特表 2024-507220 パラオキソナーゼ融合ポリペプチドならびに関連する組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-16

(54)【発明の名称】パラオキソナーゼ融合ポリペプチドならびに関連する組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20240208BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240208BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20240208BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20240208BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20240208BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20240208BHJP

   C07K 16/24 20060101ALI20240208BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20240208BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240208BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240208BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240208BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240208BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240208BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240208BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 11/08 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 17/04 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 39/02 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 7/02 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240208BHJP

   A61P 39/06 20060101ALI20240208BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20240208BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240208BHJP

   A61K 9/12 20060101ALI20240208BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240208BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C07K19/00

C12N9/16 Z

C12N9/22

C07K14/47

C07K16/18

C07K16/24

C12N15/55

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12N1/21

C12N1/19

C12N1/15

C12P21/02 A

A61P29/00

A61P11/00

A61P11/06

A61P43/00 105

A61P11/08

A61P1/04

A61P37/02

A61P3/10

A61P17/00

A61P17/06

A61P17/04

A61P37/08

A61P31/04

A61P39/02

A61P25/00

A61P25/28

A61P25/16

A61P9/00

A61P9/10

A61P1/16

A61P19/02

A61P29/00 101

A61P7/00

A61P33/00

A61P3/00

A61P7/02

A61P35/00

A61P39/06

A61K38/46

A61K39/395 N

A61K39/395 U

A61K9/12

A61K38/16

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023550042

(86)(22)【出願日】2022-02-17

(85)【翻訳文提出日】2023-08-18

(86)【国際出願番号】 US2022016723

(87)【国際公開番号】W WO2022178078

(87)【国際公開日】2022-08-25

(31)【優先権主張番号】63/151,236

(32)【優先日】2021-02-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/151,272

(32)【優先日】2021-02-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518076377

【氏名又は名称】セリピオン， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】レッドベター， ジェフリー エー．

(72)【発明者】

【氏名】ハイデン－レッドベター， マーサ エス．

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064AG26

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA91X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA31

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA24

4C076AA93

4C076BB27

4C076CC01

4C076CC07

4C076CC11

4C076CC14

4C076CC15

4C076CC16

4C076CC18

4C076CC20

4C076CC21

4C076CC27

4C076CC32

4C076CC34

4C076CC50

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA41

4C084CA18

4C084DC22

4C084DC50

4C084NA14

4C084ZA02

4C084ZA15

4C084ZA16

4C084ZA36

4C084ZA45

4C084ZA51

4C084ZA54

4C084ZA59

4C084ZA61

4C084ZA68

4C084ZA75

4C084ZA89

4C084ZA96

4C084ZB07

4C084ZB11

4C084ZB13

4C084ZB15

4C084ZB26

4C084ZB35

4C084ZB37

4C084ZC21

4C084ZC35

4C084ZC37

4C084ZC52

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC22

4C085CC23

4C085EE03

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA41

4H045DA76

4H045DA89

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

パラオキソナーゼ融合ポリペプチドに関する組成物および方法が開示される。一部の態様では、融合物は、生物学的に活性なパラオキソナーゼ（例えば、ヒトＰＯＮ１またはそのバリアント）に対してアミノ末端側に連結された第１の生物学的に活性なポリペプチドを含む二重特異的分子であり、第１の生物学的に活性なポリペプチドは、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、ＳＯＤ１、ＣＴＬＡ－４細胞外ドメイン、ＣＤ４０細胞外ドメイン、または炎症性サイトカインに特異的に結合しそれを中和するポリペプチドである。二重特異的融合物は、第１の生物学的に活性なポリペプチドに対してカルボキシル末端側かつパラオキソナーゼに対してアミノ末端側に連結された第２の生物学的に活性なポリペプチド（例えば、ダイマー化ドメインまたは新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に特異的に結合するドメイン）をさらに含み得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｐを含む融合ポリペプチドであって、式中、
Ｔは、
ＤＮａｓｅ、
ＲＮａｓｅ、
スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、
細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子－４（ＣＴＬＡ－４）細胞外ドメイン、
ＣＤ４０細胞外ドメイン、および
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）またはトランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）に特異的に結合しそれを中和するポリペプチド
からなる群から選択される第１の生物学的に活性なポリペプチドであり；
Ｌ１は、第１のポリペプチドリンカーであり、Ｌ１は、必要に応じて存在し；
Ｘは、免疫グロブリン重鎖定常領域であり、前記免疫グロブリン重鎖定常領域は、ダイマーを形成し、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に特異的に結合することが可能であり；
Ｌ２は、第２のポリペプチドリンカーであり、Ｌ２は、必要に応じて存在し；かつ
Ｐは、生物学的に活性なパラオキソナーゼであり、前記パラオキソナーゼは、配列番号６の残基１６～３５５または２６～３５５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、配列番号６の残基１～１５に対応するアミノ末端リーダー配列を含有しない
融合ポリペプチド。

【請求項2】

ヒトパラオキソナーゼ１ Ｑ１９２アイソフォーム（ｈＰＯＮ１－Ｑ１９２；配列番号４）のＱ１９２に対応する位置におけるアミノ酸が、リシンまたはアルギニンである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項3】

ｈＰＯＮ１－Ｑ１９２のＱ１９２に対応する位置におけるアミノ酸が、リシンである、請求項２に記載の融合ポリペプチド。

【請求項4】

前記ヒトパラオキソナーゼ１ Ｑ１９２アイソフォーム（ｈＰＯＮ１－Ｑ１９２；配列番号４）のＨ１１５に対応する位置におけるアミノ酸が、トリプトファンである、請求項１から３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項5】

前記パラオキソナーゼが、
（ｉ）配列番号６の残基１６～３５５または２６～３５５、
（ｉｉ）配列番号１２４の残基１６～３５５または２６～３５５、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号１２６の残基１６～３５５または２６～３５５
に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項6】

前記パラオキソナーゼが、
（ｉ）配列番号６の残基ｎ～３５５、
（ｉｉ）配列番号１２４の残基ｎ～３５５、および
（ｉｉｉ）配列番号１２６の残基ｎ～３５５
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ｎが、端点を含めた１６～２６の整数である、請求項５に記載の融合ポリペプチド。

【請求項7】

Ｌ２が存在し、少なくとも８つのアミノ酸残基を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項8】

Ｌ２が、１２～２５個のアミノ酸残基からなる、請求項７に記載の融合ポリペプチド。

【請求項9】

Ｌ２が、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の融合ポリペプチド。

【請求項10】

前記第１の生物学的に活性なポリペプチドが、前記ＤＮａｓｅ、前記ＲＮａｓｅおよび前記スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）からなる群から選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項11】

Ｌ１が存在し、前記第１の生物学的に活性なポリペプチドが、前記ＤＮａｓｅである、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。

【請求項12】

前記ＤＮａｓｅが、
（ｉ）配列番号１８の残基２１～２８０、
（ｉｉ）配列番号１５２の残基２１～２８０、または
（ｉｉｉ）配列番号１３６の残基２１～２９０
に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項13】

前記ＤＮａｓｅが、配列番号１８の残基２１～２８０または配列番号１５２の残基２１～２８０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、前記ＤＮａｓｅが、Ｎ７４、Ｇ１０５およびＡ１１４からなる群から選択されるヒト野生型ＤＮａｓｅ１（配列番号１２０）のアミノ酸に対応する位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有し、
ヒトＤＮａｓｅ１のＮ７４に対応する位置におけるアミノ酸置換（Ｎ７４置換）は、存在する場合には、ヒトＤＮａｓｅ１と比較してＤＮＡ結合を増加させ、
ヒトＤＮａｓｅ１のＧ１０５に対応する位置におけるアミノ酸置換（Ｇ１０５置換）は、存在する場合には、ヒトＤＮａｓｅ１と比較してＤＮＡ結合を増加させ、かつ
ヒトＤＮａｓｅ１のＡ１１４に対応する位置におけるアミノ酸置換（Ａ１１４置換）は、存在する場合には、ヒトＤＮａｓｅ１と比較して、エンドヌクレアーゼ活性のＧ－アクチン誘導性阻害を減少させる
請求項１２に記載の融合ポリペプチド。

【請求項14】

前記Ｎ７４置換およびＧ１０５置換の両方を含有する、請求項１３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項15】

ヒトＤＮａｓｅ１のＮ７４に対応する位置におけるアミノ酸が、リシンである、かつ／または
ヒトＤＮａｓｅ１のＧ１０５に対応する位置におけるアミノ酸が、アルギニンである
請求項１４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項16】

前記Ａ１１４置換を含有しない、請求項１４または１５に記載の融合ポリペプチド。

【請求項17】

前記Ｇ１０５置換およびＡ１１４置換の両方を含有する、請求項１３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項18】

ヒトＤＮａｓｅ１のＧ１０５に対応する位置におけるアミノ酸が、アルギニンである、かつ／または
ヒトＤＮａｓｅ１のＡ１１４に対応する位置におけるアミノ酸が、フェニルアラニンである
請求項１７に記載の融合ポリペプチド。

【請求項19】

前記Ｎ７４置換、Ｇ１０５置換およびＡ１１４置換の各々を含有する、請求項１３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項20】

ヒトＤＮａｓｅ１のＮ７４に対応する位置におけるアミノ酸が、リシンであり、
ヒトＤＮａｓｅ１のＧ１０５に対応する位置におけるアミノ酸が、アルギニンである、かつ／または
ヒトＤＮａｓｅ１のＡ１１４に対応する位置におけるアミノ酸が、フェニルアラニンである
請求項１３または１９に記載の融合ポリペプチド。

【請求項21】

前記ＤＮａｓｅが、配列番号１３６の残基２１～２９０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、配列番号１３６のＲ８０、Ｒ９５およびＮ９６に対応する位置におけるアミノ酸の各々が、アラニンまたはセリンである、請求項１２に記載の融合ポリペプチド。

【請求項22】

前記ＤＮａｓｅが、
（ｉ）配列番号１８の残基２１～２８０、
（ｉｉ）配列番号２０の残基２１～２８０、
（ｉｉｉ）配列番号１５２の残基２１～２８０、
（ｉｖ）配列番号１３８の残基２１～２９０、または
（ｖ）配列番号１４０の残基２１～２９０
に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の融合ポリペプチド。

【請求項23】

Ｌ１が、少なくとも１５個のアミノ酸残基を含む、請求項１１から２２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項24】

Ｌ１が、少なくとも２６個のアミノ酸残基を含む、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項25】

Ｌ１が、２６～３６個のアミノ酸残基からなる、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項26】

Ｌ１が、配列番号１１９のアミノ酸配列の３つまたはそれよりも多くのタンデムリピートを含む、請求項１１から２５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項27】

Ｌ１が、配列番号１２および配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項28】

前記第１の生物学的に活性なポリペプチドが、前記ＲＮａｓｅである、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。

【請求項29】

前記ＲＮａｓｅが、配列番号２２の残基２９～１５６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項２８に記載の融合ポリペプチド。

【請求項30】

前記ＲＮａｓｅが、配列番号２２の残基２９～１５６に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２９に記載の融合ポリペプチド。

【請求項31】

Ｌ１が存在し、少なくとも２つのアミノ酸残基を含む、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項32】

Ｌ１が、１０～３６個のアミノ酸残基からなる、請求項３１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項33】

Ｌ１が、配列番号１１９のアミノ酸配列の２つまたはそれよりも多くのタンデムリピートを含む、請求項２８から３２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項34】

Ｌ１が、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項３１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項35】

前記第１の生物学的に活性なポリペプチドが、前記ＳＯＤ１である、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。

【請求項36】

前記ＳＯＤ１が、配列番号３２の残基２～１５４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項３５に記載の融合ポリペプチド。

【請求項37】

前記ＳＯＤ１が、ヒトＳＯＤ１（配列番号３２）と比較して、以下のアミノ酸置換のうち少なくとも１つを含有する：
ヒトＳＯＤ１のＣ７に対応する位置におけるアラニン（Ｃ７置換）；および
ヒトＳＯＤ１のＣ１１２に対応する位置におけるセリン（Ｃ１１２置換）
請求項３６に記載の融合ポリペプチド。

【請求項38】

前記Ｃ７置換およびＣ１１２置換の両方を含有する、請求項３７に記載の融合ポリペプチド。

【請求項39】

前記ＳＯＤ１が、配列番号５４の残基２３～１７５に示されるアミノ酸配列を有する、請求項３８に記載の融合ポリペプチド。

【請求項40】

Ｌ１が存在し、少なくとも２つのアミノ酸残基を含む、請求項３５から３９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項41】

Ｌ１が、１０～３６個のアミノ酸残基からなる、請求項４０に記載の融合ポリペプチド。

【請求項42】

Ｌ１が、配列番号１１９のアミノ酸配列の２つまたはそれよりも多くのタンデムリピートを含む、請求項３５から４１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項43】

Ｌ１が、配列番号１０または配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項４０に記載の融合ポリペプチド。

【請求項44】

前記第１の生物学的に活性なポリペプチドが、前記ＣＴＬＡ－４細胞外ドメインである、請求項１から９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項45】

前記ＣＴＬＡ－４細胞外ドメインが、配列番号６６の残基２１～１４４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項４４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項46】

前記ＣＴＬＡ－４細胞外ドメインが、配列番号６６の残基２１～１４４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項４５に記載の融合ポリペプチド。

【請求項47】

前記第１の生物学的に活性なポリペプチドが、前記ＣＤ４０細胞外ドメインである、請求項１から９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項48】

前記ＣＤ４０細胞外ドメインが、
（ｉ）配列番号７４の残基２１～１８８、
（ｉｉ）配列番号７８の残基２１～１８８、
（ｉｉｉ）配列番号８２の残基２１～１８８、
（ｉｖ）配列番号８６の残基２１～１８８、または
（ｖ）配列番号９０の残基２１～１８８
に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項４７に記載の融合ポリペプチド。

【請求項49】

前記ＣＤ４０細胞外ドメインが、Ｅ６４、Ｋ８１、Ｐ８５およびＬ１２１からなる群から選択されるヒトＣＤ４０（配列番号６８）のアミノ酸に対応する位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有し、前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、ヒトＣＤ４０と比較してＣＤ４０リガンド結合を増加させる、請求項４８に記載の融合ポリペプチド。

【請求項50】

ヒトＣＤ４０のＫ８１に対応する位置におけるアミノ酸が、スレオニン、ヒスチジンおよびセリンからなる群から選択される；
ヒトＣＤ４０のＫ８１に対応する位置におけるアミノ酸が、ヒスチジンであり、ヒトＣＤ４０のＬ１２１に対応する位置におけるアミノ酸が、プロリンである；または
ヒトＣＤ４０のＥ６４に対応する位置におけるアミノ酸が、チロシンであり、ヒトＣＤ４０のＫ８１に対応する位置におけるアミノ酸が、スレオニンであり、ヒトＣＤ４０のＰ８５に対応する位置におけるアミノ酸が、チロシンである、
請求項４９に記載の融合ポリペプチド。

【請求項51】

前記ＣＤ４０細胞外ドメインが、
（ｉ）配列番号７４の残基２１～１８８、
（ｉｉ）配列番号７８の残基２１～１８８、
（ｉｉｉ）配列番号８２の残基２１～１８８、
（ｉｖ）配列番号８６の残基２１～１８８、または
（ｖ）配列番号９０の残基２１～１８８
に示されるアミノ酸配列を有する、請求項４８に記載の融合ポリペプチド。

【請求項52】

前記第１の生物学的に活性なポリペプチドが、ＴＮＦαまたはＴＧＦ－βに特異的に結合しそれを中和する前記ポリペプチドである、請求項１から９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項53】

前記第１の生物学的に活性なポリペプチドが、単鎖抗体である、請求項５２に記載の融合ポリペプチド。

【請求項54】

前記単鎖抗体が、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群から選択される、請求項５３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項55】

前記単鎖抗体が、ＴＮＦαに特異的に結合しそれを中和する、請求項５３または５４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項56】

前記単鎖抗体が、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｈ１_ＴＮＦα、ＣＤＲ－Ｈ２_ＴＮＦαおよびＣＤＲ－Ｈ３_ＴＮＦαを含むＶＨドメインを含み、ＶＨ ＣＤＲの前記セットが、配列番号１０８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインの参照ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３のセットと比較して、３つまたはそれよりも少ないアミノ酸置換を有する、請求項５５に記載の融合ポリペプチド。

【請求項57】

各ＶＨ ＣＤＲが、ＣＤＲのＣｈｏｔｈｉａ定義、Ｋａｂａｔ定義、ＡｂＭ定義、ＩＭＧＴデータベース定義または接触定義に従って定義される、請求項５６に記載の融合ポリペプチド。

【請求項58】

ＣＤＲ－Ｈ１_ＴＮＦα、ＣＤＲ－Ｈ２_ＴＮＦαおよびＣＤＲ－Ｈ３_ＴＮＦαが、ＩＭＧＴデータベース定義に従う配列番号１０８のＶＨ ＣＤＲであり、それによって、
ＣＤＲ－Ｈ１_ＴＮＦαが、配列番号１０８の残基２６～３３に示されるアミノ酸配列を有し；
ＣＤＲ－Ｈ２_ＴＮＦαが、配列番号１０８の残基５０～５９に示されるアミノ酸配列を有し；かつ
ＣＤＲ－Ｈ３_ＴＮＦαが、配列番号１０８の残基９７～１１０に示されるアミノ酸配列を有する
請求項５７に記載の融合ポリペプチド。

【請求項59】

前記単鎖抗体が、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１_ＴＮＦα、ＣＤＲ－Ｌ２_ＴＮＦαおよびＣＤＲ－Ｌ３_ＴＮＦαを含むＶＬドメインを含み、ＶＬ ＣＤＲの前記セットが、配列番号１１０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインの参照ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３のセットと比較して、３つまたはそれよりも少ないアミノ酸置換を有する、請求項５５から５８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項60】

各ＶＬ ＣＤＲが、ＣＤＲのＣｈｏｔｈｉａ定義、Ｋａｂａｔ定義、ＡｂＭ定義、ＩＭＧＴデータベース定義または接触定義に従って定義される、請求項５９に記載の融合ポリペプチド。

【請求項61】

ＣＤＲ－Ｌ１_ＴＮＦα、ＣＤＲ－Ｌ２_ＴＮＦαおよびＣＤＲ－Ｌ３_ＴＮＦαが、ＩＭＧＴデータベース定義に従う配列番号１１０のＶＬ ＣＤＲであり、それによって、
ＣＤＲ－Ｌ１_ＴＮＦαが、配列番号１１０の残基２７～３２に示されるアミノ酸配列を有し；
ＣＤＲ－Ｌ２_ＴＮＦαが、配列番号１１０の残基５０～５２に示されるアミノ酸配列を有し；かつ
ＣＤＲ－Ｌ３_ＴＮＦαが、配列番号１１０の残基８９～９７に示されるアミノ酸配列を有する
請求項６０に記載の融合ポリペプチド。

【請求項62】

前記単鎖抗体が、配列番号１０８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するＶＨドメインを含む、かつ／または前記単鎖抗体が、配列番号１１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するＶＬドメインを含む、請求項５５に記載の融合ポリペプチド。

【請求項63】

前記単鎖抗体が、ＴＧＦ－βに特異的に結合しそれを中和する、請求項５３または５４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項64】

前記単鎖抗体が、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｈ１_{ＴＧＦ－β}、ＣＤＲ－Ｈ２_{ＴＧＦ－β}およびＣＤＲ－Ｈ３_{ＴＧＦ－β}を含むＶＨドメインを含み、ＶＨ ＣＤＲの前記セットが、配列番号１１２に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインの参照ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３のセットと比較して、３つまたはそれよりも少ないアミノ酸置換を有する、請求項６３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項65】

各ＶＨ ＣＤＲが、ＣＤＲのＣｈｏｔｈｉａ定義、Ｋａｂａｔ定義、ＡｂＭ定義、ＩＭＧＴデータベース定義または接触定義に従って定義される、請求項６４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項66】

ＣＤＲ－Ｈ１_ＴＮＦα、ＣＤＲ－Ｈ２_ＴＮＦαおよびＣＤＲ－Ｈ３_{ＴＧＦ－β}が、Ｋａｂａｔ定義に従う配列番号１１２のＶＨ ＣＤＲであり、それによって、
ＣＤＲ－Ｈ１_{ＴＧＦ－β}が、配列番号１１２の残基３１～３５に示されるアミノ酸配列を有し；
ＣＤＲ－Ｈ２_{ＴＧＦ－β}が、配列番号１１２の残基５０～６６に示されるアミノ酸配列を有し；かつ
ＣＤＲ－Ｈ３_{ＴＧＦ－β}が、配列番号１１２の残基９９～１０６に示されるアミノ酸配列を有する
請求項６５に記載の融合ポリペプチド。

【請求項67】

前記単鎖抗体が、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１_{ＴＧＦ－β}、ＣＤＲ－Ｌ２_{ＴＧＦ－β}およびＣＤＲ－Ｌ３_{ＴＧＦ－β}を含むＶＬドメインを含み、ＶＬ ＣＤＲの前記セットが、配列番号１１４に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインの参照ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３のセットと比較して、３つまたはそれよりも少ないアミノ酸置換を有する、請求項６３から６６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項68】

各ＶＬ ＣＤＲが、ＣＤＲのＣｈｏｔｈｉａ定義、Ｋａｂａｔ定義、ＡｂＭ定義、ＩＭＧＴデータベース定義または接触定義に従って定義される、請求項６７に記載の融合ポリペプチド。

【請求項69】

ＣＤＲ－Ｌ１_{ＴＧＦ－β}、ＣＤＲ－Ｌ２_{ＴＧＦ－β}およびＣＤＲ－Ｌ３_{ＴＧＦ－β}が、Ｋａｂａｔ定義に従う配列番号１１４のＶＬ ＣＤＲであり、それによって、
ＣＤＲ－Ｌ１_{ＴＧＦ－β}が、配列番号１１４の残基２４～４０に示されるアミノ酸配列を有し；
ＣＤＲ－Ｌ２_{ＴＧＦ－β}が、配列番号１１４の残基５６～６２に示されるアミノ酸配列を有し；かつ
ＣＤＲ－Ｌ３_{ＴＧＦ－β}が、配列番号１１４の残基９５～１０２に示されるアミノ酸配列を有する
請求項６８に記載の融合ポリペプチド。

【請求項70】

前記単鎖抗体が、配列番号１１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するＶＨドメインを含む、かつ／または前記単鎖抗体が、配列番号１１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するＶＬドメインを含む、請求項５５に記載の融合ポリペプチド。

【請求項71】

前記単鎖抗体が、
（ｉ）配列番号９２の残基２１～２６８、
（ｉｉ）配列番号９６の残基２１～２６８、
（ｉｉｉ）配列番号１００の残基２１～２６９、または
（ｉｖ）配列番号１０４の残基２１～２６９
に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項５３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項72】

前記単鎖抗体が、
（ｉ）配列番号９２の残基２１～２６８、
（ｉｉ）配列番号９６の残基２１～２６８、
（ｉｉｉ）配列番号１００の残基２１～２６９、または
（ｉｖ）配列番号１０４の残基２１～２６９
に示されるアミノ酸配列を有する、請求項７１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項73】

アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、Ｘ－Ｌ２－Ｐを含む融合ポリペプチドであって、式中、
Ｘは、免疫グロブリン重鎖定常領域であり、前記免疫グロブリン重鎖定常領域は、ダイマーを形成し、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に特異的に結合することが可能であり；
Ｌ２は、ポリペプチドリンカーであり、Ｌ２は、必要に応じて存在し；かつ
Ｐは、生物学的に活性なパラオキソナーゼであり、前記パラオキソナーゼは、配列番号６の残基１６～３５５または２６～３５５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、配列番号６の残基１～１５に対応するアミノ末端リーダー配列を含有せず、
前記融合ポリペプチドが、前記免疫グロブリン重鎖定常領域に対してＮ末端側には生物学的に活性なポリペプチドを含まない、融合ポリペプチド。

【請求項74】

ヒトパラオキソナーゼ１ Ｑ１９２アイソフォーム（ｈＰＯＮ１－Ｑ１９２；配列番号４）のＱ１９２に対応する位置におけるアミノ酸が、リシンまたはアルギニンである、請求項７３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項75】

ｈＰＯＮ１－Ｑ１９２のＱ１９２に対応する位置におけるアミノ酸が、リシンである、請求項７４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項76】

前記ヒトパラオキソナーゼ１ Ｑ１９２アイソフォーム（ｈＰＯＮ１－Ｑ１９２；配列番号４）のＨ１１５に対応する位置におけるアミノ酸が、トリプトファンである、請求項７３から７５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項77】

前記パラオキソナーゼが、
（ｉ）配列番号６の残基１６～３５５または２６～３５５、
（ｉｉ）配列番号１２４の残基１６～３５５または２６～３５５、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号１２６の残基１６～３５５または２６～３５５
に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項７３から７６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項78】

前記パラオキソナーゼが、
（ｉ）配列番号６の残基ｎ～３５５、
（ｉｉ）配列番号１２４の残基ｎ～３５５、および
（ｉｉｉ）配列番号１２６の残基ｎ～３５５
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ｎが、端点を含めた１６～２６の整数である、請求項７７に記載の融合ポリペプチド。

【請求項79】

Ｌ２が存在し、少なくとも８つのアミノ酸残基を含む、請求項７３から７８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項80】

Ｌ２が、１２～２５個のアミノ酸残基からなる、請求項７９に記載の融合ポリペプチド。

【請求項81】

Ｌ２が、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有する、請求項７９に記載の融合ポリペプチド。

【請求項82】

前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、免疫グロブリンＦｃ領域である、請求項１から８１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項83】

前記Ｆｃ領域が、ヒトＦｃ領域である、請求項８２に記載の融合ポリペプチド。

【請求項84】

前記ヒトＦｃ領域が、野生型ヒト配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＦｃバリアントである、請求項８３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項85】

前記Ｆｃ領域が、ヒトγ１ Ｆｃ領域またはヒトγ４ Ｆｃ領域である、請求項８３または８４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項86】

前記Ｆｃ領域が、Ｅｕ残基Ｃ２２０がセリンによって置き換えられたヒトγ１ Ｆｃバリアントである、請求項８４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項87】

Ｅｕ残基Ｃ２２６およびＣ２２９が各々、セリンによって置き換えられている、請求項８６に記載の融合ポリペプチド。

【請求項88】

Ｅｕ残基Ｐ２３８が、セリンによって置き換えられている、請求項８７に記載の融合ポリペプチド。

【請求項89】

前記Ｆｃ領域が、Ｅｕ残基Ｐ３３１がセリンによって置き換えられたヒトγ１ Ｆｃバリアントである、８５に記載の融合ポリペプチド。

【請求項90】

Ｅｕ残基Ｐ３３１が、セリンによって置き換えられている、請求項８６から８８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項91】

前記Ｆｃ領域が、
（ｉ）配列番号２６の残基１～２３２または１～２３１、
（ｉｉ）配列番号２８の残基１～２３２または１～２３１、
（ｉｉｉ）配列番号４２の残基１５９～３９０または１５９～３８９、
（ｉｖ）配列番号１１６の残基１～２３２または１～２３１、あるいは
（ｖ）配列番号１１８の残基１～２３２または１～２３１
に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１から８１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項92】

前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、
（ｉ）配列番号２６の残基１６～２３２または１６～２３１、
（ｉｉ）配列番号１１６の残基１６～２３２または１６～２３１、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号１１８の残基１６～２３２または１６～２３１
に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から８１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項93】

前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、
（ｉ）配列番号２６の残基１６～２３２または１６～２３１、
（ｉｉ）配列番号１１６の残基１６～２３２または１６～２３１、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号１１８の残基１６～２３２または１６～２３１
に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９２に記載の融合ポリペプチド。

【請求項94】

（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６、
（ｉｉ）配列番号１２８の残基２１～８９６、
（ｉｉｉ）配列番号１３０の残基２１～８９６、
（ｉｖ）配列番号１４８の残基２１～９０６、
（ｖ）配列番号１５８の残基２１～８９６、
（ｖｉ）配列番号１６０の残基２１～９０６、
（ｖｉｉ）配列番号１６２の残基２１～９０６、または
（ｖｉｉｉ）配列番号１６４の残基２１～９０６
に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項95】

（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６、
（ｉｉ）配列番号１２８の残基２１～８９６、
（ｉｉｉ）配列番号１３０の残基２１～８９６、
（ｉｖ）配列番号１４８の残基２１～９０６、
（ｖ）配列番号１５８の残基２１～８９６、
（ｖｉ）配列番号１６０の残基２１～９０６、
（ｖｉｉ）配列番号１６２の残基２１～９０６、または
（ｖｉｉｉ）配列番号１６４の残基２１～９０６
に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項96】

（ｉ）配列番号４０の残基２１～７６４、または
（ｉｉ）配列番号４８の残基２１～７４０
に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の融合ポリペプチド。

【請求項97】

（ｉ）配列番号４０の残基２１～７６４、または
（ｉｉ）配列番号４８の残基２１～７４０
に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９６に記載の融合ポリペプチド。

【請求項98】

（ｉ）配列番号５０の残基２３～７８１、
（ｉｉ）配列番号５２の残基２３～７８１、または
（ｉｉｉ）配列番号５４の残基２３～７９１
に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の融合ポリペプチド。

【請求項99】

（ｉ）配列番号５０の残基２３～７８１、
（ｉｉ）配列番号５２の残基２３～７８１、または
（ｉｉｉ）配列番号５４の残基２３～７９１
に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９８に記載の融合ポリペプチド。

【請求項100】

配列番号６６の残基２１～７３６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項101】

配列番号６６の残基２１～７３６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項102】

（ｉ）配列番号７４の残基２１～８０４、
（ｉｉ）配列番号７８の残基２１～８０４、
（ｉｉｉ）配列番号８２の残基２１～８０４、
（ｉｖ）配列番号８６の残基２１～８０４、または
（ｖ）配列番号９０の残基２１～８０４
に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載の融合ポリペプチド。

【請求項103】

（ｉ）配列番号７４の残基２１～８０４、
（ｉｉ）配列番号７８の残基２１～８０４、
（ｉｉｉ）配列番号８２の残基２１～８０４、
（ｉｖ）配列番号８６の残基２１～８０４、または
（ｖ）配列番号９０の残基２１～８０４
に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０２に記載の融合ポリペプチド。

【請求項104】

（ｉ）配列番号９４の残基２１～８６０、または
（ｉｉ）配列番号９８の残基２１～８６０
に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５５に記載の融合ポリペプチド。

【請求項105】

（ｉ）配列番号９４の残基２１～８６０、または
（ｉｉ）配列番号９８の残基２１～８６０
に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項106】

（ｉ）配列番号１０２の残基２１～８６１、または
（ｉｉ）配列番号１０６の残基２１～８６１
に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項107】

（ｉ）配列番号１０２の残基２１～８６１、または
（ｉｉ）配列番号１０６の残基２１～８６１
に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０６に記載の融合ポリペプチド。

【請求項108】

（ｉ）配列番号１２２の残基２１～６１３、
（ｉｉ）配列番号１３２の残基２１～６１３、
（ｉｉｉ）配列番号１３４の残基２１～６１３、
（ｉｖ）配列番号１４２の残基２１～６１０、
（ｖ）配列番号１４４の残基２１～６１０、または
（ｖｉ）配列番号１４６の残基２１～６１０
に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項109】

（ｉ）配列番号１２２の残基２１～６１３、
（ｉｉ）配列番号１３２の残基２１～６１３、
（ｉｉｉ）配列番号１３４の残基２１～６１３、
（ｉｖ）配列番号１４２の残基２１～６１０、
（ｖ）配列番号１４４の残基２１～６１０、または
（ｖｉ）配列番号１４６の残基２１～６１０
に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０８に記載の融合ポリペプチド。

【請求項110】

アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｐを含む融合ポリペプチドであって、式中：
Ｔは、
ＤＮａｓｅ、
ＲＮａｓｅ、
スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、
細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子－４（ＣＴＬＡ－４）細胞外ドメイン、
ＣＤ４０細胞外ドメイン、および
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）またはトランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）に特異的に結合しそれを中和するポリペプチド
からなる群から選択される第１の生物学的に活性なポリペプチドであり；
Ｌ１は、第１のポリペプチドリンカーであり、Ｌ１は、必要に応じて存在し；
Ｘは、第２の生物学的に活性なポリペプチドであり、Ｘは、必要に応じて存在し；
Ｌ２は、第２のポリペプチドリンカーであり、Ｌ２は、必要に応じて存在し；かつ
Ｐは、生物学的に活性なパラオキソナーゼであり、前記パラオキソナーゼは、配列番号６の残基１６～３５５または２６～３５５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、配列番号６の残基１～１５に対応するアミノ末端リーダー配列を含有しない
融合ポリペプチド。

【請求項111】

ヒトパラオキソナーゼ１ Ｑ１９２アイソフォーム（ｈＰＯＮ１－Ｑ１９２；配列番号４）のＱ１９２に対応する位置におけるアミノ酸置換が、リシンまたはアルギニンである、請求項１１０に記載の融合ポリペプチド。

【請求項112】

ｈＰＯＮ１－Ｑ１９２のＱ１９２に対応する位置におけるアミノ酸が、リシンである、請求項１１１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項113】

前記ヒトパラオキソナーゼ１ Ｑ１９２アイソフォーム（ｈＰＯＮ１－Ｑ１９２；配列番号４）のＨ１１５に対応する位置におけるアミノ酸が、トリプトファンである、請求項１１０から１１２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項114】

前記パラオキソナーゼが、
（ｉ）配列番号６の残基１６～３５５または２６～３５５、
（ｉｉ）配列番号１２４の残基１６～３５５または２６～３５５、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号１２６の残基１６～３５５または２６～３５５
に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１１３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項115】

前記パラオキソナーゼが、
（ｉ）配列番号６の残基ｎ～３５５、
（ｉｉ）配列番号１２４の残基ｎ～３５５、および
（ｉｉｉ）配列番号１２６の残基ｎ～３５５
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ｎが、端点を含めた１６～２６の整数である、請求項１１４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項116】

前記第１の生物学的に活性なポリペプチドが、前記ＤＮａｓｅ、前記ＲＮａｓｅおよび前記スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）からなる群から選択される、請求項１１０から１１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項117】

Ｌ１が存在し、前記第１の生物学的に活性なポリペプチドが、前記ＤＮａｓｅである、請求項１１６に記載の融合ポリペプチド。

【請求項118】

前記ＤＮａｓｅが、
（ｉ）配列番号１８の残基２１～２８０、
（ｉｉ）配列番号１５２の残基２１～２８０；または
（ｉｉ）配列番号１３６の残基２１～２９０
に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１１７に記載の融合ポリペプチド。

【請求項119】

前記ＤＮａｓｅが、配列番号１８の残基２１～２８０または配列番号１５２の残基２１～２８０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、前記ＤＮａｓｅが、Ｎ７４、Ｇ１０５およびＡ１１４からなる群から選択されるヒトＤＮａｓｅ１（配列番号１２０）のアミノ酸に対応する位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有し、
ヒトＤＮａｓｅ１のＮ７４に対応する位置におけるアミノ酸置換（Ｎ７４置換）は、存在する場合には、ヒトＤＮａｓｅ１と比較してＤＮＡ結合を増加させ、
ヒトＤＮａｓｅ１のＧ１０５に対応する位置におけるアミノ酸置換（Ｇ１０５置換）は、存在する場合には、ヒトＤＮａｓｅ１と比較してＤＮＡ結合を増加させ、かつ
ヒトＤＮａｓｅ１のＡ１１４に対応する位置におけるアミノ酸置換（Ａ１１４置換）は、存在する場合には、ヒトＤＮａｓｅ１と比較して、エンドヌクレアーゼ活性のＧ－アクチン誘導性阻害を減少させる
請求項１１８に記載の融合ポリペプチド。

【請求項120】

ヒトＤＮａｓｅ１のＮ７４に対応する位置におけるアミノ酸が、リシンであり、
ヒトＤＮａｓｅ１のＧ１０５に対応する位置におけるアミノ酸が、アルギニンである、かつ／または
ヒトＤＮａｓｅ１のＡ１１４に対応する位置におけるアミノ酸が、フェニルアラニンである
請求項１１９に記載の融合ポリペプチド。

【請求項121】

前記ＤＮａｓｅが、配列番号１３６の残基２１～２９０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、配列番号１３６のＲ８０、Ｒ９５およびＮ９６に対応する位置におけるアミノ酸の各々が、アラニンまたはセリンである、請求項１１８に記載の融合ポリペプチド。

【請求項122】

前記ＤＮａｓｅが、
（ｉ）配列番号１８の残基２１～２８０、
（ｉｉ）配列番号２０の残基２１～２８０、
（ｉｉｉ）配列番号１５２の残基２１～２８０；
（ｉｖ）配列番号１３８の残基２１～２９０、または
（ｖ）配列番号１４０の残基２１～２９０
に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１１８に記載の融合ポリペプチド。

【請求項123】

前記第１の生物学的に活性なポリペプチドが、前記ＲＮａｓｅである、請求項１１６に記載の融合ポリペプチド。

【請求項124】

前記ＲＮａｓｅが、配列番号２２の残基２９～１５６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１２３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項125】

前記ＲＮａｓｅが、配列番号２２の残基２９～１５６に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１２４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項126】

前記第１の生物学的に活性なポリペプチドが、前記ＳＯＤ１である、請求項１１６に記載の融合ポリペプチド。

【請求項127】

前記ＳＯＤ１が、配列番号３２の残基２～１５４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１２６に記載の融合ポリペプチド。

【請求項128】

前記ＳＯＤ１が、配列番号５４の残基２３～１７５に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１２７に記載の融合ポリペプチド。

【請求項129】

前記第１の生物学的に活性なポリペプチドが、前記ＣＴＬＡ－４細胞外ドメインである、請求項１１０から１１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項130】

前記ＣＴＬＡ－４細胞外ドメインが、配列番号６６の残基２１～１４４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１２９に記載の融合ポリペプチド。

【請求項131】

前記ＣＴＬＡ－４細胞外ドメインが、配列番号６６の残基２１～１４４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１３０に記載の融合ポリペプチド。

【請求項132】

前記第１の生物学的に活性なポリペプチドが、前記ＣＤ４０細胞外ドメインである、請求項１１０から１１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項133】

前記ＣＤ４０細胞外ドメインが、
（ｉ）配列番号７４の残基２１～１８８；
（ｉｉ）配列番号７８の残基２１～１８８；
（ｉｉｉ）配列番号８２の残基２１～１８８；
（ｉｖ）配列番号８６の残基２１～１８８；または
（ｖ）配列番号９０の残基２１～１８８
に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１３２に記載の融合ポリペプチド。

【請求項134】

前記ＣＤ４０細胞外ドメインが、
（ｉ）配列番号７４の残基２１～１８８；
（ｉｉ）配列番号７８の残基２１～１８８；
（ｉｉｉ）配列番号８２の残基２１～１８８；
（ｉｖ）配列番号８６の残基２１～１８８；または
（ｖ）配列番号９０の残基２１～１８８
に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１３３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項135】

前記第１の生物学的に活性なポリペプチドが、ＴＮＦαまたはＴＧＦ－βに特異的に結合しそれを中和する前記ポリペプチドである、請求項１１０から１１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項136】

前記第１の生物学的に活性なポリペプチドが、単鎖抗体である、請求項１３５に記載の融合ポリペプチド。

【請求項137】

前記単鎖抗体が、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群から選択される、請求項１３６に記載の融合ポリペプチド。

【請求項138】

前記単鎖抗体が、ＴＮＦαに特異的に結合しそれを中和する、請求項１３５から１３７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項139】

前記単鎖抗体が、ＴＧＦ－βに特異的に結合しそれを中和する、請求項１３５から１３７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項140】

前記第２の生物学的に活性なポリペプチドが存在し、ダイマー化ドメインおよび新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に特異的に結合するドメインから選択される、請求項１１０から１３９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項141】

前記第２の生物学的に活性なポリペプチドが、ダイマー化ドメインである、請求項１４０に記載の融合ポリペプチド。

【請求項142】

第１の融合ポリペプチドと第２の融合ポリペプチドとを含むダイマー性タンパク質であって、前記第１および第２の融合ポリペプチドの各々が、請求項１から１０９および１４１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドである、ダイマー性タンパク質。

【請求項143】

請求項１から１４１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

【請求項144】

請求項１から１４１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む発現カセットであって、前記ＤＮＡセグメントが、プロモーターに作動可能に連結されている、発現カセット。

【請求項145】

請求項１４４に記載の発現カセットが導入された培養細胞であって、前記ＤＮＡセグメントを発現する、培養細胞。

【請求項146】

融合ポリペプチドを作製する方法であって、
請求項１４４に記載の発現カセットが導入された細胞を培養するステップであって、前記細胞が、前記ＤＮＡセグメントを発現し、前記コードされた融合ポリペプチドが産生される、ステップ；および
前記融合ポリペプチドを回収するステップ
を含む、方法。

【請求項147】

請求項１から１０９および１４１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む発現カセットであって、前記ＤＮＡセグメントが、プロモーターに作動可能に連結されている、発現カセット。

【請求項148】

ダイマー性タンパク質を作製する方法であって、
請求項１４７に記載の発現カセットが導入された細胞を培養するステップであって、前記細胞が、前記ＤＮＡセグメントを発現し、前記コードされた融合ポリペプチドが、ダイマー性タンパク質として産生される、ステップ；および
前記ダイマー性タンパク質を回収するステップ
を含む、方法。

【請求項149】

請求項１３から２２、９４および９５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む発現カセットであって、前記ＤＮＡセグメントが、プロモーターに作動可能に連結されている、発現カセット。

【請求項150】

そのゲノムＤＮＡ内に、請求項１４８に記載の発現カセットを含む安定な細胞系であって、前記ＤＮＡセグメントを構成的に発現する、安定な細胞系。

【請求項151】

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である、請求項１５０に記載の安定な細胞系。

【請求項152】

融合ポリペプチドを作製する方法であって、
そのゲノムＤＮＡ内に、請求項１４９に記載の発現カセットを含む安定な細胞系を培養するステップであって、前記安定な細胞系が、前記ＤＮＡセグメントを構成的に発現し、前記コードされた融合ポリペプチドが産生される、ステップ；および
前記融合ポリペプチドを回収するステップ
を含む、方法。

【請求項153】

ダイマー性タンパク質を作製する方法であって、
そのゲノムＤＮＡ内に、請求項１４９に記載の発現カセットを含む安定な細胞系を培養するステップであって、前記安定な細胞系が、前記ＤＮＡセグメントを構成的に発現し、前記コードされた融合ポリペプチドが、ダイマー性タンパク質として産生される、ステップ；および
前記ダイマー性タンパク質を回収するステップ
を含む、方法。

【請求項154】

前記安定な細胞系が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である、請求項１５２または１５３に記載の方法。

【請求項155】

請求項１４４、１４７および１４９のいずれか一項に記載の発現カセットを含むベクター。

【請求項156】

請求項１から１４１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド；および
薬学的に許容される担体
を含む組成物。

【請求項157】

請求項１４２に記載のダイマー性タンパク質；および
薬学的に許容される担体
を含む組成物。

【請求項158】

噴霧による肺への送達のために製剤化されている、請求項１５６または１５７に記載の組成物。

【請求項159】

炎症性疾患を処置するための方法であって、請求項１から１４１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項１４１に記載のダイマー性タンパク質の有効量を、前記炎症性疾患を有する対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項160】

前記炎症性疾患が、炎症性肺疾患である、請求項１５９に記載の方法。

【請求項161】

前記炎症性肺疾患が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、嚢胞性線維症（ＣＦ）、気管支拡張症、低酸素症、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）および間質性肺疾患からなる群から選択される、請求項１６０に記載の方法。

【請求項162】

前記間質性肺疾患が、特発性肺線維症（ＩＰＦ）およびサルコイドーシスからなる群から選択される、請求項１６１に記載の方法。

【請求項163】

前記炎症性肺疾患が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染によって特徴付けられる、請求項１６０に記載の方法。

【請求項164】

前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病および２型糖尿病からなる群から選択される、請求項１５９に記載の方法。

【請求項165】

前記炎症性疾患が、炎症性皮膚疾患である、請求項１５９に記載の方法。

【請求項166】

前記炎症性皮膚疾患が、乾癬およびアトピー性皮膚炎からなる群から選択される、請求項１６５に記載の方法。

【請求項167】

自己免疫疾患を処置するための方法であって、請求項１から１４１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項１４２に記載のダイマー性タンパク質の有効量を、前記自己免疫疾患を有する対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項168】

前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、抗リン脂質抗体症候群、１型糖尿病、血管炎および全身性強皮症からなる群から選択される、請求項１６７に記載の方法。

【請求項169】

グラム陰性細菌によるバイオフィルム形成を処置するための方法であって、請求項１から１４１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項１４２に記載のダイマー性タンパク質の有効量を、前記バイオフィルム形成を有する対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項170】

前記グラム陰性細菌が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａである、請求項１６９に記載の方法。

【請求項171】

硫黄マスタードガスまたは有機リンへの曝露を処置するための方法であって、請求項１から１４１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項１４２に記載のダイマー性タンパク質の有効量を、前記硫黄マスタードガスまたは前記有機リンに曝露された対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項172】

前記有機リンが、タブン、サリン、ソマンおよびシクロサリンからなる群から選択される、請求項１７１に記載の方法。

【請求項173】

神経学的疾患を処置するための方法であって、請求項１から１４１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項１４２に記載のダイマー性タンパク質の有効量を、前記神経学的疾患を有する対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項174】

前記神経学的疾患が、認知症によって特徴付けられる、請求項１７３に記載の方法。

【請求項175】

前記神経学的疾患が、パーキンソン病およびアルツハイマー病からなる群から選択される、請求項１７３に記載の方法。

【請求項176】

心血管疾患を処置するための方法であって、請求項１から１４１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項１４２に記載のダイマー性タンパク質の有効量を、前記心血管疾患を有する対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項177】

前記心血管疾患が、アテローム動脈硬化症によって特徴付けられる、請求項１７６に記載の方法。

【請求項178】

前記心血管疾患が、冠動脈心疾患および虚血性脳卒中からなる群から選択される、請求項１７７に記載の方法。

【請求項179】

慢性肝臓疾患を処置するための方法であって、請求項１から１４１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項１４２に記載のダイマー性タンパク質の有効量を、前記慢性肝臓疾患を有する対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項180】

前記慢性肝臓疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項１７９に記載の方法。

【請求項181】

線維性疾患を処置するための方法であって、請求項１から１４１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項１４２に記載のダイマー性タンパク質の有効量を、前記線維性疾患を有する対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項182】

前記線維性疾患が、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス、炎症性肺疾患、慢性肝臓疾患および慢性腎臓疾患からなる群から選択される、請求項１８１に記載の方法。

【請求項183】

ＮＥＴｏｓｉｓによって特徴付けられる疾患または障害を処置するための方法であって、請求項１１から２７、９４、９５および１１７から１２２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項１１から２７、９４および９５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドのダイマー化によって形成されたダイマー性タンパク質の有効量を、ＮＥＴｏｓｉｓによって特徴付けられる前記疾患または障害を有する対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項184】

ＮＥＴｏｓｉｓによって特徴付けられる疾患または障害を処置するための方法であって、（ａ）請求項７３から８１、１０８および１０９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは前記融合ポリペプチドのダイマー化によって形成されたダイマー性タンパク質の有効量、ならびに（ｂ）生物学的に活性なＤＮａｓｅの有効量を、ＮＥＴｏｓｉｓによって特徴付けられる前記疾患または障害を有する対象に投与するステップを含む併用療法である、方法。

【請求項185】

前記ＤＮａｓｅが、
（ｉ）配列番号１８の残基２１～２８０、
（ｉｉ）配列番号１５２の残基２１～２８０、または
（ｉｉｉ）配列番号１３６の残基２１～２９０
に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１８４に記載の方法。

【請求項186】

前記ＤＮａｓｅが、配列番号１８の残基２１～２８０または配列番号１５２の残基２１～２８０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、前記ＤＮａｓｅが、Ｎ７４、Ｇ１０５およびＡ１１４からなる群から選択されるヒト野生型ＤＮａｓｅ１（配列番号１２０）のアミノ酸に対応する位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有し、
ヒトＤＮａｓｅ１のＮ７４に対応する位置におけるアミノ酸置換（Ｎ７４置換）は、存在する場合には、ヒトＤＮａｓｅ１と比較してＤＮＡ結合を増加させ、
ヒトＤＮａｓｅ１のＧ１０５に対応する位置におけるアミノ酸置換（Ｇ１０５置換）は、存在する場合には、ヒトＤＮａｓｅ１と比較してＤＮＡ結合を増加させ、かつ
ヒトＤＮａｓｅ１のＡ１１４に対応する位置におけるアミノ酸置換（Ａ１１４置換）は、存在する場合には、ヒトＤＮａｓｅ１と比較して、エンドヌクレアーゼ活性のＧ－アクチン誘導性阻害を減少させる
請求項１８５に記載の方法。

【請求項187】

前記ＤＮａｓｅが、前記Ｎ７４置換およびＧ１０５置換の両方を含有する、請求項１８６に記載の方法。

【請求項188】

ヒトＤＮａｓｅ１のＮ７４に対応する位置におけるアミノ酸が、リシンである、かつ／または
ヒトＤＮａｓｅ１のＧ１０５に対応する位置におけるアミノ酸が、アルギニンである
請求項１８７に記載の方法。

【請求項189】

前記ＤＮａｓｅが、前記Ａ１１４置換を含有しない、請求項１８７または１８８に記載の方法。

【請求項190】

前記ＤＮａｓｅが、前記Ｇ１０５置換およびＡ１１４置換の両方を含有する、請求項１８６に記載の方法。

【請求項191】

ヒトＤＮａｓｅ１のＧ１０５に対応する位置におけるアミノ酸が、アルギニンである、かつ／または
ヒトＤＮａｓｅ１のＡ１１４に対応する位置におけるアミノ酸が、フェニルアラニンである
請求項１９０に記載の方法。

【請求項192】

前記ＤＮａｓｅが、前記Ｎ７４置換、Ｇ１０５置換およびＡ１１４置換の各々を含有する、請求項１８６に記載の方法。

【請求項193】

ヒトＤＮａｓｅ１のＮ７４に対応する位置におけるアミノ酸が、リシンであり、
ヒトＤＮａｓｅ１のＧ１０５に対応する位置におけるアミノ酸が、アルギニンである、かつ／または
ヒトＤＮａｓｅ１のＡ１１４に対応する位置におけるアミノ酸が、フェニルアラニンである
請求項１８６または１９２に記載の方法。

【請求項194】

前記ＤＮａｓｅが、配列番号１３６の残基２１～２９０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、配列番号１３６のＲ８０、Ｒ９５およびＮ９６に対応する位置におけるアミノ酸の各々が、アラニンまたはセリンである、請求項１８５に記載の方法。

【請求項195】

前記ＤＮａｓｅが
（ｉ）配列番号１８の残基２１～２８０、
（ｉｉ）配列番号２０の残基２１～２８０、
（ｉｉｉ）配列番号１５２の残基２１～２８０、
（ｉｖ）配列番号１３８の残基２１～２９０、または
（ｖ）配列番号１４０の残基２１～２９０
に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１８５に記載の方法。

【請求項196】

前記ＤＮａｓｅが、アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、Ｄ－Ｌ１－Ｘ_ｄを含むＤＮａｓｅ融合ポリペプチド内に含有され、式中、
Ｄは、前記ＤＮａｓｅであり、
Ｌ１は、少なくとも１５個のアミノ酸残基を含むポリペプチドリンカーであり；かつ
Ｘ_ｄは、免疫グロブリンＦｃ領域である
請求項１８４から１９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項197】

前記ＤＮａｓｅ融合ポリペプチドが、
（ｉ）配列番号６０の残基２１～５３８または２１～５３７、
（ｉｉ）配列番号６２の残基２１～５４８または２１～５４７、
（ｉｉｉ）配列番号１５５の残基２１～５３８または２１～５３７、
（ｉｖ）配列番号１５６の残基２１～５４８または２１～５４７、
（ｖ）配列番号１３８の残基２１～５４８または２１～５４７、あるいは
（ｖｉ）配列番号１４０の残基２１～５４８または２１～５４７
に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９６に記載の方法。

【請求項198】

前記ＤＮａｓｅ融合ポリペプチドが、
（ｉ）配列番号６０の残基２１～５３８または２１～５３７、
（ｉｉ）配列番号６２の残基２１～５４８または２１～５４７、
（ｉｉｉ）配列番号１５５の残基２１～５３８または２１～５３７、
（ｉｖ）配列番号１５６の残基２１～５４８または２１～５４７、
（ｖ）配列番号１３８の残基２１～５４８または２１～５４７、あるいは
（ｖｉ）配列番号１４０の残基２１～５４８または２１～５４７
に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１９６に記載の方法。

【請求項199】

前記疾患または障害が、炎症性肺疾患である、請求項１８３から１９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項200】

前記炎症性肺疾患が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、嚢胞性線維症（ＣＦ）、気管支拡張症、低酸素症、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）および間質性肺疾患からなる群から選択される、請求項１９９に記載の方法。

【請求項201】

前記間質性肺疾患が、特発性肺線維症（ＩＰＦ）およびサルコイドーシスからなる群から選択される、請求項２００に記載の方法。

【請求項202】

前記急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）が、ＣＯＶＩＤ－１９に関連する、請求項２００に記載の方法。

【請求項203】

前記炎症性疾患が、炎症性皮膚疾患である、請求項１９９に記載の方法。

【請求項204】

前記炎症性皮膚疾患が、乾癬およびアトピー性皮膚炎からなる群から選択される、請求項２０３に記載の方法。

【請求項205】

前記疾患または障害が、自己免疫疾患である、請求項１８３から１９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項206】

前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、抗リン脂質抗体症候群、１型真性糖尿病、血管炎および全身性強皮症からなる群から選択される、請求項２０５に記載の方法。

【請求項207】

前記自己免疫疾患が、ループス腎炎を伴う全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、請求項２０６に記載の方法。

【請求項208】

前記疾患または障害が、自己炎症性疾患である、請求項１８３から１９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項209】

前記自己炎症性疾患が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および痛風からなる群から選択される、請求項２０８に記載の方法。

【請求項210】

前記疾患または障害が、神経学的疾患または障害である、請求項１８３から１９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項211】

前記神経学的疾患または障害が、慢性神経変性疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）感染症および虚血性脳卒中からなる群から選択される、請求項２１０に記載の方法。

【請求項212】

前記慢性神経変性疾患が、アルツハイマー病および多発性硬化症からなる群から選択される、請求項２１１に記載の方法。

【請求項213】

前記ＣＮＳ感染症が、髄膜炎および脳性マラリアからなる群から選択される、請求項２１１に記載の方法。

【請求項214】

前記疾患または障害が、代謝疾患である、請求項１８３から１９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項215】

前記代謝疾患が、２型糖尿病および肥満からなる群から選択される、請求項２１４に記載の方法。

【請求項216】

前記疾患または障害が、心血管疾患である、請求項１８３から１９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項217】

前記心血管疾患が、アテローム動脈硬化症によって特徴付けられる、請求項２１６に記載の方法。

【請求項218】

前記心血管疾患が、冠動脈心疾患および脳卒中からなる群から選択される、請求項２１７に記載の方法。

【請求項219】

前記疾患または障害が、血栓症である、請求項１８３から１９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項220】

前記疾患または障害が、敗血症である、請求項１８３から１９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項221】

前記疾患または障害が、虚血再灌流である、請求項１８３から１９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項222】

前記疾患または障害が、慢性肝臓疾患である、請求項１８３から１９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項223】

前記慢性肝臓疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項２２２に記載の方法。

【請求項224】

前記疾患または障害が、線維性疾患である、請求項１８３から１９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項225】

前記線維性疾患が、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス、炎症性肺疾患、慢性肝臓疾患および慢性腎臓疾患からなる群から選択される、請求項２２４に記載の方法。

【請求項226】

前記疾患または障害が、がんである、請求項１８３から１９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項227】

対象において脂質酸化を低減させるための方法であって、請求項１から１４１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項１４２に記載のダイマー性タンパク質の有効量を、前記対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項228】

加齢から対象を保護するための方法であって、請求項１から１４１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項１４２に記載のダイマー性タンパク質の有効量を、前記対象に投与するステップを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０２１年２月１９日出願の米国仮特許出願第６３／１５１，２３６号および同第６３／１５１，２７２号の利益を主張する。上述の出願の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表に対する言及

【0002】

本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提供された、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０２２年２月１６日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、名称が「ＴＲＰ＿０４１０ＰＣ＿２０２２０２１６＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」であり、サイズが５５２，７３４バイトである。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
肺疾患および線維症
大気オゾンレベルによって主に引き起こされる空気汚染は、将来増加すると予測される地球規模の健康問題である（Zhang et al., Front. Immunol. 10:2518, 2019）。オゾンは、強い酸化剤であり、対流圏（地表面）オゾンは、肺の炎症および損傷を引き起こす。オゾン汚染は、血管疾患および神経学的疾患にも関連付けられている（Zhang et al., 上記）。

【0004】

肺疾患は既に、世界中で顕著な健康上および経済上の負担である。肺疾患は、米国では３番目の死亡原因である。慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および喘息を含めると、そのコストは、２０２０年までに、年間８００億ドルを超えると予測される（Foster et al., J. COPD 3:2011-2018, 2006；Nurmagambetov et al., Annals of Am. Thoracic Soc., Center for Disease Control and Prevention, 2017）。現行の治療には、ＣＯＰＤのための噴霧型ステロイド、抗コリン薬および気管支拡張薬（bronchodialator）、ならびに喘息のためのロイコトリエンモジュレーターおよび長時間作用型ベータアゴニストが含まれる。皮下または静脈内注射によって与えられるヒト化抗体は、制御困難な喘息患者のための追加治療として承認されている；これらの抗体は、ＩｇＥを枯渇させ（オマリズマブ）、ＩＬ－５を阻害し（メポリズマブおよびレスリズマブ）、または好酸球を枯渇させる（ベンラリズマブ）。肺疾患の改善された治療のための新たな標的およびアプローチが必要とされている。

【0005】

肺炎症は、肺内腔および組織中への好中球、好酸球、マクロファージおよびリンパ球の浸潤に関連する。好中球細胞外トラップ（ＮＥＴＳ）に由来する細胞外ＤＮＡは、喘息、嚢胞性線維症およびＣＯＰＤを有する患者の肺中に存在する（Liu et al., Chinese Med. Journal 130:730-736, 2017；Twaddell et al., CHEST 156:774-782, 2019；Uddin et al., Front. Immunol. 10:47, 2019；Yamashita et al., J. Immunol. 191:949-960, 2013）。さらに、好酸球は、喘息を有する患者において細胞外トラップに寄与する（Dworski et al., J. Allergy Clinical Immunol. 127:1260-1266, 2011）。トラップは、肺粘液を厚くし、組織損傷を促進するミエロペルオキシダーゼおよび好中球エラスターゼが含まれる炎症性メディエーターを含有する（Uddin et al., 上記）。ＮＥＴ関連のミエロペルオキシダーゼおよびエラスターゼは、嚢胞性線維症患者の痰および気管支肺胞上皮洗浄中で増加し、肺疾患の重症度と相関する（Kahn et al., Genes 10:183, 2019を一般に参照されたい）。ＤＮａｓｅ１は、ＮＥＴＳを消化し、粘液の粘度を低減させることができ、改善された肺クリアランスを可能にする（同上）。

【0006】

ＤＮａｓｅ１で消化され得る細胞外ＤＮＡは、シリカ誘導性肺線維症にとって重要であることが見出された（Benmerzoug et al., Nature Comm. 9:5226, 2018を参照されたい）。シリカは、細胞死および肺胞空間における自己ＤＮＡの放出を誘導し、線維症をもたらすインターフェロン遺伝子の刺激剤（ＳＴＩＮＧ）炎症経路を誘導する（同上）。
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染

【0007】

Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、易感染性個体、熱傷患者、ならびにＣＯＰＤおよび嚢胞性線維症（ＣＦ）などの肺疾患を有する患者において重症の日和見感染症を引き起こす遍在性のグラム陰性桿菌である（Mulcahy et al., Microb. Ecol. 68:1-12, 2014を参照されたい）。これは、人工呼吸器などの医療用表面上で特に厄介であり、最も一般的な院内病原体、および人工呼吸器関連肺炎を有する患者から頻繁に単離される病原体の中にある。これは、嚢胞性線維症（ＣＦ）を有する成人における主要な病原体であり、増加した臨床的増悪に関連するので、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの根絶は、ＣＦ治療および他のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染に関する重要な意味を有する（例えば、Martinez-Solano et al., Chronic Infect. Dis. 47:1526-1533, 2008.；Meyer-Hamblett et al., Clin Inf. Dis. 59:624-631, 2014；Gallego et al., BMC Pulmonary Med. 14:103, 2014を参照されたい）。

【0008】

特にＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによる持続的な細菌肺感染の結果である肺不全は、ＣＦ患者における死亡の８０％を占める。ＣＦにおけるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによる感染は、早期死亡のリスクをほぼ３倍増加させる（McColley et al., Pediatric Pulmonology 52:909-915, 2017を参照されたい）。細菌肺感染を和らげることに焦点を当てた集中的な研究にもかかわらず、ＣＦ肺における有効な処置のための追加のアプローチがなおも必要である。

【0009】

クオラムセンシング（ＱＳ）は、ＣＦ肺におけるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ持続を助け、その病理発生に顕著に寄与する重要な機構である。ＱＳは、共同体全体にわたる活動の協調を可能にする、細菌によって産生される小分子、特にアシルホモセリンラクトン（またはＡＨＬ）によって媒介される。アシルホモセリンラクトンは、ホモセリンラクトン環（ＨＳＬ）と、長さおよび飽和の程度が異なり得るアシル鎖とからなる基本構造を共有する。バリアント側鎖は、ＱＳ機構に特異性を与え、細菌がそれらの特異的ＡＨＬを認識しそれに応答することを可能にする。発現されたＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａプロテオームのほぼ４分の１は、ＱＳによって制御される。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａでは、ＱＳは、多数の病原因子の発現および調節において重要な役割を果たす。ＱＳは、バイオフィルムの形成においても重要な役割を果たす。バイオフィルムは、細菌共同体を、多糖、細胞外ＤＮＡおよびタンパク質のマトリックス中に本質的に包み、宿主の免疫応答、および抗生物質などの外部抗菌剤からそれを保護し、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの生存を容易にする（Mulcahy et al., 上記）。
パラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）

【0010】

パラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化を阻害し、その機能を守る抗酸化酵素である（Aviram et al., J. Clin. Invest. 101:1581-1590, 1998）。ＰＯＮ１は、有機リン、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによって作製されるクオラムセンシング分子であるアシルホモセリンラクトンが含まれる、複数の基質を有する。ＰＯＮ１活性は、動脈硬化症および虚血性脳卒中からの保護において重要である（Litvinov et al., N. Am. J. Med. Sci. 4:523-532, 2012）。さらに、ＰＯＮ１活性は、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えば、クローン病を有する患者が含まれる、腸炎症を有する患者において低減される（Oran et al., J. Pak. Med. Assoc. 64:820-822, 2014；Szczelkik et al., Molecules 23:2603, 2018；Rothem et al., Free Rad. Biol. Med. 43:730-739, 2007）。大腸炎のマウスモデルにおける研究は、Ｎ－アセチルシステインによる処置が、ＰＯＮ１の上方調節を刺激すること、および増加したＰＯＮ１活性が、結腸損傷の軽快に関連することを実証している（You et al., Dig. Dis. Sci. 54:1643-1650, 2009）。

【0011】

ＰＯＮ１は、複数の肺疾患においても欠損している。ＰＯＮ１が、肺炎症からの保護において重要であり、低いＰＯＮ１活性が、肺疾患に関連するという、強い証拠が存在する。酸化ストレスは、喘息の病理発生における重要な因子であり（Sahiner et al., WAO Journal 4:151-158, 2011を参照されたい）、ＰＯＮ１の抗酸化活性は、喘息患者では損なわれている。喘息を有する小児では、ＰＯＮ１レベルは、対照よりも有意に低かった（ｐ＜０．００１）（Emin et al., Allergol. Immunopathol. (Madr) 43:346-352, 2014）。追加の研究は、ＰＯＮ１活性が、喘息患者において有意に低い（ｐ＜０．０２４）ことを報告している（Sarioglu et al., Iran J. Asthma Immunol. 14:60-66, 2015）。別の研究は、ＰＯＮ１活性が、活動性疾患の間には喘息患者においてより低いが、ＰＯＮ１活性が、疾患寛解の間に増加することを示した（Tolgyesi et al., Internat. Immunol. 21:967-975, 2009）。この研究はまた、実験的マウス喘息モデルにおいて遺伝子プロファイリングを使用して、疾患活性をモニタリングするための潜在的標的としてＰＯＮ１の下方調節を同定した（同上を参照されたい）。さらに、マウス喘息モデルは、ＰＯＮ１過剰発現が、気道炎症およびリモデリングを低減させ、炎症性サイトカインを低減させたことを示した（Chen et al., J. Cell Biochem. 119:793-805, 2018）。

【0012】

対照と比較して、ＣＯＰＤを有する患者は、より低いレベルの還元されたチオール基によって明らかな、有意に低いＰＯＮ１活性および増加した酸化ストレスを有することが見出された（Rumora et al., J. COPD 11:539-545, 2014）。別の研究は、ＰＯＮ１プロモーター中の－１０８における多型Ｃ＞Ｔが、ＣＯＰＤに強く関連したことを見出した（Rajkovic et al., J. Clin. Path. 71:963-970, 2018）。－１０８のＴＴ遺伝子型およびＴ対立遺伝子は共に、強く関連し（ｐ＜０．００１）、－１０８Ｔ対立遺伝子は、ＣＯＰＤ患者におけるＰＯＮ１の低減された発現における要因であり得た（同上）。

【0013】

ＰＯＮ１活性は、特に、活動性疾患の間、サルコイドーシスおよび間質性肺疾患を有する患者において低減されることが報告された（Ivanisevic et al., Eur. J. Clin. Invest. 46:418-424, 2016；Uzun et al., Curr. Med. Res. Opin. 24:1651-1657, 2008）。別の研究は、低酸素症の間のより低いＰＯＮ１を見出した（Okur et al., Sleep Breath. 17:365-371, 2013）。ＰＯＮ１活性は、曝露が数十年前であっても、硫黄（sulfa）マスタードガスに曝露された、肺疾患を有する患者には存在しなかった（Golmanesh et al., Immunopharmacol. and Immunotoxicol. 35:419-425, 2013）。

【0014】

過剰量のＰＯＮ１は、ミエロペルオキシダーゼを阻害するが、過剰量のミエロペルオキシダーゼは、ＰＯＮ１を阻害するという点で、ＰＯＮ１とミエロペルオキシダーゼとは、相互制御を発揮することが報告された（Huang et al., J. Clin. Invest. 123:3815-3828, 2013）。Huang et al.は、ＰＯＮ１およびミエロペルオキシダーゼが共に、ａｐｏＡ－Ｉにしっかりと結合したことを見出した。これは、好中球および好酸球が過剰量のミエロペルオキシダーゼを産生する炎症の条件下で減少したＰＯＮ１活性についての１つの機構を提供する。しかし、正常条件下では、ＰＯＮ１は過剰量であり、ミエロペルオキシダーゼの活性を抑制する（同上を参照されたい）。

【0015】

組換えＰＯＮ１（ｒＰＯＮ１）は、単球性細胞系ＴＨＰ－１のＰＭＡ誘導性分化を阻害することが報告された（Rosenblat et al., Atherosclerosis 219:49-56, 2011）。ｒＰＯＮ１をＩＰ注射したマウスは、マクロファージへの単球の分化の低減、ならびにＣＤ１１ｂおよびＣＤ３６の発現の低減を有した。腹腔マクロファージの総細胞性過酸化物は、１８％減少した（同上）。

【0016】

ＰＯＮ１治療は、実験的モデルにおいて研究されてきた。１つの研究は、組換えヒトＰＯＮ１注射が、サリンおよびソマン吸入毒性からモルモットを保護できたことを示した（Valiyaveettil et al., Biochem. Pharmacol. 81:800-809, 2011；Valiyaveettil et al., Toxicol. Letters 202:203-208, 2011）。他の研究は、ＰＯＮ１による治療が、マウスにおいて有機リン中毒から保護したことを示した（Bajaj et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 180:165, 2016；Stevens et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:12780-12784, 2008）。これらの研究は、細菌封入体から精製された、またはバキュロウイルスベクターを用いてＴ．ｎｉ幼虫において作製された組換えＰＯＮ１を使用した。両方のグループはまた、ＰＯＮ１酵素活性を安定化し増加させることを助ける、ウサギ配列に由来するバリアントであるＰＯＮ１ １９２Ｋを発現させた（Bajaj et al., 上記；Stevens et al., 上記を参照されたい）。

【0017】

細菌におけるＰＯＮ１の発現は、有機リンおよび神経剤に対する増強された酵素活性を有する突然変異体を選択するためにも使用されてきた（Aharoni et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:482-487, 2004；Goldsmith et al., Chemistry and Biology 19:456, 2012を参照されたい）。ＰＯＮ１の操作は、細菌における改善された可溶性発現を有するバリアントを見出すために、指向性進化によって実施された。１つの進化したＰＯＮ１が結晶化され、ＰＯＮ１構造が記載された（Harel et al., Nature Struct. Mol. Biol. 11:412-419, 2004を参照されたい）。広く使用される別のＰＯＮ１バリアントは、マウス、ラット、ウサギおよびヒトのＰＯＮ１配列をシャッフルすることから形成されたハイブリッドＰＯＮ１であるＧ３Ｃ９である（Aharoni et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:482-487, 2004を参照されたい）。増加した有機リン分解酵素（ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）活性を有するが、低減されたエステラーゼ活性を有する他のＰＯＮ１バリアントが記載されている（Aharoni et al., 上記を参照されたい）。Ｇ型神経剤タブン、サリン、ソマンおよびシクロサリンに対する活性を増加させるＧ３Ｃ９のさらなる進化も報告されている（Gupta et al., Nat. Chem. Biol. 7:120-125, 2011；Goldsmith et al., Chemistry and Biology 19:456-466, 2012）。ヒトＰＯＮ１と比較した場合、Ｇ３Ｃ９は、５５個の位置においてアミノ酸差異を有し、さらに進化したＰＯＮ１バリアントは、さらに多くのアミノ酸差異を有する（Goldsmith et al., 上記）。

【0018】

ＰＯＮ１およびＰＯＮ１バリアントＧ３Ｃ９は、実験的大腸炎のマウスモデルにおいて試験されている（Yamashita et al., J. Immunol. 191:949-960, 2013）。ＰＯＮ１治療は、ＴＮＢＳ誘導性大腸炎において有効であり、ヒトにおいて現在最も有効な臨床的に使用される治療剤である抗ＴＮＦα治療と等価であった。しかし、ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＢ^ｈｉｇｈ細胞移入を用いた慢性大腸炎モデルでは、ＰＯＮ１は有効でなかったが、Ｇ３Ｃ９は強い有効性を示した。Ｇ３Ｃ９の有効性は、慢性大腸炎モデルにおいて、抗ＴＮＦαと等価であった（同上）。別の研究では、ＰＯＮ１活性は、クローン病の重症度と相関することが見出された（Sczceklik et al., Molecules 23:2603, 2018）。

【0019】

ＰＯＮ１による治療に向けた別のアプローチは、ＢＬ－３０５０と呼ばれる療法である、再構成されたａｐｏＡ－ＩプラスＰＯＮ１から形成されたＨＤＬ様粒子を注射することであった（Gaidukov et al., BMC Clinical Pharmacol. 9:18, 2009）。これらの研究では、細菌において発現されたＧ３Ｃ９とＢＬ－３０５０複合体とは共に、有機リン中毒のマウスモデルにおいて保護的であった（同上）。

【0020】

ＰＯＮ１は、インスリン受容体に特異的なｍＡｂ重鎖のＣ末端に結合された融合タンパク質として発現されている（例えば、Boado et al., Mol. Pharm. 5:1037, 2008を参照されたい）。インスリン受容体特異的軽鎖との、このハイブリッド重鎖の発現は、インスリン受容体に結合し、ＰＯＮ１酵素活性を有する、二機能性抗体の分泌を生じた（同上）。このハイブリッド分子は、哺乳動物細胞（ＣＯＳおよびＣＨＯ）において発現された（同上；Boado et al., Biotechnol. and Bioengineering, 108:186, 2011を参照されたい）。このハイブリッド分子は、非ヒト霊長類においても試験され、血液／脳関門を通過することが見出された；しかし、この分子は、末梢血から末梢組織中、主に肝臓中へと、迅速に除去された（Boado et al. (2011), 上記）。この分子の臨床試験の報告は存在しない。ＣＨＯ細胞におけるこの融合タンパク質の発現レベルは、複数回のトランスフェクションおよびサブクローニングの後であっても低かった（５～１０ｍｇ／リットル）（同上を参照されたい）。

【0021】

ＰＯＮ１は、膜形質導入（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）ドメインとも融合されており、これは、ＰＥＰ－１－ＰＯＮ１と呼ばれる（Kim et al., Biomaterials 64:45-56, 2015）。この分子は、パーキンソン病のマウスモデルにおいて、ミクログリア細胞系の炎症応答を阻害し、ドパミン作動性細胞死に対してｉｎ ｖｉｖｏで保護した（同上）。

【0022】

パラオキソナーゼ酵素は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の主要なＱＳ分子であるＣ１２ＨＳＬ（Ｎ－３－オキソ－ドデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン（N-3-oxo-dodecanoyl-L-Homoresine Lactone））が含まれるアシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）であるＱＳ分子を加水分解することができる。ヒトＰＯＮ１の研究は、それが、ラクトンが含まれる種々の基質を加水分解する多面的酵素活性を有することを示している（Billecke et al., Drug Metabolism and Disposition 28:1335-1342, 2000；Khersonsky and Tawfik, Biochemistry 44:6371-6382, 2005；Gaidukov and Tawfik, J. Lipid Res. 48:1637-1646, 2007；Bajaj et al., Protein Science 22:1799-1807, 2013）。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおける１つの研究は、重要なクオラムセンシング分子Ｎ－３－オキソデカノイルホモセリンラクトン（３ＯＣ１２－ＨＳＬ）を加水分解することが可能なヒトＰＯＮ１導入遺伝子の発現による、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ致死性からの保護を実証した（Stoltz et al., J. Clin. Invest. 118:3123-3131, 2008）。
ＤＮａｓｅ１

【0023】

ＤＮａｓｅ１は、ヒトＤＮａｓｅ１遺伝子によってコードされるカルシウムおよびマグネシウム依存的エンドヌクレアーゼである。ＤＮａｓｅ１は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡならびにクロマチンを切断する。クロマチンの切断は、クロマチンがオープンでありアクセス可能な高感受性部位において生じ、活性遺伝子を含有する可能性が高い領域を同定するためにゲノミクスにおいて使用される（Boyle et al., Cell 132:311-322, 2008）。ＤＮａｓｅ１は、アポトーシスの間にＤＮＡを分解することを助け（Samejima et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6:677-688, 2008）、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴＳ）もまた分解する（Hakkim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:9813, 2010）。ＤＮａｓｅ１は、バイオフィルムＤＮＡを消化して、バイオフィルムバイオマスにおける低減を生じることができ、抗生物質媒介性のバイオフィルム死滅を増加させることができる（Tetz et al., Antimicrob. Agents Chemother. 53:1204-1209, 2009）。

【0024】

死細胞および瀕死の細胞由来の細胞外ＤＮＡの蓄積は、ずっと以前に、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を有する患者において疾患の駆動因子として同定された。ＤＮａｓｅ１は、１９５９年に開始して、ＲｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒにおいてＳＬＥ患者に投与された。しかし、ウシＤＮａｓｅ１が使用され、治療は、その免疫原性によって制限された（Valle et al., Autoimmunity Rev. 7:359, 2008を参照されたい）。減少したレベルのＤＮａｓｅ１、および低減された活性を有するＤＮａｓｅ１突然変異が、ＳＬＥを有する患者において報告されている（Valle et al., 上記を参照されたい）。尿中の低減されたＤＮａｓｅ１活性は、ループス腎炎を有する患者において見出され、低減されたＤＮａｓｅ１活性は、疾患進行のバイオマーカーであった（Pedersen et al., J. Pathol. Clin. Res. 4:193, 2018）。ＳＬＥ患者では、アポトーシスデブリの欠損したクリアランスおよびクロマチンの蓄積が、トレランスの破壊および自己免疫疾患の発症に寄与する。

【0025】

活性化された好中球は、感染性因子と戦うために、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴｓ）と呼ばれる、細胞質タンパク質および顆粒タンパク質と結合したＤＮＡを押し出し、これは、「ＮＥＴｏｓｉｓ」としても公知のプロセスである（Brinkmann, J. Innate Immun. 10:422-431, 2018を参照されたい）。しかし、ＮＥＴｓは標的化されず、有効に除去されない場合、付随する組織損傷および炎症を引き起こす場合が多い。ＮＥＴｓは、複数の不治の重篤な疾患において疾患進行を駆動することに関与している。乾癬、嚢胞性線維症、ＳＬＥ、ＲＡ、Ｉ型糖尿病、敗血症、小型血管炎、ＩＢＤ、ＩＩ型糖尿病および肥満におけるＮＥＴｓの重要性の証拠が、最近概説された（Mutua and Gershwin, Clin. Rev. Allergy Immunol., 2020, DOI 10.1007/s12016-020-08804-7）。Michailidou, Front. Immunol. 11:619705, 2020（血管炎における好中球およびＮＥＴｓの関与を概説している）もまた参照されたい。ＮＥＴｓはまた、心血管疾患および血栓症において、ならびにＮＥＴｓが腫瘍の進行および転移を促進するがんにおいて、重要な役割を果たす（Brinkmann, 上記）。嚢胞性線維症におけるそれらの重要性に加えて、ＮＥＴｓは、他の呼吸器疾患、例えば、喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の臨床病理においても役割を果たす（Liu et al., Chinese Med. Journal 130:730-736, 2017；Twaddell et al., CHEST 156:774-782, 2019；Uddin et al., Front. Immunol. 10:47, 2019を参照されたい）。最近、ＮＥＴｓは、ＣＯＶＩＤ－１９急性呼吸促迫症候群における免疫血栓に寄与することが見出された（Middleton et al., Blood 136:1169, 2020；Zuo et al., JCI Insight 5:e138999, 2020；Barnes et al., J. Exp. Med. 217:e20200652, 2020）。

【0026】

ＤＮａｓｅ１は、ＮＥＴｓを消化することが可能であり、ＤＮａｓｅ１Ｌ３と呼ばれる別の細胞外ＤＮａｓｅと一緒に働いて、ＮＥＴｓを除去する。ＤＮａｓｅ１およびＤＮａｓｅ１Ｌ３の両方が欠損したマウスは、ＮＥＴｓを除去することができず、好中球活性化後の大量の血管内血餅形成および臓器損傷が原因で迅速に死亡した（Brinkmann, 上記）。血栓症へのＮＥＴｓの寄与は、ＣＯＶＩＤ－１９患者において吸入療法によって摂取される野生型ＤＮａｓｅ１（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標））の臨床試験を既にもたらしている（ＮＣＴ０４３５９６５４）。

【0027】

組換え野生型ヒトＤＮａｓｅ１（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標））は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって産生され、肺においてＤＮＡを消化し、うっ血を低減させるために、嚢胞性線維症（ＣＦ）のために最初に承認された。ＮＥＴｓに主に由来する高レベルのＤＮＡは、ＣＦ肺において病原性である（Law et al., J. Inflammation, 14:1-8, 2017）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルム形成由来の細菌ＤＮＡもまた、多くのＣＦ患者に存在し、これもまた、ＤＮａｓｅ１によって消化され得る（Whitchurch et al., Science 295:1487, 2002）。

【0028】

Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅは、噴霧によって肺に直接送達され、毎日摂取される。Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅは、ＣＦ以外の肺疾患を有する患者において研究されてきたが、代替的使用のためには承認されていない（Torbic et al., J. Pharmacy Practice 29:480, 2016）。Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅは、疾患測定値における減少なしに、マウスループスモデルにおいて（Verthelyi et al., Lupus 7:223, 1998）、およびＳＬＥ患者における第Ｉ相臨床試験において（Davis et al., Lupus 8:68-76, 1999）、試験された。ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ治療の全身投与は、この酵素が、血液および肺中に豊富な球状アクチンによって阻害されることに起因して（Ulmer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8225, 1996）、ならびにその短い半減期に起因して、制限され得る。

【0029】

ＣＦおよびＳＬＥ患者のためにＤＮａｓｅ１を増強するための試みがなされてきた。ＤＮＡ結合界面の部位特異的突然変異誘発研究は、酵素活性にとって重要な２７個のアミノ酸位置、および酵素活性に対する最小限の影響を有する、ＤＮＡ相互作用に周辺的に関与する別の１３個の位置を同定した（Pan et al., Prot. Sci. 7:628-636, 1998を参照されたい）。このグループは、特定の追加の正に荷電した残基を付加することによって、ＤＮＡに対する局所的静電引力を増加させることが、ＤＮＡへの結合親和性を改善しただけでなく、機能的活性を改善し、塩による阻害を除外したことも示した（Pan et al., Biochemistry 36:6624-6632, 1997；Pan and Lazarus, J. Biol. Chem. 273:11701-11708, 1998）。この観察と一致して、ＤＮＡとの重要な接触を行う２つのアルギニン（Ａｒｇ－４１およびＡｒｇ－１１１）のアラニン置換は、ヒトＤＮａｓｅ１のＤＮＡ切断活性を大きく低減させた（Pan et al., 1998, 上記）。さらに、ＤＮＡ界面に対して遠位の部位における、正または負に荷電した残基の導入は、比活性を変更させなかった（Ulmer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8225-8229, 1996）。

【0030】

機能亢進型ＤＮａｓｅ１バリアントは、低いＤＮＡ濃度および短いＤＮＡ長さの条件下で、有意な増強（最大１０，０００倍）を示した（Pan and Lazarus, 上記）。しかし、野生型ＤＮａｓｅ１に最適な条件下では、最良のバリアントは、７倍だけ高い活性を示し、単一のアミノ酸変化（Ｎ７４Ｋ）を含有した。Ｎ７４Ｋ機能亢進型バリアントは、カルシウムに対する低減された依存性を示した（Pan and Lazarus, Prot. Sci. 8:1780-1788, 1999）。

【0031】

Ulmer et. al.（上記）およびPan et al. (1998, 上記)は、Ａｌａ－１１４のフェニルアラニン置換（Ａ１１４Ｆ）が、Ｇ－アクチンによるＤＮａｓｅ１の阻害を除外したことを示した。

【0032】

アクチン抵抗性かつ機能亢進型のＤＮａｓｅ１突然変異体酵素が、米国特許第６，３４８，３４３号および同第６，３９１，６０７号にさらに記載されている。

【0033】

ＤＮＡＳＥ１は、多型であり、低減された活性を有する酵素をコードする対立遺伝子は、自己免疫疾患の増加したリスクに関連する。しかし、天然に存在する対立遺伝子Ｇ１０５Ｒは、活性における３倍の増加を有するＤＮａｓｅ１バリアントをコードすることが見出された（Yasuda et al., Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42:1216-1225, 2010）。これは、アフリカ系集団において見出される少数派の対立遺伝子であり、自己免疫疾患に対する抵抗を付与できた（同上）。

【0034】

アクチン／塩抵抗性かつ機能亢進型のＤＮａｓｅ１を使用するＤＮａｓｅ１治療には、大きな潜在力がある。しかし、数千個のクローンのスクリーニングにもかかわらず、増強されたＤＮａｓｅ１を構成的に発現する安定なＣＨＯ細胞を得ることは不可能であった（Lam et al., Biotech. Progress 32: 523-533, 2017を参照されたい）。これは、ＣＨＯ細胞における高い発現の間の酵素の毒性に起因すると考えられた。Lam et al.（上記）は、増強されたＤＮａｓｅ１酵素を製造する際の問題に対する１つの潜在的解決法として、ＣＨＯ細胞における誘導性の発現系を記載している。

【0035】

Dwyer et al.（J. Biol. Chem. 274:9738-43, 1999）は、Ｆｃドメインによるダイマー化に起因して損なわれた酵素活性を有するＤＮａｓｅＩ－Ｆｃ融合タンパク質を記載している。Dwyer et al.は、活性を改善することなしに、ＤＮａｓｅ１とＦｃドメインとの間に短いリンカー（最大７ａａ）を付加した（同上を参照されたい）。Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒらに対する米国特許第８，８４１，４１６号は、２１アミノ酸のリンカーを有し、組換えＤＮａｓｅ１対照と少なくとも等価な活性を有するＤＮａｓｅＩ－Ｆｃ融合物を記載している。

【0036】

野生型ＤＮａｓｅ１（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）治療は、ＣＦではＦＤＡ承認されているが、ＤＮａｓｅ１が活性であるＣＦマウスモデルは存在しない。Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅは、適切なｉｎ ｖｉｖｏ疾患モデルにおいて活性について試験することなしに、ＣＦ治療のために承認された（Greene, Hum. Exp. Toxicol., May:13 Suppl 1:S1-42, 1994）。より最近、野生型ＤＮａｓｅ１治療は、有望な結果を伴って、いくつかのｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて研究されている。ＤＮａｓｅ１は、急性喘息モデルにおいて、気道抵抗を有意に低減させることが見出されたが、炎症は低減させなかった（da Cunha et al., Exp. Lung Res. 42:66, 2016）。シリカ誘導性肺炎症モデルでは、ＤＮａｓｅ１治療は、ＤＮＡ媒介性のＳＴＩＮＧ活性化を予防し、下流のＩ型ＩＦＮ応答を遮断した（Benmerzoug et al., Nat. Comm. 9:5226, 2018）。急性肺傷害のモデルでは、ＤＮａｓｅ１治療は、肺浮腫および肺血管透過性からマウスを保護した。ＤＮａｓｅ１治療はまた、肺におけるＮＥＴ形成および血小板隔離（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）を低減させた（Caudrillier et al., J. Clin. Invest. 122:2661, 2012）。

【0037】

マウス腫瘍モデルにおける研究は、ＮＥＴｓが転移を促進すること、およびＤＮａｓｅ１またはＤＮａｓｅ１コーティングされたナノ粒子の注射が、腫瘍転移を低減させたことを示している（Cools-Lartigue et al., J. Clin. Invest. 123:3446, 2013；Park et al., Sci. Translational Med. 8:361ra138, 2016）。別の研究は、ＤＮａｓｅ１とプロテアーゼとの組合せが、ヌードマウスモデルにおけるヒト結腸がん細胞の成長を有意に阻害したことを示した（Trejo-Becirril et al., Integrative Cancer Therapies 15:NP35-NP43, 2016）。がん患者では、好中球ＮＥＴ形成のマーカーである、増加した濃度のシトルリン化されたヒストンＨ３は、不十分な臨床転帰を強く予測した（Thalin et al., PLoS ONE 13:e0191231, 2018）。

【0038】

マウスＤＳＳ大腸炎モデル（Babicova et al., Folia Biolica (Praha) 64:10, 2018）では、ＤＮａｓｅ１治療は、結腸におけるＴＮＦαおよびミエロペルオキシダーゼの低減を引き起こした。別の研究（Li et al., J. Crohns Colitis 2020, 14:240-253, 2020）は、ＤＮａｓｅ１治療が、サイトカイン産生を減少させ、ＤＳＳ誘導性大腸炎の後の加速された血栓形成および血小板活性化を減衰させたことを見出した。

【0039】

後肢虚血再灌流モデルにおけるＤＮａｓｅ１治療は、灌流の増加、浸潤性炎症細胞の減少、血栓症の局所的マーカーの低減を引き起こした（Albadawi et al., J. Vasc. Surg. 64:484, 2016）。虚血－再灌流誘導性急性腎臓傷害のラットモデルでは、ＤＮａｓｅ１処置は、有意な腎保護効果を示した。ＤＮａｓｅ１の外因性投与は、虚血ラットの腎臓における急性傷害の機能的特徴および組織学的特徴の両方を軽快させた（Peer et al., Am. J. Nephrol. 43:195, 2016）。

【0040】

ＤＮａｓｅ１処置は、マウスにおける盲腸結紮穿刺敗血症モデルにおいて傷害の４または６時間後に与えられた場合、臓器損傷を予防し、死亡から保護した（Mai et al., Shock 44:166, 2015）。ＮＥＴｓ由来の細胞外ＤＮＡは、血栓形成のための足場として認識されており、ＤＮａｓｅ１の注入は、下大静脈狭窄のモデルにおいて血栓症を予防した（Brill et al., J. Thrombosis Haemostasis 10:136, 2012）。
ＲＮａｓｅ

【0041】

ＲＮａｓｅ１は、ヒトではＲＮａｓｅ１～８からなるＲＮａｓｅ Ａスーパーファミリーのメンバーである。ＲＮａｓｅ Ａは、ウシ膵臓から最初に単離され、この場所で、消化酵素として主に機能する。ヒトでは、ＲＮａｓｅ１は、一本鎖および二本鎖ＲＮＡならびにＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを消化する。ＲＮａｓｅ１は、ヒトでは、複数の細胞型によって産生され、血管恒常性に主に関与すると考えられている。ＲＮａｓｅ１は、ポリヌクレオチド消化において、炎症性細胞外ＲＮＡを除去する主要な役割を果たす。さらに、ＲＮａｓｅ１は、抗ウイルス活性を有する。

【0042】

ＲＮａｓｅによる治療は、複数の疾患モデルにおいて研究されている。例えば、胸腺欠損マウスにおけるヒト肺腫瘍系Ａ５４９の成長は、ＰＥＧ－ＲＮａｓｅ１によって阻害された（Rutkoski et al., Translational Oncology 6:392-397, 2013）。ＲＮａｓｅ治療はまた、ルイス肺癌を有する同系マウス腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を示し、ｍｉｃｒｏＲＮＡプロファイルを変更させた（Mironova et al., Oncotarget. 8:78796-78810, 2017）。ＲＮａｓｅ１は、乳房腺癌細胞の表面上で発現される腫瘍関連抗原Ｇｌｏｂｏ Ｈに結合することが報告された（Eller et al., ACS Central Sci. 1:181-190, 2015）。

【0043】

さらに、ＲＮａｓｅ治療は、心臓移植（Kleinert et al., J. Am. Heart Assn. doi: 10.1021, 2016）、粥腫形成（Simsekyilmaz et al., Circulation 129: 598-606, 2014）および心筋梗塞（Steiger et al., JAMA 6:e004541, 2017）の動物モデルにおいて有効であることが見出された。ＲＮａｓｅ１治療はまた、急性脳卒中モデルにおいて脳浮腫および梗塞サイズを低減させた（Walberer et al., Curr. Neovas. Res. 6:12-19, 2009）。

【0044】

ＲＮａｓｅ治療は、加齢マウスにおいて術後認知機能低下を予防することが見出された（Chen et al., PLoS One 10:e0134307, 2015）。

【0045】

ＲＮａｓｅ治療は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のマウスモデルにおいても研究されている（Sun et al., J. Immunol. 190:2536-2543, 2013）。ＲＮＡセンサーＴＬＲ７の過剰発現は、自己抗体、腎臓疾患および早期死亡を伴うループス様疾患を引き起こす。これらのマウスを、ＲＮａｓｅ Ａを導入遺伝子として過剰発現するマウスと交雑させることで、増加した生存、低減されたリンパ球活性化、ＩｇＧおよびＣ３の低減された腎臓沈着、ならびに低減された肝炎症および壊死を有する子孫が生じた（同上）。

【0046】

ヒトＲＮａｓｅ１がＰ２３８ＳおよびＰ３３１Ｓ突然変異を含む突然変異したヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインに融合されたＲＮａｓｅ－Ｉｇ（米国特許第８，９３７，１５７号を参照されたい）は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）およびシェーグレン症候群を有する患者における第Ｉ相および第ＩＩ相臨床試験において試験されている。
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）

【0047】

スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、酸素フリーラジカルをＨ_２Ｏ_２およびＯ_２に変換する抗酸化酵素である。３つのヒトＳＯＤ酵素が存在する。ＳＯＤ１は、Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤとも呼ばれ、鎖内ジスルフィド結合および金属結合によって安定化されたホモダイマーである細胞質酵素である（Doucette et al., J. Biol. Chem. 279:54558-54566, 2004）。ＳＯＤ２は、ミトコンドリア中に局在し、その活性部位においてマンガンを使用するテトラマーである。ＳＯＤ３は、分泌型であり、銅および亜鉛を含有するテトラマーである。酸化的損傷からの全面的保護におけるＳＯＤ、グルタチオンペルオキシダーゼおよびカタラーゼの役割の総説については、Ighodaro and Akinolye, Alexandria J. Med. 54:287-293, 2018を参照されたい。

【0048】

ＳＯＤ３は、肺における主要な細胞外抗酸化酵素であり、この場所で、ＳＯＤ３は、肺傷害の間、細胞外マトリックスを保護する。ＳＯＤ３の遺伝的バリアントは、成人における減少した肺機能、およびＣＯＰＤの迅速な進行に関連する（総説については、Ganguly et al., Physiol. Genomics 37:260-267, 2009を参照されたい）。

【0049】

ＳＯＤ１は、ＳＯＤ１を細胞質に送達するために、細胞膜形質導入ドメインと融合されている。例えば、Eum et al.（Free Rad. Biol. Med. 37:1656-1669, 2004）は、ＰＥＰ－１と呼ばれる２１アミノ酸のペプチドとＳＯＤとの融合物を作製し、細菌においてこの融合タンパク質を発現させた。彼らは、ＰＥＰ－１－ＳＯＤ分子が、細胞膜を介してＳＯＤを送達し、虚血発作後のニューロン死の予防において、ＩＰ注射後にｉｎ ｖｉｖｏで有効であったことを示した。ＳＯＤ１およびバリアント形態のＳＯＤ１はまた、蛍光ベースの結合およびシャペロンアッセイにおいて検出され得る融合タンパク質を創出するために、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）タグに融合されている（Ganesan et al., Cell Death and Differentiation 15:312-321, 2008）。
細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子－４（ＣＴＬＡ－４）

【0050】

細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子－４（ＣＴＬＡ－４）は、ＣＤ２８－Ｂ７の共刺激性相互作用を阻害することによってＴ細胞応答の下方調節を生じる免疫調節性膜受容体である（Carreno et al., J. Immunol. 165:1352-1356, 2000）。ヒトＩｇＧ１突然変異体Ｆｃドメインに融合されたＣＴＬＡ－４の細胞外ドメイン（アバタセプト、Ｏｒｅｎｃｉａ（商標））は、Ｔ細胞上のＣＤ２８受容体の活性化を抑制するその能力に起因して、ＲＡの治療のためにＦＤＡによって承認されている（Linsley et al., J. Exp. Med. 174:561-569, 1991；Emma Hitt, FDA Approves Subcutaneous Abatacept for RA, Medscape Medical News, Aug. 2, 2011を参照されたい）。アバタセプトは、炎症性サイトカインのＴ細胞産生を阻害し、Ｂ細胞クラススイッチングおよびＩｇＧ抗体応答を阻害する。

【0051】

アバタセプト処置は、皮膚線維症を予防し、確立された炎症駆動性線維症の退縮を誘導することが示されている（Ponsoye et al., Ann. Rheum. Dis. 75:2142-2149, 2016）。さらに、アバタセプトは、Ｆｒａ－２マウスの病変肺における線維形成性マーカーレベル、Ｔ細胞増殖およびＭ１／Ｍ２マクロファージ浸潤を有意に低減させ、これは、アバタセプトが、ヒトにおける肺線維症の処置において有用であり得ることを示している（Boleto et al., Arthritis Research and Therapy 20:197, 2018）。Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによれば、アバタセプトは、間質性線維症患者における第２相臨床試験で現在試験されており（試験番号ＮＣＴ０３２１５９２７）、多発性血管炎を伴う再発性の非重症肉芽腫症（ウェゲナー肉芽腫症）の処置について第３相臨床試験においても試験されている（試験番号ＮＣＴ０２１０８８６０）。共刺激阻害剤は、肺炎症に関連する損傷および修復のプロセスを抑制するための見込みのある候補として評価されている。
ＣＤ４０－ＣＤ１５４

【0052】

ＣＤ４０は、ＴＮＦα受容体スーパーファミリーのメンバーであり、リンパ球、造血細胞、ならびに線維芽細胞、上皮細胞および内皮細胞が含まれる構造的細胞上で発現される（Sime and O'Reilly, Clin. Immunol. 99:308-319, 2001）。ＣＤ４０のリガンド（ＣＤ４０ＬまたはＣＤ１５４）は、活性化されたＴリンパ球、活性化された血小板、肥満細胞および好酸球上で発現される。活性化されたＴ細胞によって発現されるＣＤ１５４は、Ｂ細胞上のＣＤ４０に、クラススイッチングおよびＩｇＧ産生に必要とされる重要なシグナルを提供する。しかし、内皮細胞などの構造的細胞の表面上で発現されるＣＤ４０は、ＣＤ１５４に結合することによって刺激されて、炎症性サイトカインの産生を生じ得る（同上）。活性化された血小板は、それらの表面上にＣＤ１５４を発現し、血液中の可溶性ＣＤ１５４の主要な供給源でもある。

【0053】

ＣＤ４０－ＣＤ１５４シグナル伝達経路は、線維症が含まれる肺の傷害および疾患プロセスに関与している（Kaufman et al., J. Immunol. 172:1862-1871, 2004）。ＣＤ４０受容体とＣＤ１５４との間での相互作用は、炎症促進性サイトカインの産生、細胞接着分子の発現、ならびにシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ－２）およびプロスタグランジンＥ_２（ＰＧＥ_２）の誘導が含まれる細胞活性化を誘発することができる（Zhang, J. Immunol. 160:1053-1057, 1998）。これらの事象は、次に、１型サイトカイン応答と２型サイトカイン応答との間のバランスを、２型線維形成性応答に有利に働くものにすることができる。ＣＤ４０－ＣＤ１５４経路の抑制は、動物肺疾患モデルにおいて治療利益を有することが示されている。例えば、モノクローナル抗マウスＣＤ４０Ｌ抗体ＭＲ１は、マウスモデルにおける高酸素症肺傷害ならびに放射線誘導性の肺傷害および線維症の保護において有効であった（Adawi et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 89:222-230, 1998；Adawi et al., Am. J. Pathol. 152:651-657, 1998）。さらに、エピジェネティック調節および転写調節に関与する、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ経路を抑制する分子、例えば、ＣＸＸＣ５ジンクフィンガータンパク質は、マウスにおいてブレオマイシン誘導性肺線維症を軽快させることが示されており（Cheng et al., BioMed. Research Intl. Volume 2020, Article ID 7840652, 2020；Xiong et al., J. Cell. Mol. Med. 23:740-749, 2018）、これは、疾患進行においてＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ経路が果たす重要な役割を示している。
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）

【0054】

腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）サイトカインは、マクロファージおよび単球が含まれる種々の細胞型によって産生される多面的炎症促進性メディエーターである。マクロファージは、肺におけるＴＮＦαの主要な供給源である；しかし、上皮細胞、好酸球および肥満細胞もまた、活性化の際にＴＮＦαを放出し得る（Malaviya et al., Pharmacol. Ther. 180:90-98, 2017；Aggarwal et al., Blood 119:651-665, 2012）。増加したレベルのＴＮＦαは、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性肺傷害（ＡＬＩ）／急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、サルコイドーシスおよび間質性肺線維症（ＩＰＦ）が含まれるいくつかの肺炎症性疾患に関連付けられている（Malaviya et al., 上記）。

【0055】

肺病理に加えて、ＴＮＦαは、炎症性腸疾患、例えば、クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）において増加し、それらに関与する。腫瘍壊死因子－アルファに対するモノクローナル抗体治療（抗ＴＮＦ）は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を有する患者のケアを革命的に変化させている（Pouillon et al., Expert Opinion on Biological Therapy 16:1277-1290, 2016；Peyrin-Biroulet et al., The Lancet 372:67-81, 2008）。
トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）

【0056】

ＴＧＦ－βサイトカインは、免疫応答および調節において重要な役割を果たす（Travis and Sheppard, Annu. Rev. Immunol. 32:51-82, 2014）。哺乳動物では、ＴＧＦ－βの３つの主要なアイソフォーム：ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２およびＴＧＦ－β３が同定されている（Fernandez and Eickelberg, Proc. Amer. Thorac. Soc. 9:111-116, 2012）。多くの細胞型がＴＧＦ－βを発現するが、ＴＧＦ－βは、他の分子と複合体形成した非活性形態で発現され、その機能的効果を発揮するためには活性化を要求する。潜在型ＴＧＦ－βは、プレタンパク質形態から、走化性、増殖、および炎症に関連するサイトカインの刺激が含まれる多面的活性を有するサイトカインへの切断の際に活性化される。ＴＧＦ－βは、細胞増殖、分化、遊走、接着、生存、上皮－間葉転換（ＥＭＴ）、ならびにコラーゲンおよび細胞外マトリックス合成を調節し、血管形成、創傷治癒および免疫調節に重要であるが、がん、転移、糖尿病および線維症疾患進行を駆動することもできる（Varga and Pasche, Curr. Opin. Rheum. 20:720-728, 2008）。ＴＧＦ－βは、適応Ｔ細胞応答を調節する際に重要であることも示されており、最近の研究は、ＴＧＦ－βが、肺が含まれる異なる臓器における線維症の重要なメディエーターであることを示唆している。ＴＧＦ－βアイソフォームを標的化するいくつかの抗体、例えば、フレソリムマブ（ＧＣ－１００８）を使用する臨床試験は、完了しているか、またはがん治療（黒色腫、神経膠腫、乳房がんおよび非小肺がん）および線維症について進行中である。さらに、ＴＧＦ－β活性化に関与するまたはＴＧＦ－β活性化において重要な、αＶβ６などのインテグリンを標的化する抗体もまた、特発性肺線維症（ＩＰＦ）に対するそれらの有効性を決定するための第２相臨床試験において使用されている（Fernandez and Eickelberg, 上記）。
哺乳動物細胞における増強されたＤＮａｓｅ１の発現
野生型ＤＮａｓｅ１、例えば、ＦＤＡ承認された薬物Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標）は、肺および血漿中のＧ－アクチンによって阻害される。増強されたＤＮａｓｅ１は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって操作され、アクチンによる阻害に対して抵抗性であり、かつ増加した酵素活性を有するＤＮａｓｅ１を創出している（Pan and Lazarus, Prot. Sci. 8:1780-8, 1999）。しかし、この増強されたＤＮａｓｅ１は、哺乳動物細胞において毒性であり、安定なＣＨＯ細胞は、数千個のクローンのスクリーニングにもかかわらず、樹立できなかった。ＣＨＯ細胞における誘導性の発現は、報告された１つの潜在的解決法であった（Lam et al., Biotech. Progress 32: 523-33, 2017）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0057】

【非特許文献1】Zhang et al., Front. Immunol. 10:2518, 2019

【非特許文献2】Foster et al., J. COPD 3:2011-2018, 2006

【非特許文献3】Nurmagambetov et al., Annals of Am. Thoracic Soc., Center for Disease Control and Prevention, 2017

【非特許文献4】Liu et al., Chinese Med. Journal 130:730-736, 2017

【非特許文献5】Twaddell et al., CHEST 156:774-782, 2019

【非特許文献6】Uddin et al., Front. Immunol. 10:47, 2019

【非特許文献7】Yamashita et al., J. Immunol. 191:949-960, 2013

【非特許文献8】Dworski et al., J. Allergy Clinical Immunol. 127:1260-1266, 2011

【非特許文献9】Kahn et al., Genes 10:183, 2019

【非特許文献10】Benmerzoug et al., Nature Comm. 9:5226, 2018

【非特許文献11】Martinez-Solano et al., Chronic Infect. Dis. 47:1526-1533, 2008.

【非特許文献12】Meyer-Hamblett et al., Clin Inf. Dis. 59:624-631, 2014

【非特許文献13】Gallego et al., BMC Pulmonary Med. 14:103, 2014

【非特許文献14】McColley et al., Pediatric Pulmonology 52:909-915, 2017

【非特許文献15】Aviram et al., J. Clin. Invest. 101:1581-1590, 1998

【非特許文献16】Litvinov et al., N. Am. J. Med. Sci. 4:523-532, 2012

【非特許文献17】Oran et al., J. Pak. Med. Assoc. 64:820-822, 2014

【非特許文献18】Szczelkik et al., Molecules 23:2603, 2018

【非特許文献19】Rothem et al., Free Rad. Biol. Med. 43:730-739, 2007

【非特許文献20】You et al., Dig. Dis. Sci. 54:1643-1650, 2009

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0058】

発明の概要
一態様では、本発明は、アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｐを含む融合ポリペプチドであって、式中、Ｔは、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子－４（ＣＴＬＡ－４）細胞外ドメイン、ＣＤ４０細胞外ドメイン、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）またはトランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）に特異的に結合しそれを中和するポリペプチドから選択される第１の生物学的に活性なポリペプチドであり；Ｌ１は、第１のポリペプチドリンカーであり、Ｌ１は、必要に応じて存在し；Ｘは、免疫グロブリン重鎖定常領域であり、免疫グロブリン重鎖定常領域は、ダイマーを形成し、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に特異的に結合することが可能であり；Ｌ２は、第２のポリペプチドリンカーであり、Ｌ２は、必要に応じて存在し；かつＰは、生物学的に活性なパラオキソナーゼであり、パラオキソナーゼは、配列番号６の残基１６～３５５または２６～３５５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号６の残基１～１５に対応するアミノ末端リーダー配列を含有しない、融合ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、生物学的に活性なパラオキソナーゼは、（ｉ）配列番号６の残基１６～３５５または２６～３５５、（ｉｉ）配列番号１２４の残基１６～３５５または２６～３５５、あるいは（ｉｉｉ）配列番号１２６の残基１６～３５５または２６～３５５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する。

【0059】

別の態様では、本発明は、アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｐを含む融合ポリペプチドであって、式中、Ｔは、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子－４（ＣＴＬＡ－４）細胞外ドメイン、ＣＤ４０細胞外ドメイン、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）またはトランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）に特異的に結合しそれを中和するポリペプチドから選択される第１の生物学的に活性なポリペプチドであり；Ｌ１は、第１のポリペプチドリンカーであり、Ｌ１は、必要に応じて存在し；Ｘは、第２の生物学的に活性なポリペプチドであり、Ｘは、必要に応じて存在し；Ｌ２は、第２のポリペプチドリンカーであり、Ｌ２は、必要に応じて存在し；かつＰは、生物学的に活性なパラオキソナーゼであり、パラオキソナーゼは、配列番号６の残基１６～３５５または２６～３５５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号６の残基１～１５に対応するアミノ末端リーダー配列を含有しない、融合ポリペプチドを提供する。一部の変形形態では、第２の生物学的に活性なポリペプチドは存在し、ダイマー化ドメインおよび新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に特異的に結合するドメインから選択される。一部の実施形態では、生物学的に活性なパラオキソナーゼは、（ｉ）配列番号６の残基１６～３５５または２６～３５５、（ｉｉ）配列番号１２４の残基１６～３５５または２６～３５５、あるいは（ｉｉｉ）配列番号１２６の残基１６～３５５または２６～３５５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する。

【0060】

第１の生物学的に活性なポリペプチドとしてＤＮａｓｅを含み、Ｌ１が存在する上記融合ポリペプチドのある特定の実施形態では、ＤＮａｓｅは、（ｉ）配列番号１８の残基２１～２８０、（ｉｉ）配列番号１５２の残基２１～２８０、または（ｉｉｉ）配列番号１３６の残基２１～２９０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する。ＤＮａｓｅが配列番号１８の残基２１～２８０または配列番号１５２の残基２１～２８０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する一部の実施形態では、ＤＮａｓｅは、Ｎ７４、Ｇ１０５およびＡ１１４から選択されるヒト野生型ＤＮａｓｅ１（配列番号１２０）のアミノ酸に対応する位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有し、（１）ヒトＤＮａｓｅ１のＮ７４に対応する位置におけるアミノ酸置換（Ｎ７４置換）は、存在する場合には、ヒトＤＮａｓｅ１と比較してＤＮＡ結合を増加させ、（２）ヒトＤＮａｓｅ１のＧ１０５に対応する位置におけるアミノ酸置換（Ｇ１０５置換）は、存在する場合には、ヒトＤＮａｓｅ１と比較してＤＮＡ結合を増加させ、かつ（３）ヒトＤＮａｓｅ１のＡ１１４に対応する位置におけるアミノ酸置換（Ａ１１４置換）は、存在する場合には、ヒトＤＮａｓｅ１と比較して、エンドヌクレアーゼ活性のＧ－アクチン誘導性阻害を減少させる。一部の変形形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ７４置換およびＧ１０５置換の両方、Ｇ１０５置換およびＡ１１４置換の両方、またはＮ７４置換、Ｇ１０５置換およびＡ１１４置換の各々を含有する。これらの位置における特に適切なアミノ酸置換は、ヒトＤＮａｓｅ１のＮ７４に対応する位置におけるリシン、ヒトＤＮａｓｅ１のＧ１０５に対応する位置におけるアルギニン、および／またはヒトＤＮａｓｅ１のＡ１１４に対応する位置におけるフェニルアラニンである。融合ポリペプチドがＮ７４置換およびＧ１０５置換の両方を含有する一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、Ａ１１４置換を含有しない。ＤＮａｓｅが配列番号１３６のアミノ酸残基２１～２９０と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する一部の実施形態では、配列番号１３６のＲ８０、Ｒ９５およびＮ９６に対応する位置におけるアミノ酸の各々は、アラニンまたはセリンである。より具体的な変形形態では、ＤＮａｓｅは、（ｉ）配列番号１８の残基２１～２８０、（ｉｉ）配列番号２０の残基２１～２８０、（ｉｉｉ）配列番号１５２の残基２１～２８０；（ｉｖ）配列番号１３８の残基２１～２９０、または（ｖ）配列番号１４０の残基２１～２９０に示されるアミノ酸配列を有する。上記ＤＮａｓｅを含む融合ポリペプチドの一部の実施形態では、Ｌ１は、少なくとも１５個のアミノ酸残基または少なくとも２６個のアミノ酸残基を含む（例えば、２６～６０個のアミノ酸残基または２６～３６個のアミノ酸残基からなるＬ１リンカー）。特定の変形形態では、Ｌ１は、配列番号１１９のアミノ酸配列の３つまたはそれよりも多くの（例えば、４つまたはそれよりも多くの）タンデムリピートを含む；一部のかかる実施形態では、Ｌ１は、配列番号１２または配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する。

【0061】

第１の生物学的に活性なポリペプチドとしてＲＮａｓｅを含む上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、ＲＮａｓｅは、配列番号２２の残基２９～１５６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する。より具体的な変形形態では、ＲＮａｓｅは、配列番号２２の残基２９～１５６に示されるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、Ｌ１は存在し、少なくとも２つのアミノ酸残基を含む（例えば、１０～３６個のアミノ酸残基からなるＬ１リンカー）。特定の変形形態では、Ｌ１は、配列番号１１９のアミノ酸配列の２つまたはそれよりも多くのタンデムリピートを含む；一部のかかる実施形態では、Ｌ１は、配列番号１０または配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する。

【0062】

第１の生物学的に活性なポリペプチドとしてＳＯＤ１を含む上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、ＳＯＤ１は、配列番号３２の残基２～１５４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する。一部のかかる実施形態では、ＳＯＤ１は、ヒトＳＯＤ１（配列番号３２）と比較して、以下のアミノ酸置換のうち少なくとも１つを含有する：ヒトＳＯＤ１のＣ７に対応する位置におけるアラニン（Ｃ７置換）；およびヒトＳＯＤ１のＣ１１２に対応する位置におけるセリン（Ｃ１１２置換）。ある特定の変形形態では、融合ポリペプチドは、Ｃ７置換およびＣ１１２置換の両方を含有する。より具体的な変形形態では、ＳＯＤ１は、配列番号５４の残基２３～１７５に示されるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、Ｌ１は存在し、少なくとも２つのアミノ酸残基を含む（例えば、１０～３６個のアミノ酸残基からなるＬ１リンカー）。特定の変形形態では、Ｌ１は、配列番号１１９のアミノ酸配列の２つまたはそれよりも多くのタンデムリピートを含む；一部のかかる実施形態では、Ｌ１は、配列番号１０または配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する。

【0063】

第１の生物学的に活性なポリペプチドとしてＣＴＬＡ－４細胞外ドメインを含む上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４細胞外ドメインは、配列番号６６の残基２１～１４４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する。より具体的な変形形態では、ＣＴＬＡ－４細胞外ドメインは、配列番号６６の残基２１～１４４に示されるアミノ酸配列を有する。

【0064】

第１の生物学的に活性なポリペプチドとしてＣＤ４０細胞外ドメインを含む上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、ＣＤ４０細胞外ドメインは、（ｉ）配列番号７４の残基２１～１８８、（ｉｉ）配列番号７８の残基２１～１８８、（ｉｉｉ）配列番号８２の残基２１～１８８、（ｉｖ）配列番号８６の残基２１～１８８、または（ｖ）配列番号９０の残基２１～１８８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する。一部のかかる実施形態では、ＣＤ４０細胞外ドメインは、Ｅ６４、Ｋ８１、Ｐ８５およびＬ１２１から選択されるヒトＣＤ４０（配列番号６８）のアミノ酸に対応する位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有し、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ヒトＣＤ４０と比較してＣＤ４０リガンド結合を増加させる。これらの位置における特に適切なアミノ酸置換は、ヒトＣＤ４０のＥ６４に対応する位置におけるチロシン、ヒトＣＤ４０のＫ８１に対応する位置におけるスレオニン、ヒスチジンもしくはセリン、ヒトＣＤ４０のＰ８５に対応する位置におけるチロシン、および／またはヒトＣＤ４０のＬ１２１に対応する位置におけるプロリンである。一部の変形形態では、ヒトＣＤ４０のＫ８１に対応する位置におけるアミノ酸は、スレオニン、ヒスチジンおよびセリンから選択される；ヒトＣＤ４０のＫ８１に対応する位置におけるアミノ酸は、ヒスチジンであり、ヒトＣＤ４０のＬ１２１に対応する位置におけるアミノ酸は、プロリンである；またはヒトＣＤ４０のＥ６４に対応する位置におけるアミノ酸は、チロシンであり、ヒトＣＤ４０のＫ８１に対応する位置におけるアミノ酸は、スレオニンであり、ヒトＣＤ４０のＰ８５に対応する位置におけるアミノ酸は、チロシンである。より具体的な変形形態では、ＣＤ４０細胞外ドメインは、（ｉ）配列番号７４の残基２１～１８８、（ｉｉ）配列番号７８の残基２１～１８８、（ｉｉｉ）配列番号８２の残基２１～１８８、（ｉｖ）配列番号８６の残基２１～１８８、または（ｖ）配列番号９０の残基２１～１８８に示されるアミノ酸配列を有する。

【0065】

上記融合ポリペプチドのある特定の実施形態では、第１の生物学的に活性なポリペプチドは、ＴＮＦαまたはＴＧＦ－βに特異的に結合しそれを中和するポリペプチドである。一部のかかる実施形態では、第１の生物学的に活性なポリペプチドは、単鎖抗体、例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）または単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）などである。

【0066】

ＴＮＦαに特異的に結合しそれを中和する単鎖抗体を含む上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、単鎖抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｈ１_ＴＮＦα、ＣＤＲ－Ｈ２_ＴＮＦαおよびＣＤＲ－Ｈ３_ＴＮＦαを含むＶＨドメインを含み、ＶＨ ＣＤＲのセットは、配列番号１０８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインの参照ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３のセットと比較して、３つまたはそれよりも少ないアミノ酸置換を有する（例えば、配列番号１０８のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３と比較してゼロ個のアミノ酸置換を有するＶＨ ＣＤＲのセット、それによって、ＣＤＲ－Ｈ１_ＴＮＦα、ＣＤＲ－Ｈ２_ＴＮＦαおよびＣＤＲ－Ｈ３_ＴＮＦαはそれぞれ、配列番号１０８のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３である）。各ＶＨ ＣＤＲは、例えば、ＣＤＲのＣｈｏｔｈｉａ定義、Ｋａｂａｔ定義、ＡｂＭ定義、ＩＭＧＴデータベース定義または接触定義に従って定義され得る。一部の変形形態では、各ＶＨ ＣＤＲは、ＣＤＲのＩＭＧＴデータベース定義に従って定義され、それによって、配列番号１０８の参照ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３はそれぞれ、配列番号１０８の残基２６～３３、５０～５９および９７～１１０に対応する；一部のかかる実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ１_ＴＮＦα、ＣＤＲ－Ｈ２_ＴＮＦαおよびＣＤＲ－Ｈ３_ＴＮＦαは、ＩＭＧＴデータベース定義に従う配列番号１０８のＶＨ ＣＤＲであり、それによって、ＣＤＲ－Ｈ１_ＴＮＦαは、配列番号１０８の残基２６～３３に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ－Ｈ２_ＴＮＦαは、配列番号１０８の残基５０～５９に示されるアミノ酸配列を有し、かつＣＤＲ－Ｈ３_ＴＮＦαは、配列番号１０８の残基９７～１１０に示されるアミノ酸配列を有する。

【0067】

ＴＮＦαに特異的に結合しそれを中和する単鎖抗体を含む上記融合ポリペプチドの他の相互に排他的でない実施形態では、単鎖抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１_ＴＮＦα、ＣＤＲ－Ｌ２_ＴＮＦαおよびＣＤＲ－Ｌ３_ＴＮＦαを含むＶＬドメインを含み、ＶＬ ＣＤＲのセットは、配列番号１１０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインの参照ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３のセットと比較して、３つまたはそれよりも少ないアミノ酸置換を有する（例えば、配列番号１１０のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３と比較してゼロ個のアミノ酸置換を有するＶＬ ＣＤＲのセット、それによって、ＣＤＲ－Ｌ１_ＴＮＦα、ＣＤＲ－Ｌ２_ＴＮＦαおよびＣＤＲ－Ｌ３_ＴＮＦαはそれぞれ、配列番号１１０のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３である）。各ＶＬ ＣＤＲは、例えば、ＣＤＲのＣｈｏｔｈｉａ定義、Ｋａｂａｔ定義、ＡｂＭ定義、ＩＭＧＴデータベース定義または接触定義に従って定義され得る。一部の変形形態では、各ＶＬ ＣＤＲは、ＣＤＲのＩＭＧＴデータベース定義に従って定義され、配列番号１１０の参照ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３はそれぞれ、配列番号１１０の残基２７～３２、５０～５２および８９～９７に対応する；一部のかかる実施形態では、ＣＤＲ－Ｌ１_ＴＮＦα、ＣＤＲ－Ｌ２_ＴＮＦαおよびＣＤＲ－Ｌ３_ＴＮＦαは、ＩＭＧＴデータベース定義に従う配列番号１１０のＶＬ ＣＤＲであり、それによって、ＣＤＲ－Ｌ１_ＴＮＦαは、配列番号１１０の残基２７～３２に示されるアミノ酸配列を有し；ＣＤＲ－Ｌ２_ＴＮＦαは、配列番号１１０の残基５０～５２に示されるアミノ酸配列を有し；かつＣＤＲ－Ｌ３_ＴＮＦαは、配列番号１１０の残基８９～９７に示されるアミノ酸配列を有する。

【0068】

ＴＮＦαに特異的に結合しそれを中和する単鎖抗体を含む上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、単鎖抗体は、配列番号１０８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨドメインを含む、かつ／または単鎖抗体は、配列番号１１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＬドメインを含む。より具体的な変形形態では、単鎖抗体は、配列番号１０８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む、かつ／または単鎖抗体は、配列番号１１０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。

【0069】

ＴＧＦ－βに特異的に結合しそれを中和する単鎖抗体を含む上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、単鎖抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｈ１_{ＴＧＦ－β}、ＣＤＲ－Ｈ２_{ＴＧＦ－β}およびＣＤＲ－Ｈ３_{ＴＧＦ－β}を含むＶＨドメインを含み、ＶＨ ＣＤＲのセットは、配列番号１１２に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインの参照ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３のセットと比較して、３つまたはそれよりも少ないアミノ酸置換を有する（例えば、配列番号１１２のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３と比較してゼロ個のアミノ酸置換を有するＶＨ ＣＤＲのセット、それによって、ＣＤＲ－Ｈ１_{ＴＧＦ－β}、ＣＤＲ－Ｈ２_{ＴＧＦ－β}およびＣＤＲ－Ｈ３_{ＴＧＦ－β}はそれぞれ、配列番号１１２のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３である）。各ＶＨ ＣＤＲは、例えば、ＣＤＲのＣｈｏｔｈｉａ定義、Ｋａｂａｔ定義、ＡｂＭ定義、ＩＭＧＴデータベース定義または接触定義に従って定義され得る。一部の変形形態では、各ＶＨ ＣＤＲは、ＣＤＲのＫａｂａｔ定義に従って定義され、それによって、配列番号１１２の参照ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３はそれぞれ、配列番号１１２の残基３１～３５、５０～６６および９９～１０６に対応する；一部のかかる実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ１_{ＴＧＦ－β}、ＣＤＲ－Ｈ２_{ＴＧＦ－β}およびＣＤＲ－Ｈ３_{ＴＧＦ－β}は、Ｋａｂａｔ定義に従う配列番号１１２のＶＨ ＣＤＲであり、それによって、ＣＤＲ－Ｈ１_{ＴＧＦ－β}は、配列番号１１２の残基３１～３５に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ－Ｈ２_{ＴＧＦ－β}は、配列番号１１２の残基５０～６６に示されるアミノ酸配列を有し、かつＣＤＲ－Ｈ３_{ＴＧＦ－β}は、配列番号１１２の残基９９～１０６に示されるアミノ酸配列を有する。

【0070】

ＴＧＦ－βに特異的に結合しそれを中和する単鎖抗体を含む上記融合ポリペプチドの他の相互に排他的でない実施形態では、単鎖抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１_{ＴＧＦ－β}、ＣＤＲ－Ｌ２_{ＴＧＦ－β}およびＣＤＲ－Ｌ３_{ＴＧＦ－β}を含むＶＬドメインを含み、ＶＬ ＣＤＲのセットは、配列番号１１４に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインの参照ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３のセットと比較して、３つまたはそれよりも少ないアミノ酸置換を有する（例えば、配列番号１１４のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３と比較してゼロ個のアミノ酸置換を有するＶＬ ＣＤＲのセット、それによって、ＣＤＲ－Ｌ１_{ＴＧＦ－β}、ＣＤＲ－Ｌ２_{ＴＧＦ－β}およびＣＤＲ－Ｌ３_{ＴＧＦ－β}はそれぞれ、配列番号１１４のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３である）。各ＶＬ ＣＤＲは、例えば、ＣＤＲのＣｈｏｔｈｉａ定義、Ｋａｂａｔ定義、ＡｂＭ定義、ＩＭＧＴデータベース定義または接触定義に従って定義され得る。一部の変形形態では、各ＶＬ ＣＤＲは、ＣＤＲのＫａｂａｔ定義に従って定義され、配列番号１１４の参照ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３はそれぞれ、配列番号１１４の残基２４～４０、５６～６２および９５～１０２に対応する；一部のかかる実施形態では、ＣＤＲ－Ｌ１_{ＴＧＦ－β}、ＣＤＲ－Ｌ２_{ＴＧＦ－β}およびＣＤＲ－Ｌ３_{ＴＧＦ－β}は、Ｋａｂａｔ定義に従う配列番号１１４のＶＬ ＣＤＲであり、それによって、ＣＤＲ－Ｌ１_{ＴＧＦ－β}は、配列番号１１４の残基２４～４０に示されるアミノ酸配列を有し；ＣＤＲ－Ｌ２_{ＴＧＦ－β}は、配列番号１１４の残基５６～６２に示されるアミノ酸配列を有し；かつＣＤＲ－Ｌ３_{ＴＧＦ－β}は、配列番号１１４の残基９５～１０２に示されるアミノ酸配列を有する。

【0071】

ＴＧＦ－βに特異的に結合しそれを中和する単鎖抗体を含む上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、単鎖抗体は、配列番号１１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨドメインを含む、かつ／または単鎖抗体は、配列番号１１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＬドメインを含む。より具体的な変形形態では、単鎖抗体は、配列番号１１２に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む、かつ／または単鎖抗体は、配列番号１１４に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。

【0072】

ＴＮＦαまたはＴＧＦ－βに特異的に結合しそれを中和する単鎖抗体を含む上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、単鎖抗体は、（ｉ）配列番号９２の残基２１～２６８、（ｉｉ）配列番号９６の残基２１～２６８、（ｉｉｉ）配列番号１００の残基２１～２６９、または（ｉｖ）配列番号１０４の残基２１～２６９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する。より具体的な変形形態では、単鎖抗体は、（ｉ）配列番号９２の残基２１～２６８、（ｉｉ）配列番号９６の残基２１～２６８、（ｉｉｉ）配列番号１００の残基２１～２６９、または（ｉｖ）配列番号１０４の残基２１～２６９に示されるアミノ酸配列を有する。

【0073】

別の態様では、本発明は、アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、Ｘ－Ｌ２－Ｐを含む融合ポリペプチドであって、式中、Ｘは、免疫グロブリン重鎖定常領域であり、免疫グロブリン重鎖定常領域は、ダイマーを形成し、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に特異的に結合することが可能であり；Ｌ２は、ポリペプチドリンカーであり、Ｌ２は、必要に応じて存在し；かつＰは、生物学的に活性なパラオキソナーゼであり、パラオキソナーゼは、配列番号６の残基１６～３５５または２６～３５５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号６の残基１～１５に対応するアミノ末端リーダー配列を含有せず、融合ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖定常領域に対してＮ末端側には生物学的に活性なポリペプチドを含まない、融合ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、生物学的に活性なパラオキソナーゼは、（ｉ）配列番号６の残基１６～３５５または２６～３５５、（ｉｉ）配列番号１２４の残基１６～３５５または２６～３５５、あるいは（ｉｉｉ）配列番号１２６の残基１６～３５５または２６～３５５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する。

【0074】

式Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－ＰまたはＸ－Ｌ２－Ｐを含む上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、ヒトパラオキソナーゼ１ Ｑ１９２アイソフォーム（ｈＰＯＮ１－Ｑ１９２；配列番号４）のＱ１９２に対応する位置におけるアミノ酸は、リシンまたはアルギニンである。他の相互に排他的でない変形形態では、ｈＰＯＮ１－Ｑ１９２のＨ１１５に対応する位置におけるアミノ酸は、トリプトファンである。具体的な変形形態では、パラオキソナーゼは、（ｉ）配列番号６の残基ｎ～３５５、（ｉｉ）配列番号１２４の残基ｎ～３５５、および（ｉｉｉ）配列番号１２６の残基ｎ～３５５から選択されるアミノ酸配列を有し、ｎは、端点を含めた１６～２６の整数である。

【0075】

式Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－ＰまたはＸ－Ｌ２－Ｐを含む上記融合ポリペプチドのある特定の実施形態では、Ｌ２は存在し、少なくとも８つのアミノ酸残基を含む。一部のかかる実施形態では、Ｌ２は、１２～２５個のアミノ酸残基からなる。特に適切なＬ２リンカーは、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有する。

【0076】

式Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－ＰまたはＸ－Ｌ２－Ｐを有し、Ｘが免疫グロブリン重鎖定常領域である上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域は、免疫グロブリンＦｃ領域である。一部のかかる実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域、例えば、野生型ヒト配列と比較して１つまたは複数の（例えば、１～１０個の）アミノ酸置換を含むヒトＦｃバリアントなどである。特に適切なＦｃ領域には、ヒトγ１およびγ４ Ｆｃ領域が含まれる。一部の変形形態では、Ｆｃ領域は、Ｅｕ残基Ｃ２２０がセリンによって置き換えられたヒトγ１ Ｆｃバリアントである；一部のかかる実施形態では、Ｅｕ残基Ｃ２２６およびＣ２２９は各々、セリンによって置き換えられている、かつ／またはＥｕ残基Ｐ２３８は、セリンによって置き換えられている。上記Ｆｃ領域を含むさらなる変形形態では、Ｆｃ領域は、Ｅｕ残基Ｐ３３１がセリンによって置き換えられたヒトγ１ Ｆｃバリアントである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、（ｉ）配列番号２６の残基１～２３２または１～２３１、（ｉｉ）配列番号２８の残基１～２３２または１～２３１、（ｉｉｉ）配列番号４２の残基１５９～３９０または１５９～３８９、（ｉｖ）配列番号１１６の残基１～２３２または１～２３１、あるいは（ｖ）配列番号１１８の残基１～２３２または１～２３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％あるいは少なくとも９５％の同一性を有する。より具体的な変形形態では、Ｆｃ領域は、（ｉ）配列番号２６の残基１～２３２または１～２３１、（ｉｉ）配列番号２８の残基１～２３２または１～２３１、（ｉｉｉ）配列番号４２の残基１５９～３９０または１５９～３８９、（ｉｖ）配列番号１１６の残基１～２３２または１～２３１、あるいは（ｖ）配列番号１１８の残基１～２３２または１～２３１に示されるアミノ酸配列を有する。

【0077】

式Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－ＰまたはＸ－Ｌ２－Ｐを有し、Ｘが免疫グロブリン重鎖定常領域である上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域は、（ｉ）配列番号２６の残基１６～２３２または１６～２３１、（ｉｉ）配列番号１１６の残基１６～２３２または１６～２３１、あるいは（ｉｉｉ）配列番号１１８の残基１６～２３２または１６～２３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％あるいは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より具体的な変形形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域は、（ｉ）配列番号２６の残基１６～２３２または１６～２３１、（ｉｉ）配列番号１１６の残基１６～２３２または１６～２３１、あるいは（ｉｉｉ）配列番号１１８の残基１６～２３２または１６～２３１に示されるアミノ酸配列を含む。

【0078】

式Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｐを有し、第１の生物学的に活性なポリペプチドがＤＮａｓｅである上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６、（ｉｉ）配列番号１２８の残基２１～８９６、（ｉｉｉ）配列番号１３０の残基２１～８９６、（ｉｖ）配列番号１４８の残基２１～９０６、（ｖ）配列番号１５８の残基２１～８９６、（ｖｉ）配列番号１６０の残基２１～９０６、（ｖｉｉ）配列番号１６２の残基２１～９０６、または（ｖｉｉｉ）配列番号１６４の残基２１～９０６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；一部のかかる実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６、（ｉｉ）配列番号１２８の残基２１～８９６、（ｉｉｉ）配列番号１３０の残基２１～８９６、（ｉｖ）配列番号１４８の残基２１～９０６、（ｖ）配列番号１５８の残基２１～８９６、（ｖｉ）配列番号１６０の残基２１～９０６、（ｖｉｉ）配列番号１６２の残基２１～９０６、または（ｖｉｉｉ）配列番号１６４の残基２１～９０６に示されるアミノ酸配列を含む。

【0079】

式Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｐを有し、第１の生物学的に活性なポリペプチドがＤＮａｓｅである上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、Ｔ－Ｌ１－Ｘに対応するポリペプチド領域（「Ｔ－Ｌ１－Ｘ領域」）は、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５３または配列番号１５４に示されるアミノ酸配列を含む。配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５３または配列番号１５４に示されるアミノ酸配列を含むＴ－Ｌ１－Ｘ領域のある特定の変形形態では、（ｉ）３１５位および３１６位の各々におけるアミノ酸は、アラニンである；（ｉｉ）３１９位におけるアミノ酸は、セリンである；（ｉｉｉ）３７８位におけるアミノ酸は、アラニン、グルタミンもしくはグリシンであり、３４６位におけるアミノ酸は、必要に応じてアラニンである；（ｉｖ）４１０位におけるアミノ酸は、アラニン、グリシンもしくはセリンである；（ｖ）４１２位におけるアミノ酸は、セリンもしくはアラニンである；（ｖｉ）３３３位におけるアミノ酸は、チロシンであり、３３５位におけるアミノ酸は、スレオニンであり、３３７位におけるアミノ酸は、グルタミン酸である；かつ／または（ｖｉｉ）５０９位におけるアミノ酸は、ロイシンであり、５１５位におけるアミノ酸は、セリンである。配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５３または配列番号１５４に示されるアミノ酸配列を含むＴ－Ｌ１－Ｘ領域の他の相互に排他的でない変形形態では、２６１～２９６位に対応するアミノ酸配列は、（ｉ）［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］_ｎであって、式中、ｎは、４～７の整数である、（ｉｉ）［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］_ｎであって、式中、ｎは、５～９の整数である、および（ｉｉｉ）［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］_ｎであって、式中、ｎは、６～１２の整数である、からなる群から選択される式を有するＧｌｙ－Ｓｅｒタンデムリピート配列を含む；一部のかかる実施形態では、２６１～２９６位に対応するアミノ酸配列は、（ｉ）［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］_ｎであって、式中、ｎは、４～６の整数である、（ｉｉ）［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］_ｎであって、式中、ｎは、５～７の整数である、および（ｉｉｉ）［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］_ｎであって、式中、ｎは、６～１０の整数である、からなる群から選択される式を有するＧｌｙ－Ｓｅｒタンデムリピート配列を含む。配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５３または配列番号１５４に示されるアミノ酸配列を含むＴ－Ｌ１－Ｘ領域のさらに他の相互に排他的でない変形形態では、２６１位におけるアミノ酸は、アスパラギン酸である、２６２位におけるアミノ酸は、ロイシンである、２６３位におけるアミノ酸は、セリンである、２９４位におけるアミノ酸は、スレオニンである、２９５位におけるアミノ酸は、グリシンである、かつ／または２９６位におけるアミノ酸は、ロイシンである。配列番号１４９または配列番号１５３に示されるアミノ酸配列を含むＴ－Ｌ１－Ｘ領域の他の相互に排他的でない変形形態では、７４位および１０５位の各々におけるアミノ酸は、独立して、リシンまたはアルギニンである。配列番号１４９に示されるアミノ酸配列を含むＴ－Ｌ１－Ｘ領域の他の相互に排他的でない変形形態では、１１４位におけるアミノ酸は、フェニルアラニンである。

【0080】

式Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｐを有し、第１の生物学的に活性なポリペプチドがＲＮａｓｅである上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号４０の残基２１～７６４、または（ｉｉ）配列番号４８の残基２１～７４０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；一部のかかる実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号４０の残基２１～７６４、または（ｉｉ）配列番号４８の残基２１～７４０に示されるアミノ酸配列を含む。

【0081】

式Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｐを有し、第１の生物学的に活性なポリペプチドがＳＯＤ１である上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号５０の残基２３～７８１、（ｉｉ）配列番号５２の残基２３～７８１、または（ｉｉｉ）配列番号５４の残基２３～７９１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；一部のかかる実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号５０の残基２３～７８１、（ｉｉ）配列番号５２の残基２３～７８１、または（ｉｉｉ）配列番号５４の残基２３～７９１に示されるアミノ酸配列を含む。

【0082】

式Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｐを有し、第１の生物学的に活性なポリペプチドがＣＴＬＡ－４細胞外ドメインである上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号６６の残基２１～７３６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；一部のかかる実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号６６の残基２１～７３６に示されるアミノ酸配列を含む。

【0083】

式Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｐを有し、第１の生物学的に活性なポリペプチドがＣＤ４０細胞外ドメインである上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号７４の残基２１～８０４、（ｉｉ）配列番号７８の残基２１～８０４、（ｉｉｉ）配列番号８２の残基２１～８０４、（ｉｖ）配列番号８６の残基２１～８０４、または（ｖ）配列番号９０の残基２１～８０４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；一部のかかる実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号７４の残基２１～８０４、（ｉｉ）配列番号７８の残基２１～８０４、（ｉｉｉ）配列番号８２の残基２１～８０４、（ｉｖ）配列番号８６の残基２１～８０４、または（ｖ）配列番号９０の残基２１～８０４に示されるアミノ酸配列を含む。

【0084】

式Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｐを有し、第１の生物学的に活性なポリペプチドがＴＮＦαに特異的に結合しそれを中和する単鎖抗体である上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号９４の残基２１～８６０、または（ｉｉ）配列番号９８の残基２１～８６０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；一部のかかる実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号９４の残基２１～８６０、または（ｉｉ）配列番号９８の残基２１～８６０に示されるアミノ酸配列を含む。

【0085】

式Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｐを有し、第１の生物学的に活性なポリペプチドがＴＧＦ－βに特異的に結合しそれを中和する単鎖抗体である上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１０２の残基２１～８６１、または（ｉｉ）配列番号１０６の残基２１～８６１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；一部のかかる実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１０２の残基２１～８６１、または（ｉｉ）配列番号１０６の残基２１～８６１に示されるアミノ酸配列を含む。

【0086】

式Ｘ－Ｌ２－Ｐを有する上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１２２の残基２１～６１３、（ｉｉ）配列番号１３２の残基２１～６１３、（ｉｉｉ）配列番号１３４の残基２１～６１３、（ｉｖ）配列番号１４２の残基２１～６１０、（ｖ）配列番号１４４の残基２１～６１０、または（ｖｉ）配列番号１４６の残基２１～６１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；一部のかかる実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１２２の残基２１～６１３、（ｉｉ）配列番号１３２の残基２１～６１３、（ｉｉｉ）配列番号１３４の残基２１～６１３、（ｉｖ）配列番号１４２の残基２１～６１０、（ｖ）配列番号１４４の残基２１～６１０、または（ｖｉ）配列番号１４６の残基２１～６１０に示されるアミノ酸配列を含む。

【0087】

別の態様では、本発明は、第１の融合ポリペプチドと第２の融合ポリペプチドとを含むダイマー性タンパク質であって、第１および第２の融合ポリペプチドの各々が、（ｉ）式Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｐを有し、Ｘがダイマー化ドメイン（例えば、免疫グロブリン重鎖定常領域、例えば、免疫グロブリンＦｃ領域など）である上記融合ポリペプチド、または（ｉｉ）式Ｘ－Ｌ２－Ｐを有する上記融合ポリペプチドである、ダイマー性タンパク質を提供する。

【0088】

別の態様では、本発明は、上記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0089】

なお別の態様では、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、上記融合ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む発現カセットを提供する。特定の変形形態では、コードされた融合ポリペプチドは、式Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｐを有する上記融合ポリペプチドであり、第１の生物学的に活性なポリペプチドは、（ｉ）配列番号１８のアミノ酸残基２１～２８０または配列番号１５２の残基２１～２８０と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有し、かつ（ｉｉ）Ｎ７４置換、Ｇ１０５置換およびＡ１１４置換のうち少なくとも１つを含むＤＮａｓｅ（例えば、２つまたは３つ全ての置換を有するＤＮａｓｅ）である。上記発現カセットが導入された培養細胞であって、ＤＮＡセグメントを発現する培養細胞もまた、提供される。関連する態様では、本発明は、そのゲノムＤＮＡ内に、上記発現カセットを含む安定な細胞系であって、ＤＮＡセグメントを構成的に発現する、安定な細胞系を提供する。一部の実施形態では、安定な細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である。

【0090】

別の態様では、本発明は、上記発現カセットを含むベクターを提供する。

【0091】

別の態様では、本発明は、融合ポリペプチドを作製する方法を提供する。この方法は、一般に、（ｉ）上記発現カセットが導入された細胞を培養するステップであって、細胞が、ＤＮＡセグメントを発現し、コードされた融合ポリペプチドが産生される、ステップ、および（ｉｉ）融合ポリペプチドを回収するステップを含む。一部の変形形態では、培養細胞は、上記安定な細胞系である。

【0092】

さらに別の態様では、本発明は、ダイマー性タンパク質を作製する方法を提供する。この方法は、一般に、（ｉ）上記発現カセットが導入された細胞を培養するステップであって、細胞が、ＤＮＡセグメントを発現し、コードされた融合ポリペプチドが、ダイマー性タンパク質として産生される、ステップ、および（ｉｉ）ダイマー性タンパク質を回収するステップを含む。一部の変形形態では、培養細胞は、上記安定な細胞系である。

【0093】

別の態様では、本発明は、上記融合ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

【0094】

別の態様では、本発明は、上記ダイマー性タンパク質および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

【0095】

上記組成物の一部の実施形態では、組成物は、噴霧による肺への送達のために製剤化されている。

【0096】

なお別の態様では、本発明は、炎症性疾患を処置するための方法を提供する。この方法は、一般に、上記融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質の有効量を、炎症性疾患を有する対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、炎症性疾患は、炎症性肺疾患、例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、嚢胞性線維症（ＣＦ）、気管支拡張症、低酸素症、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９関連ＡＲＤＳ）および間質性肺疾患（例えば、特発性肺線維症（ＩＰＦ）またはサルコイドーシス）などである；一部の変形形態では、炎症性肺疾患は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染によって特徴付けられる。他の実施形態では、炎症性疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（例えば、ループス腎炎を伴うＳＬＥ）、１型糖尿病および２型糖尿病から選択される。なお他の実施形態では、炎症性疾患は、炎症性皮膚疾患、例えば、乾癬またはアトピー性皮膚炎などである。

【0097】

別の態様では、本発明は、自己免疫疾患を処置するための方法を提供する。この方法は、一般に、上記融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質の有効量を、自己免疫疾患を有する対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（例えば、ループス腎炎を伴うＳＬＥ）、シェーグレン症候群、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、抗リン脂質抗体症候群、１型糖尿病、血管炎および全身性強皮症から選択される。

【0098】

別の態様では、本発明は、グラム陰性細菌によるバイオフィルム形成を処置するための方法を提供する。この方法は、一般に、上記融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質の有効量を、バイオフィルム形成を有する対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、グラム陰性細菌は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａである。

【0099】

別の態様では、本発明は、硫黄マスタードガスまたは有機リンへの曝露を処置するための方法を提供する。この方法は、一般に、上記融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質の有効量を、硫黄マスタードガスまたは有機リンに曝露された対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、有機リンは、パラチオン、マラチオン、クロルピリホス、ダイアジノン、ジクロルボス、ホスメット、フェニトロチオン、テルブホス、テトラクロルビンホス、アザメチホスおよびアジンホス－メチルから選択される殺虫剤である。一部の実施形態では、有機リンは、タブン、サリン、ソマンおよびシクロサリンから選択される神経剤である。

【0100】

さらに別の態様では、本発明は、神経学的疾患を処置するための方法を提供する。この方法は、一般に、上記融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質の有効量を、神経学的疾患を有する対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、神経学的疾患は、パーキンソン病およびアルツハイマー病から選択される。一部の実施形態では、神経学的疾患は、認知症によって特徴付けられる疾患、例えば、アルツハイマー病などである。

【0101】

別の態様では、本発明は、心血管疾患を処置するための方法を提供する。この方法は、一般に、上記融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質の有効量を、心血管疾患を有する対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、心血管疾患は、アテローム動脈硬化症によって特徴付けられる疾患、例えば、冠動脈心疾患または虚血性脳卒中などである。一部の変形形態では、冠動脈心疾患は、急性冠症候群によって特徴付けられる。

【0102】

別の態様では、本発明は、慢性肝臓疾患を処置するための方法を提供する。この方法は、一般に、上記融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質の有効量を、慢性肝臓疾患を有する対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、慢性肝臓疾患は、非アルコール性脂肪性肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール関連肝臓疾患（ＡＬＤ）、門脈圧亢進症、または肝臓移植後の合併症から選択される。一部の変形形態では、非アルコール性脂肪性肝臓疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。

【0103】

別の態様では、本発明は、線維性疾患を処置するための方法を提供する。この方法は、一般に、上記融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質の有効量を、線維性疾患を有する対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、線維性疾患は、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性肺疾患、慢性肝臓疾患および慢性腎臓疾患（例えば、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症または膜性糸球体腎炎）からなる群から選択される。

【0104】

なお別の態様では、本発明は、ＮＥＴｏｓｉｓによって特徴付けられる疾患または障害を処置するための方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、一般に、上記式Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｐを有する融合ポリペプチド、または融合ポリペプチドのダイマー化によって形成されたダイマー性タンパク質の有効量を、ＮＥＴｏｓｉｓによって特徴付けられる疾患または障害を有する対象に投与するステップを含み、融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質は、第１の生物学的に活性なポリペプチドとしてＤＮａｓｅを含む。

【0105】

ＮＥＴｏｓｉｓによって特徴付けられる疾患または障害を処置するための方法の他の実施形態では、この方法は、（ａ）上記式Ｘ－Ｌ２－Ｐを有する融合ポリペプチド、または融合ポリペプチドのダイマー化によって形成されたダイマー性タンパク質の有効量、および（ｂ）生物学的に活性なＤＮａｓｅの有効量を、ＮＥＴｏｓｉｓによって特徴付けられる疾患または障害を有する対象に投与するステップを一般に含む併用療法である。併用療法の方法のある特定の実施形態では、ＤＮａｓｅは、（ｉ）配列番号１８の残基２１～２８０、（ｉｉ）配列番号１５２の残基２１～２８０、または（ｉｉｉ）配列番号１３６の残基２１～２９０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する。ＤＮａｓｅが配列番号１８の残基２１～２８０または配列番号１５２の残基２１～２８０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する一部の実施形態では、ＤＮａｓｅは、Ｎ７４、Ｇ１０５およびＡ１１４から選択されるヒト野生型ＤＮａｓｅ１（配列番号１２０）のアミノ酸に対応する位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有し、（１）ヒトＤＮａｓｅ１のＮ７４に対応する位置におけるアミノ酸置換（Ｎ７４置換）は、存在する場合には、ヒトＤＮａｓｅ１と比較してＤＮＡ結合を増加させ、（２）ヒトＤＮａｓｅ１のＧ１０５に対応する位置におけるアミノ酸置換（Ｇ１０５置換）は、存在する場合には、ヒトＤＮａｓｅ１と比較してＤＮＡ結合を増加させ、かつ（３）ヒトＤＮａｓｅ１のＡ１１４に対応する位置におけるアミノ酸置換（Ａ１１４置換）は、存在する場合には、ヒトＤＮａｓｅ１と比較して、エンドヌクレアーゼ活性のＧ－アクチン誘導性阻害を減少させる。一部の変形形態では、ＤＮａｓｅは、Ｎ７４置換およびＧ１０５置換の両方、またはＮ７４置換、Ｇ１０５置換およびＡ１１４置換の各々を含有する。これらの位置における特に適切なアミノ酸置換は、ヒトＤＮａｓｅ１のＮ７４に対応する位置におけるリシン、ヒトＤＮａｓｅ１のＧ１０５に対応する位置におけるアルギニン、および／またはヒトＤＮａｓｅ１のＡ１１４に対応する位置におけるフェニルアラニンである。ＤＮａｓｅが配列番号１３６の残基２１～２９０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する一部の実施形態では、配列番号１３６のＲ８０、Ｒ９５およびＮ９６に対応する位置におけるアミノ酸の各々は、アラニンまたはセリンである。より具体的な変形形態では、ＤＮａｓｅは、（ｉ）配列番号１８の残基２１～２８０、（ｉｉ）配列番号２０の残基２１～２８０、（ｉｉｉ）配列番号１５２の残基２１～２８０、（ｉｖ）配列番号１３８の残基２１～２９０、または（ｖ）配列番号１４０の残基２１～２９０に示されるアミノ酸配列を有する。

【0106】

上記ＮＥＴｏｓｉｓによって特徴付けられる疾患または障害を処置するための併用療法の方法のある特定の実施形態では、ＤＮａｓｅは、アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、Ｄ－Ｌ１－Ｘ_ｄを含むＤＮａｓｅ融合ポリペプチド内に含有され、式中、Ｄは、ＤＮａｓｅであり、Ｌ１は、ポリペプチドリンカー（例えば、少なくとも１５個のアミノ酸残基または少なくとも２６個のアミノ酸残基を含むリンカー）であり、かつＸ_ｄは、免疫グロブリンＦｃ領域である。免疫グロブリンＦｃ領域は、式Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－ＰまたはＸ－Ｌ２－Ｐを有する融合ポリペプチドについて上記したＦｃ領域であり得る。一部の変形形態では、ＤＮａｓｅ融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号６０の残基２１～５３８または２１～５３７、（ｉｉ）配列番号６２の残基２１～５４８または２１～５４７、（ｉｉｉ）配列番号１５５の残基２１～５３８または２１～５３７、（ｉｖ）配列番号１５６の残基２１～５４８または２１～５４７、（ｖ）配列番号１３８の残基２１～５４８または２１～５４７、あるいは（ｖｉ）配列番号１４０の残基２１～５４８または２１～５４７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％あるいは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；一部のかかる実施形態では、ＤＮａｓｅ融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号６０の残基２１～５３８または２１～５３７、（ｉｉ）配列番号６２の残基２１～５４８または２１～５４７、（ｉｉｉ）配列番号１５５の残基２１～５３８または２１～５３７、（ｉｖ）配列番号１５６の残基２１～５４８または２１～５４７、（ｖ）配列番号１３８の残基２１～５４８または２１～５４７、あるいは（ｖｉ）配列番号１４０の残基２１～５４８または２１～５４７に示されるアミノ酸配列を含む。ある特定の変形形態では、ＤＮａｓｅは、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５３または配列番号１５４に示されるアミノ酸配列を含む。

【0107】

ＮＥＴｏｓｉｓによって特徴付けられる疾患または障害を処置するための方法の一部の実施形態では、疾患または障害は、炎症性肺疾患、例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、嚢胞性線維症（ＣＦ）、気管支拡張症、低酸素症、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９関連ＡＲＤＳ）または間質性肺疾患（例えば、特発性肺線維症（ＩＰＦ）またはサルコイドーシス）などである。他の実施形態では、疾患または障害は、炎症性皮膚疾患、例えば、乾癬またはアトピー性皮膚炎などである。他の実施形態では、疾患または障害は、自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（例えば、ループス腎炎を伴うＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、抗リン脂質抗体症候群、１型真性糖尿病、血管炎または全身性強皮症などである。他の実施形態では、疾患または障害は、自己炎症性疾患、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）または痛風などである。他の実施形態では、疾患または障害は、神経学的疾患または障害、例えば、慢性神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病または多発性硬化症）、中枢神経系感染症（例えば、髄膜炎、脳炎または脳性マラリア）または虚血性脳卒中などである。他の実施形態では、疾患または障害は、代謝疾患、例えば、２型糖尿病または肥満などである。他の実施形態では、疾患または障害は、心血管疾患、例えば、アテローム動脈硬化症によって特徴付けられる心血管疾患（例えば、冠動脈心疾患または虚血性脳卒中）などである。なお他の実施形態では、疾患または障害は、血栓症、敗血症および虚血再灌流から選択される。他の実施形態では、疾患または障害は、慢性肝臓疾患、例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などである。さらに他の実施形態では、疾患または障害は、線維性疾患、例えば、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性肺疾患、慢性肝臓疾患または慢性腎臓疾患（例えば、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症または膜性糸球体腎炎）などである。

【0108】

ＮＥＴｏｓｉｓによって特徴付けられる疾患または障害を処置するための方法のさらに他の実施形態では、疾患または障害は、がんである。ある特定の変形形態では、がん処置は、併用療法である。一部の併用療法実施形態では、併用療法には、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療、抗ＣＴＬＡ－４治療、ＣＡＲ Ｔ細胞治療、またはそれらの組合せ（例えば、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療および抗ＣＴＬＡ－４治療の両方）を含む免疫調節療法が含まれる。他の併用療法実施形態では、併用療法には、放射線療法または化学療法が含まれる。一部の併用療法実施形態では、併用療法には、標的化療法が含まれる；一部のかかる実施形態では、標的化療法には、（ｉ）特異的な細胞表面もしくは細胞外抗原（例えば、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１）を標的化する治療用モノクローナル抗体、または（ｉｉ）細胞内タンパク質、例えば、細胞内酵素（例えば、プロテアソーム、チロシンキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、セリン／スレオニン－タンパク質キナーゼＢ－Ｒａｆ（ＢＲＡＦ）またはＭＥＫキナーゼ）などを標的化する小分子が含まれる。

【0109】

別の態様では、本発明は、対象において脂質酸化を低減させるための方法を提供する。この方法は、一般に、上記融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質の有効量を、対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、対象においてＮＥＴｏｓｉｓをさらに低減させ、（ａ）上記式Ｘ－Ｌ２－Ｐを有する融合ポリペプチド、または融合ポリペプチドのダイマー化によって形成されたダイマー性タンパク質の有効量、および（ｂ）生物学的に活性なＤＮａｓｅ（例えば、上記式Ｄ－Ｌ１－Ｘ_ｄを有するＤＮａｓｅ融合ポリペプチド）の有効量を投与するステップを一般に含む併用療法である。

【0110】

別の態様では、本発明は、加齢から対象を保護するための方法を提供する。この方法は、一般に、上記融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質の有効量を、対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）上記式Ｘ－Ｌ２－Ｐを有する融合ポリペプチド、または融合ポリペプチドのダイマー化によって形成されたダイマー性タンパク質の有効量、および（ｂ）生物学的に活性なＤＮａｓｅ（例えば、上記式Ｄ－Ｌ１－Ｘ_ｄを有するＤＮａｓｅ融合ポリペプチド）の有効量を投与するステップを一般に含む併用療法である。

【0111】

本発明のこれらおよび他の態様は、本発明の以下の詳細な説明を参照すれば明らかになる。
定義

【0112】

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、記載される方法および組成物に関する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語および語句は、他に特定されない限り、それらに帰せられる意味を有する。

【0113】

用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形の指示対象を含む。

【0114】

「ポリペプチド」は、天然に産生されたものであれ合成により産生されたものであれ、ペプチド結合によって接続されたアミノ酸残基のポリマーである。約５０アミノ酸残基未満のポリペプチドは、「ペプチド」とも呼ばれ得る。

【0115】

「タンパク質」は、１つまたは複数のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質は、非ペプチド性構成成分、例えば、炭水化物基もまた含み得る。炭水化物および他の非ペプチド性置換基は、タンパク質がその中で産生される細胞によってタンパク質に付加され得、細胞の型によって変動する。タンパク質は、それらのアミノ酸骨格構造の観点から本明細書で定義される；置換基、例えば、炭水化物基は、一般には特定されないが、それにもかかわらず存在し得る。

【0116】

用語「アミノ末端」（または「Ｎ末端」）および「カルボキシル末端」（または「Ｃ末端」）は、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書で使用される。文脈が許す場合、これらの用語は、近接性または相対的位置を示すために、ポリペプチドの特定の配列または部分に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端側に位置するある特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端に対して近位に位置するが、完全なポリペプチドのカルボキシル末端に必ずしもあるわけではない。

【0117】

用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書で同義語として使用され、５’末端から３’末端へと読まれる、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。ポリヌクレオチドには、ＲＮＡおよびＤＮＡが含まれ、天然の供給源から単離され得、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成され得、または天然分子と合成分子との組合せから調製され得る。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対（「ｂｐ」と略記される）、ヌクレオチド（「ｎｔ」）またはキロ塩基（「ｋｂ」）として表される。文脈が許す場合、後者の２つの用語は、一本鎖または二本鎖であるポリヌクレオチドを記載し得る。二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖が、長さがわずかに異なり得ること、およびその末端が、酵素的切断の結果としてスタッガードであり得ることが、当業者によって認識される；したがって、二本鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドが対合しているわけではない。かかる未対合の末端は、一般に、長さが２０ｎｔを超えない。

【0118】

「セグメント」は、特定された性情を有するより大きい分子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）の一部分である。例えば、特定されたポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、５’から３’の方向で読んだ場合に、特定されたポリペプチドのアミノ酸の配列をコードするより長いＤＮＡ分子、例えば、プラスミドまたはプラスミド断片の一部分である。また、例えば、本明細書に記載される融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドの異なる構成成分（例えば、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、リンカー（複数化）、免疫グロブリンＦｃ領域、パラオキソナーゼ）は各々、ポリペプチドセグメントと呼ばれ得る。

【0119】

用語「生物学的に活性な」は、本明細書に記載される融合分子のポリペプチドセグメントに関して使用される場合、生物システムにおいて測定可能または検出可能な生理的、生化学的または分子的効果を引き起こすポリペプチドを意味する。生物活性には、例えば、酵素活性、抗原結合、細胞表面受容体への結合、ダイマー化、真核生物細胞におけるシグナル伝達経路の活性化、細胞増殖の誘導、細胞分化の誘導などが含まれる。ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、パラオキソナーゼ（ＰＯＮ）またはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）であるポリペプチドセグメントに特に関して使用される場合、「生物学的に活性な」は、活性の程度、酵素反応速度論などにおける差異を許容して、ポリペプチドが、対応する天然に存在する酵素と同じ型の酵素活性（例えば、それぞれ、全長の野生型ヒトＤＮａｓｅ１／ＤＮａｓｅ１Ｌ３、ＲＮａｓｅ１、ＰＯＮ１またはＳＯＤ１と同じ型の酵素活性）を示すことを意味する。免疫グロブリンＦｃ領域は、本明細書で言及される場合、少なくとも、そのダイマー化活性およびＦｃＲｎ結合活性によって、「生物学的に活性」であると理解される。

【0120】

文脈が明らかに他を示さない限り、「パラオキソナーゼ」（例えば、「パラオキソナーゼ１」または「ＰＯＮ１」）、「ＤＮａｓｅ」（例えば、「ＤＮａｓｅ１」または「ＤＮａｓｅ１Ｌ３」）、「ＲＮａｓｅ」（例えば、「ＲＮａｓｅ１」）、「スーパーオキシドジスムターゼ」（例えば、「スーパーオキシドジスムターゼ１」または「ＳＯＤ１」）、「ＣＴＬＡ－４細胞外ドメイン」および「ＣＤ４０細胞外ドメイン」に対する本明細書での言及は、上述のいずれかの天然に存在するポリペプチド、ならびにその機能的バリアントおよび機能的断片を含むと理解される。

【0121】

用語「対立遺伝子バリアント」は、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の２つまたはそれよりも多くの代替的形態のいずれかを示すために本明細書で使用される。対立遺伝子変形形態は、突然変異を介して天然に生じ、集団内の表現型多型を生じ得る。遺伝子突然変異は、サイレント（コードされたポリペプチド中に変化なし）であり得る、または変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。対立遺伝子バリアントという用語は、遺伝子の対立遺伝子バリアントによってコードされるタンパク質を示すためにも、本明細書で使用される。

【0122】

用語「増強されたＤＮａｓｅ１」は、本明細書で使用される場合、（ａ）天然に存在するＤＮａｓｅ１と比較して、エンドヌクレアーゼ活性のＧ－アクチン誘導性阻害を減少させる少なくとも１つのアミノ酸置換、および／または（ｂ）天然に存在するＤＮａｓｅ１と比較してＤＮＡ結合を増加させる少なくとも１つのアミノ酸置換、を有するバリアントである、天然に存在するＤＮａｓｅ１（例えば、ヒトＤＮａｓｅ１）の機能亢進型および／またはアクチン抵抗性バリアントを示す。一部の実施形態では、増強されたＤＮａｓｅ１は、エンドヌクレアーゼ活性のＧ－アクチン誘導性阻害を減少させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、増強されたＤＮａｓｅ１は、エンドヌクレアーゼ活性のＧ－アクチン誘導性阻害を減少させる少なくとも１つのアミノ酸置換およびＤＮＡ結合を増加させる少なくとも１つのアミノ酸置換の両方を含む。一部の好ましい実施形態では、増強されたＤＮａｓｅ１は、野生型ヒトＤＮａｓｅ１（配列番号１２０に示される成熟アミノ酸配列）の機能亢進型バリアントである。

【0123】

用語「リンカー」または「ポリペプチドリンカー」は、ペプチド結合（複数可）によって接続され、２つの別個の別々のポリペプチド領域を連結する、２つまたはそれよりも多くのアミノ酸を示すために、本明細書で使用される。リンカーは、典型的には、別々のポリペプチド領域（例えば、Ｆｃ領域に連結されたＤＮａｓｅまたはパラオキソナーゼポリペプチドなど）がそれらの別々の機能を発揮できるように設計される。リンカーは、ネイティブ配列の一部分、そのバリアント、または合成配列であり得る。リンカーはまた、略称「Ｌ」を使用して本明細書で言及される。「Ｌ」と併せた数的識別子（例えば、「１」または「２」）の使用は、異なる融合構成成分を接続するリンカー間を識別するために、本明細書で使用される：「Ｌ１」は、パラオキソナーゼではない第１の生物学的に活性なポリペプチド（例えば、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅまたはＳＯＤ１）のＣ末端を、別のポリペプチドセグメント、例えば、免疫グロブリンＦｃ領域などのＮ末端に接続するリンカーを指し、「Ｌ２」は、生物学的に活性なパラオキソナーゼ（例えば、ＰＯＮ１）のＮ末端を、別のポリペプチドセグメント、例えば、免疫グロブリンＦｃ領域などのＣ末端に接続するリンカーを指す。Ｌ１リンカーおよびＬ２リンカーの両方を含有するポリペプチド鎖に関して、これらのリンカーは、アミノ酸配列に関して、同じでも異なってもよい。第１の生物学的に活性なポリペプチドのカルボキシル末端が単一のポリペプチドリンカーを介して生物学的に活性なパラオキソナーゼのアミノ末端に直接（即ち、介在する生物学的に活性なポリペプチドなしに）連結される一部の変形形態では、かかるポリペプチドリンカーは、Ｌ１またはＬ２のいずれかとして言及され得る。

【0124】

用語「発現カセット」は、適切な宿主細胞におけるその転写を提供する追加のセグメントに作動可能に連結された目的のポリペプチドをコードするセグメントを含むＤＮＡ構築物を示すために使用される。かかる追加の配列には、プロモーター、および典型的には、転写ターミネーターが含まれ、１つまたは複数の選択可能なマーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどもまた含まれ得る。

【0125】

用語「ベクター」は、遺伝材料を細胞中に送達するための、組換えＤＮＡ技法によって産生されたポリヌクレオチドを示すために使用され、細胞において、ベクターは複製され得る。当該分野で周知のように、ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター、人工染色体、クローニングベクターまたは発現ベクターを指し得る。用語「発現ベクター」は、発現カセットを含むベクターを示すために使用される。

【0126】

用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含有する遺伝子の一部分を示すために、その当該分野で認識された意味で、本明細書で使用される。プロモーター配列は、遺伝子の５’非コード領域において一般に見出されるが、常にではない。

【0127】

「分泌シグナル配列」は、より大きいポリペプチドの構成成分として、それが合成される細胞の分泌経路を介してより大きいポリペプチドを方向付けるポリペプチド（「分泌ペプチド」）をコードするＤＮＡ配列である。より大きいポリペプチドは、一般に、分泌経路を介した通過の間に、分泌ペプチドを除去するように切断される。

【0128】

「作動可能に連結された」は、２つまたはそれよりも多くの実体が、それらの意図した目的のために協力して機能するように、一緒に接続されることを意味する。ＤＮＡセグメントに言及する場合、この語句は、例えば、コード配列が、正しいリーディングフレームで接続されており、転写がプロモーターにおいて開始し、コードセグメント（複数可）を介してターミネーターまで進行することを示す。ポリペプチドに言及する場合、「作動可能に連結された」は、配列の所望の機能（複数可）が保持される、共有結合的に（例えば、ジスルフィド結合によって）連結された配列および非共有結合的に（例えば、水素結合、疎水性相互作用または塩橋相互作用によって）連結された配列の両方を含む。

【0129】

用語「組換え」は、例えば、細胞、核酸、タンパク質またはベクターに関して使用される場合、その細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入、またはネイティブ核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されていること、あるいはその細胞が、そのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞のネイティブ（非組換え）形態内には見出されない遺伝子を発現する、または他の点で異常に発現される、過少発現される、もしくは全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。本明細書の用語「組換え核酸」は、天然には通常見出されない形態の、一般に、例えば、ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを使用する核酸の操作によってｉｎ ｖｉｔｒｏで元々形成された核酸を意味する。この様式で、異なる配列の作動可能な連結が達成される。したがって、線状形態の単離された核酸、または通常は接続されていないＤＮＡ分子をライゲーションさせることによってｉｎ ｖｉｔｒｏで形成された発現ベクターは共に、本明細書で開示される目的のために組換えとみなされる。組換え核酸が作製され、宿主細胞または生物中に再導入されると、この組換え核酸は、非組換え的に、即ち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ操作ではなく宿主細胞のｉｎ ｖｉｖｏ細胞機構を使用して、複製すると理解される；しかし、かかる核酸は、組換え的に産生されると、引き続いて非組換え的に複製されるが、本明細書で開示される目的のためにはなおも組換えとみなされる。同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技法を使用して、即ち、上で示した組換え核酸の発現を介して作製されたタンパク質である。

【0130】

用語「異種」は、核酸の部分に関して使用される場合、その核酸が、天然での互いに対するのと同じ関連性では通常は見出されない２つまたはそれよりも多くのサブ配列を含むことを示す。例えば、例えば、新たな機能的核酸を作製するために配置された無関係の遺伝子由来の２つまたはそれよりも多くの配列、例えば、１つの供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域を有する核酸は、典型的には、組換え的に産生される。同様に、「異種」は、タンパク質の部分に関して使用される場合、そのタンパク質が、天然での互いに対するのと同じ関連性では見出されない２つまたはそれよりも多くのサブ配列（例えば、融合ポリペプチドの２つまたはそれよりも多くのセグメント）を含むことを示す。

【0131】

本明細書で使用される場合、用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン遺伝子（複数可）によって実質的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指す。免疫グロブリンの１つの形態は、無傷のネイティブ抗体の基本的構造単位を構成する。この形態は、テトラマーであり、免疫グロブリン鎖の２つの同一な対からなり、各対は、１つの軽鎖および１つの重鎖を有する。各対において、軽鎖および重鎖可変領域は一緒になって、抗原への結合を担い、定常領域は、抗体エフェクター機能を担う。免疫グロブリンは、典型的には、脊椎動物生物において抗体として機能する。免疫グロブリンタンパク質の５つのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）が、高等脊椎動物において同定されている。ＩｇＧは、主要なクラスを構成する；ＩｇＧは、血漿中で見出される２番目に豊富なタンパク質として、通常は存在する。ヒトでは、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４と称する４つのサブクラスからなる。ＩｇＧクラスの重鎖定常領域は、ギリシャ語記号γで同定される。例えば、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンは、γ１重鎖定常領域を含有する。各免疫グロブリン重鎖は、１つの種において所与のサブクラスについて本質的に不変の定常領域タンパク質ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３；ＩｇＧ３は、ＣＨ４ドメインもまた含有する）からなる定常領域を保有する。ヒトおよび非ヒト免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡ配列は、当該分野で公知である（例えば、Ellison et al., DNA 1:11-18, 1981；Ellison et al., Nucleic Acids Res. 10:4071-4079, 1982；Kenten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6661-6665, 1982；Seno et al., Nuc. Acids Res. 11:719-726, 1983；Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988；Amster et al., Nuc. Acids Res. 8:2055-2065, 1980；Rusconi and Kohler, Nature 314:330-334, 1985；Boss et al., Nuc. Acids Res. 12:3791-3806, 1984；Bothwell et al., Nature 298:380-382, 1982；van der Loo et al., Immunogenetics 42:333-341, 1995；Karlin et al., J. Mol. Evol. 22:195-208, 1985；Kindsvogel et al., DNA 1:335-343, 1982；Breiner et al., Gene 18:165-174, 1982；Kondo et al., Eur. J. Immunol. 23:245-249, 1993；およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００２２８を参照されたい）。免疫グロブリンの構造および機能の総説については、Putnam, The Plasma Proteins, Vol V, Academic Press, Inc., 49-140, 1987；およびPadlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994を参照されたい。用語「免疫グロブリン」は、文脈に依存して、無傷抗体、その構成成分鎖、または鎖の断片を示すその一般的な意味で、本明細書で使用される。

【0132】

用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、またはその断片および／もしくは操作されたバリアントを指す。用語「抗体」には、無傷のモノクローナル抗体ならびに抗原結合性抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦａｂ断片などが含まれる。遺伝子操作された無傷抗体および断片、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖Ｆｖ断片、単鎖抗体、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）などもまた含まれる。したがって、用語「抗体」は、抗原結合部位を含み、その抗原に結合することが可能な任意のタンパク質を含むように、拡張的に使用される。

【0133】

用語「遺伝子操作された抗体」は、そのアミノ酸配列が、ネイティブ（即ち、天然に存在する）抗体のアミノ酸配列から変動した、抗体を意味する。抗体の生成における組換えＤＮＡ技法の適用可能性に起因して、天然の抗体において見出されるアミノ酸の配列に限定される必要はない；抗体を、所望の特徴を得るために再設計することができる。可能な変形形態は多く、例えば、可変領域または定常領域のわずか１つまたは数個のアミノ酸の変化から、完全な再設計までの範囲である。一般に、特徴、例えば、補体結合、細胞との相互作用、および他のエフェクター機能を改善または変更するために定常領域を変化させることになる。典型的には、抗原結合特徴を改善するため、可変領域安定性を改善するため、または免疫原性のリスクを低下させるために可変領域を変化させることになる。

【0134】

「抗原結合部位」は、その抗原に結合するのに十分な抗体の部分である。最小限のかかる領域は、典型的には、免疫グロブリン可変ドメインもしくはその断片、または免疫グロブリン可変ドメインもしくはその断片の遺伝子操作されたバリアントである。単一ドメイン結合部位は、ラクダ科抗体から（Muyldermans and Lauwereys, J. Mol. Recog. 12:131-140, 1999；Nguyen et al., EMBO J. 19:921-930, 2000を参照されたい）、または単一ドメイン抗体（「ｄＡｂ」；Ward et al., Nature 341:544-546, 1989；Ｗｉｎｔｅｒらに対する米国特許第６，２４８，５１６号を参照されたい）を産生するために他の種のＶＨドメインから、生成することができる。ある特定の変形形態では、抗原結合部位は、天然に存在するもしくは天然に存在しない（例えば、突然変異誘発された）重鎖可変ドメインもしくは軽鎖可変ドメイン、またはそれらの組合せの相補性決定領域（ＣＤＲ）を２つだけ有するポリペプチド領域である（例えば、Pessi et al., Nature 362:367-369, 1993；Qiu et al., Nature Biotechnol. 25:921-929, 2007を参照されたい）。

【0135】

全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸）は、Ｎ末端では可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸をコードする）によって、およびＣ末端ではカッパまたはラムダ定常領域遺伝子によって、コードされる。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄまたは４４６アミノ酸）は、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸をコードする）、およびガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン定常領域遺伝子（約３３０アミノ酸をコードする）によってコードされ、後者は、抗体のアイソタイプを、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥとして定義する。軽鎖および重鎖内で、可変領域と定常領域とは、約１２個またはそれよりも多くのアミノ酸の「Ｊ」領域によって接続され、重鎖は、約１０個またはそれよりも多くのアミノ酸の「Ｄ」領域もまた含む（一般には、Fundamental Immunology (Paul, ed., Raven Press, N.Y., 2nd ed. 1989), Ch. 7を参照されたい）。

【0136】

免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域は、３つの超可変領域が割り込んだフレームワーク領域からなる。用語「超可変領域」は、本明細書で「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）とも呼ばれ、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。ＣＤＲは、いくつかの公知の分析方法のいずれかに従って定義され得る。かかる方法の例には、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、ＩＭＧＴデータベース定義および接触定義が含まれる。Ｋａｂａｔ定義は、抗体中の残基に番号付けするための標準であり、典型的には、ＣＤＲ領域を同定するために使用される（例えば、Johnson & Wu, Nucleic Acids Res. 28:214-8, 2000を参照されたい）。Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、Ｋａｂａｔ定義と類似であるが、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、ある特定の構造的ループ領域の位置を考慮に入れる（例えば、Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-17, 1986；Chothia et al., Nature 342:877-83, 1989を参照されたい）。ＡｂＭ定義は、抗体構造をモデル化する、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐが作成したコンピュータプログラムの統合スイートを使用する（例えば、Martin et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272, 1989；"AbM^TM, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies," Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd.を参照されたい）。ＡｂＭ定義は、Samudrala et al., "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach," in PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl. 3:194-198, 1999によって記載されるものなど、知識データベースとａｂ ｉｎｉｔｉｏ法との組合せを使用して、一次配列から抗体の三次構造をモデル化する。ＩＭＧＴデータベース定義は、可変領域／構造に番号付けするために、フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）の定義、Ｘ線回折研究からの構造データ、および超可変ループの特徴付けを考慮に入れ、それらを組み合わせる（LeFranc, Immunol. Today 18:509, 1997を参照されたい）。接触定義は、入手可能な複合体結晶構造の分析に基づく（例えば、MacCallum et al., J. Mol. Biol. 5:732-45, 1996を参照されたい）。ＶＬドメインのＣＤＲ Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はそれぞれ、本明細書でＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３とも呼ばれる；ＶＨドメインのＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２およびＨ３はそれぞれ、本明細書でＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３とも呼ばれる。

【0137】

「フレームワーク領域」は、超可変領域残基以外（例えば、ＣＤＲのＫａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、ＩＭＧＴデータベース定義または接触定義によって定義されるＣＤＲの残基以外）の可変ドメイン残基である。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。したがって、「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と実質的に（約８５％またはそれよりも高く、通常は、９０～９５％またはそれよりも高く）同一なフレームワーク領域である。構成要素である軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲを位置決めし、アラインさせるように機能する。

【0138】

「免疫グロブリンヒンジ」は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを接続させる、免疫グロブリン重鎖の部分である。ヒトγ１のヒンジ領域は、Ｅｕ残基２１６～２３０におよそ対応する。

【0139】

用語「Ｆｃ断片」、「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」は、本明細書で使用される場合、同義語であり、細胞上の抗体受容体および補体のＣ１ｑ成分への結合を担う免疫グロブリンの部分を指す（天然に存在する配列と比較して、かかる結合活性を除去するいずれのアミノ酸変化も存在しない場合）。Ｆｃは、「結晶性断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）」を示し、タンパク質結晶を容易に形成する抗体の断片である。タンパク質分解性消化によって元々記載された明確に異なるタンパク質断片が、免疫グロブリンタンパク質の全般的な一般構造を定義し得る。文献中で元々定義されたように、Ｆｃ断片は、ジスルフィド連結された重鎖ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインからなる。本明細書で使用される場合、この用語は、ＣＨ３、ＣＨ２、および第２のかかる鎖とともにジスルフィド連結されたダイマーを形成するのに十分なヒンジの少なくとも一部分からなる単鎖もまた指す。本明細書で使用される場合、Ｆｃ領域という用語は、天然に存在するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３配列のバリアントをさらに含み、これらのバリアントは、ＣＨ３ドメインのダイマー化を少なくとも介してダイマーを形成することが可能であり、改善された半減期（Ｆｃ領域が存在しない場合の融合パートナーと比較して）をｉｎ ｖｉｖｏで融合パートナーに付与するのに少なくとも十分な、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を保持しつつ、増加または減少したＦｃ受容体結合または補体結合活性を有するようなバリアントを含むことが可能である。略記された用語「Ｆｃ」は、その一般的なアミノ末端からカルボキシル末端への構造（例えば、「ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１」）によって融合ポリペプチドに言及する場合に「Ｆｃ領域」を示すためにも、本明細書で使用され得る。

【0140】

本明細書で使用される場合、用語「単鎖抗体」は、単一のポリペプチド鎖内に含有される抗原結合部位（例えば、単一のポリペプチド鎖内の重鎖および軽鎖の両方由来の可変領域）を有する抗体を指す。用語「単鎖Ｆｖ」は、重鎖および軽鎖の両方由来の可変領域を含むが、定常領域を欠如する、単鎖抗体を指す。一般に、単鎖Ｆｖは、抗原結合を可能にする所望の構造をそれが形成するのを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。単鎖抗体は、例えば、Pluckthunによって、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113 (Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315中で詳細に議論されている（国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０１６４９；米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号；Bird et al., Science 242:423-426, 1988もまた参照されたい）。単鎖抗体はまた、二重特異的および／またはヒト化であり得る。

【0141】

用語「代替的足場タンパク質」は、１つまたは複数の領域が、標的分子（例えば、炎症性サイトカイン、例えば、ＴＮＦαまたはＴＧＦ－β）に特異的に結合する１つまたは複数の結合ドメインを産生するために多様化され得る、非抗体タンパク質を指す。一部の実施形態では、結合ドメインは、抗体の特異性および親和性と類似の特異性および親和性で、標的分子に結合する。例示的な代替的足場には、フィブロネクチン（例えば、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））、β－サンドイッチ（例えば、ｉＭａｂ）、リポカリン（例えば、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標））、ＥＥＴＩ－ＩＩ／ＡＧＲＰ、ＢＰＴＩ／ＬＡＣＩ－Ｄ１／ＩＴＩ－Ｄ２（例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメイン）、プロテインＡ（例えば、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標））、アンキリンリピート（例えば、ＤＡＲＰｉｎ）、ガンマ－Ｂ－クリスタリン／ユビキチン（例えば、Ａｆｆｉｌｉｎ）、ＣＴＬＤ_３（例えば、Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ）、ＦｙｎｏｍｅｒおよびＡｖｉｍｅｒに由来するものが含まれる。代替的足場に関する追加の情報は、Binz et al., Nat. Biotechnol. 23:1257-1268, 2005；Skerra, Current Opin. in Biotech. 18:295-304, 2007；およびSilacci et al., J. Biol. Chem. 289:14392-14398, 2014に提供される。

【0142】

用語「抗ＴＮＦα」または「抗ＴＧＦβ」は、本明細書で使用される場合、その一般的なアミノ末端からカルボキシル末端への構造（例えば、「抗ＴＮＦα－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１」または「抗ＴＧＦβ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１」）によって融合ポリペプチドに言及する場合、それぞれＴＮＦαまたはＴＧＦ－βに特異的に結合しそれを中和するポリペプチド（例えば、単鎖抗体）を指す。

【0143】

「ダイマー化ドメイン」は、本明細書で使用される場合、２つのポリペプチドが、生理的条件下で会合してダイマーを形成するような、第２のポリペプチドに対する親和性を有するポリペプチドを指す。典型的には、第２のポリペプチドは、同じポリペプチドであるが、一部の変形形態では、第２のポリペプチドは、異なる。これらのポリペプチドは、共有結合的および／または非共有結合的会合（複数可）を介して互いに相互作用し得る。ダイマー化ドメインの例には、Ｆｃ領域；ヒンジ領域；ＣＨ３ドメイン；ＣＨ４ドメイン；ＣＨ１またはＣＬドメイン；ロイシンジッパードメイン（例えば、ｊｕｎ／ｆｏｓロイシンジッパードメイン、例えば、Kostelney et al., J. Immunol., 148:1547-1553, 1992を参照されたい；または酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパードメイン）；イソロイシンジッパードメイン；ダイマー化する細胞表面受容体（例えば、インターロイキン－８受容体（ＩＬ－８Ｒ）；またはインテグリンヘテロダイマー、例えば、ＬＦＡ－１もしくはＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａ）のダイマー化領域；分泌型のダイマー化するリガンド（例えば、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；例えば、Arakawa et al., J. Biol. Chem. 269:27833-27839, 1994およびRadziejewski et al., Biochem. 32:1350, 1993を参照されたい）のダイマー化領域；ならびにジスルフィド結合（複数可）が、そのポリペプチドと、少なくとも１つのシステイン残基を含む第２のポリペプチドとの間で形成し得るように、少なくとも１つのシステイン残基（例えば、約１個、２個、または３個～約１０個のシステイン残基）を含むポリペプチド（本明細書で以下「合成ヒンジ」）が含まれる。本発明に従う好ましいダイマー化ドメインは、Ｆｃ領域である。

【0144】

用語「ダイマー」または「ダイマー性タンパク質」は、本明細書で使用される場合、ダイマー化ドメインを介して一緒に連結された、本明細書で開示される２つの（「第１の」および「第２の」）融合ポリペプチドのマルチマーを指す。文脈が明らかに他を示さない限り、「ダイマー」または「ダイマー性タンパク質」は、第１または第２の融合ポリペプチド中に追加のダイマー化ドメインを含めることによって創出され得るより高次のマルチマーの観点からの、ダイマー化した第１および第２の融合ポリペプチドへの言及を含む（例えば、免疫グロブリン軽鎖を含む第１の融合ポリペプチドおよび免疫グロブリン重鎖を含む第２の融合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の相互作用を介してヘテロダイマー化することができ、２つのかかるヘテロダイマーは、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を介してさらにダイマー化し得、それによって、テトラマーを形成する）。

【0145】

用語「新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に特異的に結合するドメイン」または「ＦｃＲｎ結合ドメイン」は、本明細書で使用される場合、（ｉ）ｐＨ５．８において高い親和性で、典型的には、１０^６Ｍ^－１またはそれよりも高い（例えば、１０^７Ｍ^－１もしくはそれよりも高い、１０^８Ｍ^－１もしくはそれよりも高い、または１０^９Ｍ^－１もしくはそれよりも高い）結合親和性（Ｋ_ａ）でＦｃＲｎに結合し、かつ（ｉｉ）生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）においてＦｃＲｎに対する親和性を有さない、ポリペプチドを意味する。ＦｃＲｎに対するポリペプチドの結合親和性は、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析（Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660, 1949）によって、当業者が容易に決定することができる。典型的には、ＦｃＲｎ結合ドメインは、ＦｃＲｎに関連するポリペプチドと顕著には交差反応しない。ポリペプチドは、例えば、分子結合アッセイ、例えば、マルチウェルプレートアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、フィルターアッセイまたは表面プラズモン共鳴アッセイなどを使用して、ＦｃＲｎを検出するが、現在公知のＦｃＲｎ関連ポリペプチドは検出しない場合、ＦｃＲｎに関連するポリペプチドと顕著には交差反応しない。公知の関連するポリペプチドの例には、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質ファミリーの公知のメンバーが含まれる。ＦｃＲｎ結合ドメインは、ダイマー化ドメインを相互に除外しない、即ち、ダイマー化ドメインは、ＦｃＲｎ結合ドメインでもあり得る。ダイマー化ドメインでもあるＦｃＲｎ結合ドメインの例には、ＦｃＲｎ結合活性を保持するＦｃ領域が含まれる。

【0146】

本開示の融合ポリペプチドは、式、例えば、「ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ」、「ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ」、「ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１」、「ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１」、「ＲＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１」、「ＳＯＤ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１」、「抗ＴＮＦα－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１」または「抗ＴＧＦβ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１」などによって本明細書で言及され得る。各かかる場合において、文脈が明確に他を示さない限り、融合ポリペプチドの特定のセグメントに言及する用語（例えば、「ＤＮａｓｅ１」、「ＤＮａｓｅ１Ｌ３」、「ＰＯＮ１」、「ＲＮａｓｅ１」、「ＳＯＤ１」、「Ｌ１」または「Ｌ２」（それぞれ、第１または第２のポリペプチドリンカーの代わり）、「Ｆｃ」（「Ｆｃ領域」の代わり）など）は、本明細書でかかる用語に帰せられる意味を有すると理解され、本明細書に記載される種々の実施形態を含む。

【0147】

用語「ＮＥＴｏｓｉｓによって特徴付けられる疾患または障害」は、本明細書で使用される場合、ＮＥＴｏｓｉｓ － 好中球細胞外トラップ（ＮＥＴｓ）と呼ばれる、細胞質タンパク質および顆粒タンパク質と結合したＤＮＡを、活性化された好中球が噴出するプロセス － が、臨床病理学の少なくともいくらかの役割を果たす、疾患または障害を意味する。

【0148】

用語「有効量」は、本明細書に記載されるような、対象への可溶性融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質の投与による疾患の処置に関して、疾患の発生を阻害するのに、または疾患の１つもしくは複数の症状を軽快させるのに十分な、かかる分子の量を指す。例えば、本明細書に記載されるような、対象への融合タンパク質の投与による炎症性肺疾患の処置に具体的に関して、用語「有効量」は、炎症性肺疾患の発生を阻害するように、または炎症性肺疾患の１つもしくは複数の症状を軽快させるように、対象において炎症応答をモジュレートするのに十分な、かかる分子の量を指す。薬剤の有効量は、本発明の方法に従って、「有効なレジメン」で投与される。用語「有効なレジメン」は、疾患の処置または予防を達成するために適切な、投与されている薬剤の量と投薬頻度との組合せを指す。

【0149】

用語「患者」または「対象」には、本明細書に記載されるように疾患または障害を処置することに関して、哺乳動物、例えば、ヒトおよび他の霊長類などが含まれる。この用語には、家畜化された動物、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌおよびネコなどもまた含まれる。

【0150】

用語「併用療法」は、示された治療効果を達成するための少なくとも２つの明確に異なる療法の提供が関与する治療レジメンを指す。例えば、併用療法には、２つまたはそれよりも多くの化学的に明確に異なる活性成分または薬剤、例えば、本発明に従う可溶性ＰＯＮ１融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質、および別の薬剤、例えば、別の抗炎症剤または免疫調節剤などの投与が関与し得る。あるいは、併用療法には、単独での、または別の薬剤と併せた、本発明に従う可溶性ＰＯＮ１融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質の投与、ならびに別の療法（例えば、放射線療法）の送達が関与し得る。併用療法を構成する明確に異なる療法は、例えば、同時の、重複する、または順次の投薬レジメンとして、送達され得る。２つまたはそれよりも多くの化学的に明確に異なる薬剤の投与に関して、これらの活性成分は、同じ組成物の一部として、または異なる組成物として投与され得ることが理解される。別々の組成物として投与される場合、異なる活性成分を含む組成物は、全て、特定の文脈が要求する場合、および担当医によって決定されるように、同じまたは異なる時点において、同じまたは異なる経路によって、同じまたは異なる投薬レジメンを使用して、投与され得る。

【0151】

用語「標的化療法」は、がんを処置することに関して、典型的には、正常細胞に対する害が少ない、特定の型のがん細胞を同定しそれを攻撃する治療剤を使用する処置の型を指す。一部の実施形態では、標的化療法は、がん細胞の成長および広がりに関与する酵素または他の分子の作用を遮断する。他の実施形態では、標的化療法は、免疫系ががん細胞を攻撃することを助ける、または毒性物質をがん細胞に直接送達する。ある特定の変形形態では、標的化療法は、小分子薬物またはモノクローナル抗体を治療剤として使用する。

【0152】

語句「加齢から保護する」は、本明細書で使用される場合、例えば、受容されたバイオマーカーによって示される、全身性の炎症または疾患のリスクにおける加齢に伴う変化が含まれる、加齢の広い局面のいずれかの阻害または軽減を指す。加齢からの保護は、疾患が対象中に存在する場合の、加齢に伴う疾患、例えば、慢性炎症性、自己免疫、神経変性、心血管または線維性疾患などの処置もまた含み得る。

【0153】

２つのアミノ酸配列は、それら２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が、最大限の対応を求めてアラインされた場合に同じである場合、「１００％のアミノ酸配列同一性」を有する。配列比較は、標準的なソフトウェアプログラム、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）によって作成されたＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート中に含まれるものを使用して、実施され得る。最適なアラインメントを決定することによってアミノ酸配列を比較するための他の方法は、当業者に周知である（例えば、Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997)；Wu et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," in Methods in Gene Biotechnology 123-151 (CRC Press, Inc. 1997)；Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing (2nd ed., Academic Press, Inc. 1998)を参照されたい）。２つのアミノ酸配列は、それら２つの配列が、互いに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する場合、「実質的な配列同一性」を有するとみなされる。

【0154】

パーセント配列同一性は、従来の方法によって決定される（例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603, 1986およびHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1992を参照されたい）。例えば、２つのアミノ酸配列は、１０のギャップ開始ペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティ、およびHenikoff and Henikoff, 上記の「ＢＬＯＳＵＭ６２」スコアリングマトリックスを使用して、アラインメントスコアを最適化するようにアラインされ得る。次いで、パーセント同一性が、以下のように計算される：（［同一なマッチの総数］／［長いほうの配列の長さ＋２つの配列をアラインするために長いほうの配列中に導入されたギャップの数］）（１００）。

【0155】

当業者は、２つのアミノ酸配列をアラインするために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解する。Pearson and Lipmanの「ＦＡＳＴＡ」類似性検索アルゴリズムは、本明細書で開示されるアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列とによって共有される同一性のレベルを試験するための、適切なタンパク質アラインメント法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444, 1988およびPearson, Meth. Enzymol. 183:63, 1990によって記載されている。簡潔に述べると、ＦａｓｔＡは、保存的なアミノ酸置換も挿入も欠失も考慮せずに、クエリー配列（例えば、配列番号６の残基１６～３５５または２６～３５５）と、最も高い密度の同一性（ｋｔｕｐ変数が１である場合）または同一性の対（ｋｔｕｐ＝２の場合）のいずれかを有する試験配列とによって共有される領域を同定することによって、配列類似性を最初に特徴付ける。次いで、最も高い密度の同一性を有する１０個の領域が、アミノ酸置換マトリックスを使用して、全ての対になったアミノ酸の類似性を比較することによって再度スコア付けされ、これらの領域の末端は、最も高いスコアに寄与する残基のみを含むように「トリミング」される。「カットオフ」値（配列の長さおよびｋｔｕｐ値に基づいて、所定の式によって計算される）よりも大きいスコアを有するいくつかの領域が存在する場合、それらの領域が、ギャップを伴っておおよそのアラインメントを形成するように接続され得るかどうかを決定するために、トリミングされた初期領域が試験される。最後に、２つのアミノ酸配列の、スコアが最も高い領域が、アミノ酸の挿入および欠失を可能にする、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ－Ｓｅｌｌｅｒｓアルゴリズム（Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444, 1970；Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787, 1974）の改変版を使用してアラインされる。ＦＡＳＴＡ分析のための例となるパラメーターは、以下である：ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝１および置換マトリックス＝ｂｌｏｓｕｍ６２。これらのパラメーターは、Pearson, Meth. Enzymol. 183:63, 1990のAppendix 2で説明されるように、スコアリングマトリックスファイル（「ＳＭＡＴＲＩＸ」）を改変することによって、ＦＡＳＴＡプログラム中に導入され得る。

【0156】

用語「～に対応する」は、対象配列内の位置を記載するために参照配列中のアミノ酸残基の位置に適用される場合、参照配列と対象配列とが最適にアラインされる場合の、対象配列中の対応する位置を意味する。

【0157】

かかる値が、「約」Ｘまたは「およそ」Ｘと表される場合、Ｘの述べられた値は、±１０％まで正確であると理解される。

【0158】

本発明の態様または実施形態が、マーカッシュ群または選択肢の他の群分けの観点から記載される場合、本発明は、全体として列挙された群全体だけでなく、その群の各メンバーを個々に、および主要な群の全ての可能な下位群もまた包含する。本発明はまた、群メンバーのいずれかのうち１つまたは複数の明確な排除を、実施形態として想定する。

【図面の簡単な説明】

【0159】

【図1】図１は、ＤＮａｓｅ１－ＦｃおよびＤＮａｓｅ１－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質を発現する一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からの培養上清（無血清）のウェスタンブロットを示す。トランスフェクションおよびウェスタンブロット解析は、下記の実施例１で説明するように行った。左から右へ：レーン１ － ＬＩＣＯＲ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ（商標）分子量マーカー；レーン２、レーン３、レーン４ － ｈＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃ－ＰＯＮ１－Ｑ１９２Ｋの３つの異なる個々のクローン（＃１、＃２、＃４）からのトランスフェクション上清；レーン５ － ＴＨＥＲ４－ＲＮａｓｅ（対照）；レーン６ － ＬＩＣＯＲ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ ＭＷマーカー；レーン７ － ｈＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃ ＃４；レーン８ － ｈＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）６－Ｆｃ ＃２；レーン９ － ＴＨＥＲ４（対照）；レーン１０ － モックトランスフェクション。

【0160】

【図2】図２は、ＣＨＯクローン使用済み培養上清から精製されたＤＮａｓｅ１－ＦｃおよびＤＮａｓｅ１－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を示す。安定したＣＨＯ細胞生成、融合タンパク質のプロテインＡ精製、およびＳＤＳ－ＰＡＧＥは、下記の実施例１で説明するように行った。左から右へ：レーン１ － ＴＨＥＲ４ＰＯＮ１－Ｋ（対照）；レーン２ － ｈＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃ－ＰＯＮ１－Ｋ；レーン３ － ｈＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃ；レーン４ － ｈＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）６－Ｆｃ；レーン５ － ＬＩ－ＣＯＲ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ（登録商標）ＭＷマーカー；レーン６ － ＢｉｏＲａｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ ＭＷマーカー。

【0161】

【図3-1】図３Ａおよび３Ｂは、２つの異なる基質濃度、２２０μＭまたは６６μＭサケ精子ＤＮＡ、でのＤＮａｓｅ１融合タンパク質のヌクレアーゼ活性を評価する改良型ＳＹＴＯＸ（商標）Ｇｒｅｅｎ蛍光アッセイからの生データを示す（下記の実施例２を参照されたい）。

【図3-2】同上。

【0162】

【図4-1】図４Ａおよび４Ｂは、改良型ＳＹＴＯＸ（商標）Ｇｒｅｅｎ蛍光アッセイを使用する２つの異なるＤＮａｓｅ活性実験からのデータのミカエリス－メンテンプロットを示す（下記の実施例２を参照されたい）。

【図4-2】同上。

【0163】

【図5-1】図５Ａおよび５Ｂは、組換えヒトＤＮａｓｅ１およびＤＮａｓｅ１－Ｆｃ融合タンパク質のＤＮａｓｅ活性の相対アクチン誘導性阻害を比較するＳＹＴＯＸ（商標）Ｇｒｅｅｎ蛍光アッセイからの結果を示す（下記の実施例２を参照されたい）。

【図5-2】同上。

【0164】

【図6-1】図６Ａおよび６Ｂは、ＤＮａｓｅ１－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質のアリールエステラーゼ活性を測定する代表実験についてのミカエリス－メンテンおよびラインウィーバー－バークプロットをそれぞれ示す（下記の実施例３を参照されたい）。

【図6-2】同上。

【0165】

【図7】図７は、ＤＮａｓｅ１－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質および有機ホスファターゼ陽性対照酵素の有機ホスファターゼ活性を測定する蛍光定量アッセイの結果を示す（下記の実施例３を参照されたい）。

【0166】

【図8】図８および９は、ＨＥＫ２９３トランスフェクション上清から免疫沈降したＰＯＮ１融合タンパク質のウェスタンブロット解析を示す。トランスフェクション、プロテインＡ免疫沈降、およびウェスタンブロット解析は、下記の実施例１２で説明するように行った。

【図9】図８および９は、ＨＥＫ２９３トランスフェクション上清から免疫沈降したＰＯＮ１融合タンパク質のウェスタンブロット解析を示す。トランスフェクション、プロテインＡ免疫沈降、およびウェスタンブロット解析は、下記の実施例１２で説明するように行った。

【0167】

【図10】図１０は、ＨＥＫ２９３トランスフェクション上清から免疫沈降したＰＯＮ１融合タンパク質の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を示す。トランスフェクション、プロテインＡ免疫沈降、およびＳＤＳ－ＰＡＧＥは、下記の実施例１２で説明するように行った。

【0168】

【図11】図１１～１３は、ＨＥＫ２９３培養上清から直接アッセイしたＰＯＮ１融合タンパク質のアリールエステラーゼ活性（図１１）、有機ホスファターゼ活性（図１２）およびラクトナーゼ活性（図１３）を示す（下記の実施例１３を参照されたい）。

【図12】図１１～１３は、ＨＥＫ２９３培養上清から直接アッセイしたＰＯＮ１融合タンパク質のアリールエステラーゼ活性（図１１）、有機ホスファターゼ活性（図１２）およびラクトナーゼ活性（図１３）を示す（下記の実施例１３を参照されたい）。

【0169】

【図13】図１１～１３は、ＨＥＫ２９３培養上清から直接アッセイしたＰＯＮ１融合タンパク質のアリールエステラーゼ活性（図１１）、有機ホスファターゼ活性（図１２）およびラクトナーゼ活性（図１３）を示す（下記の実施例１３を参照されたい）。

【0170】

【図14】図１４は、ＨＥＫ２９３トランスフェクション上清中に存在するＣＤ４０－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質への固定化ＣＤ４０リガンドの高親和性結合を示す（下記の実施例１４を参照されたい）。

【0171】

【図15】図１５は、ＨＥＫ２９３トランスフェクション上清中に存在する抗ＴＮＦ－α ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質への固定化ＴＮＦαの高親和性結合を示す（下記の実施例１４を参照されたい）。

【発明を実施するための形態】

【0172】

発明の記載
Ｉ．概観
本発明は、パラオキソナーゼ融合ポリペプチドに関する組成物および方法を提供する。ある特定の態様では、融合ポリペプチドは、生物学的に活性なパラオキソナーゼに対してアミノ末端側に連結された第１の生物学的に活性なポリペプチドを含み、第１の生物学的に活性なポリペプチドは、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子－４（ＣＴＬＡ－４）細胞外ドメイン、ＣＤ４０細胞外ドメイン、および炎症性サイトカインに特異的に結合しそれを中和するポリペプチド（例えば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）またはトランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）に特異的に結合しそれを中和するポリペプチド）から選択される。一部の態様では、融合ポリペプチドは、第１の生物学的に活性なポリペプチドに対してカルボキシル末端側かつパラオキソナーゼに対してアミノ末端側に連結された第２の生物学的に活性なポリペプチドをさらに含む。第２の生物学的に活性なポリペプチドは、例えば、ダイマー化ドメインまたは新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に特異的に結合するドメインであり得る。特に適切な第２の生物学的に活性なポリペプチドは、ダイマー化およびＦｃＲｎ結合性免疫グロブリン重鎖定常領域、例えば、免疫グロブリンＦｃ領域などである。

【0173】

他の態様では、融合ポリペプチドは、ダイマー化ドメインまたはＦｃＲｎに特異的に結合するドメイン（例えば、ダイマー化およびＦｃＲｎ結合性免疫グロブリン重鎖定常領域、例えば、免疫グロブリンＦｃ領域など）に対してカルボキシル末端側に連結された生物学的に活性なパラオキソナーゼを含み、融合ポリペプチドは、ダイマー化ドメインまたはＦｃＲｎ結合ドメインに対してアミノ末端側には生物学的に活性なポリペプチドを含まない。

【0174】

他の態様では、融合ポリペプチドは、ダイマー化ドメインまたはＦｃＲｎに特異的に結合するドメイン（例えば、ダイマー化およびＦｃＲｎ結合性免疫グロブリン重鎖定常領域、例えば、免疫グロブリンＦｃ領域など）に対してアミノ末端側に連結された生物学的に活性なパラオキソナーゼを含む。

【0175】

本開示の融合ポリペプチド中の好ましいパラオキソナーゼは、パラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）ポリペプチドである。特に適切なＰＯＮ１ポリペプチドは、ＰＯＮ１の天然に存在する非切断型リーダー配列（ヒトＰＯＮ１（配列番号４）の残基１～１５に一般に対応する）に対応するアミノ末端リーダー配列を欠如する。ＰＯＮ１と血清中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）との会合は、リン脂質への疎水性非切断型リーダーの直接的結合に主に依存する（Sorenson et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19:2214-2225, 1999を参照されたい）。このリーダー配列の除去は、ＨＤＬ結合からＰＯＮ１を除去し、本開示に従う治療利益のための他の部位へのＰＯＮ１の再標的化を容易にする。例えば、本明細書に記載されるＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅを含む融合ポリペプチドに関して、ＤＮＡまたはＲＮＡへのＰＯＮ１の再標的化は、炎症性ＮＥＴｓおよび細胞死の部位へと分子を指向させる。これらの部位においてＤＮＡまたはＲＮＡを標的化することに加えて、本明細書に記載されるＤＮａｓｅ－ＰＯＮ１またはＲＮａｓｅ－ＰＯＮ１融合分子は、別の重要な炎症性ＮＥＴ標的であるミエロペルオキシダーゼへとＰＯＮ１酵素を指向させることを助け得る。また、本明細書に記載されるスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）を含む融合ポリペプチドは、ＰＯＮ１が、スーパーオキシドに対するＳＯＤ１の作用によって産生された過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を消化し、それによって、例えば、肺治療のための改善された抗酸化剤を提供し得る分子を提供する。さらに、本発明に従う他の生物学的に活性なポリペプチド（例えば、ＣＴＬＡ－４細胞外ドメイン、ＣＤ４０細胞外ドメイン、または炎症性サイトカインに特異的に結合しそれを中和するポリペプチド）を含む融合分子は、本明細書に記載されるような治療利益のために、炎症促進性および／または免疫細胞活性化の他の部位へとＰＯＮ１を標的化することができる。

【0176】

本発明のパラオキソナーゼ融合分子は、例えば、自己免疫疾患または炎症性疾患の処置が含まれる、その抗酸化性、抗炎症性、アテローム保護的（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）および／または神経保護的特性を介した種々の疾患または障害の処置のために使用され得る。例えば、研究は、自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の処置のためのパラオキソナーゼの使用を支持している。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を有する多くの患者における自己抗体力価は、ＰＯＮ１の活性の喪失と相関し（Batukla et al., Ann. NY Acad. Sci. 1108:137-146, 2007を参照されたい）、ＳＬＥＤＡＩによって評価されるＳＬＥ疾患活性およびＳＬＩＣＣ／ＡＣＲ損傷インデックスによって評価されるＳＬＥ疾患関連臓器損傷は、ＰＯＮ１活性と負に相関する（Ahmed et al., EXCLI Journal 12:719-732, 2013を参照されたい）。他の研究は、炎症性疾患、例えば、炎症性肺疾患の処置のためのパラオキソナーゼの使用を支持している。研究は、例えば、ＰＯＮ１が、肺炎症からの保護において重要であることを強く示唆しており、低いＰＯＮ１活性が、肺疾患、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および間質性肺疾患（例えば、特発性肺線維症（ＩＰＦ）またはサルコイドーシス）などに関連することをさらに示している（例えば、Sahiner et al., WAO Journal 4:151-158, 2011；Emin et al., Allergol. Immunopathol. (Madr) 43:346-352, 2014；Sarioglu et al., Iran J. Asthma Immunol. 14:60-66, 2015；Tolgyesi et al., Internat. Immunol. 21:967-975, 2009；Chen et al., J. Cell Biochem. 119:793-805, 2018；Rumora et al., J. COPD 11:539-545, 2014；Rajkovic et al., J. Clin. Path. 71:963-970, 2018；Ivanisevic et al., Eur. J. Clin. Invest. 46:418-424, 2016；Uzun et al., Curr. Med. Res. Opin. 24:1651-1657, 2008；Okur et al., Sleep Breath. 17:365-371, 2013；Golmanesh et al., Immunopharmacol. And Immunotoxicol. 35:419-425, 2013を参照されたい）。別の研究は、低いＰＯＮ１活性が、クローン病の重症度と相関することを示した（Sczceklik et al., Molecules 23:2603, 2018）。さらに、組換えＰＯＮ１治療は、有機リン中毒および大腸炎の動物モデルにおいて有効性を示している（例えば、Valiyaveettil et al., Biochem. Pharmacol. 81:800-809, 2011；Valiyaveettil et al., Toxicol. Letters 202:203-208, 2011；Bajaj et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 180:165, 2016；Stevens et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:12780-12784, 2008；Yamashita et al., J. Immunol. 191:949-960, 2013を参照されたい）。

【0177】

本明細書に記載されるパラオキソナーゼ融合分子は、例えば、神経学的疾患の処置のためにも使用され得る。例えば、ＰＯＮ１は、その抗酸化特性に起因して、脳において保護的である。ＰＯＮ１の神経保護的役割は、ＰＯＮ１活性がアルツハイマー病および他の認知症を有する患者において減少することを示す研究によって支持される（例えば、Menini et al., Redox Rep. 19:49-58, 2014を参照されたい）。さらに、ＰＯＮ１を細胞および組織中に形質導入するためにタンパク質形質導入ドメインを含有するＰＯＮ１融合物を使用する研究は、ＰＯＮ１形質導入が、ミクログリア細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで酸化ストレス誘導性の炎症応答から保護し、パーキンソン病モデルにおいてドパミン作動性ニューロン細胞死に対して保護することを示した（Kim et al., Biomaterials 64:45-56, 2015を参照されたい）。

【0178】

ＤＮａｓｅをさらに含む二重特異的融合物は、例えば、ＮＥＴｏｓｉｓによって特徴付けられる疾患または障害の処置におけるものが含まれる、ＰＯＮ媒介性の治療が適用可能である疾患の処置に、追加の治療利益を提供する。それらだけで、または炎症促進性応答を増加させることによって組織損傷を引き起こすＮＥＴｓ（Mutua and Gershwin, Clin. Rev. Allergy Immunol., 2020を参照されたい）は、種々の重篤な疾患および状態に関与している。例えば、ＮＥＴｓは、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（例えば、ループス腎炎を伴うＳＬＥ）、関節リウマチおよび乾癬が含まれる自己免疫疾患において見られる炎症の増強において役割を果たし得、自己炎症性疾患、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などにも関連する（同上を参照されたい）。ＮＥＴｓは、敗血症、代謝疾患（例えば、２型糖尿病および肥満）、神経学的疾患（例えば、アルツハイマー病、多発性硬化症、髄膜炎、脳性マラリアおよび虚血性脳卒中）、感染性疾患、心血管疾患および血栓症（thromobosis）、腫瘍の進行および転移、肝臓疾患（例えば、アルコール関連肝臓疾患（ＡＬＤ）、門脈圧亢進症、非アルコール性脂肪性肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）、例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、ならびに肝臓移植後の合併症）、ならびに例えば、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）およびＣＯＶＩＤ－１９関連急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）が含まれる種々の炎症性肺疾患においても役割を果たす（例えば、同上；Brinkmann, J. Innate Immun. 10:422-431, 2018；Liu et al., Chinese Med. Journal 130:730-736, 2017；Twaddell et al., CHEST 156:774-782, 2019；Uddin et al., Front. Immunol. 10:47, 2019；Middleton et al., Blood 136:1169, 2020；Zuo et al., JCI Insight 5:e138999, 2020；Barnes et al., J. Exp. Med. 217:e20200652, 2020；Hilscher and Shah, Semin. Liver Dis. 40:171-179, 2020を参照されたい）。ＮＥＴｏｓｉｓによって特徴付けられる疾患または障害の処置のためのＤＮａｓｅの使用は、例えば、嚢胞性線維症の処置のための組換え野生型ＤＮａｓｅ（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標））の使用、ＣＯＶＩＤ－１９患者におけるＰｕｌｍｏｚｙｍｅの進行中の臨床試験（ＮＣＴ０４３５９６５４）、ならびに例えば、急性喘息、シリカ誘導性肺炎症、急性肺傷害、がん、大腸炎、虚血再灌流、敗血症および血栓症のモデルが含まれるいくつかの動物モデル研究によって、さらに支持される（例えば、da Cunha et al., Exp. Lung Res. 42:66, 2016；Benmerzoug et al., Nat. Comm. 9:5226, 2018；Caudrillier et al., J. Clin. Invest. 122:2661, 2012；Cools-Lartigue et al., J. Clin. Invest. 123:3446, 2013；Park et al., Sci. Translational Med. 8:361ra138, 2016；Trejo-Becirril et al., Integrative Cancer Therapies 15:NP35-NP43, 2016；Thalin et al., PloS ONE 13:e0191231, 2018；Babicova et al., Folia Biolica (Praha) 64:10, 2018；Li et al., J. Crohns Colitis 2020, 14:240-253, 2020；Albadawi et al., J. Vasc. Surg. 64:484, 2016；Peer et al., Am. J. Nephrol. 43:195, 2016；Mai et al., Shock 44:166, 2015；Brill et al., J. Thrombosis Haemostasis 10:136, 2012；Manda-Handzlik and Demkow, Cells 8:1477, 2019；Delgado-Rizo et al., Front. Immunol. 8:81, 2017を参照されたい）。

【0179】

本明細書に記載されるＤＮａｓｅをさらに含む二重特異的融合物は、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＬＳ）の処置においても有用である。抗リン脂質抗体症候群は、凝固亢進状態を引き起こす、リン脂質に対する抗体によって特徴付けられる自己免疫疾患である。血栓症は、動脈および静脈の両方において生じ、流産および死産が含まれる妊娠合併症を引き起こす。抗リン脂質抗体症候群は、原発性（任意の他の関連する疾患の非存在下で生じる）または二次性（別の自己免疫疾患、例えば、ＳＬＥなどとともに生じる）であり得る。稀な症例では、ＡＰＬＳは、全身性の血栓症に起因して迅速な臓器不全をもたらす；これは、劇症型抗リン脂質抗体症候群（ＣＡＰＳまたはＡｓｈｅｒｓｏｎ症候群）と呼ばれ、死亡の高いリスクに関連する。ＣＯＶＩＤ－１９に関連する急性呼吸促迫を有する患者は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでおよびマウス血栓症モデルにおいて血栓症を促進する抗リン脂質抗体を有する（Zuo et al., JCI Insight 5:e138999, 2020；Zuo et al., Sci. Trans. Med. 12:eabd3876, 2020）。抗リン脂質抗体は、好中球ＮＥＴ形成を刺激して、血栓形成のための足場を提供する。本明細書に記載されるＤＮａｓｅ融合物によるＮＥＴｓの消化は、血栓形成を予防することができ、既存の血餅を溶解させて、血流を回復させることを助けることができる。本発明のＤＮａｓｅ融合分子はまた、例えば、ｔＰＡ、ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼが含まれる血栓溶解薬と一緒に使用され得る。

【0180】

例えば、ＤＮａｓｅをさらに含む実施形態が含まれる、本明細書に記載されるパラオキソナーゼ融合分子は、炎症性皮膚疾患の処置のためにも使用され得る。多くの研究が、炎症性皮膚疾患の病理発生における反応性酸素種および過酸化脂質の関与を報告している（例えば、Simonetti et al., Antioxidants 10:697, 2021を参照されたい）。例えば、有意に低いレベルのパラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）ならびに有意に高いレベルのミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）および過酸化脂質が、アトピー性皮膚炎において見出されており（同上を参照されたい）、増加したＭＰＯおよび減少したＰＯＮ１活性は、乾癬小児においても記載されている（Bacchetti et al., Archives of Dermatological Research 312:33-39を参照されたい）。乾癬およびアトピー性皮膚炎では、炎症の間の好中球活性化は、ＭＰＯが結合したＮＥＴｓの噴出をもたらし、脂質の酸化を引き起こし、過酸化脂質を消化することによって脂質を酸化から通常は保護するＰＯＮ１酵素を損傷させる。ＤＮａｓｅ１によるＮＥＴｓの消化は、結合したＭＰＯを放出させ、そのクリアランスを可能にし、酸化の主要駆動因子を除去し、ＰＯＮ１による治療は、酸化的損傷からの保護を回復させ、患者における酸化還元電位のバランスを取り戻す。したがって、ＰＯＮ１およびＤＮａｓｅ治療は、組合せとして特に有効である。

【0181】

ＤＮａｓｅをさらに含む実施形態が含まれる、本明細書に記載されるパラオキソナーゼ融合分子は、加齢から保護するためにも使用され得る。酸化ストレスは、加齢の主要原因であることが公知である。特に、酸化された脂質は、マクロファージスカベンジャー受容体による取込みを介した炎症の促進、および血管内皮細胞に対する損傷に起因して、加齢に関する重要な標的である。脂質酸化と加齢との間の関連性に関する議論については、例えば、Moldogazieva et al. (Oxidative Medicine and Cellular Longevity, Volume 2019, Article ID 3085756)およびBarrera et al. (Antioxidants 7:102, 2018)を参照されたい。炎症および心機能に対する酸化された脂質の毒性効果を記載するHajri (Frontiers In Bioscience, Landmark 23:1822-1847, 2018)もまた参照されたい。ＰＯＮ１は、過酸化脂質の消化によって脂質を酸化から保護することが公知である。したがって、ＰＯＮ１酵素レベルの増加と加齢の減速との間には、直接的な関連性が存在する。さらに、ＰＯＮ１酵素活性は、心血管疾患、自己免疫疾患および肺疾患が含まれる複数の加齢に伴う疾患において欠損していることが公知であり、増加したＰＯＮ１の臨床的必要性が存在することを示している。さらに、ＤＮａｓｅをさらに含む実施形態は、ＤＮａｓｅがＮＥＴｓを消化する能力に起因して、加齢を減速させるために特に有用である。ＮＥＴｓは、好中球および他の細胞によって産生されるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）およびエラスターゼのための足場を提供するので、炎症および酸化ストレスの主要駆動因子である。ＤＮａｓｅによるＮＥＴｓの消化は、炎症性酵素の放出およびクリアランスを可能にする。ＤＮａｓｅはまた、他のＤＮＡ検知経路（例えば、ＳＴＩＮＧ、ＴＬＲ９）を介して、炎症性活性化を除外する。

【0182】

本明細書に記載されるＲＮａｓｅをさらに含む二重特異的融合物は、例えば、ＮＥＴｓに関連する細胞外ＲＮＡが含まれる、死細胞および瀕死の細胞に由来する細胞外ＲＮＡを消化することによる抗炎症特性を有する。細胞外ＲＮＡは、例えば、ＴＬＲ２アゴニストと相乗効果を示して、マクロファージ炎症応答を強化し、このＲＮＡの消化は、ＴＬＲ２を介した炎症を予防する（Noll et al., PloS ONE 12:e0190002, 2017を参照されたい）。

【0183】

ＲＮａｓｅ含有融合物は、例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患（例えば、炎症性肺疾患）、２型糖尿病、感染性疾患、心血管疾患（例えば、冠状動脈疾患、脳卒中）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）およびがんが含まれる種々の疾患の処置のための追加の治療利益を提供する。例えば、いくつかの研究は、炎症性肺疾患の処置のためのＲＮａｓｅの使用を支持している。１つの研究は、ＲＮＡセンサーＴＬＲ３が、ウイルス病原体の非存在下でのＡＲＤＳ様病理の発症において主要な役割を果たすことを示している（Murray et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178:1227-1237, 2008を参照されたい）。酸素治療は、ＡＲＤＳにおける主要な治療介入であるが、さらなる肺損傷、およびウイルス感染に対する感受性に寄与する。酸素治療は、培養ヒト上皮細胞における増加したＴＬＲ３発現および活性化のための主要な刺激であり、ＴＬＲ３の非存在または遮断は、高酸素条件への曝露後に、マウスを、肺の傷害および炎症から保護した（Murray et al., 上記を参照されたい）。別の研究は、細胞外ＲＮＡによるＴＬＲ３活性化が、急性低酸素症に応答して生じること、およびマウスにおけるＲｎａｓｅＡによる治療が、急性低酸素症後の肺炎症を減弱させたことを示している（Biswas et al., Eur. J. Immunol. 45: 3158-3173, 2015を参照されたい）。

【0184】

他の研究は、自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの処置のためのＲＮａｓｅの使用を支持している。研究は、例えば、ＳＬＥ疾患病理発生における、ＲＮＡ免疫複合体、およびＴＬＲ７が含まれるＲＮＡ受容体の役割、ならびにＳＬＥのマウスモデルにおけるＲＮａｓｅ過剰発現の保護効果を示している（例えば、Sun et al., J. Immunol. 190:2536-2543, 2013を参照されたい）。

【0185】

本明細書に記載されるＲＮａｓｅ含有融合分子は、エキソソーム中に含有されるＲＮＡを消化することができる。肺疾患におけるエキソソームの総説については、Hough et al., Allergy 72:534-544, 2017を参照されたい。ＲＮａｓｅ１は、その塩基性の電荷に起因して、細胞膜を介してサイトゾル中へと移行することができる（Chao et al., Biochem. 50:8374-8382, 2011；Haigas et al., J. Cell Sci. 116:313-324, 2003；Johnson et al., Biochem. 46:10308-10316, 2007を参照されたい）。細胞質性阻害剤が、非常に高い親和性でＲＮａｓｅ１に結合し、無傷の細胞をＲＮａｓｅ毒性から保護する。しかし、細胞外小胞中のＲＮＡが含まれる細胞外ＲＮＡは、細胞質性阻害剤によっては保護されない（Mironova et al., Oncotarget 8: 78796-78810, 2017を参照されたい）。

【0186】

本明細書に記載されるＲＮａｓｅを含む融合分子は、転写後遺伝子調節に関与する小さい細胞外非コードＲＮＡであるｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をさらに標的化することができる。ｍｉＲＮＡ調節不全は、肺疾患、増殖性血管疾患、心障害、腎臓疾患、真性糖尿病、線維症およびがんが含まれる広い範囲の疾患と関連付けられている（Rajasekaran et al., Front. Pharmacol. 6:254, 2015；Thum et al., Nature 456:980-984, 2008；Kato et al., Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 4:1255-1266, 2009；Lee and Dutta, Annu. Rev. Pathol. 4:199-227, 2009；Kumar et al., Protein Cell. 3:726-738, 2012；Noetel et al., Front. Physiol. 3:49, 2012；Zampetaki and Mayr, Circ. Res. 110:508-522, 2012を参照されたい）。例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ－３３は、マウスモデルでは肉芽腫性肺組織中で、およびサルコイドーシスを有する患者のＢＡＬ液中で過剰発現される（Barna et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 54:865-871, 2016）。ｍｉｃｒｏＲＮＡ－３３は、コレステロール輸送体ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１を下方調節して、肺胞マクロファージにおけるコレステロール蓄積、および泡沫細胞形成を促進する。別の標的は、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）のマウスモデルにおいてエキソソーム中に分泌されることが示されたｍｉｃｒｏＲＮＡ－４６６であり、この場所で、ｍｉｃｒｏＲＮＡ－４６６は、ＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化した（Shikano et al., BMC Pulmonary Med. 19:110, 2019）。

【0187】

本明細書に記載されるＲＮａｓｅ含有融合物の他の標的には、ウイルスＲＮＡ、例えば、インフルエンザウイルス感染の間に肺中に放出されるプロウイルスｍｉｃｒｏＲＮＡ（Scheller et al., J. Inf. Dis. 219:540-543, 2019を参照されたい）、またはＴＬＲ８結合を介してマクロファージ泡沫細胞形成を刺激することが報告されているＨＩＶ一本鎖ＲＮＡ（Bernard et al., PloS ONE 9:e104039, 2014を参照されたい）などが含まれる。他のウイルスＲＮＡ標的には、コロナウイルスＲＮＡ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）が含まれる。

【0188】

研究は、例えば、がん、虚血／再灌流傷害、移植片拒絶、アテローム硬化性粥腫形成、心筋梗塞、急性脳卒中および術後認知機能低下の処置のためのＲＮａｓｅの使用もまた支持している（例えば、Rutkoski et al., Translational Oncology 6:392-397, 2013；Mironova et al., Oncotarget. 8:78796-78810, 2017；Eller et al., ACS Central Sci. 1:181-190, 2015；Kleinert et al., J. Am. Heart Assn. doi: 10.1021, 2016；Simsekyilmaz et al., Circulation 129: 598-606, 2014；Steiger et al., JAMA 6:e004541, 2017；Walberer et al., Curr. Neovas. Res. 6:12-19, 2009；Chen et al., PloS One 10:e0134307, 2015を参照されたい）。

【0189】

本明細書に記載されるスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）を含む二重特異的パラオキソナーゼ融合分子は、酸化ストレスからの保護において追加の治療利益を提供する。酸化的損傷からの保護におけるＳＯＤ１の役割は、例えば、Ighodaro and Akinolye, Alexandria J. Med. 54:287-293, 2018によって概説されている。そのネイティブ形態では、ＳＯＤ１は、細胞内酵素である（同上を参照されたい）。本開示によれば、ＳＯＤ１ポリペプチドセグメントは、治療のための改善された抗酸化剤を提供するために、融合分子のパラオキソナーゼセグメントと併せて機能する細胞外酵素として使用される。例えば、パラオキソナーゼは、ＳＯＤ１酵素反応の産物である過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を消化することができる。さらに、Ｈ_２Ｏ_２の消化は、ＮＥＴｓに関連するミエロペルオキシダーゼの活性を抑制する。ＳＯＤ１とパラオキソナーゼとの協調的な活性は、ＮＥＴ産生に関連する疾患を有する患者における組織の損傷および炎症からの保護における活性を改善する。本発明に従うＳＯＤ１－ＰＯＮ分子は、例えば、炎症性肺疾患、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、サルコイドーシスおよび間質性肺疾患などの処置において特に有用である。一部の好ましい実施形態では、ＳＯＤ１－ＰＯＮ融合物は、ダイマー化ドメイン、例えば、免疫グロブリンＦｃ領域などをさらに含む；かかる変形形態は、そのネイティブ形態ではジスルフィド結合によって安定化されるダイマーであるＳＯＤ１と特に適合性である。

【0190】

本明細書に記載されるＣＴＬＡ－４細胞外ドメインを含む二重特異的パラオキソナーゼ融合分子は、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）および炎症性肺疾患が含まれる炎症性疾患および自己免疫疾患の処置において特に有用である。酸化されたコレステロールは、マクロファージおよび内皮細胞において炎症応答を活性化し（Miller and Shyy, Trends Endocrinol. Metabol. 28:143-152, 2017を参照されたい）、ＰＯＮ１は、リポタンパク質を酸化から保護することによってこの炎症を抑制することができる。可溶性ＣＴＬＡ－４（例えば、アバタセプトまたは他のＣＴＬＡ４－Ｆｃ）の免疫抑制特性は、パラオキソナーゼ酵素活性と適合性であり、その結果、ＣＴＬＡ４－ＰＯＮ分子は、両方の構成成分の活性を保持し、線維性肺疾患および自己免疫／炎症性疾患において改善された活性を有する。ＣＴＬＡ４－ＰＯＮ１分子は、例えば、ＰＯＮ１酵素が活性なままである、単球および樹状細胞が含まれる活性化された抗原提示細胞上で発現されるＣＤ８０およびＣＤ８６に結合する。この分子は、Ｔ細胞、マクロファージおよび樹状細胞の活性化を阻害するのに有効であり、組織、例えば、炎症した肺などにおける酸化ストレスもまた低減させる。

【0191】

本明細書に記載されるＣＤ４０細胞外ドメインを含む二重特異的パラオキソナーゼ融合分子は、ＣＤ４０－ＣＤ１５４シグナル伝達経路に関連する炎症促進性活性化事象を抑制することによって、追加の治療利益を提供する。ＣＤ４０－ＣＤ１５４経路は、例えば、炎症性肺疾患および傷害における線維症が含まれる線維性疾患に関与し（例えば、Kaufman et al., J. Immunol. 172:1862-1871, 2004を参照されたい）、研究は、線維性疾患および炎症性肺疾患の処置においてこの経路を抑制する分子の使用を支持している（例えば、Adawi et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 89:222-230, 1998；Adawi et al., Am. J. Pathol. 152:651-657, 1998；Cheng et al., BioMed. Research Intl. Volume 2020, Article ID 7840652, 2020；Xiong et al., J. Cell. Mol. Med. 23:740-749, 2018を参照されたい）。本発明のＣＤ４０－ＰＯＮ融合物は、例えば、肺疾患および自己免疫／炎症性疾患において改善された活性を有する分子が含まれる、炎症および適応免疫の両方を阻害する分子を提供する。例えば、ＣＤ４０－ＰＯＮ１融合物は、喘息、ＣＯＰＤ、低酸素症および間質性肺疾患（例えば、特発性肺線維症（ＩＰＦ）またはサルコイドーシス）が含まれる、ＣＤ４０活性化が炎症プロセスを悪化させ、パラオキソナーゼレベルが低いかまたは存在しない肺疾患において、改善された活性を提供し得る。ＣＤＯ４０－ＰＯＮ１融合物は、例えば、肝臓疾患（例えば、慢性肝臓疾患、例えば、アルコール関連肝臓疾患（ＡＬＤ）、門脈圧亢進症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、または肝臓移植後の合併症など）および腎臓疾患（例えば、慢性腎臓疾患、例えば、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症または膜性糸球体腎炎など）の処置のためにも有益である。

【0192】

一部の実施形態では、本発明のパラオキソナーゼ融合分子は、ＣＤ１５４への増加した結合を有するバリアントＣＤ４０細胞外ドメインを含む。例えば、１つまたは複数の単一アミノ酸置換が、ＣＤ４０リガンドへの結合を改善するために、特定の残基においてなされ得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０１２００９１号を参照されたい）。かかるＣＤ４０細胞外ドメインバリアントは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで血小板の活性化も凝集も誘導しないＣＤ４０－Ｆｃバリアントを提供するために、損なわれたＦｃγＲ結合を有するヒトＩｇＧ１（γ１）Ｆｃバリアントと融合されて、ヒト血小板上のＣＤ４０およびＦｃγＲＩＩａへの同時結合に由来する毒性を回避し得る。血小板の活性化および血栓症は、血小板上のＦｃＲと、血小板表面上の抗原、例えば、ＶＥＧＦ、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌとの架橋に起因して生じることが示されている（Taylor et al., Blood 96:4254, 2020；Meyer et al., J. Thromb. Haemost. 7:151, 2009を参照されたい）。

【0193】

本明細書に記載されるＴＮＦαまたはＴＧＦ－βに特異的に結合しそれを中和するポリペプチドを含む二重特異的融合分子は、炎症応答、免疫応答、および／またはこれらのサイトカインによって媒介される他の細胞性応答の阻害を介して、追加の治療利益を提供する。抗ＴＮＦα構成成分を含むパラオキソナーゼ融合物は、例えば、炎症性疾患または自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性肺疾患（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性肺傷害（ＡＬＩ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）または間質性肺疾患（例えば、特発性肺線維症またはサルコイドーシス））、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）または炎症性皮膚疾患（例えば、乾癬またはアトピー性皮膚炎）などを処置するために使用され得る。抗ＴＧＦ－β構成成分を含むパラオキソナーゼ融合物は、例えば、炎症性疾患、線維性疾患または１型糖尿病を処置するために使用され得る。一部の実施形態では、本発明の抗ＴＧＦβ－ＰＯＮ融合物を使用する処置のための炎症性疾患または線維性疾患は、炎症性肺疾患、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性肺傷害（ＡＬＩ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）または間質性肺疾患（例えば、特発性肺線維症（ＩＰＦ）またはサルコイドーシス）などである。炎症性肺疾患の処置に関する一部の変形形態では、本明細書に記載される抗ＴＮＦαまたは抗ＴＧＦ－βポリペプチドを含む融合分子は、全身的にではなく、噴霧によって肺に直接送達され、これらのサイトカインの多面的活性に起因して生じ得る望まれない副作用がより少ない、効率的な治療活性を達成し得る。

【0194】

一部の態様では、本発明は、ＣＨＯなどの安定な細胞系におけるＤＮａｓｅ－ＰＯＮ融合物の構成的発現のためのそのような組成物および方法が含まれる、本明細書に記載される融合ポリペプチドおよびダイマー性タンパク質を産生するための組成物および方法を提供する。アクチン／塩抵抗性かつ機能亢進型のＤＮａｓｅ１を構成的に発現する安定なＣＨＯ細胞を得るための以前の試みは、数千個のクローンをスクリーニングしたにもかかわらず、不首尾であった（Lam et al., Biotech. Progress 32: 523-533, 2017を参照されたい）。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される増強されたＤＮａｓｅ１を含むＤＮａｓｅ－ＰＯＮ融合物は、最小限のスクリーニングによって安定な系において容易に発現され、それによって、当該分野におけるこの問題を克服する。本開示のある特定の増強されたＤＮａｓｅ１－ＰＯＮ分子を発現する安定な細胞系を容易に生成する能力は、これらの分子が、産業規模での生物薬物製造の実行可能性およびコストにおいて利点を有することを示している。
ＩＩ．融合ポリペプチドおよびダイマー性タンパク質

【0195】

一態様では、本発明は、アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｐを含む融合ポリペプチドであって、式中、Ｔ、Ｌ１、Ｘ、Ｌ２およびＰは、以下のように定義される：Ｔは、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子－４（ＣＬＴＡ－４）細胞外ドメイン、ＣＤ４０細胞外ドメイン、および炎症性サイトカインに特異的に結合しそれを中和するポリペプチドから選択される第１の生物学的に活性なポリペプチドであり；Ｌ１は、必要に応じて存在する第１のポリペプチドリンカーであり；Ｘは、必要に応じて存在する第２の生物学的に活性なポリペプチドであり；Ｌ２は、必要に応じて存在する第２のポリペプチドリンカーであり；かつＰは、生物学的に活性なパラオキソナーゼである、融合ポリペプチドを提供する。Ｘが存在する上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、Ｘは、ダイマー化ドメインおよび新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に特異的に結合するドメインから選択される。典型的には、生物学的に活性なパラオキソナーゼは、天然に存在するパラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片である。ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、ＳＯＤ１、ＣＬＴＡ－４細胞外ドメインまたはＣＤ４０細胞外ドメインを含む変形形態では、上述の生物学的に活性なポリペプチドのいずれかは、特定された天然に存在するポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片から選択され得る。炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦαまたはＴＧＦ－β）に特異的に結合しそれを中和するポリペプチドを含むある特定の変形形態では、抗サイトカインポリペプチドは、単鎖抗体または代替的足場結合タンパク質である。

【0196】

別の態様では、本発明は、アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、Ｘ－Ｌ２－Ｐを含む融合ポリペプチドであって、式中、Ｘは、ダイマー化ドメインおよび新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に特異的に結合するドメインから選択される生物学的に活性なポリペプチドであり、Ｌ２は、必要に応じて存在するポリペプチドリンカーであり、かつＰは、生物学的に活性なパラオキソナーゼであり、融合ポリペプチドは、Ｘに対してアミノ末端側には生物学的に活性なポリペプチドを含有しない、融合ポリペプチドを提供する。典型的には、生物学的に活性なパラオキソナーゼは、天然に存在するパラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片である。

【0197】

さらに別の態様では、本発明は、アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、Ｐ－Ｌ１－Ｘを含む融合ポリペプチドであって、式中、Ｐは、生物学的に活性なパラオキソナーゼであり、Ｌ１は、ポリペプチドリンカーであり、Ｘは、ダイマー化ドメインおよび新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に特異的に結合するドメインから選択される生物学的に活性なポリペプチドである、融合ポリペプチドを提供する。典型的には、生物学的に活性なパラオキソナーゼは、天然に存在するパラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片である。

【0198】

上で特定された天然に存在するパラオキソナーゼまたは他の生物学的に活性なポリペプチドの機能的バリアントは、対応する生物活性についてバリアントを評価するための慣用的なアッセイを使用して、容易に同定することができる。例えば、パラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）バリアントは、リン酸ジエチルｐ－ニトロフェニル（diethyl p-nitrophenol phosphate）（パラオキソン）を基質として使用してホスホトリエステラーゼ活性について、または酢酸フェニルを基質として使用してアリールエステラーゼ活性について、アッセイされ得る（例えば、Graves and Scott, Curr Chem Genomics 2:51-61, 2008を参照されたい；以下の実施例３もまた参照されたい）。さらに、機能亢進型ＤＮａｓｅ１バリアントが含まれるＤＮａｓｅ１およびＤＮａｓｅ１Ｌ３バリアントは、（ｉ）メチルグリーン色素が加水分解されたＤＮＡから放出される際のＡ_２６０の減少を測定するＤＮＡ－メチルグリーンアッセイ（例えば、Sinicropi et al., Anal. Biochem. 222:351-358；Pan and Lazarus, J. Biol. Chem. 273:11701-11708, 1998を参照されたい）、（ｉｉ）ＤＮＡ吸収に起因するＡ_２６０が、分解の関数として増加する、Ｋｕｎｉｔｚ濃色性（ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍｉｃｉｔｙ）アッセイ（例えば、Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:349-362, 1950；Pan and Lazarus, 上記を参照されたい）；（ｉｉｉ）スーパーコイル状または線状プラスミドＤＮＡのいずれかを基質として使用し、基質の消失および／または消化産物の出現（例えば、線状産物、またはスーパーコイル状ＤＮＡからの弛緩した産物の出現）を測定する、プラスミド消化アッセイ（例えば、Pan and Lazarus, 上記を参照されたい）、あるいは（ｉｖ）ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ色素で標識されたＤＮＡが加水分解される際の蛍光における減少を測定する、ＳＹＴＯＸ（商標）Ｇｒｅｅｎ蛍光アッセイ（以下の実施例２を参照されたい）、を使用して、ヌクレアーゼ活性についてアッセイされ得る。ＤＮａｓｅ１バリアントは、基質ＤＮＡの添加前にＧ－アクチンとともに事前インキュベートされたＤＮａｓｅを使用して、ヌクレアーゼ活性のＧ－アクチン誘導性阻害についてもアッセイされ得る（例えば、Pan et al., J. Biol. Chem. 273:18374-18381, 1998を参照されたい）。ヒトＲＮａｓｅ１などのＲＮａｓｅの場合、バリアントは、リボヌクレアーゼ活性を評価するための公知のアッセイにおいて、一本鎖または二本鎖ＲＮＡを消化するその能力についてアッセイされ得る（例えば、Libonati and Sorrentino, Methods Enzymol. 341:234-248, 2001を参照されたい）。

【0199】

ＳＯＤ１バリアントは、市販のスーパーオキシドジスムターゼ比色活性キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（商標）カタログ番号：ＥＩＡＳＯＤＣ）を使用してアッセイされ得る。このキットは、種々の試料型において、Ｃｕ／Ｚｎ、ＭｎおよびＦｅスーパーオキシドジスムターゼ活性が含まれるスーパーオキシドジスムターゼ活性の全ての型を測定するように設計されている。スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカルおよび過酸化水素が含まれる反応性酸素種は、通常の細胞性好気的代謝の間に産生され、フリーラジカルは、ＳＯＤ酵素が含まれるいくつかの経路によって、除外されるかまたは他の産物に変換される。このアッセイは、ＳＯＤ活性を定量的に測定するはずであり、標準曲線を生成するためにウシ赤血球ＳＯＤ標準を使用する。類似の分光光度的キットは、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓからも入手可能であり（商品番号７０６００２）、このキットを使用するＳＯＤ活性アッセイは、Mason et al., Free Radic. Biol. Med. 77:130-138, 2014に記載されている。

【0200】

可溶性ＣＬＴＡ－４およびＣＤ４０バリアント、ならびに抗炎症性サイトカインポリペプチド（例えば、単鎖抗体）は、種々の公知のアッセイのいずれかを使用して、そのそれぞれの標的に対する（例えば、ＣＴＬＡ－４の場合にはＣＤ８０／ＣＤ８６に対する、またはＣＤ４０の場合にはｇｐ１３９に対する）所望の結合活性について評価され得る。例えば、１つのアッセイシステムは、市販のバイオセンサー機器（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用し、このとき、候補結合ポリペプチド（例えば、候補ＣＴＬＡ－４－Ｆｃ、ＣＤ４０－Ｆｃまたは抗サイトカイン抗体）は、アミンまたはスルフヒドリル化学を使用して、フローセル内の金フィルムに結合したデキストラン線維に、共有結合的に結合される。可溶性標的分子（例えば、ＣＤ８０－Ｆｃ、ＣＤ８６－Ｆｃ、ＣＤ４０Ｌ－Ｆｃ（ｇｐ１３９－Ｆｃ）または可溶性サイトカイン）を含有する試験試料に、セルを通過させる。固定化されたタンパク質が標的分子に対する親和性を有する場合、そのタンパク質は、標的に結合して、金フィルムの表面プラズモン共鳴における変化として検出される、媒体の屈折率における変化を引き起こす。このシステムは、そこから結合親和性が計算され得るオンレートおよびオフレートの決定、ならびに結合の化学量論の評価を可能にする。この機器の使用は、例えば、Karlsson (J. Immunol. Methods 145:229-240, 1991)およびCunningham and Wells (J. Mol. Biol. 234:554-563, 1993)によって開示されている。候補ポリペプチドの結合活性は、当該分野で公知の他のアッセイシステムを用いても評価することができる。かかるシステムには、結合親和性の決定のためのＳｃａｔｃｈａｒｄ分析（Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949を参照されたい）および熱量測定アッセイ（Cunningham et al., Science 253:545-548, 1991；Cunningham et al., Science 254:821-825, 1991を参照されたい）が含まれる。

【0201】

可溶性ＣＴＬＡ－４およびＣＤ４０バリアントの活性もまた、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞性アッセイにおいて、機能について評価され得る。例えば、可溶性ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ８０発現細胞またはＣＤ８６発現細胞、例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、またはＣＤ８０^＋もしくはＣＤ８６^＋ＣＨＯ細胞による刺激に対するＴ細胞応答を阻害する（例えば、米国特許第５，４３４，１３１号；Linsley et al., J. Exp. Med. 174:561-569, 1991を参照されたい）。可溶性ＣＤ４０は、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ、ｇｐ３９）によるＣＤ４０陽性細胞の刺激を遮断する。ＣＤ４０応答性細胞は、Ｂ細胞、単球または樹状細胞であり得る。応答は、細胞型に依存して変動し得、これには、増殖、抗体産生の抑制、または炎症性サイトカイン産生が含まれ得る（例えば、Noelle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6550-6554, 1992；Grammer et al., J. Immunol. 154:4996-5010, 1995を参照されたい）。ＣＤ４０Ｌレポーター細胞系は、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からも入手可能である。このレポーター系は、ヒトＣＤ４０と、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）に融合されたＮＦ－ｋＢ応答エレメントとをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を使用する。そのリガンドまたは抗体によるＣＤ４０受容体の結合は、ＮＦ－ｋＢ活性化、およびＳＥＡＰの誘導性の発現をもたらす（Jerome et al., Anal. Biochem. 585:113402, 2019を参照されたい）。

【0202】

炎症性サイトカイン結合ポリペプチドの活性の中和もまた、当該分野で公知の細胞性アッセイを使用して評価され得る。例えば、抗ＴＮＦα結合タンパク質は、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能な市販のＴＮＦαレポーター細胞系を使用して、活性の中和についてアッセイされ得る。これらの細胞系は、ＴＮＦα応答性プロモーターに結合された分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子でトランスフェクトされたＨＥＫ－２９３細胞である（Gregory et al., Nature 488(7412):508-511, 2012；Idress et al., Molecules 25:922, 2020）。さらに、抗ＴＧＦ－β結合タンパク質は、ＳＥＡＰの発現を駆動するためのＴＧＦ－β応答性エレメントを含有する、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能な類似のレポーター細胞系を使用して、活性の中和について評価され得る。このレポーター系の使用は、van Noort et al. (Cancer Res. 74:5690-5699, 2014)によって記載されている。類似のレポーター遺伝子アッセイが、Lallemand et al. (J. Immunol. Methods 373:229-239, 2011)によって、ＴＮＦαアンタゴニストについて報告されている。この研究は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子に結合されたＴＮＦα応答エレメントを取り込むレポーター構築物でトランスフェクトされたヒト赤白血病Ｋ５６２細胞を利用した。ＴＮＦαは、レポーター細胞系とのインキュベーションの前に３０分間、潜在的アンタゴニストと事前混合された。残留ＴＮＦα活性は、ＴＮＦα単独の標準曲線と比較して定量化された。

【0203】

本開示に従う使用のための天然に存在するポリペプチドセグメント（例えば、天然に存在するパラオキソナーゼ、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅまたはＳＯＤ１）には、本開示と矛盾しない天然に存在するバリアント、例えば、対立遺伝子バリアントおよび種間ホモログなどが含まれる。

【0204】

特定の参照ポリペプチド（例えば、配列番号４の残基１６～３５５もしくは２６～３５５に示される野生型ヒトパラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）、配列番号１６の残基２３～２８２に示される野生型ＤＮａｓｅ１、または配列番号１８の残基２１～２８０に示される増強されたＤＮａｓｅ１）の機能的バリアントは、一般に、参照ポリペプチドと比較して、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または付加を有すると特徴付けられる。これらの変化は、好ましくは、軽微なものである、即ち、保存的アミノ酸置換（例えば、いくつかの例示的な保存的アミノ酸置換を列挙する以下の表１を参照されたい）、およびタンパク質またはポリペプチドのフォールディングにも活性にも顕著には影響を与えない他の置換；典型的には１～約３０アミノ酸の小さい欠失；ならびに小さいアミノ末端伸長またはカルボキシル末端伸長である。保存的置換は、以下からも選択され得る：１）アラニン、グリシン；２）アスパラギン酸、グルタミン酸；３）アスパラギン、グルタミン；４）アルギニン、リシン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン；６）フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；７）セリン、スレオニン；および８）システイン、メチオニン（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい）。
表1: 保存的アミノ酸置換

【表1】

【0205】

天然に存在するポリペプチド中の重要なアミノ酸は、当該分野で公知の手順、例えば、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発に従って同定され得る（Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085, 1989；Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4498-4502, 1991）。後者の技法では、単一のアラニン突然変異が、分子中の全ての残基において導入され、得られた突然変異体分子は、分子の活性にとって重要なアミノ酸残基を同定するために、生物活性（例えば、ＰＯＮ１バリアントについてはホスホトリエステラーゼもしくはアリールエステラーゼ活性、またはＤＮａｓｅ１バリアントについてはヌクレアーゼ活性）について試験される。さらに、関連するタンパク質相互作用の部位は、核磁気共鳴、結晶学または光親和性標識などの技法によって決定される結晶構造の分析によって決定され得る。重要なアミノ酸の正体は、関連するタンパク質（例えば、同じタンパク質機能を保持する種オルソログ）との相同性の分析からも推論され得る。

【0206】

複数のアミノ酸置換が、Reidhaar-Olson and Sauer Science 241:53-57, 1988またはBowie and Sauer Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989によって開示されるものなどの、突然変異誘発およびスクリーニングの公知の方法を使用して、なされ試験され得る。簡潔に述べると、これらの著者は、ポリペプチド中の２つまたはそれよりも多くの位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドについて選択し、次いで、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定して、各位置において許容される置換の範囲を決定するための方法を開示している。使用され得る別の方法は、領域特異的突然変異誘発である（Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986；Ner et al., DNA 7:127, 1988）。

【0207】

バリアントヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、ＤＮＡシャッフリングを介して生成することもできる（例えば、Stemmer, Nature 370:389, 1994；Stemmer, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:10747, 1994；国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２００７８を参照されたい）。簡潔に述べると、バリアントＤＮＡ分子は、ランダムに導入された点突然変異を生じる、親ＤＮＡのランダム断片化とその後のＰＣＲを使用する再アセンブリとによるｉｎ ｖｉｔｒｏ相同組換えによって生成される。この技法は、プロセスに追加の変動性を導入するために、親ＤＮＡ分子のファミリー、例えば、対立遺伝子バリアント、または異なる種由来のＤＮＡ分子を使用することによって改変され得る。所望の活性についての選択またはスクリーニングと、その後の、突然変異誘発およびアッセイの追加の反復とは、有害な変化に対して同時に選択しつつ、望ましい突然変異について選択することによって、配列の迅速な「進化」を提供する。

【0208】

以前に議論したように、本発明に従うポリペプチド融合物は、特定のポリペプチドの「機能的断片」に対応するポリペプチドセグメントを含み得る。核酸分子の慣用的な欠失分析が、所与のポリペプチドをコードする核酸分子の機能的断片を得るために実施され得る。実例として、残基４６～１０９９のヌクレオチド配列を有するＰＯＮ１コードＤＮＡ分子は、一連の入れ子型欠失を得るために、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼで消化され得る。次いで、断片は、適切なリーディングフレームで発現ベクター中に挿入され、発現されたポリペプチドは、単離され、ヌクレアーゼ活性について試験される。エキソヌクレアーゼ消化に対する１つの代替法は、所望の断片の産生を特定するための欠失または停止コドンを導入するために、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使用することである。あるいは、ポリペプチドをコードする遺伝子の特定の断片が、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して合成され得る。

【0209】

したがって、上で議論したような方法を使用して、当業者は、（ｉ）参照ポリペプチド（例えば、配列番号６の残基１６～３５５もしくは２６～３５５に示されるＰＯＮ１、配列番号１６の残基２３～２８２に示されるヒト野生型ＤＮａｓｅ１、または配列番号１８の残基２１～２８０に示される増強されたＤＮａｓｅ１）と実質的に同一であり、かつ（ｉｉ）参照ポリペプチドの所望の機能的特性を保持する、種々のポリペプチドを調製することができる。

【0210】

本発明内で使用されるポリペプチドセグメント（例えば、パラオキソナーゼ、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、またはダイマー化ドメインもしくはＦｃＲｎ結合ドメイン、例えば、Ｆｃ断片などに対応するポリペプチドセグメント）は、種々の種から得られ得る。タンパク質がヒトにおいて治療用に使用される場合、ヒトポリペプチド配列が使用されることが好ましい。しかし、非ヒト配列が、バリアント配列と同様、使用され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断使用および獣医使用が含まれる他の使用のために、ヒトまたは非ヒト動物由来のポリペプチド配列が使用され得るが、分子間反応の種特異性が存在する場合には、患者と同じ種由来の配列が、ｉｎ ｖｉｖｏ獣医使用のため、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ使用のために、好ましい場合がある。したがって、本発明内での使用のためのポリペプチドセグメントは、限定なしに、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギ類および鳥類ポリペプチド、ならびにそれらのバリアントであり得る。

【0211】

一部の実施形態では、パラオキソナーゼセグメントは、ヒトパラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）またはその機能的バリアントもしくは断片である。例えば、一部の実施形態では、パラオキソナーゼは、（ａ）配列番号６、配列番号８または配列番号４のアミノ酸残基１６～３５５または２６～３５５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有し、かつ（ｂ）配列番号６の残基１～１５（配列番号８または配列番号４の残基１～１５としても示される）に対応するアミノ末端リーダー配列を含有しない。一部のかかる実施形態では、生物学的に活性なパラオキソナーゼは、配列番号６、配列番号８または配列番号４のアミノ酸残基１６～３５５、１７～３５５、１８～３５５、１９～３５５、２０～３５５、２１～３５５、２２～３５５、２３～３５５、２４～３５５、２５～３５５または２６～３５５と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する。

【0212】

上記ＰＯＮ１またはその機能的バリアントもしくは断片の一部の変形形態では、ヒトパラオキソナーゼ１ Ｑ１９２アイソフォーム（ＰＯＮ１－Ｑ１９２；配列番号４）のＱ１９２に対応する位置におけるアミノ酸は、リシンまたはアルギニンである。他の相互に排他的でない変形形態では、パラオキソナーゼは、ｈＰＯＮ１－Ｑ１９２と比較して、以下のアミノ酸置換のうち少なくとも１つを含有する：（ｉ）１８Ｒに対応する位置におけるアスパラギン酸；（ｉｉ）Ｎ１９に対応する位置におけるアルギニンまたはグリシン；（ｉｉｉ）Ｈ２０に対応する位置におけるグルタミン；（ｉｖ）Ｑ２１に対応する位置におけるリシン；（ｖ）Ｙ２４に対応する位置におけるグルタミン酸またはフェニルアラニン；（ｖｉ）Ｌ２８に対応するアミノ酸におけるフェニルアラニン；（ｖｉｉ）Ａ３０に対応する位置におけるバリン；（ｖｉｉｉ）Ｌ３１に対応する位置におけるヒスチジン；（ｉｘ）Ｑ３５に対応する位置におけるスレオニン；（ｘ）Ｉ４８に対応する位置におけるバリン；（ｘｉ）Ｅ４９に対応する位置におけるアスパラギン酸；（ｘｉｉ）Ｔ５０に対応する位置におけるアスパラギン；（ｘｉｉｉ）Ｍ５５に対応する位置におけるロイシンまたはイソロイシン；（ｘｉｖ）Ｌ６９に対応する位置におけるバリン；（ｘｖ）Ｋ７５に対応する位置におけるメチオニン；（ｘｖｉ）Ｎ７８に対応する位置におけるアスパラギン酸；（ｘｖｉｉ）Ｎ８０に対応する位置におけるアスパラギン酸；（ｘｖｉｉｉ）Ｓ８１に対応する位置におけるリシン；（ｘｉｘ）Ｐ８２に対応する位置におけるセリン；（ｘｘ）Ｔ９６に対応する位置におけるバリン；（ｘｘｉ）Ｌ９８に対応する位置におけるセリン；（ｘｘｉｉ）Ｇ１０１に対応する位置におけるグルタミン酸；（ｘｘｉｉｉ）Ｓ１０５に対応する位置におけるアスパラギン；（ｘｘｉｖ）Ｋ１０６に対応する位置におけるスレオニン；（ｘｘｖ）Ｆ１０７に対応する位置におけるロイシン；（ｘｘｖｉ）Ｖ１０９に対応する位置におけるイソロイシン；（ｘｘｖｉｉ）Ｓ１１１に対応する位置におけるスレオニン；（ｘｘｖｉｉｉ）Ｈ１１５に対応する位置におけるトリプトファンまたはアラニン；（ｘｘｉｘ）Ａ１２６に対応する位置におけるスレオニン；（ｘｘｘ）Ｍ１２７に対応する位置におけるバリン；（ｘｘｘｉ）Ｈ１３４に対応する位置におけるアルギニン；（ｘｘｘｉｉ）Ｄ１３６に対応する位置におけるグルタミン；（ｘｘｘｉｉｉ）Ａ１３７に対応する位置におけるセリン；（ｘｘｘｉｖ）Ｋ１３８に対応する位置におけるセリン；（ｘｘｘｖ）Ｌ１４３に対応する位置におけるバリン；（ｘｘｘｖｉ）Ｎ１６６に対応する位置におけるセリン；（ｘｘｘｖｉｉ）Ｌ１６７に対応する位置におけるバリン；（ｘｘｘｖｉｉｉ）Ｇ１８０に対応する位置におけるアラニン；（ｘｘｘｉｘ）Ｙ１８５に対応する位置におけるグルタミン酸；（ｘｌ）Ｆ１８６に対応する位置におけるグルタミン；（ｘｌｉ）Ｌ１８７に対応する位置におけるリシンまたはアラニン；（ｘｌｉｉ）Ｙ１９０に対応する位置におけるリシン；（ｘｘｌｉｉｉ）Ｌ１９１に対応する位置におけるグルタミン；（ｘｌｉｖ）Ｑ１９２に対応する位置におけるリシン；（ｘｌｖ）Ｗ１９４に対応する位置におけるリシン；（ｘｌｖｉ）Ｙ１９７に対応する位置におけるヒスチジン；（ｘｌｖｉｉ）Ｌ１９８に対応する位置におけるグルタミン酸；（ｘｌｖｉｉｉ）Ｌ２００に対応する位置におけるグルタミン；（ｘｌｉｘ）Ｗ２０２に対応する位置におけるリシン；（ｌ）Ｙ２０４に対応する位置におけるフェニルアラニン；（ｌｉ）Ｖ２０６に対応する位置におけるスレオニン；（ｌｉｉ）Ｓ２１１に対応する位置におけるアスパラギン；（ｌｉｉｉ）Ｅ２１２に対応する位置におけるアスパラギン酸；（ｌｉｖ）Ｆ２２２に対応する位置におけるセリンまたはメチオニン；（ｌｖ）Ｎ２６５に対応する位置におけるアスパラギン酸；（ｌｖｉ）Ｅ２７６に対応する位置におけるバリン；（ｌｖｉｉ）Ｍ２８９に対応する位置におけるグルタミン；（ｌｖｉｉｉ）Ｉ２９１に対応する位置におけるロイシン；（ｌｉｘ）Ｆ２９３に対応する位置におけるグルタミン酸またはチロシン；（ｌｘ）Ｓ２９６に対応する位置におけるプロリン；（ｌｘｉ）Ｅ２９７に対応する位置におけるリシン；（ｌｘｉｉ）Ａ３０１に対応する位置におけるグリシン；（ｌｘｉｉｉ）Ｎ３０９に対応する位置におけるアスパラギン酸；（ｌｘｉｖ）Ｔ３１２に対応する位置におけるセリン；（ｌｘｖ）Ｑ３１９に対応する位置におけるバリン；（ｌｘｖｉ）Ｔ３３２に対応する位置におけるセリン；およびＳ３３５に対応する位置におけるアラニン。

【0213】

一部の変形形態では、パラオキソナーゼは、Ｇ３Ｃ９として同定されるヒトＰＯＮ１のバリアント（Aharoni et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:482-487, 2004；Harel et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 11:412-419, 2004；Mukherjee and Gupta, J. Toxicol. 2020:1-16, 2020；Goldsmit et al., Chemistry and Biology 19:456-466, 2012）、またはその機能的バリアントもしくは断片である。ＧＣ３９は、ヒトアイソフォームからの５５個のアミノ酸置換を含み、神経剤に対する触媒活性を改善し、細菌における可溶性発現を改善する。このパラオキソナーゼ配列バリアントの全長形態は、配列番号１２３（ヌクレオチド）および配列番号１２４（アミノ酸）に列挙される。一部の実施形態では、本発明に従う使用のためのＧＣ３９パラオキソナーゼまたはその機能的バリアントは、配列番号１２４のアミノ酸残基１６～３５５または２６～３５５と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する；一部のかかる実施形態では、ＧＣ３９パラオキソナーゼまたはその機能的バリアントは、配列番号１２４のアミノ酸残基１６～３５５、１７～３５５、１８～３５５、１９～３５５、２０～３５５、２１～３５５、２２～３５５、２３～３５５、２４～３５５、２５～３５５または２６～３５５と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する。Ｇ３Ｃ９またはその活性なバリアント（例えば、以下で議論されるＭ－ＩＩＧ１）を含むＰＯＮ１融合物は、一部の短期治療適用、例えば、硫黄マスタードガスへの曝露または有機リンへの曝露の処置などにおいて特に有用であり得る。

【0214】

上記融合ポリペプチドの一部の実施形態では、パラオキソナーゼは、ＩＩＧ１（本明細書でＭ－ＩＩＧ１とも呼ばれる；Goldsmith et al., Chemistry & Biology 19, 456-466, 2012を参照されたい）として同定されるＧＣ３９の改変されたもしくはさらなるバリアント形態、またはその機能的バリアントもしくは断片である。Ｍ－ＩＩＧ１の全長配列は、配列番号１２５（ヌクレオチド）および配列番号１２６（アミノ酸）に示される。一部の実施形態では、本発明に従う使用のためのＭ－ＩＩＧ１パラオキソナーゼまたはその機能的バリアントは、配列番号１２６のアミノ酸残基１６～３５５または２６～３５５と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する；一部のかかる実施形態では、Ｍ－ＩＩＧ１パラオキソナーゼまたはその機能的バリアントは、配列番号１２６のアミノ酸残基１６～３５５、１７～３５５、１８～３５５、１９～３５５、２０～３５５、２１～３５５、２２～３５５、２３～３５５、２４～３５５、２５～３５５または２６～３５５と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する。

【0215】

より具体的な変形形態では、パラオキソナーゼは、（ｉ）配列番号６の残基１６～３５５、（ｉｉ）配列番号６の残基１７～３５５、（ｉｉｉ）配列番号６の残基１８～３５５、（ｉｖ）配列番号６の残基１９～３５５、（ｖ）配列番号６の残基２０～３５５、（ｖｉ）配列番号６の残基２１～３５５、（ｖｉｉ）配列番号６の残基２２～３５５、（ｖｉｉｉ）配列番号６の残基２３～３５５、（ｉｘ）配列番号６の残基２４～３５５、（ｘ）配列番号６の残基２５～３５５、および（ｘｉ）配列番号６の残基２６～３５５から選択されるアミノ酸配列（即ち、配列番号６の残基ｎ～３５５から選択されたアミノ酸配列であって、ｎは、端点を含めた１６～２６の整数である）を有する。他の変形形態では、パラオキソナーゼは、（ｉ）配列番号８の残基１６～３５５、（ｉｉ）配列番号８の残基１７～３５５、（ｉｉｉ）配列番号８の残基１８～３５５、（ｉｖ）配列番号８の残基１９～３５５、（ｖ）配列番号８の残基２０～３５５、（ｖｉ）配列番号８の残基２１～３５５、（ｖｉｉ）配列番号８の残基２２～３５５、（ｖｉｉｉ）配列番号８の残基２３～３５５、（ｉｘ）配列番号８の残基２４～３５５、（ｘ）配列番号８の残基２５～３５５、および（ｘｉ）配列番号８の残基２６～３５５から選択されるアミノ酸配列（即ち、配列番号８の残基ｎ～３５５から選択されるアミノ酸配列であって、ｎは、端点を含めた１６～２６の整数である）を有する。なお他の変形形態では、パラオキソナーゼは、（ｉ）配列番号４の残基１６～３５５、（ｉｉ）配列番号４の残基１７～３５５、（ｉｉｉ）配列番号４の残基１８～３５５、（ｉｖ）配列番号４の残基１９～３５５、（ｖ）配列番号４の残基２０～３５５、（ｖｉ）配列番号４の残基２１～３５５、（ｖｉｉ）配列番号４の残基２２～３５５、（ｖｉｉｉ）配列番号４の残基２３～３５５、（ｉｘ）配列番号４の残基２４～３５５、（ｘ）配列番号４の残基２５～３５５、および（ｘｉ）配列番号４の残基２６～３５５から選択されるアミノ酸配列（即ち、配列番号４の残基ｎ～３５５から選択されるアミノ酸配列であって、ｎは、端点を含めた１６～２６の整数である）を有する。なお他の変形形態では、パラオキソナーゼは、（ｉ）配列番号１２４の残基１６～３５５、（ｉｉ）配列番号１２４の残基１７～３５５、（ｉｉｉ）配列番号１２４の残基１８～３５５、（ｉｖ）配列番号１２４の残基１９～３５５、（ｖ）配列番号１２４の残基２０～３５５、（ｖｉ）配列番号１２４の残基２１～３５５、（ｖｉｉ）配列番号１２４の残基２２～３５５、（ｖｉｉｉ）配列番号１２４の残基２３～３５５、（ｉｘ）配列番号１２４の残基２４～３５５、（ｘ）配列番号１２４の残基２５～３５５、および（ｘｉ）配列番号１２４の残基２６～３５５から選択されるアミノ酸配列（即ち、配列番号１２４の残基ｎ～３５５から選択されるアミノ酸配列であって、ｎは、端点を含めた１６～２６の整数である）を有する。さらに他の変形形態では、パラオキソナーゼは、（ｉ）配列番号１２６の残基１６～３５５、（ｉｉ）配列番号１２６の残基１７～３５５、（ｉｉｉ）配列番号１２６の残基１８～３５５、（ｉｖ）配列番号１２６の残基１９～３５５、（ｖ）配列番号１２６の残基２０～３５５、（ｖｉ）配列番号１２６の残基２１～３５５、（ｖｉｉ）配列番号１２６の残基２２～３５５、（ｖｉｉｉ）配列番号１２６の残基２３～３５５、（ｉｘ）配列番号１２６の残基２４～３５５、（ｘ）配列番号１２６の残基２５～３５５、および（ｘｉ）配列番号１２６の残基２６～３５５から選択されるアミノ酸配列（即ち、配列番号１２６の残基ｎ～３５５から選択されるアミノ酸配列であって、ｎは、端点を含めた１６～２６の整数である）を有する。

【0216】

第１の生物学的に活性なポリペプチドとしてＤＮａｓｅを含む融合ポリペプチドの一部の実施形態では、ＤＮａｓｅは、ヒト野生型ＤＮａｓｅ１またはその機能的バリアントもしくは断片である。例えば、一部の実施形態では、ＤＮａｓｅは、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸残基２３～２８２、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸残基２１～２８０、（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸残基２１～２８０、または（ｉｖ）配列番号１５２のアミノ酸残基２１～２８０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より特定の実施形態では、ＤＮａｓｅは、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸残基２３～２８２、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸残基２１～２８０、（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸残基２１～２８０、または（ｉｖ）配列番号１５２のアミノ酸残基２１～２８０と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0217】

ある特定の好ましい実施形態では、ＤＮａｓｅセグメントは、天然に存在するＤＮａｓｅ１の機能亢進型かつ／またはアクチン抵抗性バリアント（「増強されたＤＮａｓｅ１」）、例えば、増強されたヒトＤＮａｓｅ１バリアントなどである。例えば、一部の変形形態では、ＤＮａｓｅは、Ｎ７４、Ｇ１０５およびＡ１１４から選択される成熟野生型ヒトＤＮａｓｅ１（配列番号１２０）のアミノ酸に対応する位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有し、（１）ヒトＤＮａｓｅ１のＮ７４に対応する位置におけるアミノ酸置換（Ｎ７４置換）は、存在する場合には、ヒトＤＮａｓｅ１と比較してＤＮａｓｅのＤＮＡ結合を増加させ、（２）ヒトＤＮａｓｅ１のＧ１０５に対応する位置におけるアミノ酸置換（Ｇ１０５置換）は、存在する場合には、ヒトＤＮａｓｅ１と比較してＤＮａｓｅのＤＮＡ結合を増加させ、かつ（３）ヒトＤＮａｓｅ１のＡ１１４に対応する位置におけるアミノ酸置換（Ａ１１４置換）は、存在する場合には、ヒトＤＮａｓｅ１と比較して、ＤＮａｓｅのエンドヌクレアーゼ活性のＧ－アクチン誘導性阻害を減少させる。これらの位置における置換に適切なアミノ酸には、ヒトＤＮａｓｅ１のＮ７４に対応する位置におけるリシン、ヒトＤＮａｓｅ１のＧ１０５に対応する位置におけるアルギニン、および／またはヒトＤＮａｓｅ１のＡ１１４に対応する位置におけるフェニルアラニンが含まれる。一部の変形形態では、上記増強されたヒトＤＮａｓｅ１バリアントは、Ｎ７４置換、Ｇ１０５置換およびＡ１１４置換のうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも、ヒトＤＮａｓｅ１のＮ７４およびＧ１０５の両方またはＧ１０５およびＡ１１４の両方に対応する位置における置換）を含有する。一部の実施形態では、増強されたヒトＤＮａｓｅ１は、Ｎ７４置換、Ｇ１０５置換およびＡ１１４置換の各々を含有する。他の変形形態では、増強されたヒトＤＮａｓｅ１は、Ｎ７４置換およびＧ１０５置換を含有するが、Ａ１１４置換は含有しない。ある特定の実施形態では、増強されたＤＮａｓｅ１は、（ｉ）配列番号１８のアミノ酸残基２１～２８０、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸残基２１～２８０、または（ｉｉｉ）配列番号１５２の残基２１～２８０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の変形形態では、増強されたＤＮａｓｅ１は、配列番号１８のアミノ酸残基２１～２８０と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、増強されたＤＮａｓｅ１は、Ｎ７４置換、Ｇ１０５置換およびＡ１１４置換の各々を含有するが、ヒトＤＮａｓｅ１と比較してＤＮａｓｅのＤＮＡ結合を増加させる任意の他のアミノ酸置換を含有しない、かつ／またはヒトＤＮａｓｅ１と比較して、ＤＮａｓｅのエンドヌクレアーゼ活性のＧ－アクチン誘導性阻害を減少させる任意の他のアミノ酸置換を含有しない。他の変形形態では、増強されたＤＮａｓｅ１は、配列番号１５２のアミノ酸残基２１～２８０と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、増強されたＤＮａｓｅ１は、Ｎ７４置換およびＧ１０５置換の各々を含有するが、ヒトＤＮａｓｅ１と比較してＤＮａｓｅのＤＮＡ結合を増加させる任意の他のアミノ酸置換を含有しない、かつ／またはＡ１１４置換、もしくはヒトＤＮａｓｅ１と比較して、ＤＮａｓｅのエンドヌクレアーゼ活性のＧ－アクチン誘導性阻害を減少させる任意の他のアミノ酸置換を含有しない。アクチン抵抗性を欠如する増強されたＤＮａｓｅを含む融合物は、融合分子のより高い発現を可能にするために、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ）に対する毒性を減少させるために特に有益である。

【0218】

第１の生物学的に活性なポリペプチドとしてＤＮａｓｅを含む融合ポリペプチドの他の実施形態では、ＤＮａｓｅは、カルボキシル末端核局在化シグナル（本明細書ではＮＬＳ２と呼ばれ、配列番号１３６のアミノ酸残基２９１～３０５に対応する）が欠失している短縮化形態のヒト野生型ＤＮａｓｅ１Ｌ３、またはそのような短縮化形態のヒトＤＮａｓｅ１Ｌ３の機能的バリアントもしくは断片である。例えば、一部の実施形態では、ＤＮａｓｅは、（ｉ）配列番号１３６のアミノ酸残基２１～２９０、（ｉｉ）配列番号１３８のアミノ酸残基２１～２９０、または（ｉｉｉ）配列番号１４０のアミノ酸残基２１～２９０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より特定の実施形態では、ＤＮａｓｅは、（ｉ）配列番号１３６のアミノ酸残基２１～２９０、（ｉｉ）配列番号１３８のアミノ酸残基２１～２９０、または（ｉｉｉ）配列番号１４０のアミノ酸残基２１～２９０と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。短縮化形態のヒトＤＮａｓｅ１Ｌ３またはその機能的バリアントを含む、ある特定の好ましい実施形態では、ＤＮａｓｅは、野生型ヒトＤＮａｓｅ１Ｌ３（配列番号１３６）と比較して、分子のＮ末端の半分における核局在化シグナル（本明細書ではＮＬＳ１と呼ばれ、配列番号１３６のアミノ酸残基８０～９６に対応する）を不活性化する１つまたは複数のアミノ酸置換を含有する、バリアントＤＮａｓｅ１Ｌ３であり、一部のそのような実施形態では、配列番号１３６のＲ８０、Ｒ９５およびＮ９６に対応する位置のアミノ酸の各々は、アラニンまたはセリンである（例えば、Ｒ８０、Ｒ９５およびＮ９６の各々がアラニンである、またはＲ８０、Ｒ９５およびＮ９６の各々がセリンである）。野生型ＮＬＳ１コンセンサス配列が除去されている上記の短縮化形態のＤＮａｓｅ１Ｌ３であるバリアントのより特異的な実施形態では、ＤＮａｓｅは、（ｉ）配列番号１３８のアミノ酸残基２１～２９０または（ｉｉ）配列番号１４０のアミノ酸残基２１～２９０に示されるアミノ酸配列を有する。

【0219】

第１の生物学的に活性なポリペプチドとしてＲＮａｓｅを含む融合ポリペプチドの一部の実施形態では、ＲＮａｓｅは、ヒト野生型ＲＮａｓｅ１またはその機能的バリアントもしくは断片である。例えば、一部の実施形態では、ＲＮａｓｅは、配列番号２２のアミノ酸残基２９～１５６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より特定の変形形態では、ＲＮａｓｅは、配列番号２２のアミノ酸残基２９～１５６と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0220】

第１の生物学的に活性なポリペプチドとしてスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）を含む融合ポリペプチドの一部の実施形態では、ＳＯＤ１は、ヒト野生型ＳＯＤ１またはその機能的バリアントもしくは断片である。例えば、一部の実施形態では、ＳＯＤ１は、配列番号３２のアミノ酸残基２～１５４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より特定の変形形態では、ＳＯＤ１は、配列番号３２のアミノ酸残基２～１５４と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の変形形態では、ヒトＳＯＤ１（配列番号３２）のＣ７に対応する位置のアミノ酸は、システインではなく、および／またはヒトＳＯＤ１のＣ１１２に対応する位置のアミノ酸は、システインではなく、一部のそのような実施形態では、ヒトＳＯＤ１のＣ７に対応する位置のアミノ酸は、アラニンであり、および／またはヒトＳＯＤ１のＣ１１２に対応する位置のアミノ酸は、セリンである。より特異的な変形形態では、ＳＯＤ１は、Ｃ７位のアミノ酸がアラニンに変化しており、Ｃ１１２位のアミノ酸がセリンである、配列番号３２の残基２～１５４に示されるアミノ酸配列（配列番号５２の残基２３～１７５または配列番号５４の残基２３～１７５としても示される）を含む。

【0221】

第１の生物学的に活性なポリペプチドとしてＣＴＬＡ－４細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドの一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ヒト野生型ＣＴＬＡ－４細胞外ドメインまたはその機能的バリアントもしくは断片である。例えば、一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４細胞外ドメインは、配列番号６６のアミノ酸残基２１～１４４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より特定の変形形態では、ＣＴＬＡ－４細胞外ドメインは、配列番号６６のアミノ酸残基２１～１４４と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0222】

第１の生物学的に活性なポリペプチドとしてＣＤ４０細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドの一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ヒト野生型ＣＤ４０細胞外ドメインまたはその機能的バリアントもしくは断片である。例えば、一部の実施形態では、ＣＤ４０細胞外ドメインは、（ｉ）配列番号７４の残基２１～１８８、（ｉｉ）配列番号７８の残基２１～１８８、（ｉｉｉ）配列番号８２の残基２１～１８８、（ｉｖ）配列番号８６の残基２１～１８８、または（ｖ）配列番号９０の残基２１～１８８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より特定の実施形態では、ＣＤ４０細胞外ドメインは、（ｉ）配列番号７４の残基２１～１８８、（ｉｉ）配列番号７８の残基２１～１８８、（ｉｉｉ）配列番号８２の残基２１～１８８、（ｉｖ）配列番号８６の残基２１～１８８、または（ｖ）配列番号９０の残基２１～１８８と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0223】

ある特定の好ましい実施形態では、ＣＤ４０細胞外ドメインは、Ｅ６４、Ｋ８１、Ｐ８５およびＬ１２１から選択される野生型ヒトＣＤ４０（配列番号６８）のアミノ酸に対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含有し、この少なくとも１つのアミノ酸置換は、ヒトＣＤ４０と比較してＣＤ４０リガンド結合を増加させる。これらの位置における特に好適なアミノ酸置換は、ヒトＣＤ４０のＥ６４に対応する位置におけるチロシン、ヒトＣＤ４０のＫ８１に対応する位置におけるスレオニン、ヒスチジンもしくはセリン、ヒトＣＤ４０のＰ８５に対応する位置におけるチロシン、および／またはヒトＣＤ４０のＬ１２１に対応する位置におけるプロリンである。一部の変形形態では、ＣＤ４０細胞外ドメインは、ヒトＣＤ４０のＥ６４、Ｋ８１、Ｐ８５およびＬ１２１に対応する位置のうちの少なくとも２つ（例えば、少なくともヒトＣＤ４０のＫ８１およびＬ１２１に対応する位置に、置換、または少なくともヒトＣＤ４０のＥ６４、Ｋ８１およびＰ８５に対応する位置に、置換）を含有する。一部の実施形態では、ヒトＣＤ４０のＫ８１に対応する位置におけるアミノ酸は、スレオニン、ヒスチジンおよびセリンから選択される。他の実施形態では、ヒトＣＤ４０のＫ８１に対応する位置におけるアミノ酸は、ヒスチジンであり、ヒトＣＤ４０のＬ１２１に対応する位置におけるアミノ酸は、プロリンである。さらに他の実施形態では、ヒトＣＤ４０のＥ６４に対応する位置におけるアミノ酸は、チロシンであり、ヒトＣＤ４０のＫ８１に対応する位置におけるアミノ酸は、スレオニンであり、ヒトＣＤ４０のＰ８５に対応する位置におけるアミノ酸は、チロシンである。特異的な変形形態では、ＣＤ４０細胞外ドメインは、（ｉ）配列番号７４の残基２１～１８８、（ｉｉ）配列番号７８の残基２１～１８８、（ｉｉｉ）配列番号８２の残基２１～１８８、（ｉｖ）配列番号８６の残基２１～１８８、または（ｖ）配列番号９０の残基２１～１８８に示されるアミノ酸配列を含む。

【0224】

炎症性サイトカインに特異的に結合しそれを中和するポリペプチドを第１の生物学的に活性なポリペプチドとして含む融合ポリペプチドの一部の実施形態では、炎症性サイトカインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバー、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）スーパーファミリーのメンバー、インターロイキン、ケモカイン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、またはインターフェロンである。より特定の実施形態では、炎症性サイトカインは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－５（ＩＬ－５）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン－１１（ＩＬ－１１）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、インターロイキン－１７Ａ（ＩＬ－１７Ａ）、インターロイキン－１７Ｆ（ＩＬ－１７Ｆ）、インターロイキン－１α（ＩＬ－１α）、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン－３１（ＩＬ－３１）、インターロイキン－３３（ＩＬ－３３）、インターロイキン－３６α（ＩＬ－３６α）、インターロイキン－３６β（ＩＬ－３６β）、インターロイキンＩＬ－３６γ（ＩＬ－３６γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、およびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）からなる群から選択される。一部の変形形態では、炎症性サイトカインに特異的に結合しそれを中和するポリペプチドは、抗体である。一部の代替変形形態では、炎症性サイトカインに特異的に結合しそれを中和するポリペプチドは、代替足場タンパク質である。

【0225】

ＴＮＦαに特異的に結合しそれを中和するポリペプチド（「抗ＴＮＦαポリペプチド」）を含む融合ポリペプチドの、ある特定の実施形態では、抗ＴＮＦαポリペプチドは、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体アダリムマブと同じ重鎖および軽鎖可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）を有する抗体と、ＴＮＦαへの結合について競合する。アダリムマブＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号１０８および配列番号１１０にそれぞれ示される（重鎖および軽鎖可変領域についてのそれぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＬＱ９６１１８７およびＬＱ９６１１８６；国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４／１５９５７９も参照されたい）。

【0226】

ＴＧＦ－βに特異的に結合しそれを中和するポリペプチド（「抗ＴＧＦ－βポリペプチド」）を含む融合ポリペプチドの、ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦ－βポリペプチドは、抗ＴＧＦ－βモノクローナル抗体フレソリムマブと同じ重鎖および軽鎖可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）を有する抗体と、ＴＧＦ－βへの結合について競合する。フレソリムマブＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号１１２および配列番号１１４にそれぞれ示される（重鎖および軽鎖可変領域についてのそれぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＣ２３２８０３．１およびＪＣ２３２８０５；国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１３／０６５８６９も参照されたい）。

【0227】

アダリムマブまたはフレソリムマブのＶＨおよびＶＬドメインを有する抗体とそれぞれＴＮＦαまたはＴＧＦ－βへの結合について競合する結合タンパク質の能力は、試験ＴＮＦα結合タンパク質（例えば、抗体）もしくはその機能的結合断片が、アダリムマブのＶＨおよびＶＬドメインを有する（即ち、それぞれ配列番号１０８および配列番号１１０のＶＨおよびＶＬドメインを有する）参照抗体のＴＮＦαへの特異的結合を防止もしくは阻害するアッセイ、または試験ＴＮＦ－β結合タンパク質（例えば、抗体）もしくはその機能的結合断片が、フレソリムマブのＶＨおよびＶＬドメインを有する（即ち、それぞれ配列番号１１２および配列番号１１４のＶＨおよびＶＬドメインを有する）参照抗体のＴＮＦ－βへの特異的結合を防止もしくは阻害するアッセイによって決定され得る。典型的に、そのようなアッセイは、固体表面に結合した精製標的タンパク質またはその標的タンパク質を有する細胞、非標識試験タンパク質（即ち、ＴＮＦα結合もしくはＴＧＦ－β結合タンパク質、または候補ＴＮＦα結合もしくはＴＧＦ－β結合タンパク質）、および標識参照抗体の使用を含む。競合的阻害は、試験タンパク質の存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することにより測定される。通常、試験タンパク質は、過剰に存在する、および／または最初に結合できるようにされる。競合アッセイにより同定される可溶性ＴＮＦα結合またはＴＧＦ－β結合タンパク質（「競合ＴＮＦα結合またはＴＧＦ－β結合タンパク質」）としては、参照抗体により結合される同じエピトープに結合するタンパク質、参照抗体により結合されるエピトープとオーバーラップするエピトープに結合するタンパク質、および参照抗体により結合されるエピトープの、立体障害が生じるのに十分なほど近位にある、エピトープに結合するタンパク質が挙げられる。通常、競合ＴＮＦα結合またはＴＧＦ－β結合タンパク質（例えば、競合抗ＴＮＦαまたは抗ＴＧＦ－β抗体）が過剰に存在する場合、それは、ＴＮＦαまたはＴＧＦ－β標的タンパク質への参照抗体の特異的結合を少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％阻害することになり、一部の事例では、結合は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、またはそれより高度に阻害される。逆に言うと、参照抗体が結合される場合、それは、好ましくは、後で添加される競合ＴＮＦα結合またはＴＧＦ－β結合タンパク質（例えば、競合抗ＴＮＦαまたは抗ＴＧＦ－β抗体）の結合を少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％阻害することになり、一部の事例では、結合は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、またはそれより高度に阻害される。

【0228】

ある特定の好ましい実施形態では、本発明による使用のための炎症性サイトカインに特異的に結合しそれを中和するポリペプチドは、一本鎖抗体である。特に好適な一本鎖抗体としては、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）が挙げられる。一本鎖抗体は、例えば、所望の特異性を有する同定された無傷のネイティブモノクローナル抗体または抗体断片に由来し得る。モノクローナル抗体およびそれらの抗原結合性抗体断片を調製および単離するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、Current Protocols in Immunology, (Cooligan et al. eds., John Wiley and Sons, Inc. 2006)；Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, NY, 2nd ed. 1989)；およびMonoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (Hurrell ed., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982)を参照されたい。ｓｃＦｖをはじめとする抗原結合性断片を、例えば、当技術分野において公知の方法に従ってファージディスプレイライブラリーを使用して、調製することができる。当業者には明らかであるように、これらの方法は、本発明による使用のための炎症性サイトカインに対する抗体の産生に同様に応用できる。

【0229】

ネイティブ抗体可変領域のアミノ酸配列を、組換えＤＮＡ技法の適用によって変えることができる。したがって、抗体を、所望の特徴を得るために再設計することができる。典型的には、抗原結合特徴を改善するために、可変領域の安定性を改善するために、または免疫原性のリスクを低下させために、可変領域を変化させることになる。ファージディスプレイ技法を用いることもできる。例えば、Huse et al., Science 246:1275-1281, 1989；Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，５７１，６９８号を参照されたい。

【0230】

ヒトにおける使用のための治療用抗体については、公知の手順に従って抗体の非ヒト領域をヒト化することが、通常、望ましい。ヒト化抗体を作製する方法は、例えば、米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，８２１，３３７号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号において開示されている。ヒト化抗体を作製する方法は、例えば、米国特許第７，７３２，５７８号においても開示されている。典型的に、ヒト化抗炎症性サイトカイン抗体は、マウスドナー免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびにヒトアクセプター免疫グロブリンの重鎖および軽鎖フレームワークを含む。多くの場合、ヒトフレームヒトワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を変える、好ましくは改善する、ためにドナー抗体からの対応する残基で置換されることになる。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において周知の方法により、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲ残基とフレームワーク残基の相互作用のモデリング、および特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較により、同定される。Ｑｕｅｅｎら、米国特許５，５８５，０８９号；Riechmann et al., Nature 332:323, 1988を参照されたい。

【0231】

本発明は、完全ヒト抗体、例えば、ヒト抗体発現ライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）から選択されたもの；対応する内因性免疫グロブリン遺伝子座が不活性化されているヒト重鎖遺伝子座およびヒト軽鎖遺伝子座トランスジェニック非ヒト動物（例えば、マウス）において作製されたもの；または炎症性サイトカイン標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化することにより調製されたものなどの使用も、包含する。

【0232】

本発明による使用のための抗体は、例えば、５×１０^－４Ｍ未満、１０^－４Ｍ未満、５×１０^－５Ｍ未満、１０^－５Ｍ未満、５×１０^－６Ｍ未満、１０^－６Ｍ未満、５×１０^－７Ｍ未満、１０^－７Ｍ未満、５×１０^－８Ｍ未満、１０^－８Ｍ未満、５×１０^－９Ｍ未満、１０^－９Ｍ未満、５×１０^－１０Ｍ未満、１０^－１０Ｍ未満、５×１０^－１１Ｍ未満、１０^－１１Ｍ未満、５×１０^－１２Ｍ未満、１０^－１２Ｍ未満、５×１０^－１３Ｍ未満、１０^－１３Ｍ未満、５×１０^－１４Ｍ未満、１０^－１４Ｍ未満、５×１０^－１５Ｍ未満、または１０^－１５Ｍ未満である、解離定数（Ｋ_ｄ）を含む、結合親和性を有する。

【0233】

本発明による使用のための抗体は、参照抗体と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または付加を有するバリアントを含み、したがって、このバリアントは、参照抗体の１つまたは複数の生物学的特性を保持する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１０８および配列番号１１０にそれぞれ示される通りのＶＨおよび／またはＶＬ配列を有する参照抗ＴＮＦα中和抗体と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または付加を有するバリアントであり、したがって、この抗体は、ＴＮＦαに特異的に結合するおよびＴＮＦα活性を中和する参照抗体の能力を保持する。他の実施形態では、抗体は、配列番号１１２および配列番号１１４にそれぞれ示される通りのＶＨおよび／またはＶＬ配列を有する参照抗ＴＮＦ－β中和抗体と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または付加を有するバリアントであり、したがって、この抗体は、ＴＮＦ－βに特異的に結合するおよびＴＮＦ－β活性を中和する参照抗体の能力を保持する。当業者は、参照抗体と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または付加を有するバリアントを容易に産生することができる。遺伝学的（抑制、欠失、突然変異など）、化学的および酵素的技法を含む、これらのバリアントを得るための技法は、当業者に公知である。

【0234】

ＴＮＦαに特異的に結合しそれを中和する一本鎖抗体（「抗ＴＮＦα一本鎖抗体」）を含む上記の融合ポリペプチドの一部の実施形態では、抗ＴＮＦα一本鎖抗体は、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体アダリムマブの１つまたは複数のＣＤＲを含む。したがって、ある特定の変形形態では、抗ＴＮＦα一本鎖抗体は、アダリムマブＶＨドメイン（配列番号１０８）の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３領域のうちの少なくとも１つ）、および／またはアダリムマブＶＬドメイン（配列番号１１０）の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３領域のうちの少なくとも１つ）を含む。典型的な実施形態では、抗ＴＮＦα一本鎖抗体は、アダリムマブＶＨドメイン（配列番号１０８）の２つもしくは３つのＣＤＲ、および／またはアダリムマブＶＬドメイン（配列番号１１０）の２つもしくは３つのＣＤＲを有する。抗ＴＮＦα一本鎖抗体がアダリムマブＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲを有する、一部の変形形態では、抗体は、アダリムマブＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲをさらに含み、一部のそのような実施形態では、抗体は、アダリムマブの３つ全ての重鎖ＣＤＲおよび３つ全ての軽鎖ＣＤＲ（即ち、配列番号１０８のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３、ならびに配列番号１１０のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３）を有する。１つまたは複数のＣＤＲは、例えば、ＣＤＲのＣｈｏｔｈｉａ定義、Ｋａｂａｔ定義、ＡｂＭ定義、ＩＭＧＴデータベース定義、または接触定義に従って、定義され得る。ＣＤＲのＩＭＧＴデータベース定義によれば、アダリムマブのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３は、それぞれ、配列番号１０８の残基２６～３３、５０～５９、および９７～１１０に対応し、アダリムマブのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３は、それぞれ、配列番号１１０の残基２７～３２、５０～５２、および８９～９７に対応する。ＣＤＲのＫａｂａｔ定義によれば、アダリムマブのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３は、それぞれ、配列番号１０８の残基３１～３５、５０～６６、および９９～１１０に対応し、アダリムマブのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３は、それぞれ、配列番号１１０の残基２４～３４、５０～５６、および８９～９７に対応する。上記の抗ＴＮＦα一本鎖抗体の特定の変形形態では、一本鎖抗体は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク領域、またはヒト免疫グロブリンフレームワーク領域に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するそのバリアントを有する、ＶＨドメインおよび／もしくはＶＬドメインを含む。

【0235】

一部の実施形態では、抗ＴＮＦα一本鎖抗体は、（ａ）配列番号１０８のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である重鎖可変ドメイン、および／または（ｂ）配列番号１１０のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である軽鎖可変ドメインを含む。

【0236】

一部の実施形態では、本発明による使用のための抗ＴＮＦα一本鎖抗体は、重鎖ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｈ１_ＴＮＦα、ＣＤＲ－Ｈ２_ＴＮＦα、およびＣＤＲ－Ｈ３_ＴＮＦαを含み、ＶＨ ＣＤＲのこのセットは、アダリムマブＶＨドメイン（配列番号１０８）の参照ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３のセットと比較して１０またはそれより少ないアミノ酸置換を有する。他の相互に排他的でない実施形態では、抗ＴＮＦα一本鎖は、軽鎖ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｌ１_ＴＮＦα、ＣＤＲ－Ｌ２_ＴＮＦα、およびＣＤＲ－Ｌ３_ＴＮＦαを含み、ＶＬ ＣＤＲのこのセットは、アダリムマブＶＬドメイン（配列番号１１０）の参照ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３のセットと比較して１０またはそれより少ないアミノ酸置換を有する。ある特定の実施形態では、抗ＴＮＦα一本鎖抗体は、上記の重鎖および軽鎖ＣＤＲの両方のセットを含む。特に好適な抗ＴＮＦα一本鎖抗体は、ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｈ１_ＴＮＦα、ＣＤＲ－Ｈ２_ＴＮＦα、およびＣＤＲ－Ｈ３_ＴＮＦαを含む重鎖可変ドメインと、ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｌ１_ＴＮＦα、ＣＤＲ－Ｌ２_ＴＮＦα、およびＣＤＲ－Ｌ３_ＴＮＦαを含む軽鎖可変ドメインとを含み、重鎖ＣＤＲのこのセットは、アダリムマブのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３と比較して６つまたはそれより少ない、典型的には５つまたはそれより少ない、より典型的には４つまたはそれより少ない、最も典型的には３つまたはそれより少ないアミノ酸置換を有し、軽鎖ＣＤＲのこのセットは、アダリムマブのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３と比較して６つまたはそれより少ない、典型的には５つまたはそれより少ない、より典型的には４つまたはそれより少ない、最も典型的には３つまたはそれより少ないアミノ酸置換を有する。上記のＣＤＲは、例えば、ＣＤＲのＣｈｏｔｈｉａ定義、Ｋａｂａｔ定義、ＡｂＭ定義、ＩＭＧＴデータベース定義、または接触定義に従って、定義され得る。上記の抗ＴＮＦα抗体の特定の変形形態では、ＶＨおよびＶＬドメインの各々は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク領域、またはヒト免疫グロブリンフレームワーク領域に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するそのバリアントを有する。

【0237】

ＴＧＦ－βに特異的に結合しそれを中和する一本鎖抗体（「抗ＴＧＦ－β一本鎖抗体」）を含む上記の融合ポリペプチドの一部の実施形態では、抗ＴＧＦ－β一本鎖抗体は、抗ＴＧＦ－βモノクローナル抗体フレソリムマブの１つまたは複数ＣＤＲを含む。したがって、ある特定の変形形態では、抗ＴＧＦ－β一本鎖抗体は、フレソリムマブＶＨドメイン（配列番号１１２）の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３領域のうちの少なくとも１つ）、および／またはフレソリムマブＶＬドメイン（配列番号１１４）の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３領域のうちの少なくとも１つ）を含む。典型的な実施形態では、抗ＴＧＦ－β一本鎖抗体は、フレソリムマブＶＨドメイン（配列番号１１２）の２つもしくは３つのＣＤＲ、および／またはフレソリムマブＶＬドメイン（配列番号１１４）の２つもしくは３つのＣＤＲを有する。抗ＴＧＦ－β一本鎖抗体がフレソリムマブＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲを有する、一部の変形形態では、抗体は、フレソリムマブＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲをさらに含み、一部のそのような実施形態では、抗体は、フレソリムマブの３つ全ての重鎖ＣＤＲおよび３つ全ての軽鎖ＣＤＲ（即ち、配列番号１１２のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３、ならびに配列番号１１４のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３）を有する。１つまたは複数のＣＤＲは、例えば、ＣＤＲのＣｈｏｔｈｉａ定義、Ｋａｂａｔ定義、ＡｂＭ定義、ＩＭＧＴデータベース定義、または接触定義に従って、定義され得る。ＣＤＲのＫａｂａｔ定義によれば、フレソリムマブのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３は、それぞれ、配列番号１１２の残基３１～３５、５０～６６、および９９～１０６に対応し、フレソリムマブのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３は、それぞれ、配列番号１１４の残基２４～４０、５６～６２、および９５～１０２に対応する。上記の抗ＴＧＦ－β一本鎖抗体の特定の変形形態では、一本鎖抗体は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク領域、またはヒト免疫グロブリンフレームワーク領域に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するそのバリアントを有する、ＶＨドメインおよび／もしくはＶＬドメインを含む。

【0238】

一部の実施形態では、抗ＴＧＦ－β一本鎖抗体は、（ａ）配列番号１１２のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である重鎖可変ドメイン、および／または（ｂ）配列番号１１４のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である軽鎖可変ドメインを含む。

【0239】

一部の実施形態では、本発明による使用のための抗ＴＧＦ－β一本鎖抗体は、重鎖ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｈ１_{ＴＧＦ－β}、ＣＤＲ－Ｈ２_{ＴＧＦ－β}、およびＣＤＲ－Ｈ３_{ＴＧＦ－β}を含み、ＶＨ ＣＤＲのこのセットは、フレソリムマブＶＨドメイン（配列番号１１２）の参照ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３のセットと比較して１０またはそれより少ないアミノ酸置換を有する。他の相互に排他的でない実施形態では、抗ＴＧＦ－β一本鎖は、軽鎖ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｌ１_{ＴＧＦ－β}、ＣＤＲ－Ｌ２_{ＴＧＦ－β}、およびＣＤＲ－Ｌ３_{ＴＧＦ－β}を含み、ＶＬ ＣＤＲのこのセットは、フレソリムマブＶＬドメイン（配列番号１１４）の参照ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３のセットと比較して１０またはそれより少ないアミノ酸置換を有する。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦ－β一本鎖抗体は、上記の重鎖および軽鎖ＣＤＲの両方のセットを含む。特に好適な抗ＴＧＦ－β一本鎖抗体は、ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｈ１_{ＴＧＦ－β}、ＣＤＲ－Ｈ２_{ＴＧＦ－β}、およびＣＤＲ－Ｈ３_{ＴＧＦ－β}を含む重鎖可変ドメインと、ＣＤＲ ＣＤＲ－Ｌ１_{ＴＧＦ－β}、ＣＤＲ－Ｌ２_{ＴＧＦ－β}、およびＣＤＲ－Ｌ３_{ＴＧＦ－β}を含む軽鎖可変ドメインとを含み、重鎖ＣＤＲのこのセットは、フレソリムマブのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３と比較して６つまたはそれより少ない、典型的には５つまたはそれより少ない、より典型的には４つまたはそれより少ない、最も典型的には３つまたはそれより少ないアミノ酸置換を有し、軽鎖ＣＤＲのこのセットは、フレソリムマブのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３と比較して６つまたはそれより少ない、典型的には５つまたはそれより少ない、より典型的には４つまたはそれより少ない、最も典型的には３つまたはそれより少ないアミノ酸置換を有する。上記のＣＤＲは、例えば、ＣＤＲのＣｈｏｔｈｉａ定義、Ｋａｂａｔ定義、ＡｂＭ定義、ＩＭＧＴデータベース定義、または接触定義に従って、定義され得る。上記の抗ＴＧＦ－β抗体の特定の変形形態では、ＶＨおよびＶＬドメインの各々は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク領域、またはヒト免疫グロブリンフレームワーク領域に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するそのバリアントを有する。

【0240】

本発明による使用のための抗炎症性サイトカイン抗体は、親和性成熟実施形態を含む。親和性成熟抗体は、当技術分野において公知の手順により産生することができる（例えば、Marks et al., Bio/Technology 10:779-783, 1992；Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813, 1994；Schier et al., Gene 169:147-155, 1995；Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004, 1995；Jackson et al., J. Immunol. 154:3310-9, 1995；Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896, 1992；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２００４／０５８１８４を参照されたい）。抗体の親和性を調整するための１つの方法は、「ライブラリースキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。一般に、ライブラリースキャニング突然変異誘発は、次のように行われる。少なくとも１つのＣＤＲ内の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ内の）１つまたは複数のアミノ酸位置が、当技術分野において認知されている方法を使用して２個またはそれより多くの（例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の）アミノ酸に置き換えられる。これによって、２つまたはそれより多くのメンバーという複雑度（位置ごとに２個またはそれより多くのアミノ酸が置換される場合）を各々が有するクローンの小さいライブラリー（一部の実施形態では、分析されるアミノ酸位置ごとに１つ）が生成される。一般に、ライブラリーは、ネイティブ（非置換）アミノ酸を含むクローンも含む。各ライブラリーからの少数のクローン、例えば、約２０～８０クローン（ライブラリーの複雑度に依存して）が、標的ポリペプチド（または他の結合標的）に対する結合親和性についてスクリーニングされ、結合が増加される、同じである、減少される、または結合しない候補が、同定される。結合親和性は、例えば、約２倍のまたはそれより大きい結合親和性の差を検出するＢｉａｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴分析を使用して、決定され得る。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）は、出発抗体が、比較的高い親和性、例えば約１０ｎＭまたはそれより小さいＫ_Ｄ、で既に結合している場合、特に有用である。

【0241】

第１の生物学的に活性なポリペプチドとして抗ＴＮＦα一本鎖抗体を含む融合ポリペプチドの一部の実施形態では、抗ＴＮＦα一本鎖抗体は、（ｉ）配列番号９２のアミノ酸残基２１～２６８または（ｉｉ）配列番号９６のアミノ酸残基２１～２６８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より特定の変形形態では、抗ＴＮＦα一本鎖抗体は、（ｉ）配列番号９２のアミノ酸残基２１～２６８または（ｉｉ）配列番号９６のアミノ酸残基２１～２６８と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0242】

第１の生物学的に活性なポリペプチドとして抗ＴＧＦ－β一本鎖抗体を含む融合ポリペプチドの一部の実施形態では、抗ＴＧＦ－β一本鎖抗体は、（ｉ）配列番号１００のアミノ酸残基２１～２６９または（ｉｉ）配列番号１０４のアミノ酸残基２１～２６９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より特定の変形形態では、抗ＴＧＦ－β一本鎖抗体は、（ｉ）配列番号１００のアミノ酸残基２１～２６９または（ｉｉ）配列番号１０４のアミノ酸残基２１～２６９と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0243】

本発明による使用のためのポリペプチドリンカーは、天然に存在することがあり、合成であることがあり、または両方の組合せであることがある。リンカーは、２つの別々のポリペプチド領域（例えば、Ｆｃ領域とパラオキソナーゼ、またはＦｃ領域とＤＮａｓｅ）を結合し、連結されたポリペプチド領域を、より長いポリペプチドの別々の別個のドメインとして維持する。リンカーは、別々の別個のドメインが共働するが別々の特性を維持することを可能にし得る（例えば、パラオキソナーゼまたはＤＮａｓｅに連結されたＦｃ領域の場合、Ｆｃ領域に対するＦｃ受容体（例えば、ＦｃＲｎ）結合を維持することができ、その上、パラオキソナーゼの機能特性（例えば、有機ホスファターゼもしくはアリールエステラーゼ活性）またはＤＮａｓｅの機能特性（例えば、ＤＮＡ結合およびヌクレアーゼ活性）が維持されることになる）。異種ポリペプチドを接続するための天然に存在するペプチドリンカーおよび人工ペプチドリンカーの使用の例については、例えば、Hallewell et al., J. Biol. Chem. 264, 5260-5268, 1989；Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995；Robinson and Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996；Khandekar et al., J. Biol. Chem. 272, 32190-32197, 1997；Fares et al., Endocrinology 139, 2459-2464, 1998；Smallshaw et al., Protein Eng. 12, 623-630, 1999；米国特許第５，８５６，４５６号を参照されたい。

【0244】

典型的に、リンカーポリペプチド内の残基は、全体的に親水性の性質を提供するように、ならびに非免疫原性および可動性であるように、選択される。本明細書で使用される場合、「可動性」リンカーは、溶液中で実質的に安定な高次立体構造を欠いているものであるが、局所的安定領域は許容される。一般に、小さい、極性の、および親水性の残基が好ましく、嵩高い疎水性の残基は望ましくない。局所電荷のあるエリアは避けるべきである。リンカーポリペプチドが荷電残基を含む場合、それらの残基は、通常、そのポリペプチドの小領域内に正味の中性電荷を持たせるように位置することになる。したがって、荷電残基を反対の電荷の残基に隣接して配置することが好ましい。一般に、リンカーポリペプチドに含めるのに好ましい残基としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎが挙げられ、より好ましい残基としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＴｈｒが挙げられ、最も好ましい残基は、ＧｌｙおよびＳｅｒである。一般に、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＬｙｓおよびＡｒｇ残基は、避けられ（リンカーの免疫グロブリンヒンジ領域内に存在する場合を除いて）、Ｐｒｏ残基は、それらの疎水性、および可動性の欠如に起因して避けられ、ＬｙｓおよびＡｒｇ残基は、潜在的な免疫原性に起因して避けられることになる。リンカーの配列はまた、望ましくないタンパク質分解を避けるように設計されることになる。

【0245】

ある特定の実施形態では、リンカーＬ１は、少なくとも２個または少なくとも３個のアミノ酸残基（例えば、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１６個、少なくとも２６個、または少なくとも３６個のアミノ酸残基）を含む。特定の変形形態では、Ｌ１は、２～６０個のアミノ酸残基、３～６０個のアミノ酸残基、５～４０個のアミノ酸残基、または１５～４０個のアミノ酸残基からなる。他の変形形態では、Ｌ１は、２～５０個、２～４０個、２～３６個、２～３５個、２～３０個、２～２６個、３～５０個、３～４０個、３～３６個、３～３５個、３～３０個、３～２６個、５～６０個、５～５０個、５～４０個、５～３６個、５～３５個、５～３０個、５～２６個、１０～６０個、１０～５０個、１０～４０個、１０～３６個、１０～３５個、１０～３０個、１０～２６個、１５～６０個、１５～５０個、１５～３６個、１５～３５個、１５～３０個、または１５～２６個のアミノ酸残基からなる。他の変形形態では、Ｌ１は、１６～６０個、１６～５０個、１６～４０個、または１６～３６個のアミノ酸残基からなる。さらに他の変形形態では、Ｌ１は、２０～６０個、２０～５０個、２０～４０個、２０～３６個、２５～６０個、２５～５０個、２５～４０個、または２５～３６個のアミノ酸残基からなる。さらに他の変形形態では、Ｌ１は、２６～６０個、２６～５０個、２６～４０個、または２６～３６個のアミノ酸残基からなる。より特異的な変形形態では、Ｌ１は、１６個のアミノ酸残基、２１個のアミノ酸残基、２６個のアミノ酸残基、３１個のアミノ酸残基、または３６個のアミノ酸残基からなる。一部の実施形態では、Ｌ１は、残基配列番号１０に、配列番号１２または配列番号１４の残基２６８～２８８に示される、アミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0246】

第１の生物学的に活性なポリペプチドとしてＤＮａｓｅを含む融合ポリペプチドの典型的な変形形態では、Ｌ１は、存在し、少なくとも１５個のアミノ酸残基を含む。例えば、ＤＮａｓｅのカルボキシル末端を別の融合体成分（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域）のアミノ末端に結合するＬ１リンカーは、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、または少なくとも２６個のアミノ酸残基を含み得る。より特定の変形形態では、Ｌ１は、１５～６０個のアミノ酸残基、１５～５１個のアミノ酸残基、１５～５０個のアミノ酸残基、１５～４６個のアミノ酸残基、１５～４５個のアミノ酸残基、１５～４１個のアミノ酸残基、１５～４０個のアミノ酸残基、１５～３６個のアミノ酸残基、２６～６０個のアミノ酸残基、２６～５１個のアミノ酸残基、２６～５０個のアミノ酸残基、２６～４６個のアミノ酸残基、２６～４５個のアミノ酸残基、２６～４１個のアミノ酸残基、２６～４０個のアミノ酸残基、または２６～３６個のアミノ酸残基からなる。さらにより特異的な変形形態では、ＤＮａｓｅを連結するＬ１は、２６個のアミノ酸残基、２７個のアミノ酸残基、２８個のアミノ酸残基、２９個のアミノ酸残基、３０個のアミノ酸残基、３１個のアミノ酸残基、３２個のアミノ酸残基、３３個のアミノ酸残基、３４個のアミノ酸残基、３５個のアミノ酸残基、または３６個のアミノ酸残基からなる。一部の実施形態では、ＤＮａｓｅを連結するＬ１は、配列番号１２または配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0247】

第１の生物学的に活性なポリペプチドとしてＲＮａｓｅまたはＳＯＤ１を含む融合ポリペプチドの一部の変形形態では、Ｌ１は、存在し、少なくとも２個のアミノ酸残基を含む。例えば、ＲＮａｓｅまたはＳＯＤ１のカルボキシル末端を別の融合体成分（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域）のアミノ末端に結合するＬ１リンカーは、少なくとも３個、少なくとも５個、または少なくとも１０個のアミノ酸残基を含み得る。より特定の変形形態では、ＲＮａｓｅまたはＳＯＤ１を連結するＬ１は、２～６０個のアミノ酸残基、２～５１個のアミノ酸残基、２～５０個のアミノ酸残基、２～４６個のアミノ酸残基、２～４５個のアミノ酸残基、２～４１個のアミノ酸残基、２～４０個のアミノ酸残基、２～３６個のアミノ酸残基、１０～６０個のアミノ酸残基、１０～５１個のアミノ酸残基、１０～５０個のアミノ酸残基、１０～４６個のアミノ酸残基、１０～４５個のアミノ酸残基、１０～４１個のアミノ酸残基、１０～４０個のアミノ酸残基、または１０～３６個のアミノ酸残基からなる。より特異的な変形形態では、ＲＮａｓｅまたはＳＯＤ１を連結するＬ１は、１６または２６個のアミノ酸残基からなる。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅまたはＳＯＤ１を連結するＬ１は、配列番号１０または配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0248】

本明細書に記載の式Ｐ－Ｌ１－Ｘを含む融合ポリペプチドの一部の変形形態では、Ｌ１は、少なくとも２０個のアミノ酸残基を含む。例えば、パラオキソナーゼのカルボキシル末端を別の融合体成分（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域）のアミノ末端に結合するＬ１リンカーは、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、または少なくとも３６個のアミノ酸残基を含み得る。ある特定の変形形態では、Ｌ１は、２０～６０個のアミノ酸残基、２０～５０個のアミノ酸残基、２０～４５個のアミノ酸残基、２０～４０個のアミノ酸残基、２０～３６個のアミノ酸残基、２６～６０個のアミノ酸残基、２６～５０個のアミノ酸残基、２６～４５個のアミノ酸残基、２６～４０個のアミノ酸残基、２６～３６個のアミノ酸残基、３６～６０個のアミノ酸残基、３６～５０個のアミノ酸残基、３６～４５個のアミノ酸残基、または３６～４０個のアミノ酸残基からなる。一部の実施形態では、パラオキソナーゼのカルボキシル末端を連結するＬ１は、配列番号１２または配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0249】

例示的なＬ２リンカーは、少なくとも３個のアミノ酸残基を含み、典型的には最大で６０アミノ酸残基である。ある特定の変形形態では、Ｌ２リンカーは、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個のアミノ酸残基を含む。より特異的な変形形態では、Ｌ２は、６～３０個、６～２５個、６～２０個、７～３０個、７～２５個、７～２０個、８～３０個、８～２５個、８～２０個、９～３０個、９～２５個、９～２０個、１０～３０個、１０～２５個、１０～２０個、１１～３０個、１１～２５個、１１～２０個、１２～３０個、１２～２５個、または１２～２０個のアミノ酸残基からなる。一部の実施形態では、Ｌ２は、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0250】

ある特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、複数のグリシン残基を含む。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドリンカー（例えば、Ｌ１）は、複数のグリシン残基および必要に応じて少なくとも１個のセリン残基を含む。特定の変形形態では、ポリペプチドリンカー（例えば、Ｌ１）は、配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号２９）、例えば、配列番号２９のアミノ酸配列の２つまたはそれより多くのタンデムリピートなどを含む。一部の実施形態では、リンカーは、配列［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］_ｎ（［配列番号２９］_ｎ）を含み、ｎは、正の整数、例えば、２～８、２～７、２～６、３～８、３～７、３～６、４～８、４～７、または４～６の整数などである。式［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］_ｎを含むポリペプチドリンカーの特異的な変形形態では、ｎは４である。式［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］_ｎを含むポリペプチドリンカーの別の特異的な変形形態では、ｎは６である。式［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］_ｎを含むポリペプチドリンカーのさらに別の特異的な変形形態では、ｎは５である。ある特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ポリペプチドリンカーの２つの他の配列の間に挿入された（例えば、リンカーのＮ末端のＡｓｐ－Ｌｅｕ－ＳｅｒとリンカーのＣ末端のＴｈｒ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕとの間に挿入された）一連のグリシンおよびセリン残基（例えば、［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］_ｎ、式中、ｎは、上記の通り定義される）を含む。他の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ポリペプチドリンカーの別の配列の一方または両方の末端に結合されたグリシンおよびセリン残基（例えば、［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］_ｎ、式中、ｎは、上記の通り定義される）を含む。

【0251】

Ｘが存在する上記の融合ポリペプチドの一部の実施形態では、Ｘは、ダイマー化ドメインである。様々なダイマー化ドメインが、本明細書に記載されるようなある特定の融合ポリペプチド実施形態およびダイマー性融合タンパク質による使用に好適である。ダイマー化ドメインを含む融合ポリペプチドの、ある特定の実施形態では、ダイマー化ドメインは、免疫グロブリン重鎖定常領域である。免疫グロブリン重鎖定常領域は、ネイティブ配列定常領域であることがあり、またはバリアント定常領域であることがある。典型的な変形形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域は、ｉｎ ｖｉｖｏで融合ポリペプチドに改善された半減期をもたらすのに十分な親和性で新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合することができる。本発明による使用に特に好適な免疫グロブリン重鎖定常領域は、免疫グロブリンＦｃ領域である。一部の実施形態では、重鎖定常領域は、１つまたは複数のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能の一方または両方）を欠いている。

【0252】

免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合ポリペプチドの一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、野生型ヒトＩｇＧ配列と比較して、分子がグリコシル化されないためのアミノ酸置換をＣＨ２領域に有するヒトＩｇＧ Ｆｃ領域であり、このアミノ酸置換は、これに限定されないが、Ｎ２９７（ヒトＩｇＧ重鎖定常領域のＥｕ番号付け）（配列番号２６、配列番号２８、配列番号１１６または配列番号１１８のアミノ酸位置８２に対応する）におけるアミノ酸置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒンジ領域の３つのシステイン（Ｃ２２０、Ｃ２２６、Ｃ２２９）各々が非システイン残基（例えば、セリン）に変化しており、必要に応じてＣＨ２ドメインの２３８位におけるプロリンが非プロリン残基（例えば、セリンまたはアスパラギン酸）に変化している、ヒトＩｇＧ１（γ１）である。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、システインＣ２２０が非システイン残基（例えば、セリン）に変化しており、必要に応じてＣＨ２ドメインの２３８位におけるプロリンが非プロリン残基（例えば、セリンまたはアスパラギン酸）に変化している、ヒトγ１である。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｎ２９７が非アスパラギン残基（例えば、アラニン、グルタミンまたはグリシン）に変化している、ヒトγ１である。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｅｕ ２９２位～３００位の間に１つまたは複数のアミノ酸置換を有するヒトγ１である。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、残基２９２～３００の間の任意の位置に１つまたは複数のアミノ酸付加または欠失を有するヒトγ１である。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＳＣＣヒンジを有する（即ち、システインＣ２２０がセリンに変化しており、Ｅｕ ２２６および２２９位の各々にシステインがある）、またはＳＳＳヒンジを有する（即ち、Ｅｕ ２２０、２２６および２２９位における３個のシステインの各々がセリンに変化している）、ヒトγ１である。さらなる実施形態では、Ｆｃ領域は、ＳＣＣヒンジを有しかつＰ２３８にアミノ酸置換を有するヒトγ１である。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、半減期に重要なＦｃＲｎ結合に影響を与えることなくＦｃガンマ受容体（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）による結合を変更するアミノ酸置換を有するヒトγ１である。さらなる実施形態では、Ｆｃ領域は、Ehrhardt and Cooper, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2010 Aug. 3 (Immunoregulatory Roles for Fc Receptor-Like Molecules)；Davis et al., Ann. Rev. Immunol. 25:525-60, 2007 (Fc receptor-like molecules)；またはSwainson et al., J. Immunol. 184:3639-47, 2010において開示されているようなＦｃ領域である。

【0253】

一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、融合タンパク質の抗原非依存性エフェクター機能を変更するアミノ酸置換を含む。一部のそのような実施形態では、Ｆｃ領域は、結果として生じる分子の循環半減期を変更するアミノ酸置換を含む。そのようなＦｃバリアントは、これらの置換を欠いているＦｃ領域と比較してＦｃＲｎへの結合の増加または減少のいずれかを示し、したがって、結果として生じる分子の血清中での、それぞれ半減期の延長または短縮をもたらす。ＦｃＲｎに対する親和性が改善されたＦｃバリアントは、より長い血清中半減期を有すると予測され、このようなＦｃバリアントは、哺乳動物を処置する方法に、投与されたＦｃ融合体の長い半減期が所望される場合、および肺経由での循環血液への輸送の増加が所望される場合、有用に応用される。その一方で、ＦｃＲｎ結合親和性が低下したＦｃバリアントは、より短い半減期を有すると予想され、このようなバリアントも、例えば、哺乳動物への投与に、短縮された循環時間が有利であり得る場合（例えば、融合タンパク質が、長期間にわたって循環血液中に存在すると毒性副作用をもたらす場合）、有用である。ＮＥＴｏｓｉｓによって特徴付けられる状態の処置には、ＦｃＲｎ結合を変更することによるＤＮａｓｅ－Ｆｃ融合タンパク質の半減期の微調整が有用となり得るのは、ＮＥＴが、発病の一因となる一方で、ある特定の状況では有益でもあるからである。病原性ＮＥＴの消化は、それほど長い半減期を必要としない可能性があり、そのためＤＮａｓｅのより迅速なクリアランスによって好中球がそれらの保護的抗菌機能でＮＥＴを形成することができるようになる可能性がある。ＦｃＲｎ結合親和性が低下したＦｃバリアントは、胎盤を横断する可能性も低く、それ故、妊婦における疾患または障害の処置にも有用である。加えて、ＦｃＲｎ結合親和性の低下が所望され得る他の応用は、脳、腎臓および／または肝臓への局在化が所望される応用を含む。１つの例示的な実施形態では、本発明の融合分子は、血管系から腎臓糸球体の上皮を横断する輸送の低減を示す。別の実施形態では、本発明の融合分子は、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する脳から血管腔への輸送の低減を示す。一実施形態では、ＦｃＲｎ結合が変更された融合分子は、Ｆｃドメインの「ＦｃＲｎ結合ループ」内に１つまたは複数のアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。ＦｃＲｎ結合活性を変更する例示的なアミノ酸置換は、参照により本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０４７３２７において開示されている。ＦｃＲｎ結合活性を増加させる例示的なアミノ酸置換は、例えば、Wang et al., Protein Cell 9:63-73, 2018（例えば表１を参照されたい）によっても、記載されている。一部の実施形態では、ＦｃＲｎ結合活性が増加したＦｃバリアントは、Ｅｕ ２５２、２５４、および２５６位の各々にアミノ酸置換（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ）を有する。他の変形形態では、ＦｃＲｎ結合活性が増加したＦｃバリアントは、Ｅｕ ４２８および４３４位の各々にアミノ酸置換（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）を有する。

【0254】

他の実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、ポリペプチドの１つまたは複数の抗原依存性エフェクター機能、特に、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体活性化を、例えば野生型Ｆｃ領域と比較して、変更するアミノ酸置換を含む、Ｆｃバリアントを含む。例示的な実施形態では、そのような融合ポリペプチドは、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ、例えば、ＣＤ１６）への結合の変更を示す。そのような融合ポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比較してＦｃγＲへの結合の増加または減少どちらかを示し、従って、増強または低下したエフェクター機能をそれぞれ媒介する。ＦｃγＲに対する親和性が改善されたＦｃバリアントは、エフェクター機能を増強すると予想され、そのようなバリアントは、哺乳動物を処置する方法に、標的分子破壊が所望される場合、有用に応用される。その一方で、ＦｃγＲ結合親和性が低下したＦｃバリアントは、エフェクター機能を低下させると予想され、このような融合タンパク質も、例えば、標的細胞破壊が望ましくない状態の処置、例えば、正常な細胞が標的分子を発現し得る場合、または融合分子の慢性投与が望ましくない免疫系活性化をもたらす可能性がある場合に、有用である。一実施形態では、Ｆｃ領域を含む融合ポリペプチドは、野生型Ｆｃ領域を含むポリペプチドと比較して、オプソニン化、ファゴサイトーシス、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）またはエフェクター細胞モジュレーションからなる群から選択される、少なくとも１つの変更された抗原依存性エフェクター機能を示す。抗原依存性エフェクター機能が変更されたＦｃバリアントを含むＤＮａｓｅ融合分子の典型的な実施形態では、Ｆｃバリアントは、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して１つまたは複数の低下したエフェクター機能を有する。

【0255】

一実施形態では、Ｆｃ領域を含む融合ポリペプチドは、活性化ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＩ、ＦｃγＩＩａ、またはＦｃγＲＩＩＩａ）への結合の変更を示す。別の実施形態では、融合タンパク質は、阻害性ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩｂ）への結合親和性の変更を示す。ＦｃＲまたは補体結合活性を変更する例示的なアミノ酸置換は、参照により本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０６３８１５において開示されている。エフェクター機能が低下された例示的なＦｃバリアントは、例えば、Tam et al., Antibodies 6:12, 2017（ヒトＩｇＧ１（γ１）およびＩｇＧ４（γ４）のバリアントを記載している）；Wang et al., Protein Cell 9:63-73, 2018 (例えば、表１を参照されたい）；Lo et al., J. Biol. Chem. 292:3900-3908, 2017；Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184, 2000 によっても記載されている（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。抗原依存性エフェクター機能を低下させる好適なＦｃバリアントとしては、例えば、Ｅｕ ２３８位および／または３３１位にアミノ酸置換（例えば、Ｐ２３８Ｓおよび／またはＰ３３１ＳまたはＰ３３１Ａ）を有するバリアントが挙げられる。加えて、ヒトＦｃのＥｕ ２３４および２３５位におけるアミノ酸置換（例えば、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）は、ＦｃγＲ結合を低減させ、抗ＣＤ３ ｍＡｂに導入されたときにサイトカインストームを低減させることが示されており（例えば、Wang et al.、上掲を参照されたい）、Ｅｕ ３２９位におけるアミノ酸置換（例えば、Ｐ３２９Ａ）は、Ｃ１ｑ結合を低減させる点で非常に有効である（例えば、Lo et al.、上掲を参照されたい）。ＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能を除去するための他の例示的な手法は、ヒトＩｇＧ２（Ｅｕ １１８～２６０位）およびＩｇＧ４（Ｅｕ ２６１～４４７位）に由来するハイブリッドＦｃドメインを作製する手法、またはＩｇＧ４から選択されたアミノ酸置換を含有するようにヒトＩｇＧ２を改変する手法である。Wang et al.、上掲を参照されたい。

【0256】

Ｆｃ領域を含む融合ポリペプチドは、Ｆｃ領域のグリコシル化を変更するアミノ酸置換も含み得る。例えば、融合タンパク質のＦｃドメインは、グリコシル化（例えば、Ｎ連結型もしくはＯ連結型グリコシル化）の低減につながる突然変異を有することがあり、または野生型Ｆｃドメインの変更されたグリコフォーム（例えば、低フコースグリカンまたはフコース不含グリカン）を含むことがある。別の実施形態では、分子は、グリコシル化モチーフ、例えば、アミノ酸配列ＮＸＴまたはＮＸＳを含有するＮ連結型グリコシル化モチーフ、の付近またはその中にアミノ酸置換を有する。グリコシル化を低減させるまたは変更する例示的なアミノ酸置換は、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０１８５７２および米国特許出願公開第２００７／０１１１２８１号において開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0257】

グリコシル化を低減させ、ＦｃのＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能も低下させる、特に好適なアミノ酸置換としては、Ｅｕ ２９７位におけるアミノ酸置換（例えば、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、またはＮ２９７Ｇ）が挙げられる。例えば、Wang et al.、上掲を参照されたい。Ｎ２９７置換を２６５位における置換（例えば、Ｄ２６５Ａ）と対にしてＣＤＣをさらに低下させることもできる。例えば、Lo et al.、上掲を参照されたい。

【0258】

文脈による別段の明確な指示がない限り、本発明の融合ポリペプチドにおいて本明細書に記載のＦｃバリアントの様々な実施形態を組み合わせることができることは、当業者には理解されるであろう。

【0259】

一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、（ｉ）配列番号２６の残基１～２３２もしくは１～２３１、（ｉｉ）配列番号２８の残基１～２３２もしくは１～２３１、（ｉｉｉ）配列番号４２の残基１５９～３９０もしくは１５９～３８９、（ｉｖ）配列番号１１６の残基１～２３２もしくは１～２３１、または（ｖ）配列番号１１８の残基１～２３２もしくは１～２３１に示される配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、Ｆｃ領域は、（ｉ）配列番号２６の残基１～２３２もしくは１～２３１、（ｉｉ）配列番号２８の残基１～２３２もしくは１～２３１、（ｉｉｉ）配列番号４２の残基１５９～３９０もしくは１５９～３８９、（ｉｖ）配列番号１１６の残基１～２３２もしくは１～２３１、または（ｖ）配列番号１１８の残基１～２３２もしくは１～２３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0260】

一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域は、（ｉ）配列番号２６の残基１６～２３２もしくは１６～２３１、（ｉｉ）配列番号１１６の残基１６～２３２もしくは１６～２３１、または（ｉｉｉ）配列番号１１８の残基１６～２３２もしくは１６～２３１に示される配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域は、（ｉ）配列番号２６の残基１６～２３２もしくは１６～２３１、（ｉｉ）配列番号１１６の残基１６～２３２もしくは１６～２３１、または（ｉｉｉ）配列番号１１８の残基１６～２３２もしくは１６～２３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0261】

Ｘが存在する上記の融合ポリペプチドの一部の変形形態では、Ｘは、ＦｃＲｎ結合ドメインである。特に好適なＦｃＲｎ結合ドメインとしては、例えば免疫グロブリンＦｃ領域などの、ＦｃＲｎ結合活性を保持する免疫グロブリン重鎖定常領域が挙げられ、一部のそのような変形形態では、Ｆｃ領域は、本明細書に記載の（例えば、ダイマー化ドメインの文脈における上記の）Ｆｃ領域である。他の実施形態では、ＦｃＲｎ結合ドメインは、アルブミン（例えば、ヒトアルブミン）である。さらに他の好適なＦｃＲｎ結合ドメインとしては、ＦｃＲｎに対して結合親和性を有する、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ペプチドアプタマー、または代替足場タンパク質が挙げられ、そのような代替ＦｃＲｎ結合分子は、例えば、大きい発現ライブラリー（例えば、免疫グロブリンドメイン、ランダム化ペプチドまたは他のタンパク質構造のライブラリー）のスクリーニングによる結合剤の選択を可能にするディスプレイ技術を使用して、容易に作出される。そのようなディスプレイ技術は、当技術分野において一般に周知であり、例えば、ファージディスプレイを含む。例えば、Antibody Engineering: A Practical Approach, McCafferty, Hoogenboom, and Chiswell Eds., IRL Press 1996を参照されたい。ＦｃＲｎ結合ドメインを生成するための代替足場タンパク質としては、例えば、アビマー、アンキリンリピート、およびアドネクチン、ならびに所望の分子標的に対する特異的親和性を生じさせるように進化させることができるドメインを有する他のタンパク質（例えば、Silverman et al., Nature Biotechnology 23:1556-1561, 2005；Zahnd et al., J. Mol. Biol. 369:1015-1028, 2007；Ｌｉｐｏｖｓｅｋらの米国特許第７，１１５，３９６号を参照されたい）が挙げられる。

【0262】

上記のＤＮａｓｅを含むパラオキソナーゼ融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６もしくは１～８９６、（ｉｉ）配列番号１２８の残基２１～８９６もしくは１～８９６、（ｉｉｉ）配列番号１３０の残基２１～８９６もしくは１～８９６、（ｉｖ）配列番号１４８の残基２１～９０６もしくは１～９０６、配列番号１５８の残基２１～８９６もしくは１～８９６、（ｖｉ）配列番号１６０の残基２１～９０６もしくは１～９０６、（ｖｉｉ）配列番号１６２の残基２１～９０６もしくは１～９０６、または（ｖｉｉｉ）配列番号１６４の残基２１～９０６もしくは１～９０６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６もしくは１～８９６、（ｉｉ）配列番号１２８の残基２１～８９６もしくは１～８９６、（ｉｉｉ）配列番号１３０の残基２１～８９６もしくは１～８９６、（ｉｖ）配列番号１４８の残基２１～９０６もしくは１～９０６、（ｖ）配列番号１５８の残基２１～８９６もしくは１～８９６、（ｖｉ）配列番号１６０の残基２１～９０６もしくは１～９０６、（ｖｉｉ）配列番号１６２の残基２１～９０６もしくは１～９０６、または（ｖｉｉｉ）配列番号１６４の残基２１～９０６もしくは１～９０６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0263】

上記のＲＮａｓｅを含むパラオキソナーゼ融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号４０の残基２１～７６４もしくは１～７６４または（ｉｉ）配列番号４８の残基２１～７４０もしくは１～７４０に示される配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号４０の残基２１～７６４もしくは１～７６４または（ｉｉ）配列番号４８の残基２１～７４０もしくは１～７４０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0264】

上記のスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）を含むパラオキソナーゼ融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号５０の残基２３～７８１もしくは１～７８１、（ｉｉ）配列番号５２の残基２３～７８１もしくは１～７８１、または（ｉｉｉ）配列番号５４の残基２３～７９１もしくは１～７９１に示される配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号５０の残基２３～７８１もしくは１～７８１、（ｉｉ）配列番号５２の残基２３～７８１もしくは１～７８１、または（ｉｉｉ）配列番号５４の残基２３～７９１もしくは１～７９１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0265】

上記のＣＴＬＡ－４細胞外ドメインを含むパラオキソナーゼ融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号６６の残基２１～７３６または１～７３６に示される配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号６６の残基２１～７３６または１～７３６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0266】

上記のＣＤ４０細胞外ドメインを含むパラオキソナーゼ融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号７４の残基２１～８０４もしくは１～８０４、（ｉｉ）配列番号７８の残基２１～８０４もしくは１～８０４、（ｉｉｉ）配列番号８２の残基２１～８０４もしくは１～８０４、（ｉｖ）配列番号８６の残基２１～８０４もしくは１～８０４、または（ｖ）配列番号９０の残基２１～８０４もしくは１～８０４に示される配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号７４の残基２１～８０４もしくは１～８０４、（ｉｉ）配列番号７８の残基２１～８０４もしくは１～８０４、（ｉｉｉ）配列番号８２の残基２１～８０４もしくは１～８０４、（ｉｖ）配列番号８６の残基２１～８０４もしくは１～８０４、または（ｖ）配列番号９０の残基２１～８０４もしくは１～８０４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0267】

上記のＴＮＦαに特異的に結合しそれを中和するポリペプチドを含むパラオキソナーゼ融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号９４の残基２１～８６０もしくは１～８６０または（ｉｉ）配列番号９８の残基２１～８６０もしくは１～８６０に示される配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号９４の残基２１～８６０もしくは１～８６０または（ｉｉ）配列番号９８の残基２１～８６０もしくは１～８６０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0268】

上記のＴＧＦ－βに特異的に結合しそれを中和するポリペプチドを含むパラオキソナーゼ融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１０２の残基２１～８６１もしくは１～８６１または（ｉｉ）配列番号１０６の残基２１～８６１もしくは１～８６１に示される配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１０２の残基２１～８６１もしくは１～８６１または（ｉｉ）配列番号１０６の残基２１～８６１もしくは１～８６１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0269】

本明細書に記載の式Ｘ－Ｌ２－Ｐを含むパラオキソナーゼ融合ポリペプチドの一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１２２の残基２１～６１３もしくは１～６１３、（ｉｉ）配列番号１３２の残基２１～６１３もしくは１～６１３、（ｉｉｉ）配列番号１３４の２１～６１３もしくは１～６１３、（ｉｖ）配列番号１４２の残基２１～６１０もしくは１～６１０、（ｖ）配列番号１４４の残基２１～６１０もしくは１～６１０、または（ｖｉ）配列番号１４６の残基２１～６１０もしくは１～６１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１２２の残基２１～６１３もしくは１～６１３、（ｉｉ）配列番号１３２の残基２１～６１３もしくは１～６１３、（ｉｉｉ）配列番号１３４の２１～６１３もしくは１～６１３、（ｉｖ）配列番号１４２の残基２１～６１０もしくは１～６１０、（ｖ）配列番号１４４の残基２１～６１０もしくは１～６１０、または（ｖｉ）配列番号１４６の残基２１～６１０もしくは１～６１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0270】

本発明は、第１および第２のポリペプチド融合体を含むダイマー性タンパク質であって、ポリペプチド融合体の各々が上記のダイマー化ドメインを含む、ダイマー性タンパク質も提供する。したがって、別の態様では、本発明は、第１の融合ポリペプチドと第２の融合ポリペプチドとを含むダイマー性タンパク質であって、第１および第２の融合ポリペプチドの各々が、アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｐ（式中、Ｔは、ＤＮａｓｅ、およびＲＮａｓｅ、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子－４（ＣＴＬＡ－４）細胞外ドメイン、ＣＤ４０細胞外ドメイン、および炎症性サイトカインに特異的に結合しそれを中和するポリペプチド（例えば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）またはトランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）に特異的に結合しそれを中和するポリペプチド）から選択される第１の生物学的に活性なポリペプチドであり；Ｌ１は、必要に応じて存在する第１のポリペプチドリンカーであり；Ｘは、ダイマー化ドメインであり；Ｌ２は、必要に応じて存在する第２のポリペプチドリンカーであり；Ｐは、生物学的に活性なパラオキソナーゼである）を含む、ダイマー性タンパク質を提供する。別の態様では、本発明は、第１の融合ポリペプチドと第２の融合ポリペプチドとを含むダイマー性タンパク質であって、第１および第２の融合ポリペプチドの各々が、アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、Ｘ－Ｌ２－Ｐ（式中、Ｘは、ダイマー化ドメインであり、Ｌ２は、必要に応じて存在するポリペプチドリンカーであり、Ｐは、生物学的に活性なパラオキソナーゼである）を含む、ダイマー性タンパク質を提供する。別の態様では、本発明は、第１の融合ポリペプチドと第２の融合ポリペプチドとを含むダイマー性タンパク質であって、第１および第２の融合ポリペプチドの各々が、アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、Ｐ－Ｌ１－Ｘ（式中、Ｐは、生物学的に活性なパラオキソナーゼであり、Ｌ１は、ポリペプチドリンカーであり、Ｘは、ダイマー化ドメインである）を含む、ダイマー性タンパク質を提供する。
ＩＩＩ．ポリペプチド融合体およびダイマー性タンパク質を作製するための材料および方法

【0271】

本発明は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を含むポリヌクレオチド分子であって、上記に開示された融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子も提供する。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖分子と二本鎖分子の両方を含む。融合ポリペプチドの様々なセグメント（例えば、Ｆｃ断片；ＤＮａｓｅおよびＰポリペプチドセグメント）をコードするポリヌクレオチドを生成し、核酸の組換えマニピュレーションのための公知の方法を使用して互いに連結させて本明細書に記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを形成することができる。

【0272】

本開示による融合成分（例えば、ＤＮａｓｅ（例えば、ＤＮａｓｅ １）、パラオキソナーゼ（例えば、ＰＯＮ１）、ＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅ１）、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、ＣＴＬＡ－４およびＣＤ４０細胞外ドメイン、ならびに免疫グロブリンＦｃ領域）をコードするＤＮＡ配列は、一般に、当技術分野において公知である。例示的なＤＮＡ配列は、本明細書に開示される（配列表を参照されたい）。これらのポリペプチドのいずれかをコードする追加のＤＮＡ配列を、当業者は、遺伝子コードに基づいて容易に生成することができる。対応するＲＮＡ配列を、ＵでのＴの置換によって生成することができる。遺伝子コードの縮重を考えると、所与のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子間に相当な配列変異があり得ることは、当業者には容易に分かるであろう。そのようなポリペプチドの機能的バリアントおよび断片をコードするＤＮＡおよびＲＮＡを、ポリヌクレオチド配列に変異を導入するための公知の組換え法を使用して獲得し、続いて、コードされたポリペプチドを発現させ、適切なスクリーニングアッセイを使用して機能活性（例えば、ヌクレアーゼ活性）を決定することもできる。

【0273】

ＤＮＡおよびＲＮＡを調製するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンを、目的のポリペプチドをコードする大量のＲＮＡを産生する組織または細胞から単離されるＲＮＡから、調製することができる。全ＲＮＡを、グアニジンＨＣｌ抽出、続いて、ＣｓＣｌ勾配での遠心分離による単離を使用して、調製することができる（Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979）。ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡは、ＡｖｉｖおよびＬｅｄｅｒの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412, 1972）を使用して全ＲＮＡから調製される。相補的ＤＮＡは、公知の方法を使用してポリ（Ａ）^＋ＲＮＡから調製される。代替形態では、ゲノムＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを同定および単離するための方法は、周知であり、当技術分野における通常の技能レベルの範囲内であり、ライブラリーをプローブまたはプライミングするための本明細書に開示される配列またはその部分の使用を含む。目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」、Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，２０２号）により、同定され、単離される。発現ライブラリーを、目的のポリペプチドに対する抗体、受容体断片、または他の特異的結合パートナーを用いて、プローブすることができる。

【0274】

本発明のポリヌクレオチドを自動合成によって調製することもできる。短い二本鎖セグメント（６０～８０ｂｐ）の産生は、技術的に容易であり、相補鎖の合成、次いでそれらのアニーリングにより遂行され得る。より長いセグメント（典型的には、＞３００ｂｐ）は、長さ２０～１００ヌクレオチドである一本鎖断片からモジュール形態でアセンブルされる。ポリヌクレオチドの自動合成は、当技術分野における通常の技能レベルの範囲内であり、好適な機器および試薬は、商業的供給業者から入手可能である。一般に、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994；Itakura et al., Ann. Rev. Biochem. 53:323-356, 1984；およびClimie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:633-637, 1990を参照されたい。

【0275】

別の態様では、融合ポリペプチドを含むダイマー性タンパク質を含む、本発明のポリペプチド融合体を産生するための、材料および方法が、提供される。融合ポリペプチドを、遺伝子操作された宿主細胞において従来の技法に従って産生することができる。好適な宿主細胞は、外来性ＤＮＡを用いて形質転換またはトランスフェクトすることができ培養下で成長させることができる細胞型であり、細菌、真菌細胞、および培養高等真核細胞（多細胞生物の培養細胞を含む）、特に、培養哺乳動物細胞を含む。クローン化ＤＮＡ分子をマニピュレートするための技法および外来性ＤＮＡを様々な宿主細胞に導入するための技法は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989、およびAusubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green and Wiley and Sons, NY, 1993によって開示されている。

【0276】

一般に、宿主細胞における融合ポリペプチドの産生のために、融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、発現カセット内の、典型的には転写プロモーターおよびターミネーターを含む、その発現に必要とされる他の遺伝子エレメントに、作動可能に連結される。典型的には、発現カセットは、宿主細胞への送達用の発現ベクター内に含有される。ベクターは、一般に、１つまたは複数の選択可能なマーカーおよび１つまたは複数の複製起点も含有することになるが、ある特定の系内に選択可能なマーカーが別のベクターによって提供されることがあること、および外来性ＤＮＡの複製が、例えば、安定な細胞系の生成の際などに、宿主細胞ゲノムへの発現カセットの組込みによりもたらされることがあることは、当業者には分かるであろう。プロモーター、ターミネーター、選択可能なマーカー、ベクターおよび他のエレメントの選択は、当技術分野における通常の技能レベルの範囲内の通例の設計の問題である。多くのそのようなエレメントが文献に記載されており、商業的供給業者を通して入手可能である。

【0277】

ＤＮａｓｅ融合ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に方向付けるために、分泌シグナル配列が発現カセット内に提供される。コードされる分泌ペプチドは、対応するネイティブタンパク質（例えば、配列番号１６のアミノ酸残基１～２２に示される通りのネイティブＤＮａｓｅ分泌ペプチド、配列番号３８のアミノ酸残基１～２８に示される通りのネイティブＲＮａｓｅ分泌ペプチド、または配列番号６８のアミノ酸残基１～２０に示される通りのネイティブＣＤ４０分泌ペプチド）のものであることがあり、または別の分泌されるタンパク質（例えば、ｔ－ＰＡ；米国特許５，６４１，６５５号を参照されたい）に由来することがあり、またはｄｅ ｎｏｖｏ合成されることがある。操作された切断部位を、宿主細胞におけるタンパク質分解プロセシングを最適化するために、分泌ペプチドとポリペプチド融合体の残部の間の接合部に含めることができる。分泌シグナル配列は、ポリペプチド融合体をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されており、即ち、２つの配列は、正しいリーディングフレーム内で結合されており、新たに合成されたポリペプチド融合体を宿主細胞の分泌経路に方向付けるように位置する。分泌シグナル配列は、一般に、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側に位置するが、ある特定のシグナル配列が目的のＤＮＡ配列内の他の場所に位置することもある（例えば、Ｗｅｌｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄら、米国特許第５，１４３，８３０号を参照されたい）。本発明による使用に好適な分泌シグナル配列としては、例えば、ヒトＶＫ３リーダーペプチド（配列番号５８）をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。

【0278】

宿主細胞分泌経路による、本明細書に記載のダイマー化ドメインを含む融合ポリペプチドの発現は、ダイマー性タンパク質の産生につながると予想される。したがって、別の態様では、本発明は、上記の第１および第２の融合ポリペプチドを含むダイマー性タンパク質（例えば、第１の融合ポリペプチドと第２の融合ポリペプチドとを含むダイマー性タンパク質であって、第１および第２の融合ポリペプチドの各々が、アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、本明細書に記載のＴ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｐ、Ｘ－Ｌ２－Ｐ、またはＰ－Ｌ１－Ｘを含む、ダイマー性タンパク質）を提供する。ダイマーを、好適な条件下での成分ポリペプチドのインキュベーションによってｉｎ ｖｉｔｒｏでアセンブルすることもできる。一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアセンブリは、変性および還元条件下でタンパク質混合物をインキュベートすること、続いてポリペプチドをリフォールディングし、再酸化させてダイマーを形成することを含むことになる。細菌細胞において発現されたタンパク質の回収およびアセンブリは、下記に開示される。

【0279】

培養哺乳動物細胞は、本発明の中での使用に好適な宿主である。外来性ＤＮＡを哺乳動物宿主細胞に導入するための方法としては、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（Wigler et al., Cell 14:725, 1978；Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973）、電気穿孔（Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982）、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション（Ausubel et al.、上掲）、およびリポソーム媒介トランスフェクション（Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993；Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993）が挙げられる。培養哺乳動物細胞における組換えポリペプチドの産生は、例えば、Ｌｅｖｉｎｓｏｎら、米国特許第４，７１３，３３９号；Ｈａｇｅｎら、米国特許第４，７８４，９５０号；Ｐａｌｍｉｔｅｒら、米国特許第４，５７９，８２１号；およびＲｉｎｇｏｌｄ、米国特許第４，６５６，１３４号において開示されている。好適な培養哺乳動物細胞としては、ＣＯＳ－１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ－７（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １６５１）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １６３２）、ＢＨＫ ５７０（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １０３１４）、２９３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １５７３；Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977）およびチャイニーズハムスター卵巣（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ ６１；ＣＨＯ－ＤＧ４４、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980）細胞系が挙げられる。追加の好適な細胞系は、当技術分野において公知であり、公的寄託機関、例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手可能である。強力な転写プロモーター、例えば、ＳＶ－４０、サイトメガロウイルスまたは骨髄増殖性肉腫ウイルスからのプロモーター、を使用することができる。例えば、米国特許第４，９５６，２８８号および米国特許出願公開第２００３０１０３９８６号を参照されたい。他の好適なプロモーターとしては、メタロチオネイン遺伝子からのもの（米国特許第４，５７９，８２１号および同第４，６０１，９７８号）およびアデノウイルス主要後期プロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞において使用するための発現ベクターとしては、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ＵＳＡに受託番号９８６６９、９８６６８、およびＰＴＡ－５２６６でそれぞれ寄託されたｐＺＰ－１、ｐＺＰ－９、およびｐＺＭＰ２１、ならびにこれらのベクターの誘導体が挙げられる。

【0280】

薬物選択は、一般に、外来ＤＮＡが挿入された培養哺乳動物細胞を選択するために使用される。そのような細胞は、一般に「トランスフェクタント」と呼ばれる。選択剤の存在下で培養された細胞であって、それらの子孫に目的の遺伝子を－そのゲノムＤＮＡへの発現カセットの組込みによって－伝えることができる細胞は、「安定なトランスフェクタント」と呼ばれる。例示的な選択可能なマーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型の薬物、例えばＧ－４１８など、の存在下で行われる。選択系を使用して、目的の遺伝子の発現レベルを上昇させることもでき、これは、「増幅」と呼ばれるプロセスである。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養すること、次いで、選択剤の量を増加させて、導入された遺伝子の高レベルの産物を産生する細胞を選択することによって行われる。例示的な、増幅可能な、選択可能なマーカーは、メトトレキサートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の薬物耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）も使用することができる。細胞表面マーカーおよび他の表現型選択マーカーを、トランスフェクト細胞の同定（例えば、蛍光活性化細胞選別による）を助長するために使用することができ、これらのマーカーには、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、神経成長因子受容体、緑色蛍光タンパク質などが含まれる。

【0281】

一部の態様では、本発明は、本明細書に記載のパラオキソナーゼ融合ポリペプチドをコードする発現カセットをそのゲノムＤＮＡ内に含有する安定な細胞系であって、コードされたパラオキソナーゼ融合体を構成的に発現する安定な細胞系を提供する。安定な細胞系を、当技術分野において一般に公知の方法によって生成することができ、これらの方法は、一般に、限界希釈（limited dilution）および拡大による安定なトランスフェクタントのポリクローナルコロニーからの単一の安定な細胞クローンの同定を含む。次いで、選択されたクローンのタンパク質発現を評価して、拡大のための高発現クローンを同定することができる。一部の実施形態では、安定な細胞系は、哺乳動物細胞系、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系などである。本開示によるＤＮａｓｅ－ＰＯＮ融合ポリペプチドを構成的に発現する安定な細胞系の一部の好ましい実施形態では、ＤＮａｓｅは、本明細書に記載の増強されたＤＮａｓｅ１であり、一部のそのような実施形態では、ＤＮａｓｅ－ＰＯＮ融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６もしくは１～８９６、（ｉｉ）配列番号１４８の残基２１～９０６もしくは１～９０６、（ｉｉｉ）配列番号１５８の残基２１～８９６もしくは１～８９６、または（ｉｖ）配列番号１６０の残基２１～９０６もしくは１～９０６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、増強されたＤＮａｓｅ１－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合ポリペプチドである。一部の変形形態では、安定な細胞系は、融合ポリペプチド（例えば、ＤＮａｓｅ１－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合ポリペプチド）を、細胞培養物１Ｌあたり少なくとも２５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５００ｍｇ／Ｌの濃度で産生することができる哺乳動物細胞系（例えば、ＣＨО）である。典型的には、本明細書に記載のＤＮａｓｅ１－Ｆｃ融合ポリペプチドは、最初の単離されたクローンからおおよそ２５～１００ｍｇ／Ｌのレベルで発現され得る。最初の培養物のリクローニングは、多くの場合、発現を安定化し、２～３倍増加させることができる。発現レベルの増幅は、メトトレキサートのレベルを５０ｎＭの初期濃度から最大で１ｕＭもの高さまで上昇させながら細胞を低密度でさらに播種することによって、達成することもできる。細胞が適応したら、限界希釈クローニングのさらなるラウンドが、高い発現レベルを維持するために必要とされる。

【0282】

昆虫細胞、植物細胞および鳥類細胞をはじめとする他の高等真核細胞も宿主として使用することができる。植物細胞において遺伝子を発現させるためのベクターとしてのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの使用は、Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987により総説されている。昆虫細胞の形質転換およびそれらにおける外来ポリペプチドの産生は、Ｇｕａｒｉｎｏら、米国特許第５，１６２，２２２号および国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０６４６３によって開示されている。

【0283】

昆虫細胞を、一般にＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）に由来する、組換えバキュロウイルスに感染させることができる（King and Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman & Hall, London；O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press., New York, 1994；およびRichardson, Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, NJ, 1995を参照されたい）。組換えバキュロウイルスをＬｕｃｋｏｗら（J. Virol. 67:4566-4579, 1993）により記載されたトランスポゾンに基づく系の使用によって産生することもできる。移入ベクターを利用するこの系は、キット形態（ＢＡＣ－ＴＯ－ＢＡＣキット；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で市販されている。移入ベクター（例えば、ＰＦＡＳＴＢＡＣ１；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、目的のタンパク質をコードするＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉに維持されているバキュロウイルスゲノムに「バクミド」と呼ばれる大きいプラスミドとして移動させるためにＴｎ７トランスポゾンを含有する（Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990；Bonning et al., J. Gen. Virol. 75:1551-1556, 1994；Chazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543-1549, 1995を参照されたい）。当技術分野において公知の技法を使用して、ポリペプチド融合体をコードする移入ベクターがＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞に導入されて形質転換を生じさせ、細胞が、組換えバキュロウイルスを示す中断されたｌａｃＺ遺伝子を含有するバクミドについてスクリーニングされる。組換えバキュロウイルスゲノムを含有するバクミドＤＮＡが、一般的な技法を使用して単離され、Ｓｆ９細胞などのＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞にトランスフェクトするために使用される。その後、ポリペプチド融合体を発現する組換えウイルスが産生される。組換えウイルスストックは、当技術分野において一般に使用されている方法により作製される。

【0284】

タンパク質産生のために、組換えウイルスが、宿主細胞、典型的には、ツマジロクサヨトウ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（例えば、Ｓｆ９もしくはＳｆ２１細胞）またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（例えば、ＨＩＧＨ ＦＩＶＥ細胞；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に由来する細胞系を感染させるために使用される（一般に、Glick and Pasternak、上掲を参照されたく、米国特許第５，３００，４３５号も参照されたい）。無血清培地が、細胞を成長および維持するために使用される。好適な培地製剤は、当技術分野において公知であり、商業的供給業者から入手することができる。細胞は、おおよそ２～５×１０^５細胞の接種密度から１～２×１０^６細胞の密度に成長させられ、成長した時点で、組換えウイルスストックが、０．１～１０、より典型的にはほぼ３、の感染多重度（ＭＯＩ）で添加される。使用される手順は、入手可能な実験マニュアル（例えば、King and Possee、上掲；O'Reilly et al.、上掲；Richardson、上掲）に一般に記載されている。

【0285】

酵母細胞をはじめとする真菌細胞も本発明の中で使用することができる。このことに関連して特に興味深い酵母種としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、およびＰｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａが挙げられる。外来性ＤＮＡを用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を形質転換するための方法、およびそれらから組換えポリペプチドを産生するための方法は、例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号；Ｋａｗａｓａｋｉら、米国特許第４，９３１，３７３号；Ｂｒａｋｅ、米国特許第４，８７０，００８号；Ｗｅｌｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号；およびＭｕｒｒａｙら、米国特許第４，８４５，０７５号によって開示されている。形質転換細胞は、選択可能なマーカーによって決定される表現型、一般に、薬物耐性、または特定の栄養素（例えば、ロイシン）の非存在下で成長する能力、により選択される。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける使用のための例示的なベクター系は、グルコース含有培地での成長により形質転換細胞を選択することを可能にする、Ｋａｗａｓａｋｉら（米国特許第４，９３１，３７３号）により開示されたＰＯＴ１ベクター系である。酵母における使用に好適なプロモーターおよびターミネーターとしては、糖分解酵素遺伝子からのもの（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、米国特許第４，６１５，９７４号；およびＢｉｔｔｅｒ、米国特許第４，９７７，０９２号を参照されたい）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのものが挙げられる。米国特許第４，９９０，４４６号；同第５，０６３，１５４号；同第５，１３９，９３６号；および同第４，６６１，４５４号も参照されたい。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ、およびＣａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａをはじめとする、他の酵母用の形質転換系が、当技術分野において公知である。例えば、Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986；Ｃｒｅｇｇ、米国特許第４，８８２，２７９号；およびRaymond et al., Yeast 14:11-23, 1998を参照されたい。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞は、ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４，９３５，３４９号の方法に従って用いることができる。Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍを形質転換するための方法は、Ｓｕｍｉｎｏら、米国特許第５，１６２，２２８号により開示されている。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａを形質転換するための方法は、Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ、米国特許第４，４８６，５３３号により開示されている。Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａにおける組換えタンパク質の産生は、米国特許第５，７１６，８０８号；同第５，７３６，３８３号；同第５，８５４，０３９号；および同第５，８８８，７６８号において開示されている。

【0286】

細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓおよび他の属の株を含む、原核生物宿主細胞も、本発明の中で有用な宿主細胞である。これらの宿主を形質転換するための技法、およびそれらにおいてクローニングされた外来ＤＮＡ配列を発現させる技法は、当技術分野において周知である（例えば、Sambrook et al.、上掲を参照されたい）。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌において融合ポリペプチドを発現させる場合、ポリペプチドは、細胞質内に、典型的には不溶性顆粒として、保持されることがあり、または細菌分泌配列により細胞周辺腔に方向付けられることがある。前者の場合、細胞は溶解され、顆粒は、回収され、例えばグアニジンＨＣｌまたは尿素を使用して、変性される。次いで、変性されたポリペプチドは、変性剤を、例えば、尿素の溶液および還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンの組合せに対する透析、続いて、緩衝食塩溶液に対する透析により、希釈することによって、リフォールディングおよびダイマー化され得る。代替形態では、タンパク質は、可溶性形態で細胞質から回収され、変性剤を使用せずに単離され得る。タンパク質は、例えばリン酸緩衝食塩水中の、水性抽出物として細胞から回収される。目的のタンパク質を捕捉するために、抽出物は、クロマトグラフ媒体、例えば、固定化抗体またはヘパリン－セファロースカラムに、直接適用される。分泌されたポリペプチドは、細胞を（例えば、超音波処理または浸透圧ショックにより）破壊し、タンパク質を回収することによって変性およびリフォールディングの必要性をなくすことにより、細胞周辺腔から可溶性および機能的形態で回収され得る。例えば、Lu et al., J. Immunol. Meth. 267:213-226, 2002を参照されたい。

【0287】

形質転換またはトランスフェクト宿主細胞は、選択された宿主細胞の成長に必要な栄養素および他の成分を含有する培養培地で従来の手順に従って培養される。限定培地および複合培地をはじめとする様々な好適な培地は、当技術分野において公知であり、一般に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルを含む。培地は、増殖因子または血清のような成分も、必要に応じて含有し得る。成長培地は、外から加えられたＤＮＡを含有する細胞を、例えば、発現ベクターに担持されたまたは宿主細胞にコトランスフェクトされた選択可能なマーカーにより補完される薬物選択または必須栄養素欠乏によって、一般に選択することになる。

【0288】

一部の変形形態では、本明細書に記載のアクチン耐性ＤＮａｓｅ１－ＰＯＮ融合ポリペプチド（例えば、（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６もしくは１～８９６または（ｉｉ）配列番号１４８の残基２１～９０６もしくは１～９０６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアクチン耐性ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１融合ポリペプチド）の産生のための宿主細胞は、その発現中に増強されるＤＮａｓｅの毒性を低下させるためにＤＮａｓｅ１阻害剤の存在下で培養される。ＤＮａｓｅ１阻害剤は、当技術分野において一般に公知であり、例えば、阻害剤ルチンを含む（例えば、Kolarevic et al., Chem. Biodiversity 16:e1900060, 2019を参照されたい）。ある特定の実施形態では、ＤＮａｓｅ１阻害剤の存在下で培養される宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯなどである。

【0289】

本発明のタンパク質は、従来のタンパク質精製方法により、典型的には、クロマトグラフィー技法の組合せにより、精製される。一般に、Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988；およびScopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1994を参照されたい。免疫グロブリンＦｃ領域を含むタンパク質を、固定化プロテインＡを用いる親和性クロマトグラフィーにより精製することができる。ゲル濾過などの追加の精製ステップを使用して、所望のレベルの純度を得ること、または脱塩、緩衝液交換などを行うことができる。

【0290】

例えば、分画および／または従来の精製方法を使用して、組換え宿主細胞から精製された本発明の融合ポリペプチドおよびダイマー性タンパク質を得ることができる。一般に、硫酸アンモニウム沈殿および酸またはカオトロープ抽出が、試料の分画に使用され得る。例示的な精製ステップとしては、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、ＦＰＬＣおよび逆相高速液体クロマトグラフィーを挙げることができる。好適なクロマトグラフ媒体としては、誘導体化デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカなどが挙げられる。ＰＥＩ、ＤＥＡＥ、ＱＡＥおよびＱ誘導体が好適である。例示的なクロマトグラフ媒体としては、フェニル、ブチルもしくはオクチル基で誘導体化された媒体、例えば、Ｐｈｅｎｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ｂｕｔｙｌ ６５０（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＰＡ）、Ｏｃｔｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）など；またはポリアクリル酸樹脂、例えば、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ ７１（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ）などが挙げられる。好適な固体支持体としては、それらが使用されることになる条件下で不溶性である、ガラスビーズ、シリカ系樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂などが挙げられる。これらの支持体を、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基および／または糖鎖部分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基で修飾することができる。

【0291】

カップリング化学の例としては、臭化シアン活性化、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、ならびにカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシルおよびアミノ誘導体が挙げられる。これらのおよび他の固体媒体は、当技術分野において周知であり、広く使用されており、商業的供給業者から入手可能である。ポリペプチド単離および精製のための特定の方法の選択は、通例の設計の問題であり、部分的には選択される支持体の特性によって決定される。例えば、Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988)；Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996)を参照されたい。

【0292】

タンパク質単離および精製の追加の変形形態を当業者は考案することができる。例えば、本明細書に記載の融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質に特異的に結合する抗体（例えば、ＤＮａｓｅに対応するポリペプチドセグメントに特異的に結合する抗体）を使用して、免疫親和性精製によって大量のタンパク質を単離することができる。

【0293】

特定の特性を活用することによって、本発明のタンパク質を単離することもできる。例えば、固定化金属イオン吸着（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィーを使用して、ポリヒスチジンタグを含むものをはじめとするヒスチジンリッチタンパク質を精製することができる。手短に述べると、キレートを形成するために、先ず、ゲルが二価金属イオンで荷電される（Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1, 1985）。ヒスチジンリッチプロテインが、使用される金属イオンに依存して異なる親和性でこのマトリックスに吸着されることになり、競合的溶出、ｐＨの低下、または強いキレート剤の使用によって溶出されることになる。他の精製方法としては、レクチン親和性クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化タンパク質の精製が挙げられる（例えば、M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182:529, 1990を参照されたい）。本発明の追加の実施形態の中では、目的のポリペプチドと親和性タグ（例えば、マルトース結合タンパク質）の融合体が、精製を助長するために構築され得る。さらに、融合ポリペプチドまたはそのダイマーの受容体結合特性またはリガンド結合特性が精製に活用され得る。

【0294】

一部の変形形態では、本明細書に記載の増強されたしかし非アクチン耐性のＤＮａｓｅ１（即ち、ヒトＤＮａｓｅ１と比較してＤＮａｓｅのエンドヌクレアーゼ活性のＧ－アクチン誘導性阻害を減少させるいずれのアミノ酸置換も、ヒトＤＮａｓｅ１と比較して、含有しないＤＮａｓｅ）を含むＤＮａｓｅ１－ＰＯＮ融合分子は、分子のアクチン結合を低減させることによってアクチン耐性であるＤＮａｓｅ－Ｆｃ融合分子を得るために、精製後にエチレンジアミン（ＥＤＡ）で処理される。ＥＤＡ処理されたＤＮａｓｅ１－ＰＯＮ融合分子は、次いで、当技術分野において一般に公知の方法（例えば、米国特許第１１，２２５，６４８号を参照されたい）を使用してＥＤＡを除去するようにさらに処理される。そのような実施形態は、非アクチン耐性形態の増強されたＤＮａｓｅ１の発現のほうが宿主細胞（例えば、ＣＨＯ）への毒性が低くなるので、薬学的使用のためのＤＮａｓｅ１－ＰＯＮ融合体のより高度な発現の達成に有利である。特定の実施形態では、ＥＤＡで処置されることになる精製ＤＮａｓｅ１－ＰＯＮは、（ｉ）配列番号１５８の残基２１～８９６または（ｉｉ）配列番号１６０の残基２１～９０６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0295】

本発明のポリペプチドは、典型的には、夾雑高分子、特に、他のタンパク質および核酸に関して少なくとも約８０％の純度、より典型的には少なくとも約９０％の純度、好ましくは少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の純度に精製され、感染性および発熱性物質を含んでいない。本発明のポリペプチドを、９９．９％より高度に純粋である薬学的純粋な状態に精製することもできる。ある特定の調製物では、精製ポリペプチドは、他のポリペプチド、特に、動物起源の他のポリペプチドを、実質的に含んでいない。
ＩＶ．使用方法および医薬組成物

【0296】

本発明の融合ポリペプチドおよびダイマー性タンパク質を使用して、様々な疾患または障害の処置のための治療を施すことができる。パラオキソナーゼ融合ポリペプチドは、例えば、炎症、自己免疫、神経学的、心血管および／または線維性疾患および障害の処置に、特に有用である。本明細書に記載の第１の生物学的に活性なポリペプチド（例えば、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、またはＳＯＤ１）をさらに含む二重特異性融合体に関する態様では、融合ポリペプチドおよびダイマー性タンパク質は、処置のための１つまたは複数の追加の生物学的活性をさらに提供し得る。例えば、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅを含むパラオキソナーゼ融合ポリペプチドは、例えば、ＮＥＴｏｓｉｓによって特徴付けられる疾患および障害の処置に、特に有用である。加えて、ＣＴＬＡ－４またはＣＤ４０細胞外ドメインを含むパラオキソナーゼ融合ポリペプチドは、例えば、異常な適応免疫応答によって特徴付けられる疾患または障害の処置に、特に有用である。さらに別の例として、ＣＤ４０細胞外ドメイン、またはＴＧＦ－βに特異的に結合しそれを中和するポリペプチドを含む、パラオキソナーゼ融合ポリペプチドは、例えば、線維性炎症応答によって特徴付けられる疾患および障害の処置に、特に有用である。

【0297】

一部の態様では、本発明は、炎症性疾患、自己免疫疾患、神経学的疾患、感染性疾患、代謝性疾患、心血管疾患、肝臓疾患、線維性疾患、血栓症、敗血症、虚血再灌流、グラム陰性菌によるバイオフィルム形成、硫黄マスタードガスへの曝露、有機リンへの曝露、およびがんから選択される疾患または障害を処置するための方法を提供する。方法は、一般に、疾患または障害を有する対象に、本明細書に記載の融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質の有効量を投与するステップを含む。

【0298】

本発明による処置に適している炎症性疾患としては、例えば、炎症性肺疾患、例えば、喘息、嚢胞性線維症（ＣＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支拡張症、低酸素症、間質性肺疾患（例えば、特発性肺線維症（ＩＰＦ）またはサルコイドーシス）、および急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）などが挙げられる。ＡＲＤＳの処置を含む特定の実施形態では、ＡＲＤＳは、ＣＯＶＩＤ－１９に関連する。一部の実施形態では、炎症性肺疾患は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染によって特徴付けられる。一部の変形形態では、炎症性肺疾患を有する患者は、硫黄マスタードガス（ＳＭ）に曝露された患者である。他の変形形態では、炎症性肺疾患を有する患者は、有機リン、例えば、殺虫剤（例えば、パラチオン、マラチオン、クロルピリホス、ダイアジノン、ジクロルボス、ホスメット、フェニトロチオン、テルブホス、テトラクロルビンホス、アザメチホス、もしくはアジンホス－メチル）または他の神経毒（例えば、タブン、サリン、ソマンもしくはシクロサリン）に曝露された患者である。

【0299】

本発明による処置に適している他の炎症性疾患としては、自己炎症性疾患（即ち、一見炎症非誘発性のエピソードと明らかな自己免疫病態の相対的欠如とによって特徴付けられる自然免疫系活性化障害）が挙げられる。例示的な自己炎症性疾患としては、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、ベーチェット病、全身発症性若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、痛風、偽痛風、貯蔵（ゴーシェ）障害、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）、非典型溶血性尿毒症症候群、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、ＴＮＦ受容体関連周期熱症候群（ＴＲＡＰＳ）、クリオピリン関連周期熱症候群（ＣＡＰＳ））、ＮＯＤ２関連自己炎症性疾患（ＮＡＩＤ）、およびブラウ症候群が挙げられる。

【0300】

さらに他の実施形態では、本発明による処置のための炎症性疾患または障害は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、１型糖尿病、２型糖尿病、肝炎（例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ））、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎（例えば、アトピー性皮膚炎）、憩質炎、過敏性腸症候群、および腎炎から選択される。さらに他の変形形態では、炎症性疾患または障害は、炎症性皮膚疾患、例えば、乾癬またはアトピー性皮膚炎である。

【0301】

炎症性疾患を処置するための方法のより特定の実施形態では、炎症性疾患処置のための融合分子は、構造ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＲＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＲＮａｓｅ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＳＯＤ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＳＯＤ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＴＬＡ４－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＴＬＡ４－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＤ４０－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＤ４０－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＮＦα－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＮＦα－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＧＦβ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＧＦβ－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、もしくはＰＯＮ１－Ｌ１－Ｆｃを有するポリペプチドであるか、または前述の融合ポリペプチドのいずれかのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質であり、一部のそのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６、（ｉｉ）配列番号４０の残基２１～７６４、（ｉｉｉ）配列番号４８の残基２１～７４０、（ｉｖ）配列番号５０の残基２３～７８１、（ｖ）配列番号５２の残基２３～７８１、（ｖｉ）配列番号５４の残基２３～７９１、（ｖｉｉ）配列番号６６の残基２１～７３６、（ｖｉｉｉ）配列番号７４の残基２１～８０４、（ｉｘ）配列番号７８の残基２１～８０４、（ｘ）配列番号８２の残基２１～８０４、（ｘｉ）配列番号８６の残基２１～８０４、（ｘｉｉ）配列番号９０の残基２１～８０４、（ｘｉｉｉ）配列番号９４の残基２１～８６０、（ｘｉｖ）配列番号９８の残基２１～８６０、（ｘｖ）配列番号１０２の残基２１～８６１、（ｘｖｉ）配列番号１０６の残基２１～８６１、（ｘｖｉｉ）配列番号１２２の残基２１～６１３、（ｘｖｉｉｉ）配列番号１４２の残基２１～６１０、（ｘｉｘ）配列番号１４８の残基２１～９０６、（ｘｘ）配列番号１５８の残基２１～８９６、（ｘｘｉ）配列番号１６０の残基２１～９０６、（ｘｘｉｉ）配列番号１６２の残基２１～９０６、または（ｘｘｉｉｉ）配列番号１６４の残基２１～９０６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。自己炎症性疾患を処置するための方法の一部の実施形態では、融合分子は、構造ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＲＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、もしくはＲＮａｓｅ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１を有するポリペプチドであるか、または前述の融合ポリペプチドのいずれかのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質である。関節リウマチ、乾癬性関節炎、または若年性特発性関節炎を処置するための方法の一部の実施形態では、融合分子は、構造ＣＴＬＡ４－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１もしくはＣＴＬＡ４－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１を有するポリペプチドであるか、または前述の融合ポリペプチドのどちらかのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質である。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）を処置するための方法の一部の実施形態では、融合分子は、構造ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＮＦα－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、もしくは抗ＴＮＦα－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１を有するポリペプチドであるか、または前述の融合ポリペプチドのいずれかのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質である。炎症性皮膚疾患（例えば、乾癬またはアトピー性皮膚炎）を処置するための方法の一部の実施形態では、融合分子は、構造ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＮＦα－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＮＦα－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、もしくはＰＯＮ１－Ｌ１－Ｆｃを有するポリペプチドであるか、または前述の融合ポリペプチドのいずれかのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質である。

【0302】

本発明による処置に適している自己免疫疾患としては、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、多発性硬化症、１型糖尿病、血管炎、および全身性硬化症（強皮症としても公知）が挙げられる。他の実施形態では、自己免疫疾患は、セリアック病、神経炎、多発性筋炎、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、白斑、シェーグレン症候群、自己免疫性膵炎、自己免疫性肝炎、糸球体腎炎、ループス腎炎、強皮症、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、重力筋無力症、アジソン病、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、交感性眼炎、ぶどう膜炎、自己免疫性溶血性貧血、肺線維症、慢性ベリリウム症、および特発性肺線維症から選択される。血管炎の処置を含む一部の変形形態では、血管炎は、小型血管炎および中型血管炎から選択され、他の変形形態では、血管炎は、大型血管炎である。

【0303】

自己免疫疾患を処置するための方法のより特定の実施形態では、自己免疫疾患処置のための融合分子は、構造ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＲＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＲＮａｓｅ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＳＯＤ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＳＯＤ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＴＬＡ４－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＴＬＡ４－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＤ４０－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＤ４０－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＮＦα－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＮＦα－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＧＦβ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＧＦβ－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、もしくはＰＯＮ１－Ｌ１－Ｆｃを有するポリペプチドであるか、または前述の融合ポリペプチドのいずれかのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質であり、一部のそのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６、（ｉｉ）配列番号４０の残基２１～７６４、（ｉｉｉ）配列番号４８の残基２１～７４０、（ｉｖ）配列番号５０の残基２３～７８１、（ｖ）配列番号５２の残基２３～７８１、（ｖｉ）配列番号５４の残基２３～７９１、（ｖｉｉ）配列番号６６の残基２１～７３６、（ｖｉｉｉ）配列番号７４の残基２１～８０４、（ｉｘ）配列番号７８の残基２１～８０４、（ｘ）配列番号８２の残基２１～８０４、（ｘｉ）配列番号８６の残基２１～８０４、（ｘｉｉ）配列番号９０の残基２１～８０４、（ｘｉｉｉ）配列番号９４の残基２１～８６０、（ｘｉｖ）配列番号９８の残基２１～８６０、（ｘｖ）配列番号１０２の残基２１～８６１、（ｘｖｉ）配列番号１０６の残基２１～８６１、（ｘｖｉｉ）配列番号１２２の残基２１～６１３、（ｘｖｉｉｉ）配列番号１４２の残基２１～６１０、（ｘｉｘ）配列番号１４８の残基２１～９０６、（ｘｘ）配列番号１５８の残基１～８９６、（ｘｘｉ）配列番号１６０の残基２１～９０６、（ｘｘｉｉ）配列番号１６２の残基２１～９０６、または（ｘｘｉｉｉ）配列番号１６４の残基２１～９０６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬、１型糖尿病、または小型血管炎を処置するための方法の一部の実施形態では、融合分子は、構造ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１もしくはＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１を有する融合ポリペプチドであるか、またはそのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質である。全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群または１型糖尿病を処置するための方法の一部の実施形態では、融合分子は、構造ＲＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１もしくはＲＮａｓｅ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１を有するポリペプチドであるか、または前述の融合ポリペプチドのどちらかのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質である。関節リウマチまたは乾癬性関節炎を処置するための方法の一部の実施形態では、融合分子は、構造ＣＴＬＡ４－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１もしくはＣＴＬＡ４－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１を有するポリペプチドであるか、または前述の融合ポリペプチドのどちらかのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質である。

【0304】

本発明による処置に適している神経学的疾患としては、例えば、ＣＮＳの炎症によって特徴付けられる神経変性疾患、例えば、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などが挙げられる。一部の実施形態では、神経学的疾患は、認知症、例えばアルツハイマー病など、によって特徴付けられる神経学的疾患である。多発性硬化症（ＭＳ）を処置するための方法のより特定の変形形態では、ＭＳは、脊髄視神経型ＭＳ、一次進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）、または再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）である。他の実施形態では、本発明による処置のための神経学的疾患は、ＣＮＳ感染症、例えば、髄膜炎、脳炎、または脳性マラリアなどである。髄膜炎を処置するための方法のより特定の変形形態では、髄膜炎は、細菌性髄膜炎であり、一部のそのような実施形態では、ＣＮＳ感染症は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ａ．ｂａｕｍａｎｉｉ、Ｓ．ｏｒａｌｉｓ、Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓ、またはＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ感染症である。本明細書に記載の融合分子での処置に適している他の神経学的疾患または障害としては、例えば、急性脳損傷、例えば、虚血性脳卒中などが挙げられる。さらに他の実施形態では、神経学的疾患は、脳がん、例えば、星状細胞腫、未分化星状細胞腫、神経膠芽種、乏突起神経膠腫、退形成乏突起神経膠腫、上衣腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、髄芽腫、胚細胞腫瘍、松果体新生物、髄膜腫、下垂体腫瘍、神経鞘の腫瘍（例えば、シュワン腫）、脊索腫、頭蓋咽頭腫、および脈絡叢腫瘍（例えば、脈絡叢癌）から選択される頭蓋内腫瘍である。

【0305】

神経学的疾患を処置するための方法のより特定の実施形態では、神経学的疾患処置のための融合分子は、構造ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＲＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＲＮａｓｅ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＳＯＤ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＳＯＤ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＴＬＡ４－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＴＬＡ４－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＤ４０－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＤ４０－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＮＦα－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＮＦα－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＧＦβ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＧＦβ－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、もしくはＰＯＮ１－Ｌ１－Ｆｃを有するポリペプチドであるか、または前述の融合ポリペプチドのいずれかのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質であり、一部のそのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６、（ｉｉ）配列番号４０の残基２１～７６４、（ｉｉｉ）配列番号４８の残基２１～７４０、（ｉｖ）配列番号５０の残基２３～７８１、（ｖ）配列番号５２の残基２３～７８１、（ｖｉ）配列番号５４の残基２３～７９１、（ｖｉｉ）配列番号６６の残基２１～７３６、（ｖｉｉｉ）配列番号７４の残基２１～８０４、（ｉｘ）配列番号７８の残基２１～８０４、（ｘ）配列番号８２の残基２１～８０４、（ｘｉ）配列番号８６の残基２１～８０４、（ｘｉｉ）配列番号９０の残基２１～８０４、（ｘｉｉｉ）配列番号９４の残基２１～８６０、（ｘｉｖ）配列番号９８の残基２１～８６０、（ｘｖ）配列番号１０２の残基２１～８６１、（ｘｖｉ）配列番号１０６の残基２１～８６１、（ｘｖｉｉ）配列番号１２２の残基２１～６１３、（ｘｖｉｉｉ）配列番号１４２の残基２１～６１０、（ｘｉｘ）配列番号１４８の残基２１～９０６、（ｘｘ）配列番号１５８の残基２１～８９６、（ｘｘｉ）配列番号１６０の残基２１～９０６、（ｘｘｉｉ）配列番号１６２の残基２１～９０６、または（ｘｘｉｉｉ）配列番号１６４の残基２１～９０６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。認知症（例えば、アルツハイマー病）、急性脳損傷（例えば、虚説性脳卒中）、または脳がんによって特徴付けられる神経変性疾患を処置するための方法の一部の実施形態では、融合分子は、構造ＤＮａｓｅ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＲＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、もしくはＲＮａｓｅ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１を有するポリペプチドであるか、または前述の融合ポリペプチドのいずれかのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質である。多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、またはＣＮＳ感染症を処置するための方法の一部の実施形態では、融合分子は、構造ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１もしくはＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１を有するポリペプチドであるか、またはそのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質である。

【0306】

本発明による処置に適している感染性疾患としては、例えば、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、および寄生虫感染症が挙げられる。寄生虫感染症の処置を含む一部の実施形態では、感染症は、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、またはＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ感染症である。細菌感染症の処置を含む一部の実施形態では、感染症は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染症である。他の実施形態では、細菌感染症は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染症である。さらに他の実施形態では、細菌感染症は、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ感染症（ライム病）である。ウイルス感染症の処置を含む一部の実施形態では、感染症は、インフルエンザウイルス（例えば、Ａ型インフルエンザウイルス）または呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染症である。さらに他の実施形態では、感染症は、ＣＮＳ感染症、例えば、髄膜炎（例えば、細菌性髄膜炎）、脳炎、または脳性マラリアなどである。

【0307】

感染性疾患を処置するためのパラオキソナーゼ融合分子は、典型的に、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、ＳＯＤ１、または抗ＴＧＦ－β中和ポリペプチドを第１の生物学的に活性なポリペプチドとして含むか、または単一特異性パラオキソナーゼ融合分子であり得る。より特定の変形形態では、感染性疾患処置のための融合分子は、構造ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＲＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＲＮａｓｅ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＳＯＤ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＳＯＤ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＮＦα－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＮＦα－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＧＦβ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＧＦβ－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、もしくはＰＯＮ１－Ｌ１－Ｆｃを有するポリペプチドであるか、または前述の融合ポリペプチドのいずれかのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質である。一部のそのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６、（ｉｉ）配列番号４０の残基２１～７６４、（ｉｉｉ）配列番号４８の残基２１～７４０、（ｉｖ）配列番号５０の残基２３～７８１、（ｖ）配列番号５２の残基２３～７８１、（ｖｉ）配列番号５４の残基２３～７９１、（ｖｉｉ）配列番号９４の残基２１～８６０、（ｖｉｉｉ）配列番号９８の残基２１～８６０、（ｉｘ）配列番号１０２の残基２１～８６１、（ｘ）配列番号１０６の残基２１～８６１、（ｘｉ）配列番号１２２の残基２１～６１３、（ｘｉｉ）配列番号１４２の残基２１～６１０、（ｘｉｉｉ）配列番号１４８の残基２１～９０６、（ｘｉｖ）配列番号１５８の残基２１～８９６、（ｘｖ）配列番号１６０の残基２１～９０６、（ｘｖｉ）配列番号１６２の残基２１～９０６、または（ｘｖｉｉ）配列番号１６４の残基２１～９０６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0308】

グラム陰性菌によるバイオフィルム形成を処置するための方法の一部の実施形態では、グラム陰性菌は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａである。グラム陰性菌によるバイオフィルム形成を処置するための特定の変形形態では、バイオフィルム形成処置のための融合分子は、構造ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、もしくはＰＯＮ１－Ｌ１－Ｆｃを有するポリペプチドであるか、または前述の融合ポリペプチドのいずれかのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質であり、一部のそのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６、（ｉｉ）配列番号１２２の残基２１～６１３、（ｉｉｉ）配列番号１４２の残基２１～６１０、（ｘｉｘ）配列番号１４８の残基２１～９０６、（ｘｘ）配列番号１５８の残基２１～８９６、（ｘｘｉ）配列番号１６０の残基２１～９０６、（ｘｘｉｉ）配列番号１６２の残基２１～９０６、または（ｘｘｉｉｉ）配列番号１６４の残基２１～９０６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0309】

本発明に従って処置され得る代謝性疾患としては、例えば、２型糖尿病および肥満症が挙げられる。代謝性疾患を処置するための方法の特定の変形形態では、代謝性疾患処置のための融合分子は、構造ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＲＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＲＮａｓｅ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、もしくはＰＯＮ１－Ｌ１－Ｆｃを有するポリペプチドであるか、または前述の融合ポリペプチドのいずれかのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質であり、一部のそのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６、（ｉｉ）配列番号４０の残基２１～７６４、（ｉｉｉ）配列番号４８の残基２１～７４０、（ｉｖ）配列番号１２２の残基２１～６１３、（ｖ）配列番号１４２の残基２１～６１０、（ｖｉ）配列番号１４８の残基２１～９０６、（ｖｉｉ）配列番号１５８の残基２１～８９６、（ｖｉｉｉ）配列番号１６０の残基２１～９０６、（ｉｘ）配列番号１６２の残基２１～９０６、または（ｘ）配列番号１６４の残基２１～９０６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0310】

本発明に従って処置され得る心血管疾患としては、例えば、アテローム性動脈硬化症によって特徴付けられる心血管疾患が挙げられる。一部の実施形態では、アテローム性動脈硬化症によって特徴付けられる心血管疾患は、冠動脈心疾患または虚血性脳卒中である。冠動脈心疾患の処置を含むより特定の変形形態では、冠動脈心疾患は、急性冠症候群によって特徴付けられる。心血管疾患を処置するための方法の、ある特定の変形形態では、心血管疾患処置のための融合分子は、構造ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＲＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＲＮａｓｅ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、もしくはＰＯＮ１－Ｌ１－Ｆｃを有するポリペプチドであるか、または前述の融合ポリペプチドのいずれかのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質であり、一部のそのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６、（ｉｉ）配列番号４０の残基２１～７６４、（ｉｉｉ）配列番号４８の残基２１～７４０、（ｉｖ）配列番号１２２の残基２１～６１３、（ｖ）配列番号１４２の残基２１～６１０、（ｖｉ）配列番号１４８の残基２１～９０６、（ｖｉｉ）配列番号１５８の残基２１～８９６、（ｖｉｉｉ）配列番号１６０の残基２１～９０６、（ｉｘ）配列番号１６２の残基２１～９０６、または（ｘ）配列番号１６４の残基２１～９０６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0311】

血栓症、敗血症、または虚血性再灌流を処置するための方法の一部の実施形態では、そのような処置のための融合分子は、構造ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＲＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、もしくはＲＮａｓｅ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１を有するポリペプチドであるか、または前述の融合ポリペプチドのいずれかのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質であり、一部のそのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６、（ｉｉ）配列番号４０の残基２１～７６４、（ｉｉｉ）配列番号４８の残基２１～７４０、（ｉｖ）配列番号１４８の残基２１～９０６、（ｖ）配列番号１５８の残基２１～８９６、（ｖｉ）配列番号１６０の残基２１～９０６、（ｖｉｉ）配列番号１６２の残基２１～９０６、または（ｖｉｉｉ）配列番号１６４の残基２１～９０６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0312】

抗リン脂質症候群、血栓症、または虚血性脳卒中を処置するための方法の一部の実施形態では、本明細書に記載のＤＮａｓｅ含有融合分子は、血栓溶解剤を含む併用療法の別個の療法の１つとして患者に投与される。一部のそのような実施形態では、血栓溶解剤は、アニストレプラーゼ、レテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、ｔ－ＰＡ、テネクテプラーゼ、およびロキナーゼから選択される。

【0313】

硫黄マスタードガス（ＳＭ）への曝露または有機リン（例えば、タブン、サリン、ソマン、もしくはシクロサリン）への曝露を処置するための方法の一部の実施形態では、そのような曝露の処置のための融合分子は、構造ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＲＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＲＮａｓｅ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＳＯＤ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＳＯＤ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＴＬＡ４－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＴＬＡ４－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＤ４０－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＤ４０－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＮＦα－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＮＦα－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＧＦβ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＧＦβ－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、もしくはＰＯＮ１－Ｌ１－Ｆｃを有するポリペプチドであるか、または前述の融合ポリペプチドのいずれかのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質であり、一部のそのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６、（ｉｉ）配列番号１２８の残基２１～８９６、（ｉｉｉ）配列番号１３０の残基２１～８９６、（ｉｖ）配列番号４０の残基２１～７６４、（ｖ）配列番号４８の残基２１～７４０、（ｖｉ）配列番号５０の残基２３～７８１、（ｖｉｉ）配列番号５２の残基２３～７８１、（ｖｉｉｉ）配列番号５４の残基２３～７９１、（ｉｘ）配列番号６６の残基２１～７３６、（ｘ）配列番号７４の残基２１～８０４、（ｘｉ）配列番号７８の残基２１～８０４、（ｘｉｉ）配列番号８２の残基２１～８０４、（ｘｉｉｉ）配列番号８６の残基２１～８０４、（ｘｉｖ）配列番号９０の残基２１～８０４、（ｘｖ）配列番号９４の残基２１～８６０、（ｘｖｉ）配列番号９８の残基２１～８６０、（ｘｖｉｉ）配列番号１０２の残基２１～８６１、（ｘｖｉｉｉ）配列番号１０６の残基２１～８６１、（ｘｉｘ）配列番号１２２の残基２１～６１３、（ｘｘ）配列番号１３２の残基２１～６１３、（ｘｘｉ）配列番号１３４の残基２１～６１３、（ｘｘｉｉ）配列番号１４２の残基２１～６１０、（ｘｘｉｉｉ）配列番号１４４の残基２１～６１０、（ｘｘｉｖ）配列番号１４６の残基２１～６１０、（ｘｘｖ）配列番号１４８の残基２１～９０６、（ｘｘｖｉ）配列番号１５８の残基２１～８９６、（ｘｘｖｉｉ）配列番号１６０の残基２１～９０６、（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号１６２の残基２１～９０６、または（ｘｘｉｘ）配列番号１６４の残基２１～９０６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0314】

本発明に従って処置され得る肝臓疾患または障害としては、慢性肝臓疾患、例えば、非アルコール性脂肪性肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール関連肝臓疾患（ＡＬＤ）、門脈圧亢進症、および肝臓移植後の合併症などが挙げられる。非アルコール性脂肪性肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）の処置を含む一部の変形形態では、ＮＡＦＬＤは、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。肝臓疾患を処置するための方法の特定の変形形態では、肝臓疾患処置のための融合分子は、構造ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＤ４０－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＤ４０－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＧＦβ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＧＦβ－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、もしくはＰＯＮ１－Ｌ１－Ｆｃを有するポリペプチドであるか、または前述の融合ポリペプチドのいずれかのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質であり、一部のそのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６、（ｉｉ）配列番号７４の残基２１～８０４、（ｉｉｉ）配列番号７８の残基２１～８０４、（ｉｖ）配列番号８２の残基２１～８０４、（ｖ）配列番号８６の残基２１～８０４、（ｖｉ）配列番号９０の残基２１～８０４、（ｖｉｉ）配列番号１０２の残基２１～８６１、（ｖｉｉｉ）配列番号１０６の残基２１～８６１、（ｉｘ）配列番号１２２の残基２１～６１３、（ｘ）配列番号１４２の残基２１～６１０、（ｘｉ）配列番号１４８の残基２１～９０６、（ｘｉｉ）配列番号１５８の残基２１～８９６、（ｘｉｉｉ）配列番号１６０の残基２１～９０６、（ｘｉｖ）配列番号１６２の残基２１～９０６、または（ｘｖ）配列番号１６４の残基２１～９０６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0315】

本発明による処置に適している線維性疾患または障害としては、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、炎症性肺疾患、慢性肝臓疾患、および慢性腎臓疾患が挙げられる。炎症性肺疾患の処置を含む一部の変形形態では、線維性疾患は、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患（例えば、特発性肺線維症もしくはサルコイドーシス）、急性呼吸促迫症候群、または喘息である。慢性肝臓疾患の処置を含む一部の変形形態では、線維性疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎、アルコール関連肝臓疾患、門脈圧亢進症、または肝臓移植後の合併症である。慢性腎臓疾患の処置を含む一部の変形形態では、線維性疾患は、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、または膜性糸球体腎炎である。肝臓疾患を処置するための方法の特定の変形形態では、肝臓疾患処置のための融合分子は、構造ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＤ４０－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＣＤ４０－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＧＦβ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＧＦβ－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、もしくはＰＯＮ１－Ｌ１－Ｆｃを有するポリペプチドであるか、または前述の融合ポリペプチドのいずれかのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質であり、一部のそのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６、（ｉｉ）配列番号７４の残基２１～８０４、（ｉｉｉ）配列番号７８の残基２１～８０４、（ｉｖ）配列番号８２の残基２１～８０４、（ｖ）配列番号８６の残基２１～８０４、（ｖｉ）配列番号９０の残基２１～８０４、（ｖｉｉ）配列番号１０２の残基２１～８６１、（ｖｉｉｉ）配列番号１０６の残基２１～８６１、（ｉｘ）配列番号１２２の残基２１～６１３、（ｘ）配列番号１４２の残基２１～６１０、（ｘｉ）配列番号１４８の残基２１～９０６、（ｘｉｉ）配列番号１５８の残基２１～８９６、（ｘｉｉｉ）配列番号１６０の残基２１～９０６、（ｘｉｖ）配列番号１６２の残基２１～９０６、または（ｘｖ）配列番号１６４の残基２１～９０６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0316】

がんを処置するためのパラオキソナーゼ融合分子は、典型的に、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、または抗ＴＧＦ－β中和ポリペプチドを第１の生物学的に活性なポリペプチドとして含む。より特定の変形形態では、がん処置のための融合分子は、構造ＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＲＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、ＲＮａｓｅ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、抗ＴＧＦβ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１、もしくは抗ＴＧＦβ－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１を有するポリペプチドであるか、または前述の融合ポリペプチドのいずれかのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質であり、一部のそのような実施形態では、融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２の残基２１～８９６、（ｉｉ）配列番号４０の残基２１～７６４、（ｉｉｉ）配列番号４８の残基２１～７４０、（ｉｘ）配列番号１０２の残基２１～８６１、（ｖ）配列番号１０６の残基２１～８６１、（ｖｉ）配列番号１４８の残基２１～９０６、（ｖｉｉ）配列番号１５８の残基２１～８９６、（ｖｉｉｉ）配列番号１６０の残基２１～９０６、（ｉｘ）配列番号１６２の残基２１～９０６、または（ｘ）配列番号１６４の残基２１～９０６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0317】

本発明に従って処置され得るがんとしては、例えば、以下のものが挙げられる：頭頸部のがん（例えば、口腔、中咽頭（orophyarynx）、上咽頭、下咽頭、鼻腔もしくは副鼻腔、咽頭、唇、または唾液腺のがん）；肺がん（例えば、非小細胞肺がん、小細胞癌、または中皮腫（mesothelimia））；消化管がん（例えば、結腸直腸がん、胃がん、食道がん、または肛門がん）；消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）；膵臓腺癌；膵腺房細胞癌；小腸のがん；肝臓または胆管のがん（例えば、肝細胞腺腫、肝細胞癌、血管肉腫、肝外または肝内胆管癌、ファーター膨大部のがん、または胆嚢がん）；乳がん（例えば、転移性乳がんまたは炎症性乳がん）；婦人科がん（例えば、子宮頸がん、卵巣がん、卵管がん、腹膜癌、膣がん、外陰部がん、妊娠性トロホブラスト腫瘍、または子宮内膜がんもしくは子宮肉腫を含む子宮がん）；泌尿器系のがん（例えば、前立腺癌；膀胱がん；陰茎がん；尿道がん、または腎盂および尿管を含む腎臓がん、例えば腎細胞癌もしくは移行上皮癌など）；精巣がん；中枢神経系（ＣＮＳ）のがん、例えば、頭蓋内腫瘍（例えば、星状細胞腫、未分化星状細胞腫、神経膠芽種、乏突起神経膠腫、退形成乏突起神経膠腫、上衣腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、髄芽腫、胚細胞腫瘍、松果体新生物、髄膜腫、下垂体腫瘍、神経鞘の腫瘍（例えば、シュワン腫）、脊索腫、頭蓋咽頭腫、脈絡叢腫瘍（例えば、脈絡叢癌）、または神経細胞もしくは膠細胞起源の他の頭蓋内腫瘍）または脊髄の腫瘍（例えば、シュワン腫、髄膜腫）；内分泌腺新生物（例えば、甲状腺がん、例えば、甲状腺癌、髄様がん、もしくは甲状腺リンパ腫など；膵内分泌腫瘍、例えば、インスリノーマもしくはグルカゴノーマなど；副腎癌、例えば、褐色細胞腫など；カルチノイド腫瘍；または副甲状腺癌）；皮膚がん（例えば、扁平上皮癌；基底細胞癌；カポジ肉腫；または悪性黒色腫、例えば、眼球内黒色腫など）；骨がん（例えば、骨肉腫（ｂｏｎｅ ｓａｒｃｏｍａ）、例えば、骨肉腫（ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）、軟骨骨腫、またはユーイング肉腫）；多発性骨髄腫；緑色腫；軟部組織肉腫（例えば、線維性腫瘍または線維組織球性腫瘍）；平滑筋または骨格筋の腫瘍；血管またはリンパ管血管周囲腫瘍（例えば、カポジ肉腫）；滑膜腫瘍；中皮腫；神経性腫瘍；傍神経節腫瘍；骨外性軟骨性または骨性腫瘍；ならびに多能性間葉系腫瘍。一部のそのような実施形態では、本明細書に記載のパラオキソナーゼ融合分子は、例えば、免疫調節療法（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞療法（例えば、June et al., Science 359:1361-1365, 2018を参照されたい）、もしくは免疫チェックポイント阻害剤を含む療法）、放射線療法または化学療法を含む併用療法などの、併用療法の別個の療法の１つとして、がん患者に投与される。

【0318】

ある特定の実施形態では、併用がん療法は、本明細書に記載のＤＮａｓｅ－ＰＯＮ、ＲＮａｓｅ－ＰＯＮ、または抗ＴＧＦβ－ＰＯＮ融合分子と、標的化療法薬、例えば、特定の細胞表面もしくは細胞外抗原を標的化する治療用モノクローナル抗体、または細胞内タンパク質（例えば、細胞内酵素）を標的化する小分子などを含む。例示的な抗体標的化療法薬としては、抗ＶＥＧＦ（例えば、ベバシズマブ）、抗ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブ）、抗ＣＴＬＡ－４（例えば、イピリムマブ）、抗ＰＤ－１（例えば、ニボルマブ）、および抗ＰＤ－Ｌ１（例えば、ペムブロリズマブ）が挙げられる。例示的な小分子標的化療法薬としては、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（例えば、セリシクリブ）、ＢＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラフェニブまたはダブラフェニブ）、およびＭＥＫキナーゼ阻害剤（例えば、トラメチニブ）が挙げられる。

【0319】

免疫チェックポイント阻害剤を含む一部のがん併用療法変形形態では、併用療法は、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法、抗ＣＴＬＡ－４療法、または両方を含む。ある特定の態様では、本明細書に記載のＤＮａｓｅ－ＰＯＮ、ＲＮａｓｅ－ＰＯＮ、または抗ＴＧＦβ－ＰＯＮ融合分子は、抗ＣＴＬＡ－４または抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法のどちらかに対する奏効率はもちろん、抗ＣＴＬＡ－４と抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の併用療法に対する奏効率も上昇させることができる。本発明の融合分子は、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１、またはこれらの組合せに関連する毒性を低減させることにも有用であり得る。

【0320】

ある特定の変形形態では、本発明に従って処置されるがんは、悪性黒色腫、腎細胞癌、非小細胞肺がん、膀胱がん、および頭頸部がんから選択される。これらのがんは、免疫チェックポイント阻害剤 抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１および抗ＣＴＬＡ－４に対して応答を示した。Grimaldi et al., Expert Opin. Biol. Ther. 16:433-41, 2016；Gunturi et al., Curr. Treat. Options Oncol. 15:137-46, 2014；Topalian et al., Nat. Rev. Cancer 16:275-87, 2016を参照されたい。したがって、一部のより特異的な変形形態では、これらのがんのいずれかが、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法、抗ＣＴＬＡ－４療法、または両方と組み合わせて、本明細書に記載のＤＮａｓｅ－ＰＯＮ、ＲＮａｓｅ－ＰＯＮ、または抗ＴＧＦβ－ＰＯＮ融合分子で処置される。

【0321】

他の態様では、本発明は、対象における脂質酸化を低減させるための方法を提供する。方法は、一般に、本明細書に記載の融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質の有効量を対象に投与するステップを含み、対象における１つまたは複数の酸化脂質が低減される。一部の実施形態では、方法は、対象における疾患または障害（例えば、上記で論じられた疾患または障害）の存在に関連する１つまたは複数の酸化脂質を低減させる。他の実施形態では、１つまたは複数の酸化脂質は、そのような疾患または障害を発症するリスクに関連し、特定の変形形態では、融合分子での処置は、対象における疾患または障害の発症リスクを低下させる。

【0322】

別の態様では、本発明は、対象を老化から保護するための方法を提供する。方法は、一般に、本明細書に記載の融合ポリペプチドの融合ポリペプチドのまたはダイマー性タンパク質の有効量を対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、対象は、加齢に伴う疾患または障害（例えば、炎症性疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患、心血管疾患、または線維性疾患）を有する。他の実施形態では、対象は、そのような加齢に伴う疾患または障害を発症するリスクがあり、融合分子での処置は、対象における疾患または障害のリスクを低下させる。

【0323】

上記の疾患または障害を処置する、脂質酸化を低減させる、または老化から保護するための方法の一部の実施形態では、方法は、（ａ）上記の式Ｘ－Ｌ２－ＰもしくはＰ－Ｌ１－Ｘを有するパラオキソナーゼ融合ポリペプチドの有効量、またはこの融合ポリペプチドのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質の有効量、および（ｂ）生物学的に活性なＤＮａｓｅの有効量を、患者に投与するステップを含む併用療法である。そのような実施形態は、例えば、ＮＥＴｏｓｉｓによって特徴付けられる疾患および障害の処置に、特に有用である。一部の変形形態では、方法は、構造Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１もしくはＰＯＮ１－Ｌ１－Ｆｃを有するパラオキソナーゼ融合ポリペプチド、またはそのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質の投与を含み、一部のそのような実施形態では、パラオキソナーゼ融合ポリペプチドは、構造Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１を有し、（ｉ）配列番号１２２の残基２１～６１３、（ｉｉ）配列番号１３２の残基２１～６１３、（ｉｉｉ）配列番号１３４の残基２１～６１３、（ｉｖ）配列番号１４２の残基２１～６１０、（ｖ）配列番号１４４の残基２１～６１０、または（ｖｉ）配列番号１４６の残基２１～６１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。生物学的に活性なＤＮａｓｅは、例えば、本明細書に記載のＤＮａｓｅ１またはＤＮａｓｅ１Ｌ３ポリペプチド（例えば、本明細書に記載のＤＮａｓｅ含有パラオキソナーゼ融合体のＤＮａｓｅ成分に対応するポリペプチド、例えば、配列番号１８の残基２１～２８０、配列番号２０の残基２１～２８０、または配列番号１５２の残基２１～２８０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる増強されたＤＮａｓｅ１ポリペプチドなど）であり得る。一部の実施形態では、ＤＮａｓｅは、アミノ末端位置からカルボキシル末端位置へと、Ｄ－Ｌ１－Ｘ_ｄ（式中、Ｄは、ＤＮａｓｅであり、Ｌ１は、ポリペプチドリンカー（例えば、ＤＮａｓｅ含有パラオキソナーゼ融合分子に関して本明細書に記載のＬ１リンカー）であり、Ｘ_ｄは、本明細書に記載の免疫グロブリンＦｃ領域である）を含む融合ポリペプチドの中に含有され（またはこの融合ポリペプチドのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質とともに含有され）、一部のそのような実施形態では、ＤＮａｓｅ融合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号６０の残基２１～５３８もしくは２１～５３７、（ｉｉ）配列番号６２の残基２１～５４８もしくは２１～５４７、（ｉｉｉ）配列番号１５５の残基２１～５３８もしくは２１～５３７、（ｉｖ）配列番号１５６の残基２１～５４８もしくは２１～５４７、（ｖ）配列番号１３８の残基２１～５４８もしくは２１～５４７、または（ｖｉ）配列番号１４０の残基２１～５４８もしくは２１～５４７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0324】

上記のパラオキソナーゼ融合分子およびＤＮａｓｅの投与を含む、併用療法の一部の実施形態では、ＤＮａｓｅは、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５３または配列番号１５４に示されるアミノ酸配列を含むＤＮａｓｅ１－Ｌ１－Ｆｃ融合ポリペプチドの中に含有される。ＤＮａｓｅ融合ポリペプチドが配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５３、または配列番号１５４に示されるアミノ酸配列を含む、併用療法の方法のある特定の変形形態では、（ｉ）３１５および３１６位の各々におけるアミノ酸は、アラニンであり、（ｉｉ）３１９位におけるアミノ酸は、セリンであり、（ｉｉｉ）３７８位におけるアミノ酸は、アラニン、グルタミンもしくはグリシンであり、３４６位におけるアミノ酸は、必要に応じてアラニンであり、（ｉｖ）４１０位におけるアミノ酸は、アラニン、グリシン、もしくはセリンであり、（ｖ）４１２位におけるアミノ酸は、セリンもしくはアラニンであり、（ｖｉ）３３３位におけるアミノ酸は、チロシンであり、３３５位におけるアミノ酸は、スレオニンであり、３３７位におけるアミノ酸は、グルタミン酸であり、および／または（ｖｉｉ）５０９位におけるアミノ酸は、ロイシンであり、５１５位におけるアミノ酸は、セリンである。ＤＮａｓｅ融合ポリペプチドが配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５３または配列番号１５４に示されるアミノ酸配列を含む、併用療法の方法の他の相互に排他的でない変形形態では、２６１～２９６位に対応するアミノ酸配列は、（ｉ）「Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＧＬｙ－Ｓｅｒ］_ｎ（式中、ｎは、４～７の整数である）、（ｉｉ）「Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］_ｎ（式中、ｎは、５～９の整数である）、および（ｉｉｉ）「Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］_ｎ（式中、ｎは、６～１２の整数である）からなる群から選択される式を有する、Ｇｌｙ－Ｓｅｒタンデムリピート配列を含み、一部のそのような実施形態では、２６１～２９６位に対応するアミノ酸配列は、（ｉ）「Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］_ｎ（式中、ｎは、４～６の整数である）、（ｉｉ）「Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］_ｎ（式中、ｎは、５～７の整数である）、および（ｉｉｉ）「Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］_ｎ（式中、ｎは、６～１０の整数である）からなる群から選択される式を有する、Ｇｌｙ－Ｓｅｒタンデムリピート配列を含む。ＤＮａｓｅ融合ポリペプチドが配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５３、または配列番号１５４に示されるアミノ酸配列を含む、併用療法の方法のさらに他の相互に排他的でない変形形態では、２６１位におけるアミノ酸は、アスパラギン酸であり、２６２位におけるアミノ酸は、ロイシンであり、２６３位におけるアミノ酸は、セリンであり、２９４位におけるアミノ酸は、スレオニンであり、２９５位におけるアミノ酸は、グリシンであり、および／または２９６位におけるアミノ酸は、ロイシンである。ＤＮａｓｅ融合ポリペプチドが配列番号１４９または配列番号１５３に示されるアミノ酸配列を含む、併用療法の方法の他の相互に排他的でない変形形態では、（ｉ）７４および１０５位の各々におけるアミノ酸は、独立して、リシンもしくはアルギニンであり、ならびに／または（ｉｉ）１１４位におけるアミノ酸は、フェニルアラニンである。

【0325】

上記の疾患または障害を処置する、脂質酸化を低減させる、または老化から保護するための方法の一部の実施形態では、方法は、（ａ）上記の式Ｘ－Ｌ２－ＰもしくはＰ－Ｌ１－Ｘを有するパラオキソナーゼ融合ポリペプチド、またはこの融合ポリペプチドのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質の有効量、および（ｂ）生物学的に活性なアポリポタンパク質Ａ－１（ＡｐｏＡ１）（例えば、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／０４４４２４に記載のＡｐｏＡ１－Ｆｃ融合ポリペプチド、またはこの融合ポリペプチドのダイマー化により形成されるダイマー性タンパク質）の有効量を、患者に投与するステップを含む併用療法である。

【0326】

治療上の使用のために、本明細書に記載の融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質は、処置が求められる疾患または障害の管理に関連する従来の方法論と一致する様式で送達される。本開示に従って、融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質の有効量は、疾患または障害の予防または処置に十分な時間、十分な条件下で、そのような処置を必要とする対象に投与される。

【0327】

本明細書に記載の融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質の投与のための対象には、既存の疾患または障害を呈している患者ばかりでなく特定の疾患または障害を発症するリスクが高い患者も含まれる。ある特定の実施形態では、対象は、処置が求められる疾患または障害を有すると診断された。さらに、対象は、処置の過程において疾患または障害のあらゆる変化について（例えば、疾患または障害の臨床症状の増加または減少について）モニターされ得る。また、一部の変形形態では、対象は、パラオキソナーゼ、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、ＳＯＤ１、ＣＴＬＡ－４細胞外ドメイン、ＣＤ４０細胞外ドメイン、またはＴＮＦαもしくはＴＧＦ－βに特異的に結合しそれを中和するポリペプチド（例えば、抗体）から選択されるタンパク質の投与を含む処置を必要とする別の疾患または障害に罹患していない。

【0328】

予防的応用では、医薬組成物または薬剤は、特定の疾患に罹患しやすいまたは別様に特定の疾患のリスクがある患者に、そのリスクを消失もしくは低下させるのにまたはその疾患の開始を遅らせるのに十分な量で、投与される。治療的応用では、組成物または薬剤は、そのような疾患が疑われるまたは既に罹患している患者に、疾患およびその合併症の症状を治癒させるのにまたは少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で、投与される。これを果たすために妥当な量は、治療または薬学的有効用量または量と呼ばれる。予防レジメンと治療レジメンの両方において、薬剤は、十分な応答（例えば、炎症性肺疾患では肺胞液クリアランスの増進）が達成されるまで数回の投薬で通常は投与される。典型的には、応答がモニターされ、所望の応答が消え始めたら反復投薬が施される。

【0329】

本発明の方法による処置のための対象患者を同定するために、一般に認められているスクリーニング方法を用いて、特定の疾患に関連するリスク因子を決定することまたは対象において同定された既存の疾患の状態を決定することができる。そのような方法は、例えば、個体が、特定の疾患を有すると診断された親戚を有するかどうかを決定すること、を含み得る。スクリーニング方法は、例えば、遺伝的要素があることが分かっている特定の疾患についての家族の状態を決定するための従来の精密検査も含み得る。この目的に向けて、目的の特定の疾患に関連する遺伝子マーカーを有する個体を同定するために、ヌクレオチドプローブが常套的に用いられ得る。加えて、特定の疾患のマーカーを同定するのに有用である多種多様な免疫学的方法が、当技術分野において公知である。既知の患者総体症状、年齢因子、関連リスク因子などによって示されるようなスクリーニングを実行することができる。これらの方法によって、臨床医は、処置のために本明細書に記載される方法を必要とする患者を常套的に選択することが可能になる。これらの方法に従って、本発明の融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質を使用する処置を、独立した処置プログラムとして実行することができ、または他の処置の追跡、補助もしくは協調処置レジメンとして実行することができる。

【0330】

ＮＥＴｏｓｉｓによって特徴付けられる疾患または障害の処置のために、ＮＥＴ標的化療法による恩恵を受ける可能性が高い対象患者を、例えば、候補患者におけるＮＥＴを測定することにより、同定することができる。ＮＥＴをｉｎ ｖｉｖｏで測定するための複数の方法がある（総説については、例えば、Masuda et al., Clin. Chim. Acta 459:89-93, 2016を参照されたい）。１つの方法は、フローサイトメトリーを使用して、非細胞透過性ＤＮＡ色素で染色することにより細胞関連ＤＮＡを測定する（Zharkova et al., Cytometry A 95:268-278, 2019）。他の方法は、ＤＮＡに関連するミエロペルオキシダーゼ活性の測定、またはシトルリン化ヒストンＨ３の測定を含む（例えば、Matsuda et al.、上掲を参照されたい）。さらに別の方法は、血中好中球を自己血漿とともにインキュベートすることによりＮＥＴｏｓｉｓを測定する（Abrams et al., Am. J. Resp. Crit. Care Med. 200:869, 2019）。この方法は、重症患者における播種性血管内凝固を予測することができた（同書）。

【0331】

投与のために、本発明による融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質は、医薬組成物として製剤化される。本明細書に記載の融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質を含む医薬組成物を、治療用分子が薬学的に許容される担体と混合物で併用される薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って、製剤化するこができる。組成物は、その投与がレシピエント患者によって耐容され得る場合、「薬学的に許容される担体」であると言われる。滅菌リン酸緩衝食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。他の好適な担体は、当業者に周知である。例えば、Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995)を参照されたい。製剤は、１つまたは複数の賦形剤、保存薬、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面でのタンパク質損失を防止するためのアルブミンなどをさらに含み得る。

【0332】

本発明の融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質を含む医薬組成物は、対象に有効量で投与される。融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質を、対象に、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、心房内、関節内、非経口、鼻腔内、肺内、経皮、胸膜内、くも膜下腔内および経口投与経路によるものを含む、様々な投与方式によって、投与することができる。予防および処置を目的として、融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質を、対象に、単回ボーラス送達で、長期間にわたって連続送達（例えば、連続経皮送達）によって、または反復投与プロトコールで（例えば、毎時間、毎日、もしくは毎週）、投与することができる。

【0333】

一部の実施形態では、本発明の融合分子またはダイマー性タンパク質を含む医薬組成物は、噴霧による肺への送達用に製剤化される。エリスロポエチン－ＦＣ、インターフェロンベータ１ａ－ＦｃおよびＦＳＨ－Ｆｃをはじめとする、Ｆｃ融合タンパク質の肺送達の以前の研究は、免疫グロブリン輸送ＦｃＲｎ経路が肺内で活性であり、２０％～５０％のバイオアベイラビリティをもたらすことを示した（Bitonti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9763-9768, 2004；Bitonti and Dumont, Adv. Drug Deliv. Rev. 58:1106, 2006；Valle et al., J. Interferon Cytokine Res. 32:178-184, 2012を参照されたい）。本明細書に記載のＦｃＲｎ結合パラオキソナーゼ融合分子（例えば、Ｆｃ領域を含有するパラオキソナーゼ融合分子）の肺送達は、局所的にも、循環および末梢器官においても作用し得る。処置が、本明細書に記載のパラオキソナーゼ融合分子およびＤＮａｓｅでの併用療法である、ある特定の実施形態では、パラオキソナーゼ融合分子（例えば、本明細書に記載のＦｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１融合体）とＤＮａｓｅ（例えば、本明細書に記載のＤＮａｓｅ－Ｆｃ融合体）の両方が、ネブライザーにより送達される。ネブライザーによる肺への送達を含む一部の変形形態では、処置されることになる疾患または障害は、炎症性肺疾患（例えば、嚢胞性線維症、間質性肺疾患（例えば、特発性肺線維症またはサルコイドーシス）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、硫黄マスタードガスへの曝露、有機リンへの曝露）、グラム陰性菌（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）によるバイオフィルム形成、および敗血症から選択される。他の相互に排他的でない変形形態では、噴霧による肺への送達用のＦｃＲｎ結合融合分子（例えば、本明細書に記載のＦｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１融合体
）は、対応する野生型Ｆｃと比較してＦｃＲｎ結合親和性が上昇されたＦｃバリアントを含み、したがって、ネブライザーでの吸入後に、融合分子の半減期を延長し、血液中の濃度を上昇させることになる。

【0334】

複数の生物製剤が、噴霧後に生物活性を保持するよう製剤化されることに成功している（例えば、Hertel et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 93:79-94, 2015を参照されたい）。本発明のパラオキソナーゼ融合分子の送達用の製剤は、肺送達に好適な賦形剤、例えば、多くのバイオ医薬製剤に含まれている界面活性剤であるポリソルベート８０（ＰＳ８０）またはポリソルベート２０（ＰＳ２０）などを含み得る。そのような安定化賦形剤は、それらの臨界ミセル濃度より高い濃度で適用されたとき、タンパク質を気液界面での分解から保護する（例えば、０．０１％より高い％のＰＳ８０は、Ｇ－ＣＳＦ、ＬＤＨ、ｒｈＣｏｎＩＦＮ、およびｔ－Ｐａの安定化に有効であり、０．０４％で適用されたＰＳ２０は、Ｆｃ－ガンマＲＩＩｂの保護に有効であった）。別の好適な安定化賦形剤は、例えば０．３５％またはそれより高い％で、適用されるＨＰ－ベータ－シクロデキストリン（ＨＰ－ベータ－ＣＤ）である（Hertel et al.、上掲を参照されたい）。一部の変形形態では、安定化賦形剤は、本明細書に記載のパラオキソナーゼ融合分子（例えば、ＤＮａｓｅ１－Ｆｃ－ＰＯＮ１）の噴霧送達に必要とされない（例えば、野生型ヒトＤＮａｓｅ１（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標））は、賦形剤を必要とせずにジェットまたは振動メッシュ（ＶＭ）ネブライザーのどちらかでの噴霧後に凝集せず、安定したままであることが示されている、Cipolla et al., Pharm. Res. 11:491-498, 1994；Scherer et al., J. Pharm. Sci. 100:98-109, 2011を参照されたい）。

【0335】

有効な投薬量の決定は、典型的に、ヒト臨床試験により追跡調査される動物モデル研究に基づくものであり、モデル対象における対象疾患または障害の発生率または重症度を有意に低下させる有効投薬量および投与プロトコールの決定によって導かれる。本発明の組成物の有効用量は、投与の手段、標的部位、患者の生理状態、患者がヒトであるのか動物であるのか、投与される他の薬物療法、処置が予防的であるのか治療的であるのか、ならびに組成物自体の比活性および個体において所望の応答を惹起するその能力をはじめとする、多くの異なる因子によって変わる。通常、患者はヒトであるが、一部の疾患では、患者が非ヒト哺乳動物であることもある。典型的に、投薬量レジメンは、最適な治療応答をもたらすように、即ち、安全性および有効性を最適化するように、調整される。したがって、治療または予防有効量は、いずれの望ましくない副次的効果より有益な効果のほうが勝る（例えば、炎症性肺疾患の処置の場合、いずれの望ましくない副次的効果より、例えば、肺胞液クリアランスの改善、肺の生理状態および機能の改善などのような、いずれかの有益な効果のほうが勝る）量でもある。本発明の融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質の投与について、投薬量は、典型的に、対象の体重のｋｇあたり約０．１μｇ～１００ｍｇ、または１μｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、より通常は１０μｇ～５ｍｇ／ｋｇの範囲である。より特異的な実施形態では、薬剤の有効量は、約１μｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの間、約１０μｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの間、または約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇの間である。この範囲内の投薬量を、例えば、１日に複数回の投与または１日１回、週１回、２週間に１回、または月１回投与を含む、単回または複数回投与により達成することができる。例えば、ある特定の変形形態では、レジメンは、初回投与、続いての週１回または２週間に１回の間隔での複数回の後続投与からなる。別のレジメンは、初回投与、続いての月１回または２ヵ月に１回の間隔での複数回の後続投与からなる。あるいは、投与は、疾患もしくは障害の臨床症状のモニタリングおよび／または疾患バイオマーカーもしくは他の疾患相関因子のモニタリングによる指摘に応じて不定期であることもある。

【0336】

ネブライザーでの吸入による送達（例えば、炎症性肺疾患、例えば、嚢胞性線維症または間質性肺疾患などの処置のための）を含む、一部の特異的な実施形態では、本発明の融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質は、１日に約１ｍｇ～約５ｍｇ、または約２ｍｇ～約４ｍｇの用量でネブライザーにより肺に投与される。全身投与（例えば、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、関節リウマチ、または炎症性腸疾患の処置のための）を含む、他の特異的な実施形態では、本発明の融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質は、１ヵ月～６週間ごとに約５０ｍｇ～約１，０００ｍｇ、約５０ｍｇ～約８００ｍｇ、約５０ｍｇ～約５００ｍｇ、約１００ｍｇ～約５００ｍｇ、約１００ｍｇ～約４００ｍｇ、約１００ｍｇ～約３００ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、または約２００ｍｇの用量で（例えば、静脈内または皮下注射により）投与される。本明細書に記載のパラオキソナーゼ融合分子およびＤＮａｓｅでの併用療法については、パラオキソナーゼ融合分子（例えば、本明細書に記載のＦｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１融合体）とＤＮａｓｅ（例えば、本明細書に記載のＤＮａｓｅ－Ｆｃ融合体）の各々が、これらの用量で投与され得る。

【0337】

炎症性肺疾患の処置のための本発明のパラオキソナーゼ融合組成物の有効性の評価に特に好適な動物モデルとしては、例えば、ｄａ Ｃｕｎｈａら（Exp. Lung Res. 42:66, 2016）（野生型（ｗｔ）ＤＮａｓｅ１処置による、気道抵抗の有意な低減を示す）によって記載されたようなマウスオボアルブミン誘導性急性喘息モデル、Ｂｅｎｍｅｒｚｏｕｇら（Nat. Comm. 9:5226, 2018）（ｗｔ ＤＮａｓｅ１処置による、ＤＮＡ媒介ＳＴＩＮＧ活性化の防止および下流のＩ型ＩＦＮ応答の遮断を示す）によって記載されたようなマウスシリカ誘導性肺炎症モデル、およびＣａｕｄｒｉｌｌｉｅｒら（J. Clin. Invest. 122:2661, 2012）（ｗｔ ＤＮａｓｅ１処置による、肺水腫および肺血管透過性からの保護ならびに肺中のＮＥＴ形成および血小板分離の低減を示す）によって記載されたような輸血関連急性肺傷害のマウスモデルが挙げられる。

【0338】

硫黄マスタードガスまたは有機リンへの曝露の処置のための本明細書に記載のパラオキソナーゼ融合組成物の有効性の評価に好適な動物モデルとしては、例えば、Ｖａｌｉｙａｖｅｅｔｔｉｌら（Biochem. Pharmocol. 81:800-809, 2011；Toxicol. Letters 202:203-208, 2011)（組換えヒトＰＯＮ１注射による、サリンおよびソマン吸入毒性からの保護を示す）によって記載されたようなモルモットモデル、ならびにＢａｊａｊら（Appl. Biochem. Biotechnol. 180:165-176, 2016）およびＳｔｅｖｅｎｓら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:12780-12784, 2008）（ＰＯＮ１の組換えＱ１９２Ｋバリアントを使用する、有機リン被毒からの保護を示す）によって記載されたようなマウスモデルが挙げられる。

【0339】

炎症性腸疾患の処置のための本明細書に記載のパラオキソナーゼ組成物の有効性の評価に特に好適な動物モデルとしては、ＴＮＢＳ誘導性大腸炎モデル、およびマウスにＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＢ^ｈｉｇｈ細胞が移入された慢性大腸炎モデルが挙げられる。例えば、Yamashita et al., J. Immunol. 191:949-960, 2013（ＴＮＢＳ誘導性大腸炎モデルにおけるＰＯＮ１療法のおよび慢性大腸炎モデルにおけるＰＯＮ１バリアント（Ｇ３Ｃ９）の有効性を示す）を参照されたい。別の好適なモデルは、マウスにおけるデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導性大腸炎モデルである。例えば、Babicova et al., Folia Biolica (Praha) 64:10, 2018（ＤＳＳ誘導性大腸炎のｗｔ ＤＮａｓｅ１処置による、結腸におけるＴＮＦαおよびミエロペルオキシダーゼの低減を示す）；Li et al., J. Crohns Colitis 2020, 14:240-253, 2020（ＤＳＳ誘導性大腸炎のＤＮａｓｅ１処置による、サイトカイン産生の減少ならびに加速された血栓形成および血小板活性化の減衰を示す）を参照されたい。

【0340】

関節リウマチ（ＲＡ）のコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルも公知である（例えば、Brand et al., Nat. Protoc. 2:1269-1275, 2007を参照されたい）。ＣＩＡは、ＲＡと同様の免疫学的および病理学的特徴を共有し、そのため、ＣＩＡは、ＤＮａｓｅ組成物の有効性を評価するための理想的なモデルになる。ＲＡの別の好適なモデルは、ＬｅｗｉｓラットにおけるＰＧ－ＰＳ（プロテオグリカン－多糖）誘導性関節炎である（例えば、Esser et al., Arthritis and Rheumatism 28:1402-1411, 1985；Brooks et al., Proc. Intl. Soc. Mag. Reason. Med. 11:1526, 2003を参照されたい）。

【0341】

多発性硬化症（ＭＳ）の好適な動物モデルとしては、例えば、炎症、脱髄および衰弱につながる、ＣＮＳ抗原（ＥＡＥの文脈では「脳炎誘発物質」と呼ばれる）での免疫化によるＣＮＳにおける自己免疫応答の誘導に頼る、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルが挙げられる（例えば、Constantinescu et al., British Journal of Pharmacology 164:1079-1106, 2011を参照されたい）。

【0342】

本発明のパラオキソナーゼ融合分子の有効性を評価するための他の公知の動物モデルとしては、例えば、Ａｌｂａｄａｗｉら（J. Vasc. Surg. 64:484, 2016）（ｗｔ ＤＮａｓｅ１療法による、灌流の増加、浸潤炎症性細胞の減少、および局所血栓症マーカーの低減を示す）によって記載されたような後肢虚血再灌流モデル、Ｐｅｅｒら（Am. J. Nephrol. 43:195, 2016）（ｗｔ ＤＮａｓｅ１療法による腎保護効果を示す）によって記載されたような虚血－再灌流誘導性急性腎傷害のラットモデル、Ｍａｉら（Shock 44:166, 2015）（ｗｔ ＤＮａｓｅ１療法による、臓器損傷の防止および死亡からの防御を示す）によって記載されたようなマウスにおける盲腸結紮・穿刺敗血症モデル、およびＢｒｉｌｌら（J. Thrombosis Haemostasis 10:136, 2012）（ｗｔ ＤＮａｓｅ１療法による血栓症の予防を示す）によって記載されたような下大静脈狭窄のモデルが挙げられる。さらに他の例示的な動物モデルとしては、ＲＮａｓｅ療法の有効性を示すために使用される心臓移植拒絶、プラーク形成および心筋梗塞のモデル（例えば、Kleinert et al., J. Am. Heart Assn. doi:10.1021, 2016；Simsekyilmaz et al., Circulation 129:598-606, 2014；Steiger et al., JAMA 6:e004541, 2017を参照されたい）、ならびにＷａｌｂｅｒｅｒら（Curr. Neovas. Res. 6:12-19, 2009）（ＲＮａｓｅ１療法による脳浮腫および梗塞サイズの低減を示す）によって記載されたような急性脳卒中モデルが挙げられる。

【0343】

本発明の融合分子を動物腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性について評価することもできる。例えば、ＮＥＴ形成に関連する腫瘍転移を低減させる点でのＤＮａｓｅ－ＰＯＮ処置の有効性を、例えば、Ｃｏｏｌｓ－Ｌａｒｔｉｇｕｅら（J. Clin. Invest. 123:3446, 2013）（重症術後感染症のモデルおけるｗｔ ＤＮａｓｅ１の全身投与による注射された腫瘍（肺癌）細胞の転移の低減を示す）およびＰａｒｋら（Sci. Translational Med. 8:361ra138, 2016）（ｗｔ ＤＮａｓｅ１コートナノ粒子の全身投与による、乳がん細胞の肺への転移の低減を示す）によって記載されたような、マウスモデルにおいて評価することができる。例えば、Ｔｒｅｊｏ－Ｂｅｃｉｒｒｉｌら（Integrative Cancer Therapies 15:NP35-NP43, 2016）（ＤＮａｓｅ１とプロテアーゼの組合せによる腫瘍成長の阻害を示す）によって記載されたような、ヒト結腸がん細胞系ＳＷ４８０が皮下移植されたヌードマウスを用いるモデルも、公知である。他の好適なモデルとしては、Ｒｕｔｋｏｓｋｉら（Translational Oncology 6:392-397, 2013）（ＰＥＧ－ＲＮａｓｅ１を使用する、マウスにおける腫瘍成長の阻害を示す）によって記載されたヒト肺腫瘍異種移植モデル、およびMironova et al., Oncotarget 8:78796-78810, 2017（ＲＮａｓｅ療法による抗腫瘍活性を示す）によって記載された、ルイス肺癌を有する同種マウス腫瘍モデルが挙げられる。

【0344】

別の公知の動物腫瘍モデルは、免疫原性が低い腫瘍であるＢ１６黒色腫である。腫瘍免疫療法の複数のモデルが研究されている。Ngiow et al., Adv. Immunol. 130:1-24, 2016を参照されたい。Ｂ１６黒色腫モデルは、チェックポイント阻害剤 抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１およびこれらの組合せを用いて、幅広く研究されている。単独での抗ＣＴＬＡ－４には、ＧＭ－ＣＳＦ形質導入腫瘍ワクチンと組み合わせたときにのみ、または抗ＰＤ－１と組み合わせたときにのみ、このモデルにおいて強力な治療効果がある。Weber, Semin. Oncol. 37:430-439, 2010；Ai et al., Cancer Immunol. Immunother. 64:885-92, 2015；Haanen et al., Prog. Tumor Res. 42:55-66, 2015を参照されたい。悪性黒色腫の処置のためのＤＮａｓｅ－ＰＯＮ、ＲＮａｓｅ－ＰＯＮ、または抗ＴＧＦβ－ＰＯＮ融合分子の有効性は、例えば、触知可能な皮下腫瘍結節が形成されたＢ１６黒色腫マウスへの投与後に遅くなった腫瘍成長によって示される。パラオキソナーゼ融合分子の有効性を、Ｂ１６黒色腫マウスにおいて、単独で、または代替的に別の抗がん療法（例えば、腫瘍ワクチンを伴うもしくは伴わない、または抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を伴うもしくは伴わない、抗ＣＴＬＡ－４）と組み合わせて、評価することができる。例えば、本明細書に記載のＤＮａｓｅ－ＰＯＮ、ＲＮａｓｅ－ＰＯＮまたは抗ＴＧＦβ－ＰＯＮ融合分子と抗ＣＴＬＡ－４との組合せを腫瘍ワクチンの非存在下で使用することによるＢ１６黒色腫マウスにおける腫瘍拒絶によって、パラオキソナーゼ融合体療法を使用することによる抗ＣＴＬＡ－４への応答増強が実証される。マウスにおいて機能的に活性だがこれらのモデルにおいて免疫原性である（およびそれによって、７～１０日後に中和抗体が形成されることになる可能性が高い）と予想されるヒトタンパク質配列を含むパラオキソナーゼ融合分子を評価するための例示的な研究では、マウスに本発明の融合分子が短期間投与（例えば、１週間、例えば、約４０ｍｇ／ｋｇの２用量を３日の間隔を空けて、投与）され得、次いで、腫瘍成長が、典型的には融合分子の注射後２～３週間、モニターされ得る。

【0345】

医薬組成物の投薬量を、担当臨床医が、標的部位で所望の濃度を維持するように変えることができる。例えば、静脈内送達方式が選択された場合、標的組織における血流中の薬剤の局部濃度は、１リットルあたり組成物約１～５０ナノモルの間であり得、対象の状態および予測される測定応答に依存して時には１リットルあたり約１．０ナノモル～１リットルあたり１０、１５または２５ナノモルの間であることもある。より高濃度またはより低濃度が、送達方式、例えば粘膜表面への送達に対して経皮送達、に基づいて選択されることもある。投薬量は、投与される製剤、例えば、粉末に対してスプレー式点鼻薬、持続放出性の経口粒子または注射される粒子、経皮製剤など、の放出速度に基づいて調整すべきでもある。同じ血清中濃度レベルを達成するために、例えば、５ナノモル濃度の放出速度（標準条件下で）を有する徐放性粒子は、１０ナノモル濃度の放出速度を有する粒子の投薬量の約２倍で投与されることになる。投薬を、例えば、投与される融合分子の活性に依存して、変えることもできる。例えば、ＤＮａｓｅ１がアクチン耐性でない（即ち、ＤＮａｓｅ１が、ヒトＤＮａｓｅ１と比較してＤＮａｓｅのエンドヌクレアーゼ活性のＧ－アクチン誘導性阻害を減少させるいずれのアミノ酸置換もヒトＤＮａｓｅ１と比較して含有しない）、ＤＮａｓｅ１－ＰＯＮ融合分子に関しては、アクチンによる阻害を、同様のしかしアクチン耐性のＤＮａｓｅ１－ＰＯＮ融合分子に対して有効である用量と比較して用量を増加させることによって、克服することができる。

【0346】

本明細書に記載の融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質を含む医薬組成物を、液体形態で、エアロゾルで、または固体形態で提供することができる。液体形態は、注射可能な溶液、エアロゾル、液滴、トポロジカル溶液および経口懸濁液によって説明される。例示的な固体形態としては、カプセル、錠剤、および制御放出形態が挙げられる。後述の形態は、ミニ浸透圧ポンプおよび埋込物によって説明される。例えば、Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239, 1997；Ranade, "Implants in Drug Delivery," in Drug Delivery Systems 95-123 (Ranade and Hollinger, eds., CRC Press 1995)；Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps," in Protein Delivery: Physical Systems 239-254 (Sanders and Hendren, eds., Plenum Press 1997)；Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant," in Protein Delivery: Physical Systems 93-117 (Sanders and Hendren, eds., Plenum Press 1997)を参照されたい。他の固体形態としては、クリーム、ペースト、他のトポロジカルな応用などが挙げられる。

【0347】

分解性の高分子マイクロスフェアが、治療用タンパク質の高い全身レベルを維持するために設計されている。マイクロスフェアは、分解性ポリマー、例えば、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（オルトエステル）、非生体分解性酢酸エチルビニルポリマーから調製され、タンパク質がポリマー内に封入される。例えば、Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332, 1995；Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery," in Drug Delivery Systems 51-93 (Ranade and Hollinger, eds., CRC Press 1995)；Roskos and Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery," in Protein Delivery: Physical Systems 45-92 (Sanders and Hendren, eds., Plenum Press 1997)；Bartus et al., Science 281:1161, 1998；Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153, 1998；Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548, 1998を参照されたい。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コートナノスフェアは、治療用タンパク質の静脈内投与のための担体にもなり得る。例えば、Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167, 1997を参照されたい。

【0348】

例えば、Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lea & Febiger, 5th ed. 1990)；Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995)、およびRanade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996)によって示されているように、他の剤形を当業者は考案することができる。

【0349】

本明細書に記載の融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質の全身投与を含む一部の実施形態では、融合分子は、緩衝食塩水（例えば、１ｍＭの塩化カルシウムを加えた２ｍＭの炭酸塩、ｐＨ７．５で緩衝された食塩水）中で製剤化される。

【0350】

本明細書に記載の医薬組成物を併用療法に関連して使用することもできる。例えば、本明細書に記載のパラオキソナーゼ融合分子およびＤＮａｓｅの投与を含む併用療法のために、パラオキソナーゼ融合分子およびＤＮａｓｅ（例えば、本明細書に記載のＤＮａｓｅ－Ｆｃ融合体）の各々を、別々にまたは混合物としてのどちらかで、緩衝食塩水（例えば、１ｍＭの塩化カルシウムを加えた２ｍＭの炭酸塩、ｐＨ７．５で緩衝された食塩水）中で製剤化することができる。

【0351】

医薬組成物を、本明細書に記載の融合ポリペプチドまたはダイマー性タンパク質を含む容器を含むキットとして供給することができる。治療用分子を、例えば、単一もしくは複数用量の注射可能な溶液の形態で、または注射の前に復元されることになる滅菌粉末として、備えることができる。あるいは、そのようなキットは、治療用タンパク質の投与用のドライパウダー分散機、液体エアロゾル発生器、またはネブライザーを含むことができる。そのようなキットは、医薬組成物の適応症および用法に関する書面情報をさらに含むことができる。

【0352】

本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。

【実施例】

【0353】

（実施例１）
ＤＮａｓｅ１－ＦｃおよびＤＮａｓｅ１－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質の構築および発現
構築物を設計し、合成し、正しい配列を有するカセットを組み合わせて、特有のＤＮａｓｅ１融合分子をコードする合成融合遺伝子を生成した。各構築物は、野生型ヒトＤＮａｓｅ１（配列番号１５および１６に示される通りのヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２２３も参照されたい）のバリアントを含んだ。ＤＮａｓｅ１バリアントは、成熟野生型ヒト配列（配列番号１２０）と比較してアミノ酸置換をＮ７４位（Ｎ７４Ｋ）、Ｇ１０５位（Ｇ１０５Ｒ）およびＡ１１４位（Ａ１１４Ｆ）に含有した（成熟タンパク質に対応するバリアントＤＮａｓｅ１ヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列は、配列番号１７の残基６１～８４０、および配列番号１８の残基２１～２８０にそれぞれ示される）。用いたシグナルペプチド配列は、融合タンパク質の高レベル発現および分泌を駆動する効率的な異種リーダーペプチドであるヒトＶＫ３リーダーペプチド（配列番号５７および配列番号５８に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）であった。（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４リンカー（（ｇ４ｓ）４；配列番号１１および配列番号１２に示される通りのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列）または（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_６リンカー（（ｇ４ｓ）６；配列番号１３および配列番号１４に示される通りのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列）のどちらかであるペプチドリンカーを使用して、ＤＮａｓｅ１カセットをヒトＩｇＧ１ Ｆｃバリアント（ＳＳＳヒンジ、Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓ）のＮ末端に融合させた。Ｆｃバリアントヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号２７および配列番号２８に示される。生成された完成ＤＮａｓｅ１－Ｆｃ構築物は、次の通りである：
［ｈＶＫ３ＬＰ］－［ｈＤＮａｓｅ１ Ｎ７４Ｋ－Ｇ１０５Ｒ－Ａ１１４Ｆ］－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ］（本明細書では以降、ｈＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃとも呼ばれる；配列番号５９および配列番号６０に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）；および
［ｈＶＫ３ＬＰ］－［ｈＤＮａｓｅ１ Ｎ７４Ｋ－Ｇ１０５Ｒ－Ａ１１４Ｆ］－（ｇ４ｓ）６－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ］（本明細書では以降、ｈＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）６－Ｆｃとも呼ばれる；配列番号６１および配列番号６２に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）。

【0354】

ｈＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）４－ＦｃまたはｈＤＮａｓｅＴＭ－（ｇｓ）６－Ｆｃのカルボキシル末端を、未切断リーダーペプチドの最初の１５個のアミノ酸が欠失しているヒトＰＯＮ１のバリアント（ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ；配列番号５および配列番号６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）が後に続く、Ｎ連結型グリコシル化部位（ＮＧＳ；配列番号５５および配列番号５６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）を含有するペプチドリンカーに、融合させることによって、機能的ＰＯＮ１酵素をさらに含む二重特異性構築物も生成した。完成ＤＮａｓｅ－Ｆｃ－ＰＯＮ１構築物は、次の通りである：
［ヒトＶＫ３ＬＰ］－［ｈＤＮａｓｅ１ Ｎ９７４Ｋ－Ｇ１０５Ｒ－Ａ１１４Ｆ］－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－［ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］、（配列番号１および配列番号２に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）（本明細書では以降、ｈＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃ－ＰＯＮ１－Ｑ１９２Ｋ、ｈＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃ－ＰＯＮ１－Ｋ、またはＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋとも呼ばれる）；および
［ヒトＶＫ３ＬＰ］－［ｈＤＮａｓｅ１ Ｎ９７４Ｋ－Ｇ１０５Ｒ－Ａ１１４Ｆ］－（ｇ４ｓ）６－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－［ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］、（配列番号１４７および配列番号１４８に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）（本明細書では以降、ＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）６－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋとも呼ばれる）。
ＤＮａｓｅ１－ＦｃおよびＤＮａｓｅ１－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質の一過性発現

【0355】

全ての融合遺伝子を、ｐＵＣに基づくベクター内にアセンブルし、次いで、融合遺伝子の発現を駆動するＣＭＶプロモーターを含有するｐｃＤＮＡ３プラスミド誘導体である哺乳動物発現ベクターｐＤＧの多重クローニング部位に挿入した。プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）ミニまたはマキシプレッププラスミドＤＮＡキットを使用して調製した。精製プラスミドＤＮＡを、おおよそ５０～７５％の集密度で播種したＨＥＫ２９３細胞に、Ｐｏｌｙｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）トランスフェクション試薬を製造業者の使用説明書に従って使用してトランスフェクトした。培養培地をトランスフェクションの翌日にＤＭＥＭ Ｆｌｕｏｒｏｂｒｉｔｅ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）無血清培地に変え、トランスフェクト細胞をさらに４８時間インキュベートした後に培養上清を回収した。

【0356】

図１は、ＨＥＫ２９３一過性トランスフェクションの代表セットからの融合タンパク質発現のウェスタンブロット解析の結果を示す。培養上清をゲル電気泳動のために次のように直接ロードした：上清を収集し、１／４の試料体積の４×還元ＬＤＳ試料緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を添加し、試料を１０分間、７２℃で加熱し、試料を１分間、３０００ｒｐｍで微量遠心機（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）において遠心分離し、各試料からのローディング緩衝液中３０μｌの試料（２分の１）を、４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にロードした。タンパク質分子量マーカーを各ゲルに含めた（Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ（登録商標）ＤＵＯ分子量マーカー；ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを、ＮｕＰＡＧＥ ＭＯＰＳ泳動用緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中、還元条件下、１８５ボルトでおおよそ１～１．５時間、泳動させた。ＸＣｅｌｌブロットモジュール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と、１０％メタノールを含有するＮＵＰＡＧＥ－ＭＯＰＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）転写用緩衝液とを使用して、ゲルをニトロセルロース膜にブロットした。ブロットをＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ（商標）ブロッキング緩衝液中でブロックし、続いて、希釈ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ、ＰＡ）とともにインキュベートした。二次抗体をＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ ７９０近ＩＲ色素（ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ検出）とコンジュゲートし、ブロッキング緩衝液で、４℃で１：２５，０００希釈し、一晩、揺動した。ブロットを、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）で、４回洗浄した。次いで、ブロットをＴＢＳ緩衝液ですすぎ、ＬＩＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ（商標）スキャナーでスキャンした。トランスフェクション試料は、次のようにロードした：レーン１ － ＬＩＣＯＲ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ（商標）分子量マーカー；レーン２、レーン３、レーン４ － ｈＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃ－ＰＯＮ１－Ｑ１９２Ｋの３つの異なる個々のクローン（＃１、＃２、＃４）からのトランスフェクション上清；レーン５ － ＴＨＥＲ４－ＲＮａｓｅ（対照；ａｐｏＡ１－（ｇ４ｓ）４－ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ－Ｆｃ－ＮＧＳ－ＲＮａｓｅ１；米国特許出願公開第２０１８／０２０１６６４を参照されたい）；レーン６ － ＬＩＣＯＲ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ ＭＷマーカー；レーン７ － ｈＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃ ＃４；レーン８ － ｈＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）６－Ｆｃ ＃２；レーン９ － ＴＨＥＲ４（対照；ａｐｏＡ１－（ｇ４ｓ）４－ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ－Ｆｃ；国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／０４４４２４を参照されたい）；レーン１０ － モックトランスフェクション。各マーカーバンドの近似分子量（ｋＤａ）が、ウェスタンブロットの右側に示されている。
ＤＮａｓｅ１－ＦｃおよびＤＮａｓｅ１－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質の安定発現

【0357】

ＤＮａｓｅ１融合タンパク質の安定な産生を、ＣＭＶプロモーターの制御下のＤＮａｓｅ１融合分子ｃＤＮＡを含有する選択可能な増幅可能なプラスミド、ｐＤＧ、の、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＤＧ４４細胞への電気穿孔によって、達成した。ｐＤＧベクターは、プラスミドの選択圧を増大させるためにプロモーターが減弱された、ＤＨＦＲ選択可能マーカーをコードするｐｃＤＮＡ３の改変バージョンである。プラスミドＤＮＡ（２００μｇ）を、ＱＩＡＧＥＮ ＨＩＳＰＥＥＤマキシプレップキットを使用して調製した。精製プラスミドを特有のＡｓｃＩ部位で線状化し（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、カタログ番号Ｒ０５５８）、フェノール抽出により精製し（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、エタノールで沈殿させ、洗浄し、組織培養培地であるＥｘｃｅｌｌ ３０２（カタログ番号１４３２４、ＳＡＦＣ／Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に再懸濁させた。サケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、フェノール抽出およびエタノール沈殿の直前に担体ＤＮＡとして添加した。プラスミドおよび担体ＤＮＡを共沈させ、４００μｇを使用して電気穿孔によって２×１０^７のＣＨＯ ＤＧ４４細胞にトランスフェクトした。

【0358】

電気穿孔のために、グルタミン（４ｍＭ）、ピルビン酸塩、組換えインスリン（１μｇ／ｍｌ）、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび２×ＤＭＥＭ非必須アミノ酸（全て、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹからのもの）を含有する、Ｅｘｃｅｌｌ ３０２培地（カタログ番号１３４２４Ｃ、ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）において、細胞を対数期まで成長させた。この培地を、本明細書では以降、「Ｅｘｃｅｌｌ ３０２完全」培地と呼ぶ。トランスフェクトされていない細胞およびトランスフェクトされることになる細胞のための培地は、ＨＴ（ヒポキサンチンおよびチミジンの１００×溶液から希釈されたもの）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）も含有した。電気穿孔を、キャパシタンスエクステンダーを備えているＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ電気穿孔ユニットを使用して、２８０ボルト、９５０マイクロファラッドで行った。電気穿孔を、０．４ｃｍギャップ滅菌使い捨てキュベットにおいて行った。電気穿孔された細胞を電気穿孔後に５分間インキュベートした後、これらの処理された細胞をＴ７５フラスコの中の非選択Ｅｘｃｅｌｌ ３０２完全培地に移した。トランスフェクト細胞を、回収を可能にするために一晩、３７℃、５％ＣＯ_２で非選択培地においてインキュベートした後、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に２５０細胞／ウェル（２５００細胞／ｍｌ）～２０００細胞／ウェル（２０，０００細胞／ｍｌ）の範囲の様々な段階希釈度で選択的に播種した。細胞クローニングのための培養培地は、５０ｎＭのメトトレキサートを含有するＥｘｃｅｌｌ ３０２完全であった。トランスフェクションプレートに５日間隔で８０μｌの新鮮培地を供給した。最初の数回の供給の後、１００μｌの培地を除去し、新鮮培地に置き換えた。プレートをモニターし、クローンが入っている個々のウェルに、クローン増生がほぼ集密になるまで供給し、ほぼ集密になったら、クローンを、１ｍｌ培地／ウェルを含有する２４ウェル皿に拡大した。２４ウェルプレートへの細胞の移入およびそこでの拡大の前に、元の９６ウェルプレートからの培養上清のアリコートを第２の９６ウェルプレートに回収した。この第２のプレートを、ＩｇＧ濃度を推定するためのＥＬＩＳＡ解析のための希釈を行うまで、凍結しておいた。

【0359】

組換え融合タンパク質の産生レベルについての培養上清のスクリーニング：最初のトランスフェクタントのクローン増生が十分になったら、マスターウェルからの培養上清の段階希釈物を解凍し、－ＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡの使用により希釈物をＤＮａｓｅ１融合タンパク質の発現についてスクリーニングした。手短に述べると、ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、一晩、４℃で、ＰＢＳ中の２マイクログラム／ｍｌのＦ（ａｂ’２）ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ；カタログ番号１０９－００６－０９８）でコーティングした。プレートをＰＢＳ／３％ＢＳＡでブロックし、培養上清の段階希釈物を、室温で２～３時間、または４℃で一晩、インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０で３回洗浄し、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ中、１：７５００～１：１０，０００のホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートＦ（ａｂ’２）ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ；カタログ番号１０９－０３６－０９８）とともに１～２時間、室温でインキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０で５回洗浄し、結合をＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ（商標）ＴＭＢ基質（ＫＰＬ Ｌａｂｓ／ＳｅｒａＣａｒｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ；カタログ番号５３－００－０２）で検出した。反応を等体積の１Ｎ ＨＣｌの添加によって停止させ、各プレートのウェルあたりの吸光度をＶａｒｉｏＳｋａｎ ＬＵＸプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）によって４５０ｎＭで読み取った。培養上清の希釈物のＯＤ４５０と、公知の標準物質、本開示に記載のクローンと同一の－Ｉｇテールを有するプロテインＡ精製ヒト－ＩｇＧ融合タンパク質、典型的には、ＴＨＥＲ４（ａｐｏＡ１－（ｇ４ｓ）４－ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ；国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／０４４４２４を参照されたい）、またはヒトＣＤ１８０に標的化されたｓｃＦｖ－Ｆｃ（Ｇ２８－８）、の段階希釈物を使用して作成した標準曲線とを比較することにより、濃度を推定した。プレートリーダーソフトウェアおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ ＥｘｃｅｌまたはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．４．３（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、データを収集し、解析した。最高発現ＤＮａｓｅ－ｌｎｋ－Ｆｃクローンは、２５～５５μｇ／ｍｌの範囲で発現したが、最高発現ＤＮａｓｅ－ｌｎｋ－Ｆｃ－ＰＯＮ１－Ｋクローンは、おおよそ１０～３０μｇ／ｍｌで発現した。

【0360】

プロテインＡ精製上清を、融合タンパク質を発現している使用済みＣＨＯ細胞培養物から収集し、０．２μｍ ＰＥＳ ｅｘｐｒｅｓｓフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）によって濾過し、４℃の５０ｍｌ滅菌コニカル遠心分離管（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の中での培養上清とプロテインＡ－アガロース（ＩＰＡ ３００架橋アガロース）スラリーの緩徐な回転を使用する親和性クロマトグラフィーに供した。プロテインＡアガロースに結合した融合タンパク質を遠心分離により回収し、培養上清を除去し、交換し、上清の所望の体積が処理されるまでインキュベーションプロセスを反復した。次いで、最終プロテインＡアガローススラリーを、滅菌、酸洗浄済みエコノカラム（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）にロードして樹脂を洗浄した。次いで、溶出の前に、カラムを数カラム体積のカラム洗浄緩衝液（Ｇｅｎｔｌｅ Ａｇ－Ａｂ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｉｅｒｃｅ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で洗浄して一切の残留培養上清を除去した。次いで、結合したタンパク質を、穏やかなＡｇ／Ａｂ溶出用緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、樹脂から溶出した。画分（０．８～１．０ｍｌ）を収集し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＤＥ）微量試料分光光度計を使用して２８０ｎＭで各画分からのアリコート（２μｌ）のタンパク質濃度を決定し、溶出用緩衝液のみを使用してブランクを決定した。融合タンパク質を含有する画分をプールし、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｇ２（Ｒａｎｃｈ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ、カタログ番号Ｇ２３５０５７、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号０８－６０７－００７）ｆｌｏａｔ－ａ－ｌｙｚｅｒユニット（ＭＷＣＯ ２０ｋＤａ）を使用する［０．９％塩化ナトリウム、５ｍＭ 炭酸水素ナトリウム、１ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１ｍＭ 塩化カルシウム、ｐＨ７．５］に対する透析によって緩衝液交換を行った。透析を、滅菌２．２リットルＣｏｒｎｉｎｇローラーボトルにおいて、４℃で一晩、行った。透析後、０．２μＭフィルターユニットを使用してタンパク質を濾過し、Ｐｙｒｏｔｅｌｌ ＬＡＬゲル凝固システムシングルテストバイアル（ＳＴＶ）（カタログ番号Ｇ２００６、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ、Ｅａｓｔ Ｆａｌｍｏｕｔｈ、ＭＡ）を使用してアリコートをエンドトキシン汚染について試験した。

【0361】

図２は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動およびＩｍｐｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ／Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ；カタログ番号２４６１５）での染色後の、安定したＣＨＯトランスフェクションからの精製タンパク質を示す。５マイクログラムの各プロテインＡ精製融合タンパク質を、１×ＬＤＳ還元試料緩衝液中、７２℃で１０分間インキュベートし、続いて、４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にロードした。タンパク質分子量マーカーを各ゲルに含めた（Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ（登録商標）ＤＵＯ分子量マーカー（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）およびＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ分子量マーカー（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ））。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを、ＮｕＰＡＧＥ ＭＯＰＳ泳動用緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で還元条件下、１７５ボルトでおおよそ２時間、泳動させた。ゲルを１００ｍｌの蒸留水で３回洗浄し、次いで、室温で揺動しながら２．５時間、３０ｍｌのＩｍｐｅｒｉａｌ Ｓｔａｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で染色した。ゲルを１００～２００ｍｌの蒸留水で４回洗浄することによって脱染し、プラスチックスリーブに入れた後、染色されたゲルを撮影／スキャンした。レーンに、次のようにロードした：レーン１ － ＴＨＥＲ４ＰＯＮ１－Ｋ（ａｐｏＡ１－（ｇ４ｓ）４－ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ－Ｆｃ－ＮＧＳ－ＰＯＮ１－Ｋ；国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／０４４４２４を参照されたい）；レーン２ － ｈＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃ－ＰＯＮ１－Ｋ；レーン３ － ｈＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃ；レーン４ － ｈＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）６－Ｆｃ；レーン５ － ＬＩ－ＣＯＲ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ（登録商標）ＭＷマーカー；レーン６ － ＢｉｏＲａｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ ＭＷマーカー。各マーカーバンドの近似分子量（ｋＤａ）が、染色されたゲルの右側に示されている。
（実施例２）
ＤＮａｓｅ１－ＦｃおよびＤＮａｓｅ１－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質のＤＮａｓｅ活性

【0362】

ＤＮａｓｅ１融合タンパク質のヌクレアーゼ活性を、改良型ＳＹＴＯＸ（商標）Ｇｒｅｅｎ蛍光アッセイを使用して評価した。ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ色素（ＤＭＳＯ中の５ｍＭ溶液、カタログ番号Ｓ７０２０）をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から入手した。サケ精子ＤＮＡもＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ、せん断され、フェノール精製されたもの、カタログ番号１５６３２０１１）から入手した。酵素活性アッセイを、固定酵素濃度での基質濃度の滴定、または固定基質濃度での酵素濃度の滴定、どちらかによって行った。基質滴定実験のために、サケ精子ＤＮＡとＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ染色剤とを、１×ＤＮａｓｅ反応緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＣａＣｌ_２）中、４００μＭ（１４０ｕｇ／ｍｌ）サケ精子ＤＮＡに対して１４μＭ ｓｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎの比で混合し、混合物を３７℃でおおよそ２時間インキュベートして、標識し、平衡化した。ストック標識ＤＮＡの適切な希釈物を酵素活性アッセイのために作製した。ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ標識ＤＮＡの３分の１倍段階希釈物を別のプレートで調製し、５０μｌの各希釈物をアッセイプレートに移して、最終反応において次の基質濃度を生じさせた：１）２２０μＭサケ精子ＤＮＡ（ＳＳ ＤＮＡ）および１０μＭ ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ；２）１４７μＭ ＳＳ ＤＮＡおよび６．７μＭ ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ；３）９８．７８μＭ ＳＳ ＤＮＡおよび４．４μＭ ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ；４）６６μＭ ＳＳ ＤＮＡおよび３．０１μＭ ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ；ならびに５）４４μＭ ＳＳ ＤＮＡおよび２．０５μＭ ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ。

【0363】

各融合タンパク質または組換えＤＮａｓｅ １酵素を、１× ＤＮａｓｅ反応緩衝液中の評価される所望の最終濃度の２倍の濃度（９ｎＭの初期濃度、または４．５ｎＭの最終濃度）で調製した。５０マイクロリットルの各融合タンパク質または組換え酵素を、標識基質を収容しているアッセイプレートの各ウェルに添加した。プレートを直ちにプレートリーダーに移し、４８５ｎｍ励起および５２８ｎｍ発光波長を使用して蛍光を測定した。ＶａｒｉｏＳｋａｎ ＬＵＸ蛍光プレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて合計４０分間、４５秒ごとに読み取る動態アッセイを使用して、試料蛍光をモニターした。ＲＦＵ（相対蛍光単位）をウェルごとに時間の関数としてプロットした。各ウェルの蛍光シグナルは、ヌクレアーゼ活性の増加に伴ってより急速に減少した。

【0364】

図３は、２つの異なる基質濃度、２２０μＭまたは６６μＭサケ精子ＤＮＡ、で時間の関数として相対蛍光単位（ＲＦＵ）を解析する生データのグラフ表示を示す。これらの実験については、使用する酵素濃度を４．５ｎＭに固定した。ＤＮａｓｅ１ＴＭ－（ｇ４ｓ）４－ＦｃおよびＤＮａｓｅ１ＴＭ－（ｇ４ｓ）６－Ｆｃ融合タンパク質の比活性は、全ての基質濃度で組換え野生型ヒトＤＮａｓｅ１より高かった。より低い基質濃度（より生理的に適切なレベル）では、二重特異性融合タンパク質（ＤＮａｓｅ１ＴＭ－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ）のほうが組換え野生型ＤＮａｓｅ１より高い活性を示したが、より高いＤＮＡ基質濃度では、野生型ＤＮａｓｅ１のほうが二重特異性融合タンパク質より高い活性を有した。

【0365】

図４Ａおよび４Ｂは、これらの条件を使用する２つの異なるＤＮａｓｅ活性実験（「実験＃１」および「実験＃２」）からのデータのミカエリスメンテンプロットを示す。実験＃１および実験＃２における各融合タンパク質についての推定ＫｍおよびＶｍａｘを、各実験についての表形式データを収載する下記の表２に示す。Ｖｍａｘまたは最大速度についての単位は、消化されたＳＹＴＯＸ標識サケＤＮＡのμｍｏｌ／分であり、Ｋｍについての単位は、標識サケ精子ＤＮＡのμｍｏｌである。ＶａｒｉｏＳｋａｎ ＬＵＸプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）のＳｋａｎＩｔ（商標）ソフトウェアを使用して生データを解析し、次いで、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．４．３（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を使用してデータをさらに解析した。
表2: 4.5 nMのDNase融合タンパク質についての表形式ミカエリスメンテンデータ

【表2】

Vmax: 消化されたサケ精子DNAのμmol/分
Km: サケ精子DNAのμmol

【0366】

ＤＮａｓｅ融合タンパク質がアクチン阻害に対して感受性であるかどうかを評価するために、酵素活性アッセイをアクチンの存在または非存在下でも行った。これらのアッセイを、固定酵素濃度での基質濃度の滴定、または固定基質濃度での酵素濃度の滴定、どちらかによって行った。基質滴定実験のために、サケ精子ＤＮＡとＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ染色剤とを、１×ＤＮａｓｅ反応緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＣａＣｌ_２）中、４００μＭ（１４０μｇ／ｍｌ）サケ精子ＤＮＡに対して１４μＭ ｓｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎの比で混合し、混合物を３７℃でおおよそ２時間インキュベートして、標識し、平衡化した。

【0367】

各融合タンパク質または組換えＤＮａｓｅ１酵素を、１×ＤＮａｓｅ反応緩衝液中の評価される所望の最終濃度の４倍の濃度（１８ｎＭの初期濃度、または４．５ｎＭの最終濃度）で調製した。次いで、各４×試料を、４×＝１６０μｇ／ｍｌのもしくはヌクレアーゼ反応において４０μｇ／ｍｌの最終濃度のウサギ骨格筋アクチンタンパク質（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ、Ｄｅｎｖｅｒ、ＣＯ．、カタログ番号ＡＫＬ９９－Ａ）を含有する溶液と、またはアクチンを含有しない反応緩衝液と、１：１で混合した。８０μｇ／ｍｌのアクチンを有する９ｎＭの融合タンパク質を含有する試料を、３７℃で４５～６０分間インキュベートした後、標識ＳＹＴＯＸ ｇｒｅｅｎ基質を添加した。Ｓｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎ基質は、１×ＤＮａｓｅ反応緩衝液中の１４μＭのＳｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎ色素への１６０μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡの添加および３７℃で６０～１２０分間の平衡化によって調製した。５０マイクロリットルの各アクチン処理融合タンパク質または組換え酵素を、５０μｌの標識基質を収容しているアッセイプレートの各ウェルに添加した。プレートを直ちにプレートリーダーに移し、４８５ｎｍ励起および５２８ｎｍ発光波長を使用して蛍光を測定した。ＶａｒｉｏＳｋａｎ ＬＵＸ蛍光プレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて合計４０分間、４５秒ごとに読み取る動態アッセイを使用して、試料蛍光をモニターした。ＲＦＵ（相対蛍光単位）をウェルごとに時間の関数としてプロットした。各ウェルの蛍光シグナルは、ヌクレアーゼ活性の増加に伴ってより急速に減少した。図５Ａおよび５Ｂは、ＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃ分子についてのおよび組換えヒトＤＮａｓｅについての時間の関数としてのＲＦＵをプロットするグラフを示す。組換えヒトＤＮａｓｅ１のヌクレアーゼ活性は、アクチンによって阻害されたが、融合タンパク質バリアントは、これらの条件下で阻害されなかった。
（実施例３）
ＤＮａｓｅ１－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質のパラオキソナーゼ活性
アリールエステラーゼ活性

【0368】

酢酸フェニルを基質として使用して、ＤＮａｓｅ１ＴＭ－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃ－ＰＯＮ１－Ｑ１９２Ｋ融合タンパク質のアリールエステラーゼ活性を評価した。酵素活性アッセイを、固定酵素濃度での基質濃度の滴定、または固定基質濃度での酵素濃度の滴定、どちらかによって行った。酢酸フェニル活性アッセイのための反応緩衝液は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＣａＣｌ_２を含有した。基質溶液は、反応緩衝液および１０ｍＭの酢酸フェニルを含有し、その一方で、酵素溶液は、反応緩衝液と適切な濃度の酵素を含有した。反応における５ｍＭの酢酸フェニル基質の最終濃度のために、基質溶液を酵素溶液で１：１希釈した。融合タンパク質（酵素）濃度がアッセイに存在し、それを、４０μｇ／ｍｌから１／３段階希釈（４０、２６．８、１７．９６、１２．０５、８．０６、５．４、３．６２、および２．４μｇ／ｍｌ）で滴定した。ＶａｒｉｏＳｋａｎ ＬＵＸ蛍光プレートリーダーを用いて合計１０分間、４５秒ごとに読み取る動態アッセイを使用して、試料吸光度をモニターした。２７０ｎｍでのモル吸光率は、時間の関数として形成されるフェノールの測度として役立つ。フェノールについての１３１０Ｍ^－１ｃｍ^－１のモル吸光係数を使用して、吸光の変化を反応速度に変換した。

【0369】

加えて、アリールエステラーゼ活性アッセイを、次のような１／３倍段階的漸減で存在する酢酸フェニル基質の量を滴定して行った：１５ｍＭ、１０．０５ｍＭ、６．７３ｍＭ、４．５１ｍＭ、３．０２ｍＭ、２．０３ｍＭ、１．３６ｍＭ、および０．９１ｍＭ基質。いずれの場合にも、存在する融合タンパク質（酵素）の量は、７．５μｇ／ｍｌであった。ＤＮａｓｅ１ＴＭ－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃ－ＰＯＮ１－Ｑ１９２Ｋ分子について、この濃度は、７５ｎＭに相当する。図６Ａおよび６Ｂは、ＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃ－ＰＯＮ１－Ｑ１９２Ｋ融合タンパク質のアリールエステラーゼ活性を測定する代表実験についてのミカエリスメンテン解析およびラインウィーバーバークプロットを示す。複数の実験を比較したとき、Ｖｍａｘ平均値は、おおよそ０．０２７ｍＭフェノール／分（ｍｍｏｌ／リットル＝ｎｍｏｌ／ｕｌ）であり、Ｋｍは、おおよそ２．７ｍＭ酢酸フェニル（ｍｍｏｌ／リットル＝ｎｍｏｌ酢酸フェニル／ｕｌ）であった。
有機ホスファターゼ活性

【0370】

Ｅｎｚｃｈｅｃｋパラオキソナーゼ活性アッセイ（カタログ番号Ｅ３３７０２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、ＤＮａｓｅ１ＴＭ－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃ－ＰＯＮ１－Ｑ１９２Ｋ融合タンパク質の有機ホスファターゼ活性を評価した。このアッセイは、３６０／４５０ｎｍの励起／発光極大値を使用してキットに備えられている蛍光性有機リンアナログの変換を測定する、パラオキソナーゼの有機ホスファターゼ活性についての非常に高感度の蛍光定量アッセイである。アッセイを、動態アッセイとして設定することができ、あるいはエンドポイントアッセイのために特定の期間の後に打ち切ることができる。単位時間あたりの相対蛍光単位（ＲＦＵ）の変化を、蛍光標準物質から生成した標準曲線と１Ｕ単位のパラオキソナーゼが３７℃で毎分１ｎｍｏｌの蛍光産物を生成する換算係数とを使用して、試料中のパラオキソナーゼの単位に変換する。融合タンパク質試料中に存在するパラオキソナーゼの量を、キットに備えられているパラオキソナーゼ陽性対照と比較することができる。図７は、ヒト血清試料比較のための平均乃至は平均より高い活性範囲の有機ホスファターゼ陽性対照の２つの異なる希釈物によって生成されたＲＦＵ曲線と比較した、ＤＮａｓｅ１ＴＭ－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃ－ＰＯＮ１－Ｑ１９２Ｋ融合タンパク質の有機ホスファターゼ活性のグラフ表示を示す。試験した融合タンパク質は、１１ヵ月間４℃で保存したものであったが、それにもかかわらずＰＯＮ１アッセイにおいて平均より高い活性を有した。

【0371】

アリールエステラーゼおよび有機ホスファターゼと同様の活性アッセイ、例えば、ペルオキシダーゼ活性アッセイ（Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄペルオキシド／ペルオキシダーゼアッセイ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ、カタログ番号Ａ２２１８８）または一般的なホスファターゼアッセイ（ＥＮｚＣｈｅｋホスファターゼアッセイ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ、カタログ番号１２０２０）などを、本明細書に記載の融合タンパク質に存在するＰＯＮ１酵素活性について、行うことができる。
（実施例４）
ＤＮａｓｅ－ＦｃおよびＤＮａｓｅ－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質によるバイオフィルム形成の阻害を評価するためのアッセイ

【0372】

ＤＮａｓｅ－ＦｃおよびＤＮａｓｅ－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質をバイオフィルム形成アッセイで特徴付けて、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルム形成の阻害を評価する。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ培養物を、単離された細菌コロニーから、２ｘＹＴまたはＬＢ培地などの富栄養培地への接種によって成長させる。一晩培養物をトリプシン大豆ブロス／０．５％グルコース（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）で１：１００希釈し、希釈された培養物を使用して１００μｌ／ウェルを９６ウェル組織培養プレートに接種する。希釈された細菌培養物の接種の前に、ウェルを異なる濃度の目的の各融合タンパク質でプレコーティングする。あるいは、融合タンパク質を希釈された細菌培養物に直接添加して、溶解状態で阻害活性を評価する。プレートをアッセイの前に４～８時間、３７℃でインキュベートする。ウェル間変動を制御するために全ての条件を６～８反復で行う。インキュベーション後、培養物を吸引によって除去するか、またはプレートを反転させ、液体を振り落とすことによって除去する。次いで、プレートをＰＢＳで洗浄して、未結合細胞および培地を除去する。洗浄後、１２５μｌの０．１％クリスタルバイオレット溶液を各ウェルに添加し、プレートを１５分間、室温でインキュベートする。プレート洗浄機を使用してプレートを水またはＰＢＳで３～４回すすぐ。最終洗浄後、マイクロタイタープレートを裏返し、数時間または一晩、放置して乾燥させる。バイオフィルムを定量化するために、１２５μｌの３０％酢酸を各々の乾燥したウェルに添加してクリスタルバイオレットを可溶化する。プレートを室温で１５分間インキュベートし、１２５μｌのクリスタルバイオレットを新しい平底マイクロタイター皿に移す。次いで、ブランク溶液として３０％酢酸を使用してＶａｒｉｏｓｋａｎプレートリーダーにおいて５５０ｎｍでウェルの吸光度を測定する。バイオフィルム阻害パーセントを、［処理した融合タンパク質の吸光度平均値／未処理の吸光度平均値］の比を１から引いて１００を掛けることによって推定する。

【0373】

市販のバイオフィルム形成キットは、Ｄｏｊｉｎｄｏ（Ｄｏｎｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｋｕｍａｍｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）からも入手でき、これは、バイオフィルム形成のために固定マイクロタータープレートを使用し、それによって洗浄ステップが単純化される。
（実施例５）
ＳＯＤ１－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質の構築

【0374】

野生型ヒトＳＯＤ１の配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００４５４．５、ＣＲ４５０３５５．１、およびＣＲ４５４１７４２．１を参照されたい）をＮＣＢＩ配列データベースから入手し、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃバリアント（ＳＳＳヒンジ、Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ；配列番号２７および配列番号２８に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）のＮ末端に結合した（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２リンカー（（ｇ４ｓ）２；配列番号９および配列番号１０に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）をコードする部分融合遺伝子を既に含有する分子への挿入用の発現カセットとして設計し、合成する。ヒトＦｃバリアントのカルボキシル末端を、未切断リーダーペプチドの最初の１５個のアミノ酸が欠失しているヒトＰＯＮ１のバリアント（ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ；配列番号５および配列番号６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）が後に続く、Ｎ連結型グリコシル化部位（ＮＧＳ；配列番号５５および配列番号５６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）を含有するペプチドリンカーに、融合させる。ＳＯＤ１の予測アミノ酸配列は、分泌のためのシグナルペプチドを含有しないため、異種シグナルペプチドの正しい位置での切断を達成するためにＳＯＤ１との接合部位に追加のアミノ酸を有するヒトＶＫ３シグナル配列の改変バージョンを設計する。ＳＯＤ１のアミノ末端メチオニンは、この改変ＳＯＤ１の成熟分泌バージョンには非存在であり、したがって、改変シグナルペプチドの切断後の予測Ｎ末端アミノ酸は、アラニンである。コードされる改変ＶＫ３リーダーおよびＮ末端ＳＯＤ１配列は、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧＭＡ／ＡＴＫＡＶＣＶＬ（配列番号５０の残基１～３０）であり、この配列中のスラッシュマークは、ＶＫ３リーダーペプチド（ＶＫ３ＬＰ）とＳＯＤ１の間の接合部を示す。完成ＳＯＤ１融合構築物は、［ヒトＶＫ３ＬＰ］－［ｈＳＯＤ１］－（ｇ４ｓ）２－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－［ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］（配列番号４９および配列番号５０に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）である。

【0375】

ＳＯＤ１の配列バリアントを含有する追加のＳＯＤ１融合遺伝子も構築する。バリアントは、代替アミノ酸をヒトＳＯＤ１の７および１１２位のシステイン（配列番号３２の完全長未熟ＳＯＤ１配列によるアミノ酸番号付け）の代わりに用い、それによって予測アミノ酸配列のＣ７ＡおよびＣ１１２Ｓ二重突然変異体形態を作出する。この配列は、最初にＰａｒｇｅら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6109-6113, 1992）によって、改善された可溶性および安定性を有するＳＯＤ１の熱安定性突然変異体として記載された。このＳＯＤ１二重突然変異体バリアントを、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２リンカー（上記参照）または（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４リンカー（（ｇ４ｓ）４；配列番号１１および配列番号１２に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）のどちらかを使用して、ヒトＦｃバリアント（ＳＳＳヒンジ、Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ；上記参照）のＮ末端に融合させる。Ｆｃのカルボキシル末端をＮＧＳリンカーに融合させ、このリンカーの後に、野生型ＳＯＤ１融合体について上で説明した通りのＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋバリアントが続く。完成二重突然変異体ＳＯＤ１融合構築物は、［ヒトＶＫ３ＬＰ］－［ｈＳＯＤ１ Ｃ７Ａ Ｃ１１２Ｓ］－（ｇ４ｓ）２－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－［ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］（配列番号５１および配列番号５２に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）および［ヒトＶＫ３ＬＰ］－［ｈＳＯＤ１ Ｃ７Ａ Ｃ１１２Ｓ］－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－［ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］（本明細書では以降、ＳＯＤ１－Ｐ１－Ｋとも呼ばれる；配列番号５３および配列番号５４に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）である。

【0376】

ＳＯＤ１－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質のスーパーオキシドジスムターゼ活性を、市販のキット、例えば、ＳＯＤ比色活性キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ、カタログ番号ＥＩＡＳＯＤＣ）、またはＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌから入手可能な同様のキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ；カタログ番号７０６００２）を使用して測定する。
（実施例６）
ＲＮａｓｅ１－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質の構築

【0377】

野生型ヒトＲＮａｓｅ １の配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１９８２３５．３、ＮＭ＿１９８２３４．３、ＮＭ＿１９８２３２．３、およびＮＭ＿００２９３３．５を参照されたい）を、ＮＣＢＩ配列データベースから入手し、そのネイティブリーダー配列を有する野生型ＲＮａｓｅ １（配列番号２１および配列番号２２に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）またはヒトＶＫ３リーダーペプチド（ＶＫ３ＬＰ）配列に結合したＲＮａｓｅ １（配列番号２３および配列番号２４に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）をコードする発現カセットとして設計し、合成する。次いで、これらのＲＮａｓｅ１コードカセットを、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓアミノ酸置換を有するが野生型ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有さないヒトＩｇＧ１ Ｆｃバリアント（ＳＳＳヒンジ、Ｐ２３８Ｓ Ｆｃ；配列番号４１の残基４７５～１１７０および配列番号４２の残基１５９～３９０に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）に、融合させる。野生型ＲＮａｓｅ１－Ｆｃ構築物（ネイティブリーダーを有する）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号４１および配列番号４２に示され、ＶＫ３ＬＰ－ＲＮａｓｅ１－Ｆｃ構築物のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号４３および配列番号４４に示される。これらの構築物は、ＲＮａｓｅ１のカルボキシル末端をＦｃのＮ末端に連結する、制限部位にコードされた２個の異種アミノ酸（Ａｓｐ－Ｌｅｕ；配列番号４２の残基１５７～１５８、または配列番号４４の残基１４９～１５０）を含有する。

【0378】

ＲＮａｓｅ１コードカセットを、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４リンカーペプチド（（ｇ４ｓ）４；配列番号１１および配列番号１２に示される通りのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列）を介してＳＳＳヒンジ、Ｐ２３８Ｓ Ｆｃバリアントにも融合させる。得られるＲＮａｓｅ１－（ｇ４ｓ）４－Ｆｃヌクレオチドおよび予測アミノ酸配列は、配列番号３３および配列番号３４（ネイティブリーダーを有する野生型ＲＮａｓｅ１について）ならびに配列番号３５および配列番号３６（ヒトＶＫ３リーダーに融合した成熟野生型ＲＮａｓｅ１について）に示される。

【0379】

上記のＲＮａｓｅ１－Ｆｃ構築物の各々におけるヒトＦｃバリアントのカルボキシル末端を、未切断リーダーペプチドの最初の１５個のアミノ酸が欠失しているヒトＰＯＮ１のバリアント（ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ；配列番号５および配列番号６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）が後に続く、Ｎ連結型グリコシル化部位（ＮＧＳ；配列番号５５および配列番号５６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）を含有するペプチドリンカーに、融合させる。生成される完成ＲＮａｓｅ１－Ｆｃ－ＰＯＮ１構築物は、次の通りである：
ｈＲＮａｓｅ１－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－［ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］（配列番号４５および配列番号４６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）；
ｈＶＫ３ＬＰ－ｈＲＮａｓｅ１－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－［ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］（配列番号４７および配列番号４８に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）；
ｈＲＮａｓｅ１－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－［ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］（配列番号３７および配列番号３８に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）；および
ｈＶＫ３ＬＰ－ｈＲＮａｓｅ１－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－［ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］（配列番号３９および配列番号４０に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）。
（実施例７）
ＣＴＬＡ４－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質の構築

【0380】

野生型、完全長、ヒトＣＴＬＡ－４の配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４１２０．１およびＬ１５００６．１を参照されたい）をＮＣＢＩ配列データベースから入手し、ヒトＶＫ３リーダーペプチド（ＶＫ３ＬＰ）配列（配列番号５７および配列番号５８に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）に結合したヒトＣＴＬＡ－４細胞外ドメインをコードする発現カセットの設計および合成に使用する。次いで、これらのＣＴＬＡ－４コードカセットを、ＦｃドメインにＣ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３８ＳおよびＰ３３１Ｓアミノ酸置換を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃバリアント（ＳＳＳヒンジ、Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ；配列番号２７および配列番号２８に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）に、融合させる。ＶＫ３ＬＰ－ＣＴＬＡ４－Ｆｃ構築物のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号６３および配列番号６４に示される。これらの構築物は、ＣＴＬＡ－４のカルボキシル末端をＦｃ領域のＮ末端に連結する、制限部位にコードされた２個の異種アミノ酸（Ａｓｐ－ＬｅｕまたはＤＬ；配列番号６３の残基４３３～４３８、または配列番号６４の残基１４５～１４６）を含有する。

【0381】

上記のＣＴＬＡ４－Ｆｃ構築物の各々におけるヒトＦｃバリアントのカルボキシル末端を、未切断リーダーペプチドの最初の１５個のアミノ酸が欠失しているヒトＰＯＮ１のバリアント（ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ；配列番号５および配列番号６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）が後に続く、Ｎ連結型グリコシル化部位（ＮＧＳ；配列番号５５および配列番号５６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）を含有するペプチドリンカーに、融合させる。生成される完成ＣＴＬＡ４－Ｆｃ－ＰＯＮ１構築物（ｈＶＫ３ＬＰ－［ｈＣＴＬＡ－４ＥＣ］－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－［ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］；本明細書では以降、ＣＴＬＡ４－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋとも呼ばれる）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号６５および配列番号６６に記載される。
（実施例８）
ＣＤ４０－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質の構築

【0382】

野生型、完全長、ヒトＣＤ４０の配列（配列番号６７および配列番号６８に示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２５０を参照されたい）をＮＣＢＩ配列データベースから入手し、そのネイティブリーダー配列を有するヒトＣＤ４０細胞外ドメイン、またはヒトＶＫ３リーダーペプチド（ＶＫ３ＬＰ）配列（配列番号５７および配列番号５８に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）に結合したヒトＣＤ４０細胞外ドメインをコードする、発現カセットの設計および合成に使用する。次いで、これらのＣＤ４０コードカセットを、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４ペプチドリンカー（隣接制限部位およびコードされたアミノ酸を含む、配列番号１１および配列番号１２に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）、およびＦｃドメインにＣ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３８ＳおよびＰ３３１Ｓアミノ酸置換を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃバリアント（ＳＳＳヒンジ、Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ；配列番号２７および配列番号２８に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）に、融合させる。ネイティブリーダーを有する野生型ＣＤ４０－Ｆｃ構築物（［ｈＣＤ４０ ＥＣ］－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ Ｆｃ］）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号６９および配列番号７０に示され、ＶＫ３ＬＰリーダーを有するＣＤ４０－Ｆｃ構築物（ｈＶＫ３ＬＰ－［ｈＣＤ４０ ＥＣ］－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ Ｆｃ］）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号７１および配列番号７２に示される。

【0383】

ＣＤ４０の野生型形態に加えて、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４またはｇｐ３９）に対して改善された結合親和力を示すいくつかのバリアントを生成した。野生型、完全長ヒトＣＤ４０（配列番号６８）によるアミノ酸番号付けを使用して、野生型配列と比較してこれらのＣＤ４０バリアントの各々についてのアミノ酸置換は、（ｉ）Ｋ８１Ｔ、（ｉｉ）Ｋ８１Ｈ、Ｌ１２１Ｐ、（ｉｉｉ）Ｋ８１Ｓ、および（ｉｖ）Ｅ６４Ｙ、Ｋ８１Ｔ、Ｐ８５Ｙである。バリアントＣＤ４０－Ｆｃ構築物は、次の通りである：
ｈＶＫ３ＬＰ－［ｈＣＤ４０ ＥＣ Ｋ８１Ｔ］－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ Ｆｃ］（配列番号７５および配列番号７６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）；
ｈＶＫ３ＬＰ－［ｈＣＤ４０ ＥＣ Ｋ８１Ｈ－Ｌ１２１Ｐ］－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ Ｆｃ］（配列番号７９および配列番号８０に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）；
ｈＶＫ３ＬＰ－［ｈＣＤ４０ ＥＣ Ｋ８１Ｓ］－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ Ｆｃ］（配列番号８３および配列番号８４に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）；および
ｈＶＫ３ＬＰ－［ｈＣＤ４０ ＥＣ Ｅ６４Ｙ－Ｋ８１Ｔ－Ｐ８５Ｙ］－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ Ｆｃ］（配列番号８７および配列番号８８に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）。

【0384】

上記のＣＤ４０－Ｆｃ構築物の各々におけるヒトＦｃバリアントのカルボキシル末端を、未切断リーダーペプチドの最初の１５個のアミノ酸が欠失しているヒトＰＯＮ１のバリアント（ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ；配列番号５および配列番号６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）が後に続く、Ｎ連結型グリコシル化部位（ＮＧＳ；配列番号５５および配列番号５６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）を含有するペプチドリンカーに、融合させる。生成される完成ＣＤ４０－Ｆｃ－ＰＯＮ１構築物は、次の通りである：
ｈＶＫ３ＬＰ－［ｈＣＤ４０ ＥＣ］－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－［ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］（配列番号７３および配列番号７４に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）；
ｈＶＫ３ＬＰ－［ｈＣＤ４０ ＥＣ Ｋ８１Ｔ］－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－［ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］（配列番号７７および配列番号７８に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）；
ｈＶＫ３ＬＰ－［ｈＣＤ４０ ＥＣ Ｋ８１Ｈ－Ｌ１２１Ｐ］－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－［ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］（配列番号８１および配列番号８２に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）；
ｈＶＫ３ＬＰ－［ｈＣＤ４０ ＥＣ Ｋ８１Ｓ］－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－［ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］（配列番号８５および配列番号８６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）；および
ｈＶＫ３ＬＰ－［ｈＣＤ４０ＥＣ Ｅ６４Ｙ－Ｋ８１Ｔ－Ｐ８５Ｙ］－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－［ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］、（配列番号８９および配列番号９０に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）（本明細書では以降、ＣＤ４０ＴＭ－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋとも呼ばれる）。
（実施例９）
抗ＴＮＦ－α ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質の構築

【0385】

ヒトＴＮＦ－αに標的化されたＨｕｍｉｒａ（商標）またはアダリムマブ抗体の配列を、ＩＭＧＴデータベースＩＮＮ番号７８６０、鎖番号ＩＮＮ ７８６０＿ＨおよびＩＮＮ ７８６０＿Ｌから入手する。アダリムマブ抗ＴＮＦ－α抗体配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、重鎖可変領域についてはＬＱ９６１１８７であり、軽鎖可変領域についてはＬＱ９６１１８６である。国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４／１５９５７９も参照されたい。これらの配列を使用して、ヒトＶＫ３リーダーペプチド（ＶＫ３ＬＰ）配列（配列番号５７および配列番号５８に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）に結合したアダリムマブ抗体の重鎖および軽鎖Ｖ領域を含むｓｃＦｖをコードする発現カセットを設計し、合成する。これらのＶ領域配列を（Ｇｌｙ_４ｓｅｒ）_４リンカーセグメントによって結合させてｓｃＦｖを構築する。抗ＴＮＦ－α ｓｃＦｖを、ＶＬ－ＶＨ配向とＶＨ－ＶＬ配向の両方で構築する。ヒトＶＫ３ＬＰ抗ＴＮＦ－α ＶＬ－ＶＨ ｓｃＦｖのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号９１および配列番号９２に示され、ヒトＶＫ３ＬＰ抗ＴＮＦ－α ＶＨ－ＶＬ ｓｃＦｖのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号９５および配列番号９６に示される。

【0386】

次いで、制限部位にコードされた２個の異種アミノ酸（Ａｓｐ－Ｌｅｕ；配列番号９３および配列番号９７の残基８１６～８２２、または配列番号９４および配列番号９８の残基２６９～２７０）を使用して、これらのＴＮＦ－α ｓｃＦｖコードカセットをそのｓｃＦｖのカルボキシル末端においてＦｃドメインのＮ末端に連結させる。Ｆｃドメインは、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓアミノ酸置換を有するがＣＨ２およびＣＨ３ドメインの残りの残基が野生型であるヒトＩｇＧ１ Ｆｃバリアント（ＳＳＳヒンジ、Ｐ２３８Ｓ Ｆｃ；配列番号４１の残基４７５～１１７０および配列番号４２の残基１５９～３９０に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）をコードする。ｓｃＦｖ－Ｆｃ構築物の各々におけるヒトＦｃバリアントのカルボキシル末端を、未切断リーダーペプチドの最初の１５個のアミノ酸が欠失しているヒトＰＯＮ１のバリアント（ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ；配列番号５および配列番号６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）が後に続く、Ｎ連結型グリコシル化部位（ＮＧＳ；配列番号５５および配列番号５６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）を含有するペプチドリンカーに、融合させる。生成される完成抗ＴＮＦ－α ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ＰＯＮ１構築物は、次の通りである：
ｈＶＫ３ＬＰ－［ＶＬ－ＶＨ抗ＴＮＦアルファ ｓｃＦｖ］－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－［ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］、（配列番号９３および配列番号９４に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）（本明細書では以降、アダリムマブｓｃＦｖ－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋとも呼ばれる）；および
ｈＶＫ３ＬＰ－［ＶＨ－ＶＬ抗ＴＮＦアルファ ｓｃＦｖ］－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－［ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］（配列番号９７および配列番号９８に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）。
（実施例１０）
抗ＴＧＦ－β ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質の構築

【0387】

ヒトＴＧＦ－βサイトカインアイソフォームに標的化されたヒト化フレソリムマブ抗体（ＧＣ１００８）の配列をＩＭＧＴ配列データベースから入手する。鎖ＩＤ指定は、ＩＮＮ ９１５８＿ＨおよびＩＮＮ ９１５８＿Ｌである。フレソリムマブ抗ＴＧＦ－β抗体配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、重鎖についてはＪＣ ２３２８０３．１であり、軽鎖についてはＪＣ ２３２８０５である。この抗体の配列は、米国特許第７，７２３，４８６号および国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１３／０６５８６９にも収載されている。これらの配列を使用して、ヒトＶＫ３リーダーペプチド（ＶＫ３ＬＰ）配列（配列番号５７および配列番号５８に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）に結合したＧＣ１００８／フレソリムマブ抗体の重鎖および軽鎖Ｖ領域を含むｓｃＦｖをコードする発現カセットを設計し、合成する。これらのＶ領域配列を（Ｇｌｙ_４ｓｅｒ）_４リンカーセグメントによって結合させてｓｃＦｖを構築する。抗ＴＧＦ－β ｓｃＦｖを、ＶＬ－ＶＨ配向とＶＨ－ＶＬ配向の両方で構築する。ヒトＶＫ３ＬＰ抗ＴＧＦ－β ＶＨ－ＶＬ ｓｃＦｖのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号９９および配列番号１００に示され、ヒトＶＫ３ＬＰ抗ＴＧＦ－β ＶＬ－ＶＨ ｓｃＦｖのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号１０３および配列番号１０４に示される。

【0388】

次いで、制限部位にコードされた２個の異種アミノ酸（Ａｓｐ－Ｌｅｕ；配列番号１０１および配列番号１０５の残基８１９～８２５、または配列番号１０２および配列番号１０６の残基２７０～２７１）を使用して、これらのＴＧＦ－β ｓｃＦｖコードカセットをそのｓｃＦｖのカルボキシル末端においてＦｃドメインのＮ末端に融合させる。Ｆｃドメインは、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓアミノ酸置換を有するがＣＨ２およびＣＨ３ドメインの残りの残基が野生型であるヒトＩｇＧ１ Ｆｃバリアント（ＳＳＳヒンジ、Ｐ２３８Ｓ Ｆｃ；配列番号４１の残基４７５～１１７０および配列番号４２の残基１５９～３９０に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）をコードする。ｓｃＦｃ－Ｆｃ構築物の各々におけるヒトＦｃバリアントのカルボキシル末端を、未切断リーダーペプチドの最初の１５個のアミノ酸が欠失しているヒトＰＯＮ１のバリアント（ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ；配列番号５および配列番号６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）が後に続く、Ｎ連結型グリコシル化部位（ＮＧＳ；配列番号５５および配列番号５６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）を含有するペプチドリンカーに、融合させる。生成される完成抗ＴＧＦ－β ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ＰＯＮ１構築物は、次の通りである：
ｈＶＫ３ＬＰ－［抗ｈＴＧＦベータ ＶＨ－ＶＬ ｓｃＦｖ］－ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］（配列番号１０１および配列番号１０２に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）；および
ｈＶＫ３ＬＰ－［抗ｈＴＧＦベータ ＶＬ－ＶＨ ｓｃＦｖ］－ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］（配列番号１０５および配列番号１０６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）。
（実施例１１）
ＤＮａｓｅ１Ｌ３－ＦｃおよびＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合タンパク質の構築

【0389】

構築物を設計し、合成した。正しい配列を有するカセットを組み合わせて、特有のＤＮａｓｅ１Ｌ３融合分子をコードする２つの合成融合遺伝子を生成する。各構築物は、野生型ヒトＤＮａｓｅ１Ｌ３（配列番号１３５および１３６に示される通りのヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列）のバリアントを含む。各ＤＮａｓｅ１Ｌ３配列を改変して、Ｃ末端核局在化シグナル（ＮＬＳ２）に対応する野生型配列のアミノ酸残基２９１～３０５を除去する。各ＤＮａｓｅ１Ｌ３バリアントは、分子のＮ末端の半分に位置する核局在化シグナル（ＮＬＳ１）を不活性化するために、Ｒ８０、Ｒ９５およびＮ９６位に、野生型ヒト配列（配列番号１３６）と比較してアミノ酸置換も含有する（３つの位置全てがアラニンに変化している、または３つの位置全てがセリンに変化している、どちらか）。Ｒ８０Ａ／Ｒ９５Ａ／Ｎ９６Ａ突然変異を含有する成熟ＤＮａｓｅ１Ｌ３バリアントに対応するヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列は、配列番号１３７の残基６１～８７０および配列番号１３８の残基２１～２９０にそれぞれ示され、Ｒ８０Ｓ／Ｒ９５Ｓ／Ｎ９６Ｓ突然変異を含有する成熟ＤＮａｓｅ１Ｌ３バリアントに対応するヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列は、配列番号１３９の残基６１～８７０および配列番号１４０の残基２１～２９０にそれぞれ示される。用いたシグナルペプチド配列は、ヒトＶＫ３リーダーペプチドであった（配列番号５７および配列番号５８に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）。ＤＮａｓｅ１カセットを、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４ペプチドリンカー（（ｇ４ｓ）４；配列番号１１および配列番号１２に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）を使用してヒトＩｇＧ１ Ｆｃバリアント（ＳＳＳヒンジ、Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓ）のＮ末端に融合させた。Ｆｃバリアントヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号２７および配列番号２８に示される。生成された完成ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｆｃ構築物は、次の通りである：
ｈＶＫ３ＬＰ－［ｈＤＮａｓｅ１Ｌ３ Ｒ８０Ａ－Ｒ９５Ａ－Ｎ９６Ａ ＮＬＳ２デルタ］－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ］（配列番号１３７および配列番号１３８に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）；および
ｈＶＫ３ＬＰ－［ｈＤＮａｓｅ１Ｌ３ Ｒ８０Ｓ－Ｒ９５Ｓ－Ｎ９６Ｓ ＮＬＳ２デルタ］－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ］（配列番号１３９および配列番号１４０に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）。

【0390】

未切断リーダーペプチドの最初の１５個のアミノ酸が欠失しているヒトＰＯＮ１のバリアント（ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ；配列番号５および配列番号６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）が後に続く、Ｎ連結型グリコシル化部位（ＮＧＳ；配列番号５５および配列番号５６に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）を含有するペプチドリンカーに、上記の各バリアントＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｆｃ配列のカルボキシル末端を融合させることによって、機能的ＰＯＮ１酵素をさらに含む二重特異性構築物も生成する。完成ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｆｃ－ＰＯＮ１構築物は、次の通りである：
ｈＶＫ３ＬＰ－［ｈＤＮａｓｅ１Ｌ３ Ｒ８０Ａ－Ｒ９５Ａ－Ｎ９６Ａ ＮＬＳ２デルタ］－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－［ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］（配列番号１６１および配列番号１６２に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）；および
ｈＶＫ３ＬＰ－［ｈＤＮａｓｅ１Ｌ３ Ｒ８０Ｓ－Ｒ９５Ｓ－Ｎ９６Ｓ ＮＬＳ２デルタ］－（ｇ４ｓ）４－［ＳＳＳヒンジ－Ｐ２３８Ｓ－Ｐ３３１Ｓ Ｆｃ］－ＮＧＳ－［ＰＯＮ１ Ｑ１９２Ｋ］、（配列番号１６３および配列番号１６４に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）（本明細書では以降、ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋとも呼ばれる）。
（実施例１２）
二重特異性および単一特異性ＰＯＮ１融合タンパク質の構築および発現

【0391】

実施例１、５、７～９、および１１で説明したような様々なＦｃ融合遺伝子を、ｐＵＣに基づくベクター内にアセンブルし、アセンブルされた遺伝子をさらなるマニピュレーションの前にＤＮＡ配列決定によりスクリーニングした。アセンブルされた遺伝子は、ＤＮａｓｅ１、ＳＯＤ１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ４０、抗ＴＮＦα ｓｃＦｖ、およびＤＮａｓｅ１Ｌ３「Ｔ」領域融合パートナーの各々についての単一特異性（Ｔ－Ｌ１－Ｆｃ）形態と二重特異性ＰＯＮ１（Ｔ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＯＮ１）形態の両方を含んだ。アセンブルされたＰＯＮ１融合構築物は、次のものを含んだ：ＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）６－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、ＳＯＤ１－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、ＣＴＬＡ４－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、ＣＤ４０ＴＭ－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、アダリムマブｓｃＦｖ－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、およびＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ。加えて、単一特異性Ｆｃ－ＰＯＮ１融合構築物をアセンブルした（配列番号１２１および配列番号１２２に示される通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列；本明細書では以降、Ｆｃ－ＰＯＮ１－ＫまたはＦｃ－Ｐ１－Ｋとも呼ばれる）。２つのＡｐｏＡ１－Ｆｃ－ＰＯＮ１融合体：ＴＨＥＲ４－Ｐ１－Ｋ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／０４４４２４の配列番号４５および配列番号４６に示されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列）およびＴＨＥＲ６－Ｐ１－Ｋ（ＴＨＥＲ４－Ｐ１－Ｋと同一だが、リンカー配列内に４つの（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）リピートではなく（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）の６つのリピートを有する）も、アセンブルした。次いで、所望の配列を含有する融合遺伝子カセットを、融合遺伝子の発現を駆動するＣＭＶプロモーターを含有するｐｃＤＮＡ３プラスミド誘導体である哺乳動物発現ベクターｐＤＧの多重クローニング部位に挿入した。プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）ミニまたはマキシプレッププラスミドＤＮＡキットを使用して調製した。精製プラスミドＤＮＡを、おおよそ５０～７５％の集密度で播種したＨＥＫ２９３細胞に、Ｐｏｌｙｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）トランスフェクション試薬を製造業者の使用説明書に従って使用してトランスフェクトした。培養培地をトランスフェクションの翌日にＤＭＥＭ Ｆｌｕｏｒｏｂｒｉｔｅ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）無血清培地に変え、トランスフェクト細胞をさらに４８時間インキュベートした後、培養上清を回収した。培養上清を０．２μｍ ＰＥＳシリンジフィルターによって濾過した後、解析した。

【0392】

図８および図９は、ＨＥＫ２９３一過性トランスフェクションの代表セットからの融合タンパク質発現のウェスタンブロット解析の結果を示す。培養上清を６０μｌのプロテインＡアガロース（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）で免疫沈降させ、穏やかな抗原－抗体結合用緩衝液ｐＨ８．０（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｂｒｉｔｅ ＤＭＥＭ中の０．５ｍｌの２９３トランスフェクション上清を各微量遠心管に添加した。免疫沈降物を一晩、４℃で回転させ、３０００ｒｐｍで遠心分離し、結合用緩衝液ｐＨ８．０で洗浄した後、６０μｌの２×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を添加し、試料を１０分間、７２℃で加熱し、試料を１分間、３０００ｒｐｍで微量遠心機において遠心分離し、各試料からのローディング緩衝液中１５μｌの試料（４分の１）を、４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にロードした。タンパク質分子量マーカーを各ゲルに含めた（Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ（登録商標）ＤＵＯ分子量マーカー；ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥおよび／またはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ ＭＷマーカー；ＢＩＯＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを、ＮｕＰＡＧＥ ＭＯＰＳ泳動用緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で還元条件下、１８５ボルトでおおよそ１～１．５時間、泳動させた。ＸＣｅｌｌブロットモジュール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と、１０％メタノールを含有するＮＵＰＡＧＥ－ＭＯＰＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）転写用緩衝液とを使用して、ゲルをニトロセルロース膜にブロットした。ブロットをＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ（商標）ブロッキング緩衝液中でブロックし、続いて、希釈ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ、ＰＡ）とともにインキュベートした。二次抗体をＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ ７９０近ＩＲ色素（ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ検出）とコンジュゲートし、ブロッキング緩衝液で、４℃で１：３５，０００希釈し、一晩、揺動した。ブロットを、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）で、４回洗浄した。次いで、ブロットをＴＢＳ緩衝液ですすぎ、ＬＩＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ（商標）スキャナーでスキャンした。図８に示されているウェスタンブロットについては、トランスフェクション試料を次のようにロードした：レーン１ － ＣＴＬＡ４－Ｆｃ、レーン２ － ＣＴＬＡ４－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、レーン３ － ＳＯＤ１－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、レーン４ － ＳＯＤ１－Ｆｃ、レーン５ － ＴＨＥＲ６－Ｐ１－Ｋ、レーン６ － ＬＩＣＯＲ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ ＤＵＯ ＭＷマーカー、レーン７ － ＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）６－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、レーン８ － Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、レーン９ － ＣＤ４０ＴＭ－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ；レーン１０ － アダリムマブｓｃＦｖ－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、レーン１１ － ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、レーン１２ － ＣＤ４０ＴＭ－Ｆｃ。各マーカーバンドの近似分子量（ｋＤａ）が、ウェスタンブロットの右側に示されている。図９に示されているウェスタンブロットについては、トランスフェクション試薬を次のようにロードした：レーン１ － ＴＨＥＲ６－Ｐ１－Ｋ、レーン２ － ＳＯＤ１－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、レーン３ － ＴＨＥＲ４－Ｐ１－Ｋ、レーン４ － Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、レーン５ － ＣＤ４０ＴＭ－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ；レーン６ － ＣＤ４０ＴＭ－Ｆｃ、レーン７ － ＬＩＣＯＲ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ ＤＵＯ ＭＷマーカー、レーン８ － ＢＩＯＲＡＤ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ ＭＷマーカー、レーン９ － アダリムマブｓｃＦｖ－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、レーン１０ － アダリムマブｓｃＦｖ－Ｆｃ、レーン１１ － ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、レーン１２ － ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｆｃ。各マーカーバンドの近似分子量（ｋＤａ）が、ウェスタンブロットの右側に示されている。

【0393】

図１０は、ＨＥＫ２９３トランスフェクション上清から免疫沈降したタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果を示す。培養上清を６０μｌのプロテインＡアガロース（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）で免疫沈降させ、穏やかな抗原－抗体結合用緩衝液ｐＨ８．０（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｂｒｉｔｅ ＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中の０．５ｍｌの２９３のトランスフェクション上清を各微量遠心管に添加した。免疫沈降物を一晩、４℃で回転させ、３０００ｒｐｍで遠心分離し、結合用緩衝液ｐＨ８．０で洗浄した後、６０ｕｌの２×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を添加し、試料を１０分間、７２℃で加熱し、試料を１分間、３０００ｒｐｍで微量遠心機において遠心分離し、各試料からのローディング緩衝液中１５μｌの試料（４分の１）を、４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にロードした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを、ＮｕＰＡＧＥ ＭＯＰＳ泳動用緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で還元条件下、１８５ボルトでおおよそ１～１．５時間、泳動させた。電気泳動後、ゲルを蒸留水で数回洗浄し、次いで２時間、Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中でインキュベートした。蒸留水で数回洗浄して非特異的染色剤を除去することによって、ゲルを脱染した。次いで、Ｃａｎｏｎ ＰＩＸＭＡ ＭＧ８２２０スキャナーを使用してゲルをスキャンしてバンドを可視化した。レーンに、次のようにロードした：レーン１ － ＣＴＬＡ４－Ｆｃ、レーン２ － ＣＴＬＡ４－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、レーン３ － ＳＯＤ１－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、レーン４ － ＳＯＤ１－Ｆｃ、レーン５ － ＴＨＥＲ６－ Ｐ１－Ｋ、レーン６ － ＢＩＯＲＡＤ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ分子量マーカー、レーン７ － ＤＮａｓｅＴＭ－（ｇ４ｓ）６－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、レーン８ － Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、レーン９ － ＣＤ４０ＴＭ－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ；レーン１０ － アダリムマブｓｃＦｖ－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、レーン１１ － ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、レーン１２ － ＣＤ４０ＴＭ－Ｆｃ。各マーカーバンドの近似分子量（ｋＤａ）が、ゲル画像の右側に示されている。
（実施例１３）
ＰＯＮ１融合タンパク質の機能活性についてのｉｎ ｖｉｔｒｏ評価

【0394】

ＰＯＮ１融合タンパク質の機能活性を一連のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで評価した。アッセイのいくつかについては、タンパク質活性を、多くの場合、一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の培養上清から直接分析した。他のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイについては、機能活性の評価の前に、融合タンパク質を先ず培養上清（ＨＥＫ ２９３またはＣＨＯ ＤＧ４４トランスフェクト細胞のどちらか）から精製した。融合タンパク質は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって培養上清から精製した。培養上清を０．２μｍ ＰＥＳ ｅｘｐｒｅｓｓフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）によって濾過し、４℃の５０ｍｌ滅菌コニカル遠心分離管（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の中での培養上清とプロテインＡ－アガロース（ＩＰＡ ３００架橋アガロース）スラリーの緩徐な回転を使用する親和性クロマトグラフィーに供した。プロテインＡアガロースに結合した融合タンパク質を遠心分離により回収し、培養上清を除去し、交換し、上清の所望の体積が処理されるまでインキュベーションプロセスを反復した。次いで、最終プロテインＡアガローススラリーを、滅菌、酸洗浄済みエコノカラム（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）にロードして樹脂を洗浄した。次いで、溶出の前に、カラムを数カラム体積のカラム洗浄緩衝液（Ｇｅｎｔｌｅ Ａｇ－Ａｂ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｉｅｒｃｅ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で洗浄して一切の残留培養上清を除去した。次いで、結合したタンパク質を、穏やかなＡｇ／Ａｂ溶出用緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、樹脂から溶出した。画分（０．８～１．０ｍｌ）を収集し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＤＥ）微量試料分光光度計を使用して２８０ｎＭで各画分からのアリコート（２μｌ）のタンパク質濃度を決定し、溶出用緩衝液のみを使用してブランクを決定した。融合タンパク質を含有する画分をプールし、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｇ２（Ｒａｎｃｈ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ、カタログ番号Ｇ２３５０５７、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号０８－６０７－００７）ｆｌｏａｔ－ａ－ｌｙｚｅｒユニット（ＭＷＣＯ ２０ｋＤａ）を使用する［０．９％塩化ナトリウム、５ｍＭ 炭酸水素ナトリウム、１ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１ｍＭ 塩化カルシウム、ｐＨ７．５］に対する透析によって緩衝液交換を行った。透析を、滅菌、２．２リットルＣｏｒｎｉｎｇローラーボトルにおいて４℃で一晩、行った。透析後、０．２μＭフィルターユニットを使用してタンパク質を濾過し、Ｐｙｒｏｔｅｌｌ ＬＡＬゲル凝固システムシングルテストバイアル（ＳＴＶ）（カタログ番号Ｇ２００６、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ、Ｅａｓｔ Ｆａｌｍｏｕｔｈ、ＭＡ）を使用してアリコートをエンドトキシン汚染について試験した。

【0395】

図１１は、ＨＥＫ ２９３培養上清から直接のＰＯＮ１アリールエステラーゼ活性の代表アッセイからの結果を示す。このアッセイについては、培養上清をトランスフェクションから７２時間後にＦｌｕｏｒｏｂｒｉｔｅ ＤＭＥＭ（無血清）に回収し、使用前に０．２ｕｍシリンジフィルターで滅菌濾過した。上清をアッセイのために反応緩衝液で最終所望希釈度の２倍に希釈した。希釈された上清を、ＵＶ透過性９６ウェル平底マイクロタイタープレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の個々のウェルに分取した。反応を２５℃で行った。測定の直前に、アリールエステラーゼ基質酢酸フェニルの適切な希釈物をマルチチャネルピペッターで各ウェルに添加した。グラフに示されているデータについては、培養上清を１：８希釈し、５０μｌを各ウェルに添加した。次いで、基質を５０μｌ／ウェルで添加してアッセイを開始した。大部分のアッセイについて、基質の最終濃度が３～５ｍＭになるように６～１０ｍＭの酢酸フェニルを使用した。酢酸フェニルのフェノールへの変換をモニターするために、２７０ｎｍでの吸光度変化を、２２．５分間、４５秒ごとに読み取り（３０測定／ウェル）を行う動態アッセイでモニターした。次いで、各時点での吸光度を時間の関数としてプロットした。

【0396】

図１２は、二重特異性および単一特異性ＰＯＮ１融合タンパク質中のＰＯＮ１部分の有機ホスファターゼ活性を測定する同様の評価を示す。これらのアッセイにおいて使用した基質は、ＥｎｚＣＨＥＫパラオキソナーゼアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に収容されている有標有機ホスファターゼ基質であった。このアッセイは、３６０／４５０ｎｍの励起／発光極大値を使用してキットに備えられている蛍光性有機リンアナログの変換を測定する、パラオキソナーゼの有機ホスファターゼ活性についての非常に高感度の蛍光定量アッセイである。アッセイを、動態アッセイとして設定することができ、あるいはエンドポイントアッセイのために特定の期間の後に打ち切ることができる。単位時間あたりの相対蛍光単位（ＲＦＵ）の変化を、蛍光標準物質から生成した標準曲線と１Ｕ単位のパラオキソナーゼが３７℃で毎分１ｎｍｏｌの蛍光産物を生成する換算係数とを使用して、試料中のパラオキソナーゼの単位に変換する。融合タンパク質試料中に存在するパラオキソナーゼの量を、キットに備えられているパラオキソナーゼ陽性対照と比較することができる。図１２は、ＨＥＫ ２９３一過性トランスフェクションで発現されたＳＯＤ１－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ、ＣＴＬＡ４－Ｆｃ－Ｐ１－ＫおよびＣＤ４０ＴＭ－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ融合タンパク質のうちのいくつかからのならびにＦｃ－ＰＯＮ１－Ｋ（Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ）融合タンパク質の精製バッチからの培養上清の段階希釈物中に存在する有機ホスファターゼ活性のグラフ表示を示す。有機ホスファターゼ活性を、ヒト血清試料比較のために、平均乃至は平均より高い活性範囲の有機ホスファターゼ陽性対照の２つの異なる希釈物によって生成されたＲＦＵ曲線と比較する。Ｆｃ－ＰＯＮ１－Ｋ精製融合タンパク質は、このアッセイにおいて高い活性を示した。蛍光標準曲線と比較した計算は、ＰＯＮ１有機ホスファターゼ活性が７００ｍＵ／μｇ、または４０Ｕ／ｕｍｏｌ、Ｆｃ－Ｐ１－Ｋであることを示す。ＨＥＫ２９３トランスフェクションからの培養上清もアッセイに含めた。それらはグラフ上に示されていないが、アダリムマブｓｃＦｖ－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋトランスフェクションからの上清は、ＣＤ４０ＴＭ－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋトランスフェクションについて観察された活性プロファイルによく似ていた。同様に、ＤＮａｓｅ１Ｌ３－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋトランスフェクションからの上清は、グラフ上に示されているＳＯＤ１－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋトランスフェクションについて観察された無視できるほど小さい活性レベルとよく似ていた。

【0397】

図１３は、二重特異性および単一特異性ＰＯＮ１融合タンパク質中のＰＯＮ１部分のラクトナーゼ活性を測定するアッセイの結果を示す。これらのアッセイにおいて使用した基質は、１×反応緩衝液中１ｍＭの最終濃度でのジヒドロクマリン（ＤＨＣ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）であった。ＤＨＣアッセイのための反応緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＣａＣｌ_２であった。ＨＥＫ２９３培養上清を反応緩衝液で１：４希釈し、２５μｌを９６ウェルＵＶ ＳＴＡＲ（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯｎｅ、Ｔｈｏｍａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）マイクロタイタープレートの個々のウェルに添加した。反応緩衝液中の基質ジヒドロクマリン（ＤＨＣ）溶液を各ウェル（７５μｌ）に添加して１００μｌの最終体積を生じさせた。基質の加水分解をＯＤ ２７０で１５分間モニターした。融合タンパク質によるＤＨＣの加水分解を時間の関数としてのＯＤ２７０の変化としてモニターした。

【0398】

パラオキソナーゼ酵素活性に加えて、Ｔ－Ｌ１－Ｘ－Ｌ２－Ｐ融合タンパク質のアミノ末端における異なる「Ｔ」ドメインの機能特性も評価した。「Ｔ」ドメインの同一性に依存して、標的抗原への結合、または酵素活性を、モニターした。図１４は、ＣＤ４０ＴＭ－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋ融合タンパク質におけるヒトＣＤ４０受容体細胞外ドメイン三重突然変異体のＣＤ４０リガンドへの抗原結合アッセイの結果を示す。抗原結合ＥＬＩＳＡアッセイは、次のように行った：ヒトＣＤ４０リガンドをＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手した。ヒトＣＤ４０リガンドを０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で２μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、１００ｕｌ／ウェルを、９６ウェルＮＵＮＣ ｉｍｍｕｌｏｎ ＩＩ ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）内のアッセイで使用する各ウェルに分取した。プレートを一晩、４℃でインキュベートした後、一晩、４℃で、２００ｕｌ／ウェルのＰＢＳ／２．０％ＢＳＡでブロックした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、０．００５％Ｋａｔｈｏｎ）で洗浄し、ＨＥＫ ２９３トランスフェクション上清の段階希釈物をプレートのウェルに添加した。抗原結合についての陽性対照として、ＣＤ４０リガンドに標的化されたマウス抗体も、プレート上で段階希釈した。プレートを上清または抗体希釈物とともに４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、次いで、１：１０，０００の希釈度でのホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的、またはヤギ抗マウスＩｇＧ１（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）とともにインキュベートした。図１４は、希釈度の関数として４５０ｎｍでの吸光度をプロットすることによるＣＤ４０ＷＴ－Ｆｃ、ＣＤ４０ＴＭ－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋトランスフェクション上清、およびＣＤ４０Ｌ特異的抗体希釈物についてのＣＤ４０リガンド結合曲線を示す。ＣＤ４０突然変異体形態は、野生型ＣＤ４０Ｆｃ含有上清と比較してＣＤ４０リガンドへの改善された結合活性を示す。

【0399】

図１５は、固定化ＴＮＦ－αを用いる抗原結合ＥＬＩＳＡにおけるＨｕｍｉｒａ（商標）（アダリムマブ）ｓｃＦｖ含有融合タンパク質上清についてのＴＮＦ－アルファ（ＴＮＦ－α）への結合データを示す。抗原結合ＥＬＩＳＡアッセイは、次のように行った：ヒトＴＮＦ－αをＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手した。ＴＮＦ－αタンパク質を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、１００μｌ／ウェルを、９６ウェルＮＵＮＣ ｉｍｍｕｌｏｎ ＩＩ ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）内のアッセイで使用する各ウェルに分取した。プレートを一晩、４℃でインキュベートした後、一晩、４℃で、２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ／２．０％ＢＳＡ）でブロックした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、０．００５％Ｋａｔｈｏｎ）で洗浄し、ＨＥＫ２９３トランスフェクション上清またはマウス抗ヒトＴＮＦ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）どちらかの段階希釈物をプレートのウェルに添加した。プレートを上清または抗体希釈物とともに４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、次いで、１：１０，０００の希釈度でのホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的、またはヤギ抗マウスＩｇＧ１（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）とともにインキュベートした。図１５は、４５０ｎｍでの吸光度を希釈度の関数としてプロットした、アダリムマブｓｃＦｖ－Ｆｃトランスフェクション上清、アダリムマブｓｃＦｖ－Ｆｃ－Ｐ１－Ｋトランスフェクション上清、またはＴＮＦ－α特異的抗体についてのＴＮＦ－α結合曲線を示す。ＨＥＫ２９３一過性トランスフェクションにおいて発現されたアダリムマブｓｃＦｖ含有融合タンパク質は、プレート上に固定化されたヒトＴＮＦ－αに結合する。
（実施例１５）
ＰＯＮ１融合タンパク質の投与による肺線維症の処置

【0400】

肺線維症に対する異なるＰＯＮ１融合タンパク質の効果を、疾患のｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルを使用して評価した。１つのそのようなモデルは、ブレオマイシン誘導性肺線維症マウスモデルにおける肺線維症の処置に対する精製融合タンパク質の有効性のｉｎ ｖｉｖｏ評価を含む。ブレオマイシン（ＢＬＭ）誘導性肺線維症は、ＩＰＦの最もよく確立された疾患モデルであり、治療薬候補の有効性およびメカニズムを調査するために広く使用されている。このモデルでは、肺胞傷害および間質性炎症／線維症が気管内ＢＬＭ投与によって誘導される。この研究の目的は、ＢＬＭ誘導性肺線維症モデルにおける肺炎症および線維症に対するＰＯＮ１融合体試験化合物の効果を調べ、ニンテダニブの対照調製物に対する応答と比較することである。０日目に、食塩水中の塩酸ブレオマイシンの３．０ｍｇ／ｋｇの用量での動物１匹あたり５０μｌの体積でのＭｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒを使用する単回気管内投与によって肺線維症を発症するようにマウスを誘導する。７日目の試験化合物での処置の開始の前日にマウスを体重変化に基づいてマウス１２匹の群に分ける。マウスに試験化合物を（試験群に依存して）鼻腔内／静脈内／腹腔内投与する。化合物を７日目から２０日目まで毎日投与し、２１日目に動物を屠殺し、試料を線維症マーカーについて分析する。

【0401】

研究終了時に、抗凝結剤なしで全血試料を、メデトミジン、ミダゾラムおよびブトルファノールの混合麻酔下、腹部大動脈経由で採取する。分離血液から上清を収集し、さらなる処理まで－８０℃で保管する。肺をマウスから回収し、左側の２つの葉を切除し、一方の葉を凍結し、もう一方を生化学的アッセイ、例えば、ヒドロキシプロリンまたは炎症マーカーの測定のために回収する。残りの肺葉を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、マッソントリクローム染色および組織学的検査のためにパラフィン包埋する。肺線維症エリアの定量的分析のために、デジタルカメラを使用して倍率１００倍でマッソントリクローム染色切片の明視野画像をランダムに捉え、２０視野／マウスにおける胸膜下領域を、肺線維症をグレード分類するための基準（Ashcroft, T., et al., J Clin Pathol, 1988; 41:467-70）に従って評価して、Ａｓｈｃｒｏｆｔスコアを生成する。全ての切片を実験者が盲検的に分析する。統計を処置群ごとに行って、平均Ａｓｃｈｒｏｆｔスコアを計算し、異なる処置群におけるスコアをビヒクル群と比較する。

【0402】

融合タンパク質の別の送達方法を用いてもよい。一例として、上気道に限局される鼻腔内スプレー送達よりむしろ、融合タンパク質の噴霧のほうが、肺のより深部への融合分子の送達を改善することができ、それによって肺の全エリアをより有効に標的化することができる。融合タンパク質を、賦形剤を用いてまたは用いずに噴霧し、タンパク質回収率、凝集および酵素活性について試験することができる。振動メッシュ（ＶＭ）ネブライザー（ＰＡＲＩ ｅＦｌｏｗ．Ｏｍｒｏｎ ＮＥ－Ｕ１００、Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ）を、この器具を使用して他のタンパク質の噴霧が成功しているので、およびＶＭネブライザーは小型かつ携帯型であるため、使用することができる。１ｍＭのＣａＣｌ_２を加えた食塩水（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標）緩衝液）中、１ｍｇ／ｍｌの噴霧されるタンパク質（５００μｌ）を、滅菌６０ｍｍ低タンパク質結合組織培養皿上に収集する。回収した融合タンパク質を、噴霧の前および後に、ＳＤＳゲル、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ）によって、タンパク質濃度および酵素活性について分析して、賦形剤の効果およびタンパク質に対する噴霧の効果を評価する。

【0403】

本発明の特定の実施形態を、例証を目的として本明細書に記載したが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく様々な変更を加えることができることは、上述のことから、理解されるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。本明細書に引用する全ての刊行物、特許および特許出願は、それらの全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

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【国際調査報告】