ｉ）塩濃度は、約１５０ｍＭ～約４５０ｍＭの間であり、（ｉｉ）負荷温度は、約３７℃～約７０℃の間であり、（ｉｉｉ）負荷期間は、約２４時間～約７日間の間であり、（ｉｖ）ペイロード供給濃度は、約６×１０^１２ｐ／ｍＬ～約１．４×１０^１３ｐ／ｍＬの間である。

【0213】

[0217]一部の態様では、上記記載の塩濃度、負荷温度、負荷期間、ペイロード供給濃度、及び／又はＥＶ供給濃度を使用して、ＥＶにペイロード（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を負荷することにより、低下した塩濃度（例えば、塩を含まない緩衝剤）、低下した負荷温度（例えば、約４℃以下）、より短い負荷期間（例えば、約１時間以下）、低下したペイロード供給濃度（例えば、約５０μＭ未満）、及び／又は低下したＥＶ供給濃度（例えば、約０．５×１０^１３ｐ／ｍＬ未満）によりペイロードを付加することと比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、ＥＶにおける（例えば、外側表面への、内腔表面への、及び／又は内腔内への）ペイロードの負荷が増加する。

【0214】

[0218]一部の態様では、上記記載の塩濃度、負荷温度、負荷期間、ペイロード供給濃度、及び／又はＥＶ供給濃度を使用することにより、参照量（例えば、ペイロードが、低下した塩濃度（例えば、塩を含まない緩衝剤）、低下した負荷温度（例えば、約４℃以下）、より短い負荷期間（例えば、約１時間以下）、低下したペイロード供給濃度（例えば、約５０μＭ未満）、及び／又は低下したＥＶ供給濃度（例えば、約０．５×１０^１３ｐ／ｍＬ未満）を使用して負荷された場合のＥＶの外側表面におけるペイロードの量）と比較して、例えば少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、ＥＶの外側表面に関連するペイロードの量（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの数）が増加する。一部の態様では、上記記載の塩濃度、負荷温度、負荷期間、ペイロード供給濃度、及び／又はＥＶ供給濃度を使用することにより、参照量（例えば、ペイロードが、低下した塩濃度（例えば、塩を含まない緩衝剤）、低下した負荷温度（例えば、約４℃以下）、より短い負荷期間（例えば、約１時間以下）、低下したペイロード供給濃度（例えば、約５０μＭ未満）、及び／又は低下したＥＶ供給濃度（例えば、約０．５×１０^１３ｐ／ｍＬ未満）を使用して負荷された場合の、ＥＶの内腔表面におけるペイロードの量）と比較して、例えば、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、ＥＶの内腔表面に関連するペイロードの量（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの数）が増加する。一部の態様では、上記記載の塩濃度、負荷温度、負荷期間、ペイロード供給濃度、及び／又はＥＶ供給濃度を使用することにより、参照量（例えば、ペイロードが、低下した塩濃度（例えば、塩を含まない緩衝剤）、低下した負荷温度（例えば、約４℃以下）、より短い負荷期間（例えば、約１時間以下）、低下したペイロード供給濃度（例えば、約５０μＭ未満）、及び／又は低下したＥＶ供給濃度（例えば、約０．５×１０^１３ｐ／ｍＬ未満）を使用して負荷された場合の、ＥＶの内腔内のペイロードの量）と比較して、例えば、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、ＥＶの内腔に関連するペイロードの量（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの数）が増加する。

【0215】

ＩＩ．Ｆ．他の負荷パラメーター
ＩＩ．Ｆ．１．スクロース濃度
[0219]一部の態様では、本明細書に記載の負荷方法は、負荷プロセス中に、１つ又は複数のさらなるパラメーターをモジュレートするステップをさらに含み得る。例えば、一部の態様では、本開示にとって有用な負荷緩衝剤（例えば、本明細書に記載された濃度の範囲内の塩を含む）は、１つ又は複数の構成成分をさらに含む。このような１つ又は複数の構成成分の非限定的な例としては、スクロース、ヒスチジン、アルギニン、メチオニン、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。

【0216】

[0220]一部の態様では、本開示に関して使用され得る負荷緩衝剤は、スクロースをさらに含む。ある特定の態様では、負荷緩衝剤中のスクロースの濃度は、少なくとも約１％ｗ／ｖ、少なくとも約２％ｗ／ｖ、少なくとも約３％ｗ／ｖ、少なくとも約４％ｗ／ｖ、少なくとも約５％ｗ／ｖ、少なくとも約６％ｗ／ｖ、少なくとも約７％ｗ／ｖ、少なくとも約８％ｗ／ｖ、少なくとも約９％ｗ／ｖ、又は少なくとも約１０％ｗ／ｖである。一部の態様では、スクロースの濃度は、約１０％ｗ／ｖ、約９％ｗ／ｖ、約８％ｗ／ｖ、約７％ｗ／ｖ、約６％ｗ／ｖ、約５％ｗ／ｖ、約４％ｗ／ｖ、約３％ｗ／ｖ、約２％ｗ／ｖ、又は約１％ｗ／ｖである。

【0217】

[0221]一部の態様では、負荷緩衝剤中のスクロースの濃度は、約１％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖの間、約２％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖの間、約３％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖの間、約４％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖの間、約５％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖの間、約１％ｗ／ｖ～約９％ｗ／ｖの間、約２％ｗ／ｖ～約９％ｗ／ｖの間、約３％ｗ／ｖ～約９％ｗ／ｖの間、約４％ｗ／ｖ～約９％ｗ／ｖの間、約５％ｗ／ｖ～約９％ｗ／ｖの間、約１％ｗ／ｖ～約８％ｗ／ｖの間、約２％ｗ／ｖ～約８％ｗ／ｖの間、約３％ｗ／ｖ～約８％ｗ／ｖの間、約４％ｗ／ｖ～約８％ｗ／ｖの間、約５％ｗ／ｖ～約８％ｗ／ｖの間、約１％ｗ／ｖ～約７％ｗ／ｖの間、約２％ｗ／ｖ～約７％ｗ／ｖの間、約３％ｗ／ｖ～約７％ｗ／ｖの間、約４％ｗ／ｖ～約７％ｗ／ｖの間、約５％ｗ／ｖ～約７％ｗ／ｖの間、約１％ｗ／ｖ～約６％ｗ／ｖの間、約２％ｗ／ｖ～約６％ｗ／ｖの間、約３％ｗ／ｖ～約６％ｗ／ｖの間、約４％ｗ／ｖ～約６％ｗ／ｖの間、又は約５％ｗ／ｖ～約６％ｗ／ｖの間である。ある特定の態様では、負荷緩衝剤のスクロース濃度は、約５％ｗ／ｖである。

【0218】

ＩＩ．Ｆ．２．モル浸透圧濃度
[0222]一部の態様では、本明細書に記載の負荷方法は、本明細書に記載されているペイロードとＥＶとを混合するために使用される負荷緩衝剤のモル浸透圧濃度をモジュレートするステップを含む。ある特定の態様では、負荷緩衝剤のモル浸透圧濃度は、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約６００ｍＯｓｍ／ｋｇの間（例えば、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約５００ｍＯｓｍ／ｋｇの間）である。ある特定の態様では、負荷緩衝剤のモル浸透圧濃度は、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ～約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ～約４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、又は約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの間である。

【0219】

[0223]一部の態様では、負荷緩衝剤のモル浸透圧濃度は、約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３７０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３９０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３９５ｍＯｓｍ／ｋｇ、又は約４００ｍＯｓｍ／ｋｇである。一部の態様では、負荷緩衝剤のモル浸透圧濃度は、約３９５ｍＯｓｍ／ｋｇである。

【0220】

ＩＩ．Ｆ．３．ｐＨ
[0224]一部の態様では、本開示に関して使用することができる（例えば、ペイロードをＥＶと混合するために）負荷緩衝剤は、約６～約８の間のｐＨを有する。ある特定の態様では、負荷緩衝剤のｐＨは、約６～約７の間又は約７～約８の間である。一部の態様では、ｐＨは、約６、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、又は約８である。ある特定の態様では、負荷緩衝剤のｐＨは、約７．２である。一部の態様では、本開示にとって有用な負荷緩衝剤は、約９のｐＨを有する。

【0221】

ＩＩ．Ｇ．ペイロード
[0225]当業者にとって明らかであるように、本明細書において提供される負荷方法は、ＥＶに当技術分野で公知の任意の好適なペイロードを負荷するために使用することができる。本明細書に記載の方法を使用して、ＥＶに負荷することができるペイロードの非限定的な例としては、ペプチド、小分子、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｃＲＮＡ、アンタゴミル、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ペプチド核酸、細胞透過性ペプチド、アジュバント、タンパク質、炭水化物、糖、アミノ酸、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。一部の態様では、ペイロードは、核酸を含む。一部の態様では、ペイロードは、ペプチドを含む。一部の態様では、ペイロードは、小分子を含む。ある特定の態様では、ペイロードは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（本明細書において、「アンチセンスＡＳＯ」及び「オリゴマー」とも称される）を含む。一部の態様では、ペイロードは、ｍＲＮＡを含む。一部の態様では、ペイロードは、ｍｉＲＮＡを含む。一部の態様では、ペイロードは、ｌｃＲＮＡを含む。一部の態様では、ペイロードは、アンタゴミルを含む。一部の態様では、ペイロードは、ｔＲＮＡを含む。一部の態様では、ペイロードは、ｓｉＲＮＡを含む。一部の態様では、ペイロードは、ペプチド核酸を含む。一部の態様では、ペイロードは、細胞透過性ペプチドを含む。一部の態様では、ペイロードは、アジュバントを含む。一部の態様では、ペイロードは、タンパク質を含む。一部の態様では、ペイロードは、炭水化物を含む。一部の態様では、ペイロードは、糖を含む。一部の態様では、ペイロードは、アミノ酸を含む。ある特定の態様では、ペイロードは、ペイロードの溶解度を増加させるように設計されたドメイン（例えば、荷電置換基）を含む。このようなドメインの非限定的な例としては、細胞透過性ペプチド、ポリアニオン（例えば、ポリグルタミン酸）、ポリカチオン（例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン）、及びこれらの組合せが挙げられる。したがって、本明細書に記載の負荷方法を使用して、ＥＶの外側表面に関連するＡＳＯの数を増加させることができる。

【0222】

[0226]一部の態様では、本開示にとって有用なペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、約１０～約３０、例えば、１０～２０、１４～２０、１６～２０、又は１５～２５ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。ある特定の態様では、ペイロードは、２０ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、１８ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、１９ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、１７ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、１６ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、１５ヌクレオチド長である。一部の態様では、ペイロードは、１４ヌクレオチド長である。一部の態様では、ペイロードは、１３ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、１２ヌクレオチド長である。一部の態様では、ペイロードは、１１ヌクレオチド長である。さらなる態様では、ペイロードは、１０ヌクレオチド長である。

【0223】

[0227]一部の態様では、ペイロードは、約１０～約５０ヌクレオチド長、例えば、約１０～約４５、約１０～約４０、約１０若しくは約３５、又は約１０～約３０の連続ヌクレオチド配列を含む。ある特定の態様では、ペイロードは、２１ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、２２ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、２３ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、２４ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、２５ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、２６ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、２７ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、２８ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、２９ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、３０ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、３１ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、３２ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、３３ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、３４ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、３５ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、３６ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、３７ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、３８ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、３９ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、４０ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、４１ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、４２ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、４３ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、４４ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、４５ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、４６ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、４７ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、４８ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、４９ヌクレオチド長である。ある特定の態様では、ペイロードは、５０ヌクレオチド長である。

【0224】

[0228]様々な態様では、本開示のペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、ＲＮＡ（ユニット）を含まない。一部の態様では、ペイロードは、１つ又は複数のＤＮＡユニットを含む。ある特定の態様では、本開示にとって有用なペイロードは、直鎖状分子であるか又は直鎖状分子として合成される。一部の態様では、ペイロードは、一本鎖分子であり、例えば、同じペイロード内の同等の領域（すなわち、二重鎖）と相補的な、少なくとも３、４又は５個の連続ヌクレオチドの短い領域は含まない－この点で、ペイロードは（本質的に）二本鎖ではない。一部の態様では、ペイロードは、本質的に二本鎖ではない。一部の態様では、ペイロードは、ｓｉＲＮＡではない。様々な態様では、本明細書に記載の負荷方法に関して使用することができるペイロードは、完全に連続ヌクレオチド領域からなる。よって、一部の態様では、ペイロードは、実質的に自己相補的ではない。

【0225】

[0229]一部の態様では、本開示は、ペイロード（例えば、ＡＳＯ）の断片を含む。例えば、本開示は、本明細書で開示されているペイロード（例えば、ＡＳＯ）の少なくとも１つのヌクレオチド、少なくとも２つの連続ヌクレオチド、少なくとも３つの連続ヌクレオチド、少なくとも４つの連続ヌクレオチド、少なくとも５つの連続ヌクレオチド、少なくとも６つの連続ヌクレオチド、少なくとも７つの連続ヌクレオチド、少なくとも８つの連続ヌクレオチド、又は少なくとも９つの連続ヌクレオチドを含む。本明細書で開示されている配列のいずれかの断片は、本開示の一部として企図される。

【0226】

[0230]一部の態様では、本開示にとって有用なペイロードは、１つ又は複数のヌクレオシドアナログを含む。ある特定の態様では、ヌクレオシドアナログのうちの１つ又は複数は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）；２’－アルコキシ－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）；２’－アミノ－ＤＮＡ；２’－フルオロ－ＲＮＡ；２’－フルオロ－ＤＮＡ；アラビノ核酸（ＡＮＡ）；２’－フルオロ－ＡＮＡ；二環式ヌクレオシドアナログ（ＬＮＡ）、又はこれらの任意の組合せを含む。ある特定の態様では、ヌクレオシドアナログのうちの１つ又は複数は、糖修飾ヌクレオシドである。さらなる態様では、糖修飾ヌクレオシドは、親和性を増強する２’糖修飾ヌクレオシドである。一部の態様では、ヌクレオシドアナログのうちの１つ又は複数は、二環式の糖を含むヌクレオシドを含む。ある特定の態様では、ヌクレオシドアナログのうちの１つ又は複数は、ＬＮＡを含む。さらなる態様では、ヌクレオシドアナログのうちの１つ又は複数は、拘束エチルヌクレオシド（ｃＥｔ）、２’，４’－拘束２’－Ｏ－メトキシエチル（ｃＭＯＥ）、α－Ｌ－ＬＮＡ、β－Ｄ－ＬＮＡ、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、アミノ－ＬＮＡ、オキシ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡ、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0227】

[0231]一部の態様では、本明細書において提供される負荷方法を使用して、ＥＶに負荷することができるペイロードは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチドがコンジュゲートしたホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）、又はその両方を含む。

【0228】

ＩＩ．Ｇ．１．標的
[0232]当業者にとって明らかであるように、目的の任意の特定の分子（例えば、遺伝子）を標的とするペイロードは、本開示に関して使用することができる。例えば、一部の態様では、本明細書において提供される負荷方法は、任意の分子（例えば、遺伝子）に関して使用することができ、ここで、分子に特異的に結合するペイロード（例えば、ＡＳＯ）を生成することができる。したがって、一部の態様では、本開示にとって有用なペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、細胞内の目的の任意の遺伝子又はタンパク質の発現を下方調節する（例えば、低下させるか又は阻害する）ことが可能である。このような標的の非限定的な例は、以下にさらに記載される。

【0229】

ＩＩ．Ｇ．１．ａ．ＳＴＡＴ６
[0233]一部の態様では、本明細書において提供されるペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、細胞内の目的の任意の遺伝子又はタンパク質の発現を下方調節する（例えば、低下させるか又は阻害する）ことが可能である。ある特定の態様では、本明細書に記載の（例えば、本開示の負荷方法を使用して、ＥＶに負荷することができる）ペイロードは、ＳＴＡＴ６ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの１つ又は複数の領域（例えば、イントロン領域、エクソン領域、及び／又はエクソン－イントロン接合領域）を標的とする。一部の態様では、ペイロードは、ＳＴＡＴ６タンパク質のすべてのアイソフォームを標的とすることが可能である。ある特定の態様では、ペイロードは、特定のＳＴＡＴ６アイソフォーム（例えば、アイソフォーム１とアイソフォーム２、アイソフォーム１とアイソフォーム３、又はアイソフォーム２とアイソフォーム３）を標的とする。別段に示されていない限り、用語「ＳＴＡＴ６」は、本明細書で使用される場合、１つ又は複数の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）に由来するＳＴＡＴ６を指し得る。

【0230】

[0234]ＳＴＡＴ６（ＳＴＡＴ６）は、シグナル伝達兼転写活性化因子６としても公知である。ＳＴＡＴ６／ＳＴＡＴ６のシノニムが公知であり、ＩＬ－４ ＳＴＡＴ；ＳＴＡＴ、インターロイキン４誘導型；転写因子ＩＬ－４ ＳＴＡＴ；ＳＴＡＴ６Ｂ；ＳＴＡＴ６Ｃ；及びＤ１２Ｓ１６４４が挙げられる。ヒトＳＴＡＴ６遺伝子の配列は、公的に入手可能なＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００１２．１２：ｃ５７１１１４１３－５７０９５４０４に見い出すことができる。ヒトＳＴＡＴ６遺伝子は、染色体位置１２ｑ１３．３の５７１１１４１３～５７０９５４０４、相補配列に見られる。

【0231】

[0235]ヒトＳＴＡＴ６ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ転写物の配列（配列番号２）は、染色体１２ｑ１３．３の残基５７１１１４１３～５７０９５４０４の逆相補配列、相補配列に対応する。ＳＴＡＴ６ ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１７８０７８．１）は、配列番号４のヌクレオチド「ｔ」がｍＲＮＡ中の「ｕ」として示されていることを除いて、配列番号４に与えられている。ヒトＳＴＡＴ６タンパク質の配列は、公的に入手可能な受託番号Ｐ４２２２６－１（カノニカル配列、配列番号３）、Ｐ４２２２６－２（配列番号５）、及びＰ４２２２６－３（配列番号５）に見い出すことができ、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0232】

[0236]ヒトＳＴＡＴ６遺伝子産物の天然バリアントは公知である。例えば、ヒトＳＴＡＴ６タンパク質の天然バリアントは、Ｍ１１８Ｒ、Ｄ４１９Ｎ、及びこれらの任意の組合せから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を含有し得る。選択的スプライシングから生じるヒトＳＴＡＴ６タンパク質のさらなるバリアントも当技術分野で公知である。ＳＴＡＴ６アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔにおける識別子：Ｐ４２２２６－２）は、カノニカル配列（配列番号４）と以下のように異なる：配列番号４に対して、残基１～１７４の欠失及び_１７５ＰＳＥ_１７７の_１７５ＭＥＱ_１７７への置換。ＳＴＡＴ６アイソフォーム３（識別子：Ｐ４２２２６－３）の配列は、カノニカル配列（配列番号４）と以下のように異なる：配列番号４に対して、残基１～１１０の欠失。したがって、本明細書に記載のペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、ＳＴＡＴ６タンパク質の天然バリアントの発現を低下させるか又は阻害するように設計され得る。

【0233】

[0237]ペイロード（例えば、ＡＳＯ）の標的核酸配列の一例は、ＳＴＡＴ６ ｐｒｅ－ｍＲＮＡである。配列番号２は、ヒトＳＴＡＴ６ゲノム配列（すなわち、染色体１２ｑ１３．３のヌクレオチド５７１１１４１３～５７０９５４０４の逆相補配列、相補配列）を表す。配列番号２は、配列番号２のヌクレオチド「ｔ」がｐｒｅ－ｍＲＮＡの「ｕ」として示されていることを除いて、ＳＴＡＴ６ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列と同一である。ある特定の態様では、「標的核酸」は、ＳＴＡＴ６タンパク質をコードする核酸のイントロン又はその天然に存在するバリアント、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。一部の態様では、標的核酸は、ＳＴＡＴ６タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン領域、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。また一部の態様では、標的核酸は、ＳＴＡＴ６タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン－イントロン接合部、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。一部の態様では、例えば、研究又は診断において使用される場合、「標的核酸」は、上記ＤＮＡ又はＲＮＡ核酸標的に由来するｃＤＮＡ又は合成オリゴヌクレオチドであり得る。ＳＴＡＴ６ ｐｒｅ－ｍＲＮＡによってコードされるヒトＳＴＡＴ６タンパク質配列は、配列番号３として示されている。一部の態様では、標的核酸は、ＳＴＡＴ６タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントの非翻訳領域、例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はその両方を含む。

【0234】

[0238]一部の態様では、本開示のペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、ＳＴＡＴ６転写物のイントロン内の領域、例えば、配列番号１１にハイブリダイズする。ある特定の態様では、ペイロードは、ＳＴＡＴ６転写物のエクソン内の領域、例えば配列番号１１にハイブリダイズする。一部の態様では、ペイロードは、ＳＴＡＴ６転写物のエクソン－イントロン接合部内の領域、例えば、配列番号１１にハイブリダイズする。一部の態様では、ペイロードは、ＳＴＡＴ６転写物内の領域（例えば、イントロン、エクソン、又はエクソン－イントロン接合部）、例えば、配列番号１１にハイブリダイズする。

【0235】

[0239]一部の態様では、本明細書で開示されているＳＴＡＴ６転写物を標的とするペイロードの、ＳＴＡＴ６をコードするｍＲＮＡ転写物への結合は、ＳＴＡＴ６の発現レベル及び／又は活性レベルを低下させ得る。

【0236】

[0240]一部の態様では、ペイロードは、ＳＴＡＴ６転写物を特異的に標的とし得るＡＳＯを含む。一部の態様では、ＡＳＯのヌクレオチド配列、又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号４１～５０（すなわち、図３Ａの配列）のいずれか１つに記載されている配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性、例えば約１００％の配列同一性を有する。

【0237】

[0241]一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号４１～５０からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＳＴＡＴ６転写物と比較した場合に、１、２、３、又は４個のミスマッチを任意選択的に含み得る。

【0238】

[0242]一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号４１に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号４２に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号４３に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号４４に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号４５に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号４６に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号４７に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号４８に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号４９に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号５０に記載されている配列を含む。

【0239】

[0243]一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号４１～５０に記載されている配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一の配列を含むか又はそれからなる。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は配列番号４１～５０からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含む。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号４１～５０からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＳＴＡＴ６転写物と比較した場合に、１、２、３、又は４個のミスマッチを任意選択的に含み得る。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換を除いて、配列番号４１～５０からなる群から選択される配列のうちの１つから選択されるか、又はそれを含み、置換されたＡＳＯは、ＳＴＡＴ６転写物に結合し得る。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号４１～５０からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＳＴＡＴ６転写物に対して相補的な１、２、３、又は４個のさらなる５’及び／又は３’ヌクレオチドを任意選択的に含み得る。

【0240】

ＩＩ．Ｇ．１．ｂ ＫＲＡＳ
[0244]一部の態様では、本明細書において提供されるペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、例えば、細胞内のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ又はＫＲＡＳタンパク質の発現を下方調節する（例えば、低下させるか又は阻害する）ことが可能である。ある特定の態様では、本明細書に記載の（例えば、本開示の負荷方法を使用して、ＥＶに負荷することができる）ペイロードは、ＫＲＡＳ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの１つ又は複数の領域（例えば、イントロン領域、エクソン領域、及び／又はエクソン－イントロン接合領域）を標的とする。一部の態様では、ペイロードは、ＫＲＡＳタンパク質のすべてのアイソフォームを標的とすることが可能である。ある特定の態様では、ペイロードは、特異的なＫＲＡＳアイソフォームを標的とする。別段に示されていない限り、用語「ＫＲＡＳ」は、本明細書で使用される場合、１つ又は複数の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）に由来するＫＲＡＳを指し得る。

【0241】

[0245]ＫＲＡＳは、様々な名称で当技術分野で公知である。このような名称には、ＫＲＡＳ Ｐｒｏｔｏ－Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、ＧＴＰａｓｅ；Ｖ－Ｋｉ－Ｒａｓ２ Ｋｉｒｓｔｅｎ Ｒａｔ Ｓａｒｃｏｍａ ２ Ｖｉｒａｌ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｈｏｍｏｌｏｇ；ＧＴＰａｓｅ ＫＲａｓ；Ｃ－Ｋｉ－Ｒａｓ；Ｋ－Ｒａｓ ２；ＫＲＡＳ２；ＲＡＳＫ２；Ｖ－Ｋｉ－Ｒａｓ２ Ｋｉｒｓｔｅｎ Ｒａｔ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒａｌ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｈｏｍｏｌｏｇ；Ｋｉｒｓｔｅｎ Ｒａｔ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒａｌ Ｐｒｏｔｏ－Ｏｎｃｏｇｅｎｅ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｐｒｏｔｏ－Ｏｎｃｏｇｅｎｅ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃ－Ｋｉ－Ｒａｓ２ Ｐｒｏｔｏ－Ｏｎｃｏｇｅｎｅ；Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ２１；ＰＲ３１０ Ｃ－Ｋ－Ｒａｓ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ；Ｃ－Ｋｉｒｓｔｅｎ－Ｒａｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｋ－Ｒａｓ Ｐ２１ Ｐｒｏｔｅｉｎ；及びＯｎｃｏｇｅｎｅ ＫＲＡＳ２が挙げられる。

【0242】

[0246]ヒトＫＲＡＳ遺伝子の配列は、染色体位置１２ｐ１２．１及び公的に入手可能なＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００１２（２５，２０４，７８９～２５，２５０，９３６）に見い出すことができる。ヒト野生型ＫＲＡＳ転写物のゲノム配列は、ＮＣ＿００００１２の残基２５，２０４，７８９～２５，２５０，９３６の逆相補配列（配列番号１１）に対応する。配列番号７で与えられるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄゲノム配列は、ヌクレオチド位置５，５８７においてグアニンからアデニンへの置換を有する点で配列番号１１とは異なる。例示的なＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ配列は、配列番号３３のヌクレオチド「ｔ」がｍＲＮＡ中の「ｕ」として示されていることを除いて、配列番号９に与えられている。配列番号９で与えられるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡは、ヌクレオチド位置２２５においてグアニンからアデニンへの置換を有する点で野生型ｍＲＮＡ配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４９８５．５；配列番号１３）とは異なる。ヒトＫＲＡＳタンパク質の配列は、公的に入手可能な受託番号：Ｐ０１１１６（カノニカル配列）、Ａ８Ｋ８Ｚ５、Ｂ０ＬＰＦ９、Ｐ０１１１８、及びＱ９６Ｄ１０に見い出すことができ、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0243】

[0247]ヒトＫＲＡＳタンパク質（Ｐ０１１１６）には選択的スプライシングから得られる２つのアイソフォームが存在する。アイソフォーム２Ａ（受託番号：Ｐ０１１１６－１；配列番号１４）は、カノニカル配列である。これは、Ｋ－Ｒａｓ４Ａとしても公知である。アイソフォーム２Ｂ（受託番号：Ｐ０１１１６－２；Ｋ－Ｒａｓ４Ｂとしても公知；配列番号１２）は、以下のように、カノニカル配列とは異なる：（ｉ）１５１～１５３：ＲＶＥ→ＧＶＤ；及び（ｉｉ）１６５～１８９：ＱＹＲＬＫＫＩＳＫＥＥＫＴＰＧＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ（配列番号１５）→ＫＨＫＥＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ（配列番号１６）。一部の態様では、本明細書で開示されているペイロードは、ＫＲＡＳタンパク質のアイソフォーム２Ａ、アイソフォーム２Ｂ、又はその両方の発現を低下させるか又は阻害し得る。

【0244】

[0248]ヒトＫＲＡＳ遺伝子産物の天然バリアントは公知である。例えば、ヒトＫＲＡＳタンパク質の天然バリアントは、Ｋ５Ｅ、Ｋ５Ｎ、Ｇ１０ＧＧ、Ｇ１０Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｉ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｅ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｖ、Ｖ１４Ｉ、Ｌ１９Ｆ、Ｔ２０Ｍ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ２２Ｈ、Ｑ２２Ｋ、Ｑ２２Ｒ、Ｑ２５Ｈ、Ｎ２６Ｙ、Ｆ２８Ｌ、Ｅ３１Ｋ、Ｄ３３Ｅ、Ｐ３４Ｌ、Ｐ３４Ｑ、Ｐ３４Ｒ、Ｉ３６Ｍ、Ｒ４１Ｋ、Ｄ５７Ｎ、Ｔ５８Ｉ、Ａ５９Ｔ、Ｇ６０Ｄ、Ｇ６０Ｒ、Ｇ６０Ｓ、Ｇ６０Ｖ、Ｑ６１Ａ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｒ、Ｅ６３Ｋ、Ｓ６５Ｎ、Ｒ６８Ｓ、Ｙ７１Ｈ、Ｔ７４Ａ、Ｌ７９Ｉ、Ｒ９７Ｉ、Ｑ９９Ｅ、Ｍ１１１Ｌ、Ｋ１１７Ｎ、Ｋ１１７Ｒ、Ｄ１１９Ｇ、Ｓ１２２Ｆ、Ｔ１４４Ｐ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ、Ｋ１４７Ｅ、Ｋ１４７Ｔ、Ｒ１４９Ｋ、Ｌ１５９Ｓ、Ｉ１６３Ｓ、Ｒ１６４Ｑ、Ｉ１８３Ｎ、Ｉ８４Ｍ、又はこれらの組合せから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を含有し得る。ＫＲＡＳタンパク質アイソフォーム２Ｂに対して特異的である天然バリアントは、Ｖ１５２Ｇ、Ｄ１５３Ｖ、Ｆ１５６Ｉ、Ｆ１５６Ｌ、又はこれらの組合せから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を含有する。本開示のペイロードは、ＫＲＡＳタンパク質のバリアント（例えば、当技術分野で公知の任意のバリアント）のうちの１つ又は複数の発現を低下させるか又は阻害するように設計され得る。一部の態様では、ＫＲＡＳ変異体は、Ｇ１２Ｄのアミノ酸置換を有する。一部の態様では、本開示のペイロードは、１つ又は複数のＫＲＡＳ変異体を標的とする。ある特定の態様では、ペイロードが標的とするＫＲＡＳ変異体は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ（配列番号８）である。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ及びＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質の例示的な配列は、それぞれ、配列番号９及び配列番号８に与えられる。

【0245】

[0249]一部の態様では、本明細書で開示されているペイロード（例えば、ＡＳＯ）の標的核酸配列は、ＫＲＡＳ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの１つ又は複数の領域を含む。例えば、配列番号７（上記）は、配列番号７のヌクレオチド「ｔ」がｐｒｅ－ｍＲＮＡの「ｕ」として示されていることを除いて、ＫＲＡＳ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列と同一である。本明細書で使用される場合、用語「標的核酸配列」は、本明細書で開示されているペイロードに対して相補的である核酸配列を指す。ある特定の態様では、標的核酸配列は、ＫＲＡＳタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン領域、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。一部の態様では、標的核酸配列は、ＫＲＡＳタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのイントロン、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。さらなる態様では、標的核酸配列は、ＫＲＡＳタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン－イントロン接合部、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。一部の態様では、例えば、研究又は診断において使用される場合、標的核酸は、本明細書に記載のＤＮＡ又はＲＮＡ核酸標的に由来するｃＤＮＡ又は合成オリゴヌクレオチドであり得る。一部の態様では、標的核酸は、ＫＲＡＳタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントの非翻訳領域、例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はその両方を含む。

【0246】

[0250]したがって、一部の態様では、本明細書で開示されているペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、ＫＲＡＳ転写物のエクソン領域、例えば、配列番号７又は配列番号９にハイブリダイズする。一部の態様では、本開示のペイロードは、ＫＲＡＳ転写物のイントロン領域、例えば配列番号７にハイブリダイズする。一部の態様では、ペイロードは、ＫＲＡＳ転写物のエクソン－イントロン接合部、例えば、配列番号７にハイブリダイズする。一部の態様では、本開示のペイロードは、ＫＲＡＳ転写物（例えば、イントロン、エクソン、又はエクソン－イントロン接合部）内の領域、例えば配列番号７にハイブリダイズし、ペイロードは、本明細書の他の箇所に記載されている設計を有する。

【0247】

[0251]一部の態様では、本明細書で開示されているペイロードの標的核酸配列は、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ、例えば、配列番号９である。したがって、ある特定の態様では、本明細書で開示されているペイロードは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの１つ又は複数の領域にハイブリダイズし得る。一部の態様では、本開示のペイロードは、ＫＲＡＳタンパク質の特定のアイソフォームをコードするｍＲＮＡを標的とする。ある特定の態様では、本明細書で開示されているペイロードは、その任意のバリアント（本明細書に記載のもの）を含むＫＲＡＳタンパク質のすべてのアイソフォームを標的とし得る。一部の態様では、本開示のペイロードによって標的とされ得るＫＲＡＳタンパク質は、Ｇ１２Ｄアミノ酸置換を含む。

【0248】

[0252]一部の態様では、ペイロードは、ＫＲＡＳ転写物を特異的に標的とし得るＡＳＯを含む。一部の態様では、ＡＳＯのヌクレオチド配列、又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号５１～６１（すなわち、図３Ｂの配列）のいずれか１つに記載されている配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性、例えば約１００％の配列同一性を有する。

【0249】

[0253]一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号５１～６１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＫＲＡＳ転写物と比較した場合に、１、２、３、又は４個のミスマッチを任意選択的に含み得る。

【0250】

[0254]一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号５１に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号５２に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号５３に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号５４に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号５５に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号５６に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号５７に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号５８に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号５９に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号６０に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号６１０に記載されている配列を含む。

【0251】

[0255]一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号５１～６１に記載されている配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一の配列を含むか又はそれからなる。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は配列番号５１～６１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含む。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号５１～６１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＫＲＡＳ転写物と比較した場合に、１、２、３、又は４個のミスマッチを任意選択的に含み得る。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換を除いて、配列番号５１～６１からなる群から選択される配列のうちの１つから選択されるか、又はそれを含み、置換されたＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物に結合し得る。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号５１～６１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＫＲＡＳ転写物に対して相補的な１、２、３、又は４個のさらなる５’及び／又は３’ヌクレオチドを任意選択的に含み得る。

【0252】

ＩＩ．Ｇ．１．ｃ ＮＲＡＳ
[0256]一部の態様では、本明細書において提供されるペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、例えば、細胞内のＮＲａｓ ｍＲＮＡ又はＮＲａｓタンパク質の発現を下方調節する（例えば、低下させるか又は阻害する）ことが可能である。ある特定の態様では、本明細書に記載の（例えば、本開示の負荷方法を使用して、ＥＶに負荷することができる）ペイロードは、ＮＲａｓ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの１つ又は複数の領域（例えば、イントロン領域、エクソン領域、及び／又はエクソン－イントロン接合領域）を標的とする。一部の態様では、ペイロードは、ＮＲａｓタンパク質のすべてのアイソフォームを標的とすることが可能である。ある特定の態様では、ペイロードは、特異的なＮＲａｓアイソフォームを標的とする。別段に示されていない限り、用語「ＮＲａｓ」は、本明細書で使用される場合、１つ又は複数の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）に由来するＮＲａｓを指し得る。

【0253】

[0257]ＮＲａｓは、ゴルジ装置と原形質膜との間を行き来する膜タンパク質をコードするがん遺伝子である。ＮＲａｓをコードするゲノムＤＮＡは、染色体位置１ｐ１３．２（すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ＿００７５７２の５００１～１７４３８までのヌクレオチド）に見い出すことができる。具体的には、パルミトイル化の非存在下で、ＧＦＰタグ付きＮ－ＲａｓがサイトゾルとＥＲ／ゴルジ体膜との間で迅速な交換を受けること、及び野生型ＧＦＰ－Ｎ－Ｒａｓが非小胞体機構によってゴルジ複合体へリサイクルされることが、タイムラプス顕微鏡とフォトブリーチング技法との組合せによって明らかにされた。Ｎ－ｒａｓの変異は、黒色腫、甲状腺癌、奇形癌、線維肉腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、バーキットリンパ腫、急性前骨髄球性白血病、Ｔ細胞白血病、及び慢性骨髄性白血病において記載されている。発癌性Ｎ－Ｒａｓは、マウスにおいて急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）又は慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）様疾患を誘導し得る。

【0254】

[0258]神経芽腫ＲＡＳウイルスがん遺伝子（ＮＲａｓ）は、様々な名称で当技術分野で公知である。このような名称には、ＧＴＰａｓｅ ＮＲａｓ、Ｎ－ｒａｓタンパク質パート４、神経芽腫ＲＡＳウイルス（ｖ－ｒａｓ）がん遺伝子ホモログ 神経芽腫ＲＡＳウイルスがん遺伝子ホモログ、形質転換タンパク質Ｎ－Ｒａｓ、及びｖ－ｒａｓ神経芽腫ＲＡＳウイルスがん遺伝子ホモログを含む。

【0255】

[0259]ＮＲＡＳ遺伝子は、主に細胞分裂の調節に関与するＮ－Ｒａｓと呼ばれるタンパク質を作製するための指示を与える。ヒトＮＲＡＳをコードするｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００２５２４．５に見出すことができ、コード配列（配列番号１９）によって表される。

【0256】

[0260]ヒトＮＲａｓ遺伝子産物の天然バリアントは公知である。例えば、ヒトＮＲａｓタンパク質の天然バリアントは、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｄ、Ｔ５０Ｉ、Ｇ６０Ｅ、及びこれらの任意の組合せから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を含有し得る。Ｇ１３Ｒ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｒ、及びＰ３４Ｌなどの選択的スプライシングから得られるヒトＮＲａｓタンパク質のさらなるバリアントも当技術分野で公知である。したがって、本開示のペイロードは、ＮＲａｓタンパク質の天然バリアントの発現を低下させるか又は阻害するように設計され得る。

【0257】

[0261]配列番号１７は、配列番号１７のヌクレオチド「ｔ」がｐｒｅ－ｍＲＮＡの「ｕ」として示されていることを除いて、ＮＲａｓ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列と同一である。ある特定の態様では、「標的核酸」は、ＮＲａｓタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのイントロン、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。ある特定の態様では、標的核酸は、ＮＲａｓタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン領域、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。ある特定の態様では、標的核酸は、ＮＲａｓタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン－イントロン接合部、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。一部の態様では、例えば、研究又は診断において使用される場合、「標的核酸」は、上記ＤＮＡ又はＲＮＡ核酸標的に由来するｃＤＮＡ又は合成オリゴヌクレオチドであり得る。ＮＲａｓ ｐｒｅ－ｍＲＮＡによってコードされるヒトＮＲａｓタンパク質配列は、配列番号１８として示されている。ある特定の態様では、標的核酸は、ＮＲａｓタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントの非翻訳領域、例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はその両方を含む。

【0258】

[0262]ある特定の態様では、本開示のペイロードは、ＮＲａｓ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を下方調節する（例えば、低下させるか又は除去する）ことも可能である。この点に関して、本開示のペイロードは、典型的には、ヒト細胞、例えば腫瘍細胞などの哺乳動物細胞において、ＮＲａｓ ｍＲＮＡレベルの低下により、ＮＲａｓタンパク質の間接的阻害に影響を及ぼし得る。特に、本開示は、ＮＲａｓ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの１つ又は複数の領域（例えば、イントロン領域、エクソン領域、及び／又はエクソン－イントロン接合領域）を標的とするペイロードを対象とする。別段に示されていない限り、用語「ＮＲａｓ」は、本明細書で使用される場合、１つ又は複数の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）に由来するＮＲａｓを指し得る。

【0259】

[0263]一部の態様では、本開示のペイロードは、ＮＲＡＳ転写物のイントロン内の領域、例えば配列番号１７又は配列番号１９にハイブリダイズする。ある特定の態様では、本開示のペイロードは、ＮＲＡＳ転写物のエクソン内の領域、例えば配列番号１７又は配列番号１９にハイブリダイズする。ある特定の態様では、本開示のペイロードは、ＮＲＡＳ転写物のエクソン－イントロン接合部内の領域、例えば配列番号１７又は配列番号１９にハイブリダイズする。一部の態様では、本開示のペイロードは、ＮＲＡＳ転写物内の領域（例えば、イントロン、エクソン、又はエクソン－イントロン接合部）、例えば、配列番号１７又は配列番号１９にハイブリダイズする。

【0260】

[0264]一部の態様では、本開示のペイロードは、ＮＲａｓ転写物内の複数の標的領域（例えば、ゲノム配列、配列番号１７）にハイブリダイズする。一部の態様では、ペイロードは、ＮＲａｓ転写物内の２つの異なる標的領域にハイブリダイズする。一部の態様では、ペイロードは、ＮＲａｓ転写物内の３つの異なる標的領域にハイブリダイズする。一部の態様では、ＮＲａｓ転写物内の複数の領域（例えば、ゲノム配列、配列番号１７）にハイブリダイズするペイロードは、ＮＲａｓ転写物内の単一の領域（例えば、ゲノム配列、配列番号１７）にハイブリダイズするペイロードと比較して、ＮＲａｓ発現を低下させることにおいてより強力である（例えば、より低いＥＣ５０を有する）。

【0261】

[0265]一部の態様では、ペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、ＮＲＡＳタンパク質の特定のアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１、ＮＣＢＩ ＩＤ：ＮＰ＿００１２２９８２１．１）をコードするｍＲＮＡを標的とする。一部の態様では、ペイロードは、ＮＲａｓタンパク質のすべてのアイソフォームを標的とする。ある特定の態様では、ペイロードは、ＮＲａｓタンパク質の２つのアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１とアイソフォーム２（ＮＣＢＩ ＩＤ：ＮＰ＿００９０８９．４）、アイソフォーム２とアイソフォーム３（ＮＣＢＩ ＩＤ：ＮＰ＿００１１２３９９５）、及びアイソフォーム３とアイソフォーム４（ＮＣＢＩ ＩＤ：ＮＰ＿００１２２９８２０．１））を標的とする。

【0262】

[0266]本開示のペイロードは、ＮＲａｓ転写物の領域の相補配列に対応する連続ヌクレオチド配列、例えば、配列番号１７に対応するヌクレオチド配列を含む。

【0263】

[0267]一部の態様では、本明細書で開示されているＮＲａｓ転写物を標的とするペイロード（例えば、ＡＳＯ）の、ＮＲａｓをコードするｍＲＮＡ転写物への結合は、ＮＲａｓの発現レベル及び／又は活性レベルを低下させ得る。

【0264】

[0268]一部の態様では、ペイロードは、ＮＲａｓ転写物を特異的に標的とし得るＡＳＯを含む。一部の態様では、ＡＳＯのヌクレオチド配列、又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号６２～７１（すなわち、図３Ｃの配列）のいずれか１つに記載されている配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性、例えば約１００％の配列同一性を有する。

【0265】

[0269]一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号６２～７１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＮＲａｓ転写物と比較した場合に、１、２、３、又は４個のミスマッチを任意選択的に含み得る。

【0266】

[0270]一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号６２に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号６３に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号６４に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号６５に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号６６に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号６７に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号６８に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号６９に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号７０に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号７１に記載されている配列を含む。

【0267】

[0271]一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号６２～７１に記載されている配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一の配列を含むか又はそれからなる。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は配列番号６２～７１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含む。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号６２～７１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＮＲａｓ転写物と比較した場合に、１、２、３、又は４個のミスマッチを任意選択的に含み得る。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換を除いて、配列番号６２～７１からなる群から選択される配列のうちの１つから選択されるか、又はそれを含み、置換されたＡＳＯは、ＮＲａｓ転写物に結合し得る。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号６２～７１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＮＲａｓ転写物に対して相補的な１、２、３、又は４個のさらなる５’及び／又は３’ヌクレオチドを任意選択的に含み得る。

【0268】

ＩＩ．Ｇ．１．ｄ ＰＭＰ２２
[0272]一部の態様では、本明細書において提供されるペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、例えば、細胞内のＰＭＰ２２ ｍＲＮＡ又はＰＭＰ２２タンパク質の発現を下方調節する（例えば、低下させるか又は阻害する）ことが可能である。ある特定の態様では、本明細書に記載の（例えば、本開示の負荷方法を使用して、ＥＶに負荷することができる）ペイロードは、ＰＭＰ２２ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの１つ又は複数の領域（例えば、イントロン領域、エクソン領域、及び／又はエクソン－イントロン接合領域）を標的とする。一部の態様では、ペイロードは、ＰＭＰ２２タンパク質のすべてのアイソフォームを標的とすることが可能である。ある特定の態様では、ペイロードは、特異的なＰＭＰ２２アイソフォームを標的とする。別段に示されていない限り、用語「ＰＭＰ２２」は、本明細書で使用される場合、１つ又は複数の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）に由来するＳＴＡＴ６を指し得る。

【0269】

[0273]末梢性ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）は、成長停止特異的タンパク質３（ＧＡＳ－３）としても公知であり、ＰＭＰ２２遺伝子によってコードされている。ＰＭＰ２２は、１６０個のアミノ酸から構成される２２ｋＤａの膜貫通型糖タンパク質であり、末梢神経系のシュワン細胞で主に発現される。シュワン細胞は、ＰＭＰ２２の高発現を示し、コンパクトミエリン中の総タンパク質含量の２～５％を占め得る。コンパクトミエリンは、末梢神経細胞のミエリン鞘の大部分である、神経軸索を電気的に絶縁する保護脂肪層である。成体の中枢神経系では、ＰＭＰ２２の発現レベルは比較的低い。

【0270】

[0274]ヒトでは、ＰＭＰ２２遺伝子は、染色体１７ｐ１１．２に位置し、およそ４０ｋｂに及ぶ。この遺伝子はヒトと齧歯類の両方で保存されている６つのエクソンを含有し、そのうちの２つは５’非翻訳エクソン（１ａ及び１ｂ）であり、同一のコード配列を有する２つの異なるＲＮＡ転写物を生じる。２つの転写物は５’非翻訳領域が異なり、それぞれ発現を調節するプロモーターを有する。残りのエクソン（２～５）は、ＰＭＰ２２遺伝子のコード領域を含み、転写後修飾（すなわち、選択的スプライシング）の後に一緒に接合される。ＰＭＰ２２タンパク質は、４つの膜貫通ドメイン、２つの細胞外ループ（ＥＣＬ１及びＥＣＬ２）、及び１つの細胞内ループによって特徴付けられる。ＥＣＬ１は、２つのＰＭＰ２２タンパク質間のホモ親和性相互作用を媒介することが示唆されているが、ＥＣＬ２は、ＰＭＰ２２タンパク質とミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ又はＭＰ０）間のヘテロ親和性相互作用を媒介することが示されている。

【0271】

[0275]ＰＭＰ２２は、コンパクトミエリンの形成及び維持において不可欠な役割を果たす。シュワン細胞が神経軸索と接触すると、ＰＭＰ２２の発現は著しく上方調節されるが、軸索の変性又は切断時にはＰＭＰ２２は下方調節される。ＰＭＰ２２は、他の細胞及び細胞外マトリックスとの接着に関与し、またミエリンの機能を支えるタンパク質である閉鎖帯（ｚｏｎｕｌａ－ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ）１及びオクルディンとの関連を示している。細胞接着機能と共に、ＰＭＰ２２はシュワン細胞の増殖中も上方調節され、細胞周期の調節における役割が示唆される。ＰＭＰ２２は、神経以外の組織でも検出可能であり、その発現は、成長停止特異的（ｇａｓ－３）機能を果たすことが示されている。

【0272】

[0276]ＰＭＰ２２遺伝子の不適切な遺伝子投与は、ミエリン鞘の異常なタンパク質合成及び機能を引き起こす可能性がある。ミエリンの構成成分は化学量論的に設定されているため、構成成分の発現が不規則になると、ミエリンの不安定化及び神経障害を引き起こす可能性がある。ＰＭＰ２２遺伝子発現の変化は、シャルコーマリートゥース１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）、デジェリンソッタス病、及び遺伝性圧脆弱性ニューロパチー（ＨＮＰＰ）などの種々の神経障害と関連している。ＰＭＰ２２が多すぎると（例えば、遺伝子の重複が原因）、ＣＭＴ１Ａとなる。ＰＭＰ２２の遺伝子重複は、ＣＭＴの最も一般的な遺伝的原因であり、ＰＭＰ２２の過剰産生により、複数のシグナル伝達経路に欠陥が生じ、ＫＮＯＸ２０、ＳＯＸ１０及びＥＧＲ２のような転写因子が機能不全に陥る。

【0273】

[0277]ヒトＰＭＰ２２遺伝子の配列は、公的に入手可能なＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＭ＿０００３０４に見出すことができる。代替のＲｅｆＳｅｑ ｍＲＮＡ転写物は、それぞれ、受託番号ＮＭ＿００１２８１４５５、ＮＭ－００１２８１４５６、ＮＭ－１５３３２１、及びＮＭ＿１５３３２２を有する。ヒトＰＭＰ２２遺伝子は、染色体位置１７ｐ１２の１５，２２９，７７７～１５，２６５，３２６に見られる。

【0274】

[0278]ヒトＰＭＰ２２ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ転写物の配列（配列番号２０）は、染色体位置１７ｐ１２の残基１５，２２９，７７７～１５，２６５，３２６の逆相補配列に対応する。ＰＭＰ２２ ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３０４．４）は、配列番号２１に与えられる。ヒトＰＭＰ２２タンパク質の配列は、公的に入手可能なＵｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ０１４５３（カノニカル配列、配列番号２３）に見出すことができる。潜在的なＰＭＰ２２アイソフォームは、それぞれ、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ８ＭＵ７５、Ｊ３ＫＱＷ０、Ａ０Ａ２Ｒ８Ｙ５Ｌ５、Ｊ３ＫＴ３６、及びＪ３ＱＳ０８を有する。本明細書で開示されている受託番号に対応するデータベース実体の公的に入手可能なコンテンツは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0275】

[0279]ヒトＰＭＰ２２遺伝子産物の天然バリアントは公知である。例えば、ヒトＰＭＰ２２タンパク質の天然バリアントは、Ｌ１６Ｐ、Ｓ２２Ｆ、Δ２５～２６、Ｄ３７Ｖ、Ｖ６５Ｆ、Ｓ７２Ｌ、Ｓ７９Ｃ、Ｇ９３Ｒ、Ｌ１０５Ｒ、Ｇ１０７Ｖ、Ｔ１１８Ｎ、Ｌ１４７Ｒ、Ｈ１２Ｑ、Ｌ１６Ｐ、Ｌ１９Ｐ、Ｍ６９Ｋ、Ｌ７１Ｐ、Ｓ７２Ｌ、Ｓ７２Ｐ、Ｓ７２Ｗ、Ｓ７６Ｉ、Ｓ７９Ｐ、Ｌ８０Ｐ、Ｌ８０Ｒ、Δ８４、Ｇ１００Ｅ、Ｇ１００Ｒ、Ｌ１０５Ｒ、Ｃ１０９Ｒ、Ｓ１４９Ｒ、Ｇ１５０Ｃ、Ｇ１５０Ｄ、Ｒ１５７Ｗ、Ｓ２２Ｆ、Ｖ３０Ｍ、Ａ６７Ｔ、Ｓ２３Ｔ、Ｗ２８Ｒ、Ａ６７Ｐ、Δ１１５－１１８、及びこれらの任意の組合せから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を含有し得る。

【0276】

[0280]本開示のペイロードは、ＰＭＰ２２タンパク質の天然バリアントの発現を低下させるか又は阻害するように設計され得る。

【0277】

[0281]ペイロードの標的核酸配列の一例は、ＰＭＰ２２ ｐｒｅ－ｍＲＮＡである。配列番号２０は、ヒトＰＭＰ２２ゲノム配列（すなわち、染色体１７ｐ１２のヌクレオチド１５２２９７７７～１５２６５３２６の逆相補配列、相補配列）を表す。配列番号２０は、配列番号２０のヌクレオチド「ｔ」がｐｒｅ－ｍＲＮＡの「ｕ」として示されていることを除いて、ＰＭＰ２２ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列と同一である。

【0278】

[0282]一部の態様では、連続ヌクレオチド配列は、ＰＭＰ２２転写物内の核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％相補的である。一部の態様では、ペイロードは、ヒト細胞（例えば、シュワン細胞）におけるＰＭＰ２２タンパク質発現を低下させることが可能であるが、ヒト細胞はＰＭＰ２２タンパク質を発現する。

【0279】

[0283]一部の態様では、本開示のペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、ＰＭＰ２２転写物のイントロン内の領域、例えば配列番号２０にハイブリダイズする。ある特定の態様では、本開示のペイロードは、ＰＭＰ２２転写物のエクソン内の領域、例えば配列番号２０にハイブリダイズする。ある特定の態様では、本開示のペイロードは、ＰＭＰ２２転写物のエクソン－イントロン接合部内の領域、例えば配列番号２０にハイブリダイズする。

【0280】

[0284]一部の態様では、本開示のペイロードは、ＰＭＰ２２転写物内の複数の標的領域（例えば、ゲノム配列、配列番号２０）にハイブリダイズする。一部の態様では、ペイロードは、ＰＭＰ２２転写物内の２つの異なる標的領域にハイブリダイズする。一部の態様では、ペイロードは、ＰＭＰ２２転写物内の３つの異なる標的領域にハイブリダイズする。一部の態様では、ＰＭＰ２２転写物内の複数の領域（例えば、ゲノム配列、配列番号２０）にハイブリダイズするペイロードは、ＰＭＰ２２転写物内の単一の領域（例えば、ゲノム配列、配列番号２０）にハイブリダイズするペイロードと比較して、ＰＭＰ２２発現を低下させることにおいてより強力である（例えば、より低いＥＣ５０を有する）。

【0281】

[0285]一部の態様では、本明細書で開示されているＰＭＰ２２転写物を標的とするペイロード（例えば、ＡＳＯ）の、ＰＭＰ２２をコードするｍＲＮＡ転写物への結合は、ＰＭＰ２２の発現レベル及び／又は活性レベルを低下させ得る。

【0282】

[0286]一部の態様では、ペイロードは、ＰＭＰ２２転写物を特異的に標的とし得るＡＳＯを含む。一部の態様では、ＡＳＯのヌクレオチド配列、又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号７２～８１（すなわち、図３Ｄの配列）のいずれか１つに記載されている配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性、例えば約１００％の配列同一性を有する。

【0283】

[0287]一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号７２～８１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＰＭＰ２２転写物と比較した場合に、１、２、３、又は４個のミスマッチを任意選択的に含み得る。

【0284】

[0288]一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号７２に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号７３に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号７４に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号７５に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号７６に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号７７に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号７８に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号７９に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号８０に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号８１に記載されている配列を含む。

【0285】

[0289]一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号７２～８１に記載されている配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一の配列を含むか又はそれからなる。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は配列番号７２～８１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含む。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号７２～８１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＰＭＰ２２転写物と比較した場合に、１、２、３、又は４個のミスマッチを任意選択的に含み得る。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換を除いて、配列番号７２～８１からなる群から選択される配列のうちの１つから選択されるか、又はそれを含み、置換されたＡＳＯは、ＰＭＰ２２転写物に結合し得る。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号７２～８１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＰＭＰ２２転写物に対して相補的な１、２、３、又は４個のさらなる５’及び／又は３’ヌクレオチドを任意選択的に含み得る。

【0286】

ＩＩ．Ｇ．１．ｅ Ｃ／ＥＢＰβ
[0290]一部の態様では、本明細書において提供されるペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、例えば、細胞内のＣ／ＥＢＰβ ｍＲＮＡ又はＣＥＢＰ／βタンパク質の発現を下方調節する（例えば、低下させるか又は阻害する）ことが可能である。ある特定の態様では、本明細書に記載の（例えば、本開示の負荷方法を使用して、ＥＶに負荷することができる）ペイロードは、ＣＥＢＰ／β ｐｒｅ－ｍＲＮＡの１つ又は複数の領域（例えば、イントロン領域、エクソン領域、及び／又はエクソン－イントロン接合領域）を標的とする。一部の態様では、ペイロードは、ＣＥＢＰ／βタンパク質のすべてのアイソフォームを標的とすることが可能である。ある特定の態様では、ペイロードは、特異的なＣＥＢＰ／βアイソフォームを標的とする。別段に示されていない限り、用語「ＣＥＢＰ／β」は、本明細書で使用される場合、１つ又は複数の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）に由来するＣＥＢＰ／βを指し得る。

【0287】

[0291]ＣＥＢＰ／β（ＣＥＢＰ／β）は、ＣＣＡＡＴ／エンハンサーに結合するタンパク質ベータとしても公知である。ＣＥＢＰ／β／ＣＥＢＰ／βのシノニムは公知であり、Ｃ／ＥＢＰベータ；肝臓活性化タンパク質；ＬＡＰ；肝臓濃縮阻害タンパク質；ＬＩＰ；核因子ＮＦ－ＩＬ６；転写因子５；ＴＣＦ－５；ＣＥＢＰＢ；ＣＥＢＰｂ；ＣＥＢＰβ；ＣＥＢＰ／Ｂ；及びＴＣＦ５が含まれる。ヒトＣＥＢＰ／β遺伝子の配列は、公的に入手可能なＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００２０．１１（５０１９０５８３．．５０１９２６９０）に見出すことができる。ヒトＣＥＢＰ／β遺伝子は、５０１９０５８３～５０１９２６９０の染色体位置２０ｑ１３．１３に見られる。

【0288】

[0292]ヒトＣＥＢＰ／β ｐｒｅ－ｍＲＮＡ転写物の配列（配列番号２５１）は、染色体２０ｑ１３．１３の残基５０１９０５８３～５０１９２６９０の逆相補配列に対応する。ＣＥＢＰ／β ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２８５８７８．１）は、配列番号２７のヌクレオチド「ｔ」がｍＲＮＡ中の「ｕ」として示されていることを除いて、配列番号２７に与えられている。ヒトＣＥＢＰ／βタンパク質の配列は、公的に入手可能な受託番号Ｐ１７６７６（カノニカル配列、配列番号２６）、Ｐ１７６７６－２（配列番号２８）、及びＰ１７６７６－３（配列番号２９）に見出すことができ、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0289】

[0293]ヒトＣＥＢＰ／β遺伝子産物の天然バリアントは公知である。例えば、ヒトＣＥＢＰ／βタンパク質の天然バリアントは、Ａ２４１Ｐ、Ａ２５３Ｇ、Ｇ１９５Ｓ、及びこれらの任意の組合せから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を含有し得る。選択的スプライシングから得られるヒトＣＥＢＰ／βタンパク質のさらなるバリアントも当技術分野で公知である。ＣＥＢＰ／βアイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔの識別子：Ｐ１７６７６－２）は、カノニカル配列（配列番号２７）と以下のように異なる：配列番号２７に対して、残基１～２３の欠失。ＣＥＢＰ／β アイソフォーム３（識別子：Ｐ１７６７６－３）の配列は、カノニカル配列（配列番号２３）と以下のように異なる：配列番号２７に対して、残基１～１９８の欠失。したがって、本明細書に記載のペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、タンパク質の天然バリアントの発現を低下させるか又は阻害するように設計され得る。

【0290】

[0294]ペイロードの標的核酸配列の一例は、ＣＥＢＰ／β ｐｒｅ－ｍＲＮＡである。配列番号２５は、ヒトＣＥＢＰ／βゲノム配列（すなわち、染色体２０ｑ１３．１３のヌクレオチド５０１９０５８３～５０１９２６９０の逆相補配列）を表す。配列番号２５は、配列番号２５のヌクレオチド「ｔ」がｐｒｅ－ｍＲＮＡの「ｕ」として示されていることを除いて、ＣＥＢＰ／β ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列と同一である。ある特定の態様では、「標的核酸」は、ＣＥＢＰ／βタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのイントロン、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。ある特定の態様では、標的核酸は、ＣＥＢＰ／βタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン領域、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。ある特定の態様では、標的核酸は、ＣＥＢＰ／βタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン－イントロン接合部、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。一部の態様では、例えば、研究又は診断において使用される場合、「標的核酸」は、上記ＤＮＡ又はＲＮＡ核酸標的に由来するｃＤＮＡ又は合成オリゴヌクレオチドであり得る。ＣＥＢＰ／β ｐｒｅ－ｍＲＮＡによってコードされるヒトＣＥＢＰ／βタンパク質配列は、配列番号２６として示されている。ある特定の態様では、標的核酸は、ＣＥＢＰ／βタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントの非翻訳領域、例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はその両方を含む。

【0291】

[0295]一部の態様では、本開示のペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、ＣＥＢＰ／β転写物のイントロン内の領域、例えば配列番号２５にハイブリダイズする。ある特定の態様では、本開示のペイロードは、ＣＥＢＰ／β転写物のエクソン内の領域、例えば配列番号２５１にハイブリダイズする。ある特定の態様では、本開示のＡＳＯは、ＣＥＢＰ／β転写物のエクソン－イントロン接合部内の領域、例えば配列番号２５にハイブリダイズする。一部の態様では、本開示のペイロードは、ＣＥＢＰ／β転写物（例えば、イントロン、エクソン、又はエクソン－イントロン接合部）内の領域、例えば配列番号２５にハイブリダイズし、ペイロードは、本明細書の他の箇所に記載されている式５’Ａ－Ｂ－Ｃ３’による設計を有する。

【0292】

[0296]一部の態様では、ペイロードは、ＣＥＢＰ／βタンパク質の特定のアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１）をコードするｍＲＮＡを標的とする。一部の態様では、ペイロードは、ＣＥＢＰ／βタンパク質のすべてのアイソフォームを標的とする。ある特定の態様では、ペイロードは、ＣＥＢＰ／βタンパク質の２つのアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１とアイソフォーム２、アイソフォーム１とアイソフォーム３、又はアイソフォーム２とアイソフォーム３）を標的とする。

【0293】

[0297]一部の態様では、本明細書で開示されているＣＥＢＰｂ転写物を標的とするペイロード（例えば、ＡＳＯ）の、ＣＥＢＰｂをコードするｍＲＮＡ転写物への結合は、ＣＥＢＰｂの発現レベル及び／又は活性レベルを低下させ得る。

【0294】

[0298]一部の態様では、ペイロードは、ＣＥＢＰｂ転写物を特異的に標的とし得るＡＳＯを含む。一部の態様では、ＡＳＯのヌクレオチド配列、又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号８２～９１（すなわち、図３Ｅの配列）のいずれか１つに記載されている配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性、例えば約１００％の配列同一性を有する。

【0295】

[0299]一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号８２～９１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＣＥＢＰｂ転写物と比較した場合に、１、２、３、又は４個のミスマッチを任意選択的に含み得る。

【0296】

[0300]一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号８２に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号８３に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号８４に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号８５に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号８６に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号８７に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号８８に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号８９に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号９０に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号９１に記載されている配列を含む。

【0297】

[0301]一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号８２～９１に記載されている配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一の配列を含むか又はそれからなる。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は配列番号８２～９１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含む。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号８２～９１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＣＥＢＰｂ転写物と比較した場合に、１、２、３、又は４個のミスマッチを任意選択的に含み得る。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換を除いて、配列番号８２～９１からなる群から選択される配列のうちの１つから選択されるか、又はそれを含み、置換されたＡＳＯは、ＣＥＢＰｂ転写物に結合し得る。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号８２～９１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＣＥＢＰｂ転写物に対して相補的な１、２、３、又は４個のさらなる５’及び／又は３’ヌクレオチドを任意選択的に含み得る。

【0298】

ＩＩ．Ｇ．１．ｆ ＳＴＡＴ３
[0302]一部の態様では、本明細書において提供されるペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、細胞内の目的の任意の遺伝子又はタンパク質の発現を下方調節する（例えば、低下させるか又は阻害する）ことが可能である。ある特定の態様では、本明細書に記載の（例えば、本開示の負荷方法を使用して、ＥＶに負荷することができる）ペイロードは、ＳＴＡＴ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの１つ又は複数の領域（例えば、イントロン領域、エクソン領域、及び／又はエクソン－イントロン接合領域）を標的とする。一部の態様では、ペイロードは、ＳＴＡＴ３タンパク質のすべてのアイソフォームを標的とすることが可能である。ある特定の態様では、ペイロードは、特異的なＳＴＡＴ３アイソフォームを標的とする。別段に示されていない限り、用語「ＳＴＡＴ３」は、本明細書で使用される場合、１つ又は複数の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）に由来するＳＴＡＴ３を指し得る。

【0299】

[0303]シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）は、様々な名称で当技術分野で公知である。このような名称には、ＤＮＡ結合タンパク質ＡＰＲＦ、及び急性期応答因子が含まれる。ヒトＳＴＡＴ３をコードするｍＲＮＡは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３１５０．３において見い出すことができ、配列（配列番号３２）によって表される。

【0300】

[0304]ヒトＳＴＡＴ３遺伝子産物の天然バリアントは公知である。例えば、ヒトＳＴＡＴ３タンパク質の天然バリアントは、Ｒ３８２Ｌ、Ｒ３８２Ｑ、ＯＲ Ｒ３８２Ｗ、及びこれらの任意の組合せから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を含有し得る。Ｒ３８２Ｗ、Ｆ３８４Ｌ、Ｆ３８４Ｓ、Ｔ３８９Ｉ、Ｎ３９５Ｙ、Ｒ４２３Ｑ、Ｎ４２５Ｙ、Ｈ４３７Ｙ、Ｄｅｌ－４６３、Ｓ６１１Ｎ、Ｆ６２１Ｖ、Ｔ６２２Ｉ、Ｖ６３７Ｌ、Ｖ６３７Ｍ、Ｄｅｌ－６４４、Ｙ６５７Ｃ、Ｐ３３０Ｓ、Ｋ３９２Ｒ、Ｎ６４６Ｋ、Ｋ６５８Ｎ、Ｄｅｌ－７０１、又はＴ７１６Ｍなどの選択的スプライシングから生じるヒトＳＴＡＴ３タンパク質のさらなるバリアントも当技術分野で公知である。したがって、本開示のペイロードは、ＳＴＡＴ３タンパク質の天然バリアントの発現を低下させるか又は阻害するように設計され得る。

【0301】

[0305]配列番号３０は、配列番号３０のヌクレオチド「ｔ」がｐｒｅ－ｍＲＮＡの「ｕ」として示されていることを除いて、ＳＴＡＴ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列と同一である。ある特定の態様では、「標的核酸」は、ＳＴＡＴ３タンパク質をコードする核酸のイントロン又はその天然に存在するバリアント、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。ある特定の態様では、標的核酸は、ＳＴＡＴ３タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン領域、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。ある特定の態様では、標的核酸は、ＳＴＡＴ３タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン－イントロン接合部、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。一部の態様では、例えば、研究又は診断において使用される場合、「標的核酸」は、上記ＤＮＡ又はＲＮＡ核酸標的に由来するｃＤＮＡ又は合成オリゴヌクレオチドであり得る。ＳＴＡＴ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡによってコードされるヒトＳＴＡＴ３タンパク質配列は、配列番号３１として示されている。ある特定の態様では、標的核酸は、ＳＴＡＴ３タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントの非翻訳領域、例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はその両方を含む。

【0302】

[0306]一部の態様では、標的核酸は、ＳＴＡＴ３タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン－イントロン接合部、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。一部の態様では、例えば、研究又は診断において使用される場合、「標的核酸」は、上記ＤＮＡ又はＲＮＡ核酸標的に由来するｃＤＮＡ又は合成オリゴヌクレオチドであり得る。ＳＴＡＴ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡによってコードされるヒトＳＴＡＴ３タンパク質配列は、配列番号３２として示されている。ある特定の態様では、標的核酸は、ＳＴＡＴ３タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントの非翻訳領域、例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はその両方を含む。

【0303】

[0307]一部の態様では、ペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、ＳＴＡＴ３転写物のイントロン内の領域、例えば配列番号３０又は配列番号３２にハイブリダイズする。ある特定の態様では、本開示のペイロードは、ＳＴＡＴ３転写物のエクソン内の領域、例えば配列番号４１又は配列番号３２にハイブリダイズする。ある特定の態様では、本開示のペイロードは、ＳＴＡＴ３転写物のエクソン－イントロン接合部内の領域、例えば配列番号３０又は配列番号３２にハイブリダイズする。一部の態様では、本開示のペイロードは、ＳＴＡＴ３転写物（例えば、イントロン、エクソン、又はエクソン－イントロン接合部）内の領域、例えば配列番号３０又は配列番号３２にハイブリダイズする。

【0304】

[0308]一部の態様では、ペイロードは、ＳＴＡＴ３タンパク質の特定のアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１）をコードするｍＲＮＡを標的とする。一部の態様では、ペイロードは、ＳＴＡＴ３タンパク質のすべてのアイソフォームを標的とする。ある特定の態様では、ペイロードは、ＳＴＡＴ３タンパク質の２つのアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ４０７６３－１）とアイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ４０７６３－２）、アイソフォーム２とアイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ４０７６３－３）を標的とする。

【0305】

[0309]一部の態様では、本開示のペイロードは、ＳＴＡＴ３転写物のイントロン内の領域、例えば配列番号３０又は配列番号３２にハイブリダイズする。ある特定の態様では、本開示のペイロードは、ＳＴＡＴ３転写物のエクソン内の領域、例えば配列番号３０又は配列番号３２にハイブリダイズする。ある特定の態様では、本開示のペイロードは、ＳＴＡＴ３転写物のエクソン－イントロン接合部内の領域、例えば配列番号３０又は配列番号３２にハイブリダイズする。一部の態様では、本開示のペイロードは、ＳＴＡＴ３転写物（例えば、イントロン、エクソン、又はエクソン－イントロン接合部）内の領域、例えば配列番号３０又は配列番号３２にハイブリダイズし、ペイロードは、本明細書の他の箇所に記載されている式５’Ａ－Ｂ－Ｃ３’による設計を有する。

【0306】

[0310]一部の態様では、本開示のペイロードは、ＳＴＡＴ３転写物内の複数の標的領域（例えば、ゲノム配列、配列番号３０）にハイブリダイズする。一部の態様では、ペイロードは、ＳＴＡＴ３転写物内の２つの異なる標的領域にハイブリダイズする。一部の態様では、ペイロードは、ＳＴＡＴ３転写物内の３つの異なる標的領域にハイブリダイズする。一部の態様では、ＳＴＡＴ３転写物内の複数の領域（例えば、ゲノム配列、配列番号３０）にハイブリダイズするペイロードは、ＳＴＡＴ３転写物内の単一の領域（例えば、ゲノム配列、配列番号３０）にハイブリダイズするペイロードと比較して、ＳＴＡＴ３発現を低下させることにおいてより強力である（例えば、より低いＥＣ５０を有する）。

【0307】

[0311]本開示のペイロードは、ＳＴＡＴ３転写物の領域の相補配列に対応する連続ヌクレオチド配列、例えば、配列番号３０に対応するヌクレオチド配列を含む。

【0308】

[0312]一部の態様では、本明細書で開示されているＳＴＡＴ３転写物を標的とするペイロードの、ＳＴＡＴ３をコードするｍＲＮＡ転写物への結合は、ＳＴＡＴ３の発現レベル及び／又は活性レベルを低下させ得る。

【0309】

[0313]一部の態様では、ペイロードは、ＳＴＡＴ３転写物を特異的に標的とし得るＡＳＯを含む。一部の態様では、ＡＳＯのヌクレオチド配列、又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号９２～１０１（すなわち、図３Ｆの配列）のいずれか１つに記載されている配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性、例えば約１００％の配列同一性を有する。

【0310】

[0314]一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号９２～１０１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＳＴＡＴ３転写物と比較した場合に、１、２、３、又は４個のミスマッチを任意選択的に含み得る。

【0311】

[0315]一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号９２に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号９３に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号９４に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号９５に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号９６に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号９７に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号９８に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号９９に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号１００に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号１０１に記載されている配列を含む。

【0312】

[0316]一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号９２～１０１に記載されている配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一の配列を含むか又はそれからなる。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は配列番号９２～１０１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含む。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号９２～１０１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＳＴＡＴ３転写物と比較した場合に、１、２、３、又は４個のミスマッチを任意選択的に含み得る。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換を除いて、配列番号９２～１０１からなる群から選択される配列のうちの１つから選択されるか、又はそれを含み、置換されたＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物に結合し得る。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号９２～１０１からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＳＴＡＴ３転写物に対して相補的な１、２、３、又は４個のさらなる５’及び／又は３’ヌクレオチドを任意選択的に含み得る。

【0313】

ＩＩ．Ｇ．１．ｇ ＮＬＲＰ３
[0317]一部の態様では、本明細書において提供されるペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、細胞内の目的の任意の遺伝子又はタンパク質の発現を下方調節する（例えば、低下させるか又は阻害する）ことが可能である。ある特定の態様では、本明細書に記載の（例えば、本開示の負荷方法を使用して、ＥＶに負荷することができる）ペイロードは、ＮＬＲＰ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの１つ又は複数の領域（例えば、イントロン領域、エクソン領域、及び／又はエクソン－イントロン接合領域）を標的とする。一部の態様では、ペイロードは、ＮＬＲＰ３タンパク質のすべてのアイソフォームを標的とすることが可能である。ある特定の態様では、ペイロードは、特異的なＮＬＲＰ３アイソフォームを標的とする。別段に示されていない限り、用語「ＮＬＲＰ３」は、本明細書で使用される場合、１つ又は複数の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）に由来するＳＴＡＴ６を指し得る。

【0314】

[0318]ＮＬＲＰ３（ＮＬＲＰ３）は、ＮＬＲファミリーピリンドメイン含有３としても公知である。別段に示されていない限り、用語「ＮＬＲＰ３」は、本明細書で使用される場合、１つ又は複数の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）に由来するＮＬＲＰ３を指し得る。ＮＬＲＰ３／ＮＬＲＰ３のシノニムは公知であり、ＮＬＲＰ３；Ｃ１ｏｒｆ７；ＣＩＡＳ１；ＮＡＬＰ３；ＰＹＰＡＦ１；ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン、ロイシンリッチリピート及びピリンドメイン含有３；寒冷誘発性自己炎症性症候群１タンパク質；クリオピリン；ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲ及びＰＹＤドメイン含有タンパク質３；アンジオテンシン／バソプレッシン受容体ＡＩＩ／ＡＶＰ様；キャタピラータンパク質１．１；ＣＬＲ１．１；寒冷誘発性自己炎症性症候群１タンパク質；及びＰＹＲＩＮ含有ＡＰＡＦ１様タンパク質１が挙げられる。ヒトＮＬＲＰ３遺伝子の配列は、公的に入手可能なＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００００１．１１：２４７４１６１５６－２４７４４９１０８に見い出すことができる。ヒトＮＬＲＰ３遺伝子は、染色体位置１ｑ４４の２４７，４１６，１５６～２４７，４４９，１０８に見られる。

【0315】

[0319]ヒトＮＬＲＰ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ転写物の配列（配列番号３３）は、染色体１ｑ４４の残基２４７，４１６，１５６～２４７，４４９，１０８の逆相補配列に対応する。ＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０７９８２１．２）は、配列番号３５のヌクレオチド「ｔ」がｍＲＮＡ中の「ｕ」として示されていることを除いて、配列番号３５に与えられている。ヒトＮＬＲＰ３タンパク質の配列は、公的に入手可能な受託番号で見出すことができる：Ｑ９６Ｐ２０、（カノニカル配列、配列番号３４）、Ｑ９６Ｐ２０－２（配列番号３６）、Ｑ９６Ｐ２０－３（配列番号３７）、Ｑ９６Ｐ２０－４（配列番号３８）、Ｑ９６Ｐ２０－５（配列番号３９）、及びＱ９６Ｐ２０－６（配列番号４０）に見出すことができ、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0316】

[0320]ヒトＮＬＲＰ３遺伝子産物の天然バリアントは公知である。例えば、ヒトＮＬＲＰ３タンパク質の天然バリアントは、Ｄ２１Ｈ、Ｉ１７４Ｔ、Ｖ２００Ｍ、Ｒ２６２Ｌ、４２６２Ｐ、Ｒ２６２Ｗ、Ｌ２６６Ｈ、Ｄ３０５Ｇ、Ｄ３０５Ｎ、Ｌ３０７Ｐ、Ｑ３０８Ｋ、Ｆ３１１Ｓ、Ｔ３５０Ｍ、Ａ３５４Ｖ、Ｌ３５５Ｐ、Ｅ３５６Ｄ、Ｈ３６０Ｒ、Ｔ４０７Ｐ、Ｔ４３８Ｉ、Ｔ４３８Ｎ、Ａ４４１Ｔ、Ａ４４１Ｖ、Ｒ４９０Ｋ、Ｆ５２５Ｃ、Ｆ５２５Ｌ、Ｇ５７１Ｒ、Ｙ５７２Ｃ、Ｆ５７５Ｓ、Ｅ６２９Ｇ、Ｌ６３４Ｆ、Ｍ６６４Ｔ、Ｑ７０５Ｋ、Ｙ８６１Ｃ、及びＲ９２０Ｑ、並びにこれらの任意の組合せから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を含有し得る。選択的スプライシングから生じるヒトＮＬＲＰ３タンパク質のさらなるバリアントも当技術分野で公知である。ＮＬＲＰ３ アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔの識別子：Ｑ９６Ｐ２０－２）は、カノニカル配列（配列番号３５）と以下のように異なる：配列番号３５に対して、残基７２１～７７７及び８３６～８９２の欠失。ＮＬＲＰ３アイソフォーム３（識別子：Ｑ９６Ｐ２０－３）の配列は、カノニカル配列（配列番号３５）と以下のように異なる：配列番号３５に対して、残基７２０～１０３６の欠失。ＮＬＲＰ３アイソフォーム４（識別子：Ｑ９６Ｐ２０－４）の配列は、カノニカル配列（配列番号３５）と以下のように異なる：配列番号３５に対して、残基７２１～７７７の欠失。ＮＬＲＰ３アイソフォーム５（識別子：Ｑ９６Ｐ２０－５）の配列は、カノニカル配列（配列番号３５）と以下のように異なる：配列番号３５に対して、残基８３６～８９２の欠失。ＮＬＲＰ３アイソフォーム６（識別子：Ｑ９６Ｐ２０－６）の配列は、カノニカル配列（配列番号３５）と以下のように異なる：配列番号３５に対して、残基７７６～７９６の欠失。したがって、本開示のペイロードは、ＮＬＲＰ３タンパク質の天然バリアントの発現を低下させるか又は阻害するように設計され得る。

【0317】

[0321]ペイロードの標的核酸配列の一例は、ＮＬＲＰ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡである。配列番号３３は、ヒトＮＬＲＰ３ゲノム配列（すなわち、染色体１ｑ４４のヌクレオチド２４７，４１６，１５６～２４７，４４９，１０８の逆相補配列）を表す。配列番号３３は、配列番号３３のヌクレオチド「ｔ」がｐｒｅ－ｍＲＮＡの「ｕ」として示されていることを除いて、ＮＬＲＰ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列と同一である。ある特定の態様では、「標的核酸」は、ＮＬＲＰ３タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのイントロン、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。ある特定の態様では、標的核酸は、ＮＬＲＰ３タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン領域、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。ある特定の態様では、標的核酸は、ＮＬＲＰ３タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン－イントロン接合部、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。一部の態様では、例えば、研究又は診断において使用される場合、「標的核酸」は、上記ＤＮＡ又はＲＮＡ核酸標的に由来するｃＤＮＡ又は合成オリゴヌクレオチドであり得る。ＮＬＲＰ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡによってコードされるヒトＮＬＲＰ３タンパク質配列は、配列番号３５として示されている。ある特定の態様では、標的核酸は、ＮＬＲＰ３タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントの非翻訳領域、例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はその両方を含む。

【0318】

[0322]一部の態様では、ペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、ＮＬＲＰ３転写物のイントロン内の領域、例えば、配列番号３３にハイブリダイズする。ある特定の態様では、本開示のペイロードは、ＮＬＲＰ３転写物のエクソン内の領域、例えば配列番号３３にハイブリダイズする。ある特定の態様では、本開示のペイロードは、ＮＬＲＰ３転写物のエクソン－イントロン接合部内の領域、例えば配列番号３３にハイブリダイズする。一部の態様では、本開示のペイロードは、ＮＬＲＰ３転写物（例えば、イントロン、エクソン、又はエクソン－イントロン接合部）内の領域、例えば配列番号３３にハイブリダイズする。

【0319】

[0323]一部の態様では、ペイロードは、ＮＬＲＰ３タンパク質の特定のアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１）をコードするｍＲＮＡを標的とする。一部の態様では、ペイロードは、ＮＬＲＰ３タンパク質のすべてのアイソフォームを標的とする。ある特定の態様では、ペイロードは、ＮＬＲＰ３タンパク質の２つのアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１とアイソフォーム２、アイソフォーム３とアイソフォーム４、及びアイソフォーム５とアイソフォーム６）を標的とする。

【0320】

[0324]一部の態様では、本明細書で開示されているＮＬＲＰ３転写物を標的とするペイロードの、ＮＬＲＰ３をコードするｍＲＮＡ転写物への結合は、ＮＬＲＰ３の発現レベル及び／又は活性レベルを低下させ得る。

【0321】

[0325]一部の態様では、ペイロードは、ＮＬＲＰ３転写物を特異的に標的とし得るＡＳＯを含む。一部の態様では、ＡＳＯのヌクレオチド配列、又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１０２～１１２（すなわち、図３Ｇの配列）のいずれか１つに記載されている配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性、例えば約１００％の配列同一性を有する。

【0322】

[0326]一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号１０２～１１２からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＮＬＲＰ３転写物と比較した場合に、１、２、３、又は４個のミスマッチを任意選択的に含み得る。

【0323】

[0327]一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号１０２に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号１０３に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号１０４に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号１０５に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号１０６に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号１０７に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号１０８に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号１０９に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号１１０に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号１１１に記載されている配列を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号１１２に記載されている配列を含む。

【0324】

[0328]一部の態様では、ＡＳＯは、配列番号１０２～１１２に記載されている配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一の配列を含むか又はそれからなる。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は配列番号１０２～１１２からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含む。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号１０２～１１２からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＮＬＲＰ３転写物と比較した場合に、１、２、３、又は４個のミスマッチを任意選択的に含み得る。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換を除いて、配列番号１０２～１１２からなる群から選択される配列のうちの１つから選択されるか、又はそれを含み、置換されたＡＳＯは、ＮＬＲＰ３転写物に結合し得る。一部の態様では、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号１０２～１１２からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＮＬＲＰ３転写物に対して相補的な１、２、３、又は４個のさらなる５’及び／又は３’ヌクレオチドを任意選択的に含み得る。

【0325】

ＩＩ．Ｇ．２ アンカー部分
[0329]１つ又は複数のアンカー部分（ＡＭ）を使用して、ペイロード（又は目的の任意の他の部分）をＥＶ（例えば、エクソソーム）に係留することができる。一部の態様では、ペイロードは、アンカー部分に直接的に連結されている。一部の態様では、ペイロードは、本明細書に記載のものなどのリンカーを介してアンカー部分に連結されている。一部の態様では、ペイロードは、「反応性基」（ＲＧ；例えば、アミン、チオール、ヒドロキシ、カルボン酸、又はアジド）と「反応性部分」（ＲＭ；例えば、マレイミド、スクシネート、ＮＨＳ）との間の反応により、アンカー部分及び／又はリンカーに結合され得る。いくつかの可能性のある合成経路、例えば：
［ＡＭ］－／反応性部分／＋／反応性基／－［ペイロード］
［ＡＭ］－［リンカー］ｎ－／反応性部分／＋／反応性基／－［ペイロード］
［ＡＭ］－／反応性部分／＋／反応性基／－［リンカー］ｎ－［ペイロード］
［ＡＭ］－［リンカー］ｎ－／反応性部分／＋／反応性基／－［リンカー］ｎ－［ペイロード］
が想定される。

【0326】

[0330]アンカー部分を、ＥＶの脂質二重層中に挿入し、ペイロードの負荷を可能にし得る。一部の態様では、アンカー部分はペイロードに化学的にコンジュゲートされ、その疎水特性を増強し、それによって、ペイロードによるＥＶへの負荷を増強することができる。一部の態様では、アンカー部分は、ステロール（例えば、コレステロール）、ＧＭ１、脂質、ビタミン、小分子、ペプチド、又はこれらの組合せを含む。

【0327】

[0331]一部の態様では、アンカー部分は、脂質を含む。当技術分野で公知の任意の好適な脂質をアンカー部分（例えば、パルミチン酸又はグリコシルホスファチジルイノシトール）として使用することができる。一部の態様では、アンカー部分は、ステロール、例えば、コレステロールである。さらなる疎水性部分としては、例えば、リン脂質、リゾリン脂質、脂肪酸、又はビタミン（例えば、ビタミンＤ又はビタミンＥ）が挙げられる。

【0328】

[0332]一部の態様では、アンカー部分は、化学的に結合されている。ある特定の態様では、アンカー部分は、ペイロード（例えば、ＡＳＯ）に酵素的に結合され得る。一部の態様では、アンカー部分は、細胞培養条件の修飾によりペイロードに結合され得る。例えば、ミリスチン酸が制限される培養培地を使用することによって、短鎖及び不飽和を含む一部の他の脂肪酸をＮ末端のグリシンに結合させることができる。例えば、ＢＫチャネルでは、ミリステートがヒドロキシエステル連結を介して内部のセリン／トレオニン残基又はチロシン残基に翻訳後結合することが報告されている。

【0329】

[0333]アンカー部分は、任意の化学的に実行可能な位置、例えば、ペイロードの５’及び／又は３’末端で、リンカーの組合せを介して、直接的又は間接的にペイロードにコンジュゲートされ得る。ある特定の態様では、アンカー部分は、ペイロードの３’末端にのみコンジュゲートされる。ある特定の態様では、アンカー部分は、ペイロードの５’末端にのみコンジュゲートされる。一部の態様では、アンカー部分は、ペイロードの３’末端又は５’末端ではない位置にコンジュゲートされる。

【0330】

[0334]アンカー部分（それらの構造を含む）の非限定的な例は以下に提供される：

【表1】

【0331】

[0335]一部の態様では、本開示にとって有用なアンカー部分は、本明細書で開示されている２種類以上のアンカー部分を含む。例えば、一部の態様では、アンカー部分は、合わせて６～８０個の炭素原子（すなわち、６～８０の同等の炭素数（ＥＣＮ））を有する２つの脂質、例えばリン脂質及び脂肪酸、又は２つのリン脂質、又は２つの脂肪酸、又は脂質及びビタミン、又はコレステロール及びビタミンなどを含み得る。

【0332】

[0336]一部の態様では、アンカー部分の組合せ、例えば、脂質（例えば、脂肪酸）の組合せは、６～８０個、８～８０個、１０～８０個、１２～８０個、１４～８０個、１６～８０個、１８～８０個、２０～８０個、２２～８０個、２４～８０個、２６～８０個、２８～８０個、３０～８０個、４～７６個、６～７６個、８～７６個、１０～７６個、１２～７６個、１４～７６個、１６～７６個、１８～７６個、２０～７６個、２２～７６個、２４～７６個、２６～７６個、２８～７６個、３０～７６個、６～７２個、８～７２個、１０～７２個、１２～７２個、１４～７２個、１６～７２個、１８～７２個、２０～７２個、２２～７２個、２４～７２個、２６～７２個、２８～７２個、３０～７２個、６～６８個、８～６８個、１０～６８個、１２～６８個、１４～６８個、１６～６８個、１８～６８個、２０～６８個、２２～６８個、２４～６８個、２６～６８個、２８～６８個、３０～６８個、６～６４個、８～６４個、１０～６４個、１２～６４個、１４～６４個、１６～６４個、１８～６４個、２０～６４個、２２～６４個、２４～６４個、２６～６４個、２８～６４個、３０～６４個、６～６０個、８～６０個、１０～６０個、１２～５６個、１４～５６個、１６～５６個、１８～５６個、２０～５６個、２２～５６個、２４～５６個、２６～５６個、２８～５６個、３０～５６個、６～５２個、８～５２個、１０～５２個、１２～５２個、１４～５２個、１６～５２個、１８～５２個、２０～５２個、２２～５２個、２４～５２個、２６～５２個、２８～５２個、３０～５２個、６～４８個、８～４８個、１０～４８個、１２～４８個、１４～４８個、１６～４８個、１８～４８個、２０～４８個、２２～４８個、２４～４８個、２６～４８個、２８～４８個、３０～４８個、６～４４個、８～４４個、１０～４４個、１２～４４個、１４～４４個、１６～４４個、１８～４４個、２０～４４個、２２～４４個、２４～４４個、２６～４４個、２８～４４個、３０～４４個、６～４０個、８～４０個、１０～４０個、１２～４０個、１４～４０個、１６～４０個、１８～４０個、２０～４０個、２２～４０個、２４～４０個、２６～４０個、２８～４０個、３０～４０個、６～３６個、８～３６個、１０～３６個、１２～３６個、１４～３６個、１６～３６個、１８～３６個、２０～３６個、２２～３６個、２４～３６個、２６～３６個、２８～３６個、３０～３６個、６～３２個、８～３２個、１０～３２個、１２～３２個、１４～３２個、１６～３２個、１８～３２個、２０～３２個、２２～３２個、２４～３２個、２６～３２個、２８～３２個、又は３０～３２個のＥＣＮを有する。

【0333】

ＩＩ．Ｇ．１．ａ．コレステロール及び他のステロール
[0337]一部の態様では、アンカー部分は、ステロール、ステロイド、ホパノイド、ヒドロキシステロイド、セコステロイド、又は脂溶性を有するそのアナログを含む。一部の態様では、アンカー部分は、植物ステロール、菌類ステロール、又は動物ステロールなどのステロールを含む。例示的な動物ステロールとしては、コレステロール及び２４Ｓ－ヒドロキシコレステロールが挙げられ、例示的な植物ステロールとしては、エルゴステロール（菌類ステロール）、カンペステロール、シトステロール、及びスチグマステロールが挙げられる。一部の態様では、ステロールは、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、コレステロール、２４Ｓ－ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、シクロアルテノール、フコステロール、サリンゴステロール、カンペステロール、β－シトステロール、シトスタノール、コプロスタノール、アベナステロール、及びスチグマステロールから選択される。ステロールは、遊離ステロール、アシル化ステロール（ステロールエステル）、アルキル化ステロール（ステリルアルキルエーテル）、硫酸化ステロール（硫酸ステロール）、又はグリコシド部分と連結しており（ステリルグリコシド）、それ自体がアシル化されている可能性のあるステロール（アシル化ステロールグリコシド）のいずれかとして見られる場合がある。

【0334】

[0338]一部の態様では、アンカー部分は、ステロイドを含む。一部の態様では、ステロイドは、ジヒドロテストステロン、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン、プロゲステロン、又はコルチゾールから選択される。

【0335】

[0339]例えば、ステロールは、直接的に又はステロールの利用可能な－ＯＨ基におけるリンカーの組合せを介してペイロード（例えば、ＡＳＯ）にコンジュゲートされ得る。例示的なステロールは、以下に示されている一般的骨格を有する：

【化5】

【0336】

[0340]さらなる例として、エルゴステロールは以下の構造を有する：

【化6】

【0337】

[0341]コレステロールは以下の構造を有する：

【化7】

【0338】

[0342]したがって、一部の態様では、ステロール又はステロイドの遊離－ＯＨ基を使用して、直接的に又はリンカーの組合せを介して、ペイロードをステロール（例えば、コレステロール）又はステロイドにコンジュゲートさせる。一部の態様では、本明細書に記載のペイロード（例えば、ＡＳＯ）をコンジュゲートさせるために使用することができるコレステロールは、図２Ａに示されている構造を有する。一部の態様では、本明細書に記載のペイロード（例えば、ＡＳＯ）をコンジュゲートさせるために使用することができるコレステロールは、図２Ｂに示されている構造を有する。本明細書で記載されているように、図２Ａに示されているコレステロールは、リンカー、例えば、トリエチレングリコール（本明細書において、「ｃｈｏｌ２」と称される）に結合され得る。一部の態様では、図２Ｂに示されているコレステロールは、リンカー、例えば、テトラエチレングリコール（本明細書において、「ｃｈｏｌ４」と称される）に結合され得る。

【0339】

ＩＩ．Ｇ．２．ｂ．脂肪酸
[0343]一部の態様では、アンカー部分は、脂肪酸である。一部の態様では、脂肪酸は、短鎖、中鎖、又は長鎖脂肪酸である。一部の態様では、脂肪酸は、飽和脂肪酸である。一部の態様では、脂肪酸は、不飽和脂肪酸である。一部の態様では、脂肪酸は、モノ不飽和脂肪酸である。一部の態様では、脂肪酸は、ポリ不飽和脂肪酸、例えばオメガ－３又はオメガ－６脂肪酸である。

【0340】

[0344]一部の態様では、脂質、例えば脂肪酸は、Ｃ_２～Ｃ_６０鎖を有する。一部の態様では、脂質、例えば脂肪酸は、Ｃ_２～Ｃ_２８鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ_２～Ｃ_４０鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ_２～Ｃ_１２又はＣ_４～Ｃ_１２鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ_４～Ｃ_４０鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ_４～Ｃ_４０、Ｃ_２～Ｃ_３８、Ｃ_２～Ｃ_３６、Ｃ_２～Ｃ_３４、Ｃ_２～Ｃ_３２、Ｃ_２～Ｃ_３０、Ｃ_４～Ｃ_３０、Ｃ_２～Ｃ_２８、Ｃ_４～Ｃ_２８、Ｃ_２～Ｃ_２６、Ｃ_４～Ｃ_２６、Ｃ_２～Ｃ_２４、Ｃ_４～Ｃ_２４、Ｃ_６～Ｃ_２４、Ｃ_８～Ｃ_２４、Ｃ_１０～Ｃ_２４、Ｃ_２～Ｃ_２２、Ｃ_４～Ｃ_２２、Ｃ_６～Ｃ_２２、Ｃ_８～Ｃ_２２、Ｃ_１０～Ｃ_２２、Ｃ_２～Ｃ_２０、Ｃ_４～Ｃ_２０、Ｃ_６～Ｃ_２０、Ｃ_８～Ｃ_２０、Ｃ_１０～Ｃ_２０、Ｃ_２～Ｃ_１８、Ｃ_４～Ｃ_１８、Ｃ_６～Ｃ_１８、Ｃ_８～Ｃ_１８、Ｃ_１０～Ｃ_１８、Ｃ_１２～Ｃ_１８、Ｃ_１４～Ｃ_１８、Ｃ_１６～Ｃ_１８、Ｃ_２～Ｃ_１６、Ｃ_４～Ｃ_１６、Ｃ_６～Ｃ_１６、Ｃ_８～Ｃ_１６、Ｃ_１０～Ｃ_１６、Ｃ_１２～Ｃ_１６、Ｃ_１４～Ｃ_１６、Ｃ_２～Ｃ_１５、Ｃ_４～Ｃ_１５、Ｃ_６～Ｃ_１５、Ｃ_８～Ｃ_１５、Ｃ_９～Ｃ_１５、Ｃ_１０～Ｃ_１５、Ｃ_１１～Ｃ_１５、Ｃ_１２～Ｃ_１５、Ｃ_１３～Ｃ_１５、Ｃ_２～Ｃ_１４、Ｃ_４～Ｃ_１４、Ｃ_６～Ｃ_１４、Ｃ_８～Ｃ_１４、Ｃ_９～Ｃ_１４、Ｃ_１０～Ｃ_１４、Ｃ_１１～Ｃ_１４、Ｃ_１２～Ｃ_１４、Ｃ_２～Ｃ_１３、Ｃ_４～Ｃ_１３、Ｃ_６～Ｃ_１３、Ｃ_７～Ｃ_１３、Ｃ_８～Ｃ_１３、Ｃ_９～Ｃ_１３、Ｃ_１０～Ｃ_１３、Ｃ_１０～Ｃ_１３、Ｃ_１１～Ｃ_１３、Ｃ_２～Ｃ_１２、Ｃ_４～Ｃ_１２、Ｃ_６～Ｃ_１２、Ｃ_７～Ｃ_１２、Ｃ_８～Ｃ_１２、Ｃ_９～Ｃ_１２、Ｃ_１０～Ｃ_１２、Ｃ_２～Ｃ_１１、Ｃ_４～Ｃ_１１、Ｃ_６～Ｃ_１１、Ｃ_７～Ｃ_１１、Ｃ_８～Ｃ_１１、Ｃ_９～Ｃ_１１、Ｃ_２～Ｃ_１０、Ｃ_４～Ｃ_１０、Ｃ_２～Ｃ_９、Ｃ_４～Ｃ_９、Ｃ_２～Ｃ_８、Ｃ_２～Ｃ_７、Ｃ_４～Ｃ_７、Ｃ_２～Ｃ_６、又はＣ_４～Ｃ_６鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２、Ｃ_１３、Ｃ_１４、Ｃ_１５、Ｃ_１６、Ｃ_１７、Ｃ_１８、Ｃ_１９、Ｃ_２０、Ｃ_２１、Ｃ_２２、Ｃ_２３、Ｃ_２４、Ｃ_２５、Ｃ_２６、Ｃ_２７、Ｃ_２８、Ｃ_２９、Ｃ_３０、Ｃ_３１、Ｃ_３２、Ｃ_３３、Ｃ_３４、Ｃ_３５、Ｃ_３６、Ｃ_３７、Ｃ_３８、Ｃ_３９、Ｃ_４０、Ｃ_４１、Ｃ_４２、Ｃ_４３、Ｃ_４４、Ｃ_４５、Ｃ_４６、Ｃ_４７、Ｃ_４８、Ｃ_４９、Ｃ_５０、Ｃ_５１、Ｃ_５２、Ｃ_５３、Ｃ_５４、Ｃ_５５、Ｃ_５６、Ｃ_５７、Ｃ_５８、Ｃ_５９、又はＣ_６０鎖を有する。

【0341】

[0345]一部の態様では、アンカー部分は、２つの脂肪酸を含み、その各々は、前記範囲又は数の炭素原子のいずれか１つを有する鎖を有する脂肪酸から独立的に選択される。一部の態様では、脂肪酸のうちの１つは、独立的に、Ｃ６～Ｃ２１鎖を有する脂肪酸であり、１つは、独立的に、Ｃ１２～Ｃ３６鎖を有する脂肪酸である。一部の態様では、各脂肪酸は、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個の炭素原子の鎖を独立的に有する。

【0342】

[0346]好適な脂肪酸は、飽和直鎖脂肪酸、飽和分岐脂肪酸、不飽和脂肪酸、ヒドロキシ脂肪酸、及びポリカルボン酸を含む。一部の態様では、このような脂肪酸は、最大３２個の炭素原子を有する。

【0343】

[0347]有用な飽和直鎖脂肪酸の例としては、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ヘキサコサン酸、オクタコサン酸、トリアコンタン酸及びｎ－ドトリアコンタン酸などの偶数の炭素原子を有するもの、並びにプロピオン酸、ｎ－吉草酸、エナント酸、ペラルゴン酸、ヘンデカン酸、トリデカン酸、ペンタデカン酸、ヘプタデカン酸、ノナデカン酸、ヘネイコサン酸、トリコサン酸、ペンタコサン酸、及びヘプタコサン酸などの奇数の炭素原子を有するものが挙げられる。

【0344】

[0348]好適な飽和分岐脂肪酸の例としては、イソ酪酸、イソカプロン酸、イソカプリル酸、イソカプリン酸、イソラウリン酸、１１－メチルドデカン酸、イソミリスチン酸、１３－メチル－テトラデカン酸、イソパルミチン酸、１５－メチル－ヘキサデカン酸、イソステアリン酸、１７－メチルオクタデカン酸、イソアラキン酸、１９－メチル－エイコサン酸、α－エチル－ヘキサン酸、α－ヘキシルデカン酸、α－ヘプチルウンデカン酸、２－デシルテトラデカン酸、２－ウンデシルテトラデカン酸、２－デシルペンタデカン酸、２－ウンデシルペンタデカン酸、及びＦｉｎｅ ｏｘｏｃｏｌ１８００酸（日産化学工業株式会社（Ｎｉｓｓａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）の製品）が挙げられる。好適な飽和奇数炭素分岐脂肪酸としては、イソブチル基を末端に有するアンテイソ脂肪酸、例えば、６－メチル－オクタン酸、８－メチル－デカン酸、１０－メチル－ドデカン酸、１２－メチル－テトラデカン酸、１４－メチル－ヘキサデカン酸、１６－メチル－オクタデカン酸、１８－メチル－エイコサン酸、２０－メチル－ドコサン酸、２２－メチル－テトラコサン酸、２４－メチル－ヘキサコサン酸、及び２６－メチルオクタコサン酸が挙げられる。

【0345】

[0349]好適な不飽和脂肪酸の例としては、４－デセン酸、カプロレイン酸、４－ドデセン酸、５－ドデセン酸、ラウロレイン酸、４－テトラデセン酸、５－テトラデセン酸、９－テトラデセン酸、パルミトレイン酸、６－オクタデセン酸、オレイン酸、９－オクタデセン酸、１１－オクタデセン酸、９－エイコセン酸、ｃｉｓ－１１－エイコセン酸、セトオレイン酸、１３－ドコセン酸、１５－テトラコセン酸、１７－ヘキサコセン酸、６，９，１２，１５－ヘキサデカテトラエン酸、リノール酸、リノレン酸、α－エレオステアリン酸、β－エレオステアリン酸、プニカ酸、６，９，１２，１５－オクタデカテトラエン酸、パリナリン酸、５，８，１１，１４－エイコサテトラエン酸、５，８，１１，１４，１７－エイコサペンタエン酸、７，１０，１３，１６，１９－ドコサペンタエン酸、４，７，１０，１３，１６，１９－ドコサヘキサエン酸などが挙げられる。

【0346】

[0350]好適なヒドロキシ脂肪酸の例としては、α－ヒドロキシラウリン酸、α－ヒドロキシミリスチン酸、α－ヒドロキシパルミチン酸、α－ヒドロキシステアリン酸、ω－ヒドロキシラウリン酸、α－ヒドロキシアラキン酸、９－ヒドロキシ－１２－オクタデセン酸、リシノール酸、α－ヒドロキシベヘン酸、９－ヒドロキシ－ｔｒａｎｓ－１０，１２－オクタデカジエン酸、カモレン酸、イプロール酸、９，１０－ジヒドロキシステアリン酸、１２－ヒドロキシステアリン酸などが挙げられる。

【0347】

[0351]好適なポリカルボン酸の例としては、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、Ｄ，Ｌ－リンゴ酸などが挙げられる。

【0348】

[0352]一部の態様では、各脂肪酸は、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデシル酸、アラキジン酸、ヘンイコシル酸、ベヘン酸、トリコシル酸、リグノセリン酸、ペンタコシル酸、セロチン酸、ヘプタコシル酸、モンタン酸、ノナコシル酸、メリシン酸、ヘナトリアコンチル酸、ラセロン酸、サイリン酸、ゲド酸、セロプラスチック酸、ヘキサトリアコンチル酸（ｈｅｘａｔｒｉａｃｏｎｔｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、ヘプタトリアコンタン酸、又はオクタトリアコンタン酸から独立的に選択される。

【0349】

[0353]一部の態様では、各脂肪酸は、α－リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リノール酸、ガンマ－リノール酸、ジホモ－ガンマ－リノール酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、パルミトレイン酸、ワクセン酸、パウリン酸、オレイン酸、エライジン酸、ゴンド酸、エルカ酸、ネルボン酸、ミード酸、アドレン酸、ボソペンタエン酸、オズボンド酸、イワシ酸、ニシン酸、ドコサヘキサエン酸、若しくはテトラコサノールペンタエン酸、或いは別のモノ不飽和又は多価不飽和脂肪酸から独立的に選択される。

【0350】

[0354]一部の態様では、脂肪酸の一方又は両方が、必須脂肪酸である。特定の必須脂肪酸の有益な健康効果を考慮すると、開示された治療薬が負荷されたエクソソームの治療効果は、そのような脂肪酸を治療剤に含めることによって増加される場合がある。一部の態様では、必須脂肪酸は、リノレン酸、ガンマ－リノレン酸、ジホモ－ガンマ－リノレン酸、アラキドン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸ｎ－６、アルファ－リノレン酸、ステアリドン酸、２０：４ｎ－３酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸ｎ－３、又はドコサヘキサエン酸からなる群から選択されるｎ－６又はｎ－３必須脂肪酸である。

【0351】

[0355]一部の態様では、各脂肪酸は、ａｌｌ－ｃｉｓ－７，１０，１３－ヘキサデカトリエン酸、α－リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、テトラコサペンタエン酸、テトラコサヘキサエン酸、又はリポ酸から独立的に選択される。一部の態様では、脂肪酸は、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、又はリポ酸から選択される。脂肪酸の他の例としては、ａｌｌ－ｃｉｓ－７，１０，１３－ヘキサデカトリエン酸、α－リノレン酸（ＡＬＡ又はａｌｌ－ｃｉｓ－９，１２，１５－オクタデカトリエン酸）、ステアリドン酸（ＳＴＤ又はａｌｌ－ｃｉｓ－６、９，１２，１５－オクタデカテトラエン酸）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥ又はａｌｌ－ｃｉｓ－１１，１４，１７－エイコサトリエン酸）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ又はａｌｌ－ｃｉｓ－８，１１，１４，１７－エイコサテトラエン酸）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、クルパノドン酸又はａｌｌ－ｃｉｓ－７，１０，１３，１６，１９－ドコサペンタエン酸）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ又はａｌｌ－ｃｉｓ－４，７，１０，１３，１６，１９－ドコサヘキサエン酸）、テトラコサペンタエン酸（ａｌｌ－ｃｉｓ－９，１２，１５，１８，２１－ドコサヘキサエン酸）、又はテトラコサヘキサエン酸（ニシン酸又はａｌｌ－ｃｉｓ－６，９，１２，１５，１８，２１－テトラコセン酸）が挙げられる。一部の態様では、脂肪酸は、リポ酸などの中鎖脂肪酸である。

【0352】

[0356]脂肪酸鎖は、その鎖の長さが大きく異なり、鎖の長さによって、例えば短鎖から極長鎖まで分類され得る。短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は、炭素数が約５以下の鎖を有する脂肪酸である（例えば、酪酸）。一部の態様では、脂肪酸は、ＳＣＦＡである。中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）は、炭素数約６～１２の鎖を有する脂肪酸を含み、中鎖トリグリセリドを形成し得る。一部の態様では、脂肪酸は、ＭＣＦＡである。長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）は、炭素数１３～２１の鎖を有する脂肪酸を含む。一部の態様では、脂肪酸は、ＬＣＦＡである。一部の態様では、脂肪酸は、ＬＣＦＡである。極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）には、２２個以上の炭素、例えば、２２～６０、２２～５０、又は２２～４０個の炭素を有する脂肪酸が含まれる。一部の態様では、脂肪酸は、ＶＬＣＦＡである。

【0353】

ＩＩ．Ｇ．２．ｃ．リン脂質
[0357]一部の態様では、アンカー部分は、リン脂質を含む。リン脂質は、すべての細胞膜の主要な構成成分である脂質の分類である。これらは、その両親媒性特性のために脂質二重層を形成し得る。リン脂質分子の構造は、一般に、２つの疎水性脂肪酸「テール」とリン酸基からなる親水性「ヘッド」からなる。例えば、リン脂質は、以下の式：

【化8】

（式中、Ｒ_ｐは、リン脂質部分を表し、Ｒ_１及びＲ_２は、同一であっても異なっていてもよい不飽和を有するか又は有さない脂肪酸部分を表す）による脂質であり得る。

【0354】

[0358]リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択されてよい。

【0355】

[0359]特定のリン脂質は、脂質二重層、例えばエクソソーム膜の脂質二重層への融合を容易にし得る。例えば、カチオン性リン脂質は、膜の１つ又は複数の負に荷電したリン脂質と相互作用し得る。リン脂質の膜への融合は、脂質含有組成物のうちの１つ又は複数の要素が、膜に結合するか又は膜を通過するのを可能にし得る。

【0356】

[0360]脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択することができる。

【0357】

[0361]本開示のアンカー部分を使用するリン脂質は、天然又は非天然のリン脂質であり得る。分岐、酸化、環化、及びアルキンを含む修飾及び置換を有する天然種を含む非天然リン脂質種も企図される。例えば、リン脂質は、１つ又は複数のアルキン（例えば、１つ又は複数の二重結合が三重結合で置き換えられたアルケニル基）で官能基化されるか又はそれに架橋されていてもよい。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドに曝露されると、銅触媒による環化付加反応を起こし得る。

【0358】

[0362]リン脂質としては、以下に限定されないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジン酸などのグリセロリン脂質が挙げられる。

【0359】

ＩＩ．Ｇ．２．ｄ．リゾ脂質（例えば、リゾリン脂質）
[0363]一部の態様では、アンカー部分は、リゾ脂質、例えばリゾリン脂質を含む。リゾ脂質は、一方又は両方の脂肪アシル鎖が、一般には加水分解により除去された脂質の誘導体である。リゾリン脂質は、一方又は両方の脂肪アシル鎖が加水分解により除去されたリン脂質の誘導体である。

【0360】

[0364]一部の態様では、アンカー部分は、一方又は両方のアシル鎖が加水分解によって除去され、したがって、得られたリゾリン脂質が１つの脂肪酸アシル鎖を含むか又は脂肪酸アシル鎖を含まない、上に開示されているリン脂質のいずれかを含む。

【0361】

[0365]一部の態様では、アンカー部分は、リゾグリセロリン脂質、リゾグリコスフィンゴ脂質、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルイノシトール、又はリゾホスファチジルセリンを含む。

【0362】

ＩＩ．Ｇ．２．ｅ．ビタミン
[0366]一部の態様では、アンカー部分は、脂溶性ビタミン、例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ピリドキソン、ナイアシン、又はビタミンＫを含む。

【0363】

[0367]一部の態様では、アンカー部分は、ビタミンＡを含む。ビタミンＡは、レチノール、レチナール、レチノイン酸、及びいくつかのプロビタミンＡカロテノイド（特にベータカロテン）を含む不飽和栄養有機化合物の一群である。一部の態様では、アンカー部分は、レチノールを含む。一部の態様では、アンカー部分は、レチノイドを含む。レチノイドは、ビタミンＡのビタマーである化学的化合物の分類であるか又はそれに化学的に関連する。一部の態様では、アンカー部分は、第１世代のレチノイド（例えば、レチノール、トレチノイン、イソトレアチノイン、又はアリトレチノイン）、第２世代のレチノイド（例えば、エトレチネート又はアシトレチン）、第３世代のレチノイド（例えば、アダパレン、ベキサロテン、又はタザロテン）、又はこれらの任意の組合せを含む。

【0364】

ＩＩ．Ｇ．３ リンカーの組合せ
[0368]一部の態様では、ペイロード（例えば、ＡＳＯ）（又は本明細書に記載の目的の任意の他の部分）は、リンカーの組合せを介して本明細書で開示されているアンカー部分に連結されている。ある特定の態様では、リンカーの組合せは、複数の（例えば、２つ以上の）切断性リンカーを含む。ある特定の態様では、リンカーの組合せは、複数の（例えば、２つ以上の）非切断性リンカーを含む。一部の態様では、リンカーの組合せは、複数の（例えば、２つ以上の）非切断性リンカー及び切断性リンカーを含む。

【0365】

[0369]リンカーは、切断を受けやすく（「切断性リンカー」）、それによって、生物学的に活性な分子（例えば、ペイロード）の放出を容易にし得る。よって、一部の態様では、本明細書で開示されているリンカーの組合せは、切断性リンカーを含み得る。このような切断性リンカーは、例えば、生物学的に活性な分子（例えば、ペイロード、例えば、ＡＳＯ）が活性なままである条件で、酸誘導性切断、光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断、活性酸素種誘導性切断、ジセレニド結合切断、及びジスルフィド結合切断を受けやすい可能性がある。或いは、リンカーは、切断に対して実質的に耐性である場合がある（「非切断性リンカー」）。一部の態様では、切断性リンカーは、スペーサーを含む。一部の態様では、スペーサーは、ＰＥＧである。

【0366】

[0370]一部の態様では、リンカーの組合せは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、若しくは少なくとも６個又はそれより多い本明細書で開示されている様々なリンカーを含む。一部の態様では、リンカーの組合せにおけるリンカーは、エステル連結（例えば、ホスホジエステル又はホスホロチオエートエステル）によって連結され得る。

【0367】

[0371]一部の態様では、リンカーは、アンカー部分とペイロード（例えばＡＳＯ）との間の直接結合である。

【0368】

ＩＩ．Ｇ．３．ａ 非切断性リンカー
[0372]一部の態様では、リンカーの組合せは、非切断性リンカーを含む。「非切断性リンカー」は、本開示の修飾された生物学的に活性な分子の２つ以上の構成成分（例えば、生物学的に活性な分子及びアンカー部分；生物学的に活性な分子及び切断性リンカー；アンカー部分及び切断性リンカー）を安定な共有結合様式で連結することができ、切断性リンカーについて上に列挙したカテゴリーに該当しない任意の化学的部分である。よって、非切断性リンカーは、酸誘導性切断、光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断及びジスルフィド結合の切断に対して実質的に耐性である。

【0369】

[0373]さらに、非切断性は、環状ジヌクレオチド及び／又は抗体がその活性を失わない条件下で、酸、感光性切断剤、ペプチダーゼ、エステラーゼ、又はジスルフィド結合を切断する化学的若しくは生理学的化合物によって誘導される切断に耐える、リンカー又はリンカーに隣接する化学結合の能力を指す。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、別のリンカー、例えば、自己犠牲リンカーを介してリンカーに結合されている。

【0370】

[0374]一部の態様では、リンカーの組合せは、例えば、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、スクシンイミド、又はこれらの任意の組合せを含む非切断性リンカーを含む。一部の態様では、非切断性リンカーは、生物学的に活性な分子を非切断性リンカーに連結させるスペーサー単位を含む。

【0371】

[0375]一部の態様では、１つ又は複数の非切断性リンカーは、一緒に連結したより小さい単位（例えば、ＨＥＧ、ＴＥＧ、グリセロール、Ｃ２～Ｃ１２アルキルなど）を含む。一態様では、連結は、エステル連結（例えば、ホスホジエステル又はホスホロチオエートエステル）又は他の連結である。

【0372】

ＩＩ．Ｇ．３．ａ．１ エチレングリコール（ＨＥＧ、ＴＥＧ、ＰＥＧ）
[0376]一部の態様では、リンカーの組合せは、非切断性リンカーを含み、非切断性リンカーは、式Ｒ^３－（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｎ－又はＲ^３－（０－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｎ－Ｏ－（Ｒ^３は、水素、メチル又はエチルであり、ｎは２～２００の値を有する）によって特徴付けられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。一部の態様では、リンカーはスペーサーを含み、スペーサーはＰＥＧである。

【0373】

[0377]一部の態様では、ＰＥＧリンカーは、オリゴ－エチレングリコール、例えば、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ペンタエチレングリコール、又はヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）リンカーである。

【0374】

[0378]一部の態様では、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８９、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、又は２００の値を有する。

【0375】

[0379]一部の態様では、ｎは、２～１０の間、１０～２０の間、２０～３０の間、３０～４０の間、４０～５０の間、５０～６０の間、６０～７０の間、７０～８０の間、８０～９０の間、９０～１００の間、１００～１１０の間、１１０～１２０の間、１２０～１３０の間、１３０～１４０の間、１４０～１５０の間、１５０～１６０の間、１６０～１７０の間、１７０～１８０の間、１８０～１９０の間、又は１９０～２００の間である。

【0376】

[0380]一部の具体的態様では、ｎは、３～２００、３～２０、１０～３０、又は９～４５の値を有する。

【0377】

[0381]一部の態様では、ＰＥＧは、分岐ＰＥＧである。分岐ＰＥＧは、中央のコア基から出ている３～１０本のＰＥＧ鎖を有する。

【0378】

[0382]ある特定の態様では、ＰＥＧ部分は、単分散ポリエチレングリコールである。本開示の文脈では、単分散ポリエチレングリコール（ｍｄＰＥＧ）は、単一の、規定された鎖長及び分子量を有するＰＥＧである。ｍｄＰＥＧは、典型的には、クロマトグラフィーによる重合混合物からの分離によって生成される。特定の式では、単分散ＰＥＧ部分にはｍｄＰＥＧの略号が付与される。

【0379】

[0383]一部の態様では、ＰＥＧは、Ｓｔａｒ ＰＥＧである。Ｓｔａｒ ＰＥＧは、中央のコア基から出ている１０～１００本のＰＥＧ鎖を有する。

【0380】

[0384]一部の態様では、ＰＥＧは、Ｃｏｍｂ ＰＥＧである。Ｃｏｍｂ ＰＥＧは、ポリマー骨格に通常グラフトされた複数のＰＥＧ鎖を有する。

【0381】

[0385]ある特定の態様では、ＰＥＧは、１００ｇ／ｍｏｌ～３０００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００ｇ／ｍｏｌ～２５００ｇ／ｍｏｌの間、より詳細にはおよそ１００ｇ／ｍｏｌ～２０００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有する。ある特定の態様では、ＰＥＧは、２００ｇ／ｍｏｌ～３０００ｇ／ｍｏｌの間、特に３００ｇ／ｍｏｌ～２５００ｇ／ｍｏｌの間、より詳細にはおよそ４００ｇ／ｍｏｌ～２０００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有する。

【0382】

[0386]一部の態様では、ＰＥＧは、ＰＥＧ_１００、ＰＥＧ_２００、ＰＥＧ_３００、ＰＥＧ_４００、ＰＥＧ_５００、ＰＥＧ_６００、ＰＥＧ_７００、ＰＥＧ_８００、ＰＥＧ_９００、ＰＥＧ_１０００、ＰＥＧ_１１００、ＰＥＧ_１２００、ＰＥＧ_１３００、ＰＥＧ_１４００、ＰＥＧ_１５００、ＰＥＧ_１６００、ＰＥＧ_１７００、ＰＥＧ_１８００、ＰＥＧ_１９００、ＰＥＧ_２０００、ＰＥＧ_２１００、ＰＥＧ_２２００、ＰＥＧ_２３００、ＰＥＧ_２４００、ＰＥＧ_２５００、ＰＥＧ_１６００、ＰＥＧ_１７００、ＰＥＧ_１８００、ＰＥＧ_１９００、ＰＥＧ_２０００、ＰＥＧ_２１００、ＰＥＧ_２２００、ＰＥＧ_２３００、ＰＥＧ_２４００、ＰＥＧ_２５００、ＰＥＧ_２６００、ＰＥＧ_２７００、ＰＥＧ_２８００、ＰＥＧ_２９００、又はＰＥＧ_３０００である。ある特定の態様では、ＰＥＧは、ＰＥＧ_４００である。ある特定の態様では、ＰＥＧは、ＰＥＧ_２０００である。

【0383】

[0387]一部の態様では、本開示のリンカーの組合せは、いくつかのＰＥＧリンカー、例えば、ＰＥＧ、ＨＥＧ、又はＴＥＧリンカーに隣接した切断性リンカーを含み得る。

【0384】

[0388]一部の態様では、リンカーの組合せは、（ＨＥＧ）ｎ及び／又は（ＴＥＧ）ｎを含み、ｎは、１～５０の間の整数であり、各単位は、例えば、リン酸エステルリンカー、ホスホロチオエートエステル連結、又はこれらの組合せを介して接続されている。

【0385】

ＩＩ．Ｇ．３．ａ．２．グリセロール及びポリグリセロール（ＰＧ）
[0389]一部の態様では、リンカーの組合せは、グリセロール単位又は式（（Ｒ_３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＨ－ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－）に記載のポリグリセロール（ＰＧ）を含む非切断性リンカーを含み、Ｒ３は、水素、メチル又はエチルであり、ｎは、３～２００の値を有する。一部の態様では、ｎは３～２０の値を有する。一部の態様では、ｎは１０～３０の値を有する。

【0386】

[0390]一部の態様では、ＰＧリンカーは、ジグリセロール、トリグリセロール、テトラグリセロール（ＴＧ）、ペンタグリセロール、又はヘキサグリセロール（ＨＧ）リンカーである。

【0387】

[0391]一部の態様では、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８９、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、又は２００の値を有する。

【0388】

[0392]一部の態様では、ｎは、２～１０の間、１０～２０の間、２０～３０の間、３０～４０の間、４０～５０の間、５０～６０の間、６０～７０の間、７０～８０の間、８０～９０の間、９０～１００の間、１００～１１０の間、１１０～１２０の間、１２０～１３０の間、１３０～１４０の間、１４０～１５０の間、１５０～１６０の間、１６０～１７０の間、１７０～１８０の間、１８０～１９０の間、又は１９０～２００の間である。

【0389】

[0393]これらの態様の一部の代替では、ｎは９～４５の値を有する。一部の態様では、異種部分は、式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＲ^５－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）に記載の分岐ポリグリセロールであり、Ｒ^５は、水素又は式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＨ－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）に記載の直鎖グリセロール鎖であり、Ｒ^３は、水素、メチル又はエチルである。一部の態様では、異種部分は、式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＲ^５－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）に記載の多分岐ポリグリセロールであり、Ｒ^５は、水素又は式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＲ^６－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）に記載のグリセロール鎖であり、Ｒ６は、水素又は式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＲ^７－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）に記載のグリセロール鎖であり、Ｒ^７は、水素又は式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＨ－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）に記載の直鎖グリセロール鎖であり、Ｒ^３は、水素、メチル又はエチルである。多分岐グリセロール及びその合成方法は、Ｏｕｄｓｈｏｒｎら（２００６） Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２７：５４７１～５４７９頁；Ｗｉｌｍｓら（２０１００ Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ４３、１２９～４１頁、及びそれらにおいて引用される参照文献に記載されている。

【0390】

[0394]ある特定の態様では、ＰＧは、１００ｇ／ｍｏｌ～３０００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００ｇ／ｍｏｌ～２５００ｇ／ｍｏｌの間、より詳細にはおよそ１００ｇ／ｍｏｌ～２０００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有する。ある特定の態様では、ＰＧは、２００ｇ／ｍｏｌ～３０００ｇ／ｍｏｌの間、特に３００ｇ／ｍｏｌ～２５００ｇ／ｍｏｌの間、より詳細にはおよそ４００ｇ／ｍｏｌ～２０００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有する。

【0391】

[0395]一部の態様では、ＰＧは、ＰＧ_１００、ＰＧ_２００、ＰＧ_３００、ＰＧ_４００、ＰＧ_５００、ＰＧ_６００、ＰＧ_７００、ＰＧ_８００、ＰＧ_９００、ＰＧ_１０００、ＰＧ_１１００、ＰＧ_１２００、ＰＧ_１３００、ＰＧ_１４００、ＰＧ_１５００、ＰＧ_１６００、ＰＧ_１７００、ＰＧ_１８００、ＰＧ_１９００、ＰＧ_２０００、ＰＧ_２１００、ＰＧ_２２００、ＰＧ_２３００、ＰＧ_２４００、ＰＧ_２５００、ＰＧ_１６００、ＰＧ_１７００、ＰＧ_１８００、ＰＧ_１９００、ＰＧ_２０００、ＰＧ_２１００、ＰＧ_２２００、ＰＧ_２３００、ＰＧ_２４００、ＰＧ_２５００、ＰＧ_２６００、ＰＧ_２７００、ＰＧ_２８００、ＰＧ_２９００、又はＰＧ_３０００である。特定の一態様では、ＰＧは、ＰＧ_４００である。別の特定の態様では、ＰＧは、ＰＧ_２０００である。

【0392】

[0396]一部の態様では、リンカーの組合せは、（グリセロール）ｎ、及び／又は（ＨＧ）ｎ及び／又は（ＴＧ）ｎを含み、ｎは、１～５０の間の整数であり、各単位は、例えば、リン酸エステルリンカー、ホスホロチオエートエステル連結、又はこれらの組合せを介して接続されている。

【0393】

ＩＩ．Ｇ．３．ａ．３．脂肪族（アルキル）リンカー
[0397]一部の態様では、リンカーの組合せは、例えば、プロピル、ブチル、ヘキシル、又はＣ２～Ｃ１０アルキル若しくはＣ２～Ｃ６アルキルなどのＣ２～Ｃ１２アルキルの少なくとも１つの脂肪族（アルキル）リンカーを含む。

【0394】

[0398]一部の態様では、リンカーの組合せは、アルキル鎖、例えば、非置換アルキルを含む。一部の態様では、リンカーの組合せは、置換又は非置換のアルケニル、置換又は非置換のアルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルレイアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、又はアルケニルヘテロシクリルアルキニルを含む。

【0395】

[0399]これらの構成成分は任意選択的に置換されている。置換は、アルコール、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、及びプロポキシ）、直鎖若しくは分岐鎖アルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ１２アルキル）、アミン、アミノアルキル（例えば、アミノＣ１～Ｃ１２アルキル）、ホスホラミダイト、ホスフェート、ホスホロアミデート、ホスホロジチオエート、チオホスフェート、ヒドラジド、ヒドラジン、ハロゲン、（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）、アミド、アルキルアミド（例えば、アミドＣ１～Ｃ１２アルキル）、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物、カルボン酸ハロゲン化物、エーテル、ハロゲン化スルホニル、イミデートエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロホルメート、カルボジイミド付加物、アルデヒド、ケトン、スルフヒドリル、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホネート、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝Ｏ）（マレイミド）、チオエーテル、シアノ、糖（例えば、マンノース、ガラクトース、及びグルコース）、α，β－不飽和カルボニル、アルキル水銀、又はα，β－不飽和スルホンを含む。

【0396】

[0400]脂肪族リンカーの例としては、以下の構造を含む：
－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－
－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－
－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－
－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－
－Ｓ－（ＣＨ_２）_ｎ１－
－ＣＯ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＣＯ－
－ＣＯ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＮＨ－
－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＮＨ－
－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＮＨ－Ｃ－（＝Ｓ）－
－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－Ｃ－（＝Ｓ）－
－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－Ｃ－（＝Ｓ）－
－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－Ｃ－（＝Ｓ）－
－ＮＨ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ２－ＣＨ（ＣＨ_２ＯＨ）－
－ＮＨ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ２－ＣＨ_２－
－ＮＨ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ２－ＣＨ_２－ＣＯ－
－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ３－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ_２）_ｎ４－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）_２－
－ＣＯ－（ＣＨ_２）_ｎ３－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ４－
－ＣＯ－（ＣＨ_２）_ｎ３－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ４－
－（ＣＨ２）_ｎ１ＮＨ－
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）_ｎ１ＮＨ－
－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）_ｎ１－Ｃ（Ｏ）－
－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）_ｎ１－Ｃ（Ｏ）Ｏ－
－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－
－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）_ｎ１－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－
－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）_ｎ１－
－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－
－Ｃ（Ｏ）－
－（ＣＨ２）_ｎ１－Ｃ（Ｏ）－
－（ＣＨ２）_ｎ１－Ｃ（Ｏ）Ｏ－
－（ＣＨ２）_ｎ１－
－（ＣＨ２）_ｎ１－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－
ｎ１は、１～４０の間の整数（例えば、２～２０、又は２～１２）であり；ｎ２は、１～２０の間の整数（例えば、１～１０、又は１～６）であり；ｎ３及びｎ４は、同一であっても異なっていてもよく、１～２０の間の整数（例えば、１～１０、又は１～６）である。

【0397】

[0401]一部の態様では、リンカーの組合せは、（Ｃ３）ｎ、（Ｃ４）ｎ、（Ｃ５）ｎ、（Ｃ６）ｎ、（Ｃ７）ｎ、若しくは（Ｃ８）ｎ、又はこれらの組合せを含み、ｎは、１～５０の間の整数であり、各単位は、例えば、リン酸エステルリンカー、ホスホロチオエートエステル連結、又はこれらの組合せを介して接続されている。

【0398】

ＩＩ．Ｇ．３．ｂ．切断性リンカー
[0402]一部の態様では、リンカーの組合せは、切断性リンカーを含む。用語「切断性リンカー」は、破壊又は切断され得る少なくとも１つの連結又は化学結合を含むリンカーを指す。切断は、例えば、ヌクレアーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、エステラーゼ、若しくはレダクターゼによって、例えば、又は特定の生理化学条件、例えば、酸化還元環境、ｐＨ、活性酸素種の存在、若しくは特定の光波長によって媒介されてもよい。

【0399】

[0403]一部の態様では、切断性リンカーは、ジヌクレオチド若しくはトリヌクレオチド若しくはテトラペプチドリンカー、ジスルフィド、ジセレニド、イミン、ベータ－カルボン酸アミド、チオケタール、ｖａｌ－ｃｉｔジペプチド、グルタミン酸－バリン－シトルリントリペプチド、グリシン－ヒスチジン－ロイシン－グリシンテトラペプチド、又はこれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、切断性リンカーは、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメート又はバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートを含む。

【0400】

ＩＩ．Ｂ．４．特定の例及びトポロジー
[0404]本開示の特定の態様では、リンカーの組合せは、式
［アルキルリンカー］ｍ－［ＰＥＧ１］ｎ－［ＰＥＧ２］ｏ
（式中、ｍ、ｎ、及びｏは、０又は１であり、ｍ、ｎ、及びｏの少なくとも１つはゼロではない）
のリンカーからなる。このような式による例示的なリンカーの組合せは、Ｃ６－ＴＥＧ－ＨＥＧ、Ｃ６－ＨＥＧ、Ｃ６－ＴＥＧ、Ｃ６、ＴＥＧ－ＨＥＧ、ＴＥＧ、Ｃ８－ＴＥＧ－ＨＥＧ、Ｃ８－ＨＥＧ、Ｃ８－ＴＥＧ、及びＣ８である。

【0401】

[0405]一部の態様では、リンカーの組合せは、１つ又は複数の切断性リンカー、例えば、酵素切断性リンカー及び自己犠牲リンカーと組み合わせて、非切断性リンカー（例えば、ＴＥＧ又はＨＥＧ）を含む。

【0402】

[0406]具体的な態様では、リンカーの組合せは、以下に示されているように、リンカーの組合せＴＥＧ（非切断性リンカー）－Ｖａｌ－Ｃｉｔ（切断性リンカー）－ｐＡＢ（自己犠牲リンカー）を含む。

【化9】

【0403】

[0407]アンカー部分とリンカーの組合せとの具体的な組合せは、以下の表に例示されている。

【0404】

【表2】

【0405】

【表3】

【0406】

[0408]本開示にとって有用な具体的なペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、以下に例示されている：
［コレステロール］－［ＴＥＧ］－［ＨＥＧ］－［ＡＳＯ］

【化10】

［コレステロール］－［ＳＭａｌ］－［Ｖａｌ－Ｃｉｔ］－［ｐＡＢ］－［ＡＳＯ］

【化11】

［コレステロール］－［ＴＥＧ］－［Ｖａｌ－Ｃｉｔ］－［Ｃ６］－［ＡＳＯ］

【化12】

［コレステロール］－［ＴＥＧ］－［ＳＳ］－［Ｃ６］－［ＡＳＯ］

【化13】

ここで、［コレステロール］は、コレステロールアンカー部分であり、［ＴＥＧ］は、ＴＥＧ非切断性リンカーであり、［ＨＥＧ］は、ＨＥＧ非切断性リンカーであり、［ＳＳ］は、ジスルフィド酸化還元切断性リンカーであり、［Ｃ６］は、アルキル非切断性リンカーであり、［ＳＭａｌ］は、Ｓ－マレイミドであり、［Ｖａｌ－Ｃｉｔ］は、バリン－シトルリン切断性リンカーであり、［ｐＡＢ］は、ｐＡＢ自己犠牲リンカーである。一部の態様では、ペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、上記で提供される例示的な構造による構造を有し、ここで、１つ又は複数の構成成分は、例に示されたものと同じ分類の構成成分によって置き換えられている。例えば、［コレステロール］アンカー部分は、本明細書で開示されている別のアンカー部分によって置換され得るか、［ＴＥＧ］は、本明細書で開示されている別のポリマー非切断性リンカー（例えば、ＨＥＧ、ＰＥＧ、ＰＧ）によって置換され得るか、［Ｖａｌ－Ｃｉｔ］は、別のペプチダーゼ切断性リンカーによって置き換えられ得るか、又は［ｐＡＢ］は、別の自己犠牲リンカーによって置換され得る。

【0407】

ＩＩＩ．ＥＶ
[0409]一部の態様では、本開示は、目的の部分（例えば、ペイロード、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）が増量するように修飾されたＥＶを提供する。例えば、本開示の他の箇所でさらに記載されているように、本明細書に記載の負荷条件（例えば、記載された塩濃度、負荷温度、負荷期間、ペイロード供給濃度、及び／又はＥＶ供給濃度）で、ＥＶにペイロード（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を負荷することにより、ＥＶ中のペイロードの負荷を増加させることができる。したがって、一部の態様では、本明細書に記載のＥＶはペイロードを含み、ＥＶの外側表面に関連するペイロードの量（例えば、ペイロード濃度）は、参照ＥＶ（例えば、本明細書に記載の負荷方法を使用して修飾されなかったＥＶ）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、又は少なくとも約５０倍以上、増加している。

【0408】

[0410]一部の態様では、本開示のＥＶは、ＥＶの外側表面にペイロードを含み、ＥＶの外側表面のペイロードの数は、少なくとも約１，０００個、少なくとも約２，０００個、少なくとも約３，０００個、少なくとも約４，０００個、少なくとも約５，０００個、少なくとも約６，０００個、少なくとも約７，０００個、少なくとも約８，０００個、少なくとも約９，０００個、少なくとも約１０，０００個、少なくとも約１１，０００個、少なくとも約１２，０００個、少なくとも約１３，０００個、少なくとも約１４，０００個、少なくとも約１５，０００個、少なくとも約１６，０００個、少なくとも約１７，０００個、少なくとも約１８，０００個、少なくとも約１９，０００個、少なくとも約２０，０００個、少なくとも約２１，０００個、少なくとも約２２，０００個、少なくとも約２３，０００個、少なくとも約２４，０００個、少なくとも約２５，０００個、少なくとも約３０，０００個、少なくとも約３５，０００個、少なくとも約４０，０００個、少なくとも約４５，０００個、又は少なくとも約５０，０００個である。一部の態様では、ＥＶの外側表面のペイロードの数は、約５，０００～約２０，０００個の間、約６，０００～約２０，０００個の間、約７，０００～約２０，０００個の間、約８，０００～約２０，０００個の間、約９，０００～約２０，０００個の間、約１０，０００～約２０，０００個の間、約５，０００～約１８，０００個の間、約６，０００～約１８，０００個の間、約７，０００～約１８，０００個の間、約８，０００～約１８，０００個の間、約９，０００～約１８，０００個の間、約１０，０００～約１８，０００個の間、約５，０００～約１５，０００個の間、約６，０００～約１５，０００個の間、約７，０００～約１５，０００個の間、約８，０００～約１５，０００個の間、約９，０００～約１５，０００個の間、又は約１０，０００～約１５，０００個の間である。一部の態様では、ＥＶの外側表面のペイロードの数は、約１０，０００～約１５，０００個の間である。

【0409】

[0411]一部の態様では、ＥＶの外側表面のペイロードは各々は同一である。一部の態様では、ＥＶの外側表面のペイロードのうちの１つ又は複数は異なっている。本明細書に記載されているように、一部の態様では、本開示のＥＶは、１つ又は複数のさらなるペイロードを含み得る。ある特定の態様では、１つ又は複数のさらなるペイロードは、ＥＶの外側表面に関連するか、ＥＶの内腔表面に関連するか、又はこれらの組合せで、ＥＶの内腔に存在し得る（すなわち、封入され得る）。

【0410】

[0412]本明細書に記載されているように、本開示にとって有用なＥＶは、約２０～３００ｎｍの間の直径を有し得る。ある特定の態様では、本開示のＥＶは、約２０～２９０ｎｍ、２０～２８０ｎｍ、２０～２７０ｎｍ、２０～２６０ｎｍ、２０～２５０ｎｍ、２０～２４０ｎｍ、２０～２３０ｎｍ、２０～２２０ｎｍ、２０～２１０ｎｍ、２０～２００ｎｍ、２０～１９０ｎｍ、２０～１８０ｎｍ、２０～１７０ｎｍ、２０～１６０ｎｍ、２０～１５０ｎｍ、２０～１４０ｎｍ、２０～１３０ｎｍ、２０～１２０ｎｍ、２０～１１０ｎｍ、２０～１００ｎｍ、２０～９０ｎｍ、２０～８０ｎｍ、２０～７０ｎｍ、２０～６０ｎｍ、２０～５０ｎｍ、２０～４０ｎｍ、２０～３０ｎｍ、３０～３００ｎｍ、３０～２９０ｎｍ、３０～２８０ｎｍ、３０～２７０ｎｍ、３０～２６０ｎｍ、３０～２５０ｎｍ、３０～２４０ｎｍ、３０～２３０ｎｍ、３０～２２０ｎｍ、３０～２１０ｎｍ、３０～２００ｎｍ、３０～１９０ｎｍ、３０～１８０ｎｍ、３０～１７０ｎｍ、３０～１６０ｎｍ、３０～１５０ｎｍ、３０～１４０ｎｍ、３０～１３０ｎｍ、３０～１２０ｎｍ、３０～１１０ｎｍ、３０～１００ｎｍ、３０～９０ｎｍ、３０～８０ｎｍ、３０～７０ｎｍ、３０～６０ｎｍ、３０～５０ｎｍ、３０～４０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、４０～２９０ｎｍ、４０～２８０ｎｍ、４０～２７０ｎｍ、４０～２６０ｎｍ、４０～２５０ｎｍ、４０～２４０ｎｍ、４０～２３０ｎｍ、４０～２２０ｎｍ、４０～２１０ｎｍ、４０～２００ｎｍ、４０～１９０ｎｍ、４０～１８０ｎｍ、４０～１７０ｎｍ、４０～１６０ｎｍ、４０～１５０ｎｍ、４０～１４０ｎｍ、４０～１３０ｎｍ、４０～１２０ｎｍ、４０～１１０ｎｍ、４０～１００ｎｍ、４０～９０ｎｍ、４０～８０ｎｍ、４０～７０ｎｍ、４０～６０ｎｍ、４０～５０ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２９０ｎｍ、５０～２８０ｎｍ、５０～２７０ｎｍ、５０～２６０ｎｍ、５０～２５０ｎｍ、５０～２４０ｎｍ、５０～２３０ｎｍ、５０～２２０ｎｍ、５０～２１０ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１９０ｎｍ、５０～１８０ｎｍ、５０～１７０ｎｍ、５０～１６０ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、５０～１４０ｎｍ、５０～１３０ｎｍ、５０～１２０ｎｍ、５０～１１０ｎｍ、５０～１００ｎｍ、５０～９０ｎｍ、５０～８０ｎｍ、５０～７０ｎｍ、５０～６０ｎｍ、６０～３００ｎｍ、６０～２９０ｎｍ、６０～２８０ｎｍ、６０～２７０ｎｍ、６０～２６０ｎｍ、６０～２５０ｎｍ、６０～２４０ｎｍ、６０～２３０ｎｍ、６０～２２０ｎｍ、６０～２１０ｎｍ、６０～２００ｎｍ、６０～１９０ｎｍ、６０～１８０ｎｍ、６０～１７０ｎｍ、６０～１６０ｎｍ、６０～１５０ｎｍ、６０～１４０ｎｍ、６０～１３０ｎｍ、６０～１２０ｎｍ、６０～１１０ｎｍ、６０～１００ｎｍ、６０～９０ｎｍ、６０～８０ｎｍ、６０～７０ｎｍ、７０～３００ｎｍ、７０～２９０ｎｍ、７０～２８０ｎｍ、７０～２７０ｎｍ、７０～２６０ｎｍ、７０～２５０ｎｍ、７０～２４０ｎｍ、７０～２３０ｎｍ、７０～２２０ｎｍ、７０～２１０ｎｍ、７０～２００ｎｍ、７０～１９０ｎｍ、７０～１８０ｎｍ、７０～１７０ｎｍ、７０～１６０ｎｍ、７０～１５０ｎｍ、７０～１４０ｎｍ、７０～１３０ｎｍ、７０～１２０ｎｍ、７０～１１０ｎｍ、７０～１００ｎｍ、７０～９０ｎｍ、７０～８０ｎｍ、８０～３００ｎｍ、８０～２９０ｎｍ、８０～２８０ｎｍ、８０～２７０ｎｍ、８０～２６０ｎｍ、８０～２５０ｎｍ、８０～２４０ｎｍ、８０～２３０ｎｍ、８０～２２０ｎｍ、８０～２１０ｎｍ、８０～２００ｎｍ、８０～１９０ｎｍ、８０～１８０ｎｍ、８０～１７０ｎｍ、８０～１６０ｎｍ、８０～１５０ｎｍ、８０～１４０ｎｍ、８０～１３０ｎｍ、８０～１２０ｎｍ、８０～１１０ｎｍ、８０～１００ｎｍ、８０～９０ｎｍ、９０～３００ｎｍ、９０～２９０ｎｍ、９０～２８０ｎｍ、９０～２７０ｎｍ、９０～２６０ｎｍ、９０～２５０ｎｍ、９０～２４０ｎｍ、９０～２３０ｎｍ、９０～２２０ｎｍ、９０～２１０ｎｍ、９０～２００ｎｍ、９０～１９０ｎｍ、９０～１８０ｎｍ、９０～１７０ｎｍ、９０～１６０ｎｍ、９０～１５０ｎｍ、９０～１４０ｎｍ、９０～１３０ｎｍ、９０～１２０ｎｍ、９０～１１０ｎｍ、９０～１００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１１０～２９０ｎｍ、１２０～２８０ｎｍ、１３０～２７０ｎｍ、１４０～２６０ｎｍ、１５０～２５０ｎｍ、１６０～２４０ｎｍ、１７０～２３０ｎｍ、１８０～２２０ｎｍ、又は１９０～２１０ｎｍの間の直径を有する。本明細書に記載のＥＶのサイズは、当技術分野で公知の方法によって測定することができる。

【0411】

[0413]一部の態様では、本明細書に記載のＥＶは、内側（内腔）表面と外側表面とを含む、二重脂質膜を含む。ある特定の態様では、内側（内腔）表面は、ＥＶの内部コア（すなわち、内腔）に面する。ある特定の態様では、外側表面（本明細書において、「外部表面」とも称される）は、産生細胞又は標的細胞のエンドソーム、多小胞体、又は膜／細胞質と接触し得る。

【0412】

[0414]一部の態様では、ＥＶ膜は、脂質及び脂肪酸を含む。一部の態様では、ＥＶは、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、及びホスファチジルセリンを含む。

【0413】

[0415]一部の態様では、ＥＶ膜は、内層及び外層を含む。内層及び外層の組成は、当技術分野で公知の二重層間分配アッセイによって決定することができ、例えば、Ｋｕｙｐｅｒｓら、Ｂｉｏｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ８１９：１７０頁（１９８５）を参照されたい。一部の態様では、外層の組成は、およそ７０～９０％の間のコリンリン脂質、およそ０～１５％の間の酸性リン脂質、及びおよそ５～３０％の間のホスファチジルエタノールアミンである。一部の態様では、内層の組成は、およそ１５～４０％の間のコリンリン脂質、およそ１０～５０％の間の酸性リン脂質、及びおよそ３０～６０％の間のホスファチジルエタノールアミンである。

【0414】

[0416]一部の態様では、ＥＶ膜は、グリカンなどの１つ又は複数の多糖類を含む。ＥＶの表面のグリカンは、マレイミド部分又はグリカンとマレイミド部分を接続するリンカーへの付着物として機能し得る。グリカンは、ＥＶの表面の１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＰＴＧＦＲＮポリペプチド、又はＥＶの脂質膜上に存在し得る。

【0415】

ＩＩＩ．Ａ．ＥＶ膜貫通ドメイン
[0417]一部の態様では、本開示にとって有用なＥＶは、１つ又は複数のＥＶ膜貫通タンパク質（本明細書において、「エクソソームタンパク質」又は「ＥＶタンパク質」とも称される）を含む。

【0416】

[0418]ある特定の態様では、１つ又は複数の膜貫通タンパク質は、トランスフェクションによってＥＶに導入される。一部の態様では、１つ又は複数の膜貫通タンパク質は、カチオン性の脂質及びポリマーなどの合成巨大分子を使用してＥＶ中に導入され得る（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８～Ｓ１３０頁（２００５））。ある特定の態様では、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、又はポリブレンなどの化学物質は、１つ又は複数の膜貫通タンパク質をＥＶに導入するために使用することができる。

【0417】

[0419]一部の態様では、１つ又は複数の膜貫通タンパク質は、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＣＤ４９、ＣＤ４０、ＣＤ１３３、ＣＤ５９、グリピカン－１、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、インテグリン、セレクチン、レクチン、カドヘリン、当業者に公知の他の類似ポリペプチド、又はこれらの任意の組合せであり得る。

【0418】

[0420]一部の態様では、１つ又は複数の膜貫通タンパク質は、産生細胞において膜貫通タンパク質を組換え発現させることによって、ＥＶの膜に発現される。産生細胞から得られたＥＶは、マレイミド部分又はリンカーにコンジュゲートされるようにさらに修飾することができる。

【0419】

[0421]膜貫通タンパク質の例としては、以下に限定されないが、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、又はその断片若しくはバリアント）が挙げられる。一部の態様では、膜貫通タンパク質は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、若しくはＬＡＭＰ２Ｂ、又はこれらの任意の組合せであり得る。本開示に関して使用され得る他の膜貫通タンパク質の非限定的な例としては、アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）；ネプリライシン、別名膜メタロエンドペプチダーゼ（ＭＭＥ）；エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）；ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）；又はこれらの任意の組合せが挙げられる。

【0420】

[0422]一部の態様では、膜貫通タンパク質のさらなる例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年２月５日に発行された米国特許第１０，１９５，２９０号及び２０２０年２月１８日に発行された同第１０，５６１，７４０号、並びに２０１８年８月２４日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４８０２６号（国際公開第２０１９／０４０９２０号として公開されている）に見い出すことができる。

【0421】

[0423]一部の態様では、本開示のＥＶは、天然に存在するＥＶのものと異なる内部スペース（すなわち、内腔）を含む。例えば、ＥＶは、ＥＶの内腔表面の組成が、天然に存在するＥＶのものと異なるタンパク質、脂質、又はグリカン含有量を有するように、変更され得る。

【0422】

[0424]一部の態様では、操作されたＥＶは、エクソソームの内腔表面の組成又は含有量を変化させる１つ若しくは複数のエクソソームタンパク質又はエクソソームタンパク質の修飾体若しくは断片をコードする外因性配列で形質転換された細胞から産生され得る。ＥＶの内腔表面に発現され得るＥＶタンパク質の様々な修飾体又は断片を、本開示の態様に使用することができる。

【0423】

[0425]一部の態様では、ＥＶの内腔表面を変化させ得るＥＶタンパク質としては、以下に限定されないが、ＭＡＲＣＫＳタンパク質、ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質、ＢＡＳＰ１タンパク質、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。一部の態様では、エクソソームタンパク質は、Ｂｒａｉｎ Ａｃｉｄ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＢＡＳＰ１タンパク質）を含む。ＢＡＳＰ１タンパク質は、２２ｋＤａの神経組織濃縮酸性タンパク質（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）又は神経軸索膜タンパク質（ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｘｏｎａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）ＮＡＰ－２２としても公知である。完全長ヒトＢＡＳＰ１タンパク質配列（異性体１）が以下に示されている。エクソソームタンパク質の非限定的な例としては、以下に限定されないが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年１１月１６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６１６７９（国際公開第２０１９／０９９９４２号として公開されている）、及び２０１９年５月２２日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３３６２９（国際公開第２０２０／１０１７４０号として公開されている）が挙げられる。

【0424】

ＩＶ．ＥＶを産生する方法
[0426]一部の態様では、本開示にとって有用なＥＶを産生する方法は、産生細胞を目的の１つ又は複数の部分（例えば、ＥＶ膜貫通タンパク質）で修飾するステップを含む。

【0425】

[0427]一部の態様では、産生細胞は、哺乳動物細胞株、植物細胞株、昆虫細胞株、真菌細胞株、又は原核細胞株であり得る。ある特定の態様では、産生細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞株の非限定的な例としては、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＨＴ－１０８０細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＰＥＲＣ－６細胞株、ＣＥＶＥＣ細胞株、線維芽細胞株、羊膜細胞株、上皮細胞株、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）細胞株、及びこれらの組合せが挙げられる。ある特定の態様では、哺乳動物細胞株は、ＨＥＫ－２９３細胞、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪間葉系幹細胞、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞、又はこれらの組合せを含む。一部の態様では、産生細胞は、初代細胞である。ある特定の態様では、初代細胞は、哺乳動物の初代細胞、植物の初代細胞、昆虫の初代細胞、真菌の初代細胞、又は原核生物の初代細胞であり得る。

【0426】

[0428]一部の態様では、産生細胞は、抗原提示細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、ヘルパーＴ細胞、又は調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）などの免疫細胞ではない。一部の態様では、産生細胞は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、マスト細胞、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、又はこのような細胞のいずれかに由来する細胞）ではない。一部の態様では、産生細胞は、天然に存在する抗原提示細胞ではない（すなわち、改変されている）。一部の態様では、産生細胞は、天然に存在する樹状細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、マクロファージ、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、これらの細胞のいずれかに由来する細胞、又はこれらの任意の組合せではない。

【0427】

[0429]一部の態様では、目的の１つ又は複数の部分（例えば、ＥＶ膜貫通タンパク質）は、当業者に公知である方法で産生細胞に導入することができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０２０／１９１３６９号を参照されたい。

【0428】

ＩＶ．Ａ．ＥＶの単離
[0430]一部の態様では、本明細書で開示されているＥＶを産生する方法は、ＥＶを産生細胞から単離するステップを含む。ある特定の態様では、ＥＶは、産生細胞によって細胞培養培地中に放出される。ＥＶの単離についてのすべての公知の様式が本明細書における使用に好適であると考えられることが企図される。例えば、ＥＶを培地又は他の供給源物質から分離するために、ＥＶの物理的特性を用いることができ、電荷（例えば、電気泳動分離）、サイズ（例えば、濾過、分子ふるいなど）、密度（例えば、通常の遠心分離又は勾配遠心分離）、スベドベルグ定数（例えば、外力を有するか又は有さない沈降など）に基づく分離を含む。或いは、又はさらに、単離は、１つ又は複数の生物学的特性に基づいてもよく、表面マーカーを用いることができる方法（例えば、沈殿、固相への可逆的結合、ＦＡＣＳ分離、特異的リガンド結合、非特異的リガンド結合、アフィニティー精製など）を含む。

【0429】

[0431]単離及び濃縮は、一般的で非選択的な様式で行うことができ、典型的には連続遠心分離を含む。或いは、単離と濃縮は、ＥＶ又は産生細胞特異的表面マーカーを使用するなど、より特異的で選択的な様式で行うことができる。例えば、特異的表面マーカーは、免疫沈殿、ＦＡＣＳ選別、アフィニティー精製、ビーズ結合リガンドによる磁気分離で使用できる。

【0430】

[0432]一部の態様では、サイズ排除クロマトグラフィーを利用して、ＥＶを単離することができる。サイズ排除クロマトグラフィー技法は、当技術分野で公知である。例示的な非限定的技法が本明細書において提供される。一部の態様では、空隙容量画分が単離され、目的のＥＶを含む。さらに、一部の態様では、ＥＶは、当技術分野において一般的に知られているように、遠心分離技術（１つ又は複数のクロマトグラフィー画分の）によるクロマトグラフィー分離後にさらに単離することができる。一部の態様では、例えば、密度勾配遠心分離を利用して、細胞外ベシクルをさらに単離することができる。ある特定の態様では、産生細胞由来のＥＶを他の起源のＥＶからさらに分離することが望ましい場合がある。例えば、産生細胞に特異的な抗原抗体を使用する免疫吸着捕捉により、産生細胞由来のＥＶを非産生細胞由来のＥＶから分離することができる。

【0431】

[0433]一部の態様では、ＥＶの単離は、差次的遠心分離、サイズベースの膜濾過、免疫沈殿、ＦＡＣＳ選別、及び磁気分離を含むがこれらに限定されない方法の組合せに関与し得る。

【0432】

[0434]本明細書に記載の負荷効率の増加に加えて、異なる負荷パラメーターのうちの１つ又は複数（例えば、塩濃度）を調整することにより、負荷及び精製（例えば、クロマトグラフィー精製）後のＥＶからの目的の部分（例えば、ペイロード、例えば、ＡＳＯ）の解離を大幅に低減することもできる。本明細書において実証されるように（例えば、例４を参照されたい）、精製ステップ中に高塩濃度（例えば、約１００ｍＭより高い）を維持することにより、低塩濃度下（例えば、約１００ｍＭ未満）で負荷されたＥＶを精製する際に観察される解離と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は約１００％、ＥＶからの目的の部分の解離を低減させることができる。

【0433】

Ｖ．治療用途
[0435]本明細書に記載されているように、本明細書に記載のＥＶは、目的の様々な部分（例えば、ペイロード、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を含むように迅速に操作することができ、これは、広範な疾患及び障害の処置に有用であり得る。したがって、一部の態様では、本開示は、それを必要とする対象における疾患又は状態を処置する方法であって、本開示のＥＶを含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。

【0434】

[0436]一部の態様では、本発明のＥＶで処置することができる疾患又は障害は、がんを含む。本開示により処置することができるがんの非限定的な例としては、結腸直腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ））、膵臓がん（例えば、膵管腺癌（ＰＤＡＣ））、白血病、子宮がん、卵巣がん、膀胱がん、胆管がん、胃がん、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。一部の態様では、がんは、結腸腺癌、直腸腺癌、膵臓腺癌、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌、急性骨髄性白血病、精巣胚細胞腫瘍、肺腺癌、脳低悪性度神経膠腫、多形膠芽腫、ぶどう膜黒色腫、甲状腺癌、子宮体部子宮内膜癌、子宮癌肉腫、褐色細胞腫、傍神経節腫、及びこれらの任意の組合せから選択される。ある特定の態様では、がんは、骨髄性のがんである。一部の態様では、がんは、肝臓がんを含む。一部の態様では、がんは、肝細胞がん（ＨＣＣ）を含む。一部の態様では、がんは、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を含み、一部の態様では、がんは、結腸直腸癌（ＣＲＣ）を含む。一部の態様では、がんは、卵巣がんを含む。一部の態様では、がんは、軟膜腫を含む。

【0435】

[0437]がんを有する対象に投与される場合、ある特定の態様では、本開示のＥＶは、免疫応答を上方調節し、対象の免疫系の腫瘍標的化を増強することができる。一部の態様では、処置されるがんは、腫瘍微小環境への白血球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球）の浸潤、又はいわゆる「ホット腫瘍」若しくは「炎症性腫瘍」によって特徴付けられる。一部の態様では、処置されるがんは、腫瘍微小環境への白血球浸潤のレベルが低いか又は検出されないこと、いわゆる「コールド腫瘍」又は「非炎症性腫瘍」によって特徴付けられる。一部の態様では、ＥＶは、「コールド腫瘍」を「ホット腫瘍」に変換するのに十分な量及び時間で投与される。すなわち、前記投与は、腫瘍微小環境への白血球（Ｔ細胞など）の浸潤をもたらす。ある特定の態様では、がんは、膀胱がん、子宮頸がん、腎細胞がん、精巣がん、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん、及び卵巣がん、リンパ腫、肝臓がん、膠芽腫、黒色腫、骨髄腫、白血病、膵臓がん、又はこれらの組合せを含む。他の用語では、「遠位腫瘍」又は「遠隔腫瘍」は、元の（又は原発の）腫瘍から遠隔器官又は遠隔組織、例えばリンパ節に広がった腫瘍を指す。一部の態様では、本開示のＥＶは、転移拡散後の腫瘍を処置する。

【0436】

[0438]一部の態様では、ＥＶは、対象の循環系に静脈内投与される。一部の態様では、ＥＶは、好適な液体に注入され、対象の静脈に投与される。

【0437】

[0439]一部の態様では、ＥＶは、対象の循環系に動脈内投与される。一部の態様では、ＥＶは、好適な液体に注入され、対象の動脈に投与される。

【0438】

[0440]一部の態様では、ＥＶは、髄腔内投与によって対象に投与される。

【0439】

[0441]一部の態様では、ＥＶは、脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するように、脊柱管内、又はくも膜下腔内に注射を介して投与される。

【0440】

[0442]一部の態様では、ＥＶは、対象の１つ又は複数の腫瘍に腫瘍内投与される。

【0441】

[0443]一部の態様では、ＥＶは、鼻腔内投与によって対象に投与される。一部の態様では、ＥＶは、局所投与又は全身投与のいずれかの形態で鼻から気腹させることができる。ある特定の態様では、ＥＶは、鼻腔スプレーとして投与される。

【0442】

[0444]一部の態様では、ＥＶは、腹腔内投与により対象に投与される。一部の態様では、ＥＶは、好適な液体に注入され、対象の腹膜内に注入される。一部の態様では、腹腔内投与は、ＥＶのリンパ管への分布をもたらす。一部の態様では、腹腔内投与は、胸腺、脾臓、及び／又は骨髄へのＥＶの分布をもたらす。一部の態様では、腹腔内投与は、ＥＶの１つ又は複数のリンパ節への分布をもたらす。一部の態様では、腹腔内投与は、頸部リンパ節、鼠径リンパ節、縦隔リンパ節、又は胸骨リンパ節のうちの１つ又は複数へのＥＶの分布をもたらす。一部の態様では、腹腔内投与は、ＥＶの膵臓への分布をもたらす。

【0443】

[0445]一部の態様では、ＥＶは、眼周囲投与により対象に投与される。一部の態様では、ｓは、眼周囲組織に注射される。眼周囲への薬物投与には、結膜下投与、前テノン嚢下投与、後テノン嚢下投与、及び眼球後投与の経路が含まれる。

【0444】

[0446]本開示のある特定の態様は、それを必要とする対象における脳腫瘍を処置する方法を対象とする。一部の態様では、方法は、本明細書に記載のＥＶの治療有効量を対象に投与するステップを含む。一部の態様では、ＥＶは、脳腫瘍を処置するために、ペイロード（例えば、ＡＳＯ）をＣＮＳに標的化送達することが可能である。一部の態様では、ＥＶは、対象における免疫応答を上方調節し、それによって、神経免疫障害に対する対象の免疫応答を増強することが可能である。一部の態様では、組成物は、対象に腫瘍内投与又は髄腔内投与される。

【0445】

[0447]対象における脳腫瘍の転移を防止する方法も本明細書において提供される。方法は、本明細書で開示されている組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含み、組成物は、対象における１箇所の脳腫瘍が、対象における別の箇所の１つ又は複数の腫瘍の増殖を促進するのを防止することが可能である。一部の態様では、組成物は、１箇所の第１の腫瘍に腫瘍内投与又は髄腔内投与され、第１の腫瘍に投与された組成物は、第２の箇所における１つ又は複数の腫瘍の転移を防止する。

【0446】

ＶＩ．医薬組成物及び投与方法
[0448]本開示は、対象に投与するのに好適な本明細書に記載のＥＶを含む医薬組成物も提供する。医薬組成物は、一般に、マレイミド部分を介して複数のＥＶに共有結合により連結した生物学的に活性な分子を含む複数のＥＶ、及び対象への投与に好適な形態の薬学的に許容できる賦形剤又はキャリアを含む。薬学的に許容できる賦形剤又は担体は、投与される特定の組成物、及び組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。したがって、複数のＥＶを含む医薬組成物の多種多様な好適な製剤が存在する。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ． 第１８版（１９９０）を参照されたい）。医薬組成物は、一般に、無菌で、且つ米国食品医薬品局のすべての適正製造基準（ＧＭＰ）規制を完全に遵守して製剤化される。一部の態様では、医薬組成物は、例えば、本明細書に記載のＥＶに共有結合により連結した小分子などの１つ又は複数の化学化合物を含む。

【0447】

[0449]一部の態様では、医薬組成物は、１つ又は複数の治療剤及び本明細書に記載のＥＶを含む。ある特定の態様では、ＥＶは、薬学的に許容できる担体中で、１つ又は複数の追加の治療剤と同時に投与される。一部の態様では、ＥＶを含む医薬組成物は、追加の治療剤の投与前に投与される。一部の態様では、ＥＶを含む医薬組成物は、追加の治療剤の投与後に投与される。さらなる態様では、ＥＶを含む医薬組成物は、追加の治療剤と同時に投与される。

【0448】

[0450]対象に投与するのに好適な形態で、所望の純度を有する本開示のＥＶ、及び薬学的に許容できる担体又は賦形剤を含む医薬組成物が本明細書において提供される。薬学的に許容できる賦形剤又は担体は、投与される特定の組成物、及び組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定され得る。したがって、複数の細胞外ベシクルを含む医薬組成物の多種多様な好適な製剤が存在する。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ． 第２１版（２００５）を参照されたい）。医薬組成物は、一般に、無菌で、且つ米国食品医薬品局のすべての適正製造基準（ＧＭＰ）規制を完全に遵守して製剤化される。

【0449】

[0451]一部の態様では、医薬組成物は、１つ又は複数の治療剤及び本明細書に記載のＥＶを含む。ある特定の態様では、ＥＶは、薬学的に許容できる担体中で、１つ又は複数の追加の治療剤と同時に投与される。一部の態様では、ＥＶを含む医薬組成物は、追加の治療剤の投与前に投与される。一部の態様では、ＥＶを含む医薬組成物は、追加の治療剤の投与後に投与される。さらなる態様では、ＥＶを含む医薬組成物は、追加の治療剤と同時に投与される。

【0450】

[0452]許容できる担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエント（例えば、動物又はヒト）に対して無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；並びに／又はトゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（商標）、プルロニクス（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。

【0451】

[0453]担体又は希釈剤の例には、以下に限定されないが、水、食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが含まれる。医薬活性物質に対するこのような媒体及び化合物の使用は当技術分野で周知である。いずれかの従来の培地又は化合物が本明細書に記載の細胞外ベシクルと不適合である場合を除き、組成物におけるその使用が企図される。補足的な治療剤もまた、組成物に組み込むことができる。典型的には、医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように製剤化される。本開示のＥＶは、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、腫瘍内、筋肉内経路又は吸入剤として投与することができる。ある特定の態様では、ＥＶを含む医薬組成物は、静脈内、例えば注射により投与される。ＥＶは、ＥＶが意図される疾患、障害又は状態を処置する際に少なくとも部分的に有効な他の治療剤と組み合わせて任意選択的に投与され得る。

【0452】

[0454]溶液又は懸濁物には、以下の構成成分：無菌希釈剤、例えば、水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗細菌化合物、例えば、ベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート化合物、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩；及び張性の調整のための化合物、例えば、塩化ナトリウム又はデキストロースが含まれ得る。ｐＨは、酸又は塩基、例えば、塩酸又は水酸化ナトリウムで調整され得る。調製物は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器又は多回投与バイアルに封入することができる。

【0453】

[0455]注射可能な使用に好適な医薬組成物には、無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び無菌粉末が含まれる。静脈内投与では、好適な担体には、生理的食塩水、静菌性水、クレモホールＥＬ（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ）（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。組成物は、一般に無菌であり、容易にシリンジできる程度に流動性がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒などであり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用によって、分散液の場合には要求される粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌化合物及び抗真菌化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。所望により、等張化合物、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、及び塩化ナトリウムが組成物に添加され得る。注射用組成物の延長された吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによってもたらされ得る。

【0454】

[0456]本開示のＥＶを、有効量で、適切な溶媒中に、所望の場合本明細書に列挙される成分の１つ又は組合せと共に、組み込むことにより、無菌注射用溶液を調製することができる。一般に、分散液は、ＥＶを、塩基性分散媒体及び所望の他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の方法は、その予め無菌濾過した溶液から、活性成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥及び凍結乾燥である。ＥＶは、ＥＶの持続的又は拍動的放出を可能にするような様式で製剤化することができるデポー注射剤又は埋込み製剤の形態で投与することができる。

【0455】

[0457]本開示のＥＶを含む組成物の全身投与は、経粘膜手段によることもできる。経粘膜投与では、浸透させるバリアに適切な浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は一般に当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与では、洗剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、例えば、鼻腔スプレーの使用によって達成され得る。

【0456】

[0458]ある特定の態様では、本開示のＥＶを含む医薬組成物は、医薬組成物から利益を受ける対象に静脈内投与される。ある特定の態様では、組成物は、リンパ系、例えば、リンパ管内注射又は結節内注射（例えば、Ｓｅｎｔｉら、ＰＮＡＳ １０５（４６）：１７９０８頁（２００８）を参照されたい）、又は筋肉内注射、皮下投与、腫瘍内注射、胸腺、若しくは肝臓への直接注射によって投与される。

【0457】

[0459]ある特定の態様では、本開示のＥＶを含む医薬組成物は、液体懸濁液として投与される。ある特定の態様では、医薬組成物は、投与後にデポーを形成することが可能な製剤として投与される。ある特定の好ましい態様では、デポーは、ＥＶを循環中にゆっくりと放出するか、又はデポー形態のままである。

【0458】

[0460]典型的には、薬学的に許容できる組成物は、夾雑物を含まないように高度に精製され、生体適合性であり、毒性がなく、対象への投与に適している。水が担体の構成成分である場合、水は高度に精製され、夾雑物、例えばエンドトキシンを含まないように処理される。

【0459】

[0461]薬学的に許容できる担体としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸塩、プロピルヒドロキシ安息香酸塩、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び／又は鉱油であり得るが、これらに限定されない。医薬組成物は、滑沢剤、湿潤剤、甘味剤、風味増強剤、乳化剤、懸濁化剤、及び／又は保存剤をさらに含み得る。

【0460】

[0462]本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書に記載のＥＶ、及び任意選択的に薬学的に活性な薬剤又は治療剤を含む。治療剤は、生物学的薬剤、低分子薬剤、又は核酸薬剤であり得る。

【0461】

[0463]本明細書に記載のＥＶを含む医薬組成物を含む剤形が提供される。一部の態様では、剤形は、静脈内注射用の液体懸濁剤として製剤化される。一部の態様では、剤形は、腫瘍内注射用の液体懸濁剤として製剤化される。

【0462】

[0464]本開示のＥＶは、他の薬物と同時に使用されてよい。具体的には、本開示のＥＶは、ホルモン治療剤、化学療法剤、免疫療法剤、細胞増殖因子又は細胞増殖因子受容体の作用を阻害する医薬などの医薬と一緒に使用されてよい。

【0463】

ＶＩＩ．キット
[0465]本開示は、本開示の１つ又は複数のＥＶ、及び任意選択的に使用説明書を含むキット、又は製造品も提供する。一部の態様では、キット、又は製造品は、本開示の少なくとも１つのＥＶ、及び使用説明書を含む、本明細書に記載の医薬組成物を含有する。一部の態様では、キット、又は製造品は、１つ又は複数の容器中に、本開示の少なくとも１つのＥＶ、又はＥＶを含む医薬組成物を含む。当業者であれば、本開示のＥＶ、本開示のＥＶを含む医薬組成物、又はそれらの組合せが、当技術分野で周知の確立されたキット形式の１つに容易に組み込まれ得ることを容易に認識するであろう。

【0464】

[0466]一部の態様では、キット、又は製造品は、ＥＶ、１つ若しくは複数の生物学的に活性な分子、１つ若しくは複数の生物学的に活性な分子をＥＶに共有結合させるための試薬、又はそれらの任意の組合せ、及び１つ又は複数の生物学的に活性な分子をＥＶに共有結合させるための反応を実行するための説明書を含む。

【0465】

[0467]一部の態様では、キットは、生物学的に活性な分子をＥＶにコンジュゲートするための試薬、及びコンジュゲーションを実行するための指示書を含む。

【0466】

[0468]本開示の実践には、別段に示されていない限り、当業者の技術範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来技術を用いることになる。このような技法は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（１９９２） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ）；Ｄ． Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ編、（１９８５） ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ及びＩＩ巻；Ｇａｉｔ編（１９８４） Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓら 米国特許第４，６８３，１９５号；Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４） Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７） Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ及びＣａｌｏｓ編（１９８７） Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕら編、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４及び１５５巻；Ｍａｙｅｒ及びＷａｌｋｅｒ編（１９８７） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ及びＢｌａｃｋｗｅｌｌ編、（１９８６） Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ～ＩＶ巻；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８６）；）；Ｃｒｏｏｋｅ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第２版 ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００７）並びにＡｕｓｕｂｅｌら（１９８９）におけるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．）を参照されたい。

【0467】

[0469]上記で引用したすべての参照文献、及び本明細書で引用したすべての参照文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0468】

[0470]以下の例は、例示のために与えられるものであり、限定を目的とするものではない。

【実施例】

【0469】

実施例１－ＥＶ負荷に及ぼす塩濃度の効果
[0471]ペイロードの負荷効率を向上させるのに重要な様々な負荷パラメーターの特定を開始するために、ＡＳＯ（例えば、ＳＴＡＴ６を標的とする）を、異なるＮａＣｌ濃度（２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、又は１５０ｍＭ）とスクロース濃度（２．５％、３．７５％、又は５％）からなる負荷緩衝剤中でＥＶと混合した。ＡＳＯとＥＶとを３７℃で２４時間混合した。次いで、混合物を室温まで冷却し、次に、０．４５μｍの（ＰＶＤＦ）濾過で濾過した。濾液をサンプリングし、ＡＥＸ－ＵＨＰＬＣ（ＡＳＯ含有量）及びナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）（ＥＶ含有量）について試験し、クロマトグラフィークリーンアップの前にＡＳＯ負荷効率を決定した。ＡＳＯ含有量を決定するための代替方法の非限定的な例としては、（１）Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）ＲＮＡ試薬（例えば、溶液中のＲＮＡを定量するための蛍光色素）、（２）２６０ｎｍにおけるＵＶ吸光度が挙げられる。ＥＶ含有量を測定するための代替方法の非限定的な例としては、（１）動的光散乱の強度及び（２）４０５ｎｍでのＵＶ吸光度が挙げられる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／２４６５９１号を参照されたい。

【0470】

[0472]以下の表３に示されているように、ＮａＣｌ濃度を増加させると、エクソソームの外側表面にＡＳＯがより多く負荷された。試験した異なるＮａＣｌ濃度の中で、スクロース濃度にかかわらず、最大のＡＳＯ負荷効率は１５０ｍＭで観察された。これらの結果は、負荷緩衝剤の塩濃度をモジュレートすることが、ＥＶの負荷効率を向上させるのに有用であり得ることを示唆している。

【0471】

【表4】

【0472】

実施例２－ＥＶ負荷に及ぼす時間及び温度の効果
[0473]次に、ＥＶへのＡＳＯ負荷への負荷時間及び負荷温度の効果を特徴付けるために、ＥＶを５℃、２２℃、及び３７℃で４８時間までＡＳＯと混合した。次いで、混合物を冷却し、濾過し、濾液を実施例１に記載されているようにＡＳＯ含有量とＥＶ含有量について分析した。

【0473】

[0474]図１Ａに示されているように、負荷時間は、ＡＳＯとＥＶとが５℃（菱形）で混合された場合には影響を及ぼさなかった。対照的に、ＡＳＯとＥＶとを２２℃又は３７℃のいずれかで混合した場合、負荷時間の増加はＡＳＯ負荷効率にプラスの効果をもたらした（それぞれ、図１Ａの四角と三角の記号を参照されたい）。２２℃では、負荷プラトー（すなわち、ＥＶのＡＳＯ濃度がさらに増加しないこと）は、２４時間付近から観察され始めた。３７℃では、負荷時間の増加と共に、ＥＶ中のＡＳＯ濃度が継続的に増加した。

【0474】

[0475]上記の結果は、負荷時間と負荷温度の両方がＥＶの負荷効率に影響を与え得ることを実証する。負荷時間と負荷温度の両方を増加させることによって、結果は、より強力なＥＶ（すなわち、より多量の負荷されたペイロードを含む）を生成することが可能であることを示唆する。

【0475】

実施例３－ＥＶ負荷に及ぼす塩濃度、負荷時間、ＥＶ供給濃度、及びペイロード供給濃度をモジュレートする効果
[0476]異なる負荷パラメーター（例えば、本明細書に記載のもの）がＥＶの負荷効率に及ぼす影響をさらに評価するために、ＡＳＯとＥＶを以下の２つの負荷条件のうちの１つで混合した：（ｉ）負荷緩衝剤：２０ｍＭのＰＯ_４、５０ｍＭのＮａＣｌ、５．０％のスクロース、ｐＨ７．２、混合する温度は室温で１時間であった（「負荷条件番号１」）；及び（ｉｉ）負荷緩衝剤：２０ｍＭのＰＯ_４、１００ｍＭのＮａＣｌ、２．５％のスクロース、ｐＨ７．２、混合する温度は室温で２４時間であった（「負荷条件番号２」）。さらなる変数として、ＥＶとＡＳＯを様々な濃度で混合物に添加した。特に、ＥＶは以下の供給濃度で添加した：１．４×１０^１３、１．０×１０^１３、又は６．０×１０^１２。ＡＳＯは以下の供給濃度で添加した：８００μＭ、６００μＭ、４００μＭ、２００μＭ、又は１００μＭ。次いで、ＡＳＯ含有量及びＥＶ含有量を先の実施例に記載したように測定した。

【0476】

[0477]表４及び表５（以下）に示されているように、ＡＳＯ負荷効率は、ＥＶ供給濃度の増加とＡＳＯ濃度の増加の両方に正の相関があった。例えば、ＥＶ供給濃度とＡＳＯ濃度の両方が最大（それぞれ、１．４×１０^１３及び８００μＭ）である場合に、最も高い負荷効率（すなわち、ＥＶのＡＳＯ濃度が最も高い）が観察された。２つの負荷条件と同様に、負荷条件番号２でＡＳＯとＥＶとを混合した場合、ＡＳＯ負荷効率はおよそ４倍に増加した。

【0477】

[0478]上記の結果は、塩濃度と負荷時間の増加がＥＶの負荷効率にプラスの効果をもたらすことを裏付ける。この結果は、ＥＶ供給濃度とＡＳＯ供給濃度の両方が負荷効率に影響し得ることをさらに実証する。

【0478】

【表5】

【0479】

【表6】

【0480】

実施例４－ＥＶの効力に関する負荷パラメーターの解析
[0479]異なる負荷パラメーターがＥＶ負荷効率に及ぼす影響をさらに理解するために、２つの異なる抗ＳＴＡＴ６ ＡＳＯをペイロードとして使用した：１つはヒトＳＴＡＴ６を標的とし（「ヒトＡＳＯ」）、もう１つはマウスＳＴＡＴ６を標的とした（「マウスＡＳＯ」）。マウスＡＳＯは、マウスＳＴＡＴ６転写物と相補的な配列を含有し、ヒトＡＳＯはヒトＳＴＡＴ６転写物と相補的である。マウス及びヒトのＳＴＡＴ６転写物は全長が異なることは当業者には明らかであろう。先の実施例で提供した方法と同様に、マウス及びヒトのＡＳＯを、１５０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む負荷緩衝剤中でＥＶと独立的に混合した。マウスＡＳＯは、以下の供給濃度のうちの１つで添加した：１００ｍＭ、８００ｍＭ、又は９５０ｍＭ。ヒトＡＳＯは、以下の供給濃度のうちの１つで添加した：１００ｍＭ、８００ｍＭ、又は１０００ｍＭ。さらなる負荷条件は以下の通りであった：１×１０^１３ｐ／ｍＬのＥＶ供給濃度で３７℃にて２４時間。次いで、ＡＳＯ含有量及びＥＶ含有量を先の実施例に記載したように測定した。

【0481】

[0480]表６に示されているように、及び先のデータ（例えば、実施例３を参照されたい）と一致するように、ＡＳＯ供給濃度を増加させると、ＥＶ当たりのＡＳＯの負荷がより大きくなった。これは、マウス及びヒトのＡＳＯの両方で観察され、本明細書において提供される負荷方法を使用して、配列長が異なるＡＳＯの負荷効率を高めることができることを示した。同様の結果（少なくとも負荷密度に関して）が、他の標的を標的とし、異なる脂質リンカーにコンジュゲートしたＡＳＯで観察された。例えば、図５に示されているように、本明細書において提供される負荷方法を使用すると、対照負荷条件と比較して、平均して、ＡＳＯ負荷が１０～１４倍増加することが観察された。

【0482】

【表7】

【0483】

[0481]次に、得られるＥＶの効力を確認するために、マウス又はヒトのＡＳＯを負荷したＥＶを使用して、肝細胞におけるＳＴＡＴ６発現をノックダウンさせた。図４に示されているように、ＡＳＯの総質量を投与した場合、ＳＴＡＴ６発現のノックダウンに有意差は見られず、ＡＳＯの負荷密度を高めることで、同じ治療効果を実現するために使用するＥＶはより少なくて済むことが実証された。

【0484】

[0482]上記の結果は、本明細書において提供される負荷方法によって、より強力なＥＶの生成が可能になり、それにより、より多くの患者を処置するために所与のバッチのＥＶの生成が可能になる。

【0485】

実施例５－クロマトグラフィー精製後のＥＶのＡＳＯ濃度に及ぼす負荷温度、ナトリウム濃度、及びスクロース濃度の効果
[0483]本明細書に記載の異なる負荷パラメーターが精製後のＥＶのＡＳＯ濃度に影響するかどうかを理解するために、高塩及び低スクロース（１５０ｍＭのＮａＣｌ及び２．５％のスクロース）又は低塩及び高スクロース（５０ｍＭのＮａＣｌ及び５％のスクロース）の濃度のいずれかを含む負荷緩衝剤を使用して、ＥＶとＡＳＯとを混合した。負荷温度は、２４℃（すなわち、室温）又は３７℃のいずれかであった。ＥＶを、１×１０^１３ｐ／ｍＬの供給濃度で混合物に添加した。ＡＳＯを、６５０μＭの供給濃度で添加した。その後、ＥＶとＡＳＯとの混合物を濾過し、Ｃａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ７００樹脂を用いたクロマトグラフィーによって、負荷されたＥＶをクリーンアップした。フロースルーは、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ蛍光により、ＥＶを負荷したＡＳＯと遊離ＡＳＯとについて測定した。

【0486】

[0484]表７（下）に示されているように、ＥＶとＡＳＯとを、塩濃度の高い負荷緩衝剤を使用し、３７℃の負荷温度で混合した場合、ＥＶのＡＳＯ濃度が最も高かった。同じ負荷条件下で、遊離ＡＳＯの量が最も少ないことも観察された。低塩濃度の負荷緩衝剤を用いた場合、試験したいずれの負荷温度でも、ＡＳＯと共に負荷されたＥＶは少なく、フロースルーで観察された遊離ＡＳＯは多かった。負荷温度の上昇（３７℃対２４℃）により、低塩濃度負荷緩衝剤で観察された負荷効率は改善されたが、３７℃の負荷温度にて高塩濃度で観察された負荷効率には及ばなかった。

【0487】

【表8】

【0488】

[0485]上記の結果は、塩濃度と負荷温度の増加がＥＶの負荷効率にプラスの効果をもたらすことをさらに裏付ける。結果は、Ｃａｐｔｏ Ｃｏｒｅが負荷温度及び塩濃度に依存せずに遊離ＡＳＯをクリーンアップできることも実証し、その強固なクリーンアップ能力を示している。

【0489】

実施例６－クロマトグラフィー精製後のＥＶからのＡＳＯ解離に及ぼす様々な負荷パラメーターの効果
[0486]次に、様々な負荷条件下でＡＳＯを負荷したＥＶにおけるクロマトグラフィー精製後のＡＳＯ解離を評価した。簡単に説明すると、ＥＶとＡＳＯとは、以下の２つの負荷緩衝剤のうち１つを使用して混合した：（ｉ）ＣＥＦ（２０ｍＭのＰＯ_４、５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のスクロース）；及び（ｉｉ）Ｈｉ（２０ｍＭのＰＯ_４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５％のスクロース）。ＥＶとＡＳＯとは、室温（約２４℃）又は３７℃のいずれかで混合した。次いで、ＡＳＯを負荷したＥＶをＣａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ７００樹脂を用いるクロマトグラフィーでクリーンアップした。Ｃａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ７００での洗浄後、ＥＶから解離するＡＳＯに及ぼす希釈倍率、希釈剤、及び希釈物の保持時間の効果を評価し、結果を表８に示している。

【0490】

【表9】

【0491】

[0487]遊離パーセントは、負荷されてクリーンアップされた物質を、より低い塩濃度を含有する負荷緩衝剤で希釈すると、より多くのＡＳＯがＥＶから解離することを示した。希釈倍率が高くなるにつれて、解離はより急激に進んだ。しかし、より高濃度の塩を含有する負荷緩衝剤（１５０ｍＭのＮａＣｌ）で物質を希釈した場合、ＡＳＯの解離は観察されなかった。希釈したクリーンアップ物質を室温で２０時間保持したところ、さらなる解離が観察されたのは、希釈液の塩濃度がより低い場合（５０ｍＭ）のみであった。より高濃度の塩を含有する希釈液では、希釈した物質を室温で２０時間保持しても解離は観察されなかった。このデータは、塩濃度を維持することによって、負荷されたエクソソームの安定性を最適化できることを示している。

【0492】

実施例７－ＡＳＯをＥＶに負荷するプロセスのスケーリング
[0488]上記開示から明らかなように、本明細書において提供される負荷方法は、様々なスケールでペイロードを負荷したＥＶを生成する際に有用であり得る。表９（以下）は、ラボスケール、非ＧＭＰ、及びＧＭＰ生成のための例示的な負荷パラメーターを提供する。

【0493】

【表10】

【0494】

[0489]特許請求の範囲を解釈するために使用されることを意図しているのは、要約及び要旨のセクションではなく、詳細な説明のセクションであることが認識されるべきである。要約及び要旨のセクションは、本発明者（ら）によって企図された本開示の１つ又は複数の例示的な態様を示すことができるが、すべてではなく、よって、本開示及び添付の特許請求の範囲を何らかの方法で限定することを意図するものではない。

【0495】

[0490]本開示は、指定された機能及びその関係の実行を例示する機能的構成要素の助けを借りて上述されてきた。これらの機能的構成要素の境界は、本明細書では、説明の便宜のために任意に定義されている。指定された機能及びその関係が適切に実施される限り、別の境界を定義することができる。

【0496】

[0491]具体的な態様についての前述の説明は、本開示の一般的な性質を十分に明らかにするため、他者は、当業者内の知識を適用することにより、過度の実験を行うことなく、本開示の一般的な概念から逸脱することなく、このような具体的な態様を様々な用途のために容易に修正及び／又は翻案することができる。したがって、このような翻案及び修正は、本明細書に提示された教示及び指針に基づいて、開示された態様の均等物の意味及び範囲内にあることが意図される。本明細書の用語又は語法は、教示及び指針に照らして当業者によって解釈されるべきものであるように、本明細書の語法又は用語は、説明のためのものであり、限定するためのものではないことを理解されたい。

【0497】

[0492]本開示の広さ及び範囲は、上述の例示的態様のいずれかによって限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲及びその均等物に従ってのみ定義されるべきである。

【0498】

[0493]本出願を通じて引用される可能性のあるすべての引用文献（参照文献、特許、特許出願、及びウェブサイトを含む）の内容は、その中で引用された参照文献と同様に、いかなる目的であれ、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図4】

【図5】

【配列表】

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【国際調査報告】