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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-16
(54)【発明の名称】癌治療のためのシアリダーゼのウイルス送達
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20240208BHJP
A61K 38/47 20060101ALI20240208BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240208BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240208BHJP
C12N 15/56 20060101ALI20240208BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240208BHJP
C12N 15/44 20060101ALN20240208BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
A61K38/47
A61P35/00
A61K35/76
C12N15/56 ZNA
C12N15/11 Z
C12N15/44
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023549830
(86)(22)【出願日】2022-02-18
(85)【翻訳文提出日】2023-10-10
(86)【国際出願番号】 EP2022054067
(87)【国際公開番号】W WO2022175446
(87)【国際公開日】2022-08-25
(31)【優先権主張番号】21157979.2
(32)【優先日】2021-02-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21182465.1
(32)【優先日】2021-06-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515160921
【氏名又は名称】ウニヴェルズィテート バーゼル
(74)【代理人】
【識別番号】100149032
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 敏明
(74)【代理人】
【識別番号】100181906
【弁理士】
【氏名又は名称】河村 一乃
(72)【発明者】
【氏名】リューブリ，ハインツ
(72)【発明者】
【氏名】ロドリゲス マントゥアーノ，ナタリア
【テーマコード（参考）】
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084CA01
4C084DC22
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB261
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB26
(57)【要約】
本発明は、固形癌と診断された患者を治療するために単独で又は免疫チェックポイント阻害剤とともに使用される、インフルエンザ由来のノイラミニダーゼ導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスに関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
シアリダーゼをコードする導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ－Ｓｉａ）であって、前記シアリダーゼがインフルエンザウイルス由来であり、それを必要とする患者の癌の治療又は再発予防のために使用される、前記ＡＡＶ－Ｓｉａ。
【請求項2】
前記シアリダーゼが、ａ．インフルエンザウイルスＡ型由来のノイラミニダーゼ、特にＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１０、又はＮ１１ノイラミニダーゼ；又は
ｂ．インフルエンザＢ型ビクトリア、又はヤマガタ系統由来のノイラミニダーゼ；
から選択されるノイラミニダーゼであり、
特に、前記シアリダーゼがＮ１ノイラミニダーゼである、請求項１に記載の使用のためのＡＡＶ－Ｓｉａ。
【請求項3】
前記シアリダーゼが、配列番号００１、配列番号００２、配列番号００３、配列番号００４、配列番号００５、配列番号００６、配列番号００７、配列番号００８、配列番号００９、又は配列番号０１０から選択されるシアリダーゼポリペプチド配列を含むか、又はそれからなり；又は前記シアリダーゼが、配列番号００１、配列番号００２、配列番号００３、配列番号００４、配列番号００５、配列番号００６、配列番号００７、配列番号００８、配列番号００９、又は配列番号０１０から選択される前記シアリダーゼポリペプチド配列と比較して、≧８５％、特に≧９０％、より特に≧９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含むか、又はそれからなるものであって、前記ポリペプチド配列が、前記シアリダーゼポリペプチド配列の生物学的活性の少なくとも９０％を有し；
特に、前記シアリダーゼが、配列番号００１のポリペプチド配列を含むか、又はそれからなり、又は前記シアリダーゼが、配列番号００１と比較して、≧８５％、特に≧９０％、より特に≧９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含むか、又はそれからなり、かつ、配列番号００１のシアリダーゼポリペプチド配列の生物学的活性の少なくとも９０％を有する、請求項１又は２に記載の使用のためのＡＡＶ－Ｓｉａ。
【請求項4】
前記シアリダーゼをコードする導入遺伝子が、配列番号００１、配列番号００２、配列番号００３、配列番号００４、配列番号００５、配列番号００６、配列番号００７、配列番号００８、配列番号００９、又は配列番号０１０から選択されるシアリダーゼポリペプチド配列をコードする核酸配列を含むか、又はそれからなり；又は前記導入遺伝子が、配列番号００１、配列番号００２、配列番号００３、配列番号００４、配列番号００５、配列番号００６、配列番号００７、配列番号００８、配列番号００９、又は配列番号０１０から選択される前記シアリダーゼポリペプチド配列と比較して、≧８５％、特に≧９０％、より特に≧９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含むか、又はそれからなるものであって、前記ポリペプチド配列が、前記シアリダーゼポリペプチド配列の生物学的活性の少なくとも９０％を有し；
特に、前記導入遺伝子が、配列番号０１１、配列番号０１２、配列番号０１３、配列番号０１４、配列番号０１５、配列番号０１６、配列番号０１７、配列番号０１８、配列番号０１９、又は配列番号０２０から選択される核酸配列を含むか、又はそれからなり；
より特に、前記導入遺伝子が、配列番号０１１の前記核酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のためのＡＡＶ－Ｓｉａ。
【請求項5】
前記導入遺伝子が、哺乳動物細胞において導入遺伝子の発現を与えるプロモーター配列に作動可能に連結された導入遺伝子を含むウイルス発現エレメント内に備えられ、特に、前記プロモーター配列がサイトメガロウイルスプロモーターを含むか、又はそれからなり、
より特に、前記プロモーター配列が配列番号０２１の核酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のためのＡＡＶ－Ｓｉａ。
【請求項6】
前記アデノ随伴ウイルスが複製欠損組換えアデノ随伴ウイルスである、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のためのＡＡＶ－Ｓｉａ。
【請求項7】
前記アデノ随伴ウイルスがアデノ随伴２型ウイルスである、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用のためのＡＡＶ－Ｓｉａ。
【請求項8】
前記癌が固形癌であり、特に肝臓癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、子宮頸癌、肺癌、乳癌及び黒色腫から選択される固形癌である、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のためのＡＡＶ－Ｓｉａ。
【請求項9】
前記癌が転移癌として特徴付けられる、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のためのＡＡＶ－Ｓｉａ。
【請求項10】
前記ＡＡＶ－Ｓｉａが腫瘍に直接投与され、特に前記ＡＡＶ－Ｓｉａが腫瘍内注射により投与される、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用のためのＡＡＶ－Ｓｉａ。
【請求項11】
前記患者がチェックポイント阻害剤を投与される予定であるか、現在投与されているか、又は最近投与された、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用のためのＡＡＶ－Ｓｉａ。
【請求項12】
前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１から選択されるチェックポイント分子に対する特異性を有する抗体、より特に、ＰＤ－１に対する特異性を有する抗体である、請求項１１に記載の使用のためのＡＡＶ－Ｓｉａ。
【請求項13】
前記チェックポイント阻害剤が非経口的に投与される、請求項１１又は１２に記載の使用のためのＡＡＶ－Ｓｉａ。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか１項に記載のＡＡＶ－Ｓｉａを含む、それを必要とする患者の癌の治療又は再発予防のために使用するための医薬組成物。
【請求項15】
腫瘍内投与用に製剤化される、請求項１４に記載の使用のための医薬組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、癌の治療に使用するシアリダーゼ遺伝子を有するアデノ随伴ウイルスに関する。
【0002】
本出願は、２０２１年２月１８日に出願された欧州特許出願ＥＰ２１１５７９７９．２及び２０２１年６月２９日に出願された欧州特許出願ＥＰ２１１８２４６５．１の利益を主張するものであり、これらはいずれも参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
腫瘍微小環境の治療的脱シアリル化は、癌の免疫介在性増殖の強力な抑制につながり得る。シアリダーゼはノイラミニダーゼとも呼ばれ、多くの生物に見られる酵素である。ウイルスのシアリダーゼは、最もよく研究されているシアリダーゼの構造である。
【0004】
例えば、免疫刺激性サイトカインを産生する導入遺伝子を有するウイルスの腫瘍内注射は、進行黒色腫患者に対する治療法として承認されており、現在、頭頸部腫瘍、トリプルネガティブ乳癌、皮膚リンパ腫など、さまざまな癌種で研究が進められている。
【0005】
以上のような現状に基づき、本発明の目的は、シアリダーゼの投与により癌を治療する、又は固形癌の治療を補完する手段及び方法を提供することである。この目的は、本明細書の独立請求項の主題によって達成され、本明細書の従属請求項、実施例、図及び一般記載に記載されたさらに有利な実施形態によって達成される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、シアリダーゼ（Ｓｉａ）導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関し、特にインフルエンザ由来のノイラミニダーゼタンパク質をコードするシアリダーゼ（Ｓｉａ）導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関する。本発明のさらなる態様は、本発明に特に関連する投与経路及び投与方法に加えて、癌を治療するための、又は癌と闘うために投与される免疫療法の効果を増強するための医薬品としての、ノイラミニダーゼを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ－Ｓｉａ）の使用に関する。
【0007】
別の実施形態では、本発明は、本発明のＡＡＶ－Ｓｉａと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含み、任意にチェックポイント阻害剤をさらに含む医薬組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
用語と定義
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用され、適宜、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆もまた同様である。以下に定める定義が、参照によりここに組み込まれる文書と矛盾する場合は、ここに定める定義が優先されるものとする。
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用され、適宜、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆もまた同様である。以下に定める定義が、参照によりここに組み込まれる文書と矛盾する場合は、ここに定める定義が優先されるものとする。
【0009】
本明細書で使用される用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」、及び「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、並びに他の類似の形態、及びそれらの文法的等価物は、意味において等価であること、及びこれらの単語のいずれかに続く項目又は項目が、そのような項目又は項目の網羅的なリストであることを意図していないこと、又は列挙された項目又は項目のみに限定されることを意図していない点で、変更可能であることを意図している。例えば、成分Ａ、Ｂ及びＣを「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」成形品は、成分Ａ、Ｂ及びＣからなる（すなわち、成分Ａ、Ｂ及びＣだけを含む）こともできるし、成分Ａ、Ｂ及びＣだけでなく、１つ以上の他の成分を含むこともできる。このように、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及びその類似の形態、並びにその文法的等価物は、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ」又は「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」の実施形態の開示を含むことが意図され、理解される。
【0010】
値の範囲が提供されている場合、文脈上明らかにそうでないと示されない限り、その範囲の上限と下限の間の、下限の単位の１０分の１までの各介在する値、及びその記載された範囲内の他の記載された値又は介在する値は、記載された範囲内の特に除外された制限を条件として、本開示内に包含されると理解される。記載された範囲に限界値の一方又は両方が含まれる場合、それらの含まれる限界値の一方又は両方を除いた範囲も開示に含まれる。
【0011】
本明細書において、値又はパラメータの「約」は、その値又はパラメータそれ自体に向けられたバリエーションを含む（そして記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載には、「Ｘ」についての記載も含まれる。
【0012】
添付の特許請求の範囲を含め、本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「又は」、「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでない場合を除き、複数の参照語を含む。
【0013】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学）により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学的、遺伝学的、生化学的手法（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇを参照）：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）５ｔｈ Ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）及び化学的手法には標準的な技術が使用される。
【0014】
遺伝子という用語は、転写され翻訳された後、特定のポリペプチド又はタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチド配列は、それが関連する遺伝子のより大きな断片又は全長コード配列を同定するために使用することができる。より大きな断片配列を単離する方法は当業者に知られている。
【0015】
遺伝子発現又は発現という用語、若しくは遺伝子産物という用語は、核酸（ＲＮＡ）の生成過程、又はペプチド若しくはポリペプチドの生成過程（それぞれ転写及び翻訳とも呼ばれる）、あるいはポリペプチド産物を産生するための遺伝情報のプロセッシングを制御する中間過程のいずれか、又はその両方を指す場合がある。遺伝子発現という用語は、ＲＮＡ遺伝子産物、例えば調節ＲＮＡや構造（リボソームなど）ＲＮＡの転写やプロセシングにも適用される。発現ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれる。発現は、転写と翻訳の両方のレベルで、言い換えればｍＲＮＡ及び／又はタンパク質産物で測定することができる。
【0016】
本明細書に開示した配列と類似又は相同（例えば、少なくとも約７０％の配列同一性）の配列も本発明の一部である。いくつかの実施形態において、アミノ酸レベルでの配列同一性は、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上であり得る。核酸レベルでは、配列同一性は約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上であり得る。あるいは、核酸セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下（例えば、非常に高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下）で、鎖の相補体にハイブリダイズする場合には、実質的な同一性が存在する。核酸は、細胞全体、細胞溶解物中、もしくは部分精製又は実質的に純粋な形態で存在することができる。
【0017】
本明細書において、配列同一性及び配列同一性のパーセンテージという用語は、２つの整列された配列を位置ごとに比較することによって決定される配列比較の結果を表す単一の定量的パラメータを指す。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野でよく知られている。比較のための配列のアライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズム、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎの類似性探索法、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）、又はこれらに限定されないが、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によるものである：ＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡを含むがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウエアは、例えば、国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて一般に公開されている。
【0018】
アミノ酸配列の比較の一例として、デフォルト設定を使用するＢＬＡＳＴＰアルゴリズムがある：Ｅ値の閾値：１０；単語サイズ：３；クエリー範囲の最大マッチ数：０；Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１，Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １；構成調整：条件付き構成スコア行列調整。核酸配列の比較のためのそのような例の１つは、デフォルト設定を使用するＢＬＡＳＴＮアルゴリズムである：期待しきい値：１０；単語サイズ：２８；クエリー範囲内の最大マッチ数：０；Ｍａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｓｃｏｒｅｓ：１．－ギャップコスト：線形。別段の記載がない限り、本明細書で提供される配列同一性値は、ＢＬＡＳＴ一連のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））を使用して、タンパク質及び核酸の比較のためにそれぞれ上記で同定されたデフォルトパラメーターを使用して得られた値を指す。
【0019】
パーセンテージを指定しない同一配列への言及は、１００％同一配列（すなわち同一配列）を意味する。
【0020】
本明細書におけるＡＡＶの略語とは、ヒトや他の霊長類に感染する小型の非病原性ウイルスであるアデノ随伴ウイルスのことである。ＡＡＶという用語は、ＡＡＶビリオン及びＡＡＶウイルス粒子と同義であり、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質とカプセル化されたＡＡＶ核酸からなるウイルス粒子に関する。遺伝子導入目的で使用されるＡＡＶ製剤は一般に、複製するためにアデノウイルスのようなヘルパーウイルスとのコインフェクションに依存しているが、複製コンピテントＡＡＶが存在する場合もある。特に断りのない限り、ＡＡＶはすべての亜型又は血清型、複製コンピテント型及び組換え型の両方を指す。ＡＡＶという用語は、血清型ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０などの野生型血清型、及び特定の組織標的選好性を有する合成変異型を包含する。
【0021】
本明細書における導入遺伝子という用語は、ある生物から別の生物に導入された遺伝子又は遺伝物質に関するものであり、ここではＡＡＶベクター内へのノイラミニダーゼ遺伝子の挿入を指す。本発明の実施形態によれば、この用語は、インフルエンザウイルスのＲＮＡゲノム由来のノイラミニダーゼをコードするＯＲＦを包含する。当業者は、この情報に基づいてＤＮＡゲノムアデノウイルスベクターを構築し、インフルエンザノイラミニダーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列を作ることができる。現在の文脈では、この用語は、ＡＡＶベクターに感染した患者の組織への遺伝子配列の発現の移入を指すこともある。
【0022】
シアリダーゼという用語は、本明細書ではノイラミニダーゼという用語と互換的に使用される。本発明でいうシアリダーゼ又はノイラミニダーゼとは、オリゴ糖鎖に結合したノイラミニン酸基の誘導体である非還元性シアル酸残基の切断を触媒するグリコシドヒドロラーゼ酵素のファミリーを指す。
【0023】
本発明の文脈におけるインフルエンザウイルス由来のシアリダーゼという用語は、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のインフルエンザウイルスに天然に存在するノイラミニダーゼタンパク質の公知の変異体の１つを指す。
【0024】
本明細書において、チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤又はチェックポイント阻害抗体という用語は、当該技術分野において免疫チェックポイント機構として知られているものの一部として、Ｔ細胞活性化後のＴ細胞阻害につながるシグナルカスケードを破壊することができる薬剤、特に抗体（又は抗体様分子）を包含することを意味する。チェックポイント阻害剤又はチェックポイント阻害抗体の非限定的な例としては、ＣＴＬＡ－４（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１６４１０）、ＰＤ－１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５１１６）、ＰＤ－Ｌ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＮＺＱ７）、又はＢ７Ｈ３（ＣＤ２７６；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ５ＺＰＲ３）とそれらの天然リガンドとの相互作用を阻害する抗体が挙げられる。
【0025】
本明細書において、抗体という用語は、免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）、Ａ型（ＩｇＡ）、Ｄ型（ＩｇＤ）、Ｅ型（ＩｇＥ）又はＭ型（ＩｇＭ）、それらの抗原結合断片又は一本鎖、並びに関連する又は由来する構築物を含むがこれらに限定されない抗体全体を指す。全抗体は、少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖がジスルフィド結合で連結された糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。ＩｇＧの重鎖定数領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）と軽鎖定数領域（ＣＬ）から構成される。軽鎖定数領域は、ＣＬという１つのドメインから構成される。重鎖と軽鎖の可変領域には抗原と相互作用する結合ドメインがある。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）や古典的補体系の第一成分を含む宿主組織や因子への免疫グロブリンの結合を仲介する可能性がある。この用語は、いわゆるナノボディや単一ドメイン抗体、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片、あるいは単一可変鎖断片（ＳｃＦｖ）多量体などの抗体様分子を包含する。
【0026】
本明細書で使用される場合、医薬組成物という用語は、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩を、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とともに指す。特定の実施形態では、本発明による医薬組成物は、局所投与、非経口投与又は注射投与に適した形態で提供される。
【0027】
本明細書で使用される場合、薬学的に許容される担体という用語は、当業者に公知であるような、任意の溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定化剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、染料など、及びそれらの組み合わせを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、ＩＳＢＮ０８５７１１０６２４を参照のこと）。
【0028】
本明細書で使用される場合、任意の疾患又は障害（例えば、癌）の治療又は処置という用語は、一実施形態において、疾患又は障害を改善すること（例えば、悪性腫瘍疾患の発生、拡大、又は増殖速度を遅らせるか、阻止するか、又は低減すること）を指す。別の実施形態では、「治療する」又は「処置する」とは、患者が識別できない可能性のあるものも含めて、少なくとも１つの身体的パラメータを緩和又は改善することを指す。さらに別の実施形態では、「治療」又は「処置」とは、身体的（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的（例えば、身体的パラメーターの安定化）、又はその両方のいずれかで、疾患又は障害を調節することを指す。疾患の治療及び／又は予防を評価する方法は、本明細書で特に説明しない限り、当技術分野で一般的に知られている。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】図１は、ＡＡＶ２－Ｓｉａコンストラクトの設計を示す。ＡＡＶ２ウイルスは、ノイラミニダーゼ配列を含むＡＡＶプラスミドとヘルパープラスミドをＨＥＫ２９３細胞に共導入することによって産生された。ノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）は、構成的ＣＭＶプロモーターを有するインフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１ウイルスから得られた。ＡＡＶプラスミドでは、野生型ＡＡＶのＲＥＰ遺伝子とＣＡＰ遺伝子が欠失し、２コピーの逆末端反復（ＩＴＲ）が残っている。
【図2A】図２Ａ～Ｄは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＡＶ－Ｓｉａ腫瘍細胞の脱シアリル化を示す。腫瘍細胞株Ａ Ｂ１６Ｄ５、Ｂ ＭＣ３８、Ｃ ＥＭＴ６、Ｄ Ｈｅｌａを９６ウェルプレートに１０４細胞／ウェルで播種した（ｎ－１）。ＡＡＶ－Ｓｉａを指示濃度／細胞（感染多重度、ＭＯＩ）で添加し、７２時間後に細胞をトリプシンで剥離し、脱シアリル化糖鎖に結合するＰＮＡ（ピーナッツアグルチニン）、又は細胞表面のシアル酸残基に結合するＭＡＡ ＩＩ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）とＳＮＡで染色した。ＰＮＡ、ＭＡＡＩＩ又はＳＮＡ（Ｓｕｃｕｍｂｕｓ Ｎｉｇｒａ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーで取得した。
【図2B】図２Ａ～Ｄは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＡＶ－Ｓｉａ腫瘍細胞の脱シアリル化を示す。腫瘍細胞株Ａ Ｂ１６Ｄ５、Ｂ ＭＣ３８、Ｃ ＥＭＴ６、Ｄ Ｈｅｌａを９６ウェルプレートに１０４細胞／ウェルで播種した（ｎ－１）。ＡＡＶ－Ｓｉａを指示濃度／細胞（感染多重度、ＭＯＩ）で添加し、７２時間後に細胞をトリプシンで剥離し、脱シアリル化糖鎖に結合するＰＮＡ（ピーナッツアグルチニン）、又は細胞表面のシアル酸残基に結合するＭＡＡ ＩＩ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）とＳＮＡで染色した。ＰＮＡ、ＭＡＡＩＩ又はＳＮＡ（Ｓｕｃｕｍｂｕｓ Ｎｉｇｒａ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーで取得した。
【図2C】図２Ａ～Ｄは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＡＶ－Ｓｉａ腫瘍細胞の脱シアリル化を示す。腫瘍細胞株Ａ Ｂ１６Ｄ５、Ｂ ＭＣ３８、Ｃ ＥＭＴ６、Ｄ Ｈｅｌａを９６ウェルプレートに１０４細胞／ウェルで播種した（ｎ－１）。ＡＡＶ－Ｓｉａを指示濃度／細胞（感染多重度、ＭＯＩ）で添加し、７２時間後に細胞をトリプシンで剥離し、脱シアリル化糖鎖に結合するＰＮＡ（ピーナッツアグルチニン）、又は細胞表面のシアル酸残基に結合するＭＡＡ ＩＩ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）とＳＮＡで染色した。ＰＮＡ、ＭＡＡＩＩ又はＳＮＡ（Ｓｕｃｕｍｂｕｓ Ｎｉｇｒａ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーで取得した。
【図2D】図２Ａ～Ｄは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＡＶ－Ｓｉａ腫瘍細胞の脱シアリル化を示す。腫瘍細胞株Ａ Ｂ１６Ｄ５、Ｂ ＭＣ３８、Ｃ ＥＭＴ６、Ｄ Ｈｅｌａを９６ウェルプレートに１０４細胞／ウェルで播種した（ｎ－１）。ＡＡＶ－Ｓｉａを指示濃度／細胞（感染多重度、ＭＯＩ）で添加し、７２時間後に細胞をトリプシンで剥離し、脱シアリル化糖鎖に結合するＰＮＡ（ピーナッツアグルチニン）、又は細胞表面のシアル酸残基に結合するＭＡＡ ＩＩ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）とＳＮＡで染色した。ＰＮＡ、ＭＡＡＩＩ又はＳＮＡ（Ｓｕｃｕｍｂｕｓ Ｎｉｇｒａ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーで取得した。
【図3AB】図３ＡＢＣＤは、ＡＡＶ２－Ｓｉａが腫瘍の増殖を阻害し、チェックポイント阻害剤による治療を促進することを示す。ＭＣ３８又はＢ１６Ｄ５細胞をＣ５７Ｂｌ６マウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍の増殖は、倫理的エンドポイントである腫瘍体積１５００ｍｍ３に達するまで、週３回測定された。ＡＡＶ２－Ｓｉａ又はコントロールのＡＡＶ２－ｎｕｌｌ治療は、腫瘍が約５０ｍｍ３に達した時点で開始し、２～３日ごとに４回投与（１０１０ＧＣ）し、５０μｌのＰＢＳで希釈して腫瘍内（ｉ．ｔ．）に注射した。ａ－ＰＤ１抗体も併用治療として４回投与（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）した。ａ－ＰＤ１治療はＡＡＶの２回目の投与から開始され、３～４日ごとに行われた。ＭＣ３８結腸癌マウスモデルにおける腫瘍増殖Ａと生存率Ｂ：ＡＡＶ２－ｓｉａ（ｎ６）、ＡＡＶ２－ｎｕｌｌ（ｎ－５）、ＡＡＶ２－ｓｉａ＋ａ－ＰＤ１（ｎ－５）、ＡＡＶ２－ｎｕｌｌ＋ａ－ＰＤ１（ｎ－６）、ａ－ＰＤ１（ｎ－５）、無処置（ｎ－５）。ａＰＤ－１耐性Ｂ１６Ｄ５メラノーママウスモデルにおける腫瘍増殖Ｃと生存率Ｄ：ＡＡＶ２－ｓｉａ（ｎ－１０）、ＡＡＶ２－ｎｕｌｌ（ｎ－１１）、ＡＡＶ２－ｓｉａ＋ａ－ＰＤ１（ｎ－４）、ＡＡＶ２－ｎｕｌｌ＋ａ－ＰＤ１（ｎ－４）、無処置（ｎ－９）。結果は平均値±ＳＥＭで表した。ｐ値は二元配置アノバ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定）を使用して算出した。生存曲線については、Ｇｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用してｐ値を算出した。＊Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図3CD】図３ＡＢＣＤは、ＡＡＶ２－Ｓｉａが腫瘍の増殖を阻害し、チェックポイント阻害剤による治療を促進することを示す。ＭＣ３８又はＢ１６Ｄ５細胞をＣ５７Ｂｌ６マウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍の増殖は、倫理的エンドポイントである腫瘍体積１５００ｍｍ３に達するまで、週３回測定された。ＡＡＶ２－Ｓｉａ又はコントロールのＡＡＶ２－ｎｕｌｌ治療は、腫瘍が約５０ｍｍ３に達した時点で開始し、２～３日ごとに４回投与（１０１０ＧＣ）し、５０μｌのＰＢＳで希釈して腫瘍内（ｉ．ｔ．）に注射した。ａ－ＰＤ１抗体も併用治療として４回投与（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）した。ａ－ＰＤ１治療はＡＡＶの２回目の投与から開始され、３～４日ごとに行われた。ＭＣ３８結腸癌マウスモデルにおける腫瘍増殖Ａと生存率Ｂ：ＡＡＶ２－ｓｉａ（ｎ６）、ＡＡＶ２－ｎｕｌｌ（ｎ－５）、ＡＡＶ２－ｓｉａ＋ａ－ＰＤ１（ｎ－５）、ＡＡＶ２－ｎｕｌｌ＋ａ－ＰＤ１（ｎ－６）、ａ－ＰＤ１（ｎ－５）、無処置（ｎ－５）。ａＰＤ－１耐性Ｂ１６Ｄ５メラノーママウスモデルにおける腫瘍増殖Ｃと生存率Ｄ：ＡＡＶ２－ｓｉａ（ｎ－１０）、ＡＡＶ２－ｎｕｌｌ（ｎ－１１）、ＡＡＶ２－ｓｉａ＋ａ－ＰＤ１（ｎ－４）、ＡＡＶ２－ｎｕｌｌ＋ａ－ＰＤ１（ｎ－４）、無処置（ｎ－９）。結果は平均値±ＳＥＭで表した。ｐ値は二元配置アノバ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定）を使用して算出した。生存曲線については、Ｇｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用してｐ値を算出した。＊Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【0030】
感染の第一の側面は、インフルエンザ由来シアリダーゼポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む組換えＡＡＶベクターに関する。「ＡＡＶ－Ｓｉａ」という用語は、本明細書を通して「インフルエンザ由来シアリダーゼポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む組換えＡＡＶベクター」という用語と同義に使用される。この意味での組換えとは、インフルエンザ由来のシアリダーゼ導入遺伝子を含む改変ＡＡＶベクターを指す。
【0031】
本発明によるシアリダーゼポリペプチド
本発明の特定の実施形態は、インフルエンザ由来シアリダーゼポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む組換えＡＡＶに関する。インフルエンザノイラミニダーゼポリペプチドの既知の変異体（ＵｎｉｐｒｏｔデータベースにＩＤ：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ２０２１＿０１でリストされている）は、同様の生物学的シアリダーゼ活性を有していれば、実施例で試験したＡＡＶに組み込まれたＡ型ノイラミニダーゼ１（Ｎ１）の実現可能な代替物であると考えられる。
本発明の特定の実施形態は、インフルエンザ由来シアリダーゼポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む組換えＡＡＶに関する。インフルエンザノイラミニダーゼポリペプチドの既知の変異体（ＵｎｉｐｒｏｔデータベースにＩＤ：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ２０２１＿０１でリストされている）は、同様の生物学的シアリダーゼ活性を有していれば、実施例で試験したＡＡＶに組み込まれたＡ型ノイラミニダーゼ１（Ｎ１）の実現可能な代替物であると考えられる。
【0032】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、風土病感染及び免疫化プログラムによりヒト集団に広範な免疫原性が存在するシアリダーゼをコードする。別の実施形態では、シアリダーゼは、より一般的に異なる哺乳動物宿主に感染するインフルエンザ株由来である（表１の代表例を参照）。これは、ＡＡＶ－Ｓｉａを導入した腫瘍細胞に対するワクチン接種又は自然感染に由来する既存の免疫を誘導することが期待される。免疫原性、核酸の長さ（一本鎖ＡＡＶベクターは４．４Ｋｂ以下の導入遺伝子に適しているが、二本鎖の容量はその半分である）、ヒト細胞での発現の適性などの付加的な特徴が、適切なノイラミニダーゼ導入遺伝子を選択するために考慮されることがある。
【0033】
本発明のＡＡＶ－Ｓｉａのいくつかの実施形態では、シアリダーゼ導入遺伝子は、組換えＡＡＶ－Ｓｉａの文脈において、配列番号００１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１）に指定されるポリペプチドと同等の生物学的シアリダーゼ機能を有するＡ型インフルエンザポリペプチドをコードする。
【0034】
導入遺伝子のシアリダーゼ活性は、ＡＡＶ－Ｓｉａによる形質導入後の腫瘍細胞の脱シアリル化レベルを決定するアッセイで測定することができる。例えば、実施例の図２に示されるように、腫瘍細胞株をＡＡＶ－Ｓｉａに暴露した後の蛍光レクチンの存在を測定する試験などである。ＡＡＶ－Ｓｉａベクターを導入した腫瘍細胞でシアリダーゼ導入遺伝子を発現させると、腫瘍細胞表面からシアル酸残基が切断され、検出剤としてのピーナッツアグルチニン（ＰＮＡ）レクチンの結合が増加する。脱シアリル化は、シアリダーゼ導入遺伝子を欠くコントロールベクター又は未導入細胞と比較して、標的細胞あたり２×１０５ウイルス粒子のウイルス用量で、約９９％（Ｂ１６Ｄ５）、３０％（ＥＭＴ６）、７２％（ＭＣ３８）及び４３％ＨｅｌａのＡＡＶ－Ｓｉａ導入腫瘍細胞株におけるＰＮＡ蛍光強度の増加として定義することができる（図２、破線）。シアル酸除去は、ＳＮＡ又はＭＡＡ染色によっても評価できる。本発明の生物学的活性の測定は、以下の「本発明のＡＡＶ－Ｓｉａの生物学的活性」の項で定義する。
【0035】
ＡＡＶ－Ｓｉａの特定の実施形態では、シアリダーゼ導入遺伝子はＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１０又はＮ１１ノイラミニダーゼをコードする（表１の代表例を参照）。
【0036】
ＡＡＶ－Ｓｉａのいくつかの実施形態では、シアリダーゼ導入遺伝子はＮ２インフルエンザノイラミニダーゼである。他の実施形態では、シアリダーゼ導入遺伝子はＮ３インフルエンザノイラミニダーゼである。他の実施形態では、シアリダーゼ導入遺伝子はＮ４インフルエンザノイラミニダーゼである。他の実施形態では、シアリダーゼ導入遺伝子はＮ５インフルエンザノイラミニダーゼである。他の実施形態では、シアリダーゼ導入遺伝子はＮ６インフルエンザノイラミニダーゼである。他の実施形態では、シアリダーゼ導入遺伝子はＮ７インフルエンザノイラミニダーゼである。他の実施形態では、シアリダーゼ導入遺伝子はＮ８インフルエンザノイラミニダーゼである。他の実施形態では、シアリダーゼ導入遺伝子はＮ９インフルエンザノイラミニダーゼである。他の実施形態では、シアリダーゼ導入遺伝子はＮ１０インフルエンザノイラミニダーゼである。他の実施形態では、シアリダーゼ導入遺伝子はＮ１１インフルエンザノイラミニダーゼである。特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子はインフルエンザＡ型Ｎ１ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする。
【0037】
ＡＡＶ－Ｓｉａの代替実施形態では、シアリダーゼ導入遺伝子はＢ型ビクトリア系統ノイラミニダーゼをコードする。さらに他の実施形態では、シアリダーゼ導入遺伝子はＢ型ヤマガタ系統ノイラミニダーゼをコードする。
【0038】
ＡＡＶ－Ｓｉａの他の実施形態では、ＡＡＶ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００２に指定されるポリペプチドを含むか、又はそれからなるＡ型インフルエンザノイラミニダーゼポリペプチドをコードする。他の実施形態では、ＡＡＶ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００３に指定されるポリペプチドを含むか、又はそれからなるノイラミニダーゼポリペプチドをコードする。他の実施形態では、ＡＡＶ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００４に指定されるポリペプチドを含むか、又はそれからなるノイラミニダーゼポリペプチドをコードする。他の実施形態では、ＡＡＶ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００５に指定されるポリペプチドを含むか、又はそれからなるノイラミニダーゼポリペプチドをコードする。他の実施形態では、ＡＡＶ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００６に指定されるポリペプチドを含むか、又はそれからなるノイラミニダーゼポリペプチドをコードする。他の実施形態では、ＡＡＶ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００７に指定されるポリペプチドを含むか、又はそれからなるノイラミニダーゼポリペプチドをコードする。他の実施形態では、ＡＡＶ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００８に指定されるポリペプチドを含むか、又はそれからなるノイラミニダーゼポリペプチドをコードする。他の実施形態では、ＡＡＶ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００９に指定されるポリペプチドを含むか、又はそれからなるノイラミニダーゼポリペプチドをコードする。他の実施形態では、ＡＡＶ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１０に指定されるポリペプチドを含むか、又はそれからなるノイラミニダーゼポリペプチドをコードする。これらのポリペプチド配列は、９種類の一般的なＡ型由来のポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１～００９）及びＢ型由来のノイラミニダーゼポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１０）をコードする。実施例において腫瘍増殖に対抗するのに有効であることが実証された特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１の配列を有するインフルエンザＡ型ノイラミニダーゼ１をコードする。
【0039】
代替実施形態では、ＡＡＶベクターシアリダーゼ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１０と比較して、≧８５％、特に≧９０％、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、より特に≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含むか、又はそれからなるポリペプチドをコードする。ただし、そのシアリダーゼが、そのベースとなる特定のシアリダーゼポリペプチド配列の生物学的活性の少なくとも９０％を有することを条件とする。
【0040】
特定の代替実施形態では、ＡＡＶベクターシアリダーゼ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１と比較して、≧８５％、特に≧９０％、より特に≧９５％の同一性を有するポリペプチド配列、及びＡＡＶベクター発現シアリダーゼポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１の生物学的活性の少なくとも９０％を有するポリペプチド配列を含むか、又はそれからなる変異型ポリペプチドをコードする。
【0041】
本発明のシアリダーゼＡＡＶ導入遺伝子の核酸配列
特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１を有するＮ１ノイラミニダーゼをコードする核酸配列を含む。さらなる特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１を有するＮ１ノイラミニダーゼをコードする核酸配列からなる。
特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１を有するＮ１ノイラミニダーゼをコードする核酸配列を含む。さらなる特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１を有するＮ１ノイラミニダーゼをコードする核酸配列からなる。
【0042】
他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００２を有するインフルエンザノイラミニダーゼをコードする核酸配列を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００３を有するインフルエンザノイラミニダーゼをコードする核酸配列を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００４を有するインフルエンザノイラミニダーゼをコードする核酸配列を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００５を有するインフルエンザノイラミニダーゼをコードする核酸配列を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００６を有するインフルエンザノイラミニダーゼをコードする核酸配列を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００７を有するインフルエンザノイラミニダーゼをコードする核酸配列を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００８を有するインフルエンザノイラミニダーゼをコードする核酸配列を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００９を有するインフルエンザノイラミニダーゼをコードする核酸配列を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１０を有するインフルエンザノイラミニダーゼをコードする核酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0043】
特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１１に指定される配列を含む導入遺伝子を保有する。代替の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１２に指定される配列を有する。さらなる実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１３に指定される配列を有する。さらなる実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１４に指定される配列を有する。さらなる実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１５に指定される配列を有する。さらなる実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１６に指定される配列を有する。さらなる実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１７に指定される配列を有する。さらなる実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１８に指定される配列を有する。さらなる実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１９に指定される配列を有する。さらなる実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０２０に指定される配列を有する。
【0044】
特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａシアリダーゼ導入遺伝子は、核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１１からなる。
【0045】
代替の実施形態は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１０から選択されるアミノ酸配列と比較して、≧８５％、特に≧９０％、より特に≧９５％の配列同一性を有する変異型シアリダーゼポリペプチド配列を含むか、又はそれからなるポリペプチドをコードするシアリダーゼ導入遺伝子を含むＡＡＶ２ベクターを提供する。これらの実施形態によれば、シアリダーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１０の生物学的活性の少なくとも９０％を有する。特定の実施形態では、変異体は、ポリペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１の生物学的機能の少なくとも９０％を有する。特定の実施形態では、ＡＡＶ２ベクターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１に指定されるアミノ酸配列と比較して、≧８５％、特に≧９０％、より特に≧９５％の配列同一性を有し、かつ、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１を有するシアリダーゼの生物学的機能の少なくとも９０％を有するポリペプチド配列を含むか、又はそれからなるポリペプチドをコードするシアリダーゼ導入遺伝子を含む。
【0046】
本発明のシアリダーゼの生物学的活性
本発明のＡＡＶ－Ｓｉａの生物学的活性は、ＡＡＶ－Ｓｉａ導入腫瘍細胞の脱シアリル化を決定するように設計されたｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで測定することができる。同等の生物学的活性は、シアリダーゼ導入遺伝子を欠くベクターと比較して、導入腫瘍細胞表面へのＰＮＡ結合の少なくとも１．２倍の増加、及び／又はＭＡＡ ＩＩ及びＳＮＡ結合の減少の誘導によって定義することができる。あるいは、実施例の図２及び図３に示されるような、動物モデルにおける腫瘍の進行、増殖率、又は広がりの減少も、ＡＡＶ－Ｓｉａの生物学的活性の指標となり得る。
本発明のＡＡＶ－Ｓｉａの生物学的活性は、ＡＡＶ－Ｓｉａ導入腫瘍細胞の脱シアリル化を決定するように設計されたｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで測定することができる。同等の生物学的活性は、シアリダーゼ導入遺伝子を欠くベクターと比較して、導入腫瘍細胞表面へのＰＮＡ結合の少なくとも１．２倍の増加、及び／又はＭＡＡ ＩＩ及びＳＮＡ結合の減少の誘導によって定義することができる。あるいは、実施例の図２及び図３に示されるような、動物モデルにおける腫瘍の進行、増殖率、又は広がりの減少も、ＡＡＶ－Ｓｉａの生物学的活性の指標となり得る。
【0047】
さらなる指示がない場合、変異型シアリダーゼが同等の生物学的活性、すなわち本明細書に記載のシアリダーゼの生物学的活性の９０％を有するかどうかを評価するために、生物学的活性は以下のアッセイで決定される。陽性コントロール組換えＡＡＶ２ベクターは、図１に示すように、ＣＭＶプロモーターの制御下で、変異体が比較される本明細書で提供されるシアリダーゼポリペプチド配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１のインフルエンザノイラミニダーゼ１タンパク質をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１１をコードする核酸からなる導入遺伝子を含んで生成される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１をコードする核酸を、試験する変異型シアリダーゼポリペプチドをコードする核酸に置き換えることにより、試験用組換えＡＡＶ２ベクターを作製する。ＨＥＫ２９３細胞に、野生型ＡＡＶ２のＲＥＰ遺伝子及びＣＡＰ遺伝子をコードする複製ヘルパープラスミドＤＮＡとともに、各Ｇｅｎｅ－ｏｆ－Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＧＯＩ）を有するＡＡＶプラスミドを共導入する。トランスフェクションの２日後、細胞ペレットを採取し、３回の凍結融解サイクルを経てウイルスを放出する。ウイルスはＣｓＣｌ－勾配超遠心分離によって精製され、その後脱塩される。ウイルス力価（ＧＣ／ｍｌ－ゲノムコピー／ｍｌ）は、目的の遺伝子のリアルタイムＰＣＲ測定によって決定される。９０％のＡＡＶタンパク質の純度は、実験においてウイルスストックを使用する前に、ＳＤＳゲル銀染色を使用して確認される。ＭＣ３８、Ｂ１６Ｄ５、Ｈｅｌａ又はＥＭＴ６細胞（好ましくは後者）を、０．１ｍＬのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ， Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５ｍＭグルコース、１％グルタミン、１％ピルビン酸、１％非必須アミノ酸、ストレプトマイシン ペニシリン（５０００Ｕ／ｍｌ）及び１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中に、３７℃、５％ＣＯ２下、９６ウェルプレートに１０４細胞／ウェルで播種する。ＰＢＳ５％グリセロールで保存した各ウイルスストックを細胞培養液で希釈し、プレートの３ウェルに２×１０５の感染倍率（ＭＯＩ）で適用する。７２時間後、細胞培地を除去し、付着細胞をトリプシンで回収し、洗浄する。各ウェルの細胞ペレットを１０μｇ／ｍｌ ＰＮＡ（Ｐｅａｎｕｔ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）に３０分間懸濁する。ＰＢＳで２回洗浄後、細胞ペレットをストレプトアビジン－ＰＥ（１：５００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で３０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＩＣ固定バッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で固定する。フローサイトメトリーにより、各ウェルの細胞におけるＰＥの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の評価を実行する。試験組換えＡＡＶ２ベクターで形質導入された細胞を含む複製ウェルの平均ＰＮＡ－ＰＥは、本明細書で定義されるノイラミニダーゼポリペプチド配列、特に配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１のＮ１ポリペプチドをコードする陽性コントロール組換えＡＡＶ２ベクターの複製サンプルの平均ＭＦＩの少なくとも９０％であり、サンプルが陽性コントロールＡＡＶ－Ｓｉａの生物学的活性の９０％を有することを確認する。
【0048】
本発明のシアリダーゼポリペプチド
本発明の別の側面は、ＡＡＶベクターに関する。特定の実施形態では、ＡＡＶは組換えＡＡＶ１である。特定の実施形態では、ＡＡＶは組換えＡＡＶ２ベクターである。ＡＡＶ２は、広範な細胞指向性を有する遺伝子導入に最もよく利用されるＡＡＶベクターである。しかし、所望の腫瘍細胞標的に適合するように、特異的な組織指向性を有する異なる人工血清型又は天然に存在する血清型を選択することもできる。例えば、気道上皮細胞由来の腫瘍を標的とする場合はＡＡＶ６が選択され、肝臓癌を標的とする場合はＡＡＶ８ベクターが選択され得る。
本発明の別の側面は、ＡＡＶベクターに関する。特定の実施形態では、ＡＡＶは組換えＡＡＶ１である。特定の実施形態では、ＡＡＶは組換えＡＡＶ２ベクターである。ＡＡＶ２は、広範な細胞指向性を有する遺伝子導入に最もよく利用されるＡＡＶベクターである。しかし、所望の腫瘍細胞標的に適合するように、特異的な組織指向性を有する異なる人工血清型又は天然に存在する血清型を選択することもできる。例えば、気道上皮細胞由来の腫瘍を標的とする場合はＡＡＶ６が選択され、肝臓癌を標的とする場合はＡＡＶ８ベクターが選択され得る。
【0049】
特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは肝臓癌の治療に使用するためのものであり、ＡＡＶ－Ｓｉａはインフルエンザノイラミニダーゼポリペプチドの発現を誘導することができるＡＡＶ８ベクターである。
【0050】
特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは肺癌の治療に使用するためのものであり、ＡＡＶ－Ｓｉａはインフルエンザノイラミニダーゼポリペプチドの発現を誘導することができるＡＡＶ６ベクターである。
【0051】
特定の実施形態では、ベクターは組換えＡＡＶ２ベクターであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで様々な癌細胞株において機能的な導入遺伝子の発現を誘導するのに有効であることが実証され、異なる組織由来の癌のマウスモデルにおいて抗腫瘍効果を有する（図２及び３）。
【0052】
特定の実施形態では、ＡＡＶ２ベクターは、インフルエンザＡ型ノイラミニダーゼＮ１ポリペプチドをコードする導入遺伝子を有する。他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、Ｎ２導入遺伝子を保有するＡＡＶ２ベクターである。他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、Ｎ３導入遺伝子を保有するＡＡＶ２ベクターである。他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、Ｎ４導入遺伝子を保有するＡＡＶ２ベクターである。他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、Ｎ５導入遺伝子を保有するＡＡＶ２ベクターである。他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、Ｎ６導入遺伝子を保有するＡＡＶ２ベクターである。他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、Ｎ７導入遺伝子を保有するＡＡＶ２ベクターである。他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、Ｎ８導入遺伝子を保有するＡＡＶ２ベクターである。他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、Ｎ９導入遺伝子を保有するＡＡＶ２ベクターである。他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、Ｎ１０導入遺伝子を保有するＡＡＶ２ベクターである。他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、Ｎ１１導入遺伝子を保有するＡＡＶ２ベクターである。代替の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、Ｂ型ビクトリア系統ノイラミニダーゼをコードする導入遺伝子を有するＡＡＶ２ベクターである。別の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、Ｂ型ヤマガタ系統ノイラミニダーゼをコードするＡＡＶ２ベクターである。
【0053】
他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１を含むポリペプチド配列をコードする導入遺伝子を有するＡＡＶ２である。さらに他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１に指定されるタンパク質をコードする核酸配列からなる導入遺伝子を有するＡＡＶ２である。代替の実施形態では、本発明のＡＡＶ－Ｓｉａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１０に指定されるものから選択されるタンパク質をコードする核酸配列を含むか、又はそれからなる導入遺伝子を含むＡＡＶ２ベクターである。特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１を有するインフルエンザＡ型ノイラミニダーゼをコードするＡＡＶ２ベクターである。
【0054】
本発明のＡＡＶ－Ｓｉａの代替実施形態は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１０から選択される配列と比較して、≧８５％、特に≧９０％、より特に≧９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むか、又はそれからなる変異型シアリダーゼポリペプチドをコードするシアリダーゼ導入遺伝子を含むＡＡＶ２ベクターを提供する。特定の実施形態では、本発明のこの側面による変異型シアリダーゼポリペプチドは、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１のＮ１インフルエンザノイラミニダーゼの生物学的活性の少なくとも９０％を有する。
【0055】
他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、核酸ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１１を含む導入遺伝子を有するＡＡＶ２である。代替の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１２からなるシアリダーゼ導入遺伝子を含むＡＡＶ２である。代替の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１３からなるシアリダーゼ導入遺伝子を含むＡＡＶ２である。代替の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１４からなるシアリダーゼ導入遺伝子を含むＡＡＶ２である。代替の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１５からなるシアリダーゼ導入遺伝子を含むＡＡＶ２である。代替の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１６からなるシアリダーゼ導入遺伝子を含むＡＡＶ２である。代替の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１７からなるシアリダーゼ導入遺伝子を含むＡＡＶ２である。代替の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１８からなるシアリダーゼ導入遺伝子を含むＡＡＶ２である。代替の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１９からなるシアリダーゼ導入遺伝子を含むＡＡＶ２である。代替の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０２０からなるシアリダーゼ導入遺伝子を含むＡＡＶ２である。
【0056】
代替の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０２０と比較して、≧８５％、特に≧９０％、より特に≧９５％の配列同一性を有する配列を有する導入遺伝子を有するＡＡＶ２である。ただし、導入遺伝子によってコードされるポリペプチドのシアリダーゼ活性は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１０の生物学的活性の少なくとも９０％を有することを条件とする。
【0057】
他の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１１を含む導入遺伝子を保有するＡＡＶ２である。より特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１１からなるノイラミニダーゼ導入遺伝子を含むＡＡＶ２である。
【0058】
ＡＡＶはその一本鎖ＤＮＡゲノムにシアリダーゼ配列のプラス鎖又はマイナス鎖のいずれかをカプセル化してビリオンを生成することができるので、ＡＡＶ－Ｓｉａのこの態様に従って規定されるものの相補的核酸配列も本発明に包含される。
【0059】
特定の実施形態では、シアリダーゼ導入遺伝子は、哺乳動物細胞内で作動可能なプロモーター配列の３’方向に位置し、その制御下にある。特定の実施形態では、プロモーター配列はヒト細胞、特に悪性癌細胞で作動可能である。特定の実施形態では、プロモーターはユビキタスプロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは細胞特異的プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターはＣＭＶ最初期プロモーターである。特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０２１を有するＣＭＶ最初期プロモーターの制御下にあるＡ型又はＢ型インフルエンザノイラミニダーゼをコードする核酸配列を含む。
【0060】
代替の実施形態では、Ｅｆ１ａは、実施例で試験したＣＭＶプロモーターと同様の発現特性を有し、市販の複製欠損－ＡＡＶコンストラクトにしばしば組み込まれているので、ＡＡＶ－Ｓｉａは、ヒトＥｆ１ａプロモーターの制御下にあるＡ型又はＢ型インフルエンザノイラミニダーゼをコードする核酸配列を含む。
【0061】
本発明のさらなる側面は、医薬に使用するための、インフルエンザ由来のＡ型又はＢ型ノイラミニダーゼをコードする導入遺伝子を含むＡＡＶベクターに関する。特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、癌と診断された患者を治療するための医薬品として使用される。より特定の実施形態では、上記で規定した側面によるインフルエンザＮ１ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする導入遺伝子を含むＡＡＶ２である。
【0062】
一般的に、癌は発生する組織の種類によって分類される。上皮細胞由来の癌は、癌腫としても知られ、癌症状の９０％を占める。しかし、他の種類の固形組織由来の腫瘍（肉腫としても知られる）や混合由来の腫瘍と闘うために必要な免疫応答は類似している。本発明のこの側面の一実施形態では、固形癌、例えば結腸癌のような癌腫、又は黒色腫のような肉腫を治療するために、上記のようなＡＡＶ－Ｓｉａが提供される。
【0063】
特定の実施形態は、結腸癌、肺癌、乳癌、又は黒色腫から選択される固形癌を治療するためのＡＡＶ－Ｓｉａの使用に関する。
【0064】
特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、組換え導入遺伝子を有するウイルスの腫瘍内注射が、例えば、頭頸部腫瘍、トリプルネガティブ乳癌、又は皮膚リンパ腫を含む、承認された治療プロトコルであるタイプの癌における使用のために提供される。
【0065】
特定の実施形態では、本発明の癌の治療に使用するためのＡＡＶ－Ｓｉａは、ＭＣ３８系によってモデル化された結腸癌と診断された患者を治療するために使用される。
【0066】
特定の実施形態では、本発明による癌の治療に使用するためのＡＡＶ－Ｓｉａは、肺癌と診断された患者の治療に使用され、実施例７で効果的に脱シアリル化されることが示されている。
【0067】
特定の実施形態では、本発明の癌の治療に使用するＡＡＶ－Ｓｉａは、図２で形質導入されたＥＭＴ６細胞によってモデル化されるように、乳癌と診断された患者の治療に使用される。特定の実施形態では、本発明の癌の治療に使用するためのＡＡＶ－Ｓｉａは、トリプルネガティブ乳癌と診断された患者の治療に使用される。
【0068】
【0069】
特定の実施形態では、本発明の癌の治療に使用するためのＡＡＶ－Ｓｉａは、皮膚リンパ腫と診断された患者の治療に使用される。
【0070】
特定の実施形態では、本発明の癌の治療に使用するためのＡＡＶ－Ｓｉａは、頭頸部癌と診断された患者の治療に使用される。
【0071】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、上皮細胞由来の腫瘍と診断された患者の治療に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、癌は膵臓癌である。代替の実施形態では、癌は前立腺癌である。
【0072】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、原発腫瘍とは別の第２の部位への転移を特徴とする癌と診断された患者に使用される。
【0073】
特定の実施形態は、例えば注入によって、マイクロポンプの挿入によって、又は外科的処置の間に腫瘍に直接投与される本発明のＡＡＶ－Ｓｉａの使用に関する。特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは腫瘍内注射によって癌患者に投与される。したがって、本発明のこの側面によるＡＡＶ－Ｓｉａは、あらゆるタイプの固形組織由来の癌又は悪性新生物の増殖を阻害することが妥当であると期待されるが、例えば、びまん性の血球由来の癌は期待できない。
【0074】
ＡＡＶベクターによって送達されるシアリダーゼの免疫調節作用の広範に有益な効果は、単独で投与した場合、又は実施例で示すチェックポイント阻害剤の一種と併用した場合の有効性において観察することができる（図３）。
【0075】
本発明の他の実施形態は、ＡＡＶ－Ｓｉａ使用の医学的に関連する範囲内でチェックポイント阻害剤が投与されていない患者の癌を治療するためのＡＡＶ－Ｓｉａの使用に関する。換言すると、ＡＡＶ－Ｓｉａは、抗ＰＤ－１や抗ＰＤ－Ｌ１などのチェックポイント阻害抗体などの免疫療法剤と併用せずに患者に投与される。
【0076】
癌と診断された患者の治療に使用するＡＡＶ－Ｓｉａの特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞治療を投与されていない患者に使用される。換言すると、ＡＡＶ－Ｓｉａは、養子移植や腫瘍抗原に特異的な組換えＴ細胞と併用することなく患者に投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、ＡＡＶ－Ｓｉａ投与前の３ヶ月間にＣＡＲ Ｔ細胞治療を受けていない患者に使用される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、ＡＡＶ－Ｓｉａ投与時にＣＡＲ Ｔ細胞治療を受けていない患者に使用される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、ＡＡＶ－Ｓｉａ投与後３ヶ月以内にＣＡＲ Ｔ細胞治療を受ける予定の患者に使用される。
【0077】
本明細書に記載のいずれかの態様又は側面で規定される本発明の使用のためのＡＡＶ－Ｓｉａの特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは、ＣＡＲ－Ｔ細胞のような患者の治療に使用される遺伝子移植細胞に投与されることなく、患者に直接投与される。特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは細胞治療の後、又は細胞治療と同時に患者に投与することができる。より特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａは細胞治療を受けていない患者に投与される。細胞治療という用語は、特に腫瘍を標的とする細胞を患者に投与することに関する。
【0078】
組み合わせ治療
代替の実施形態は、特に抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１又は抗ＣＴＬＡ－４チェックポイント阻害抗体から選択される免疫療法と組み合わせて癌患者を治療するために、本発明の先に特定した側面によるＡＡＶ－Ｓｉａを使用することに関する。
代替の実施形態は、特に抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１又は抗ＣＴＬＡ－４チェックポイント阻害抗体から選択される免疫療法と組み合わせて癌患者を治療するために、本発明の先に特定した側面によるＡＡＶ－Ｓｉａを使用することに関する。
【0079】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａとチェックポイント阻害剤は、固形癌に直接投与される併用薬として、一緒に供給される。
【0080】
他の実施形態は、チェックポイント免疫療法剤の非経口投与と共に腫瘍内投与するＡＡＶ－Ｓｉａを提供する。これは、ＡＡＶ－Ｓｉａ投与の医学的に関連する範囲内、例えば本発明のＡＡＶ－Ｓｉａ投与から２ヶ月以内に、チェックポイント阻害剤を最近投与された、現在投与されている、又は投与予定の患者を治療するためのＡＡＶ－Ｓｉａの使用を包含する。
【0081】
本発明の別の側面は、癌の治療に使用するためのチェックポイント阻害剤に関し、チェックポイント阻害剤は、上記で提供された本発明のいずれか１つの側面によるＡＡＶ－Ｓｉａの投与とともに使用するために提供される。いくつかの実施形態では、患者には両方の薬剤が同時に投与される。代替の実施形態では、両方を医学的に適切な範囲内で、例えば１週間交互に投与する。
【0082】
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）とその受容体ＰＤ－Ｌ１との相互作用の阻害剤である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、臨床的に利用可能な抗体医薬であるニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；ＣＡＳ番号９４６４１４－９４－４）、ペムブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｃ．ＣＡＳ番号１３７４８５３－９１－４）、ピジリズマブ（ＣＡＳ番号１０３６７３０－４２－３）、アテゾリズマブ（Ｒｏｃｈｅ ＡＧ；ＣＡＳ番号１３８０７２３－４４－３）、及びアベルマブ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ；ＣＡＳ番号１５３７０３２－８２－８）から選択される。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ；ＣＡＳ番号４７７２０２－００－９）である。
【0083】
特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－１に対する非アゴニストリガンドである。より特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－１に特異的な非アゴニスト抗体である。
【0084】
治療法と投与形態
同様に、必要に応じて上記のチェックポイント阻害剤に加えて、患者にＡＡＶ－Ｓｉａを投与することを含む、それを必要とする患者の癌を治療する方法も本発明の範囲内である。
同様に、必要に応じて上記のチェックポイント阻害剤に加えて、患者にＡＡＶ－Ｓｉａを投与することを含む、それを必要とする患者の癌を治療する方法も本発明の範囲内である。
【0085】
本明細書における腫瘍内投与とは、ＡＡＶ－シアリダーゼを固形腫瘍、腫瘍近傍、腫瘍リンパ節に直接投与することをいう。これは、単回注射でも、間欠注入でも、持続注入でも可能である。代替の実施形態では、腫瘍内投与は、生検や腫瘍切除部位への溶液中のＡＡＶ－Ｓｉａの直接投与など、外科的介入の文脈で行われる。
【0086】
特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗体、フラグメント抗体、抗体様分子、又はプロテインＡドメイン由来のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、２つの重鎖と２つの軽鎖とからなる免疫グロブリンである。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、重鎖又は軽鎖から分離された可変ドメインからなる単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ラクダ科動物に見られる抗体のような重鎖のみからなる重鎖抗体である。
【0087】
特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤はフラグメント抗体である。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、Ｆａｂフラグメント、すなわち抗体の抗原結合フラグメント、又は単鎖可変フラグメント、すなわち抗体の重鎖と軽鎖の可変領域をペプチドリンカーで連結した融合タンパク質である。
【0088】
同様に、本発明の上記側面又は実施形態のいずれかによるチェックポイント阻害剤分子に対する非アゴニストリガンドを含む、癌の治療又は再発防止のための剤形が提供される。
【0089】
本発明によるチェックポイント阻害剤の非経口投与のための剤形としては、皮下、静脈内、肝内又は筋肉内注射の剤形を使用することができる。任意で、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤が存在してもよい。
【0090】
ＡＡＶ－Ｓｉａ又は本発明の免疫チェックポイント阻害剤のいずれかの局所投与も、皮膚癌や皮膚リンパ腫に直接適用される本発明の腫瘍内使用の範囲内である。当業者は、Ｂｅｎｓｏｎ ａｎｄ Ｗａｔｋｉｎｓｏｎ（Ｅｄｓ），Ｔｏｐｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第１版、Ｗｉｌｅｙ ２０１１年、ＩＳＢＮ－１３：９７８－０４７０４５０２９１）；及びＧｕｙ ａｎｄ Ｈａｎｄｃｒａｆｔ：Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｒｅｖｉｓｅｄ ａｎｄ Ｅｘｐａｎｄｅｄ（第２版，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ２００２，ＩＳＢＮ－１３：９７８－０８２４７０８６１０）；Ｏｓｂｏｒｎｅ ａｎｄ Ａｍａｎｎ（Ｅｄｓ．）：Ｔｏｐｉｃａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（第１版，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９；ＩＳＢＮ－１３：９７８－０８２４７８１８３５）．の内容で例示されるように、局所製剤を提供するための広範囲の可能なレシピを認識している。
【0091】
医薬組成物と投与
本発明の別の側面は、本明細書に関連する本発明のいずれか１つの側面によるＡＡＶ－Ｓｉａを含む医薬組成物に関する。特定の実施形態において、組成物は、腫瘍又は腫瘍近傍、又は腫瘍排出リンパ節への局所投与のために処方される。特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａを含む組成物は腫瘍内注射用に製剤化される。他の実施形態では、組成物は、本発明の免疫チェックポイント阻害剤とともにＡＡＶ－Ｓｉａと、薬学的に許容される担体との両方を含む。さらなる実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるような少なくとも２つの薬学的に許容される担体を含む。
本発明の別の側面は、本明細書に関連する本発明のいずれか１つの側面によるＡＡＶ－Ｓｉａを含む医薬組成物に関する。特定の実施形態において、組成物は、腫瘍又は腫瘍近傍、又は腫瘍排出リンパ節への局所投与のために処方される。特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａを含む組成物は腫瘍内注射用に製剤化される。他の実施形態では、組成物は、本発明の免疫チェックポイント阻害剤とともにＡＡＶ－Ｓｉａと、薬学的に許容される担体との両方を含む。さらなる実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるような少なくとも２つの薬学的に許容される担体を含む。
【0092】
本発明の特定の実施形態では、ＡＡＶ－Ｓｉａ又は本発明の免疫チェックポイント阻害剤のいずれかは、通常、薬剤の制御が容易な投与量を提供し、患者に簡易で取り扱いが容易な製品を与えるために、医薬用剤形に製剤化される。
【0093】
本発明のＡＡＶ－Ｓｉａ又は免疫チェックポイント阻害剤のいずれかの局所的使用に関連する本発明の実施形態では、医薬組成物は、水溶液、懸濁液、軟膏、クリーム、ゲル、又は噴霧可能な製剤などの局所投与に適した方法で製剤化される。活性成分を、当業者に公知の可溶化剤、安定化剤、強壮剤、緩衝剤及び保存剤の１種又は２種以上とともに含む、エアロゾルなどによる送達に適した方法で製剤化される。
【0094】
免疫チェックポイント阻害剤を含む医薬組成物は、例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）注射又は注入、腹腔内（ｉ．ｐ．）、皮内、皮下又は筋肉内投与などの非経口投与用に製剤化することができる。
【0095】
本発明の免疫チェックポイント阻害剤の投与レジメンは、特定の薬剤の薬力学的特性、その投与様式及び投与経路；レシピエントの種、年齢、性別、健康状態、病状、及び体重；症状の性質及び程度；同時治療の種類；治療の頻度、投与経路、患者の腎機能及び肝機能、並びに所望の効果などの既知の因子に応じて変化する。特定の実施形態では、本発明の化合物は、１日１回投与してもよいし、１日総投与量を１日２回、３回、又は４回に分けて投与してもよい。
【0096】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物又は組合せは、約５０～７０ｋｇの対象に対して約１～１０００ｍｇの免疫チェックポイント阻害剤の単位用量であり得る。ＡＡＶ－Ｓｉａウイルス粒子の数に対する投与量は、実施例で利用した動物モデル、又は当該技術分野で公知の類似の治療用ＡＡＶベクターから推定することができる。ウイルス、医薬組成物、又はそれらの組み合わせの治療上有効な投与量は、体重、年齢、個々の状態、治療される障害又は疾患若しくはその重症度に依存する。医師や臨床医であれば、障害や疾患の予防、治療、進行抑制に必要な各有効成分の有効量を容易に決定することができる。
【0097】
本発明の医薬組成物は、滅菌のような従来の医薬操作に供することができ、及び／又は従来の不活性希釈剤、潤滑剤、又は緩衝剤、並びに保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤及び緩衝剤などのアジュバントを含有することができる。これらは、標準的なプロセス、例えば、従来の混合、造粒、溶解又は凍結乾燥プロセスによって製造することができる。医薬組成物を調製するための多くのそのような手順及び方法は当該技術分野で公知であり、例えば、Ｌ．Ｌａｃｈｍａｎら，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第４版，２０１３（ＩＳＢＮ８１２３９２２８９２）を参照されたい。
【0098】
本発明の製造方法及び処理方法
本発明はさらに、付加的な側面として、固形腫瘍の治療又は再発予防のための医薬の製造方法における使用のための、本明細書において同定された本発明の態様によるＡＡＶ－Ｓｉａ、及び任意に付加的な免疫チェックポイント阻害剤リガンドの使用を包含する。
本発明はさらに、付加的な側面として、固形腫瘍の治療又は再発予防のための医薬の製造方法における使用のための、本明細書において同定された本発明の態様によるＡＡＶ－Ｓｉａ、及び任意に付加的な免疫チェックポイント阻害剤リガンドの使用を包含する。
【0099】
同様に、本発明は、組織由来の固形腫瘍に関連する疾患と診断された患者の治療方法を包含する。この方法は、本明細書で同定されるＡＡＶ－Ｓｉａの有効量を、特に腫瘍内投与によって、任意に、本明細書で詳細に規定される免疫チェックポイント阻害抗体を非経口投与によって、医学的に関連する範囲内で受けるのと同時、受けた直後、又は受ける直前に、患者に投与することを伴う。
【0100】
本明細書において、例えば、ウイルス株、シアリダーゼ配列、チェックポイント阻害剤、又は医学的適応症のような単一の分離可能な特徴の代替案が「実施形態」として示される場合、そのような代替案は、本明細書に開示される本発明の個別の実施形態を形成するために自由に組み合わせることができることを理解されたい。したがって、ウイルスベクターに関する代替実施形態のいずれかを、チェックポイント阻害剤に関する代替実施形態のいずれかと組み合わせることができ、これらの組み合わせは、本明細書で言及される任意の医療適用と組み合わせることができる。
【0101】
本発明はさらに、以下の項目に関する：
Ａ．インフルエンザウイルス由来のシアリダーゼをコードする導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ－Ｓｉａ）。
Ｂ．項目Ａに記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、シアリダーゼが、
ａ．インフルエンザウイルスＡ型由来のノイラミニダーゼ、特にＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１０、又はＮ１１ノイラミニダーゼ；又は
ｂ．インフルエンザＢ型ビクトリア、又はヤマガタ系統由来のノイラミニダーゼ；
から選択されるノイラミニダーゼであり、
特に前記シアリダーゼがＮ１ノイラミニダーゼである。
Ｃ．項目Ａ又はＢに記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、シアリダーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１０から選択されるシアリダーゼポリペプチド配列を含むか、又はそれからなり；又は、
シアリダーゼは、シアリダーゼポリペプチド配列と比較して、≧８５％、特に≧９０％、より特に≧９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含むか、又はそれからなるものであって、該ポリペプチド配列は、シアリダーゼポリペプチド配列の生物学的活性の少なくとも９０％を有し；
特に、シアリダーゼは、ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１を含むか、又はそれからなる。
Ｄ．項目Ａ～Ｃのいずれか１項に記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、シアリダーゼをコードする導入遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１０から選択されるシアリダーゼポリペプチド配列をコードする核酸配列を含むか、又はそれからなり；又は、
シアリダーゼポリペプチド配列と比較して≧８５％、特に≧９０％、より特に≧９５％の同一性を有するポリペプチド配列であって、該ポリペプチド配列がシアリダーゼポリペプチド配列の生物学的活性の少なくとも９０％を有し；
特に、導入遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０２０から選択される核酸配列を含むか、又はそれからなり；
より特に、核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１１を含むか、又はそれからなる。
Ｅ．導入遺伝子が、哺乳動物細胞において導入遺伝子の発現を与えるプロモーター配列に作動可能に連結された導入遺伝子を含むウイルス発現エレメント内に備えられ、
特に、プロモーター配列がサイトメガロウイルスプロモーターを含むか、又はそれからなり、
より特に、プロモーター配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０２１の核酸配列を含むか、又はそれからなる。
Ｆ．項目Ａ～Ｅのいずれか１項に記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、組換えアデノ随伴ウイルスが、複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス、特に複製欠損アデノ随伴２型ウイルスである。
Ｇ．項目Ａ～Ｆのいずれか１項に記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、それを必要とする患者における癌の治療又は再発予防のための使用のためのものである。
Ｈ．項目Ｇに記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、癌が固形癌であり、特に結腸癌、肺癌、乳癌及び黒色腫から選択される固形癌である。
Ｉ．項目Ｇ又はＨに記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、ＡＡＶ－Ｓｉａが腫瘍に直接投与され、特にＡＡＶ－Ｓｉａが腫瘍内注射により投与される。
Ｊ．項目Ｇ～Ｉに記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、患者がチェックポイント阻害剤を投与される予定であるか、現在投与されているか、又は最近投与された患者である。
Ｋ．項目Ｊに記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１から選択されるチェックポイント分子に対する特異性を有する抗体であり、より詳細にはＰＤ－１を標的とする。
Ｌ．項目Ｊ又はＫに記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、チェックポイント阻害剤が非経口的に投与される。
Ｍ．それを必要とする患者における癌の治療、又は再発予防のために使用するための薬学的組成物であって：
ａ．項目Ａ～Ｉのいずれか１項に記載のＡＡＶ－Ｓｉａ、及び任意に、
ｂ．チェックポイント阻害剤、特にＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１リガンド、より詳細にはＰＤ－１リガンド
を含む。
Ｎ．それを必要とする対象において癌を処置する方法であって、項目Ａ～Ｌのいずれか１項に記載のＡＡＶ－Ｓｉａの有効量、又は項目Ｍに記載の医薬組成物を、該対象に腫瘍内注射により投与することを含む。
Ａ．インフルエンザウイルス由来のシアリダーゼをコードする導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ－Ｓｉａ）。
Ｂ．項目Ａに記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、シアリダーゼが、
ａ．インフルエンザウイルスＡ型由来のノイラミニダーゼ、特にＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１０、又はＮ１１ノイラミニダーゼ；又は
ｂ．インフルエンザＢ型ビクトリア、又はヤマガタ系統由来のノイラミニダーゼ；
から選択されるノイラミニダーゼであり、
特に前記シアリダーゼがＮ１ノイラミニダーゼである。
Ｃ．項目Ａ又はＢに記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、シアリダーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１０から選択されるシアリダーゼポリペプチド配列を含むか、又はそれからなり；又は、
シアリダーゼは、シアリダーゼポリペプチド配列と比較して、≧８５％、特に≧９０％、より特に≧９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含むか、又はそれからなるものであって、該ポリペプチド配列は、シアリダーゼポリペプチド配列の生物学的活性の少なくとも９０％を有し；
特に、シアリダーゼは、ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１を含むか、又はそれからなる。
Ｄ．項目Ａ～Ｃのいずれか１項に記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、シアリダーゼをコードする導入遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１０から選択されるシアリダーゼポリペプチド配列をコードする核酸配列を含むか、又はそれからなり；又は、
シアリダーゼポリペプチド配列と比較して≧８５％、特に≧９０％、より特に≧９５％の同一性を有するポリペプチド配列であって、該ポリペプチド配列がシアリダーゼポリペプチド配列の生物学的活性の少なくとも９０％を有し；
特に、導入遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０２０から選択される核酸配列を含むか、又はそれからなり；
より特に、核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１１を含むか、又はそれからなる。
Ｅ．導入遺伝子が、哺乳動物細胞において導入遺伝子の発現を与えるプロモーター配列に作動可能に連結された導入遺伝子を含むウイルス発現エレメント内に備えられ、
特に、プロモーター配列がサイトメガロウイルスプロモーターを含むか、又はそれからなり、
より特に、プロモーター配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０２１の核酸配列を含むか、又はそれからなる。
Ｆ．項目Ａ～Ｅのいずれか１項に記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、組換えアデノ随伴ウイルスが、複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス、特に複製欠損アデノ随伴２型ウイルスである。
Ｇ．項目Ａ～Ｆのいずれか１項に記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、それを必要とする患者における癌の治療又は再発予防のための使用のためのものである。
Ｈ．項目Ｇに記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、癌が固形癌であり、特に結腸癌、肺癌、乳癌及び黒色腫から選択される固形癌である。
Ｉ．項目Ｇ又はＨに記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、ＡＡＶ－Ｓｉａが腫瘍に直接投与され、特にＡＡＶ－Ｓｉａが腫瘍内注射により投与される。
Ｊ．項目Ｇ～Ｉに記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、患者がチェックポイント阻害剤を投与される予定であるか、現在投与されているか、又は最近投与された患者である。
Ｋ．項目Ｊに記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１から選択されるチェックポイント分子に対する特異性を有する抗体であり、より詳細にはＰＤ－１を標的とする。
Ｌ．項目Ｊ又はＫに記載のＡＡＶ－Ｓｉａであって、チェックポイント阻害剤が非経口的に投与される。
Ｍ．それを必要とする患者における癌の治療、又は再発予防のために使用するための薬学的組成物であって：
ａ．項目Ａ～Ｉのいずれか１項に記載のＡＡＶ－Ｓｉａ、及び任意に、
ｂ．チェックポイント阻害剤、特にＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１リガンド、より詳細にはＰＤ－１リガンド
を含む。
Ｎ．それを必要とする対象において癌を処置する方法であって、項目Ａ～Ｌのいずれか１項に記載のＡＡＶ－Ｓｉａの有効量、又は項目Ｍに記載の医薬組成物を、該対象に腫瘍内注射により投与することを含む。
【0102】
本発明は、以下の実施例及び図によってさらに説明され、そこからさらなる実施形態及び利点を導き出すことができる。これらの実施例は本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【0103】
実施例１：方法
ウイルスコンストラクト
インフルエンザ由来のノイラミニダーゼ１ポリペプチドを、図１に示すように、ＡＡＶ２由来のキャプシドとＩＴＲの両方からなるＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ウイルスに挿入した。組換えＡＡＶウイルスとクローニングはすべてＶｅｃｔｏｒ ＢｉｏＬａｂｓ（ｌｏｔ：１９０７１５＃４５，ＰＯ：ＨＬ＿２０１９＿０２）で行った。つまり、ＨＥＫ２９３細胞に、関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）を持つＡＡＶプラスミドと、ＡＡＶ２キャプシドと複製遺伝子からなる複製ヘルパープラスミドＤＮＡを共導入した。選択されたＧＯＩは、ＣＭＶ（プロモーターＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２１）の制御下にあるノイラミニダーゼ１（インフルエンザＡウイルスＨ１Ｎ１由来のＮ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１１、ＲｅｆＳｅｑ＃ＮＣ＿０２６４３４．１）であった（図１）。ＡＡＶプラスミドでは、野生型ＡＡＶのＲＥＰ遺伝子とＣＡＰ遺伝子が欠失し、２コピーのＩＴＲ（～１４５ｂｐ／個）が残っていた。ＡＡＶ２－ｎｕｌｌ空コントロールベクターも同時に調製した（Ｖｅｃｔｏｒ ＢｉｏＬａｂｓ ＃７０２６）。トランスフェクションの２日後、細胞ペレットを採取し、３回の凍結融解サイクルを経てウイルスを放出した。ウイルスはＣｓＣｌ－勾配超遠心分離で精製し、その後脱塩した。ウイルス力価（ＧＣ／ｍｌ－ゲノムコピー／ｍｌ）はリアルタイムＰＣＲ法で測定した。ＡＡＶタンパク質の純度は、ＳＤＳゲル銀染色を使用して分析し、純度９０％以上のＡＡＶ調製物のみを実験に使用した。
ウイルスコンストラクト
インフルエンザ由来のノイラミニダーゼ１ポリペプチドを、図１に示すように、ＡＡＶ２由来のキャプシドとＩＴＲの両方からなるＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ウイルスに挿入した。組換えＡＡＶウイルスとクローニングはすべてＶｅｃｔｏｒ ＢｉｏＬａｂｓ（ｌｏｔ：１９０７１５＃４５，ＰＯ：ＨＬ＿２０１９＿０２）で行った。つまり、ＨＥＫ２９３細胞に、関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）を持つＡＡＶプラスミドと、ＡＡＶ２キャプシドと複製遺伝子からなる複製ヘルパープラスミドＤＮＡを共導入した。選択されたＧＯＩは、ＣＭＶ（プロモーターＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２１）の制御下にあるノイラミニダーゼ１（インフルエンザＡウイルスＨ１Ｎ１由来のＮ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１１、ＲｅｆＳｅｑ＃ＮＣ＿０２６４３４．１）であった（図１）。ＡＡＶプラスミドでは、野生型ＡＡＶのＲＥＰ遺伝子とＣＡＰ遺伝子が欠失し、２コピーのＩＴＲ（～１４５ｂｐ／個）が残っていた。ＡＡＶ２－ｎｕｌｌ空コントロールベクターも同時に調製した（Ｖｅｃｔｏｒ ＢｉｏＬａｂｓ ＃７０２６）。トランスフェクションの２日後、細胞ペレットを採取し、３回の凍結融解サイクルを経てウイルスを放出した。ウイルスはＣｓＣｌ－勾配超遠心分離で精製し、その後脱塩した。ウイルス力価（ＧＣ／ｍｌ－ゲノムコピー／ｍｌ）はリアルタイムＰＣＲ法で測定した。ＡＡＶタンパク質の純度は、ＳＤＳゲル銀染色を使用して分析し、純度９０％以上のＡＡＶ調製物のみを実験に使用した。
【0104】
ウイルス株
ウイルス株は－８０℃で保存し、凍結融解を繰り返さないようにした。ウイルス株は５％グリセロールＰＢＳで希釈し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では細胞培養液で、ｉｎ ｖｉｖｏ治療ではＰＢＳで希釈した。
ウイルス株は－８０℃で保存し、凍結融解を繰り返さないようにした。ウイルス株は５％グリセロールＰＢＳで希釈し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では細胞培養液で、ｉｎ ｖｉｖｏ治療ではＰＢＳで希釈した。
【0105】
細胞培養
腫瘍細胞株は、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５ｍＭグルコース、１％グルタミン、１％ピルビン酸、１％非必須アミノ酸、ストレプトマイシン、ペニシリン（５０００Ｕ／ｍｌ）、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。Ｂ１６Ｄ５、ＥＭＴ６、ＭＣ３８及びＨｅｌａ細胞株を６ウェルプレートに１０４細胞／ウェルで播種した（ｎ－１）。ＡＡＶ－Ｓｉａを異なる濃度／細胞（感染多重度、ＭＯＩ）で添加し、７２時間後にトリプシンで細胞を剥離し、ＰＮＡ（ピーナッツアグルチニン、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）で染色した。
腫瘍細胞株は、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５ｍＭグルコース、１％グルタミン、１％ピルビン酸、１％非必須アミノ酸、ストレプトマイシン、ペニシリン（５０００Ｕ／ｍｌ）、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。Ｂ１６Ｄ５、ＥＭＴ６、ＭＣ３８及びＨｅｌａ細胞株を６ウェルプレートに１０４細胞／ウェルで播種した（ｎ－１）。ＡＡＶ－Ｓｉａを異なる濃度／細胞（感染多重度、ＭＯＩ）で添加し、７２時間後にトリプシンで細胞を剥離し、ＰＮＡ（ピーナッツアグルチニン、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）で染色した。
【0106】
フローサイトメトリー
ＡＡＶ２－ｓｉａ感染後、細胞株を剥離し、ビオチン化ＰＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）、ＭＡＡＩＩ又はＳＮＡで３０分間染色した後、ＰＢＳで２回洗浄し、ストレプトアビジン－ＰＥで３０分間インキュベートした（１：５００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。細胞を２回洗浄し、ＩＣ固定バッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で固定した。収集はＦｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ ＩＩ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。解析にはＦｌｏｗｊｏとＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用した。
ＡＡＶ２－ｓｉａ感染後、細胞株を剥離し、ビオチン化ＰＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）、ＭＡＡＩＩ又はＳＮＡで３０分間染色した後、ＰＢＳで２回洗浄し、ストレプトアビジン－ＰＥで３０分間インキュベートした（１：５００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。細胞を２回洗浄し、ＩＣ固定バッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で固定した。収集はＦｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ ＩＩ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。解析にはＦｌｏｗｊｏとＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用した。
【0107】
動物実験
マウス実験は現地の倫理委員会（Ｋａｎｔｏｎ Ｂａｓｅｌ Ｓｔａｄｔ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の承認を得た。Ｉｎ ｖｉｖｏ実験には８～１０週齢の雄のＣ５７Ｂｌ／６マウスを使用した。２００μｌのＰＢＳ中のＭＣ３８又はＢ１６Ｄ５細胞懸濁液（５×１０５）をマウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍が最大１５００ｍｍ３（腫瘍末期）に達するまで、腫瘍の増殖と一般的な健康状態を週３回モニターした。ＡＡＶ２－Ｓｉａの投与は腫瘍が約５０ｍｍ３に達した時点で開始し、３～４日ごとに４回（１０９ ＧＣ）投与した。コントロールとして空のベクターを使用した（ＡＡＶ２－ｎｕｌｌ）。全てのウイルスは、５０μｌのＰＢＳで希釈し、腫瘍内に注射した。提示の実験では、抗ＰＤ１抗体、クローンＲＭＰ１－１４（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）も４用量（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の併用治療として使用された。ａ－ＰＤ１治療はＡＡＶの２回目の投与から開始され、３～４日ごとに行われた。
マウス実験は現地の倫理委員会（Ｋａｎｔｏｎ Ｂａｓｅｌ Ｓｔａｄｔ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の承認を得た。Ｉｎ ｖｉｖｏ実験には８～１０週齢の雄のＣ５７Ｂｌ／６マウスを使用した。２００μｌのＰＢＳ中のＭＣ３８又はＢ１６Ｄ５細胞懸濁液（５×１０５）をマウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍が最大１５００ｍｍ３（腫瘍末期）に達するまで、腫瘍の増殖と一般的な健康状態を週３回モニターした。ＡＡＶ２－Ｓｉａの投与は腫瘍が約５０ｍｍ３に達した時点で開始し、３～４日ごとに４回（１０９ ＧＣ）投与した。コントロールとして空のベクターを使用した（ＡＡＶ２－ｎｕｌｌ）。全てのウイルスは、５０μｌのＰＢＳで希釈し、腫瘍内に注射した。提示の実験では、抗ＰＤ１抗体、クローンＲＭＰ１－１４（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）も４用量（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の併用治療として使用された。ａ－ＰＤ１治療はＡＡＶの２回目の投与から開始され、３～４日ごとに行われた。
【0108】
原発腫瘍細胞
原発サンプルは、現地の倫理委員会（ＥＫＮＺ ２０１８－０１９９０）に承認された大学病院の胸部外科から入手した。単一細胞懸濁液の調製のために、腫瘍を採取し、外科標本を機械的に解離し、その後アキュターゼ（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ドイツ）、コラゲナーゼＩＶ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、米国）、ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ、米国）及びＤＮａｓｅ ｔｙｐｅ ＩＶ（Ｓｉｇｍａ、米国）を用いて３７℃で１時間、一定攪拌下で消化した。消化された原発腫瘍を２４ウェルプレートでウェルあたり５×１０４細胞で一晩培養し、同じ日にサンプルに２つの異なるＡＡＶ－Ｓｉａを５日間かけて形質導入した。付着細胞と非付着細胞の両方を５日目に採取し、ビオチン化ＰＮＡで染色して上記と同様にフローサイトメトリー解析を行った。
原発サンプルは、現地の倫理委員会（ＥＫＮＺ ２０１８－０１９９０）に承認された大学病院の胸部外科から入手した。単一細胞懸濁液の調製のために、腫瘍を採取し、外科標本を機械的に解離し、その後アキュターゼ（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ドイツ）、コラゲナーゼＩＶ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、米国）、ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ、米国）及びＤＮａｓｅ ｔｙｐｅ ＩＶ（Ｓｉｇｍａ、米国）を用いて３７℃で１時間、一定攪拌下で消化した。消化された原発腫瘍を２４ウェルプレートでウェルあたり５×１０４細胞で一晩培養し、同じ日にサンプルに２つの異なるＡＡＶ－Ｓｉａを５日間かけて形質導入した。付着細胞と非付着細胞の両方を５日目に採取し、ビオチン化ＰＮＡで染色して上記と同様にフローサイトメトリー解析を行った。
【0109】
実施例２：ＡＡＶ２－ＮＡの設計
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ２－Ｓｉａ）は、哺乳動物細胞に導入するとシアリダーゼを産生するように設計された。インフルエンザノイラミニダーゼＮ１遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１をコード）を増幅／合成し、ＣＭＶ構成プロモーターの制御下にある発現カセット中の市販の複製欠損ＡＡＶ血清型２ウイルスにライゲーションにより挿入した（図１）。Ｎ１遺伝子挿入を欠いたベクターをコントロールとして使用した（ＡＡＶ２－ｎｕｌｌ）。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ２－Ｓｉａ）は、哺乳動物細胞に導入するとシアリダーゼを産生するように設計された。インフルエンザノイラミニダーゼＮ１遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ０１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ００１をコード）を増幅／合成し、ＣＭＶ構成プロモーターの制御下にある発現カセット中の市販の複製欠損ＡＡＶ血清型２ウイルスにライゲーションにより挿入した（図１）。Ｎ１遺伝子挿入を欠いたベクターをコントロールとして使用した（ＡＡＶ２－ｎｕｌｌ）。
【0110】
実施例３：ＡＡＶ２－ＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＡを除去すること
腫瘍細胞感染のｉｎ ｖｉｔｒｏ解析が行われた。ＡＡＶ－Ｓｉａが形質導入された細胞でシアリダーゼの機能的発現を誘導したかどうかを調べるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入された腫瘍細胞の酵素活性、すなわち脱シアリル化を調べるために、フローサイトメトリーと直接ＰＮＡ染色によって脱シアリル化のレベルを分析した。このことは、脱シアリル化糖鎖残基へのレクチンＰＮＡ（ピーナッツアグルチニン）の結合の増加によって示されるように、ＡＡＶ２－Ｓｉａへの曝露が増加すると、ＡＡＶ２－Ｓｉａが腫瘍細胞の脱シアル化を誘導することを示した（図２）。シアル酸残基に直接結合するレクチンＭＡＡ ＩＩ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）とＳＮＡ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ Ｎｉｇｒａ）を使用して、シアル化にもアクセスしたが、形質転換細胞は一貫して結合を減少させた（図２）。
腫瘍細胞感染のｉｎ ｖｉｔｒｏ解析が行われた。ＡＡＶ－Ｓｉａが形質導入された細胞でシアリダーゼの機能的発現を誘導したかどうかを調べるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入された腫瘍細胞の酵素活性、すなわち脱シアリル化を調べるために、フローサイトメトリーと直接ＰＮＡ染色によって脱シアリル化のレベルを分析した。このことは、脱シアリル化糖鎖残基へのレクチンＰＮＡ（ピーナッツアグルチニン）の結合の増加によって示されるように、ＡＡＶ２－Ｓｉａへの曝露が増加すると、ＡＡＶ２－Ｓｉａが腫瘍細胞の脱シアル化を誘導することを示した（図２）。シアル酸残基に直接結合するレクチンＭＡＡ ＩＩ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）とＳＮＡ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ Ｎｉｇｒａ）を使用して、シアル化にもアクセスしたが、形質転換細胞は一貫して結合を減少させた（図２）。
【0111】
実施例４：ＡＡＶ２－Ｓｉａは前臨床マウスモデルにおいて腫瘍の増殖を抑制すること
これらのＡＡＶ２－Ｓｉａウイルスの有効性は、皮下移植したＢＩ６Ｄ５メラノーマとＭＣ３８結腸癌由来の腫瘍にウイルスを腫瘍内投与することで検証された。ＡＡＶ２－ＳｉａウイルスをＣ５７Ｂｌ６マウスの皮下に腫瘍細胞を移植した接合性腫瘍モデルに適用したところ、ＡＡＶ２－ＳｉａとＡＡＶ２－ｎｕｌｌの治療を比較して抗腫瘍効果が観察された（図３）。
これらのＡＡＶ２－Ｓｉａウイルスの有効性は、皮下移植したＢＩ６Ｄ５メラノーマとＭＣ３８結腸癌由来の腫瘍にウイルスを腫瘍内投与することで検証された。ＡＡＶ２－ＳｉａウイルスをＣ５７Ｂｌ６マウスの皮下に腫瘍細胞を移植した接合性腫瘍モデルに適用したところ、ＡＡＶ２－ＳｉａとＡＡＶ２－ｎｕｌｌの治療を比較して抗腫瘍効果が観察された（図３）。
【0112】
実施例５：ＡＡＶ２－Ｓｉａはチェックポイント阻害薬治療に相加的な効果をもたらすこと
ＡＡＶ２－Ｓｉａとａ－ＰＤ１抗体の併用療法は、ＭＣ３８とＢ１５Ｄ５の両モデルにおいて、ＡＡＶ２－Ｓｉａの２回目投与後にａ－ＰＤ１抗体を同時投与することで試験された。この組み合わせは、反応性ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて相加的な利点を示し、ＡＡＶ２－Ｓｉａ群とＡＡＶ２－Ｓｉａ＋ａＰＤ１群を比較すると、コントロールＡＡＶ２－ｎｕｌｌ群及びＡＡＶ２－ｎｕｌｌ＋ａ－ＰＤ１群と比較して、腫瘍増殖率の低下と生存期間の延長が観察された（図３）。３５日目では、ＡＡＶ－Ｓｉａを投与した動物は、抗ＰＤ－１治療単独と比較して、明らかに５０％の生存優位性を示した。本発明のＡＡＶ－Ｓｉａと非アゴニスト抗ＰＤ－１抗体との併用治療により、予想外の相乗的生存優位性がもたらされた。４０日目以降、抗ＰＤ１抗体とＡＡＶ－Ｓｉａの局所投与を組み合わせた全身注射を受けた動物の約８０％が生存していたが、どちらか一方の治療のみを受けた群では生存していた動物はいなかった。メラノーマＢ１６腫瘍は、免疫療法に対してより抵抗性のある癌モデルであるが、ＡＡＶ２－ｎｕｌｌと組み合わせた場合、免疫チェックポイント阻害による腫瘍負荷の有意な減少は見られなかった。しかし、ＡＡＶ２－Ｓｉａは腫瘍増殖率をわずかではあるが有意に減少させ、この減少率はａＰＤ－１治療の追加によって増強されたことから、ＡＡＶ２－Ｓｉａが免疫療法抵抗性癌の感受性を誘導したことが示唆された。併用療法は、この治療抵抗性腫瘍の移植後３４日目の生存率にも相乗効果をもたらし、コントロール群ではわずか２０％、抗ＰＤ１治療群では皆無であったのに対し、この時点まで生存していた動物は５０％であった。
ＡＡＶ２－Ｓｉａとａ－ＰＤ１抗体の併用療法は、ＭＣ３８とＢ１５Ｄ５の両モデルにおいて、ＡＡＶ２－Ｓｉａの２回目投与後にａ－ＰＤ１抗体を同時投与することで試験された。この組み合わせは、反応性ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて相加的な利点を示し、ＡＡＶ２－Ｓｉａ群とＡＡＶ２－Ｓｉａ＋ａＰＤ１群を比較すると、コントロールＡＡＶ２－ｎｕｌｌ群及びＡＡＶ２－ｎｕｌｌ＋ａ－ＰＤ１群と比較して、腫瘍増殖率の低下と生存期間の延長が観察された（図３）。３５日目では、ＡＡＶ－Ｓｉａを投与した動物は、抗ＰＤ－１治療単独と比較して、明らかに５０％の生存優位性を示した。本発明のＡＡＶ－Ｓｉａと非アゴニスト抗ＰＤ－１抗体との併用治療により、予想外の相乗的生存優位性がもたらされた。４０日目以降、抗ＰＤ１抗体とＡＡＶ－Ｓｉａの局所投与を組み合わせた全身注射を受けた動物の約８０％が生存していたが、どちらか一方の治療のみを受けた群では生存していた動物はいなかった。メラノーマＢ１６腫瘍は、免疫療法に対してより抵抗性のある癌モデルであるが、ＡＡＶ２－ｎｕｌｌと組み合わせた場合、免疫チェックポイント阻害による腫瘍負荷の有意な減少は見られなかった。しかし、ＡＡＶ２－Ｓｉａは腫瘍増殖率をわずかではあるが有意に減少させ、この減少率はａＰＤ－１治療の追加によって増強されたことから、ＡＡＶ２－Ｓｉａが免疫療法抵抗性癌の感受性を誘導したことが示唆された。併用療法は、この治療抵抗性腫瘍の移植後３４日目の生存率にも相乗効果をもたらし、コントロール群ではわずか２０％、抗ＰＤ１治療群では皆無であったのに対し、この時点まで生存していた動物は５０％であった。
【0113】
実施例６：ＡＡＶ２－Ｓｉａがアブスコパル腫瘍の増殖を抑制すること
ＡＡＶ－Ｓｉａの腫瘍内投与は、注射を受けた腫瘍に局所効果をもたらすことが上記で実証されている。本発明者らは、ＡＡＶ－Ｓｉａが全身性の適応免疫を活性化し、宿主内の離れた部位にある二次的な転移性腫瘍の増殖を抑制する可能性があるかどうかを検討した。非治療の遠隔腫瘍におけるＡＡＶ２－Ｓｉａウイルスの有効性は、皮下移植されたＭＣ３８腫瘍（治療腫瘍）にウイルスを腫瘍内投与する一方、対側の腫瘍（遠隔腫瘍）は未治療のままにして試験した。ＡＡＶ２－Ｓｉａを腫瘍に直接注入すると、同側（図４Ａ）及び対側（図４Ｂ）の腫瘍部位の両方で、ＡＡＶ２－ｎｕｌｌ（ビヒクル）コントロール動物と比較して、期待される抗腫瘍効果があることが確認された。重要なことは、ウイルスを直接投与していない対側の腫瘍の増殖も阻害されたことである。このことは、ＡＡＶ－Ｓｉａの局所投与によって生じる全身的な抗腫瘍免疫応答が、宿主全体の腫瘍増殖に対抗し、転移癌を制御できることを示している（図４Ｂ）。
ＡＡＶ－Ｓｉａの腫瘍内投与は、注射を受けた腫瘍に局所効果をもたらすことが上記で実証されている。本発明者らは、ＡＡＶ－Ｓｉａが全身性の適応免疫を活性化し、宿主内の離れた部位にある二次的な転移性腫瘍の増殖を抑制する可能性があるかどうかを検討した。非治療の遠隔腫瘍におけるＡＡＶ２－Ｓｉａウイルスの有効性は、皮下移植されたＭＣ３８腫瘍（治療腫瘍）にウイルスを腫瘍内投与する一方、対側の腫瘍（遠隔腫瘍）は未治療のままにして試験した。ＡＡＶ２－Ｓｉａを腫瘍に直接注入すると、同側（図４Ａ）及び対側（図４Ｂ）の腫瘍部位の両方で、ＡＡＶ２－ｎｕｌｌ（ビヒクル）コントロール動物と比較して、期待される抗腫瘍効果があることが確認された。重要なことは、ウイルスを直接投与していない対側の腫瘍の増殖も阻害されたことである。このことは、ＡＡＶ－Ｓｉａの局所投与によって生じる全身的な抗腫瘍免疫応答が、宿主全体の腫瘍増殖に対抗し、転移癌を制御できることを示している（図４Ｂ）。
【0114】
実施例７：ＡＡＶ－Ｓｉａの安全性プロファイル
ＡＡＶ－Ｓｉａを投与した動物において、免疫細胞が腫瘍に対する局所的及び全身的な防御を媒介することが証明されたので、研究者らは、ウイルス感染細胞によるシアリダーゼ発現が免疫細胞にどのような影響を及ぼすかを検討した。Ｔ細胞は、特にチェックポイント阻害を受けている患者において、抗腫瘍免疫応答の重要な構成要素である。腫瘍細胞と同様に、Ｔ細胞の膜脂質は末端シアル酸残基からなる糖鎖で装飾されており、このような残基は細胞の成熟、分化、遊走から細胞の生存、細胞死まで、Ｔ細胞の運命と機能のほとんどすべての側面に関与している。理想的には、癌の治療に使用するＡＡＶ－Ｓｉａ組成物は、原発腫瘍のＡＡＶ－Ｓｉａに伴って癌細胞の特異的な脱シアリル化を誘導し、防御免疫細胞の遊走やエフェクター機能の獲得を阻害しないように、浸潤免疫細胞などのバイスタンダー細胞への酵素作用は制限される。腫瘍内で発現したシアリダーゼのバイスタンダー効果を評価するために、ＡＡＶ－Ｓｉａを用いて、３人の異なる肺癌患者の腫瘍を消化した組織サンプルから得たＣＤ４５＋免疫細胞とＣＤ４５－癌細胞の混合細胞培養を、レクチンＰＮＡを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで感染させた。原発腫瘍細胞を２種類の濃度のＡＡＶ２－Ｓｉａウイルス（１０４又は１０５ウイルス／細胞）で５日間かけて形質導入した。ウイルス導入後のＰＮＡ量をフローサイトメトリーで解析したところ、ＣＤ４５陰性コンパートメント内の癌細胞（図５Ａ）は処理によって効果的に脱シアリル化されたが、ＣＤ４５＋細胞（免疫細胞）は影響を受けなかった（図５Ｂ）。このように、ＡＡＶ－Ｓｉａは腫瘍細胞に対するシアリダーゼ作用の高い特異性を示し、患者検体から得られた混合初代細胞集団内では免疫細胞への影響は少ない。この特異的な作用により、ＡＡＶ－Ｓｉａは、局所的な防御免疫細胞応答のリクルートとエフェクター機能に対するバイスタンダー効果がないため、癌の文脈では、他の形態のシアリダーゼ投与に代わる望ましい選択肢となる。
ＡＡＶ－Ｓｉａを投与した動物において、免疫細胞が腫瘍に対する局所的及び全身的な防御を媒介することが証明されたので、研究者らは、ウイルス感染細胞によるシアリダーゼ発現が免疫細胞にどのような影響を及ぼすかを検討した。Ｔ細胞は、特にチェックポイント阻害を受けている患者において、抗腫瘍免疫応答の重要な構成要素である。腫瘍細胞と同様に、Ｔ細胞の膜脂質は末端シアル酸残基からなる糖鎖で装飾されており、このような残基は細胞の成熟、分化、遊走から細胞の生存、細胞死まで、Ｔ細胞の運命と機能のほとんどすべての側面に関与している。理想的には、癌の治療に使用するＡＡＶ－Ｓｉａ組成物は、原発腫瘍のＡＡＶ－Ｓｉａに伴って癌細胞の特異的な脱シアリル化を誘導し、防御免疫細胞の遊走やエフェクター機能の獲得を阻害しないように、浸潤免疫細胞などのバイスタンダー細胞への酵素作用は制限される。腫瘍内で発現したシアリダーゼのバイスタンダー効果を評価するために、ＡＡＶ－Ｓｉａを用いて、３人の異なる肺癌患者の腫瘍を消化した組織サンプルから得たＣＤ４５＋免疫細胞とＣＤ４５－癌細胞の混合細胞培養を、レクチンＰＮＡを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで感染させた。原発腫瘍細胞を２種類の濃度のＡＡＶ２－Ｓｉａウイルス（１０４又は１０５ウイルス／細胞）で５日間かけて形質導入した。ウイルス導入後のＰＮＡ量をフローサイトメトリーで解析したところ、ＣＤ４５陰性コンパートメント内の癌細胞（図５Ａ）は処理によって効果的に脱シアリル化されたが、ＣＤ４５＋細胞（免疫細胞）は影響を受けなかった（図５Ｂ）。このように、ＡＡＶ－Ｓｉａは腫瘍細胞に対するシアリダーゼ作用の高い特異性を示し、患者検体から得られた混合初代細胞集団内では免疫細胞への影響は少ない。この特異的な作用により、ＡＡＶ－Ｓｉａは、局所的な防御免疫細胞応答のリクルートとエフェクター機能に対するバイスタンダー効果がないため、癌の文脈では、他の形態のシアリダーゼ投与に代わる望ましい選択肢となる。
【0115】
表１にはヒト、鳥類、ウマから単離された代表的なシアリダーゼタンパク質配列と代表的なゲノムＲＮＡシアリダーゼ配列を示した。
【0116】
【表1】
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3AB】
【図3CD】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】