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特表2024-506841プレフェナート脱水酵素変異体及びそれを用いた分岐鎖アミノ酸生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-15
(54)【発明の名称】プレフェナート脱水酵素変異体及びそれを用いた分岐鎖アミノ酸生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/60 20060101AFI20240207BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240207BHJP
C12N 9/88 20060101ALI20240207BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240207BHJP
C12P 13/06 20060101ALI20240207BHJP
C12P 13/08 20060101ALI20240207BHJP
【ＦＩ】
C12N15/60 ZNA
C12N1/21
C12N9/88
C12N15/63 Z
C12P13/06 B
C12P13/06 C
C12P13/08 D
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023545938
(86)(22)【出願日】2022-01-19
(85)【翻訳文提出日】2023-08-16
(86)【国際出願番号】 KR2022000984
(87)【国際公開番号】W WO2022164118
(87)【国際公開日】2022-08-04
(31)【優先権主張番号】10-2021-0014077
(32)【優先日】2021-02-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514199250
【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダング コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100097456
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 徹
(72)【発明者】
【氏名】ハユン リー
(72)【発明者】
【氏名】ジュ エウン キム
(72)【発明者】
【氏名】ジ ヒェ リー
(72)【発明者】
【氏名】キュングリム キム
(72)【発明者】
【氏名】ヘエセオク リー
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AE05
4B064AE06
4B064AE07
4B064CA02
4B065AA24X
4B065AA24Y
4B065AB10
4B065BA02
4B065CA17
(57)【要約】
本出願は、プレフェナート脱水酵素変異体に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１８２番の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、プレフェナート脱水酵素（Ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）変異体。
【請求項2】
前記変異体は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１８２番の位置に対応するアミノ酸がアルギニン以外のアミノ酸への置換を含む、請求項１に記載のプレフェナート脱水酵素変異体。
【請求項3】
前記他のアミノ酸への置換は、非極性（ｎｏｎｐｏｌａｒ）アミノ酸または大きさが小さいアミノ酸への置換である、請求項１に記載のプレフェナート脱水酵素変異体。
【請求項4】
前記他のアミノ酸は、アラニン（Ａｌａ）である、請求項１に記載のプレフェナート脱水酵素変異体。
【請求項5】
前記プレフェナート脱水酵素は、配列番号５と９９％以上の相同性または同一性を有する、請求項１に記載のプレフェナート脱水酵素変異体。
【請求項6】
前記プレフェナート脱水酵素変異体は、配列番号１のプレフェナート脱水酵素に比べて弱化された活性を有する、請求項１に記載のプレフェナート脱水酵素変異体。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載のプレフェナート脱水酵素変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項8】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項9】
請求項１～６のいずれか一項に記載のプレフェナート脱水酵素変異体；前記プレフェナート脱水酵素変異体をコードするポリヌクレオチド；及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターのうち１以上を含むコリネバクテリウム属微生物。
【請求項10】
前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項９に記載の微生物。
【請求項11】
前記微生物は、分岐鎖アミノ酸生産用である、請求項９に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項12】
前記分岐鎖アミノ酸は、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン及びＬ－バリンから選択される１以上である、請求項１１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項13】
請求項９に記載の微生物を培地で培養する段階を含む、分岐鎖アミノ酸生産方法。
【請求項14】
前記方法は、分岐鎖アミノ酸を微生物または培地から回収する段階をさらに含む、請求項１３に記載の分岐鎖アミノ酸生産方法。
【請求項15】
前記分岐鎖アミノ酸は、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン及びＬ－バリンから選択される１以上である、請求項１３に記載の分岐鎖アミノ酸生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、プレフェナート脱水酵素（Ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）変異体及びそれを用いた分岐鎖アミノ酸生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｌ－アミノ酸は、タンパク質の基本構成単位であり、薬品原料と食品添加剤、動物飼料、栄養剤、殺虫剤、殺菌剤などの重要素材として用いられる。従って、アミノ酸を産業的に生産することは、経済的に重要な産業工程になってきた。
【0003】
アミノ酸を効率よく生産するための多様な研究、例えば、アミノ酸の高効率生産微生物や発酵工程技術を開発するための努力が行われている。具体的には、コリネバクテリウム属菌株でアミノ酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させたりまたはアミノ酸の生合成に不要な遺伝子を除去するような目的物質特異的なアプローチ方法が開発され（ＵＳ ９１０９２４２ Ｂ２， ＵＳ ８０３００３６ Ｂ２）、このような方法以外にアミノ酸生産に関与しない遺伝子を除去する方法、アミノ酸生産において具体的に機能が知られていない遺伝子を除去する方法も活用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】ＵＳ ９１０９２４２ Ｂ２
【特許文献2】ＵＳ ８０３００３６ Ｂ２
【特許文献3】米国特許ＵＳ ７６６２９４３ Ｂ２
【特許文献4】米国登録特許ＵＳ １０５８４３３８ Ｂ２
【特許文献5】米国登録特許ＵＳ １０２７３４９１ Ｂ２
【特許文献6】韓国公開特許ＫＲ１０－２０２０－０１３６８１３Ａ
【特許文献7】大韓民国登録特許ＫＲ１０－２１４３９６４Ｂ１
【特許文献8】ＵＳ２０２０－０３４００２２Ａ１
【特許文献9】ＵＳ８４６５９６２Ｂ２
【特許文献10】大韓民国登録特許第１０－００５７６８４号
【特許文献11】ＫＲ １０－２０１８－００７７００８ Ａ
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３
【非特許文献2】Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００ Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６： ２７６－２７７
【非特許文献3】Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） ［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５］： ２４４４
【非特許文献4】Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３
【非特許文献5】Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２： ３８７ （１９８４）
【非特許文献6】Ａｔｓｃｈｕｌ， ［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ， Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］： ４０３ （１９９０）
【非特許文献7】Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ， Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ， ［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４
【非特許文献8】［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴ ＡＬ．］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８： １０７３
【非特許文献9】Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ （１９８１） ２：４８２
【非特許文献10】Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ．， Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ． ３５３－３５８ （１９７９）
【非特許文献11】Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ６７４５
【非特許文献12】Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９
【非特許文献13】Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ９．５０－９．５１， １１．７－１１．８
【非特許文献14】Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１０， Ｖｏｌ． ２． １－１６
【非特許文献15】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２
【非特許文献16】Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． ２０１４；１５（２）：２７７３－２７９３
【非特許文献17】Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｒｅｖｉｅｗｓ － Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｖｏｌ． １（１） １９８６
【非特許文献18】″Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ″ ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ＵＳＡ， １９８１）
【非特許文献19】Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （２０１５） ３１：１３６９－１３７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
分岐鎖アミノ酸（ｂｒａｎｃｈｅｄ－ｃｈａｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）は、バリン、ロイシン、イソロイシンの３種を指し、主に筋肉で代謝されて活動時にエネルギー源として用いられることが知られている。分岐鎖アミノ酸が活動時に筋肉維持及び増量に重要な役割をすることが知られながら、その使用量が増加している。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本出願の目的は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１８２番の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、プレフェナート脱水酵素変異体を提供することにある。
【0008】
本出願の他の目的は、上記変異体をコードするポリヌクレオチド及びそれを含むベクターを提供することにある。
【0009】
本出願のもう一つの目的は、上記変異体、ポリヌクレオチド及びベクターの一つ以上を含むコリネバクテリウム属微生物を提供することにある。
【0010】
本出願のもう一つの目的は、上記微生物を培地で培養する段階を含む、分岐鎖アミノ酸生産方法を提供することにある。
【発明の効果】
【0011】
本出願のプリフェネート脱水酵素変異体を用いる場合、それを用いない場合に比べて高収率の分岐鎖アミノ酸の生産が可能である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用することができる。すなわち、本出願で開示された様々な要素の全ての組み合わせが、本出願の範囲に属する。また、以下に記載される具体的な記述により本出願の範囲が制限されるとは見られない。
【0013】
また、当該技術分野の通常の知識を有する者は、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定様態に対する多数の等価物を認知したり確認することができる。また、このような等価物は、本出願に含まれることが意図される。
【0014】
本出願の一つの様態は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１８２番の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、プレフェナート脱水酵素（Ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）変異体を提供する。
【0015】
上記プレフェナート脱水酵素変異体は、プレフェナート脱水酵素活性を有するポリペプチドまたはプレフェナート脱水酵素において、配列番号１のプレフェナート脱水酵素のＮ末端から１８２番の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された変異体を意味する。
【0016】
本出願において、「プレフェナート脱水酵素（Ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）」は、次の反応を触媒できる酵素である。
【0017】
ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ ⇔ ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ ＋ Ｈ２Ｏ ＋ ＣＯ２
【0018】
本出願のプレフェナート脱水酵素は、本出願で提供するプレフェナート脱水酵素変異体を製造するために変形が加えられるプレフェナート脱水酵素またはプレフェナート脱水酵素活性を有するポリペプチドであってもよい。具体的には、自然に発生するポリペプチドまたは野生型ポリペプチドであってもよく、その成熟ポリペプチドであってもよく、その変異体または機能的断片を含んでもよいが、本出願のプレフェナート脱水酵素変異体の母体（ｐａｒｅｎｔ）になり得る限り、制限なく含まれる。
【0019】
本出願において上記プレフェナート脱水酵素は、これに制限されないが、配列番号１のポリペプチドであってもよい。一具現例において、配列番号１のポリペプチドと約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドであってもよく、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一あるいは対応する活性を有する場合であれば、制限なくプレフェナート脱水酵素の範囲に含まれる。
【0020】
本出願のプレフェナート脱水酵素は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列が得られる。具体的には、ｐｈｅＡ遺伝子によりコードされるポリペプチドであってもよいが、これに制限されない。
【0021】
本出願において、「変異体」とは、１つ以上のアミノ酸が保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）及び／または変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）され、前記変異体の変異前のアミノ酸配列とは異なるが、機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）または特性（ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）が維持されるポリペプチドを指す。そのような変異体は、一般に、ポリペプチドのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸を変形し、前記変形ポリペプチドの特性を評価して同定（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）されてもよい。すなわち、変異体の能力は、変異前のポリペプチドに比べて増加したり、変化しないか、または減少されてもよい。また、一部の変異体は、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）などの１つ以上の部分が除去された変異体を含んでもよい。他の変異体は、成熟タンパク質（ｍａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）のＮ及び／またはＣ末端から一部分が除去された変異体を含んでもよい。前記用語「変異体」は、変異型、変形、変異型ポリペプチド、変異タンパク質、変異及び変異体などの用語（英語表現では、ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ， ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｍｕｔａｎｔ， ｍｕｔｅｉｎ， ｄｉｖｅｒｇｅｎｔなど）を混用することができ、変異された意味で使用される用語であれば、これに限定されない。
【0022】
またに、変異体は、ポリペプチドの特性と二次構造に最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加を含んでもよい。例えば、変異体のＮ末端には、翻訳と同時に（ｃｏ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）または翻訳後に（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）タンパク質の移動（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）に関与するシグナル（またはリーダー）配列がコンジュゲートされてもよい。また、変異体は、確認、精製、または合成可能に、他の配列またはリンカーとコンジュゲートされてもよい。
【0023】
本出願で提供する変異体は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１８２番の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたプレフェナート脱水酵素変異体であってもよい。しかし、これに制限されない。
【0024】
上記配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１８２番の位置に対応するアミノ酸はアルギニンであってもよい。
【0025】
本出願で提供する変異体は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１８２番の位置に対応するアミノ酸がアルギニン以外のアミノ酸への置換を含んでもよいが、これに制限されない。
【0026】
前記「他のアミノ酸」は、置換前のアミノ酸と異なるアミノ酸であれば限定されない。一方、本出願において「特定アミノ酸が置換された」と表現する場合、他のアミノ酸で置換されたと特に表記しなくても、置換前のアミノ酸と異なるアミノ酸で置換されることは自明である。
【0027】
一具現例として、本出願の変異体は、比較（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）タンパク質である配列番号１のアミノ酸配列で１８２番の位置に対応するアミノ酸が疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）アミノ酸または脂肪族（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ）アミノ酸中、置換前のアミノ酸と他のアミノ酸で置換された変異体であってもよい。
【0028】
具体的には、上記変異体は、配列番号１のアミノ酸配列で１８２番の位置に対応するアミノ酸が疎水性（非極性）アミノ酸または脂肪族アミノ酸中の一つのアミノ酸で置換された変異体であってもよい。上記脂肪族アミノ酸は、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸であってもよいが、これに制限されない。上記疎水性（非極性）アミノ酸は、例えば、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸であってもよいが、これに制限されない。
【0029】
一具現例として、本出願の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列で１８２番の位置に対応するアミノ酸が大きさ（ｓｉｚｅ）が小さいアミノ酸中、置換前のアミノ酸と他のアミノ酸で置換された変異体であってもよいが、これに制限されない。
【0030】
本出願において用語「大きさが小さいアミノ酸」は、２０種のアミノ酸中、相対的に大きさが小さいアミノ酸であるグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、及びアスパラギンを含むことであり、具体的には、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びプロリンを意味するが、これに制限されず、より具体的には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、及びトレオニンを意味することであってもよく、一例としてアラニン、セリン、グリシンを指すことであってもよいが、これに制限されない。
【0031】
より具体的には、本出願の変異体において他のアミノ酸での置換は、アラニンでの置換であってもよいが、これに制限されない。
【0032】
本出願において、用語「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」とは、ポリペプチドで列挙される位置のアミノ酸残基であるか、またはポリペプチドで列挙される残基と類似または同一または相同のアミノ酸残基を指す。対応する位置のアミノ酸を確認することは、特定の配列を参照する配列の特定のアミノ酸を決定することであってもよい。本出願で使用される「対応する領域」は、一般に、関連タンパク質または比較（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）タンパク質における類似または対応する位置を指す。
【0033】
例えば、任意のアミノ酸配列を配列番号１と整列（ａｌｉｇｎ）し、これに基づいて、前記アミノ酸配列の各アミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸残基と対応するアミノ酸残基の数字の位置を参照して番号付けすることができる。例えば、本出願に記載されているような配列整列アルゴリズムは、クエリシーケンス（「参照配列」ともいう）に比べてアミノ酸の位置、または置換、挿入または欠失などの変形が発生する位置を確認することができる。
【0034】
そのような整列には、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３）、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ： Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ， Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６： ２７６－２７７）などを用いることができるが、これに限定されず、当業界に知られている配列整列プログラム、ペアワイズ配列（ｐａｉｒｗｉｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）比較アルゴリズムなどを適宜用いることができる。
【0035】
一具現例として、本出願の変異体は、配列番号１のポリペプチドと約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有し、配列番号１の１８２番の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものであってもよい。
【0036】
一具現例として、本出願の変異体は、配列番号５で記載されたアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％または９９．９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含めてもよい。
【0037】
具体的には、本出願の変異体は、配列番号５で記載されたアミノ酸配列を有してもよく（ｈａｖｉｎｇ）、含んでもよく（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、構成されてもよく（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）、上記アミノ酸配列で 必須的に構成され（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）てもよい。
【0038】
一具現例として、本出願の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を基準に１８２番の位置に対応するアミノ酸がアラニンであり、上記配列番号５で記載されたアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％または９９．９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。また、このような相同性または同一性を有し、本出願の変異体に対応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有する変異体も本出願の範囲内に含まれることは自明である。
【0039】
例えば、上記アミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端そして／または内部に本出願の変異体の機能を変更しない配列の追加または欠失、自然に発生し得る突然変異、サイレント突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）または保存的置換を有する場合である。
【0040】
前記「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、あるアミノ酸を類似の構造的及び／または化学的性質を有する他のアミノ酸で置換させることを意味する。そのようなアミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／または両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）における類似性に基づいて起こり得る。通常、保存的置換はタンパク質またはポリペプチドの活性にほとんど影響を及ぼさないか、または影響を及ぼさない。
【0041】
本出願において、用語「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列相互間の類似度を意味し、百分率で表すことができる。用語の相同性及び同一性はしばしば互換的に使用することができる。
【0042】
保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準的な配列アルゴリズムにより決定され、使用されるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に使用されてもよい。実質的に、相同性を有したり（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）配列は、一般に、配列の全部または一部と中程度または高いストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）でハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドにおける一般のコドンまたはコドン縮退性を考慮したコドンを含有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることが自明である。
【0043】
任意の２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） ［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５］： ２４４４でのようなデフォルトパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの既知のコンピュータアルゴリズムを使用して決定されてもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ， Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６： ２７６－２７７）（バージョン５．０．０または以降のバージョン）で行われるような、ニードルマン－ウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３）を使用して決定されてもよい（ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２： ３８７ （１９８４））， ＢＬＡＳＴＰ， ＢＬＡＳＴＮ， ＦＡＳＴＡ （Ａｔｓｃｈｕｌ， ［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ， Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］： ４０３ （１９９０）； Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ， Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ， ［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４，及び［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴ ＡＬ．］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８： １０７３を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴまたはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性または同一性を決定することができる。
【0044】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ （１９８１） ２：４８２において公知となっているように、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９７０）， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４８：４４３のようなＧＡＰコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することにより決定されてもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列中、より短いものにおける記号の総数であり、類似の配列された記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を除した値と定義することができる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）二進法比較マトリックス（同一性のために１、そして非－同一性のために０の値を含む）、及びＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ．， Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ． ３５３－３５８ （１９７９）により開示されているように、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ６７４５の加重比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップにおいて各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；（３）末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。
【0045】
一具現例として、本出願の変異体はプレフェナート脱水酵素活性を有してもよい。一具現例として、本出願の変異体は、野生型あるいは非変異プレフェナート脱水酵素に比べ、分岐鎖アミノ酸生産能を増加させる活性を有してもよい。一具現例として、本出願の変異体は、野生型あるいは非変異プレフェナート脱水酵素に比べ、分岐鎖アミノ酸産生経路の副産物産生レベルを低下させる活性を有してもよい。一具現例として、本出願の変異体は、野生型あるいは非変異プレフェナート脱水酵素に比べ、弱化された活性を有するものであってもよい。しかし、これに制限されない。
【0046】
本出願のもう一つの様態は、本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0047】
本出願において、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体（ｍｏｎｏｍｅｒ）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（ｐｏｌｙｍｅｒ）で、一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖であり、より具体的には、上記変異体をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
【0048】
本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５で記載されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでもよい。本出願の一例として、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号６の配列を有するか、または含むことができる。また、出願のポリヌクレオチドは、配列番号６の配列からなってもよく、必須に構成されてもよい。
【0049】
本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）または本出願の変異体を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、本出願の変異体のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が行われてもよい。具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号６の配列と相同性または同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満の塩基配列を有してもよく、含んでもよく、または配列番号６の配列と相同性または同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満の塩基配列からなってもよく、または必須に構成されてもよいが、これらに限定されない。
【0050】
この時、上記相同性または同一性を有する配列において、配列番号６の１８２番の位置に対応するアミノ酸をコードするコドンは、アラニンをコードするコドンの一つであってもよい。
【0051】
また、本出願のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から製造されるプローブ、例えば、本出願のポリヌクレオチド配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる配列であれば、制限なく含まれる。前記「ストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９； Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ９．５０－９．５１， １１．７－１１．８を参照）に具体的に記載されている。例えば、相同性または同一性の高いポリヌクレオチド同士、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性または同一性を有するポリヌクレオチド同士をハイブリダイズし、それより相同性または同一性の低いポリヌクレオチド同士をハイブリダイズしない条件、または通常のサザンハイブリダイゼーション（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的に２回～３回洗浄する条件を列挙することができる。
【0052】
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格度に応じて塩基間のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語「相補的」は、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに使用される。例えば、ＤＮＡに関し、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願のポリヌクレオチドは、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、配列全体に相補的な単離された核酸断片を含んでもよい。
【0053】
具体的には、本出願のポリヌクレオチドと相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーション段階を含むハイブリダイゼーション条件を用い、上述の条件を用いて探知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節することができる。
【0054】
前記ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，同上）。
【0055】
本出願のもう一つ一態様は、本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを提供することである。前記ベクターは、前記ポリヌクレオチドを宿主細胞で発現させるための発現ベクターであってもよいが、これらに限定されない。
【0056】
本出願の「ベクター」は、適切な宿主内で目的ポリペプチドを発現させることができるように、適切な発現調節領域（または発現調節配列）に作動可能に連結された前記目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含むＤＮＡ製造物を含んでもよい。前記発現調節領域は、転写を開始し得るプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を制御する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノム自体に統合されてもよい。
【0057】
本出願で使用されるベクターは、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージを挙げることができる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしてｐＤＣ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。
【0058】
一例として、細胞内における染色体挿入用ベクターを通じて目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に知られている任意の方法、例えば相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により行われてもよいが、これらに限定されない。前記染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。前記選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち、目的核酸分子の挿入有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面ポリペプチドの発現のような選別可能表現型を付与するマーカーが使用されてもよい。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみが生存するか、または他の発現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
【0059】
本出願における用語「形質転換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞または微生物内に導入し、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現できる限り、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、または染色体外に位置するかに関係なく、それらいずれも含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ及び／またはＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、如何なる形態でも導入されてもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体で発現されるのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位、及び翻訳終結信号を含んでもよい。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに限定されない。
【0060】
また、前記において用語「作動可能に連結」されたとは、本出願の目的変異体をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。
【0061】
本出願の他の一つの様態は、本出願の変異体、本出願のポリヌクレオチド及び本出願のベクターを含む、コリネバクテリウム属微生物を提供する。
【0062】
本出願の微生物は、本出願の変異型ポリペプチド、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを含んでもよい。
【0063】
本出願において、「微生物」または「菌株」とは、野生型微生物や天然または人為的に遺伝的変形が生じた微生物を全て含み、外部遺伝子が挿入されたり、または内在的遺伝子の活性が増強されたり、不活性化されるなどの原因により、特定の機序が弱化または強化された微生物であり、所望のポリペプチド、タンパク質または産物の生産のための遺伝的変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含む微生物であってもよい。
【0064】
本出願の菌株は、本出願の変異体、本出願のポリヌクレオチド及び本出願のポリヌクレオチドを含むベクターのいずれか一つ以上を含む菌株；本出願の変異体または本出願のポリヌクレオチドを発現するように変形された菌株；本出願の変異体、または本出願のポリヌクレオチドを発現する菌株（例えば、組換え菌株）；または本出願の変異体活性を有する菌株（例えば、組換え菌株）であってもよいが、これに制限されない。
【0065】
本出願の菌株は分岐鎖アミノ酸生産能を有する菌株であってもよい。
【0066】
本出願の菌株は自然にプレフェナート脱水酵素または分岐鎖アミノ酸生産能を有している微生物、またはプレフェナート脱水酵素または分岐鎖アミノ酸生産能のない親株に、本出願の変異体またはこれをコードするポリヌクレオチド（または上記ポリヌクレオチドを含むベクター）が導入されるか、及び／または分岐鎖アミノ酸生産能が与えられた微生物であってもよいが、これに限定されない。
【0067】
一例として、本出願の菌株は、本出願のポリヌクレオチドまたは本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換され、本出願の変異体を発現する細胞または微生物であり、本出願の目的上、本出願の菌株は、本出願の変異体を含み分岐鎖アミノ酸を生産できる全ての微生物を含んでもよい。例えば、本出願の菌株は、天然の野生型微生物、または分岐鎖アミノ酸を生産する微生物に本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドが導入されることによりプレフェナート脱水酵素変異体が発現され、分岐鎖アミノ酸生産能が増加した組換え菌株であってもよい。上記分岐鎖アミノ酸生産能が増加した組換え菌株は、天然の野生型微生物、またはプレフェナート脱水酵素非変形微生物（即ち、野生型プレフェナート脱水酵素を発現する微生物）に比べて分岐鎖アミノ酸生産能が増加した微生物であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0068】
一例として、上記分岐鎖アミノ酸生産能の増加有無を比較する対象菌株である、プレフェナート脱水酵素非変形微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株であってもよい。他の例として、上記分岐鎖アミノ酸生産能の増加有無を比較する対象菌株である、プレフェナート脱水酵素非変形微生物は、ＣＪＬ－８１０９、ＫＣＣＭ１２７３９Ｐ（ＣＡ１０－３１０１）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐであってもよいが、これに制限されない。
【0069】
一例として、上記組換え菌株は、変異前の親株または非変形微生物の分岐鎖アミノ酸生産能に比べて約１％以上、具体的には、約３％、約５％以上高くなったものであってもよいが、変異前の親株または非変形微生物の生産能に比べて＋値の増加量を有する限り、これに制限されない。
【0070】
他の例として、上記組換え菌株は、変異前の親株または非変形微生物に比べて分岐鎖アミノ酸生産経路で生成される副産物の生産量が約５０％以下、具体的には、約３０％以下、約１０％以下に低くなったものであってもよく、または副産物が生産されないものであってもよいが、これに制限されない。
【0071】
上記用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などを全て含む範囲であり、約という用語に続く数値と同等又は類似の範囲の数値を全て含むが、これに限定されない。
【0072】
本出願において「分岐鎖アミノ酸」は、側鎖に分岐アルキル基があるアミノ酸をいい、バリン、ロイシン及びイソロイシンを含む。具体的には、本出願において上記分岐鎖アミノ酸はＬ－分岐鎖アミノ酸であってもよく、上記Ｌ－分岐鎖アミノ酸はＬ－バリン、Ｌ－ロイシン及びＬ－イソロイシンから選択される１以上であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0073】
本出願において分岐鎖アミノ酸生産経路で生成される副産物は、分岐鎖アミノ酸以外の物質を意味し、具体的には、芳香族（ａｒｏｍａｔｉｃ）アミノ酸、より具体的には、Ｌ－チロシン及びＬ－フェニルアラニンから選択される１以上であってもよい。しかし、これに制限されない。
【0074】
本出願において、用語「非変異型微生物」とは、微生物に自然に生じ得る突然変異を含む菌株を除外するものではなく、野生型菌株または天然型菌株自体であるか、自然的または人為的要因による遺伝的変異で形質変化する前の菌株を意味する。例えば、前記非変形微生物は、本出願のプレフェナート脱水酵素変異体が導入されないか、または導入される前の菌株を意味する。「非変形微生物」は、「変形前の菌株」、「変異前の微生物」、「非変異菌株」、「非変形菌株」、「非変異微生物」または「基準微生物」と混用され得る。
【0075】
一具現例として、本出願の微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ ）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウム・デセルティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・シングラレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウム・イミタンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）またはコリネバクテリウム・フラベッセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）であってもよい。
【0076】
本出願の微生物は、分岐鎖アミノ酸生産能を増加させる変異を追加でさらに含んでもよい。
【0077】
一具現例として、本出願の微生物は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、スレオニンデヒドラターゼ、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、クエン酸シンターゼの一つ以上の活性変更を含んでもよい。
【0078】
一具現例として、本出願の微生物は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ｂｒａｎｃｈｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及びスレオニンデヒドラターゼ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）の一つ以上の活性がさらに強化された微生物であってもよい。
【0079】
しかし、前述した内容に制限されず、生産しようとする分岐鎖アミノ酸により当業者は微生物が含む追加の変形を適宜選択できる。
【0080】
本出願において用語、ポリペプチド活性の「強化」とは、ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて増加することを意味する。前記強化は、活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、上方制御（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、増加（ｉｎｃｒｅａｓｅ）などの用語と混用され得る。ここで、活性化、強化、上方制御、過剰発現、増加は、本来有していなかった活性を示すこと、または内在的活性または変形前の活性に比べて向上した活性を示すようになることを全て含むことができる。前記「内在的活性」とは、天然または人為的要因による遺伝的変異で形質が変化した場合、形質転換前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が、内在的活性に比べて「強化」、「上方制御」、「過剰発現」または「増加」するとは、形質転換前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性及び／または濃度（発現量）に比べて向上したことを意味する。
【0081】
前記強化は、外来のポリペプチドを導入するか、または内在的なポリペプチドの活性強化及び／または濃度（発現量）を通じて達成することができる。前記ポリペプチドの活性の強化有無は、当該ポリペプチドの活性度、発現量または当該ポリペプチドから排出される産物の量の増加から確認することができる。
【0082】
前記ポリペプチドの活性の強化は、当分野においてよく知られた様々な方法の適用が可能であり、目的のポリペプチドの活性を改変前の微生物より強化させることができる限り、限定されない。具体的には、分子生物学の日常的な方法である当業界の通常の技術者によく知られた遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を利用したものであってもよいが、これに限定されない（例えば、Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１０， Ｖｏｌ． ２． １－１６， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。
【0083】
具体的には、本出願のポリペプチドの強化は、
１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加；
２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性の強力な配列で交換；
３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５′－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
４）ポリペプチド活性が強化されるように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形；
５）ポリペプチド活性が強化されるように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が強化されるように変形されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形）；
６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはそれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入；
７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選択して変形するか、または化学的に修飾；または
９）前記１）～８）から選択される２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。
１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加；
２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性の強力な配列で交換；
３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５′－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
４）ポリペプチド活性が強化されるように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形；
５）ポリペプチド活性が強化されるように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が強化されるように変形されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形）；
６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはそれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入；
７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選択して変形するか、または化学的に修飾；または
９）前記１）～８）から選択される２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。
【0084】
より具体的には、
前記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製して機能し得るベクターの宿主細胞内への導入により達成されるものであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞内の染色体内に１コピーまたは２コピー以上の導入により達成されるものであってもよい。前記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行うことができるが、これらに限定されない。前記ベクターは、前述の通りである。
前記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製して機能し得るベクターの宿主細胞内への導入により達成されるものであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞内の染色体内に１コピーまたは２コピー以上の導入により達成されるものであってもよい。前記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行うことができるが、これらに限定されない。前記ベクターは、前述の通りである。
【0085】
前記２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域（または発現調節配列）を活性の強力な配列での交換は、例えば、前記発現調節領域の活性をさらに強化するように欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはそれらの組合せにより配列上の変異の発生、またはより強い活性を有する配列への交換であってもよい。前記発現調節領域は、特にこれに限定されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写及び解読の終結を調節する配列などを含んでもよい。一例として、本来のプロモーターを強力なプロモーターと交換させることであってもよいが、これらに限定されない。
【0086】
公知の強力なプロモーターの例としては、ｃｊ１～ｃｊ７プロモーター（米国特許ＵＳ ７６６２９４３ Ｂ２）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（米国登録特許ＵＳ １０５８４３３８ Ｂ２）、Ｏ２プロモーター（米国登録特許ＵＳ １０２７３４９１ Ｂ２）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどがあるが、これらに限定されない。
【0087】
前記３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５′－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がより高い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換することであってもよいが、これらに限定されない。
【0088】
前記４）及び５）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を強化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせにより配列上の変異の発生、またはより強い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列または活性が増加するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記交換は、具体的には、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体内に挿入することにより行うことができるが、これらに限定されない。このときに使用されるベクターは、染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。前記選別マーカーは前述の通りである。
【0089】
前記６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドの導入は、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドの宿主細胞内の導入であってもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限はない。前記導入に用いられる方法は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現されることによりポリペプチドが生成し、その活性が増加されてもよい。
【0090】
前記７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化は、内在ポリヌクレオチドが宿主細胞内で転写または翻訳が増加するようにコドン最適化したものであるか、または外来ポリヌクレオチドが宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるようにそのコドンを最適化したものであってもよい。
【0091】
前記８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選択して変形または化学的に修飾することは、例えば、分析しようとするポリペプチドの配列情報を既知のタンパク質の配列情報が格納されたデータベースと比較することにより、配列の類似性の程度にしたがって、鋳型タンパク質候補を決定し、それに基づいて構造を確認し、変形または化学的に修飾する露出部位を選択して変形または修飾することであってもよい。
【0092】
このようなポリペプチド活性の強化は、対応するポリペプチドの活性または濃度発現量が野生型や変形前の微生物菌株で発現されたポリペプチドの活性または濃度を基準にして増加するか、または当該ポリペプチドから生産される産物の量が増加することであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0093】
本出願の微生物においてポリヌクレオチドの一部または全部の変形は、（ａ）微生物内の染色体挿入用ベクターを用いた相同組換えまたは遺伝子はさみ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ，ｅ．ｇ．，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）を用いたゲノム編集及び／または（ｂ）紫外線及び放射線などのような光及び／または化学物質の処理により誘発されてもよいが、これらに限定されない。前記遺伝子の一部または全体の変形方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法を含むことができる。例えば、目的遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはベクターを前記微生物に注入して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を起こさせるようにして、遺伝子の一部または全体の欠損がなされてもよい。前記注入されるヌクレオチド配列またはベクターは、優性選別マーカーを含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
【0094】
本出願における用語、ポリペプチド活性の「弱化」は、内在的活性に比べて活性が減少または活性がないことを全て含む概念である。前記弱化は、不活性化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、欠乏（ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、下方制御（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）、低下（ｒｅｄｕｃｅ）、減衰（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）などの用語と混用され得る。
【0095】
前記弱化は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異などにより、ポリペプチド自体の活性が本来微生物が有しているポリペプチドの活性に比べて減少または除去された場合、それをコードするポリヌクレオチドの遺伝子の発現阻害またはポリペプチドへの翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）阻害などにより細胞内で全体的なポリペプチド活性度及び／又は濃度（発現量）が天然型菌株に比べて低い場合、前記ポリヌクレオチドの発現が全く行われていない場合、及び／又はポリヌクレオチドの発現にもかかわらず、ポリペプチドの活性がない場合も含むことができる。前記「内在的活性」とは、天然または人為的要因による遺伝的変異により形質が変化した場合、形質転換前の親株、野生型または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて「不活性化、欠乏、減少、下方制御、低下、減衰」するということは、形質転換前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性に比べて低下したことを意味する。
【0096】
そのようなポリペプチドの活性の弱化は、当業界に知られた任意の方法により行うことができるが、これらに限定されるものではなく、当該分野においてよく知られている様々な方法の適用により達成されてもよい（例えば、Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． ２０１４；１５（２）：２７７３－２７９３， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。
【0097】
具体的には、本出願のポリペプチドの弱化は、
１）ポリペプチドをコードする遺伝子の全部または一部の欠損；
２）ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域（または発現調節配列）の変形；
３）ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸配列の変形（例えば、アミノ酸配列上の１以上のアミノ酸の削除／置換／付加）；
４）ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、前記ポリペプチドをコードする遺伝子配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように変形されたポリペプチドをコードするように、前記ポリペプチド遺伝子の核酸塩基配列上の１以上の核酸塩基の削除／置換／追加）；
５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５′－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
６）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入；
７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な二次構造物を形成させるためにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加；
８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３′末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＲＴＥ）；または
９）前記１）～８）から選択された２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。
１）ポリペプチドをコードする遺伝子の全部または一部の欠損；
２）ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域（または発現調節配列）の変形；
３）ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸配列の変形（例えば、アミノ酸配列上の１以上のアミノ酸の削除／置換／付加）；
４）ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、前記ポリペプチドをコードする遺伝子配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように変形されたポリペプチドをコードするように、前記ポリペプチド遺伝子の核酸塩基配列上の１以上の核酸塩基の削除／置換／追加）；
５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５′－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
６）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入；
７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な二次構造物を形成させるためにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加；
８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３′末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＲＴＥ）；または
９）前記１）～８）から選択された２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。
【0098】
例えば、
前記１）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の一部または全部の欠損は、染色体内の内在的目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド全体の除去、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチドへの交換、またはマーカー遺伝子への交換であってもよい。
前記１）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の一部または全部の欠損は、染色体内の内在的目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド全体の除去、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチドへの交換、またはマーカー遺伝子への交換であってもよい。
【0099】
また、前記２）発現調節領域（又は発現調節配列）の変形は、欠失、挿入、非保存的若しくは保存的置換又はこれらの組み合わせで発現調節領域（又は発現調節配列）上の変異が発生、又は更に弱い活性を有する配列への交換であってもよい。前記発現調節領域には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列が含むが、これらに限定されるものではない。
【0100】
また、上記３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ地域をコードする塩基配列変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がさらに低い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換されるものであってもよいが、これに制限されない。
【0101】
また、前記４）及び５）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を弱化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはそれらの組み合わせで、配列上の変異の発生、またはより弱い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列もしくは活性がないように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これに限定されるものではない。例えば、ポリヌクレオチド配列内の変異を導入して終結コドンを形成することにより、遺伝子の発現を阻害または弱化させることができるが、これに限定されない。
【0102】
前記６）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入は、例えば、文献［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｒｅｖｉｅｗｓ － Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｖｏｌ． １（１） １９８６］を参照することができる。
【0103】
前記７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な二次構造物を形成させるために、ポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加はｍＲＮＡ翻訳を不可能にするか、または速度を低下させるものであってもよい。
【0104】
前記８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３′の末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＲＴＥ）は、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の転写体に相補的なアンチセンスヌクレオチドを作って活性を弱化するものであってもよい。
【0105】
本出願の微生物において、変異体、ポリヌクレオチド、ベクター及び分岐鎖アミノ酸については他の様態で記載した通りである。
【0106】
本出願のもう一つの様態は、本出願のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階を含む、分岐鎖アミノ酸生産方法を提供する。
【0107】
本出願において、用語「培養」とは、本出願のコリネバクテリウム属微生物を適切に調節された環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当業界に知られている適当な培地と培養条件に応じて行うことができる。このような培養過程は、選択される菌株に応じて当業者が容易に調整して使用することができる。具体的には、前記培養は、回分式、連続式及び／または流加式であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0108】
本出願において、用語「培地」とは、本出願のコリネバクテリウム属微生物を培養するために必要とする栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質及び発育因子などを供給する。具体的には、本出願のコリネバクテリウム属微生物の培養に用いられる培地及びその他の培養条件は、通常の微生物の培養に使用される培地であれば、特に制限なくいずれも使用できるが、本出願のコリネバクテリウム属微生物を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地内で好気性条件下で温度、ｐＨ等を調節しながら培養することができる。
【0109】
具体的には、コリネバクテリウム属微生物に対する培養培地は、文献［″Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ″ ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ＵＳＡ， １９８１）］で見ることができる。
【0110】
本出願において、前記炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどのような炭水化物；マンニトール、ソルビトールなどのような糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などのような有機酸；グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのようなアミノ酸などを含むことができる。また、澱粉加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米ぬか、キャッサバ、バカス及びトウモロコシ浸漬液のような天然の有機栄養源を用いることができ、具体的には、グルコース及び殺菌された前処理糖蜜（すなわち、還元糖に転換された糖蜜）などのような炭水化物を使用することができ、その他の適量の炭素源を制限なく多様に利用することができる。これらの炭素源は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよく、これに限定されるものではない。
【0111】
前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのような無機窒素源；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのようなアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物などのような有機窒素源が使用されてもよい。これらの窒素源は、単独で使用し、２種以上を組み合わせて使用してもよく、これに限定されるものではない。
【0112】
前記リン源としては、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、またはそれに対応するナトリウム含有塩などが含まれてもよい。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使用されてもよく、それ以外にアミノ酸、ビタミン及び／または適切な前駆体などが含まれてもよい。これらの構成成分または前駆体は、培地に回分式または連続式で添加されてもよい。しかし、これに限定されるものではない。
【0113】
また、本出願のコリネバクテリウム属微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などのような化合物を培地に適切な方法で添加し、培地のｐＨを調整することができる。また、培養中は脂肪酸ポリグリコールエステルなどのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。また、培地の好気状態を維持するために、培地内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入することができ、これに限定されるものではない。
【0114】
本出願の培養において、培養温度は２０～４５℃、具体的には２５～４０℃を維持することができ、約１０～１６０時間培養することができるが、これに限定されるものではない。
【0115】
本出願の培養により生産された分枝鎖アミノ酸は、培地中に分泌されるか、または細胞内に残留する。
【0116】
本出願の分枝鎖アミノ酸生産方法は、本出願のコリネバクテリウム属微生物を準備する段階、前記菌株を培養するための培地を準備する段階、またはこれらの組み合わせ（順は無関係、ｉｎ ａｎｙ ｏｒｄｅｒ）を、例えば、前記培養段階の前に、さらに含むことができる。
【0117】
本出願の分枝鎖アミノ酸生産方法は、前記培養による培地（培養済み培地）または本出願のコリネバクテリウム属微生物から分枝鎖アミノ酸を回収する段階をさらに含むことができる。前記回収する段階は、前記培養する段階の後にさらに含むことができる。
【0118】
前記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などにより当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて所望の分枝鎖アミノ酸を収集（ｃｏｌｌｅｃｔ）することであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣまたはそれらの方法を組み合わせて使用することができ、当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて培地または微生物から所望の分枝鎖アミノ酸を回収することができる。
【0119】
また、本出願の分枝鎖アミノ酸生産方法は、さらに精製段階を含んでもよい。前記精製は、当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて行うことができる。一例として、本出願の分枝鎖アミノ酸生産方法が回収段階と精製段階の両方を含む場合、回収段階及び精製段階は、順序に関係なく異時的（または連続的）に行われるか、または同時にまたは一つの段階に統合されて行うことができるが、これに限定されるものではない。
【0120】
本出願の方法において、変異体、ポリヌクレオチド、ベクター及び微生物などは、上記他の様態で記載した通りである。
【0121】
本出願の他の一つの様態は、本出願の変異体、上記変異体をコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクターまたは本出願のポリヌクレオチドを含むコリネバクテリウム属微生物；それを培養した培地；またはそれらのうち２以上の組合わせを含む分岐鎖アミノ酸生産用組成物を提供することである。
【0122】
本出願の組成物は、分岐鎖アミノ酸生産用組成物に通常使用される任意の適切な賦形剤をさらに含むことができ、そのような賦形剤は、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤または等張化剤などであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0123】
本出願の組成物において、変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、菌株、培地及び分岐鎖アミノ酸などは上記他の様態で記載した通りである。
【0124】
本出願の他の一つの様態は、本出願のプレフェナート脱水酵素変異体；上記プレフェナート脱水酵素変異体をコードするポリヌクレオチド；及び上記ポリヌクレオチドを含むベクターのうち１以上を含む微生物の、分岐鎖アミノ酸生産用途を提供する。
【0125】
本出願の用途において、変異体、ポリヌクレオチド、ベクター及び微生物などは、上記他の様態で記載した通りである。
【0126】
以下、本出願を実施例及び実験例を通じてより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例及び実験例は本出願を例示的に説明するためのことであり、本出願の範囲がこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。
【0127】
実施例１：ｐｈｅＡ変異の発掘
実施例１－１．ｐｈｅＡを含むベクター製作
プレフェナート脱水酵素の活性を有するｐｈｅＡ変異ライブラリを製作するために、まずｐｈｅＡを含む組換えベクターを製作した。野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のｐｈｅＡタンパク質（配列番号１、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ１０３４１）をコードするｐｈｅＡ遺伝子（配列番号２）を増幅するために、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２野生株の染色体を鋳型とし、配列番号３及び４のプライマーを用いて９４℃で１分間変性、５８℃で３０秒間結合、７２℃で１分間Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼで重合する条件を２５回繰り返すＰＣＲ方法を行った。用いたプライマーの具体的な配列は、表１に記載した。上記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大腸菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングして「ｐＣＲ－ｐｈｅＡ」を得た。
実施例１－１．ｐｈｅＡを含むベクター製作
プレフェナート脱水酵素の活性を有するｐｈｅＡ変異ライブラリを製作するために、まずｐｈｅＡを含む組換えベクターを製作した。野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のｐｈｅＡタンパク質（配列番号１、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ１０３４１）をコードするｐｈｅＡ遺伝子（配列番号２）を増幅するために、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２野生株の染色体を鋳型とし、配列番号３及び４のプライマーを用いて９４℃で１分間変性、５８℃で３０秒間結合、７２℃で１分間Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼで重合する条件を２５回繰り返すＰＣＲ方法を行った。用いたプライマーの具体的な配列は、表１に記載した。上記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大腸菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングして「ｐＣＲ－ｐｈｅＡ」を得た。
【0128】
【表1】
【0129】
実施例１－２．ｐｈｅＡ変異ライブラリの製作
上記実施例１－１で製作されたベクターを基盤にｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ（登録商標） ＰＣＲ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）を用いてｐｈｅＡ変異ライブラリを製作した。１０００ｂｐ当り０～３個の変異が発生し得る条件で、配列番号３及び配列番号４をプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。具体的には、９４℃で３０秒間プレヒーティング（ｐｒｅ－ｈｅａｔｉｎｇ）後、９４℃で３０秒、６８℃で１分３０秒の過程を２５回（ｃｙｃｌｅ）繰り返してＰＣＲ反応を行った。この時、得られたＰＣＲ産物をｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ（５０～１２５ｎｇ）として９５℃で５０秒、６０℃で５０秒、６８℃で１２分の過程を２５回繰り返して行った後ＤｐｎＩ処理し、大腸菌ＤＨ５αに熱衝撃方法を通じて形質転換してカナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換されたコロニー２０種を選別した後、プラスミドを獲得して塩基配列を分析した結果、２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ／ｋｂの頻度で互いに異なる位置に変異が導入されたことを確認した。約２０，０００個の形質転換された大腸菌コロニーを取ってプラスミドを抽出し、これを「ｐＴＯＰＯ－ｐｈｅＡ－ｌｉｂｒａｒｙ」と命名した。
上記実施例１－１で製作されたベクターを基盤にｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ（登録商標） ＰＣＲ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）を用いてｐｈｅＡ変異ライブラリを製作した。１０００ｂｐ当り０～３個の変異が発生し得る条件で、配列番号３及び配列番号４をプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。具体的には、９４℃で３０秒間プレヒーティング（ｐｒｅ－ｈｅａｔｉｎｇ）後、９４℃で３０秒、６８℃で１分３０秒の過程を２５回（ｃｙｃｌｅ）繰り返してＰＣＲ反応を行った。この時、得られたＰＣＲ産物をｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ（５０～１２５ｎｇ）として９５℃で５０秒、６０℃で５０秒、６８℃で１２分の過程を２５回繰り返して行った後ＤｐｎＩ処理し、大腸菌ＤＨ５αに熱衝撃方法を通じて形質転換してカナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換されたコロニー２０種を選別した後、プラスミドを獲得して塩基配列を分析した結果、２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ／ｋｂの頻度で互いに異なる位置に変異が導入されたことを確認した。約２０，０００個の形質転換された大腸菌コロニーを取ってプラスミドを抽出し、これを「ｐＴＯＰＯ－ｐｈｅＡ－ｌｉｂｒａｒｙ」と命名した。
【0130】
実施例２：製作したライブラリ評価及び変異体の選別
実施例２－１．Ｌ－ロイシン及びＬ－フェニルアラニン生産量増加及び低減された変異菌株の選別
上記実施例１－２で製作されたｐＴＯＰＯ－ｐｈｅＡ－ｌｉｂｒａｒｙを野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２に電気穿孔法で形質転換した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した栄養培地（表２）に塗抹して変異遺伝子が挿入された菌株１０，０００個のコロニーを選別した。選別された各コロニーをＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｐｈｅＡ（ｍｔ）１からＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｐｈｅＡ（ｍｔ）１０，０００と命名した。
実施例２－１．Ｌ－ロイシン及びＬ－フェニルアラニン生産量増加及び低減された変異菌株の選別
上記実施例１－２で製作されたｐＴＯＰＯ－ｐｈｅＡ－ｌｉｂｒａｒｙを野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２に電気穿孔法で形質転換した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した栄養培地（表２）に塗抹して変異遺伝子が挿入された菌株１０，０００個のコロニーを選別した。選別された各コロニーをＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｐｈｅＡ（ｍｔ）１からＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｐｈｅＡ（ｍｔ）１０，０００と命名した。
【0131】
確保された１０，０００個のコロニー中、Ｌ－ロイシン生産が増えながら芳香族アミノ酸中、Ｌ－フェニルアラニン生産量が増加及び低減されるコロニーを確認するために、それぞれのコロニーに対して下記のような方法で発酵力価評価を進行した。
【0132】
【表2】
【0133】
加圧殺菌した生産培地（表２）２５ｍｌに２５ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各コロニーを白金耳を用いて接種した後、３０℃で６０時間２００ｒｐｍで振盪培養した。培養終了後に高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ，ＳＨＩＭＡＺＤＵ ＬＣ２０Ａ）を用いた方法によりＬ－ロイシン及び芳香族アミノ酸中のＬ－フェニルアラニンを測定した。
【0134】
確保された１０，０００個のコロニー中、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２）比Ｌ－ロイシン生産能が最も向上し、Ｌ－フェニルアラニン生産量が低減した菌株（ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｐｈｅＡ（ｍｔ）３８９１）の１種を選別した。選別された菌株から生産されたＬ－ロイシン（Ｌｅｕ）及びＬ－フェニルアラニン（Ｐｈｅ）の濃度は、下記の表３の通りである。
【0135】
【表3】
【0136】
上記表３に示された通り、ｐｈｅＡ遺伝子に変異があるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｐｈｅＡ（ｍｔ）３８９１は親株比Ｌ－ロイシン生産量が約１．４倍向上し、Ｌ－フェニルアラニンが約７倍低減することを確認した。
【0137】
実施例２－２．Ｌ－ロイシン及びＬ－フェニルアラニン生産量の増加及び低減された菌株の変異の確認
選別された変異菌株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｐｈｅＡ（ｍｔ）３８９１のｐｈｅＡ遺伝子変異を確認するために、表１に記載された配列番号３と配列番号４のプライマーを用いて各変異菌株のＤＮＡを鋳型とし、９４℃で５分間変性後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒を３０回繰り返した後、７２℃で５分の条件でＰＣＲを行ってＤＮＡシーケンシングを進行した。
選別された変異菌株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｐｈｅＡ（ｍｔ）３８９１のｐｈｅＡ遺伝子変異を確認するために、表１に記載された配列番号３と配列番号４のプライマーを用いて各変異菌株のＤＮＡを鋳型とし、９４℃で５分間変性後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒を３０回繰り返した後、７２℃で５分の条件でＰＣＲを行ってＤＮＡシーケンシングを進行した。
【0138】
シーケンシングの結果、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｐｈｅＡ（ｍｔ）３８９１菌株はｐｈｅＡ遺伝子の５４４－５４６番目、ヌクレオチドであるＣＧＣがＧＣＧで置換されていることを確認した。これは、ｐｈｅＡタンパク質の１８２番目のアミノ酸であるアルギニンがアラニンで置換された変異体（以下、Ｒ１８２Ａ）をコードできることを意味する。ｐｈｅＡ変異体（Ｒ１８２Ａ）のアミノ酸配列及びこれをコードするｐｈｅＡ変異体の塩基配列は、配列番号５及び６の通りである。
【0139】
従って、以下の実施例では、上記変異（Ｒ１８２Ａ）がコリネバクテリア属微生物のＬ－ロイシン及び芳香族アミノ酸の生産に影響を及ぼすかを確認することにした。
【0140】
実施例３：選別された変異菌株のＬ－ロイシン及びＬ－フェニルアラニン生産能の確認
実施例３－１．ｐｈｅＡ変異を含む挿入ベクターの製作
上記実施例２で選別された変異を菌株内に導入するために、挿入用ベクターを製作しようとした。ｐｈｅＡ（Ｒ１８２Ａ）変異導入用ベクターの製作は、部位特異的突然変異誘発（Ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法を用いた。コリネバクテリウム・グルタミカム野生型の染色体を鋳型とし、Ｒ１８２Ａ変異を生成するために、配列番号７及び８のプライマー、配列番号９及び１０のプライマー対を用い、ＰＣＲを行った。具体的には、９４℃で５分間変性後に９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒を３０回繰り返した後、７２℃で５分の条件でＰＣＲを行った。用いたプライマーの具体的な配列は、表４に記載した。
実施例３－１．ｐｈｅＡ変異を含む挿入ベクターの製作
上記実施例２で選別された変異を菌株内に導入するために、挿入用ベクターを製作しようとした。ｐｈｅＡ（Ｒ１８２Ａ）変異導入用ベクターの製作は、部位特異的突然変異誘発（Ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法を用いた。コリネバクテリウム・グルタミカム野生型の染色体を鋳型とし、Ｒ１８２Ａ変異を生成するために、配列番号７及び８のプライマー、配列番号９及び１０のプライマー対を用い、ＰＣＲを行った。具体的には、９４℃で５分間変性後に９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒を３０回繰り返した後、７２℃で５分の条件でＰＣＲを行った。用いたプライマーの具体的な配列は、表４に記載した。
【0141】
【表4】
【0142】
その結果、得られたＰＣＲ産物をＳｍａＩ制限酵素で切断させた線状のｐＤＣＭ２ベクター（韓国公開特許ＫＲ１０－２０２０－０１３６８１３Ａ）とＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素を用いてＤＮＡ断片間の末端１５ｂａｓｅの相同配列をｆｕｓｉｏｎさせてクローニングし、ｐｈｅＡの１８２番のアミノ酸をアラニンで置換するベクター「ｐＤＣＭ２－ｐｈｅＡ（Ｒ１８２Ａ）」を製作した。
【0143】
実施例３－２．ＡＴＣＣ１３０３２菌株内変異体の導入及び評価
上記実施例３－１で製作したｐＤＣＭ２－ｐｈｅＡ（Ｒ１８２Ａ）ベクターをＡＴＣＣ１３０３２に電気穿孔法で形質転換し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で選別した。選別された１次菌株は、再度２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的には、形質転換された菌株のｐｈｅＡ遺伝子変異導入如何は、配列番号３と配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、塩基配列を分析することにより、菌株内変異が導入されたことを確認した。製作された菌株は計３種であり、ＡＴＣＣ１３０３２＿ｐｈｅＡ＿Ｒ１８２Ａと命名した。
上記実施例３－１で製作したｐＤＣＭ２－ｐｈｅＡ（Ｒ１８２Ａ）ベクターをＡＴＣＣ１３０３２に電気穿孔法で形質転換し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で選別した。選別された１次菌株は、再度２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的には、形質転換された菌株のｐｈｅＡ遺伝子変異導入如何は、配列番号３と配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、塩基配列を分析することにより、菌株内変異が導入されたことを確認した。製作された菌株は計３種であり、ＡＴＣＣ１３０３２＿ｐｈｅＡ＿Ｒ１８２Ａと命名した。
【0144】
上記製作された計３種の菌株Ｌ－ロイシン及び芳香族アミノ酸生産能を評価するために、フラスコ発酵力価評価を進行した。それぞれの生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２及び上記製作したＡＴＣＣ１３０３２＿ｐｈｅＡ＿Ｒ１８２Ａをそれぞれ一白金耳接種した後、３０℃で６０時間２００ｒｐｍで振盪培養してＬ－ロイシンを生産した。培養終了後、ＨＰＬＣでＬ－ロイシン、Ｌ－チロシン及びＬ－フェニルアラニンの生産量を測定した。実験した各菌株に対する培養液中のロイシン濃度は、下記の表５の通りである。
【0145】
【表5】
【0146】
上記表５に示された通り、ＡＴＣＣ１３０３２＿ｐｈｅＡ＿Ｒ１８２Ａは親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に比べてＬ－ロイシンの収率が約１．５倍向上したことを確認した。ＡＴＣＣ１３０３２＿ｐｈｅＡ＿Ｒ１８２ＡはＬ－フェニルアラニンが約８倍減少した。
【0147】
実施例４：ロイシン生産株でｐｈｅＡ選別変異のロイシン及びフェニルアラニン生産能の確認
コリネバクテリウム属野生型の菌株は、ロイシンを生産しても非常に極微量が生産されるだけである。これにＡＴＣＣ１３０３２由来のロイシン生産菌株を製作し、選別した変異を導入してロイシン及びフェニルアラニン生産能を確認する実験を進めた。具体的な実験は、次の通りである。
コリネバクテリウム属野生型の菌株は、ロイシンを生産しても非常に極微量が生産されるだけである。これにＡＴＣＣ１３０３２由来のロイシン生産菌株を製作し、選別した変異を導入してロイシン及びフェニルアラニン生産能を確認する実験を進めた。具体的な実験は、次の通りである。
【0148】
実施例４－１．Ｌ－ロイシン生産株ＣＪＬ－８１０９菌株の製作
高濃度のＬ－ロイシン生産のための菌株として（１）ｌｅｕＡ遺伝子の１６７３番目のヌクレオチドであるＧがＡで置換され、ＬｅｕＡタンパク質の５５８番目のアミノ酸であるアルギニンがヒスチジンで置換される変異（Ｒ５５８Ｈ）と（２）１ｅｕＡ遺伝子の１６８２番目、１６８３番目のヌクレオチドであるＧＣがＡＴで置換され、５６１番目のアミノ酸であるグリシンがアスパラギン酸で置換される変異（Ｇ５６１Ｄ）と（３）ｌｅｕＡ遺伝子の７３９番目、７４０番目のヌクレオチドであるＣＣがＴＧで置換され、２４７番目のアミノ酸であるプロリンがシステインで置換される変異（Ｐ２４７Ｃ）を含むＡＴＣＣ１３０３２由来の菌株を製造した。
高濃度のＬ－ロイシン生産のための菌株として（１）ｌｅｕＡ遺伝子の１６７３番目のヌクレオチドであるＧがＡで置換され、ＬｅｕＡタンパク質の５５８番目のアミノ酸であるアルギニンがヒスチジンで置換される変異（Ｒ５５８Ｈ）と（２）１ｅｕＡ遺伝子の１６８２番目、１６８３番目のヌクレオチドであるＧＣがＡＴで置換され、５６１番目のアミノ酸であるグリシンがアスパラギン酸で置換される変異（Ｇ５６１Ｄ）と（３）ｌｅｕＡ遺伝子の７３９番目、７４０番目のヌクレオチドであるＣＣがＴＧで置換され、２４７番目のアミノ酸であるプロリンがシステインで置換される変異（Ｐ２４７Ｃ）を含むＡＴＣＣ１３０３２由来の菌株を製造した。
【0149】
具体的には、上記ｌｅｕＡ遺伝子変異を含むｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に電気穿孔法で形質転換し、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選別した。選別された１次菌株は、再度２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、ｌｅｕＡ遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的には、形質転換された菌株の変異導入如何は、表６の配列番号１１と配列番号１２のプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃５分後、９４℃３０秒／５５℃３０秒／７２℃９０秒３０回繰り返し、７２℃５分）を行い、塩基配列を分析してＰ２４７Ｃ、Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ変異が導入されたことを確認した。ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクターで形質転換されたＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿（Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）菌株を「ＣＪＬ－８１０５」と命名した。
【0150】
【表6】
【0151】
製作したＣＪＬ－８１０５菌株にＬ－ロイシン生産能を高めるために、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ｂｒａｎｃｈｅｄ－ｃｈａｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコードする遺伝子であるｉｌｖＥ変異体（Ｖ１５６Ａ）が導入された菌株を製作した（大韓民国登録特許ＫＲ１０－２１４３９６４Ｂ１）。具体的には、上記ｉｌｖＥ遺伝子変異を含むｐＤＣＭ２－ｉｌｖＥ（Ｖ１５６Ａ）ベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ－８１０５に電気穿孔法で形質転換し、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選別した。選別された１次菌株は、再度２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、ｉｌｖＥ遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に、形質転換された菌株の変異導入如何は、表７の配列番号１３と配列番号１４のプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃５分後、９４℃３０秒／５５℃３０秒／７２℃９０秒３０回繰り返し、７２℃５分）を行い、塩基配列を分析してＶ１５６Ａ変異が導入されたことを確認した。ｐＤＣＭ２－ｉｌｖＥ（Ｖ１５６Ａ）ベクターで形質転換された菌株を「ＣＪＬ－８１０８」と命名した。
【0152】
【表7】
【0153】
製作したＣＪＬ－８１０８菌株にＬ－ロイシン生産能を高めるために、クエン酸シンターゼ（Ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）活性を弱化させたｇｌｔＡ変異体（Ｍ３１２Ｉ；配列番号２５）が導入された菌株を製作した。具体的には、上記ｇｌｔＡ遺伝子変異を含むｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）ベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ－８１０８に電気穿孔法で形質転換し、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選別した。選別された１次菌株は、再度２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、ｇｌｔＡ遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に、形質転換された菌株の変異導入如何は、表８の配列番号１５と配列番号１６のプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃５分後、９４℃３０秒／５５℃３０秒／７２℃９０秒３０回繰り返し、７２℃５分）を行い、塩基配列を分析してＭ３１２Ｉ変異が導入されたことを確認した。ｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）ベクターで形質転換された菌株を「ＣＪＬ－８１０９」と命名した。
【0154】
【表8】
【0155】
実施例４－２．ＣＪＬ－８１０９菌株内ｐｈｅＡ変異体の導入及び評価
ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１０９を上記実施例３－１で製作したｐＤＣＭ２－ｐｈｅＡ（Ｒ１８２Ａ）ベクターで形質転換し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で選別した。選別された１次菌株は再度２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に、形質転換された菌株のｐｈｅＡ遺伝子変異導入如何は、配列番号３と配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、塩基配列を分析することにより菌株内ｐｈｅＡ変異が導入されたことを確認した。製作されたＣＪＬ８１０９＿ｐｈｅＡ＿Ｒ１８２ＡをＣＡ１３－８１１６と命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０２１年１月２２日付で国際寄託して寄託番号ＫＣＣＭ１２９４３Ｐの付与を受けた。
ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１０９を上記実施例３－１で製作したｐＤＣＭ２－ｐｈｅＡ（Ｒ１８２Ａ）ベクターで形質転換し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で選別した。選別された１次菌株は再度２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に、形質転換された菌株のｐｈｅＡ遺伝子変異導入如何は、配列番号３と配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、塩基配列を分析することにより菌株内ｐｈｅＡ変異が導入されたことを確認した。製作されたＣＪＬ８１０９＿ｐｈｅＡ＿Ｒ１８２ＡをＣＡ１３－８１１６と命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０２１年１月２２日付で国際寄託して寄託番号ＫＣＣＭ１２９４３Ｐの付与を受けた。
【0156】
上記製作されたＣＡ１３－８１１６及びＡＴＣＣ１３０３２、ＣＪＬ－８１０９菌株のロイシン生産能を評価した。実施例２と同様な方式でフラスコ培養を進行し、培養終了後にＨＰＬＣを用いた方法によりロイシン生産量を測定し、培養結果は、下記表９の通りである。
【0157】
【表9】
【0158】
上記表９に示された通り、ｐｈｅＡ遺伝子にＲ１８２Ａ変異が追加しているＬ－ロイシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ１３－８１１６は、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に比べてＬ－ロイシン生産能が約４倍向上したことを確認した。また、Ｌ－ロイシン生産菌株コリネバクテリウムＣＡ１３－８１１６は、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ－８１０９に比べてＬ－ロイシン生産能が約１．２倍向上したことを確認した。ＣＡ１３－８１１６は、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ－８１０９に比べてＬ－フェニルアラニン生産能が約５．４倍減少された。
【0159】
上記結果を通じてｐｈｅＡタンパク質のアミノ酸配列中、１８２番目の位置のアミノ酸がＬ－ロイシン生産の増加に重要な位置であることを確認することができる。
【0160】
実施例５：イソロイシン生産株においてｐｈｅＡ選別変異のロイシン及びフェニルアラニン生産能の確認
ロイシンと代表的な分岐鎖アミノ酸であるイソロイシンに対しても選別された変異が効果を奏するかを確認するために、コリネバクテリウム属イソロイシン生産菌株に導入してイソロイシン生産能を確認する実験を進めた。具体的な実験は、次の通りである。
ロイシンと代表的な分岐鎖アミノ酸であるイソロイシンに対しても選別された変異が効果を奏するかを確認するために、コリネバクテリウム属イソロイシン生産菌株に導入してイソロイシン生産能を確認する実験を進めた。具体的な実験は、次の通りである。
【0161】
実施例５－１．Ｌ－イソロイシン生産株ＣＡ１０－３１０１菌株の製作
野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２からＬ－イソロイシン生産菌株を開発した。具体的には、生合成経路でイソロイシンの前駆体であるスレオニンのフィードバック阻害解消のためにホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるｈｏｍの４０７番目のアミノ酸であるアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）をヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）で置換した（ＵＳ２０２０－０３４００２２Ａ１）。具体的には、ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）変異が導入された菌株を製作するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号１７及び配列番号１８あるいは、配列番号１９及び配列番号２０のプライマーを用いてＰＣＲをそれぞれ行った。ここで用いられたプライマー配列は、下記表１０の通りである。
野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２からＬ－イソロイシン生産菌株を開発した。具体的には、生合成経路でイソロイシンの前駆体であるスレオニンのフィードバック阻害解消のためにホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるｈｏｍの４０７番目のアミノ酸であるアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）をヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）で置換した（ＵＳ２０２０－０３４００２２Ａ１）。具体的には、ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）変異が導入された菌株を製作するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号１７及び配列番号１８あるいは、配列番号１９及び配列番号２０のプライマーを用いてＰＣＲをそれぞれ行った。ここで用いられたプライマー配列は、下記表１０の通りである。
【0162】
【表10】
【0163】
ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；及び重合反応７２℃１分を２８回繰り返した。その結果、ｈｏｍ遺伝子の変異を中心に５’上端部位の１０００ｂｐＤＮＡ断片と３’下端部位の１０００ｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ得た。増幅された２つのＤＮＡ切片を鋳型とし、配列番号１７及び配列番号２０のプライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間変性後、９５℃３０秒の変性、５５℃３０秒のアニーリング、７２℃２分重合を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。
【0164】
その結果、４０７番目のアルギニンがヒスチジンで置換されたホモセリンデヒドロゲナーゼ変異体をコードするｈｏｍ遺伝子の変異を含む２ｋｂのＤＮＡ断片が増幅された。増幅産物をＰＣＲ精製キット（ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製してベクター製作のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。精製した増幅産物を制限酵素ｓｍａＩで処理した後、６５℃で２０分間熱処理したｐＤＣＭ２ベクターと上記増幅産物である挿入ＤＮＡ断片のモル濃度（Ｍ）比率が１：２になるようにし、インフュージョンクローニングキット（Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ，ＴａＫａＲａ）を用いて提供されたマニュアルによりクローニングすることにより、ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）変異を染色体上に導入するためのベクターｐＤＣＭ２－Ｒ４０７Ｈを製作した。
【0165】
製作されたベクターを電気穿孔法でコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に形質転換し、２次交差過程を経て染色体上でｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）変異を含む菌株を得、これをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）と命名した。
【0166】
製作したＡＴＣＣ１３０３２ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）菌株に、Ｌ－イソロイシンにフィードバック解除と活性を高めるために、Ｌ－スレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子であるｉｌｖＡ変異体（Ｔ３８１Ａ、Ｆ３８３Ａ）が導入された菌株を製作した。さらに具体的には、ｉｌｖＡ（Ｔ３８１Ａ、Ｆ３８３Ａ）変異が導入された菌株を製作するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号２１及び配列番号２２あるいは、配列番号２３及び配列番号２４のプライマーを用いてＰＣＲをそれぞれ行った。ここで用いられたプライマー配列は、下記表１１の通りである。
【0167】
【表11】
【0168】
ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；及び重合反応７２℃１分を２８回繰り返した。その結果、ｉｌｖＡ遺伝子の変異を中心に５’上端部位の１１２６ｂｐ ＤＮＡ断片と３’下端部位の２８６ｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ得た。増幅された２種類のＤＮＡ切片を鋳型とし、配列番号２１及び配列番号２４のプライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は９５℃で５分間変性後、９５℃３０秒の変性、５５℃３０秒のアニーリング、７２℃２分の重合を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。
【0169】
その結果、３８１番目のスレオニンがアラニンで、３８３番目のフェニルアラニンがアラニンで置換されたスレオニンデヒドラターゼ変異体をコードするｉｌｖＡ遺伝子の変異を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片が増幅された。増幅産物をＰＣＲ精製キット（ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、ベクター製作のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。精製した増幅産物を制限酵素ｓｍａｌで処理した後、６５℃で２０分間熱処理したｐＤＣＭ２ベクターと上記増幅産物である挿入ＤＮＡ断片のモル濃度（Ｍ）比率が１：２になるようにし、インフュージョンクローニングキット（Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ，ＴａＫａＲａ）を用いて提供されたマニュアルによりクローニングすることにより、ｉｌｖＡ（Ｔ３８１Ａ、Ｆ３８３Ａ）変異を染色体上に導入するためのベクターｐＤＣＭ２－ｉｌｖＡ（Ｔ３８１Ａ、Ｆ３８３Ａ）を製作した。
【0170】
製作されたベクターを電気穿孔法でコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）に形質転換し、２次交差過程を経て染色体上でｉｌｖＡ（Ｔ３８１Ａ、Ｆ３８３Ａ）変異を含む菌株を得、これをコリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ１０－３１０１と命名した。
【0171】
実施例５－２．ＣＡ１０－３１０１菌株内ｐｈｅＡ変異体の導入及び評価
Ｌ－イソロイシン生産菌株であるＣＡ１０－３１０１を上記実施例３－１で製作したｐＤＣＭ２－ｐｈｅＡ（Ｒ１８２Ａ）ベクターで形質転換し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で選別した。選別された１次菌株は再度２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に、形質転換された菌株のｐｈｅＡ遺伝子変異導入如何は、表１の配列番号３と配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、塩基配列を分析することにより、菌株内ｐｈｅＡ変異が導入されたことを確認した。
Ｌ－イソロイシン生産菌株であるＣＡ１０－３１０１を上記実施例３－１で製作したｐＤＣＭ２－ｐｈｅＡ（Ｒ１８２Ａ）ベクターで形質転換し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で選別した。選別された１次菌株は再度２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に、形質転換された菌株のｐｈｅＡ遺伝子変異導入如何は、表１の配列番号３と配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、塩基配列を分析することにより、菌株内ｐｈｅＡ変異が導入されたことを確認した。
【0172】
上記製作されたＣＡ１０－３１０１＿ｐｈｅＡ＿Ｒ１８２Ａ及びＡＴＣＣ１３０３２、ＣＡ１０－３１０１菌株のＬ－イソロイシン及びＬ－フェニルアラニン生産能を評価した。イソロイシン生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに親株及び上記ｐｈｅＡ変異株を接種した後、３２℃で６０時間２００ｒｐｍで振盪培養してＬ－イソロイシンを製造した。本実施例で用いた生産培地の組成は、下記の通りである。
【0173】
＜生産培地＞
ブドウ糖１０％、酵母抽出物０．２％、硫酸アンモニウム１．６％、第１リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．１％、硫酸鉄７水塩１０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン１水塩１０ｍｇ／ｌ、ビオチン２００μｇ／ｌ、ｐＨ７．２
ブドウ糖１０％、酵母抽出物０．２％、硫酸アンモニウム１．６％、第１リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．１％、硫酸鉄７水塩１０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン１水塩１０ｍｇ／ｌ、ビオチン２００μｇ／ｌ、ｐＨ７．２
【0174】
培養終了後、液体高速クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いてＬ－イソロイシン及びＬ－フェニルアラニンの生産量を測定し、実験した各菌株に対する培養液中のＬ－イソロイシンと副産物の濃度は、下記表１２に示した。
【0175】
【表12】
【0176】
上記表１２に示された通り、ｐｈｅＡ遺伝子にＲ１８２Ａ変異が追加しているＬ－イソロイシン生産菌株は、親株であるコリネグルタミカムＣＡ１０－３１０１に比べてＬ－イソロイシン生産能が約１．１倍向上し、ＣＡ１０－３１０１＿ｐｈｅＡ＿Ｒ１８２Ａ菌株は、副産物であるＬ－フェニルアラニンが減少することを確認した。
【0177】
上記結果を通じてｐｈｅＡタンパク質のアミノ酸配列中、１８２番目の位置のアミノ酸がＬ－イソロイシン生産増加に重要な位置であることを確認することができる。
【0178】
実施例６：バリン生産株においてｐｈｅＡ選別変異のバリン及びフェニルアラニン生産能の確認
ロイシンのような代表的な分岐鎖アミノ酸Ｌ－バリンに対しても選別された変異が効果を奏するかを確認するために、コリネバクテリウム属バリン生産菌株ＫＣＣＭ１１２０１Ｐでも選別した変異を導入してバリン及びフェニルアラニン生産能を確認する実験を進めた。具体的な実験は、次の通りである。
ロイシンのような代表的な分岐鎖アミノ酸Ｌ－バリンに対しても選別された変異が効果を奏するかを確認するために、コリネバクテリウム属バリン生産菌株ＫＣＣＭ１１２０１Ｐでも選別した変異を導入してバリン及びフェニルアラニン生産能を確認する実験を進めた。具体的な実験は、次の通りである。
【0179】
実施例６－１．ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株内ｐｈｅＡ変異体の導入及び評価
当該変異がＬ－バリン生産能の増加に効果があるかを確認するために、Ｌ－バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ（ＵＳ８４６５９６２Ｂ２）菌株を用いた。バリン生産菌株であるＫＣＣＭ１１２０１Ｐを上記実施例３－１で製作したｐＤＣＭ２－ｐｈｅＡ（Ｒ１８２Ａ）ベクターで形質転換して相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で選別した。選別された１次菌株は再度２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に、形質転換された菌株のｐｈｅＡ遺伝子変異導入如何は、表１の配列番号３と配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、塩基配列を分析することにより菌株内ｐｈｅＡ変異が導入されたことを確認した。製作された菌株をＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ｐｈｅＡ（Ｒ１８２Ａ）とそれぞれ命名した。
当該変異がＬ－バリン生産能の増加に効果があるかを確認するために、Ｌ－バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ（ＵＳ８４６５９６２Ｂ２）菌株を用いた。バリン生産菌株であるＫＣＣＭ１１２０１Ｐを上記実施例３－１で製作したｐＤＣＭ２－ｐｈｅＡ（Ｒ１８２Ａ）ベクターで形質転換して相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で選別した。選別された１次菌株は再度２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に、形質転換された菌株のｐｈｅＡ遺伝子変異導入如何は、表１の配列番号３と配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、塩基配列を分析することにより菌株内ｐｈｅＡ変異が導入されたことを確認した。製作された菌株をＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ｐｈｅＡ（Ｒ１８２Ａ）とそれぞれ命名した。
【0180】
上記製作されたＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ｐｈｅＡ（Ｒ１８２Ａ）菌株のバリン生産能を評価した。実施例２と同様な方式でフラスコ培養を進行し、培養終了後にＨＰＬＣを用いた方法によりバリン生産量を測定し、培養結果は、下記表１３の通りである。
【0181】
【表13】
【0182】
上記表１３に示された通り、ｐｈｅＡ遺伝子にＲ１８２Ａ変異が追加しているＬ－バリン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ｐｈｅＡ（Ｒ１８２Ａ）は、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに比べてＬ－バリン生産能が約１．１倍向上したことを確認した。ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ｐｈｅＡ（Ｒ１８２Ａ）は、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに比べてＬ－フェニルアラニン生産能が５．３６倍減少することを確認した。上記結果を通じてｐｈｅＡタンパク質のアミノ酸配列中の１８２番目の位置のアミノ酸がＬ－バリン生産増加に重要な位置であることを確認することができる。
【0183】
参考例１：ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）変異のロイシン生産に関する効果の確認
参考例１－１．ｇｌｔＡ変異を含む挿入ベクター製作
ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ；配列番号２５）変異導入用ベクター製作は、部位特異的突然変異誘発（Ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法を用いた。
参考例１－１．ｇｌｔＡ変異を含む挿入ベクター製作
ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ；配列番号２５）変異導入用ベクター製作は、部位特異的突然変異誘発（Ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法を用いた。
【0184】
コリネバクテリウム・グルタミカム野生型の染色体を鋳型とし、配列番号２７及び２８のプライマー対、配列番号２９及び３０のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲは９４℃で５分間変性後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果として得られた遺伝子断片をＳｍａＩ制限酵素で切断させた線状のｐＤＣＭ２ベクターとインフュージョン（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ）酵素を用いてＤＮＡ断片間の末端１５個塩基の相同配列を結合させてクローニングして３１２番目のアミノ酸であるメチオニンをイソロイシンで置換するベクターｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）を製作した。
ＰＣＲは９４℃で５分間変性後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果として得られた遺伝子断片をＳｍａＩ制限酵素で切断させた線状のｐＤＣＭ２ベクターとインフュージョン（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ）酵素を用いてＤＮＡ断片間の末端１５個塩基の相同配列を結合させてクローニングして３１２番目のアミノ酸であるメチオニンをイソロイシンで置換するベクターｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）を製作した。
【0185】
【表14】
【0186】
参考例１－２．ＡＴＣＣ１３０３２菌株内変異体の導入及び評価
上記参考例１－１で製作したｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）ベクターを野生型ＡＴＣＣ１３０３２に形質転換し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で選別した。選別された１次菌株は、再度２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終形質転換された菌株のｇｌｔＡ遺伝子変異導入如何は、配列番号１５及び配列番号１６（実施例４－１、表８）のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、塩基配列を分析することにより菌株内変異（配列番号２６）が導入されたことを確認した。製作された菌株はＡＴＣＣ１３０３２＿ｇｌｔＡ＿Ｍ３１２Ｉと命名した。
上記参考例１－１で製作したｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）ベクターを野生型ＡＴＣＣ１３０３２に形質転換し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で選別した。選別された１次菌株は、再度２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終形質転換された菌株のｇｌｔＡ遺伝子変異導入如何は、配列番号１５及び配列番号１６（実施例４－１、表８）のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、塩基配列を分析することにより菌株内変異（配列番号２６）が導入されたことを確認した。製作された菌株はＡＴＣＣ１３０３２＿ｇｌｔＡ＿Ｍ３１２Ｉと命名した。
【0187】
上記製作されたＡＴＣＣ１３０３２＿ｇｌｔＡ＿Ｍ３１２Ｉ菌株のロイシン生産能を評価するために、フラスコ発酵力価評価を進行した。生産培地をそれぞれ２５ｍｌ含有する２５０ｍｌコーナー－バッフルフラスコに親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２及び上記製作したＡＴＣＣ１３０３２＿ｇｌｔＡ＿Ｍ３１２Ｉをそれぞれ一白金耳接種した後、３０℃で６０時間２００ｒｐｍで振盪培養してロイシンを生産した。培養終了後にＨＰＬＣでロイシンの生産量を測定した。実験した各菌株に対する培養液中のロイシン濃度は、下記表１５の通りである。
【0188】
－生産培地：ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ、大豆タンパク質（Ｓｏｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ）２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１，０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド３，０００μｇ、 ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸溜水１リットル基準）、ｐＨ７．０
【0189】
【表15】
【0190】
これからｇｌｔＡのＭ３１２Ｉ置換がロイシン生産の増加に有効な変異であることを確認した。
【0191】
参考例２：ｉｌｖＡ（Ｔ３８１Ａ、Ｆ３８３Ａ）変異のイソロイシン生産に関する効果の確認
参考例２－１：ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）の製作
スレオニンデヒドラターゼ（配列番号３１）をコードする遺伝子であるｉｌｖＡ（配列番号３２）を増幅するために、既に報告されたＦ３８３Ａ変異が導入されたｉｌｖＡ配列（Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （２０１５） ３１：１３６９－１３７７）に基づいてプロモーター部位（開始コドン上端約３００ｂｐ）からターミネーター部位（終結コドン下端約１００ｂｐ）まで増幅するためのプライマー（配列番号３３及び配列番号３４）の量末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位を挿入した。また、ｉｌｖＡにＦ３８３Ａ変異を導入するためのプライマー（配列番号３５及び配列番号３６）を用いた。ここで用いられたプライマー配列は、下記表１６の通りである。
参考例２－１：ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）の製作
スレオニンデヒドラターゼ（配列番号３１）をコードする遺伝子であるｉｌｖＡ（配列番号３２）を増幅するために、既に報告されたＦ３８３Ａ変異が導入されたｉｌｖＡ配列（Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （２０１５） ３１：１３６９－１３７７）に基づいてプロモーター部位（開始コドン上端約３００ｂｐ）からターミネーター部位（終結コドン下端約１００ｂｐ）まで増幅するためのプライマー（配列番号３３及び配列番号３４）の量末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位を挿入した。また、ｉｌｖＡにＦ３８３Ａ変異を導入するためのプライマー（配列番号３５及び配列番号３６）を用いた。ここで用いられたプライマー配列は、下記表１６の通りである。
【0192】
【表16】
【0193】
野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号３３及び配列番号３４、配列番号３５及び配列番号３６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は９５℃で５分間変性後、９５℃３０秒の変性、５５℃３０秒のアニーリング、７２℃９０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。
【0194】
その結果、ｉｌｖＡ遺伝子の変異を中心に５’上端部位の１４６０ｂｐのＤＮＡ断片と３’下端部位の２７６ｂｐ ＤＮＡ断片を得た。
【0195】
増幅された２種類のＤＮＡ切片を鋳型とし、配列番号３５及び配列番号３６のプライマーでＰＣＲを行った。
【0196】
その結果、３８３番目のフェニルアラニンがアラニンで置換されたｉｌｖＡ変異を含む１５３１ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ｐＥＣＣＧ１１７（大韓民国登録特許第１０－００５７６８４号）ベクターとｉｌｖＡ ＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、ＤＮＡ接合酵素を用いて連結した後、クローニングすることにより、プラスミドを獲得し、これをｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）と命名した。
【0197】
参考例２－２：ＰＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）にランダム変異の追加導入
Ｌ－スレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子の変異体を得るためにランダム突然変異キット（ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）を用いてｉｌｖＡ変異体遺伝子プラスミドを製造した。参考例２－１のｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）染色体を鋳型として配列番号３５及び配列番号３６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間変性後、９５℃３０秒の変性、５５℃３０秒のアニーリング、７２℃９０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間重合反応を行った。
Ｌ－スレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子の変異体を得るためにランダム突然変異キット（ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）を用いてｉｌｖＡ変異体遺伝子プラスミドを製造した。参考例２－１のｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）染色体を鋳型として配列番号３５及び配列番号３６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間変性後、９５℃３０秒の変性、５５℃３０秒のアニーリング、７２℃９０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間重合反応を行った。
【0198】
その結果、３８３番目のフェニルアラニンがアラニンで置換された変異以外に追加のランダム変異を有するＬ－スレオニンデヒドラターゼをコードできるｉｌｖＡ変異体である１５３１ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ｐＥＣＣＧ１１７ベクターとｉｌｖＡ変異体ＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、ＤＮＡ接合酵素を用いて連結した後、クローニングすることにより、プラスミド群を獲得した。
【0199】
参考例２－３：ＣＪＩＬＥ－３０１菌株製作
野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）菌株にｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）を導入し、製作したプラスミドを導入した菌株はＡＴＣＣ１３０３２ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）と命名した。また、参考例２－２で得られた変異体プラスミド群をコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）菌株に導入し、最小培地に塗抹して死滅率を求めてみた結果、死滅率は７０％であり、生存した細胞を種培地に接種培養、最終的に、ＡＴＣＣ１３０３２ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）対照群より優れたイソロイシン生産能を示す変異株を選別してコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＩＬＥ－３０１（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ，ＣＪＩＬＥ－３０１）と命名した。
野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）菌株にｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）を導入し、製作したプラスミドを導入した菌株はＡＴＣＣ１３０３２ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）と命名した。また、参考例２－２で得られた変異体プラスミド群をコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）菌株に導入し、最小培地に塗抹して死滅率を求めてみた結果、死滅率は７０％であり、生存した細胞を種培地に接種培養、最終的に、ＡＴＣＣ１３０３２ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）対照群より優れたイソロイシン生産能を示す変異株を選別してコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＩＬＥ－３０１（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ，ＣＪＩＬＥ－３０１）と命名した。
【0200】
ＣＪＩＬＥ－３０１菌株からプラスミドを分離してｉｌｖＡ遺伝子をシーケンシングした結果、ｉｌｖＡ遺伝子の１１４１番目の塩基配列がＡからＧで置換され、ｉｌｖＡタンパク質の３８３番目のＦがＡで置換された変異以外に、追加で３８１番目のＴがＡで置換された変異タンパク質をコードできることを確認し、これは、配列番号３８で示した。
【0201】
参考例２－４：ｉｌｖＡ変異体（Ｔ３８１Ａ、Ｆ３８３Ａ）の導入
ｉｌｖＡ変異体（Ｔ３８１Ａ、Ｆ３８３Ａ）を野生型菌株として導入するために、配列番号２１及び配列番号２４（実施例５－１、表１１）のプライマーを製作した。
ｉｌｖＡ変異体（Ｔ３８１Ａ、Ｆ３８３Ａ）を野生型菌株として導入するために、配列番号２１及び配列番号２４（実施例５－１、表１１）のプライマーを製作した。
【0202】
ｉｌｖＡ変異体（Ｔ３８１Ａ、Ｆ３８３Ａ）が導入された菌株を製作するために、ＣＪＩＬＥ－３０１菌株から抽出したプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号２１及び配列番号２４のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【0203】
ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は、変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；及び重合反応７２℃２分を２８回繰り返した。
【0204】
その結果、１３１１ｂｐであるｉｌｖＡ遺伝子の約１００ｂｐターミネーター部位を含む１４１１ｂｐの遺伝子断片をそれぞれ得た。
【0205】
増幅産物をＰＣＲ精製キットを用いて精製し、ベクター製作のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。精製した増幅産物を制限酵素ｓｍａＩで処理した後、６５℃で２０分間熱処理したｐＤＣＭ２ベクターと上記増幅産物である挿入ＤＮＡ断片のモル濃度（Ｍ）比率が１：２になるようにし、インフュージョンクローニングキットを用いて提供されたマニュアルによりクローニングすることにより、Ｔ３８１Ａ、Ｆ３８３Ａ変異を染色体上に導入するためのベクターｐＤＣＭ２－Ｔ３８１Ａ＿Ｆ３８３Ａを製作した。
【0206】
製作されたベクターを電気穿孔法によりコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３０３２ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）に形質転換し、２次交差過程を経て染色体上でｉｌｖＡ（Ｔ３８１Ａ、Ｆ３８３Ａ；配列番号３７）変異を含む菌株を得、これをＣＡ１０－３１０１と命名した。
【0207】
上記菌株ＣＡ１０－３１０１は、２０２０年５月２７日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に国際寄託してＫＣＣＭ１２７３９Ｐとして寄託番号の付与を受けた。
【0208】
上記ＫＣＣＭ１２７３９Ｐ菌株をイソロイシン生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに接種した後、３２℃で６０時間２００ｒｐｍで振盪培養してＬ－イソロイシンを製造した。用いた生産培地の組成は、下記の通りである。
【0209】
＜生産培地〉
ブドウ糖１０％、酵母抽出物０．２％、硫酸アンモニウム１．６％、第１リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．１％、硫酸鉄７水塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１水塩１０ｍｇ／Ｌ、ビオチン２００μｇ／Ｌ、ｐＨ７．２
ブドウ糖１０％、酵母抽出物０．２％、硫酸アンモニウム１．６％、第１リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．１％、硫酸鉄７水塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１水塩１０ｍｇ／Ｌ、ビオチン２００μｇ／Ｌ、ｐＨ７．２
【0210】
培養終了後、高性能液体クロマトグラフィ（ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）を用いて培養液中のＬ－イソロイシンとＬ－スレオニン濃度を測定し、その結果を下記表１７に示した。
【0211】
【表17】
【0212】
上記表１７に示された通り、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）はＬ－イソロイシンを生産しなかったが、ＡＴＣＣ１３０３２ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）ｉｌｖＡ（Ｔ３８１Ａ、Ｆ３８３Ａ）変異株は３．９ｇ／Ｌの濃度でＬ－イソロイシンを生産し、親株に比べてＬ－イソロイシン生産性が顕著に増加したことを確認した。
【0213】
これからｉｌｖＡ（Ｔ３８１Ａ、Ｆ３８３Ａ）変異がイソロイシン生産増加に有効な変異であることを確認した。
【0214】
参考例３：ｌｅｕＡ（Ｐ２４７Ｃ、Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ）のロイシン生産に関する効果の確認
参考例３－１．ＣＪＬ－８１００菌株製作
ＫＲ １０－２０１８－００７７００８ Ａ に公知となったｌｅｕＡ遺伝子変異を含むｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に電気穿孔法で形質転換し、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選別した。選別された１次菌株は再度２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、ｌｅｕＡ遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に、形質転換された菌株の変異導入如何は、配列番号３９と配列番号４３のプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃５分後、９４℃３０秒／５５℃３０秒／７２℃９０秒３０回繰り返し、７２℃５分）を行い、塩基配列を分析してＲ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ変異が導入されたことを確認した。ｐＤＣＭ２－１ｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ）ベクターで形質転換されたＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）菌株を「ＣＪＬ－８１００」と命名した。
参考例３－１．ＣＪＬ－８１００菌株製作
ＫＲ １０－２０１８－００７７００８ Ａ に公知となったｌｅｕＡ遺伝子変異を含むｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に電気穿孔法で形質転換し、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選別した。選別された１次菌株は再度２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、ｌｅｕＡ遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に、形質転換された菌株の変異導入如何は、配列番号３９と配列番号４３のプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃５分後、９４℃３０秒／５５℃３０秒／７２℃９０秒３０回繰り返し、７２℃５分）を行い、塩基配列を分析してＲ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ変異が導入されたことを確認した。ｐＤＣＭ２－１ｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ）ベクターで形質転換されたＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）菌株を「ＣＪＬ－８１００」と命名した。
【0215】
以下、参考例３で用いたプライマー配列を表１８に示した。
【0216】
【表18】
【0217】
参考例３－２．ｌｅｕＡ変異を含む挿入ベクターの製作
ＬｅｕＡに２つの変異（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）が導入されたＬ－ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１００にＰ２４７Ｃ変異を導入するためのベクターを製作した。
ＬｅｕＡに２つの変異（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）が導入されたＬ－ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１００にＰ２４７Ｃ変異を導入するためのベクターを製作した。
【0218】
ＣＪＬ－８１００菌株の染色体を鋳型とし、配列番号３９及び４０のプライマー、配列番号４１及び４２のプライマ一対を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは９４℃で５分間変性後、９４℃で３０秒５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果として得られたＰＣＲ産物をＳｍａＩ制限酵素で切断させた線状のｐＤＣＭ２ベクターとＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素を用いてＤＮＡ断片間の末端１５ｂａｓｅの相同配列をｆｕｓｉｏｎさせてクローニングし、野生型菌株のＬｅｕＡアミノ酸配列で５５８番目のアミノ酸であるアルギニンがヒスチジンで置換され、５６１番目のアミノ酸であるグリシンがアスパラギン酸で置換されたＬｅｕＡ変異体をコードするｌｅｕＡ変異を含み、ＬｅｕＡの２４７番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ）をシステイン（Ｃｙｓ）で置換するベクターｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｐ２４７Ｃ、Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ）を製作した。
【0219】
参考例３－３．ＣＪＬ－８１００菌株内ＬｅｕＡ変異体（Ｐ２４７Ｃ）の導入及び評価
Ｌ－ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１００を上記参考例３－２で製作したｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクターで形質転換し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で選別した。選別された１次菌株は、再度２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に、形質転換された菌株のｌｅｕＡ遺伝子変異導入如何は、配列番号３９と配列番号４５のプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃５分後、９４℃３０秒／５５℃３０秒／７２℃９０秒３０回繰り返し、７２℃５分）を行った後、塩基配列を分析した。塩基配列分析結果、菌株染色体内ｌｅｕＡ遺伝子の１６７３番目のヌクレオチドであるＧがＡで置換され、１６８２番目、１６８３番目のヌクレオチドであるＧＣがＡＴで置換され、７３９番目、７４０番目のヌクレオチドであるＣＣがＴＧで置換され、ＬｅｕＡタンパク質の５５８番目のアミノ酸であるアルギニンがヒスチジンで置換され、５６１番目のアミノ酸であるグリシンがアスパラギン酸で置換され、２４７番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ）がシステイン（Ｃｙｓ）で置換されたＬｅｕＡ変異体（Ｐ２４７Ｃ、Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ）をコードするｌｅｕＡ変異が菌株内に導入されたことを確認した。製作されたＣＪＬ８１００＿ｌｅｕＡ＿Ｐ２４７Ｃを「ＣＡ１３－８１０５」と命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ＫＣＣＭ）に２０２０年４月２９日付で寄託して寄託番号ＫＣＣＭ１２７０９Ｐの付与を受けた。
Ｌ－ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１００を上記参考例３－２で製作したｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクターで形質転換し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で選別した。選別された１次菌株は、再度２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に、形質転換された菌株のｌｅｕＡ遺伝子変異導入如何は、配列番号３９と配列番号４５のプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃５分後、９４℃３０秒／５５℃３０秒／７２℃９０秒３０回繰り返し、７２℃５分）を行った後、塩基配列を分析した。塩基配列分析結果、菌株染色体内ｌｅｕＡ遺伝子の１６７３番目のヌクレオチドであるＧがＡで置換され、１６８２番目、１６８３番目のヌクレオチドであるＧＣがＡＴで置換され、７３９番目、７４０番目のヌクレオチドであるＣＣがＴＧで置換され、ＬｅｕＡタンパク質の５５８番目のアミノ酸であるアルギニンがヒスチジンで置換され、５６１番目のアミノ酸であるグリシンがアスパラギン酸で置換され、２４７番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ）がシステイン（Ｃｙｓ）で置換されたＬｅｕＡ変異体（Ｐ２４７Ｃ、Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ）をコードするｌｅｕＡ変異が菌株内に導入されたことを確認した。製作されたＣＪＬ８１００＿ｌｅｕＡ＿Ｐ２４７Ｃを「ＣＡ１３－８１０５」と命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ＫＣＣＭ）に２０２０年４月２９日付で寄託して寄託番号ＫＣＣＭ１２７０９Ｐの付与を受けた。
【0220】
上記計３種の変異を含むＬｅｕＡ変異体（Ｐ２４７Ｃ、Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ）のアミノ酸配列及びこれをコードするｌｅｕＡ変異体の塩基配列は、それぞれ配列番号４６及び配列番号４７の通りである。
【0221】
ＡＴＣＣ１３０３２、製作されたＣＪＬ－８１００、及びＣＡ１３－８１０５菌株のＬ－ロイシンの生産能を評価した。具体的には、実施例２－１と同様な方式でフラスコ培養を進行し、培養終了後にＨＰＬＣを用いて、親株及び変異菌株のＬ－ロイシン生産量を測定し、その結果を表１９に記載した。
【0222】
【表19】
【0223】
上記表１９に示された通り、Ｌ－ロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ８１００は、親株であるＡＴＣＣ１３０３２に比べてＬ－ロイシン生産能が約１３０％向上した。ＣＪＬ８１００菌株内ｌｅｕＡ＿Ｐ２４７Ｃ変異を追加で導入したＣＡ１３－８１０５菌株は、親株であるＣＪＬ８１００比Ｌ－ロイシン生産能が約１５０％向上した。
【0224】
これからｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ、Ｐ２４７Ｃ）変異がロイシンの生産増加に有効な変異であることを確認した。
【0225】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【0226】
【表20】
【0227】
【表21】
【0228】
【表22】
【手続補正書】
【提出日】2023-08-16
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-08-16
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0225】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１８２番の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、プレフェナート脱水酵素（Ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）変異体。
（態様２）
前記変異体は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１８２番の位置に対応するアミノ酸がアルギニン以外のアミノ酸への置換を含む、態様１に記載のプレフェナート脱水酵素変異体。
（態様３）
前記他のアミノ酸への置換は、非極性（ｎｏｎｐｏｌａｒ）アミノ酸または大きさが小さいアミノ酸への置換である、態様１に記載のプレフェナート脱水酵素変異体。
（態様４）
前記他のアミノ酸は、アラニン（Ａｌａ）である、態様１に記載のプレフェナート脱水酵素変異体。
（態様５）
前記プレフェナート脱水酵素は、配列番号５と９９％以上の相同性または同一性を有する、態様１に記載のプレフェナート脱水酵素変異体。
（態様６）
前記プレフェナート脱水酵素変異体は、配列番号１のプレフェナート脱水酵素に比べて弱化された活性を有する、態様１に記載のプレフェナート脱水酵素変異体。
（態様７）
態様１～６のいずれか一項に記載のプレフェナート脱水酵素変異体をコードするポリヌクレオチド。
（態様８）
態様７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（態様９）
態様１～６のいずれか一項に記載のプレフェナート脱水酵素変異体；前記プレフェナート脱水酵素変異体をコードするポリヌクレオチド；及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターのうち１以上を含むコリネバクテリウム属微生物。
（態様１０）
前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムである、態様９に記載の微生物。
（態様１１）
前記微生物は、分岐鎖アミノ酸生産用である、態様９に記載のコリネバクテリウム属微生物。
（態様１２）
前記分岐鎖アミノ酸は、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン及びＬ－バリンから選択される１以上である、態様１１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
（態様１３）
態様９に記載の微生物を培地で培養する段階を含む、分岐鎖アミノ酸生産方法。
（態様１４）
前記方法は、分岐鎖アミノ酸を微生物または培地から回収する段階をさらに含む、態様１３に記載の分岐鎖アミノ酸生産方法。
（態様１５）
前記分岐鎖アミノ酸は、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン及びＬ－バリンから選択される１以上である、態様１３に記載の分岐鎖アミノ酸生産方法。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１８２番の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、プレフェナート脱水酵素（Ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）変異体。
（態様２）
前記変異体は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１８２番の位置に対応するアミノ酸がアルギニン以外のアミノ酸への置換を含む、態様１に記載のプレフェナート脱水酵素変異体。
（態様３）
前記他のアミノ酸への置換は、非極性（ｎｏｎｐｏｌａｒ）アミノ酸または大きさが小さいアミノ酸への置換である、態様１に記載のプレフェナート脱水酵素変異体。
（態様４）
前記他のアミノ酸は、アラニン（Ａｌａ）である、態様１に記載のプレフェナート脱水酵素変異体。
（態様５）
前記プレフェナート脱水酵素は、配列番号５と９９％以上の相同性または同一性を有する、態様１に記載のプレフェナート脱水酵素変異体。
（態様６）
前記プレフェナート脱水酵素変異体は、配列番号１のプレフェナート脱水酵素に比べて弱化された活性を有する、態様１に記載のプレフェナート脱水酵素変異体。
（態様７）
態様１～６のいずれか一項に記載のプレフェナート脱水酵素変異体をコードするポリヌクレオチド。
（態様８）
態様７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（態様９）
態様１～６のいずれか一項に記載のプレフェナート脱水酵素変異体；前記プレフェナート脱水酵素変異体をコードするポリヌクレオチド；及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターのうち１以上を含むコリネバクテリウム属微生物。
（態様１０）
前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムである、態様９に記載の微生物。
（態様１１）
前記微生物は、分岐鎖アミノ酸生産用である、態様９に記載のコリネバクテリウム属微生物。
（態様１２）
前記分岐鎖アミノ酸は、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン及びＬ－バリンから選択される１以上である、態様１１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
（態様１３）
態様９に記載の微生物を培地で培養する段階を含む、分岐鎖アミノ酸生産方法。
（態様１４）
前記方法は、分岐鎖アミノ酸を微生物または培地から回収する段階をさらに含む、態様１３に記載の分岐鎖アミノ酸生産方法。
（態様１５）
前記分岐鎖アミノ酸は、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン及びＬ－バリンから選択される１以上である、態様１３に記載の分岐鎖アミノ酸生産方法。
【国際調査報告】