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特表2024-506928組織を細胞懸濁液に消化するためのマイクロ流体デバイス
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-15
(54)【発明の名称】組織を細胞懸濁液に消化するためのマイクロ流体デバイス
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20240207BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20240207BHJP
C12M 1/33 20060101ALI20240207BHJP
C12M 1/36 20060101ALI20240207BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20240207BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 A
C12N1/00 K
C12M1/33
C12M1/36
C12N5/071
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023549574
(86)(22)【出願日】2022-02-17
(85)【翻訳文提出日】2023-10-13
(86)【国際出願番号】 US2022016855
(87)【国際公開番号】W WO2022178168
(87)【国際公開日】2022-08-25
(31)【優先権主張番号】17/180,711
(32)【優先日】2021-02-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＭＡＴＬＡＢ
(71)【出願人】
【識別番号】592110646
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
(74)【代理人】
【識別番号】110001302
【氏名又は名称】弁理士法人北青山インターナショナル
(72)【発明者】
【氏名】ハウン，ジェレッド
(72)【発明者】
【氏名】チウ，シャオロン
(72)【発明者】
【氏名】ホイ，エリオット
(72)【発明者】
【氏名】カルナラトネ，アムリス
(72)【発明者】
【氏名】ヴェルナー，エリック
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA15
4B029BB11
4B029DC05
4B029DF05
4B029DG06
4B065AA90X
4B065BD14
4B065CA44
(57)【要約】
組織消化のスピードと効率を向上させるため、試料に流体力学的剪断力を利用するマイクロ流体デバイスが開示される。マイクロ流体チャネルは、長さ１ｃｍ、直径１ｍｍまでの組織標本上の個別の位置に流体力学的剪断力を加えるように設計されており、これにより流体力学的剪断力と酵素・組織間接触の改善を通じて消化を促進する。マイクロ流体消化デバイスは、組織試料をメスでミンチにする必要性をなくすか減らすことができ、試料の処理時間を短縮し、細胞の生存率を維持する。もう一つの利点は、下流のマイクロ流体操作を統合することで、高度な細胞処理と分析が可能になることである。本デバイスは、単一細胞ベースの分析技術を促進するため、また組織工学や再生医療の分野で使用する初代細胞、前駆細胞、幹細胞を単離するために、研究および臨床の場で使用することができる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１ｍｍ～５０ｍｍ３の寸法の組織試料を細胞懸濁液へと処理するためのマイクロ流体システムであって、入口、出口、および組織試料を保持する寸法の試料チャンバが形成された基板またはチップから形成されたマイクロ流体デバイスを含み、前記試料チャンバは、第１の側で、前記入口に流体的に結合された前記基板またはチップに配置された複数の上流のハイドロミンシングマイクロ流体チャネルに流体的に結合され、前記試料チャンバの第２の側で、前記出口に流体的に結合された前記基板またはチップに配置された複数の下流の篩マイクロ流体チャネルに流体的に結合されており、
前記上流のハイドロミンシングマイクロ流体チャネルの幅と前記下流の篩マイクロ流体チャネルの幅の両方が、５０μｍより大きく、前記組織試料の最小寸法より小さいことを特徴とするシステム。
【請求項2】
前記試料チャンバの幅が約０．５ｍｍ～１ｃｍである、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
前記試料チャンバの長さが５０ｃｍ未満であり、前記試料チャンバの高さが５ｃｍ未満である、請求項２に記載のシステム。
【請求項4】
前記試料チャンバの幅が２．０ｍｍ以下であり、前記試料チャンバの長さが２ｃｍ以下であり、前記試料チャンバの高さが２ｍｍ未満である、請求項３に記載のシステム。
【請求項5】
前記試料チャンバは、取り外し可能なプラグによって外部環境に対して閉鎖されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項6】
前記試料チャンバが、前記基板またはチップの一方の側に位置する隔壁を具える、請求項１に記載のシステム。
【請求項7】
前記上流のハイドロミンシングマイクロ流体チャネルが約１００μｍ～約２００μｍの幅を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項8】
前記下流の篩マイクロ流体チャネルが約１０μｍ～約１ｍｍの幅を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項9】
前記下流の篩マイクロ流体チャネルが、約５００μｍ～約１ｍｍの幅を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項10】
前記篩マイクロ流体チャネルの数が、前記上流のハイドロミンシングマイクロ流体チャネルの数と等しい、請求項１に記載のシステム。
【請求項11】
前記入口に消化酵素を含む流体を送り込むように構成されたポンプをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項12】
前記流体は、前記マイクロ流体デバイスから得られた再循環流体を含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項13】
前記出口は接合部に流体接続されており、当該接合部は出口チューブと再循環チューブとに流体接続されており、前記再循環チューブは前記入口に流体接続され、前記組織試料は前記出口チューブを通って導かれ、前記流体は前記再循環チューブを通って導かれる、請求項１２に記載のシステム。
【請求項14】
さらに、前記複数のハイドロミンシングマイクロ流体チャネル内に配置された複数のバルブを含み、前記複数のバルブは、個々のハイドロミンシングマイクロ流体チャネルをオン／オフするように構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項15】
前記マイクロ流体デバイスの出口に結合された二次組織解離デバイスをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項16】
前記試料チャンバにビアで接続された装填ポートをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項17】
前記基板またはチップは、一緒に挟まれた複数の層を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項18】
前記試料チャンバは１つの層に配置され、当該試料チャンバに流体接続される入口チャネルおよび出口チャネルがそれぞれ別の層に配置されている、請求項１７に記載のシステム。
【請求項19】
前記試料チャンバが表面層に配置され、当該試料チャンバをマイクロ流体デバイスの外部環境から密閉するためのキャップまたは蓋をさらに含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項20】
前記マイクロ流体デバイスの第１のインスタンスが、マイクロ流体デバイスの最大２つのさらなるインスタンスに結合可能であり、当該結合は、前記試料チャンバの第３の側、前記試料チャンバの第４の側、またはそれらの組み合わせで生じる、請求項１に記載のシステム。
【請求項21】
入口、出口、および組織試料を保持する寸法の試料チャンバが形成された基板またはチップを具えるマイクロ流体デバイスにおいて組織を処理する方法であって、前記試料チャンバは、一方の側で、前記基板またはチップに配置された複数の上流のハイドロミンシングマイクロ流体チャネルに流体的に結合され、さらに前記入口と流体的に結合され、前記試料チャンバのもう一方の側で、前記基板またはチップに配置された複数の下流の篩マイクロ流体チャネルに流体的に結合され、さらに前記出口と流体的に結合されており、前記方法は、前記試料チャンバに組織を配置するステップと、
前記入口に消化酵素を含む流体を流すステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項22】
さらに、前記出口から出る流体を捕捉し、捕捉した流体を前記入口に再循環させるステップをさらに含む、請求項２１に記載の組織処理方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２１年２月１９日に出願された米国特許出願第１７／１８０，７１１号に対する優先権を主張するものであり、当該米国特許出願は２０１８年８月２８日に出願され現在は米国特許第１０，９２６，２５７号として発行されている米国特許出願第１６／１１５，４３４号の一部継続出願であり、この米国特許出願もまた、２０１７年８月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／５５１，１７２号に対する優先権を主張するものであり、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条、第１２０条およびその他の適用法令に従って優先権が主張される。
本出願は、２０２１年２月１９日に出願された米国特許出願第１７／１８０，７１１号に対する優先権を主張するものであり、当該米国特許出願は２０１８年８月２８日に出願され現在は米国特許第１０，９２６，２５７号として発行されている米国特許出願第１６／１１５，４３４号の一部継続出願であり、この米国特許出願もまた、２０１７年８月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／５５１，１７２号に対する優先権を主張するものであり、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条、第１２０条およびその他の適用法令に従って優先権が主張される。
【0002】
連邦政府の後援に関する声明
研究開発
本発明は、米国科学財団（ＮＳＦ）から授与された助成金第ＩＩＰ－１３６２１６５号の政府支援を受けてなされたものである。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
研究開発
本発明は、米国科学財団（ＮＳＦ）から授与された助成金第ＩＩＰ－１３６２１６５号の政府支援を受けてなされたものである。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【0003】
この技術分野は一般に、組織標本または組織試料を細胞懸濁液に消化させるために使用されるマイクロ流体デバイスに関する。
【背景技術】
【0004】
過去１０年間で、いくつかの生物医学研究分野にわたり、組織から単一細胞を採取することへの関心が急速に高まっている。この背景には、フローサイトメトリ、質量分析、単一細胞シーケンシングなどの単一細胞分析技術を使用して、組織内に通常見られる多様な細胞タイプを同定し、プロファイリングすることが増加していることがある。がんの場合、これによって腫瘍の不均一性、転移可能性、推定がん幹細胞のような希少な細胞型の存在を評価することが可能になった。単一細胞の解像度で得られたこれらの洞察は、がんに対する理解を劇的に変えつつあり、将来的には臨床診断に革命をもたらし、患者の個別化ケアに情報を提供することになる。組織工学の分野では、損傷した臓器（皮膚、肝臓、心臓、膵臓、腎臓など）の代わりとなる新しい構築物を作るために、組織から初代細胞を単離することが重要である。最後に、再生医療の主な目標は、間葉系幹細胞や前駆細胞を組織から単離し、身体の罹患部分を治癒や置換することである。これらのアプリケーションを統合する共通のテーマは、可能な限り元の表現型の状態を代表する生存可能な単一細胞を必要とすることである。従って、迅速かつ穏やかに、そして徹底的な方法で組織から単一細胞を遊離させることを可能にする新しい技術を開発することが極めて重要である。
【0005】
マイクロ流体技術は、細胞試料をマイクロスケールで処理し操作するためのシンプルかつ強力な方法として登場した。しかし、細胞凝集体や組織を扱うために開発されたマイクロ流体デバイスはごくわずかである。Ｌｉｎらに記載されたマイクロ流体細胞解離チップ（μ－ＣＤＣ）は、マイクロピラーアレイを用いて流体下でニューロスフェアを解離するように設計されている（Lin et al., Separation of Heterogenous Neural Cells in Neurospheres using Microfluidic Chip, Anal Chem, 85, 11920-8 (2013)参照）。しかしながら、この装置は直径３００μｍ以下の骨材にしか使用できず、しかも目詰まりの問題があった。Ｗａｌｌｍａｎらには、デバイス断面を横切って配置された鋭利なシリコンナイフエッジを使ってニューロスフェアを機械的に切断するように設計されたバイオグリッド（Ｂｉｏｇｒｉｄ）デバイスが開示されている（Wallman et al., Biogrid - a microfluidic device for large-scale enzyme-free dissociation of stem cell aggregates, Lab Chip, 11(19), pp. 3241-8 (2011)参照）。より効果的ではあるが、この方法の機械的切断は過酷で、単一細胞ではなく、より小さな凝集体しか得られなかった。以前の研究では、分岐チャネルのネットワークを利用して、がん細胞凝集塊を生存可能な単一細胞へと高効率かつ迅速に解離させるマイクロ流体デバイスが開示されている（Qui et al., Microfluidic device for mechanical dissociation of cancer cell aggregates into single cells, Lab on a Chip, 15.1, 339-350 (2015)参照）。しかし、入口が１ｍｍ以上の試料には対応できないため、チップ外で大きな組織試料をミンチし消化する必要があった。ラットの肝生検の培養と酵素消化という一つのマイクロ流体アプリケーションで、フルスケールの組織が採用されているが、このデバイスには多くの限界がある。（Hattersley et al.,Development of microfluidic device for maintenance and interrogation of viable tissue biopsies、Lab Chip、8(11)、pp1842-6(2008)参照）。例えば、このデバイスは組織を酵素とインキュベートする手段を提供するだけであり、長時間消化しても細胞の収率が非常に低いという問題があった。
【発明の概要】
【0006】
一実施形態では、組織試料を細胞懸濁液へと処理するためのマイクロ流体デバイスは、入口、出口、および組織試料を保持する寸法の試料チャンバが中に形成された基板またはチップを含む。この試料チャンバは、片側で、基板またはチップに配置された複数の上流のハイドロミンシングマイクロ流体チャネルに流体的に結合される。これらの上流のハイドロミンシングマイクロ流体チャネルは、噴射プロセスで流体を組織の個別の場所に送り込み、流体力学的剪断力の適用と（流体に含まれる）酵素の浸透の向上により、効果的に組織をミンチする。試料チャンバはさらに、試料チャンバの別の側で、基板またはチップに配置された複数の下流の篩マイクロ流体チャネルに流体的に結合され、さらに出口に流体的に結合される。下流の篩マイクロ流体チャネルは、組織を所定位置にしっかりと固定する篩として機能すると同時に、より小さな凝集体や細胞を試料チャンバから排出する。
【0007】
いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、小さな凝集体から単一細胞をよりよく遊離させるために、二次マイクロ流体解離デバイスなどの下流操作と連結され得る。任意に、バルブを上流のハイドロミンシングマイクロ流体チャネルに組み込むか、またはこれと関連付けて、組織の選択されるか目標とされた範囲または領域に高度の剪断力を与える。これらのバルブのオンオフを切り替えて、チャンバ内の組織の全長をカバーすることができる。さらに、細胞ベースの診断や治療のためのポイントオブケアプラットフォームを構築するために、細胞ソーティングや分析コンポーネントを追加することもできる。
【0008】
別の実施形態では、マイクロ流体デバイスを使用して組織を処理する方法は、組織を試料チャンバ内に配置した後、消化酵素を含む流体を注入口に流すことを含む。マイクロ流体デバイスを用いて処理される組織は、健常組織と疾患組織を含み得る。例えば、特定の実施形態では、デバイスで処理される組織は腫瘍組織を含むが、他の組織タイプも考えられる。また、様々な臓器から採取した組織も治療され得る。例として、肝臓組織、腎臓組織、膵臓組織、脾臓組織、皮膚組織、心臓組織などが含まれる。流体は、ポンプを使用してマイクロ流体デバイスに送り込むことができる。細胞または組織の小さな集合体を、マイクロ流体デバイスの出口から回収することができる。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスから収集された出力は、マイクロ流体デバイスの入力に再循環される。
【0009】
いくつかの実施形態では、組織は、試料ポートを使用して試料チャンバに装填される。いくつかの実施形態では、試料ポートに針を挿入し、組織を試料チャンバ内に出すことによって試料が装填される。他の実施形態では、プラグ、キャップ、または蓋が試料チャンバを覆い、マイクロ流体デバイスに取り外し／固定することができる。
【0010】
１ｍｍ３～５０ｍｍ３の寸法の組織試料を細胞懸濁液へと処理するためのマイクロ流体システムであって、入口、出口、および組織試料を保持する寸法の試料チャンバが形成された基板またはチップから形成されたマイクロ流体デバイスを含み、前記試料チャンバは、第１の側で、前記入口に流体的に結合された前記基板またはチップに配置された複数の上流のハイドロミンシングマイクロ流体チャネルに流体的に結合され、前記試料チャンバの第２の側で、前記出口に流体的に結合された前記基板またはチップに配置された複数の下流の篩マイクロ流体チャネルに流体的に結合されており、前記上流のハイドロミンシングマイクロ流体チャネルの幅と前記下流の篩マイクロ流体チャネルの幅の両方が、５０μｍより大きく、前記組織試料の最小寸法より小さいことを特徴とする。
【0011】
入口、出口、および組織試料を保持する寸法の試料チャンバが形成された基板またはチップに形成されたマイクロ流体デバイスにおいて組織を処理する方法であって、前記試料チャンバは、一方の側で、前記基板またはチップに配置された複数の上流のハイドロミンシングマイクロ流体チャネルに流体的に結合され、さらに前記入口と流体的に結合され、前記試料チャンバのもう一方の側で、前記基板またはチップに配置された複数の下流の篩マイクロ流体チャネルに流体的に結合され、さらに前記出口と流体的に結合されていることを特徴とする。この方法には、組織を前記試料チャンバ内に配置し、消化酵素を含む流体を前記入口に流すことが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
本発明の特徴および利点は、添付図面に関連して提示される以下の詳細な説明を考慮することにより明らかになるであろう。
【図3】図３は、組織試料を装填するためのチャンバと、ハイドロミンシングのための上流（左）と下流（右）の篩（篩ゲート）を含む流体「ミンシング」チャネルとを含む、レーザエッチングされたアクリルシートの写真画像である。
【図4】図４は、２枚のアクリルシートまたは他の硬質プラスチックシートの間に挟まれたポリマーまたは弾性ガスケット層を含む、一実施形態によるマイクロ流体デバイスの分解図である。ホースバーブが最上層に描かれ、ナイロンスクリュを用いてデバイスが固定されている。
【図6】図６は、組織の処理および消化のためのマイクロ流体デバイスを使用した消化実験に使用される実験セットアップを概略的に示す図である。流れは蠕動ポンプで駆動され、組織の消化がデバイス上部に取り付けられたカメラで視覚的にモニタされた。
【図7】図７は、異なる数（３、５、７）のハイドロミンシングマイクロ流体チャネルを有するデバイスにおける流速プロファイルを示す有限要素流体力学シミュレーションを示す。シミュレーション結果は、チャンバが空の状態で、モデル組織で部分的にブロックされた状態で、流速１ｍＬ／分で示されている。ハイドロミンチチャネルが少ないと、組織を剪断する流体ジェットが強く発生するが、全体的なカバー範囲は狭くなる。
【図13C】図１３Ｃは、時間の関数としての組織損失を示すグラフである。組織損失は、平均のグレー値と組織全体の面積に基づいて画像から定量化されている。傾向は各設計で類似していたが、変動は３つのハイドロミンシングマイクロ流体チャネルで最も小さくなった。
【図13D】図１３Ｄは、３０分動作後のデバイス流出物の顕微鏡写真画像である。上部はハイドロミンシングマイクロ流体チャネル７本である。中央はハイドロミンシングマイクロ流体チャネル５本である。下はハイドロミンシングマイクロ流体チャネル３本である。スケールバーは１００μｍである。エラーバーは少なくとも３回の独立した実験による標準誤差を表す。
【図14】図１４は、組織消化のモニタリングに使用される画像処理アルゴリズムを示す。画像は組織のサイズと密度について分析され、デバイス内での消化中の変化を定量化した。まず、生の画像を２値画像（上矢印）とグレースケール画像（下矢印）に個別に変換し、それぞれの輪郭を描き、平均グレー値を定量化した。次に、組織の輪郭内の面積を計算し、平均グレー値を乗じて、組織のサイズと密度を考慮した単一の指標を得た。
【図15D】図１５Ｄは、ＣｙＱＵＡＮＴ（商標）アッセイを用いて、合計１５分、３０分、６０分の、消化のみ、メスによるミンチと消化、またはデバイス処理によって得られた細胞懸濁液を直接定量化した結果を示すグラフである。ＣｙＱＵＡＮＴ（商標）の信号は処理時間とともに増加し、腎臓試料では全体的に高くなった。デバイス処理した試料からの信号は、本文の図３に示したｇＤＮＡおよび細胞計数の結果と同様に、ミンチしたコントロールよりも一貫して高い値である。エラーバーは少なくとも３回の独立した実験による標準誤差を表す。＊は、同じ消化時間におけるミンチしたコントロールと比較してｐ＜０．０５を示す。
【図16A】図１６Ａは、合計１５分、３０分、６０分の、消化のみ、メスによるミンチと消化、またはデバイス処理によって得られた腎臓と肝臓の組織細胞懸濁液から抽出・定量化されたゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の量を示すグラフである。グラフに見られるように、ｇＤＮＡは処理時間とともに増加し、全体的に腎臓試料の方が高い値を示した。デバイス処理では、同じ時点で一貫して、ミンチしたコントロールよりも多くのｇＤＮＡが得られた。ほとんどの場合、ｇＤＮＡも次の消化時点より高い値を示したが、その差は有意ではなかった。
【図16B】図１６Ｂは、細胞カウンタの結果を示すグラフで、単一細胞の数はｇＤＮＡの所見とほぼ一致するが、ばらつきが大きいことを示している。また、肝臓の値も腎臓と同程度になったことから、腎臓懸濁液にはより多くの凝集体が含まれていた可能性が示唆された。エラーバーは少なくとも３回の独立した実験による標準誤差を表す。＊は、同じ消化時間におけるミンチしたコントロールと比較してｐ＜０．０５を示す。
【図17】図１７は、消化されたマウスの肝臓および腎臓の試料から得られた細胞懸濁液のＦＡＣＳゲーティングデータを示す。消化されたマウスの肝臓および腎臓試料から得た細胞懸濁液を、表１に示す４つのプローブパネルで染色し、フローサイトメトリで解析した。コントロールは、アイソタイプが一致した（ＩｇＧ２ｂ）ＰＥ標識抗体のみで処理された。取得したデータはシーケンシャルゲーティングスキームで評価された。まず、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａゲート（ゲート１）を使用して、原点付近のデブリを除外した。ゲート２はＦＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ｈに基づき、単一細胞の選択に使用した。ゲート３は、ＦＬ２－Ａ対ＳＳＣ－ＨプロットにおけるＣＤ４５－ＰＥシグナルに基づいてＣＤ４５＋白血球を識別した。ＣＤ４５－細胞サブセットはさらに、ＦＬ４－Ａ対ＳＳＣ－ＨプロットにおけるＤｒａｑ５核染色からのシグナルに基づいて、無核赤血球サブセットと有核組織細胞サブセットに分けられた。目的の有核組織細胞の細胞性を、ＦＬＩ－Ａ対ＦＳＣ－Ｈプロットにおける細胞膜色素ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎのシグナルに基づいて検証した。最後に、ＦＬ３－Ａ対ＳＳＣ－Ｈプロットにおける７ＡＡＤシグナルに基づいて、組織細胞の生死を識別した。すべてのゲートは、６０分間消化されたミンチコントロールを使用して確立された。死細胞に対する適切な７ＡＡＤシグナルを確認するため、熱処理細胞をポジティブコントロールとして使用した。
【図18A】図１８Ａは、マウスの腎臓懸濁液のフローサイトメトリ結果を示す。フローサイトメトリを用いて、ミンチしたコントロールまたはデバイス処理で得られた懸濁液中の白血球、赤血球、単一組織細胞の数を同定し定量化した。各細胞タイプの相対数を表示している。赤血球はほぼすべての集団で最も高い割合を占め、すべてのミンチしたコントロールおよびデバイスの条件において集団組成に統計的に有意な変化はなかった。
【図18B】図１８Ｂは、マウスの肝臓懸濁液のフローサイトメトリ結果を示す。フローサイトメトリを用いて、ミンチしたコントロールまたはデバイス処理で得られた懸濁液中の白血球、赤血球、単一組織細胞の数を同定し定量化した。各細胞タイプの相対数を表示している。赤血球はほぼすべての集団で最も高い割合を占め、すべてのミンチしたコントロールおよびデバイスの条件において集団組成に統計的に有意な変化はなかった。
【図18D】図１８Ｄは、肝臓試料の組織１ｍｇあたりの全組織細胞数と生組織細胞数のグラフである。図１８Ｃと図１８Ｄの両方において、組織細胞の回収は、ミンチしたコントロールの消化時間とともに増加したが、１０分を超えるデバイス処理では有意な変化は見られなかった。しかし重要なことは、どのデバイス条件でも、最大３０分消化したミンチコントロールより多くの細胞が得られたことである。生存率は、最長時点を除いてすべて＞８０％のままであり、最長時点では７０％まで低下した。図１８Ａおよび図１８ＢのＸ軸は、図１８Ｃおよび図１８Ｄと同じである。エラーバーは少なくとも３回の独立した実験による標準誤差を表す。＊は、同じ消化時間におけるミンチしたコントロールと比較したｐ＜０．０５を示す。＃は、１５分間消化したミンチコントロールと比較したｐ＜０．０５を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
図１は、一実施形態による組織の処理および消化のためのマイクロ流体デバイス１０を示す図である。特定の実施形態では、マイクロ流体デバイス１０は、哺乳類の対象（例えば、ヒト）から得られた組織を処理するように設計されている。特に、マイクロ流体デバイス１０は、腫瘍組織の処理および消化に特に適用可能であるが、他の組織タイプもこのマイクロ流体デバイス１０を使用して処理することができる。マイクロ流体デバイス１０は基板またはチップ構造１２に形成され、これは本明細書で説明するように、マイクロ流体デバイス１０を形成するために一緒に組み立てられる複数の層を用いて形成され得る。マイクロ流体デバイス１０には、基板またはチップ構造１２に画定または形成された３つの主な特徴を有する。これには試料チャンバ１４が含まれ、これはタンパク質分解酵素や他の消化剤を含む液体を試料チャンバ１４内や試料１６の表面に通過させつつ、試料１６を所定の位置に保持する。このように試料チャンバ１４は、試料１６を基板またはチップ構造１２内の概ね固定された位置に保持する。試料１６を試料チャンバ１４内に保持することで、試料の混合を促進し、酵素活性を高め、以下に説明するように、流体力学的剪断力を適用して、大きな試料１６から細胞や凝集体を機械的に取り除く。
【0014】
いくつかの実施形態において、本発明は、試料１６を細胞懸濁液へと処理するためのシステムを特徴とする。本システムは、１ｍｍ３～５０ｍｍ３の大きさを有する組織試料１６を含むことができる。システムはさらにマイクロ流体デバイス１０を含み得る。マイクロ流体デバイス１０は、基板またはチップ１２として形成される。基板またはチップ１２は、入口２２、出口２８、およびその中に形成された組織試料１６を保持する寸法の試料チャンバ１４を有し得る。試料チャンバ１４は、第１の側で、基板またはチップ１２に配置された複数の上流のハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８に流体的に結合され得る。上流のハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８は、さらに入口２２に流体的に結合され得る。試料チャンバ１４はさらに、第２の側で、基板またはチップ１２に配置された複数の下流の篩マイクロ流体チャネル２４に結合され得る。下流の篩マイクロ流体チャネル２４は、さらに出口２８に流体連通され得る。いくつかの実施形態では、上流のハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８の幅および下流篩マイクロ流体チャンネル２４の幅は、５０μｍより大きくてもよい。いくつかの実施形態では、上流のハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８の幅および下流の篩マイクロ流体チャネル２４の幅は、組織試料１６の最小寸法よりも小さくてもよい。いくつかの実施形態では、試料チャンバ１４の幅は、約０．５ｍｍ～１ｃｍであり得る。いくつかの実施形態では、試料チャンバ１４の長さは５０ｃｍ未満であり、試料チャンバ１４の高さは５ｃｍ未満であり得る。いくつかの実施形態では、上流のハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８の数は、下流の篩マイクロ流体チャネル２４の数と等しくてもよい（図２０参照）。上流のハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８および下流の篩マイクロ流体チャネル２４の数と、試料チャンバ１４の幅とは、処理される組織試料１６のサイズに依存し得る。幅の小さい組織試料１６は、幅の大きい組織試料１６よりも効果的に処理され得る。
【0015】
いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイス１０の最初のインスタンスは、マイクロ流体デバイス１０の最大２つの追加のインスタンスに結合され得る。結合は、マイクロ流体デバイス１０の第１のインスタンスに結合されるマイクロ流体デバイス１０のインスタンスの数に応じて、試料チャンバ１４の第３の側（例えば、一側面）、試料チャンバ１４の第４の側（例えば、他方の側面）、またはそれらの組み合わせで生じ得る。図２１Ａおよび１２Ｂに見られるように、これらの異なるインスタンスは同じ基板またはチップ１２に含まれていてもよい。図２１Ａ～２１Ｂは、上記マイクロ流体デバイス１０の並列結合の実施形態を示す図である。これにより、デバイスを長くしたり大きくしたりする必要なく、より大きな試料サイズを処理するために、無限数のマイクロ流体デバイス１０を互いに並列に連結することができる。結合されたマイクロ流体デバイス１０を通る流体の流量は、互いに結合されたマイクロ流体デバイス１０のインスタンス数に応じて比例して増加し得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの各インスタンスの試料チャンバ１４に、異なるタイプの組織試料１６が配置される。本発明によって処理される組織試料１６の種類は、腎臓組織、肝臓組織、心臓組織、肺組織、乳房腫瘍組織、脾臓組織、および膵臓組織からなる群から選択され得る。
【0016】
マイクロ流体デバイス１０は、一実施形態では、メスによるミンチのような手作業の処理工程を必要とせずに、コアニードル生検から得られた試料を直接細胞懸濁液へと処理するように設計されている。しかしながら、他の実施形態では、マイクロ流体デバイス１０は、試料が何らかの機械的処理（例えば、メスによるミンチ）を受けた後に、より大きな組織試料を処理するようにする。試料チャンバ１４の大きさは、試料１６の大きさによって異なり得る。典型的には、試料チャンバ１４の幅は約０．５ｍｍ～約１０ｍｍであり、試料チャンバ１４の長さは２ｃｍ未満であり、試料チャンバ１４の高さは１ｃｍ未満である。例えば、図１を参照すると、一実施形態では、試料チャンバ１４の幅は２ｍｍ以下、試料チャンバ１４の長さは２ｃｍ未満、試料チャンバ１４の高さは２ｍｍ未満である（高さ寸法はページの平面に垂直）。流体は試料チャンバ１４の幅に沿って矢印Ａの方向に流れる。別の実施形態では、試料チャンバ１４の幅は約１．５ｍｍ以下、試料チャンバ１４の長さは約１ｃｍ以下であり（例えば、Ｔｒｕ－Ｃｕｔ（商標）コア生検針の大きさであり、長さ約１ｃｍ×直径約１ｍｍの組織）、チャンバの高さは２ｍｍ未満である（例えば、約１ｍｍ）。さらに別の実施形態では、試料チャンバ１４はもっと小さく、例えば、最長寸法が１ｍｍ程度の試料１６を収容してもよい。例えば、試料１６が何らかの機械的処理（例えば、ミンチ化）を受けた場合、試料チャンバ１４のサイズはかなり小さくてもよい。試料チャンバ１４の高さは様々であるが、典型的には１ｃｍ未満、より典型的には２ｍｍ未満である（例えば、本明細書に記載のように１ｍｍの高さを使用し得る）。いくつかの実施形態では、試料チャンバ１４は、Ｔｒｕ－Ｃｕｔ（商標）コア生検針などの組織生検装置から直接採取した試料１６を受け入れる寸法になっている。
【0017】
マイクロ流体デバイス１０の第２の特徴は、試料チャンバ１４の上流側に配置され、試料チャンバ１４に保持された試料１６に向けられる高速ジェットに流体を集中させる複数のハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８を含む。図１に見られるように、ハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８は、入口２２から流体を受け取る入口チャネル２０と流体的に結合している。したがって、流体はマイクロ流体デバイス１０内を矢印Ａの方向に移動する。ハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８は、流体ジェットを発生させ、これが試料１６の個別の位置に流体力学的剪断力を集中させ、試料１６を機械的に破壊し、試料１６（すなわち組織）の深部にタンパク質分解酵素を送達する。これは、メスを使って手作業で組織をミンチすることに似ており、したがってハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８と呼ばれる。ハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８の幅は様々であるが、一般的に約５０μｍ～約１ｍｍである。例えば、ハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８の幅は典型的に約１００μｍ～約２００μｍであり得るが、この特定範囲外の他の寸法が使用されてもよい。
【0018】
最後に、複数の下流の篩マイクロ流体チャネル２４が試料チャンバ１４の下流に配置され、さらなる消化のために大きな組織片や細胞凝集塊を選択的に保持する篩として機能する。下流の篩マイクロ流体チャネル２４は、大きなサイズの組織部分や細胞凝集塊を保持し、それらがさらに下流に流れるのを防ぐ篩ゲートを形成する。しかし、小さな凝集体や単一細胞は、収集のため、あるいは更なるマイクロ流体処理のために、デバイス１０の外へ排出され得る。例えば、装置１０を出た細胞は、細胞ベースの診断や治療のためのポイントオブケアプラットフォームを構築するために、下流の細胞選別および／または分析に供されてもよい。
【0019】
一実施形態では、下流の篩マイクロ流体チャネル２４は（ハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８とともに）試料チャンバ１４の側部または端部に沿って等間隔に配置され、試料１６を試料チャンバ１４内の所定の位置にしっかりと固定し、背圧を最小限に抑える。下流の篩マイクロ流体チャネル２４の幅は様々であるが、約１０μｍ～１ｍｍであり得る。より典型的には、下流の篩マイクロ流体チャネル２４の幅は約１００μｍ～約１ｍｍである。例えば、いくつかの実施形態では、５００μｍ～１ｍｍの幅が有用である。本書記載の実験では、下流の篩マイクロ流体チャネル２４の流路幅を５００μｍとし、試料チャンバ１６の幅にわたって７本のチャネルを快適に配置できるようにした。複数の下流の篩マイクロ流体チャネル２４は、流体がマイクロ流体デバイス１０から出される出口２８まで延びる共通の出口チャネル２６につながっている。
【0020】
いくつかの実施形態では、下流の篩マイクロ流体チャネル２４の幅は、ハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８の幅よりも大きくあり得る。他の実施形態では、下流の篩マイクロ流体チャネル２４の幅は、ハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８の幅よりも小さくあり得る。さらに別の実施形態では、下流の篩マイクロ流体チャネル２４の幅は、ハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８の幅と実質的に同じであり得る。
【0021】
５００μｍは、メスによるミンチで通常得られる組織片の大きさ（～１ｍｍ）に相当する。このサイズの凝集体は、米国特許第９，５８０，６７８号に開示されているような下流の分岐チャネルアレイ単離デバイスに直接投入するのにも理想的である。図２は、そのように、第１のデバイス（すなわち、デバイス＃１：マイクロ流体デバイス１０）からの出力が、さらなる組織単離のために第２の下流デバイス１００（デバイス＃２）に入力される実施形態の１つを示す。
【0022】
例えば、一実施形態では、マイクロ流体デバイス１０は、’６７８特許に示されるような別の組織単離デバイス１００に結合される。そのデバイス１００では、寸法が減少し、一連の膨張領域と収縮領域を有する一連のマイクロ流体チャネルステージ（図２に図示）を用いて、細胞クラスタや凝集体に剪断力を与えて組織を解離する。マイクロ流体デバイス１０は、図２に示すようなデバイス１００に結合することができる。この実施形態では、第１のマイクロ流体デバイス１０の出力は、さらなる組織解離に使用される第２のマイクロ流体デバイス１００の入力に結合することができる。バルブ３０を２つのデバイス（１０、１００）の間に配置し、第２の組織解離デバイス１００を通る選択的な流れを実現することができる。さらに、マイクロ流体デバイス１０、１００の一方または両方の間で流れを再循環させるために使用されるポンプ３２が図示されている。しかしながら、図示のように流れを再循環させるのではなく、流れは再循環されずに直接デバイスを通過してもよいことを理解されたい。
【0023】
いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイス１０の出口２８は、接合部に流体的に接続され得る。この接合部は、出口チューブ３１と再循環チューブ３３の両方に流体接続されてもよい。出口チューブ３１は、組織試料１６がポンプ３２によって出口チューブ３１を通って収集チャンバに導かれるように構成され得る。再循環チューブ３３は、マイクロ流体デバイス１０の入口２２に流体的に接続され、マイクロ流体デバイス１０を通って導かれた消化酵素液がポンプ３２によって再循環チューブ３３を通って入口２２に導かれるように構成され得る。いくつかの実施形態では、再循環チューブ３３はさらに、マイクロ流体デバイス１０に導入される追加の消化酵素を供給するための消化酵素源に流体連通され得る（図２２参照）。このプロセスは、組織試料１６をさらに処理するために使用される。
【0024】
複数のハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８の目標は、効率的なハイドロミンシングを達成することである。チャネル数を少なくすれば、より強力な流体ジェットが発生されるが、組織断面をカバーする範囲が狭くなり、デバイスの背圧が高くなる。これらは競合する要素であるため、チャネル数をテスト変数として用いた実験が行われ、３本、５本、７本のハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８を持つデバイスが作成された。図３は、硬質アクリル板に形成されたマイクロ流体デバイス１０の写真であり、３本のハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８と７本の下流の篩マイクロ流体チャネル２４が示されている。代替的に、マイクロ流体デバイス１０の材料には、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）が含まれる。図４は、一実施形態によるマイクロ流体デバイス１０の多層構造を示す。この実施形態では、マイクロ流体デバイス１０は、入口２２および出口２８に流体的に結合されるバーブ端部またはチューブ接続部３４（例えば、ホースバーブ）を含むＰＥＴから形成された上部基板層１２ａを具える。マイクロ流体デバイス１０は、その中にマイクロ流体機能が形成された下部基板１２ｂをさらに含む。これには、図１の入口２２、入口チャネル２０、試料チャンバ１４、下流側篩マイクロ流体チャネル２４、出口チャネル２６、出口２８が含まれる。この特定の実施形態では、（流体アクセス用の）穴またはビア３５を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）ガスケット１２ｃが、集合的に基板／チップ１２を形成する上部基板１２ａと下部基板１２ｂの間に挟まれている。ガスケット１２ｃには他の弾性体やポリマーを使用してもよい。この特定の実施形態では、図５に見られるように、複数の基板１２ａ、１２ｂ、１２ｃを単一構造に固定するためにファスナ３６（例えば、ネジ）を使用している。
【0025】
チャネルサイズについては、幅が小さいほど、より強力で集中した流体ジェットが発生する。そのため、マイクロ流体デバイス１０で行った実験では、ハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８の幅２００μｍが選択され、これはレーザベースの製造方法で確実に達成できる最小の後続的解像度であった。しかし、上流のハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８と下流の篩マイクロ流体チャネル２４には、他の寸法を使用してもよいことを理解されたい。
【0026】
デバイス１０は、レーザを用いて、試料チャンバ１４と、ハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８、下流の篩マイクロ流体チャネル２４、入口チャネル２０、入口２２、出口チャネル２６、および出口２８のチャネル構造とを硬質アクリル板にエッチングし、上記のように第１の基板１２ａに作製した。レーザ出力とラスタースピードは、深さ約１ｍｍになるように制御され、チャネルの高さが確立された。第２の基板１２ｂとしてアクリルの第２の層が使用され、入口と出口チューブを接続するためにタップ加工され、ホースバーブ３４が取り付けられた。最後に、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなるガスケット層１２ｃをアクリル層１２ａ、１２ｂの間に挟んで水密シールを形成した。ＰＤＭＳの変形可能な性質、そしておそらく組織自体が、組織が最初に流路を塞いでいる間でも、流体の流れと背圧の問題を軽減するはずであることに留意されたい。最後に、図５にあるように、組み立てたデバイスサンドイッチ１０を６本のナイロンネジ３６で固定した。実験セットアップを図６に示す。最初の実験では、タンパク質分解酵素溶液を節約するために、蠕動ポンプ３２を使用してデバイス内の液体を再循環させた。もちろん、別の実施形態では、流れは連続的でもよいし、デバイス内で再循環する前に細胞を除去してもよい。実験装置では、マイクロ流体デバイス１０の上方にカメラ３８を取り付け、組織消化の進行がモニタされた。
【0027】
流体力学シミュレーションの計算は、ＣＯＭＳＯＬ Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓソフトウェアを使用して、１ｍＬ／分の流量で、３本、５本、および７本のハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８それぞれについて実施された（図７）。これらのシミュレーションは、試料チャンバ１４内に流れを妨げるモデル組織を入れた場合と入れない場合で実施した。予想通り、３本のハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８を持つ設計が、最も高い流体速度、すなわち最も強い流体の「カット」を生じた。ハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８の数を増やすと、「カット」が弱くなり、組織全体によく分散した。
【0028】
図８Ａ、８Ｂ、９Ａ、および９Ｂは、試料チャンバ１６へ組織または他の試料の装填を補助する機能を有するマイクロ流体デバイス１０の２つの代替実施形態を示す。マイクロ流体デバイス１０は、複数の層１２ａ、１２ｂ、１２ｃを含み、これらは隣接する層間の界面に適用された接着剤またはグルーの助けを借りて加圧積層されてマイクロ流体デバイス１０を形成し得る。あるいは、層１２ａ、１２ｂ、１２ｃは、図４の実施形態で使用されるようなファスナを用いて一緒に固定されてもよい。図８Ａおよび８Ｂの実施形態では、マイクロ流体デバイス１０の最上層１２ａに開口窓４０が設けられており、鉗子を用いて試料１６を装填することができる。その後、シリコンゴム材などで形成されたプラグ４２を窓の中に入れ、粘着テープや接着剤で固定する。中間層１２ｃは、試料１６を第１基板１２ａに形成された試料チャンバ１４に装填できるように、穴またはビア４４が形成されている。
【0029】
図９Ａおよび９Ｂの実施形態では、マイクロ流体デバイス１０は、試料チャンバ１４に試料１６を装填するために使用できる、マイクロ流体デバイス１０の側面に位置する試料ポート４６を有する。この設計では、図９Ｂに見られるように、シリコンゴムの隔壁４８を針５０で貫通することで、マイクロ流体デバイス１０の側面からのアクセスが可能になる。一実施形態では、針５０は、コア針やパンチ生検など、試料１６（例えば組織）を採取するのに使用したものと同じものである。隔壁４８を貫通した後、針５０は試料１６を試料チャンバ１４内に配置し、その場に留まり（隔壁４８を貫通した状態で）マイクロ流体デバイス１０を密封する。代替の実施形態では、隔壁４８は、マイクロ流体デバイス１０の外部に流体または他の内容物を漏らすことなく、針５０をマイクロ流体デバイス１０から取り外すことができるような自己封止型隔壁４８であってもよい。
【0030】
図１０は、ハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８の１以上が、個々のバルブ５４によって選択的にオンオフできるマイクロ流体デバイス１０の１つの代替実施形態を示す。流体の流れ方向を、図１０の矢印Ａで示す。これに関し、少数のハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８を順次使用することで、試料１６の広い範囲をミンチするオプションが提供される。例えば、ハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８の１つまたはいくつかを特定の時間に開いて、試料１６に高い噴流または剪断力を与えることができる。その後、バルブ５４を閉じ、試料１６の異なる領域に向けられた別のバルブ５４またはバルブ５４のセットをオンにすることができる。バルブ５４は、当該技術分野で知られているマイクロ流体バルブ５４を含み得る。例えば、チャネル内の流れを作動させるために変形可能な膜を使用するマイクロ流体バルブ５４が知られており、一例として使用することができる。このプロセスは、試料１６全体をミンチにするために、任意数のサイクルで続けることができる。
【0031】
図１１は、マイクロ流体デバイス１０の別の実施形態を示す。このマイクロ流体デバイス１０は、本明細書に記載されるように、硬質アクリルまたはＰＥＴを使用した多層構造から形成されている。この実施形態では、マイクロ流体デバイス１０は複数の層６０ａ、６０ｂ、６０ｃ、６０ｄ、６０ｅ、６０ｆから形成されている。層６０ａ、６０ｂ、６０ｃ、６０ｄ、６０ｅ、６０ｆは、隣接する層間の界面に適用された接着剤またはグルー（例えば、シリコーン系またはアクリル系の接着剤または粘着剤）の助けを借りて加圧積層されてマイクロ流体デバイス１０を形成する。層６０ａはベース層または最下層として機能する。層６０ｂには、入口チャネル２０、出口チャネル２６、ハイドロミンシングマイクロ流体チャネル１８、下流の篩マイクロ流体チャネル２４が形成されている。層６０ｃには、層６０ｂの入口チャネル２０と出口チャネル２６に連通するビア６２と、入口２２と出口２８にアクセスする開口または孔６４が形成されている。層６０ｄには、層６０ｃのビア６２と連通する試料チャンバ１４が形成されている。層６０ｄはさらに開口または穴６４を含む。層６０ｅは、開口または穴６４に加えて、試料チャンバ１４にアクセスするためのビア６６を含む。このビア６６の直径は、機械的に処理された（例えば、ミンチされた）試料１６を収容できる大きさである１ｍｍ程度であり得る。層６０ｆは最上層であり、マイクロ流体デバイス１０へ出入りする流体アクセスを提供するバーブ端３４を含む。さらに層６０ｆは、ビア６６および試料チャンバ１４と連通する装填ポート６８を含む。流体や組織／細胞がマイクロ流体デバイス１０内に留まるように、装填後にキャップ（図示せず）を装填ポート６８に被せてもよい。
【0032】
装填ポート６８は、装填のために注射器などとインターフェースするルアー端として構成され得る。この実施形態では、マイクロ流体デバイスに流体を流す前に、ミンチ化した試料１６（例えば、ミンチ化した組織）を装填ポート６８に装填する。この実施形態の１つの代替例では、出口チャネル２６と連通する下流の篩マイクロ流体チャネル２４は、デバイス１０の下流に試料１６の大きな断片の通過を制限するフィルタリング機能を含んでもよい。フィルタリングは、ビア６２によっても提供され得る。
【0033】
図１２は、マイクロ流体デバイス１０の別の実施形態を示す。このマイクロ流体デバイス１０は、本明細書に記載されるように、硬質アクリルまたはＰＥＴを使用した多層構造から形成されている。この実施形態では、マイクロ流体デバイス１０は複数の層７０ａ、７０ｂ、７０ｃ、７０ｄから形成され、本明細書で説明するように、試料１６がマイクロ流体デバイス１０に装填された後にデバイスを閉じるために使用されるキャップまたは蓋７２を含む。層７０ａ、７０ｂ、７０ｃ、７０ｄは、隣接する層間の界面に適用された接着剤またはグルーの助けを借りて加圧積層され、マイクロ流体デバイス１０を形成する。層７０ａはベースまたはボトム層として機能する。層７０ｂには、入口チャネル２０と出口チャネル２６が形成されている。層７０ｃには、層７０ｂの入口チャネル２０および出口チャネル２６と連通するビア７４と、入口２２および出口２８にアクセスするための開口または穴７６が形成されている。層７０ｄには、層７０ｃのビア７４と連通する試料チャンバ１４が形成されている。層７０ｄはまた、図４、図５、図８Ａ、図８Ｂ、図９Ａ、図９Ｂ、および図１１に示すような有刺端部３４（図１２には図示せず）を収容できる開口または穴７８を含む。
【0034】
この実施形態では、試料１６を試料チャンバ１４に直接装填することができる。試料チャンバ１４に試料１６を装填した後、キャップまたは蓋７２を試料チャンバ１４の上層７０ｄに取り付け、試料チャンバ１４をマイクロ流体デバイス１０の外部環境から密閉する。キャップまたは蓋７２は、接着剤などを使用して層７０ｄに固定されてもよい。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイス１０を複数回使用できるように、キャップ等７２は取り外し可能であってもよい。しかし、他の実施形態では、キャップまたは蓋７２は恒久的な方法で層７０ｄに固定される。接着剤またはグルーの代替として、キャップまたは蓋７２は、クランプ、ネジ、バンド、クリップなどの１つまたは複数の留め具（図示せず）を使用して層７０ｄに固定されてもよい。
【0035】
牛肝臓組織を用いたデバイスの初期最適化
図１に示すようなマイクロ流体消化デバイスの性能を、まず試料組織として牛の肝臓を用いて評価した。Ｔｒｕ－Ｃｕｔ（商標）生検針を使用してモデル組織コアを抽出し、試料チャンバ１４に装填した（図１３Ａ）。その後、コラゲナーゼを含むＰＢＳ緩衝液でデバイスをプライミングし、密封し、蠕動ポンプで達成可能な最高流速である２０ｍＬ／分でフローを開始した。消化をモニタするために、図６に示すように、デバイス上部に取り付けられたカメラ３８を用いて組織標本の画像を５分ごとに取得し、実験を合計３０分間行った（図１３Ｂ）。各画像を取得した後、フローを短時間反転させ、篩マイクロ流体チャネルに滲んだ（ｓｅｅｐｅｄ）組織を除去した。組織の滲みは、３本のハイドロミンチチャネルを使った場合に最も広範囲に及び、これは生成される流体力学的な力が大きいことを反映している。ＩｍａｇｅＪとＭＡＴＬＡＢを用いて画像を処理し、組織面積と画素密度に基づき、各時点でデバイス内に残存する肝組織の量を評価した（図１４参照）。消化プロファイルを、初期組織質量で正規化した後、図１３Ｃにプロットした。結果は３つのデバイスでほぼ同様で、最初の５分間で４０％の劇的な組織減少がみられ、その後５分間ごとに１０％ずつ緩やかに組織が減少した。初期の低下は主に画素密度の低下と相関しており、これは組織の脱落や赤血球の洗い流しを反映している可能性がある。その後の緩やかな段階は、主に組織量の減少を反映している。３０分後、３つのデバイス設計すべてから組織の約８０％が除去された。しかし、３本のハイドロミンシングマイクロ流体チャネルを備えたデバイスは、実験間のばらつき、特に後の時点におけるばらつきが少ないという点で最も一貫した結果を出したため、さらなる評価のために選択された。図１３Ｄは、３０分間のデバイス処理後に収集されたデバイス流出液の代表的な顕微鏡写真を示す。すべてのケースにおいて、試料流出液は主に大きな組織凝集塊、組織細胞、赤血球の混合物から構成されていた。
図１に示すようなマイクロ流体消化デバイスの性能を、まず試料組織として牛の肝臓を用いて評価した。Ｔｒｕ－Ｃｕｔ（商標）生検針を使用してモデル組織コアを抽出し、試料チャンバ１４に装填した（図１３Ａ）。その後、コラゲナーゼを含むＰＢＳ緩衝液でデバイスをプライミングし、密封し、蠕動ポンプで達成可能な最高流速である２０ｍＬ／分でフローを開始した。消化をモニタするために、図６に示すように、デバイス上部に取り付けられたカメラ３８を用いて組織標本の画像を５分ごとに取得し、実験を合計３０分間行った（図１３Ｂ）。各画像を取得した後、フローを短時間反転させ、篩マイクロ流体チャネルに滲んだ（ｓｅｅｐｅｄ）組織を除去した。組織の滲みは、３本のハイドロミンチチャネルを使った場合に最も広範囲に及び、これは生成される流体力学的な力が大きいことを反映している。ＩｍａｇｅＪとＭＡＴＬＡＢを用いて画像を処理し、組織面積と画素密度に基づき、各時点でデバイス内に残存する肝組織の量を評価した（図１４参照）。消化プロファイルを、初期組織質量で正規化した後、図１３Ｃにプロットした。結果は３つのデバイスでほぼ同様で、最初の５分間で４０％の劇的な組織減少がみられ、その後５分間ごとに１０％ずつ緩やかに組織が減少した。初期の低下は主に画素密度の低下と相関しており、これは組織の脱落や赤血球の洗い流しを反映している可能性がある。その後の緩やかな段階は、主に組織量の減少を反映している。３０分後、３つのデバイス設計すべてから組織の約８０％が除去された。しかし、３本のハイドロミンシングマイクロ流体チャネルを備えたデバイスは、実験間のばらつき、特に後の時点におけるばらつきが少ないという点で最も一貫した結果を出したため、さらなる評価のために選択された。図１３Ｄは、３０分間のデバイス処理後に収集されたデバイス流出液の代表的な顕微鏡写真を示す。すべてのケースにおいて、試料流出液は主に大きな組織凝集塊、組織細胞、赤血球の混合物から構成されていた。
【0036】
新鮮なマウス臓器から得られた細胞懸濁液の評価
次に、切除したばかりのマウス肝臓と腎臓の試料を使って、３本のハイドロミンシングチャネル設計をテストした。このような生きた組織は、将来のアプリケーションで使用される試料をよりよく表しており、得られた細胞懸濁液は品質を直接分析することができる。肝臓は一般に解離しやすい組織と考えられているが、肝細胞は壊れやすいことがよく知られている。腎臓は、高い生理的流体力学的圧力のもとで機能し、緊密な細胞間結合を有し、特殊な基底膜を有し、血管と上皮に裏打ちされた尿細管が密集した構造をしているため、解離が困難な組織と考えられている。採取後すぐに、組織をメスで１ｃｍｘ１ｍｍｘ１ｍｍの小片に切断し（図１５Ａ参照）、重量を測定した。その後、試料採取前にコラゲナーゼを１５分または３０分間再循環させ、牛肝臓の場合と同様に消化デバイス実験を行った。画像はここでも５分ごとに撮影され、牛肝臓と同様に、組織損失をモニタするために処理された（図１５Ｂおよび１５Ｃ参照）。コニカルチューブ内で１５、３０、６０分間コラゲナーゼで消化する前に、コントロールをさらにメスで１ｍｍ３程度の断片にミンチした。これらの試料は常に５分ごとに撹拌され渦動（ｖｏｒｔｅｘｅｄ）された。組織をミンチせず、３０分間消化しただけの別のコントロールも含められた。消化後、デバイス処理した試料とコントロール試料とを渦動とピペッティングで機械的に処理し、７０μｍのセルストレーナで濾過し、ＤＮａｓｅで処理して細胞外ＤＮＡを除去した。その後、ＱＩＡａｍｐ（商標）ＤＮＡキットを用いて抽出された総ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に基づいて、細胞含量を評価した。ミンチしたコントロールでは、ｇＤＮＡは消化時間と共に徐々に増加した（図１６Ａ）。腎臓試料は、６０分間の消化で組織１ｍｇあたり約１００ｎｇのｇＤＮＡが得られたが、肝臓ではこの値の半分以下であった。ミンチ化していないコントロール群からはｇＤＮＡがやや少なかったが、その差は有意ではなかった。同じ消化時間で比較した場合、デバイス処理ではコントロールよりも劇的に多くのｇＤＮＡが得られた。その差は、１５分後には両組織タイプで約５倍、３０分後には３～４倍であった。さらに、デバイス処理では、次に長い消化時間で、ミンチ化したコントロールと少なくとも同量のｇＤＮＡが生成された。このように、マイクロ流体消化デバイスは、消化効率を大幅に改善し、消化時間を短縮することができる。ＤＮＡはまた、ＣｙＱＵＡＮＴ（商標）アッセイを用いて無傷の細胞懸濁液内で評価され、ｇＤＮＡの結果を裏付けた（図１３Ｄ参照）。最後に、各細胞懸濁液の代表試料を赤血球溶解バッファで処理した後、自動カウンタで細胞数を定量化し、位相差顕微鏡で細胞を可視化した。細胞数は、主に単一細胞を反映するが、小さなクラスタを含む場合もあり、ｇＤＮＡの結果と同様であった（図１６Ｂ）。主な違いは、肝臓が腎臓と同等の値を示したことである。このことは、腎臓細胞のかなりの部分が凝集体として残存しており、セルストレーナを通過して溶解されてｇＤＮＡが得られた可能性を示唆している。あるいは、細胞カウンタが肝臓懸濁液中のデブリを多く検出した可能性もあり、これはミンチ化したコントロール群とデバイス処理した試料の両方の顕微鏡写真で見られた（図１６Ｃ）。
次に、切除したばかりのマウス肝臓と腎臓の試料を使って、３本のハイドロミンシングチャネル設計をテストした。このような生きた組織は、将来のアプリケーションで使用される試料をよりよく表しており、得られた細胞懸濁液は品質を直接分析することができる。肝臓は一般に解離しやすい組織と考えられているが、肝細胞は壊れやすいことがよく知られている。腎臓は、高い生理的流体力学的圧力のもとで機能し、緊密な細胞間結合を有し、特殊な基底膜を有し、血管と上皮に裏打ちされた尿細管が密集した構造をしているため、解離が困難な組織と考えられている。採取後すぐに、組織をメスで１ｃｍｘ１ｍｍｘ１ｍｍの小片に切断し（図１５Ａ参照）、重量を測定した。その後、試料採取前にコラゲナーゼを１５分または３０分間再循環させ、牛肝臓の場合と同様に消化デバイス実験を行った。画像はここでも５分ごとに撮影され、牛肝臓と同様に、組織損失をモニタするために処理された（図１５Ｂおよび１５Ｃ参照）。コニカルチューブ内で１５、３０、６０分間コラゲナーゼで消化する前に、コントロールをさらにメスで１ｍｍ３程度の断片にミンチした。これらの試料は常に５分ごとに撹拌され渦動（ｖｏｒｔｅｘｅｄ）された。組織をミンチせず、３０分間消化しただけの別のコントロールも含められた。消化後、デバイス処理した試料とコントロール試料とを渦動とピペッティングで機械的に処理し、７０μｍのセルストレーナで濾過し、ＤＮａｓｅで処理して細胞外ＤＮＡを除去した。その後、ＱＩＡａｍｐ（商標）ＤＮＡキットを用いて抽出された総ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に基づいて、細胞含量を評価した。ミンチしたコントロールでは、ｇＤＮＡは消化時間と共に徐々に増加した（図１６Ａ）。腎臓試料は、６０分間の消化で組織１ｍｇあたり約１００ｎｇのｇＤＮＡが得られたが、肝臓ではこの値の半分以下であった。ミンチ化していないコントロール群からはｇＤＮＡがやや少なかったが、その差は有意ではなかった。同じ消化時間で比較した場合、デバイス処理ではコントロールよりも劇的に多くのｇＤＮＡが得られた。その差は、１５分後には両組織タイプで約５倍、３０分後には３～４倍であった。さらに、デバイス処理では、次に長い消化時間で、ミンチ化したコントロールと少なくとも同量のｇＤＮＡが生成された。このように、マイクロ流体消化デバイスは、消化効率を大幅に改善し、消化時間を短縮することができる。ＤＮＡはまた、ＣｙＱＵＡＮＴ（商標）アッセイを用いて無傷の細胞懸濁液内で評価され、ｇＤＮＡの結果を裏付けた（図１３Ｄ参照）。最後に、各細胞懸濁液の代表試料を赤血球溶解バッファで処理した後、自動カウンタで細胞数を定量化し、位相差顕微鏡で細胞を可視化した。細胞数は、主に単一細胞を反映するが、小さなクラスタを含む場合もあり、ｇＤＮＡの結果と同様であった（図１６Ｂ）。主な違いは、肝臓が腎臓と同等の値を示したことである。このことは、腎臓細胞のかなりの部分が凝集体として残存しており、セルストレーナを通過して溶解されてｇＤＮＡが得られた可能性を示唆している。あるいは、細胞カウンタが肝臓懸濁液中のデブリを多く検出した可能性もあり、これはミンチ化したコントロール群とデバイス処理した試料の両方の顕微鏡写真で見られた（図１６Ｃ）。
【0037】
フローサイトメトリによる細胞の種類、数、生存率の解析
最終的な評価は、単一細胞の数と生存率の測定に焦点を当てた。新鮮なマウスの腎臓と肝臓の試料を、前章で説明したように調製し消化したが、ミンチ化されていないコントロールを除き、１０分間のデバイス処理を追加した。消化された細胞懸濁液を４０μｍのセルストレーナで濾過し、以下の４つの蛍光プローブのパネルで標識した。リン脂質細胞膜を染色するＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ、全細胞内のＤＮＡを染色するＤｒａｑ５、細胞膜が破壊された死細胞内のＤＮＡのみを染色する７ＡＡＤ、および白血球を染色するＣＤ４５である（以下の表１）。
最終的な評価は、単一細胞の数と生存率の測定に焦点を当てた。新鮮なマウスの腎臓と肝臓の試料を、前章で説明したように調製し消化したが、ミンチ化されていないコントロールを除き、１０分間のデバイス処理を追加した。消化された細胞懸濁液を４０μｍのセルストレーナで濾過し、以下の４つの蛍光プローブのパネルで標識した。リン脂質細胞膜を染色するＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ、全細胞内のＤＮＡを染色するＤｒａｑ５、細胞膜が破壊された死細胞内のＤＮＡのみを染色する７ＡＡＤ、および白血球を染色するＣＤ４５である（以下の表１）。
【0038】
【0039】
このパネルにより、組織細胞を非細胞デブリ、無核赤血球、白血球から区別し、同時に生存率を評価することが可能になった。染色した細胞懸濁液をＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）フローサイトメータで分析し、方法の章に記載され図１７に示すゲーティングプロトコルを用いて、各細胞タイプの数を求めた。各細胞タイプの相対数を比較すると（図１８Ａおよび１８Ｂ）、１５分間消化したミンチ化コントロール以外は、赤血球が大部分を占めていた。意外なことに、赤血球のパーセンテージは、組織がより完全に消化されるにつれてわずかに増加したが、この効果は有意ではなかった。白血球の割合は安定しており、消化時間と共にわずかに減少した。主に上皮であると予想される組織細胞数を腎臓と肝臓の試料について定量化し、それぞれ図１８Ｃと１８Ｄに示した。組織細胞数は、ミンチ化したコントロールでは肝臓より腎臓の方が２～５倍多く、いずれも消化時間とともに増加した。１５～３０分では１桁以上、３０～６０分では５倍に増加した。デバイス処理では、１０分と１５分の時点ではほとんど変化はなかったが、腎臓試料では１０分で大きな変動がみられた。処理時間を３０分に延長したら、両組織タイプで細胞数は５０％程度しか増加しなかったが、その差は有意ではなかった。ミンチ化したコントロールと比較すると、同じ消化時点において、デバイス処理は再び優れた結果をもたらした。腎臓では、細胞数の差は１５分で３０倍、３０分で４倍であった。肝臓ではその差は約半分となった。さらに、１５分間のデバイス処理では、３０分間消化したミンチ化コントロールと同等かそれ以上の結果が得られた。しかし、６０分間消化したミンチ化コントロールは細胞数が最も多くなり、３０分間のデバイス処理を腎臓で５０％、肝臓で１００％上回った。この所見は、特に腎臓におけるｇＤＮＡの結果とは対照的であるが、ＣｙＱＵＡＮＴ（商標）やセルカウンタのデータと概ね一致している。したがって、消化デバイスによって遊離された新しい細胞の大部分は、小さな凝集体またはクラスタ内に存在すると考えられ、最小のチャネル構造サイズが２００μｍであることを考慮すると、これは合理的であろう。最後に、無傷の膜を持つ健康な細胞から排除されたＤＮＡ色素を用いて生存率を評価した。生存率は、６０分間消化したミンチ化コントロールと３０分間のデバイスケース（いずれも７０％に低下した）を除き、すべての腎臓試料で約８０％であった（図１９参照）。肝臓の場合、生存率はミンチ化コントロールで約９０％、１０分と１５分のデバイス処理で８０％、３０分のデバイス処理で７０％であった。各条件から得られた生組織細胞数も図１８Ｃと１８Ｄに示されている。腎臓では、３０分間のデバイス処理により、６０分間消化したミンチ化コントロールとほぼ同数の生きた単一組織細胞が得られた。１０分と１５分のデバイス処理では、この値の約半分が、わずかな時間で得られた。肝臓の場合、生きた単一組織細胞数は、１０分を超えてデバイス処理しても増加しなかった。これは、肝細胞の壊れやすい性質のためで、デバイス内を再循環する際に損傷を受けたか完全に破壊された可能性がある。腎臓は一般に解離が難しいとされる組織であるが、全体的にこのマイクロ流体消化デバイスは腎臓試料に対して優れた性能を示した。これは、腎臓の細胞がより頑強であることと、腎臓の組織がより緻密であるため、解離させるのに高い剪断力が必要であることの組み合わせによると考えられる。
【0040】
流体力学的剪断力とタンパク質分解消化の組み合わせを使用して、ｃｍＸｍｍスケールの組織から単一細胞を抽出または分離するために使用されるマイクロ流体デバイス１０が開示されている。腎臓と肝臓の組織試料を用いてマイクロ流体消化デバイスをテストしたところ、メスでミンチする必要がある標準的な方法と比較して、ＤＮＡと単一組織細胞の回収率の向上が一貫して観察された。短い処理時間でのデバイスのパフォーマンスは特に刺激的であり、１０分間の処理で、メスによるミンチと１時間の消化の５０％以内の結果が得られ、生存率も改善された。回収率の向上はＤＮＡで最も顕著であり、現在のデバイス設計では、小さな凝集体やクラスタ内にかなりの数の細胞が残っている可能性が示唆された。デバイスの機能および操作の改善は、チャネルの寸法を小さくし、流量を増やし、図１０に示すようなバルブ５４を設置して流れを組織の異なる領域に向けるなど、ハイドロミンシングを改善することで見出され得る。これらのアプローチは、組織の凝集解離を改善する可能性もある。さらに、この消化デバイスは、流体力学的マイクロメスを有する分岐チャネルアレイのような、図２に示すような別の解離装置１００と組み合わせることができる。特に肝臓について、最初の組織消化の際、あるいはむしろデバイス内を繰り返し再循環する間に細胞が損傷した可能性があるという証拠がいくつか観察された。したがって、次世代の設計では、再循環ではなく、濾過や他の物理的分離手段によって、単一細胞が遊離したらすぐに取り出すことを目指すことになる。マイクロ流体デバイス１０は、診断目的での様々な種類の癌の固形腫瘍や、組織工学や再生医療に使用するための皮膚、心臓、脂肪などの健康な組織など、他の組織に使用することができる。すなわち、様々な組織タイプをマイクロ流体デバイス１０に関連して使用することができる。これには癌組織などの疾患組織も含まれるし、健康な組織も含まれる。さらに、組織や試料は多くの異なる臓器や組織タイプから得られてもよい。
【0041】
実施例
以下は本発明の非限定的な実施例である。この実施例は、本発明を何ら限定することを意図していないことを理解されたい。均等物または代替物は本発明の範囲内である。
以下は本発明の非限定的な実施例である。この実施例は、本発明を何ら限定することを意図していないことを理解されたい。均等物または代替物は本発明の範囲内である。
【0042】
流体力学シミュレーション
ＣＯＭＳＯＬ Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓソフトウェアを使用して、デバイスチャネル内のフロープロファイル（図７）をシミュレートした。これは、有限要素法による流体力学シミュレーションにおいて、ナビエ・ストークス方程式と連続方程式の組み合わせが含まれる。流体フローは層流であると仮定し、チャネル壁にはノースリップの境界条件を適用した。１ｍＬ／分の流量を使用したが、実験に使用した最大２０ｍＬ／分の異なる流量でもフロープロファイルは同じである。唯一の違いは、対応する最大流速の変化である。
ＣＯＭＳＯＬ Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓソフトウェアを使用して、デバイスチャネル内のフロープロファイル（図７）をシミュレートした。これは、有限要素法による流体力学シミュレーションにおいて、ナビエ・ストークス方程式と連続方程式の組み合わせが含まれる。流体フローは層流であると仮定し、チャネル壁にはノースリップの境界条件を適用した。１ｍＬ／分の流量を使用したが、実験に使用した最大２０ｍＬ／分の異なる流量でもフロープロファイルは同じである。唯一の違いは、対応する最大流速の変化である。
【0043】
デバイスの製造
消化デバイスはＯｎｓｈａｐｅソフトウェアを使って設計された。ＶＬＳ４．６０ ６０Ｗ ＣＯ２レーザ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、アリゾナ州スコッツデール）を使用して、流体チャネルとホースバーブの開口部をレーザエッチングした。チャネルのデザインは、６×６インチの光学的に透明なキャストアクリル板（ＭｃＭａｓｔｅｒ－Ｃａｒｒ社、イリノイ州エルムハースト）にエッチングし、デバイスの最下層として使用された。その後、ホースバーブの開口部をタップし、ネジ切りを行った。ガスケットはＰＤＭＳ（Ｅｌｌｓｗｏｒｔｈ Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ社、ウィスコンシン州ジャーマンタウン）から５ｍｍのスラブをキャストし、メスで切断して作製した。デバイスの組み立ては、上下のアクリル層の間にＰＤＭＳガスケットを配置し、ナイロンネジで固定された。デバイスの入口と出口は、特注のＡｒｄｕｉｎｏ Ｕｎｏ Ｒ３マイクロコントローラで制御される蠕動ポンプに接続した。
消化デバイスはＯｎｓｈａｐｅソフトウェアを使って設計された。ＶＬＳ４．６０ ６０Ｗ ＣＯ２レーザ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、アリゾナ州スコッツデール）を使用して、流体チャネルとホースバーブの開口部をレーザエッチングした。チャネルのデザインは、６×６インチの光学的に透明なキャストアクリル板（ＭｃＭａｓｔｅｒ－Ｃａｒｒ社、イリノイ州エルムハースト）にエッチングし、デバイスの最下層として使用された。その後、ホースバーブの開口部をタップし、ネジ切りを行った。ガスケットはＰＤＭＳ（Ｅｌｌｓｗｏｒｔｈ Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ社、ウィスコンシン州ジャーマンタウン）から５ｍｍのスラブをキャストし、メスで切断して作製した。デバイスの組み立ては、上下のアクリル層の間にＰＤＭＳガスケットを配置し、ナイロンネジで固定された。デバイスの入口と出口は、特注のＡｒｄｕｉｎｏ Ｕｎｏ Ｒ３マイクロコントローラで制御される蠕動ポンプに接続した。
【0044】
組織モデル
牛肝臓は地元の精肉店から購入し、Ｔｒｕ－Ｃｕｔ（商標）生検針（ＣａｒｅＦｕｓｉｏｎ社，イリノイ州バーノンヒルズ）を用いて、臨床生検と同様の方法で組織コアを抽出した。簡単に説明すると、オブチュレータを後退させて標本ノッチを覆い、カニューレのハンドルをしっかり握って針を組織に挿入する。オブチュレータを可能な限り素早く前進させて標本ノッチを組織内に配置し、カニューレハンドルを素早く前進させて組織をカットする。標本ノッチに得られた組織を、ピンセットを使ってデバイスに移した。マウスの肝臓と腎臓は、カリフォルニア大学アーバイン校のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ａｎｇｅｌａ Ｇ．Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎ博士提供）で承認された研究から廃棄物とみなされた、犠牲となったＣ５７Ｂ／６またはＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、メイン州バーハーバー）から採取された。動物の臓器をメスで長さ１ｃｍ×直径１ｍｍに切断し、それぞれの質量を記録した。マウスの腎臓を左右対称にスライスし、皮質と髄質の両方を含む組織学的に類似した部分を得た。
牛肝臓は地元の精肉店から購入し、Ｔｒｕ－Ｃｕｔ（商標）生検針（ＣａｒｅＦｕｓｉｏｎ社，イリノイ州バーノンヒルズ）を用いて、臨床生検と同様の方法で組織コアを抽出した。簡単に説明すると、オブチュレータを後退させて標本ノッチを覆い、カニューレのハンドルをしっかり握って針を組織に挿入する。オブチュレータを可能な限り素早く前進させて標本ノッチを組織内に配置し、カニューレハンドルを素早く前進させて組織をカットする。標本ノッチに得られた組織を、ピンセットを使ってデバイスに移した。マウスの肝臓と腎臓は、カリフォルニア大学アーバイン校のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ａｎｇｅｌａ Ｇ．Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎ博士提供）で承認された研究から廃棄物とみなされた、犠牲となったＣ５７Ｂ／６またはＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、メイン州バーハーバー）から採取された。動物の臓器をメスで長さ１ｃｍ×直径１ｍｍに切断し、それぞれの質量を記録した。マウスの腎臓を左右対称にスライスし、皮質と髄質の両方を含む組織学的に類似した部分を得た。
【0045】
組織試料の消化
消化デバイスは、まず２００μＬのコラゲナーゼＩ型（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）でプライミングし、インキュベータ内で３７℃に加温して最適な酵素条件を確保した。その後、組織をチャンバ内に入れ、デバイスを組み立て、ナイロンネジで固定し、１ｍＬのコラゲナーゼを充填した。実験は、蠕動ポンプで２０ｍＬ／分で液体をデバイスに流して開始し、５分ごとに流れを反転させて下流の篩ゲートから組織を除去した。装置の流出液は、ポンプで直接コニカルチューブに注入して回収した。コントロールは、１ｍＬのコラゲナーゼが入ったコニカルチューブで、メスで～１ｍｍ３の小片に事前にミンチするか、しない状態で消化させた。チューブを３７℃のインキュベータ内に配置し、回転ミキサで穏やかに撹拌した。５分ごとにチューブをボルテックスして、組織を機械的に破壊し、消化を最大に高めた。消化手順の最後に、すべての細胞懸濁液をボルテックスとピペッティングを繰り返して機械的に凝集塊を破壊し、ＤＮａｓｅ Ｉ（１０μＬ、ロシュ、インディアナポリス）３７℃で５分間処理した。
消化デバイスは、まず２００μＬのコラゲナーゼＩ型（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）でプライミングし、インキュベータ内で３７℃に加温して最適な酵素条件を確保した。その後、組織をチャンバ内に入れ、デバイスを組み立て、ナイロンネジで固定し、１ｍＬのコラゲナーゼを充填した。実験は、蠕動ポンプで２０ｍＬ／分で液体をデバイスに流して開始し、５分ごとに流れを反転させて下流の篩ゲートから組織を除去した。装置の流出液は、ポンプで直接コニカルチューブに注入して回収した。コントロールは、１ｍＬのコラゲナーゼが入ったコニカルチューブで、メスで～１ｍｍ３の小片に事前にミンチするか、しない状態で消化させた。チューブを３７℃のインキュベータ内に配置し、回転ミキサで穏やかに撹拌した。５分ごとにチューブをボルテックスして、組織を機械的に破壊し、消化を最大に高めた。消化手順の最後に、すべての細胞懸濁液をボルテックスとピペッティングを繰り返して機械的に凝集塊を破壊し、ＤＮａｓｅ Ｉ（１０μＬ、ロシュ、インディアナポリス）３７℃で５分間処理した。
【0046】
組織消化をモニタする画像解析
装置の作動中、図６に示すように、装置の真上に取り付けたカメラで組織の画像を５分ごとに撮影した。生の画像は、まず組織の境界を識別するためにＩｍａｇｅＪを使用してバイナリに変換し処理された（図１４参照）。次に組織境界内の平均グレー値を求め、面積を乗じて、組織のサイズと密度を考慮した単一の指標を得た。各時点での結果は、実験前の初期値で正規化し、組織残存率で表示した。
装置の作動中、図６に示すように、装置の真上に取り付けたカメラで組織の画像を５分ごとに撮影した。生の画像は、まず組織の境界を識別するためにＩｍａｇｅＪを使用してバイナリに変換し処理された（図１４参照）。次に組織境界内の平均グレー値を求め、面積を乗じて、組織のサイズと密度を考慮した単一の指標を得た。各時点での結果は、実験前の初期値で正規化し、組織残存率で表示した。
【0047】
細胞懸濁液から回収したＤＮＡの定量化
消化された細胞懸濁液のＤＮＡ含量は、抽出と精製、および蛍光ＤＮＡ染色を用いた細胞内の直接評価によって評価された。いずれの場合も、まず試料を７０μｍのセルストレーナで濾過し、残存組織や大きな凝集体を除去した。精製ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、ＱＩＡａｍｐ（商標）ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、メリーランド州ジャーマンタウン）を用いて製造者の指示に従って単離し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて定量した。細胞内のＤＮＡは、ＣｙＱＵＡＮＴ（商標）ＮＦ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて、製造元の指示に従って標識した。３５ｍｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムと２０ｍＭのＨＥＰＥＳを添加したＨＢＳＳに試料を懸濁させ、不透明の９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、ニューヨーク州コーニング）に３重に添加した。その後、各ウェルに等量のＣｙＱＵＡＮＴ（商標）色素を添加し、２００ＲＰＭで連続攪拌しながら３７℃で４０分間インキュベートし、Ｓｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダ（ＢｉｏＴｅｋ社、バーモント州ウィヌースキ）を用いて蛍光シグナルを定量した。ＨＢＳＳとＣｙＱＵＡＮＴ（商標）色素のみを含むウェルをバックグラウンド減算に使用した。ｇＤＮＡおよび蛍光強度は、初期の組織質量で正規化した。
消化された細胞懸濁液のＤＮＡ含量は、抽出と精製、および蛍光ＤＮＡ染色を用いた細胞内の直接評価によって評価された。いずれの場合も、まず試料を７０μｍのセルストレーナで濾過し、残存組織や大きな凝集体を除去した。精製ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、ＱＩＡａｍｐ（商標）ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、メリーランド州ジャーマンタウン）を用いて製造者の指示に従って単離し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて定量した。細胞内のＤＮＡは、ＣｙＱＵＡＮＴ（商標）ＮＦ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて、製造元の指示に従って標識した。３５ｍｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムと２０ｍＭのＨＥＰＥＳを添加したＨＢＳＳに試料を懸濁させ、不透明の９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、ニューヨーク州コーニング）に３重に添加した。その後、各ウェルに等量のＣｙＱＵＡＮＴ（商標）色素を添加し、２００ＲＰＭで連続攪拌しながら３７℃で４０分間インキュベートし、Ｓｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダ（ＢｉｏＴｅｋ社、バーモント州ウィヌースキ）を用いて蛍光シグナルを定量した。ＨＢＳＳとＣｙＱＵＡＮＴ（商標）色素のみを含むウェルをバックグラウンド減算に使用した。ｇＤＮＡおよび蛍光強度は、初期の組織質量で正規化した。
【0048】
細胞計数と細胞懸濁液のイメージング
消化された流出液を回収し、７０μｍのセルストレーナで濾過し、塩化アンモニウム、炭酸カリウム、ＥＤＴＡを含む赤血球溶解バッファ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カリフォルニア州サンディエゴ）と共に室温で５分間インキュベートした。細胞濃度は、タイプＳカセットを備えるＭｏｘｉＺセルカウンタ（Ｏｒｆｌｏ社、アイダホ州ヘイリー）を用いて測定し、回収された総量と初期の組織質量を用いて、組織質量あたりの細胞数に換算した。イメージングには、試料を１２ウェルプレートに移し、細胞が定着するまで１時間待ち、４倍の対物レンズを備えたホフマン位相差顕微鏡で画像を撮影した。
消化された流出液を回収し、７０μｍのセルストレーナで濾過し、塩化アンモニウム、炭酸カリウム、ＥＤＴＡを含む赤血球溶解バッファ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カリフォルニア州サンディエゴ）と共に室温で５分間インキュベートした。細胞濃度は、タイプＳカセットを備えるＭｏｘｉＺセルカウンタ（Ｏｒｆｌｏ社、アイダホ州ヘイリー）を用いて測定し、回収された総量と初期の組織質量を用いて、組織質量あたりの細胞数に換算した。イメージングには、試料を１２ウェルプレートに移し、細胞が定着するまで１時間待ち、４倍の対物レンズを備えたホフマン位相差顕微鏡で画像を撮影した。
【0049】
単一細胞のフローサイトメトリ分析
消化したマウスの腎臓と肝臓の細胞懸濁液をＦＡＣＳチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、ニューヨーク州コーニング）に均等に分け、１％ＢＳＡと０．１％ＮａＮ３を添加したＦＡＣＳバッファ（１Ｘ ＰＢＳ、ｐＨ７．４、ＣａとＭｇカチオンを含まない）に再懸濁させた。試料はまず０．５Ｘ ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、マサチューセッツ州ウォルサム）と２．５μｇ／ｍＬ抗マウスＣＤ４５－ＰＥモノクローナル抗体（クローン３０－Ｆ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、カリフォルニア州サンディエゴ）で３７℃で２０分間染色し、遠心分離によりＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒで２回ウォッシュした。その後、細胞を１２．５μＭ Ｄｒａｑ５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、カリフォルニア州サンディエゴ）と５μｇ／ｍＬ ７ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンノゼ）を添加したＦＡＣＳバッファに再懸濁し、Ａｃｃｕｒｉ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）での解析前に少なくとも１５分間氷上に維持した。アイソタイプを一致させたＰＥ標識モノクローナル抗体（クローンＲＴＫ４５３０社、カリフォルニア州サンディエゴ）をコントロールとして使用した。フローサイトメトリデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ社、オレゴン州アシュランド）を用いて補正・解析した。補正は、腎臓と肝臓の組織をメスでミンチし、６０分間消化したものを４種類の調製液に分注し、各プローブについて陽性と陰性のサブセットを明確にして特定された。４種類の調製物には、１）ネガティブコントロールのＣｏｍｐＢｅａｄｓ（直径３．０－３．４μｍ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンノゼ）とＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ膜染色、２）溶解赤血球とＣＤ４５－ＰＥ抗体、３）生細胞と死細胞（５５℃で３０分間加熱死滅）と７ＡＡＤ染色、４）Ｄｒａｑ５染色の細胞画分が含まれる。各補償試料内の陽性および陰性の部分母集団を包含するゲートをＦｌｏｗＪｏに入力し、補償マトリックスを自動計算する。最後に、連続ゲーティングスキームを使用して、異なる細胞部分集団を同定した（図１７参照）。ＳＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ａゲートは、すべての細胞イベントを選択し、さらなる分析からデブリを除外するために作成された。ＦＳＣ－Ｈ対ＦＳＣ－Ａゲートを用いて、解析集団から多細胞凝集体を除去し、単一細胞のみに焦点を当てた。最初に白血球が、ＣＤ４５の発現（ＦＬ２－ＡまたはＰＥ対ＳＳＣ－Ｈ）に基づいて単一細胞集団から区別された。無核赤血球は、Ｄｒａｑ５核染色（ＦＬ４－ＡまたはＤｒａｑ５対ＳＳＣ－Ｈ）がないことで区別した。最終的に残った単一細胞（ＣＤ４５陰性、Ｄｒａｑ５陽性）の細胞性が、ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ染色を用いて細胞膜を検出することで確認された（ＦＬ１－ＡまたはＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）ｇｒｅｅｎ対ＦＳＣ－Ｈ）。最後に、７ＡＡＤシグナル（ＦＬ３－Ａまたは７ＡＡＤ対ＳＳＣ－Ｈ）に基づいて、生細胞と死細胞の有核組織細胞のパーセンテージを識別した。
消化したマウスの腎臓と肝臓の細胞懸濁液をＦＡＣＳチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、ニューヨーク州コーニング）に均等に分け、１％ＢＳＡと０．１％ＮａＮ３を添加したＦＡＣＳバッファ（１Ｘ ＰＢＳ、ｐＨ７．４、ＣａとＭｇカチオンを含まない）に再懸濁させた。試料はまず０．５Ｘ ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、マサチューセッツ州ウォルサム）と２．５μｇ／ｍＬ抗マウスＣＤ４５－ＰＥモノクローナル抗体（クローン３０－Ｆ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、カリフォルニア州サンディエゴ）で３７℃で２０分間染色し、遠心分離によりＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒで２回ウォッシュした。その後、細胞を１２．５μＭ Ｄｒａｑ５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、カリフォルニア州サンディエゴ）と５μｇ／ｍＬ ７ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンノゼ）を添加したＦＡＣＳバッファに再懸濁し、Ａｃｃｕｒｉ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）での解析前に少なくとも１５分間氷上に維持した。アイソタイプを一致させたＰＥ標識モノクローナル抗体（クローンＲＴＫ４５３０社、カリフォルニア州サンディエゴ）をコントロールとして使用した。フローサイトメトリデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ社、オレゴン州アシュランド）を用いて補正・解析した。補正は、腎臓と肝臓の組織をメスでミンチし、６０分間消化したものを４種類の調製液に分注し、各プローブについて陽性と陰性のサブセットを明確にして特定された。４種類の調製物には、１）ネガティブコントロールのＣｏｍｐＢｅａｄｓ（直径３．０－３．４μｍ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンノゼ）とＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ膜染色、２）溶解赤血球とＣＤ４５－ＰＥ抗体、３）生細胞と死細胞（５５℃で３０分間加熱死滅）と７ＡＡＤ染色、４）Ｄｒａｑ５染色の細胞画分が含まれる。各補償試料内の陽性および陰性の部分母集団を包含するゲートをＦｌｏｗＪｏに入力し、補償マトリックスを自動計算する。最後に、連続ゲーティングスキームを使用して、異なる細胞部分集団を同定した（図１７参照）。ＳＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ａゲートは、すべての細胞イベントを選択し、さらなる分析からデブリを除外するために作成された。ＦＳＣ－Ｈ対ＦＳＣ－Ａゲートを用いて、解析集団から多細胞凝集体を除去し、単一細胞のみに焦点を当てた。最初に白血球が、ＣＤ４５の発現（ＦＬ２－ＡまたはＰＥ対ＳＳＣ－Ｈ）に基づいて単一細胞集団から区別された。無核赤血球は、Ｄｒａｑ５核染色（ＦＬ４－ＡまたはＤｒａｑ５対ＳＳＣ－Ｈ）がないことで区別した。最終的に残った単一細胞（ＣＤ４５陰性、Ｄｒａｑ５陽性）の細胞性が、ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ染色を用いて細胞膜を検出することで確認された（ＦＬ１－ＡまたはＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）ｇｒｅｅｎ対ＦＳＣ－Ｈ）。最後に、７ＡＡＤシグナル（ＦＬ３－Ａまたは７ＡＡＤ対ＳＳＣ－Ｈ）に基づいて、生細胞と死細胞の有核組織細胞のパーセンテージを識別した。
【0050】
統計
データは少なくとも３回の独立した実験から得られた平均値±標準誤差として表される。Ｐ値は、異なる実験条件間の平均値と標準誤差に基づき、ｓｔｕｄｅｎｔｓ ｔ－ｔｅｓｔを用いて算出した。
データは少なくとも３回の独立した実験から得られた平均値±標準誤差として表される。Ｐ値は、異なる実験条件間の平均値と標準誤差に基づき、ｓｔｕｄｅｎｔｓ ｔ－ｔｅｓｔを用いて算出した。
【0051】
本発明の実施形態を示し、説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく様々な変更を加えることができる。例えば、ある実施形態の態様は、そのような置換または組み合わせが本明細書に明示的に記載されていなくても、他の実施形態と関連して使用することができる。さらに、Ｑｉｕらの刊行物、Microfluidic device for rapid digestion of tissues into cellular suspensions、Lab Chip、17、3300(2017)およびその補足情報は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の好ましい実施形態を示し、説明したが、添付の特許請求の範囲を超えない範囲で変更を加えてもよいことは、当業者には容易に明らかであろう。したがって、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。いくつかの実施形態では、本特許出願にある図面は、角度、寸法の比率などを含め、縮尺通りに描かれている。いくつかの実施形態では、図面は代表的なものであり、特許請求の範囲は図面の寸法によって限定されるものではない。
【0052】
以下の特許請求の範囲に記載された参照番号は、本特許出願の審査を容易にするためだけのもので、例示的なものであり、図面中の対応する参照番号を有する特定の特徴に特許請求の範囲を限定することを何ら意図するものではない。
したがって、本発明は、特許請求の範囲およびその均等物を除き、限定されるべきではない。
したがって、本発明は、特許請求の範囲およびその均等物を除き、限定されるべきではない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15-1】
【図15-2】
【図16-1】
【図16-2】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21-1】
【図21-2】
【図22】
【国際調査報告】