特表 2024-507278 ポリペプチドの播種沈降

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-16

(54)【発明の名称】ポリペプチドの播種沈降

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/32 20060101AFI20240208BHJP

【ＦＩ】

C07K1/32

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023551217

(86)(22)【出願日】2022-02-22

(85)【翻訳文提出日】2023-10-20

(86)【国際出願番号】 EP2022054454

(87)【国際公開番号】W WO2022180062

(87)【国際公開日】2022-09-01

(31)【優先権主張番号】21158984.1

(32)【優先日】2021-02-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＢＲＩＪ

３．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521002017

【氏名又は名称】プレオミクス・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング

【氏名又は名称原語表記】ＰＲＥＯＭＩＣＳ ＧＭＢＨ

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】クルカ，ニルス・アー

(72)【発明者】

【氏名】ヨハンソン，セバスチャン・ハー

(72)【発明者】

【氏名】ハーティンガー，カトリン

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA62

4H045EA60

4H045GA05

4H045HA32

(57)【要約】

本発明は、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを含む試料をプロセシングまたは分画する方法であって、（ａ）前記試料の物理化学的条件を変化させるステップ；ならびに（ｂ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）：（ｉ）前記試料に固体粒子状物質を添加すること；および（ｉｉ）粗面を有する容器中で前記方法を実行することの一方または両方を実行するステップを含み、ステップ（ａ）および（ｂ）を同時に、または任意の順序で行うことができ；前記プロセシングまたは分画が、前記粒子状物質および／または前記不均一な表面上の沈降物としてタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの１つまたは複数の第１の画分、ならびに上清中に残存するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの第２の画分を得る、前記方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを含む試料をプロセシングまたは分画する方法であって、
（ａ）前記試料の物理化学的条件を変化させるステップ；ならびに
（ｂ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）：
（ｉ）前記試料に固体粒子状物質を添加すること；および
（ｉｉ）粗面を有する容器中で前記方法を実行すること
の一方または両方を実行するステップ
を含み、
ステップ（ａ）および（ｂ）を同時に、または任意の順序で行うことができ；
前記プロセシングまたは分画が、前記粒子状物質および／または前記不均一な表面上の沈降物としてタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの１つまたは複数の第１の画分、ならびに上清中に残存するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの第２の画分を得る、前記方法。

【請求項2】

前記試料が細胞溶解物または体液であり、必要に応じて、前記細胞溶解物または前記体液が抗凝固剤で処理されている、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、またはステップ（ａ）と（ｂ）との両方が、好ましくは、請求項１で定義された上清を用いて、１回より多く実施される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項4】

前記変化させるステップに際した前記物理化学的条件が、
（ｉ）７０℃を超える温度、０．８％（ｗ／ｖ）を超えるＳＤＳなどの変性界面活性剤の濃度、および２５％（ｖ／ｖ）を超えるアセトニトリルなどの有機溶媒の濃度を含まない；ならびに／または
（ｉｉ）前記タンパク質、ポリペプチドおよび／もしくはペプチドのための非変性条件である、
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記物理化学的条件が、
（ｉ）ｐＨ値；
（ｉｉ）温度；
（ｉｉｉ）少なくとも１つの有機溶媒の濃度；
（ｉｖ）少なくとも１つの塩の濃度；
（ｖ）少なくとも１つの界面活性剤の濃度；ならびに
（ｖｉ）前記タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの濃度
の１つ、複数または全部である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

物理化学的条件の前記変化させるステップが、
（ｉ）上昇後の温度が５０℃より低い、前記温度の前記上昇；
（ｉｉ）増加後の溶媒の濃度が２０％（ｖ／ｖ）未満である、有機溶媒の前記濃度の前記増加；
（ｉｉｉ）増加後のカオトロピック塩の濃度が０．５Ｍ未満である、前記カオトロピック塩の前記濃度の前記増加；および
（ｉｖ）増加後の界面活性剤の濃度が０．５％（ｗ／ｖ）未満である変性界面活性剤の前記濃度の前記増加
から選択される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記固体粒子状物質が、０．４～５００μｍの直径を有する複数のマイクロ粒子であり、好ましくは、前記複数のマイクロ粒子が組成において同一である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記粗面がエッチングされている、または多孔性である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記固体粒子状物質が、
（ｉ）磁性または磁化可能な組成物；
（ｉｉ）浮遊粒子；および
（ｉｉｉ）沈降粒子
の１つ、複数または全部からなる、またはそれを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記固体粒子状物質または前記粗面が、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリスチレンジビニルベンゼン（ＰＳ－ＤＶＢ）、ポリ－テトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）および低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）を含むポリエチレン（ＰＥ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、シリカ、シラノール、セラミック、ガラス、または金属からなる、またはそれを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記固体粒子状物質が、
（ｉ）Ｃ４、Ｃ８、Ｃ１８およびスチレンなどの疎水性部分；ならびに／または
（ｉｉ）ヒドロキシル、カルボキシル、スルホニル、第２級、第３級および第４級アミンなどの親水性部分、好ましくは、ヒドロキシル、より好ましくは、シラノール
を担持する、請求項１から５、７または８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記プロセシングまたは分画の後、以下のステップ：
（ｃ）前記沈降物から前記上清を分離するステップ；
（ｄ）前記沈降物を洗浄し、必要に応じて、前記洗浄溶液を、前記上清と合わせるステップ；ならびに
（ｅ）ステップ（ｃ）または（ｄ）の前記上清中の前記タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを、好ましくは、プロテアーゼを用いて、化学物質を用いて、または機械的に切断するステップ
の１つまたは複数を行う、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記プロセシングまたは分画の後、以下のステップ：
（ｆ）前記上清から前記沈降物を分離するステップ；
（ｇ）前記沈降物を洗浄するステップ；
（ｈ）前記沈降物に由来するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを可溶化または再懸濁するステップ；ならびに
（ｊ）ステップ（ｈ）で得られた前記溶出液中の前記タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを、好ましくは、プロテアーゼを用いて、化学物質を用いて、または機械的に切断するステップ
の１つまたは複数を行う、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの沈降をモジュレートまたは増強するための、不均一な表面を有する容器および／または固体粒子状物質の使用。

【請求項15】

少なくとも１つの薬剤が固体粒子状物質に付着した前記固体粒子状物質であって、前記少なくとも１つの薬剤が、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの沈降の誘発因子である、固体粒子状物質。

【請求項16】

（ｉ）前記少なくとも１つの薬剤が１つの薬剤である；
（ｉｉ）前記薬剤が酸もしくは塩基である；
（ｉｉｉ）前記薬剤が界面活性剤、好ましくは、非変性界面活性剤である；および／または
（ｉｖ）前記薬剤が塩、好ましくは、コスモトロピック塩である、
請求項１５に記載の固体粒子状物質。

【請求項17】

予め充填された反応容器であって、請求項１５または１６に記載の固体粒子状物質を含む、前記容器。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

本発明は、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを含む試料をプロセシングまたは分画する方法であって、（ａ）前記試料の物理化学的条件を変化させるステップ；ならびに（ｂ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）：（ｉ）前記試料に固体粒子状物質を添加すること；および（ｉｉ）粗面を有する容器中で前記方法を実行することの一方または両方を実行するステップを含み、ステップ（ａ）および（ｂ）を同時に、または任意の順序で行うことができ；前記プロセシングまたは分画が、前記粒子状物質および／または前記不均一な表面上の沈降物としてタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの１つまたは複数の第１の画分、ならびに上清中に残存するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの第２の画分を得る、前記方法に関する。

【0002】

本明細書では、特許出願および製造業者のマニュアルを含むいくつかの文献が引用される。これらの文献の開示は、本発明の特許性に関連するとは考えられないが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。より具体的には、全ての参照される文献は、あたかもそれぞれ個々の文献が具体的かつ個別的に参照により組み込まれると示されたのと同じ程度に参照により組み込まれる。

【0003】

ポリペプチド／タンパク質の分画、分離、または枯渇は、依然としてバイオ医薬品研究における課題である。例えば、現在の製薬研究における主要な目標の１つは、血漿などの体液の中からのポリペプチド／タンパク質バイオマーカーの同定、検出および定量である。体液内のポリペプチド／タンパク質の非常に高いダイナミックレンジのため、低い存在量のポリペプチド／タンパク質は、検出が困難であることが多いか、または多くの場合、不可能である。このために、多くの現在の方法は、血清アルブミンおよび免疫グロブリンなどの高い存在量のポリペプチド／タンパク質を、それぞれのタンパク質に対するより高い親和性を有するタンパク質への選択的結合によって枯渇させ、除去することを目標とする。例えば、プロテインＧビーズは、目的の試料中のＩｇＧタンパク質の量を減少させるために一般的に用いられている。さらに、イオン交換クロマトグラフィーなどの分画方法も、ポリペプチド／タンパク質を分離し、試料の複雑性およびダイナミックレンジを減少させるために使用されることが多い。

【0004】

選択的タンパク質／ポリペプチド沈降の概念は、よく確立されており、以前に記載された（Ｅ．Ｊ．Ｃｏｈｎ、Ｌ．Ｅ．Ｓｔｒｏｎｇ、Ｗ．Ｌ．Ｈｕｇｈｅｓ、Ｄ．Ｊ．Ｍｕｌｆｏｒｄ、Ｊ．Ｎ．Ａｓｈｗｏｒｔｈ、Ｍ．Ｍｅｌｉｎ、およびＨ．Ｌ．Ｔａｙｌｏｒ；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９４６、６８巻（３号）、４５９～４７５頁；ＤＯＩ：１０．１０２１／ｊａ０１２０７ａ０３４）。ここで、ｐＨ、温度、およびエタノール含量が、血漿中の溶液中のある特定のポリペプチド／タンパク質の段階的沈降を誘導するために利用される。このプロセスは依然として、ある特定のタンパク質／ポリペプチド種を精製するための製薬業界における大規模タンパク質富化における主要プロセスの１つである。しかしながら、このプロセスは、残存する可溶性ポリペプチド／タンパク質から沈降したポリペプチド／タンパク質を上手く分離するために濾過またはスピンダウンすることができる十分な沈降物を生成するために大量の出発材料を必要とする。さらに、濾過または遠心分離の自動化は、依然として困難である。

【0005】

Ｂａｔｔｈら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １８巻、１０２７～１０３５頁、２０１９）およびＨｕｇｈｅｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０巻、７５７頁、２０１４）は、タンパク質変性を伴う過酷な条件、例えば、沸騰時でも８０℃の温度、高濃度の変性界面活性剤、例えば、ＳＤＳ、高濃度の有機溶媒、例えば、アセトニトリル、またはそれらの組合せを共有するプロテオーム分析のためのワークフローを記載している。

【0006】

先行技術の欠点を考慮すると、本発明の基礎となる技術的課題は、試料のプロセシングもしくは試料の分画のための改善された手段および方法、特に、ポリペプチドを含む試料の提供、または研究、製造および診断を含むプロテオミクスの分野に見ることができる。

【0007】

この技術的課題は、同封の特許請求の範囲によって、および本開示に含まれる実施例によって証明されるように解決された。

【0008】

したがって、本発明は、第１の態様において、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを含む試料をプロセシングまたは分画する方法であって、（ａ）前記試料の物理化学的条件を変化させるステップ；ならびに（ｂ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）：（ｉ）前記試料に固体粒子状物質を添加すること；および（ｉｉ）粗面を有する容器中で前記方法を実行することの一方または両方を実行するステップを含み、ステップ（ａ）および（ｂ）を同時に、または任意の順序で行うことができ；前記プロセシングまたは分画が、前記粒子状物質および／または前記不均一な表面上の沈降物としてタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの１つまたは複数の第１の画分、ならびに上清中に残存するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの第２の画分を得る、前記方法に関する。

【0009】

それと関連して、本発明は、生体分子を含む試料をプロセシングまたは分画する方法であって、（ａ）前記試料の物理化学的条件を変化させるステップ；ならびに（ｂ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）：（ｉ）前記試料に固体粒子状物質を添加すること；および（ｉｉ）粗面を有する容器中で前記方法を実行することの一方または両方を実行するステップを含み、ステップ（ａ）および（ｂ）を同時に、または任意の順序で行うことができる、前記方法を提供する。

【0010】

好ましい生体分子は、生体高分子である。好ましい生体高分子は、上に開示されたタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドに加えて、核酸、糖および脂質を含む。

【0011】

用語「分画」は、その業界で確立された意味を有する。それは、化合物または分析物の混合物を、少なくとも２つの別々の混合物に分割することを指し、ここで、前記別々の混合物は、少なくとも１つの前記化合物または分析物に関してその相対含量が異なる。換言すれば、少なくとも１つの分析物は、少なくとも１つの他の画分と比較して、少なくとも１つの画分において富化されている。分画は、少なくとも１つの分析物の、少なくとも１つの画分からの実質的な、または全体的な枯渇をもたらし得るが、そうである必要はない。より一般的な意味では、分画は、元の混合物と比較して、ダイナミックレンジまたは複雑性の改変または低下をもたらし得る、例えば、最も存在量の多い分析物の量の、最も存在量の少ない分析物の量に対する比を、元の混合物と比較して、得られる画分の少なくとも１つにおいて低下させることができる。ダイナミックレンジのそのような低下は、一般的には、その後の分析手順、例えば、質量分析（ＭＳ）における検出に適している分析物の量を増加させる。本明細書で使用される場合、用語「複雑性」とは、所与の画分に含まれる分析物、特に、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの数を指す。ダイナミックレンジの圧縮は、一般的には、より多数の分析物が検出されることを伴う。

【0012】

用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、同様にその業界で確立された意味を有する。特に、ペプチドおよびポリペプチドは、アミノ酸、好ましくは、タンパク質を構成するＬ－アルファ－アミノ酸の重縮合物である。本明細書では、そのような重縮合物は、それが３０個以下のアミノ酸を含有する場合、ペプチドと称され、より長い重縮合物は、ポリペプチドと称される。好ましいペプチドは、２０～３０アミノ酸の長さを有するものである。一般に、ペプチドおよびポリペプチドは、単鎖であり、ジスルフィドなどの架橋および／またはリン酸化などの改変の存在を排除しない。他方で、タンパク質は、それらがポリペプチドのオリゴマーであっても、および／または補欠分子族などの非タンパク質性成分を含んでもよいという点で、より複雑な構造を有してもよい。そのようなタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの分析は、分子レベルで健康状態と疾患状態とを区別することに関して、特に興味深いものである。

【0013】

「物理化学的条件」は、温度などの物理的パラメータならびに溶媒組成などの化学的パラメータの両方を包含する。物理化学的条件は、混合物中の分析物の状態に対する影響を有し、その状態を分析物の化学ポテンシャルに関して表現することができる。物理化学的条件の変化は、より大きい、またはより小さい程度での、混合物中の１つまたは複数の分析物の沈降を誘発するための手段である。条件の変化は、分析物の沈降状態を促進する。この点で、沈降と変性との間には線を引く必要がある。以下でさらに明らかになるように、沈降を誘発するが、変性を避ける条件が優先される。

【0014】

用語「沈降」は、特に、化学の分野で使用される場合、その業界で確立された意味を有する。それは、溶解または可溶性から不溶性への、考慮中の物質の組成物（ここでは、タンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチド）の状態の変化を指す。不溶性物質は、最初は懸濁液として形成してもよく、次いで、例えば、重力の影響下で沈殿して（遠心分離などの手順によって促進することができる）、沈降物（特定の領域、一般的には、使用される容器またはコンテナの底部における不溶性物質）を得てもよい。遠心分離の場合、沈降物は、一般的には、ペレットと称される。

【0015】

前記プロセシングまたは分画は、前記粒子状物質および／または前記不均一な表面上の沈降物としてタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの１つまたは複数の第１の画分、ならびに上清中に残存するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの第２の画分を得る。そのような分画は、原理的には、その最も広い定義において第１の態様の方法に内在する。これは、上清および沈降物の用語を提起し、両方ともその業界で確立された意味を有する。第１の態様の方法に従うプロセシングの後、元の試料のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの一部は、その物質の状態を変化させており、もはや溶液中にはないが、沈降物として、前記不均一な表面および／または前記固体粒子状物質に接着する。残りの分析物は依然として溶液中にあり、上清を構成する。

【0016】

これは、少なくとも１つの第１の画分および第２の画分の概念を提起する。１つより多い第１の画分、すなわち、１つより多い沈降物が存在してもよいという事実は、本発明の方法が１つより多い型の粒子状物質および／または１つより多い型の不均一な表面を用いてもよいという事実に由来する。１つの型の粒子状物質または不均一な表面が好ましい。

【0017】

沈降は、溶液が過飽和になった時、すなわち、溶液が、所与の条件下で溶液中で安定に維持することができるものよりも多い溶質を含有する時に起こる。しかし、過飽和状態は、ある特定の時間量にわたって持続してもよい。これが、沈降が起こる理由であり、一般的には、核生成として知られるプロセスが起こる必要がある。核生成が起こらない場合、過飽和状態は、準安定になり得る。「準安定」とは、わずかな条件変化に応答して安定であるが、より大きい条件変化が起こる場合には不安定である状態を指す。核生成は、播種によって容易化され得る。播種は一般に、準安定な過飽和状態を、沈降を伴う不安定な状態に変換する。播種は、以下でさらに明らかになるように、機構的な用語で本発明の重要な特徴である。

【0018】

物理化学的条件は、沈降の好適な誘発因子であると記載されている；上記の背景のセクションで引用された文献を参照されたい。本発明に従って変化させるべき好ましい物理化学的条件の一覧は、以下にさらに開示される好ましい実施形態の主題である。本明細書で使用される条件と関連する用語「過酷」とは、沈降を誘発するのに特にふさわしい物理化学的条件を指す。過酷な条件は、極端な場合、前記試料からの全部または実質的に全部のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの沈降を引き起こし得る。そのため、過酷な条件は、一般的には、あまり好ましくない。過酷な条件の別の欠点は、沈降に加えて、それらが好ましい分析物であるタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドなどの生体分子の変性を誘発し得るということである。以下でより詳細に考察される通り、本発明による手段（ｂ）は、沈降を全く誘発しない、または不十分な程度で誘発するため、手段（ｂ）の非存在下では用いることができない条件を含む、あまり過酷ではない条件を使用することを可能にする。好ましい、あまり過酷ではない条件は、非変性条件ならびに以下にさらに開示される特定の条件である。

【0019】

実際、本発明者らは、驚くべきことに、物理化学的条件の変化の効果をモジュレートまたは増強することができることを発見した。これは、本発明の第１の態様の方法のステップ（ｂ）において表現される。そのようなモジュレーションまたは増強は、異なる程度で異なる分析物に影響してもよいが、影響する必要はない。ステップ（ｂ）による尺度は、事実上、物理的である。それらの包括的原理は、構造化された表面または粗面である。そのような構造化された表面は、プロセシングもしくは分画しようとする試料に添加される粒子状物質として、またはプロセシングもしくは分画が行われる容器の表面の改変として具体化され得る。

【0020】

構造化された表面は、特に制限されない。驚くべきことに、粒子状物質の組成は無関係であるということが判明した。さらに、容器の構造化された表面は、容器の残りの部分と同じ材料（ガラス、プラスチックなど）から作られていてもよい。

【0021】

容器の表面は、全体的に、または１つもしくは複数の領域において粗くてもよい。前記１つまたは複数の領域のサイズは巨視的であるが、粗い領域における構造的な不均一性または粗さは顕微鏡的である。例えば、領域は、３、４、５、６、７、８、または９ｍｍを含む、２～１０ｍｍなどの１～２０ｍｍの直径を有してもよい。他方、構造的不均一性または粗さは、ナノメートルからμｍ規模、好ましくは、０．４～１００μｍ、より好ましくは、１～６０μｍ、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０および２５μｍを含む２～３０μｍなどの１～６０μｍである。

【0022】

表面の構造的不均一性または粗さは、粗さパラメータＲａを単位として記載され得る。Ｒａは、考慮中の表面に沿ったプロファイルの中心線からの算術平均偏差である。Ｒａの値は、長さである；それは通常、μｍで特定される。好ましい実施形態では、粗さに関する上で与えられた好ましい値が、Ｒａ値である。粗さは、表面形状測定装置、光学コンパレータ、干渉計および顕微鏡などの機器によって決定することができる。好ましい機器は、表面形状測定装置である。

【0023】

一般に、構造的不均一性の好ましいスケールは、前記固体粒子状物質の好ましいサイズでもある。

【0024】

特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、前記固体粒子状物質および前記粗面は、常に形成するが、粒子または粗面の非存在下では再び溶解する、非常に小さい核（沈降プロセスの初期中間体）を安定化すると考えられる。さらに説明すると、小さい核は、より大きい核と比較して、体積比でより大きい表面を有する。核の自由エネルギーは、その表面とその体積との両方に依存する。古典的な核生成理論によれば、表面項は常に正であり、核生成の合計自由エネルギーが小さい核について正となるような核生成を好まない。核のサイズが成長している場合にのみ、体積項が優位に立ち、最終的に、核生成が進行し、沈降が起こる。前記粒子状物質または前記粗面は、体積項の優位が非常に小さい核について既に起こっているように、小さい核の表面エネルギーを改変すると考えられる。

【0025】

本発明の方法は、試料中の分析物のダイナミックレンジを減少させること、および／または検出に適している分析物の数を増加させることに関して確立された方法と比較した場合、優れて機能する。ダイナミックレンジの減少は、質量分析などの任意の下流の分析方法の性能を改善する。質量分析などの分析方法は、本質的には、十分な定性的および定量的検出がその中で可能である限られたダイナミックレンジを特徴とする。試料中に含まれる分析物のダイナミックレンジを減少させることによって、例えば、最も存在量の多い分析物の相対量を減少させることによって、本発明の方法を用いてプロセシングされなかった試料中の、検出を逃れる低い存在量の分析物が、検出可能および定量可能になる。

【0026】

本発明の方法はさらに、タンパク質またはポリペプチドの分画の業界で確立された方法と比較して、プロセシング速度の劇的な改善を提供する。一晩、または数日間のプロセシングが当業界で一般的であり、また、本発明によっても想定されるが（３０秒～一晩（約１２時間）または１週間の任意のプロセシング時間が好ましい）、本発明の方法は、より好ましくは、分で測定される時間規模で、例えば、１分～３時間、２～３０分、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５分で実施することができる。

【0027】

さらなる改善は、方法の実施の成功にとって十分な試料の量である。先行技術の方法は一般的には大量の、またはさらには数リットルの体液を必要とするが、本発明は、１～１０００μｌ、５～１００μｌ、例えば、１０、２０、３０、４０または５０μｌなどの小さい試料サイズで機能する。尿などのタンパク質／ポリペプチド／ペプチド濃度が低い体液の場合、上記で特定された範囲および値に加えて、１μｌ～１００ｍｌまたは１０μｌ～５０ｍｌなどの、より大きい試料サイズも考慮される。

【0028】

実施例に見られるように、考慮中のプロテオームを、前例のない深度で分析することができた。すなわち、ＭＳによる検出に適しているタンパク質の数は、予想外に多かった。

【0029】

本発明の、特に、不均一な表面または粒子状物質の沈降に対するモジュレート／増強効果のさらなる利点は、業界で確立された手順と比較してあまり過酷ではない様式で、物理化学的条件を用いることができるということである。換言すれば、第１の態様のステップ（ｂ）による尺度の存在下では、物理化学的条件を、沈降と分画との両方に関して依然として十分な結果を得ながら、前記尺度の非存在下と比較して少ない程度で変化させることができる。実際、あまり強力に沈降しない条件は、例えば、血漿試料中の、高存在量のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドから低存在量のものを分離するのに十分であるだけでなく、より優れていることが見出されている。強力に沈降する条件（Ｃｏｈｎら、上掲に記載されたものなど）は一般に、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの混合物の選択性の低い沈降をもたらすが、あまり沈降しない条件は驚くべきことに、播種された沈降物のより選択的な沈降をもたらすことが見出された。実施例に示されるように、沈降物中の高存在量の分析物と比較して、低存在量の分析物を富化することができた。とりわけ、前記試料中の総タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの画分のみを沈降させることが想定されるか、またはさらには好ましい。そうすることによって、好ましい様式で検出可能なタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドのダイナミックレンジおよび数が改変される。前記画分は、０．０１～５０重量％、より好ましくは、０．１～２０重量％、例えば、０．５～１０重量％の範囲にあってもよい。０．０００１～５重量％および０．００１～１重量％などの、さらにより少ない画分が、意図的に想定される。

【0030】

実施例に示されるように、本発明の方法は、所与の試料中のより多数のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの検出を可能にするため（換言すれば、プロテオームがより大きい深度で検出される）、前記方法は、細胞、組織または生物の所与の状態（健康および疾患を含む「状態」）のための新規マーカーおよび新規マーカーの組合せを提供し、順に、新規マーカーは改善された診断を提供する。特に、タンパク質の検出は多くの分析または診断適用において目的のものであることを考慮すれば、タンパク質が特に好ましい分析物である。

【0031】

好ましい実施形態では、前記タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドは、前記試料中に溶解している。

【0032】

さらに好ましい実施形態では、前記試料は、細胞溶解物または体液であり、必要に応じて、前記体液または細胞溶解物は、抗凝固剤で処理されている。

【0033】

本発明の方法の細胞溶解物への適用は、「宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）」分析として当業界で公知であるものに拡張される。ＨＣＰ分析は、その生産／製造のために使用される、細胞、例えば、不死化Ｂ細胞からの、バイオ医薬品、例えば、抗体の精製のモニタリングを指す。そのような精製は一般に、宿主細胞タンパク質を枯渇させ、最終的に医薬品等級の生成物を得る段階的プロセスである。前記宿主細胞タンパク質は、宿主細胞に由来する潜在的にアレルギー性の、またはそうでなければ望ましくないタンパク質またはポリペプチドを含む。換言すれば、ＨＣＰ分析を、本発明の方法を使用して実行することができる。

【0034】

体液は、血液、血清、血漿、唾液、鼻スワブ、尿、膣液、精液、および脳脊髄液を含む。細胞溶解物を、任意の細胞、組織または生検から取得することができる。好ましくは、前記細胞溶解物の不溶性部分は、例えば、本発明の方法を実施する前に遠心分離または濾過によって除去される。

【0035】

用語「抗体」は、その業界で確立された意味を有する。それは、全ての天然に存在するクラスおよびサブクラス、例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、ならびにラクダ科抗体を包含する。本明細書で使用される場合、用語「抗体」はさらに、断片（Ｆａｂなど）および操作された抗原結合性分子、例えば、単鎖抗体、二または多特異性抗体および少なくとも３個（特に、ラクダ科抗体およびその誘導体の場合）、好ましくは、６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する任意の抗原結合性分子を包含する。

【0036】

抗凝固剤を用いた生体試料の処理は、特に、それが臨床試料になる場合、当業界で一般的である。一例を挙げれば、血清は、保存された場合に凝固し得る血液の液体成分であるが、抗凝固剤の添加は、凝固を防止するのに役立ち、血漿を生じさせる。血清の場合の血栓および血漿の場合の血液細胞は一般に、遠心分離によって除去される。抗凝固剤は、当業界で公知であり、ＥＤＴＡが特に一般的であり、ＥＤＴＡ Ｋ２およびＥＤＴＡ Ｋ３が好ましい。

【0037】

さらに好ましい実施形態では、ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、またはステップ（ａ）と（ｂ）との両方は、好ましくは、上で定義された上清を用いて、１回より多く実施される。本発明の方法を、反復的に実施することができる。例えば、最初の沈降物が除去されたら、同じか、もしくは改変された物理化学的条件下で、および／または同じか、もしくは異なる不均一な表面もしくは粒子状物質を用いて、上清を用いて方法を反復することができる。これにより、方法の最初の実施時に得られた上清をさらに分画することができる。

【0038】

さらに好ましい実施形態では、前記変化に際した前記物理化学的条件は、（ｉ）７０℃を超える温度、０．８％（ｗ／ｖ）を超えるＳＤＳなどの変性界面活性剤の濃度、および２５％（ｖ／ｖ）を超えるアセトニトリルなどの有機溶媒の濃度を含まない；ならびに／または（ｉｉ）前記タンパク質、ポリペプチドおよび／もしくはペプチドのための非変性条件である。

【0039】

試料調製のための一般的に使用されるワークフロー（本明細書の導入部分を参照されたい）は、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの完全な、または実質的に完全な沈降を含む。このために、非常に過酷な条件、特に、上記実施形態の項目（ｉ）に記載されたものが用いられる。他方、本発明の方法は、粒子および／または粗面の使用のおかげで、そのような過酷な条件をなしで済ますことができる。

【0040】

これは、明確な利点を提供する。上述の通り、プロテオームは、一般的には、大きいダイナミックレンジを特徴とする。結果として、抗体およびアルブミンなどの高存在量のタンパク質の存在下での低存在量のタンパク質の検出は困難になる。しかし、研究および診断の分野における多くの適用について、低存在量のタンパク質の捕捉は興味深いものである。例えば、疾患状態では、疾患に特徴的な少量のマーカーは、罹患した局部組織から離れ、血漿に進入し、そこでそれらは高度に希釈される。したがって、ダイナミックレンジの圧縮が望ましい。粒子状物質および／または粗面の使用は、これを達成するための１つの手段である。過酷な条件、特に、変性条件の回避は、さらなる手段である。さらに説明すると、包括的変性および同時沈降は一般に、ダイナミックレンジを実質的に未変化のままにする：全ての分析物は沈降し、続いて、さらなるプロセシングのために溶液中に戻される。他方で、あまり過酷ではない条件（好ましいその実施については、以下を参照されたい）は、より差別化された効果を有する。特に、経験上、記載された高存在量のタンパク質は、記載された低存在量のタンパク質よりも、非変性条件下で沈降する傾向が低い（しかし、それらは本明細書で以前に概説された条件下ではそうするであろう）。結果として、非変性条件下での沈降は、優先的に、一般的には完全にではないが、沈降物から高存在量のタンパク質を枯渇させる。したがって、沈降物中に見出されるものは、依然として非常に有益であるが、圧縮されたダイナミックレンジを特徴とする。

【0041】

そのため、本発明による好ましい条件は、非変性条件である。
本明細書で使用される場合、用語「条件」は、別途特定されない場合、第１の態様の方法のステップ（ａ）に従って「物理化学的条件を変化させた」後の条件を指す。タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを含む前記試料が、その天然状態、すなわち、非変性状態の前記タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを含むと仮定すると、例えば、前記試料は、少なくとも変性を伴う程度ではなく、その物理化学的条件を変化させることなく、または実質的に変化させることなく、その天然の生体環境から得られたため、前記変化前の条件は一般に、非変性的であることが理解される。

【0042】

タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドに関する用語「非変性条件」は、当業界で一般的に使用され、当業者によって理解される。変性のプロセスは、明確な三次元構造の喪失をもたらす。そのような喪失は一般に、機能、同族結合パートナーへの結合および／またはその同族基質をプロセシングする酵素の能力を含む「機能」を損なう。さらに、前記喪失は一般に、サイズの増加（例えば、流体力学半径を単位として測定される）ならびにサイズ分布の幅の増大を伴う。

【0043】

完全を期すために、非変性条件と変性条件とを区別する閾値の好ましい定義は、以下の通りである。

【0044】

動的光散乱（ＤＬＳ）は、拡散定数Ｄを流体力学半径Ｒ_ｈと接続するＳｔｒｏｋｅ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎの関係によって粒子の流体力学半径Ｒ_ｈを測定することによって、懸濁液または溶液中の小さい粒子のサイズ分布を決定するために使用することができる分析方法である。それにより、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの非変性状態と変性状態とを識別することができる。非変性状態または天然状態は、上述の通り、限られた幅を有するサイズ分布のピークを与える明確な構造を特徴とする。他方の変性は、前記明確な構造の喪失を引き起こし、前記明確な構造を全て、または実質的に全て有する分子の以前の均一な集合は、天然構造の欠如を共有するが、そうでなければ、特に、その流体力学半径Ｒ_ｈに関して多様である不規則な構造のより不均一な集合に変換される。これは、一般的には平均流体力学半径の増大を伴う、ＤＬＳによって得られた分布のピークの広がりによって反映される。平均Ｒｈの増大ならびにＲｈの分布のピークの広がり、好ましくは、いずれかのパラメータの統計的に有意な変化は、両方とも変性の特質である。本発明による天然と変性とを区別する閾値は、ピーク幅の変化を十分に利用する。

【0045】

ピークの幅のモデル非依存的尺度は、半値全幅（ＦＷＨＭ）である。より具体的には、ＦＷＨＭは、従属変数がその最大値の半分に等しい独立変数の２つの値の間の差異である。前記ピークの形状を規定するガウス分布の場合、ＦＷＨＭは、前記ガウス分布の標準偏差の単純関数である。

【0046】

変性条件と非変性条件とを区別する閾値を定義する目的のために、原理的には任意のタンパク質を使用することができる。これに関して好ましいタンパク質は、好ましくは、ヒト起源のＧＡＰＤＨおよびＭＴＡＰ、より好ましくは、ヒトＧＡＰＤＨである。

【0047】

好ましい非変性条件は、生理的条件である。用語「生理的条件」は、その業界で確立された意味を有し、細胞内条件を指す。好ましい生理的条件は、以下の通りである：１４ｍＭ Ｎａ^＋、１４０ｍＭ Ｋ^＋、１０^－７ｍＭ Ｃａ^２＋、２０ｍＭ Ｍｇ^２＋、４ｍＭ Ｃｌ^－、１０ｍＭ ＨＣＯ_３ ^－、１１ｍＭ ＨＰＯ_４ ^２－およびＨ_２ＰＯ_４ ^－、１ｍＭ ＳＯ_４ ^２－、４５ｍＭホスホクレアチン、１４ｍＭカルノシン、８ｍＭアミノ酸、９ｍＭクレアチン、１．５ｍＭラクテート、５ｍＭ ＡＴＰ、３．７ｍＭヘキソース一リン酸、４ｍＭタンパク質および４ｍＭ尿素。好ましい温度は３７℃である。好ましい圧力は１０１３．２５ｈＰａである。

【0048】

したがって、好ましい実施形態では、動的光散乱によって決定された前記タンパク質の流体力学半径の分布関数のピークの、非変性条件と比較した広がり、好ましくは、統計的に有意な広がりは、変性条件を示す。前記ピークの幅の好ましい尺度は、ＦＷＨＭである。

【0049】

特に好ましい実施形態では、物理化学的条件の変化時の少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％または少なくとも２０％の前記ＦＷＨＭの相対的増加は、変性条件をもたらしている条件の前記変化を示す。相対的増加という用語は、以下のように定義される：（ＦＷＨＭ_ｆ－ＦＷＨＭ_ｉ）×１００／ＦＷＨＭ_ｉ（式中、下付き文字ｉおよびｆは、それぞれ、最初（条件を変化させる前）および最後（条件を変化させた後）を指す）。

【0050】

前記値より低いＦＷＨＭの任意の変化は、条件を変化させる際に、非変性条件から出発して、新しい条件を用語「非変性」の下に包含させるべきであることを意味する。

【0051】

特に好ましい実施形態では、用語「非変性」は、２０％より下であるＦＷＨＭの相対的増加に適用される。

【0052】

さらに好ましい実施形態では、前記物理化学的条件は、（ｉ）ｐＨ値；（ｉｉ）温度；（ｉｉｉ）少なくとも１つの有機溶媒の濃度；（ｉｖ）少なくとも１つの塩の濃度；（ｖ）少なくとも１つの界面活性剤の濃度；ならびに（ｖｉ）前記タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの濃度の１つ、複数または全部である。

【0053】

特に好ましい実施形態では、ｐＨの変化は、前記不均一な表面または固体粒子状物質上に沈降させようとするタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの等電点に向かう。タンパク質性分子は、その等電点（ＩＥＰ）の近くで少なくとも可溶性であることが公知である。ｐＨを変化させる薬剤は、特に限定されず、酸および塩基を含む。

【0054】

好ましい酸としては、ホウ酸、硫酸、硝酸ならびにＨＦ、ＨＣｌおよびＨＢｒを含むハロゲン化水素などの無機酸；メタンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸などのスルホン酸；ギ酸、酢酸およびクエン酸などのカルボン酸；トリフルオロ酢酸、クロロ酢酸およびフルオロ酢酸などのハロゲン化カルボン酸が挙げられる。

【0055】

好ましい塩基としては、金属酸化物、金属水酸化物、金属炭酸塩および金属重炭酸塩が挙げられる。特に好ましい塩基は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＣｓＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）_２、Ｃａ（ＯＨ）_２、Ｓｒ（ＯＨ）_２、Ｂａ（ＯＨ）_２ならびにさらに、ＮＨ_３、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド、グアニジン、ブチルリチウムおよびＮａＨである。

【0056】

特に好ましい実施形態では、温度の変化は、低下である。温度の低下は一般に、溶解度を低下させ、異なる程度で異なるタンパク質性分析物に影響する。

【0057】

特に好ましい実施形態では、温度の変化は、増加である。温度の増加は、変性を含む構造的変更をもたらし、次いで、沈降を促進し得る。

【0058】

特に好ましい実施形態では、有機溶媒の濃度の変化は、好ましくは、エタノール、メタノール、ｎ－プロパノール、ｉ－プロパノールなどのアルコール；アセトニトリルなどのニトリル；アセトンなどのケトン；２－メトキシエタノールなどのグリコールエーテル；ヘキサンなどの脂肪族炭化水素；ベンゼンなどの芳香族炭化水素；ホルムアルデヒドなどのアルデヒド；またはそれらの混合物の、増加または低下である。

【0059】

プロセシングしようとする試料が、有機溶媒を含まないか、または実質的に含まない場合、濃度の増加は、明らかに好ましい選択肢である。他方で、沈降を受ける試料が有機溶媒を含有する場合、例えば、それは有機溶媒の添加を含む予備プロセシングを受けているため、前記有機溶媒の濃度の低下は、沈降条件を微調整および／または最適化する手段でもあり得る。

【0060】

特に好ましい実施形態では、塩の濃度の変化は、前記塩の濃度の増加であり、前記塩は、好ましくは、コスモトロピック塩である。コスモトロピック塩を使用する「塩析」は、沈降を誘発するための手段として公知である。好ましいコスモトロピック塩としては、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、ならびにＬｉ＋、Ｚｎ２＋およびＡｌ３＋から選択されるカチオンならびに炭酸塩、硫酸塩およびリン酸水素から選択されるアニオンとの塩が挙げられる。

【0061】

また、コスモトロピック塩の濃度を低下させることも想定される。
さらに特に好ましい実施形態では、塩の濃度の変化は、前記塩の濃度の低下であり、前記塩は、好ましくは、カオトロピック塩である。カオトロピック塩は、一般に、溶解度を増加させる。したがって、濃度の低下が好ましい。好ましいカオトロピック塩は、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ_２、グアニジン塩酸塩などのグアニジン塩、過塩素酸リチウムなどの過塩素酸塩、酢酸リチウム、バリウム塩、チオシアン酸塩、ヨウ化物およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。

【0062】

他方で、高存在量タンパク質が沈降する傾向があり、沈降物中の大量のそれ存在が回避されるべきであるシナリオがあってもよい。そのような場合、カオトロピック塩の添加またはその濃度の増加が望ましい場合がある。

【0063】

沈降に対する異なる塩／カチオン／アニオンの異なる効果は、ホフマイスターシリーズとして当業界で公知である。

【0064】

特に好ましい実施形態では、界面活性剤の濃度の変化は、濃度の増加である。界面活性剤の添加は、そうでなければ不必要に高い沈降する傾向を有するタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを溶液中に保持するための手段である。これは、例えば、アポリポタンパク質などの膜貫通タンパク質に適用される。

【0065】

前記試料が界面活性剤を含むか、または界面活性剤を添加することによる予備プロセシングを受けた程度で、界面活性剤の濃度を低下させることも想定される。これは、一般的には、沈降を誘発するための手段である。

【0066】

好ましい界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）、コール酸ナトリウム（ＳＣ）、２－［４－（２，４，４－トリメチルペンタン－２－イル）フェノキシ］エタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド（ＤＤＭ）、ジギトニン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）、ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０）、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３－（［３－コラミドプロピル］ジメチルアンモニオ）－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、ポリエチレングリコールノニルフェニルエーテル（ＮＰ－４０）、ｎ－オクチルベータ－Ｄ－チオグルコピラノシド（ＯＴＧ）、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－２－（ヒドロキシメチル）－６－オクトキシオキサン－３，４，５－トリオール（オクチルグルコシド）、ｎ－デシル－β－Ｄ－マルトピラノシド（ＤＭ）、３－（４－（１，１－ビス（ヘキシルオキシ）エチル）ピリジニウム－１－イル）プロパン－１－スルホネート（ＰＰＳ）、３－（（１－（フラン－２－イル）ウンデシルオキシ）カルボニルアミノ）プロパン－１－スルホン酸ナトリウム（ＰｒｏｔｅａｓｅＭＡＸ）、または３－［（２－メチル－２－ウンデシル－１，３－ジオキソラン－４－イル）メトキシ］－１－プロパンスルホン酸ナトリウム（ＲａｐｉＧｅｓｔ ＳＦ）；およびそれらの混合物である。

【0067】

好ましいのは、温和な界面活性剤、すなわち、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを変性させないが、疎水性であり、界面活性剤の非存在下では凝集するであろう、それらまたはその一部を可溶化する界面活性剤である。温和な界面活性剤としては、ＳＤＳなどのデオキシコレートが挙げられる。

【0068】

特に好ましい実施形態では、前記タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの濃度の変化は、増加である。そのような増加を、例えば、蒸発によって達成することができる。

【0069】

特に好ましい実施形態では、前記タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの濃度の変化は、例えば、水または緩衝剤（例えば、ＰＢＳ）などの溶媒を添加することによる、低下である。好ましくは、添加される前記溶媒は、試料の組成を模倣する（前記タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドは無視する）。

【0070】

さらに好ましい実施形態では、物理化学的条件の前記変化は、（ｉ）上昇後の温度が５０℃より低い、前記温度の前記上昇；（ｉｉ）増加後の溶媒の濃度が２０％（ｖ／ｖ）未満である、有機溶媒の前記濃度の前記増加；（ｉｉｉ）増加後のカオトロピック塩の濃度が０．５Ｍ未満である、前記カオトロピック塩の前記濃度の前記増加；および（ｉｖ）増加後の界面活性剤の濃度が０．５％（ｗ／ｖ）未満である変性界面活性剤の前記濃度の前記増加、から選択される。

【0071】

上記の好ましい実施形態は、本明細書の「あまり過酷でない」または「非変性」条件とより一般的に称されるものの具体的な定義を提供する。

【0072】

前記上昇後の特に好ましい温度は、４０℃未満、３０℃未満であるか、または前記試料を周囲温度（２０℃など）もしくはそれ未満に維持することが好ましい場合、全く上昇しない。

【0073】

用語「有機溶媒」は、その業界で確立された意味を有する。それは、プロトン性および非プロトン性の両方の極性有機溶媒を包含する。化合物クラスに関して、それは、メタノール、エタノールおよびプロパノール（ｉ－プロパノールを含む）などのアルコール、アルデヒド、アセトンなどのケトン、ならびにアセトニトリルなどのニトリルを包含する。さらなる有機溶媒は、上にさらに開示されている。

【0074】

前記有機溶媒の特に好ましい濃度は、有機溶媒の非存在を含む、１５％（ｖ／ｖ）未満、１０％（ｖ／ｖ）未満、または５％（ｖ／ｖ）未満である。

【0075】

好ましいカオトロピック塩は、上にさらに開示されている。前記カオトロピック塩の特に好ましい濃度は、カオトロピック塩の非存在を含む、０．４Ｍ未満、０．３Ｍ未満、０．２Ｍ未満、０．１Ｍ未満、０．０５Ｍ未満または０．０１Ｍ未満である。

【0076】

界面活性剤または洗剤内で、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの構造的および機能的完全性に対するその効果に関して区別を行うことができる。変性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含み、その回避または低濃度での使用が特に好ましい。さらなる変性界面活性剤は、エチルトリメチルアンモニウムブロミドである。非変性界面活性剤としては、ＮＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、Ｂｒｉｊ－３５、Ｂｒｉｊ－６８、Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｔｗｅｅｎ－８０、オクチルベータ－グリコシド、オクチルチオグリコシド、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯならびにＳＤＣおよびそれらの誘導体が挙げられる。

【0077】

変性界面活性剤の特に好ましい濃度は、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、および０．１％未満（全てｗ／ｖ）であり、変性界面活性剤の完全な非存在を含む。

【0078】

そのあまり過酷でない特性のため、好ましくは、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満（全てｗ／ｖ）の濃度で非変性界面活性剤を用いることができる。

【0079】

さらに好ましい実施形態では、還元剤は使用されないか、または使用する場合、０．１％（ｗ／ｖ）未満の濃度で使用される。還元剤としては、Ｔｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）が挙げられる。

【0080】

さらに好ましい実施形態では、前記固体粒子状物質は、０．４～５００μｍの直径を有する複数のマイクロ粒子であり、好ましくは、前記複数のマイクロ粒子は、組成において同一である。より好ましいサイズ範囲は、０．５～２００μｍ、１～１００μｍ、または２～５０μｍ、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５μｍである。粒子の集団中の粒径は、一般的には平均あたりに分布する。上記数値は、前記平均を指す。走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）または静的光散乱（ＳＬＳ）などの業界で確立された方法を用いて、粒径を決定することができる。

【0081】

好ましい実施形態では、使用される粒子の量は、試料１μｌあたり０．０１～１００μｇの範囲の粒子、より好ましくは、０．１～１０μｇ／μｌまたは１～５μｇ／μｌ、例えば、２．５μｇ／μｌである。

【0082】

さらに好ましい実施形態では、前記粗面は、エッチングされているか、または多孔性である。

【0083】

一般的に言えば、これは前記固体粒子状物質ならびに前記不均一な表面の両方に適用されるが、好ましくは、これらはいずれも、ある特定の分析物または分析物のクラスに優先的に結合する表面を提供するために誘導体化も官能化もされていない。これは、各分析物を富化または枯渇させるための調整された表面を用いる多くの先行技術の手法とは異なる。実際、前記表面または前記粒子状物質に対する結合部分に関する要件は存在しない。その代わりに、前記表面および前記粒子状物質の効果は、シードのものである。播種は、物質の変化が、シードの非存在下では起こらない、遅れて起こる、またはより過酷な物理化学的条件が起こる必要がある、物質の状態の変化を誘発するための手段である。

【0084】

さらに好ましい実施形態では、前記固体粒子状物質は、（ｉ）磁性または磁化可能な組成物；（ｉｉ）浮遊粒子；および（ｉｉｉ）沈降粒子の１つ、複数または全部からなる、またはそれを含む。これらの様々な型の粒子を、本発明の方法を実行する場合、単一の型の粒子として使用することができるが、１つより多い型の粒子状物質を使用し、それによって、複数の第１の画分または沈降物を生成する実施形態も可能にする。

【0085】

さらに好ましい実施形態では、前記固体粒子状物質は、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリスチレンジビニルベンゼン（ＰＳ－ＤＶＢ）、ポリ－テトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）および低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）を含むポリエチレン（ＰＥ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、シリカ、シラノール、セラミック、ガラス、または金属からなる、またはそれを含む。

【0086】

前記固体粒子状物質にとって好ましい材料は、好ましい容器材料でもあり、前記容器は、本発明による粗面を有する容器である。

【0087】

さらなる実施形態では、前記固体粒子状物質は、定義された部分、好ましくは、（ｉ）Ｃ４、Ｃ８、Ｃ１８およびスチレンなどの疎水性部分；ならびに／または（ｉｉ）親水性部分、例えば、ヒドロキシル、カルボキシル、スルホニル、第２級、第３級および第４級アミン、好ましくは、ヒドロキシル、より好ましくは、シラノールを担持する。

【0088】

とりわけ、そのような型の官能化または誘導体化された粒子が想定されるが、それらを使用するための本発明による要件は存在しない。

【0089】

上で開示された粒子は、様々な製造業者から入手可能であり、文献、例えば、Ｈｅｎｃｈ ＆ Ｗｅｓｔ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０巻、３３～７２頁（１９９０）；Ｒａｈｍａｎ ＆ Ｐａｄａｖｅｔｔａｎ、Ｊ．Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ １３２４２４（２０１２）；Ｒａｏら、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．２８９巻、１２５～１３１頁（２００５）；およびＲａｈｍａｎら、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａ ２９４巻、１０２～１１０頁（２００７）に提供された指針に従うことによって調製することができる。

【0090】

第１の態様の方法の以下の好ましい実施形態は、順に、さらに下流の分析方法に先行し得る、好ましい下流のプロセシングステップに関する。好ましい下流の分析方法は、ＭＳ（典型的には、以下の実施形態の１つ、複数または全部のプロセシングステップ（ｃ）～（ｊ）の後に実施される）である。

【0091】

そのため、好ましい実施形態では、前記プロセシングまたは分画の後、１つまたは複数の下記ステップ：（ｃ）沈降物から上清を分離するステップ；（ｄ）沈降物を洗浄し、必要に応じて、洗浄溶液を前記上清と合わせるステップ；ならびに（ｅ）（ｃ）または（ｄ）の上清中のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを、好ましくは、プロテアーゼを用いて、化学物質を用いて、または機械的に切断するステップを行う。この実施形態は、上清をさらにプロセシングすることに焦点を合わせたものである。

【0092】

さらに好ましい実施形態では、前記プロセシングまたは分画の後、１つまたは複数の下記ステップ：（ｆ）上清から沈降物を分離するステップ；（ｇ）沈降物を洗浄するステップ；（ｈ）前記沈降物に由来するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを可溶化または再懸濁するステップ；ならびに（ｊ）ステップ（ｈ）で得られた溶出液中のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを、好ましくは、プロテアーゼを用いて、化学物質を用いて、または機械的に切断するステップを行う。この実施形態は、沈降物をさらにプロセシングすることに焦点を合わせたものである。とりわけ、この実施形態および先行する好ましい実施形態は両方とも、併用して使用することができる。

【0093】

特に好ましい実施形態では、前記固体粒子状物質を使用する場合、前記分離するステップは、遠心分離、濾過によってまたは磁気的手段によって行われる。

【0094】

特に好ましい実施形態では、前記粗面を使用する場合、前記分離するステップは、ピペッティング、排水またはデカンテーションなどによって上清を除去することによって行われる。

【0095】

さらに特に好ましい実施形態では、前記可溶化または再懸濁するステップは、洗剤、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）などの溶媒、尿素もしくはチオウレアなどのカオトロピック剤、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの酸、ＮａＯＨなどの塩基、またはそれらの混合物を用いて実施される。

【0096】

好ましい界面活性剤は、本明細書の上に開示されている。
さらに特に好ましい実施形態では、（ｉ）前記プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、セリンカルボキシプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼおよびメタロカルボキシプロテアーゼから、好ましくは、トリプシン、キモトリプシン、Ｌｙｓ－Ｃ、Ｌｙｓ－Ｎ、Ａｓｐ－Ｎ、Ｇｌｕ－ＣおよびＩｄｅＳから選択される；（ｉｉ）前記化学物質は、ＨＣｌ、ＢｒＣＮ、ＢＮＰＳ－スカトール、ギ酸、ヒドロキシルアミン、もしくは２－ニトロ－５－チオシアノ安息香酸である；または（ｉｉｉ）機械的切断は、それぞれ、前記上清または溶出液中に存在する磁石を少なくとも１回動かすことによる。

【0097】

プロテアーゼに関して、記載されたクラスは、以下のようなＥＣクラスである：セリンプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１）、セリンカルボキシプロテアーゼ（ＥＣ３．４．１６）、システインプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２２）、アスパラギン酸プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２３）、メタロプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４）、およびメタロカルボキシプロテアーゼ（ＥＣ３．４．１７）。

【0098】

好ましくは、磁石を動かすことによる、機械的切断に関しては、全体が参照により本明細書に組み込まれる、本発明者らの以前の特許出願ＷＯ２０２０／００２５７７およびＥＰ特許出願第２０１７４４６９号、第２０１７４４８４号、および第２０１７９３１７号が参照される。

【0099】

簡単に述べると、機械的切断を、少なくとも１個の分子中の少なくとも１個の共有結合を切断する方法であって、（ａ）少なくとも１つの磁性体を前記少なくとも１個の分子と衝突させること；および／または（ｂ）前記少なくとも１つの磁性体を動かすことによって、少なくとも１つの非磁性粒子の、前記少なくとも１個の分子との衝突を誘発することを含む、前記方法によって行うことができる。

【0100】

好ましい分子は、生体分子、特に、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドである。
前記少なくとも１つの磁性体を、単一の磁石、すなわち、フェリ磁性、強磁性または常磁性材料の一部として実装することができる。前記磁性体は、好ましくは、変動運動または周期振動運動を実行する。そのような運動は、好ましくは、変動磁場または周期振動磁場によって誘発される。順に変動するか、または周期的に振動する電流によって、磁場を生成することができる。時間の関数としての電流のアンペア数は、好ましくは、矩形関数である。電流は、好ましくは、機械的切断が起こる容器を取り囲むコイルを通って流れる。前記容器は、プロセシングしようとする試料および前記少なくとも１つの磁性体を含有する。

【0101】

さらに好ましい実施形態では、本発明の方法によって得られる画分、すなわち、上清および／または沈降物は、ＭＳに供され、必要に応じて、上で開示された介在するプロセシングステップ（ｃ）～（ｊ）の１つ、複数または全部がＭＳの前に行われる。好適なＭＳシステムまたは質量分析計としては、（分析装置によって分類される）：
飛行時間（ＴＯＦ）分析装置、例えば、ＴＩＭＳ－ＴＯＦ Ｐｒｏ（Ｂｒｕｋｅｒ）またはＳｙｎａｐｔ ＸＳ（Ｗａｔｅｒｓ）、６２３０Ｂ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ６６００（Ｓｃｉｅｘ）、ＬＣＭＳ－９０３０（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）；
Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ａｎａｌｙｚｅｒ、例えば、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐシリーズ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｔｒｉｂｒｉｄ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｘｐｌｏｒｉｓシリーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；
四重極分析装置、例えば、Ａｌｔｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｅｖｏｑ（Ｂｒｕｋｅｒ）、６４００シリーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、ＱＴＲＡＰ（Ｓｃｉｅｘ）、ＳＣＩＥＸ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ７５００（Ｓｃｉｅｘ）、Ｘｅｖｏシリーズ（Ｗａｔｅｒｓ）、ＬＣＭＳ－８０６０シリーズ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）；および
イオントラップ分析装置、例えば、ＬＴＱ ＸＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、アマゾンシリーズ（Ｂｒｕｋｅｒ）、
ＦＴ－ＩＣＲ（フーリエ変換－イオンサイクロトロン共鳴）分析装置、例えば、ｓｏｌａｒｉＸ（Ｂｒｕｋｅｒ）またはＬＴＱ ＦＴ Ｕｌｔｒａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
が挙げられる。

【0102】

好ましくは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）デバイス、より好ましくは、マイクロまたはナノフローＬＣシステムを、好ましくは、オンラインで質量分析計と連結する。

【0103】

第２の態様では、本発明は、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの沈降をモジュレートまたは増強するための、不均一な表面を有する容器および／または固体粒子状物質の使用に関する。前記容器は、前記タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの溶液または懸濁液を含有する。前記粒子状物質は、前記タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに、一般的には、その溶液または懸濁液に添加される。

【0104】

第１の態様の方法の好ましい実施形態は、適用可能な場合、第２の態様の使用の好ましい実施形態を定義する。

【0105】

第３の態様では、本発明は、少なくとも１つの薬剤が固体粒子状物質に付着した固体粒子状物質であって、前記少なくとも１つの薬剤が、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの沈降の誘発因子である、固体粒子状物質に関する。

【0106】

好ましい実施形態では、（ｉ）前記少なくとも１つの薬剤は、１つの薬剤である；（ｉｉ）前記薬剤は、酸もしくは塩基である；（ｉｉｉ）前記薬剤は、界面活性剤、好ましくは、非変性界面活性剤である；および／または（ｉｖ）前記薬剤は、塩、好ましくは、コスモトロピック塩である。

【0107】

第１の態様の方法の好ましい実施形態は、適用可能な場合、第３の態様の好ましい実施形態を定義する。

【0108】

第４の態様では、本発明は、予め充填された反応容器であって、第３の態様による固体粒子状物質を含む、前記容器を提供する。

【0109】

第１の態様の方法の好ましい実施形態は、適用可能な場合、第４の態様の好ましい実施形態を定義する。

【図面の簡単な説明】

【0110】

【図1】ＬｏＢｉｎｄ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブの内面を粗くするために使用されるデバイスである。

【図2】粗くなった表面を有するＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブ（左）および通常のチューブ（右）である。

【実施例】

【0111】

実施例は、本発明を例示する。
実施例１
粒子を使用する播種沈降
材料および方法
本発明による播種上の沈降法を、ＰｒｅＯｍｉｃｓ ＧｍｂＨ（Ｐｌａｎｅｇｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入することができるｉＳＴキットからのｉＳＴ緩衝剤およびｉＳＴカートリッジを利用するｉＳＴ手順（Ｋｕｌａｋら、２０１４）と共に使用することができる。それは、以下に記載されるようなｉＳＴプロセスの前にｎ個の追加ステップを追加する。

【0112】

ステップ１（追加ステップ）：一般に、第１のステップとして、沈降シード、別途言及しない場合、典型的には、直径３μｍの、シラノール表面化学を有する磁性ビーズを、１００μｌのｄｄＨ_２Ｏで３回洗浄し、ドライシードで終了させた。次いで、８０μｌのインキュベーション緩衝剤を添加した後、大まかに１０００μｇのタンパク質含量に相当する２０μｌのヒト血漿を添加した。全ての成分を、ボルテクサーを使用して完全に混合した後、１，０００ｒｐｍで３０分間混合しながら室温でインキュベートした。インキュベーション後、好適な分離技術を使用して、シードから流体を分離した後、上記のインキュベーション緩衝剤でシードを３回洗浄し、それらの上にタンパク質が沈降したドライシードを得た。

【0113】

ステップ２：次いで、５０μｌのＬＹＳＥ－ＢＣＴ緩衝剤を添加した後、９５℃および１，０００ｒｐｍで１０分間、加熱および振とうした。室温に冷却した後、５０μｌの再懸濁したＤＩＧＥＳＴを添加し、５００ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で６０分間インキュベートした。

【0114】

１００μｌのＳＴＯＰ緩衝剤を添加して、消化反応物をクエンチした。得られる懸濁液を完全に混合し、ｉＳＴカートリッジ上に移した後、３，８００ｒｃｆで１分間遠心分離した。２００μｌのＷＡＳＨ１を添加した後、今記載した通りに遠心分離した。ＷＡＳＨ２を使用して、前の通りこれを反復した。フロースルーを廃棄し、カートリッジを新鮮な収集チューブに移した。

【0115】

１００μｌのＥＬＵＴＥ緩衝剤をカートリッジに添加した後、３，８００ｒｃｆで１分間遠心分離した。このステップを合計２回の溶出について１回反復し、１つの収集チューブに集めた。

【0116】

溶出液を、完全に乾燥するまで４５℃、真空下でＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ中に移した。乾燥したペプチドを再懸濁し、振とうおよび／またはボルテックスによって適切に再懸濁するために、典型的には、ｉＳＴキットのＬＣ－ＬＯＡＤ緩衝剤１０μｌを添加した。ペプチドの濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ機器を用いて測定した。

【0117】

タンパク質およびペプチド同定の分析のために、Ｔｈｅｒｍｏ ｅａｓｙ ｎＬＣ１２００液体クロマトグラフィーシステムを使用して、ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ質量分析計中に溶液を注入した。ＭＳ測定のために、５％の緩衝剤Ａ（水中の０．１％ギ酸）から９５％の緩衝剤Ｂ（８０％アセトニトリル中の０．１％ギ酸）までの４５分の勾配を、全ての実験に適用した。

【0118】

この一般的手順を、以下に示されるいくつかの異なる様式で実行した：
－ 実験１（ＳＪ１５０）：インキュベーション緩衝剤を改変した。試料１＋２：水、試料３＋４：０．２×ＰＢＳ溶液、試料５＋６：０．４×ＰＢＳ溶液、試料７＋８：０．６×ＰＢＳ溶液、試料９＋１０：０．８×ＰＢＳ溶液、試料１１＋１２：１×ＰＢＳ溶液。

【0119】

－ 実験２（ＳＪ１５４）：インキュベーション緩衝剤を改変した。試料１＋２：水、試料３＋４：２％エタノール、試料５＋６：４％エタノール、試料７＋８：６％エタノール、試料９＋１０：８％エタノール、試料１１＋１２：１０％エタノール。

【0120】

－ 実験３（ＳＪ１５５）：インキュベーション緩衝剤を改変した。試料１＋２：水、試料３＋４：２％アセトニトリル、試料５＋６：４％アセトニトリル、試料７＋８：６％アセトニトリル、試料９＋１０：８％アセトニトリル、試料１１＋１２：１０％アセトニトリル。

【0121】

－ 実験４（ＳＪ１５６）：インキュベーション緩衝剤を改変した。試料１＋２：ｐＨ＝２．４、試料３＋４：ｐＨ＝４．２、試料５＋６：ｐＨ＝６．０、試料７＋８：ｐＨ＝６．９２、試料９＋１０：ｐＨ＝９．０、試料１１＋１２：ｐＨ＝１０．９４。

【0122】

－ 実験５（ＳＪ１６４）：ｐＨ１０．９４のインキュベーション緩衝剤（実験４、試料１１＋１２と同じ）。ここでは、異なるシードを使用した。試料１＋２：Ｃ１８磁性ビーズ、試料３＋４：ＣＯＯＨ磁性ビーズ、試料５＋６：トシル磁性ビーズ、試料１＋２：ＮＨ２磁性ビーズ、試料９＋１０：プロテインＧ磁性ビーズ、試料１１＋１２：エポキシ磁性ビーズ、試料１３～１５：内部対照（実験４、試料１１＋１２の反復）。

【0123】

－ 実験６（ＳＪ１６５）：ｐＨ１０．９４のインキュベーション緩衝剤（実験４、試料１１＋１２と同じ）。ここでは、沈降ステップ後にシードを新しいフラスコに移す効果を試験した。試料１～３：実験４と同じ、試料１１＋１２（内部対照）、試料４～６：沈降後にシードを新しいフラスコに移す。

【0124】

－ 実験６（ＳＪ１６９）：ｐＨ１０．９４のインキュベーション緩衝剤（実験４、試料１１＋１２と同じ）。ここでは、シードの多孔性の影響を試験した。試料１～３：３つのｚｅｏｌｉｔｈビーズを、シード、多孔性材料として使用した。試料４～６：非多孔性セラミックビーズをシードとして使用した。

【0125】

－ 実験７（ＳＪ１７４）：ｐＨ１０．９４のインキュベーション緩衝剤（実験４、試料１１＋１２と同じ）。ここでは、シード表面の影響を試験した。試料１～３：直径１００～２００μｍのガラスビーズをシードとして使用した。試料４～６：直径９０～１２５μｍのｋｏｒｕｎｄ Ｆ１２０をシードとして使用した。試料７～９：直径９０～１２５μｍのｓｉｌｉｃｉｕｍ Ｆ１２０をシードとして使用した。これらの材料は、典型的な吹き付け加工剤である。

【0126】

－ 対照１（ＳＪ１５０、１３～１５）：上記のｉＳＴ－ＢＣＴ手順であるが、沈降を用いない（ステップ１）。２μｌのヒト血漿を遊離体として使用した。

【0127】

－ 対照２（ＳＪ１３０、１＋２；ＳＪ１１９、３＋４）：ステップ１を以下のように改変した：試料１および２について、８００μｌのＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｍｅｒｃｋ、ＧＥ１７－０９４８－０１）を、ポリエチレンフリットを含有するカラムに添加した。ブルーセファローススラリーに由来する液体を、シリンジを使用して押し出した。次いで、０．８ｍｌの０．２×ＰＢＳ溶液を添加し、再度押し出した。合計３回にわたって、これを２回繰り返した。６４μｌのヒト血漿を、０．２×ＰＢＳを使用して１００μｌまで埋め、洗浄したブルーセファロースビーズに添加し、３６０度回転しながら１時間インキュベートした。次いで、４００μｌの０．２×ＰＢＳを添加し、シリンジを用いて押し出した。フロースルーを収集し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ中で乾燥した。次いで、乾燥したペレットの半分を、ステップ２に記載されたようにプロセシングした。試料３および４について、５０μｌのブルーセファロースビーズを、１００μｌのｄｄＨ２Ｏで３回洗浄し、急速ボルテックス（１５秒）および遠心分離（５秒）を使用し、上清を除去して、１００μｌの平衡化緩衝剤（製造業者によって記載された、０．０５ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４）を用いて３回平衡化させた。次いで、５０μｌの結合緩衝剤（製造業者によって記載された、０．０５ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４）を、比較的乾燥ビーズに添加し、１０μｌのヒト血漿上に注意深く移した。効率的な結合のために、１，０００ｒｐｍで振とうしながら１０分間、インキュベートした。試料をスピンダウンし、上清を新しい反応フラスコに移した。２５μｌの２×ＬＹＳＥ－ＢＣＴ（ＰｒｅＯｍｉｃｓ ＧｍｂＨ）を添加し、ステップ２を実施した。

【0128】

－ 対照３（ＳＪ１３４）：試料１および２：１００μｌのプロテインＡ磁性ビーズ（ＲｅＳｙｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ、Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａ）を、３００μｌのＰＢＳで３回洗浄し、磁気分離を使用して、流体を廃棄した。次いで、９０μｌの結合緩衝剤（製造業者によって記載された、ＰＢＳ）を、１０μｌのヒト血漿に添加し、混合し、上記の洗浄した乾燥ビーズに添加した。１，０００ｒｐｍで振とうしながら、懸濁液を３０分間インキュベートした。インキュベーション後、磁気分離を使用して上清を除去し、１００μｌのプロテインＧビーズ（ＲｅＳｙｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ、Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａ）に添加し、上記のように洗浄し、乾燥した。インキュベーションを上記のように実施した後、分離し、プロテインＧビーズを用いる別のラウンドのインキュベーションを行った。最後に、上清をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ中で乾燥した。乾燥した場合、ステップ２を実施した。試料３＋およびを上記のように処理したが、プロテインＡビーズ（Ｍａｇｔｉｖｉｏ）は１回のみ使用した。

【0129】

結果
同定されたタンパク質の数

【0130】

【表1】

【0131】

【表2】

【0132】

考察
示した全ての実験について、全ての対照と比較したタンパク質同定の顕著な増加を観察することができる。これは、本発明によるシード上での沈降が、本明細書の上で開示された利点を有することを示している。

【0133】

実施例２
粗面を使用する沈降
材料および方法
本実施例では、粒子を使用しなかった。その代わりに、粗面を有する容器を使用し、それによって、本発明の代替的な実施を例示した。その他の点では、別途特定しない限り、材料および方法は実施例１のものである。

【0134】

－ 実験８（ＳＪ２２１）：ＬｏＢｉｎｄ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブの壁面を、市販のＤｒｅｍｅｌ機器（図１および２を参照されたい）を使用して粗くし、ビーズに基づくワークフロー（実施例１、実験４、試料１１＋１２と同様）およびｉＳＴワークフローと比較した。最後の２つの３回反復物は、この実験内の対照として役立つ。

【0135】

－ 実験９（ＳＪ２１６）：血漿自体を、異なるチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ ＥＤＴＡ ＫＥ ９ｍｌ、Ｓａｒｓｔｅｄｔ Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ Ｎａ Ｃｉｔｒａｔｅ ２．９ｍｌ、Ｓａｒｓｔｅｄｔ Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ Ｌｉ Ｈｅｐａｒｉｎ ７．５ｍｌ、Ｓａｒｓｔｅｄｔ Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ抗凝固剤なし、ＢＤ Ｐ１００ Ｋ２ＥＤＴＡ Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ ２ｍＬ）を使用して回収し、室温で１０分間、１５０ｇで遠心分離した。遠心分離後、上清をさらなるプロセシングのために除去した。同じ抗凝固剤の異なるドナーに由来する血漿をプールした。試料を、ビーズに基づくワークフロー（実施例１、実験４、試料１１＋１２と同様）を使用してプロセシングしたが、記載されたのと同じ勾配設定でＴｈｅｒｍｏ ｅａｓｙ ｎＬＣ１２００液体クロマトグラフィーに取り付けたＢｒｕｋｅｒ ＴｉｍｓＴＯＦ Ｐｒｏ上で測定した。

【0136】

結果
結果を、以下の表に示す。用語「ビーズに基づくワークフロー」とは、実施例１を指す。

【0137】

実験８：

【0138】

【表3】

【0139】

実験９：

【0140】

【表4】

【0141】

考察
実験８は、粗面が、通常のｉＳＴワークフローと比較して、同定されるタンパク質（タンパク質ＩＤ）の数を増加させることを示す。

【0142】

実験９は、血漿を回収するための抗凝固剤の使用の安定化効果を示す。

【図1】

【図2】

【国際調査報告】