特表 2024-507126 細胞培養培地のｐＨを調整する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-16

(54)【発明の名称】細胞培養培地のｐＨを調整する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/00 20060101AFI20240208BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20240208BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240208BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240208BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20240208BHJP

   C12M 1/36 20060101ALI20240208BHJP

【ＦＩ】

C12N1/00 B

C12N5/071

C12P21/02 C

C12P21/08

C12M3/00 Z

C12M1/36

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023548244

(86)(22)【出願日】2022-02-11

(85)【翻訳文提出日】2023-10-03

(86)【国際出願番号】 US2022016113

(87)【国際公開番号】W WO2022174030

(87)【国際公開日】2022-08-18

(31)【優先権主張番号】63/149,169

(32)【優先日】2021-02-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＪＡＶＡ

２．ＰＹＴＨＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】517108181

【氏名又は名称】バイエル・ヘルスケア・エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】バルカルセル，アール・ロバート

(72)【発明者】

【氏名】ズオン，タム

【テーマコード（参考）】

4B029

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA02

4B029AA07

4B029BB11

4B029DF02

4B029DF04

4B064AG01

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC07

4B064CC09

4B064CC22

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BB32

4B065BC02

4B065BC07

4B065BD14

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

(57)【要約】

細胞培養培地のｐＨを調整するための方法、ｐＨ調整された細胞培養培地中で細胞を培養するための方法、およびｐＨ調整された細胞培養培地中で培養される細胞によって発現されるポリペプチドを製造するための方法が記載されている。また、所望のｐＨを得るために、どれだけの量の酸または塩基が細胞培養培地に添加されるべきかを決定するためのシステムも記載される。本方法は、細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度、細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率、細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度、および所望の培地ｐＨの間の関数関係に関するパラメータを含む電荷平衡モデルを含む。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞培養培地のｐＨを調整する方法であって：
細胞培養培地について、細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、及び細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度を得ること；
細胞培養培地に炭酸塩又は重炭酸塩を添加することで細胞培養培地中の所望の炭酸塩又は重炭酸塩の濃度を得ること；及び
電荷平衡モデルを用いて、細胞培養培地のｐＨを所望のｐＨに調整するために細胞培養培地に添加されるべき強酸又は強塩基の量を決定することを含み、ここで、前記電荷平衡モデルが、少なくとも細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度、細胞培養培地中の所望の炭酸塩又は重炭酸塩の濃度、及び所望のｐＨに基づく、前記方法。

【請求項2】

決定された量の強酸又は強塩基を細胞培養培地に添加し、それによってｐＨ調整された細胞培養培地を作製することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記炭酸塩又は重炭酸塩が、炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウムである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

細胞培養培地に１つ以上のイオン性化合物を補充することをさらに含み、ここで、前記電荷平衡モデルが、１つ以上のイオン性化合物の濃度にさらに基づく、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記１つ以上のイオン性化合物が、１つ以上のアミノ酸又は塩化アンモニウムを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記１つ以上のアミノ酸が、グルタミン、アスパラギン、又はグルタミン酸を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記強塩基が水酸化ナトリウムである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記強酸が塩酸である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記電荷平衡モデルが、下記式によって定義される：

【数1】

式中：
［Ｎａ^＋］は、水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、又は炭酸ナトリウムとして細胞培養培地に添加されたナトリウムイオンの濃度であり；
［Ｈ^＋］は、所望のｐＨを得るために必要な細胞培養培地中のプロトンの濃度であり；
［ＯＨ^－］は、細胞培養培地中の水酸化物アニオンの濃度であり；
［ＮＭＡ^－］は、細胞培養培地中の正味の培地中の酸イオンの濃度であり；
［Ａ^－］は、細胞培養培地に添加された負に帯電したイオンの濃度であり、それらの電荷の絶対値を乗じたものであり、任意のＯＨ^－又は［ＮＭＡ－］に含まれる負に帯電したイオンを除いている；及び
［Ｂ^＋］は、細胞培養培地に添加された正に帯電したイオンの濃度に、それらの電荷の絶対値を乗じたものであり、任意のＨ^＋、［Ｎａ^＋］に含まれるナトリウムイオン、又は［ＮＭＡ－］に含まれる正に帯電したイオンを除いたものである、
請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

下記式を満たし、

【数2】

式中：
Ｋ_０、Ｋ_１、及びＫ_２は、重炭酸塩及び炭酸塩アニオンの解離定数であり；
Ｐは、細胞培養培地に適用されている気体圧力であり；
ｙＣＯ_２は、細胞培養培地に適用されているＣＯ_２気相のモル百分率であり；及び
ｍ及びＫ_Ｈはそれぞれ、細胞培養培地について経験的に決定されるパラメータである
である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度が、細胞培養培地のｐＨの関数として、前記電荷平衡モデルにおいてモデル化される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度が、細胞培養培地のｐＨと線形関係でモデル化される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度が以下のようにモデル化される：

【数3】

式中：
［ＮＭＡ^－］は、細胞培養培地中の正味の培地中の酸イオンの濃度であり；及び
Ｃ_０ｐ及びＣ_１ｐはそれぞれ、細胞培養培地について経験的に決定される定数である、
請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度が、温度の関数として電荷平衡モデルにおいてモデル化される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度が、ｐＨ及び温度の関数として電荷平衡モデルにおいてモデル化される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記電荷平衡モデルのために前記関数関係及び正味の培地中の酸濃度を得ることが、前記関数関係及び細胞培養培地の正味の培地中の酸濃度を経験的に決定することを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記関数関係及び細胞培養培地の正味の培地中の酸濃度を経験的に決定することが：
異なる気体状二酸化炭素レベルで平衡化され、異なる量の添加された強酸又は強塩基を含有する細胞培養培地の複数の条件についてｐＨデータを測定すること；及び
測定されたｐＨデータを用いて電荷平衡モデルに適合させること
を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

ｐＨデータを測定する前に、所望の培養温度において複数の条件で細胞培養培地を平衡化することを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記所望の培養温度が、約３５℃～約４０℃である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

細胞培養培地が室温で調製される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

所望の炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウムの濃度が、約１．５ｇ／Ｌ～約２ｇ／Ｌである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

細胞を培養する方法であって：
請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法に従って、細胞培養培地のｐＨを調整すること；及び
ｐＨ調整された細胞培養培地で細胞を培養すること
を含む、前記方法。

【請求項23】

前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項２２又は２３に記載の方法。

【請求項25】

前記細胞が、約３５℃～約４０℃において細胞培養培地中で培養される、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記細胞が、約０．１％～約２０％モル分率のＣＯ_２下で、細胞培養培地中で培養される、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記細胞が、組換えポリペプチドをコードする核酸分子を含む、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

組換えポリペプチドを製造する方法であって：
請求項２７に記載の方法に従って細胞を培養すること；及び
ｐＨ調整された細胞培養培地中で組換えポリペプチドを産生すること
を含む、前記方法。

【請求項29】

前記組換えポリペプチドが、抗体又はそのフラグメントである、請求項２７又は２８に記載の方法。

【請求項30】

システムであって、以下を備え：
１つ以上のプロセッサ；及び
前記１つ以上のプロセッサに通信可能に結合されるとともに、システムに行わせる命令を記憶するように構成されるメモリー、ここで前記命令が前記１つ以上のプロセッサによって実行されるときに、前記命令により前記システムは：
１つ以上のプロセッサにおいて、細胞培養培地について、細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係を示す１つ以上のパラメータ、及び細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度を示す正味の培地中の酸のパラメータを受信し；
１つ以上のプロセッサにおいて、細胞培養培地中の所望の炭酸塩又は重炭酸塩の濃度を示す炭酸塩又は重炭酸塩のパラメータを受信し；
１つ以上のプロセッサにおいて、細胞培養培地の所望のｐＨを示すｐＨパラメータを受信し；さらに
電荷平衡モデルを使用して、細胞培養培地のｐＨを所望のｐＨに調整するために細胞培養培地に添加されるべき強酸又は強塩基の量を決定する、ここで、前記電荷平衡モデルが、少なくとも細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度、細胞培養培地中の所望の炭酸塩又は重炭酸塩の濃度、及び所望のｐＨに基づく、
前記システム。

【請求項31】

ポリペプチドを発現する宿主細胞中でポリペプチドを製造する方法であって、細胞培養培地中で宿主細胞を培養することを含み、これは重炭酸ナトリウムを用いて細胞培養培地を調製することで前記培地のｐＨを厳密に制御することによって行われ、さらに以下を含む：
レシピを定義するために細胞培養培地に添加されるべき添加剤及び相対量を決定すること；
レシピを使用して溶液を調製し、さらに溶液のｐＨを決定することで第１のデータセットを定義すること；
溶液をＣＯ_２ガス化及び撹拌がされるバイオリアクター中に配置し、さらにそれを平衡化することで生じるｐＨ及びｐＣＯ２の値を決定し、第２のデータセットを定義すること；
溶液を定義された温度及びモル％ＣＯ_２のインキュベーター中に配置し、さらにｐＨ及びｐＣＯ_２の測定値を決定することで第３のデータセットを定義すること；
第１、第２、及び第３のデータセット並びに以下のｐＨモデルを使用することで：

【数4】

ｍ、ｓ、及び正味の培地中の酸のパラメータ値を同時に解くこと、ここで以下を最小化することにより行う：

【数5】

細胞培養培地のための目標ｐＨを定義し、さらにそのｐＨ等量となるようにｐＨモデルから決定される適切な濃度の塩基を細胞培養培地に添加することで、細胞培養培地のｐＨが厳密に制御されること；並びに
ポリペプチドを産生すること、
方法。

【請求項32】

浸透圧を維持するために塩が前記溶液に添加される、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記添加剤が、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、及び水酸化ナトリウムからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

前記培地が、３６．５℃及び５％ＣＯ_２でインキュベーター中に配置される、請求項３３記載の方法。

【請求項35】

細胞培養培地が室温で調製される、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

細胞培養培地のｐＨが、予想されるｐＨ値の０．００５標準偏差以内である、請求項３１に記載の方法。

【請求項37】

細胞培養培地のｐＨが、７．２７２±０．００５である、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記方法が自動化されている、請求項３１に記載の方法。

【請求項39】

前記方法が、バッチ供給プロセスで実施される、請求項３１に記載の方法。

【請求項40】

前記方法は、工業生産の規模で適用可能であり、各生産規模において頑健性が確保される、請求項３１に記載の方法。

【請求項41】

前記方法が、培地の開発又は研究中に、異なるアミノ酸添加剤を含む複数の溶液の高品質な比較を確実にするために適用可能である、請求項３１に記載の方法。

【請求項42】

前記方法が、振盪フラスコなどの小規模システムに適用可能である、請求項３１に記載の方法。

【請求項43】

ポリペプチドを発現する宿主細胞中で該ポリペプチドを製造する方法であって、宿主細胞の培養をこの培養物の産生期中にグルタミンを含まない産生培養培地中ですることを含み、さらに以下を含む：
７．５ｍＭ～１５ｍＭの範囲の濃度で細胞培養培地にアスパラギンを添加すること；
１ｍＭ～１０ｍＭの範囲の濃度で細胞培養培地にアスパラギン酸を添加すること；
細胞培養培地に塩を添加すること；
細胞培養培地に添加されるべき添加剤及び相対量を決定することでレシピを定義すること；
レシピを用いて溶液を調製し、さらに溶液のｐＨを決定することで第１のデータセットを定義すること；
溶液をＣＯ_２ガス化され撹拌されているバイオリアクター中に配置し、さらに生じるｐＨ及びｐＣＯ_２値を決定するためにそれを平衡化させることで第２のデータセットを定義すること；
前記溶液を所定の温度及びモル％ＣＯ_２のインキュベーター内に配置し、さらにｐＨ及びｐＣＯ_２の測定値を決定することで第３のデータセットを定義すること；
第１、第２、及び第３のデータセット並びに以下のｐＨモデルを使用することで：

【数6】

ｍ、ｓ、及び正味の培地中の酸のパラメータ値を同時に解くこと、ここで以下を最小化することにより行う：

【数7】

細胞培養培地のための目標ｐＨを定義し、さらにそのｐＨ等量となるようにｐＨモデルから決定される適切な濃度の塩基を細胞培養培地に添加することで、細胞培養培地のｐＨを厳密が制御されること；及び
ポリペプチドを産生すること、
方法。

【請求項44】

前記ポリペプチドを単離する工程をさらに含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記産生期が、バッチ又はフェドバッチ培養期である、請求項４３記載の方法。

【請求項46】

前記産生培養培地が無血清である、請求項４３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年２月１２日に出願された米国仮出願第６３／１４９，１６９号の優先権および利益を主張し、これは、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本明細書には、細胞培養培地などの溶液のｐＨを調整する方法が記載されている。また、細胞を培養し、細胞培養培地中で培養さている細胞からポリペプチドを発現させる方法を含む、ｐＨ調整された細胞培養培地を使用する方法も記載されている。さらに、細胞培養培地などの溶液のｐＨをどのように調整すべきかを決定するためのシステムが記載されている。

【背景技術】

【0003】

過去数十年にわたって、哺乳動物細胞培養物は、多くの貴重なバイオ医薬品生物製剤を製造するために使用されてきた。これらは、モノクローナル抗体、治療用タンパク質、およびワクチンを含む、生細胞から作製される複雑な医薬である。伝統的に、バイオ医薬品は、その治療用途に必要とされる全ての製品品質基準を首尾よく満たした後に市場に放出される。しかしながら、ますます多くの複雑な生物製剤は、「最終製品試験」によって完全に特徴づけることができないので、生産プロセスのはるかに徹底的な検証の必要性が追加されている。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、この文脈においてクオリティ・バイ・デザイン（Ｑｕａｌｉｔｙ ｂｙ Ｄｅｓｉｇｎ）（ＱｂＤ）を導入し、ここで、増大した科学的知識ベースに基づいて、特定の目的を満たし、製造中の潜在的なリスクを軽減するために、品質基準が製品およびプロセスの両方に組み込まれる。調和国際会議、ＩＣＨ調和三者ガイドライン：製剤開発Ｑ８（Ｒ２）（２００９年８月）を参照されたい。ＱｂＤは、重要工程パラメータ（ＣＰＰ）と、その重要品質特性（ＣＱＡ）および業績評価指標（ＫＰＩ）への影響を識別することから始まる。複雑な製造プロセスがかなりのばらつきを含むことを考慮すると、必要とされる製品ＣＱＡを効果的に得る条件の範囲を定義するために、ＣＰＰとＣＱＡおよびＫＰＩとの間の関係を決定する実験が実行される。これまで固定されていたプロセスであったものではなく、このより進んだ手法は、最終製品品質に対する制御の向上を得るために、プロセス分析技術からのフィードバックを利用することに基づくことを含む、設計空間内での調整を可能にすることを意図している。これは、承認後のプロセスの変更を減らし、バイオ医薬品会社の規制の柔軟性を高め、一方で、治療薬の安全性、同一性、純度および効力を確保するはずである。Ｃａｌｃｏｔｔ、「Ｈｏｗ ＱｂＤ ａｎｄ ｔｈｅ ＦＤＡ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ａｆｆｅｃｔ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ」、ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２０１１）を参照されたい。

【0004】

統計的実験計画法（ＤＯＥ）は、哺乳動物細胞培養プロセスにおける組換えタンパク質産生にＱｂＤ概念を適用することの一部として広く使用されている。Ｈｏｒｖａｔｈら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｑｕａｌｉｔｙ ｂｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第４５巻、２０３－２０６頁（２０１０）；Ｋｉｍら、「Ａｐｐｌｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｑｕａｌｉｔｙ ｂｙ Ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ Ｒｏｂｕｓｔ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｐａｃｅ Ｄｅｆｉｎｅ ｆｏｒ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｓｓ」、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｏｒｅａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、第４０巻、第１０号、１００２－１０１２頁（２０１９）；Ｎａｇａｓｈｉｍａら、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｑｕａｌｉｔｙ ｂｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｐａｃｅ」、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１０２巻、第１２号、４２７４－４２８３頁（２０１３）；およびＲｏｕｉｌｌｅｒら、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｑｕａｌｉｔｙ ｂｙ Ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ａｎ Ｆｃ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、第８１巻、第２号、４２６－４３７頁（２０１２）を参照されたい。これらの研究は、ｐＨを、細胞増殖、生産性、および製品品質に著しい影響を与える、最も重要なＣＰＰの１つとして報告した。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞では、ｐＨ６．８５よりもｐＨ７．２で２倍高い増殖速度が報告された。Ｙｏｏｎら、「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｐＨ ｏｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ Ｃｅｌｌｓ Ｇｒｏｗｎ ｉｎ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ａｔ ３２．５ ａｎｄ ３７．０ ｄｅｇｒｅｅｓ Ｃ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第８９巻、第３号、３４５－３５６頁（２００５）を参照されたい。同様に、ヒトＰＥＲ．Ｃ６細胞増殖は、ｐＨ７．１～７．６の範囲では影響を受けなかったが、ｐＨ６．８では有意な遅延およびより低い増殖速度があった。Ｘｉｅら、「Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標） Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｕｎｄｅｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第８０巻、第５号、５６９－５７９頁（２００２）を参照されたい。ｐＨのこれらの影響は、幹細胞培養の分野にまで及んでおり、報告されている培養前駆体の収率は、投入培地のｐＨが７．３から７．０に減少したときに２倍を超えて減少した。Ｃｈａｕｄｈｒｙら、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｐＨ ａｎｄ Ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ Ｙｉｅｌｄｓ ｏｆ Ｍｕｒｉｎｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊ．第４５巻、第２号、１２６－１３５頁（２００９）；Ｔｅｏら、「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｐＨ ｏｎ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｒｄｉａｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｒｉｎｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊ．第９０巻、８－１５頁（２０１４）を参照されたい。したがって、これらの研究は、十分に理解された設計空間を確立するための実験中に、ｐＨのわずかな差異に見えることが、多くの細胞型にいかに有意な影響を与えるかを強調する。特に、組換えタンパク質の産生、細胞代謝、およびタンパク質のグリコシル化に対するｐＨの実質的な効果は、文献に広く記載されている。Ｂｏｒｙｓら、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｐＨ Ａｆｆｅｃｔｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｒａｔｅｓ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｏｕｓｅ Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｌａｃｔｏｇｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ （ＣＨＯ） Ｃｅｌｌｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１１巻、７２０－７２４頁（１９９３）；Ｄｅ Ｊｅｓｕｓら、「Ｔｈｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐＨ ｏｎ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔｗｏ ＣＨＯ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ Ｒｈ Ｄ ＩｇＧ」：Ｌｉｎｄｎｅｒ－Ｏｌｓｓｏｎ Ｅ．、Ｃｈａｔｚｉｓｓａｖｉｄｏｕ Ｎ．、Ｌｕｅｌｌａｕ Ｅ．（編集）Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ Ｔａｒｇｅｔ ｔｏ Ｍａｒｋｅｔ，ＥＳＡＣＴ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、第１巻、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈ（２００１）中；Ｋｕｒａｎｏら、「Ｇｒｏｗｔｈ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｌｏｏｐ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ：１．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１５巻、１０１－１１頁（１９９０）；Ｌｉｎｋら、「Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＭＵＣ１ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ＣＨＯ－Ｋ１ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ」、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１１０巻、第１号、５１－６２頁（２００４）；Ｍｉｌｌｅｒら、「Ａ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｂａｔｃｈ ａｎｄ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｒａｔｅ，ａｎｄ ｐＨ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第３２巻、第８号、９４７－９６５頁（１９８８）；Ｔｒｕｍｍｅｒら、「Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｓｈｉｆｔｉｎｇ：Ｐａｒｔ Ｉ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＤＯＴ，ｐＨ，ａｎｄ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ Ｅｐｏ－Ｆｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＣＨＯ Ｃｅｌｌｓ Ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｂａｔｃｈ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第９４巻、第６号、１０３３－１０４４頁（２００６）；Ｚａｎｇｈｉら、「Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ ａｒｅ Ｋｅｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＣＨＯ Ｃｅｌｌ Ｐｏｌｙｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ Ｕｎｄｅｒ Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐＣＯ_２ ｏｒ ｐＨ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第６５巻、第２号、１８２－１９１頁（１９９９）を参照されたい。

【0005】

緩衝剤の添加は、細胞培養中のｐＨの変動を制御するために使用され、これはプロセス開発において最初に一般的に使用されるハイスループットのマルチウェル培養にとって特に重要である。この目的のために、二酸化炭素（ＣＯ_２）／重炭酸塩（ＨＣＯ_３ ^－）緩衝系が日常的に使用される。重炭酸ナトリウムで調合された新鮮な培地では、液相中のＨＣＯ_３ ^－と溶解ＣＯ_２との間で平衡に達し、後者は、気相中のＣＯ_２レベルとも平衡に達する。乳酸およびＣＯ_２ならびに他の酸性および塩基性種を産生する代謝の際に、培養物のｐＨは、気相へのまたは気相からのＣＯ_２の移動によって緩衝される。高細胞濃度でＣＯ_２が高レベルに蓄積する場合を除き（Ｇｏｕｄａｒら、「Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｐＣＯ_２ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｔｏ Ｈｉｇｈ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第９６巻、第６号、１１０７－１１１７頁（２００６）；Ｔａｋｕｍａら、「Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｎ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐＣＯ_２ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｎ ＣＨＯ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ＩｇＧ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第９７巻、第６号、１４７９－１４８８頁（２００７）を参照されたい）、重炭酸ナトリウムの使用は、細胞またはその産物の生理に悪影響を及ぼさず、したがって、哺乳動物細胞培養のために広く使用される緩衝剤である。

【0006】

それにもかかわらず、重炭酸ナトリウムの使用は、その緩衝作用が気相ＣＯ_２濃度に依存するので、その落とし穴を有し、そのため、ＣＯ_２脱気がｐＨを上昇させるので、ｐＨオフラインを分析するときに注意を払う必要がある。低雰囲気ＣＯ_２濃度によるＣＯ_２脱気のこの問題は、通常、大気条件下の開放環境中で行われるので、細胞培養培地の調製中にも問題を引き起こす。培地の調製中に生じるｐＨの連続的な上昇は、全ての培地のｐＨを一致させるための多くの滴定を含む、ＤＯＥ調査のために多くの異なる培養培地を調製する必要がある場合に、複雑な問題となる。また、この培地の調製は、通常、室温で行われ、一方、細胞培養工程は３７℃に近い。ｐＨも温度依存性であるので、室温で目標ｐＨを達成するために必要な塩基／酸の量は、より高い培養温度では同等のｐＨをもたらさない。
［０００７］
細胞培養培地およびフィードの配合は、細胞培養プロセス開発における重要なステップである。ハイスループット技術は、複数の成分を有する複数の配合物を同時にスクリーニングすることの加速を可能にした。Ｂｒｕｅｈｌｍａｎｎら、「Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｑｕａｌｉｔｙ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１１４巻、第７号、１４４８－１４５８頁（２０１７）；Ｌｅｅら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｂｙ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６９巻、８５－９３頁（１９９９）；Ｊｏｒｄａｎら、「Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｂｙ Ｒｉｇｏｒｏｕｓ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｅｄｉａ Ｂｌｅｎｄｉｎｇ」、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６５巻、第１号、３１－４０頁（２０１３）；Ｒｏｕｉｌｌｅｒら、「Ａ Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｍｅｄｉａ Ｄｅｓｉｇｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｆｅｄ－Ｂａｔｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ」、ＭＡｂｓ、第５巻、第３号、５０１－５１１頁（２０１３）；Ｓａｎｄａｄｉら、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ Ｆａｃｔｏｒｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎｓ ｔｏ Ｓｃｒｅｅｎ Ａｃｔｉｖｅ Ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ Ｃｅｌｌｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、第２２巻、第２号、５９５－６００頁（２００６）を参照されたい。これらの実験は十分に設計されたが、それらは平行培養物のｐＨにおけるいかなる変動も最小限にするために、さまざまな配合物がどのように調製されたかについては言及しなかった。ＣＯ_２脱気に関する問題に加えて、いくつかの成分の追加は、これらの配合物のｐＨを変化させ得る。例えば、ほとんどのアミノ酸は生理学的ｐＨでは荷電していないが、それらのカチオンおよびアニオンへの不均等な解離は依然として、溶液中の種の全荷電のわずかな変化をもたらし得、したがって、ｐＨのわずかな差をもたらす。この差は、グルタミン酸またはアスパラギン酸などの生理的ｐＨで荷電したアミノ酸の場合により大きい。滴定プロセスは多くの場合、全ての培地のｐＨを一致させるために使用されるが、これは複数の溶液を一度に使用する場合、より多くの時間を要し、ポリペプチドを発現させるための上記のような重炭酸塩で緩衝された培地を使用する場合の課題に対処しない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｃａｌｃｏｔｔ、ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２０１１）

【非特許文献2】Ｈｏｒｖａｔｈら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第４５巻、２０３－２０６頁（２０１０）

【非特許文献3】Ｋｉｍら、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｏｒｅａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、第４０巻、第１０号、１００２－１０１２頁（２０１９）

【非特許文献4】Ｎａｇａｓｈｉｍａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１０２巻、第１２号、４２７４－４２８３頁（２０１３）

【非特許文献5】Ｒｏｕｉｌｌｅｒら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、第８１巻、第２号、４２６－４３７頁（２０１２）

【非特許文献6】Ｙｏｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第８９巻、第３号、３４５－３５６頁（２００５）

【非特許文献7】Ｘｉｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第８０巻、第５号、５６９－５７９頁（２００２）

【非特許文献8】Ｃｈａｕｄｈｒｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊ．第４５巻、第２号、１２６－１３５頁（２００９）

【非特許文献9】Ｔｅｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊ．第９０巻、８－１５頁（２０１４）

【非特許文献10】Ｃｈａｕｄｈｒｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊ．第４５巻、第２号、１２６－１３５頁（２００９）

【非特許文献11】Ｔｅｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊ．第９０巻、８－１５頁（２０１４）

【非特許文献12】Ｂｏｒｙｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１１巻、７２０－７２４頁（１９９３）

【非特許文献13】Ｄｅ Ｊｅｓｕｓら、Ｌｉｎｄｎｅｒ－Ｏｌｓｓｏｎ Ｅ．、Ｃｈａｔｚｉｓｓａｖｉｄｏｕ Ｎ．、Ｌｕｅｌｌａｕ Ｅ．（編集）Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ Ｔａｒｇｅｔ ｔｏ Ｍａｒｋｅｔ，ＥＳＡＣＴ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、第１巻、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈ（２００１）中

【非特許文献14】Ｋｕｒａｎｏら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１５巻、１０１－１１頁（１９９０）

【非特許文献15】Ｌｉｎｋら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１１０巻、第１号、５１－６２頁（２００４）

【非特許文献16】Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第３２巻、第８号、９４７－９６５頁（１９８８）

【非特許文献17】Ｔｒｕｍｍｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第９４巻、第６号、１０３３－１０４４頁（２００６）

【非特許文献18】Ｚａｎｇｈｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第６５巻、第２号、１８２－１９１頁（１９９９）

【非特許文献19】Ｇｏｕｄａｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第９６巻、第６号、１１０７－１１１７頁（２００６）

【非特許文献20】Ｔａｋｕｍａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第９７巻、第６号、１４７９－１４８８頁（２００７）

【非特許文献21】Ｂｒｕｅｈｌｍａｎｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１１４巻、第７号、１４４８－１４５８頁（２０１７）

【非特許文献22】Ｌｅｅら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６９巻、８５－９３頁（１９９９）

【非特許文献23】Ｊｏｒｄａｎら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６５巻、第１号、３１－４０頁（２０１３）

【非特許文献24】Ｒｏｕｉｌｌｅｒら、ＭＡｂｓ、第５巻、第３号、５０１－５１１頁（２０１３）

【非特許文献25】Ｓａｎｄａｄｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、第２２巻、第２号、５９５－６００頁（２００６）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

したがって、複数の培地配合物の組み立てを容易にし、培養環境条件下での培地ｐＨの精度および制御を向上させるために、室温でのｐＨ測定に依存しない培地配合物に対する半経験的モデルに基づくアプローチが必要とされている。

【0009】

さらに、ポリペプチドを産生する細胞のためのアミノ酸の異なる組み合わせを有する異なる細胞培養培地を生成するために、滴定プロセスの助けなしに所望のｐＨを達成するために必要とされる塩基／酸添加の量を規定するモデルが必要である。

【0010】

さらに、塩で緩衝された培地のｐＨを予測するだけでなく、滴定プロセスの助けなしに所望のｐＨを達成するために必要な塩基／酸の正確な量を規定するためのｐＨモデルおよび方法を提供する必要がある。

【0011】

さらに、培地調製およびポリペプチド発現プロセスの間のＣＯ_２発生および温度差による課題に対処する、アミノ酸の異なる組合せを有する様々な異なる細胞培養培地を作製するための方法またはプロセスが必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0012】

細胞培養培地などの溶液のｐＨを調整するための方法、ｐＨ調整された細胞培養培地中で細胞を培養するための方法、およびｐＨ調整された細胞培養培地中で培養さている細胞によって発現されるポリペプチドを作製するための方法が、本明細書に記載される。

【0013】

細胞培養培地のｐＨを調整する方法は、細胞培養培地について、細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、および細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度を取得すること；細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度を得るために、細胞培養培地に炭酸塩または重炭酸塩を添加すること；および、電荷平衡モデル（ｃｈａｒｇｅ ｂａｌａｎｃｅ ｍｏｄｅｌ）を使用して、細胞培養培地のｐＨを所望のｐＨに調整するために、細胞培養培地に添加される強酸または強塩基の量を決定することを含むことができ、ここで、電荷平衡モデルは、少なくとも細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度、細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度、および所望のｐＨに基づく。

【0014】

本方法は、強酸または強塩基の決定された量を細胞培養培地に添加し、それによってｐＨ調整された細胞培養培地を作製することをさらに含み得る。

【0015】

いくつかの実施において、炭酸塩または重炭酸塩は、炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウムである。

【0016】

いくつかの実施において、本方法は、１つ以上のイオン性化合物を細胞培養培地に補充することをさらに含み、ここで、電荷平衡モデルは、１つ以上のイオン性化合物の濃度にさらに基づく。いくつかの実施形態において、１つ以上のイオン性化合物は、１つ以上のアミノ酸または塩化アンモニウムを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のアミノ酸は、グルタミン、アスパラギン、またはグルタミン酸を含む。

【0017】

記載される方法のいくつかの実施において、強塩基は水酸化ナトリウムである。記載される方法のいくつかの実施において、強酸は塩酸である。

【0018】

記載される方法のいくつかの実施において、電荷平衡モデルは：

【数1】

により定義され、
式中：
［Ｍ^ｋ＋］は、金属水酸化物、重炭酸塩、または炭酸塩として細胞培養培地に添加された金属イオンの濃度であり；
ｋは、金属イオンの電荷であり；
［Ｈ^＋］は、所望のｐＨを得るために必要な細胞培養培地中のプロトンの濃度であり；
［ＯＨ^－］は、細胞培養培地中の水酸化物アニオンの濃度であり；
［ＮＭＡ^－］は、細胞培養培地中の正味の培地中の酸イオンの濃度であり；
［Ａ^－］は、細胞培養培地に添加された負に帯電したイオンの濃度に、それらの電荷の絶対値を乗じたものであり、任意のＯＨ^－または［ＮＭＡ－］に含まれる負に帯電したイオンを除外したものであり；および
［Ｂ^＋］は、細胞培養培地に添加された正に帯電したイオンの濃度に、それらの電荷の絶対値を乗じたものであり、任意のＨ^＋、［Ｎａ^＋］に含まれるナトリウムイオン、または［ＮＭＡ－］に含まれる正に帯電したイオンを除いたものである。

【0019】

記載される方法のいくつかの実施において、電荷平衡モデルは：

【数2】

により定義され、
式中：
［Ｎａ^＋］は、水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、または炭酸ナトリウムとして細胞培養培地に添加されたナトリウムイオンの濃度であり；
［Ｈ^＋］は、所望のｐＨを得るために必要な細胞培養培地中のプロトンの濃度であり；
［ＯＨ^－］は、細胞培養培地中の水酸化物アニオンの濃度であり；
［ＮＭＡ^－］は、細胞培養培地中の正味の培地中の酸イオンの濃度であり；
［Ａ^－］は、細胞培養培地に添加された負に帯電したイオンの濃度に、それらの電荷の絶対値を乗じたものであり、任意のＯＨ^－または［ＮＭＡ－］に含まれる負に帯電したイオンを除外したものであり；および
［Ｂ^＋］は、細胞培養培地に添加された正に帯電したイオンの濃度に、それらの電荷の絶対値を乗じたものであり、任意のＨ^＋、［Ｎａ^＋］に含まれるナトリウムイオン、または［ＮＭＡ－］に含まれる正に帯電したイオンを除いたものである。

【0020】

モデルのいくつかの実施において、

【数3】

式中：
Ｋ_０、Ｋ_１、およびＫ_２は、重炭酸塩および炭酸塩アニオンの解離定数であり；
Ｐは、細胞培養培地に適用されている気体圧力であり；
ｙＣＯ_２は、細胞培養培地に適用されているＣＯ_２気相のモル百分率であり；および
ｍおよびＫ_Ｈはそれぞれ、細胞培養培地について経験的に決定されるパラメータである。

【0021】

記載される方法のいくつかの実施において、細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度は、電荷平衡モデルにおいて細胞培養培地のｐＨの関数としてモデル化される。例えば、細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度は、細胞培養培地のｐＨと線形関係でモデル化され得る。いくつかの実施形態において、細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度は：

【数4】

式中：
［ＮＭＡ^－］は、細胞培養培地中の正味の培地中の酸イオンの濃度であり；および
Ｃ_０ｐおよびＣ_１ｐはそれぞれ、細胞培養培地について経験的に決定される定数である。
としてモデル化される。

【0022】

記載される方法のいくつかの実施において、細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度は、電荷平衡モデルにおいて温度の関数としてモデル化される。

【0023】

記載される方法のいくつかの実施において、細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度は、電荷平衡モデルにおいてｐＨおよび温度の関数としてモデル化される。

【0024】

記載される方法のいくつかの実施において、電荷平衡モデルのための関数関係および正味の培地中の酸濃度を得ることは、関数関係および細胞培養培地の正味の培地中の酸濃度を経験的に決定することを含む。関数関係および細胞培養培地の正味の培地中の酸濃度を経験的に決定することは、例えば：異なる気体状二酸化炭素レベルで平衡化され、異なる量の添加された強酸または強塩基を含有する細胞培養培地の複数の条件についてのｐＨデータを測定すること；および測定されたｐＨデータを使用して電荷平衡モデルを適合することを含み得る。いくつかの実施形態において、この方法は、ｐＨデータを測定する前に、所望の培養温度で複数の条件を平衡させることを含む。所望の培養温度は、いくつかの実施形態において、約３５℃～約４０℃であり得る。

【0025】

記載される方法のいくつかの実施において、細胞培養培地は、室温で調製される。

【0026】

記載される方法のいくつかの実施において、所望の炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウムの濃度は、約１．５ｇ／Ｌ～約２ｇ／Ｌである。

【0027】

また、細胞を培養する方法であって、上記方法に従って細胞培養培地のｐＨを調整すること；および、ｐＨ調整された細胞培養培地中で細胞を培養することを含む方法が、本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、細胞は哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、約３５℃～約４０℃で、細胞培養培地中で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、約０．１％～約２０％モル分率のＣＯ_２下で、細胞培養培地中で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、組換えポリペプチドをコードする核酸分子を含有する。

【0028】

また、組換えポリペプチドを製造する方法であって、上記の方法に従って細胞を培養すること、およびｐＨ調整された細胞培養培地中で組換えポリペプチドを産生することを含む方法が、本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、抗体またはそのフラグメントである。

【0029】

１つ以上のプロセッサ；および１つ以上のプロセッサに通信可能に結合され、１つ以上のプロセッサによって実行されるときに、１つ以上のプロセッサにおいて、細胞培養培地について、細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係を示す１つ以上のパラメータ、および細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度を示す正味の培地中の酸のパラメータを受信すること；１つ以上のプロセッサにおいて、細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度を示す炭酸塩または重炭酸塩のパラメータを受信すること；１つ以上のプロセッサにおいて、細胞培養培地の所望のｐＨを示すｐＨのパラメータを受信すること；および、電荷平衡モデルを使用して、細胞培養培地のｐＨを所望のｐＨに調整するために細胞培養培地に添加されるべき強酸または強塩基の量を決定することをシステムに行わせる命令を記憶するように構成されたメモリー：を備えるシステムであって、ここで、電荷平衡モデルが、少なくとも、細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度、細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度、および所望のｐＨに基づく、前記システムも本明細書に記載される。

【0030】

本明細書にさらに記載されるのは、ポリペプチドを発現する宿主細胞においてポリペプチドを製造するための方法であって、培地のｐＨを厳密に制御するために重炭酸ナトリウムを用いて細胞培養培地を調製することによって、細胞培養培地中で宿主細胞を培養することを含み、レシピを定義するために細胞培養培地に添加されるべき添加剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）および相対量を決定すること；第１のデータセットを定義するために、前記レシピを用いて溶液を調製し、溶液のｐＨを決定すること；第２のデータセットを定義するために、前記溶液をＣＯ_２ガス化および撹拌されているバイオリアクター中に配置し、および生じるｐＨおよびｐＣＯ２値を決定するためにそれを平衡化すること；第３のデータセットを定義するために、前記溶液を、定義された温度およびモル％ＣＯ_２でインキュベーター中に配置し、ｐＨおよびｐＣＯ_２測定値を決定すること；最小化すること：

【数5】

によって、ｍ、ｓ、および正味の培地中の酸のパラメータ値を同時に解くために、第１、第２、および第３のデータセットおよび

【数6】

に従うｐＨモデルを使用すること；ｐＨ同等性を達成するために、細胞培養培地のための目標ｐＨを定義し、ｐＨモデルから決定されるように、適切な濃度の塩基を細胞培養培地に添加すること（ここで、細胞培養培地のｐＨは厳密に制御される）；およびポリペプチドを産生することを含む、前記方法である。

【0031】

いくつかの実施形態において、浸透圧を維持するために溶液に塩が添加される。

【0032】

いくつかの実施形態において、添加剤は、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、および水酸化ナトリウムからなる群から選択される。

【0033】

いくつかの実施形態において、培地は、３６．５℃および５％ＣＯ_２でインキュベーター中に置かれる。

【0034】

いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、室温で調製される。

【0035】

いくつかの実施形態において、細胞培養培地のｐＨは、予測されるｐＨ値の０．００５標準偏差以内である。

【0036】

いくつかの実施形態において、細胞培養培地のｐＨは、７．２７２＋０．００５である。

【0037】

いくつかの実施形態において、本方法は、自動化される。

【0038】

いくつかの実施形態において、本方法は、バッチ供給プロセスで実施される。

【0039】

いくつかの実施形態において、本方法は、製造規模に適用可能であり、規模全体で頑健性を確保する。

【0040】

いくつかの実施形態において、本方法は、培地の開発または研究中に、異なるアミノ酸添加剤を含む複数の溶液の高品質な比較を確実にするために適用可能である。

【0041】

いくつかの実施形態において、本方法は、振盪フラスコなどの小規模システムに適用可能である。

【0042】

さらに本明細書に記載されているのは、ポリペプチドを発現する宿主細胞中でポリペプチドを製造するための方法であって、グルタミンを含まない産生培養培地中で培養の産生期に宿主細胞を培養すること含み、７．５ｍＭ～１５ｍＭの範囲の濃度で細胞培養培地にアスパラギンを添加すること；１ｍＭ～１０ｍＭの範囲の濃度で細胞培養培地にアスパラギン酸を添加すること；細胞培養培地に塩を添加すること；レシピを定義するために細胞培養培地に添加されるべき添加剤および相対量を決定すること；第１のデータセットを定義するために、前記レシピを用いて溶液を調製し、溶液のｐＨを決定すること；第２のデータセットを定義するために、前記溶液をＣＯ_２ガス化および撹拌されているバイオリアクター中に配置し、生じたｐＨおよびｐＣＯ_２値を決定するためにそれを平衡化すること；第３のデータセットを定義するために、前記溶液を、定義された温度およびモル百分率ＣＯ_２でインキュベーター中に配置し、ｐＨおよびｐＣＯ_２測定値を決定すること；最小化すること：

【数7】

によってｍ、ｓ、および正味の培地中の酸のパラメータ値を同時に解くために第１、第２、および第３のデータセットおよび

【数8】

に従うｐＨモデルを使用すること；ｐＨ同等性を達成するために細胞培養培地についての目標ｐＨを定義し、ｐＨモデルから決定されるように、適切な濃度の塩基を細胞培養培地に添加すること（ここで、細胞培養培地のｐＨは厳密に制御される）；およびポリペプチドを産生することを含む、前記方法である。いくつかの実施形態において、本方法は、前記ポリペプチドを単離するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、産生期は、バッチまたは流加培養期である。いくつかの実施形態において、産生培地は無血清である。

【0043】

実施形態は、ポリペプチドを発現する宿主細胞においてポリペプチドを製造するための方法であって、培地のｐＨを厳密に制御するために重炭酸ナトリウムを用いて細胞培養培地を調製することによって、細胞培養培地中で宿主細胞を培養することを含み、レシピを定義するために細胞培養培地に添加されるべき添加剤および相対量を決定することを含み、第１のデータセットを定義するために、前記レシピを用いて溶液１を調製し、その溶液のｐＨを決定し；第２のデータセットを定義するために、溶液１をＣＯ_２ガス化および撹拌されているバイオリアクター中に配置し、生じたｐＨおよびｐＣＯ２値を決定するためにそれを平衡化し；第３のデータセットを定義するために、溶液１を定義された温度および％ＣＯ_２でインキュベーター中に配置し、ｐＨおよびｐＣＯ_２測定値を決定し；細胞培養培地のための目標ｐＨを定義する電荷平衡式を最小限にすることにより、ｍ、ｓ、および正味の培地中の酸のパラメータ値を同時に解くために、第１、第２、および第３のデータセットおよび本明細書に記載されたｐＨモデルを使用し、およびｐＨ同等性を達成するために、結果から決定されるように、適切な濃度の塩基を細胞培養培地に添加し（ここで、細胞培養培地のｐＨは厳密に制御される）；およびポリペプチドを産生する、前記方法である。

【図面の簡単な説明】

【0044】

当業者は、以下に記載される図面が例示のみを目的としていることを理解するであろう。図面は、本教示または特許請求の範囲を決して限定することを意図するものではない。

【0045】

【図1】ＦＩＧ．１は、いくつかの実施形態による、細胞培養培地のｐＨを調整するための例示的な方法を示す。

【0046】

【図2】ＦＩＧ．２は、いくつかの実施形態による、本明細書に記載される方法を実行するために使用され得る例示的なシステムを示す。

【0047】

【図3A】ＦＩＧ．３Ａは、時間の関数（ｐＣＯ_２対時間）として溶液のｐＣＯ_２に影響される溶液調製プロセス中のＣＯ_２の損失を示す。Ｎ＝３、エラーバー＝標準偏差。

【0048】

【図3B】ＦＩＧ．３Ｂは、時間の関数（ｐＨ対時間）として溶液のｐＨに影響される溶液調製プロセス中のＣＯ_２の損失を示す。Ｎ＝３、エラーバー＝標準偏差。

【0049】

【図4】ＦＩＧ．４は、ｐＨ対温度を示す。Ｎ＝６、エラーバー＝標準偏差。

【0050】

【図5】ＦＩＧ．５は、１つの溶液を調製するのに要した時間を示す。Ｎ＝５、エラーバー＝標準偏差。

【0051】

【図6】ＦＩＧ．６は、３６．５℃および５％ＣＯ_２で平衡に達した後のそれぞれの溶液のｐＨを示す。Ｎ＝５、エラーバー＝標準偏差。

【0052】

【図7】ＦＩＧ．７は、第１の実験後の１６個の異なる溶液についての平衡ｐＨおよびｐＣＯ_２データを示す。

【0053】

【図8】ＦＩＧ．８は、第２の実験後の１６個の異なる溶液についての平衡ｐＨおよびｐＣＯ_２データを示す。

【0054】

【図9】ＦＩＧ．９は、全ての３２データポイントについてのｐＨとｐＣＯ２の間の関係を示す。

【0055】

【図10A】ＦＩＧ．１０Ａは、実施例１に従って収集された経験的データの正規性プロットを示す。

【0056】

【図10B】ＦＩＧ．１０Ｂは、実施例１に従って収集された経験的データの残差プロットを示す。

【0057】

【図11】ＦＩＧ．１１は、例示的な実施形態による、測定されたｐＨデータおよび決定されたパラメータを使用して電荷平衡から計算された、モデル適合されたｐＨデータを示す。

【0058】

【図12】ＦＩＧ．１２は、例示的な実施形態による、測定されたｐＨデータおよびｐＨの関数として正味の培地中の酸を考慮するときに、決定されたパラメータを使用して電荷平衡から計算された、モデル適合されたｐＨデータを示す。

【0059】

【図13】ＦＩＧ．１３は、例示的な実施形態による、測定されたｐＨおよび電荷平衡モデルに基づいて、目標ｐＨを得るために添加された水酸化ナトリウムを含むいくつかの培養培地についてのモデル化されたｐＨを示す。

【0060】

【図14】ＦＩＧ．１４は、別の例示的実施形態による、測定されたｐＨおよび電荷平衡モデルに基づいて、目標ｐＨを得るために添加された水酸化ナトリウムを含むいくつかの培養培地についてのモデル化されたｐＨを示す。

【0061】

【図15】ＦＩＧ．１５は、いくつかの実施形態による、第１のｐＨ測定デバイスを使用して測定された、細胞培養培地の冗長条件についての測定されたｐＨ対モデルｐＨを示す。

【0062】

【図16】ＦＩＧ．１６は、いくつかの実施形態による、第２のｐＨ測定デバイスを使用して測定され、細胞培養培地の冗長条件についての測定されたｐＨ対モデルｐＨを示す。

【発明を実施するための形態】

【0063】

本開示は、細胞培養培地およびその製造方法に関する実施形態を記載する。特に、細胞培養培地のｐＨを調整するための方法、ｐＨ調整された細胞培養培地中で細胞を培養するための方法、およびｐＨ調整された細胞培養培地中で培養される細胞によって発現されるポリペプチドを作製するための方法が記載される。また、所望のｐＨを得るために、どれだけの量の酸または塩基が細胞培養培地に添加されるべきかを決定するためのシステムも記載される。

【0064】

本明細書に記載される方法およびシステムは、細胞培養培地に関して記載される。当業者は、本明細書に記載される方法およびシステムが炭酸塩または重炭酸塩緩衝剤を含有する任意の溶液に適用され得ることを認識するのであろう。

【0065】

細胞培養培地などの溶液のｐＨは、細胞培養培地のｐＨを所望のｐＨに調整するために、細胞培養培地に添加されるべき強酸または強塩基の量を決定することによって調整することができる。この決定は、少なくとも細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度、細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩（炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウムなど）濃度、および所望のｐＨに基づく電荷平衡モデルを使用して行うことができる。本明細書にさらに記載されるように、細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、および細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度は、特定の細胞培養培地について経験的に決定され得る。これらのパラメータ（すなわち、関数関係および正味の培地中の酸濃度）は、別の事業体（細胞培養培地の製造業者など）によって受け取られてもよく、またはエンドユーザーによって経験的に決定されてもよい。本方法は、細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度を得るために、細胞培養培地に炭酸塩または重炭酸塩を添加することをさらに含み得る。

【0066】

細胞培養培地のｐＨを所望のｐＨに調整するために細胞培養培地に添加されるべき強酸または強塩基の量が決定されると、決定された量の強酸または強塩基が細胞培養培地に添加され得、それによってｐＨ調整された細胞培養培地が作製される。

【0067】

細胞培養培地は１つ以上のイオン性化合物（例えば、１つ以上のアミノ酸および／または１つ以上の塩）でさらに補充されてもよい。電荷平衡モデルはさらに、細胞培養培地に添加される１つ以上のイオン性化合物の濃度に基づいてもよい。

【0068】

ｐＨ調整された細胞培養培地は、細胞を培養するために使用され得る。例えば、細胞を培養する方法は、本明細書に記載の方法に従って細胞培養培地のｐＨを調整すること、およびｐＨ調整された細胞培養培地中で細胞を培養することを含み得る。細胞は、組換えポリペプチドをコードする核酸分子を含み得る。組換えポリペプチドは、細胞培養培地中の細胞によって発現され得る。例えば、組換えポリペプチドを製造する方法は、本明細書に記載の方法に従って細胞培養培地のｐＨを調節すること、ｐＨ調節された細胞培養培地中で組換えポリペプチドをコードする核酸分子を含む細胞を培養すること、およびｐＨ調節細胞培養培地中で組換えポリペプチドを産生することを含み得る。

【0069】

１つ以上のプロセッサおよび１つ以上のプロセッサに通信可能に結合され、１つ以上のプロセッサによって実行されるときに、細胞培養培地のｐＨを所望のｐＨに調整するために、細胞培養培地に添加されるべき強酸または強塩基の量をシステムまたは電子デバイスに決定させる命令を記憶するように構成されたメモリーを含むシステムまたは電子デバイスも記載されている。例えば、命令は、システムまたは電子デバイスに、１つ以上のプロセッサにおいて、細胞培養培地の所望のｐＨを示すｐＨパラメータを受信させ；電荷平衡モデルを使用して、細胞培養培地のｐＨを所望のｐＨに調整するために、細胞培養培地に添加されるべき強酸または強塩基の量を決定させることができ、ここで、電荷平衡モデルは、少なくとも細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度、細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度、および所望のｐＨに基づく。
定義

【0070】

本明細書を解釈するために、以下の定義が適用される。以下に記載される定義が、参照により本明細書に組み込まれる任意の文書を含む任意の他の文書におけるその単語の使用と矛盾する場合、反対の意味が明確に意図されない限り（例えば、その用語が最初に使用される文書において）、以下に記載される定義は、本明細書およびその関連する特許請求の範囲を解釈する目的で常に優先されるものとする。

【0071】

適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形も含み、逆もまた同様である。本明細書における「ａ」の使用は、別段の記載がない限り、または「１つ以上」の使用が明らかに不適切である場合を除き、「１つ以上」を意味する。

【0072】

別段の記載がない限り、「または」の使用は、「および／または」を意味する。

【0073】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は互換可能であり、限定するものではない。さらに、用語「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」、「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」、および「例えば（ｅ．ｇ．）」は、限定することを意図したものではない。例えば、「含む」という用語は「含むが、これに限定されない」ことを意味するものとする。

【0074】

本明細書で使用される場合、用語「約」は、提供される単位値の＋／－１０％を指す。

【0075】

本明細書で使用される場合、用語「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」は、対象の特徴または特性の全体的またはおおよその程度を示す定性的な状態を指す。生物学分野の当業者は、生物学的および化学的現象は、生物学的および化学的組成物および材料の試験、製造、および保存に影響を及ぼす多くの変数のために、ならびに生物学的および化学的組成物および材料の試験、製造、および保存に使用される機器および装置における固有の誤差のために、たとえあったとしても、稀に絶対的な結果を達成するか、または回避することを理解するであろう。したがって、用語「実質的に」は、本明細書では多くの生物学的および化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するために使用される。

【0076】

用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、特に、個々のモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）およびポリエピトープ特異性を有する抗体組成物を包含する。用語「抗体」は特に、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体フラグメントを包含する。

【0077】

「正味の培地中の酸（ｎｅｔ ｍｅｄｉｕｍ ａｃｉｄｓ）」または「ＮＭＡ」という用語は、本明細書に記載の電荷平衡モデルによってモデル化された炭酸塩または重炭酸塩または他の培地サプリメントを添加する前、および細胞培養培地のｐＨを調整する前の細胞培養培地の正味の酸含有量を指す。ＮＭＡは、酸性種については正の量、塩基性種については負の量として定義される。従って、ＮＭＡの濃度（［ＮＭＡ^－］）は、酸性培地では正味プラスであり、塩基性培地全体では正味マイナスである。

【0078】

本明細書に記載される本発明の態様および変形は、態様および変形「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」ことを含むことが理解される。

【0079】

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間に介在する各値、およびその状態範囲内の任意の他の記載された値または介在する値は、本開示の範囲内に包含されることを理解されたい。記載された範囲が上限または下限を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかを除外する範囲も本開示に含まれる。

【0080】

本明細書で使用されるセクションの見出しは、整理のみを目的としており、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。説明は、当業者が本発明を実施および使用することを可能にするために提示され、特許出願およびその要件の文脈において提供される。記載された実施形態に対する様々な修正は当業者には容易に明らかであり、本明細書の一般原理は、他の実施形態に適用され得る。したがって、本発明は、示された実施形態に限定されることを意図するものではなく、本明細書に記載の原理および特徴と一致する最も広い範囲が与えられるべきである。

【0081】

図面は、様々な実施形態によるプロセスを示す。例示的なプロセスにおいて、いくつかのブロックが任意選択的に組み合わされ、いくつかのブロックの順序は任意選択的に変更され、いくつかのブロックは任意選択的に省略される。いくつかの例では、追加のステップが例示的なプロセスと組み合わせて実行され得る。したがって、図示される（および以下でより詳細に説明される）操作は、本質的に例示的なものであり、それ自体を限定するものと見なされるべきではない。

【0082】

本明細書で参照される全ての刊行物、特許、および特許出願の開示は、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
細胞培養培地のｐＨを決定するための電荷平衡モデル

【0083】

二酸化炭素／重炭酸塩系は、哺乳動物細胞培養培地中の緩衝剤として日常的に使用される。しかしながら、二酸化炭素の連続的な脱気およびその温度依存性のために、調製中に周囲温度で、および溶解二酸化炭素の制御なしで目標ｐＨを達成することは困難であり、細胞培養の操作条件ではさらに困難である。これらの問題は、哺乳動物細胞培養系の研究およびプロセス開発中に、自社独自の培地の複数（例えば、２０個）のカスタマイズされた調製物を調製するときに拡大された。したがって、滴定を行う必要なくプロセス条件で各培地の目標ｐＨを達成するために、調製中に添加する酸または塩基の量を特定するための数学的モデルが作成された。未知種を含む独自の培地中の気体状二酸化炭素と溶存二酸化炭素との関係が、修正ヘンリーの法則の方程式（ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｈｅｎｒｙ’ｓ Ｌａｗ ｅｑｕａｔｉｏｎ）を用いて特定された。さらに、滴定を行わずに培地を調製することを可能にするために、モデルパラメータの特定中に、独自の培地の酸／塩基特性が、その「正味の培地中の酸」（または「ＮＭＡ」）に関連するパラメータによって適合された。培地を調製するために使用されることに加えて、このモデルは、インキュベーションおよびサンプリング中に発生するｐＣＯ_２の変動にもかかわらず、カスタマイズされた培地配合物のｐＨの等価性を評価するために使用された。

【0084】

ｐＨモデル（本明細書では「電荷平衡モデル」とも呼ばれる）は、細胞培養培地に添加される酸または塩基に基づいて細胞培養培地のｐＨを予測することを可能にし、あるいは、所望のｐＨに基づいて、どれだけの酸または塩基が細胞培養培地に添加されるべきかを示すことができる。本明細書でさらに説明されるように、特定の細胞培養培地についてのＣＯ_２の溶解度を示す係数（例えば、ｓまたはＫ_Ｈ）および気相ＣＯ_２と溶解ＣＯ_２との関係を示す指数項（例えば、ｍ）は、細胞培養培地に添加される酸または塩基の量にかかわらず、所与の温度で一定である。係数および指数項を使用して、細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係を記述することができる。正味の培地中の酸は、細胞培養培地の定数としてモデル化されてもよく、またはｐＨ、温度、もしくはその両方の関数としてモデル化されてもよい。いくつかの実施形態において、正味の培地中の酸濃度は、異なるｐＨまたは温度範囲にわたって一定に保たれる。いくつかの実施形態において、正味の培地中の酸濃度は、ｐＨの関数としてモデル化される。いくつかの実施形態において、正味の培地中の酸濃度は、温度の関数としてモデル化される。いくつかの実施形態において、正味の培地中の酸濃度は、温度およびｐＨの関数としてモデル化される。関数関係は、細胞培養培地のｐＨが調整される前に、例えば所望の操作温度において、細胞培養培地について経験的に決定され得る。さらに、同じモデル定数を使用して、異なるｐＨで細胞培養培地のいくつかのバッチを作製することができる。

【0085】

モデルは最初に、培地の電荷平衡が溶液の電気的中性（すなわち、正味電荷ゼロ）によって決定されると仮定する。したがって、以下を満たさなければならなかった：

【数9】

式中、［Ｃ］は濃度であり、ｋは各イオンの電荷である。モデルはさらに、細胞培養培地中の各種についての質量バランスを仮定し、これは次の式で提供することができる：

【数10】

式中、［Ｘ］^０は、化合物Ｘの初期濃度であり、

【数11】

は、全てのカチオン種の濃度の合計であり；

【数12】

は、全てのアニオン種の濃度の合計であり；［Ｘ］は、非解離型の濃度である。

【0086】

細胞培養培地の正味の電荷はゼロであるので、任意の炭酸塩または重炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウム）および酸／塩基が添加された細胞培養培地は、以下の例示的な電荷平衡モデルを用いてモデル化することができる：

【数13】

例示的な電荷平衡モデルにおいて、［Ｎａ^＋］は、水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、または炭酸ナトリウムとして細胞培養培地に添加されたナトリウムイオンの濃度であり；［Ｈ^＋］は、所望のｐＨを得るために必要な細胞培養培地中のプロトンの濃度であり；［ＯＨ^－］は、細胞培養培地中の水酸化物アニオンの濃度であり；［Ａ^－］は、細胞培養培地に添加された負に帯電したイオンの濃度に、それらの電荷の絶対値を乗じたものであり、任意のＯＨ^－または［ＮＭＡ－］に含まれる負に帯電したイオンを除外したものであり；および［Ｂ^＋］は、細胞培養培地に添加された正に帯電したイオンの濃度に、それらの電荷の絶対値を乗じたものであり、任意のＨ^＋、［Ｎａ^＋］に含まれるナトリウムイオン、または［ＮＭＡ－］に含まれる正に帯電したイオンを除外したものである。細胞培養培地中の特定の成分および量（または濃度）を知ることなく、正味の培地中の酸濃度は、経験的にのみ決定することができる。本明細書に記載のモデルは、これらの正味の培地中の酸の考察を含む。これは、エンドユーザーがｐＨを調整する必要がある独自の細胞培養培地を購入する場合に特に有用である。さらに、基礎培地の成分が知られていても、記述したモデルは、培地中の全ての成分をモデル化する必要がないので、実質的に使用が容易である。細胞培養培地中の成分の数は非常に多くてもよい（例えば、細菌および真菌培養物については約１０～約３０成分、または哺乳動物細胞培養物については約３０～約１００成分）。

【0087】

重炭酸ナトリウムまたは炭酸ナトリウム系は、細胞培養培地において最も一般的に使用されるが、このモデルは炭酸塩または重炭酸塩を含有する任意の溶液に適用可能である。したがって、モデルは、次のような任意の炭酸塩について考慮され得る：

【数14】

式中、［Ｍ^ｋ＋］は、金属水酸化物、重炭酸塩、または炭酸塩として細胞培養培地に添加された金属イオンの濃度であり；ｋは、金属イオンの電荷であり；［Ｈ^＋］は、所望のｐＨを得るために必要な細胞培養培地中のプロトンの濃度であり；［ＯＨ^－］は、細胞培養培地中の水酸化物アニオンの濃度であり；［ＮＭＡ^－］は、細胞培養培地中の正味の培地中の酸イオンの濃度であり；［Ａ^－］は、細胞培養培地に添加された負に帯電したイオンの濃度に、それらの電荷の絶対値を乗じたものであり、任意のＯＨ^－または［ＮＭＡ－］に含まれる負に帯電したイオンを除外したものであり；および［Ｂ^＋］は、細胞培養培地に添加された正に帯電したイオンの濃度に、それらの電荷の絶対値を乗じたものであり、任意のＨ^＋、［Ｎａ^＋］に含まれるナトリウムイオン、または［ＮＭＡ－］に含まれる正に帯電したイオンを除外したものである。

【0088】

二酸化炭素／重炭酸塩緩衝系は、以下の平衡反応を含む（Ｍｉｌｌｅｒｏ、「Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｒｂｏｎ Ｄｉｏｘｉｄｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｔｈｅ Ｏｃｅａｎｓ」、Ｇｅｏｃｈｍｉｃａ ｅｔ Ｃｏｓｍｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、第５９巻、第４号、６６１－６７７頁（１９９５）を参照）：

【化1】

【0089】

平衡におけるアニオンおよびカチオンの濃度は、解離定数によって提供される関係を使用して決定することができる。炭酸の第１および第２の解離定数は：

【数15】

により与えられる。
別の方法でフレーム化すると：

【数16】

重炭酸塩の解離の解離定数（例えば、Ｋ_ａ、Ｋ_０、Ｋ_１、Ｋ_２など）は、文献において公知であるか、または経験的に決定することができる。例えば、３６．５℃での第１および第２の解離定数のｐＫ_ａは、それぞれ６．３０３および１０．２３８であると報告された。Ｈａｒｎｅｄら、「Ｔｈｅ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎｉｃ Ａｃｉｄ ｉｎ Ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｄｉｏｘｉｄｅ ｉｎ Ｗａｔｅｒ ａｎｄ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ０ ｔｏ ５０o」、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、第６５巻、第１０号、２０３０－２０３７頁（１９４３）を参照されたい。したがって、Ｋ_ａ１値およびＫ_ａ２値は、それぞれ４．９８×１０^－７ｍｏｌ／Ｌおよび５．７７×１０^－１１ｍｏｌ／Ｌと決定された。

【0090】

平衡状態および希釈系では、ヘンリーの法則のこのバージョン：

【数17】

式中、ｓ（ｍＭ／％）は、

【数18】

（分圧パーセント）を液相中のＣＯ_２のｍＭに変換する溶解度係数である
によって表されるように、溶解ＣＯ_２の濃度は、気相中のＣＯ_２のモル分率に比例する。しかしながら、細胞培養培地については、この関係が、細胞培養培地が水および重炭酸塩の溶液とは異なる挙動を示すように非線形であることが示されている。このようにして、ヘンリーの法則の修正された形式が開発された：

【数19】

Ｇｒａｍｅｒら、「Ａ Ｓｅｍｉ－Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｍｏｄｅｌ Ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ Ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ ｔｈｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｃａｒｂｏｎ Ｄｉｏｘｉｄｅ， ｐＨ， Ｌａｃｔａｔｅ ａｎｄ Ｂａｓｅ ｉｎ ａ Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｓｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４７巻、第４号、１９７－２０４頁（２００７）を参照されたい。したがって、値「ｓ」は、ＣＯ_２の溶解度を示す例示的な係数であり、値「ｍ」は、ＣＯ_２の溶解度を示す例示的な指数である。具体的には、ＣＯ_２を示す係数よび指数は、具体的なモデルに合わせて、別の式で表現することができる。例えば、全圧（Ｐ）とヘンリー定数（ｋ_Ｈ）で表現すると：

【数20】

したがって、［ＨＣＯ_３ ^－］および［ＣＯ_３ ^２－］は、以下のように表すことができる：

【数21】

【0091】

モデルは、水の解離をさらに説明することができる：

【数22】

式中、

【数23】

は、水の解離定数である。

【0092】

したがって、細胞培養培地のための合計電荷平衡モデルは、以下のように記述できる：

【数24】

［Ｎａ^＋］は、細胞培養培地に水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、または炭酸ナトリウムとして添加されたナトリウムイオンの濃度であり；［Ｈ^＋］は、所望のｐＨを得るために必要とされる細胞培養培地中のプロトンの濃度であり；［ＯＨ^－］は、細胞培養培地中の水酸化物アニオンの濃度であり；［Ａ^－］は、細胞培養培地に添加された負に帯電したイオンの濃度に、それらの電荷の絶対値を乗じたものであり、任意のＯＨ^－または［ＮＭＡ－］に含まれる負に帯電したイオンを除外したものであり；［Ｂ^＋］は、細胞培養培地に添加された正に帯電したイオンの濃度に、それらの電荷の絶対値を乗じたものであり、任意のＨ^＋、［Ｎａ^＋］に含まれるナトリウムイオン、または［ＮＭＡ－］に含まれる正に帯電したイオンを除外したものであり；Ｋ_０、Ｋ_１、およびＫ_２は、重炭酸イオンおよび炭酸アニオンの解離定数であり；Ｐは、細胞培養培地に適用されている気体の圧力であり；ｙＣＯ_２は、細胞培養培地に適用されているＣＯ_２気相のモル百分率であり；およびｍおよびＫ_Ｈはそれぞれ、細胞培養培地について経験的に決定されるパラメータである。

【0093】

上記のように、Ｋ_Ｈ、ｍ、および［ＮＭＡ^－］の値は、細胞培養培地に添加された重炭酸ナトリウム（または炭酸ナトリウム）または酸もしくは塩基の量に関係なく、細胞培養培地の特定の温度で一定であり（ただし、［ＮＭＡ^－］は、より洗練されたモデルにおいてｐＨの関数としてモデル化されてもよい）、経験的に決定され得る。さらに、水および炭酸塩／重炭酸塩の解離定数が知られている。したがって、このモデル関数は、細胞培養培地に添加される重炭酸塩または炭酸塩および強酸または強塩基の量に基づいて、細胞培養培地のｐＨを予測するために使用され得る。あるいは、より一般的な使用法では、添加される重炭酸ナトリウムまたは炭酸ナトリウムの所定良と所望のｐＨが与えられた場合に、細胞培養培地に添加すべき強酸または強酸の量は、モデルを使用して決定することができる。

【0094】

細胞培地中の正味の培地中の酸は、弱酸および／または弱塩基を含み得、これらの成分の平衡はそれ自体、細胞培養培地のｐＨおよび／または温度によって影響され得る。したがって、いくつかの実施形態において、正味の培地中の酸濃度は、電荷平衡モデルにおいて細胞培養培地のｐＨの関数としてモデル化される。正味の培地中の酸濃度とｐＨの間の関係は、多項式関係、例えば線形関係であってもよい。いくつかの実施形態において、細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度は、以下のようにモデル化される：

【数25】

式中、［ＮＭＡ^－］は、細胞培養培地中の正味の培地中の酸イオンの濃度であり；およびＣ_０ｐおよびＣ_１ｐは、それぞれ細胞培養培地について経験的に決定される定数である。したがって、いくつかの実施形態において、完全に拡張された電荷平衡モデルは、以下のように書かれ得る：

【数26】

または、いくつかの実施形態において：

【数27】

【0095】

場合によっては、培養培地のパラメータ（すなわち、Ｋ_Ｈ、ｍ、および［ＮＭＡ^－］）は、例えば、ｐＨプローブ間のばらつきのために、細胞培養培地のｐＨを測定するために使用される特定の方法によって影響を受ける。したがって、パラメータの決定は、基礎培地と調製中にｐＨを測定するために使用される特定の方法の各組み合わせについて行うことができる。
モデルパラメータの経験的決定

【0096】

モデルパラメータ（すなわち、Ｋ_Ｈ、ｍ、および［ＮＭＡ^－］）は、ユーザ指定のプロセス温度で行われる実験で決定されてもよい。パラメータを経験的に決定するために、基礎培地は、異なる気体状二酸化炭素レベルおよび異なる量の添加される強酸または強塩基で決定され得る。これらの条件下のそれぞれにおいて、ｐＨが測定される系は、液状培地中の溶解ＣＯ_２と気相ＣＯ_２との平衡に維持される。例えば、３６．５℃では、［ＨＣｌ］＝０および［ＨＣｌ］＝５ｍＭで作製された培地調製物について、バイオリアクターシステムのマスフローコントローラーを用いて、ｙＣＯ_２％を、４％、６％、８％、１０％、１５％、および２０％に設定して、培地を平衡化する。パラメータｍ、Ｋ_Ｈ、および［ＮＭＡ^－］は、最小二乗最小化法によって解かれる。

【0097】

いくつかの実施において、ｍのみが最初に決定され得るように、１つの酸／塩基レベルのみが、ｙＣＯ_２％の２つ以上のレベルとともに使用される。次に、異なるレベルの酸／塩基を個別に試験し、最初の推定値からｍを与えると、Ｋ_Ｈおよび［ＮＭＡ－］が決定される。

【0098】

重炭酸塩で緩衝される細胞培養培地についてのｐＨとｐＣＯ_２の間の半経験的関係を考慮する別の方法では、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈの式を使用することができる：

【数28】

ここで、ｐＫａは、３６．５℃で６．３０３である。Ｓａｎｄａｄｉら、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ Ｆａｃｔｏｒｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎｓ ｔｏ Ｓｃｒｅｅｎ Ａｃｔｉｖｅ Ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ Ｃｅｌｌｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、第２２巻、第２号、５９５－６００頁（２００６）を参照されたい。標準的な炭酸塩のｐＨ式の場合、［Ｂ］は、ＨＣＯ_３ ^－の濃度（例えば、ｍＭで表すことができる）である。多くの未知の種を有する独自の培地の場合、［Ｂ］は、培地調製中に添加された、重炭酸塩および炭酸塩以外のすべての酸性または塩基性種の濃度と、正味の培地中の酸の合計として定義することができる。これらは、例えば、正の値として［Ｎａ^＋］、［Ｇｌｎ^＋］、［Ａｓｎ^＋］、［Ｇｌｕ^＋］、および負の値として［正味の培地中の酸（Ｎｅｔ Ｍｅｄｉｕｍ Ａｃｉｄ）］ならびに［Ｇｌｎ^－］、［Ａｓｎ^－］、［Ｇｌｕ^－］、および［Ｇｌｕ^（２－）］を含むことができる。この用語は、細胞培養培地で使用されるｐＨの範囲内ではｐＨ変化の影響を受けないため、気相ＣＯ_２による平衡化の前後でも同様である。

【0099】

独自の培地の説明を完全にするために、正味の培地中の酸濃度は、その調製に使用される水酸化ナトリウムに対する均衡として考えることができる。正味の培地中の酸は、異なる初期組成を有する異なる基礎培地間で変化し得る。しかしながら、同じ基礎培地を用いて作製された細胞培地間では、正味の培地中の酸は一定である。

【0100】

細胞培養培地を記述する３つの経験的パラメータ（例えば、ｍ、ｓ（またはＫ_Ｈ）、および正味の培地中の酸）は、３つの条件下（１）室温での調製中、（２）目標温度での様々な気相ＣＯ_２分圧での平衡中、および（３）目標気相ＣＯ_２濃度および温度での平衡中、で測定された、補充されていない培地の調製についての電荷平衡モデル式を使用して見出すことができる。例えば、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈの式は、次のように再表現され得る：

【数29】

この式は、半経験的パラメータとして定数「ｍ」および「ｓ」を使用して、

【数30】

と細胞培養培地のｐＨの間の例示的な関係を提供する。

【数31】

対（ｐＨ－ｐＫ_Ａ－ｌｏｇ［Ｂ］）のプロットは、傾き（－ｍ）とｌｏｇ（１／ｓ）の切片との線形関係を提供した。

【0101】

すべての種の濃度および３つのパラメータの値を提供した後、ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（商標）Ｅｘｃｅｌソルバーなど）を使用して、ｐＨ値をゼロに最小化するこの電荷平衡式中のｐＨ値を見つけることができる。

【0102】

別の例において、細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率（例えば、Ｋ_Ｈ（またはｓ）およびｍのパラメータ）の間の関数関係、および正味の培地中の酸濃度は、電荷平衡モデルについて、異なる気体状二酸化炭素レベルおよび異なる添加量の強酸または強塩基で平衡化された細胞培養培地の複数の条件から測定されるｐＨデータを使用することを含む。いくつかの実施形態において、関数関係および正味の培地中の酸濃度は、同時に決定される。いくつかの実施形態では、正味の培地中の酸濃度および関数関係が連続的に決定される。平衡化された条件のｐＨを測定し、電荷平衡モデルをパラメータ化するために使用することができる。複数の条件に対する電荷平衡を最小化することができ、それによって、関数関係のためのパラメータおよび［ＮＭＡ^－］を提供することができる。
細胞培養培地への追加サプリメント

【0103】

細胞培養培地は、１つ以上の塩、酸、または塩基などの１つ以上の追加の添加剤でさらに補充されてもよい。例えば、細胞培養培地は、１つ以上のアミノ酸および／または塩化アンモニウムで補充されてもよい。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、１つ以上のアミノ酸で補充される。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、グルタミン、アスパラギン、および／またはグルタミン酸で補充される。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、塩化アンモニウムで補充される。有利には正味の培地中の酸濃度および細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率（例えば、モデルのパラメータｍ、Ｋ_Ｈ、および［ＮＭＡ^－］）の間の関数関係は、追加の荷電種を添加する前の細胞培養培地に基づいてもよく、したがって、添加剤の濃度を調整するとき（添加剤が溶解および気体状ＣＯ_２の間の関数関係を変更しない限り）、一般に調整される必要はない。

【0104】

電荷平衡モデルに荷電種の濃度、［Ａ^－］および［Ｂ^＋］を組み込むことにより、電荷平衡モデルを用いて、細胞培養培地に添加される荷電種（例えば、弱酸または弱塩基）を考慮することができる。例えば、細胞培養培地がグルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、および塩化アンモニウムで補充される場合、電荷平衡モデルは以下のように記載され得る：

【数32】

【0105】

水溶液中のアミノ酸のアミン（－ＮＨ_２）、カルボキシル（－ＣＯＯＨ）、および官能基は、水溶液のｐＨがそれぞれのｐＫａを下回る場合、ほとんどプロトン化される。平衡におけるすべてのアニオンおよびカチオンの濃度は、ｐＫ_ａ値を用いて決定することができる。例えば、３つのｐＫ_ａ値を有するグルタミン酸の場合、以下の解離／会合平衡を用いることができる：

【化2】

【0106】

両性イオンとカチオン（Ｋ_ａ１）、両性イオンとアニオン（Ｋ_ａ２）、およびアニオンと二重荷電アニオン（Ｋ_ａ３）との間の解離／会合平衡は、以下のように記載され得る：

【数33】

【0107】

グルタミンおよびアスパラギンなどの一酸性アミノ酸については、第３のＫ_ａ値を考慮する必要はない。

【0108】

塩化アンモニウムは、アンモニウムイオンを溶液中に放出する可溶性塩であり、アンモニアに変換されると、別の水素イオンを放出する。

【化3】

アンモニアの解離平衡は、以下のように記述された：

【数34】

【0109】

３６．５℃におけるグルタミン、アスパラギン、グルタミン酸およびアンモニアの解離定数を表１に示す。

【表1】

Ｋｏｃｈｅｒｇｉｎａら、「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｈｅａｔｓ ｏｆ Ａｃｉｄ－Ｂａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」、Ｒｕｓｓｉａｎ Ｊ．ｏｆ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５８巻、７４４－７４８頁（２０１３）；Ｋｏｃｈｅｒｇｉｎａら、「Ｔｈｅｒｍｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ａｃｉｄ－Ｂａｓｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｌ－Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｒｕｓｓｉａｎ Ｊ．Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５６巻、第１４８１号（２０１１）；Ｎａｇａｉら、「Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｏｆ Ｓｅｖｅｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ」、Ｊ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄａｔａ」、第５３巻、第３号、６１９－６２７頁（２００８）；Ｂａｔｅｓら、「Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｏｆ Ａｑｕｅｏｕｓ Ａｍｍｏｎｉａ ａｔ ０ ｔｏ ５０o ｆｒｏｍ Ｅ． ｍ． ｆ． Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓａｌｔ ｏｆ ａ Ｗｅａｋ Ａｃｉｄ」、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、第７０巻、第３号、１３９３－１３９５頁（１９５０）

【0110】

したがって、１つ以上のイオン性化合物が補充された細胞培養培地は、電荷平衡モデルを用いてモデル化することができる。いくつかの実施形態において、１つ以上のイオン性化合物は、塩化アンモニウムを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のイオン性化合物は、Ｌ－アミノ酸などのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のイオン性化合物は、グルタミン、アスパラギン、およびグルタミン酸のうちの１つ以上を含む。細胞培養培地に添加され得る他の補足成分は当技術分野において公知であり、本明細書に記載される方法に従ってモデル化され得る。他の補足成分としては、消泡剤、ポロキサマー、塩、成長因子、血清などを挙げることができる。
細胞培養培地のｐＨを調整する方法

【0111】

細胞培養培地のｐＨは、細胞培養培地のｐＨを所望のｐＨに調整するために、細胞培養培地に添加されるべき強酸または強塩基の量を決定することによって調整することができる。本明細書で議論されるように、この決定は少なくとも、細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度、細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウム）濃度、および所望のｐＨに基づく電荷平衡モデルを使用して行われ得る。本方法は、細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度を得るために、細胞培養培地に炭酸塩または重炭酸塩を添加することをさらに含み得る。本方法は決定された量の強酸または強塩基を細胞培養培地に添加し、それによってｐＨ調整された細胞培養培地を作製することをさらに含み得る。

【0112】

経験的モデルパラメータ（例えば、細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、および細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度）は、経験的決定によって得ることができる。代替的に、経験的モデルパラメータは、別の事業体から受け取ることができる。

【0113】

したがって、本方法のいくつかの実施において、細胞培養培地のｐＨを調整する方法は、細胞培養培地について、細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、および細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度を取得すること；細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度を得るために、細胞培養培地に炭酸塩または重炭酸塩を添加すること；および、電荷平衡モデルを使用して、細胞培養培地のｐＨを所望のｐＨに調整するために、細胞培養培地に添加されるべき強酸または強塩基の量を決定することを含み、ここで、電荷平衡モデルは、少なくとも細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度、細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度、および所望のｐＨに基づく。本方法は、決定された量の強酸または強塩基を細胞培養培地に添加し、それによってｐＨ調整された細胞培養培地を作製することをさらに含み得る。

【0114】

いくつかの実施において、細胞培養培地のｐＨを調整する方法は、細胞培養培地について、細胞培養培地中の溶解した二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係を示す１つ以上のパラメータ、および細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度を示すパラメータを受け取ること；細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度を得るために、細胞培養培地に炭酸塩または重炭酸塩を添加すること；および、電荷平衡モデルを使用して、細胞培養培地のｐＨを所望のｐＨに調整するために、細胞培養培地に添加されるべき強酸または強塩基の量を決定することを含み、ここで、電荷平衡モデルは、少なくとも細胞培養培地中の溶解した二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度、細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度、および所望のｐＨに基づく。本方法は、決定された量の強酸または強塩基を細胞培養培地に添加し、それによってｐＨ調整された細胞培養培地を作製することをさらに含み得る。

【0115】

いくつかの実施形態において、細胞培養培地のｐＨを調整する方法は、細胞培養培地について、細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、および細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度を経験的に決定すること；細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度を得るために、細胞培養培地に炭酸塩または重炭酸塩を添加すること；および、電荷平衡モデルを使用して、細胞培養培地のｐＨを所望のｐＨに調整するために細胞培養培地に添加されるべき強酸または強塩基の量を決定することを含み、ここで、電荷平衡モデルは、少なくとも細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度、細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度、および所望のｐＨに基づく。本方法は、決定された量の強酸または強塩基を細胞培養培地に添加し、それによってｐＨ調整された細胞培養培地を作製することをさらに含み得る。

【0116】

炭酸塩または重炭酸塩は一般に、重炭酸ナトリウムまたは炭酸ナトリウムであるが、いくつかの実施形態では異なる炭酸塩または重炭酸塩を使用してもよい。例えば、いくつかの実施形態において、炭酸塩または重炭酸塩は、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸カルシウム－マグネシウム、炭酸カリウム、炭酸亜鉛、炭酸鉄、または他の好適な炭酸塩または重炭酸塩である。細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度は、細胞培養培地の仕様および／または製造業者の推奨に依存し得る。いくつかの実施形態において、所望の炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウム濃度は、約１．５ｇ／Ｌ～約２ｇ／Ｌ、例えば約１．８ｇ／Ｌである。

【0117】

本方法は、細胞培養培地に１つ以上のイオン性化合物を補充することをさらに含んでもよい。本明細書にさらに記載されるように、電荷平衡モデルは、細胞培養培地を補充するために使用される１つ以上のイオン性化合物の濃度にさらに基づいてもよい。例えば、細胞培養培地は、１つ以上のアミノ酸および／または塩化アンモニウムで補充されてもよい。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、１つ以上のアミノ酸で補充される。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、グルタミン、アスパラギン、および／またはグルタミン酸で補充される。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、塩化アンモニウムを補充される。

【0118】

細胞培養培地のｐＨを調整するために使用される強酸または強塩基は、任意の好適な強酸または強塩基であり得る。例示的な強酸としては、塩素酸、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、および硫酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、強酸は塩酸である。例示的な強塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、および水酸化ストロンチウムが挙げられる。いくつかの実施形態において、強塩基は水酸化ナトリウムである。

【0119】

電荷平衡モデルのための関数関係および正味の培地中の酸濃度は、細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、および細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度を経験的に決定することを含み得る。例えば、細胞培養培地の複数のサンプルは、異なる気体状二酸化炭素レベルで平衡化され得、異なる量の強酸または強塩基を含有する。平衡化されると、サンプルのｐＨを測定し、ｐＨデータを電荷平衡モデルに適合させて、関数関係および正味の培地中の酸濃度を決定することができる。複数のサンプルは例えば、第１の量の添加された酸または塩基を含み、異なる気体状二酸化炭素レベルで平衡化された第１のセットのサンプルと、第２の量の添加された酸または塩基（第１の量とは異なる）を含み、異なる気体状二酸化炭素レベルで平衡化された第２のセットのサンプルを含むことができる。複数のサンプルは、複数のサンプルのｐＨを測定する前に、所望の操作温度（すなわち、培養温度）で平衡化することができる。関数関係および正味の培地中の酸は、温度依存性パラメータであり得るので、それらを操作温度で決定することが好ましい。それにもかかわらず、培地は別の温度（例えば、室温、またはほぼ２５℃）で調製することができる。

【0120】

いくつかの実施形態において、所望の培養温度は、約３５℃～約４０℃、例えば約３６℃～約３７℃、または約３６．５℃である。いくつかの実施形態において、培養温度は、哺乳動物細胞の増殖を増強するように最適化される。いくつかの実施形態において、所望の培養温度は、約２５℃～約３５℃、例えば約２７℃～約３２℃、または約２７℃～約３０℃である。いくつかの実施形態において、培養温度は、昆虫細胞の増殖を増強するように最適化される。いくつかの実施形態において、培養温度は、細菌細胞の増殖を増強するように最適化される。いくつかの実施形態において、培養温度は、ウイルス複製を増強するように最適化される。

【0121】

いくつかの実施形態において、細胞培養培地は無血清培地である。

【0122】

図１（ＦＩＧ．１）は、細胞培養培地のｐＨを調整する例示的な方法を示す。１０２において、細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、および細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度が得られる。これらのパラメータはたとえば、パラメータを経験的に決定することによって、または別の事業体からパラメータを受け取ることによって取得され得る。１０４において、細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度を得るために、炭酸塩または重炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウム）が細胞培養培地に添加される。１０６において、電荷平衡モデルを用いて、細胞培養培地の所望のｐＨを得るために、細胞培養培地に添加されるべき強酸または強塩基の量を決定する。電荷平衡モデルは、少なくとも細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度、細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度、および所望のｐＨに基づく。１０８において、細胞培養培地のｐＨは、決定された量の強酸または強塩基を細胞培養培地に添加することによって調整される。
細胞を培養し、ポリペプチドを製造するための方法

【0123】

細胞を培養する方法は、本明細書に記載の方法に従って細胞培養培地のｐＨを調整すること、およびｐＨ調整された細胞培養培地中で細胞を培養することを含み得る。例えば、細胞を培養する方法は、細胞培養培地について、細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、および細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度を得ること；細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度を得るために、細胞培養培地に炭酸塩または重炭酸塩を添加すること；電荷平衡モデルを使用して、細胞培養培地のｐＨを所望のｐＨに調整するために、細胞培養培地に添加されるべき強酸または強塩基の量を決定すること（ここで、電荷平衡モデルは、少なくとも細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体状二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、細胞培養培地中の正味培地中の酸濃度、細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度、および所望のｐＨに基づく）；および決定された量の強酸または強塩基を細胞培養培地に加え、それによりｐＨ調整された細胞培養培地を作製すること；およびｐＨ調整された細胞培養培地中で細胞を培養することを含み得る。

【0124】

細胞培養培地中で培養される細胞は、任意の好適な細胞型であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である。例示的な哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３、３Ｔ６、Ａ４９、Ａ９、ＡｔＴ－２０、ＢＡＬＢ／３Ｔ３、ＢＨＫ－２１、ＢＨＬ－１００、ＢＴ、Ｃａｃｏ－２、Ｃｈａｎｇ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１）、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－３、ＣＯＳ－７、ＣＲＦＫ、ＣＶ－１、Ｄ－１７、Ｄａｕｉｄｉ、ＧＨ１、ＧＨ３、Ｈ９、ＨａＫ、ＨＣＴ－１５、ＨｅＬａ、ＨＥｐ－２、ＨＬ－６０、ＨＴ－１０８０、ＨＴ－２９、ＨＵＶＥＣ、Ｉ－１０、ＩＭ－９、ＪＥＧ－２、Ｊｅｎｓｅｎ、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ－５６２、ＫＧ－１、Ｌ２、ＬＬＣ－ＷＲＣ２５６、ＭｃＣｏｙ、ＭＣＦ７、ＷＩ－３８、ＷＩＳＨ、ＸＣ、およびＹ－１細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、またはＳｃｈｎｅｉｄｅｒ２（Ｓ２）細胞などの昆虫細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、植物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、酵母細胞、例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト幹細胞などの幹細胞、または分化細胞型である。

【0125】

細胞は、任意の好適な温度で培養することができ、例えば、培養される細胞のタイプに基づいて選択することができる。いくつかの実施形態において、培養温度は、約３５℃～約４０℃、例えば約３６℃～約３７℃、または約３６．５℃などである。いくつかの実施形態において、培養温度は、哺乳動物細胞の増殖を増強するように最適化される。いくつかの実施形態において、培養温度は、約２５℃～約３５℃、例えば、約２７℃～約３２℃、または約２７℃～約３０℃である。いくつかの実施形態において、培養温度は、昆虫細胞の成長を増強するように最適化される。いくつかの実施形態において、培養温度は、細菌細胞増殖を増強するように最適化される。いくつかの実施形態において、培養温度は、ウイルス複製を増強するように最適化される。

【0126】

本明細書に記載の方法の１つの特定の長所は、電荷平衡モデルのための経験的パラメータが、細胞培養に適用されているＣＯ_２の様々なモル分率に対して細胞培養培地のパラメータが使用できることである。したがって、選択されたＣＯ_２のモル分率は、モデルパラメータを再決定する必要なく、所望に応じて変更することができる。したがって、例えば、異なる細胞株が、同じ細胞培地組成物中であるが、異なるモル分率のＣＯ_２で培養される場合、該モデルは、それぞれの培養に適用され得る。本方法のいくつかの実施において、細胞は、ＣＯ_２の約０．１％～約２０％モル分率、例えばＣＯ_２の約０．１％～約０．５％モル分率、ＣＯ_２の約０．５％～約１％モル分率、ＣＯ_２の約１％～約２％モル分率、ＣＯ_２の約２％～約５％モル分率、ＣＯ_２の約５％～約１０％モル分率、ＣＯ_２の約１０％～約１５％モル分率、またはＣＯ_２の約１５％ないし約２０％モル分率下で、細胞培養培地中で培養される。

【0127】

ｐＨ調整された細胞培養培地中で培養される細胞は、ポリペプチドをコードする核酸分子を含み得る。例えば、細胞は、ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む宿主細胞であってもよい。

【0128】

本明細書に記載されるｐＨ調整された細胞培養培地は、抗体または抗体フラグメントなどのポリペプチドを製造するために細胞を培養する方法において使用され得る。ｐＨ調整された細胞培養培地中で培養されてる細胞によって産生されるポリペプチドは、宿主細胞と同種であってもよく、または好ましくは、外来性であってもよく、つまり利用される宿主細胞と異種、すなわち外来であることを意味し、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞によって産生されるヒトタンパク質、または哺乳動物細胞によって産生される酵母ポリペプチドなどである。一つの変形形態において、ポリペプチドは、宿主細胞によって培地中に直接分泌される哺乳動物ポリペプチドである。別の変形形態において、ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞の溶解によって培地中に放出される。

【0129】

宿主細胞において発現可能な任意のポリペプチドは、本開示に従って製造され得、提供される組成物中に存在し得る。ポリペプチドは、宿主細胞に対して内因性である遺伝子から、または遺伝子工学によって宿主細胞に導入される遺伝子から発現され得る。ポリペプチドは、天然に存在するものであってもよく、あるいは操作または選択された配列を有する可能性がある。操作されたポリペプチドは、天然に個々に存在する他のポリペプチドセグメントから組み立てられてもよく、または天然に存在しない１つ以上のセグメントを含んでもよい。

【0130】

本発明に従って望ましく発現され得るポリペプチドは、興味深い生物学的または化学的活性に基づいて選択され得る。例えば、本発明は、任意の薬学的または商業的に関連する酵素、受容体、抗体、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤などを発現させるために使用され得る。

【0131】

細胞培養において抗体などのポリペプチドを製造するための方法は、当技術分野において周知である。細胞培養において抗体（例えば、全長抗体、抗体フラグメントおよび多重特異性抗体）を製造するための非限定的な例示的方法が、本明細書において提供される。本明細書の方法は、タンパク質ベースの阻害剤などの他のタンパク質の製造のために当業者によって適合させることができる。

【0132】

一般に、細胞は、細胞増殖、維持および／またはポリペプチド産生のいずれかを促進する１つ以上の条件下で、細胞培養培地のいずれかと組み合わせられる（接触させられる）。細胞を培養し、ポリペプチドを製造する方法は、細胞および細胞培養培地を入れる培養容器（バイオリアクター）を使用する。培養容器は、ガラス、プラスチックまたは金属を含む、細胞を培養するのに適した任意の材料から構成され得る。典型的には、培養容器が少なくとも１リットルであり、１０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００リットル以上であり得る。それにもかかわらず、他のサイズの容器、例えば、試験管、マイクロチップ、マルチウェルプレート、または他のサイズのフラスコ、例えば、２５０ｍＬ、１００ｍＬ、５０ｍＬ、２５ｍＬ、１５ｍＬ、１０ｍＬ、もしくはそれ以下を使用してもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。培養プロセス中に調整され得る培養条件にはｐＨおよび温度が含まれるが、これらに限定されない。

【0133】

細胞培養物は一般に、細胞培養物の生存、増殖および生存率（維持）に寄与する条件下で、初期増殖期に維持される。正確な条件は、細胞型、細胞が由来した生物、ならびに発現されるポリペプチドの性質および特徴に応じて変化する。

【0134】

初期増殖期における細胞培養物の温度は主に、細胞培養物が生存可能なままである温度の範囲に基づいて選択される。例えば、初期増殖期の間、ＣＨＯ細胞は、３７℃でよく増殖する。一般に、ほとんどの哺乳類細胞は、約２５℃～４２℃の範囲内で十分に増殖する。好ましくは、哺乳動物細胞は、約３５℃～４０℃の範囲内で十分に増殖する。当業者は、細胞の必要性および生産要件に応じて、細胞を増殖させるための好適な温度または温度を選択することができる。

【0135】

細胞培養物は、酸素化および細胞への栄養素の分散を増加させるために、初期培養期中に撹拌または振盪され得る。本発明によれば、当業者は、温度、酸素化などを含むが、これらに限定されない、初期増殖期中のバイオリアクターの特定の内部条件を制御または調節することが有益であり得ることを理解するのであろう。

【0136】

最初の培養ステップは、増殖期であり、ここで、バッチ細胞培養条件が、組換え細胞の増殖を増強するように、シードトレインを生成するように改変される。増殖期は一般に、細胞が一般に急速に分裂している、例えば増殖している指数関数的増殖の期間を指す。この期間、細胞は通常、限定されないが、１～４日間、例えば、１、２、３、または４日間、および細胞増殖が最適であるような条件下で培養される。宿主細胞の増殖サイクルの決定は、当業者に公知の方法によって特定の宿主細胞について決定することができる。

【0137】

増殖期において、本明細書で提供される基礎培養培地および細胞を、バッチで培養容器に供給することができる。１つの態様における培養培地は、約５％未満または１％未満または０．１％未満の血清および他の動物由来タンパク質を含有する。しかし、必要に応じて、血清および動物由来のタンパク質を使用することができる。それらの増殖の特定の時点で、細胞は、産生期における培養の開始時に培地に接種するための接種材料を形成し得る。あるいは、産生期が増殖期と連続していてもよい。細胞増殖期の後には、一般に、ポリペプチド産生期が続く。

【0138】

ポリペプチド産生期の間、細胞培養物は、細胞培養物の生存および生存率に寄与し、所望のポリペプチドの発現に好適な第２セットの培養条件（増殖期と比較して）下で維持され得る。例えば、その後の産生期間、ＣＨＯ細胞は、２５℃～３８℃の範囲内で十分に組換えポリペプチドおよびタンパク質を発現する。細胞密度もしくは生存率を増加させるために、または組換えポリペプチドもしくはタンパク質の発現を増加させるために、複数の別個の温度シフトを使用することができる。一態様において、本明細書で提供される培地は、ポリペプチドが異なる培地で産生される場合に得られる混入物と比較して、ポリペプチド産生を増加させる方法で使用される場合に、代謝副産物の存在を減少させる。一変形形態において、汚染物質は、活性酸素種である。一態様において、本明細書で提供される培地は、ポリペプチド産物が異なる培地で産生される場合に得られる色強度と比較して、ポリペプチドの産生を増加させる方法で使用される場合に、ポリペプチド産物の色強度を減少させる。一変形形態において、ポリペプチド産生を増加させる方法は、ポリペプチド産生期間の温度シフトステップを含む。さらなる変形形態において、温度シフトステップは、３１℃から３８℃、３２℃から３８℃、３３℃から３８℃、３４℃から３８℃、３５℃から３８℃、３６℃から３８℃、３１℃から３２℃、３１℃から３３℃、３１℃から３４℃、３１℃から３５℃、または３１℃から３６℃までの温度シフトを含む。

【0139】

細胞は、所望の細胞密度または産生力価に達するまで、その後の産生期で維持され得る。一実施形態において、細胞は、組換えポリペプチドに対する力価が最大に達するまで、後続の産生期で維持される。他の実施形態において、培養物は、この時点の前に採取されてもよい。例えば、細胞は、最大生存細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセントの生存細胞密度を達成するのに十分な期間維持され得る。場合によっては、生存細胞密度を最大値に達させ、次いで、培養物を採取する前に生存細胞密度をあるレベルまで低下させることを可能にすることが望ましい場合がある。

【0140】

目的のポリペプチドは、好ましくは分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収され得るか、または分泌シグナルなしで直接発現される場合に宿主細胞溶解物から回収され得る。一態様において、産生されるポリペプチドは、モノクローナル抗体などの抗体である。

【0141】

培養培地または溶解物を遠心分離して、粒子状細胞残屑を除去することができる。その後、ポリペプチドは、汚染物質の可溶性タンパク質およびポリペプチドから精製することができ、以下の手順は好適な精製手順の例である：免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画による；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５を使用するゲル濾過；およびＩｇＧなどの汚染物質を除去するためのプロテインＡセファロースカラム。フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼ阻害剤もまた、精製中のタンパク質分解を阻害するのに有用であり得る。当業者は、目的のポリペプチドに適した精製方法は、組換え細胞培養における発現時のポリペプチドの特性の変化を考慮するための修飾を必要とし得ることを理解するであろう。ポリペプチドは一般に、クロマトグラフィー技術（例えば、プロテインＡ、低ｐＨ溶出工程を有するアフィニティークロマトグラフィー、およびプロセス不純物を除去するためのイオン交換クロマトグラフィー）を用いて精製することができる。抗体について、アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。

【0142】

組換えポリペプチドを含むポリペプチドを発現および単離するための他の方法は、当技術分野で公知である。
コンピュータシステムおよび電子デバイス

【0143】

本明細書で説明する方法は、方法を実施するための電子デバイスまたはシステムの使用を含むことができる。例えば、電子デバイスまたはシステムは、細胞培養培地に添加されるべき酸または塩基の量を決定するために、電荷平衡モデルの１つ以上のモデルパラメータを決定または適合させるために使用され得る。

【0144】

例として、システムまたは電子デバイスは、１つ以上のプロセッサ；および１つ以上のプロセッサに通信可能に結合され、１つ以上のプロセッサによって実行されるときに、システムに、細胞培養培地について、細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体二酸化炭素のモル分率の間の関数関係を示す１つ以上のパラメータ、および細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度を示す正味の培地中の酸のパラメータを受信させ；１つ以上のプロセッサにおいて、細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度を示す炭酸塩または重炭酸塩のパラメータを受信させ；１つ以上のプロセッサにおいて、細胞培養培地の所望のｐＨを示すｐＨパラメータを受信させ；および、電荷平衡モデルを使用して、細胞培養培地のｐＨを所望のｐＨに調整するために細胞培養培地に添加されるべき強酸または強塩基の量を決定させる命令を記憶するように構成されたメモリーを含むことができ、ここで、電荷平衡モデルは、少なくとも細胞培養培地中の溶解二酸化炭素の濃度と細胞培養培地に適用されている気体二酸化炭素のモル分率の間の関数関係、細胞培養培地中の正味の培地中の酸濃度、細胞培養培地中の所望の炭酸塩または重炭酸塩の濃度、および所望のｐＨに基づく。

【0145】

ユーザは例えば、所望の操作温度で所望のｐＨを得るために、細胞培養培地にどれだけの酸または塩基を添加すべきかを決定するために、システムまたは電子デバイスなどを使用することができる。

【0146】

図２（ＦＩＧ．２）は、一実施形態によるコンピューティングデバイスまたはシステムの一例を示す。デバイス２００は、ネットワークに接続されたホストコンピュータとすることができる。デバイス２００は、クライアントコンピュータまたはサーバとすることができる。図２に示されるように、デバイス２００は、パーソナルコンピュータ、ワークステーション、サーバ、または電話もしくはタブレットなどのハンドヘルドコンピューティングデバイス（ポータブル電子デバイス）など、任意の好適なタイプのマイクロプロセッサベースのデバイスであり得る。デバイスはたとえば、１つ以上のプロセッサ２１０、入力デバイス２２０、出力デバイス２３０、メモリーまたはストレージデバイス２４０、および通信デバイス２６０を含み得る。メモリーまたはストレージデバイス２４０に常駐するソフトウェア２５０は例えば、オペレーティングシステム、ならびに本明細書で説明する方法を実行するためのソフトウェアを含むことができる。入力デバイス２２０および出力デバイス２３０は概して、本明細書で説明するものに対応することができ、コンピュータに接続可能であるか、またはコンピュータと一体化され得る。

【0147】

入力デバイス２２０は、タッチスクリーン、キーボードもしくはキーパッド、マウス、または音声認識デバイスなどの、入力を提供する任意の好適なデバイスであり得る。出力デバイス２３０は、タッチスクリーン、触覚デバイス、またはスピーカなどの、出力を提供する任意の好適なデバイスであり得る。入力デバイス２２０および出力デバイス２３０は、同じデバイスであってもよいし、異なるデバイスであってもよい。

【0148】

ストレージ２４０は、ストレージ（例えば、ＲＡＭ（揮発性および不揮発性）、キャッシュ、ハードドライブ、またはリムーバブルストレージディスクを含む電気、磁気、または光学メモリー）を提供する任意の好適なデバイスであり得る。通信デバイス２６０は、ネットワークインターフェースチップまたはデバイスなど、ネットワークを介して信号を送信および受信することが可能な任意の好適なデバイスを含むことができる。コンピュータの構成要素は、例えば有線媒体（例えば、物理システムバス２８０、イーサネット接続、または任意の他の有線転送技術）または無線（例えば、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、Ｗｉ－Ｆｉ（登録商標）、または任意の他の無線技術）を介して、任意の好適な方法で接続することができる。

【0149】

実行可能命令としてストレージデバイス２４０に記憶され、プロセッサ２１０によって実行されることができる、ソフトウェアモジュール２５０は、例えば、オペレーティングシステムおよび／または本開示の方法の機能を具現化する（例えば、本明細書に記載されるようなデバイスにおいて具現化されるように）プロセスを含むことができる。

【0150】

ソフトウェアモジュール２５０はまた、命令実行システム、装置、またはデバイスからのソフトウェアに関連付けられた命令をフェッチし、命令を実行することができる、本明細書で説明されるものなどの命令実行システム、装置、またはデバイスによって、またはそれらと関連して使用するための、任意の非一時的コンピュータ可読記憶媒体内に、記憶および／または輸送され得る。本開示の文脈では、コンピュータ可読記憶媒体は、命令実行システム、装置、またはデバイスによって、またはそれに関連して使用するためのプロセスを含むか、または記憶することができる、ストレージデバイス２４０などの任意の媒体であり得る。コンピュータ可読記憶媒体の例は、ハードドライブ、フラッシュドライブ、および単一の機能ユニットとして動作する分散モジュールなどのメモリーユニットを含み得る。また、本明細書で説明される様々なプロセスは、上記で説明された実施形態および技法に従って動作するように構成されたモジュールとして具現化され得る。さらに、プロセスは別々に示され、および／または記載され得るが、当業者は上記プロセスが他のプロセス内のルーチンまたはモジュールであり得ることを理解するのであろう。

【0151】

ソフトウェアモジュール２５０はまた、命令実行システム、装置、またはデバイスからソフトウェアに関連付けられた命令をフェッチし、命令を実行することができる、上記で説明したような命令実行システム、装置、またはデバイスによって、またはそれに関連して使用するための、任意のトランスポート媒体内で伝送され得る。本開示の文脈では、トランスポート媒体は、命令実行システム、装置、またはデバイスによって、またはそれに関連して使用するために、プログラミングを通信、伝送、またはトランスポートすることができる任意の媒体とすることができる。トランスポート可読媒体は、電子、磁気、光学、電磁または赤外線の有線または無線伝送媒体を含むことが、これらに限定されない。

【0152】

デバイス２００は、任意の好適なタイプの相互接続された通信システムであり得るネットワークに接続され得る。ネットワークは、任意の好適な通信プロトコールを実装することができ、任意の好適なセキュリティプロトコールによって保護することができる。ネットワークは、ワイヤレスネットワーク接続、Ｔ１またはＴ３回線、ケーブルネットワーク、ＤＳＬ、または電話回線など、ネットワーク信号の送信および受信を実装することができる任意の好適な構成のネットワークリンクを備えることができる。

【0153】

デバイス２００は、任意のオペレーティングシステム、例えば、ネットワーク上で動作するのに適したオペレーティングシステムを使用して実装することができる。ソフトウェアモジュール２５０は、Ｃ、Ｃ＋＋、ＪａｖａまたはＰｙｔｈｏｎなどの任意の好適なプログラミング言語で記述できる。様々な実施形態において、本開示の機能を具現化するアプリケーションソフトウェアは例えば、クライアント／サーバ構成において、またはウェブベースのアプリケーションもしくはウェブサービスとしてのウェブブラウザを通して、異なる構成で展開され得る。いくつかの実施形態において、オペレーティングシステムは、１つ以上のプロセッサ、たとえば、プロセッサ（単数または複数）２１０によって実行される。

【実施例】

【0154】

実施例
実施例１

【0155】

本研究で使用した基礎培地は、Ｃｙｔｉｖａ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）からの化学的に定義された専用培地であった。これは、グルタミン、グルタミン酸、およびアスパラギンを除去したＡｃｔｉＣＨＯＰ培地のカスタムオーダーであった。これらの３つのアミノ酸を、塩化アンモニアと共に、個別にまたは組み合わせてカスタム培地に添加した。このカスタムＡｃｔｉＣＨＯＰ培地はまた、製造業者のレシピあたり１．８ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを有する。７．２７のｐＨ、３６．５℃および３３０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度の１６個の溶液を全て得るために、以下に示されるｐＨモデルによって決定されるように、様々な量の５Ｎ水酸化ナトリウムおよび５Ｍ塩化ナトリウムが添加された。次いで、全ての１６個の溶液を、加湿インキュベーター内の振盪フラスコに、３６．５℃、５％ＣＯ_２および１２５ｒｐｍで入れた。平衡に達した後（１～２日）、サンプルを採取し、それらのｐＨおよびｐＣＯ_２レベルを測定した。

【0156】

ｐＨおよびｐＣＯ_２測定は、特に明記しない限り、Ｓｉｅｍｅｎｓ ＲａｐｉｄＬａｂ ２４８血液ガス分析器を使用して実施した。ｐＣＯ_２は、気相ＣＯ_２の平衡分圧であり、ｍｍＨｇで報告されている。ｐＣＯ_２は、１００％／７６０ｍｍＨｇの係数を使用して、

【数35】

に変換された。

【0157】

ｐＣＯ_２は、時間の経過とともに減少し、培地調製プロセス中にＣＯ_２の脱気が発生したことを示した。培地調製プロセス中のＣＯ_２の脱気を実証するために、上記培地溶液の１つの調製中に実験を行った。溶液を１００ｍｌフラスコ中で調製し、Ｃｉｍａｒｅｃ Ｂａｓｉｃ撹拌プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）上で、速度５に設定して混合した。フラスコに蓋をしておかず、サンプルを５０分間にわたって採取し、これは、単一の溶液を調製するための典型的な時間量である。各サンプルのｐＨおよびｐＣＯ_２を記録した。図３Ａ（ＦＩＧ．３Ａ）は、ｐＣＯ_２が、時間の経過とともに－０．４８ｍｍＨｇ／分の速度で直線的に低下したことを示す；同時に、溶液のｐＨは、時間の経過とともに０．００５８ｐＨ単位／分の速度で直線的に増加した。図３Ｂ（ＦＩＧ．３Ｂ）を参照のこと。５０分後、ｐＣＯ_２は、２４ｍｍＨｇ低下したが、ｐＨは０．２９単位上昇した。この結果は、重炭酸緩衝剤を含有する培地の溶液調製中に予想されるチャレンジを確認した。連続的にＣＯ_２がガス放出されるにつれて、溶液のｐＨは増加し、したがって、滴定プロセスに必要とされる塩基／酸の量は、実験ごとの脱気の正確なタイミングおよび程度に依存し得る。

【0158】

培地溶液のｐＨと温度との関係を実証するために、カスタムＡｃｔｉＣＨＯＰ培地を充填したＡＭＢＲ２５０バイオリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ａｕｂａｇｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて実験を行った。ガス流量は、乾燥基準、１０％ＣＯ_２および９０％空気の濃度を達成するように設定した。続いて温度設定値を３６．５℃から２５℃、さらに１５℃に変更した。それぞれの系が定常状態に達した後、サンプルを採取した。サンプルを、Ｏｒｉｏｎ ＶｅｒｓａＳｔａｒ Ｐｒｏベンチトップメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｐＨについて分析した。以下の図４（ＦＩＧ．４）に示されるように、気相ＣＯ_２が総ガス流量の１０％の濃度に保たれた場合、温度が１０度上昇するごとに、ｐＨは０．１単位増加した。

【0159】

ｐＨと温度の間のこの関係は、予想通りではなかった。重炭酸塩を含む水の場合、温度が上昇するにつれて、ｐＨが低下することが以前に示されていた。Ｇｒｅｅｎ、「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｐＨ ｏｆ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｗａｔｅｒｓ － Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ，Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ，ａｎｄ Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ Ａｌｋａｌｉｎｉｔｙ」、第４１巻、第８号、１７９５－７９７頁（１９４９）を参照。この発見は、細胞培養培地がその物理的特性に影響を及ぼす可能性がある他の緩衝剤および成分を含有していた可能性があるため、細胞培養培地が、水および重炭酸塩だけの溶液とは異なる可能性があるという理論を再び支持した。

【0160】

１６個の溶液についてのｍ、ｓ、および正味の培地中の酸は、これらの異なる溶液が同じ基礎培地に基づいて確立されたものと同じであるとみなされた。まず、製造業者のプロトコールに従って指示されるように、粉末からＡｃｔｉＣＨＯＰのみの溶液（溶液１）を調製した。この溶液のｐＨを記録した。次いで、溶液１を４×２リットルバイオリアクターに入れた。総ガス流量は、２００ｃｃｍ（空気、窒素、およびＣＯ_２）、攪拌速度は２００回転／分、温度は３６．５℃とした。入口のＣＯ_２の構成は、総ガス流量の約４～２０％の範囲の値とした。各％ＣＯ_２レベルで定常状態に達した後、ｐＨおよびｐＣＯ_２測定のためにサンプルを採取した。最後に、溶液１を３６．５℃および５％ＣＯ_２でインキュベーターに入れた。ｐＨおよびｐＣＯ_２測定値は、溶液が平衡に達した後、再び記録した。これらの３つのデータセットとセクション２．４で開発されたｐＨモデルを用いて、式（２０）を最小化することによって、ｍ、ｓ、および正味の培地中の酸の値が同時に見出された。このＡｃｔｉＣＨＯＰ溶液について、パラメータｍは０．８２７±０．０２１、ｓは０．５４０±０．０２６ｍＭ／％ＣＯ_２であり；および正味の培地中の酸は０．０３３Ｍであった。

【0161】

ｐＨモデルを開発する動機は、滴定を用いて同じｐＨで１６個の異なる溶液を調製するのに必要な予想されるより長い時間と予見可能な課題から生じた。滴定法および必要とされる正確な塩基量を予測するためにｐＨモデルを使用するレシピ法の両方を使用して、溶液１を調製することを含む実験を実施した。以下の図５（ＦＩＧ．５）は、各方法がこの溶液を調製するのにどれくらいの時間を要したかを示す。

【0162】

レシピ法を用いて溶液１を調製するのに要した平均時間は、滴定法を用いて必要とした平均時間よりも８分短かった。滴定法はまた、必要とされる時間量においてより多くの変動を有し、これは、塩基／酸の添加により正しいｐＨを達成するために必要とされる余分な時間のためであった。さらに、レシピ法のためにこの溶液を５回調製するための合計時間は、滴定法を用いた２時間半の合計時間と比較して、わずか１時間半であった。また、レシピ法は、単一の人によって複数の溶液を並行して作製することを可能にしたが、滴定法は滴定ステップ中により多くの手動操作を必要とした。

【0163】

両方の方法を用いて溶液を作製した後、それらを２つの異なったバイオリアクターに入れ、５％ＣＯ_２の気相組成で、３６．５℃に設定した。ｐＨデータを図６（ＦＩＧ．６）に示す。

【0164】

予想されたｐＨは、３６．５℃および５％ＣＯ_２で、７．２７であった。レシピ法で調製した溶液のｐＨは７．２７４±０．００５であったが；滴定法で調製した溶液のｐＨは７．２８２±０．００９であった。実際に、両方の方法は、０．０１２単位以内で所望の目標ｐＨを達成し、これは非常に顕著である。室温において滴定を行い、さらに時間をかけてＣＯ_２を脱気するという課題は、ここでは明らかではないようである。これは、おそらく、優れた混合を伴う少量の調製を、同日に連続して行い、そして、ｐＨの綿密なモニタリングを伴う、計量試薬および滴定において極度の注意を払った結果である。これにもかかわらず、滴定法の標準偏差は、依然として比較的小さいが、レシピ法の標準偏差よりほぼ２倍大きかった。対照的に、製造において滴定を使用する培地調製からの経験は、標準偏差が０．１０単位であり、１０倍高いことを実証する。したがって、全体として、レシピ法を用いて培地溶液調製を実施することが依然として有益である。

【0165】

溶液１を用いて測定したｍ、ｓ、および正味の培地中の酸を用いて、平衡状態で３６．５℃および５％ＣＯ_２の温度およびｐＨ目標を有するｐＨモデルを用いて、１６個の培地すべてにわたって同等のｐＨを達成するために添加される塩基の正確な量を決定した。目標ｐＨは７．２７であった。また、同等の浸透圧を確保するために、それぞれの溶液に塩化ナトリウムが添加された。以下の表２は、各溶液を構成するために添加される各成分の量を詳述する。

【表2】

【0166】

作製後、記載の溶液を、ベントキャップを有する２５０ｍｌの三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）に移し、３６．５℃および５％ＣＯ_２（３８ｍｍＨｇ ｐＣＯ_２）のインキュベーターに入れた。各フラスコを、ｐＨおよびｐＣＯ_２測定のためにインキュベーターから取り出し、フラスコ１から始めて一度に１つずつ測定した。図７（ＦＩＧ．７）は、第１の実験における１６個の溶液すべてについての平衡ｐＨおよびｐＣＯ_２を表す。

【0167】

溶液１のｐＨは７．３３であり、予想よりも０．０６単位高く、そのｐＣＯ_２は３４．４ｍｍＨｇであり、予想よりも３．６ｍｍＨｇ低かった。この差は、サンプル採取直前のインキュベーター内部のＣＯ_２レベルの変動によるものである可能性がある。すべての後続溶液のｐＨはより高かったが、それらのｐＣＯ_２は、溶液１の値と比較してより低かった。この傾向は、図８に示すように、第２の実験を繰り返した後に再び観察された。

【0168】

これらの観察の可能性のある説明は、フラスコをサンプリングするためにインキュベーターのドアが開かれるたびに、インキュベーター内部のＣＯ_２レベルがもはや同じではなかったことであり得る。これらの観察は、これらの１６個の異なる溶液が、レシピ法を用いて同じｐＨを達成したと結論付けることを困難にした。しかし、セクション２．３で述べたように、これらの溶液のｐＨとｐＣＯ_２の間には関係があった。したがって、２回の実験にわたる１６個の溶液すべてのｐＨおよびｐＣＯ_２データを、図９（ＦＩＧ．９）に示される式１８に当てはめた。

【0169】

傾き（－ｍ）は、－０．８１５±０．０５４であることが判明したが、ｌｏｇ（１／ｓ）の切片は、０．２８４±０．０３２であることが判明し、パラメータｓは、０．０５２±０．０３２ｍＭ／％と計算された（報告された誤差は、９５％信頼区間に基づく）。これらの２つの値は、セクション３．３で計算されたｐＨモデルパラメータと有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。データを以下の表３に示す。

【表3】

【0170】

平衡データからのパラメータの値は、モデルからのパラメータと一致した。このモデルは、真の平衡を規定していたが、外乱（インキュベーターのＣＯ_２の循環、サンプル間のインキュベーターのドアの開閉など）が存在することを考慮すると、実験結果は、真の平衡状態ではなかった可能性がある。それにもかかわらず、開発されたｐＨモデルは、生データから異なるｐＨおよびｐＣＯ_２を有することが観察された１６個の異なる溶液を提供しが、実際には依然としてモデルに関連していた。これは、気相ＣＯ_２の濃度が全く同じであれば、それぞれの溶液のｐＨが同様であることを意味している。

【0171】

図９（ＦＩＧ．９）の線のＲ^２は、０．９６９であり、調整されたＲ^２値は０．９６８であることが判明した。Ｒ Ｓｔｕｄｉｏプログラムを用いて、正規確率と残差プロットをグラフ化した。図１０Ａ（ＦＩＧ．１０Ａ）の正規確率プロットは、全てのデータが直線上にあることが判明したことを示している。図１０Ｂ（ＦＩＧ．１０Ｂ）の残差プロットは、明らかなパターンを有さず、全ての外部スチューデント化残差値は±２の範囲内であった。したがって、このデータセットは、正規性および等分散性の仮定を満たしており、このモデルに対する適合は良好な適合であったと結論付けることができる。

【0172】

細胞培養培地は、細胞の増殖、代謝、および生産性において重要な役割を果たす。ｐＨはＣＰＰであり、したがって、培地のｐＨを厳密に制御することが重要である。重炭酸ナトリウムは、細胞培養培地で使用される一般的な緩衝剤であるが、重炭酸ナトリウムを用いた細胞培養培地の調製には多くの課題があり；これらの課題は本明細書に記載の方法を用いて対処される。ｐＨモデルは、１６個の培地配合のそれぞれについてレシピを提供するために使用され、これにより、滴定せずに室温でのこれらの培地の調製を可能にし、３６．５℃での５％気相ＣＯ_２との平衡で７．２７のｐＨ目標を満たした。しかし、インキュベーターから採取したフラスコからのサンプルのｐＨ／ｐＣＯ_２測定の難しさのために、これらの１６個の溶液のｐＨおよびｐＣＯ_２は同じではなかった。それにもかかわらず、それらのｐＨおよびｐＣＯ_２は、修正Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈの式を通して関連することが実証された。本明細書に記載されるｐＨモデルはまた、特に複数の溶液が必要とされる場合に、溶液調製プロセスの自動化を可能にするのに役立つことができる。これらの方法は小規模で最も有用であるが、製造規模でも適用可能であり、規模全体でプロセスの頑健性を確保するのに役立ち得る。
実施例２

【0173】

この実施例は、電荷平衡モデルのためのパラメータ決定を実証する。

【0174】

独自の培地（「培地Ａ」）を、製造業者のプロトコールに従って調製した。培地Ａを粉末として提供し、これを水に溶解して基礎液体培地を形成した。基礎液体培地に、６．５ｍＬのＮａＯＨ、次いで１．８ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、続いて最終量の水を加えた。最後に、室温（１５～２５℃）での培地のｐＨを、ｐＨプローブおよび追加量のＮａＯＨまたはＨＣｌを用いて、６．９０～７．５５の範囲内のｐＨに滴定した。

【0175】

２つの３ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクターのそれぞれに、２リットルの調製された培地を充填した（バイオリアクター１およびバイオリアクター２）。３０ｍＬの５Ｎ塩酸を第２のバイオリアクター（バイオリアクター２）中の培地に添加した。

【0176】

バイオリアクターの温度を３６．５℃に設定し、培地を２００ｒｐｍで撹拌した。空気とＣＯ_２を含む気体流をバイオリアクターに供給した。入口ガスの８つの組成を使用した：入口ガス流中の二酸化炭素は、１、２、４、６、８、１０、１５、および２０％であった。ガスの各々の組成について、バイオリアクターは、ｐＨのためのサンプル採取の前に定常状態に達するように操作され、これはＳｉｅｍｅｎｓ ＲＡＰＩＤＬａｂ（登録商標）血液ガス分析器を使用して測定された。

【0177】

１６個の定常状態のそれぞれで測定されたｐＨを表４に報告する。

【表4】

【0178】

電荷平衡モデルを、表１の１６個のサンプルのそれぞれについて実施した。この式の一般的な形式は以下の通りであった：

【数36】

【0179】

細胞培養培地に追加のサプリメントを添加しなかったので、［Ａ^－］および［Ｂ^＋］項を電荷平衡の式から落とした。バイオリアクター２に添加されたＨＣｌを考慮して、［Ｃｌ^－］項が追加された。

【0180】

全ての電荷平衡は、Ｋ_０＝１．７０ｘ１０^－３；Ｋ_１＝４．９８ｘ１０^－７；Ｋ_２＝５．７７ｘ１０－１１；およびＰ＝１を使用した。

【0181】

サンプル１～８の電荷平衡は、［Ｎａ^＋］＝５．２２×１０^－２および［Ｃｌ^－］＝０を使用した。サンプル９～１６の電荷平衡は、［Ｎａ^＋］＝５．１４×１０^－２および［Ｃｌ^－］＝１．４９×１０^－２を使用した。サンプル９～１６の式中のパラメータ［ＮＭＡ^－］は、塩酸の添加によるその希釈を考慮して、０．９８５倍に修正された。

【0182】

１６個の式のそれぞれは：［Ｈ^＋］＝１０^－ｐＨ（ここで、ｐＨはデータ点について測定されたものである）；および各データ点についてバイオリアクター入口ガス流量によって指定されるｙＣＯ２％を有する。

【0183】

次いで、パラメータｍ、Ｋ_Ｈ、および［ＮＭＡ^－］を、すべての電荷平衡について、各平方和に１０^１２をかけたものを最小化することによって決定した。パラメータは、ｍ＝０．６７１；Ｋ_Ｈ＝１４．５ａｔｍ／（ｍｏｌ／Ｌ）；［ＮＭＡ^－］＝０．０３２７ｍｏｌ／Ｌであることが判明した。この最小二乗最小化の間に方程式の系が過剰に決定されたので、各電荷平衡は正確にゼロに等しくなかった。したがって、パラメータフィッティングの平方和は、５．８４ｘ１０^１９であった。

【0184】

図１１（ＦＩＧ．１１）は、測定されたｐＨデータおよび決定されたパラメータを用いて電荷平衡から計算されたモデル適合されたｐＨデータ（表４にも示される）を示す。

【0185】

データとモデル適合された値の差の平方和は、０．１０８であった。１５自由度で割ると、モデル：データ標準偏差の推定値は、０．０８５であった。

【0186】

［ＮＭＡ^－］とｐＨの間の関係を考慮するために、同じデータの第二の分析において、［ＮＭＡ^－］の別の定義を考慮した。ここで、［ＮＭＡ^－］は、以下のように定義された：

【数37】

式中、Ｃ_０ｐとＣ_１ｐは定数である。最小二乗法で求めたパラメータは、ｍ＝１．２５４；Ｋ_Ｈ＝８５．７５ａｔｍ／（ｍｏｌ／Ｌ）；Ｃ_０ｐ＝３．８９×１０^－２；およびＣ_１ｐ＝１．３７×１０^－２であった。パラメータ適合の平方和は、１．６９×１０^１９であった。

【0187】

表５および図１２（ＦＩＧ．１２）は、ｐＨについてのモデル適合された値およびこれらの新しい値からの差異（［ＮＭＡ^－］をｐＨの関数として考慮する）を示す。データとモデル適合された値の差異の平方和は、０．０４４８であった。１５自由度で割ると、モデル：データ標準偏差の推定値は、０．０５４であった。

【表5】

実施例３

【0188】

この実施例は、追加の既知の種の１６の組み合わせを有する細胞培養培地を調製するための水酸化ナトリウムの量を決定するために電荷平衡モデルがどのように使用されるかを実証する。

【0189】

モデルパラメータｍ＝０．８４１２、Ｋ_Ｈ＝２０．１０ａｔｍ／（ｍｏｌ／Ｌ）、および［ＮＭＡ^－］＝２．８９ｘ１０－２ｍｏｌ／Ｌで指定され、一般的な基礎培地Ｃの調製中に使用される初期量の５．３ｍＬＮａＯＨとともに、電荷平衡モデルを使用して、４つの既知の成分を様々な組合せで添加した場合に、合計１６個の異なる培地調製物に対して、培地Ｃに添加するのに必要がある水酸化ナトリウムの量を推定した。

【0190】

４つのさらなる既知の成分は、グルタミン酸塩、グルタミン、アスパラギン、および塩化アンモニウムである。平衡におけるすべてのアニオンおよびカチオンの濃度を、ｐＫａ値を用いて決定した。３つのｐＫａ値を有するグルタミン酸の場合、以下の解離／会合平衡を考慮した：

【数38】

式中、［Ｇｌｕ_０］は、添加されたグルタミン酸とそのイオンの総和である。３７℃において、Ｋ_ａ１、Ｋ_ａ２、Ｋ_ａ３の値は、それぞれ６．４８×１０^－３ｍｏｌ／Ｌ、５．６２×１０^－５ｍｏｌ／Ｌ、および２．１４×１０^－１０ｍｏｌ／Ｌである。

【0191】

グルタミンの場合、以下の解離／会合平衡を考慮した：

【数39】

式中、［Ｇｌｎ_０］は、添加されたグルタミンおよびそのイオンの濃度の合計である。３７℃における、Ｋ_ａ１およびＫ_ａ２の値は、それぞれ６．７６×１０^－３ｍｏｌ／Ｌおよび６．７６×１０^－１０ｍｏｌ／Ｌである。

【0192】

アスパラギンの場合、以下の解離／会合平衡を考慮した：

【数40】

式中、［Ａｓｎ_０］は、添加されたアスパラギンとそのイオンの濃度の合計である。３７℃における、Ｋ_ａ１およびＫ_ａ２の値は、それぞれ９．５５×１０^－３ｍｏｌ／Ｌおよび１．５８×１０^－９ｍｏｌ／Ｌである。

【0193】

アンモニアの場合、アンモニアは、塩化アンモニウム塩に由来する：

【数41】

式中、［ＮＨ_３，０］は、添加されたアンモニアとそのイオンの濃度の合計である。３７℃における、Ｋ_ａＡの値は、５．７５×１０^－１０ｍｏｌ／Ｌである。

【0194】

電荷平衡モデルは、以下のように書かれる：

【数42】

式中、［Ｎａ⁺］_Ｔは、レシピ（ｒｅｃｉｐｅ）の重炭酸ナトリウム、レシピ（ｒｅｃｉｐｅ）の水酸化ナトリウム、および所望のｐＨを達成するために必要とされる追加の（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ）量のＮａＯＨから得られる［Ｎａ⁺］の総量である。また、［Ｃｌ^－］は、アンモニウム試薬中のその存在を説明するための追加の項である。

【数43】

【0195】

これらの方程式を用いて、１６個の異なる培地のそれぞれについて、ｙＣＯ_２％＝５％、Ｔ＝３７℃、およびｐＨ＝７．３０の目標プロセス条件を指定した後に必要とされるＮａＯＨの量を計算した。表６Ａおよび６Ｂ（全ての濃度はｍｏｌ／Ｌ）は、添加する必要があるＮａＯＨの量を含む、細胞培養培地中の成分の濃度を示す。

【表6】

【0196】

レシピ重炭酸ナトリウムおよびレシピＮａＯＨからのＮａ^＋の濃度は、全ての培地について一定であり、それらは、それぞれ、２．１０Ｅ－０２Ｍおよび２．６０Ｅ－０２に等しい。

【0197】

各培地は、４つの成分：グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、およびアンモニアの全ての１６個の可能な組み合わせの独自の組み合わせであった。グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、およびアンモニアの出発濃度は、それぞれ３．００Ｅ－０３Ｍ、６．００Ｅ－０３Ｍ、５．００Ｅ－０３Ｍ、および２．００Ｅ－０３Ｍであった。使用した塩化アンモニウム試液からのＣｌ^－の濃縮は、２．００Ｅ－０３Ｍであった。

【0198】

ＣＯ_２の濃度は、１．９３Ｅ－０３Ｍと計算され、１気圧で指定されたＣＯ_２濃度が５％であったので、すべての培地で同じであった。

【0199】

使用したＫ_Ｈの値は、２０．１０ａｔｍ／（ｍｏｌ／Ｌ）であり、使用したｍの値は、０．８４１２であった。正味の培地中の酸（Ｎｅｔ Ｍｅｄｉｕｍ Ａｃｉｄｓ）（ＮＭＡ）濃度はすべての培地で同じであり、２．８９Ｅ－０２ｍｏｌ／Ｌに等しかった。

【0200】

Ｈ^＋の予想される濃度は、７．３０の所望のｐＨから５．０１Ｅ－０８Ｍとなるように計算されたが、丸め誤差のため、それぞれの培地のｐＨは正確に７．３０ではなかった。ＯＨ^－イオンの濃度は、Ｈ^＋の濃度からを計算され、４．５９Ｅ－０７と予測されたが、これも丸め誤差のために、近いが、正確には等しくなかった。計算に使用した水のＫ_ｗは、２．３０Ｅ－１４Ｍであった（プロセス温度が３７℃に設定されているため）。

【0201】

各培地に必要なＮａＯＨの量は、電荷平衡の式を用いて表６Ｂの最後の列で計算されていた。

【0202】

上記のように、所望のｐＨを得るために各細胞培地に添加されるＮａＯＨの量を用いて、培養培地を調製し、ｐＨを測定することによってモデルの精度を試験した。１６個の異なる培地を、調製後、Ｔ＝３７℃および５％のＣＯ２設定のインキュベーターで２５０ｍｌの振盪フラスコに入れた。それらを一晩インキュベートして、平衡に達させた。次いで、各フラスコをインキュベーターから一度に１つずつ取り出し、サンプリングし、ＲａｐｉｄＬａｂ ＢＧＡを用いて測定した。

【0203】

フラスコの取り扱い、サンプリング、および測定中に発生したＣＯ_２脱気により、溶存ＣＯ_２濃度はインキュベーター内の５％の平衡濃度ではなかった。したがって、各フラスコのｐＨは、所望の目標よりも高かった。しかしながら、ＲａｐｉｄＬａｂ ｐＣＯ_２データも各サンプルについて収集し、モデルを評価するために測定されたｐＣＯ_２が提供された（表７参照）。測定したｐＣＯ_２値を用いて、各フラスコの新しいｙＣＯ２％値を推定した。定常状態の平衡において、ｙＣＯ２％＝６．５９ｘｐＣＯ_２（ｍｍＨｇ）＋４．６５は、ＲａｐｉｄＬａｂ ＢＧＡのための経験的に決定された方程式である。塩基の体積を最も近いマイクロリットルに丸めるため、各培地についての目標ｐＨは、正確に７．０３０ではない。モデル化されたｐＨおよび測定されたｐＨを表７および図１３（ＦＩＧ．１３）に示す。

【表7】

【0204】

推定されたシグマ値は、０．００６であった。これは、単一のＢＧＡ ｐＨ読み取り値の精度（０．０１～０．０２）の範囲内である。したがって、ＣＯ_２脱気により測定に困難があっても、実際のｙＣＯ２％（測定されたｐＣＯ_２から推定される）がモデル計算に入力されると、溶液のｐＨは、モデルから推定される値であった。

【0205】

１６個の溶液の第２のセットを異なる日に調製し、精度評価を繰り返した。表８および図１４（ＦＩＧ．１４）を参照すると、ＣＯ_２の脱気のために、ｐＨは再度目標よりも高かったが、測定されたｐＣＯ_２における測定されたｐＨおよびモデル計算されたｐＨは非常に類似しており、この事例では、シグマ＝０．００９であった。

【表8】

実施例４

【0206】

この実施例は、調製された溶液のｐＨをＲａｐｉｄＬａｂ（ｐＨ＝７．０４）およびＮＯＶＡ Ｆｌｅｘ ＩＩ（ｐＨ＝７．１５）のモデル値と比較することによって、培地Ｂの目標ｐＨを達成する際の電荷平衡モデルの精度を実証する。

【0207】

培地Ｂを、製造者の手順に従って調製し、次いで、無菌様式でバイオリアクターにポンプ注入した。次いで、バイオリアクターを３７℃に設定し、気体流を１０％ＣＯ_２水準を達成するように設定した。オンラインｐＨが少なくとも１５分間安定した後、定常状態に到達させた。次いで、サンプルを採取して、ＲａｐｉｄＬａｂデバイスおよびＮＯＶＡ Ｆｌｅｘ ＩＩデバイスの両方で測定した。同じまたは異なるバイオリアクターを用いて、同じまたは異なる日に、および同じまたは異なるロットの培地Ｂを用いて、実験を１６回繰り返した。

【0208】

ＮＭＡの濃度は、Ｂ培地について３．４０Ｅ－０２ｍｏｌ／Ｌと算出された。ＲａｐｉｄＬａｂデバイスに基づくｐＨモデルについてのｍおよびＫ_Ｈの値は、それぞれ、０．８４１２および２０．８５ａｔｍ／（ｍｏｌ／Ｌ）であった。ＮＯＶＡ Ｆｌｅｘ ＩＩデバイスに基づくｐＨモデルについてのｍおよびＫ_Ｈの値は、それぞれ、０．９１２８および３１．７８ａｔｍ／（ｍｏｌ／Ｌ）であった。

【0209】

全ての１６個の試験のＲａｐｉｄＬａｂデバイスを使用して測定されたｐＨを図１５(ＦＩＧ．１５）にプロットする。測定されたデータはノイズが多く、この装置の予想モデルｐＨ（ｐＨ＝７．０４）から外れていた。これは、各測定の単一読み取りからのノイズによるものである可能性がある。また、各バイオリアクターの気体流量を制御する各マスフローコントローラー（ＭＦＣ）は、それに伴うノイズを有し、正確に１０％のＣＯ_２モル百分率を提供していない。最後に、測定ノイズのために、培地の各バッチはわずかに異なるように調製され、これも観察された変動するｐＨに寄与した可能性もある。しかし、ＲａｐｉｄＬａｂ（ｎ＝１６）によって測定された平均ｐＨは、７．０５１であることが判明し、標準偏差は０．０２０であった。９５％信頼限界は０．０１１と計算された。７．０４のｐＨ目標からの平均ｐＨの差異は、統計的に有意ではなかった。したがって、培地ＢおよびＲａｐｉｄＬａｂデバイスについてのｐＨモデルは、ＲａｐｉｄＬａｂデバイスを使用して測定されるように、調製された培地ＢのｐＨを正確に予測した。

【0210】

すべての１６個の試験のＮｏｖａ ｆｌｅｘ ＩＩデバイスを使用して測定されたｐＨを図１６（ＦＩＧ．１６）にプロットする。測定されたデータが再びノイズが多く、このデバイスの予想されるモデルｐＨ（ｐＨ＝７．１５）から外れたことは、上記と同様の理由による可能性がある。Ｎｏｖａ ｆｌｅｘ ＩＩ（ｎ＝１６）で測定された平均ｐＨは、７．１４５であることが判明し、標準偏差は０．０４０であった。９５％信頼限界は、０．０１３と計算された。７．１５のｐＨ目標値からの平均ｐＨの差異は、統計的に有意ではなかった。したがって、培地ＢおよびＮＯＶＡ Ｆｌｅｘ ＩＩデバイスのｐＨモデルは、ＮＯＶＡ Ｆｌｅｘ ＩＩデバイスを使用して測定されるように、調製された培地ＢのｐＨを正確に予測した。

【0211】

開示された方法およびシステムの特定の実施が例示され、説明されてきたが、それに対して様々な修正が行われることができ、本明細書で企図されることを、上記から理解されたい。また、本発明は、本明細書内で提供される特定の実施例によって限定されることを意図するものではない。上述の明細書を参照して本発明を説明してきたが、本明細書における好ましい実施形態の説明および例示は限定的な意味で解釈されることを意味しない。さらに、本発明のすべての態様は、様々な条件および変数に依存する本明細書に記載の特定の描写、構成、または相対的比率に限定されないことを理解されたい。本発明の実施形態の形態および詳細における様々な修正は、当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、任意のそのような修正、変形、および均等物も包含することが企図される。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【国際調査報告】