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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-15
(54)【発明の名称】トランスアミナーゼ突然変異体及びその応用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20240207BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20240207BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240207BHJP
C12P 41/00 20060101ALI20240207BHJP
C12P 19/26 20060101ALI20240207BHJP
C12N 15/10 20060101ALN20240207BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54
C12N9/10
C12N15/63 Z
C12P41/00 H
C12P19/26
C12N15/10 200Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023547522
(86)(22)【出願日】2021-07-06
(85)【翻訳文提出日】2023-08-04
(86)【国際出願番号】 CN2021104841
(87)【国際公開番号】W WO2022166103
(87)【国際公開日】2022-08-11
(31)【優先権主張番号】202110150760.0
(32)【優先日】2021-02-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202110451381.5
(32)【優先日】2021-04-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516336828
【氏名又は名称】凱菜英医藥集團（天津）股▲分▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＹＭＣＨＥＭ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ （ＴＩＡＮＪＩＮ） ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100158920
【弁理士】
【氏名又は名称】上野 英樹
(72)【発明者】
【氏名】洪 浩
(72)【発明者】
【氏名】ジェイムズ，ゲイジ
(72)【発明者】
【氏名】肖 毅
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ 娜
(72)【発明者】
【氏名】焦 学成
(72)【発明者】
【氏名】▲馬▼ 玉磊
(72)【発明者】
【氏名】牟 慧▲艷▼
(72)【発明者】
【氏名】王 祖建
(72)【発明者】
【氏名】▲孫▼ ▲凱▼▲華▼
(72)【発明者】
【氏名】李 シャン
(72)【発明者】
【氏名】▲趙▼ 桐
(72)【発明者】
【氏名】曹 珊
【テーマコード（参考）】
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B064AE01
4B064CA21
4B064CB30
4B064CC24
4B064DA16
(57)【要約】
トランスアミナーゼ突然変異体及びその応用を提供する。当該トランスアミナーゼ突然変異体は、配列番号２に１つ以上のアミノ酸突然変異が発生して得られたものであるか、又は野生型ＣｖＴＡトランスアミナーゼの配列番号１を参照として、保存的アミノ酸に突然変異が発生した突然変異体である。野生型トランスアミナーゼに比べ、突然変異体の触媒活性はいずれも異なる程度向上し、そのため、キラルアミン系化合物合成の生産効率を向上させることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
トランスアミナーゼ突然変異体であって、（１）配列番号２に、下記から選ばれるいずれか１つのアミノ酸突然変異が発生して得られたものであるか、【表1】
（２）野生型トランスアミナーゼの保存的アミノ酸の突然変異から得られ、野生型ＣｖＴＡトランスアミナーゼの配列番号１を参照とし、前記保存的アミノ酸に、（ａ）Ｌ５９Ａ＋Ｆ８８Ａ、（ｂ）Ｌ５９Ａ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ、（ｃ）Ｌ５９Ａ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ＋Ｎ８６Ｈ、（ｄ）Ｌ５９Ａ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｙ８５Ｍのうちのいずれかの組合せ突然変異が発生し、前記野生型トランスアミナーゼは、下表に示される酵素番号が１～５４であるいずれか１つに由来するものであることを特徴とするトランスアミナーゼ突然変異体。
【表2】
【請求項2】
請求項１に記載のトランスアミナーゼ突然変異体をコードすることを特徴とするＤＮＡ分子。
【請求項3】
請求項２に記載のＤＮＡ分子が連結されていることを特徴とする組換えプラスミド。
【請求項4】
キラルアミン化合物の合成方法であって、請求項１に記載のトランスアミナーゼ突然変異体を用いて、アミノ供与体の作用下で、式Ｉで表されるケトン類基質に対してアミノ基転移反応を行い、前記キラルアミン化合物を獲得し、【化1】
Ａｒ２は、置換又は非置換のアリール基、又はシクロアルキル基を表し、及び
任意的なＲであり、Ｒは、Ｃ原子数が１～５の置換又は非置換のアルキレン基を表し、前記Ｒは前記Ａｒ１或いはＡｒ２と連結して環を形成し、
ここで、前記置換のアリール基或いはアリーレン基、前記置換のヘテロアリーレン基或いは前記置換のアルキレン基の置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ基或いはアミノ基から選択され、前記置換のヘテロアリーレン基中のヘテロ原子はＮ、Ｏ或いはＳから選択される、キラルアミン化合物の合成方法。
【請求項5】
前記置換のアリール基或いはアリーレン基中の置換基は、ハロゲン或いは－Ｓ－ＣＨ３であり、前記ハロゲン或いは－Ｓ－ＣＨ３は、前記アリール基或いはアリーレン基のオルト位、メタ位或いはパラ位のうちのいずれか１つ以上の位置に位置する請求項４に記載の合成方法
【請求項6】
前記ハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ或いはＢｒである請求項５に記載の合成方法。
【請求項7】
式Ｉで表されるケトン類基質は、ｉ）前記Ａｒ１は、置換又は非置換のアリール基或いはアリーレン基を表し、前記Ａｒ２は、非置換のアリール基を表し、前記Ｒは、Ｃ原子数が１～５の非置換のアルキレン基を表し、且つ前記Ｒは前記Ａｒ１と連結して環を形成するもの、
ｉｉ）前記Ａｒ１は、非置換のヘテロアリーレン基を表し、前記Ａｒ２は、ハロゲン置換のアリール基を表し、前記Ｒは、ヒドロキシ基置換のＣ原子数が１～５のアルキレン基を表し、且つ前記Ｒは前記Ａｒ１と連結して環を形成するもの、
ｉｉｉ）前記Ａｒ１は、ハロゲン及びアミノ基置換のアリーレン基を表し、前記Ａｒ２は、炭素数が３～８のシクロアルキル基であるもの、
ｉｖ）前記Ａｒ１は、非置換のシクロアルキル基或いはアリール基を表し、前記Ａｒ２は、置換又は非置換のシクロアルキル基或いはアリール基であるもの、
ｖ）前記Ａｒ１は、ヒドロキシ基、メチル基、エチル基或いは－Ｓ－ＣＨ３置換のシクロアルキル基或いはアリール基を表し、前記Ａｒ２は、非置換のアリール基或いはアルキル基であるもの、のいずれか１つである請求項４に記載の合成方法。
【請求項8】
前記ケトン類基質は、【化2】
【請求項9】
前記アミノ供与体は、イソプロピルアミン、イソプロピルアミン塩酸塩、アラニン、ｎ－ブチルアミン或いはアニリンである請求項４に記載の合成方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物酵素応用の分野に関し、具体的に言えば、トランスアミナーゼ突然変異体及びその応用に関する。
【背景技術】
【0002】
大きな立体障害のキラルアミン化合物（本願では、潜在的キラルカルボニル基の隣の基がメチル基より大きい一種類の化合物を指す。）は、一種類の光学活性物質及び機能性分子であり、薬物及びリガンドの合成に広く応用される重要なキラル中間体である。しかしながら、このようなキラル化合物の合成に関する報告は少なく、しかも満足できる結果が得られていないのが現状である。例えば、カルボニル基の一側に大きな立体障害のフェニルｔ－ブチルアミノエステルがあるものの選択性は７６％である（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００７，４６，４３６７）。現在、小さな立体障害（本願では、潜在的キラルカルボニル基の隣の基がＨ又はメチル基である一種類の化合物を指す。）の不斉水素化反応に対して、一部の金属触媒、例えばルテニウム、ロジウム、パラジウムなどはいずれも、良い立体選択性を得たことが報告されているが、カルボニル基の近接立体障害が大きいにつれて、触媒効果が悪くなる。
【0003】
不斉水素化とは、ファインケミカル及びプロドラッグを生産するための１種類の技術であるが、この技術は、いくつかの欠点があり、例えば高圧水素ガスを用いる必要があり、生産の安全性に大きな挑戦をもたらし、高価な遷移金属触媒が必要であり、これらの有毒な触媒が後処理過程で慎重に取り扱い、且つ除去する必要があるる。また、この過程では、対応するリガンドをスクリーニングするのに多大な労力や物資を要する。多くの場合、この過程には、立体選択性が高くないという問題も存在する（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０，３２９，３０５）。
【0004】
トランスアミナーゼによって触媒される不斉アミノ基転移反応は、キラルアミン化合物の合成に、経済的で、環境に優しい合成考え方を提供した。しかし、トランスアミナーゼの構造に大小２つのポケットが天然に存在するため、転化可能な基質には大きな限界があり、現在は、大きな立体障害のキラルアミン化合物に対して触媒活性を有するトランスアミナーゼがまだ見出されていない。一般的に言えば、潜在的キラルカルボニル基の隣の基が、メチル基より大きい場合に、トランスアミナーゼの小ポケットには受け入れられることができない。そのため、トランスアミナーゼが大きな立体障害のキラルアミン化合物の合成を触媒することは、長年にわたる存在する挑戦である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の主な目的は、トランスアミナーゼが大きな立体障害のキラルアミン化合物の合成を触媒しにくいという従来技術における問題を解決するために、トランスアミナーゼ突然変異体及びその応用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上記目的を実現するために、本発明の一態様によれば、トランスアミナーゼ突然変異体を提供し、当該トランスアミナーゼ突然変異体は、（１）配列番号２に、Ｆ２２Ａ、Ｌ５９Ａ、Ｗ６０Ａ、Ｃ６１Ａ、Ｆ８８Ａ、Ｙ８９Ａ、Ｋ９０Ａ、Ｔ１０７Ａ、Ｎ１５１Ａ、Ｙ１５３Ａ、Ｆ１６６Ａ、Ｅ１７１Ａ、Ｋ１９３Ａ、Ｖ２３４Ａ、Ｉ２６２Ａ、Ｉ２９７Ａ、Ｋ３０４Ａ、Ｆ３２０Ａ、Ｔ３２１Ａ、Ｅ３６８Ａ、Ｌ３８０Ａ、Ｆ３９７Ａ、Ｒ４０５Ａ、Ｆ４０９Ａ、Ｄ４１６Ａ、Ｓ４１７Ａ、Ｃ４１８Ａ、Ｓ４２４Ａのいずれか１つのアミノ酸突然変異が発生して得られたもの、又は（２）配列番号２に、Ｆ８８Ａ、と、Ｌ５９、Ｐ８３、Ｆ８４、Ｙ８５、Ｎ８６、Ｔ８７、Ｙ８９、Ｋ９０、Ｔ９１、Ｆ４０９及びＡ４１７の位置のうちのいずれか１つ以上の位置との突然変異であるアミノ酸突然変異が発生して得られたもの、又は（３）野生型トランスアミナーゼの保存的アミノ酸が突然変異して得られ、野生型ＣｖＴＡトランスアミナーゼの配列番号１のものを参照とし、保存的アミノ酸が配列番号１の第５４～６３位及び第８４～９６位に位置し、保存的アミノ酸に、Ｌ５９Ａ、Ｗ６０Ａ、Ｃ６１Ａ、Ｆ８４Ｓ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｒ／Ｖ／Ｐ／Ａ／Ｍ／Ｅ／Ｋ／Ｗ／Ｑ／Ｔ／Ｈ／Ｄ／Ｙ／Ｎ／Ｉ、Ｙ８５Ｍ、Ｎ８６Ｈ／Ｑ／Ｐ／Ｄ／Ｋ／Ｙ／Ｓ／Ｌ／Ｍ／Ｉ／Ｔ／Ｗ／Ｆ／Ｖ／Ｒ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、Ｔ８７Ｋ／Ｃ／Ｅ／Ｎ／Ｑ／Ｈ／Ｆ／Ｒ／Ｄ／Ｉ／Ｍ／Ｗ／Ａ／Ｐ／Ｖ／Ｓ／Ｌ／Ｇ、Ｆ８８Ａ、Ｙ８９Ｄ／Ａ／、Ｋ９０Ａ／Ｆ／Ｇ／Ｄ／Ｃ／Ｓ／Ａ／Ｅ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｒ／Ｔ／Ｙ／Ｍ／Ｈ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｗ、Ｔ９１Ｍ／Ｗ／Ｖ／Ｇ／Ｃ／Ｒ／Ａ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｅ／Ｌ／Ｓ／Ｋ／Ｈ／Ｑ／Ｄ／Ｎ／Ｐ／Ｙのうちの少なくともいずれか１つの突然変異が発生して得られたものから選択される。「／」は「又は」を表す。
【0007】
さらに、（３）において、野生型トランスアミナーゼは、配列番号１と６９％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上の相同性を有し、且つ、保存的アミノ酸を有する野生型トランスアミナーゼであり、好ましくは、野生型トランスアミナーゼは、表９及び表１１に示す酵素番号が１～５４に示される供給源のうちのいずれか一つに由来する。
【0008】
さらに、（３）において、保存的アミノ酸に、（ａ）Ｌ５９Ａ＋Ｆ８８Ａ、（ｂ）Ｌ５９Ａ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ、（ｃ）Ｌ５９Ａ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ＋Ｎ８６Ｈ、（ｄ）Ｌ５９Ａ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｙ８５Ｍのうちのいずれか一つの組合せ突然変異が発生する。
【0009】
さらに、（１）又は（２）において、アミノ酸突然変異は、以下のいずれか１つである。
【表1】
【0010】
上記の目的を実現するために、本発明の第２態様によれば、上記のいずれか１つのトランスアミナーゼ突然変異体をコードするＤＮＡ分子を提供する。
【0011】
上記の目的を実現するために、本発明の第３態様によれば、上記のＤＮＡ分子が連結されている組換えプラスミドを提供する。
【0012】
上記の目的を実現するために、本発明の第４態様によれば、キラルアミン化合物の合成方法を提供し、上記のいずれか１つのトランスアミナーゼ突然変異体を用いて、アミノ供与体の作用下で、式Ｉで表されるケトン類基質に対してアミノ基転移反応を行い、キラルアミン化合物を獲得し、
Ａｒ１は、置換又は非置換のアリール基或いはアリーレン基、又は置換又は非置換のヘテロアリーレン基を表し、Ａｒ２は、置換又は非置換のアリール基、又はシクロアルキル基を表し、任意的なＲであり、Ｒは、Ｃ原子数が１～５の置換又は非置換のアルキレン基を表し、ＲはＡｒ１或いはＡｒ２と連結して環を形成し、ここで、置換のアリール基或いはアリーレン基、置換のヘテロアリーレン基或いは置換のアルキレン基の置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ基或いはアミノ基から選択され、置換のヘテロアリーレン基中のヘテロ原子はＮ、Ｏ或いはＳから選択される。
【化1】
【0013】
さらに、置換のアリール基或いはアリーレン基中の置換基はハロゲン或いは－Ｓ－ＣＨ３であり、ハロゲン或いは－Ｓ－ＣＨ３は、アリール基或いはアリーレン基のオルト位、メタ位或いはパラ位のうちのいずれか１つ以上の位置に位置し、好ましくは、ハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ或いはＢｒである。
【0014】
さらに、Ａｒ１は、置換又は非置換のアリール基或いはアリーレン基を表し、Ａｒ２は、非置換のアリール基を表し、Ｒは、Ｃ原子数が１～５の非置換のアルキレン基を表し、且つＲは、Ａｒ１と連結して環を形成する。
【0015】
さらに、Ａｒ１は、非置換のヘテロアリーレン基を表し、Ａｒ２は、ハロゲン置換のアリール基を表し、Ｒは、ヒドロキシ基置換のＣ原子数が１～５のアルキレン基を表し、且つＲは、Ａｒ１と連結して環を形成する。
【0016】
さらに、Ａｒ１は、ハロゲン及びアミノ基置換のアリーレン基を表し、Ａｒ２は、炭素数が３～８のシクロアルキル基である。
【0017】
さらに、Ａｒ１は、非置換のシクロアルキル基或いはアリール基を表し、Ａｒ２は、置換又は非置換のシクロアルキル基或いはアリール基である。
【0018】
さらに、Ａｒ１は、ヒドロキシ基、メチル基、エチル基或いは－Ｓ－ＣＨ３によって置換されるシクロアルキル基或いはアリール基を表し、Ａｒ２は、非置換のアリール基或いはアルキル基である。
【0019】
さらに、ケトン類基質は、
である。
【化2】
【0020】
さらに、アミノ供与体は、イソプロピルアミン、イソプロピルアミン塩酸塩、アラニン、ｎ－ブチルアミン或いはアニリンである。
【発明の効果】
【0021】
本発明の技術的解決手段を使用して、特定の基質に対していずれも一定の触媒活性を有する一種類のトランスアミナーゼをスクリーニングし、且つこのようなトランスアミナーゼが有する保存的なアミノ酸配列領域を分析し、保存領域のアミノ酸に対して部位特異的突然変異及び定方向スクリーニングを行い、それにより、野生型に比べ、一連の触媒活性が向上したトランスアミナーゼ突然変異体を取得した。これらの突然変異体を利用してキラルアミン系化合物の合成、特に大きな立体障害のキラルアミンの合成を行い、生産効率の向上、工業生産コストの低減に有利である。且つ、生物酵素でグリーン化学合成を行い、工業の廃液・廃ガス・廃棄物の低減に有利である。
【図面の簡単な説明】
【0022】
本願の一部を構成する明細書の添付図面は、本発明に対する更なる理解を提供するために用いられ、本発明の例示的な実施例及びその説明は、本発明を解釈するために用いられ、本発明を不当に限定するものではない。図面は下記の通りである。
【図1】本発明の実施例による多重配列（配列番号１及び配列番号３～配列番号２０）アラインメントの部分的結果の模式図を示す。
【図2】本発明の実施例による多重配列（配列番号２０～配列番号３８）アラインメントの部分的結果の模式図を示す。
【図3】本発明の実施例による多重配列（配列番号３９～配列番号５６）アラインメントの部分的結果の模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【0023】
なお、本願における実施例及び実施例における特徴は、矛盾しない限り、互いに組み合わせることができる。以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【0024】
用語の解釈
大きな立体障害のキラルアミン化合物：本願では、プロキラルカルボニル基の隣の基がメチル基より大きいケトン類化合物をいい、ここで、メチル基より大きい基は、例えば、エチル、プロピル、ｔ－ブチル或いはフェニルｔ－ブチルなどであり得る。
大きな立体障害のキラルアミン化合物：本願では、プロキラルカルボニル基の隣の基がメチル基より大きいケトン類化合物をいい、ここで、メチル基より大きい基は、例えば、エチル、プロピル、ｔ－ブチル或いはフェニルｔ－ブチルなどであり得る。
【0025】
従来技術には、大きな立体障害のキラルアミン化合物に対して触媒活性を有するトランスアミナーゼが、未だ報告されず、この状況を改善するために、発明者は、既存の報告されているトランスアミナーゼに対してバルクスクリーニングを行い、数千種類の野生型トランスアミナーゼをスクリーニングし、結果は予想に類似し、大多数は触媒活性を有さない（即ち、目標生成物が全く検出されていない）。しかし、このような大きな立体障害のキラルアミン化合物の合成を触媒することが可能なトランスアミナーゼ（表１０及び表１２）が依然として幾つか発見され、活性（基質を触媒する転化率）が低い（１％より低い）が、少なくとも潜在的な改良の基礎を提供する。
【0026】
発明者は、これらの一定の触媒活性を有する、Ｃｈｒｏｍｏｂａｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍのＣｖＴＡトランスアミナーゼ（野生型配列が配列番号１である。）と同属又は異属由来のトランスアミナーゼに対して、ＣｖＴＡトランスアミナーゼをアミノ酸配列アラインメントを行う参照配列として、多重配列アラインメントを行い、アラインメント結果は、図１～図３に示すように、保存的アミノ酸配列領域が複数存在することを見出した。例えば、第３７位のＴ、第４１のＧ、第４３～３７位のＹＬＷＤＳ、第４９位のＧ、第５１～５２位のＫＩ、第５４～６３位のＤＧＭＡＧＬＷＣＶＮ、第６６～６９位のＧＹＧＲ、第７５位のＡ、第７８～７９位のＱＭ、第８１～８２位のＥＬ、第８４～９６位のＦＹＮＴＦＦＫＴＴＨＰＡＶなどである。
【0027】
多重配列アラインメントの結果から分かるように、第５４位～第６３位の保存的アミノ酸配列領域及び第８４位～第９６位の保存的アミノ酸配列領域は、両領域ともＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属のトランスアミナーゼ中で保存性が高く、且つ構造上でいずれも基質結合近傍に位置し、比較的重要なアミノ酸である。一般的に言えば、タンパク質配列中の高度保存的な部位の突然変異は酵素活性の損失を招きやすいため、高度保存的な位置で突然変異を行うことは一般的に選択されない。でも、このようなトランスアミナーゼが、一定のトランスアミナーゼ活性を有し、従って、このような保存的アミノ酸配列領域のアミノ酸に対してある突然変異を行った後に、大きな立体障害の基質に対するこのようなトランスアミナーゼの触媒活性を高めるのに役立つかもしれない。
【0028】
このような大きな立体障害の基質に対するこれらの保存的アミノ酸の部位の突然変異の触媒活性が改善されたかをさらに検証するために、発明者は、まず、Ｃｈｒｏｍｏｂａｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ由来のＣｖＴＡトランスアミナーゼ（野生型配列が配列番号１である。）をテストし、且つＣｖＴＡトランスアミナーゼにＴ７Ｃ、Ｓ４７Ｃ、Ｆ８９Ｙ、Ｍ１６６Ｆ、Ｙ１６８Ａ、Ｖ３７９Ａ、Ｑ３８０Ｌ、Ｒ４１６Ｄ及びＡ４１７Ｓという突然変異が発生した後の変異体を進化型母種とし、当該母種のアミノ酸配列を配列番号２と記す。
【0029】
配列番号１の配列は次のとおりである（４５９個のアミノ酸）。
【化3】
【0030】
配列番号２の配列は次のとおりである。
【化4】
【0031】
さらに、当該母種を基として、タンパク質工学改造を行って、一連のトランスアミナーゼ突然変異体を獲得し、結果から、複数のケトン類基質に対するこれらのトランスアミナーゼ突然変異体の触媒効率がきわめて大きく向上し、複数のキラルアミン化合物の合成、特に大きな立体障害のキラルアミン化合物の高効率合成に使用できることを見出した。
【0032】
さらに、発明者は、上記の異なる由来の野生型トランスアミナーゼ（即ち配列番号３～配列番号５６に示すもの）について、いずれも同じ保存部位で同じ突然変異を行わせた。例えば、配列番号１を基にＬ５９Ａ突然変異が発生することにしたがって、他の種属由来のトランスアミナーゼの対応する保存部位に同じＬのＡへの突然変異を行い、大きな立体障害の基質に対していずれも明らかな改善された触媒活性を有することを見出した。類似して、配列番号１を基にＬ５９Ａ＋Ｆ８８Ａ突然変異が発生することにしたがって、他の種属由来のトランスアミナーゼに対する相応の保存的アミノ酸部位に同じ突然変異を行って、同様に、大きな立体障害の基質に対する触媒活性を得た。
【0033】
実施例部分では、配列番号１を参照とする第５４～６３位及び第８４～９６位の保存的アミノ酸突然変異を例とし、異なる種属由来の野生型トランスアミナーゼが、ＣｖＴＡトランスアミナーゼと同じ保存的アミノ酸部位を有する領域で同じアミノ酸突然変異を行われた後の、大きな立体障害の基質に対する触媒活性の変化について詳細に説明する。
【0034】
これに基づいて、本願の好ましい一実施例において、上記のトランスアミナーゼ突然変異体は、
（１）配列番号２に、Ｆ２２Ａ、Ｌ５９Ａ、Ｗ６０Ａ、Ｃ６１Ａ、Ｆ８８Ａ、Ｙ８９Ａ、Ｋ９０Ａ、Ｔ１０７Ａ、Ｎ１５１Ａ、Ｙ１５３Ａ、Ｆ１６６Ａ、Ｅ１７１Ａ、Ｋ１９３Ａ、Ｖ２３４Ａ、Ｉ２６２Ａ、Ｉ２９７Ａ、Ｋ３０４Ａ、Ｆ３２０Ａ、Ｔ３２１Ａ、Ｅ３６８Ａ、Ｌ３８０Ａ、Ｆ３９７Ａ、Ｒ４０５Ａ、Ｆ４０９Ａ、Ｄ４１６Ａ、Ｓ４１７Ａ、Ｃ４１８Ａ、Ｓ４２４Ａのいずれか１つのアミノ酸突然変異が発生して得られたもの、又は
（２）配列番号２に、Ｆ８８Ａと、Ｌ５９、Ｐ８３、Ｆ８４、Ｙ８５、Ｎ８６、Ｔ８７、Ｙ８９、Ｋ９０、Ｔ９１、Ｆ４０９及びＡ４１７の位置のうちのいずれか１つ以上の位置との突然変異であるアミノ酸突然変異が発生して得られたもの、又は
（３）野生型トランスアミナーゼの保存的アミノ酸が突然変異して得られ、その中の野生型ＣｖＴＡトランスアミナーゼの配列番号１のものを参照とし、保存的アミノ酸が配列番号１の第５４～６３位及び第８４～９６位に位置し、保存的アミノ酸に、Ｌ５９Ａ、Ｗ６０Ａ、Ｃ６１Ａ、Ｆ８４Ｓ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｒ／Ｖ／Ｐ／Ａ／Ｍ／Ｅ／Ｋ／Ｗ／Ｑ／Ｔ／Ｈ／Ｄ／Ｙ／Ｎ／Ｉ、Ｙ８５Ｍ、Ｎ８６Ｈ／Ｑ／Ｐ／Ｄ／Ｋ／Ｙ／Ｓ／Ｌ／Ｍ／Ｉ／Ｔ／Ｗ／Ｆ／Ｖ／Ｒ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、Ｔ８７Ｋ／Ｃ／Ｅ／Ｎ／Ｑ／Ｈ／Ｆ／Ｒ／Ｄ／Ｉ／Ｍ／Ｗ／Ａ／Ｐ／Ｖ／Ｓ／Ｌ／ＧＦ８８Ａ、Ｙ８９Ｄ／Ａ／、Ｋ９０Ａ／Ｆ／Ｇ／Ｄ／Ｃ／Ｓ／Ａ／Ｅ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｒ／Ｔ／Ｙ／Ｍ／Ｈ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｗ、Ｔ９１Ｍ／Ｗ／Ｖ／Ｇ／Ｃ／Ｒ／Ａ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｅ／Ｌ／Ｓ／Ｋ／Ｈ／Ｑ／Ｄ／Ｎ／Ｐ／Ｙのうちの少なくともいずれか１つの突然変異が発生して得られたものから選択され、「／」は「又は」を表す。
（１）配列番号２に、Ｆ２２Ａ、Ｌ５９Ａ、Ｗ６０Ａ、Ｃ６１Ａ、Ｆ８８Ａ、Ｙ８９Ａ、Ｋ９０Ａ、Ｔ１０７Ａ、Ｎ１５１Ａ、Ｙ１５３Ａ、Ｆ１６６Ａ、Ｅ１７１Ａ、Ｋ１９３Ａ、Ｖ２３４Ａ、Ｉ２６２Ａ、Ｉ２９７Ａ、Ｋ３０４Ａ、Ｆ３２０Ａ、Ｔ３２１Ａ、Ｅ３６８Ａ、Ｌ３８０Ａ、Ｆ３９７Ａ、Ｒ４０５Ａ、Ｆ４０９Ａ、Ｄ４１６Ａ、Ｓ４１７Ａ、Ｃ４１８Ａ、Ｓ４２４Ａのいずれか１つのアミノ酸突然変異が発生して得られたもの、又は
（２）配列番号２に、Ｆ８８Ａと、Ｌ５９、Ｐ８３、Ｆ８４、Ｙ８５、Ｎ８６、Ｔ８７、Ｙ８９、Ｋ９０、Ｔ９１、Ｆ４０９及びＡ４１７の位置のうちのいずれか１つ以上の位置との突然変異であるアミノ酸突然変異が発生して得られたもの、又は
（３）野生型トランスアミナーゼの保存的アミノ酸が突然変異して得られ、その中の野生型ＣｖＴＡトランスアミナーゼの配列番号１のものを参照とし、保存的アミノ酸が配列番号１の第５４～６３位及び第８４～９６位に位置し、保存的アミノ酸に、Ｌ５９Ａ、Ｗ６０Ａ、Ｃ６１Ａ、Ｆ８４Ｓ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｒ／Ｖ／Ｐ／Ａ／Ｍ／Ｅ／Ｋ／Ｗ／Ｑ／Ｔ／Ｈ／Ｄ／Ｙ／Ｎ／Ｉ、Ｙ８５Ｍ、Ｎ８６Ｈ／Ｑ／Ｐ／Ｄ／Ｋ／Ｙ／Ｓ／Ｌ／Ｍ／Ｉ／Ｔ／Ｗ／Ｆ／Ｖ／Ｒ／Ｓ／Ｋ／Ｇ、Ｔ８７Ｋ／Ｃ／Ｅ／Ｎ／Ｑ／Ｈ／Ｆ／Ｒ／Ｄ／Ｉ／Ｍ／Ｗ／Ａ／Ｐ／Ｖ／Ｓ／Ｌ／ＧＦ８８Ａ、Ｙ８９Ｄ／Ａ／、Ｋ９０Ａ／Ｆ／Ｇ／Ｄ／Ｃ／Ｓ／Ａ／Ｅ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｒ／Ｔ／Ｙ／Ｍ／Ｈ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｗ、Ｔ９１Ｍ／Ｗ／Ｖ／Ｇ／Ｃ／Ｒ／Ａ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｅ／Ｌ／Ｓ／Ｋ／Ｈ／Ｑ／Ｄ／Ｎ／Ｐ／Ｙのうちの少なくともいずれか１つの突然変異が発生して得られたものから選択され、「／」は「又は」を表す。
【0035】
本願の好ましい一実施例において、上記の野生型トランスアミナーゼは、配列番号１と６９％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上の相同性を有し、且つ保存的アミノ酸を有する野生型トランスアミナーゼである。例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の相同性を有する野生型トランスアミナーゼであってもよい。例えば、さらに、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、さらには９９．９％以上の相同性の野生型トランスアミナーゼであってもよい。
【0036】
本願の好ましい一実施例において、野生型トランスアミナーゼは、酵素番号が１～５４に示される５４種類の供給源のうちのいずれか１つに由来する。
【0037】
本願の好ましい一実施例において、保存的アミノ酸に、（ａ）Ｌ５９Ａ＋Ｆ８８Ａ、（ｂ）Ｌ５９Ａ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ、（ｃ）Ｌ５９Ａ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ＋Ｎ８６Ｈ、（ｄ）Ｌ５９Ａ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｙ８５Ｍのうちのいずれか一つの組合せの突然変異が発生する。
【0038】
本願の好ましい一実施例において、トランスアミナーゼ突然変異は、表１～表９に示されるトランスアミナーゼ突然変異体である。
【0039】
上記の各トランスアミナーゼ突然変異体は、いずれも野生型に比べ、ケトン類基質に対する触媒活性が大幅に向上し、トランスアミナーゼを利用して大きな立体障害のキラルアミン化合物の合成を触媒することを実現し、重金属触媒を用いる必要がなく、グリーン化学合成が実現され、且つ活性が向上したトランスアミナーゼを使用してアミノ基転移反応を行い、高活性・高選択性の一連のキラルアミン化合物を容易に得ることができる。
【0040】
本願の典型的な実施例において、前述のいずれか１つのトランスアミナーゼ突然変異体をコードするＤＮＡ分子をさらに提供する。当該ＤＮＡ分子がコードしたトランスアミナーゼ突然変異体は、一連のケトン類基質化合物に対して高い触媒活性を有し、生物酵素で触媒する方法によりこのようなキラルアミン化合物を合成するのに有利である。
【0041】
本発明の上記ＤＮＡ分子は、「発現カセット」の形態で存在してもよい。「発現カセット」とは適切な宿主細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができるＤＮＡ及びＲＮＡ配列を包含する、線形又は環状の核酸分子を指す。一般に、目的ヌクレオチドに効果的に連結されたプロモーターを含み、これは任意選択で停止シグナル及び／又は他の調節エレメントに効果的に連結されている。発現カセットは、また、ヌクレオチド配列の正確な翻訳に必要な配列を含んでもよい。コード領域は、通常、目的タンパク質をコードするが、センス又はアンチセンス方向に目的機能性ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡもコードする。目的ポリヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってもよく、ここで、キメラとは、少なくとも１つのその成分と、その少なくとも１つの他の成分とが異種であることを意味する。発現カセットは、また、天然に存在するが、異種発現のための効果的な組換え形成によって得られることができる。
【0042】
本願の典型的な一実施例において、前述のＤＮＡ分子が連結されている組換えプラスミドをさらに提供する。当該組換えプラスミドは、上記いずれかのＤＮＡ分子を含有する。上記組換えプラスミド中のＤＮＡ分子は、組換えプラスミドの適切な位置に配置されることにより、上記ＤＮＡ分子は、複製、転写又は発現を正確かつ円滑に行うことができる。
【0043】
本発明において上記ＤＮＡ分子を限定する際に用いる限定語は「含有」であるが、ＤＮＡ配列の両端にその機能に関与しない他の配列を任意に付加できることを意味するものではない。当業者は、組換え操作の要求を満たすために、ＤＮＡ配列の両端に適切な制限酵素の酵素切断部位を付加するか、又は開始コドン、終止コドンなどをさらに付加する必要があることを知っており、従って、閉鎖式の表現で限定すれば、これらの状況を真実にカバーすることができない。
【0044】
本発明において用いられる用語「プラスミド」は、二本鎖又は一本鎖の線形又は環状の形態の任意のプラスミド、コスミド、バクテリオファージ又はアグロバクテリウム二元核酸分子を含み、好ましくは組換え発現プラスミドであり、原核生物発現プラスミドであっても真核生物発現プラスミドであってもよいが、好ましくは原核生物発現プラスミドであり、幾つかの実施方案において、組換えプラスミドは、ｐＥＴ－２１ｂ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－３ａ（＋）、ｐＥＴ－３ｄ（＋）、ｐＥＴ－１１ａ（＋）、ｐＥＴ－１２ａ（＋）、ｐＥＴ－１４ｂ、ｐＥＴ－１５ｂ（＋）、ｐＥＴ－１６ｂ（＋）、ｐＥＴ－１７ｂ（＋）、ｐＥＴ－１９ｂ（＋）、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ｂ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）、ｐＥＴ－２９ａ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ（＋）、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａ（＋）、ｐＥＴ－３５ｂ（＋）、ｐＥＴ－３８ｂ（＋）、ｐＥＴ－３９ｂ（＋）、ｐＥＴ－４０ｂ（＋）、ｐＥＴ－４１ａ（＋）、ｐＥＴ－４１ｂ（＋）、ｐＥＴ－４２ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ｂ（＋）、ｐＥＴ－４４ａ（＋）、ｐＥＴ－４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ－Ａ、ｐＲＳＥＴ－Ｂ、ｐＲＳＥＴ－Ｃ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２－８、ｐＵＣ－１８又はｐＵＣ－１９から選択される。より好ましくは、上記の組換えプラスミドはｐＥＴ－２２ｂ（＋）である。
【0045】
本発明の典型的な一実施形態によれば、上記のいずれか１つの組換えプラスミドを含有する宿主細胞を提供する。本発明に適用される宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞を含むが、これらに限定されない。好ましくは、原核細胞は大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌ＤＨ５α形質転換受容性細胞であり、真核細胞は酵母である。
【0046】
本願の典型的な実施例において、キラルアミン化合物の合成方法をさらに提供し、当該合成方法は、上記のいずれか１つのトランスアミナーゼ突然変異体を用いてアミノ供与体の作用下で、式Ｉで表されるケトン類基質に対してアミノ基転移反応を行い、キラルアミン化合物を獲得し、
Ａｒ１は、置換又は非置換のアリール基或いはアリーレン基、又は置換又は非置換のヘテロアリーレン基を表し、Ａｒ２は、置換又は非置換のアリール基、又はシクロアルキル基を表し、任意的なＲであり、Ｒは、Ｃ原子数が１～５の置換又は非置換のアルキレン基を表し、ＲはＡｒ１或いはＡｒ２と連結して環を形成し、ここで、置換のアリール基或いはアリーレン基、置換のヘテロアリーレン基或いは置換のアルキレン基の置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ基或いはアミノ基から選択され、置換のヘテロアリーレン基中のヘテロ原子はＮ、Ｏ或いはＳから選択される。
【化5】
【0047】
本発明の上記のトランスアミナーゼは上記の式Ｉで表される基質に対してより高い酵素触媒活性を有するため、本発明のトランスアミナーゼ突然変異体を利用してキラルアミン系化合物、特に大きな立体障害のキラルアミン系化合物を製造し、生産コストを低減できるだけでなく、得られた大きな立体障害のキラルアミンの純度及びｅｅ値がより高い。
【0048】
上記の置換のアリール基或いはアリーレン基中の置換基はハロゲン或いは－Ｓ－ＣＨ３であり、ハロゲン或いは－Ｓ－ＣＨ３は、アリール基或いはアリーレン基のオルト位、メタ位或いはパラ位のうちのいずれか１つ以上の位置に位置し、好ましくは、ハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ或いはＢｒである。
【0049】
好まいし一実施例において、Ａｒ１は、置換又は非置換のアリール基或いはアリーレン基を表し、Ａｒ２は、非置換のアリール基を表し、Ｒは、Ｃ原子数が１～５の非置換のアルキレン基を表し、且つＲは、Ａｒ１と連結して環を形成する。
【0050】
好ましい一実施例において、Ａｒ１は、非置換のヘテロアリーレン基を表し、Ａｒ２は、ハロゲン置換のアリール基を表し、Ｒは、ヒドロキシ基置換のＣ原子数が１～５のアルキレン基を表し、且つＲは、Ａｒ１と連結して環を形成する。
【0051】
好ましい一実施例において、Ａｒ１は、ハロゲン及びアミノ基置換のアリーレン基を表し、Ａｒ２は、炭素数が３～８のシクロアルキル基である。
【0052】
好まし一実施例において、Ａｒ１は、非置換のシクロアルキル基或いはアリール基を表し、Ａｒ２は、置換又は非置換のシクロアルキル基或いはアリール基である。
【0053】
好ましい一実施例において、Ａｒ１は、ヒドロキシ基、メチル基、エチル基或いは－Ｓ－ＣＨ３置換のシクロアルキル基或いはアリール基を表し、Ａｒ２は、非置換のアリール基或いはアルキル基である。
【0054】
好ましい一実施例において、ケトン類基質は、
である。
【化6】
【0055】
好ましい一実施例において、アミノ供与体は、イソプロピルアミン、イソプロピルアミン塩酸塩、アラニン、ｎ－ブチルアミン或いはアニリンである。
【0056】
以下、具体的な実施例を参照しながら、上記の技術的解決手段及び技術的効果について説明する。以下の実施例に使用される基質は次のとおりである。
【化7】
【0057】
（一）第一部分では、配列番号２を母種として改造を行った。
【0058】
（実施例１）
母種を基に定方向突然変異を行い、具体的な突然変異部位は下表を参照し、下記のような反応条件にしたがって突然変異体の触媒活性を検出した。
母種を基に定方向突然変異を行い、具体的な突然変異部位は下表を参照し、下記のような反応条件にしたがって突然変異体の触媒活性を検出した。
【0059】
１ｍＬ体系には、１ｍｇの基質１、１ｍｇのＰＬＰ、１ｍｇのイソプロピルアミン塩酸塩、５０ｍｇの酵素粉末、ｐＨ８．０の、１００ｍＭのリン酸塩緩衝液が含まれ、５０℃で４０ｈ反応した。
【0060】
検出結果は、下表を参照する。
備考：上表中で、０は、転化率＜１％を表し、＋は、転化率が１％以上且つ５％未満であることを表し、＋＋は、転化率が５％以上且つ１０％以下であることを表す。
【表2】
【0061】
（実施例２）
実施例１を基に組合せ突然変異を行い、実施例１と同じ反応条件にしたがって組合せ突然変異に対して活性スクリーニングを行い、結果は下表を参照する。
備考：上表中で、０は、転化率＜１％を表し、＋は、転化率が１％以上且つ５％未満であることを表し、＋＋は、転化率が５％以上且つ１０％未満であることを表し、＋＋＋は、転化率１０％以上且つ１５％未満であることを表し、＋＋＋＋は、転化率が１５％以上且つ２０％未満であることを表す。
実施例１を基に組合せ突然変異を行い、実施例１と同じ反応条件にしたがって組合せ突然変異に対して活性スクリーニングを行い、結果は下表を参照する。
【表3】
【0062】
（実施例３）
実施例２を基に組合せ突然変異を行い、実施例１と同じ反応条件にしたがって組合せ突然変異に対して活性スクリーニングを行い、結果は下表を参照する。
備考：０は、転化率＜１％を表し、＋は、転化率が１％以上且つ５％未満であることを表し、＋＋は、転化率が５％以上且つ１０％未満であることを表し、＋＋＋は、転化率１０％以上且つ１５％未満であることを表し、＋＋＋＋は、転化率が１５％以上且つ２０％未満であることを表し、＋＋＋＋＋は、転化率が２０％以上且つ４０％以下であることを表す。
実施例２を基に組合せ突然変異を行い、実施例１と同じ反応条件にしたがって組合せ突然変異に対して活性スクリーニングを行い、結果は下表を参照する。
【表4】
【0063】
（実施例４）
実施例３を基に組合せ突然変異を行い、実施例１と同じ反応条件にしたがって組合せ突然変異に対して活性スクリーニングを行い、結果は下表を参照する。
備考：上表中で、０は、転化率＜１％を表し、＋は、転化率が１％以上且つ５％未満であることを表し、＋＋は、転化率が５％以上且つ１０％未満であることを表し、＋＋＋は、転化率１０％以上且つ１５％未満であることを表し、＋＋＋＋は、転化率が１５％以上且つ２０％未満であることを表し、＋＋＋＋＋は、転化率が２０％以上且つ４０％未満であることを表し、＋＋＋＋＋＋は、転化率が４０％以上であることを表す。
実施例３を基に組合せ突然変異を行い、実施例１と同じ反応条件にしたがって組合せ突然変異に対して活性スクリーニングを行い、結果は下表を参照する。
【表5】
【0064】
（実施例５）
実施例４を基に組合せ突然変異を行い、具体的な突然変異部位は下表を参照し、下記のような反応条件にしたがって突然変異体の触媒活性を検出した。
実施例４を基に組合せ突然変異を行い、具体的な突然変異部位は下表を参照し、下記のような反応条件にしたがって突然変異体の触媒活性を検出した。
【0065】
１ｍＬ体系には、１０ｍｇの基質１、１ｍｇのＰＬＰ、１ｍｇのイソプロピルアミン塩酸塩、５ｍｇの酵素粉末、ｐＨ８．０の、１００ｍＭのリン酸塩緩衝液が含まれ、５０℃で４０ｈ反応し、結果は下表を参照する。
備考：上表中で、＋は、転化率が０％以上且つ２０％未満であることを表し、＋＋は、転化率が２０％以上且つ４０％未満であることを表す。
【表6】
【0066】
（実施例６）
実施例５を基に組合せ突然変異を行い、実施例５と同じ反応条件にしたがって組合せ突然変異に対して活性スクリーニングを行い、結果は下表を参照する。
備考：＋は、転化率が０％以上且つ２０％未満であることを表し、＋＋は、転化率が２０％以上且つ４０％未満であることを表し、＋＋＋は、転化率が４０％以上且つ８０％未満であることを表す。
実施例５を基に組合せ突然変異を行い、実施例５と同じ反応条件にしたがって組合せ突然変異に対して活性スクリーニングを行い、結果は下表を参照する。
【表7】
【0067】
（実施例７）
実施例６を基に組合せ突然変異を行い、実施例５と同じ反応条件にしたがって組合せ突然変異に対して活性スクリーニングを行い、結果は下表を参照する。
備考：上表中、＋は、転化率が０％以上且つ２０％未満であることを表し、＋＋は、転化率が２０％以上且つ４０％未満であることを表し、＋＋＋は、転化率が４０％以上且つ８０％未満であることを表し、＋＋＋＋は、転化率が８０％以上であることを表す。
実施例６を基に組合せ突然変異を行い、実施例５と同じ反応条件にしたがって組合せ突然変異に対して活性スクリーニングを行い、結果は下表を参照する。
【表8】
【0068】
（実施例８）
実施例７を基に組合せ突然変異を行い、実施例５と同じ反応条件にしたがって組合せ突然変異に対して活性スクリーニングを行い、結果は下表を参照する。
備考：上表中で、＋は、転化率が０％以上且つ２０％未満であることを表し、＋＋は、転化率が２０％以上且つ４０％未満であることを表し、＋＋＋は、転化率が４０％以上且つ８０％未満であることを表し、＋＋＋＋は、転化率が８０％以上であることを表す。
実施例７を基に組合せ突然変異を行い、実施例５と同じ反応条件にしたがって組合せ突然変異に対して活性スクリーニングを行い、結果は下表を参照する。
【表9】
【0069】
（実施例９）
実施例８を基に組合せ突然変異を行った。反応条件は、下記のとおりである。
１ｍＬ体系には、１０ｍｇの基質１、１ｍｇのＰＬＰ、１ｍｇのイソプロピルアミン塩酸塩、３ｍｇの酵素粉末、ｐＨ８．０の、１００ｍＭのリン酸塩緩衝液が含まれ、５０℃で４０ｈ反応し、結果は下表を参照する。
備考：上表中で、＋は、転化率が０％以上且つ２０％未満であることを表し、＋＋は、転化率が２０％以上且つ４０％未満であることを表し、＋＋＋は、転化率が４０％以上且つ８０％未満であることを表し、＋＋＋＋は、転化率が８０％以上であることを表す。
実施例８を基に組合せ突然変異を行った。反応条件は、下記のとおりである。
１ｍＬ体系には、１０ｍｇの基質１、１ｍｇのＰＬＰ、１ｍｇのイソプロピルアミン塩酸塩、３ｍｇの酵素粉末、ｐＨ８．０の、１００ｍＭのリン酸塩緩衝液が含まれ、５０℃で４０ｈ反応し、結果は下表を参照する。
【表10】
【0070】
（実施例１０）
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（５ｖｏｌ）を５０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２０ｍＬ加え、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
（基質１）を１０ｇ加え、均一に撹拌してから、配列番号２を基に突然変異したＣｖＴＡのトランスアミナーゼ突然変異体（Ｆ８８Ａ＋Ｌ５９Ａ＋Ｙ８９Ｄ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｋ９０Ｇ＋Ｔ９１Ｍ＋Ｐ８３Ｓ＋Ｖ２３４Ａ＋Ｌ３８０Ａ＋Ｓ４１７Ｉ）の酵素液を１０ｍＬ（０．５ｗｔ、０．５ｇ／ｍＬ）加えて、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。５０℃に昇温させ、夜通し撹拌しながら反応させた。完全に反応させた後、体系の酸性をｐＨ＝２～３に調整して、変性タンパク質にした。濾過後、５０ｍＬのメチルｔ－ブチルエーテルで濾液を抽出した。水相をｐＨ＝１２に調整してから、５０ｍＬのメチルｔ－ブチルエーテルを用いて２回抽出した。有機相を合併して無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、Ｔ＜４０℃、Ｐ≦－０．０６Ｍｐａ条件下で、留分がないまで濃縮した。目標生成物
を得た。
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９８％、ｄｅ値＞９９％、収率８４％であった。
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（５ｖｏｌ）を５０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２０ｍＬ加え、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
【化8】
【化9】
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９８％、ｄｅ値＞９９％、収率８４％であった。
【0071】
（実施例１１）
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（５ｖｏｌ）を５０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２０ｍＬ加え、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
（基質２）を１０ｇ加え、均一に撹拌してから、配列番号２を基に突然変異したＣｖＴＡのトランスアミナーゼ突然変異体（Ｆ８８Ａ＋Ｌ５９Ａ＋Ｙ８９Ｄ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｋ９０Ｇ＋Ｔ９１Ｍ＋Ｐ８３Ｓ＋Ｖ２３４Ａ＋Ｌ３８０Ａ＋Ｓ４１７Ｉ）酵素液を１０ｍＬ（０．５ｗｔ、０．５ｇ／ｍＬ）加えて、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。５０℃に昇温させ、夜通し撹拌しながら反応させた。完全に反応させた後、体系の酸性をｐＨ＝２～３に調整して、変性タンパク質にした。濾過後、５０ｍＬのメチルｔ－ブチルエーテルで濾液を抽出した。水相をｐＨ＝１２に調整してから、５０ｍＬのメチルｔ－ブチルエーテルを用いて２回抽出した。有機相を合併して無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、Ｔ＜４０℃、Ｐ≦－０．０６Ｍｐａ条件下で、留分がないまで濃縮した。目標生成物
を得た。
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９８％、ｄｅ値＞９９％、収率８２％であった。
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（５ｖｏｌ）を５０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２０ｍＬ加え、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
【化10】
【化11】
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９８％、ｄｅ値＞９９％、収率８２％であった。
【0072】
（実施例１２）
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（５ｖｏｌ）を５０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２０ｍＬ加え、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
（基質３）を１０ｇ加え、均一に撹拌してから、配列番号２を基に突然変異したＣｖＴＡのトランスアミナーゼ突然変異体（Ｆ８８Ａ＋Ｌ５９Ａ＋Ｙ８９Ｄ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｋ９０Ｇ＋Ｔ９１Ｍ＋Ｐ８３Ｓ＋Ｖ２３４Ａ＋Ｌ３８０Ａ＋Ｓ４１７Ｉ）酵素液を１０ｍＬ（０．５ｗｔ、０．５ｇ／ｍＬ）加えて、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。５０℃に昇温させ、夜通し撹拌しながら反応させた。完全に反応させた後、体系の酸性をｐＨ＝２～３に調整して、変性タンパク質にした。濾過後、５０ｍＬのメチルｔ－ブチルエーテルで濾液を抽出した。水相をｐＨ＝１２に調整してから、５０ｍＬのメチルｔ－ブチルエーテルを用いて２回抽出した。有機相を合併して無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、Ｔ＜４０℃、Ｐ≦－０．０６Ｍｐａ条件下で、留分がないまで濃縮した。目標生成物
を得た。
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９８％、ｅｅ値＞９９％、収率８０％であった。
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（５ｖｏｌ）を５０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２０ｍＬ加え、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
【化12】
【化13】
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９８％、ｅｅ値＞９９％、収率８０％であった。
【0073】
（実施例１３）
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（５ｖｏｌ）を５０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２０ｍＬ加え、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
（基質４）を１０ｇ加え、均一に撹拌してから、配列番号２を基に突然変異したＣｖＴＡのトランスアミナーゼ突然変異体（Ｆ８８Ａ＋Ｌ５９Ａ＋Ｙ８９Ｄ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｋ９０Ｇ＋Ｔ９１Ｍ＋Ｐ８３Ｓ＋Ｖ２３４Ａ＋Ｌ３８０Ａ＋Ｓ４１７Ｉ）酵素液を１０ｍＬ（０．５ｗｔ、０．５ｇ／ｍＬ）加えて、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。５０℃に昇温させ、夜通し撹拌しながら反応させた。完全に反応させた後、体系の酸性をｐＨ＝２～３に調整して、変性タンパク質にした。濾過後、５０ｍＬのメチルｔ－ブチルエーテルで濾液を抽出した。水相をｐＨ＝１２に調整してから、５０ｍＬのメチルｔ－ブチルエーテルを用いて２回抽出した。有機相を合併して無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、Ｔ＜４０℃、Ｐ≦－０．０６Ｍｐａ条件下で、留分がないまで濃縮した。目標生成物
を得た。
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９８％、ｄｅ値＞９９％、収率８９％であった。
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（５ｖｏｌ）を５０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２０ｍＬ加え、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
【化14】
【化15】
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９８％、ｄｅ値＞９９％、収率８９％であった。
【0074】
（実施例１４）
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（５ｖｏｌ）を５０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２０ｍＬ加え、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
（基質１３）を１０ｇ加え、均一に撹拌してから、配列番号２を基に突然変異したＣｖＴＡのトランスアミナーゼ突然変異体（Ｆ８８Ａ＋Ｌ５９Ａ＋Ｙ８９Ｄ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｋ９０Ｇ＋Ｔ９１Ｍ＋Ｐ８３Ｓ＋Ｖ２３４Ａ＋Ｌ３８０Ａ＋Ｓ４１７Ｉ）酵素液を１０ｍＬ（０．５ｗｔ、０．５ｇ／ｍＬ）加えて、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。５０℃に昇温させ、夜通し撹拌しながら反応させた。完全に反応させた後、体系の酸性をｐＨ＝２～３に調整して、変性タンパク質にした。濾過後、５０ｍＬのメチルｔ－ブチルエーテルで濾液を抽出した。水相をｐＨ＝１２に調整してから、５０ｍＬのメチルｔ－ブチルエーテルを用いて２回抽出した。有機相を合併して無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、Ｔ＜４０℃、Ｐ≦－０．０６Ｍｐａ条件下で、留分がないまで濃縮した。目標生成物
を得た。
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９８％、ｅｅ値９８％、収率８１％であった。
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（５ｖｏｌ）を５０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２０ｍＬ加え、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
【化16】
【化17】
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９８％、ｅｅ値９８％、収率８１％であった。
【0075】
（実施例１５）
配列番号２を基に突然変異したＣｖＴＡのトランスアミナーゼ突然変異体（Ｆ８８Ａ＋Ｌ５９Ａ＋Ｙ８９Ｄ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｋ９０Ｇ＋Ｔ９１Ｍ＋Ｐ８３Ｓ＋Ｖ２３４Ａ＋Ｌ３８０Ａ＋Ｓ４１７Ｉ＋Ａ１６８Ｅ＋Ａ３７９Ｌ＋Ｓ４２４Ａ＋Ｆ３０１Ｓ＋Ｇ１６４Ｓ＋Ｔ４５２Ｓ＋Ｍ１８０Ｖ＋Ｆ４４９Ｌ＋Ｆ３２０Ｈ＋Ｙ３２２Ｔ＋Ｍ９１Ｉ）の酵素液を用いて、実施例１０～実施例１４の触媒合成ステップを参照して、対応する基質に対して触媒反応を行い、結果はそれぞれ（１）～（５）である。
（１）基質１を触媒して合成した目標生成物の純度が＞９９％、ｄｅ値が＞９９％、収率が８７％であり、
（２）基質２を触媒して合成した目標生成物の純度が＞９８％、ｄｅ値が＞９９％、収率が８４％であり、
（３）基質３を触媒して合成した目標生成物の純度が＞９８％、ｅｅ値が＞９９％、収率が８２％であり、
（４）基質４を触媒して合成した目標生成物の純度が＞９９％、ｄｅ値が＞９９％、収率が９１％であり、
（５）基質１３を触媒して合成した目標生成物の純度が＞９８％、ｅｅ値が＞９９％、収率が８５％である。
配列番号２を基に突然変異したＣｖＴＡのトランスアミナーゼ突然変異体（Ｆ８８Ａ＋Ｌ５９Ａ＋Ｙ８９Ｄ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｋ９０Ｇ＋Ｔ９１Ｍ＋Ｐ８３Ｓ＋Ｖ２３４Ａ＋Ｌ３８０Ａ＋Ｓ４１７Ｉ＋Ａ１６８Ｅ＋Ａ３７９Ｌ＋Ｓ４２４Ａ＋Ｆ３０１Ｓ＋Ｇ１６４Ｓ＋Ｔ４５２Ｓ＋Ｍ１８０Ｖ＋Ｆ４４９Ｌ＋Ｆ３２０Ｈ＋Ｙ３２２Ｔ＋Ｍ９１Ｉ）の酵素液を用いて、実施例１０～実施例１４の触媒合成ステップを参照して、対応する基質に対して触媒反応を行い、結果はそれぞれ（１）～（５）である。
（１）基質１を触媒して合成した目標生成物の純度が＞９９％、ｄｅ値が＞９９％、収率が８７％であり、
（２）基質２を触媒して合成した目標生成物の純度が＞９８％、ｄｅ値が＞９９％、収率が８４％であり、
（３）基質３を触媒して合成した目標生成物の純度が＞９８％、ｅｅ値が＞９９％、収率が８２％であり、
（４）基質４を触媒して合成した目標生成物の純度が＞９９％、ｄｅ値が＞９９％、収率が９１％であり、
（５）基質１３を触媒して合成した目標生成物の純度が＞９８％、ｅｅ値が＞９９％、収率が８５％である。
【0076】
以上の実施例の記述から分かるように、上記の実施例により下記のような技術的効果が実現された。
１）活性が向上したトランスアミナーゼを使用してアミノ基転移反応を行い、高活性、高選択性で一連のキラルアミン化合物を得ることができる。
２）トランスアミナーゼ突然変異体を使用して生物触媒を行い、重金属触媒を用いる必要がなく、グリーン化学を実現した。
３）当該トランスアミナーゼ突然変異体は、触媒効率が高く、反応体積が少なく、製品の収率が高く、廃液・廃ガス・廃棄物を大幅に低減させ、生産コストを節約する。
１）活性が向上したトランスアミナーゼを使用してアミノ基転移反応を行い、高活性、高選択性で一連のキラルアミン化合物を得ることができる。
２）トランスアミナーゼ突然変異体を使用して生物触媒を行い、重金属触媒を用いる必要がなく、グリーン化学を実現した。
３）当該トランスアミナーゼ突然変異体は、触媒効率が高く、反応体積が少なく、製品の収率が高く、廃液・廃ガス・廃棄物を大幅に低減させ、生産コストを節約する。
【0077】
（二）第二部分では、さらに、このような大きな立体障害の基質に対する異なる種属由来のトランスアミナーゼ突然変異体の触媒活性に対してスクリーニング及び検証を行った。
【0078】
（実施例１６）他の由来の野生型トランスアミナーゼの触媒活性に対するテスト
本実施例では、Ｃｈｒｏｍｏｂａｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ由来の野生型トランスアミナーゼ（即ち配列番号１）と同属であるが異なる種類であり、且つ配列番号１に比べ、アミノ酸配列の相同性が８２％以上である野生型トランスアミナーゼを選択し（具体的には表１０を参照）、且つ基質４に対する触媒活性をテストし、結果はＣｖＴＡ野生型トランスアミナーゼに類似し（１％以下である。）、具体的な結果は表１１を参照する。
１０＊：番号１０の酵素は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属さないが、相同性が高いため、同表に示した。
本実施例では、Ｃｈｒｏｍｏｂａｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ由来の野生型トランスアミナーゼ（即ち配列番号１）と同属であるが異なる種類であり、且つ配列番号１に比べ、アミノ酸配列の相同性が８２％以上である野生型トランスアミナーゼを選択し（具体的には表１０を参照）、且つ基質４に対する触媒活性をテストし、結果はＣｖＴＡ野生型トランスアミナーゼに類似し（１％以下である。）、具体的な結果は表１１を参照する。
【表11】
【0079】
（実施例１７）目標の大きな立体障害の基質を触媒する活性突然変異体をスクリーニングする。
本実施例において、上記表１０における野生型トランスアミナーゼは、配列番号１に対応する第５９位でＬ５９Ａ突然変異を行うとともに、Ｙ８５Ｍ、Ｎ８６Ｈ、Ｆ８８Ａ及びＦ８９Ｄのいずれか１つ以上の突然変異をさらに行った後、目標の大きな立体障害基質（基質４）を触媒する活性がいずれも異なる程度で向上した（表１１を参照）。当該結果から分かるように、配列番号１と相同性が８２％～９５％であるトランスアミナーゼは、保存的アミノ酸部位で同じアミノ酸突然変異が発生した後、大きな立体障害の基質に対する触媒活性が全部向上した。
上表中で、＋は、転化率が１～２０であることを表し、＋＋は、転化率が２０％以上であることを表す。
本実施例において、上記表１０における野生型トランスアミナーゼは、配列番号１に対応する第５９位でＬ５９Ａ突然変異を行うとともに、Ｙ８５Ｍ、Ｎ８６Ｈ、Ｆ８８Ａ及びＦ８９Ｄのいずれか１つ以上の突然変異をさらに行った後、目標の大きな立体障害基質（基質４）を触媒する活性がいずれも異なる程度で向上した（表１１を参照）。当該結果から分かるように、配列番号１と相同性が８２％～９５％であるトランスアミナーゼは、保存的アミノ酸部位で同じアミノ酸突然変異が発生した後、大きな立体障害の基質に対する触媒活性が全部向上した。
【表12】
【0080】
（実施例１８）
Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のトランスアミナーゼ以外に、本願では、Ｃｈｒｏｍｏｂａｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍと６９％～８７％の相同性を有する他の由来のトランスアミナーゼをさらにテストした。同様に、基質４に対する触媒活性が１％より低い。しかし、これらのトランスアミナーゼの保存的アミノ酸配列領域に、表１１と同じアミノ酸突然変異が発生した後に、いずれも活性が異なる程度向上した。具体的な情報リストは表１２及び表１３を参照する。
上表中で、＋は、転化率が１～２０であることを表し、＋＋は、転化率が２０％以上であることを表す。
Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のトランスアミナーゼ以外に、本願では、Ｃｈｒｏｍｏｂａｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍと６９％～８７％の相同性を有する他の由来のトランスアミナーゼをさらにテストした。同様に、基質４に対する触媒活性が１％より低い。しかし、これらのトランスアミナーゼの保存的アミノ酸配列領域に、表１１と同じアミノ酸突然変異が発生した後に、いずれも活性が異なる程度向上した。具体的な情報リストは表１２及び表１３を参照する。
【表13】
【表14】
【0081】
（実施例１９）
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（５ｖｏｌ）を５０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２４ｍｌ加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
（基質５）を１ｇ加え、均一に撹拌してから、配列番号１を基とするＣｖＴＡの突然変異体（Ｌ５９Ａ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ）酵素液を１０ｍｌ（５ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。３０℃に昇温させ、夜通し撹拌しながら反応させた。完全に反応させた後、体系の酸度をｐＨ＝１に調整し、変性タンパク質にした。濾過後、濾液を、５０ｍＬのジクロロメタンで抽出した。水相をｐＨ＝１２に調整してから、５０ｍｌのジクロロメタンを用いて３回抽出した。有機相を合併して無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、有機相を、Ｔ＜３５℃、Ｐ≦－０．０６Ｍｐａ条件で留分がないまで濃縮した。目標生成物
を得た。
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９８％、ｅｅ値＞９９％、収率８４％であった。
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（５ｖｏｌ）を５０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２４ｍｌ加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
【化18】
【化19】
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９８％、ｅｅ値＞９９％、収率８４％であった。
【0082】
（実施例２０）
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（６ｖｏｌ）を６０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を１８ｍｌ加えて、ｐＨ＝８．０～８．５に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
（基質１）を１ｇ加え、均一に撹拌してから、配列番号１を基とするＣｖＴＡの突然変異体（Ｌ５９Ａ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ）酵素液を１０ｍｌ（５ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）加えて、ｐＨ＝８．０～８．５に調整した。２０℃に温度を調整して、夜通し撹拌しながら反応させた。完全に反応させた後、体系の酸度をｐＨ＝２に調整し、変性タンパク質にした。濾過後、濾液を、５０ｍＬのジクロロメタンで抽出した。水相をｐＨ＝１３に調整してから、５０ｍｌの酢酸エチルを用いて３回抽出した。有機相を合併して無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、有機相を、Ｔ＜４５℃、Ｐ≦－０．０８Ｍｐａ条件下で留分がないまで濃縮した。目標生成物
を得た。
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９８％、ｄｅ値＞９９％、収率８９％であった。
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（６ｖｏｌ）を６０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を１８ｍｌ加えて、ｐＨ＝８．０～８．５に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
【化20】
【化21】
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９８％、ｄｅ値＞９９％、収率８９％であった。
【0083】
（実施例２１）
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（７ｖｏｌ）を７０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を１３ｍｌ加えて、ｐＨ＝７．０～７．５に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
（基質２）を１ｇ加え、均一に撹拌してから、配列番号１を基とするＣｖＴＡの突然変異体（Ｌ５９Ａ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ）酵素液を１０ｍｌ（５ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）加えて、４０℃に昇温させて夜通し撹拌しながら反応させた。完全に反応させた後、体系の酸度をｐＨ＝１に調整し、変性タンパク質にした。濾過後、濾液を、５０ｍＬのジクロロメタンで抽出した。水相をｐＨ＝１３に調整してから、５０ｍｌのジクロロメタンを用いて３回抽出した。有機相を合併して無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、有機相を、Ｔ＜３５℃、Ｐ≦－０．０６Ｍｐａ条件下で留分がないまで濃縮した。目標生成物
を得た。
ＨＰＬＣ検出を経て、純度が９７％より大きく、ｄｅ値が＞９９％、収率が８６％であった。
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（７ｖｏｌ）を７０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を１３ｍｌ加えて、ｐＨ＝７．０～７．５に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
【化22】
【化23】
ＨＰＬＣ検出を経て、純度が９７％より大きく、ｄｅ値が＞９９％、収率が８６％であった。
【0084】
（実施例２２）
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（５ｖｏｌ）を５０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を３８ｍｌ加えて、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
（基質６）を１ｇ加え、均一に撹拌してから、配列番号１を基とするＣｖＴＡの突然変異体（Ｌ５９Ａ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ）酵素液を１０ｍｌ（５ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）加えて、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。温度を１０℃に調整して、夜通し撹拌しながら反応させた。完全に反応させた後、体系の酸度をｐＨ＝２に調整し、変性タンパク質にした。濾過後、濾液を、５０ｍＬのジクロロメタンで抽出した。水相をｐＨ＝１３に調整してから、５０ｍｌのジクロロメタンを用いて３回抽出した。有機相を合併して無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、有機相を、Ｔ＜３５℃、Ｐ≦－０．０６Ｍｐａ条件で留分がないまで濃縮した。目標生成物
を得た。
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９５％、ｄｅ値＞９９％、収率：８５％であった。
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（５ｖｏｌ）を５０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を３８ｍｌ加えて、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
【化24】
【化25】
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９５％、ｄｅ値＞９９％、収率：８５％であった。
【0085】
（実施例２３）
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（７ｖｏｌ）を７０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を１７ｍｌ加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
（基質３）を１ｇ加え、均一に撹拌してから、配列番号１を基とするＣｖＴＡの突然変異体（Ｌ５９Ａ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ）酵素液を１０ｍｌ（５ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。２９℃に昇温させ、夜通し撹拌しながら反応させた。完全に反応させた後、体系の酸度をｐＨ＝１に調整して、変性タンパク質にした。濾過後、濾液を、５０ｍＬのジクロロメタンで抽出した。水相をｐＨ＝１２に調整してから、５０ｍｌの酢酸エチルを用いて３回抽出した。有機相を合併して無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、有機相を、Ｔ＜４５℃、Ｐ≦－０．０８Ｍｐａ条件下で留分がないまで濃縮した。目標生成物
を得た。
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９６％、ｅｅ値＞９９％、収率：７７％であった。
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（７ｖｏｌ）を７０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を１７ｍｌ加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
【化26】
【化27】
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９６％、ｅｅ値＞９９％、収率：７７％であった。
【0086】
（実施例２４）
室温で５００ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（７ｖｏｌ）を１４０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を５０ｍｌ加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．２ｇ、
（基質７）を２ｇ加え、均一に撹拌してから、配列番号１を基とするＣｖＴＡの突然変異体（Ｌ５９Ａ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ）酵素液を２０ｍｌ（５ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。３２℃に昇温させ、夜通し撹拌しながら反応させた。完全に反応させた後、体系の酸度をｐＨ＝１に調整して、変性タンパク質にした。濾過後、濾液を１００ｍＬのジクロロメタンで抽出した。水相をｐＨ＝１２に調整してから、１００ｍｌの酢酸エチルを用いて３回抽出した。有機相を合併して無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、有機相を、Ｔ＜４５℃、Ｐ≦－０．０８Ｍｐａ条件下で留分がないまで濃縮した。目標生成物
を得た。
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９５％、ｅｅ値＞９９％、収率：８０％であった。
室温で５００ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（７ｖｏｌ）を１４０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を５０ｍｌ加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．２ｇ、
【化28】
【化29】
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９５％、ｅｅ値＞９９％、収率：８０％であった。
【0087】
（実施例２５）
室温で５００ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（１１ｖｏｌ）を２２０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を５０ｍｌ加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．２ｇ、
（基質８）を２ｇ加え、均一に撹拌してから、配列番号１を基とするＣｖＴＡの突然変異体（Ｌ５９Ａ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ）酵素液を４０ｍｌ（１０ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。３２℃に昇温させ、夜通し撹拌しながら反応させた。完全に反応させた後、体系の酸度をｐＨ＝１に調整して、変性タンパク質にした。濾過後、濾液を１００ｍＬのジクロロメタンで抽出した。水相をｐＨ＝１２に調整してから、１００ｍｌの酢酸エチルを用いて３回抽出した。有機相を合併して無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、有機相を、Ｔ＜４５℃、Ｐ≦－０．０８Ｍｐａ条件下で留分がないまで濃縮した。目標生成物
を得た。
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９５％、ｅｅ値＞９９％、収率：８６％であった。
室温で５００ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（１１ｖｏｌ）を２２０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を５０ｍｌ加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．２ｇ、
【化30】
【化31】
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９５％、ｅｅ値＞９９％、収率：８６％であった。
【0088】
（実施例２６）
室温で５００ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（１２ｖｏｌ）を１８０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を３６ｍｌ加え、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１５ｇ、
（基質９）を１．５ｇ加え、均一に撹拌してから、配列番号１を基とするＣｖＴＡの突然変異体（Ｌ５９Ａ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ）酵素液を３０ｍｌ（１ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。３５℃に昇温させ、夜通し撹拌しながら反応させた。完全に反応させた後、体系の酸度をｐＨ＝１に調整して、変性タンパク質にした。濾過後、濾液を１００ｍＬのジクロロメタンで抽出した。水相をｐＨ＝１２に調整してから、１００ｍｌの酢酸エチルを用いて３回抽出した。有機相を合併して無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、有機相を、Ｔ＜４５℃、Ｐ≦－０．０８Ｍｐａ条件下で留分がないまで濃縮した。目標生成物
を得た。
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９６％、ｅｅ値＞９９％、収率：８５％であった。
室温で５００ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（１２ｖｏｌ）を１８０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を３６ｍｌ加え、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１５ｇ、
【化32】
【化33】
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９６％、ｅｅ値＞９９％、収率：８５％であった。
【0089】
（実施例２７）
室温で５００ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（１２ｖｏｌ）を１８０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２６ｍｌ加え、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１５ｇ、
（基質１０）を１．５ｇ加え、均一に撹拌してから、配列番号１を基とするＣｖＴＡの突然変異体（Ｌ５９Ａ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ）酵素液を３０ｍｌ（１０ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。４０℃に昇温させ、夜通し撹拌しながら反応させた。完全に反応させた後、体系の酸度をｐＨ＝１に調整して、変性タンパク質にした。濾過後、濾液を１００ｍＬのジクロロメタンで抽出した。水相をｐＨ＝１２に調整してから、１００ｍｌの酢酸エチルを用いて３回抽出した。有機相を合併して無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、有機相を、Ｔ＜４５℃、Ｐ≦－０．０８Ｍｐａ条件下で留分がないまで濃縮した。目標生成物
を得た。
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９７％、ｅｅ値＞９９％、収率：７９％であった。
室温で５００ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（１２ｖｏｌ）を１８０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２６ｍｌ加え、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１５ｇ、
【化34】
【化35】
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９７％、ｅｅ値＞９９％、収率：７９％であった。
【0090】
（実施例２８）
室温で５００ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（１１ｖｏｌ）を１１０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２３ｍｌ加え、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
（基質１１）を１ｇ加え、均一に撹拌してから、配列番号１を基とするＣｖＴＡの突然変異体（Ｌ５９Ａ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ）酵素液を１０ｍｌ（５ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。４０℃に昇温させて夜通し撹拌しながら反応させた。完全に反応させた後、体系の酸度をｐＨ＝２に調整し、変性タンパク質にした。濾過後、濾液を、５０ｍＬのジクロロメタンで抽出した。水相をｐＨ＝１２に調整してから、５０ｍｌの酢酸エチルを用いて３回抽出した。有機相を合併して無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、有機相を、Ｔ＜４５℃、Ｐ≦－０．０８Ｍｐａ条件下で留分がないまで濃縮した。目標生成物
を得た。
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９５％、収率：７３％であった。
室温で５００ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（１１ｖｏｌ）を１１０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２３ｍｌ加え、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
【化36】
【化37】
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９５％、収率：７３％であった。
【0091】
（実施例２９）
室温で５００ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（１１ｖｏｌ）を１１０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２３ｍｌ加え、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
（基質１２）を１ｇ加え、均一に撹拌してから、配列番号１を基とするＣｖＴＡの突然変異体（Ｌ５９Ａ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ）酵素液を１０ｍｌ（５ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。４０℃に昇温させて夜通し撹拌しながら反応させた。完全に反応させた後、体系の酸度をｐＨ＝２に調整し、変性タンパク質にした。濾過後、濾液を、５０ｍＬのジクロロメタンで抽出した。水相をｐＨ＝１２に調整してから、５０ｍｌの酢酸エチルを用いて３回抽出した。有機相を合併して無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、有機相を、Ｔ＜４５℃、Ｐ≦－０．０８Ｍｐａ条件下で留分がないまで濃縮した。目標生成物
を得た。
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９５％、ｅｅ値＞９９％、収率：６７％であった。
室温で５００ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（１１ｖｏｌ）を１１０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２３ｍｌ加え、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
【化38】
【化39】
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９５％、ｅｅ値＞９９％、収率：６７％であった。
【0092】
（実施例３０）
室温で５００ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（１１ｖｏｌ）を１１０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２３ｍＬ加え、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
（基質４）を１ｇ加え、均一に撹拌してから、配列番号１を基とするＣｖＴＡの突然変異体（Ｌ５９Ａ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ）酵素液を１０ｍＬ（５ｗｔ、０．５ｇ／ｍＬ）加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。４０℃に昇温させ、夜通し撹拌しながら反応させた。完全に反応させた後、体系の酸度をｐＨ＝２に調整し、変性タンパク質にした。濾過後、濾液を、５０ｍＬのジクロロメタンで抽出した。水相をｐＨ＝１２に調整してから、５０ｍｌの酢酸エチルを用いて３回抽出した。有機相を合併して無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、有機相を、Ｔ＜４５℃、Ｐ≦－０．０８Ｍｐａ条件下で留分がないまで濃縮した。目標生成物
を得た。
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９５％、ｄｅ値＞９９％、収率：８０％であった。
室温で５００ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（１１ｖｏｌ）を１１０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２３ｍＬ加え、ｐＨ＝７．５～８．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
【化40】
【化41】
ＨＰＬＣ検出を経て、純度＞９５％、ｄｅ値＞９９％、収率：８０％であった。
【0093】
（実施例３１）
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（５ｖｏｌ）を５０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２０ｍＬ加え、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
（基質１３）を１ｇ加え、均一に撹拌してから、配列番号１を基とするＣｖＴＡのトランスアミナーゼ突然変異体（Ｌ５９Ａ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ）酵素液を１０ｍＬ（０．５ｗｔ、０．５ｇ／ｍＬ）加えて、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。４０℃に昇温させ、夜通し撹拌しながら反応させた。完全に反応させた後、体系の酸度をｐＨ＝２～３に調整して、変性タンパク質にした。濾過後、５０ｍＬのメチルｔ－ブチルエーテルで濾液を抽出した。水相をｐＨ＝１２に調整してから、５０ｍＬのメチルｔ－ブチルエーテルを用いて２回抽出した。有機相を合併して無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、有機相を、Ｔ＜４０℃、Ｐ≦０．０６Ｍｐａ条件で留分がないまで濃縮した。目標生成物
を得た。
ＨＰＬＣ検出を経て、純度９３％、ｅｅ値９８％、収率７３％であった。
室温で２５０ｍＬの四ツ口フラスコ内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（５ｖｏｌ）を５０ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を２０ｍＬ加え、ｐＨ＝８．５～９．０に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．１ｇ、
【化42】
【化43】
ＨＰＬＣ検出を経て、純度９３％、ｅｅ値９８％、収率７３％であった。
【0094】
（実施例３２）
基質１を例とし、反応の酵素量を最適化し、具体的な操作は次のとおりである。
室温で１０ｍＬのバイアル内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（６ｖｏｌ）を１．２ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を０．４ｍｌ加え、ｐＨ＝８．０～８．５に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．００２ｇ、
（基質１）を０．０２ｇ加えて、均一に混合し、ＣｖＴＡの突然変異体（Ｌ５９Ａ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ）酵素液をそれぞれ０．０４ｍＬ、０．０８ｍＬ、０．１２ｍＬ、０．１６ｍＬ、０．２ｍＬ、０．２４ｍＬ、０．２８ｍＬ、０．３２ｍＬ、０．３６ｍＬ、０．４ｍＬ（酵素液の濃度は０．５ｇ／ｍＬであり、対応する質量比はそれぞれ１ｗｔ、２ｗｔ、３ｗｔ、４ｗｔ、５ｗｔ、６ｗｔ、７ｗｔ、８ｗｔ、９ｗｔ、１０ｗｔである。）加え、ｐＨ＝８．０～８．５に調整した。シェーカーの回転速度は１７０ｒｐｍであり、３０℃に昇温させた条件で夜通し反応させた。転化率の結果は下表に示すとおりであり、５ｗｔの基質の転化率は９９％より大きく、酵素量が増大し続けても顕著な効果がないことを証明した。
基質１を例とし、反応の酵素量を最適化し、具体的な操作は次のとおりである。
室温で１０ｍＬのバイアル内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（６ｖｏｌ）を１．２ｍＬ、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を０．４ｍｌ加え、ｐＨ＝８．０～８．５に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．００２ｇ、
【化44】
【表15】
【0095】
（実施例３３）
基質１を例として、反応の基質濃度を最適化した。具体的な操作は次のとおりである。
室温で１０～５０ｍＬのバイアル内（反応体積に応じて適切な振とうフラスコを選択する。）にそれぞれ１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液を０．５ｍＬ加え、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を０．４ｍｌ加え、ｐＨ＝８．０～８．５に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．００２ｇ、
を０．０２ｇ（１ｖｏｌ、０．０２ｍｌ）加えて、均一に混合し、ＣｖＴＡの突然変異体（Ｌ５９Ａ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ）酵素液を０．２ｍｌ（１ｖｏｌ、５ｗｔ、酵素液濃度が０．５ｇ／ｍｌである。）加え、１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸塩緩衝液を反応体積がそれぞれ２ｍＬ、２．２ｍＬ、２．４ｍＬ、３ｍＬ、３．４ｍＬ、４ｍＬになるまで補充し、対応する反応体積は、それぞれ１００ｖｏｌ、１１０ｖｏｌ、１２０ｖｏｌ、１５０ｖｏｌ、１７０ｖｏｌ、２００ｖｏｌであった。ｐＨ＝８．０～８．５に調整した。シェーカーの回転速度が１７０ｒｐｍであり、３０℃に昇温した条件で夜通し反応させた。下表に示すように、５～１０ｇ／Ｌの濃度で、基質の転化率が９９％より大きいことを証明した。基質濃度を下げ続けると反応体積が増加し、廃液・廃ガス・廃棄物が増加した。
基質１を例として、反応の基質濃度を最適化した。具体的な操作は次のとおりである。
室温で１０～５０ｍＬのバイアル内（反応体積に応じて適切な振とうフラスコを選択する。）にそれぞれ１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液を０．５ｍＬ加え、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２ｖｏｌ）を０．４ｍｌ加え、ｐＨ＝８．０～８．５に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．００２ｇ、
【化45】
【表16】
【0096】
（実施例３４）
基質１を例として、反応のアミノ供与体を最適化し、具体的な操作は次のとおりである。
室温で１０ｍＬのバイアル内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（６ｖｏｌ）を１．２ｍＬ加え、３ｖｏｌのアミノ供与体の体系（アミノ供与体は、それぞれイソプロピルアミン、イソプロピルアミン塩酸塩、アラニン、アニリン、ｎ－ブチルアミンである）をそれぞれ用いて、ｐＨ＝８．０～８．５に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．００２ｇ、
を０．０２ｇ加えて、均一に混合し、ＣｖＴＡの突然変異体（Ｌ５９Ａ＋Ｙ８５Ｍ＋Ｎ８６Ｈ＋Ｆ８８Ａ＋Ｆ８９Ｄ）酵素液を０．２ｍｌ（５ｗｔで、酵素液濃度が０．５ｇ／ｍｌである。）加えて、ｐＨ＝８．０～８．５に調整した。シェーカーの回転速度が１７０ｒｐｍであり、２９℃に昇温させた条件で夜通し反応させた。転化率の結果は、下表に示すとおりであり、イソプロピルアミン、イソプロピルアミン塩酸塩、アラニン、ｎ－ブチルアミンをアミノ供与体として、基質の転化率が９９％より大きいことを証明した。アニリンはアミノ供与体として、この反応条件で転化率は、７５％のみである。
基質１を例として、反応のアミノ供与体を最適化し、具体的な操作は次のとおりである。
室温で１０ｍＬのバイアル内に１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（６ｖｏｌ）を１．２ｍＬ加え、３ｖｏｌのアミノ供与体の体系（アミノ供与体は、それぞれイソプロピルアミン、イソプロピルアミン塩酸塩、アラニン、アニリン、ｎ－ブチルアミンである）をそれぞれ用いて、ｐＨ＝８．０～８．５に調整した。続いて、ピリドキサルリン酸（１ｗｔ％）を０．００２ｇ、
【化46】
【表17】
【0097】
以上の記述から分かるように、本発明の上記の実施例では、次のような技術的効果が実現された。
１）異なる由来のトランスアミナーゼを用いて、保存部位の突然変異を行った後のトランスアミナーゼ突然変異体は、複数のケトン類基質の生物転化反応を触媒し、ワンステップ反応で必要な目標化合物を得ることができ、基質タイプが、広く適用可能である。
２）トランスアミナーゼを用いて当該生物転化反応を行うと、選択性が非常に高く、製品のｅｅ値又はｄｅ値が９９％より大きい。
３）前述の異なる由来の突然変異のトランスアミナーゼ変異体を用いて、触媒反応を行い、基質濃度は、１００ｇ／Ｌに達することができ、生産効率が大幅に向上した。
４）トランスアミナーゼを用いて生物触媒を行い、重金属触媒を用いる必要がなく、グリーン化学が実現された。
５）当該トランスアミナーゼの触媒効率が高く、反応体積が少なく、合成経路が短く、製品の収率が高く、廃液・廃ガス・廃棄物を大幅に下げ、生産コストを節約した。
１）異なる由来のトランスアミナーゼを用いて、保存部位の突然変異を行った後のトランスアミナーゼ突然変異体は、複数のケトン類基質の生物転化反応を触媒し、ワンステップ反応で必要な目標化合物を得ることができ、基質タイプが、広く適用可能である。
２）トランスアミナーゼを用いて当該生物転化反応を行うと、選択性が非常に高く、製品のｅｅ値又はｄｅ値が９９％より大きい。
３）前述の異なる由来の突然変異のトランスアミナーゼ変異体を用いて、触媒反応を行い、基質濃度は、１００ｇ／Ｌに達することができ、生産効率が大幅に向上した。
４）トランスアミナーゼを用いて生物触媒を行い、重金属触媒を用いる必要がなく、グリーン化学が実現された。
５）当該トランスアミナーゼの触媒効率が高く、反応体積が少なく、合成経路が短く、製品の収率が高く、廃液・廃ガス・廃棄物を大幅に下げ、生産コストを節約した。
【0098】
以上は、本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明を限定するものではなく、当業者にとって、本発明は様々な修正及び変更が可能である。本発明の精神と原則内で、行われたいかなる修正、等価置換、改善などは、いずれも本発明の保護範囲内に含まれるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【国際調査報告】