特表 2024-507118 抗トランスフェリン受容体融合タンパク質及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-16

(54)【発明の名称】抗トランスフェリン受容体融合タンパク質及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/68 20170101AFI20240208BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240208BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240208BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20240208BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240208BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240208BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240208BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240208BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240208BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240208BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240208BHJP

【ＦＩ】

A61K47/68

C07K19/00 ZNA

C07K16/28

C07K16/40

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

A61K39/395 N

A61K38/46

A61K39/395 L

A61P3/00

A61P43/00 105

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023547794

(86)(22)【出願日】2022-02-11

(85)【翻訳文提出日】2023-09-06

(86)【国際出願番号】 US2022016229

(87)【国際公開番号】W WO2022174114

(87)【国際公開日】2022-08-18

(31)【優先権主張番号】63/148,543

(32)【優先日】2021-02-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518086619

【氏名又は名称】デナリ セラピューティクス インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｄｅｎａｌｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】アルゲロ， アニー

(72)【発明者】

【氏名】ジース， ティナ

(72)【発明者】

【氏名】カナン， グナセカラン

(72)【発明者】

【氏名】カリオリス， ミハリス エス．

(72)【発明者】

【氏名】マホーン， カタル エス．

(72)【発明者】

【氏名】ワン， ジュンファ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064AG26

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE10

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA88X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC21

4C076CC26

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA01

4C084BA22

4C084BA41

4C084DC22

4C084NA13

4C084ZB21

4C084ZC19

4C084ZC21

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA21

4C085CC23

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045DA89

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA21

(57)【要約】

特定の実施形態は、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）アミノ酸配列、ＩＤＳバリアントのアミノ酸配列、またはその触媒活性断片、及び本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）抗体を含む融合タンパク質、ならびにその使用方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１つ以上のＧＡＧ種のレベルの低下を必要とする対象においてそれを行う方法であって、約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの用量で融合タンパク質を対象に投与することを含み、前記融合タンパク質が：
（ａ）イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）アミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片、及び
（ｂ）抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であって、
ｉ）ＧＹＳＦＴＮＹ（配列番号１３）を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、または配列番号１３と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｉ）ＹＰＧＧＤＹ（配列番号１５）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、または配列番号１５と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｉｉ）ＳＧＮＹＤＥＶＡＹ（配列番号１６）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、または配列番号１６と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｖ）ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、または配列番号７と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｖ）ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、または配列番号８と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、及び
ｖｉ）ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３、または配列番号９と比較して１もしくは２個の置換を有する配列を含む前記抗体を含む、前記方法。

【請求項2】

前記投与が、前記対象のＣＳＦ中の１つ以上のＧＡＧ種のレベルを少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％低下させ、ここで前記低下が、前記投与前の前記対象のＣＳＦ中の対応する１つ以上のＧＡＧ種のレベルと比較したものである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＧＡＧがヘパランスルフェートである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＧＡＧがデルマタンスルフェートである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項5】

前記投与が、前記対象のＣＳＦ中の総ＧＡＧのレベルを少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％低下させ、ここで前記低下が、前記投与前の前記対象のＣＳＦ中の総ＧＡＧのレベルと比較したものである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項6】

ハンター症候群の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの用量で融合タンパク質を前記対象に投与することを含み、前記融合タンパク質が：
（ａ）イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）アミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片、及び
（ｂ）抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であって、
ｉ）ＧＹＳＦＴＮＹ（配列番号１３）を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、または配列番号１３と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｉ）ＹＰＧＧＤＹ（配列番号１５）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、または配列番号１５と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｉｉ）ＳＧＮＹＤＥＶＡＹ（配列番号１６）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、または配列番号１６と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｖ）ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、または配列番号７と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｖ）ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、または配列番号８と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、及び
ｖｉ）ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３、または配列番号９と比較して１もしくは２個の置換を有する配列を含む前記抗体を含む、前記方法。

【請求項7】

前記融合タンパク質が、約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記融合タンパク質が、約３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記融合タンパク質が、約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記融合タンパク質が毎週投与される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記融合タンパク質が、薬学的に許容され得る賦形剤をさらに含む医薬組成物内に含まれる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記抗体が：
ａ）ＧＹＳＦＴＮＹ（配列番号１３）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ１、
ｂ）ＹＰＧＧＤＹ（配列番号１５）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、
ｃ）ＳＧＮＹＤＥＶＡＹ（配列番号１６）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、
ｄ）ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、
ｅ）ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、及び
ｆ）ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記抗体が、配列番号６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記抗体が、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記抗体が、配列番号５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記抗体が、配列番号５を含む軽鎖を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記抗体が、配列番号１１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記抗体が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記抗体が、配列番号１０と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記抗体が、配列番号１０を含む重鎖を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記抗体が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記ＩＤＳアミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片が、前記抗体重鎖のＣ末端に直接またはリンカーを介して連結されている、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記ＩＤＳアミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片が、リンカーを介して前記抗体重鎖のＣ末端に連結されている、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記ペプチドリンカーが、１～５０アミノ酸長である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記ペプチドリンカーが、単一のグリシン残基、単一のセリン残基、ＧＧＧＧＳ（配列番号１９）、ＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）、ＳＧＧＧＧ（配列番号２１）、ＧＧＳ（配列番号２２）、ＧＳ（配列番号２３）、及び連続して連結された前述の配列のいずれかの２～１０個からなるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記ペプチドリンカーが配列番号２３である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記抗ヒトＴｆＲ抗体が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖、Ｎ’末端からＣ’末端方向に順に：配列番号１０、配列番号２３、及びＩＤＳアミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片を含むペプチドリンカーによって、ＩＤＳアミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された重鎖を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記ＩＤＳアミノ酸配列が、配列番号１、２、３または４と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

前記ＩＤＳアミノ酸配列が配列番号３または４を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記ＩＤＳアミノ酸配列に連結された前記重鎖が、配列番号１７または１８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２９または３０に記載の方法。

【請求項32】

前記ＩＤＳアミノ酸配列に連結された前記重鎖が、配列番号１７または１８のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記抗ヒトＴｆＲ抗体が、配列番号５を含む軽鎖、及び配列番号１８を含むＩＤＳアミノ酸配列に連結された重鎖を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記融合タンパク質が、少なくとも約６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記融合タンパク質が、少なくとも約１０ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記融合タンパク質が、少なくとも約１２ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記融合タンパク質が、約６～約１９ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記融合タンパク質が、約１２～約１９ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記融合タンパク質が、約１５～約１６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

約１５ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む、請求項３９に記載の融合タンパク質。

【請求項41】

約１６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む、請求項３９に記載の融合タンパク質。

【請求項42】

約１．５～約２．５ｍｏｌ／ｍｏｌのマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）：融合タンパク質を含む、請求項１～４１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項43】

約１．５ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質を含む、請求項４２に記載の融合タンパク質。

【請求項44】

約１．７ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質を含む、請求項４２に記載の融合タンパク質。

【請求項45】

約２．３ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質を含む、請求項４２に記載の融合タンパク質。

【請求項46】

１つ以上のＧＡＧ種を減少させる方法で使用するための請求項１～４５のいずれか１項に記載の融合タンパク質であって、前記方法が、約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの用量で前記融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む、前記融合タンパク質。

【請求項47】

医薬を約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの用量でそれを必要とする対象に投与することによって、１つ以上のＧＡＧ種を減少させるための前記医薬の調製における、請求項１～４５のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。

【請求項48】

ハンター症候群を治療する方法において使用するための請求項１～４５のいずれか１項に記載の融合タンパク質であって、前記方法が、約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの用量で前記融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む、前記融合タンパク質。

【請求項49】

約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの用量で医薬をそれを必要とする対象に投与することによって、ハンター症候群を治療するための前記医薬の調製における、請求項１～４５のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。

【請求項50】

融合タンパク質であって：
（ａ）イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）アミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片、及び
（ｂ）抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であって、
ｉ）ＧＹＳＦＴＮＹ（配列番号１３）を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、または配列番号１３と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｉ）ＹＰＧＧＤＹ（配列番号１５）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、または配列番号１５と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｉｉ）ＳＧＮＹＤＥＶＡＹ（配列番号１６）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、または配列番号１６と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｖ）ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、または配列番号７と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｖ）ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、または配列番号８と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、及び
ｖｉ）ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３、または配列番号９と比較して１もしくは２個の置換を有する配列を含む前記抗体を含み、
前記融合タンパク質が、少なくとも約６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む、前記融合タンパク質。

【請求項51】

前記融合タンパク質が、少なくとも約１０ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む、請求項５０に記載の融合タンパク質。

【請求項52】

前記融合タンパク質が、少なくとも約１２ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む、請求項５０に記載の融合タンパク質。

【請求項53】

前記融合タンパク質が、約６～約１９ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む、請求項５０に記載の融合タンパク質。

【請求項54】

前記融合タンパク質が、約１２～約１９ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む、請求項５０に記載の融合タンパク質。

【請求項55】

前記融合タンパク質が、約１５～約１６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む、請求項５０に記載の融合タンパク質。

【請求項56】

約１５ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む、請求項５５に記載の融合タンパク質。

【請求項57】

約１６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む、請求項５５に記載の融合タンパク質。

【請求項58】

約１．５～約２．５ｍｏｌ／ｍｏｌのマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）：融合タンパク質を含む、請求項５０～５７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項59】

約１．５ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質を含む、請求項５８に記載の融合タンパク質。

【請求項60】

約１．７ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質を含む、請求項５８に記載の融合タンパク質。

【請求項61】

約２．３ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質を含む、請求項５８に記載の融合タンパク質。

【請求項62】

融合タンパク質であって：
（ａ）イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）アミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片、及び
（ｂ）抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であって、
ｉ）ＧＹＳＦＴＮＹ（配列番号１３）を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、または配列番号１３と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｉ）ＹＰＧＧＤＹ（配列番号１５）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、または配列番号１５と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｉｉ）ＳＧＮＹＤＥＶＡＹ（配列番号１６）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、または配列番号１６と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｖ）ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、または配列番号７と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｖ）ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、または配列番号８と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、及び
ｖｉ）ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３、または配列番号９と比較して１もしくは２個の置換を有する配列を含む前記抗体を含み、
前記融合タンパク質が、約１．５～約２．５ｍｏｌ／ｍｏｌのマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）：融合タンパク質を含む、前記融合タンパク質。

【請求項63】

約１．５ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質を含む、請求項６２に記載の融合タンパク質。

【請求項64】

約１．７ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質を含む、請求項６２に記載の融合タンパク質。

【請求項65】

約２．３ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質を含む、請求項６２に記載の融合タンパク質。

【請求項66】

前記抗体が：
ａ）ＧＹＳＦＴＮＹ（配列番号１３）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ１、
ｂ）ＹＰＧＧＤＹ（配列番号１５）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、
ｃ）ＳＧＮＹＤＥＶＡＹ（配列番号１６）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、
ｄ）ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、
ｅ）ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、及び
ｆ）ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３を含む、請求項５０～６５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項67】

前記抗体が、配列番号６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５０～６６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項68】

前記抗体が、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項６７に記載の融合タンパク質。

【請求項69】

前記抗体が、配列番号５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項５０～６８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項70】

前記抗体が、配列番号５を含む軽鎖を含む、請求項６９に記載の融合タンパク質。

【請求項71】

前記抗体が、配列番号１１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項５０～７０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項72】

前記抗体が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項７１に記載の融合タンパク質。

【請求項73】

前記抗体が、配列番号１０と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項５０～７２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項74】

前記抗体が、配列番号１０を含む重鎖を含む、請求項７３に記載の融合タンパク質。

【請求項75】

前記抗体が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項５０～６６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項76】

前記ＩＤＳアミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片が、前記抗体重鎖のＣ末端に直接またはリンカーを介して連結されている、請求項５０～７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項77】

前記ＩＤＳアミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片が、リンカーを介して前記抗体重鎖のＣ末端に連結されている、請求項７６に記載の融合タンパク質。

【請求項78】

前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項７７に記載の融合タンパク質。

【請求項79】

前記ペプチドリンカーが、１～５０アミノ酸長である、請求項７８に記載の融合タンパク質。

【請求項80】

前記ペプチドリンカーが、単一のグリシン残基、単一のセリン残基、ＧＧＧＧＳ（配列番号１９）、ＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）、ＳＧＧＧＧ（配列番号２１）、ＧＧＳ（配列番号２２）、ＧＳ（配列番号２３）、及び連続して連結された前述の配列のいずれかの２～１０個からなるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７９に記載の融合タンパク質。

【請求項81】

前記ペプチドリンカーが配列番号２３である、請求項８０に記載の融合タンパク質。

【請求項82】

前記抗体が、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖、Ｎ’末端からＣ’末端方向に順に：配列番号１０、配列番号２３、及びＩＤＳアミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片を含むペプチドリンカーによって、ＩＤＳアミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された重鎖を含む、請求項８１に記載の融合タンパク質。

【請求項83】

前記ＩＤＳアミノ酸配列が、配列番号１、２、３または４と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５０～８２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項84】

前記ＩＤＳアミノ酸配列が配列番号３または４を含む、請求項８３に記載の融合タンパク質。

【請求項85】

前記ＩＤＳアミノ酸配列に連結された前記重鎖が、配列番号１７または１８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８３または８４に記載の融合タンパク質。

【請求項86】

前記ＩＤＳアミノ酸配列に連結された前記重鎖が、配列番号１７または１８のアミノ酸配列を含む、請求項８３または８４に記載の融合タンパク質。

【請求項87】

前記抗体が、配列番号５を含む軽鎖、及び配列番号１８を含むＩＤＳアミノ酸配列に連結された重鎖を含む、請求項８６に記載の融合タンパク質。

【請求項88】

請求項５０～８７のいずれか１項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項89】

請求項５０～８７のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む宿主細胞。

【請求項90】

請求項５０～８７のいずれか１項に記載の融合タンパク質を産生する方法であって、前記融合タンパク質を産生するのに適した条件下の宿主細胞において、１）請求項５０～７０のいずれか１項に記載の軽鎖、及び２）請求項７６～８６のいずれか１項に記載のＩＤＳアミノ酸配列に連結された重鎖を発現するように操作可能な１つ以上のポリヌクレオチドを発現することを含む、前記方法。

【請求項91】

請求項９０に記載の方法によって産生される融合タンパク質。

【請求項92】

１つ以上のＧＡＧ種のレベルの低下を必要とする対象においてそれを行う方法であって、請求項５０～８７のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項８８に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項93】

前記投与が、前記対象のＣＳＦ中の１つ以上のＧＡＧ種のレベルを少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％低下させ、ここで前記低下が、前記投与前の前記対象のＣＳＦ中の対応する１つ以上のＧＡＧ種のレベルと比較したものである、請求項９２に記載の方法。

【請求項94】

前記ＧＡＧがヘパランスルフェートである、請求項９２または９３に記載の方法。

【請求項95】

前記ＧＡＧがデルマタンスルフェートである、請求項９２または９３に記載の方法。

【請求項96】

前記投与が、前記対象のＣＳＦ中の総ＧＡＧのレベルを少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％低下させ、ここで前記低下が、前記投与前の前記対象のＣＳＦ中の総ＧＡＧのレベルと比較したものである、請求項９２または９３に記載の方法。

【請求項97】

１つ以上のＧＡＧ種を減少させる方法で使用するための、請求項５０～８７のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項８８に記載の医薬組成物であって、前記方法が、前記融合タンパク質または医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記融合タンパク質または医薬組成物。

【請求項98】

医薬をそれを必要とする対象に投与することによって、１つ以上のＧＡＧ種を減少させるための前記医薬の調製における、請求項５０～８７のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。

【請求項99】

ハンター症候群の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、請求項５０～８７のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項８８に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項100】

ハンター症候群を治療する方法で使用するための、請求項５０～８７のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項８８に記載の医薬組成物であって、前記方法が、前記融合タンパク質または医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記融合タンパク質または医薬組成物。

【請求項101】

医薬をそれを必要とする対象に投与することによって、ハンター症候群を治療するための前記医薬の調製における、請求項５０～８７のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年２月１１日に出願された米国仮出願第６３／１４８，５４３号の優先権を主張する。上記で参照された出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

ハンター症候群またはＭＰＳ ＩＩは、ＩＤＳ遺伝子変異によって引き起こされる稀なＸ連鎖劣性障害である。不十分なイズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）活性は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ヘパランスルフェート（ＨＳ）及びデルマタンスルフェート（ＤＳ）の蓄積ならびに複数の臓器及び組織におけるリソソーム機能障害をもたらす。患者の約２／３が、ニューロン障害性表現型（ｎＭＰＳ ＩＩ）を示す。ＩＤＳの組換え型は、ハンター症候群を治療するために承認されているが、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて組換え酵素を送達することが困難であるため、脳にほとんど影響を及ぼさない。１つの可能なアプローチは、抗トランスフェリン受容体抗体を利用して、ＢＢＢを横切るＩＤＳなどの大きな分子の通過を促進する技術を含む。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

したがって、特定の実施形態は、融合タンパク質であって：
（ａ）イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）アミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片、及び
（ｂ）本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）抗体（例えば、抗ヒトＴｆＲ抗体）を含み、
融合タンパク質が、少なくとも約６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含み、及び／または約１．５～約２．５ｍｏｌ／ｍｏｌのマンノース６－リン酸（Ｍ６Ｐ）：融合タンパク質を含む、融合タンパク質を提供する。特定の実施形態では、融合タンパク質は、約１５～１６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質（すなわち、約１５～約１６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質）を含む、及び／または約１．５～約２．５ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質（すなわち、約１．５～約２．５ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質）を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、約１５～１６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質（すなわち、約１５～約１６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質）を含む、及び／または約１．５～約２．３ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質（すなわち、約１．５～約２．３ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質）を含む。

【0004】

特定の実施形態では、融合タンパク質は：
（ａ）イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）アミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片、及び
（ｂ）抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であって、
ｉ）ＧＹＳＦＴＮＹ（配列番号１３）を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、または配列番号１３と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｉ）ＹＰＧＧＤＹ（配列番号１５）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、または配列番号１５と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｉｉ）ＳＧＮＹＤＥＶＡＹ（配列番号１６）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、または配列番号１６と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｖ）ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、または配列番号７と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｖ）ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、または配列番号８と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、及び
ｖｉ）ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３、または配列番号９と比較して１もしくは２個の置換を有する配列を含む抗体を含み、
融合タンパク質は、少なくとも約６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質（例えば、約１５～１６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質（すなわち、約１５～約１６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質））を含む。

【0005】

特定の他の実施形態では、融合タンパク質は：
（ａ）イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）アミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片、及び
（ｂ）抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であって、
ｉ）ＧＹＳＦＴＮＹ（配列番号１３）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ１、または配列番号１３と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｉ）ＹＰＧＧＤＹ（配列番号１５）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、または配列番号１５と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｉｉ）ＳＧＮＹＤＥＶＡＹ（配列番号１６）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、または配列番号１６と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｖ）ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、または配列番号７と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｖ）ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、または配列番号８と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、及び
ｖｉ）ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３、または配列番号９と比較して１もしくは２個の置換を有する配列を含む抗体を含み、
融合タンパク質は、約１．５～約２．５ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、約１．５～約２．３ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質（すなわち、約１．５～約２．３ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質）を含む。

【0006】

特定の実施形態はまた、本明細書に記載の融合タンパク質及び薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

【0007】

特定の実施形態は、本明細書に記載の融合タンパク質を含む宿主細胞を提供する。

【0008】

特定の実施形態は、融合タンパク質を産生するのに適した条件下の宿主細胞において、１）本明細書に記載の軽鎖及び２）本明細書に記載のＩＤＳアミノ酸配列に連結された重鎖を発現するように操作可能な１つ以上のポリヌクレオチドを発現させることを含む、本明細書に記載の融合タンパク質を産生する方法を提供する。

【0009】

特定の実施形態は、本明細書に記載の方法によって産生される融合タンパク質を提供する。

【0010】

特定の実施形態は、１つ以上のＧＡＧ種のレベルの低下を必要とする対象においてそれを行う方法であって、本明細書に記載の融合タンパク質または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与すること（例えば、本明細書中に記載されるような治療有効量を投与すること）を含む方法を提供する。

【0011】

特定の実施形態は、ハンター症候群の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、本明細書に記載の融合タンパク質または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与すること（例えば、本明細書に記載ノ治療有効量を投与すること）を含む、方法を提供する。

【0012】

特定の実施形態はまた、１つ以上のＧＡＧ種のレベルの低下を必要とする対象においてそれを行う方法であって、約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの用量で融合タンパク質を対象に投与することを含む方法を提供し、ここで融合タンパク質は、
（ａ）イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）アミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片、及び
（ｂ）抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であって、
ｉ）ＧＹＳＦＴＮＹ（配列番号１３）を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、または配列番号１３と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｉ）ＹＰＧＧＤＹ（配列番号１５）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、または配列番号１５と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｉｉ）ＳＧＮＹＤＥＶＡＹ（配列番号１６）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、または配列番号１６と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｖ）ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、または配列番号７と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｖ）ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、または配列番号８と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、及び
ｖｉ）ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３、または配列番号９と比較して１もしくは２個の置換を有する配列を含む抗体を含む。

【0013】

特定の実施形態は、ハンター症候群の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの用量で融合タンパク質を対象に投与することを含む方法を提供し、ここで融合タンパク質は：
（ａ）イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）アミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片、及び
（ｂ）抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であって、
ｉ）ＧＹＳＦＴＮＹ（配列番号１３）を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、または配列番号１３と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｉ）ＹＰＧＧＤＹ（配列番号１５）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、または配列番号１５と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｉｉ）ＳＧＮＹＤＥＶＡＹ（配列番号１６）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、または配列番号１６と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｉｖ）ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、または配列番号７と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、
ｖ）ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、または配列番号８と比較して１もしくは２個の置換を有する配列、及び
ｖｉ）ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３、または配列番号９と比較して１もしくは２個の置換を有する配列を含む抗体を含む。

【0014】

特定の実施形態はまた、本明細書中に記載されるような融合タンパク質を調製するために有用である本明細書中に開示されるプロセス及び中間体を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】抗トランスフェリン受容体抗体を含むＩｇＧ：ＩＤＳ融合タンパク質の概略図であり、各重鎖はＩＤＳ酵素に融合されている。

【図2】マンノース－６－リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ）へのＩｇＧ：ＩＤＳの結合を示す。様々な濃度のＩｇＧ：ＩＤＳを使用してＥＬＩＳＡ結合アッセイを実施して、代表的な結合曲線を作成した。

【図3】ＭＰＳＩＩ線維芽細胞におけるＩｇＧ：ＩＤＳの細胞効力を示す。Ｓ^３５－スルフェート蓄積アッセイを使用して、ＩｇＧ：ＩＤＳの代表的な細胞効力曲線（細胞株全体の平均）を作成した。

【図4】１、３、または１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ：ＩＤＳの単回静脈内投与を受けたＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウス（ｎ＝３／群）の血清中のＩｇＧ：ＩＤＳの薬物動態（ＰＫ）プロファイルを示す。投与の０．５、４、８及び２４時間後に終末試料を収集した。

【図5】１、３、または１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ：ＩＤＳの単回静脈内投与を受けたＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウス（ｎ＝３／群）の脳のＩｇＧ：ＩＤＳのＰＫプロファイルを示す。投与の０．５、４、８及び２４時間後に終末試料を収集した。

【図6】１、３、または１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ：ＩＤＳの単回静脈内投与を受けたＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウス（ｎ＝３／群）の肝臓のＩｇＧ：ＩＤＳのＰＫプロファイルを示す。投与の０．５、４、８及び２４時間後に終末試料を収集した。

【図7A】１、３または１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ：ＩＤＳの単回静脈内用量を投与されたＩｄｓ ＫＯ、ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウス（ｎ＝５／群）由来の肝臓における総ＧＡＧレベルを示す。ＧＡＧレベルを投与の７日後に測定し、ビヒクル処置及びＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウスと比較した。ｎ＝５／群。グラフは、平均±ＳＥＭ及びｐ値を示し：テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図7B】１、３または１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ：ＩＤＳの単回静脈内用量を投与されたＩｄｓ ＫＯ、ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウス（ｎ＝５／群）由来の肝臓におけるヘパランスルフェート（ＨＳ）レベルを示す。ＧＡＧレベルを投与の７日後に測定し、ビヒクル処置及びＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウスと比較した。ｎ＝５／群。グラフは、平均±ＳＥＭ及びｐ値を示し：テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図7C】１、３または１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ：ＩＤＳの単回静脈内用量を投与されたＩｄｓ ＫＯ、ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウス（ｎ＝５／群）由来の肝臓におけるデルマタンスルフェート（ＤＳ）レベルを示す。ＧＡＧレベルを投与の７日後に測定し、ビヒクル処置及びＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウスと比較した。ｎ＝５／群。グラフは、平均±ＳＥＭ及びｐ値を示し：テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図8A】１、３または１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ：ＩＤＳの単回静脈内用量を投与されたＩｄｓ ＫＯ、ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウス（ｎ＝５／群）由来のＣＳＦにおける総ＧＡＧレベルを示す。ＧＡＧレベルを投与の７日後に測定し、ビヒクル処置及びＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウスと比較した。ｎ＝５／群。グラフは、平均±ＳＥＭ及びｐ値を示し：テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図8B】１、３または１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ：ＩＤＳの単回静脈内用量を投与されたＩｄｓ ＫＯ、ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウス（ｎ＝５／群）由来のＣＳＦにおけるヘパランスルフェート（ＨＳ）レベルを示す。ＧＡＧレベルを投与の７日後に測定し、ビヒクル処置及びＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウスと比較した。ｎ＝５／群。グラフは、平均±ＳＥＭ及びｐ値を示し：テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図8C】１、３または１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ：ＩＤＳの単回静脈内用量を投与されたＩｄｓ ＫＯ、ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウス（ｎ＝５／群）由来のＣＳＦにおけるデルマタンスルフェート（ＤＳ）レベルを示す。ＧＡＧレベルを投与の７日後に測定し、ビヒクル処置及びＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウスと比較した。ｎ＝５／群。グラフは、平均±ＳＥＭ及びｐ値を示し：テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図9A】１、３または１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ：ＩＤＳの単回静脈内用量を投与されたＩｄｓ ＫＯ、ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウス（ｎ＝５／群）由来の脳における総ＧＡＧレベルを示す。ＧＡＧレベルを投与の７日後に測定し、ビヒクル処置及びＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウスと比較した（ｎ＝５／群）。グラフは、平均±ＳＥＭ及びｐ値を示し：テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図9B】１、３または１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ：ＩＤＳの単回静脈内用量を投与されたＩｄｓ ＫＯ、ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウス（ｎ＝５／群）由来の脳におけるヘパランスルフェート（ＨＳ）レベルを示す。ＧＡＧレベルを投与の７日後に測定し、ビヒクル処置及びＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウスと比較した（ｎ＝５／群）。グラフは、平均±ＳＥＭ及びｐ値を示し：テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図9C】１、３または１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ：ＩＤＳの単回静脈内用量を投与されたＩｄｓ ＫＯ、ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウス（ｎ＝５／群）由来の脳におけるデルマタンスルフェート（ＤＳ）レベルを示す。ＧＡＧレベルを投与の７日後に測定し、ビヒクル処置及びＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウスと比較した（ｎ＝５／群）。グラフは、平均±ＳＥＭ及びｐ値を示し：テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【発明を実施するための形態】

【0016】

ハンター症候群、具体的には神経認知表現型は、依然として重大な満たされていない医学的ニーズである。本明細書にはＩｇＧ：ＩＤＳと呼ばれる特異的酵素補充療法の評価が記載されており、これは、ＢＢＢを通過し、ハンター症候群の特定のＣＮＳ症状を治療する能力を有するＩＤＳ酵素アミノ酸配列を含む融合タンパク質である。実施例に記載されるように、ＩｇＧ：ＩＤＳの産生は、シアル酸及びマンノース６－リン酸（Ｍ６Ｐ）修飾を含む融合タンパク質の特異的な翻訳後修飾（ＰＴＭ）をもたらす。これらのＰＴＭは、融合タンパク質への末梢（例えば血清）曝露に影響を及ぼし、ＣＮＳ内の特定の細胞への融合タンパク質の適切な輸送、ならびに細胞内輸送を促進することができる。さらに、ＩｇＧ：ＩＤＳに対する治療応答は、対象からの生理学的試料中に存在するグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）種のレベルを測定することによって評価することができる。これらのレベルは、ＩｇＧ：ＩＤＳの治療有効用量を同定及び評価するために使用し得る。

【0017】

融合タンパク質
したがって、特定の実施形態は、融合タンパク質であって：
（ａ）イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）アミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片、及び
（ｂ）本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）抗体（例えば、抗ヒトＴｆＲ抗体）を含む、融合タンパク質を提供する。本明細書に記載されるように、そのような融合タンパク質は、シアル酸及び／またはＭ６Ｐなどの特定のＰＴＭの特定の分子量または量の範囲（例えば、本明細書に記載の量または範囲）を含む、特定のＰＴＭを含み得る。

【0018】

特定の実施形態において、抗ＴｆＲ抗体は、ＴｆＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ヒトＴｆＲに特異的に結合する抗体は、ヒトＴｆＲに対応する別の種の１つ以上のタンパク質（すなわち、ＴｆＲオルソログ）との交差反応性を示す。例えば、いくつかの実施形態では、抗ＴｆＲ抗体は、種間で保存されている（例えば、種間で構造的に保存されている）、例えば、非ヒト霊長類とヒト種との間で保存されている（例えば、非ヒト霊長類とヒト種との間で構造的に保存されている）ＴｆＲ上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＴｆＲ受容体抗体は、ヒトＴｆＲに排他的に結合し得る。

【0019】

いくつかの実施形態では、抗ＴｆＲ抗体は抗ヒトＴｆＲ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、本明細書に記載の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む。特定の実施形態において、抗ヒトＴｆＲ抗体は、（１）重鎖可変領域配列、重鎖配列、または重鎖とＩＤＳアミノ酸配列とを含む融合ポリペプチド、及び／または（２）本明細書に記載の軽鎖可変領域配列または軽鎖配列を含む。例えば、表６は、ＩｇＧ：ＩＤＳ（実施例１参照）内に含まれる抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１～ＣＤＲ３及び重鎖可変領域のＣＤＲ１～ＣＤＲ３に含まれる各アミノ酸配列の配列番号を示す。しかしながら、表６は、それらのアミノ酸配列を例として示しているにすぎず、各ＣＤＲのアミノ酸配列を表６のアミノ酸配列に限定するものではない。むしろ、それらは、これらの列挙された配列のいずれかを含むアミノ酸配列の領域であっても、またはこれらの配列の一部を含む３つ以上の連続したアミノ酸からなるアミノ酸配列のいずれかであってもよい。

【0020】

したがって、特定の実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は：
ａ）ＧＹＳＦＸ_１ＮＹ（配列番号１２）を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、または配列番号１２と比較して１もしくは２個の置換を有するアミノ酸配列（式中、Ｘ_１はＭまたはＴである）、
ｂ）ＹＰＧＧＤＹ（配列番号１５）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、または配列番号１５と比較して１もしくは２個の置換を有するアミノ酸配列、
ｃ）ＳＧＮＹＤＥＶＡＹ（配列番号１６）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、または配列番号１６と比較して１もしくは２個の置換を有するアミノ酸配列、
ｄ）ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、または配列番号７と比較して１もしくは２個の置換を有するアミノ酸配列、
ｅ）ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、または配列番号８と比較して１もしくは２個の置換を有するアミノ酸配列、及び
ｆ）ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３、または配列番号９と比較して１もしくは２個の置換を有するアミノ酸配列を含む抗体を含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、参照配列に対して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、参照配列に対して２つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換（複数可）は、保存的置換である。

【0022】

したがって、いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は：
ａ）ＧＹＳＦＸ_１ＮＹ（配列番号１２）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ１、または配列番号１２に対して１つの置換を有するアミノ酸配列（式中、Ｘ_１はＭまたはＴである）、
ｂ）ＹＰＧＧＤＹ（配列番号１５）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、または配列番号１５と比較して１個の置換を有するアミノ酸配列、
ｃ）ＳＧＮＹＤＥＶＡＹ（配列番号１６）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、または配列番号１６と比較して１個の置換を有するアミノ酸配列、
ｄ）ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、または配列番号７と比較して１個の置換を有するアミノ酸配列、
ｅ）ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、または配列番号８と比較して１個の置換を有するアミノ酸配列、及び
ｆ）ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３、または配列番号９と比較して１個の置換を有するアミノ酸配列を含む。

【0023】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、ＧＹＳＦＸ_１ＮＹ（配列番号１２）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ１（式中、Ｘ_１はＭまたはＴである）、ＹＰＧＧＤＹ（配列番号１５）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、ＳＧＮＹＤＥＶＡＹ（配列番号１６）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３を含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は：ＧＹＳＦＸ_１ＮＹ（配列番号１２）からなる重鎖ＣＤＲ－Ｈ１（式中、Ｘ_１はＭまたはＴであり）、ＹＰＧＧＤＹ（配列番号１５）からなる重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、ＳＧＮＹＤＥＶＡＹ（配列番号１６）からなる重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号７）からなる軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）からなる軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、及びＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号９）からなる軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３を含む。

【0025】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＴｆＲ抗体は：ＧＹＳＦＴＮＹ（配列番号１３）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ１、ＹＰＧＧＤＹ（配列番号１５）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、ＳＧＮＹＤＥＶＡＹ（配列番号１６）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３を含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は：ＧＹＳＦＴＮＹ（配列番号１３）からなる重鎖ＣＤＲ－Ｈ１、ＹＰＧＧＤＹ（配列番号１５）からなる重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、ＳＧＮＹＤＥＶＡＹ（配列番号１６）からなる重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号７）からなる軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）からなる軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号９）からなる軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３を含む。

【0027】

いくつかの実施形態において、抗ヒトＴｆＲ抗体は：ＧＹＳＦＭＮＹ（配列番号１４）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ１、ＹＰＧＧＤＹ（配列番号１５）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、ＳＧＮＹＤＥＶＡＹ（配列番号１６）を含む重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３を含む。

【0028】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は：ＧＹＳＦＭＮＹ（配列番号１４）からなる重鎖ＣＤＲ－Ｈ１、ＹＰＧＧＤＹ（配列番号１５）からなる重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、ＳＧＮＹＤＥＶＡＹ（配列番号１６）からなる重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号７）からなる軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）からなる軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号９）からなる軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３を含む。

【0029】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の置換（例えば、保存的置換）または挿入を含むが、ＴｆＲに特異的に結合する能力を保持する。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号６に１個、２個または３個の置換（例えば、保存的置換）を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む。

【0033】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＮＹＷＬＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＤＹＰＴＹＳＥＫＦＫＶＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＳＧＮＹＤＥＶＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１１）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0034】

いくつかの実施形態では、配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の置換（例えば、保存的置換）または挿入を含むが、ＴｆＲに特異的に結合する能力を保持する。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１１に１個、２個または３個の置換（例えば、保存的置換）を含む。

【0035】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0036】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む。

【0037】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む。

【0038】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む。

【0039】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、配列番号１１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域をさらに含む。

【0040】

本明細書に記載されるように、抗ヒトＴｆＲ抗体は、実質的に完全長の抗体、例えばＩｇＧ抗体、例えばＩｇＧ_１抗体、または本明細書で定義される他の抗体クラスもしくはアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３またはＩｇＧ_４抗体）であり得る。したがって、特定の実施形態において、抗体は、少なくとも１つの重鎖定常領域及び／または少なくとも１つの軽鎖定常領域（例えば、カッパまたはラムダ）を含む。

【0041】

特定の実施形態において、抗ヒトＴｆＲ抗体は軽鎖定常領域を含む。特定の実施形態において、抗ヒトＴｆＲ抗体は、ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号５）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0042】

いくつかの実施形態では、配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の置換（例えば、保存的置換）または挿入を含むが、ＴｆＲに特異的に結合する能力を保持する。いくつかの実施形態において、軽鎖は、配列番号５に１個、２個または３個の置換（例えば、保存的置換）を含む。

【0043】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0044】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、配列番号５のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む。

【0045】

特定の実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、ＩｇＧ_１由来の定常領域（複数可）を含むＩｇＧ_１抗体である。例えば、特定の実施形態において、抗ヒトＴｆＲ抗体は、ＩｇＧ_１ Ｆｃ領域（例えば、配列番号２４を参照のこと）を含む。したがって、いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、以下と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む：ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＮＹＷＬＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＤＩＹＰＧＧＤＹＰＴＹＳＥＫＦＫＶＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＳＧＮＹＤＥＶＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１０）。

【0046】

いくつかの実施形態では、配列番号１０と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の置換（例えば、保存的置換）または挿入を含むが、ＴｆＲに特異的に結合する能力を保持する。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１０に１個、２個または３個の置換（例えば、保存的置換）を含む。

【0047】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列からなる重鎖を含む。

【0049】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号１０と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む。

【0050】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む。

【0051】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、配列番号５のアミノ酸配列からなる軽鎖を含み、配列番号１０のアミノ酸配列からなる重鎖をさらに含む。

【0052】

特定の実施形態では、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）アミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片が、抗体重鎖のＣ末端に直接またはリンカーを介して連結されている（すなわち、重鎖融合ポリペプチドを生成する）。

【0053】

いくつかの実施形態では、ＩＤＳアミノ酸配列（すなわち、ＩＤＳアミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片）は、抗体重鎖のＣ末端に直接（例えば、ペプチド結合によって）連結される。特定の他の実施形態では、ＩＤＳアミノ酸配列は、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）によって抗体重鎖のＣ末端に連結される。ペプチドリンカーは、それが結合している抗ｈＴｆＲ抗体に対するＩＤＳ酵素の回転を可能にするように構成されてもよく、及び／またはプロテアーゼによる消化に耐性である。ペプチドリンカーは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸またはそれらの組合せを含有し得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａなどのようなアミノ酸を含有するフレキシブルリンカーであり得る。そのようなリンカーは、公知のパラメータを使用して設計され、任意長のものであり得、かつ任意長の反復単位（例えば、Ｇｌｙ残基及びＳｅｒ残基の反復単位）を任意数含有し得る。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、１～５０アミノ酸長、１～４０アミノ酸長、１～３０アミノ酸長、１～２０アミノ酸長、１～１５アミノ酸長、１～１０アミノ酸長または１～５アミノ酸長（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０アミノ酸長）である。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシンまたはセリンから構成され、例えば、グリシンまたはセリンのいずれかの単一アミノ酸からなり、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号２３）、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号２２）、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号１９）、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号２０）、アミノ酸配列Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号２１）、または連続して連結されたこれらのアミノ酸配列のいずれかの１～１０もしくは２～５（例えば、２、３、４または５）を含む配列である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、例えば、中枢神経系に存在する酵素によって切断可能なプロテアーゼ切断部位を含み得る。

【0054】

特定の実施形態において、ＩＤＳアミノ酸配列は、重鎖のＣ末端に、１個のグリシン残基、１個のセリン残基、ＧＧＧＧＳ（配列番号１９）、ＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）、ＳＧＧＧＧ（配列番号２１）、ＧＧＳ（配列番号２２）、ＧＳ（配列番号２３）からなる群より選択されるアミノ酸配列、及び連続して連結された前述の配列のいずれかの２～１０個からなるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーによって連結される。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、単一のグリシン残基、単一のセリン残基、ＧＧＧＧＳ（配列番号１９）、ＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）、ＳＧＧＧＧ（配列番号２１）、ＧＧＳ（配列番号２２）、ＧＳ（配列番号２３）、及び連続して連結された前述の配列のいずれかの２～１０個からなるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。

【0055】

いくつかの実施形態において、ＩＤＳアミノ酸配列は、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー（配列番号２３）によって重鎖のＣ末端に連結される。

【0056】

したがって、特定の実施形態において、本明細書に記載の融合タンパク質は、抗ヒトＴｆＲ抗体及び、Ｎ’末端からＣ’末端に向かって順に：重鎖（配列番号１０）、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー（配列番号２３）、及びＩＤＳアミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片を含むペプチドリンカー（すなわち、重鎖融合ポリペプチド）によって重鎖のＣ末端に連結されたＩＤＳアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖、及びＮ’末端からＣ’末端に向かって順に：配列番号１０、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー（配列番号２３）、及びＩＤＳアミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片を含むペプチドリンカーによって、ＩＤＳアミノ酸配列、ＩＤＳバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された重鎖を含む抗ヒトＴｆＲ抗体を含む。

【0057】

特定の実施形態において、ＩＤＳアミノ酸配列は、野生型ＩＤＳアミノ酸配列であるか、または野生型ＩＤＳ、例えば、野生型ヒトＩＤＳの触媒的に活性なバリアントまたは断片である。いくつかの実施形態において、ＩＤＳ酵素の触媒活性バリアントまたは断片は、野生型ＩＤＳ酵素の活性の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれを超える活性を有する。

【0058】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質中に存在するＩＤＳ酵素、またはその触媒活性バリアントもしくは断片は、抗ＴｆＲ抗体に結合していない場合のその活性と比較して、その活性の少なくとも２５％を保持する。いくつかの実施形態では、ＩＤＳ酵素、またはその触媒活性バリアントもしくは断片は、抗ＴｆＲ抗体に結合していない場合の活性と比較して、その活性の少なくとも１０％、または少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を保持する。いくつかの実施形態では、ＩＤＳ酵素、またはその触媒活性バリアントもしくは断片は、抗ＴｆＲ抗体に結合していない場合の活性と比較して、その活性の少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％を保持する。いくつかの実施形態では、抗ＴｆＲ抗体への融合は、ＩＤＳ酵素またはその触媒活性バリアントもしくは断片の活性を低下させない。いくつかの実施形態では、抗ＴｆＲ抗体への融合は、ＩＤＳ酵素の活性を低下させない。

【0059】

特定の実施形態では、ＩＤＳアミノ酸配列は、配列番号１、２、３または４と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＩＤＳアミノ酸配列は、配列番号１、２、３または４と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＩＤＳアミノ酸配列は、配列番号１、２、３または４を含む。特定の実施形態では、ＩＤＳアミノ酸配列は、配列番号１、２、３または４からなる。

【0060】

特定の実施形態では、ＩＤＳアミノ酸配列は、配列番号３または４を含む。特定の実施形態では、ＩＤＳアミノ酸配列は、配列番号３を含む。特定の実施形態では、ＩＤＳアミノ酸配列は、配列番号３からなる。特定の実施形態では、ＩＤＳアミノ酸配列は、配列番号４を含む。特定の実施形態では、ＩＤＳアミノ酸配列は、配列番号４からなる。

【0061】

したがって、特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１７または１８と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＤＳアミノ酸配列（すなわち、重鎖融合ポリペプチド）に連結した重鎖を含む抗ヒトＴｆＲ抗体を含む。特定の実施形態において、ＩＤＳアミノ酸配列に連結される重鎖（すなわち、重鎖融合ポリペプチド）は、配列番号１７または１８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ＩＤＳアミノ酸配列に連結される重鎖は、配列番号１７または１８を含む。特定の実施形態において、ＩＤＳアミノ酸配列に連結される重鎖は、配列番号１７または１８からなる。

【0062】

特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１７と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＤＳアミノ酸配列（すなわち、重鎖融合ポリペプチド）に連結した重鎖を含む抗ヒトＴｆＲ抗体を含む。特定の実施形態において、ＩＤＳアミノ酸配列に連結される重鎖は、配列番号１７を含む。特定の実施形態において、ＩＤＳアミノ酸配列に連結される重鎖は、配列番号１７からなる。

【0063】

特定の実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＩＤＳアミノ酸配列に連結した重鎖を含む。特定の実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、配列番号５からなる軽鎖、及び配列番号１７からなるＩＤＳアミノ酸配列に連結された重鎖を含む。

【0064】

特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１８と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＤＳアミノ酸配列（すなわち、重鎖融合ポリペプチド）に連結した重鎖を含む抗ヒトＴｆＲ抗体を含む。特定の実施形態において、ＩＤＳアミノ酸配列に連結される重鎖は、配列番号１８を含む。特定の実施形態において、ＩＤＳアミノ酸配列に連結される重鎖は、配列番号１８からなる。

【0065】

特定の実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＩＤＳアミノ酸配列に連結した重鎖を含む。特定の実施形態では、抗ヒトＴｆＲ抗体は、配列番号５からなる軽鎖、及び配列番号１８からなるＩＤＳアミノ酸配列に連結された重鎖を含む。

【0066】

特定の実施形態は、本明細書に記載の融合タンパク質を提供する。

【0067】

さらなる態様では、上記の実施形態のいずれかによる融合タンパク質、またはその中に含まれる抗ヒトＴｆＲ抗体は、以下に記載される特徴のいずれかを単独でまたは組み合わせて組み込むことができる。

【0068】

Ｆｃ領域バリアント
特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾が、本明細書に記載される融合タンパク質／抗体のＦｃ領域に導入され、それによってＦｃ領域バリアントを生成してもよい。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、またはＩｇＧ_４ Ｆｃ領域）を含んでもよい。

【0069】

特定の実施形態では、抗体バリアントは、全てではないが、いくつかのエフェクター機能を有することにより、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗体の半減期が重要ではあるが、特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途に望ましい候補となる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを実行して、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行して、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（よって、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞にはＮＫ細胞が挙げられ、これはＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、一方で単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の第４６４頁、表３に要約されている。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６））及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照のこと）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照のこと）。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるものなどの動物モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで評価されてもよい。Ｃ１ｑ結合アッセイも行って、抗体がＣ１ｑに結合不可能であり、よってＣＤＣ活性を欠いていることを確認してもよい。例えば、ＷＯ ２００６／０２９８７９及びＷＯ ２００５／１００４０２のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評定するために、ＣＤＣアッセイが行われ得る（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期決定は、当該技術分野において既知の方法を使用しても行われ得る（Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）を参照されたい）。

【0070】

低減されたエフェクター機能を有する抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、アラニンへの残基２６５及び２９７の置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位及び３２７位のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。

【0071】

特定の実施形態において、野生型ヒトＦｃ領域のＰｒｏ３２９が、グリシン、アルギニン、セリン、または、Ｆｃのプロリン３２９とＦｃγＲＩＩＩのトリプトファン残基Ｔｒｐ８７及びＴｒｐ１１０との間に形成される、Ｆｃ／Ｆｃγ受容体界面内のプロリンサンドイッチを破壊するのに十分に大きなアミノ酸残基で置換される（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ ４０６，２６７－２７３（２０ Ｊｕｌｙ ２０００））。さらなる一実施形態において、Ｆｃバリアント内の少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、またはＰ３３１Ｓであり、さらに別の実施形態において、該少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ_１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、またはヒトＩｇＧ_４ Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅである（米国特許第８９６９５２６号（参照によりその全体が組み込まれる））。

【0072】

特定の実施形態において、ポリペプチドは、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＦｃバリアントを含み、このポリペプチドは、グリシンで置換されたヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＰｒｏ３２９を有し、Ｆｃバリアントは、ヒトＩｇＧ_１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、またはヒトＩｇＧ_４ Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅにおいて少なくとも２つのさらなるアミノ酸置換を含み、残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番される（米国特許第８９６９５２６号、これは参照によりその全体が組み込まれる）。特定の実施形態において、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドによって誘発されるＡＤＣＣの少なくとも２０％へのＡＤＣＣの下方調節、及び／またはＡＤＣＰの下方調節について、Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａの置換を含むポリペプチドは、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の低減を示す。（米国特許第８９６９５２６号、これは参照によりその全体が組み込まれる）。

【0073】

特定の一実施形態において、野生型ヒトＦｃポリペプチドのＦｃバリアントを含むポリペプチドは、三重変異、つまり、Ｐｒｏ３２９位におけるアミノ酸置換、Ｌ２３４Ａ変異、及びＬ２３５Ａ変異（Ｐ３２９／ＬＡＬＡ）を含む（米国特許第８，９６９，５２６号、これは参照によりその全体が組み込まれる）。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｐ３２９Ｓ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａを含む。

【0074】

ＦｃＲへの結合が改善または減少した特定の抗体バリアントは、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載される。（例えば、ＵＳ ６７３７０５６、ＷＯ ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４を参照されたい）。

【0075】

特定の実施形態において、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／または３３４位（残基のＥＵ付番）における置換を有する、Ｆｃ領域を含む。

【0076】

いくつかの実施形態において、例えば、米国特許第６１９４５５１号、ＷＯ １９９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されるように、変化した（すなわち、改善されたかまたは減少したかのいずれか）Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）をもたらす変化が、Ｆｃ領域において行われる。

【0077】

母体ＩｇＧの胎児への移入の原因である、増加した半減期及び新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合を有する抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載される。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。かかるＦｃバリアントとしては、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものが挙げられる（米国特許第７３７１８２６号）。

【0078】

Ｆｃ領域バリアントの他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）、ＵＳ ５６４８２６０、ＵＳ ５６２４８２１、及びＷＯ １９９４／２９３５１もまた参照されたい。

【0079】

翻訳後修飾：シアル酸及びマンノース－６－リン酸
翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、共有結合的または酵素修飾によるアミノ酸側鎖、カルボキシル基または末端アミノの修飾を含む生物学的プロセスである。そのような修飾としては、例えば、タンパク質中の１つ以上のアミノ酸のグリコシル化、シアリル化、リン酸化またはアセチル化が挙げられ得る。特定のタンパク質のＰＴＭは、配列のみに基づいて予測することができない可能性があり、タンパク質の産生及び精製方法に基づいて変化し得る。ＰＴＭは、タンパク質の機能及び安定性を決定するのに重要であることが示されている。例えば、グリコフォームの不均一性は、例えば、抗体安定性、薬物動態（ＰＫ）、有効性、免疫原性及び／またはＦｃ受容体結合に影響を及ぼし得る。

【0080】

本明細書に記載のＩｇＧ：ＩＤＳ融合タンパク質は、シアル酸及びマンノース６－リン酸修飾を含む特定のＰＴＭを含む。これらのＰＴＭは、ＣＮＳ内の特定の細胞への融合タンパク質の適切な輸送、ならびに細胞内輸送を促進する。さらに、ＰＴＭは、ｉｎ ｖｉｖｏでの融合タンパク質の曝露（例えば、薬物動態）に影響を及ぼし得る。例えば、マンノース－６－リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ）に結合するマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）グリカンは、細胞取込み及びリソソーム標的化に関与することが示されている。

【0081】

シアル酸またはＭ６Ｐなどの目的のタンパク質に存在する特定の修飾の分子量を評価する方法は、当該技術分野で公知である。そのようなアッセイの非限定的な例は、実施例３に記載されており、ここでは、Ｍ６Ｐ：融合タンパク質のｍｏｌ／ｍｏｌ及びＳＡ：融合タンパク質のｍｏｌ／ｍｏｌを決定するために液体クロマトグラフィー－質量分析が使用されている。Ｍ６ＰＲ結合／親和性を調べるための様々な方法もまた、この技術分野では公知である。例えば、実施例２に記載されるような蛍光酵素アッセイが使用される場合がある。

【0082】

特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、少なくとも約６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、少なくとも約８ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、少なくとも約１０ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、少なくとも約１２ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、少なくとも約１４ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、少なくとも約１５ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、約６～約１９ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質（すなわち、約６～約１９ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質）を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、約６～約１６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質（すなわち、約６～約１６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、約６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、約１２～約１９ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質（すなわち、約１２～約１９ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質）を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、約１５～１６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質（すなわち、約１５～約１６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、約１５ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、約１６ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質を含む。

【0083】

特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、約１．５～約２．５ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質（すなわち、約１．５～約２．５ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質）を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、約１．５～約２．３ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質（すなわち、約１．５～約２．３ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、約１．５ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、約１．７ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、約２．３ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：融合タンパク質を含む。

【0084】

親和性、結合速度、濃度／曝露及び機能的特性評価
本明細書に記載の融合タンパク質は、広範囲の結合親和性を有し得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＴｆＲに対して約１ｐＭ～２５００ｐＭの範囲の親和性を有する。例えば、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＴｆＲに対して約１ｐＭ～５００ｐＭの範囲の親和性を有する。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに対する親和性は、約１０ｐＭ～２５０ｐＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに対する親和性は、約５０ｐＭ～２００ｐＭの範囲である。例えば、ＴｆＲに対する親和性は、約２５ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、１５０ｐＭまたは２００ｐＭであり得る。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ親和性は、ヒトＴｆＲ（ｈＴｆＲ）に対するものである。

【0085】

結合親和性、結合速度及び交差反応性を分析するための方法は、当該技術分野で公知である（例えば、実施例を参照のこと）。これらの方法としては、固相結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）、免疫沈降、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））、速度論的排除アッセイ（例えば、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（例えば、Ｏｃｔｅｔ（商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ））及びウエスタンブロット分析が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡは、結合親和性、結合カイネティクス及び／または交差反応性を決定するために使用される。ＥＬＩＳＡアッセイを実施するための方法は当該技術分野において公知であり、以下の実施例セクションにも記載されている。いくつかの実施形態では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、結合親和性、結合カイネティクス、及び／または交差反応性を判定する。いくつかの実施形態では、結合親和性、結合カイネティクス、及び／または交差反応性を決定するために、結合平衡除外法（ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）が使用される。いくつかの実施形態では、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法アッセイを使用して、結合親和性、結合カイネティクス、及び／または交差反応性を判定する。結合親和性を決定するための方法の非限定的な例、ならびにＩｇＧ：ＩＤＳ融合タンパク質の比活性を決定するための方法の非限定的な例を実施例２に記載する。

【0086】

末梢器官（例えば、肝臓）、脳及び／または血漿中の本明細書に記載の融合タンパク質の濃度は、例えば、ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）ノックインマウスモデルを使用して測定することができる。そのようなモデルは、例えば、最大脳内濃度（Ｃ_ｍａｘ）及び／または脳曝露を測定及び／または比較するために、例えば、Ｃ_ｍａｘが増加したか及び／または脳曝露が延長したかを判断するために、使用することができる。ヒトアピカルＴｆＲ（ＴｆＲ^{ｍｓ／ｈｕ}）マウスノックインモデルの作製は、米国特許第１０，１４３，１８７号に記載されている。脳及び／または血漿濃度または融合タンパク質の曝露の評価のために、融合タンパク質をマウスモデルに投与することができる（例えば、ＴｆＲ^{ｍｓ／ｈｕ}）。血漿試料は、適切な期間後にマウスから得られ、続いて適切な溶液で血管系を灌流することができる。灌流後、末梢器官または脳（またはその一部）を抽出し、ホモジナイズし、溶解することができる。次いで、血漿、及び／または組織（例えば、脳）溶解物中の薬剤の濃度は、当業者に公知の標準的な方法を使用して決定し得る。非限定的な例として、実施例４に記載されているようなＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用して濃度を測定することができる。一連の用量をノックインマウスモデルに投与することにより、標準曲線を作成することができる。

【0087】

本明細書に記載される融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ：ＩＤＳ）はまた、融合タンパク質が標的細胞の表現型または挙動を調節する能力が検査される様々な機能アッセイで評価され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能アッセイの非限定的な例を実施例３に記載し、この実施例では、ＭＰＳ ＩＩ患者初代線維芽細胞においてＩｇＧ：ＩＤＳ融合タンパク質の細胞効力を評価した。

【0088】

ＩＤＳ活性はまた、細胞試料、組織試料または液体試料（例えば、ＣＳＦまたは尿）などの試料を、ＩＤＳ欠損の結果として蓄積する１つ以上のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（例えば、ヘパランスルフェート、デルマタンスルフェート、または総ＧＡＧ）の量についてアッセイすることによって評価し得る。ヘパラン及びデルマタンスルフェートの量は、試料中に存在するＧＡＧをヘパリナーゼ及びコンドロイチナーゼで消化することによって決定される。次いで、得られた二糖を質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によってアッセイすることができる。高レベルのヘパラン及びデルマタンスルフェート蓄積を有する試料は、量が増加したヘパラン及びデルマタンスルフェート由来二糖を有する。したがって、二糖のレベルはＩＤＳ酵素活性に反比例する。質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）アッセイは、細胞試料、組織試料、及び液体試料を含む、ＧＡＧが蓄積する任意の試料に対して行うことができる。そのような試料は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に投与されるか、またはいくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏで対象に投与される、本明細書に記載のＩＤＳ含有タンパク質の活性をモニターするために評価することができる。対象は、げっ歯類、例えばマウス、または非ヒト霊長類などの動物であり得る。いくつかの実施形態において、対象はヒト患者であり、例えば、ＩＤＳ療法による治療を受けているハンター症候群を有する患者などであり、アッセイは患者におけるＩＤＳ活性をモニターするために使用される。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、本明細書に記載の融合タンパク質による治療を受けている。そのようなアッセイのための例示的なプロトコルを実施例４に記載する。

【0089】

融合タンパク質／抗体産生
ＩＤＳアミノ酸配列に連結された抗ＴｆＲ抗体を含む融合タンパク質を調製する方法は、当該技術分野で公知であり、以下の実施例のセクションにも記載される。

【0090】

例えば、目的の抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているように、組換え方法及び組成物を使用して細胞からクローニングすることができる。したがって、特定の実施形態は、本明細書に記載の抗体または融合タンパク質／融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。さらなる実施形態において、かかる核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる実施形態において、かかる核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態では、宿主細胞は：（１）抗体のＶＬ（例えば、軽鎖）を含むアミノ酸配列と、ペプチドリンカーもしくはペプチド結合を介してＩＤＳアミノ酸配列に連結された抗体の重鎖を含むアミノ酸配列とをコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬ（例えば、軽鎖）を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクターと、ペプチドリンカーもしくはペプチド結合を介してＩＤＳアミノ酸配列に連結された抗体の重鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターとを含む（例えば、これらで形質転換されている）。一実施形態において、宿主細胞は、真核性、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。

【0091】

したがって、特定の実施形態は、融合タンパク質を産生するのに適した条件下の宿主細胞において、１）本明細書に記載の軽鎖及び２）本明細書に記載のＩＤＳアミノ酸配列に連結された重鎖を発現するように操作可能な１つ以上のポリヌクレオチドを発現させることを含む、本明細書に記載の融合タンパク質を産生する方法を提供する。特定の実施形態はまた、そのような方法によって産生される融合タンパク質を提供する。

【0092】

融合タンパク質の組換え産生のために、例えば本明細書に記載の融合タンパク質／ポリペプチドをコードする核酸を単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び／または発現のために１つ以上のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体／融合タンパク質の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され、配列決定され得る。

【0093】

融合タンパク質をコードするベクターのクローン化または発現に好適な宿主細胞としては、本明細書に記載される原核生物細胞または真核生物細胞が挙げられる。例えば、融合タンパク質は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合に、細菌内で産生され得る。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、米国特許第５７８９１９９号及び米国特許第５８４０５２３号を参照されたい。（Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体断片の発現を記載しているＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照されたい）。発現後、融合タンパク質は、可溶性画分で細菌細胞ペーストから単離され得、さらに精製され得る。

【0094】

脊椎動物細胞もまた、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で成長するように適合される哺乳類細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓系統（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されるＨＥＫ２９３または２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（ＷＩ３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ^－ ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及び骨髄腫細胞株、例えばＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。

【0095】

組成物及び製剤
本開示において使用するための製剤を調製するための指針は、当業者に公知である医薬調製物及び製剤についての多くの便覧に見ることができる。

【0096】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されている融合タンパク質を含み、１つ以上の薬学的に許容可能な担体及び／または賦形剤をさらに含む。例えば、特定の実施形態では、融合タンパク質は、薬学的に許容され得る賦形剤をさらに含む医薬組成物内に含まれる。医薬的に許容され得る担体としては、任意の溶媒、分散媒、またはコーティング剤が挙げられ、これらは、当該活性薬剤と生理学的に適合し、該活性薬剤の活性を妨害しないか、または阻害しない。

【0097】

いくつかの実施形態では、担体は、静脈内、髄腔内、脳室内、筋肉内、腹腔内または皮下投与に適している。薬学的に許容され得る担体は、例えば、組成物を安定化させるように、またはポリペプチドの吸収を増加もしくは減少させるように作用する１つ以上の生理学的に許容可能な化合物を含むことができる。生理学的に許容され得る化合物としては、例えば、グルコース、スクロースもしくはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸もしくはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、活性物質のクリアランスもしくは加水分解を減少させる組成物、または賦形剤もしくは他の安定剤及び／または緩衝液を挙げることができる。その他の薬学的に許容され得る担体及びその配合物もまた、当該技術分野で利用可能である。

【0098】

本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、通常使用されている混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセスによって製造することができる。以下の方法及び賦形剤は例示的なものである。

【0099】

上で開示されたように、本明細書に記載されている融合タンパク質は、例えば、ボーラス注射または持続注入による注射による非経口投与用に製剤化することができる。注射の場合、融合タンパク質を水性または非水性溶媒、例えば、植物性または他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコールに溶解、懸濁または乳化させることによって、ならびに必要に応じて、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤及び保存剤などの通常使用されている添加剤と共に、製剤に製剤化することができる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、生理学的に適合性のある緩衝液などの水溶液中に製剤化することができ、その非限定的な例としては、ハンクス液、リンゲル液及び生理的食塩水緩衝液が挙げられる。注射用製剤は、保存剤を添加した単位剤形、例えばアンプルまたは複数回用量の容器で提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルションなどの形態をとることができ、また、懸濁剤、安定剤、及び／または分散剤などの製剤化剤を含有することができる。いくつかの実施形態では、組成物は凍結乾燥組成物である。例えば、凍結乾燥組成物（例えば、凍結乾燥粉末またはケーキ）は、浸透圧及び／またはｐＨを調整するための塩（例えば、ＮａＣｌ、ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ＮａＯＨ、ＨＣｌ）、凍結保護剤（例えば、トレハロース、スクロース）、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレン－ポリプロピレングリコールなどのポリエーテルポリマーまたはブロックコポリマー）、及び増量剤（例えば、マンニトール、グリシン）からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含み得る。凍結乾燥組成物は、使用前に注入可能な液体形態に再構成され得る（例えば、水、生理食塩水、またはデキストロース５％水を介して再構成される）。特定の実施形態では、凍結乾燥組成物は、Ｎａ^＋、Ｃｌ^－、ＰＯ_４ ^３－、スクロース、及びブロックコポリマーのポリエチレン－ポリプロピレングリコールを含む賦形剤を含み得る。

【0100】

典型的には、ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用するための医薬組成物は、滅菌されている。滅菌は、当該技術分野において公知の方法、例えば、加熱滅菌、蒸気滅菌、滅菌濾過、または照射によって実現され得る。

【0101】

本明細書に記載の医薬組成物の用量及び所望の薬物濃度は、想定される特定の使用に応じて異なり得る。特定の適切な投与量が本明細書に記載される。

【0102】

使用方法
ＩＤＳ酵素活性が不十分であるか、または欠如すると、ＣＮＳ及び末梢におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ヘパランスルフェート（ＨＳ、例えば、Ｄ０Ａ０及びＤ０Ｓ０）及びデルマタンスルフェート（ＤＳ、例えば、Ｄ０ａ４）の蓄積、ならびに複数の臓器及び組織におけるリソソーム機能障害がもたらされる。したがって、特定の実施形態は、総ＧＡＧまたは１つ以上のＧＡＧ種のレベルの低下を必要とする対象においてそれを行う方法であって、本明細書に記載の融合タンパク質（すなわち、本明細書中に記載されるＩｇＧ：ＩＤＳ融合タンパク質）またはそのような融合タンパク質を含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、治療有効量の融合タンパク質または融合タンパク質を含む医薬組成物（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのタンパク質）を対象に投与する。

【0103】

総ＧＡＧの濃度または１つ以上のＧＡＧ種の濃度もまた、ハンター症候群を有する対象において（例えば、対象由来の生理学的試料、例えば、本明細書中に記載される融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ：ＩＤＳ）を投与された対象由来の治療後試料において）評価することができる。そのような評価は、本明細書中に記載される融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ：ＩＤＳ）に対する疾患活性または治療応答を評価するために使用される場合があり、これには、融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ：ＩＤＳ）の安全な用量及び治療有効用量を同定及び評価することが含まれる。ＧＡＧ濃度レベルの定量化は、当該技術分野で公知の方法を使用して、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）アッセイ（例えば、実施例４を参照のこと）を使用して実施し得る。

【0104】

特定の実施形態では、１つ以上のＧＡＧ種の濃度を評価し、ベースラインレベルまたは対照と比較することができる。対照またはベースラインレベルは変化することがあり、評価されるパラメータに応じて適切な対照またはベースラインレベルを特定することは、当業者の技術の範囲内である。例えば、特定の実施形態では、「対照」という用語は、健康な対象もしくはＩＤＳ欠損を有さない対象、またはそれら由来の試料を指し得る。あるいは、「対照」という用語は、融合タンパク質を投与されなかったＩＤＳ欠損（例えば、ＩＤＳ ＫＯマウスまたはハンター症候群患者）を有する対象を指し得る。「対照」はまた、治療前にＩＤＳ欠損を有する対象（またはそれ由来の試料）を指す場合がある。同様に、「ベースラインレベル」は、例えば、健康な対象、またはＩＤＳ欠損を有さない対象において測定されるレベルまたはレベルの範囲を指す場合がある。本明細書に記載される特定の他の実施形態では、「ベースラインレベル」はまた、融合タンパク質を投与されなかったＩＤＳ欠損を有する対象、または融合タンパク質の投与前の対象におけるレベルまたはレベルの範囲を指し得る。特定の実施形態では、対照値またはベースラインレベルは、対照対象の集団からのデータを使用して確立され得る。いくつかの実施形態では、対象の集団は、年齢または性別などの１つ以上の対象の特徴に従って試験対象に適合する。いくつかの実施形態では、対照値は、試験対象の脂質／タンパク質のレベルを評価するために使用されるのと同じ種類の対象集団由来の試料（例えば、血液またはＰＢＭＣを含む試料）を使用して確立される。特定の実施形態において、特定の評価が、例えば、治療開始の７日後、４週間後、１２週間後、６ヶ月後、１２ヶ月後及び／または１８ヶ月後に行われる。

【0105】

特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質の投与は、対照と比較して、対象由来の試料中の１つ以上のＧＡＧ種のレベルを低下させる。特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質の投与は、対照と比較して、対象由来の試料中の１つ以上のＧＡＧ種のレベルを少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれを超えて低下させる。特定の実施形態では、対照は、医薬組成物を投与されなかったＩＤＳ欠損を有する対象である。特定の実施形態において、対照は、治療前の対象である。

【0106】

本明細書で使用される場合、「試料」または「生理学的試料」という語句は、ＧＡＧ種などの目的の分析物を含む対象から得られた生物学的試料を指すことを意味する。したがって、試料は、例えば、分子、脂質またはタンパク質レベルで評価され得る。特定の実施形態では、生理学的試料は、組織、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、血液、血清、または血漿を含む。特定の実施形態では、試料は、脳、肝臓、腎臓、肺または脾臓などの組織を含む。試料は液体を含んでいてもよい。特定の実施形態では、試料は、ＣＳＦを含む。特定の実施形態では、試料は血液及び／または血漿を含む。特定の実施形態では、試料は血清を含む。特定の実施形態では、試料はＣＮＳ組織（例えば、脳組織）を含む。

【0107】

特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質の投与は、対照と比較して、対象の臓器、組織または体液（例えば、血液、血漿、血清、ＣＳＦまたは尿）中の１つ以上のＧＡＧ種のレベルを低下させる。特定の実施形態では、対象の臓器、組織または体液中の１つ以上のＧＡＧ種のレベルは、対照と比較して、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれを超えて低下する。特定の実施形態では、対照は、医薬組成物を投与されなかったＩＤＳ欠損を有する（例えばハンター症候群）対象である。特定の実施形態において、対照は、治療前の対象である。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質の投与は、対象のＣＳＦ中の１つ以上のＧＡＧ種のレベルを少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれを超えて（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％またはそれを超えて）低下させ、低下は、投与前の対象のＣＳＦ中の対応する１つ以上のＧＡＧ種のレベルと比較したものである。特定の実施形態では、投与は、対象のＣＳＦ中の１つ以上のＧＡＧ種（例えば、ＨＳ、ＤＳまたは総ＧＡＧ）のレベルを少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％低下させ、ここで低下は、投与前の対象のＣＳＦ中の対応する１つ以上のＧＡＧ種（例えば、ＨＳ、ＤＳまたは総ＧＡＧ）のレベルと比較したものである。

【0108】

特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質の投与は、対照と比較して、対象のＣＮＳ中の１つ以上のＧＡＧ種のレベルを低下させる。特定の実施形態では、対象のＣＮＳにおける１つ以上のＧＡＧ種のレベルは、対照と比較して、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれを超えて（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、またはそれを超えて）低下する。

【0109】

特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質の投与は、対照と比較して、対象のＣＳＦ中の１つ以上のＧＡＧ種のレベルを低下させる。特定の実施形態では、対象のＣＳＦにおける１つ以上のＧＡＧ種のレベルは、対照と比較して、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれを超えて（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、またはそれを超えて）低下する。特定の実施形態では、対象のＣＳＦ中の１つ以上のＧＡＧ種の減少は、投与前の対象の１つ以上のＧＡＧ種のＣＳＦレベルと比較したものである。

【0110】

特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質の投与は、対照と比較して、対象の血清中の１つ以上のＧＡＧ種のレベルを低下させる。特定の実施形態では、対象の血清中の１つ以上のＧＡＧ種のレベルは、対照と比較して、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれを超えて低下する。特定の実施形態では、対象の血清中の１つ以上のＧＡＧ種の減少は、投与前の対象の１つ以上のＧＡＧ種の血清レベルと比較したものである。特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質の投与は、対象の血清中の１つ以上のＧＡＧ種のレベルをベースラインレベル（例えば、健康な対象またはＩＤＳ欠損（例えばハンター症候群）を有さない対象において測定したレベル）に低下させる。

【0111】

特定の実施形態では、総ＧＡＧレベルが低下する。特定の実施形態では、ヘパランスルフェートレベルが低下する（例えば、Ｄ０Ａ０及び／またはＤ０Ｓ０レベルが低下する）。特定の実施形態では、デルマタンスルフェートレベルが低下する（例えば、Ｄ０ａ４レベルが低下する）。

【0112】

特定の実施形態は、１つ以上のＧＡＧ種を減少させる方法で使用するための本明細書に記載の融合タンパク質、またはそのような融合タンパク質を含む医薬組成物を提供し、この方法は、融合タンパク質または医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む。特定の実施形態では、方法は、治療有効量の融合タンパク質または融合タンパク質を含む医薬組成物を対象に（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのタンパク質用量などの本明細書に記載の用量で）投与することを含む。

【0113】

特定の実施形態は、医薬をそれを必要とする対象に投与することによって、１つ以上のＧＡＧ種を減少させるための医薬の調製における、本明細書に記載の融合タンパク質の使用を提供する。特定の実施形態では、使用は、治療有効量の医薬を、それを必要とする対象に（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのタンパク質用量などの本明細書に記載の用量で）投与することによるものである。

【0114】

特定の実施形態はまた、本明細書に記載の融合タンパク質またはそのような融合タンパク質を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、ハンター症候群の治療を必要とする対象においてそれを行う方法を提供する。

【0115】

特定の実施形態は、本明細書に記載の融合タンパク質、または医学療法に使用するためのそのような融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。

【0116】

特定の実施形態は、ハンター症候群を治療する方法で使用するための、本明細書に記載の融合タンパク質、またはそのような融合タンパク質を含む医薬組成物を提供し、方法は、融合タンパク質または医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む。

【0117】

特定の実施形態では、方法は、治療有効量の融合タンパク質または融合タンパク質を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載の用量、例えば約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのタンパク質用量が対象に投与される。

【0118】

特定の実施形態はまた、ハンター症候群の治療を必要とする対象にその治療のための医薬を投与することにより、治療を行うための医薬の調製における本明細書中に記載の融合タンパク質の使用を提供する。特定の実施形態では、使用は、治療有効量の医薬を、対象に（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのタンパク質用量などの本明細書に記載の用量で）投与することによるものである。

【0119】

投与及び有効用量
本明細書に記載の融合タンパク質または本明細書に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物は、例えば治療効果用量などの有効量または有効用量で対象に投与し得る。

【0120】

いくつかの実施形態において、用量（例えば、有効用量または治療有効用量）は、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇのタンパク質（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ）である。いくつかの実施形態では、用量（例えば、有効用量または治療有効用量）は、約１ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇのタンパク質である。いくつかの実施形態では、用量（例えば、有効用量または治療有効用量）は、約３ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇのタンパク質である。特定の実施形態において、用量（例えば、有効用量または治療有効用量）は、約１ｍｇ／ｋｇのタンパク質である。特定の実施形態において、用量（例えば、有効用量または治療有効用量）は、約３ｍｇ／ｋｇのタンパク質である。特定の実施形態において、用量（例えば、有効用量または治療有効用量）は、約１０ｍｇ／ｋｇのタンパク質である。

【0121】

特定の実施形態では、本明細書に記載のそのような用量は、治療有効用量、例えば安全な治療有効用量（例えば、対象の尿中総ＧＡＧ濃度の安定化または減少をもたらす用量）である。

【0122】

特定の実施形態では、医薬組成物は、毎週投与される。

【0123】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質分子は、少なくとも約５００単位（Ｕ）／ｍｇ、約１，０００Ｕ／ｍｇ、または少なくとも約１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、または１０，０００Ｕ／ｍｇの酵素活性を有する。いくつかの実施形態において、酵素活性は少なくとも約１１，０００Ｕ／ｍｇ、または少なくとも約１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５０００もしくは５０，０００Ｕ／ｍｇ、または約５００Ｕ／ｍｇ～約５０，０００Ｕ／ｍｇの範囲内のいずれかである。

【0124】

投与量は、選択された投与経路、組成物の製剤、患者の応答、状態の重症度、対象の体重、対象の年齢、対象の頭の大きさ及び／または頭の大きさと身長との比、ならびに処方医の判断を含むいくつかの要因に従って変動し得る。投与量は、個々の患者による必要に応じて経時的に増加または減少され得る。いくつかの実施形態では、患者には、まず最初に低用量が投与され、次いで、患者が耐えられる有効な投薬量まで増量される。有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。

【0125】

種々の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物を非経口投与する。いくつかの実施形態では、医薬組成物を静脈内投与する。静脈内投与は、例えば、約１０～約３０分の期間にわたる、または少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間もしくは１０時間の期間にわたる、注入によるものであり得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約２０分～６時間、または約３０分～４時間の期間にわたって静脈内投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は静脈内ボーラスとして投与される。注入とボーラス投与の組合せも使用されてもよい。

【0126】

特定の実施形態では、融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ：ＩＤＳ）の薬物動態（ＰＫ）を評価する。例えば、ＰＫパラメータとしては、限定されないが：Ｃｍａｘ、トラフ濃度（Ｃｍｉｎ）、Ｔｍａｘ、時間０から最後の定量可能な濃度の時間までの濃度－時間曲線下面積（_{ＡＵＣ０－最後}）、投与間隔にわたる濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ_０－Ｔ）、見かけの末端除去速度定数（λｚ）、見かけの末端除去ｔ１／２、及び累積比が挙げられる。

【0127】

製品
他の態様では、本明細書に記載の融合タンパク質を含む製品が提供される。製品は、容器、及び容器上のまたは容器と関連したラベルまたは添付文書を含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成され得る。容器は、組成物を単独でまたは別の組成物と組み合わせて保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本明細書に記載の融合タンパク質である。ラベルまたは添付文書は、組成物がハンター症候群を治療するために使用されることを示す。さらに、製品は、（ａ）本明細書に記載の融合タンパク質を含む組成物が収容された第１の容器、及び（ｂ）治療剤を含む組成物が収容された第２の容器を含み得る。本実施形態における製品は、組成物がハンター症候群を治療するために使用され得ることを示す添付文書をさらに含み得る。代替的に、または追加的に、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液などの、薬学的に許容される緩衝液を含む、第２の（または第３の）容器をさらに含んでもよい。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザの立場から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。

【0128】

特定の定義
別途定義されない限り、本明細書に使用される技術及び科学用語は、当該技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有し、それらは、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、及びＪａｎｅｗａｙ，Ｃ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．，Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋと一致する。

【0129】

本明細書で使用する場合、「約」及び「およそ」という用語は、数値または範囲で指定された量を修正するために使用される場合、その数値及び当業者に公知の値からの妥当な偏差、例えば、±２０％、±１０％または±５％が、記載された値の意図する意味の範囲内であることを示す。

【0130】

用語「投与する」は、薬剤（例えば、本明細書中に記載されるＩｇＧ：ＩＤＳ融合タンパク質など）、化合物または組成物（例えば、医薬組成物）を所望の生物学的作用部位に送達する方法を指す。これらの方法としては、経口、局所送達、非経口送達、静脈内送達、皮内送達、筋肉内送達、髄腔内送達、結腸送達、直腸送達、または腹腔内送達が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、静脈内投与される。

【0131】

「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の、総計の非共有性相互作用の強度を指す。別途指定されない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する、本来の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離定数（「Ｋｄ」、「ＫＤ」、または「Ｋ_Ｄ」と呼ばれる）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例証的かつ例示的な実施形態は本明細書に記載される。

【0132】

「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の形で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。

【0133】

天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるものと、それらのアミノ酸が後で改変されたもの、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート及びＯ－ホスホセリンである。

【0134】

天然に存在するα－アミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びそれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。天然に生じるα－アミノ酸の立体異性体は、Ｄ－アラニン（Ｄ－Ａｌａ）、Ｄ－システイン（Ｄ－Ｃｙｓ）、Ｄ－アスパラギン酸（Ｄ－Ａｓｐ）、Ｄ－グルタミン酸（Ｄ－Ｇｌｕ）、Ｄ－フェニルアラニン（Ｄ－Ｐｈｅ）、Ｄ－ヒスチジン（Ｄ－Ｈｉｓ）、Ｄ－イソロイシン（Ｄ－Ｉｌｅ）、Ｄ－アルギニン（Ｄ－Ａｒｇ）、Ｄ－リジン（Ｄ－Ｌｙｓ）、Ｄ－ロイシン（Ｄ－Ｌｅｕ）、Ｄ－メチオニン（Ｄ－Ｍｅｔ）、Ｄ－アスパラギン（Ｄ－Ａｓｎ）、Ｄ－プロリン（Ｄ－Ｐｒｏ）、Ｄ－グルタミン（Ｄ－Ｇｌｎ）、Ｄ－セリン（Ｄ－Ｓｅｒ）、Ｄ－トレオニン（Ｄ－Ｔｈｒ）、Ｄ－バリン（Ｄ－Ｖａｌ）、Ｄ－トリプトファン（Ｄ－Ｔｒｐ）、Ｄ－チロシン（Ｄ－Ｔｙｒ）、及びその組合せを含むが、これらに限定されない。

【0135】

アミノ酸は、本明細書では、一般的に知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字記号のいずれかで言及され得る。

【0136】

本明細書で使用される、「抗体」という用語は、免疫グロブリンフォールドを有し、可変領域を介して抗原と特異的に結合するタンパク質を指す。本明細書において「抗体」は、最も広義に使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び所望される生物活性を呈する限りにおいて抗体断片が含まれる（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７０：４８５４－４８６１）。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラであり得るか、または他の種に由来するものであり得る。（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．，Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。標的抗原は、一般的に、複数の抗体上のＣＤＲ（相補性決定領域）によって認識される、エピトープとも呼ばれる多数の結合部位を有する。異なるエピトープに特異的に結合する各抗体は、異なる構造を有する。したがって、１つの抗原は、２つ以上の対応する抗体を有し得る。抗体は、完全長免疫グロブリン分子、または目的の標的の抗原もしくはその一部（例えば、ＴｆＲ）に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む完全長免疫グロブリン分子の一部を含む。本明細書に開示される免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、及びＩｇＡ_２）、またはサブクラスのものであり得る。免疫グロブリンは、任意の種に由来し得る。しかしながら、一態様において、免疫グロブリンは、ヒト、マウス、またはウサギ起源のものである。

【0137】

「ＴｆＲに結合する抗体」及び「抗ＴｆＲ抗体」という用語は、抗体が血液脳関門を通過する輸送のためにＴｆＲに結合することができるように、十分な親和性でその可変領域を介してＴｆＲに結合することができる抗体を指す。一実施形態では、抗ＴｆＲ抗体が無関係の非ＴｆＲタンパク質に結合する程度は、例えば放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定される、抗体のＴｆＲへの結合の約１０％未満である。特定の実施形態において、ＴｆＲに結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下または０．００１ｎＭ以下（例えば１０^－８Ｍ以下、例えば１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施形態において、抗ＴｆＲ抗体は、異なる種由来のＴｆＲ間で保存されるＴｆＲのエピトープに結合する。

【0138】

「抗原結合部分」及び「抗原結合断片」という用語は、本明細書において互換的に使用され、その可変領域を介して抗原（例えば、ＴｆＲ）に特異的に結合する能力を保持した抗体の１つ以上の断片を指す。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片）、Ｆ（ａｂ’）_２断片（ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片から構成される二価断片）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＶＬ（軽鎖可変領域）、ならびにＶＨ（重鎖可変領域）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0139】

本明細書で使用する場合、「ＣＨ３ドメイン」及び「ＣＨ２ドメイン」という用語は、免疫グロブリン定常領域ドメインポリペプチドを指す。本出願の目的で、ＣＨ３ドメインのポリペプチドとは、ＥＵに従ってナンバリングされるほぼ３４１位からほぼ４４７位のアミノ酸のセグメントを指し、ＣＨ２ドメインのポリペプチドとは、ＥＵナンバリングスキームに従ってナンバリングされるほぼ２３１位からほぼ３４０位のアミノ酸のセグメントを指し、ヒンジ領域の配列を含まない。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのポリペプチドはまた、ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）ナンバリングスキームによってもナンバリングされる場合があり、この場合、ＩＭＧＴ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃｈａｒｔのナンバリング（ＩＭＧＴウェブサイト）によれば、ＣＨ２ドメインのナンバリングは１～１１０であり、ＣＨ３ドメインのナンバリングは１～１０７である。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域の一部である。Ｆｃ領域とは、ＥＵナンバリングスキームに従ってナンバリングされるほぼ２３１位からほぼ４４７位のアミノ酸のセグメントを指すが、本明細書で使用される場合、抗体のヒンジ領域の少なくとも一部を含むことができる。例示的なヒンジ領域配列は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列のＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２５）である。

【0140】

「対照」または「対照試料」という用語は、使用される検出技術に適切な任意の試料を指す。対照試料は、使用される検出技術の生成物または試験される材料を含有し得る。さらに、対照は陽性対照または陰性対照であり得る。

【0141】

「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部分が特定の源または種に由来する一方で、重鎖及び／または軽鎖の残りの部分が異なる源または種に由来する、抗体を指す。いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、ある供給源または種（例えば、マウス）に由来する可変領域と、別の供給源または種（例えば、ヒト）に由来する定常領域とを含むモノクローナル抗体である。キメラ抗体を作製する方法は、当該技術分野において説明されている。

【0142】

抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。５つの主要な抗体クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちの数個は、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、及びＩｇＡ_２にさらに分割され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

【0143】

「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、軽鎖及び重鎖可変領域によって確立される４つのフレームワーク領域を分断する各鎖中の３つの超可変領域を指す。ＣＤＲは、抗原のエピトープへの抗体結合を主として担う。各鎖のＣＤＲは、通常、Ｎ末端から順番にナンバリングしてＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と称され、通常、特定のＣＤＲが位置する鎖によっても識別される。従って、ＶＨ ＣＤＲ３またはＣＤＲ－Ｈ３は、それが見出される抗体重鎖の可変領域に位置する一方、ＶＬ ＣＤＲ１またはＣＤＲ－Ｌ１は、それが見出される抗体軽鎖の可変領域に由来するＣＤＲ１である。

【0144】

「交差反応する」という用語は、本明細書で使用する場合、抗体を産生させた抗原とは別の抗原に結合する、抗体の能力を指す。いくつかの実施形態では、交差反応性は、抗体が産生された抗原の種とは異なる種由来の抗原に結合する抗体の能力を指す。非限定的な例として、ヒトＴｆＲペプチドに対して産生される本明細書に記載の抗ＴｆＲ抗体は、ＴｆＲオルソログ（例えば、サル）との交差反応性を示し得る。

【0145】

「有効量」という語句は、（ｉ）特定の疾患、状態もしくは障害を治療または予防するか、（ｉｉ）特定の疾患、状態もしくは障害の、１つ以上の症状を減弱、改善もしくは除去するか、または（ｉｉｉ）本明細書に記載の特定の疾患、状態もしくは障害の、１つ以上の症状の発症を予防または遅延化させる、化合物の量を意味する。

【0146】

「エフェクター機能」は、抗体アイソタイプにより様々である、抗体のＦｃ領域に起因し得る生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。

【0147】

「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原分子上の特定の部位を指す。抗体が結合するエピトープは、当該技術分野で公知のエピトープビニング法、例えばペアワイズコンビナトリアル法によって決定することができる。いくつかの実施形態において、抗体が結合する抗原分子上の特定の部位は、ヒドロキシルラジカルフットプリント法によって決定される。

【0148】

「発現」は、内在性遺伝子、導入遺伝子の細胞における転写及び／または翻訳、ならびにセンス（ｍＲＮＡ）または機能性ＲＮＡの転写及び安定な蓄積を指す。アンチセンス構築物の場合、発現は、アンチセンスＤＮＡのみの転写を指し得る。発現はまた、タンパク質の産生を指し得る。

【0149】

「Ｆａｂ」断片（Ｆ（ａｂ）とも呼ばれる）はまた、軽鎖定常領域及び重鎖定常領域（ＣＨ１）を含む。例えば、抗体のパパイン消化は、２種類の断片：単一の抗原結合ドメインとして働く重鎖及び軽鎖の可変領域を含む、Ｆａｂ断片と呼ばれる抗原結合断片：及び結晶化しやすいため「Ｆｃ」と呼ばれる残りの部分を産生する。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域由来の１つ以上のシステイン残基を含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシル末端に由来するいくつかの残基も有する点で、Ｆａｂ断片とは異なる。しかしながら、Ｆａｂ’断片は、共に単一の抗原結合ドメインとして働く重鎖及び軽鎖の可変領域を含む抗原結合断片であるという点で、Ｆａｂと構造的に等価である。本明細書では、単一の抗原結合ドメインとして機能する重鎖及び軽鎖の可変領域を含み、パパイン消化によって得られるものと同等である抗原結合断片を、プロテアーゼ消化によって産生される抗体断片と同一でない場合であっても、「Ｆａｂ様抗体」と称する。Ｆａｂ’－ＳＨは、その定常領域に遊離チオール基を有する１つ以上のシステイン残基を有するＦａｂ’である。Ｆ（ａｂ’）断片は、Ｆ（ａｂ’）_２のヒンジ領域内のシステイン残基間のジスルフィド結合を切断することによって生成される。他の化学的に架橋された抗体断片も当該技術分野の当業者に公知である。抗体のペプシン消化は、２つの断片を生じる。一方は、２つの抗原結合ドメインを含み、抗原と交差反応することができるＦ（ａｂ’）_２断片であり、他方は残りの断片（ｐＦｃ’と呼ばれる）である。本明細書では、ペプシン消化によって得られたものと同等の抗体断片を、２つの抗原結合ドメインを含み、抗原と交差反応することができる場合、「Ｆ（ａｂ’）_２様抗体」と称する。このような抗体断片は、例えば遺伝子工学によっても産生することができる。

【0150】

本明細書における「Ｆｃ領域」または「Ｆｃポリペプチド」という用語は、構造ドメインとしてのＩｇフォールドを特徴とする免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は、少なくともＣＨ２ドメイン及び／またはＣＨ３ドメインを含む定常領域の一部を含み、ヒンジ領域の少なくとも一部を含み得る。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端に及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在する場合もあれば、しない場合もある。本明細書において別段明記されない限り、Ｆｃ領域または定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載される、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。一般に、Ｆｃ領域は可変領域を含有しない。

【0151】

「ＦｃＲｎ」という用語は、胎児性Ｆｃ受容体を指す。ＦｃポリペプチドのＦｃＲｎへの結合は、Ｆｃポリペプチドのクリアランスを低下させ、血清半減期を延長する。ヒトＦｃＲｎタンパク質は、主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質に類似した約５０ｋＤａのサイズのタンパク質と、約１５ｋＤａのサイズのβ２－ミクログロブリンからなるヘテロ二量体である。

【0152】

本明細書で使用される場合、「ＦｃＲｎ結合部位」は、ＦｃＲｎに結合するＦｃポリペプチドの領域を指す。ヒトＩｇＧでは、ＥＵインデックスを使用して付番したＦｃＲｎ結合部位には、Ｔ２５０、Ｌ２５１、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｒ２５５、Ｔ２５６、Ｔ３０７、Ｅ３８０、Ｍ４２８、Ｈ４３３、Ｎ４３４、Ｈ４３５及びＹ４３６が含まれる。これらの位置は、配列番号１の位置２０～２６、７７、１５０、１９８及び２０３～２０６に対応する。

【0153】

本明細書で使用する場合、「天然ＦｃＲｎ結合部位」は、ＦｃＲｎに結合し、かつＦｃＲｎに結合する天然Ｆｃポリペプチドの領域と同じアミノ酸配列を有するＦｃポリペプチドの領域を指す。

【0154】

「フレームワーク」または「ＦＲ」は、種内で比較的保存されている超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（またはＶＬ）において次の配列で現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。

【0155】

「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書で、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有する、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する、抗体を指すように交換可能に使用される。

【0156】

本明細書で使用される「融合タンパク質」または「抗体融合タンパク質」は、ＩＤＳ酵素、ＩＤＳ酵素バリアント、またはその触媒活性断片に連結または融合された抗ＴｆＲ抗体（例えば、抗ヒトＴｆＲ抗体）を指す。本明細書に記載されるように、特定の実施形態では、ＩＤＳ酵素、ＩＤＳ酵素バリアント、またはその触媒活性断片（集合的に「ＩＤＳアミノ酸配列」と称する）は、重鎖のＣ末端に連結され得る（すなわち、重鎖融合ポリペプチド）。抗体内の一方または両方の重鎖は、ＩＤＳアミノ酸配列に連結され得る。特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＩＤＳアミノ酸配列に連結された１つの重鎖を含む抗ＴｆＲ抗体を含む。特定の他の実施形態において、融合タンパク質は、両方の重鎖がそれぞれ独立してＩＤＳアミノ酸配列に連結されている抗ＴｆＲ抗体を含み得る。ＩＤＳ酵素、ＩＤＳ酵素バリアントまたはその触媒活性断片は、ペプチド結合またはポリペプチドリンカーによって抗ＴｆＲ抗体に連結され得る。

【0157】

本明細書で使用される「融合ポリペプチド」または「重鎖融合ポリペプチド」は、ＩＤＳ酵素、ＩＤＳ酵素バリアント、またはその触媒活性断片に連結された（例えば、融合した）重鎖アミノ酸配列を指す。重鎖融合ポリペプチドは、ペプチド結合またはポリペプチドリンカーによってＩＤＳ酵素、ＩＤＳ酵素バリアントまたはその触媒活性断片に連結され得る。

【0158】

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、交換可能に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞には、初代形質転換細胞及び継代の数に関わらずそれに由来する子孫を含む、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれる。子孫は、核酸含量において親細胞と完全に同一でない場合があるが、突然変異を含有し得る。元々形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する突然変異体子孫が、本明細書に含まれる。

【0159】

「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を所有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に除外する。

【0160】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免役グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を代表する、フレームワークである。一般に、ヒト免役グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列の下位集団から行われる。一般に、配列の下位集団は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３にあるような下位集団である。一実施形態において、ＶＬについて、下位集団は、上記のＫａｂａｔらにあるような下位集団カッパＩである。一実施形態において、ＶＨについて、下位集団は、上記のＫａｂａｔらにあるような下位集団ＩＩＩである。

【0161】

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含む、キメラ抗体を指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、そのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが、非ヒト抗体に対応し、そのＦＲの全てまたは実質的に全てが、ヒト抗体のそれらに対応する。ヒト化抗体は任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の、「ヒト化型」は、ヒト化を経た抗体を指す。

【0162】

「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列中で超可変であり、及び／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然４本鎖抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つはＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）中にあり、３つはＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）中にある。ＨＶＲは一般に、超可変ループからの及び／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、このうち後者が、配列可変性が最も高く、及び／または抗原認識に関与する。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）において生じる。（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）。）例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）は、アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５Ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）において生じる。（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）。）ＶＨ中のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原に接触する残基である、「特異性決定残基」または「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮型（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ）ＣＤＲ、またはａ－ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含有される。例となるａ－ＣＤＲ（ａ－ＣＤＲ－Ｌ１、ａ－ＣＤＲ－Ｌ２、ａ－ＣＤＲ－Ｌ３、ａ－ＣＤＲ－Ｈ１、ａ－ＣＤＲ－Ｈ２、及びａ－ＣＤＲ－Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１～３４、Ｌ２の５０～５５、Ｌ３の８９～９６、Ｈ１の３１～３５Ｂ、Ｈ２の５０～５８、及びＨ３の９５～１０２において生じる。（Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）参照）。別途指示されない限り、可変ドメインにおけるＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において上記のＫａｂａｔらに従って番号付けされる。

【0163】

２つ以上のポリペプチド配列との関連における「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、配列比較アルゴリズムを使用して、または手動アラインメント及び目視検査により測定した場合に、比較ウィンドウまたは指定された領域にわたり最大限一致するように比較及びアラインメントされた場合に、特定の領域にわたって、同一であるかまたは特定のパーセンテージ、例えば、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％以上同一であるアミノ酸残基を有する、２つ以上のポリペプチド配列または部分配列を指す。

【0164】

ポリペプチドの配列比較については、通常、１つのアミノ酸配列が候補配列と比較する参照配列として機能する。アラインメントは、当業者に利用可能な様々な方法、例えば、視覚によるアラインメントを用いて、または既知のアルゴリズムを用いた公開されているソフトウェアを用いて行い、最大のアラインメントを達成することができる。かかるプログラムとしては、ＢＬＡＳＴプログラム、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）が挙げられる。最大のアラインメントを達成するためにアラインメントに使用されるパラメータは、当業者によって決定され得る。本出願の目的で、ポリペプチド配列の配列比較に関しては、２種のタンパク質配列をデフォルトのパラメータで整列させるためのＢＬＡＳＴＰアルゴリズム標準タンパク質ＢＬＡＳＴが使用される。

【0165】

ポリペプチド配列における所与のアミノ酸残基の特定との関連で使用される場合の「～に対応する」、「～に準拠して決められる」、または「～に準拠してナンバリングされる」という表現は、該所与のアミノ酸配列が最大に整列され、特定の参照配列と比較される場合の該参照配列の残基の位置を指す。参照配列に整列されるポリペプチドは、該参照配列と同じ長さである必要はない。

【0166】

本明細書で使用される「イズロン酸スルファターゼ」、「イズロン酸－２－スルファターゼ」または「ＩＤＳ」は、グリコサミノグリカンヘパランスルフェート及びデルマタンスルフェートのリソソーム分解に関与する酵素であるイズロン酸２－スルファターゼ（ＥＣ ３．１．６．１３）を指す。ＩＤＳの欠損は、ハンター症候群としても知られるムコ多糖症ＩＩに関連する。本明細書で使用される「ＩＤＳ」または「ＩＤＳ酵素」という用語は、任意で抗ＴｆＲ抗体を含む融合タンパク質の成分として、触媒活性であり、野生型ＩＤＳ及び対立遺伝子及びスプライス変異体を含む機能的バリアント、ならびにその触媒活性断片を包含する。カノニカル配列と呼ばれるヒト配列であるヒトＩＤＳアイソフォームＩの配列は、ＵｎｉＰｒｏｔエントリーＰ２２３０４で入手可能であり、Ｘｑ２８でヒトＩＤＳ遺伝子によってコードされる。完全長配列は、配列番号１として示される。本明細書で使用される「成熟」ＩＤＳ配列は、天然に存在する完全長ポリペプチド鎖のシグナル及びプロペプチド配列を欠くポリペプチド鎖の形態を指す。成熟ヒトＩＤＳポリペプチドのアミノ酸配列は、完全長ヒト配列のアミノ酸３４～５５０に対応する配列番号２として示される。本明細書で使用される「切断型」ＩＤＳ配列は、天然に存在する完全長ポリペプチド鎖の触媒活性な断片を指す。例示的な切断型ヒトＩＤＳポリペプチドのアミノ酸配列は、完全長ヒト配列のアミノ酸２６～５５０に対応する配列番号３として示される。ヒトＩＤＳの構造は十分に特徴づけられている。例示的な構造はＰＤＢアクセッションコード５ＦＱＬの下で入手可能である。構造はＮａｔ．Ｃｏｍｍ．８：１５７８６ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５７８６，２０１７にも記載されている。チンパンジー（ＵｎｉＰｒｏｔエントリーＫ７ＢＫＶ４）及びアカゲザル（ＵｎｉＰｒｏｔエントリーＨ９ＦＴＸ２）を含む非ヒト霊長類ＩＤＳ配列も記載されている。マウスＩＤＳ配列は、ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＱ０８８９０で入手可能である。ＩＤＳバリアントは、例えば、同一の条件下でアッセイした場合、対応する野生型ＩＤＳまたはその断片の活性の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を有する。触媒活性ＩＤＳ断片は、例えば、同一の条件下でアッセイした場合、対応する完全長ＩＤＳまたはそのバリアントの活性の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を有する。

【0167】

「ＩＤＳ酵素バリアント」とは、野生型ＩＤＳ酵素またはその断片の機能的バリアント、例えば対立遺伝子バリアント及びスプライスバリアントを指し、ＩＤＳ酵素バリアントは、例えば、同一条件下でアッセイした場合、対応する野生型ＩＤＳ酵素またはその断片の活性の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を有する。

【0168】

「免疫コンジュゲート」は、１つ以上の異種性分子（複数可）にコンジュゲートされる抗体である。

【0169】

本明細書で互換的に使用される「個体」、「対象」、及び「患者」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、ラット、マウス及びモルモット）、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、及び他の哺乳動物種を含むがこれらに限定されない哺乳動物を指す。本明細書中に記載される特定の実施形態において、対象はヒト対象である。特定の実施形態では、対象は男性対象である。

【0170】

重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、無傷抗体には、異なる「クラス」が割り当てられ得る。無傷免疫グロブリン抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つの主要なクラスが存在し、これらのうちのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ_２にさらに分けられ得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元構成は、周知である。Ｉｇ形態には、ヒンジ修飾またはヒンジなし形態が含まれる（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３－４０９０、Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：７２４６－７２５６、ＵＳ ２００５／００４８５７２、ＵＳ ２００４／０２２９３１０）。

【0171】

「単離された」抗体とは、その天然環境の成分から分離された抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動法）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９０％、９５％または９９％を超える純度に精製される。抗体の純度の評価のための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。

【0172】

「単離された」核酸とは、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離核酸には、核酸分子を通常含有する細胞内に含有される核酸分子が含まれるが、その核酸分子は、染色体外に、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に、存在する。

【0173】

「抗ＴｆＲ抗体をコードする単離核酸」とは、抗体重鎖及び軽鎖（またはそれらの断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、単一のベクターまたは別個のベクター内のそのような核酸分子（複数可）を含み、そのような核酸分子（複数可）は、宿主細胞内の１つ以上の位置に存在する。

【0174】

本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する変異の可能性を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位を対象としている。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の抗体が混入することなく合成され得るという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本明細書に記載のモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５が初めて述べたハイブリドーマ法によって作製してもよく、または組換えＤＮＡ法（例えば、ＵＳ ４８１６５６７、ＵＳ ５８０７７１５を参照されたい）によって作製してもよい。モノクローナル抗体はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離し得る。

【0175】

本明細書におけるモノクローナル抗体には、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同である一方で、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびにそのような抗体の断片を具体的に含み、これは、それらが所望される生物活性を呈する限りにおいてである（ＵＳ ４８１６５６７、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５）。本明細書において対象となるキメラ抗体としては、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列と、ヒト定常領域配列とを含む、「霊長類化」抗体が挙げられる。

【0176】

本明細書で使用される場合、変異体ポリペプチドまたは変異体ポリヌクレオチドに関する「変異体」という用語は、「バリアント」と互換的に使用される。変異には、置換、挿入、及び欠失が含まれ得る。

【0177】

「天然抗体」は、様々な構造を有する、自然発生免役グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて定常軽（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの型うちの１つが割り当てられ得る。

【0178】

「患者から試料を得ること」、「患者から得られる」という用語及び同様の表現は、患者から直接試料を得ること、ならびに中間個体を介して患者から間接的に試料を得ること（例えば、患者から試料を得た看護師から試料を得た宅配業者から試料を得ること）を指すために使用される。

【0179】

「添付文書」という用語は、そのような製品の使用条件、適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌症についての情報、及び／またはその使用に関する警告を含有する、研究ツールまたは治療製品のパッケージに通例含まれる指示書を指すように使用される。

【0180】

「医薬製剤」という用語は、調製物の中に含有される活性成分の生物活性が有効になるような形態であり、製剤が投与されるであろう対象にとって許容できないほど有毒である追加の構成成分を何ら含有しない、調製物を指す。

【0181】

「薬学的に許容され得る賦形剤」という用語は、限定されないが、緩衝液、担体、または保存剤などの、ヒトまたは動物における使用に生物学的または薬理学的に適合する非活性薬学的成分を指す。

【0182】

「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は本明細書において互換的に使用され、単一鎖中のアミノ酸残基のポリマーを指す。用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び非天然に生じるアミノ酸ポリマーに適用される。アミノ酸ポリマーは、完全にＬ－アミノ酸、完全にＤ－アミノ酸、またはＬアミノ酸及びＤアミノ酸の混合物を含み得る。

【0183】

本明細書で使用する場合、「タンパク質」という用語は、単一鎖ポリペプチドの１つのポリペプチドまたは二量体（すなわち、２つ）または多量体（すなわち、３つ以上）のいずれかを指す。タンパク質の一本鎖ポリペプチドは、共有結合、例えば、ジスルフィド結合によって、または非共有相互作用によって結合され得る。

【0184】

「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、交換可能に、任意の長さのヌクレオチド鎖を指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、及び／またはそれらの類似体、あるいは、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによって鎖の中に組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。本明細書で企図されるポリヌクレオチドの例としては、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖ならびに二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡの混合物を有するハイブリッド分子が挙げられる。

【0185】

本明細書で使用する場合、「結合親和性」という用語は、２つの分子間、例えば、ポリペプチド上の単一の結合部位と、それが結合する標的、例えばトランスフェリン受容体との間の非共有結合相互作用の強さを指す。したがって、例えば、別段示されない限り、または文脈から明らかでない限り、この用語はポリペプチドとその標的との間の１：１の相互作用を指す場合がある。結合親和性は、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を測定することにより定量化することができ、これは、結合速度定数（ｋ_ａ、時間^－１Ｍ^－１）で除した解離速度定数（ｋ_ｄ、時間^－１）を指す。Ｋ_Ｄは、複合体形成及び解離の動態の測定、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）方法、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システム、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）などの結合平衡除外法アッセイ、及びＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ（登録商標）プラットフォームを使用する）を使用することによって決定され得る。本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、ポリペプチドとその標的との間の１：１の相互作用を反映するものなどの公式の結合親和性のみならず、強力な結合を反映し得るＫ_Ｄが算出される見かけの親和性も含む。

【0186】

本明細書で使用される場合、本明細書に記載のＴｆＲ結合抗体またはそのような抗体を含む融合タンパク質に言及する場合、標的、例えばＴｆＲに「特異的に結合する」または「選択的に結合する」という用語は、ＴｆＲ結合抗体または融合タンパク質が、構造的に異なる標的に結合するよりも高い親和性、高いアビディティー、及び／または高い持続時間で標的に結合する結合反応を指す。典型的な実施形態では、ＴｆＲ結合抗体または融合タンパク質は、同じ親和性アッセイ条件下でアッセイした場合、無関係の標的と比較して、特定の標的、例えばＴｆＲに対して少なくとも５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超える親和性を有する。本明細書で使用される場合、特定の標的（例えば、ＴｆＲ）に「特異的結合」、「特異的に結合すること」または「特異的である」という用語は、例えば、例えば１０^－４Ｍ以下、例えば１０^－５Ｍ、１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ、または１０^－１２Ｍの、それが結合する標的の平衡解離定数Ｋ_Ｄを有する分子によって示され得る。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合抗体または融合タンパク質は、種間で保存されている（例えば、種間で構造的に保存されている）、例えば、非ヒト霊長類とヒト種との間で保存されている（例えば、非ヒト霊長類とヒト種との間で構造的に保存されている）ＴｆＲ上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合抗体または融合タンパク質は、ヒトＴｆＲに排他的に結合し得る。

【0187】

本明細書で使用される、「トランスフェリン受容体」または「ＴｆＲ」とは、トランスフェリン受容体タンパク質１を指す。ヒトトランスフェリン受容体１ポリペプチド配列は、配列番号２６で規定される。他の種に由来するトランスフェリン受容体タンパク質１の配列も知られている（例えば、チンパンジー、アクセッション番号ＸＰ＿００３３１０２３８．１、アカゲザル、ＮＰ＿００１２４４２３２．１、イヌ、ＮＰ＿００１００３１１１．１、畜牛、ＮＰ＿００１１９３５０６．１、マウス、ＮＰ＿０３５７６８．１、ラット、ＮＰ＿０７３２０３．１、及びニワトリ、ＮＰ＿９９０５８７．１）。「トランスフェリン受容体」という用語はまた、例示的な参照配列、例えば、トランスフェリン受容体タンパク質１染色体座における遺伝子によってコードされるヒト配列の対立遺伝子バリアントも包含する。完全長トランスフェリン受容体タンパク質は、短いＮ末端細胞内領域、膜貫通領域、及び大きな細胞外ドメインを含む。細胞外ドメインは、３つのドメイン、すなわち、プロテアーゼ様ドメイン、ヘリカルドメイン、及びアピカルドメインによって特徴づけられる。ヒトトランスフェリン受容体１のアピカルドメイン配列は、配列番号２７に記載される。

【0188】

本明細書で使用されるとき、「治療」（及び「治療する」または「治療すること」などのその文法上の変形）とは、治療されている個体の自然経過を変更するための臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理過程中のいずれかに実施され得る。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的病理学的帰結の縮小、疾患進行速度の減少、病状の回復または寛解、及び緩解または予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。

【0189】

本明細書に開示される物質／分子の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する物質／分子の能力などの要因に従って変化し得る。治療有効量は、物質／分子の任意の毒性または有害作用に治療的に有益な作用が勝る量を包含する。「予防上有効な量」は、所望の予防結果を達成するために必要な用量及び期間に有効な量を指す。典型的であって必ずしもそうではないが、疾患の早期段階前または早期段階で予防用量が対象において用いられるため、予防上有効な量は、治療上有効な量よりも少ない。

【0190】

「形質転換」という用語は、遺伝的に安定な遺伝をもたらす、宿主細胞のゲノムへの核酸断片の移入を指す。形質転換された核酸断片を含む宿主細胞を「トランスジェニック」細胞と称し、トランスジェニック細胞を含む生物は「トランスジェニック生物」と称する。

【0191】

「形質転換された」、「トランスジェニック」及び「組換え」は、異種核酸分子が導入された宿主細胞または生物を指す。核酸分子は、当該技術分野で一般的に知られている方法を使用してゲノムに安定に組み込むことができる。ＰＣＲの公知の方法としては、ペアードプライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的ミスマッチプライマーなどを使用する方法が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、「形質転換された」、「形質転換体」及び「トランスジェニック」細胞は、形質転換プロセスを経ており、その染色体に組み込まれた外来遺伝子を含み得る。「非形質転換」という用語は、形質転換プロセスを経ていない正常細胞を指す。

【0192】

「トランスジェニック」生物は、発現ベクターを含む１つ以上の細胞を有する生物である。

【0193】

「可変領域」、「可変ドメイン」、「Ｖ領域」または「Ｖドメイン」という用語は、抗原への抗体の結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は一般に、同様の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えばＫｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい。）抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨまたはＶＬドメインで十分であり得る。さらに、抗原に結合する抗体からのＶＨまたはＶＬドメインを使用して、それぞれ、相補的ＶＬまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングして、特定の抗原に結合する抗体を単離してもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照されたい。

【0194】

「バリアント」ポリペプチドとは、天然タンパク質のＮ末端及び／またはＣ末端への１つ以上のアミノ酸の欠失（いわゆる切断）または付加、天然タンパク質の１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の欠失または付加、または天然タンパク質の１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の置換による天然タンパク質に由来するポリペプチドを意図する。そのようなバリアントは、例えば、遺伝子多型またはヒト操作から生じ得る。そのような操作のための方法は、当該技術分野で一般的に知られている。

【0195】

したがって、本明細書に記載されるポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断及び挿入を含む様々な方法で変更され得る。そのような操作のための方法は、当該技術分野において一般的に公知である。例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡ中の突然変異によって調製することができる。突然変異誘発及びヌクレオチド配列変更のための方法は、当該技術分野で周知である。

【0196】

「保存的置換」、「保存的変異」、または「保存的に修飾されたバリアント」という用語は、類似の特徴を有すると分類され得る別のアミノ酸でのアミノ酸の置換を生じる改変を指す。このようにして定義される保存的アミノ酸群の分類の例としては、Ｇｌｕ（グルタミン酸またはＥ）、Ａｓｐ（アスパラギン酸またはＤ）、Ａｓｎ（アスパラギンまたはＮ）、Ｇｌｎ（グルタミンまたはＱ）、Ｌｙｓ（リジンまたはＫ）、Ａｒｇ（アルギニンまたはＲ）、及びＨｉｓ（ヒスチジンまたはＨ）を含めた「荷電／極性群」、Ｐｈｅ（フェニルアラニンまたはＦ）、Ｔｙｒ（チロシンまたはＹ）、Ｔｒｐ（トリプトファンまたはＷ）、及び（ヒスチジンまたはＨ）を含めた「芳香族群」、ならびにＧｌｙ（グリシンまたはＧ）、Ａｌａ（アラニンまたはＡ）、Ｖａｌ（バリンまたはＶ）、Ｌｅｕ（ロイシンまたはＬ）、Ｉｌｅ（イソロイシンまたはＩ）、Ｍｅｔ（メチオニンまたはＭ）、Ｓｅｒ（セリンまたはＳ）、Ｔｈｒ（トレオニンまたはＴ）、及びＣｙｓ（システインまたはＣ）を含めた「脂肪族群」を挙げることができる。各群内で、下位群もまた識別され得る。例えば、荷電または極性アミノ酸の群は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓを含む「正に荷電した下位群」、Ｇｌｕ及びＡｓｐを含む「負に荷電した下位群」、ならびにＡｓｎ及びＧｌｎを含む「極性下位群」を含めた下位群に分割され得る。別の例では、該芳香族または環状群は、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、及びＴｒｐを含む「窒素環下位群」、ならびにＰｈｅ及びＴｙｒを含む「フェニル下位群」を含めた下位群に分割され得る。別のさらなる例では、該脂肪族群は、下位群、例えば、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、及びＡｌａを含む「脂肪族非極性下位群」ならびにＭｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＣｙｓを含む「脂肪族微極性下位群」に分割され得る。保存的変異の分類の例としては、上記下位群内のアミノ酸、例えば、限定されないが、正の荷電が維持され得るようにＬｙｓによるＡｒｇのアミノ酸置換、またはその逆、負の荷電が維持され得るように、ＧｌｕによるＡｓｐのアミノ酸置換、またはその逆、遊離の－ＯＨが維持され得るように、ＳｅｒによるＴｈｒのアミノ酸置換、またはその逆、及び遊離の－ＮＨ_２が維持され得るように、ＧｌｎによるＡｓｎのアミノ酸置換、またはその逆を含む。いくつかの実施形態では、疎水性アミノ酸は、天然に存在する疎水性アミノ酸で、例えば、活性部位を置き換え、疎水性を保存する。

【0197】

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を増殖することが可能な核酸分子を指す。この用語には、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびに導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。特定のベクターは、作動的に連結された核酸の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。

【0198】

「野生型」は、正常な遺伝子、またはいかなる既知の突然変異も有さずに自然界で見出される生物を指す。

【0199】

以下の実施例は、非限定的であることが意図される。

【実施例】

【0200】

実施例１：ＩｇＧ：ＩＤＳの構築
クローニング及びアーキテクチャ
ＩｇＧ：ＩＤＳ分子は、２つのＩＤＳ酵素に連結されたＴｆＲ抗体を含有する。１つのＩＤＳ酵素を、ペプチドリンカーによってＴｆＲ抗体重鎖の各Ｆｃ部のＣ末端に連結する（図１）。ＩｇＧ：ＩＤＳ中の抗体定常領域はヒトＩｇＧ１であった。重鎖ＩＤＳ配列は配列番号１７または配列番号１８で表され、軽鎖配列は配列番号５で表される。

【0201】

タンパク質発現
ＩｇＧ：ＩＤＳ構築物を、製造者の説明書に従ってＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の一過性トランスフェクションによって発現させた。培養物を、ＩｇＧ：ＩＤＳ（重鎖及び軽鎖）及びＳＵＭＦ１ ｃＤＮＡを２：２：１の比でコードするプラスミドで共トランスフェクションした。

【0202】

タンパク質精製
ＩｇＧ：ＩＤＳを、一連のクロマトグラフィー工程によって無血清ＣＨＯ培養物から均一になるまで精製した。ＩｇＧ：ＩＤＳを、プロテインＡ、続いてアニオン交換クロマトグラフィーを使用して親和性精製した。分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び／またはマイクロキャピラリー電気泳動及びＬＣＭＳによって評価されるように、高純度及び負に帯電した翻訳後修飾（ＰＴＭ）が比較的濃縮された（例えば、約１２～１９ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸：融合タンパク質）最終画分の両方をプールし、濃縮し、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５及び１３０ｍＭ ＮａＣｌに透析した。調製物を使用前に４℃または－８０℃で保存し、ＳＥＣ、比活性及びエンドトキシン含有量によって日常的に分析した。

【0203】

実施例２：ＩｇＧ：ＩＤＳの特性評価
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いたＫ_Ｄ決定
ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）に対するＩｇＧ：ＩＤＳの親和性を、以前に記載されたものと同様の二つの方法を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００装置での表面プラズモン共鳴によって決定した（Ｋａｒｉｏｌｉｓ ｅｔ ａｌ．２０２０．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １２（５４５）：ｅａａｙ１３５９）。方法１では、一価ＴｆＲ結合親和性を評価するために、ＩｇＧ：ＩＤＳをプロテインＡコーティングＢｉａｃｏｒｅ（商標）シリーズＳ ＣＭ５センサーチップ上に捕捉し、ｈＴｆＲのアピカルドメインの段階希釈物（ｈＴｆＲ^アピカル）を捕捉した試料上に注入した。方法２では、ＩｇＧ：ＩＤＳの見かけのｈＴｆＲ結合親和性を評価するために、ビオチン化完全長ｈＴｆＲをストレプトアビジンコーティングＣＭ５センサーチップに固定化した後、ＩｇＧ：ＩＤＳの段階希釈物を注入した。両方の方法について、単一サイクル速度論モードを試料注入（会合時間、９０秒、解離時間、６００秒）に使用し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアｖ３．０を使用して結合親和性を計算した。

【0204】

ＳＰＲを使用して、ＩｇＧ：ＩＤＳはＴｆＲに二価で結合することができ、受容体密度によって強く影響されることが観察された。ＩｇＧ：ＩＤＳは、ｈＴｆＲ^アピカルに対して２．６ｎＭの一価親和性及び完全長受容体に対して約１００ｐＭの見かけの親和性を有するとして測定した。

【0205】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＤＳ活性
ＩｇＧ：ＩＤＳの比活性を、前述のように人工基質を使用した二段階蛍光酵素アッセイで測定した（Ｕｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０２０．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １２（５４５）：ｅａａｙ １１６３）。簡潔に記載すると、４－メチルウンベリフェロン（脱離基）標準曲線を線形回帰によってフィッティングして生成物の量を計算し、全基質切断の１０％未満であることを確認した。比活性ｐｍｏｌ生成物／分／タンパク質ｍｇを計算した。

【0206】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイに基づいて、ＩｇＧ：ＩＤＳの比活性は非常に活性であり、約４４００ｐｍｏｌの生成物／分／タンパク質ｍｇと測定された（ｎ＝５の測定で平均）。

【0207】

マンノース－６－リン酸結合
ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬのヒトカチオン非依存性マンノース６－リン酸受容体（ｃｉＭ６ＰＲ、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１１７１７）の第９のドメインのＦｃ融合物で４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートを洗浄緩衝液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄し、ブロッキング緩衝液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０及び５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を各ウェルに添加した。ブロッキングは室温で１時間行った後、プレートを３回洗浄し、ＩｇＧ：ＩＤＳを２５ｎＭの濃度でプレートの第１のカラムに添加した。プレート全体で３倍段階希釈を行った。結合反応の一次インキュベーションを室温で１時間行った。結合後、プレートを３回洗浄し、試料緩衝液で０．０６２５μｇ／ｍＬに希釈したビオチン化抗ＩＤＳ抗体を用いて結合を検出した。プレートを検出抗体と共に室温で１時間インキュベートし、次いで３回洗浄した。次いで、試料緩衝液で１：５０，０００に希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰを各ウェルに添加した。プレートを室温で３０分間インキュベートし、次いで３回洗浄した。ＥＬＩＳＡを、ＴＭＢ試薬を使用して発色させた。ＥＬＩＳＡプレートをＨｉｇｈＲｅｓ ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダーで読み取り、４５０ｎｍでの吸光度を記録した。

【0208】

ＥＬＩＳＡ結合アッセイに基づくと、マンノース－６－リン酸受容体へのＩｇＧ：ＩＤＳの結合は、約５５～７６ｐＭのＥＣ５０と測定された。ＩｇＧ：ＩＤＳの代表的な結合曲線を図２に示す。

【0209】

実施例３：ＩｇＧ：ＩＤＳの薬物動態学的特性評価
細胞効力を評価するためのＳ^３５－スルフェート蓄積アッセイ
ＩｇＧ：ＩＤＳの細胞活性を、ＭＰＳ ＩＩ患者由来線維芽細胞において、^３５Ｓが新たに合成されたＧＡＧに組み込まれる^３５Ｓパルスチェースアッセイを使用して評価した（Ｕｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０２０．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １２（５４５）：ｅａａｙ１１６３）。ＭＰＳ ＩＩ患者（ＧＭ０１９２８、ＧＭ１２３６６、ＧＭ０１５８３）の初代線維芽細胞をＣｏｒｉｅｌｌから入手した。細胞Ｓ^３５蓄積アッセイは、Ｌｕ及び共著者（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２１：１５１－１５６）から改変した方法を使用して行った。簡潔に説明すると、線維芽細胞を９６ウェルプレートに２５，０００細胞／ウェルで播種し、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ高グルコース（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。３日間の培養後、培地を、１０％透析ウシ胎児血清及び４０ｍＣｉ／ｍＬ［Ｓ３５］硫酸ナトリウム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を補充した低スルフェートＦ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）と９６時間交換した。［Ｓ３５］硫酸ナトリウムのインキュベーション後、細胞をＩｇＧ：ＩＤＳで処理した。２４時間のインキュベーション後、培地を吸引し、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、０．０１Ｎ ＮａＯＨで溶解した。組み込まれたＳ３５をシンチレーションカウンティング（Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ）によって測定した。ＥＣ５０曲線を、対数（アゴニスト）ｖｓ応答、可変勾配（４つのパラメータ）フィットを使用してＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して作成した。

【0210】

ＩｇＧ：ＩＤＳは、このアッセイにおいて高活性であることが見出され、^３５Ｓ標識基質の蓄積を減少させ、細胞ＥＣ５０値は約１６ｐＭ～２３ｐＭの範囲であった（表１参照）。データは、ＩｇＧ：ＩＤＳが低ｐＭ範囲でＭＰＳ ＩＩ患者由来細胞において効果的に内在化され、基質蓄積が減少したことを示している。ＩｇＧ：ＩＤＳの代表的な細胞効力曲線（細胞株全体の平均）を図３に示す。

【0211】

【表1】

【0212】

マンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）及びシアル酸（ＳＡ）の液体クロマトグラフィー－質量分析
組換え精製ＩｇＧ：ＩＤＳタンパク質（５μｇ）を５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．２に緩衝液交換した。正規化された量のタンパク質を、内部標準として安定同位体標識（ＳＩＬ）^１３Ｃ_６マンノース－６－リン酸（ＳＩＬ－Ｍ６Ｐ、Ｏｍｉｃｒｏｎｂｉｏ Ｉｎｃ、カタログ番号、ＭＡＮ－０５、試料あたり６２．５ｎｇ）及び^１３Ｃ_３－シアル酸（ＳＩＬ－ＳＡ、Ｏｍｉｃｒｏｎｂｉｏ Ｉｎｃ、カタログ番号ＮＥＵ－００４、試料あたり２００ｎｇ）でスパイクし、次いで、分析のために加水分解または消化した。Ｍ６Ｐを、振とうしながら９０℃のヒーターブロックにおいて６．６Ｍトリフルオロ酢酸溶液１５０μＬを使用して９０分間タンパク質から加水分解した。次いで、高速真空試料をアセトニトリル（ＡＣＮ）で１回洗浄し、乾燥させた。ＡＣＮ：水（２０：８０、ｖ：ｖ）５０μＬに再懸濁した最終ペレットをＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。ＳＡを、ＳｉａｌＥＸＯ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｇｅｎｏｖｉｓ）によってタンパク質から消化した。簡潔に説明すると、タンパク質５μｇを２０ｎｇ／μＬのＳＩＬ－ＳＡ １０μＬと混合し、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）３μＬを添加し、ＭｉｌｉＱ水で６０μＬにし、次いでＳｉａｌＥＸＯ（１０単位／μＬ）１μＬを添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＳＡ試料をさらなるプロセスなしで注入した。

【0213】

Ｍ６Ｐ及びＳＡ分析は、ＵＶ／Ｖｉｓ及びＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐエレクトロスプレーイオン化質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＡ，ＵＳＡ）に連結されたＵＨＰＬＣ Ｖａｎｑｕｉｓｈ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＡ，ＵＳＡ）での液体クロマトグラフィーによって行った。試料をＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ １．７ｍｍ、２．１×１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に注入し、（Ａ）０．１％ギ酸を含む水及び（Ｂ）０．１％ギ酸を含むアセトニトリルの移動相を用いた負イオン化モード質量分析によって、６０％Ｂ、次いで１．８分で４２％Ｂから開始し、２．２分で１０％Ｂに低下させ、３分まで保持し、次いで６０％Ｂまで上昇させ、４．５分まで保持する４．５分勾配を使用して分析した。流量は０．４５ｍＬ／分であり、カラム温度は６０℃である。

【0214】

Ｍ６Ｐ及びＳＩＬ－Ｍ６Ｐ内部標準を含むネガティブモード下での並行反応モニタリング（ＰＲＭ）取得を使用してデータを収集した。包含リストは、Ｍ６Ｐ及びＳＩＬ－Ｍ６Ｐについてそれぞれ１．６～２．２分の２５９．０２２４及び２６５．０４２６（陰イオン）であり、ＳＡ及びＳＩＬ－ＳＡについて、それぞれ１．０～１．６分の３０８．０９９２及び３１１．１７５（陰イオン）である。Ｍ６Ｐ／ＳＩＬ－Ｍ６Ｐ及びＳＡ／ＳＩＬ－ＳＡのＡＵＣ比を用いて、Ｍ６Ｐ及びＳＡの分子量を算出し、Ｍ６Ｐ：タンパク質のｍｏｌ／ｍｏｌ及びＳＡ：タンパク質のｍｏｌ／ｍｏｌを求めた。

【0215】

ＩｇＧ：ＩＤＳの測定されたＭ６Ｐ含有量は、約１．５ｍｏｌ／ｍｏｌ～２．３ｍｏｌ／ｍｏｌのＭ６Ｐ：タンパク質の範囲であった。ＩｇＧ：ＩＤＳの測定されたシアル酸含有量は、ＳＡ：タンパク質の約１５～１６ｍｏｌ／ｍｏｌであった。

【0216】

実施例４：ＩｇＧ：ＩＤＳの投与は脳及びＣＳＦのＧＡＧをＩＤＳ ＫＯ、ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}マウスにおいて減少させる。
材料及び方法
動物の管理
マウスを１２時間の明／暗サイクル下で収容し、水及び標準的なげっ歯類飼料（ＬａｂＤｉｅｔ（登録商標）番号２５５０２、照射）を自由に摂取させた。

【0217】

マウス系統
以前に記載されたＢ６ＮバックグラウンドのＩｄｓ ＫＯマウスは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した（ＪＡＸ系統０２４７４４）。マウス受容体にノックされたヒトＴｆＲアピカルドメインを有するＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウス系統の開発及び特性決定は、以前に記載された（米国特許第１０，１４３，１８７号）。ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}雄マウスを雌のＩｄｓヘテロ接合マウスに交配して、Ｉｄｓ ＫＯ、ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウスを作製した。この試験で使用したマウスは全て雄であった。

【0218】

ＩｇＧ：ＩＤＳの薬物動態（ＰＫ）
２～３月齢のＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウス（ｎ＝３／群）に、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ体重のＩｇＧ：ＩＤＳを尾静脈を介して注射し、投与の０．５、４、８及び２４時間後に屠殺した。最終試料採取のために、動物を腹腔内（ｉ．ｐ．）２．５％Ａｖｅｒｔｉｎの注射を介して深く麻酔した。血清採取のために心臓穿刺を介して血液を採取し、室温で少なくとも３０分間凝固させた。次いで、チューブを、４℃で７分間、１２，７００ｒｐｍで遠心分離した。血清を新鮮なチューブに移し、ドライアイス上で急速凍結した。蠕動ポンプ（Ｇｉｌｓｏｎ Ｉｎｃ．Ｍｉｎｉｐｕｌｓ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて動物に氷冷ＰＢＳを経心的に灌流し、脳及び肝臓を解剖した。肝臓及び脳組織（５０ｍｇ）をドライアイス上で急速凍結し、以下に記載されるようにＩＤＳ／ＩＤＳ ＥＬＩＳＡのために調製した。

【0219】

ＰＫ分析のための組織調製
組織（５０ｍｇ）を、Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ ＩＩを使用して２７Ｈｚで３分間２回、３ｍｍステンレス鋼ビーズを用いて、組織重量で１０倍体積の冷１％ＮＰ４０溶解緩衝液（１０％ＮＰ－４０ Ｓｕｒｆａｃｔ－Ａｍｐｓ界面活性剤溶液１ｍＬ、１×ＰＢＳ ９ｍＬ、ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤１錠、ＰｈｏｓＳＴＯＰプロテアーゼ阻害剤１錠）中でホモジナイズした。次いで、ホモジネートを氷上で２０分間インキュベートし、４℃で２０分間１４，０００ｒｐｍで回転させた。得られた溶解物を単回使用アリコートに移し、－８０℃で保存した。

【0220】

ＩＤＳ：ＩＤＳ ＥＬＩＳＡ及びＰＫ分析
ＩｇＧ：ＩＤＳを、イズロン酸－２－スルファターゼサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して血清、肝臓溶解物及び脳溶解物において測定した。３８４ウェルマキシソーププレート（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号４６４７１８）を抗ＩＤＳ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＦ２４４９）で一晩コーティングし、翌日、カゼイン－ＰＢＳ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号３７５２８）でブロッキングした。ＩｇＧ：ＩＤＳを含有する試料をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。その後の洗浄後、ビオチン化抗ＩＤＳ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＡＦ２４４９）を添加して、固定化ＩｇＧ：ＩＤＳ及びＩｇＧ：ＩＤＳを捕捉した。次いで、ストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号０１６－０３０－０８４）を用いてＩＤＳサンドイッチを検出し、続いて、３，３’，５，５’テトラ－メチル－ベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号３４０２８）と共にインキュベートした。反応物を４Ｎ塩酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＳＳ０４）でクエンチし、プレートをプレート分光光度計で４５０ｎｍの吸光度波長で読み取った。ＴＭＢ発色は、試料中のＩｇＧ：ＩＤＳの濃度に正比例する。検量線は、０．００１３７ｎＭ～１ｎＭのアッセイ範囲で５パラメータロジスティックフィットを使用して作成した。ＩｇＧ：ＩＤＳの血清、肝臓及び脳への曝露は、Ｄｏｔｍａｔｉｃｓバージョン４．８（Ｂｉｓｈｏｐ’ｓ Ｓｔｏｒｔｆｏｒｄ，ＵＫ）のＶｏｒｔｅｘモジュールからのＮＣＡを用いて計算した。標準偏差を有する半対数線形グラフ及び表形式の結果をＰｒｉｓｍ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）でキュレートした。

【0221】

ＩｇＧ：ＩＤＳの薬力学
２～３月齢のＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩ（ｎ＝５／群）及びＩｄｓ ＫＯ、ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}マウス（ｎ＝５／群）に、０、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ体重のＩｇＧ：ＩＤＳの単回用量を尾静脈を介して投与し、投与の７日後に屠殺した。最終試料収集のために、動物を腹腔内２．５％Ａｖｅｒｔｉｎの注射を介して深く麻酔した。ＣＳＦ収集のために、動物の頭蓋骨の後部で矢状切開を行い、皮下組織及び筋肉を分離して大槽を露出させ、予め引張したガラス毛細管を使用して大槽を穿刺してＣＳＦを収集した。ＣＳＦをＬｏｗ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移し、４℃で１０分間遠心分離した。ＣＳＦを新鮮なチューブに移し、ドライアイス上で急速凍結した。４２０ｎｍでの試料の吸光度を測定することによって、マウスＣＳＦにおける血液汚染の欠如を確認した。血液、血清及び組織を上記のように得て、ドライアイス上で急速凍結した。

【0222】

薬力学的ＧＡＧ分析のための組織及び液体製剤
５０ｍｇの組織を、Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ ＩＩを使用して３０Ｈｚで３分間、７５０μＬの水中でホモジナイズした。ホモジネートを９６ウェル深プレートに移し、９６チップソニケーター（Ｑ Ｓｏｎｉｃａ）を用いて１０×１秒パルスで超音波処理した。超音波処理したホモジネートを２，５００ｘｇで４℃で３０分間回転させた。得られた溶解物を清浄な９６ウェル深プレートに移し、ＢＣＡを行って総タンパク質を定量化した。総タンパク質溶解物１０μｇまたはＣＳＦ ３μＬをその後のＨＳ／ＤＳ消化に使用した。消化を以下のようにＰＣＲプレート中で行った：ＨＳ及びＤＳの内部標準混合物（合計２０ｎｇ）を各試料に添加し、消化緩衝液中でヘパリナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びコンドリオチナーゼＢと、３０℃で振とうしながら３時間混合した。消化後、ＥＤＴＡを各試料に添加し、混合物を９５℃で１０分間沸騰させた。消化後の試料を５分間回転させ、セルロースアセテートフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＳＵＮ０３０１０）に移して５分間回転させた。得られたフロースルーをガラスバイアル中で等量のアセトニトリルと混合し、以下に記載されるように質量分析によって分析した。

【0223】

ＧＡＧの質量分析
ＧＡＧの定量化を、エレクトロスプレー質量分析（Ｓｃｉｅｘ ＱＴＲＡＰ ６５００＋，Ｓｃｉｅｘ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）に連結した液体クロマトグラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２システム、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ，ＵＳＡ）によって行った。それぞれの分析について、試料をＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ １．７ｍｍ，２．１×１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に流速０．５５ｍＬ／分、カラム温度５５℃で注入した。移動相Ａ及びＢは、それぞれ１０ｍＭギ酸アンモニウム及び０．１％ギ酸を含む水、ならびに０．１％ギ酸を含むアセトニトリルからなっていた。勾配を以下のようにプログラムした：８０％Ｂで０．０～０．５分、８０％Ｂから５０％Ｂまで０．５～３．５分、５０％Ｂから８０％Ｂまで３．５～４．０分、８０％Ｂで保持４．０～４．５分。エレクトロスプレーイオン化を、以下の設定を適用して陰イオンモードで実施した：カーテンガス２５、衝突ガスを中に設定、イオンスプレー電圧－４５００、温度６００℃、イオン源ガス１ ５０、イオン源ガス２ ６０。Ａｎａｌｙｓｔ １．６．３（Ｓｃｉｅｘ）を使用して多重反応モニタリングモード（ＭＲＭ）で、各種の滞留時間５０（ｍｓｅｃ）でデータ取得を行った。衝突エネルギー（ＣＥ）を－３０に設定、デクラスタリング電位（ＤＰ）を－８０、入射電位（ＥＰ）を－１０、衝突セル出口電位（ＣＸＰ）を－１０に設定した。以下のＭＲＭトランジションを使用して、ＧＡＧを［Ｍ－Ｈ］－として検出した：Ｄ０Ａ０ ｍ／ｚ ３７８．１＞８７．０、Ｄ０Ｓ０ ｍ／ｚ ４１６．１＞１３８．０、Ｄ０ａ４ ｍ／ｚ ４５８．１＞３００．０、Ｄ４ＵＡ－２Ｓ－ＧｌｃＮＣＯＥｔ－６Ｓ（Ｉｄｕｒｏｎ Ｌｔｄ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）ｍ／ｚ ４７２．０（ソースフラグメントイオン中）＞９７．０を内部標準として使用した。個々の二糖種を、市販の参照標準（Ｉｄｕｒｏｎ Ｌｔｄ）を使用して、その保持時間及びＭＲＭ転移に基づいて同定した。ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ ３．０．２（Ｓｃｉｅｘ）を用いて、内部標準に対するＤ０Ａ０（ＨＳ）、Ｄ０Ｓ０（ＨＳ）及びＤ０ａ４（ＤＳ／ＣＳ）のピーク面積比によりＧＡＧを定量化した。報告されたＧＡＧ量を、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定される総タンパク質レベルに対して正規化した。ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩ値に対する倍数を以下のように計算した：

【数1】

ビヒクル処理されたＩｄｓ ＫＯ、ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウスからの減少パーセントを以下のように計算した：

【数2】

【0224】

ヘパランスルフェート（ＨＳ）及びデルマタンスルフェート（ＤＳ）検量線
Ｄ０ａ４（ＤＳ／ＣＳ）、Ｄ０Ａ０（ＨＳ）、及びＤ０Ｓ０（ＨＳ）の純粋な標準をアセトニトリル：水５０／５０（ｖ／ｖ）に溶解して、１ｍｇ／ｍＬストックを生成した。ＰＢＳにおける８点希釈曲線を、０．１２ｎｇ～１０００ｎｇの範囲で作成した。続いて、内部標準Ｄ４ＵＡ－２Ｓ－ＧｌｃＮＣＯＥｔ－６Ｓ（２０ｎｇ）を各段階希釈液に添加した。次いで、試料を９５℃で１０分間煮沸し、次いで、回転させて粒子状物質をペレット化した。上清を、室温において３３６４ｘｇで５分間回転させることによって、３０ｋＤ ＭＷＣＯセルロースアセテートフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＳＵＮ０３０１０）を使用して濾過した。得られたフロースルーをガラスバイアル中で等量のアセトニトリルと混合し、上記のように質量分析によって分析した。

【0225】

結果
ＩｇＧ：ＩＤＳの薬物動態学的プロファイルを図４～図６に示す。ＩｇＧ：ＩＤＳの血清曝露を図４に示し、用量依存的効果を示す。ＩｇＧ：ＩＤＳ脳ＰＫプロファイルを図５に示し、最大濃度が投与後４～８時間で観察された。ＩｇＧ：ＩＤＳ肝臓ＰＫレベルを図６に示し、ＩｇＧ：ＩＤＳは良好な肝臓取込みを示した。

【0226】

薬力学的効果を調べるために、ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ} ＫＩマウスに１、３、または１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ：ＩＤＳの単回静脈内投与を行い、７日後に肝臓、ＣＳＦ、及び脳のＧＡＧレベル（総ＧＡＧレベル、ＨＳレベル、及びＤＳレベル）を評価した（図７～図９を参照されたい）。肝臓、ＣＳＦ及び脳におけるＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩ総ＧＡＧレベルの倍数を表２に示す。肝臓、ＣＳＦ及び脳におけるＩｄｓ ＫＯ、ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩ＋ビヒクル総ＧＡＧレベルからの減少パーセントを表３に示す。肝臓、ＣＳＦ及び脳におけるＩｄｓ ＫＯ、ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩ＋ビヒクルＨＳ及びＤＳレベルからの減少率パーセントをそれぞれ表４及び５に示す。

【0227】

【表2】

【0228】

【表3】

【0229】

【表4】

【0230】

【表5】

【0231】

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【表6-4】

【表6-5】

【表6-6】

【0232】

全ての刊行物、特許及び特許文献は、参照により個々に組み込まれるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、様々な特定の好ましい実施形態及び技術を参照して説明されている。しかしながら、本発明の主旨及び範囲内に留まりながら、多くの変形及び修正が行われ得ることを理解されたい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【配列表】

2024507118000001.app

【国際調査報告】